ES2692393T3 - Método de diagnóstico in vitro para cáncer por medio de ADN circulante libre de células - Google Patents

Método de diagnóstico in vitro para cáncer por medio de ADN circulante libre de células Download PDF

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ES2692393T3 ES14719023.5T ES14719023T ES2692393T3 ES 2692393 T3 ES2692393 T3 ES 2692393T3 ES 14719023 T ES14719023 T ES 14719023T ES 2692393 T3 ES2692393 T3 ES 2692393T3
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Abstract

Método de diagnóstico in vitro para cáncer de próstata que comprende la etapa de determinar la cantidad de la secuencia ALU 244 y la cantidad de la secuencia ALU 83 en una muestra aislada de líquido corporal, determinar un valor que es la razón entre la cantidad de ALU 244 y de ALU 83 en la muestra aislada de líquido corporal, en el que dicha razón se compara con un valor de referencia de pacientes sanos.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de diagnostico in vitro para cancer por medio de ADN circulante libre de celulas
La presente invencion se refiere a un metodo in vitro para el diagnostico de cancer de prostata.
Se sabe que pueden encontrarse secuencias de ADN y ADN libre en liquidos corporales como resultado del proceso de apoptosis. A diferencia de las secuencias liberadas por celulas normales, tambien pueden encontrarse secuencias alteradas que son indicativas de la presencia de celulas alteradas, es decir, tumorales.
La identificacion y posiblemente la cuantificacion de dichas secuencias, por tanto, representa un modo para identificar la presencia de un cancer en un sujeto y por tanto una herramienta de diagnostico potencialmente poderosa.
La publicacion de Mariangela Zane et al (“Circulating cell-free DNA, SLC5A8 and SLC26A4 hypermethylation, BRAFV600E: A non-invasive tool panel for early detection of thyroid cancer”, Biomedicine & Pharmacotherapy, vol. 67, n.° 8, 1 de octubre de 2013, paginas 723-730) da a conocer la correlacion de ADN libre de celulas que se corresponde con las secuencias ALU 244 y ALU 83 con el cancer de tiroides.
La publicacion de Feng Jiang et al (“Plasma cell-free DNA and its DNA integrity as biomarker to distinguish prostate cancer from benign prostatic hyperplasia in patients with increased serum prostate-specific antigen”, International urology and nephrology, Akademiai, Budapest, HU, vol. 45, n.° 4, 19 de junio de 2013, paginas 1023-1028) da a conocer que los niveles de ADN libre en el plasma pueden usarse para distinguir cancer de prostata de tumores benignos y, en particular, cita las secuencias ALE 247 y ALU 115 y su razon relativa como marcadores.
Sumario de la invencion
La presente invencion da a conocer un metodo para el diagnostico in vitro de cancer de prostata, en el que se detectan secuencias ALU especificas en una muestra corporal.
Objeto de la invencion
Un primer objeto de la invencion esta representado por un metodo in vitro para el diagnostico de cancer de prostata. En un aspecto adicional, la invencion da a conocer un metodo para el pronostico de cancer de prostata.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Para los propositos de la presente invencion, una muestra es una alicuota aislada de un liquido corporal de un sujeto.
En particular, la muestra usada es una muestra de plasma, suero, saliva, orina, liquido de ganglios linfaticos u organos linfaticos, medula osea, liquido de la pleura, conductos mamarios, liquido lagrimal, liquido seroso, liquido peritoneal, licor (liquido cefalorraquideo), heces, esputo, ascitis, jugo gastrico o pancreatico, sudor.
En una realizacion preferida de la invencion la muestra es una muestra aislada de muestra de sangre o suero o licor, mientras que en una muestra mas preferida es una muestra aislada de sangre o suero.
El volumen de la muestra adecuada para realizar el metodo de la invencion depende del tipo de liquido corporal.
En particular, un volumen adecuado esta comprendido entre aproximadamente 300 pl-1 ml y preferiblemente es de aproximadamente 500 pl.
En un primer aspecto de la invencion, la muestra de sangre no esta purificada.
Por consiguiente, una vez tomada del sujeto, las unicas etapas realizadas comprenden la centrifugacion y/o filtracion con el fin de eliminar el material particulado (celulas). Ademas, pueden realizarse sobre la muestra otros tratamientos adecuados con el fin de eliminar o inactivar proteinas, como por ejemplo una etapa de tratamiento con enzimas.
En otra realizacion de la invencion, la muestra se somete a una etapa para la extraccion de ADN.
Dicha etapa puede realizarse segun tecnicas bien conocidas en la tecnica, como por ejemplo la extraccion con fenol/cloroformo.
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Para los fines de la presente invencion, un sujeto se pretende que sea un ser humano o un animal.
Dentro de los animales, se prefieren las mascotas y animales de jardin, en los que los se prefieren particularmente los mamiferos. En una realizacion incluso mas preferida, los animales se refieren a perros.
El “ADN circulante total” segun la invencion puede determinarse con PCR cuantitativa u otro metodo adecuado en la tecnica.
Dentro de la presente invencion, la “cantidad de” se usa para referirse a un valor que es representativo de la concentracion de una secuencia particular (secuencia nucleica) en la muestra.
“Representativo” se usa para referirse a una relacion entre dos valores.
Por ejemplo, una medicion de un compuesto en una muestra podria proporcionar un valor que puede usarse para determinar la concentracion a traves de un calculo conocido.
La manera de calcular la concentracion a partir del primer valor depende de las circunstancias asi como del metodo usado.
La “integridad del ADN” se refiere a la razon de la cantidad del ADN circulante liberado de celulas cancerosas con respecto a la cantidad total de ADN.
En el metodo de diagnostico de la invencion, el sujeto es una persona o un animal que es probable que desarrolle cancer u otro cancer (es decir, recidiva del cancer) o se sospecha que tiene cancer.
El metodo de diagnostico in vitro de la presente invencion comprende en particular las etapas de:
1) determinar el ADN circulante total en una muestra;
2) determinar el ADN liberado por celulas cancerosas;
3) determinar el valor “II” (indice de integridad), que se corresponde con la relacion entre los valores de las etapas 1) y 2).
En particular, la etapa 1) comprende determinar la cantidad de ALU 83 presente en la muestra.
Para dicho fin, se usan los siguientes cebadores:
Secuencia 5’—^3’: SEQ. ID. n.

directo CTGAGGTCAGGAGTTCGAGACC 1

inverso CCACGCCCGGCTAATTTT 2
En lo que respecta a la etapa 2), comprende determinar la cantidad de ALU 244 presente en la muestra.
Para dicho fin, se usan los siguientes cebadores:
Secuencia 5’—3’: SEQ. ID. n.

directo GCGGTGGCTCACGCCTGTAA 3

inverso GGAGTGCAGTGGCGCGATCT 4
En la etapa 3) se calcula la razon “II” entre la cantidad del ADN liberado por celulas cancerosas y el ADN circulante total, tal como puede representarse a continuacion:
Valor de ALU244 Valor de ALU83
En una realizacion preferida “valor” representa una medida de cantidad, como concentracion, determinada con PCR cuantitativa; por tanto, el valor “C” se calcula como a continuacion:
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imagen1
Segun una realizacion preferida de la presente invencion, en las etapas anteriores 1) y 2) las secuencias ALU se amplifican por PCR cuantitativa (qPCR).
Ademas de las etapas anteriores 1) a 3), el metodo de diagnostico in vitro de la invencion comprende la etapa adicional de comparar los datos obtenidos para el valor de “II” con un grupo de valores de referencia.
Para los fines de la presente invencion un grupo de valores de referencia comprende valores que se sabe que corresponden a o bien:
- pacientes sanos, o bien
- pacientes con cancer, o bien
- a un estado patologico de un grupo de pacientes.
En particular, el valor de referencia depende de caracteristicas del paciente que se somete al metodo de diagnostico in vitro de la invencion, como edad, sexo, raza, etc.
Ademas de eso, el valor de referencia depende de la clase de muestra en examen y del tipo de tumor que se investiga.
En la realizacion preferida, el metodo dado a conocer anteriormente permite el diagnostico del cancer de prostata. Segun otro objeto de la invencion, se da a conocer un metodo de tratamiento que comprende la etapa de realizar el metodo de diagnostico in vitro de la invencion.
En particular, dicho metodo puede usarse para el tratamiento de cancer y, mas en particular, del cancer de prostata.
Mas en detalle, dicho metodo puede realizarse en un sujeto que desarrollo un cancer o que esta tratandose contra un cancer o que se sometio a tratamiento contra el cancer, como una intervencion quirurgica para eliminar el cancer. Por consiguiente, el presente metodo puede usarse para monitorizar la progresion del cancer asi como la respuesta al tratamiento terapeutico.
De hecho, cualquier variacion en los datos recogidos puede ser indicativa de la progresion o regresion del cancer en caso de que el tratamiento terapeutico sea ineficaz o satisfactorio.
Por tanto, el metodo de la invencion puede usarse tambien para identificar si un farmaco o un tratamiento es eficaz contra el cancer.
En otro objeto de la invencion, se da a conocer un metodo para el pronostico del cancer que comprende llevar a cabo el metodo de la invencion.
Para dicho fin, el metodo puede realizarse en un sujeto que es probable que desarrolle un cancer en el futuro.
A este respecto, debe considerarse el entorno en el que vive el sujeto (si en el pasado ha estado en contacto con sustancias potencialmente peligrosas) y/o su familiaridad con la patologia (por ejemplo, si uno o mas parientes cercanos desarrollaron un cancer).
Los datos del valor de “C” pueden recogerse a uno o posteriores tiempos y compararse con valores de referencia, que son indicativos de la aparicion de la patologia. Tambien en este caso, los datos de referencia dependen de caracteristicas del paciente que se somete al metodo de la invencion, como edad, sexo, raza, etc.
Ademas de eso, los datos de referencia dependen de la clase de muestra de muestra en examen y del tipo de tumor que se investiga.
Gracias al metodo de la invencion, el tratamiento curativo del paciente puede empezarse ventajosamente en un estadio muy temprano de la patologia.
Los metodos dados a conocer anteriormente que hacen uso del metodo de diagnostico in vitro de la invencion pueden usarse en combinacion con otro metodo de modo que se logren resultados incluso mas fiables y eficaces.
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Segun un objeto adicional de la presente invencion, se proporciona un kit para realizar el metodo de diagnostico in vitro de la invencion.
En particular, dicho kit comprende:
- cebadores para la amplificacion de ALU 83; y
- cebadores para amplificacion de ALU 244.
Mas en detalle, cada uno de los cebadores se incluye en una disolucion de reaccion apropiada que comprende una sonda adecuada.
En una primera realizacion de la invencion, un reactivo para la amplificacion de ALU 83 comprende:
Sonda de mezcla maestra Fluocycle II ™ (sin ROX) (Euroclone S.p.A.) 10 pl
ALU83 directo (10 pM) 0,1 pl
ALU83 inverso (10 pM) 1,8 pl
Sonda (10 pM) 0,5 pl
Agua hasta 20 pl
La formulacion de mezcla maestra Fluocycle II™ comprende: KCl 100 mM, Tris HCl 20 mM pH 8,3, Tween-20 al 0,02%, 0,8 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Taq ADN polimerasa 200 unidades/ml, MgCl2 8 mM, estabilizadores.
Por otro lado, el reactivo para la amplificacion de ALU 244 comprende:
Sonda de mezcla maestra Fluocycle II ™ (sin ROX) (Euroclone S.p.A.) 10 pl
ALU83 directo (10 pM) 1,8 pl
ALU83 inverso (10 pM) 1,8 pl
Sonda (10 pM) 0,5 pl
Agua hasta 20 pl
La formulacion de mezcla maestra Fluocycle II™ comprende: KCl 100 mM, Tris HCl 20 mM pH 8,3, Tween-20 al 0,02%, 0,8 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Taq ADN polimerasa 200 unidades/ml, MgCl2 8 mM, estabilizadores.
El kit de la invencion tambien comprende preferiblemente una secuencia para realizar la curva de referencia patron. Por ejemplo, una preparacion de una secuencia ALU, puede estar en forma liofilizada o en disolucion. Segun otro aspecto, el kit puede comprender adicionalmente una muestra que puede usarse para verificar la variabilidad entre ensayos.
En un primer kit de la invencion, se incluyen:
- el reactivo anterior para la amplificacion de ALU83;
- el reactivo anterior para la amplificacion de ALU244;
- la secuencia para realizar la curva de referencia patron, tal como una preparacion de una secuencia ALU;
- una muestra para verificar la variabilidad entre ensayos.
En un kit alternativo, pueden incluirse:
- una disolucion de la sonda de mezcla maestra Fluocycle II™ (sin ROX) (Euroclone S.p.A.);
- una disolucion que comprende los cebadores para la secuencia ALU83 y una sonda adecuada;
- una disolucion que comprende los cebadores para la secuencia ALU244 y una sonda adecuada;
- la secuencia para realizar la curva de referencia patron, tal como una preparacion de una secuencia ALU;
- una muestra de referencia para verificar la variabilidad entre ensayos.
En el kit anterior, las disoluciones de cebador para las secuencias ALU son preferiblemente:
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ALU83 directo (10 pM) 0,1 pl

ALU83 inverso (10 pM) 1,8 pl

Sonda (10 pM) de agua 0,5 pl
y

ALU244 directo (10 pM) 1,8 pl

ALU244 inverso (10 pM) 1,8 pl

Sonda (10 pM) de agua 0,5 pl
El kit puede comprender adicionalmente una coleccion de datos que pueden usarse como referencia en el metodo de diagnostico in vitro, terapeutico o de pronostico de la invencion.
Materiales y metodos
Kit de extraccion de ADNlc
Kit de virus QIAamp(R) UltraSensTM (QIAGEN):
Volumen de partida, plasma: 500 pl
Volumen de elucion de ADNlc: 50 pl
Protocolo de amplificacion por PCR en tiempo real
Curva patron
Patron 6:
0,5 pg/pl
Patron 5:
1 pg/pl
Patron 4:
10 pg/pl
Patron 3:
100 pg/pl
Patron 2:
1*103 pg/pl
Patron 1:
10*103 pg/pl
Reactivo para la mezcla ALU83
p1
Sonda de mezcla maestra Fluocycle II (SIN ROX)
10
ALU83 directo (10 pM)
0,1
ALU83 inverso (10 pM)
1,8
Sonda (10 pM)
0,5
H2O
6,6
ADNlc/patron
1
Volumen total
20
Reactivo para la mezcla ALU244
p1
Sonda de mezcla maestra Fluocycle II (SIN ROX)
10
ALU244 directo (10 pM)
1,8
ALU244 inverso (10 pM)
1,8
Sonda (10 pM)
0,5
H2O
4,9
ADNlc/patron
1
Volumen total
20
Protocolo de amplificacion para la mezcla ALU
95°C
5 min
95°C
15 s X40 ciclos
62°C
1 min
Sonda
6FAM-CCTGGCCAACATGGTGAAACCCC-TMR SEQ.ID. n. 5 Ejemplo 1
PCR cuantitativa de fragmentos de ADN plasmatico
La cuantificacion de fragmentos de ADN libre de celulas (ADNIc) en plasma se realizo mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR), que amplifico y cuantifico los fragmentos de ADN mas corto y mas largo. Para maximizar la 5 sensibilidad de la cuantificacion de ADNlc, se usaron las repeticiones de ALU como diana de la qPCR.
Se disenaron dos pares de cebadores tal como sigue: el primer conjunto de cebadores (ALU244) amplifico solo el fragmento de ADN mas largo (244 pb), mientras que el segundo conjunto de cebadores (ALU83) amplifico tanto el mas corto (83 pb) como el mas largo, porque el sitio de apareamiento de ALU83 estaba dentro del sitio de 10 apareamiento de ALU244. Los resultados obtenidos usando los cebadores de ALU83 representan el ADN circulante en plasma libre de celulas total, mientras que los resultados obtenidos usando los cebadores de ALU244 reflejan la cantidad de ADN liberado de celulas no apoptoticas.
La secuencia de sonda fue 6FAM-CCTGGCCAACATGGTGAAACCCC-TMR.
15
Las dos reacciones se realizaron en un volumen final de 20 pl que contenia 1 pl de muestra, sonda FluoCycle™ II 1X (Euroclone®, Milan, Italia), 0,25 pM de la sonda y 0,9 pM de cada cebador de ALU244 en una o 0,05 pM de cebador directo y 0,9 mM de cebador inverso para ALU83 en la otra. La amplificacion por qPCR consistio en una etapa de desnaturalizacion inicial durante 5 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de desnaturalizacion durante 15 20 segundos a 95°C y apareamiento/extension durante 1 minuto a 62°C, usando el sistema de PCR en tiempo real 7300 y el sistema de PCR en tiempo real rapido 7500 (Applied Biosystems, Milan, Italia).
Las muestras se sometieron a prueba por triplicado y se incluyo una muestra de referencia negativa apropiada (sin molde). La cantidad absoluta de ADNlc en cada muestra se determino mediante una curva patron, usando diluciones 25 en serie de 10 veces (desde 10 ng hasta 1 pg) de ADN genomico obtenido de la capa leucocitica de sujetos sanos.

Claims (9)

  2. 2.
    10
  3. 3.
    15 4.
    20
  4. 5.
  5. 6.
    25
  6. 7.
    30 8.
  7. 9.
    35
  8. 10.
    40
  9. 11.
    REIVINDICACIONES
    Metodo de diagnostico in vitro para cancer de prostata que comprende la etapa de determinar la cantidad de la secuencia ALU 244 y la cantidad de la secuencia ALU 83 en una muestra aislada de liquido corporal, determinar un valor que es la razon entre la cantidad de ALU 244 y de ALU 83 en la muestra aislada de liquido corporal, en el que dicha razon se compara con un valor de referencia de pacientes sanos.
    Metodo de diagnostico in vitro segun la reivindicacion 1, en el que la muestra aislada de liquido corporal se purifica en una etapa de purificacion antes de determinar la cantidad de la secuencia ALU.
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de la reivindicacion 1 o 2, en el que la muestra aislada del liquido corporal se trata con el fin de extraer el ADN de la muestra aislada antes de determinar la cantidad de la secuencia ALU.
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra aislada de liquido corporal es una muestra de sangre, plasma, suero, saliva, orina, liquido de ganglios linfaticos u organos linfaticos, medula osea, liquido de la pleura, conductos mamarios, liquido lagrimal, liquido seroso, liquido peritoneal, liquido cefalorraquideo, heces, esputo, ascitis, jugo gastrico o pancreatico, sudor.
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho liquido corporal es de un ser humano o un animal.
    Metodo de diagnostico in vitro segun la reivindicacion 5, en el que dicho liquido corporal es de un perro.
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra aislada tiene un volumen comprendido entre aproximadamente 300 pl-1 ml y preferiblemente es de aproximadamente 500 pl.
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de determinar la cantidad de ALU 244 comprende el uso de los siguientes cebadores:
    Secuencia 5’^3’:
    directo CTGAGGTCAGGAGTTCGAGACC SEQ. ID. n. 1
    inverso CCACGCCCGGCT AATTTT SEQ. ID. n. 2
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de determinar la cantidad de ALU 83 comprende el uso de los siguientes cebadores:
    Secuencia 5’^3’:
    directo GCGGTGGCTCACGCCTGTAA SEQ. ID. n. 3
    inverso GGAGTGCAGTGGCGCGATCT SEQ. ID. n. 4
    Metodo de diagnostico in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de ALU 244 y/o de ALU 83 se determina mediante reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa.
    Uso de una secuencia nucleotidica aislada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ.ID. n.° 1,2, 3, 4 y 5 para los metodos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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