ES2313143T3 - Metodo para el diagnostico de cancer mediante la deteccion de adn y arn circulantes. - Google Patents

Metodo para el diagnostico de cancer mediante la deteccion de adn y arn circulantes. Download PDF

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Abstract

Método para diagnosticar o hacer un seguimiento de la evolución de cánceres, que comprende medir juntas, en los fluidos corporales de pacientes que se sospecha que tienen cáncer, la sobreexpresión génica (ARN) y la amplificación génica (ADN) en cualquier gen que tanto se amplifica como se sobreexpresa en células cancerígenas, y compararlas con los controles de personas sanas, en el que el ARN y el ADN se extraen en un fluido corporal, se purifican y se amplifican, y caracterizado porque se detectan niveles elevados de ARN de hTR, hTERT o TEP1 y niveles elevados de ADN de hTERT, en comparación con un gen único estructural.

Description

Método para el diagnóstico de cáncer mediante la detección de ADN y ARN circulantes.
La presente invención describe un método de diagnóstico y/o de seguimiento de la evolución de la mayoría de tipos de cáncer, por ejemplo tras quimioterapia o tras una operación.
Se sabe que el diagnóstico y seguimiento de la evolución del cáncer se realizan, además de hacerlo mediante observación directa de los tumores, mediante análisis de la biopsia o, en el caso de tumores malignos de la sangre, mediante análisis de la médula ósea. Esto implica una intervención quirúrgica o una prueba invasiva, tal como una biopsia o una aspiración de la médula ósea. Ahora, sin tener en cuenta el aspecto desagradable o incluso peligroso de tales métodos, se ha observado que además podrían no ser muy precisos.
Los métodos convencionales de diagnóstico no son muy satisfactorios. Como ejemplo, la detección del cáncer colorrectal se basa actualmente en el análisis de sangre oculta en las heces (FOBT), que es tanto insensible como no específico. Por el contrario, la sigmoidoscopia flexible es sensible y específica para la enfermedad distal temprana, pero es tanto invasiva como insensible para la enfermedad proximal. Además, el enema de bario es relativamente sensible y específico, pero requiere la preparación colónica, la radiación y la baja laboral de un día, mientras que la colonoscopia total es muy sensible y específica, pero también es invasiva y cara.
La situación parece ser un poco mejor para otros cánceres. Existe una prueba no fiable para la detección prematura del cáncer de pulmón, siendo la herramienta más fiable la tomografía computerizada.
Una estrategia importante para reducir la mortalidad por cáncer de mama es la introducción de la detección mamográfica, en un intento por detectar cánceres en una etapa asintomática o patológicamente temprana. Aunque varios estudios indican que la detección en masa es una estrategia útil para reducir la mortalidad por cáncer de mama, existe un número de desventajas asociado con esta forma de detección del cáncer. Éstas incluyen una alta proporción de pruebas con falsos positivos, pruebas con frecuentes falsos negativos, y los enormes costos para la salud pública implicados. De este modo, cuando se sopesan los beneficios de la detección mamográfica frente a sus costes y otras desventajas, quizá no es sorprendente que esta forma de detección haya engendrado un debate caluroso y contencioso durante los últimos 20 años.
Finalmente, el desarrollo de marcadores tumorales proteínicos convencionales, tales como el antígeno carcinoembriónico (CEA) y la alfa-fetoproteína (AFP), junto con el ampliamente usado antígeno específico de la próstata (PSA), fue debido principalmente a la introducción de nuevos métodos para cuantificar pequeñas cantidades de proteínas circulantes. Sin embargo, los puntos flacos de sensibilidad y especificidad con estos ensayos todavía se han de
superar.
El objetivo de la presente invención consiste por lo tanto en proporcionar un método de diagnóstico y/o de seguimiento de la evolución de la mayoría de los tipos de cáncer, que sería, por un lado, más preciso y fiable, y, por otro lado, más fácil de llevar a cabo sin implicar una prueba invasiva para el paciente.
En el plasma o suero humano tanto de personas sanas como enfermas circulan pequeñas cantidades de ADN libre, y, en pacientes con cáncer, hay concentraciones más elevadas de ADN plasmídico o sérico. Los actuales inventores fueron los primeros en demostrar que este ADN, extraído del plasma de pacientes con cáncer, tiene características relacionadas con tumores. Éstas incluyen una disminución de la estabilidad de la cadena, mutaciones oncogénicas y de genes supresores de tumores, alteraciones de microsatélites, e hipermetilación génica. Esto ha conducido a sugerir que, usando estas técnicas moleculares, puede ser factible una prueba diagnóstica no invasiva para el cáncer.
Usando técnicas moleculares esencialmente similares, se ha detectado en el plasma de pacientes con cáncer ARNm relacionado con tumores. Estos marcadores de ARN son el resultado de una sobreexpresión de algunos genes en las células cancerígenas, y se pueden encontrar en mayores cantidades en el plasma/suero de pacientes con cáncer, en comparación con controles sanos.
Ahora, esta sobreexpresión de genes está acompañada a menudo por una amplificación del mismo gen en las células cancerígenas, y se ha encontrado que esta amplificación se puede observar subsiguientemente en el plasma/suero del paciente. Se debería de enfatizar que esta amplificación es independiente del hecho de que, como se ha mencionado anteriormente, habitualmente hay más ADN plasmídico/sérico en pacientes con cáncer que en controles sanos.
Además, se sabe, especialmente desde las publicaciones ANKER P. y otros: "Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies?" International Journal of Cancer, New York, NY, US, 2003, páginas 149-152, XP002275956 ISSN: 0020-7136, GOESSL CARSTEN: "Diagnostic potential of circulating nucleic acids for oncology. "Expert review of molecular diagnostics, julio 2003, vol. 3, nº 4, julio de 2003 (2003-07), páginas 431-442, XP002341141 ISSN: 1473-7159 y SILVA J. y otros, 2002, Genes, chromosomes & cancer, 35, 4, 375-376, el uso de ácidos nucleicos circulantes, en plasma y suero, como una investigación no invasiva del cáncer, más particularmente mediante detección de tanto ADN como ARN circulantes, respectivamente, procedentes de diversos genes.
Por lo tanto, se ha desarrollado un ensayo de detección del cáncer midiendo el plasma/suero, añadiendo y comparando la cantidad de ADN y ARN de ciertos genes en el plasma/suero de pacientes con cáncer, que son el reflejo de una amplificación génica y de una sobreexpresión génica. De este modo, la amplificación génica (observada mediante más ADN) y la sobreexpresión génica (más ARN) están relacionadas.
Además, se ha demostrado que los genes analizados son, más particularmente, los seleccionados de hTR, hTERT y TEP1.
En consecuencia, el objetivo de la presente invención, que quiere alcanzar el objetivo anteriormente mencionado, consiste en proporcionar un método para el diagnóstico o seguimiento de la evolución de cánceres, que comprende medir juntas, en los fluidos corporales de los pacientes que se sospecha que tienen cáncer, la sobreexpresión génica (ARN) y la amplificación génica (ADN) sobre cualquier gen que tanto se amplifique como se sobreexprese en células cancerígenas, y compararlas con controles sanos, en el que el ARN y el ADN se extraen de un fluido corporal, se purifican y se amplifican, y que se caracteriza porque se detectan niveles elevados de ARN de hTR, hTERT o TEP1, y niveles elevados de ADN de hTERT, en comparación con un gen único estructural.
Más particularmente, el ARN y el ADN se extraen de un fluido corporal, tal como plasma, suero, esputo, saliva, etc., se purifican y se amplifican, y el ARN sobreexpresado y el ADN amplificado se analizan y se comparan con un gen único estructural.
Preferentemente, los ácidos nucleicos se amplifican mediante reacción en cadena de transcriptasa inversa (RT-PCR), y se analizan mediante coloración en gel, mediante técnica inmunológica radioactiva (RIA), mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), o mediante un ensayo de microchip (conjunto génico), y se cuantifican posiblemente mediante un método para la cuantificación de ácidos nucleicos.
La cuantificación del ARN y del ADN se pueden llevar a cabo ventajosamente mediante PCR de tiempo real, tal como "Taq Man", o sobre capilares "Light Cycler", o mediante PCR en tiempo real y RT PCR de cualquier compañía.
Además, los genes analizados se pueden comparar con un extracto de ácidos nucleicos (ADN y ARN) de referencia, que corresponde a la expresión (ARN) y a la cantidad (ADN) de un gen único estructural, o se pueden comparar con un ARN de referencia que corresponde a la expresión de un gen codificante implicado en funciones básicas necesarias para el sustento de la célula, o con un ADN de referencia que corresponde a un gen único, o se puede estimar con referencia a una curva estándar obtenida con ácidos nucleicos de una estirpe celular.
En la siguiente descripción de la presente invención, se han seleccionado como ejemplo ARN y ADN de telomerasa, ya que la actividad de telomerasa está aumentada en 85 a 100% de los cánceres. Pero se debe de enfatizar que la presente invención es válida para todos los genes, y específicamente oncogenes que se ha dado a conocer que son amplificados y sobreexpresados en muchos cánceres y estirpes celulares cancerígenas, por ejemplo MYCN en neuroblastoma, ErbB2 en cáncer esofágico, de mama y ovárico, Her2, Her2/Neu y Her1 en cáncer de mama y Her2/Neu en cáncer de pulmón, ciclina A y D1 en cáncer colorrectal o laríngeo, ABL en leucemias y linfomas, SKP2 en cáncer de pulmón no microcítico, ETV& (gen TEL) en síndrome mielodisplásico. Estos son algunos de los más estudiados, pero se han dado a conocer muchos otros, tales como MGC2177, PLAG1, PSMC6P, y LYN.
Para ilustrar la presente invención, se usó el gen de hTERT, que codifica la transcriptasa inversa de la ribonucleoproteína telomerasa.
La telomerasa es una enzima ribonucleoproteínica que sintetiza secuencias teloméricas repetidas en los extremos cromosómicos. Los telómeros protegen los extremos cromosómicos y, en cada división celular, estos telómeros se acortan. La telomerasa está compuesta de un molde de ARN (hTR) y una enzima de transcriptasa inversa (hTERT) más proteínas asociadas, tales como TEP1 que sintetizan estos telómeros.
La actividad de esta enzima se ha convertido en un indicador aceptado para el diagnóstico y el pronóstico de la mayoría de los tumores malignos. La expresión del ARN de telomerasa humana (hTR), o de la enzima de transcriptasa inversa del ARN de telomerasa (hTERT) o de la proteína asociada (TEP1), se ha medido durante la progresión de varios tipos de tumores. Esto ha permitido establecer una correlación entre esta expresión (la cantidad de ARN) y la actividad de telomerasa. La mayoría de los cánceres y de estirpes celulares inmortalizadas tienen una elevada actividad de telomerasa, que refleja un mecanismo que escapa a las regulaciones normales del envejecimiento. Además, ya se ha descrito en publicaciones previas (documentos EP-A-1158055 y WO 01/90409) la medición de la cantidad de ARNm en el plasma/suero que codifica hTR, hTERT y TEP1, en comparación con un gen de referencia.
Ahora, se ha observado una amplificación de los genes (ADN) que codifican subunidades de telomerasa (especialmente hTERT) en estirpes celulares cancerígenas y en diferentes tipos de cánceres. Se ha observado además una amplificación del gen de hTERT en el plasma de pacientes con cáncer.
Aunque los componentes del ARN y ARNm que codifican la telomerasa son componentes celulares, se observó sorprendentemente que estos componentes también se podrían encontrar en forma extracelular en el plasma o en el suero.
De hecho, cuando se extraen y se amplifican ambos ácidos nucleicos, la diferencia entre los controles sanos y los pacientes con cáncer es sorprendentemente más elevada.
Para resumir el método, se ha mostrado una cantidad creciente de ARN de hTR, hTERT y TEP1 en el plasma o suero de personas que padecen cáncer de mama, ovárico, de cabeza y de cuello, pancreático, hepático, de estómago o de colon, mientras que se ha demostrado que estos productos no se encuentran en la sangre de personas sanas. Además, el ADN que codifica componentes de telomerasa, en particular hTERT, también se puede encontrar en cantidades (amplificado) en el plasma de pacientes con cáncer mayores que en los controles sanos. Se sabe desde hace tiempo que a menudo hay más ADN en el plasma de pacientes con cáncer que en el plasma de controles sanos (esto se ha demostrado por ejemplo midiendo la cantidad de beta-globina, pero el ADN de hTERT produce incluso más de lo que se podría esperar, dando muestras de una amplificación de este gen.
De forma más precisa, el método de diagnóstico según la invención consiste en extraer los ácidos nucleicos (ARN y ADN) del plasma o del suero de la sangre, purificarlos y amplificarlos a fin de demostrar la presencia y la cantidad del producto obtenido en este caso mediante la reacción en cadena de polimerasa inversa (RT-PCR) que representa los componentes tanto de ARN como de ADN de hTERT. Esto se debe de hacer de manera comparativa entre el plasma o suero de una persona que se sospecha que tiene un tumor maligno y el plasma o suero de una persona sana o de un control, que no padece ninguna enfermedad tumoral.
Se detecta el producto de amplificación del ADN y de los componentes de ARN transcritos en ADN mediante RT-PCR. Esto se puede realizar mediante cualquier método de cuantificación de ácidos nucleicos.
De forma similar, se puede usar cualquier técnica de extracción, de purificación y de amplificación de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) en el plasma o en el suero.
La presente invención se ilustrará ahora de manera no limitativa mediante el siguiente ejemplo relacionado con el diagnóstico de algunos cánceres, usando la cuantificación de ADN y ARN de hTERT.
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Ejemplo
Diagnóstico de diferentes cánceres mediante la detección de ADN de hTERT amplificado y de ARN de hTERT sobreexpresado, en el plasma o en el suero
Se recogieron muestras de sangre (2 ml) en tubos de EDTA antes de la cirugía o el tratamiento de pacientes que tienen pequeños tumores malignos de mama, o de pacientes que sufren cáncer de cabeza y cuello, colorrectal, pancreático y hepático. De la misma manera, se extrajo sangre a voluntarios sanos, como controles.
Para garantizar ácidos nucleicos plasmáticos de buena calidad, las muestras de sangre completa se debieron de centrifugar tan pronto como fue posible. Si la centrifugación no puede tener lugar inmediatamente, las muestras de sangre se deben de almacenar a 4º inmediatamente después de la recogida de la sangre, y se deben de centrifugar dentro de las 6 horas. Las muestras de sangre se centrifugaron a 1.600 g durante 10 minutos a 4ºC. El plasma se transfirió a nuevos tubos, teniendo cuidado de no perturbar la capa de revestimiento amarillenta. Se realizó una segunda ronda de centrifugación del plasma a 16.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El plasma se transfirió finalmente a nuevos tubos, teniendo cuidado de no perturbar el pelete celular subyacente, y se almacenó, si es necesario, a
-70º.
El ARN y el ADN se extrajeron usando un kit comercialmente disponible (kit vírico Ultrasens, de Qiagen), que extrae ADN así como ARN, según las instrucciones del fabricante.
Los cebadores y la sonda de Taq Man para hTERT se situaron en un exón y que daría tanto ARN como ADN: cebador directo: 5'-ACC GTC TGC GTG AGG AGA TC-3'; cebador inverso: 5'-CCG GTA GAA AAA AGA GCC TGT TC-3' y la sonda 5'Fam-TGT ACG TCG TCG AGC TGC TCA GGT CTT T-3' TAMRA.
Como referencia para el ARN y el ADN, se usó el gen de beta-globina en el exón 2: cebador directo: 5' CTGCTGG
TGGTCTACCCTTG 3'; cebador inverso: 5' CCTGAAGTTCTCAGGATCCA 3'; y sonda de hibridación: 5'Fam. CTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCT 3 TAMRA' que produciría tanto ARN como ADN, o el gen de GAPDH en el exón 8: cebador directo 5'GTGGACCTGACCTGCCG3'; cebador inverso 5'GGAGGAGTGGGTGTCGC3', y la sonda para Taq Man 5'FAM-AAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCA3'TAMRA.
Estos cebadores de referencia para ARN y ADN se pueden sustituir mediante cualquier gen único estructural. Los resultados dados más abajo se calcularon usando cantidades arbitrarias expresadas como valores de CT (números liminares de ciclos) o de 2^{\Delta CT} (por ejemplo 2^{CT} de hTERT^{-CT} de b-globina). Siempre comparan extracciones de ácidos nucleicos plasmáticos de pacientes con cáncer y de donantes sanos, extraídas el mismo día y con la misma cantidad (0,5 ml) de plasma/suero. Es posible hacer la estimación de otra manera, comparando los resultados con una curva obtenida mediante cantidades conocidas de un gen.
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Se usó el kit QuantiTect Probe RT-PCR (Qiagen) en 25 \mul de mezcla de reacción de RT-PCR que contiene la mezcla Master Mix del fabricante, la mezcla de RT (transcriptasa inversa OmniscriptTM, transcriptasa inversa Sensiscript TM, ADN polimerasa hot-start TaqTM) a la que se añadió el conjunto de cebadores (0,4 \muM) y la sonda Taq Man (0,1 \muM) y 3 a 6 \mul de los 30 \mul de ácidos nucleicos eluidos. Las condiciones de RT-PCR de la mezcla fueron: una incubación inicial a 50ºC durante 30 minutos, seguido de una incubación a 95ºC durante 15 minutos para activar la ADN polimerasa HotstarTaqTM, y después 50 ciclos a 94ºC (15 segundos), 60ºC (1 minuto).
Todas las secuencias de las bases mencionadas anteriormente en la presente memoria como ejemplos de cebadores son conocidas y como tales se pueden consultar en el sitio web de la base de datos genómica (http:/www.gdb.org/). Se pueden sustituir por otros cebadores y sondas localizados en los genes mencionados anteriormente. Los genes de referencia se pueden cambiar por otros genes.
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Resultados obtenidos
Los datos se han obtenido de 74 pacientes con cáncer y 51 controles, con una especificidad de 98%. Los cambios de sensibilidad de cáncer a cáncer oscilan de 81% hasta aproximadamente 90%. Los pacientes con cáncer sufrieron cánceres de cuello y cabeza, mama, colorrectal, pancreático y hepático.
En la siguiente Tabla se presentan los resultados obtenidos mediante la medición cuantitativa en tiempo real por RT PCR tanto de ADN como de ARN de hTERT, en comparación con el gen de beta-globina, en el plasma de pacientes con cáncer y de controles sanos.
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1 
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Adicionalmente, los resultados obtenidos se ilustran en las figuras adjuntas, en las que:
- la Figura 1 muestra como referencia las gráficas de amplificación obtenidas usando PCR cuantitativa en tiempo real para el gen de hTERT (ADN), siendo el eje X el número de ciclos de la reacción de PCR, y siendo el eje Y la intensidad de fluorescencia con respecto al fondo.
- La Figura 2 muestra como referencia las gráficas de amplificación obtenidas usando RT-PCR cuantitativa en tiempo real para el gen de hTERT (ARN), siendo el eje X el número de ciclos de la reacción de PCR, y siendo el eje Y la intensidad de fluorescencia con respecto al fondo.
- La Figura 3 muestra las gráficas de amplificación obtenidas usando RT-PCR cuantitativa en tiempo real para el gen de hTERT (ácidos nucleicos ADN y ARN totales), según la presente invención, siendo el eje X el número de ciclos de la reacción de PCR, y siendo el eje Y la intensidad de fluorescencia con respecto al fondo.
Como se puede observar fácilmente en la Figura 1, el primer grupo de líneas (A) con un valor de CT de aproximadamente 37 está compuesto por el producto de amplificación de las muestras de ADN procedentes de donantes sanos con cebadores de hTERT, y el segundo grupo (B) con un valor de CT de aproximadamente 35 está compuesto por el producto de amplificación de muestras de ADN plasmídico procedentes de pacientes que sufren cáncer de cabeza y de cuello.
En la Figura 2, el primer grupo de líneas (C) con un valor de CT de aproximadamente 34 está compuesto por el producto de amplificación de las muestras de ARN procedentes de donantes sanos con cebadores de hTERT, y el segundo grupo (D) con un valor de CT de aproximadamente 32 está compuesto por el producto de amplificación de muestras de ARN plasmídico procedentes de pacientes que sufren cáncer de cabeza y de cuello. Una diferencia de valores de CT de 2 representa una diferencia de valores de ARN de 4 veces, obtenidos a partir de la misma cantidad de plasma.
En la Figura 3, que representa los resultados del método según la presente invención, el primer grupo de líneas (E) con un valor de CT de aproximadamente 35 está compuesto por el producto de amplificación de muestras de ácido nucleico plasmídico procedentes de donantes sanos con cebadores de hTERT, y el segundo grupo (F) con un valor de CT de aproximadamente 29 está compuesto por el producto de amplificación de muestras de ácido nucleico plasmídico procedente de pacientes que sufren cáncer de cabeza y de cuello. La diferencia entre los valores de CT (que comprenden ARN y ADN) del grupo de control y del grupo de cáncer es mayor que en las figuras 1 y 2, en las que se mide el ADN o el ARN. Esto demuestra la clara ventaja del método según la presente invención.

Claims (8)

1. Método para diagnosticar o hacer un seguimiento de la evolución de cánceres, que comprende medir juntas, en los fluidos corporales de pacientes que se sospecha que tienen cáncer, la sobreexpresión génica (ARN) y la amplificación génica (ADN) en cualquier gen que tanto se amplifica como se sobreexpresa en células cancerígenas, y compararlas con los controles de personas sanas, en el que el ARN y el ADN se extraen en un fluido corporal, se purifican y se amplifican, y caracterizado porque se detectan niveles elevados de ARN de hTR, hTERT o TEP1 y niveles elevados de ADN de hTERT, en comparación con un gen único estructural.
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque los ácidos nucleicos se amplifican mediante reacción en cadena de transcriptasa inversa (RT-PCR).
3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los genes analizados se comparan con un extracto de ácidos nucleicos (ADN y ARN) de referencia que corresponde a la expresión (ARN) y a la cantidad (ADN) de un gen único estructural.
4. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los genes analizados se comparan con un ARN de referencia, que corresponde a la expresión de un gen codificante estructural.
5. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los genes analizados se comparan con un ADN de referencia, que corresponde a un gen único.
6. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los genes analizados se estiman con referencia a una curva estándar obtenida con ácidos nucleicos de una estirpe celular.
7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los ácidos nucleicos ARN y ADN se analizan mediante coloración en gel, mediante técnica inmunológica radioactiva (RIA), mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) o mediante un ensayo de microchip (conjunto génico), y se cuantifican posiblemente mediante cualquier método para la cuantificación de ácidos nucleicos.
8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los ácidos nucleicos ARN y ADN se cuantifican mediante RT PCR en tiempo real.
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