ES2693542T3 - Nuevos anticuerpos que inhiben la dimerización de c-Met y sus utilizaciones - Google Patents

Abstract

Anticuerpo apto para unirse a cMet, o uno de sus fragmentos divalentes de unión a antígeno caracterizado por que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4, 5 y 6; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 13, 11 y 14.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos anticuerpos que inhiben la dimerizacion de c-Met y sus utilizaciones.

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a nuevos anticuerpos que pueden unirse espedficamente al receptor de c-Met humano y/o que pueden inhibir espedficamente la actividad de tirosina cinasa del receptor, especialmente anticuerpos monoclonales de origen murino, quimerico y humanizado, as^ como las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos que codifican para estos anticuerpos. Mas particularmente, anticuerpos de acuerdo con la invencion pueden inhibir la dimerizacion de c-Met. La invencion igualmente comprende la utilizacion de estos anticuerpos como un medicamento para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de canceres o cualquier patologfa relacionada con la sobreexpresion del receptor, asf como en procesos o equipos para diagnostico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresion de c-Met. La invencion finalmente comprende productos y/o composiciones que comprenden estos anticuerpos, en combinacion con otros anticuerpos y/o compuestos qmmicos dirigidos contra otros factores de crecimiento involucrados en avance de tumor o metastasis y/o compuestos y/o agentes anticancengenos o agentes conjugados con toxinas y su uso para la prevencion y/o el tratamiento de ciertos canceres.

Antecedentes de la invencion

Los agentes dirigidos al receptor tirosina cinasa (RTK) tales como inhibidores trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, imatinib y gefitinib, han ilustrado el interes de dianizar esta clase de protema para tratamiento de canceres seleccionados.

El c-Met, es el miembro prototipo de una subfamilia de RTKs que tambien incluye RON y SEA. La familia c-Met RTK es estructuralmente diferente de otras familias RTK y es el unico receptor de alta afinidad conocido para factor de crecimiento de hepatocitos (HGF = Hepatocyte Growth Factor), tambien denominado factor de dispersion (SF = scater factor) [D.P. Bottaro et al, Science 1991, 251:802-804; L. Naldini et al, Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:28672878]. c-Met y HGF se expresan ampliamente en una variedad de tejidos y su expresion normalmente se restringe a celulas de origen epitelial y mesenquimal respectivamente [M. F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Ambos se requieren para un desarrollo normal de mairnfero y se ha mostrado que son particularmente importantes en migracion celular, diferenciacion morfogenica, y organizacion de las estructuras tubulares tridimensionales asf como crecimiento y angiogenesis [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Mientras que la regulacion controlada de c-Met y HGF se ha mostrado que es importante en el desarrollo, mantenimiento y reparacion de tejidos de mamfferos [Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh

J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2): 155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi

K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51], su desregulacion esta implicada en el avance de canceres.

La senalizacion aberrante dirigida por una activacion inapropiada de c-Met es una de las alteraciones mas frecuentes observadas en canceres de humanos y juega un papel crucial en tumorigenesis y metastasis [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915- 925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289- 300].

Una activacion c-Met inapropiada puede surgir por mecanismos dependientes e independientes de ligando, que incluye sobreexpresion de c-Met y/o activacion paracrina o autocrina o a traves de ganancia en mutacion de funcion [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Sin embargo una oligomerizacion de receptor c-Met, en presencia o en ausencia de ligando, se requiere para regular la afinidad de enlace y cineticas de enlace de la cinasa hacia ATP y sustratos peptido que contienen tirosina [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]. c-Met activado recluta efectores de senalizacion a su sitio de acoplamiento o conexion multiple ubicado en el dominio de citoplasma, resultando en la activacion de varias rutas de senalizacion clave, incluyendo Ras- MAPK, PI3K, Src y Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Estas rutas son esenciales para proliferacion de celulas de tumor, invasion y angiogenesis y para evadir apoptosis [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]. Ademas, una faceta unica de la senalizacion c-Met respecto a otra RTK es la interaccion de la que se ha informado con complejos de adhesion focal y asociados sin enlace a cinasa tales como a6p4 integrinas [Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R, Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals St, J Biol Chem. 1999, 274(10):6499-506], Plexina B1 o semaforinas [Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23:5131-7] que ademas pueden contribuir a la complejidad de regular la funcion celular por este receptor. Finalmente datos

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recientes demuestran que c-Met puede estar involucrado en resistencia a tumor de gefitinib o erlotinib, sugiriendo que la combinacion del compuesto que hace blanco a EGFR como c-Met puede ser de interes significativo [Engelman JA et al., Science, 2007, 3l6:1039-43].

En los ultimos anos recientes, muchas estrategias diferentes se han desarrollado para atenuar la senalizacion c-Met en lmeas celulares de cancer. Estas estrategias incluyen i) neutralizar anticuerpos contra c-Met o HGF/SF [Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] o el uso de antagonista HGF/SF NK4 para evitar enlace de ligando a c-Met [Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) inhibidores de sitio de enlace ATP pequenos a c-Met que bloquean actividad de cinasa [Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) polipeptido de dominio SH2 de ingeniena que interfiere con el acceso al sitio de acoplamiento o conexion multiple y ARNi (RNAi) o ribozima que reduce expresion de ligando o receptor. La mayona de estos enfoques exhiben una inhibicion selectiva de c-Met, resultando en inhibicion de tumor y mostrando que c-Met puede ser de interes para la intervencion terapeutica en cancer.

Dentro de las moleculas generadas para la dianizacion de c-Met, algunos son anticuerpos.

La mas extensamente descrita es el anticuerpo anti-c-Met 5D5 generado por Genentech [documento WO96/38557] que se comporta como un agonista potente cuando se agrega solo en diversos modelos y como un antagonista cuando se emplea como un fragmento Fab. Una forma de ingeniena monovalente de este anticuerpo descrita como 5D5 de un brazo (OA5D5) y producida como una protema recombinante en E. Coli, tambien es la materia de una solicitud de patente [documento WO2006/015371] por Genentech. Sin embargo, esta molecula que no puede considerarse como un anticuerpo debido a su particular adaptador, exhibe tambien mutaciones que pueden ser inmunogenicas en humanos. En terminos de actividad, esta molecula no glicosilada carece de funciones efectoras y finalmente no hay datos claros que demuestren que OA5D5 inhibe la dimerizacion de c-Met. Aun mas, cuando se prueba en el modelo in vivo g55, una lmea celular de glioblastoma que expresa c-Met pero no HGF mRNA y protema que se desarrolla indepenientmente del ligando, el anti-c-Met de un brazo no tiene efecto significante en crecimiento de tumor G55, sugiriendo que OA5D5 actua primordialmente al bloquear enlace HGF y no es capaz de dianizar tumores activados independientemente de HGF [Martens T. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144- 6152].

Otro anticuerpo que dianiza c-Met se describe por Pfizer como un anticuerpo que actua "predominantemente como un antagonista c-Met, y en algun caso o instancia como un agonista c-Met" [WO 2005/016382]. En esta solicitud no se describen datos que muestren efecto alguno de anticuerpos Pfizer en dimerizacion de c-Met.

Uno de los aspectos innovadores de la presente invencion es generar anticuerpos monoclonales de raton sin actividad agonista intrmseca e inhibir la dimerizacion de c-Met. Ademas de hacer blanco en tumores dependientes de ligando, este enfoque tambien deteriora activaciones independientes de ligando de c-Met debido a su sobreexpresion o mutaciones de los dominios intra celulares que quedan dependientes de oligomerizacion para senalizacion. Otro aspecto de la actividad de estos anticuerpos puede ser un impedimento esterico para interaccion c-Met con sus asociados, que resulta en deterioro de funciones c-Met. Estos anticuerpos seran humanizados y preferencialmente sometidos a ingeniena pero no limitados como IgG1 humano para obtener funciones efectoras tales como ADCC y CDC ademas de funciones enlazadas a bloqueo espedfico del receptor c-Met.

Exposicion de la invencion

De manera sorprende, por primera vez, los inventores han logrado generar un anticuerpo capaz de unirse a c-Met pero tambien capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met. Si es cierto que, en la tecnica anterior, en ocasiones se sugiere que puede ser interesante un anticuerpo capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met con sus asociados, nunca se ha descrito o sugerido claramente, un anticuerpo capaz de hacerlo. Aun mas, respecto a la especificidad de anticuerpo, no fue evidente por completo lograr la generacion de este anticuerpo activo.

Un primer aspecto se refiere a un proceso para la generacion y seleccion de anticuerpos como se divulga en la presente memoria.

Mas particularmente, se proporciona en la presente memoria un proceso para la seleccion de un anticuerpo anti c- Met, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, capaces de inhibir tanto activacion dependiente de ligando como independiente de ligando de c-Met, comprendiendo dicho proceso las siguientes etapas:

i) detectar los anticuerpos generados y seleccionar anticuerpos capaces de ligar espedficamente a c-Met;

ii) evaluar in vitro de los anticuerpos seleccionados de la etapa i) y seleccionar anticuerpos capaces de inhibir al menos 50%, de preferencia al menos 60%, 70% o 80% de proliferacion de celulas de tumor para al menos un tipo de tumor; y despues

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iii) someter a prueba los anticuerpos selectos de la etapa ii) y seleccionar anticuerpos capaces de inhibir la dimerizacion de c-Met.

Como se explico anteriormente, la inhibicion de la dimerizacion de c-Met es un aspecto capital ya que estos anticuerpos presentaran un interes real para una poblacion mas grande de pacientes. No solo cancer c-Met activado dependiente de ligando, como fue el caso anteriormente, sino tambien cancer c-Met activado independiente de ligando, pueden tratarse con anticuerpos generados por el presente proceso.

La generacion del anticuerpo puede lograrse por cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia, tal como por ejemplo fusion de una celula de mieloma con celulas de bazo de ratones inmunizados u otras especies compatible con las celulas de mieloma selectas [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Los animales inmunizados pueden incluir ratones transgenicos con sitios de inmunoglobulina humana que despues producen directamente anticuerpos humanos. Otra forma de realizacion posible puede consistir en utilizar tecnologfas de expresion en fago para cribas o detectar bibliotecas.

La etapa de deteccion i) puede lograrse por cualquier procedimiento o proceso conocido por el experto en la materia. Como ejemplos no limitativos pueden mencionarse ELISA, BIAcore, inmunohistoqmmica, analisis FACS y cribas funcionales. Un proceso preferido consiste en una criba por ELISA en la protema recombinante c-Met y despues por analisis FACS en al menos una lmea celular tumoral, para asegurarse que los anticuerpos producidos seran capaces de reconocer tambien el receptor nativo en celulas de tumor. Este proceso se describira en forma mas precisa en los siguientes ejemplos.

De la misma manera, la etapa ii) tambien puede lograrse en forma clasica por un procedimiento o proceso conocido tal como por ejemplo, utilizando 3H-timidina o cualquier otro agente de tincion de ADN, MTT, evaluacion ATP, etc. Un modelo de celulas de tumor preferido en la presente invencion puede consistir en el modelo BxPC3.

Al inhibir la dimerizacion de c-Met, debe entenderse preferentemente la homodimerizacion de c-Met.

En una forma de realizacion preferida de la etapa iii) de seleccion del presente proceso, consistiendo dicha etapa iii) consiste en evaluar anticuerpos por analisis BRET en celulas que expresan tanto c-Met-RLuc/c-Met-YFP y seleccionar anticuerpos capaces de inhibir al menos 30%, de preferencia 35%, 40%, 45%, 50%, 55% y mas preferible 60% de la senal BRET.

La tecnologfa BRET es una tecnologfa conocida como representativa de la dimerizacion de protema [Angers et al, PNAS, 2000, 97:3684-89].

La tecnologfa BRET, empleada en la etapa iii) del proceso, es bien conocida por el experto en la materia y sera detallada en los siguientes ejemplos. Mas particularmente, la Transferencia de Energfa por Resonancia Bioluminiscencia (BRET = Bioluminescence Resonance Energy Transfer) es una transferencia de energfa no radiante, que ocurre entre un donador bio luminiscente (Renilla Luciferasa (Rluc)) y un aceptor fluorescente, un mutante de Protema Fluorescente Verde (GFP = Green Fluorescent Protein) o Protema Fluorescente Amarilla (YFP = Yellow fluorescent protein). En el presente caso se empleo Protema Fluorescente Amarilla Mejorada (EYFP = Enhanced Yellow Fluorescent Protein). La eficacia de la transferencia depende de la orientacion y la distancia entre el donador y aceptor. Despues, la transferencia de energfa puede ocurrir solo si las dos moleculas estan en proximidad inmediata (1-10 nm). Esta propiedad se emplea para generar ensayos de interaccion protema-protema. Sin duda, a fin de estudiar la interaccion entre dos socios, el primero se fusiona geneticamente a la Renilla Luciferasa y el segundo al mutante amarillo de GFP. Protemas de fusion en general, pero no en forma obligatoria, se expresan en celulas de mairnfero. En la presencia de su sustrato permeable a membrana (coelenterazina), Rluc emite luz azul. Si el mutante GFP esta mas cercano a 10 nm de Rluc, puede ocurrir una transferencia de energfa y puede detectarse una senal amarilla adicional. La senal BRET se mide como la proporcion entre la luz emitida por el aceptor y la luz emitida por el donador. D esta manera, la senal BRET aumentara conforme las dos protemas de fusion se ponen en proximidad o si un cambio de conformacion lleva mas cerca a Rluc y mutante GFP.

Si el analisis BRET consiste en una forma de realizacion preferida, cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia puede emplearse para medir la dimerizacion de c-Met. Sin limitacion, pueden mencionarse las siguientes tecnologfas: FRET (Transferencia de Energfa por Fluorescencia Resonancia), HTRF (Fluorescencia con resolucion de tiempo homogenea), FLIM (Microscopfa de Formacion de Imagen por Vida Util de Fluorescencia) o SW-FCCS (Espectroscopfa de Correlacion cruzada de Fluorescencia de Longitud de Onda Sencilla).

Otras tecnologfas clasicas tambien pueden emplearse tales como Coinmunoprecipitacion, Alpha screen, Entrelazamiento qmmico, Doble-Hfbrido, Cromatograffa de Afinidad, ELISA o Transferencia Far western.

Un segundo aspecto se refiere a un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que se obtiene por el proceso. El anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados, es capaz de unirse espedficamente al c- Met humano y de ser necesario, aun mas de preferencia es capaz de inhibir la conexion natural de su HGF ligando

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y/o capaz de inhibir espedficamente la actividad de tirosina cinasa del c-Met, el anticuerpo tambien es capaz de inhibir dimerizacion de c-Met. Mas particularmente, los anticuerpos seran capaces de inhibir tanto activacion dependiente de ligando como independiente de ligando de c-Met.

Las expresiones "fragmentos y derivados funcionales" se definiran en detalle a continuacion en la presente memoria.

Debe apreciarse en la presente memoria que los anticuerpos no se encuentran en forma natural, es decir no estan en su ambiente natural pero deben ser capaces de ser aislados u obtenidos por purificacion de fuentes naturales, o de otra forma obtenidos por recombinacion genetica, o por smtesis qmmica, y que pueden contener aminoacidos no naturales como se describira adicionalmente.

Mas particularmente, segun otro aspecto, se reivindica un anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, caracterizandose el anticuerpo por que comprende cuando menos una region de determinacion de complementariedad de CDR seleccionada de CDRs que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID Nos. 1 a 17 y 56 a 61.

Cualquier anticuerpo, o fragmentos o derivados, que tienen al menos una CDR cuya secuencia tiene al menos 80% de identidad, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad, despues de alineamiento optimo con las secuencias SEC ID Nos. 1 a 17 y 56 a 61, debe entenderse como equivalente.

Por regiones CDR o CDR(s), se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas definidas por iMGT.

La numeracion unica de IMGT se ha definido para comparar los dominios variables cualquiera que sea el receptor de antfgeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. En la numeracion unica de IMGT, los aminoacidos conservados siempre tienen la misma posicion, por ejemplo cistema 23 (la-CYS), triptofano 41 (TRP- CONSERVADO), aminoacido hidrofobo 89, cistema 104 (2a-CYs), fenilalanina o triptofano 118 (J-PhE o J-TRP). La numeracion unica IMGT proporciona una delimitacion estandar de las regiones marco (FRl-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones de determinacion de complementariedad: CDRl-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Ya que los espacios representan posiciones no ocupadas, las longitudes CDR-IMGT (que se muestran entre (cuadrados) y separadas por puntos, por ejemplo [8.8.13]) devienen informacion crucial. La numeracion unica IMGT se emplea en representaciones graficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and mHc structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Existen CDR de tres cadenas pesadas y CDR de 3 cadenas ligeras. Los terminos CDR o CDRs se utilizan en la presente memoria para indicar, de acuerdo con el caso, una de las regiones o varias o incluso todas estas regiones que contienen la mayona de los residuos aminoacidos responsables por el enlace por afinidad del anticuerpo para el antfgeno o el epftopo que reconoce.

Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos en la presente memoria, se pretende indicar un porcentaje de nucleotidos o de residuos aminoacidos identicos entre las dos secuencias a comparar, obtenidos despues del mejor alineamiento (alineamiento optimo), este porcentaje es solamente estadfstico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen al azar y sobre toda la longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos, se llevan a cabo tradicionalmente al comparar estas secuencias despues de haberlas alineado en una forma optima, la comparacion es capaz de llevarse a cabo por segmento o por "ventana de comparacion". El alineamiento optimo de las secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo ademas de manualmente, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], mediante el algoritmo de homologfa local de Neddleman and Wunsch (1970) [J. MoI. Biol. 48: 443], mediante el procedimiento de busqueda de similaridad de Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), mediante soporte logico de computadora utilizando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o de otra forma por el programa para comparacion BLAST N o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos, se determina al comparar estas dos secuencias alineadas en una forma optima y en donde la secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos a comparar, puede comprender adiciones o deleciones respecto a la secuencia de referencia para un alineamiento optimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula al determinar el numero de posiciones identicas para las cuales el residuo nucleotido o aminoacido es identico entre las dos secuencias, al dividir este numero de posiciones identicas por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y al multiplicar el resultado obtenido por 100, a fin de obtener el por ciento de identidad entre estas dos secuencias.

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Por ejemplo, es posible utilizar el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, los parametros empleados son aquellos dados por valor predefinido (en particular para los parametros "open gap penalty": 5, y "extension gap penalty": 2; la matriz seleccionada por ejemplo, es la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar se calcula directamente por el programa.

Por secuencia de aminoacidos que tienen al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoacido de referencia, aquellos que tienen con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una delecion, adicion o sustitucion de al menos un aminoacido, un truncado o una elongacion, se prefieren. En el caso de una sustitucion de uno o mas aminoacidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en donde los aminoacidos sustituidos se reemplazan por aminoacidos "equivalentes". La expresion "aminoacidos equivalentes" se utiliza en la presente memoria para indicar cualquier aminoacido capaz de sustituirse con uno de los aminoacidos de la estructura base, sin embargo, sin que modifique esencialmente las actividades biologicas de los anticuerpos correspondientes y como se definira posteriormente, en especial en los ejemplos. Estos aminoacidos equivalentes pueden determinar ya sea al basarse en su homologfa estructural con los aminoacidos que reemplazan, o a los resultados de pruebas comparativas de actividad biologica entre los diferentes anticuerpos capaces de llevarse a cabo.

A tttulo de ejemplo, se hace mencion de las posibilidades de sustitucion capaz de llevarse a cabo sin resultar en una modificacion profunda de la actividad biologica del anticuerpo modificado correspondiente.

Como ejemplo no limitativo, la siguiente tabla 1 proporciona posibilidades de sustitucion concebibles con una conservacion de la actividad biologica del anticuerpo modificado. Las sustituciones inversas tambien por supuesto son posibles en las mismas condiciones.

Tabla 1

Residuo original

Sustitucion

Ala (A)

Val, Gly, Pro

Arg (R)

Lys, His

Asn(N)

Gln

Asp(D)

Glu

Cys(C)

Ser

Gln (Q)

Asn

Glu (G)

Asp

Gly (G)

Ala

His (H)

Arg

Ile (I)

Leu

Leu (L)

Ile, Val, Met

Lys (K)

Arg

Met (M)

Leu

Phe (F)

Tyr

Pro (P)

Ala

Ser (S)

Thr, Cys

Thr (T)

Ser

Trp (W)

Tyr

Tyr (Y)

Phe, Trp

Val (V)

Leu, Ala

De acuerdo con un primer enfoque, el anticuerpo se definira por su secuencia de cadena pesada. Mas particularmente, el presente anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza porque comprende una cadena pesada que comprende cuando menos un CDR seleccionado de CDRs que comprenden las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 1 a 9 y 56 a 58.

Las secuencias mencionadas son las siguientes:

SEC ID No. 1: GYIFTAYT SEC ID No. 2: IKPNNGLA SEC ID No. 3: ARSEITTEFDY SEC ID No. 4: GYSFTDYT SEC ID No. 5: INPYNGGT SEC ID No. 6: AREEITKDFDF

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SEC ID No. 7: GYTFTDYN

SEC ID No. 8: INPNNGGT

SEC ID No. 9: ARGRYVGYYYAMDY

SEC ID No. 56: GYTFTSYW

SEC ID No. 57: INPTTGST

SEC ID No. 58: AIGGYGSWFAY

Las CDR de la cadena pesada pueden seleccionarse al azar en las secuencias previas, es decir SEC ID Nos. 1 a 9 y 56 a 58.

Segun un aspecto preferido, el presente anticuerpo, o uno de sus fragmented o derivados funcionales, comprende una cadena pesada que comprende cuando menos un CDR seleccionado de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde:

- CDR-H1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 1,4, 7 o 56,

- CDR-H2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 2, 5, 8 o 57 y

- CDR-H3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 3, 6, 9 o 58.

Segun una primera forma de realizacion de dicho aspecto, el presente anticuerpo, o uno de sus fragmentos o

derivados funcionales, comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde CDR-H1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 1, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 2 y CDR-H3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 3.

Mas particularmente, dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales de acuerdo con esta primera forma de realizacion comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 18.

SEC ID No. 18:

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQKFKGKATLTVDKSSS

TAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSEITTEFDYWGQGTALTVSS

Segun una segunda forma de realizacion de dicho aspecto, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en el que CDR-H1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 5 y CDR-H3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 6.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, segun dicha segunda forma de realizacion comprendera preferentemente una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 19.

SEC ID No. 19:

EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTLNWVKQSHGKTLEWIGLINPYNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSS

TAYMELLSLTSEDSAVYYCAREEITKDFDFWGQGTTLTVSS

Segun una tercera forma de realizacion de dicho aspecto, el presente anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde CDR-H1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 7, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 8 y CDR-H3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 9.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales segun dicha tercera forma de realizacion comprendera preferentemente una cadena pesada de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 20.

SEC ID No. 20:

EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGMSLEWIGDINPNNGGTIFNQKFKGKATLTVDKSSS

TAYMELRSLTSEDTAVYYCARGRYVGYYYAMDYWGQGTSVTVSS

Segun una cuarta forma de realizacion dicho aspecto, el presente anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde CDR-H1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 56, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 57 y CDR-H3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 58.

El anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales segun dicha cuarta forma de realizacion comprendera preferentemente una cadena pesada de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 62.

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SEC ID No. 62:

QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGYINPTTGSTDYNQKLKDKATLTADKS

SNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIGGYGSWFAYWGQGTLVTVSA

En un segundo enfoque, el anticuerpo se definira a continuacion por su secuencia de cadena ligera. Mas particularmente, segun un segundo aspecto particular, el presente anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza por que comprende una cadena ligera que comprende al menos un CDR seleccionado de CDRs que comprende las secuencias aminoacidos SEC ID Nos. l0 a 17 y 59 a 61.

Las secuencias mencionadas son las siguientes:

SEC ID No. 10: ESVDSYANSF

SEC ID No. 11: RAS

SEC ID No. 12: QQSKEDPLT

SEC ID No. 13: ESIDTYGNSF

SEC ID No. 14: QQSNEDPFT

SEC ID No. 15: ENIYSN

SEC ID No. 16: AAT

SEC ID No. 17: QHFWGPPYT

SEC ID No. 59: SSVSSTY

SEC ID No. 60: TTS

SEC ID No. 61: HQWSSYPFT

Las CDR de la cadena ligera pueden seleccionarse al azar en las secuencias previas, es decir SEC ID Nos. 10 a 17 y 59 a 61.

Segun otro aspecto preferido, el presente anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena ligera que comprende al menos una cDr seleccionada de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en donde:

- CDR-L1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 10, 13, 15 o 59,

- CDR-L2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 11, 16 o 60, y

- CDR-L3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 12, 14, 17 o 61.

Segun una primera forma de realizacion de dicho otro aspecto, el presente anticuerpo de la invencion, o uno de sus

fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR-L1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 10, CDR-L2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 11 y CDR-L3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 12.

Mas particularmente, dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales segun esta primera forma de realizacion comprende una cadena ligera de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 21.

SEC ID No. 21:

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTI NPVEADDVATYYCQQSKE DPLTFGSGTKLEMK

Segun una segunda forma de realizacion de dicho otro aspecto, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR-L1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 13, CDR-L2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 11 y CDR-L3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 14.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, segun dicha segunda forma de realizacion comprendera preferentemente una cadena ligera de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 22.

SEC ID No. 22:

GIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRVSESIDTYGNSFIHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTIN PVEADDSATYYCQQSNEDPF TFGSGTKLEMK

Segun una tercera forma de realizacion dicho otro aspecto, el presente anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR- L1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 15, CDR-L2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 16 y CDR-L3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 17.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales segun dicha tercera forma de realizacion comprendera preferentemente una cadena ligera de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC

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ID No. 23.

SEC ID No. 23:

DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLVDGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSL QSEDFGSYYCQHFWGPPYTF GGGTKLEIK

Segun una cuarta forma de realizacion de dicho otro aspecto, el presente anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR-L1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 59, CDR-L2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 60 y CDR-L3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 61.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, segun dicha tercera forma de realizacion comprendera preferentemente una cadena ligera de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 63.

SEC ID No. 63:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSTYLYWYQQKPGSSPKLWIYTTSILASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSM

ETEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLDIK

Segun un tercer enfoque, el anticuerpo se definira a continuacion tanto por su secuencia de cadenas ligeras como su secuencia de cadenas pesadas. El presente anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza por que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 18, 19, 20 o 62 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 21,22, 23 o 63.

Mas particularmente, un anticuerpo preferido, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, denominado 224G11, comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprende respectivamente la secuencia de aminoacidos SEC ID Nos. 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID Nos. 10, 11 y 12.

En otro aspecto de la invencion, el anticuerpo 224G11 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 18 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 21.

Otro anticuerpo preferido, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la invencion, denominado 227H1, que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprende respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 4, 5 y 6; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 13, 11 y 14.

En otro aspecto, el anticuerpo 227H1 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 19 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 22.

Todavfa otro anticuerpo preferido, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, denominado 223C4, que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprende respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 7, 8 y 9; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 15, 16 y 17.

En otro aspecto, el anticuerpo 223C4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 20 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 23.

Todavfa otro anticuerpo preferido, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales denominado 11E1, que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, que comprende respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 56, 57 y 58; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR- L3, que comprende respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID Nos. 59, 60 y 61.

En otro aspecto, el anticuerpo 11E1 comprende una cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 62 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID No. 63.

Otro aspecto se refiere a hibridoma murino capaz de secretar los presentes anticuerpos monoclonales, en especial hibridoma de origen murino tal como el depositado en la Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) (Institut Pasteur, Pans, Francia).

Los anticuerpos monoclonales, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, estan caracterizados por que dichos anticuerpos son secretados por el hibridoma depositado en la CNCM en 03/14/2007 con los numeros CNCm I-3724 (correspondiente a 11E1), I-3731 (correspondiente a 224G11), I-3732 (correspondiente a 227H1) y en 07/06/2007 con el numero I-3786 (correspondiente a 223C4). Estos hibridomas consisten en un hibridoma murino que da como resultado la fusion celular de esplenocitos de raton inmunizado con una estirpe celular de mieloma

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(Sp20 Agl4).

La siguiente tabla 2 reagrupa elementos referentes a los anticuerpos preferidos. Tabla 2

224G11 227H1 223C4 11E1

1-3731 1-3732 1-3786 1-3724

Prot. Nucl. Prot. Nucl. Prot. Nucl. Prot. Nucl.

SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID

CDR-H1

1 24 4 27 7 30 56 64

CDR-H2

2 25 5 28 8 31 57 65

CDR-H3

3 26 6 29 9 32 58 66

Cadena H

18 41 19 42 20 43 62 70

CDR-L1

10 33 13 36 15 38 59 67

CDR-L2

11 34 11 34 16 39 60 68

CDR-L3

12 35 14 37 17 40 61 69

Cadena L

21 44 22 45 23 46 63 71

A partir de la tabla 2, es claro que CDR-L2 de los anticuerpos 227H1 y 224G11 es similar. Este ejemplo claramente soporta las reivindicaciones de la presente solicitud que cubre anticuerpos que comprende al menos una CDR seleccionada al azar a traves de las secuencias CDR descritas.

De acuerdo con una forma de realizacion preferida, la invencion se refiere a anticuerpos monoclonales.

El termino "Anticuerpo Monoclonal" o se utiliza de acuerdo con su significado ordinario para denotar un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos excepto por mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal consiste en un anticuerpo homogeneo que resulta de la proliferacion de un solo clon de celulas (por ejemplo, celulas de hibridoma, celulas hospedadoras eucarioticas transfectadas con ADN que codifica el anticuerpo homogeneo, celulas hospedadoras procarioticas transformadas con ADN que codifica el anticuerpo homogeneo, etc.), y que en general se caracteriza por cadenas pesadas de una sola clase y subclase, y cadenas ligeras de un solo tipo. Anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, dirigidos contra un solo antigeno. Ademas, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que tfpicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes o epttopo, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antfgeno.

En la presente descripcion, los terminos polipeptidos, secuencias polipeptido, secuencias de aminoacidos, peptidos y protemas conectados a compuestos de anticuerpo o sus secuencias, son intercambiables.

Un aspecto igualmente particular se refiere a un anticuerpo quimerico, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque el anticuerpo aun mas comprende las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heterologa al raton, en especial humano, y en una forma preferida en que las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano, respectivamente son la region kappa y gamma-1 , gamma-2 o gamma-4.

En la presente solicitud, IgG1 se prefieren para obtener funciones efectoras y mas preferiblemente ADCC y CDC.

El experto en la materia apreciara que funciones efectoras incluyen por ejemplo enlace C1q; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); enlace receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; y regulacion a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de celula B; bCr).

Los anticuerpos segun la presente invencion son preferentemente anticuerpos monoclonales espedficos, en especial de origen murino, quimerico o humanizado, que pueden obtenerse de acuerdo con metodos estandar bien conocidos por el experto en la materia.

En general, para la preparacion de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos o derivados funcionales, en especial de origen murino, es posible referirse a tecnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o la tecnica de preparacion a partir de hibridomas descrita por Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los presentes anticuerpos monoclonales pueden obtenerse, por ejemplo a partir de celulas de animales inmunizadas contra c-Met, o uno de sus fragmentos que contiene el epttopo espedficamente reconocido por los anticuerpos monoclonales. c-Met o uno de sus fragmentos, puede producirse especialmente de acuerdo con los

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metodos de trabajo usuales, por recombinacion genetica partiendo con una secuencia de acidos nucleicos contenida en la secuencia ADNc (cADN) que codifica por c-Met o por smtesis de peptido partiendo de una secuencia de aminoacidos comprendida en la secuencia de peptido de c-Met.

Los anticuerpos monoclonales por ejemplo pueden purificarse en una columna de afinidad en la que c-Met o uno de sus fragmentos que contiene el epftopo reconocido espedficamente por los anticuerpos monoclonales ha sido previamente inmovilizado. Mas particularmente, los anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por cromatograffa en protema A y/o G, seguido o no seguido por cromatograffa de intercambio de iones dirigida a eliminar los contaminantes de protema residuales asf como ADN y los LPS, por sf mismos seguido o no seguido por cromatograffa de exclusion en gel de SepharoseMR a fin de eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dfmeros o de otros mulffmeros. En una forma aun mas preferida, todas estas tecnicas pueden emplearse en forma simultanea o sucesiva.

Los anticuerpos quimericos o humanizados igualmente se incluyen en los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion.

Por anticuerpo quimerico, se pretende indicar un anticuerpo que contiene una region variable natural (cadena ligera y cadena pesada), derivada de un anticuerpo de una especie determinada, en combinacion con regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heterologa a la especie determinada (por ejemplo raton, caballo, conejo, perro, vaca, pollo, etc.).

Los anticuerpos o sus fragmentos de tipo quimerico, pueden prepararse al utilizar las tecnicas de recombinacion genetica. Por ejemplo, el anticuerpo quimerico puede producirse al clonar un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la region variable de un anticuerpo monoclonal no-humano, especialmente murino y una secuencia que codifica la region constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimerico codificado por este gen recombinante, por ejemplo sera una quimera raton-humano, la especificidad de este anticuerpo se determina por la region variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la region constante derivada del ADN humano. Para los metodos de preparacion de anticuerpos quimericos, es posible por ejemplo referirse al documento Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:685l-6855, 1984) o la patente US n° 4.816.567.

Por anticuerpo humanizado, se pretende hacer referencia a un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molecula de anticuerpo se derivan de uno (o varios) anticuerpos humanos. Aun mas, algunos de los residuos de los segmentos del esqueleto (denominado FR) pueden modificarse a fin de conservar la afinidad del enlace (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Los anticuerpos humanizados de acuerdo con la invencion o sus fragmentos, pueden prepararse por tecnicas conocidas por el experto en la materia (tal como por ejemplo, aquellos descritos en los documentos de Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).

Otros metodos de humanizacion se conocen por el experto en la materia, por ejemplo el procedimiento de "injerto de CDR" (CDR Grafting) por Protein Design Lab (PDL) en las solicitudes de patente Ep 0 451261, EP 0 682 040, EP 0 9127, EP 0 566 647 o patentes US n° 5,530,101, 6.180.370, 5.585.089 y 5.693.761. Las siguientes patentes tambien pueden mencionarse: US n° 5.639.641; US n° 6.054.297; US n° 5.886.152 y US n° 5.877.293.

Por "fragmento funcional" de un anticuerpo, se pretende en la presente memoria indicar en particular un fragmento de anticuerpo, tal como Fv, scFv (sc para cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', fragmentos o diacuerpos scFv-Fc, o cualquier fragmento del cual el tiempo de vida media se ha incrementado por modificacion qmmica, tal como la adicion de poli(alquilen) glicol tal como poli(etilen) glicol ("modificacion con polietilen glicol o PEG-ilacion") (fragmentos modificados con polietilen glicol denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" por Poli(Etilen) Glicol), o por incorporacion en un liposoma, los fragmentos tienen al menos una de las CDRs caractensticas de las secuencias SEC ID Nos. 1 a 17 y 56 a 61, y en especial porque es capaz de ejercer de manera general, una actividad incluso parcial del anticuerpo del cual desciende, tal como en particular la capacidad por reconocer y ligar a c-Met, y de ser necesario inhibir la actividad de c-Met.

Preferentemente dichos fragmentos funcionales estaran constituidos o comprenderan una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual se derivan, la secuencia parcial es suficiente para retener la misma especificidad de enlace que el anticuerpo del cual desciende y una afinidad suficiente, de preferencia al menos igual a 1/100, en una forma mas preferida de al menos 1/10, del anticuerpo del cual desciende, con respecto a c-Met. Este fragmento funcional contendra por lo menos 5 aminoacidos de preferencia 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 y 100 aminoacidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual desciende.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales seran fragmentos del tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, que en general tienen la misma especificidad de enlace que el anticuerpo del cual descienden. En una

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forma de realizacion mas preferida estos fragmentos se eligen entre fragmentos divalentes tales como fragmentos F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse partiendo de anticuerpos tal como se describio anteriormente por metodos tales como digestion por enzimas, tales como pepsina o papama y/o por rompimiento de los puentes disulfuro por reduccion qmmica. De otra manera, los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse por tecnicas de recombinacion genetica igualmente bien conocidas por el experto en la materia o de otra forma por smtesis de peptido mediante por ejemplo sintetizadores de peptido automaticos tales como aquellos suministrados por la companfa Applied Biosystems, etc.

Por "fragmento divalente", habra de entenderse cualesquiera fragmentos de anticuerpo que comprenden dos brazos y mas particularmente fragmentos F(ab')2.

Mas particularmente, la invencion comprende los presentes anticuerpos o sus fragmentos funcionales en especial anticuerpos quimericos o humanizados, obtenidos por recombinacion genetica o por smtesis qmmica.

Por "derivados" de un anticuerpo, se entiende en la presente memoria una protema de enlace que comprende un andamio o adaptador de protema y al menos una de las CDRs seleccionadas del anticuerpo original, a fin de mantener la capacidad de enlace. Estos compuestos son bien conocidos por el experto en la materia y se describiran con mayor detalle en la siguiente especificacion.

Mas particularmente, el presente anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza por que dicho derivado consiste en una protema de enlace que comprende un andamio o adaptador en el que al menos una CDR se ha insertado para la conservacion de las propiedades de reconocimiento paratopicas del anticuerpo original.

Una o varias secuencias a traves de las 6 secuencias CDR descritas en la presente memoria, pueden presentarse en un andamio o adaptador de protema. En este caso, el andamio de protema reproduce la estructura principal de protema con plegado apropiado de las CDR(s) insertadas, de esta manera permitiendole (o permitiendoles) mantener sus propiedades de reconocimiento paratopicas de antfgeno.

El experto en la materia sabe como seleccionar el andamio de protema en el que puede injertarse al menos una CDR seleccionada del anticuerpo original. Mas particularmente, se conoce que, para seleccionarse, este andamio debera exhibir varias caractensticas como sigue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187):

- buena conservacion filogenetica,

- arquitectura robusta con una organizacion molecular tri-dimensional bien conocida (tal como por ejemplo, cristalograffa o RMN),

- tamano pequeno,

- sin o solo bajo grado de modificaciones post-traduccion,

- facil de producir, expresar y purificar.

Este andamio de protema puede ser, pero sin limitacion, una estructura seleccionada del grupo que consiste de fibronectina y de preferencia el decimo dominio tipo fibronectina III (FNfn10), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), el derivado de protema Z del dominio B de la protema de estafilococo A, tioredoxina A o cualquier protema con dominio repetido tal como "repeticion de anquirina" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "repeticion armadillo", "repeticion rica en leucina" o "repeticion de tetratricopeptido".

Tambien puede mencionarse derivado de andamio de toxinas (tal como por ejemplo, de toxinas de escorpion, de insectos, plantas o moluscos) o inhibidores de protema de oxido mtrico sintasa neuronal (PIN).

Como un ejemplo no limitativo de estas construcciones hteridas, puede mencionarse la insercion del CDR-H1 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-CD4, es decir el anticuerpo 13B8.2, en uno del bucle expuesto de PIN. Las propiedades de enlace de la protema de enlace obtenida permanecen similares al anticuerpo original (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). Tambien puede mencionarse el injerto de CDR-H3 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-lizozima VHH en un bucle de neocarzinostatina (Nicaise et al., 2004).

En el presente caso, una CDR interesante para conservar puede ser, sin limitacion la CDR-L2 como se conserva en dos anticuerpos identificados descritos en la presente memoria, es decir 227H1 y 224G11.

Como se menciono anteriormente, este andamio de protema puede comprender de 1 a 6 CDR(s) del anticuerpo original. En una forma de realizacion preferida, pero sin limitacion alguna, el experto en la materia seleccionara al menos una CDR de la cadena pesada, la cadena pesada se conoce particularmente implicada en la especificidad de anticuerpo. La seleccion de las CDR(s) de interes sera evidente para el experto en la materia con metodos

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conocidos (BES et al, FEBS letters 508, 2001, 67-74).

Como una evidencia, estos ejemplos no son limitativos y cualquier otro andamio conocido o descrito, debera ser incluido en la presente memoria.

De acuerdo con un nuevo aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico aislado, caracterizado por que se selecciona de entre los siguientes acidos nucleicos:

a) un acido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la invencion;

b) un acido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo de secuencias que consiste en:

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias

SEC ID n° CM SEC ID n° 25, SEC ID n° CD CM y las

secuencias SEC ID n° 33, SEC iD n° 34 y SEC ID n° 35;

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias

SEC ID n° 27, SEC ID n° 28, SEC ID n° 29 y las

secuencias SEC ID n° 36, SEC iD n° 34 y SEC ID n° 37;

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias

SEC ID n° 30, SEC ID n° 31, SEC ID n° 32 y las

secuencias SEC ID n° 38, SEC ID n° 39 y SEC ID n° 40;

y

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias

SEC ID n° 64, SEC ID n° 65, SEC ID n° 66 y las

secuencias SEC ID n° 67, SEC iD n° 68 y SEC ID n° 69;

c) un acido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada de

entre el grupo de secuencias que

consiste en:

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias SEC ID n° 41 y SEC ID n° 44;

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias SEC ID n° 42 y SEC ID n° 45;

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias SEC ID n° 43 y SEC ID n° 46; y

- una secuencia nucleica que comprende las secuencias SEC ID n° 70 y SEC ID n° 71;

d) los correspondientes acidos nucleicos de ARN de los acidos nucleicos segun lo definido en b) o c);

e) los acidos nucleicos complementarios de los acidos nucleicos segun lo definido en a), b) y c); y

f) un acido nucleico de por lo menos 18 nucleotidos apto para hibridar en condiciones de elevada severidad con por lo menos una de las CDR de secuencias SEC ID n° 24 a 40 y 64 a 69.

Por acido nucleico, secuencia nucleica o de acido nucleico, polinucleotido, oligonucleotido, secuencia de polinucleotidos, secuencia de nucleotidos, terminos que se emplearan en forma indiferente en la presente memoria, se pretende indicar un enlace de nucleotidos preciso que esta o no modificado, permitiendo que se defina un fragmento o una region de un acido nucleico, que contiene o no contiene nucleotidos no naturales, y capaces de corresponder por igual a un ADN de doble hebra, un ADN de hebra sencilla a los productos de transcripcion de los ADN.

Tambien habra de apreciarse en la presente memoria que las presentes secuencias nucleotidas no se encuentran en su ambiente cromosomal natural, es decir en el estado natural. Se refiere a secuencias que se han aislado y/o purificado, es decir, que se han seleccionado en forma directa o indirecta por ejemplo por copia, su ambiente ha sido al menos parcialmente modificado. De esta manera igualmente se pretende que indique en la presente memoria los acidos nucleicos aislados obtenidos por recombinacion genetica, por ejemplo mediante celulas hospedadoras obtenidas por smtesis qmmica.

Una hibridizacion bajo condiciones de alta severidad, significa que se eligen las condiciones de temperatura y concentracion ionica de manera tal que permitan el mantenimiento de la hibridizacion entre dos fragmentos de ADN complementario. A manera de ilustracion, las condiciones de alta severidad de la etapa de hibridizacion para propositos de definir los fragmentos polinucleotidos descritos anteriormente, son ventajosamente las siguientes.

La hibridizacion ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridizacion a 42 grados C por 3 horas en amortiguador fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC que corresponde a una solucion de NaCl 0.15 M + citrato de sodio 0.015 m), 50% de formamida, 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 10 x Denhardt, 5% de dextran sulfato y 1% de ADN de esperma de salmon; (2) hibridizacion actual por 20 horas a una temperatura que depende del tamano de la sonda (es decir: 42 grados C, para un tamano de sonda > 100 nucleotidos) seguido por 2 lavados de 20 minutos a 20 grados C en 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20 grados C en 0.1 x SSC

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+ 0.1% de SDS. El ultimo lavado se lleva a cabo en 0.1 x SSC + 0.1% de SDS por 30 minutos a 60 grados C para un tamano de sonda > 100 nucleotidos. Las condiciones de hibridizacion de alta severidad descritas anteriormente para un polinucleotido de tamano definido, pueden adaptarse por el experto en la materia para oligonucleotidos de tamano mayor o menor, de acuerdo con las ensenanzas de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

La invencion igualmente se refiere a un vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con la presente invencion.

La invencion se refiere especialmente a vectores de expresion y/o clonacion que contienen una secuencia de nucleotidos descritos anteriormente.

Los vectores contienen preferentemente unos elementos que permiten la expresion y/o secrecion de las secuencias de nucleotidos en una celula hospedadora determinada. El vector por lo tanto debe contener un promotor, senales de inicio y terminacion de traduccion, asf como regiones apropiadas de regulacion de transcripcion. Debe ser capaz de mantenerse en una forma estable en la celula hospedadora y opcionalmente tener senales particulares que especifican la secrecion de la protema traducida. Estos diferentes elementos se eligen y optimizan por el experto en la materia, como una funcion de la celula hospedadora empleada. Para este efecto, las secuencias de nucleotido de acuerdo con la invencion pueden insertarse en vectores de replicacion autonomos en el hospedador selecto o ser vectores integrales del hospedador selecto.

Estos vectores se preparan por metodos actualmente empleados por el experto en la materia, y los clones resultantes pueden introducirse en un hospedador apropiado por metodos estandar, tales como lipofeccion, electroporacion, choque termico, o metodos qmmicos.

Los presentes vectores por ejemplo son, vectores de origen plasmido o viral. Son utiles para transformar celulas hospedadoras a fin de clonar o expresar las secuencias de nucleotido de acuerdo con la invencion.

La invencion igualmente comprende las celulas hospedadoras transformadas por o que comprenden un vector como se describe anteriormente.

La celula hospedadora puede seleccionarse de sistemas procarioticos o eucarioticos, por ejemplo celulas bacterianas pero igualmente celulas de levadura o celulas de animales, en particular celulas de mairnfero. Igualmente es posible utilizar celulas de insecto o celulas de plantas.

Se divulgan asimismo animales, excepto hombres, que comprenden al menos una celula transformada de acuerdo con la invencion.

En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un proceso para la produccion de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invencion, estando dicho proceso caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una celula hospedadora de acuerdo con la invencion; y

b) la recuperacion de los anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de esta manera, partiendo del medio de cultivo o las celulas cultivadas.

Las celulas transformadas como se describe anteriormente pueden utilizarse en procesos para preparacion de polipeptidos recombinantes de acuerdo con la invencion. Los procesos para preparacion de un polipeptido de acuerdo con la invencion, en forma recombinante, se caracterizan porque emplean un vector y/o una celula transformada por dicho vector, los mismos son comprendidos en la presente invencion. De preferencia, se recupera una celula transformada por un vector, se cultiva bajo condiciones que permiten la expresion del polipeptido y el peptido recombinante.

Como se ha dicho, la celula hospedadora puede seleccionarse de sistemas procarioticos o eucarioticos. En particular, es posible identificar secuencias nucleotido, facilitando la secrecion en dicho sistema procariotico o eucariotico. Un vector que transporta dicha secuencia, por lo tanto puede ser empleado ventajosamente para la produccion de protemas recombinantes, pretendidas para secretarse. En efecto, la purificacion de estas protemas recombinantes de interes se facilitara por el hecho de que estan presentes en el sobrenadante del cultivo celular en vez de en el interior de las celulas hospedadoras.

Igualmente es posible preparar los presentes polipeptidos por smtesis qmmica. Este proceso de preparacion igualmente es un objeto de la divulgacion. El experto en la materia conoce los procesos de smtesis qmmica, por ejemplo las tecnicas que emplean fases solidas [Steward et al, 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)] o tecnicas que utilizan fases solidas parciales, al condensar fragmentos o

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por smtesis clasica en solucion. Los polipeptidos obtenidos por smtesis qmmica y capaces de contener aminoacidos no naturales correspondientes, igualmente estan comprendidos en la divulgacion.

Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, capaces de obtenerse por un proceso de acuerdo con la invencion estan asimismo comprendidos en la presente invencion.

La invencion tambien se refiere al presente anticuerpo como un medicamento.

La invencion se refiere asimismo a una composicion farmaceutica que comprende a manera de principio activo, un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invencion, de preferencia en mezcla con un excipiente y/o un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

Otra forma de realizacion complementaria de la invencion consiste en una composicion tal como se describio anteriormente, que comprende aun mas, como un producto de combinacion para uso simultaneo, separado o secuencial, un anticuerpo antitumoral.

Mas preferentemente, dicho segundo anticuerpo anti-tumoral puede seleccionarse a traves de anti-IGF-IR, anti- EGFR, anti-HER2/neu, anti-VEGFR, anti-VEGF, etc., anticuerpos o cualesquiera otros anticuerpos anti-tumorales conocidos por el experto en la materia. Resulta evidente que la utilizacion, como segundo anticuerpo, de fragmentos o derivados funcionales de los anticuerpos anteriormente mencionados forma parte de la invencion.

Como un anticuerpo mas preferido, se eligen anticuerpos anti-EGFR tal como por ejemplo del anticuerpo C225 (Erbitux).

"Uso simultaneo" se entiende que significa la administracion de los dos compuestos de dicha composicion en una forma farmaceutica sencilla e identica.

"Uso separado" se entiende que significa la administracion, al mismo tiempo de los dos compuestos de dicha composicion en formas farmaceuticas distintas.

"Uso secuencial" se entiende que significa la administracion sucesiva de los dos compuestos de dicha composicion, cada uno en una forma farmaceutica distinta.

De manera general, la composicion de acuerdo con la invencion aumenta considerablemente la eficacia del tratamiento de cancer. En otras palabras, el efecto terapeutico de los presentes anticuerpos anti-c-Met, se potencia de manera inesperada por la administracion de un agente citotoxico. Otra ventaja subsecuente mayor producida por dicha composicion, se refiere a la posibilidad de utilizar dosis eficaces inferiores de principio activo, que permiten evitar o reducir los riesgos de aparicion de efectos secundarios, en particular los efectos de agente citotoxico.

Ademas, esta composicion permitira que se alcance mas rapidamente el efecto terapeutico esperado.

La composicion de la invencion tambien puede caracterizarse por que comprende, aun mas, como un producto de combinacion para uso simultaneo, separado o secuencial, un agente citotoxico/citostatico.

Por "agentes terapeuticos anticancengenos" o "agentes citotoxicos/citostaticos", se pretende una sustancia que cuando se administra a un sujeto, trata o evita el desarrollo de cancer en el cuerpo del sujeto. Como ejemplos no limitantes de estos agentes, pueden mencionarse agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos antitumorales, inhibidores mitoticos, inhibidores de funcion de cromatina, agentes antiangiogenesis, anti-strogenos, antiandrogenos o inmunomoduladores.

Estos agentes por ejemplo se citan en la edicion 2001 de VIDAL, en la pagina dedicada a los compuestos agregados a la columna de oncologfa y hematologfa "Citotoxicos" (Citotoxics), estos compuestos citotoxicos citados haciendo referencia a este documento, se mencionan en la presente memoria como agentes citotoxicos preferidos.

Mas particularmente, los agentes siguientes son preferidos segun la invencion.

"Agente alquilante" se refiere a cualquier sustancia que puede entrelazar o alquilar cualquier molecula, de preferencia acido nucleico (por ejemplo, ADN), dentro de una celula. Ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostaza de nitrogeno, tales como mecloretamina, clorambucol, melfalan, clorhidrato, pipobromen, prednimustina, fosfato disodico o estramustina; oxazoforinas tales como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida o ifosfamida; aziridinas o imino-etilenos tales como tiotepa, trietilenamina o altetramina; nitrosourea tal como carmustina, estreptozocina, fotemustina o lomustina; alquil-sulfonatos tales como busulfan, treosulfan o improsulfan; triazenos tales como dacarbazina; o complejos de platino tales como cis-platino, oxaliplatina y carboplatina.

"Antimetabolitos" se refiere a sustancias que bloquean el crecimiento celular y/o metabolismo, al interferir con ciertas actividades, usualmente smtesis de ADN. Ejemplos de antimetabolitos incluyen metotrexato, 5-fluoruracilo,

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floxuridina, 5-fluorodeoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, citosina arabinosida, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, deoxicoformicina y pentostatina.

"Antibioticos antitumorales" se refieren a compuestos que pueden evitar o inhibir smtesis de ADN, ARN y/o de protemas. Ejemplos de antibioticos antitumorales incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, valrrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina y procarbazina.

"Inhibidores mitoticos" evitan el avance normal del ciclo celular y mitosis. En general, inhibidores de microtubulos o taxoides tales como paclitaxel y docetaxel, son capaces de inhibir la mitosis. Vinca alcaloides tales como vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina tambien son capaces de inhibir la mitosis.

"Inhibidores de funcion de cromatina" o "inhibidores de topoisomerasa" se refieren a sustancias que inhiben la funcion normal de protemas que modelan cromatina tales como topoisomerasa I o topoisomerasa II. Ejemplos de inhibidores de funcion de cromatina incluyen para topoisomerasa I, camptotecina y sus derivados tales como topotecan o irinotecan, y para topoisomerasa II, etoposido, etoposido fosfato y teniposido.

"Agente antiangiogenesis" se refiere a cualquier farmaco, compuesto, sustancia o agente que inhibe el crecimiento de vasos sangumeos. Agentes antiangiogenesis incluyen, pero de ninguna manera estan limitados a razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS- 275291, talidomida, CdC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina y vitaxina.

"Antiestrogeno" o "agente antiestrogenico" se refiere a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la accion de estrogeno. Ejemplos de agentes antiestrogenos son tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, anastrozol, letrozol y exemestano.

"Antiandrogenos" o "agentes antiandrogenos" se refieren a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la accion de un androgeno. Ejemplos de antiandrogenos son flutamida, nilutamida, bicalutamida, esprironolactona, ciproterona acetato, finasterida y cimitidina.

"Inmunomoduladores" son sustancias que estimulan el sistema inmunitario.

Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen interferon, interleucina tales como aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox e interleucina-2, factores de necrosis tumoral tales como tasonermina u otros inmunomoduladores tales como lentinano, sizofirano, roquinimex, pidotimod, pegademase, timopentina, acido poliinos^nico-policitid^lico (poly I:C) o levamisol en conjunto con 5- fluorouracilo.

Para mas detalle, el experto en la materia puede referirse al manual editado por la "Association Franpaise des Enseignants de Chimie Therapeutique" y con titulo "traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans Ie traitement des cancers, edicion TEC & DOC, 2003".

Tambien pueden mencionarse como agentes qrnmicos o agentes citotoxicos, todos los inhibidores de cinasa tales como por ejemplo, gefitinib o erlotinib.

En una forma de realizacion particularmente preferida, dicha composicion como un producto de combinacion de acuerdo con la invencion, se caracteriza por que el agente citotoxico se acopla qmmicamente al anticuerpo para uso simultaneo.

A fin de facilitar el acoplamiento entre el agente citotoxico y el anticuerpo de acuerdo con la invencion, es especialmente posible introducir moleculas espaciadoras entre los dos compuestos a acoplar, tales como poli(alquilen) glicoles como polietilen glicol, o de otra forma aminoacidos o en otra modalidad, utilizar derivados activos de los agentes citotoxicos en los que se hubieran introducido funciones capaces de reaccionar con el anticuerpo. Estas tecnicas de acoplamiento son bien conocidos por el experto en la materia y no seran desarrolladas en la presente descripcion.

La invencion se refiere en otro aspecto, a una composicion caracterizada por que uno, al menos de los anticuerpos, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales se conjuga con una toxina celular y/o un radioelemento.

Preferentemente, dicha toxina o dicho radioelemento es capaz de inhibir al menos una actividad celular de celulas que expresan c-Met, en una forma mas preferida capaz de evitar el crecimiento o la proliferacion de la celula, especialmente de inactivar totalmente la celula.

Preferentemente asimismo dicha toxina es una toxina enterobacteriana, en especial la exotoxina pseudomonas A.

Los radioelementos (o radioisotopos) de preferencia conjugados con los anticuerpos empleados para la terapia, son radioisotopos que emiten rayos gamma y de preferencia yodo131, itrio, oro19 , paladio100, cobre67, bismuto217 y

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antimonio211. Los radioisotopos que emiten rayos beta y alfa igualmente pueden emplearse para la terapia.

Por toxina o radioelemento conjugado con al menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invencion, se pretende indicar cualesquiera medios que permitan que la toxina o el radioelemento se una al anticuerpo por lo menos, en especial por acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin introduccion de una molecula de enlace.

Entre los agentes que permiten enlace en una forma qmmica (covalente), electrostatica o no covalente de todo o parte de los componentes del conjugado, puede hacerse particularmente mencion de benzoquinona, carbodiimida y mas particularmente EDC (hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, acido ditiobis- nitrobenzoico (DTNB), N-succinimidil S-acetil tio-acetato (SATA), los agentes fuente que tienen uno o mas grupos fenilazida que reaccionan con los ultravioletas (U.V.) y de preferencia N-[-4-(azidosalicilamino)butil]-3'-(2'-piridilditio)- propionamida (APDP), N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 6-hidrazino-nicotinamida (HYNIC).

Otra forma de acoplamiento, especialmente para los radioelementos, puede consistir en el uso de un quelante de ion bifuncional.

Entre estos quelatos, es posible mencionar los quelatos derivados de EDTA (acido etilendiamintetraacetico) o de DTPA (acido dietilentriaminapentaacetico) que se han desarrollado para ligar metales, en especial metales radioactivos, e inmunoglobulinas. De esta manera, DTPA y sus derivados pueden sustituirse por diferentes grupos en la cadena de carbonos, a fin de incrementar la estabilidad y la rigidez del complejo ligando-metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); patente US 4.831.175).

Por ejemplo el acido dietilentriaminpentaacetico (DTPA) y sus derivados, que se han empleado ampliamente en medicina y en biologfa durante un largo tiempo, ya sea en su forma libre o en la forma de un complejo con un ion metalico, tiene la caractenstica notable de formar quelatos estables con iones metalicos y para acoplarse con protemas de interes terapeutico o de diagnostico tales como anticuerpos para el desarrollo de radioinmunoconjugados en terapia de cancer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).

Asimismo, preferentemente dicho por lo menos un anticuerpo que forma dicho conjugado, se selecciona de sus fragmentos funcionales, en especial los fragmentos amputados de su componente Fc tales como los fragmentos scFv.

Como se ha mencionado anteriormente, en una forma de realizacion preferida, dicho agente citotoxico/citostatico o la toxina y/o un radioelemento, se acopla qmmicamente a por lo menos uno de los elementos de la composicion para uso simultaneo.

La presente invencion comprende la composicion descrita como un medicamento.

La presente invencion comprende ademas la utilizacion de la presente composicion para la preparacion de un medicamento.

En otro aspecto, la invencion se refiere a la utilizacion de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, y/o de una composicion como se describio anteriormente, para la preparacion de un medicamento pretendido para inhibir el crecimiento y/o la proliferacion de celulas de tumor.

Otro aspecto de la invencion consiste en el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales y/o de una composicion, como se describio anteriormente o el uso anteriormente mencionado, para la preparacion de un medicamento pretendido para la prevencion o para el tratamiento de cancer.

Un procedimiento pretendido para inhibir el crecimiento y/o proliferacion de celulas de tumor en un paciente esta asimismo comprendido en la invencion, comprendiendo dicho procedimiento la administracion a un paciente que lo requiere, de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales de acuerdo con la invencion, un anticuerpo producido por un hibridoma de acuerdo con la invencion o una composicion de acuerdo con la invencion.

La presente invencion comprende ademas un procedimiento para la prevencion o tratamiento de cancer en un paciente que lo requiere, que comprende la administracion al paciente de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales de acuerdo con la invencion, un anticuerpo producido por un hibridoma de acuerdo con la invencion o una composicion de acuerdo con la invencion.

En un aspecto particular preferido, el cancer es un cancer seleccionado de cancer de prostata, osteosarcomas, cancer pulmonar, cancer de mama, cancer endometrial, glioblastoma o cancer de colon.

Como se explico anteriormente, una ventaja de la invencion es permitir el tratamiento de canceres relacionados a activacion de Met dependiente e independiente de HGF.

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La invencion, todav^a en otro aspecto, comprende un procedimiento de diagnostico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresion o una subexpresion del receptor c-Met partiendo de una muestra biologica en donde la presencia normal del receptor c-Met se sospecha, el procedimiento se caracteriza por que comprende la etapa en donde la muestra biologica se pone en contacto con un anticuerpo de la invencion, siendo posible que el anticuerpo de ser necesario, este marcado.

Preferentemente, dichas enfermedades conectadas con la presencia anormal del receptor c-Met en el procedimiento de diagnostico, seran canceres.

Dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, puede estar presente en la forma de un inmunoconjugado o de un anticuerpo marcado para obtener una senal detectable y/o cuantificable.

Los anticuerpos marcados o sus fragmentos funcionales incluyen por ejemplo, anticuerpos denominados inmunoconjugados, que pueden conjugarse, por ejemplo con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbonica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato dehidrogenasa o glucosa 6-fosfato dehidrogenasa o por una molecula tal como biotina, digoxigenina o 5- bromodeoxiuridina. Etiquetas fluorescentes igualmente pueden conjugarse en los anticuerpos o sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invencion y en especial incluyen fluorescema y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP por "Protema Fluorescente Verde"), dansil, umbeliferona, etc. En estos conjugados, los anticuerpos pueden prepararse por metodos conocidos por la persona con destreza en la especialidad. Pueden acoplarse a las enzimas o a las etiquetas fluorescentes directamente o por intermedio de un grupo espaciador o de un grupo de enlace tal como un polialdehido, como glutaraldetndo, acido etilendiamintetraacetico (EDTA), acido dietilen-triaminpentaacetico (DPTA), o en la presencia de agentes de acoplamiento tales como aquellos mencionados anteriormente para los conjugados terapeuticos. Los conjugados contienen etiquetas de tipo fluorescema, pueden prepararse por reaccion con un isotiocianato.

Otros conjugados igualmente pueden incluir etiquetas quimioluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, etiquetas bioluminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o de otra forma etiquetas radioactivas tales como yodo123, yodo125 ™ """ ” ~

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yodo133, bromo77, tecnecio99m, indio111, indio113m, galio67, galio68 mercurio107, mercurio203, renio99m, renio101, renio105, escandio47, telurio121m

rutenio95, rutenio97,

rutenio , rutenio , mercurio , mercurio , renio , renio , renio , escandio , telurio , telurio , telurio125m, tulio165, tulio167, tulio168, fluor18, itrio199, yodo13 . Los metodos conocidos por el experto en la materia, existentes para acoplar los radioisotopos terapeuticos a los anticuerpos, ya sea directamente o por un agente quelante tal como EDTA, DTPA anteriormente mencionados, pueden emplearse para los radioelementos que pueden utilizase en diagnostico. Igualmente es posible mencionar marcado con Na[I125] por el procedimiento de cloramina T [Hunter W.M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495] o de otra forma con tecnecio99"1 por la tecnica de Crockford et al. (patente US n° 4.424.200) o enlazado mediante DTPA como se describe por Hnatowich (patente US n° 4.479.930).

De esta manera, los presentes anticuerpos o sus fragmentos funcionales pueden emplearse en un proceso para la deteccion y/o la cuantificacion de una sobreexpresion o de una subexpresion, de preferencia una sobre-expresion del receptor c-Met en una muestra biologica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) el contacto de la muestra biologica con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de acuerdo con la invencion; y

b) la demonstracion del complejo c-Met/anticuerpo posiblemente formado.

En una forma de realizacion particular, dichos anticuerpos o sus fragmentos funcionales, pueden emplearse en un proceso para la deteccion y/o la cuantificacion del receptor c-Met en una muestra biologica, para la supervision de la eficacia de un tratamiento profilactico y/o terapeutico de cancer dependiente de c-Met.

Mas generalmente, dichos anticuerpos o sus fragmentos funcionales pueden emplearse ventajosamente en cualquier situacion en donde debe observarse la expresion del receptor c-Met en una forma cualitativa y/o cuantitativa.

Preferentemente, dicha muestra biologica se forma por un fluido biologico, tal como suero, sangre entera, celulas, una muestra de tejido o biopsias de origen humano.

Cualquier procedimiento o prueba convencional puede emplearse a fin de llevar a cabo esta deteccion y/o dosis. La prueba puede ser una prueba de competencia o de emparedado, o cualquier prueba conocida por el experto en la materia dependiente de la formacion de un complejo inmune de tipo anticuerpo-antfgeno. Siguiendo las aplicaciones de acuerdo con la invencion, el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, puede ser inmovilizado o marcado. Esta inmovilizacion puede llevarse a cabo en numerosos soportes conocidos por el experto en la materia. Estos soportes pueden incluir especialmente vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon o celulas naturales o modificadas. Estos soportes ya pueden ser solubles o insolubles.

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A t^tulo de ejemplo, un procedimiento preferido pone en juego procesos inmunoenzimaticos de acuerdo con la tecnica ELISA, por inmunofluorescencia o tecnica de radioinmunoensayo (RIA) o equivalente.

Por lo tanto, la presente invencion comprende asimismo los kits o conjuntos necesarios para llevar a cabo un procedimiento de diagnostico de enfermedades inducido por una sobreexpresion o una subexpresion del receptor c- Met o para llevar a cabo un proceso para la deteccion y/o cuantificacion de una sobreexpresion o de una subexpresion del receptor c-Met en una muestra biologica, de preferencia una sobreexpresion del receptor, caracterizado por que el kit o conjunto comprende los siguientes elementos:

a) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invencion;

b) opcionalmente, los reactivos para la formacion del medio favorable para la reaccion inmunologica;

c) opcionalmente, los reactivos que permiten la demostracion de complejos c-Met/anticuerpo producidos por la reaccion inmunologica.

Un objeto de la invencion igualmente es el uso de un anticuerpo o una composicion de acuerdo con la invencion, para la preparacion de un medicamento pretendido para el blanco espedfico de un compuesto biologicamente activo a celulas que expresan o sobre-expresan el receptor c-Met.

En la presente memoria se pretende mediante compuestos biologicamente activos indicar cualquier compuesto capaz de modular, en especial de inhibir, actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferacion, transcripcion o traduccion de genes.

Un objeto de la invencion es asimismo un reactivo de diagnostico in vivo, que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales, de preferencia marcado, especialmente radiomarcado, y su uso en formacion de imagen medica, en particular para la deteccion de cancer conectado con la expresion o la sobreexpresion por una celula del receptor c-Met.

La invencion se refiere asimismo una composicion como un producto de combinacion o a un conjugado anti-c- Met/toxina o radioelemento, de acuerdo con la invencion, como un medicamento.

Preferentemente, dicha composicion, como un producto de combinacion de dicho conjugado segun la invencion se mezclara con un excipiente y/o un vehfculo farmaceutico aceptable.

En la presente descripcion, vehfculo farmaceuticamente aceptable se pretende que indique un compuesto o combinacion de compuestos que entran en una composicion farmaceutica que no provoca reacciones secundarias y que permite, por ejemplo facilitar la administracion del o de los compuestos activos, un aumento en su extension de vida util y/o su eficacia en el cuerpo, un aumento en su solubilidad en solucion o de otra forma una mejora en su conservacion. Estos vehnculos farmaceuticamente aceptables son bien conocidos y se adaptaran por el experto en la materia como una funcion de la naturaleza y del modo de administracion del o de los compuestos activos seleccionados.

Preferentemente, estos compuestos se administraran por la ruta sistemica, en particular por la ruta intravenosa, por la ruta intramuscular, intradermica, intraperitoneal o subcutanea, o por la ruta oral. En una forma mas preferida, la composicion que comprende los anticuerpos de acuerdo con la invencion se administrara varias veces, en una forma secuencial.

Sus modos de administracion, dosis y formas farmaceuticas optimas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente tomando en cuenta el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente tal como por ejemplo, la edad o peso corporal del paciente, la seriedad de su condicion general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios notados.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion aparecen en la continuacion de la descripcion, con los ejemplos y figuras en las que:

Figura 1: Ejemplos de perfiles FACS de los anticuerpos anti-c-Met selectos;

Figuras 2A y 2B: Inhibicion in vitro de proliferacion BXPC3 por anticuerpos que dianizan c-Met;

Figura 3: Inhibicion de dimerizacion de c-Met;

Figura 4: Reconocimiento de protema por anticuerpos anti-c-Met;

Figuras 5A y 5B: "Cartograffa de epftopo" de 11E1 y 5D5 por analisis BIAcore;

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Figuras 6A y 6B: Efecto de MAbs en fosforilacion de c-Met;

Figuras 7A y 7B: Desplazamiento de HGF radio-etiquetado por anticuerpos anti-c-Met;

Figura 8: Inhibicion de invasion por anticuerpos anti-c-Met [en esta figura, SVF significa suero bovino fetal (FCS)]; Figura 9: Efecto de anticuerpos anti c-Met en sanacion de heridas;

Figuras 10A y 10B: Ensayo de dispersion;

Figura 11: Ensayo de tubulogenesis tridimensional;

Figuras 12A y 12B: Efecto de anticuerpos en formacion de esferoide;

Figura 13: Actividad in vivo de Mabs anti-c-Met en el modelo de xenoinjerto U87MG;

Figura 14: Expresion HGF por un conjunto de lmeas celulares de tumor;

Figuras 15A y 15B: Caracterizacion de lmea celular NCI-H441; con la Figura 15A que corresponde al analisis RT- PCR cuantitativo y la Figura 15B que corresponde a analisis FACS;

Figura 16: Actividad in vivo de anticuerpos anti-c-Met en modelo de xenoinjerto NCI-H441;

Figura 17A: Alineamiento de 224G11 VL con gen de celula germinal IGKV3-5*01 murina;

Figura 17B: Alineamiento de 224G11 VL con genes de celulas germinales IGKJ4*01 murina;

Figura 18A: Alineamiento de 224G11 VL con genes de celulas germinales IGKV3-11*01 y IGKV4-1*01 humanas;

Figura 18B: Alineamiento de 224G11 VL con gen de celulas germinales IGKJ4*02 humanas;

Figura 19A: IGKV3-11*01 version humanizada basada en 224G11 VL con mutaciones mencionadas;

Figura 19B: IGKV4-1*01 version humanizada basada en 224G11 VL con mutaciones mencionadas;

Figura 20A: Alineamiento de 224G11 VH con gen de celulas germinales IGHV1-18*01 murinas;

Figura 20B: Alineamiento de 224G11 VH con gen de celulas germinales IGHD2-4*01 murinas;

Figura 20C: Alineamiento de 224G11 VH con gen de celulas germinales IGHJ2*01 murinas;

Figura 21A: Alineamiento de 224G11 VH con gen de celulas germinales IGHV1-2*02 humanas;

Figura 21B: Alineamiento de 224G11 VH con gen de celulas germinales IGHJ4*01 humanas;

Figura 22: 224G11 VH humanizado con mutaciones mencionadas 224G11 VH;

Figura 23A: Alineamiento de 227H1 VL con gen de celulas germinales IGKV3-5*01 murinas;

Figura 23B: Alineamiento de 227H1 VL con gen de celulas germinales IGKJ4*01 murinas;

Figura 24A: Alineamiento de 227H1 VL con gen de celulas germinales IGKV3-11*01 y IGKV4-1*01 humanas;

Figura 24B: Alineamiento de 227H1 VL con gen de celulas germinales IGKJ4*02 humanas;

Figura 25A: Version humanizada basada en IGKV3-11*01 de 227H1 VL con mutaciones mencionadas;

Figura 25B: version humanizada basada en IGKV4-1*01 de 227H1 VL con mutaciones mencionadas;

Figura 26A: Alineamiento de 227H1 VH con gen de celulas germinales IGHV1-18*01 murinas;

Figura 26B: Alineamiento de 227H1 VH con un gen de celulas germinales IGHD1-1*02 murinas;

Figura 26C: Alineamiento de 227H1 VH con un gen de celulas germinales IGHJ2*01 murinas;

Figura 27A: Alineamiento de 227H1 VH con un gen de celulas germinales IGHV1-2*02 humanas;

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Figura 27B: Alineamiento de 227H1 VH con un gen de celulas germinales IGHJ4*01 humanas;

Figura 28: Humanizado 227H1 VH con mutaciones mencionadas;

Figura 29A: Alineamiento de 223C4 VL con un gen de celulas germinales IGKV12-46*01 murinas;

Figura 29B: Alineamiento de 223C4 VL con un gen de celulas germinales IGKJ2*01 murinas;

Figura 30A: Alineamiento de 223C4 VL con un gen de celulas germinales IGKV1-NL1*01 humana;

Figura 30B: Alineamiento de 223C4 VL con un gen de celulas germinales IGKJ2*01 humana;

Figura 31: 223C4 VL humanizado con mutaciones mencionadas;

Figura 32A: Alineamiento de 223C4 VH con un gen de celulas germinales IGHV1-18*01 murinas;

Figura 32B: Alineamiento de 223C4 VH con un gen de celulas germinales IGHD6-3*01 murinas;

Figura 32C: Alineamiento de 223C4 VH con un gen de celulas germinales IGHJ4*01 murinas;

Figura 33A: Alineamiento de 223C4 VH con un gen de celulas germinales IGHV1-2*02 humanas;

Figura 33B: Alineamiento de 223C4 VH con un gen de celulas germinales IGHD1-26*01 humanas;

Figura 33C: Alineamiento de 223C4 VH con un gen de celulas germinales IGHJ6*01 humanas; y Figura 34: 223C4 VH humanizado con mutaciones mencionadas;

Figura 35: Actividad antitumoral de 224G11 Mab murino solo o combinado con Navelbine® en el modelo de tumor NCI-H441 de xenoinjerto establecido;

Figura 36: Evaluacion de Mabs anti-c-Met en proliferacion de HUVEC;

Figura 37: Evaluacion de Mabs anti-c-Met en formacion de tubo HUVEC;

Figura 38A: Alineamiento de 11E1 VL con gen de celulas germinales IGKV4-79*01 murinas;

Figura 38B: Alineamiento de 11E1 VL con un gen de celulas germinales IGKJ4*01 murinas;

Figura 39A: Alineamiento de 11E1 VL con un gen de celulas germinales IGKV3D-7*01 humanas;

Figura 39B: Alineamiento de 11E1 VL con un gen de celulas germinales IGKJ4*02 humanas;

Figura 40: Version humanizada de 11E1 VL con mutaciones mencionadas;

Figura 41A: Alineamiento de 11E1 VH con gen de celulas germinales IGHV1-7*01 murinas;

Figura 41B: Alineamiento de 11E1 VH con gen de celulas germinales IGHD4-l*01 murinas;

Figura 41C: Alineamiento de 11E1 VH con gen de celulas germinales IGHJ3*01 murinas;

Figura 42A: Alineamiento de 11E1 VH con genes de celulas germinales IGHV1-2*02 y IGHV1-46*01 humanas; Figura 42B: Alineamiento de 11E1 VH con un gen de celulas germinales IGHJ4*03 humanas;

Figura 43: 11E1 VH humanizado con mutaciones mencionadas;

Figuras 44A y 44B: Ensayo de fosforilacion c-Met en celulas A549. Evaluacion de Mabs purificados 11E1 y 224G11, en ausencia o en presencia de HGF, ya sea a 30 pg/ml (Figura 44A) o dentro de un intervalo de dosis de 0.0015 a 30 pg/ml a fin de determinar valores EC50 (Figura 44B);

Figura 45: Combinacion in vivo de 224G11 Mab con Navelbine® en el modelo de xenoinjerto NSCLC NCI-H441;

Figura 46: Combinacion in vivo de 224G11 Mab con Doxorrubicina en el modelo de xenoinjerto NSCLC NCI- H441;

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Figura 47: Combinacion in vivo de 224G11 Mab con Docetaxel en el modelo de xenoinjerto NSCLC NCI-H441;

Figura 48: Combinacion in vivo de 224G11 Mab con Temozolomida en el modelo de xenoinjerto NSCLC NCI- H441;

Figuras 49A, 49B, 49C y 49D: Efecto de Mabs anti-c-Met en crecimiento de esferoide U87-MG;

Figuras 50A y 50B: Actividad in vitro de formas quimerica y humanizada de 224G11 en el ensayo fosfo-c-Met; Figura 51: Ajustes de analisis Biacore;

Figura 52: Actividad in vivo de 224G11 en celulas MDA-MB-231 coimplantadas con celulas MRC5 como fuente HGF humana en ratones desnudos Artmicos;

Figura 53: Ensayo de enlace basado en ELISA a Fc-cMet. Actividad de enlace Anti-Fc-c-Met se mide en un ensayo basado en ELISA, en donde conjugados anti-murinos Fc se utilizan para detectar los anticuerpos monoclonales murinos purificados 11E1, 224G11 y 227H1. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc- cMet recombinante revestido con plastico se miden a 450 nm;

Figura 54: Ensayo de competencia HGF-cMet. En este ensayo basado en ELISA, enlace residual Fc-cMET recombinante con HGF revestido con plastico en la presencia de anticuerpos monoclonales murinos purificados 11E1, 224G11 y 227H1 se detecta con conjugado FC antimurino y mide a 450 nm;

Figura 55: Alineamiento de secuencias de aminoacidos de dominio VH recombinante derivados de 227H1. La secuencia de aminoacidos 227H1 VH se almea con las secuencias marco receptoras humanas seleccionadas, con solo mencionados de los aminoacidos que se encontraron diferentes de la secuencia 227H1 VH murina. Secuencias 227H1 HZ1, HZ2 y HZ3 VH corresponden a versiones humanizadas implementadas del dominio VH murino 227H1, con residuos murino restantes en negrita. En HZ3, 10 residuos (*) se cambiaron automaticamente por sus contras partes humanas. En HZ2, los siete residuos del tercer grupo (3) se han estudiado. En HZ1VH, los nueve residuos del segundo grupo (2) se han mutado en sus contrapartes humanas, solo los seis residuos del primer grupo (1) permanecen murinos;

Figura 56: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 227H1 recombinantes. La actividad de enlace anti-Fc-cMet se midio en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumano se midieron en el ensayo basado en ELISA en donde Fc antihumano se emplearon para detectar anticuerpos recombinantes derivados 227-H1 quimericos y humanizados. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 227H1 derivado de dominios VH humanizados, se midieron a 450 nm y despues compararon con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 57: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos derivados 227H1-recombinantes. La actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumanos se emplean para detectar anticuerpos recombinantes derivados 227-H1 quimericos y humanizados. La actividad de enlace dependiente de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpo 227H1 derivado HZ4VH humanizado se midio a 450 nm y despues comparo con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 58: ensayo de competencia HGF-cMet de anticuerpos recombinantes y murinos 227H1. En este ensayo basado en ELISA, enlace residual Fc-cMet recombinante con HGF revestido con plastico en la presencia de las diferentes formas del anticuerpo 227H1, se detecta con un anticuerpo anti-cMet no relacionado biotinilado. Anticuerpo monoclonal 227H1 murino purificado, anticuerpos recombinantes derivados 227H1 humanizados derivados de HZ4VH y quimericos se probaron y compararan por sus habilidades para competir con enlace de HGF-cMet cuando se mide a 450 nm;

Figura 59: secuencia de dominio variable humanizado 227H1-HZ VH. *, corresponde a aminoacidos cambiados de facto a sus contrapartes humanas; !, corresponde a aminoacidos humanizados durante la implementacion HZ3 a HZ1; §, corresponde a aminoacidos humanizados en la secuencia 227H1-HZ VH final;

Figura 60: Alineamiento de secuencias de aminoacidos de dominios VH recombinantes derivados de 11E1. La secuencia de aminoacidos 11E1 VH se alinea con la secuencia marco receptora humana seleccionada, con solo los aminoacidos mencionados que se encontraron diferentes de la secuencia 11E1 VH murina. Secuencias 11E1 HZ VH1, VH2 y VH3 corresponden a versiones humanizadas implementadas del dominio VH murino 11E1, con residuos murinos restantes en negritas. En HZ VH3, siete residuos (*) se cambiaron automaticamente por sus contrapartes humanas. En HZ VH2, los siete residuos del tercer grupo (3) se han estudiado. En HZ VH1, los cinco residuos del segundo grupo (2) se han mutado a sus contrapartes humanas, solo los cinco residuos del primer grupo (1) permanecen murinos;

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Figura 61: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 11E1 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se midio en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc anti-humanos se emplearon para detectar anticuerpos recombinantes derivados de 11E1 quimericos y humanizados. Actividades de enlace dependientes de dosis sobre Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 11E1 derivados de dominios VH humanizados se midieron a 450 nm y despues compararon con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 62: Alineamiento de secuencias de aminoacidos de dominios de VL recombinantes derivados de 11E1. La secuencia de aminoacidos 11E1 VL se alinea con la secuencia marco receptora humana seleccionada, con solo los aminoacidos mencionados que se encontraron diferentes de la secuencia 11E1 VL murina. Secuencias 11E1 HZ VL1, VL2 y VL3 corresponden a versiones humanizadas implementadas del dominio VL murino 11E1, con residuos murinos restantes en negritas. En HZ VL3, diez residuos (*) se cambiaron automaticamente por sus contrapartes humanas. En HZ VL2, los ocho residuos del tercer grupo (3) se han estudiado. En HZ VL1, los ocho residuos del segundo grupo (2) se han mutado a sus contrapartes humanas, solo los cuatro residuos del primer grupo (1) permanecen murinos;

Figura 63: ensayo de enlace basado en ELISA a Fc-cMet de anticuerpos 11E1 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc anti-humanos se emplean para detectar anticuerpos recombinantes derivados de 11E1 quimericos y humanizados. Actividades de enlace dependientes de dosis sobre Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 11E1 derivados de dominios VL humanizados, se miden a 450 nm y despues comparan con aquellos del anticuerpo quimerico a referencia/paternal;

Figura 64: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 11E1 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se midio en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc anti-humano se emplean para detectar anticuerpos recombinantes derivados de 11E1 humanizados y quimericos. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 11E1 derivados de dominios humanizados dobles se miden a 450 nm y despues comparan con aquellas del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 65: Alineamiento de secuencias de aminoacidos de secuencia de dominio 224G11 VH. La secuencia aminoacidos 224G11 VH se alinea con la secuencia de 227H1 VH (subrayados son residuos no homologos) y con la secuencia marco receptora humana selecta, con solo los aminoacidos mencionados que se encontraron diferentes de la secuencia 224G11 VH murina. La secuencia 224G11 HZ VH0 corresponde a la version humanizada "IMGT completa/basada en 227H1" del dominio VH murino 224G11. En esta secuencia, ningun residuo externo-IMGT-CDRs permanece murino;

Figura 66: ensayo de enlace basado en ELISA a Fc-cMet de anticuerpos 224G11 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc anti-humano se emplearon para detectar anticuerpos recombinantes derivados 224G11 humanizados derivados de HZVH0 y quimericos. Actividad de enlace dependiente de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico del anticuerpo 224G11 derivado de VH11 humanizado HZVH0 "IMGT completo" se midio a 224G11 despues comparo con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 67: ensayo de competencia HGF-cMet de anticuerpos recombinantes y murinos 224G11. En este ensayo basado en ELISA, enlace residual Fc-cMet recombinante a HGF revestido con plastico en la presencia de formas diferentes del anticuerpo 224G11, se detecta con un anticuerpo anti-cMet no relacionado biotinilado. Anticuerpo monoclonal 224G11 murino purificado, anticuerpos recombinantes derivados 224G11 humanizados derivados de HZVH0 y quimericos se probaron y compararan por sus capacidades para competir con enlace HGF-cMet cuando se miden a 450 nm;

Figura 68: Alineamiento de secuencias de aminoacidos de secuencia de dominio 224G11 VL. La secuencia de aminoacidos 24G11 VL se alinea con las dos secuencias de marco receptor humano selectas, con solo los aminoacidos mencionados que se encontraron diferentes de la secuencia 224G11 VL murina. La secuencia 224G11 HZ VL3 corresponde a la version humanizada "CDR1 mas corto" del dominio VH murino 224G11 mientras que HZ VL6 corresponde a la version "CDR1 mas largo", con los residuos murinos restantes en negrita. Para ambas versiones humanizadas basicas, los residuos murino restantes estan clasificados para adicional proceso de humanizacion en donde * corresponde a aminoacidos en las versiones basicas y 3, 2 y 1 corresponden a los grupos de residuos para el diseno de las versiones humanizadas implementadas;

Figura 69: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 224G11 recombinantes. La actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumano se utilizan para detectar anticuerpos recombinantes derivados 22G11 humanizados y quimericos. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 224G11 derivados de dominios VL3 y VL6 humanizados, se miden a 450 nm y despues comparan con aquellos del anticuerpo

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Figura 70: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 224G11 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumanos se utilizan para detectar anticuerpos recombinantes derivados 224G11 quimericos y humanizados. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 224G11 derivados de dominios VL humanizados se miden a 450 nm y despues comparan con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 71: ensayo de competencia HGF-cMet de anticuerpos recombinantes y murinos 224G11. En este ensayo basado en ELlSA, enlace residual Fc-cMet recombinante a HGF revestido con plastico en la presencia de las formas diferentes del anticuerpo 224G11, se detecta con un anticuerpo anti-cMet no relacionado biotinilado. Anticuerpo monoclonal 224G11 murino purificado, anticuerpos recombinantes derivados 224G11 humanizados derivados de HZVL4 y quimericos, se probaron y compararan por sus habilidades para competir con enlace de HGF-cMet cuando se miden a 450 nm;

Figura 72: Secuencias de aminoacidos de la secuencia de dominio 224G11 VL. *, corresponde a aminoacidos cambiados de facto a sus contrapartes humanas en la version HZ VL6 basica; !, corresponde a aminoacidos humanizados durante la implementacion HZ VL6 a HZ VL4; §, corresponde a aminoacidos humanizados que permanecen murinos en la secuencia 224G11-HZ VL4;

Figura 73: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 224G11 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumano se utilizan para detectar anticuerpos recombinantes derivados de 22G11 humanizados y quimericos. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de anticuerpos 224G11 derivados de dominios humanizados dobles se miden a 450 nm y despues comparan con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 74: ensayo de competencia HGF-cMet de anticuerpos recombinantes y murinos 224G11. En este ensayo basado en ELISA, enlace residual Fc-cMet recombinante con HGF revestido con plastico en la presencia de las formas diferentes del anticuerpo 224G11, se detecta con un anticuerpo anti-cMet no relacionado biotinilado. Anticuerpo monoclonal 224G11 murino purificado, anticuerpos recombinantes derivados 224G11 quimericos y totalmente humanizados se probaron y compararan por sus habilidades para competir con enlace de HGF-cMet cuando se miden a 450 nm;

Figura 75: ensayo de enlace basado en ELISA a Fc-cMet de anticuerpos 224G11 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumanos se utilizan para detectar anticuerpos recombinantes derivados 22G11 quimericos y humanizados. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico de mutantes sencillos de anticuerpos 224G11 totalmente humanizados derivados de VL4, se miden a 450 nm y despues comparan con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal;

Figura 76: ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet de anticuerpos 224G11 recombinantes. Actividad de enlace anti-Fc-cMet se mide en un ensayo basado en ELISA en donde conjugados Fc antihumano se utilizan para detectar anticuerpos recombinantes derivados de 22G11 quimericos y humanizados. Actividades de enlace dependientes de dosis en Fc-cMet recombinante revestido con plastico y mutantes sencillos y multiples de los anticuerpos 224G11 humanizados totalmente derivados de VL4, se miden a 450 nm y despues comparan con aquellos del anticuerpo quimerico de referencia/paternal; y

Figura 77: Ensayo de competencia HGF-cMet de anticuerpos recombinantes y murinos 224G11. En este ensayo basado en ELISA, enlace residual Fc-cMet recombinante con HGF revestido con plastico en la presencia de las diferentes formas de anticuerpo 224G11, se detecta con un anticuerpo anti-cMet no relacionado biotinilado. Anticuerpo monoclonal 224G11 murino purificado, mutantes quimericas y sencillas o multiples de los anticuerpos recombinantes 224G11 totalmente humanizados derivados de VL4, se probaron y compararon por sus habilidades para competir con enlace de HGF-cMet cuando se mide a 450nm.

Ejemplo 1: Generacion de anticuerpos contra c-Met

Para generar anticuerpos anti-c-Met, ratones BALB/c de 8 semanas de edad se inmunizaron ya sea 3 a 5 veces en forma subcutanea con una lmea celular transfectada CHO que expresa c-Met en su membrana de plasma (20x106 celulas/dosis/raton) o 2 a 3 veces con una protema de fusion de dominio extracelular c-Met (10-15 pg/dosis/raton) (R&D Systems, Catalogo # 358MT) o fragmentos de esta protema recombinante en mezcla con adyuvante completo de Freund, para la primer inmunizacion y adyuvante Freund incompleto para las siguientes. Protocolos mixtos en donde los ratones recibieron tanto celulas CHO-cMet como protemas recombinantes tambien se realizaron. Tres dfas antes de la fusion celular, los ratones se reforzaron i.p. o i.v. con la protema recombinante o fragmentos. Los bazos de los ratones se recolectaron y fusionaron a celulas de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC) y sometieron a

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seleccion HAT. Cuatro fusiones se realizaron. En general, para la preparacion de anticuerpos monoclonales o sus fragmented funcionales, en especial de origen murino, es posible referirse a tecnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la tecnica de preparacion de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los hibridomas obtenidos inicialmente se cribaron por ELISA en la protema recombinante c-Met y despues por analisis FACS en lmeas celulares A549 NSCLC, pancreaticas BxPC3 y U87-MG de glioblastoma (perfiles representativos se presentan en la Figura 1) para asegurarse que los anticuerpos producidos eran capaces de reconocer tambien el receptor nativo en las celulas de tumor. Reactores positivos en estas 2 pruebas se amplificaron, clonaron y un conjunto de hibridomas se recupero, purifico y cribo por su habilidad para inhibir proliferacion de celulas in vitro en el modelo BxPC3.

Para ese proposito, 50 000 celulas de BxPC3 se revistieron en placas de 96 pocillos en medio RPMI, L. Glutamina 2 mM, sin SVF. 24 horas despues de revestir, los anticuerpos a probar se agregaron a una concentracion final en el intervalo de 0.0097 a 40 pg/ml 60 min antes de adicion de 100 ng/ml de hHGF. Despues de 3 dfas, las celulas se pulsaron con 0.5 pCi de [3H]timidina por 16 horas. La magnitud de [3H]timidina incorporada en ADN insoluble en acido tricloroacetico se cuantifico por conteo de centelleo en medio lfquido. Los resultados se expresan como datos en crudo para realmente evaluar el efecto agomstico intrmseco de cada Mab (Figuras 2A y 2B).

Despues, anticuerpos que inhiben al menos 50% de proliferacion celular se evaluaron como sobrenadantes por analisis BRET en celulas transfectadas c-Met. Para este proposito, lineas celulares estables CHO que expresan C- Met-Rluc o C-Met-Rluc y C-Met-K1100A-YFP se generaron. Las celulas se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos blancas en DMEM-F 12/FBS 5% de medio de cultivo, uno o dos dfas antes de experimentos BRET. Las celulas primero se cultivaron a 37 grados C con CO2 al 5%, a fin de permitir conexion celular a la placa. Las celulas despues se ayunaron con 200 pl de DMEM/pozo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento, DMEM se retiro y las celulas rapidamente se lavaron con PBS. Las celulas se incubaron en PBS en la presencia o ausencia de anticuerpos para probarse o compuestos de referencia, 10 minutos a 37 grados C antes de la adicion de coelenterazina, con o sin HGF, en un volumen final de 50 pl. Despues de incubacion por 10 minutos mas a 37 grados C, la adquisicion de emision de luz a 485 nm y 530 nm se inicio, utilizando el luminometro Mithras (Berthold) (1s/longitud de onda/pozo repetido 15 veces).

La proporcion BRET se ha definido previamente [Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689] como: [(emision a 530 nm)-(emision a 485 nm) X CfJ/(emision a 485 nm), en donde Cf corresponde a (emision a 530 nm) / (emision a 485 nm) para celulas que expresan la protema de fusion Rluc sola en las mismas condiciones experimentales. Simplificando esta ecuacion muestra que la proporcion BRET corresponde a la proporcion 530/485 nm que se obtiene cuando los dos socios estuvieron presentes, corregido por una proporcion 530/485 nm que se obtiene bajo las mismas condiciones experimentales, cuando solo el socio fusionado a R. reniformis luciferasa se presenta en el ensayo. Por razones de legibilidad, los resultados se expresan en unidades milliBRET (mBU); mBU corresponde a la proporcion BRET multiplicada por 1000.

Despues de esta segunda prueba in vitro, se seleccionaron 4 anticuerpos i) sin actividad intrmseca como una molecula entera en la prueba funcional de proliferacion, ii) que inhiben significativamente la proliferacion BxPC3 (Figuras 2A y 2B) y iii) que inhiben la dimerizacion de c-Met (Figura 3). Estos 3 anticuerpos del isotipo IgG1 kappa se describieron como 11E1, 224G11, 223C4 y 227H1. En los experimentos, el 5D5 Mab, generado por Genentech, y disponible en ATCC, se agrego como un control para la actividad antagomstica intrmseca.

Las Figuras 2A y 2B demuestran que 11E1, 224G11, 223C4 y 227H1 estuvieron sin ninguna actividad agonista en contraste con 5D5 que induce un estfmulo dependiente de dosis de proliferacion celular en ausencia de ligando. Una inhibicion significativa de proliferacion celular se observo con los 4 anticuerpos selectos. 5D5 esta sin efecto en proliferacion celular inducida por HGF en esta prueba.

Cuando se evalua para bloqueo de dimerizacion, se observaron significativos efectos que llegan a 32, 55, 69 y 52% de inhibicion de dimerizacion para 224G11, 223C4, 11E1 y 227H1, respectivamente. Comparado con senales basales en los experimentos respectivos, el anticuerpo 5D5 esta sin efecto en este modelo de dimerizacion.

Ejemplo 2: Reconocimiento de protema por anticuerpos anti-c-Met

Para caracterizar el patron de reconocimiento de 3 anticuerpos selectos, se han configurado 3 ELISA con la protema c-Met recombinante, su fragmento monomerico (que se obtiene por rotura de la protema c-Met-Fc recombinante y el dominio SEMA recombinante.

Los resultados presentados en la Figura 4, demuestran que los 4 anticuerpos reconocen tanto protemas dimericos como monomericas. Para realizar este ELISA, la protema c-Met dimerica humana (R&D sytems, cat# 358MT) se reviste a concentracion de 0.7 pg/ml en PBS durante la noche a 4 grados C. Despues de saturacion de las placas (Costar #3690) con una solucion de gelatina al 0.5%, 2 horas a 37 grados C, se incuban sobrenadantes de

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hibridoma por 1 hora a 37 grados C. Una vez enjuagado con PBS, el anticuerpo HRP anti-raton (Jackson ImmunoResearch, # de catalogo 115-035-164) se agrega a cada pozo a una dilucion de 1/5000 en amortiguador ELISA (gelatina al 0.1% / Tween 20 al 0.05% en PBS) y las placas se incubaron por 1 hora a 37 grados C. Despues de 3 lavados en PBS, la actividad de la peroxidasa se revela por la adicion de 50 jl de sustrato TMB (Uptima). La reaccion se deja que ocurra por 5 minutos a temperatura ambinete. La reaccion se detiene por la adicion de 50 jl/pozo de una solucion H2SO41 M y lee en un lector de placas a 450 nm. El mismo tipo de protocolo se realizo en el dominio SEMA y c-Met monomerico pero en esos casos, las protemas se revistieron a 5 y 3 jg/ml respectivamente.

El 5D5 Mab introducido como un control positivo reconoce como se espera la protema SEMA. 224G11, 227H1 y 223C4 no ligan al dominio SEMA. 11E1 es capaz de unirse a SEMA.

Para determinar si 11E1 y 5D5, ambos que reconocen el dominio SEMA compiten para epftopos super-puestos, se realizo analisis BIAcore. El sistema BIAcore basado en el fenomeno de resonancia Plasmon de Superficie suministra datos al supervisar eventos de enlace en tiempo real. Es entonces util para agrupar anticuerpos en los asf denominados experimentos de "cartograffa de epttopo". Un par de anticuerpos incapaces de ligar al mismo tiempo en la molecula de antfgeno, se clasifican en el mismo grupo (sitios de enlace identicos o vecinos). Al contrario, cuando sus sitios de enlace respectivos estan suficientemente distantes para permitir un enlace simultaneo de ambos anticuerpos, estos ultimos se clasifican en dos grupos diferentes. En estos experimentos, el antfgeno se emplea comunmente como el ligando (inmovilizado en el chip-sensor) y los anticuerpos se utilizan sin marcado alguno como analitos (fase de solucion).

Todos los experimentos descritos se han realizado en un instrumento BIAcore X (GE Healthcare Europe GmbH). Un chip-sensor CM5 (BIAcore) activado por un anti-Tag-6His Mab de raton (R&D System ref. MAB050) se ha preparado siguiendo las instrucciones del fabricante al utilizar el equipo de acoplamiento amina (BIAcore). El amortiguador de corrida (HBS-EP) y el amortiguador de regeneracion (Glicina, HCl) son de BIAcore. Una version soluble recombinante del receptor HGF humano producida como una molecula quimerica c-Met-Fc-Tag His fue de R&D systems (ref. 358-MT-CF). Los experimentos se realizaron a 25 grados C, a un gasto de flujo de 30 jl/min. Una solucion de 10 jg/ml de c-Met en amortiguador de corrida se inyecta durante un minuto en la celula de flujo 2 (fc2) tipicamente 270 RU de la forma soluble de c-Met se capturaron. La celula de flujo (fc1) se emplea como una referencia para verificar cualquier enlace no espedfico de los anticuerpos a la matriz de chip-sensor.

Se realizaron unas inyecciones secuenciales de anticuerpos que deben someterse a prueba. Un anticuerpo se inyecto en ambas celulas de flujo durante 2 minutos. Un segundo anticuerpo (o el mismo) se inyecto despues en las mismas condiciones. Si no se observa enlace significante, se realiza una tercera inyeccion con otro anticuerpo. El chip-sensor despues se regenera por una sola inyeccion de 30 s del amortiguador de regeneracion. Ya sea anticuerpos y c-Met-Fc se descargaron en esta etapa.

Analisis de los resultados:

La capacidad de un anticuerpo "A" para bloquear el enlace de un anticuerpo "B" se calcula por la proporcion BIA/C=(R2A/B/R1B)x100: en donde R2A/B es la respuesta correspondiente al enlace de MAb "B" cuando se inyecta despues de Mab "A" y R1B es la respuesta correspondiente al enlace de MAb "B" cuando se inyecta primero. Un BIA/C inferior a 20% significa que A es capaz de bloquear el enlace de B, de manera tal que A y B tienen sitios de enlace vecinos.

La cartograffa de epftopo se ha realizado con 2 Mabs, 11E1 y 5D5.

Tabla 3

2° Ab (B) 1° Ab (A)

11E1 5d5

11E1

6,5% 84,2%

5D5

98,4% 11,0%

La visualizacion del enlace alrededor de 270RU de c-Met-Fc capturado por las inyecciones secuenciales de 2 minutos de Mabs 5D5 (primero), 5D5 (segundo) y 11E1 (tercero) a una concentracion de 10 jg/ml, cada una demostro que 5D5 y 11E1 ligan claramente a dos sitios distantes (Figura 5A). Esta observacion se confirma por la secuencia redproca del anticuerpo (Figura 5B).

La Tabla 3 resume la proporcion de calculo obtenida con las diferentes secuencias de estos 2 anticuerpos. Valores negros (mas de 75%) significan que Mab A no bloquea el enlace de Mab B. Valores en negrita/italicas (inferiores a 20%) significan que los sitios de enlace de ambos anticuerpos (A y B) son identicos o suficientemente cercanos para inhabilitar un enlace simultaneo.

Ejemplo 3: Efecto de Mabs en fosforilacion c-Met

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Para determinar la actividad de anticuerpos anti-c-Met en fosforilacion c-Met, un ensayo ELISA fosfo c-Met se configuro. Brevemente 500 000 celulas A549 se sembraron en cada pozo de placas de 6-pozos en medio F12K + FCS 10%. 16 horas antes de adicion de HGF (100 ng/ml), las celulas se ayunaron y cada anticuerpo a probar se agrego a una concentracion final de 30 pg/ml, 15 minutos antes de estfmulo de ligando. 15 Minutos despues de adicion de HGF, amortiguador de lisis en frio se agrega, las celulas se rasparon y los lisados celulares se recolectaron y centrifugaron a 13 000 rpm por 10 minutos a 4 grados C. Sobrenadantes se cuantificaron con un equipo BCA (Pierce) y almacenaron a -20 grados C. Para ensayo ELISA, un anticuerpo cabra anti-c-Met (R&D ref. AF276) se utiliza como un anticuerpo de captura (revestimiento durante la noche a 4 grados C) y despues de una etapa de saturacion (1 h a RT) con un amortiguador TBS-BSA al 5%, 25 pg de protema de los diferentes lisados celulares, se agregan a cada pozo de la placa de 96 pocillos. Despues de un tiempo de incubacion de 90 minutos a RT, las placas se lavaron cuatro veces y se agrega un anticuerpo anti-fosfo-c-Met (conejo anti-pY1230-1234-1235 c- Met). Despues de 1 hora adicional de tiempo de incubacion y 4 lavados, se agrega un anti-conejo-HRP (anti-rabbit- HRP) (Biosource) por 1 hora a RT y el sustrato de Luminol se agrega antes de evaluacion de la luminiscencia con un dispositivo Mithras. Resultados presentados en la Figura 6B demuestran que 11E1, 224G11,223C4 y 227H1 inhiben fosforilacion c-Met por 68, 54, 80 y 65% respectivamente en comparacion con 5D5 Mab que exhibe una inhibicion mas debil de fosforilacion c-Met (42%). En esta prueba, un efecto basal debil (menor a 20%) se observa con los 4 anticuerpos candidato (Figura 6A). Como se describe en los diversos ejemplos presentados en esta patente, este efecto basal debil no tuvo consecuencias en la actividad de anticuerpos en otras pruebas in vitro e in vivo. El 5D5 empleado como control exhibio, en esta prueba un efecto basal significante.

Ejemplo 4: Desplazamiento de HGF radio-etiquetado por anticuerpos anti-c-Met

Para determinar si los anticuerpos anti-c-Met fueron capaces de desplazar HGF, se organizaron experimentos de enlace. Brevemente, microplacas de 96 pocillos FlashPlate de protema A (Perkin Elmer), se saturaron con gelatina al 0.5% en PBS (200 pl/pozo, 2 h a temperatura ambiente) antes de agregar c-Met-Fc recombinante (R&D Systems) como una protema de revestimiento. Dos mil pl de una solucion de 1 pg/ml de c-Met-Fc en PBS, se agregaron a cada pozo. Las placas despues se incubaron durante la noche a 4 grados C. Sitios de protema A residuales libres, se saturaron adicionalmente con hlgG no relevante (0.5 pg/pozo en PBS) por 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS despues de cada etapa.

Para ensayos de competencia, enlace de [125I]-HGF (actividad espedfica ~ 2,000 Ci/mmol) a 200 pM a c-Met inmovilizado, se midio en la presencia de concentraciones variantes de los anticuerpos monoclonales anti-c-Met 11E1,224G11, 223C4, 227H1 o HGF (R&D Systems) en el intervalo de 0.1 pM a 1 pM en PBS pH 7.4. Las placas se incubaron a temperatura ambiente por 6 h, despues contaron en un contador de Centelleo de Microplacas - Packard Top Count Microplate Scintillation Counter. Enlace no espedfico se determina en la presencia de 1 pM de HGF. El anticuerpo monoclonal 9G4, que no se dirige a c-Met pero reconoce espedficamente una protema de E. coli, se utiliza como control de isotipo IgG1 raton.

El por ciento de total de enlace [125I]-HGF espedfico se marco como una funcion de concentracion de ligando en graficas semilog. Concentraciones de los diversos inhibidores requeridas para inhibir el enlace radioligando en 50% (IC50), se determinaron graficamente a partir de las curvas de competencia sigmoide obtenidas (Figuras 7A y 7B).

Como se espero, HGF no radiomarcado fue capaz de desplazar completamente el enlace [125I]-HGF a c-Met inmovilizado, mientras que el anticuerpo de control 9G4 no muestra ninguna actividad de bloqueo HGF (Figuras 7A y 7B). Anticuerpos anti-c-Met monoclonales 11E1, 224G11, 223C4 y 227H1 fueron capaces de inhibir enlace [125I]- HGF a c-Met inmovilizado, con valores IC50 de 20 nM, 3 nM, 2.7 nM y 5.8 nM, respectivamente. Los valores IC50 determinados para los anticuerpos 224G11,223C4 y 227H1 fueron comparables con el valor IC50 determinado para HGF no radiomarcado, que esta comprendido entre 3 y 5 nM, mientras que el anticuerpo 11E1 exhibio un valor IC50 superior.

Ejemplo 5: Inhibicion de invasion por anticuerpos anti-c-Met

Para evaluar el efecto inhibitorio de los anticuerpos anti-c-Met en el proceso de invasion, celulas A549 se revistieron en la camara superior de camaras de invasion BD BioCoat™ Matrigel™ (pozos con diametro de 6.5 mm con membranas de policarbonato con pre-tamano de 8-pm). Celulas A459 se ayunaron 24 horas antes de realizar el ensayo de invasion. Despues, 500 000 celulas a A549 se revistieron en amortiguador de quimiotaxia (medio DMEM, BSA 0.1%, Hepes 12 mM) en el pozo superior de cada camara, sobre el revestimiento de Matrigel, ya sea con o sin el anticuerpo a probar (concentracion Mab final 10 pg/ml). Despues de 1 hora de incubacion de las placas a 37 grados C con CO2 al 5%, las camaras inferiores se llenaron, ya sea con medio de crecimiento que contiene 400 ng/ml de rhHGF o con medio de crecimiento solo. Las camaras se incubaron por 48 horas adicionales a 37 grados C con CO2 al 5%. Al final de este tiempo de incubacion, celulas que permanecen en la superficie superior del filtro se retiraron suavemente con una torunda de algodon, celulas que migraron a la superficie inferior del filtro se lisaron, tineron con amortiguador de tincion CyQuant GR (Invitrogen) y contaron utilizando un lector de fluorescencia Berthold Mithras LB940. Todas las condiciones se probaron como triplicados.

Como se espero HGF induce una invasion significante de celulas de tumor, comparables con la observada con FCS

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al 10% introducido como un control positivo (Figura 8). El IgG1 9G4 murino introducido como un control de isotipo no tiene efecto significante en invasion inducida HGF o basal, cuando se compara con celulas revestidas sin IgG. No se noto efecto agonista con 11E1, 224G11, 223C4 y 227H1 cuando se agregan solos y una inhibicion significante y comparable de la invasion inducida por HGF se observa con los 3 Mabs.

Ejemplo 6: Inhibicion de sanacion de heridas por anticuerpos anti-c-Met

HGF estimula la movilidad. Para determinar si los anticuerpos anti-HGF fueron capaces de inhibir migracion, celulas NCI-H441 se desarrollaron a alta densidad y se introdujo un espacio con una punta de pipeta P200. Las celulas despues se estimularon para migrar a traves del espacio con hGf (100 ng/ml), en presencia o ausencia de 11E1. pocillos con 11E1 solos, fueron tambien evaluados. Cada condicion de prueba se evaluo como un sextuplicado y 3 experimentos independientes se realizaron. Despues de una incubacion durante la noche, las celulas se visualizaron con una Axio Vision Camera (objetivo x4).

HGF induce una migracion significante resultando en un cierre completo del espacio dentro de una noche (Figura 9). IgG1 irrelevante 9G4 empleado como un control de isotipo no tiene efecto alguno en migracion celular. Como se espero, se observo un efecto agonista con 5D5 cuando se agrega solo pero una inhibicion significante de migracion celular se observa con este anticuerpo en presencia de HGF en la porcion del espacio que permanece abierto. El fragmento Fab de 5D5 esta sin efecto agonista cuando se agrega solo. Sin embargo, no se observa actividad de este fragmento en la presencia de HGF. Como se observa con el control de isotipo 9G4, MAb 11E1 no tuvo efecto agonista cuando se agrega solo y se comporta como un antagonista completo en la presencia de HGF.

Ejemplo 7: Ensayo de Dispersion

Celulas SK-HEP-1 se sembraron a baja densidad (1.104 celulas/pozo) en una placa de 24-pozos en DMEM con FCS al 10% y desarrollan por 24 horas antes de adicion, al mismo tiempo, de HGF (100 ng/ml) y los anticuerpos a probar (10 |jg/ml). Despues de 72 horas de incubacion, se fijaron y tineron colonias con violeta cristal al 0.2% en metanol y estimaron por dispersion visualmente. Cada condicion probada se probo en triplicado y se realizaron 3 experimentos independientes.

La adicion de HGF a celulas SK-HEP-1 induce una dispersion significante de celulas (Figuras 10A y 10B). El anticuerpo 9G4 introducido como un control de isotipo no tiene efecto ni solo o en la presencia de HGF. Como se espera, el anticuerpo 5D5 exhibe un efecto agonista significante solo y no se observa efecto inhibitorio cuando se agrega 5D5 con HGF (Figura 10A). No se observa efecto agonista ni con 11E1 (Figura 10A) ni con 224G11 (Figura 10B) agregados solos. Un efecto inhibitorio muy significante de estos anticuerpos se demuestra en la presencia de HGF (Figuras 10A y 10B).

Ejemplo 8: Ensayo de Tubulogenesis Tri-dimensional

Celulas SK-HEP-1 se sembraron a 1.104 celulas/pozo en una placa de 24 pocillos en DMEM con FCS al 10%/Matrigel (50/50) e incubaron por 30 minutos antes de adicion, al mismo tiempo, de HGF (100 ng/ml) y los anticuerpos a probar (10 jg/ml). Despues de 7 dfas de incubacion, las celulas se estimaron visualmente por formacion de tubos. Cada condicion probada se realizo como un triplicado y se efectuaron 3 experimentos independientes.

La adicion de HGF induce una formacion de tubo SK-HEP-1 significante (Figura 11). El anticuerpo 9G4 introducido como un control de isotipo no tuvo efecto ni solo ni en la presencia de HGF. Como se espera, el anticuerpo 5D5 exhibe un efecto agonista significante solo y no se observa efecto inhibitorio cuando 5D5 se agrega con HGF. No se observa efecto agonista con 11E1,223C4 y 224G11 agregados solos y un efecto inhibitorio completo se demuestra tanto con 11E1 como 223C4, en la presencia de HGF. Una inhibicion parcial pero significativa se observa con 224G11Mab.

Ejemplo 9: Formacion de Esferoide

Para evaluar la capacidad de anticuerpos anti-c-Met para inhibir el crecimiento de tumor in vitro, en un modelo cercano a una situacion in vivo, se generaron esferoides de celulas de glioblastoma humano U-87MG (ATCC # HTB- 14). Las celulas desarrolladas como una monocapa se desprendieron con tripsina-EDTA y resuspenden en medio de cultivo celular completo (DMEM) suplementado con FBS al 10%. Se iniciaron esferoides al inocular 625 celulas en pocillos sencillos de fondo redondo, 96 placas en DMEM-FCS al 10%. Para impedir adhesion celular a un sustrato, las placas se prerrevistieron con polyHEMA en etanol al 95% y secaron al aire a temperatura ambiente. Las placas se incubaron bajo condiciones de cultivo celular estandar a 37 grados C, CO2 al 5% en incubadoras humidificadas. Anticuerpos monoclonales purificados (10 jg/ml) se agregaron despues de 3 y 7 dfas de cultivo de esferoide. HGF (400 ng/ml) se agrega una vez despues de 4 dfas de cultivo. Los esferoides se mantienen en cultivo por al menos 10 dfas. Despues, se supervisa crecimiento de esferoides al medir el area de esferoides utilizando un modulo de auto- medicion del soporte logico o programa axiovision. El area se expresa en jm2. 8-16 esferoides se evaluaron por cada condicion.

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Las figuras 12A y 12B mostraron que en la presencia de FCS al 10%, no se observo estimulo cuando HGF se agrega al medio completo. Como se espera, el control de isotipo 9G4 no tiene efecto en crecimiento de esferoides. 11E1 y 223C4 reducen significativamente el crecimiento de esferoides tanto en la presencia como en la ausencia de HGF. No se observo efecto con el fragmento 5D5 Fab.

Ejemplo 10: Actividad in vivo de Mabs anti-c-Met en el modelo de xenoinjerto U87MG

Ratones atimicos de seis a ocho semanas de edad se alojaron en jaulas con tapa de filtro esterilizado, que se mantienen en condiciones esteriles y manipulan de acuerdo con las gmas francesas y europeas. U87-MG, una lmea celular de glioblastoma, expresa c-Met y autocrina para el ligando HGF se selecciona para evaluaciones in vivo. Se inyectaron ratones subcutaneamente con 5x106 celulas. Despues, seis dfas despues de implante celular, los tumores fueron medibles (aproximadamente 100 mm3), los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con un tamano de tumor comparable y trataron dos veces a la semana con 1 mg/dosis de cada anticuerpo a probar. Los ratones fueron seguidos para la observacion de velocidad de crecimiento de xenoinjerto y cambios en peso corporal. Volumen de tumor se calcula por la formula: n (Pi)/6 X longitud X ancho X altura.

Los resultados obtenidos se resumen en la Figura 13 y demuestran que todos los anticuerpos probados inhiben significativamente el crecimiento in vivo de celulas U87-MG. El uso de un anticuerpo anti-IGF-1R neutralizante (IgG1) en el panel A, demuestra que la inhibicion in vivo observada, se relaciona espedficamente con una modulacion del eje HGF-cMet.

Ejemplo 11: Actividad in vivo de Mabs anti-c-Met en el modelo de xenoinjerto NCI-H441

NCI-H441 se deriva de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altos niveles de c-Met y demuestra fosforilacion constitutiva de c-Met RTK.

Para determinar si esta lmea celular expresa altos niveles de c-Met y es capaz de producir HGF, se realizaron tanto RT-PCRs cuantitativos como FACS o ELISA (Quantikine HGF; R&D systems). Para RT-PCRs cuantitativos, HGF total o niveles de expresion de transcripcion cMet en lmeas celulares se estimaron por PCR cuantitativo utilizando la tecnica TaqManMR estandar. Nivel de transcripcion c-Met o HGF se normalizaron a la protema ribosomica de gen domestico o constitutivo, grande, P0 (RPL0) y los resultados se expresan como valores de expresion normalizados (metodo 2-ddCT).

Los conjuntos o juegos de cebador/sonda para RPL0 fueron directo, 5'-gaaactctgcattctcgcttcctg-3' (SEC ID No. 47); inverso, 5 '-aggactcgtttgtacccgttga-3 ' (SEC ID No. 48); y sonda, 5 '-(FAM)-tgcagattggctacccaactgttgca-(TAMRA)-3' (SEC ID No. 49). Los juegos cebador/sonda para HGF fueron directo, 5'-aacaatgcctctggttcc-3' (SEC ID No. 50); inverso, 5'-cttgtagctgcgtcctttac-3' (SEC ID No. 51); y sonda, 5 '-(F AM)- ccttcaatagcatgtcaagtggagtga-(TAMRA)-3' (SEC ID No. 52). Los juegos cebador/sonda para cMet fueron delantero, 5'-cattaaaggagacctcaccatagctaat-3' (SEC ID No. 53); inverso, 5'-cctgatcgagaaaccacaacct-3' (SEC ID No. 54); y sonda, 5 '-(F AM)- catgaagcgaccctctgatgtccca- (TAMRA)-3' (SEC ID No. 55). El protocolo de termociclado consistio de fundir a 50 grados C por 2 minutos y 95 grados C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos a 95 grados C por 15 segundos y 62 grados C por 1 minuto.

No se encontro ARNm para HGF en NCI-H441 (Figura 14) y HGF no es detectable por ELISA en sobrenadantes de NCI-H441. En estos experimentos U87-MG, una lmea celular de glioblastoma conocida como una lmea celular autocrina para HGF, se introduce como un control positivo. El analisis RT-PCR mostro un nivel significante de ARNm de HGF en U87-MG y 1.9 ng de HGF/millon de celulas se detectan en el sobrenadante de celulas U87-MG. Tanto analisis cuantitativo RT-PCRs como FACS Figuras 15A y 15B, demostro que como se esperaba celulas NCI-H441 sobre expresan significativamente c-Met y que esta expresion fue dramaticamente superior a la observada para celulas U87-MG. En este experimento, la lmea celular MCF-7 se introduce como un control negativo. Tomado en conjunto NCI-H441 aparece como una lmea celular no autocrina activada en forma constitutiva, capaz de desarrollar independientemente de ligando HGF en donde una dimerizacion independiente de ligando de c-Met ocurre como una consecuencia de la sobreexpresion del receptor.

La evaluacion de anticuerpos anti-c-Met en la actividad in vivo de esta lmea celular no autocrina puede dar lugar a ciertas percepciones respecto a su potencia para impactar en dimerizacion de c-Met.

La Figura 16 demuestra que 224G11, 11E1 y 227H1 inhiben significativamente el crecimiento in vivo de NCI-H441, sugiriendo que ademas de inhibicion dependiente de ligando, estos anticuerpos capaces de inhibir dimerizacion, son tambien capaces de hacer blanco a una inhibicion independiente de ligando de c-Met. Como se menciono anteriormente, en la memoria, con esa ultima propiedad 224G11, 11E1 y 227H1 se muestran diferentes del anticuerpo anti-c-Met 5D5 de un brazo (OA-5D5).

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Ejemplo 12: Proceso de humanizacion por injerto-CDR del anticuerpo 224G11

I - Humanizacion del dominio variable de cadena ligera

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 224G11VL con genes de celulas germinales murinos

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 224G11 VL se comparo con las secuencias de genes de celulas germinales bovinas parte de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr).

Los genes de celulas germinales IGKV3-5*01 y IGKJ4*01 murinos con una identidad de secuencia de 99.31% para la region V y 94.28% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido utilizar directamente las secuencias 224G11VL para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 17A para el gen V y 17B para el gen J.

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 224G11VL con los genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, se ha buscado el gen de celulas germinales humanas que exhibe la mejor identidad con 224G11VL. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos de 224G11VL se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT. Para optimizacion de la seleccion, alineamientos entre las secuencias de protema se realizaron para buscar mejores homologfas.

Estos dos metodos complementarios llevaron a la identificacion de dos secuencias V humanas receptoras posibles para las 224G11 VL CDRs murinas. Alineamiento nucleotidico da a los genes de celulas germinales IGKV3- 11*01 humanas con una identidad de secuencia de 75.99% mientras que el alineamiento proteico da a los genes de celulas germinales IGKV4-1*01 humanas con una identidad de secuencia de 67.30%. Debe apreciarse que en ambos casos, los dos genes de celulas germinales mas cercanos y las secuencias analizadas muestran diferentes longitudes de aminoacidos CDR1 (10 aminoacidos en 224G11 VL; 6 aminoacidos en IGKV3-11*01; 12 aminoacidos en IGKV4-1*01).

Para la region J, la mejor calificacion de homologfa se obtuvo primero con IGKJ3*01 humano que muestra una identidad de secuencia de 80%. Pero un numero superior de nucleotidos identicos consecutivos y mejor ajuste de aminoacidos se ha encontrado en el alineamiento con el gen de celulas germinales IGKJ4*02 humanas (identidad de secuencia de 77.14%). De esta manera, se elige el gen de celulas germinales IGKJ4*02 que recibe la region J humana para los 11E1 VL CDRs murinos.

Los alineamientos se representan en las Figuras 18A para la region V y 18B para la region J.

Version humanizada de 224G11 VL

Dada la posibilidad de dos regiones V humanas receptoras para las 224G11 VL CDRs murinas, dos versiones humanizadas del dominio 224G11 se describiran. La primera corresponde a una prueba inicial para un marco humano con una longitud CDR1 mas corta (IGKV3-11*01), la segunda con una longitud de CDR1 mas larga (IGKV4- 1*01).

a) Version humanizada basada en IGKV3-11*01 de 224G11 VL

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGKV3-11*01 y IGKJ4*02 y tambien las CDR de 224G11 VL murino con los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 19A, los residuos en negrita en la secuencia 224G11 VL corresponden a los veinticinco aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio de 224G11 VL y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGKV3-11*01 y IGKJ4*02).

Respecto a los varios criterios tales como su participacion conocida en la interfase VH/VL, en enlace de antfgeno o en la estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre los residuos murinos y humanos, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, tres de los veinticinco residuos diferentes se han identificado para mutar eventualmente. Estos tres residuos definidos mas importantes y mutaciones en sus contra-partes humanas son M39 murino en L humano, H40 en A y R84 en G. Estos residuos con rango uno se muestran en la Figura 19a, como residuos en negrita en la secuencia 224G11 HZlVL en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados a probarse no se limitan pero deben considerarse como mutaciones preferidas.

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Con el auxilio de un modelo molecular, otras mutaciones pueden ser identificadas. Pueden mencionarse los siguientes residuos con rango dos, es decir los residuos 15 (L/P), 49 (P/A), 67 (L/R), 68 (E/A), 93 (P/S) y 99 (V/F) en los que las mutaciones tambien pueden concebirse en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados a probarse eventualmente, no se limitan pero deben considerarse como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los otros dieciseis residuos rango tres entre los veinticinco diferentes aminoacidos, pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se probaran individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 19A representa el 224G11 VL humanizado con base en IGKV3-11*01 implementado con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara la mutacion.

b) Version humanizada basada en IGKV4-1*01 de 224G11 VL

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGKV4-1*01 y IGKJ4*02 y tambien las CDR de la 224G11 VL murina a los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 19B, los residuos en negrita en la secuencia 224G11 VL corresponden a veintidos aminoacidos que encontraron diferentes entre el dominio de 224G11 VL y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGKV4-1*01 y IGKJ4*02).

Respecto a los varios criterios tales como su participacion conocida en la interfase VH/VL, el enlace de antfgeno o en estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre los residuos murinos y humanos, la localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, cuatro de los veintidos residuos diferentes se han identificado eventualmente mutados. Estos cuatro residuos definidos mas importantes y mutaciones en sus contra-partes humanas son el L4 murino en M humano, M39 en L, H40 en A y R84 en G. Estos residuos de rango uno se muestran en la Figura 19B como residuos en negrita en la secuencia 224G11 HZ2VL en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados a probarse, no se limitan pero deben considerarse como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir residuos 25 (A/S), 66 (N/T), 67 (L/R), y 93 (P/S) en donde mutaciones tambien pueden ser concebidas en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados a probarse eventualmente no se limitan pero deben considerarse como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los otros catorce residuos rango tres entre los veintidos diferentes aminoacidos pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se probaran individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 19B representa la 224G11 VL humanizada con base en IGKV4-1*01, con las mutaciones anteriormente mencionadas previamente identificadas con mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

II - Humanizacion del dominio variable de cadena pesada

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 224G11 VH con genes de celulas germinales murinos

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 224G11 VH se compara con las secuencias de genes de celulas germinales murinas parte de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr).

Los genes de celulas germinales IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 y IGHJ2*01 murinos con una identidad de secuencia de 92.70% para la region V, 75.00% para la region D y 89.36% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido el utilizar directamente las secuencias 224G11 VH para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 20A para el gen V, 20B para el gen D y 20C para el gen J.

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Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 224G11 VH con los genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con 224G11 VH se ha buscado. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos 224G11 VH se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT. Para optimizacion de la seleccion, se hicieron alineamientos entre las secuencias de protema para buscar mejores homologfas.

Estos dos metodos complementarios llevaron a la identificacion de la misma secuencia IGHV1-2*02 V humana receptora para las 224G11 VH CDRs murinas con una identidad de secuencia de 75.00% al nivel de nucleotidos y 64.30% a nivel de protema.

Vale la pena apreciar que la region D pertenece estrictamente a la region CDR3 en el dominio VH. El proceso de humanizacion se basa en un enfoque de "injerto CDR". Analisis de los genes D humanos mas cercanos no es util en esta estrategia.

Buscando homologfas para la region J lleva a la identificacion del gen de celula germinal IGHJ4*04 humano con una identidad de secuencia de 78.72 %.

El gen de celula germinal IGHV1-2*02 V humano y el gen de celula germinal IGHJ4*01 J humano, de esta manera se han seleccionado como las secuencias humanas receptoras para las 224G11 VH CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 21A para la region V y 21B para la region J.

Version humanizada de 224G11 VH

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGHV1-2*02 y IGHJ4*01 y tambien las CDRs del 224G11 VH murino con los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 22, los residuos en negrita en la secuencia 224G11 VH corresponden a los treinta aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 224G11 VH y los fragmentos humanos selectos (RF humano, es decir IGHV1-2*02 y IGHJ4*01).

Respecto a los varios criterios tales como su conocida participacion en la interfase VH/VL, en enlace de antfgeno o en la estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre residuos murinos y humanos, la localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, cuatro de los treinta diferentes residuos se han identificado mutados eventualmente. Estos cuatro residuos definidos mas importantes y mutaciones en sus contra-partes humanas son D51 murino en E humano, G55 en W, V80 en R y K82 en T. Estos residuos rango uno se muestran en la Figura 22, como residuos en negrita en la secuencia 224G11 HZVH en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba no estan limitados sino que deben ser considerados como mutaciones preferidas.

A partir de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir los residuos 25 (T/A), 48 (E/Q), 49 (S/G), 53 (I/M), 76 (A/V), 78 (L/M) y 90 (D/E), en donde mutaciones tambien pueden ser concebidas en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba eventualmente, no estan limitados pero deben considerarse como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los otros diecinueve residuos rango tres entre los treinta diferentes aminoacidos pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se probaran individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 22 representa la 224G11 VH humanizada con las mutaciones anteriormente mencionadas, claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

Ejemplo 13: Proceso de humanizacion por injerto CDR del anticuerpo 227H1

I - Humanizacion del dominio variable de cadena ligera

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 227H1 VL con los genes de celulas germinales murinas.

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 227H1 VL se comparo con las secuencias de genes de celulas germinales murinas parte de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr).

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Los genes de celulas germinales IGKV3-5*01 y IGKJ4*01 murinas con una identidad de secuencia de 96.90% para la region V y 97.29% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido emplear directamente las secuencias 227H1 VL para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 23A para el gen V y 23B para el gen J.

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 227H1 VL con los genes de celulas germinales humanas.

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humano que exhibe la mejor identidad con 227H1 VL. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos de 227H1 VL se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT. Para optimizacion de la seleccion, se realizaron alineamientos entre secuencias de protema para buscar mejores homologfas.

Estos dos metodos complementarios llevaron a la identificacion de dos secuencias V humanas receptoras posibles para las 227H1 VL CDRs murinas. Los alineamientos nucleotfdicos proporcionan al gen de celula germinal IGKV3- 11*01 humana con una identidad de secuencia de 74.91%, mientras que el alineamiento proteico proporciona al gen de celula germinal IGKV4-1*01 humana con una identidad de secuencia de 64.00%. Debe apreciarse que en ambos casos, estos dos genes de celulas germinales mas cercanos y las secuencias analizadas muestran diferentes longitudes de aminoacidos CDR1 (10 aminoacidos en 227H1 VL; 6 aminoacidos en IGKV3-11*01; 12 aminoacidos en IGKV4-1*01).

Para la region J, la mejor calificacion de homologfa se obtuvo primero con el IGKJ3*01 humano que muestran una identidad de secuencia de 78.38%. Pero un numero superior de nucleotidos identicos consecutivos y un mejor ajuste de aminoacidos se han encontrado en el alineamiento con el gen de celulas germinales IGKJ4*02 humano (identidad de secuencia de 75.68%). De esta manera, el gen de celulas germinales IGKJ4*02 se selecciona como la region J humana receptora para las 227H1 VL CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 24A para la region V y 24B para la region J.

Version humanizada de 224G11 VL

Dada la posibilidad de dos regiones V humanas receptoras para las 227H1 VL CDRs murinas, se describiran dos versiones humanizadas del dominio 227H1 VL. La primera corresponde a una prueba inicial para un marco humano con una longitud CDR1 mas corta (IGKV3-11*01), la segunda con una longitud CDR1 mas larga (IGKV4-1*01).

a) Version humanizada de 227H1 VL basada en IGKV3-11*01

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGKV3-11*01 e IGKJ4*02 y tambien las CDRs del 227H1 VL murino con los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 25A, los residuos en negrita en la secuencia 227H1 VL corresponden a los veintiseis aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 227H1 VL y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGKV3-11*01 y IGKJ4*02).

Respecto a los varios criterios tales como su conocida participacion en la interfase VH/VL, en enlace de antfgeno o en estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre los residuos murinos y humanos, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, tres de los veintiseis residuos diferentes se han identificado como eventualmente mutados. Estos tres residuos mas importantes definidos y mutaciones en sus contra-partes humanas son 139 murino en L humano, H40 en A y R84 en G. Estos residuos de rango uno se muestran en la Figura 25A como residuos en negrita en la secuencia 227H1 HZ1VL en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba no estan limitados sino que deben considerarse como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir residuos 15 (L/P), 25 (V/A), 49 (P/A), 67 (L/R), 68 (E/A), 93 (P/S) y 99 (S/F) en donde las mutaciones tambien pueden concebirse en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba eventualmente, no estan limitados sino que deben ser considerados como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, pueden reconsiderarse todos los otros dieciseis residuos rango tres entre los veinticinco diferentes aminoacidos.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se probaran en forma individual o de acuerdo con diversas

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combinaciones.

La Figura 25A representa el 227H1 V1 humanizado basado en IGKV3-11*01 implementado con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

b) Version humanizada de 227H1 VL basada en IGKV4-1*01

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en ligar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGKV4-1*01 y IGKJ4*02 y tambien las CDR del 227H1 VL murino con los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 25B, los residuos en negrita en la secuencia 227H1 VL corresponden a los veinticuatro aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 227H1 VL y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGKV4-1*01 y IGKJ4*02).

Respecto a los varios criterios tales como su conocida participacion en la interfase VH/VL, en enlace de antfgeno o en la estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre los residuos murinos y humanos, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, cuatro de los veinticuatro diferentes residuos se han identificado mutados eventualmente. Estos cuatro residuos mas importantes definidos y mutaciones en sus contra-partes humanas son L4 murino en M humano, 139 en L, H40 en A y R84 en G. Estos residuos rango uno se muestran en la Figura 25B como residuos en negrita en la secuencia 227H1 HZ2VL en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba no estan limitados sino que deben ser considerados como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir los residuos 25 (V/S), 66 (N/T), 67 (L/R) y 93 (P/S) en los que las mutaciones tambien pueden concebirse en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que van a someterse a prueba eventualmente no estan limitados sino que deben ser considerados como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los dieciseis otros residuos rango tres entre los veintidos aminoacidos diferentes pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se probaran individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 25B representa el 227H1 VL humanizado con base en IGKV4-1*01 implementado con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

II - Humanizacion del dominio variable de cadena pesada

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 227H1 VH con los genes de celulas germinales murinas

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 227H1 VH se compara con la secuencias de genes de celulas germinales murinas parte de la base de datos IMGT (
http://imgt.ciiies.fr).

Genes de celulas germinales IGHV1-18*01, IGHD1-1*02 e IGHJ2*01 murinas con una identidad de secuencia de 92.70% para la region V, 63.63% para la region D y 91.48% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido usar directamente las secuencias 227H1 VH para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 26A para el gen V, 26B para el gen D y 26C para el gen J.

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 227H1 VH con los genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con 224G11 VH. Para este objetivo, la secuencia nucleotidico de 227H1 VH se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT. La secuencia IGHV1- 2*02 V humana receptora para las 224G11 VH CDRs murinas con una identidad de secuencia de 72.92% de esta manera se identifico.

Debe apreciarse que la region D pertenece estrictamente a la region CDR3 en el dominio VH. El proceso de humanizacion se basa en un enfoque de "injerto CDR". El analisis de los genes D humanos mas cercanos no es util en esta estrategia.

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Buscando homolog^as para la region J lleva a la identificacion del gen de celula germinal IGHJ4*01 humana con una identidad de secuencia de 78.72%.

El gen de celulas germinales IGHV1-2*02 V humanas y el gen de celulas germinales IGHJ4*01 J humanas de esta manera se han seleccionado como las secuencias humanas receptoras para las 227H1 VH CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 27A para la region V y 27B para la region J.

Para optimizacion de la seleccion, el experto en la materia tambien puede realizar alineamientos entre las secuencias de protema a fin de ayudarles en la seleccion.

Version humanizada de 227H1 VH

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGHV1-2*02 y IGHJ4*01 y tambien las CDRs del 227H1 VH murino con los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 28, los residuos en negrita en la secuencia 227H1 VH corresponden a los treinta y dos aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 227H1 VH y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGHV1-2*02 y IGHJ4*01).

Respecto a los varios criterios tales como su participacion conocida en la interfase VH/VL, en enlace de antfgeno o en estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre los residuos murinos y humanos, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, seis de lois treinta y dos residuos diferentes se han identificado mutados eventualmente. Estos seis residuos mas importantes definidos y mutaciones en sus contra-partes humanas son L39 murino en M humano, N40 en H, L55 en W, T66 en N, V80 en R y K82 en T. Estos residuos rango uno, se muestran en la Figura 28 como residuos en negrita en la secuencia 227H1 HZVH en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados a probarse no estan limitados sino deben considerarse como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir los residuos 48 (K/Q), 49 (T/G), 53 (I/M), 76 (A/V) y 78 (L/M) en donde las mutaciones tambien pueden conceptuarse en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba eventualmente no estan limitados sino que deben ser considerados como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los veintiun otros residuos rango tres entre los treinta diferentes aminoacidos pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se someten a prueba individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 28 representa el 227H1 VH humanizado con las mutaciones anteriormente mencionadas, claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

Ejemplo 14: Proceso de humanizacion por injerto CDR del anticuerpo 223C4

I - Humanizacion del dominio variable de cadena ligera

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 223C4 VL con los genes de celulas germinales murinas

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 223C4 VL, se comparo con las secuencias de genes de celulas germinales murinas parte de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr) .

Los genes de celulas germinales IGKV12-46*01 y IGKJ2*01 murinas con una identidad de secuencia de 99.64% para la region V y 94.59% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido el utilizar directamente las secuencias 223C4 VL para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 29A para el gen V y 29B para el gen J.

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 223C4 VL con genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con 223C4 VL. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos de 223C4 VL se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT.

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Los genes de celulas germinales IGKV1-NL1*01 y IGKJ2*01 humanas con identidad de secuencia de 78.49% para la region V y 81.08% para la region J, respectivamente se han identificado. Los genes de celulas germinales IGKV1- NL1*01 para la region V y IGKJ2*01 para la region J de esta manera se han seleccionado como secuencias humanas receptoras para las 223C4 VL CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 30A para la region V y 30B para la region J.

Para optimizacion de la seleccion, el experto en la materia tambien puede realizar alineamientos entre las secuencias de protema a fin de ayudarle en la seleccion.

Version humanizada de 223C4 VL

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGKV1-NL1*01 y IGKJ2*01 y tambien las CDRs de 223C4 VL murinos a los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

En esta etapa de proceso, un modelo molecular de dominios Fv murinos 223C4 puede desarrollarse y es util en la seleccion de los residuos murinos que deben conservarse debido a sus papeles en el mantenimiento de la estructura tri-dimensional de la molecula o en el sitio de enlace y funcion de antfgeno. Mas particularmente, 9 residuos que deben mutar, eventualmente se han identificado.

En una primera etapa, se someten a prueba los residuos involucrados en las anclas CDR o estructura. Estos residuos son el residuo 66 (R/N) y el residuo 68 (E/V).

En una segunda etapa, los residuos expuestos a solvente, y como tales que pueden involucrar inmunogenicidad, tambien se someten a prueba. Estos son los residuos 49 (A/S), 51 (K/Q), 69 (S/D), 86 (D/Q) y 92 (S/N).

Despues, en una tercera etapa, los residuos involucrados en estructura/plegamiento de dominio variable tambien pueden mutarse. Estos residuos son el residuo 46 (P/Q) y el residuo 96 (P/S).

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba no estan limitados pero deben considerarse como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, otras mutaciones pueden ser identificadas. Pueden mencionarse los siguientes residuos, es decir los residuos 9 (S/A), 13 (A/V), 17 (D/E), 18 (R/T), 54 (L/V), 88 (T/S), 90 (T/K), 100 (A/G) y 101 (T/S), en los que las mutaciones tambien pueden concebirse en otra forma de realizacion preferida.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se someten a prueba individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 31 representa 223C4 VL humanizado con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el que se realizara la mutacion.

II - Humanizacion del dominio variable de cadena pesada

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 223C4 VH con genes de celulas germinales murinas

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 223C4 VH se comparo con las secuencias de genes de celulas germinales murinas parte de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr).

Los genes de celulas germinales IGHV1-18*01, IGHD6-3*01 y IGHJ4*01 murinas con una identidad de secuencia de 98.95% para la region V, 72.72% para la region D y 98.11% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido el utilizar directamente las secuencias 223C4 VH para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 32A para el gen V, 32B para el gen D y 32C para el gen J.

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 223C4 VH con los genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con 223C4 VH se ha buscado. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos de 223C4 VH se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT.

Los genes de celulas germinales IGHV1-2*02, IGHD1-26*01 y IGHJ6*01 humanas con una identidad de secuencia de 76.38% para la region V, 75.00% para la region D y 77.41% para la region J, respectivamente, se han

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identificado. Los genes de celulas germinales IGHV1-2*02 para la region V y IGHJ6*01 para la region J, de esta manera se han seleccionado que reciben las secuencias humanas para las 223C4 VH CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 33A para la region V, 33B para la region D y 33C para la region J.

Para optimizacion de la seleccion, el experto en la materia tambien puede hacer alineamientos entre las secuencias de protema a fin de ayudarse en la seleccion.

Version humanizada de 223C4 VH

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGHV1-2*02 y IGHJ6*01 y tambien las CDR de 223C4 VH murino a los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

En esta etapa del proceso, un modelo molecular de los dominios Fv murinos 223C4 puede desarrollarse y es util en la seleccion de los residuos murinos que deben conservarse debido a sus papeles en el mantenimiento de la estructura tri-dimensional de la molecula o en la funcion y sitio de enlace de antfgeno. Mas particularmente, se han identificado 14 residuos que deben mutar eventualmente.

En una primera etapa, se probaran residuos involucrados en la estructura o anclas CDR. Estos residuos son los residuos 40 (H/D), 45 (A/S), 55 (W/D), 66 (N/I) y 67 (Y/F).

En una segunda etapa, residuos expuestos a solvente, y como tal que pueden involucrar inmunogenicidad, tambien se someten a prueba. Estos son los residuos 1 (Q/E), 3 (Q/L), 5 (V/Q), 48 (Q/M) y 80 (R/V).

Despues, en una tercera etapa, residuos involucrados en estructura/plegamiento de dominio variable tambien pueden mutarse. Estos son los residuos 9 (A/P), 13 (K/V), 22 (S/P) y 46 (P/H).

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que se deben someter a prueba, no son limitados sino deben ser considerados como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos, es decir los residuos 12 (V/L), 21 (V/I), 43 (R/K), 49 (G/S), 53 (M/I), 68 (A/N), 72 (Q/K), 75 (R/K), 76 (V/A), 78 (M/L), 82 (T/K), 84 (I/S), 92 (S/R), 93 (R/S), 95 (R/T) y 97 (D/E), en los cuales mutaciones tambien pueden concebirse en otra forma de realizacion preferida.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se someten a prueba individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 34 representa el 223C4 VH humanizado con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara la mutacion.

Ejemplo 15: Actividad anti-tumor de 224G11 MAb murina sola o combinada con el agente quimioterapico Navelbine® en el modelo de tumor NCI-H441 de xenoinjerto establecido

Los enfoques quimioterapicos exitosos dependen en parte de la respuesta celular a inductores apoptosicos y el balance entre las rutas pro- y anti-apoptosica dentro de la celula. El efecto protector de c-Met activado en supervivencia celular se ha documentado. Primordialmente resulta de una expresion incrementada de la protema Bcl-2 y Bcl-x1 anti-apoptosica como consecuencia de senalizacion mediada por PI3-K que a su vez inhibe la apoptosis dependiente mitocondrial (caspasa 9). Sin duda, se concibe que el sistema HGF/c-Met con su efecto regulatorio marcado en proceso apoptosico tambien puede influenciar la quimiosensibilidad de celulas de cancer. Esta hipotesis como se ha probado con Navelbine®, un agente quimioterapico comercializado utilizado para tratamiento de cancer pulmonar (Aapro et al., Crit.Rev.Oncol.Hematol. 2001, 40:251-263; Curran et al., Drugs Aging. 2002, 19:695-697). El modelo NCI-H441 NSCLC de xenoinjerto se utiliza ya que se ha descrito previamente que esta lmea celular es sensible tanto a Navelbine (Kraus-Berthier et al., Clin.Cancer Res., 2000; 6:297-304) como a terapia que dianiza c-Met (Zou H. T. et al., Cancer Res. 2007, 67: 4408-4417).

Brevemente, las celulas NCI-H441 de ATCC se cultivaron rutinariamente en medio RPMI 1640, FCS al 10% y L- Glutamina al 1%. Las celulas se dividieron dos dfas antes de insercion o injerto prendido, de manera tal que estuviera en la fase de crecimiento exponencial. Diez millones de celulas NCI-H441 se injertaron en PBS a ratones desnudos Swiss de 7 semanas de edad. Tres dfas despues del implante, se midieron tumores y los animales se dividieron en 4 grupos de 6 ratones con tamano de tumor comparable. Los ratones se trataron i.p. con una dosis de carga de 2 mg de 224G11/raton y despues dos veces por semana por 43 dfas, con 1 mg de anticuerpo/raton. 9G4 MAb se utilizo como un control de isotipo.

El Navelbine® se suministro por inyecciones i.p. a una dosis de 8 mg/kg los dfas 5, 12, 19 post-inyeccion de celula.

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Para terapia combinada tanto 224G11 como Navelbine®, los dos compuestos se administraron por separado. En esta experiencia, los 2 compuestos se utilizaron en sus dosis optimas. El volumen de tumor se midio dos veces a la semana y calculo por la formula: p/6 X longitud X ancho X altura.

La Figura 35 demuestra que 224G11 es tan eficiente como Navelbine® cuando se utiliza como una terapia de un agente solo. Un beneficio significante de combinar ambas terapias se observa con regresiones completo de tumor observadas en 3 de 6 ratones al dfa 63.

Ejemplo 16: Inhibidores de c-Met y angiogenesis

Ademas de su papel directo en la regulacion de una variedad de funciones de celulas de tumor, la activacion de c- Met tambien se ha implicado en angiogenesis de tumor. Las celulas endoteliales expresan c-Met y HGF estimula el crecimiento celular endotelial, invasion y movilidad (Nakamura Y. et al., Biochem. Biophys. Res., Commun. 1995, 215:483-488; Bussolino F. et al., J. Cell Biol. 1992, 119:629-641). La regulacion coordinada de crecimiento, invasion y movilidad en celulas endoteliales vasculares por HGF/c-Met, se ha demostrado que resulta en la formacion de tubos endoteliales capilares 3D in vitro (Rosen E. M. et al., Supplementum to Experientia 1991, 59:76-88).

Para determinar una interferencia potencial de Mabs anti-c-Met con angiogenesis inducida por HGF, dos juegos de experimentos se realizaron incluyendo i) la evaluacion de MAbs en proliferacion HUVEC y ii) la prueba de MAbs de formacion de tubo HUVEC.

Para experimentos de proliferacion, 7500 HUVEC se revistieron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos previamente revestida con laminina. Celulas se desarrollaron 24 horas del medio de ensayo EMB-2 suplementado con FBS 0.5% y heparina. Despues, MAbs a probar (0.15 a 40 pg/ml) se agregaron por 1 hora antes de adicion de 20 ng/ml de HGF. Despues de 24 horas adicionales, las celulas se pulsaron con 0.5 pCi de [3H] Timidina. La magnitud de [3H] Timidina incorporada se cuantifico por conteo de centelleo de lfquido. En este experimento, 9G4 MAb es un anticuerpo irrelevante empleado como un control de isotipo IgG1.

Los resultados expresados como datos en bruto en la Figura 36 demuestran que, como se espero HGF es un inductor potencial de crecimiento celular HUVEC. Anticuerpos evaluados en la ausencia HGF no exhiben ninguna actividad proliferativa agonista en HUVEC cualquiera que sea la dosis probada. En presencia de HGF, una inhibicion dependiente de dosis dramatica se observa para ambas 11E1 y 224G11 MAbs.

Para la evaluacion de formacion de tubo HUVEC, 25000 celulas incubadas 30 minutos con anticuerpos a probar, se revistieron en placas de 48 pocillos revestidas con matrigel. Despues HGF 50 ng/ml se agrega y las placas se incubaron a 37 grados C. Medio despues se recolecta y CMFDA 5 pM se agrega por 15 minutos antes de observar al microscopio.

Los resultados mostrados en la Figura 37 demuestran que como se espera HGF induce una formacion de tubo significante. El anticuerpo 9G4 introducido como un control de isotipo IgG1 no tuvo efecto alguno en formacion de tubo inducida por HGF mientras que tanto 11E1 como 224G11 inhiben formacion de tubo dramaticamente.

Ejemplo 17: Proceso de humanizacion por injerto CDR del anticuerpo 11E1

I - Humanizacion del dominio variable de cadena ligera

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 11E1 VL con genes de celulas germinales murinas

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 11E1 VL se comparo con la parte de secuencias de genes de celulas germinales murinas de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr).

Los genes de celulas germinales IGKV4-79*01 y IGKJ4*01 murinas con una identidad de secuencia de 98.58% para la region V y 97.22% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido utilizar directamente las secuencias 11E1 VL para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 38A para el gen V y 38B para el gen J.

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 11E1 VL con genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con 11E1 VL, se ha buscado. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos de 11E1 VL se ha alineado con la parte de secuencias de genes de celulas germinales humanas de la base de datos IMGT.

IGKV3-7*02 y IGKV3D-7*01 humanas con una identidad de secuencia tanto para ambos genes de celulas germinales de 69.86% para la region V, se han identificado. El gen de celula germinal humana IGKV3-7*02 se conoce en la base de datos IMGT como un "ORF" que significa que esta secuencia se ha encontrado en el genoma

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humano pero puede presentar ciertos problemas de recombinacion que llevan a anticuerpos naturales derivados de IGKV3-7*02 no funcionales. De esta manera, el gen de celula germinal IGKV3D-7*01 se selecciona que recibe la region V humana para las 11E1 VL CDRs murinas.

Para la region J, la mejor calificacion de homologfa se obtuvo primero con humano, IGKJ3*01 humana que muestra una identidad de secuencia de 78.38%. Pero un numero superior de nucleotidos identicos consecutivos y un mejor ajuste de aminoacidos se ha encontrado en el alineamiento con el gen de celula germinal IGKJ4*02 humana (identidad de secuencia de 75.68%). De esta manera, el gen de celula germinal IGKJ4*02 se elige que recibe la region J humana para las 11E1 VL CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 39A para la region V y 39B para la region J.

Para la optimizacion de la seleccion, el experto en la materia tambien puede hacer alineamientos entre las secuencias de protema a fin de ayudarle en la seleccion.

Version humanizada de 11E1 VL

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales IGKV3D-7*01 y IGKJ4*02 y tambien las CDR de la 11E1 VL murina a los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 40, los residuos en negrita en la secuencia 11E1 VL corresponden a los treinta aminoacidos que se encuentran diferentes entre el dominio 11E1 VL y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGKV3D-7*01 y IGKJ4*02).

Respecto a los varios criterios tales como su participacion conocida en la interfase VH/VL, en enlace de anticuerpo o en la estructura CDR, la clase de aminoacido cambia entre residuos murinos y humanos, la localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, cuatro de los treinta diferentes residuos se han identificado mutados eventualmente. Estos cuatro residuos definidos mas importantes y mutaciones en sus contra-partes humanas son murino L4 en humano M, Y40 en S, Y87 en F y T96 en P. Estos residuos de rango uno se ilustran en la Figura 40 como residuos en negrita en la secuencia 11E1 HZVL en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba no son limitados sino deben ser considerados con mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, otras mutaciones pueden ser identificadas. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir los residuos 24 (S/R), 53 (W/L), 66 (I/T), 67 (L/R), 86 (S/D), 95 (Q/E), 99 (A/F) o 121 (E/D), en donde las mutaciones tambien pueden ser concebidas en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba eventualmente no estan limitados sino deben ser considerados como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los otros dieciocho residuos rango tres entre los treinta diferentes aminoacidos pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se probaran en forma individual o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 40 representa la 11E1 VL humanizada implementada con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara la mutacion.

II - Humanizacion del dominio variable de cadena pesada

Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 11E1 VH con genes de celulas germinales murinas

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleotidos de 11E1 VH se comparo con la parte de secuencias de genes de celulas germinales murinas de la base de datos IMGT (
http://imgt.cines.fr).

Los genes de celulas germinales IGHV1-7*01, IGHD4-1*01 e IGHJ3*01 murinas con una identidad de secuencia de 94.10% para la region V, 66.67% para la region D y 100% para la region J, respectivamente, se han identificado. Respecto a la identidad obtenida, se ha decidido utilizar directamente las secuencias 11E1 VH para buscar homologfas humanas.

Estos alineamientos se representan en las Figuras 41A para el gen V, 41B para el gen D y 41C para el gen J.

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Comparacion de la secuencia de nucleotidos de 11E1 VH con genes de celulas germinales humanas

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con 11E1 VH. Para este objetivo, la secuencia de nucleotidos de 11E1 VH se ha alineado con las secuencias de genes de celulas germinales humanas parte de la base de datos IMGT. Para optimizacion de la seleccion, se realizaron alineamientos entre las secuencias de protema para buscar mejores homologfas.

Estos dos metodos complementarios llevaron a la identificacion de dos secuencias V humanas receptoras posibles para las 11E1 VH CDRs murinas. Alineamiento nucleotidico da el gen de celula germinal IGHV1-2*02 humana con una identidad de secuencia de 75.69%, mientras que el alineamiento proteico da el gen de celula germinal IGHV1- 46* 01 humana con una identidad de secuencia de 71.10%.

Debe apreciarse que la region D pertenece estrictamente a la region CDR3 en el dominio VH. El proceso de humanizacion se basa en el enfoque de "injerto CDR". Analisis del gen D humano mas cercano no es util en esta estrategia.

Buscando homologfas para la region J lleva a la identificacion del gen de celula germinal IGHJ4*03 humana con una identidad de secuencia de 80.85%.

Buscando similaridades totales y alineamientos de secuencias, el gen de celula germinal IGHV1-46*01 V humana y el gen de celula germinal IGHJ4*03 J humana de esta manera se han seleccionado que reciben secuencias humanas para las 11E1 VH CDRs murinas.

Los alineamientos se representan en las Figuras 42A para la region V y 42B para la region J.

Version humanizada de 11E1 VH

Las siguientes etapas en el proceso de humanizacion consisten en enlazar las secuencias de genes de celulas germinales selectas IGHV1-46*01 e IGHJ4*03 y tambien las CDRs de la 11E1 VH murina a los marcos de estas secuencias de genes de celulas germinales.

Como se ilustra en la Figura 43, los residuos en negrita en la secuencia 11E1 VH, corresponden a los veintiseis aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 11E1 VH y los fragmentos humanos selectos (FR humano, es decir IGHV1-46*01 y IGHJ4*03).

Respecto a los varios criterios tales como su participacion conocida en la interfase VH/VL, en enlace de antfgeno o en estructura CDR, la clase de aminoacidos cambia entre residuos murinos y humanos, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, cinco de los veinteseis diferentes residuos se han identificado mutados eventualmente. Estos cinco residuos definidos mas importantes y mutaciones en sus contrapartes humanas son N40 murino en H humano, Y55 en I, D66 en S, A80 en R y K82 en T. Estos residuos rango uno se ilustran en la Figura 43 como residuos en negrita en la secuencia 11E1 HZVH en donde permanecen murinos.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba no estan limitados sino que deben considerarse como mutaciones preferidas.

Con el auxilio de un modelo molecular, pueden identificarse otras mutaciones. Pueden mencionarse los siguientes residuos rango dos, es decir residuos 53 (I/M), 71 (L/F), 76 (A/V), 78 (L/M) y 87 (A/V) en los que las mutaciones tambien pueden concebirse en otra forma de realizacion preferida.

Por supuesto, los residuos anteriormente mencionados que deben someterse a prueba eventualmente no estan limitados sino que deben considerarse como mutaciones preferidas. En otra forma de realizacion preferida, todos los otros dieciseis residuos rango tres entre los veintiseis diferentes aminoacidos pueden ser reconsiderados.

Todas las mutaciones anteriormente mencionadas se someten a prueba individualmente o de acuerdo con diversas combinaciones.

La Figura 43 representa la 11E1 VH humanizada implementada con las mutaciones anteriormente mencionadas claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara la mutacion.

Ejemplo 18: Efecto de Mabs purificada en fosforilacion c-Met

En el ejemplo 3, el efecto de Mabs anti-c-Met en fosforilacion se estimo con sobrenadantes dosificados de cada hibridoma a evaluar. La prueba se ha realizado de nuevo con 11E1 y 224G11 Mabs purificadas que se han evaluado ya sea a una concentracion final de 30 pg/ml (200 nM) o a un rango de dosis de 0.0015 a 30 pg/ml (0.01-200 nM) a

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fin de determinar la IC50 de cada anticuerpo. El protocolo empleado es el mismo que aquel descrito en el ejemplo 3.

Los resultados de 3 experimented independientes se presentan en la Figura 44 y demuestran que una vez purificadas 11E1 y 224G11 no exhiben efecto agonista cuando se agregan solas a celulas A549 y respectivamente 87 y 75% efecto antagonista en presencia de HGF. Como se espera 5D5 Mab introducido como un control positivo agonista mostro un significante efecto agonista (58%) cuando se agrega sola y solo un efecto antagonista moderado (39%) en presencia de HGF. Respecto a calculos de EC50, tanto 11E1 como 224G11 tuvieron IC50S nanomolares.

Ejemplo 19: Combinacion in vivo de 224G11 y Navelbine® en modelo de xenoinjerto NCI-H441

las celulas NCI-H441 de ATCC se cultivaron rutinariamente en medio RPMI 1640, FCS al 10%, L-Glutamina al 1%. Las celulas se dividieron dos dfas antes de insercion estando en fase de crecimiento exponencial. Diez millones de celulas NCI-H441 se injertaron a ratones desnudos artmicos. Cinco dfas despues de implante, los tumores se pudieron medir y los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamano de tumor comparable. Los ratones se trataron i.p. ya sea con una dosis de carga de 2 mg de 224G11 Mab /raton y despues dos veces a la semana con 1 mg de anticuerpo/raton hasta el dfa 38 o con 3 inyecciones de Navelbine® (D5, D12, D19) a 8 mg/kg. Un tercer grupo administrado con el tratamiento combinado tambien se incluyo. Navelbine® se suministro por inyecciones i.p. El volumen de tumor se midio dos veces a la semana y calculo por la formula: n/6 X longitud X ancho X altura y los pesos de animales se supervisaron cada dfa sobre el periodo de tratamiento de Navelbine®. Analisis estadfstico se realizo en cada tiempo medido utilizando ya sea una prueba t o una prueba Mann-Whitney. En este experimento, el volumen de tumor promedio de los grupos tratados de modalidad sencilla se reduce en 72%, 76% y 99.8% para 224G11, Navelbine® y Navelbine® + 224G11 respectivamente el dfa 41 post primera inyeccion. El dfa 41, la terapia combinada mejoro significativamente el crecimiento de tumor en comparacion con los tratamientos de terapia sencillos (p<0.041 comparado con Navelbine® solo y p<0.002 comparado con 224G11 solo el dfa 41), 4 de 6 ratones estan sin tumor en el grupo de terapia combinada. Los resultados se representan en la Figura 45.

Estos resultados se confirmaron 50 dfas despues del fin de los tratamientos (D88) en donde 66% de ratones que reciben el tratamiento combinado permanecieron libres de tumores.

Ejemplo 20: Combinacion in vivo de 224G11 y Doxorubicina en modelo de xenoinjerto NCI-H441

Celulas NCI-H441 de ATCC se cultivaron rutinariamente en medio RPMI 1640, FCS al 10%, L-Glutamina al 1%. Las celulas se dividieron dos dfas antes de insercion en fase de crecimiento exponencial. Diez millones de celulas NCI- H441 se injertaron en ratones desnudos artmicos. Cinco dfas despues de implante, los tumores se pudieron medir y los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamano de tumor comparable. Los ratones se trataron i.p. ya sea con una dosis de carga de 2 mg de 224G11 Mab/raton y despues dos veces a la semana con 1 mg de anticuerpo/raton o con 4 inyecciones de Doxorubicina (D5, D12, D19, D26) a 5 mg/kg. Un tercer grupo administrado con el tratamiento combinado tambien se incluyo. Doxorubicina se suministro por inyecciones i.v. El volumen de tumor se midio dos veces a la semana y calculo por la formula: n/6 X longitud X ancho X altura y los pesos de animales se supervisaron todos los dfas durante el periodo de tratamiento con Doxorubicina. Analisis estadfstico se realizo en cada tiempo medido utilizando ya sea una prueba-t o una prueba Mann-Whitney. Tanto terapias sencillas como tratamiento combinado exhiben significante actividad anti-tumor comparada con el grupo de control (p<0.002 de D11 a D39). Los resultados se representan en la Figura 46.

El tratamiento combinado tambien demuestra una actividad de crecimiento antitumoral significante en comparacion con un tratamiento de modalidad sencilla entre D11 y D39 indicando que existe un beneficio en combinar Doxorrubicina con un tratamiento anti-c-Met.

Ejemplo 21: Combinacion in vivo de 224G11 y Docetaxel en modelo de xenoinjerto NCI-H441

Las celulas NCI-H441 de ATCC se cultivaron rutinariamente en medio RPMI 1640, FCS al 10%, L-Glutamina al 1%. Las celulas se dividieron dos dfas antes de insercion en fase de crecimiento exponencial. Nueve millones de celulas NCI-H441 se injertaron en ratones desnudos artmicos. Cinco dfas despues de implante, los tumores se pudieron medir y los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamano de tumor comparables. Los ratones se trataron i.p. ya sea con una dosis de carga de 2 mg de 224G11 Mab/raton y despues dos veces a la semana con 1 mg de anticuerpo/raton o con 4 inyecciones de Docetaxel (D5, D12, D19, D26) a 7.5 mg/kg. Un tercer grupo administrado con el tratamiento combinado tambien se incluyo. Docetaxel se suministro por inyecciones i.p. Volumen de tumor se midio dos veces a la semana y calculo por la formula: n/6 X longitud X ancho X altura y los pesos de animales se supervisaron cada dfa durante el periodo de tratamiento con Docetaxel. Analisis estadfstico se realizo en cada tiempo medido utilizando ya sea una prueba-t o una prueba Mann-Whitney. Tanto terapias sencillas como tratamiento combinado exhibieron actividad antitumoral significativa en comparacion con el grupo de control (p<0.002 de D11 a D35). Los resultados se representan en la Figura 47.

El tratamiento combinado tambien demostro una actividad de crecimiento antitumoral significativa en comparacion con tratamiento de modalidad sencilla entre D18 y D35 indicando que existe un beneficio en combinar Docetaxel con un tratamiento anti-c-Met.

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Ejemplo 22: Combinacion in vivo de 224G11 y Temozolomida en modelo de xenoinjerto U87MG

Las celulas U87-MG de ATCC se cultivaron rutinariamente en medio DMEM, FCS al 10%, L-Glutamina al 1%. Las celulas se dividieron dos dfas antes de insercion en la fase de crecimiento exponencial. Cinco millones de celulas U87-MG se injertaron en ratones desnudos atimicos. Diecinueve d^as despues de implante, los tumores se pudieron medir y los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamano de tumor comparable. Los ratones se trataron i.p. ya sea con una dosis de carga de 2 mg de 224G11 Mab/raton y despues dos veces a la semana con 1 mg de anticuerpo/raton o con 3 inyecciones de Temozolomida (D19, D26, D33) a 5 mg/kg. Tambien fue incluido un tercer grupo al que se le administro el tratamiento combinado. Temozolomida se suministra por inyecciones i.p. El volumen de tumor se midio dos veces a la semana y calculo por la formula: n/6 X longitud X ancho X altura y los pesos de animales se supervisaron cada dfa durante el periodo de tratamiento con Temozolomida. Analisis estadfstico se realizo en cada tiempo medido utilizando ya sea una prueba-t o una prueba Mann-Whitney. Tanto las terapias sencillas como el tratamiento combinado exhiben significante actividad antitumoral, en comparacion con el grupo de control (p<0.002 de D22 a D32 (en donde ratones de control se sometieron a eutanasia por razones eticas)). Los resultados se representan en la Figura 48.

El tratamiento combinado tambien demuestra una actividad de crecimiento anti-tumor significante en comparacion con tratamientos de modalidad sencilla (P<0.002 del dfa 22 al dfa 43 (en donde ratones de control se sometieron a eutanasia por razones de etica) para Temozolomida y del dfa 29 al dfa 53 (ultimo dfa de tratamiento) para 224G11. Tomados en conjunto, estos datos indican que existe un beneficio en combinar Temozolomida con un tratamiento de anti-c-Met.

Ejemplo 23: Formacion de esferoide

Como ya se describio en el Ejemplo 9 para otras Mabs, evaluamos la capacidad de 224G11 Mab para inhibir el crecimiento de tumor in vitro en el modelo de esferoide U87-MG. Para este proposito, celulas U87-MG desarrolladas como una monocapa se desprendieron con tripsina-EDTA y resuspendieron en medio de cultivo de celulas completas. Se iniciaron esferoides por inoculacion de 625 celulas en pocillos sencillos de fondo redondo, 96 placas en DMEM-FCS al 2.5%. Para impedir adhesion celular a un sustrato, las placas fueron revestidas previamente con polyHEMA en etanol al 95% y secaron al aire a temperatura ambiente. Las capas se incubaron bajo condiciones de cultivo celular estandar a 37 grados C, CO2 al 5% en incubadoras humidificadas. Anticuerpos monoclonales purificados (10 pg/ml) se agregaron despues de 4 y 10 dfas de cultivo esferoide. Los esferoides se mantuvieron en cultivo por 17 dfas. Despues, el crecimiento de esferoides se supervisa al medir el area de esferoides utilizando el modulo de automedida del programa axiovision. El area se expreso en pm2. 8-16 esferoides se evaluaron por cada condicion. El tamano de esferoides se midio antes de adicion de anticuerpos, despues de 10 dfas de cultivo y despues de 17 dfas de cultivo.

En estas condiciones, se obtuvieron esferoides homogeneos y no se observo diferencia estadfstica antes de adicion de anticuerpos (Figura 49A).

Como se ilustra en las Figuras 49B-49D, el control de isotipo, 9G4 no afecto el crecimiento de esferoides despues de 10 o 17 dfas de cultivo. Mientras que la adicion de 5D5 no tuvo efecto mayor en tamano de esferoide, la adicion de cualquiera de 224G11 y 11E1 inhibio marcadamente el crecimiento de tumor.

Ejemplo 24: Actividad in vitro de formas quimericas y humanizadas de 224G11 en el ensayo fosfo-c-Met

A fin de comparar la eficacia in vitro de formas murina, quimerica y humanizada en un ensayo funcional, sobrenadantes de cultivo que resultan de hibridoma 224G11 y celulas transfectadas HEK293 se dosificaron y probaron como se describe en el Ejemplo 3. Datos resumidos en la Figura 50, mostraron los resultados esperados para el anticuerpo murino no purificado como ya se describio en la Figura 6B. Tanto anticuerpos no purificados quimericos como humanizados exhibieron una actividad comparable ya sea cuando se agregan solos (Figura 50A) o cuando se incuban en la presencia de HGF (Figura 50B).

Ejemplo 25: Determinacion de constantes de afinidad (KD) de anticuerpos anti-c-Met por analisis de Biacore

La afinidad de enlace de anticuerpos 11E1 y 224G11 purificados se investigo por BIAcore X utilizando Dominio c- Met-Extra-Celular Recombinante (ECD) fusionado a un dominio IgGl Fc humano (R&D Systems) como antfgeno (MW = 129 kDa). Como ambas protemas de fusion c-Met-Fc y anticuerpos son compuestos bivalentes, fragmentos Fab de mAbs 11E1 y 224G11 (MW = 50 kDa) se generaron por corte con papama, purificaron y utilizaron en este ensayo para evitar interferencia con parametro de avidez. Para el ensayo, un anticuerpo de captura anti-Tag histidina se revistio en chips-sensores CM5. El amortiguador de corrida fue HBS-EP, el gasto de flujo fue 30 pl/min y la prueba se realizo a 25 grados C. Antfgeno c- Met (ECD_M1)2-Fc-(HHHHHH)2 soluble se capturo en el chipsensor (alrededor de 270 RU), y los anticuerpos a probar se utilizaron en solucion como analitos. El chip-sensor se regenero utilizando amortiguador Glicina, HCl pH 1.5 en ambas celulas de flujo por medio minuto.

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La Figura 51 ilustra el principio de este analisis. Los parametros cineticos resultantes se resumen en la siguiente tabla 4. Indican que ambos anticuerpos 11E1 y 224G11 anti-c-Met ligan la protema de fusion c-Met-Fc recombinante con afinidades comparables en el intervalo de aproximadamente 40 pM.

Tabla 4

Kon1 X 10-6 [1/M.s] Kon1 X 10-6 [1/M.s] Vida media [h] K [pM]

11E1 Fab

1,13 ± 0,01 4,68 ± 0,001 4,1 41,4 ± 0,5

224G11 Fab

2,04 ± 0,01 7,79 ± 0,40 2,5 34,8 ± 1,9

Ejemplo 26: Actividad in vivo de 224G11 en celulas MDA-MB-231 coimplantadas con celulas MRC5 como una fuente de HGF humano en ratones desnudos atimicos

Las celulas MDA-MB-213 y MRC5 de ATCC se cultivaron ambas en medio DMEM, FCS al 10%, L-Glutamina al 1%. Las celulas se dividieron dos d^as antes de insercion en la fase de crecimiento exponencial. Cinco millones de celulas MDA-MB-231 y 500 000 celulas MRC5 se co-inyectaron s.c. en ratones desnudos Atimicos. Doce dfas despues de implante, los tumores se pudieron medir y los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamanos de tumor comparable. Los ratones se trataron i.p. ya sea con una dosis de carga de 2 mg de 224G11 Mab/raton y despues dos veces a la semana con 1 mg de anticuerpo/raton. Volumen de tumor se midio dos veces a la semana y calculo por la formula: n/6 X longitud X ancho X altura.

Los resultados descritos en la Figura 52 mostraron una diferencia significativa en crecimiento de tumores medios de ratones tratados con 224G11, en comparacion con el grupo de control.

Ejemplo 27: Elementos complementarios en humanizacion de anticuerpos 227H1, 11E1 y 224Gll

Procedimiento General

Humanizacion de los anticuerpos anti-cMet se realizo independientemente de cada cadena y secuencialmente respecto a los aminoacidos analizados en cada dominio variable. El proceso de humanizacion se evalua en un primer intento en un ensayo de enlace basado en ELISA con Fc-cMet recombinante; las actividades de enlace de los anticuerpos humanizados se comparan con el anticuerpo quimerico recombinante. En un segundo intento, anticuerpos humanizados anti-cMet se evaluaron por sus habilidades para desplazar el enlace Fc-cMet en HGF recombinante revestido con plastico; este ensayo de competencia permite la comparacion directa de versiones murina, quimerica y humanizada de los anticuerpos anti-cMet.

En las Figuras 53 y 54 se ejemplifican las actividades de enlace anti-cMet tipicas de anticuerpos monoclonales murinos 227H1, 11E1 y 224G11.

La Figura 53 muestra actividades de enlace directo anti-cMet de anticuerpos murinos purificados detectados. En este ensayo, anticuerpos anti-cMet monoclonales murinos exhiben diferentes actividades de enlace anti-cMet diferentes pero todavfa dependientes de dosis.

La Figura 54 muestra las actividades de competencia de enlace HGF-cMet de anticuerpos murinos purificados. El ensayo de competencia revela diferencias confiables entre estos anticuerpos monoclonales anti-cMet con una actividad moderada, no completa pero confiable competitiva para anticuerpo monoclonal 11E1, mientras que 224G11 y 227H1 murinos exhiben un patron similar de actividades de competencia con un 100% de maximo de desplazamiento de enlace HGF a alta concentracion de anticuerpo. El anticuerpo monoclonal 224G11 muestra el mejor valor IC50.

Debe apreciarse que las actividades de enlace directo de los anticuerpos murinos no reflejan sus propiedades competitivas de enlace HGF intrrnsecas.

Estos dos ensayos se emplearon para caracterizar las versiones quimerica y humanizada recombinantes de los anticuerpos anti-cMet murinos. Para este objetivo, brevemente, dominios variables anti-cMet, ya sean murinos o humanizados, se clonaron en las series de vectores de expresion pCONplus de LONZA y anticuerpos derivados IgG-i/K recombinantes se expresaron en celulas CHO. Sobrenadantes de cultivo de expresion se concentraron y dialisaron extensamente contra PBS y despues dosificaron para concentraciones de anticuerpos expresados y directamente emplearon para estimar las actividades de enlace anti-cMet correspondientes. Se estimaron tanto ensayos de enlace directo como competencia de HGF para caracterizar mejor las versiones quimericas o humanizadas recombinantes.

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Ejemplo 27-1: Humanizacion de dominio variable de cadena pesada 227H1

A fin de identificar el mejor candidate humano para el injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humana que exhiben la mejor identidad con la secuencia murina 227H1 VH. Con el auxilio de la base de datos IMGT, el gen de celula germinal IGHV1-2*O2 V humana y el gen de celula germinal IGHJ4*01 J humana de esta manera se han seleccionado que reciben las secuencias humanas para las 227H1 VH CDRs murinas.

La Figura 55 representa un alineamiento de aminoacidos del dominio 227H1 VH murino con el marco humano selecto. En la fila de FR humano, solo se ilustra el aminoacido que se encuentra diferente del dominio VH murino 227H1. Las filas HZ3VH, HZ2VH y HZ1VH corresponden a versiones humanizadas implementadas del dominio 227H1 VH con las mutaciones anteriormente mencionadas (fila "cambiada") claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

En una primera serie de experimentos, construimos y analizamos las actividades de enlace anti-cMet de las tres primeras versiones humanizadas del dominio VH murino 227H1 cuando se expresan en combinacion con la cadena ligera quimerica 227H1. Resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 56. En este experimento, no se observaron diferencias en las capacidades de enlace de los anticuerpos recombinantes parcialmente humanizados o quimericos derivados 227H1 probados. En este punto, 26 de los 32 aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 227H1 VH murino y el marco humano selecto se han analizado y no se encontraron relevantes para actividad de enlace anti-cMet del dominio VH humanizado 227H1, cuando se combinan con la cadena ligera quimerica.

En conjunto con un analisis de mutagenesis dirigida por sitio de los ultimos seis residuos murinos en la version humanizada HZ1VH del dominio 227H1 VH, construimos una version original HZ4VH "totalmente humanizada-lMGT" y se probaron sus propiedades de enlace anti-cMet. Los resultados se proporcionan en la Figura 57 para el ensayo de enlace directo y en la Figura 58 para el ensayo de competencia de enlace HGF. Debe apreciarse que ambas versiones recombinantes quimerica y humanizada 227H1 exhiben una mejor actividad competitiva que el anticuerpo murino paternal.

Sin embargo, dados los datos experimentales obtenidos respecto a las propiedades de enlace anti-cMet del dominio 227H1 VH humanizado "completo-lMGT", la secuencia de aminoacidos resultante ilustrada en la Figura 59 se eligio y un analisis bioinformatica se realizo para evaluar el nivel de calidad o "caracter humano" ("humaness") del dominio variable humanizado 227H1-HZ VH asf denominado.

Para este objetivo, una comparacion simple de las secuencias marco a la base de datos humana, se realizo utilizando las herramientas IMGT. Dado el nivel de humanizacion que alcanzamos durante este proceso, de los 89 aminoacidos analizados correspondientes a los residuos marco, 89 se encontraron confiables con un origen humano. Solo residuos de las CDRs pueden encontrarse diferentes, pero de ser asf son diferentes del gen de celula germinal humana correspondiente, y evidentemente en posiciones hipervariables. Basandose en el sistema de numeracion IMGT y las herramientas de analisis de homologfa, primero humanizamos totalmente un dominio variable de anticuerpo de origen murino.

Ejemplo 27-2: Humanizacion de anticuerpo monoclonal 11E1

I - Humanizacion de dominio variable de cadena pesada 11E1

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR, el gen de lmea celular germinal humana que exhibe la mejor identidad con la secuencia murina 11E1 VH se ha buscado. Con el auxilio de la base de datos IMGt, el gen de celula germinal IGHV1-46*01 V humano y gen de celula germinal IGHJ4*03 J humano de esta manera se han seleccionado como secuencias receptoras humanas para las 11E1 VH CDRs murinas.

La Figura 60 representa un alineamiento de aminoacidos del dominio 11E1 VH murino con el marco humano selecto. En la fila de fR humano, solo el aminoacido que se encontro diferente del dominio VH murino 11E1 se ilustra. Las filas HZ VH3, HZ VH2 y HZ VH1 corresponden a versiones humanizadas implementadas del dominio 11E1 VH con las mutaciones anteriormente mencionadas (fila "cambiada"), claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion.

En una primera serie de experimentos, construimos y analizamos las actividades de enlace anti-cMet de las tres primeras versiones humanizadas del dominio VH murino 11E1 cuando se expresan en combinacion con la cadena ligera quimerica 11E1. Resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 61. En este experimento, se observo una capacidad de enlace similar de anticuerpos recombinantes parcialmente humanizados o quimericos derivados de 11E1 probados. En este punto, 19 de los 24 aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 11E1 VH murino y el marco humano selecto, se han analizado y se han encontrado que no son relevantes para actividad de enlace anti-cMet del dominio VH humanizado 11E1 cuando se combinan con la cadena ligera quimerica.

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II - Humanizacion de dominio variable de cadena ligera 11E1

A fin de identificar el mejor candidato humano para el injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humano que exhibe la mejor identidad con la secuencia murina 11E1 VL. Con el auxilio de la base de datos IMGT, el gen de celula germinal lGKV3D-7*01 V humano y el gen de celula germinal IGKJ4*01 J humano, de esta manera se han seleccionado como secuencias humanas receptoras para las 11E1 VL CDRs murinas.

La Figura 62 representa un alineamiento de aminoacidos del dominio 11E1 VL murino con el marco humano selecto. En la fila de FR humano, solo el aminoacido que se encuentra diferente del dominio VL murino 11E1 se ilustra. Las filas HZ VL3, HZ VL2 y HZ VL1 corresponden a versiones humanizadas implementadas del dominio 11E1 VL con las mutaciones anteriormente mencionadas (fila "cambiada") claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara la mutacion.

En una primer serie de experimentos, se construyen y analizan las actividades de enlace anti-cMet de las tres primeras versiones humanizadas del dominio VL murino 11E1 cuando se expresa en combinacion con la cadena pesada quimerica 11E1. Resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 63. En este experimento, observamos capacidades de enlace similares de los anticuerpos recombinantes parcialmente humanizados o quimericos derivados 11E1 probados. En este punto, 26 de los 30 aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 11E1 VL murino y el marco humano selecto, se han analizado y no se han encontrado relevantes para la actividad de enlace anti-cMet del dominio VL humanizado 11E1, cuando se combinan con la cadena pesada quimerica.

III - Humanizacion de anticuerpo 11E1

En esta etapa de la humanizacion de anticuerpo monoclonal 11E1, la secuencia de anticuerpos humanizada resultante teorica contiene solo cinco residuos de CDRs externos que tienen un dominio VH murino paternal y cuatro residuos CDRs externos que provienen de la secuencia VL murina paternal (ver Figura 60, fila HZ VH1 y Figura 62, fila HZ VL1). Se ha decidido entonces caracterizar inmediatamente la version humanizada de cadena pesada y ligera combinada resultante del anticuerpo 11E1. Los resultados se proporcionan en la Figura 64 para el ensayo de enlace directo anti-cMet.

En este experimento, se han observado capacidades de enlace similares para los anticuerpos recombinantes humanizados o quimericos derivados de 11E1 probados. Analisis de las propiedades competitivas de enlace HGF y analisis de mutagenesis dirigida por sitio de la contribucion de los nueve residuos murinos izquierdos restantes para realizarse independientemente o en combinacion en esta version VH1/VL1 "prehumanizada" del anticuerpo monoclonal 11E1.

Ejemplo 27-3: Humanizacion de anticuerpo monoclonal 224G11

I - Humanizacion de dominio variable de cadena pesada 224G11

A fin de identificar el mejor candidato humano para injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con la secuencia murina 224G11 VH.

Respecto a la homologfa de alta secuencia entre las secuencias de dominio 224G11 y 227H1 VH y como se confirma por el uso de las herramientas de la base de datos IMGT, el mismo gen de celula germinal IGHV1-2*02 V humano y el gen de celula germinal IGHJ4*01 J humano de esta manera se han seleccionado como las secuencias humanas receptoras para las 224G11 VH CDR murinas.

Basandose en esta alta homologfa, se ha decidido el transferir directamente las informaciones de humanizacion ganadas de la humanizacion de dominio 227H1 VH (ver Ejemplo 27) y disenamos de esta manera una version humanizada de "completa-IMGT" como se ilustra en la Figura 65, que representa un alineamiento de aminoacidos de los dominios 227H1 y 224G11 VH murinos con el marco humano selecto. En la fila de FR humano, solo se ilustra el aminoacido que se encuentra diferente del dominio VH murino 224G11. La fila HZVHO corresponde a la version humanizada "completo-IMGT" del dominio 224G11 VH como se obtiene para el dominio 227H 1 -HZVH "completo- IMGT".

La version humanizada "completo-IMGT" del dominio VH murino 224G11 de esta manera se ha construido y sus actividades de enlace anti-cMet se analizaron, cuando se expresan en combinacion con la cadena ligera quimerica 224G11. Resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 66, mientras que la Figura 67 ilustra el ensayo de competencia de enlace HGF. Dados los datos experimentales obtenidos respecto a las propiedades de enlace anti-cMet del dominio 224G11 VH humanizado "completo-IMGT", la secuencia de aminoacidos resultante como se ilustra en la Figura 65, se elige y se realiza entonces un analisis bioinformatico para evaluar el nivel de "caracter humano" del dominio 224G11-HZ vHo asf denominado.

Dada la estrategia de humanizacion aqrn aplicada, debe de referirse al Ejemplo 27 para el analisis de

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calidad/caracter humano de la secuencia 224G11 HZ VHO. Como se describe para la humanizacion de dominio 227H1 VH, confirmamos la confiabilidad del sistema de numeracion IMGT y las herramientas de analisis de homolog^a y tambien se demuestra la posibilidad de transferir la estrategia de humanizacion entre anticuerpos bajo los lfmites de su homologfa intrmseca.

II - Humanizacion de dominio variable de cadena ligera 224G11

A fin de identificar el mejor candidato humano para injerto CDR, se ha buscado el gen de celula germinal humana que exhibe la mejor identidad con la secuencia murina 224G11 VL. Con el auxilio de las herramientas de analisis de la base de datos IMGT, se identificaron dos regiones V humanas receptoras para las 224G11 VL CDR murinas. De esta manera, dos estrategias de humanizacion se han planeado para el dominio 224G11 VL. La primera corresponde a una prueba inicial para un marco humano con una longitud CDR1 mas corta (IGKV3-11*01), la segunda con una longitud CDR1 mas larga (IGKV4-l*01).

La Figura 68 representa un alineamiento de aminoacidos del dominio 224G11 VL murino con los dos fragmentos humanos seleccionados. En ambas filas FR Hu-FR mas corta y mas larga, solo se ilustra el aminoacido que se encuentra diferente del dominio VL murino 224G11. Las filas HZ VL3 y HZ VL6 corresponden a versiones humanizadas basicas del dominio 224G11 VL con las mutaciones anteriormente mencionadas (fila de "rango") claramente identificadas. El numero bajo cada mutacion propuesta corresponde al rango en el cual se realizara dicha mutacion cuando se elige el marco CDR1 basico "mas corto" o "mas largo".

En un primer conjunto de experimentos, las dos versiones humanizadas basicas del dominio VL murino 224G11 se construyeron y sus actividades de enlace anti-cMet se analizaron, cuando se expresan en combinacion con la cadena pesada quimerica 224G11. Resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 69. En este experimento, una actividad de enlace anti-cMet similar se observa para la version quimerica y HZ VL6 ("CDR1 mas largo") mientras que casi no se detecta enlace para el anticuerpo derivado 224G11 recombinante HZ VL3 ("CDR1-mas corto").

En un segundo juego de experimentos, construimos y analizamos las actividades de enlace anti-cMet de las versiones humanizadas implementadas del dominio 224G11 VH derivado de HZ VL6 cuando se expresa en combinacion con la cadena pesada quimerica 224G11. Dos formas humanizadas adicionales se analizaron; en la version HZ VL5, los siete residuos del tercer grupo (rango 3) son humanizados y en la version HZ VL4, los cuatro residuos izquierdos del primer grupo (residuos rango 1) solo permanecieron murinos. Resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 70. En este experimento, no se observaron diferencias en las capacidades de enlace de los anticuerpos recombinantes parcialmente humanizados o quimericos derivados de 224G11 probado. En este punto, 18 de los 22 aminoacidos que se encontraron diferentes entre el dominio 224G11 VL murino y el marco humano "CDR1-mas largo" selecto se han analizado y no se han encontrado relevantes para la actividad de enlace anti-cMet del dominio VL humanizado 224G11, cuando se combinan con la cadena pesada quimerica.

Se ha probado la version humanizada HZ VL4 del dominio 224G11 VL en el ensayo de competencia de enlace HGF. Como se muestra en la Figura 71, los resultados obtenidos demuestran la actividad competitiva similar de anticuerpos derivados de 224G11 humanizados HZ VL4 y quimericos recombinantes y murinos.

En esta etapa de la humanizacion del dominio 224G11 VL, la secuencia resultante contiene solo cuatro residuos externos CDRs que provienen de la secuencia paternal murina. Como se muestra en la Figura 72, estos cuatro residuos marcados § son L4, M39, H40 y R84.

Basandose en el sistema de numeracion IMGT y en las herramientas de analisis y homologfa, demostramos que el marco humano que exhibe diferencias estructurales en terminos de longitud de CDR todavfa puede ser adecuado en un proceso de humanizacion. Se ha decidido entonces el caracterizar las versiones humanizadas de cadena ligera y pesada resultantes del anticuerpo 224G11. El analisis de mutagenesis dirigida por sitio de la contribucion de los cuatro residuos murinos restantes se realiza entonces cuando se expresa en combinacion con la version humanizada VHO de la cadena pesada.

III - Humanizacion de anticuerpo 224G11

En una primera serie de experimentos, construimos y analizamos las actividades de enlace anti-cMet de la version totalmente humanizada del anticuerpo 224G11. Esta version recombinante abarca ambos dominios VH y VL humanizados VH0 y VL4 respectivamente. Los resultados obtenidos del ensayo de enlace directo anti-cMet se muestran en la Figura 73. En este experimento, la actividad de enlace anti-cMet 224G11 totalmente humana, se encuentra similar a la de las versiones 224G11 recombinante quimerica y humanizada de "cadena sencilla".

Se ha probado entonces la version totalmente humanizada del dominio 224G11 VL en el ensayo de competencia de enlace HGF. Los resultados obtenidos como se muestra en la Figura 74, demuestran la actividad competitiva similar de anticuerpos derivados 224G11 totalmente humanizados y quimericos recombinantes y murinos paternales.

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En esta etapa de la humanizacion de anticuerpo 224G11, la secuencia resultante contiene solo cuatro residuos CDRs externos que provienen de la secuencia de dominio variable de cadena ligera paternal murina. Analizamos entonces variantes sencillas de mutagenesis dirigida por sitio del dominio VL humanizado VL4 cuando se expresa en combinacion con la version humanizada VH0 de la cadena pesada. Como se ejemplifica en la Figura 75 para el ensayo de enlace directo, identificamos residuos relevantes potenciales entre los cuatro probados, que son M39 y H40.

Se ha decidido el analizar multiples mutantes del dominio 224G11 VL humanizado HZ VL4 cuando se expresan en combinacion con el dominio 224G11 VH humanizado HZ VH0. Como se muestra en la Figura 76 para el ensayo de enlace directo y en la Figura 77 para el ensayo de competencia de enlace HGF, multiples mutantes aminoacidos del dominio variable VL4 se analizaron para identificar la mejor combinacion humanizada. Basandose en el analisis de mutantes sencillo, se ha enfocado en mutantes dobles y triples que pueden exhibir las mejores actividades anti- cMet. El mutante VH0/VL4-2x corresponde al dominio VH humanizado HZ VH0 224G11 expresado con el dominio VL humanizado HZ VL4 224G11 con la doble mutacion L4M/R84G. El mutante VH0/VL4-3x corresponde al dominio VH humanizado HZ VH0 224G11 expresado con el dominio VL humanizado HZ VL4 224G11 con la mutacion triple L4M/M39L/R84G.

Dados los datos experimentales obtenidos respecto a las propiedades de enlace anti-cMet del anticuerpo 224G11 totalmente humanizado, el analisis bioinformatico de ambas secuencias de dominios variables de cadena ligera y pesada, se realiza para evaluar el nivel de "calidad/caracter humano" de las versiones mejor humanizadas VH0/VL4- 2x y VH0/VL4-3x. Se ha demostrado previamente la humanizacion "completa-lMGT" del dominio VH0 224G11 VH. Respecto al nivel de "calidad/caracter humano" de las versiones de dominio VL humanizadas VL4-2x y -3x 224G11, solo contienen residuos murinos M39 y/o H40. Estos dos residuos clave potenciales se ubican al final de CDR1, M39 es el ancla CDR N-terminal. Dado el problema de longitud de CDR que enfrentamos durante la humanizacion del dominio 224G11 VL, y considerando estas posiciones como parte de la definicion Kabat de VL CDR1, el nivel de "calidad/caracter humano" del anticuerpo 224G11 totalmente humanizado debera exhibir una fuerte inmunogenicidad reducida debido a los residuos murinos conservados mmimos.

Listado de secuencias

<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT Goetsch, Liliane

<120> Nuevos anticuerpos que inhiben la dimerizacion de c-Met, y sus utilizaciones

<130> D25728

<150> EP 07301231.2 <151> 2007-07-12

<150> US 60/929,789 <151> 2007-07-12

<150> US 61/020,639 <151> 2008-01-11

<160> 71

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 1

Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr 1 5

<210>2 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 2

Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala

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1 5

<210>3 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 3

Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 4 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 4

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr 15

<210> 5 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 5

Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr 1 5

<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 6

Ala Arg Glu Glu Ile Thr Lys Asp Phe Asp Phe 1 5 10

<210>7 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn 15

<210> 8 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 8

Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr 15

<210>9 <211> 14 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 9

Ala Arg Gly Arg Tyr Val Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<211> 10

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 10

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Ala Asn Ser Phe 1 5 10

<210> 11 <211>3 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 11 Arg Ala Ser 1

<210> 12 <211>9 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 12

Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr 15

<210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 13

Glu Ser Ile Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Phe 1 5 10

<210> 14 <211>9 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 14

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr 15

<210> 15 <211>6 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 15

Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 1 5

<210> 16 <211>3 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 16 Ala Ala Thr 1

<210> 17 <211>9 <212> PRT <213> mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 17

Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Tyr Thr 15

<210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 18

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ser Leu Gly Glu Ser Leu Asp Trp Ile 35 40 45

Gly Gly Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110

Ala Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 19

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Thr Leu Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Thr Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Glu Ile Thr Lys Asp Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 20

Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Met Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Phe Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Arg Tyr Val Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 111 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 21

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 100 105 110

<210> 22 <211> 111 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 22

Gly Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Val Ser Glu Ser Ile Asp Thr Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 100 105 110

<210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 24 <211> 24 <212>ADN <213> mus musculus

<400> 24

ggatacatat tcactgcata cacc 24

<210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 25

attaaaccaa acaatggtct tgct 24

<210> 26 <211> 33 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 26

gcaagatctg agattacgac ggaatttgac tac 33

<210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 27

ggttattcat tcactgacta cacc 24

<210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 28

attaatcctt acaatggtgg tact 24

<210> 29 <211> 33 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 29

gcaagagagg aaattacgaa ggactttgat ttc 33

<210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 30

ggatacacat tcactgacta caac 24

<210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 31

attaatccta acaatggtgg tact 24

<210> 32 <211> 42 <212>ADN <213> mus musculus

<400> 32

gcaagaggga ggtatgttgg ttactactat gctatggact ac 42

<210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 33

gaaagtgttg atagttatgc caatagtttt 30

<210> 34 <211>9 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 34

cgtgcatcc 9

<210> 35 <211> 27 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 35

cagcaaagta aggaggatcc tctcacg 27

<210> 36 <211> 30 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 36

gaaagtattg atacttatgg caatagtttt 30

<210> 37

<211> 27

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 37

cagcaaagta atgaggatcc attcacg 27

<210> 38 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 38

gagaatattt acagtaat 18

<210> 39 <211>9 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 39

gctgcaaca 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<210> 40 <211> 27 <212>ADN <213> mus musculus

<400> 40

caacattttt ggggtcctcc gtacacg 27

<210> 41 <211> 354 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 41

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaaga cttctggata catattcact gcatacacca tgcactgggt gaggcagagc 120

cttggagaga gccttgactg gattggaggt attaaaccaa acaatggtct tgctaactac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atggacctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagatctgag 300

attacgacgg aatttgacta ctggggccaa ggcaccgctc tcacagtctc ctca 354

<210> 42 <211> 354 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 42

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacaccc tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga cccttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtgg tactacctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaggaa 300

attacgaagg actttgattt ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354

<210> 43 <211> 363 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 43

gaggtcctgc tgcaacagtc ccctgcaagg cttctggata catggaatga gccttgagtg aaccagaagt tcaagggcaa atggagctcc gcagcctgac tatgttggtt actactatgc tea

tggacctgag ctggtgaagc cacattcact gactacaaca gattggagat attaatccta ggccacattg actgtagaca atctgaggac actgcagtct tatggactac tggggtcaag

ctggggcttc agtgaagata tggactgggt gaagcagagc acaatggtgg tactatcttc agtcctccag cacagcctac attactgtgc aagagggagg gaacctcagt caccgtctcc

60

120

180

240

300

360

363

<210> 44 <211> 333 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 44

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatgcca cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aegttegget cggggacaaa attggaaatg aaa

ctctagggca

gagggccacc 60

atagttttat

gcactggtac 120

gtgcatccaa

cctagaatct 180

acttcaccct

caccattaat 240

aaagtaagga

ggatcctctc 300

333

<210> 45 <211> 333 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 45

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ggcattgtgt tgacccaatc tccagcttct atatcctgca gagtcagtga aagtattgat cagcagaaac caggacagcc acccaaactc gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg cctgtggagg ctgatgattc tgcaacctat

ttggctgtgt

acttatggca

ctcatctatc

tctaggacag

tactgtcagc

ctctaggaca gagggccacc atagttttat acactggtac gtgcatccaa cctagaatct acttcaccct caccattaat aaagtaatga ggatccattc

60

120

180

240

300

<210> 46 <211> 321 <212>ADN <213> mus musculus

<400> 46

gacatccaga

atcacatgtc

ggaaaatctc

aggttcagtg

gaagattttg

gggaccaagc

tgactcagtc

gagcaagtga

ctcagctcct

gcagtggatc

ggagttatta

tggagataaa

tccagcctcc

gaatatttac

ggtctatgct

aggcacacag

ctgtcaacat

9

ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc agtaatttag catggtatca gcagaaacag gcaacaaact tagtagatgg tgtgccatca tattccctca agatcaacag cctgcagtct ttttggggtc ctccgtacac gttcggaggg

60

120

180

240

300

321

<210> 47 <211> 24 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para protema ribosomica de gen domestico, grande, P0 (RPL0) <400> 47

gaaactctgc attctcgctt cctg 24

<210> 48 <211> 22 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para protema ribosomica de gen domestico, grande, P0 (RPL0) <400> 48

aggactcgtt tgtacccgtt ga 22

<210> 49 <211> 26 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para protema ribosomica de gen domestico, grande, P0 (RPL0)

<400> 49

tgcagattgg ctacccaact gttgca 26

<210> 50 <211> 18 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para HGF <400> 50

aacaatgcct ctggttcc 18

<210> 51 <211> 20 <212> ADN

<213> secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> Cebador para HGF <400> 51

cttgtagctg cgtcctttac 20

<210> 52 <211> 27 <212>ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> Sonda para HGF <400> 52

ccttcaatag catgtcaagt ggagtga 27

<210> 53 <211> 28 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> Cebador para c-Met <400> 53

cattaaagga gacctcacca tagctaat 28

<210> 54 <211> 22 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> Cebador para c-Met <400> 54

cctgatcgag aaaccacaac ct 22

<210> 55 <211> 25 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> Sonda para c-Met <400> 55

catgaagcga ccctctgatg tccca 25

<210> 56 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 56

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5

<210> 57 <211>8 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 57

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ile Asn Pro Thr Thr Gly Ser Thr 1 5

<210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 58

Ala Ile Gly Gly Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10

<210> 59 <211>7 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 59

Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr 1 5

<210> 60 <211>3 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 60 Thr Thr Ser 1

<210> 61 <211>9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 61

His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 62 <211> 118 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 62

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Leu 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ile Gly Gly Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala 115

<210> 63 <211> 108 <212> PRT <213> mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 63

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45

Ile Tyr Thr Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Thr Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys 100 105

<210> 64 <211> 24 <212>ADN <213> mus musculus

<400> 64

ggctacactt ttacttccta ctgg 24

<210> 65 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 65

attaacccta ccactggttc tact 24

<210> 66 <211> 33 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 66

gcaataggag gatatgggtc ctggtttgct tac 33

<210> 67 <211> 21 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 67

tcaagtgtaa gttccaccta c 21

<210> 68 <211>9 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 68

accacatcc 9

<210> 69 <211> 27 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 69

catcagtgga gtagttaccc attcacg 27

<210> 70 <211> 354

<212>ADN <213> mus musculus

5

<400> 70

caggtccagc

tcctgcaagg

cctggacagg

aatcagaagt

atgcaactga

tatgggtcct

ttcagcagtc tggggctgaa cttctggcta cacttttact gtctggaatg gattggatac taaaggacaa ggccacattg gcagcctgac atctgaggac ggtttgctta ctggggccaa

ctggcaaaac

tcctactgga

attaacccta

actgcagaca

tctgcagtct

gggactctgg

ctggggcctc

tgaactgggt

ccactggttc

aatcctccaa

attactgtgc

tcactgtctc

agtgaagatg

gaaacagagg

tactgactac

cacagcctac

aataggagga

tgca

60

120

180

240

300

354

<210> 71 <211> 324 <212> ADN

10 <213> mus musculus

<400> 71

caaattgttc

ttgacctgca

ccaggatcct

gctcgcttca

actgaagatg

tcggggacaa

tcacccagtc

gtgccagctc

cccccaaact

gtggcagtgg

ctgcctctta

agttggacat

tccagcaatc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc aagtgtaagt tccacctact tgtactggta ccagcagaag ctggatttat accacatcca tcctggcttc tggagtccct gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag tttctgccat cagtggagta gttacccatt cacgttcggc aaaa

60

120

180

240

300

324

15

Claims (25)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo apto para unirse a cMet, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antigeno caracterizado por que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, 5 y 6; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 13, 11 y 14.
2. 2. Anticuerpo segun la reivindicacion 1, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antigeno, caracterizado por que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 19 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 22.
3. 3. Hibridoma murino apto para secretar un anticuerpo segun la reivindicacion 2, caracterizado por que dicho hibridoma es el hibridoma murino depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Paris, el 14 de marzo, 2007 con el numero I-3732.
4. 4. Anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antigeno, caracterizado por que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
5. 5. Anticuerpo segun la reivindicacion 4, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antigeno, caracterizado por que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimerico en el que las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada proceden de un anticuerpo humano.
6. 6. Anticuerpo segun la reivindicacion 5, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, caracterizado por que resulta apto para inhibir la activacion dependiente de ligando e independiente de ligando de c-Met.
7. 7. Anticuerpo segun la reivindicacion 6, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, caracterizado por que inhibe la dimerizacion de c-Met.
8. 8. Acido nucleico aislado, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, segun una de las reivindicaciones 1 y 2.
9. 9. Acido nucleico aislado segun la reivindicacion 8, caracterizado por que es seleccionado de entre los acidos nucleicos siguientes:

   a) un acido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias de SEC ID n° 27, SEC ID n° 28, SEC ID n° 29 y las secuencias SEC ID n° 36, SEC ID n° 34 y SEC ID n° 37; y

   b) un acido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias de SEC ID n° 42 y SEC ID n° 45.
10. 10. Vector que comprende un acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9.
11. 11. Celula hospedadora que comprende un vector segun la reivindicacion 10.
12. 12. Procedimiento para la produccion de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, segun una de las reivindicaciones 1, 2 y 4-7, caracterizado por que el procedimiento comprende:

    a) cultivar una celula hospedadora segun la reivindicacion 11, en un medio y en unas condiciones de cultivo adecuadas; y

    b) recuperar dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, a partir del medio de cultivo o dichas celulas cultivadas.
13. 13. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, segun las reivindicaciones 1, 2 y 4-7 u obtenido mediante el procedimiento segun la reivindicacion 12, para su utilizacion como un medicamento.
14. 14. Composicion que comprende como un principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, segun una de las reivindicaciones 1, 2 y 4-7, u obtenido mediante el procedimiento segun la reivindicacion 12, o producido mediante el hibridoma segun la reivindicacion 3.
15. 15. Composicion segun la reivindicacion 14, caracterizada por que comprende ademas un anticuerpo antitumoral.
16. 16. Composicion segun la reivindicacion 14, caracterizada por que comprende ademas por lo menos un agente citotoxico/citostatico.
17. 17. Composicion segun la reivindicacion 16, en la que dicho agente citotoxico es seleccionado de entre el grupo que

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos antitumorales, inhibidores mitoticos, inhibidores de la funcion de la cromatina, agentes antiangiogenesis, agentes antiestrogenos, agentes antiandrogenos o inmunomoduladores.
18. 18. Composicion segun la reivindicacion 17, en la que dicho agente citotoxico es un inhibidor mitotico.
19. 19. Composicion segun la reivindicacion 17 o 18, en la que dicho agente citotoxico esta acoplado qmmicamente a dicho anticuerpo como un producto de combinacion para la utilizacion simultanea.
20. 20. Composicion segun una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada por que dicho anticuerpo apto para unirse a cMet, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, es conjugado con una toxina celular y/o un radioelemento.
21. 21. Composicion segun una de las reivindicaciones 14 a 17 para su utilizacion como un medicamento.
22. 22. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, segun las reivindicaciones 1, 2 y 4-7, u obtenido mediante el procedimiento segun la reivindicacion 12, o producido mediante el hibridoma segun la reivindicacion 3, o de una composicion segun una de las reivindicaciones 14 a 20 para su utilizacion para la prevencion o para el tratamiento del cancer.
23. 23. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, o composicion para la utilizacion segun la reivindicacion 22, caracterizado/a por que dicho cancer es un cancer seleccionado de entre cancer de prostata, osteosarcoma, canceres de pulmon, cancer de mama, cancer de endometrio, glioblastoma o cancer de colon.
24. 24. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, o composicion, para la utilizacion segun la reivindicacion 22 o 23, caracterizado/a por que dicho cancer es un cancer relacionado con la activacion de c-Met, en el/la que dicho cancer es dependiente del HGF o independiente del HGF.
25. 25. Procedimiento de diagnostico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresion o una infraexpresion del receptor c-Met a partir de una muestra biologica en la que se supone la presencia anormal del receptor c-Met, caracterizado por que dicho procedimiento comprende una etapa en la que dicha muestra biologica se pone en contacto con el anticuerpo, o uno de sus fragmentos divalentes de union a antfgeno, segun las reivindicaciones 1,2 y 4-7, u obtenido mediante el procedimiento segun la reivindicacion 12, o producido mediante el hibridoma segun la reivindicacion 3, siendo posible para dicho anticuerpo ser, si resulta necesario, marcado.

    imagen1

    imagen2

    imagen3

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    FIGURA 1

    3H-Timidina (cpm)

    140000

    120000

    100000

    30000

    60000

    40000

    20000

    imagen5

    imagen6

    9G4 9G4 5D5 505 11E1 11E1 223C4 223C4 224G11 224G11

    FIGURA 2A

    3H-Timidina (cpm)

    120000

    100000 80000 60000

    40000 20000

    0

    9G4 9G4 227H1 227H1

    imagen7

    FIGURA 2B

    BRETtmBU) BRET QmBU)

    imagen8

    basal HGF 224G11 224G11+HGF basal HGF 223C4

    90 T

    imagen9

    basal HGF 227H1 227H1+HGF

    FIGURA 3

    I

    11E1+HGF

    imagen10

    223C4+HGF

    imagen11

    imagen12

    Dif. Resp.

    imagen13

    FIGURA 5A

    Q.

    CO

    <u

    cr

    RU

    300

    250 - 200 - 150 - 100 -

    / f i t / 1 /

    i i > ! i - /

    11E1 ! ^-------•—1-----1-------»----

    5D5 --'-------1------- -------1----

    175

    275

    375 475

    Tiempo

    575

    875

    imagen14

    FIGURA 6A

    imagen15

    imagen16

    Ligando (nM)

    FIGURA 7A

    imagen17