ES2693789T3 - Microorganismo para la producción de metionina con mejor actividad de metionina sintasa y flujo de metionina - Google Patents
Microorganismo para la producción de metionina con mejor actividad de metionina sintasa y flujo de metionina Download PDFInfo
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Abstract
Un microorganismo recombinante genéticamente modificado para presentar una producción fermentativa mejorada de metionina y/o sus derivados en comparación con la producción endógena de los correspondientes microorganismos de tipo salvaje, en donde en dicho microorganismo recombinante, la expresión de metH de E. coli, y la expresión de los genes fldA y fpr de E. coli se potencian y los genes ygaZH de E. coli o sus genes homólogos se hiperexpresan, en donde dicho microorganismo recombinante es Escherichia coli y en donde la expresión potenciada y la hiperexpresión, respectivamente, se logran - aumentando el número de copias del gen en el microorganismo, - usando un promotor que produce un alto nivel de expresión del gen, - atenuando la actividad o la expresión de un represor de transcripción, específico o no específico del gen, o - utilizando elementos que estabilizan el correspondiente ARN mensajero o elementos que estabilizan la proteína
Description
Por lo tanto, la mejora de la actividad de la metionina sintasa dependiente de cobalamina preferiblemente se lleva a cabo por hiperexpresión del gen metH y también de su sistema de reactivación codificado por los genes fldA y fpr.
En una realización de la invención, la actividad de metionina sintasa dependiente de cobalamina se potencia por hiperexpresión (potenciando su expresión) de los genes metH, fldA, fpr de E. coli. Preferiblemente, estos genes se 5 hiperexpresan bajo un promotor diferente de su promotor de tipo salvaje.
Más preferiblemente, los genes metH, fldA o fpr se expresan en forma cromosómica, es decir, estos genes se hiperexpresan a partir del cromosoma. Se introducen una o varias copias complementarias de cada gen en el cromosoma del microorganismo. Se integran en distintos locus seleccionados entre la lista descrita en la solicitud de patente WO2011 /073122, y en donde las eliminaciones no tienen un impacto sobre la producción de metionina. La
10 copia de tipo salvaje de la secuencia codificante de cada gen se conserva, pero su región promotora puede reemplazarse con un promotor artificial y/o un sitio de unión al ribosoma (RBS).
En una realización específica de la invención:
− el gen de tipo salvaje metH se conserva con reemplazo de su promotor natural y RBS, y se introducen dos copias adicionales en el cromosoma, y
15 − los genes de tipo salvaje fldA y fpr y sus regiones promotoras se conservan, y se introduce una copia adicional de cada gen en el cromosoma.
Las copias adicionales de los genes introducidos se expresan bajo control del promotor artificial y RBS.
En los microorganismos productores de aminoácidos, la metionina se excreta por un transportador de flujo específico. Cabe destacar que en E. coli este transportador se denomina YgaZH y está codificado por los genes
20 ygaZ y ygaH. Los homólogos funcionales de este sistema de flujo de metionina se han identificado en varios otros microorganismos. En la invención, el microorganismo recombinante hiperexpresa los genes ygaZH de E. coli. Alternativamente, el microorganismo recombinante de la invención puede hiperexpresar homólogos funcionales de transportadores de YgaZH. Las proteínas homólogas de YgaZ y YgaH se presentan respectivamente en la Tabla 1 y en la Tabla 2.
25 Tabla 1: Proteínas homólogas de YgaZ
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- yp_001455539.1 NC_009792.1. ABV15103.1
- proteína hipotética CK0_04031 [Citrobacter koseri ATCCBAA-895] Citrobacter koseri
- WP_005122932.1 EIQ78635.1
- proteína de membrana [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- YP_007877063.1 AGJ89511.1 WP_ 015585890.1
- proteína hipotética RORB6_24155 [Raoultella ornithinolytica B6] Raoultella ornithinolytica
- YP_008107733.1 AGN85393.1 WP_020454909.1
- proteína de membrana [Enterobacter sp. R4-368] Enterobacter sp.
- WP_004959353.1 EFE95945.1
- proteína de membrana [Serratia odorifera] Serratia odorifera
- YP_003884334. 1 ADM99777 .1
- transportador de aminoácidos [Dickeya dadantii 3937] Erwinia chrysanthemi (cepa 3937) Dickeya dadantii
- YP_006647984.1 AFR04731.1
- transportador de aminoácidos [Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCC21] Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum
- YP_001007412.1 CAL13268. 1
- transportador de aminoácidos putativo [Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081] Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- NP_928590.1 CAE13573.1
- proteína hipotética plu 1279 [Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TT01] Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii
- WP_004847360.1 EHM42581.1
- proteína de membrana [Hafnia alvei] Hafnia alvei
- WP_016157304.1 EOQ28426.1
- proteína de membrana interior YgaZ [Citrobacter sp. KTE32] Citrobacter sp. KTE32
- WP_006687199.1 EFE06904.1
- proteína de membrana [Citrobacteryoungae] proteína de resistencia a azaleucina putativa AzlC [Citrobacter voungae ATCC 29220] Citrobacter youngae
- YP_005198838.1 AEX50698.1
- permeasa de aminoácidos ramificados putativa (resistencia a azaleucina) [Rahnella aquatilis CIP 78.65 = ATCC 33071] Rahnella aquatilis
- WP_009111644.1 EHD20336.1.
- proteína de membrana [Brenneria sp.EniD312] Brenneria sp.
- yp_003469114.1 CBJ82350.1
- transportador de aminoácidos [Xenorhabdus bovienii SS-2004] Xenorhabdus bovienii
- WP_000841919. 1
- proteína de membrana [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- WP_ 000445647.1
- proteína de membrana [Shigella dysenteriae] Shigella dvsenteriae
- WP_000445645.1
- proteína de membrana [Shigellaflexneri] Shigella flexneri
- EFP71467.1
- proteína de la familia azlC [Shigella dysenteriae 1617] Shigella dvsenteriae
- WP_005063865.1
- proteína de membrana [Shigellaflexneri] Shigella flexneri
- WP_001428008.1
- proteína de membrana [Shigella dysenteriae] Shigella dysenteriae
- WP_005031133.1
- proteína de membrana [Shigella dysenteriae] Shigella dysenteriae
- WP_004993748.1
- proteína de membrana [Shigella boydii] Shigella boydii
- WP_005099151.1
- proteína de membrana [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- NP_708495.1
- proteína hipotética SF2709 [Shigella flexneri 2a str. 301] Shigella flexneri
- YP_409184.1. NC_007613.1.1. ABB67356
- proteína hipotética SBO_2835 [Shigella boydii Sb227] Shigella boydii
- WP_005119769.1
- permeasa de aminoácidos de cadena ramificada [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- WP_003825971.1
- proteína de membrana [Citrobacter sp. 30_2] Citrobacter sp.
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- WP_016154156.1
- proteína de membrana interior YgaZ [Citrobacter sp. KTE151] Citrobacter sp.
- WP_003839672.1
- proteína hipotética [Citrobacter freundii] Citrobacter freundii
- WP_016150871.1
- proteína de membrana interior YgaZ [Citrobacter sp. KTE30] Citrobacter sp.
- WP_019077531.1
- proteína de membrana [Citrobacter freundii] Citrobacter freundii
- WP_003037292.1
- proteína de membrana [Citrobacter sp. L17] Citrobacter sp.
- WP_009652545.1
- proteína de membrana [Klebsiella sp. OBRC7] Klebsiella sp.
- WP_004853460.1
- proteína de membrana [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- YP_005016079.1
- proteína de la familia AzlC [Klebsiella oxytoca KCTC 1686] Klebsiella oxytoca
- WP_004866792.1
- proteína de membrana [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_017459327.1
- proteína de membrana [Enterobacter cloacae] Enterobacter cloacae
- WP_004205700.1
- proteína de la familia azlC [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- CDA02044.1
- proteína de la familia azlC [Klebsiella variicola CAG:634] Klebsiella variicola
- WP_004123979.1
- proteína de membrana [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_004132932.1
- proteína de la familia AzlC [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_017900616.1
- proteína de membrana [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- YP_002236980.1
- proteína de la familia AzlC [Klebsiella pneumoniae 342] Klebsiella pneumoniae
- YP_005228384.1
- proteína de transporte de aminoácidos putativa [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_001336647.1
- proteína de transporte de aminoácidos putativa [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- WP_016947585.1
- proteína de membrana [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- YP_005956056.1
- proteína de transporte de aminoácidos putativa [Klebsiella pneumoniae KCTC 2242] Klebsiella pneumoniae
- WP_020803754.1
- proteína de membrana interior YgaZ [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- WP_016161678.1
- proteína de membrana interior YgaZ [Klebsiella sp. Klebsiella sp.
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- imagen6
-
KTE92]
imagen7
- WP_004174723.1
- proteína de membrana [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- WP_004114705.1
- proteína de membrana [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- YP_007990259.1
- ygaZ [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- WP_004104780.1
- proteína de membrana [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_007370573.1
- proteína de membrana [Kosakonia radicincitans] Kosakonia radicincitans
- WP_007370573.1
- proteína de membrana [Kosakonia radicincitans] Kosakonia radicincitans
- NP_668256.1
- proteína hipotética y0925 [Yersinia pestis KIM10+] Yersinia pestis
- WP_005119769.1
- permeasa de aminoácidos de cadena ramificada [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- YP_069400.1
- subunidad grande del exportador de aminoácidos de cadena ramificada de la familia LIV-E [Yersinia pseudotuberculosis IP 32953] Yersinia pseudotuberculosis
- WP_017893772.1
- proteína de membrana [Serratia sp. S4] Serratia sp.
- YP_001479963.1
- proteína de la familia AzlC [Serratia proteamaculans 568] Serratia proteamaculans
- WP_005189088.1
- proteína de membrana [Yersinia intermedia] Yersinia intermedia
- YP_004297214.1
- transportador de aminoácidos putativo [Yersinia enterocolitica subsp. palearctica 105.5R(r)] Yersinia enterocolitica subsp. Palearctica
- WP_019081387.1
- proteína de membrana [Yersinia enterocolitica] Yersinia enterocolitica
- WP_004392936.1
- proteína de membrana [Yersinia kristensenii] Yersinia kristensenii
- WP_016929851.1
- proteína de membrana [Serratia marcescens] Serratia marcescens
- WP_019845222.1
- proteína de membrana [Dickeya zeae] Dickeya zeae
- YP_003334823.1
- proteína de la familia AzlC [Dickeya dadantii Ech586] Dickeya dadantii
- YP_003042011.1
- proteína hipotética conservada [Photorhabdus asymbiotica] Photorhabdus asymbiotica
- WP_016941678.1
- proteína de membrana [Dickeya zeae] Dickeya zeae
- WP_005274999.1
- proteína de membrana [Yersinia bercovieri] Yersinia bercovieri
- CAC44347.1
- proteína YgaZ [Erwinia chrysanthemi] Erwinia chrysanthemi
- WP_004704053.1
- proteína de membrana [Yersinia aldovae] Yersinia aldovae
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- YP_003003219.1
- proteína de la familia AzlC [Dickeya zeae Ech1591] Dickeya zeae
- WP_004707388.1
- proteína de membrana [Yersinia frederiksenii] Yersinia frederiksenii
- WP_008812528.1
- proteína de membrana [Enterobacteriaceae bacterium 9_2_54FAA] Enterobacteriaceae bacterium
- YP_008231812.1
- proteína de membrana [Serratia liquefaciens ATCC 27592] Serratia liquefaciens
- YP_051597.1
- transportador de aminoácidos [Pectobacterium atrosepticum SCRI1043] Pectobacterium atrosepticum
- WP_019455591.1
- proteína de membrana [Serratia marcescens] Serratia marcescens
- YP_007407667.1 AGE19648.1 NC_020211.1.
- transportador de aminoácidos putativo YgaZ [Serratia marcescens WW4] Serratia marcescens
- WP_004716726.1
- proteína de membrana [Yersinia rohdei] Yersinia rohdei
- YP_003018879.1
- proteína de la familia AzlC [Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PC1] Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum
- WP_004873538.1
- proteína de membrana [Yersinia mollaretii] Yersinia mollaretii
- WP_005975645.1
- proteína de membrana [Pectobacterium wasabiae] Pectobacterium wasabiae
- YP_003260827.1
- proteína de la familia AzlC [Pectobacterium wasabiae WPP163] Pectobacterium wasabiae
- YP_002986523.1
- proteína de la familia AzlC [Dickeya dadantii Ech703] Dickeya dadantii
- YP_007345875.1 AGB83690.1
- permeasa de aminoácidos de cadena ramificada putativa (resistencia a azaleucina) [Serratia marcescens FGI94] Serratia marcescens
- YP_004211503.1
- proteína de la familia AzlC [Rahnella sp. Y9602] Rahnella sp.
- YP_005400523.1
- proteína de la familia AzlC [Rahnella aquatilis HX2] Rahnella aquatilis
- WP_010305354.1
- proteína de membrana [Pectobacterium carotovorum] Pectobacterium cartovorum
- WP_010848732.1
- proteína hipotética conservada [Xenorhabdus nematophila] Xenorhabdus nematophila
- YP_003711585.1 CBJ89380.1
- proteína hipotética XNC1_1315 [Xenorhabdus nematophila ATCC 19061] Xenorhabdus nematophila
- YP_006500218.1 AFN33798.1
- proteína hipotética A225_4537 [Klebsiella oxytoca E718] Klebsiella oxytoca
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- EHT06520.1
- proteína de membrana interior YgaZ [Klebsiella oxytoca 10-5246] Klebsiella oxytoca
- EKP29343.1
- proteína de la familia AzlC [Klebsiella oxytoca M5al] Klebsiella oxytoca
- EJK15416.1
- proteína de transporte de aminoácidos putativa [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae KPNIH18] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_006500218.1
- proteína hipotética A225_4537 [Klebsiella oxytoca E718] Klebsiella oxytoca
- YP_002920871.1
- proteína de transporte de aminoácidos putativa [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NTUH-K2044] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_003437997.1
- proteína de la familia AzlC [Klebsiella variicola At-22] Klebsiella variicola
- YP_003260827.1
- proteína de la familia AzlC [Pectobacterium wasabiae WPP163] Pectobacterium wasabiae
- WP_010305354.1
- proteína de membrana [Pectobacterium carotovorum] Pectobacterium carotovorum
- YP_404404.1 ABB62913.1
- proteína hipotética SDY_2877 [Shigella dysenteriae Sd197] Shigella dysenteriae
- YP_311671.1. NC_007384.1. AAZ89436.1
- proteína hipotética SSON_2826 [Shigella sonnei Ss046] Shigella sonnei
Tabla 2: Proteínas homólogas de YgaH
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- YP_001455540.1 ABV15104.1
- proteína hipotética CKO_04032 [Citrobacter koseri ATCC BAA-895] Citrobacter koseri
- WP_005122930.1 EIQ78634.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- YP_007877062.1 AGJ89510.1
- exportador de L-valina [Raoultella ornithinolytica B6] Raoultella ornithinolytica
- YP_008107734.1 WP_020454910.1 AGN85394.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Enterobacter sp. R4-368] Enterobacter sp.
- WP_004959351.1 EFE95944.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Serratia odorifera] Serratia odorifera
- YP_003884335.1 ADM99778.1
- proteína hipotética Dda3937_00895 [Dickeya dadantii 3937] Dickeya dadantii
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- YP_006647985.1 AFR04732.1
- proteína hipotética PCC21_033290 [Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCC21] Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
- YP_001007413.1 CAL13269.1
- proteína hipotética YE3239 [Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081] Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
- NP_928589.1 CAE13572.1
- proteína hipotética plu1278 [Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1] Photorhabdus luminescens subsp. laumondii
- WP_004847362.1 EHM42582.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Hafnia alvei] Hafnia alvei
- WP_016154157.1 EOQ28427.1 EOQ47452.1
- exportador de L-valina [Citrobacter sp. KTE32] Citrobacter sp.
- WP_006687198.1 EFE06903.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Citrobacter youngae] Citrobacter youngae
- YP_005198837.1 AEX50697.1
- proteína de transporte de aminoácidos de cadena ramificada AzID [Rahnella aquatilis CIP 78.65 = ATCC 33071] Rahnella aquatilis
- WP_009111643.1 EHD20335.1.
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada e [Brenneria sp. EniD312] Brenneria sp. EniD312
- YP_003469115.1 CBJ82351.1
- transportador [Xenorhabdus bovienii SS-2004] Xenorhabdus bovienii
- NP_708496.1
- exportador de L-valina [Shigella flexneri 2a str. 301] Shigella flexneri
- YP_409183.1. NC_007613.1. ABB67355.1.
- proteína hipotética conservada [Shigella boydii Sb227] Shigella boydii
- WP_000119765.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Shigella flexneri] Shigella flexneri
- WP_003825969.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Citrobacter sp. 30_2] Citrobacter sp.
- WP_003037297.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Citrobacter freundii] Citrobacter freundii
- WP_003037297.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Citrobacter freundii] Citrobacter freundii
- EKU35015
- subunidad pequeña de aminoácidos ramificados de la familia liv-e [Citrobacter sp. L17] Citrobacter sp.
- WP_009652550.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella sp. OBRC7] Klebsiella sp.
- WP_004853462.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- YP_005016080.1
- exportador de L-valina putativa [Klebsiella oxytoca KCTC 1686] Klebsiella oxytoca
- WP_017459326.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Enterobacter cloacae] Enterobacter cloacae
- WP_004205699.1
- exportador de L-valina [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- WP_004123982.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_004132928.1
- exportador de L-valina [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- YP_002236979.1
- proteína hipotética KPK_1115 [Klebsiella pneumoniae 342] Klebsiella pneumoniae
- YP_005228385.1
- proteína hipotética KPHS_40850 [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_001336648.1
- proteína hipotética KPN_03012 [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_005956057.1. NC_017540.1.
- exportador de L-valina putativa [Klebsiella pneumoniae KCTC 2242] Klebsiella pneumoniae
- WP_020803764.1
- proteína hipotética [Klebsiella pneumoniae] Klebsiella pneumoniae
- WP_004114708.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_004104783.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella oxytoca] Klebsiella oxytoca
- WP_007370572.1 EJI192176.1
- proteína de la familia de transporte de aminoácidos de cadena ramificada [Kosakonia radicincitans] Kosakonia radicincitans
- EJI93105.1
- proteína de la familia de transporte de aminoácidos de cadena ramificada [Enterobacter radicincitans DSM 16656] Enterobacter radicincitans
- NP_668255.1
- proteína hipotética y0924 [Yersinia pestis KIM10+] Yersinia pestis
- YP_069399.1
- proteína hipotética YPTB0858 [Yersinia pseudotuberculosis IP 32953] Yersinia pseudotuberculosis
- YP_001479964.1
- proteína hipotética Spro_3740 [Serratia proteamaculans 568] Serratia proteamaculans
- WP_005189085.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia intermedia] Yersinia intermedia
- YP_004297213.1
- proteína hipotética YE105_C1014 [Yersinia enterocolitica subsp. palearctica 105.5R(r)] Yersinia enterocolitica subsp. Palearctica
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- WP_019081388.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia enterocolitica] Yersinia enterocolitica
- WP_004392937.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia kristensenii] Yersinia kristensenii
- WP_016929852.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Serratia marcescens] Serratia marcescens
- WP_019845221.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Dickeya zeae] Dickeya zeae
- YP_003334824.1
- proteína hipotética Dd586_3285 [Dickeya dadantii Ech586] Dickeya dadantii
- YP_003042012.1. NC_012962.1.
- proteína hipotética conservada [Photorhabdus asymbiotica] Photorhabdus asymbiotica
- WP_016941677.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Dickeya zeae] Dickeya zeae
- WP_005275000.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia bercovieri] Yersinia bercovieri
- CAC44348.1
- proteína YgaH [Erwinia chrysanthemi] Erwinia chrysanthemi
- WP_004704054.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia aldovae] Yersinia aldovae
- YP_003003218.1
- proteína hipotética Dd1591_0860 [Dickeya zeae Ech1591] Dickeya zeae Ech1591
- WP_004707387.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia frederiksenii] Yersinia frederiksenii
- WP_008812527.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Enterobacteriaceae bacterium 9_2_54FAA] Enterobacteriaceae bacterium
- YP_008231813.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Serratia liquefaciens ATCC 27592] Serratia liquefaciens
- YP_051598.1
- proteína hipotética ECA3510 [Pectobacterium atrosepticum SCRI1043] Pectobacterium atrosepticum
- WP_019455592.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Serratia marcescens] Serratia marcescens
- YP_007407668.1
- transportador de aminoácidos YgaH putativo [Serratia marcescens WW4] Serratia marcescens
- WP_004716724.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia rohdei] Yersinia rohdei
- YP_003018880.1.
- proteína hipotética PC1_3328 [Pectobacterium Pectobacterium carotovorum
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- NC_012917.1.
- carotovorum subsp. carotovorum PC1] subsp. Carotovorum
- WP_004873539.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia mollaretii] Yersinia mollaretii
- WP_005975643.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada e [Pectobacterium wasabiae] Pectobacterium wasabiae
- YP_003260828.1
- proteína hipotética Pecwa_3484 [Pectobacterium wasabiae WPP163] Pectobacterium wasabiae
- YP_002986522.1
- proteína hipotética Dd703_0892 [Dickeya dadantii Ech703] Dickeya dadantii
- YP_007345876.1
- proteína transportadora de aminoácidos de cadena ramificada (AzID) [Serratia marcescens FGI94] Serratia marcescens
- YP_004211502.1
- transportador de aminoácidos de cadena ramificada [Rahnella sp. Y9602] Rahnella sp.
- YP_005400522.1 NC_017047.1.
- exportador de L-valina putativa [Rahnella aquatilis HX2] Rahnella aquatilis
- WP_010305358.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Pectobacterium carotovorum] Pectobacterium carotovorum
- YP_003711584.1. NC_014228.1.
- proteína hipotética XNC1_1314 [Xenorhabdus nematophila ATCC 19061] Xenorhabdus nematophila
- YP_006500219.1 AFN29790.1
- transporte de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella oxytoca E718] Klebsiella oxytoca
- EHT06521.1
- proteína hipotética HMPREF9690_03780 [Klebsiella oxytoca 10-5246] Klebsiella oxytoca
- EKP29342.1.
- exportador de L-valina [Klebsiella oxytoca M5al] Klebsiella oxytoca
- EJK15417.1.
- exportador de L-valina putativa [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae KPNIH18] Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_006500219.1
- transporte de aminoácidos de cadena ramificada [Klebsiella oxytoca E718] Klebsiella oxytoca
- BAH64805.1.
- proteína hipotética KP1_4275 [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NTUH-K2044]-ygaH Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae
- YP_003437996.1
- proteína hipotética Kvar_1056 [Klebsiella variicola At22] Klebsiella variicola
- YP_003260828.1
- proteína hipotética Pecwa_3484 [Pectobacterium wasabiae WPP163] Pectobacterium wasabiae
- WP_010282658.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Pectobacterium carotovorum] Pectobacterium carotovorum
- Número de acceso
- Nombre Organismo
- YP_404405.1. NC_007606.1. ABB62914.1.
- proteína hipotética SDY_2878 [Shigella dysenteriae Sd197] Shigella dysenteriae
- WP_000119748.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Shigella dysenteriae] Shigella dysenteriae
- YP_311672.1 AAZ89437.1
- proteína hipotética SSON_2827 [Shigella sonnei Ss046] Shigella sonnei
- WP 005150562.1
- proteína de membrana putativa [Shigella sonnei] Shigella sonnei
- WP_ 000119744 .1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Shigella boydii] Shigella boydii
- WP_002427075.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Yersinia pestis] Yersinia pestis
- WP_017491438.1
- permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada (gamma proteobacterium WG36] gamma proteobacterium
- WP_ 002366138.1
- proteína de la familia de aminoácidos de cadena ramificada, parcial [Yersinia pestis] Yersinia pestis
Con el número de acceso descrito en las tablas para cada homólogo, el experto en la técnica puede obtener la secuencia de aminoácidos y su secuencia nucleotídica codificante en las bases de datos NCBI, por ejemplo.
A partir de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia nucleotídica, es una tarea habitual para el experto obtener
5 genes que codifican estos homólogos. Se puede hacer o bien por síntesis artificial del gen que codifica la proteína de interés a partir de su secuencia de aminoácidos o por ampliación PCR de la región codificante de interés a partir del correspondiente ADN genómico. En el contexto de la invención, estos genes se denominan "genes homólogos ygaZ o ygaH". Las secuencias de estos genes homólogos ygaZH se pueden ajustar al sesgo del codón del microorganismo hospedante.
10 En una realización específica de la invención, el microorganismo recombinante hiperexpresa los genes ygaZ y ygaH de E. coli que codifican las proteínas cuyas secuencias se describen respectivamente en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o sus genes homólogos. Preferiblemente, los genes homólogos ygaZ y ygaH están compuestos por el par de genes que se origina del mismo organismo y compuestos por el gen homólogo de ygaZ y el gen homólogo de ygaH. No obstante, podrían utilizarse el par desigual de un gen homólogo ygaZ de un primer organismo y un gen
15 homólogo ygaH de un segundo organismo. Preferiblemente, los genes ygaZH o sus genes homólogos se hiperexpresan.
Los genes homólogos de YgaZH se escogen entre genes que codifican los homólogos de YgaZ y YgaH descritos respectivamente en la tabla 1 y en la tabla 2. Preferiblemente, los genes homólogos de ygaZH se escogen entre genes que codifican homólogos de YgaZH de la especie Citrobacter, especie Shigella, especie Raoultella, especie
20 Enterobacter, especie Yersinia y especie Photorhabdus. Más preferiblemente, los genes homólogos de ygaZH se originan de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii. Lo más preferiblemente, los genes homólogos de ygaZH se originan de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii o Enterobacter sp.
Por consiguiente, los genes homólogos de ygaZH preferiblemente se escogen entre genes que codifican el par de
25 homólogo de YgaZ y homólogo de YgaH definidos respectivamente por: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 de Citrobacter koseri, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 de Shigella flexneri, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 de Raoultella ornithinolytica, SEQ ID NO: 9 ySEQ JO NO: 10 de Enterobacter sp. (R4-368), SEQ ID NO: 11 o 12 y SEQ ID NO: 13
o 14 de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 de Photorhabdus luminescens
subsp. laumondii, SEQ ID NO: 17 ySEQ ID NO: 18de Citrobacter youngae, SEQ ID NO: 19 ySEQ ID NO: 20de 30 Citrobacter freundii.
Los ejemplos de vectores de C. glutamicum y E. coli adecuados son, p. ej., pClik5aMCS (WO2005059093) o se pueden hallar en Eikmanns et al., (1991).
Los ejemplos de vectores adecuados para manipular Corynebacteria se pueden hallar en el manual de Corynebacteria editado por Eggeling y Bott en 2005.
5 Protocolos
Se han empleado varios protocolos para construir las cepas que producen metionina descritas en los siguientes ejemplos.
El protocolo 1 (Modificaciones cromosómicas por recombinación homóloga, selección de recombinantes y escisión de cassettes de antibióticos) y el protocolo 2 (Fago de transducción P1) utilizados en esta invención se han descrito
10 por completo en la solicitud de patente WO2013/001055.
Protocolo 3: Construcción de plásmidos recombinantes
La tecnología de ADN recombinante está bien descrita y el experto en la técnica la conoce bien. En síntesis, se amplían por PCR fragmentos de ADN usando oligonucleótidos (el experto en la técnica los puede diseñar) y ADN genómico MG1655 como matriz. Los fragmentos de ADN y el plásmido seleccionado se digieren con enzimas de
15 restricción compatibles, se ligan y luego se transforman en células competentes. Los transformantes se analizan y los plásmidos recombinantes de interés se verifican por secuenciación de ADN.
Tabla 3: Secuencias citadas en los siguientes ejemplos
- SEQ ID N°
- Secuencia 5' → 3'
- 21
-
imagen12
- 22
-
imagen13
- 23
-
imagen14
- 24
-
imagen15
- 25
-
imagen16
- 26
-
imagen17
- 27
-
imagen18
Con el fin de combinar la hiperproducción de MetHCG, FprAl o MetHEC, FldA, Fpr en C. glutamicum con la hiperproducción del sistema de expresión de L-metionina específico BrnFE, el plásmido pCBl anteriormente descrito se introduce por electroporación en las cepas D y E, dando origen a las cepas G y H respectivamente.
La cepa G porta solamente genes que pertenecen a C. glutamicum mientras que la cepa H porta metionina sintasa 5 dependiente de cobalamina y su sistema de reactivación de E. coli.
El exportador es en todos los casos BrnFE.
Ejemplo 5: Producción de L-metionina por fermentación en un biorreactor con cepas de E.coli
Las cepas descritas en los ejemplos previos se ensayaron bajo condiciones de producción en reactores de 2,5 litros (Pierre Guerin) usando una estrategia de lotes alimentados.
10 En síntesis, se usó un cultivo de 24 horas desarrollado en medio LB de 10 ml con 2,5 g.L-1 glucosa para inocular un precultivo de 24 horas en medio mínimo (B1a). Estas incubaciones se llevaron a cabo en matraces de 500 ml que contenían 50 ml de medio mínimo (B1a) en un agitador giratorio (200 RPM). El primer precultivo se efectuó a una temperatura de 30°C, el segundo a una temperatura de 34°C.
Se llevó a cabo una tercera etapa de precultivo en biorreactores (Sixfors) rellenos con 200 ml de medio mínimo
15 (B1b) inoculado a una concentración de biomasa de 1,2 g.l-1 con 5 ml de precultivo concentrado. La temperatura de precultivo se mantuvo constante a 34°C y el pH se ajustó automáticamente hasta un valor de 6,8 usando una disolución al 10% de NH4OH. La concentración de oxígeno disuelto se ajustó continuamente hasta un valor de 30% de la saturación de la presión de aire parcial con suministro de aire y/o agitación. Después de agotar la glucosa del medio del lote, se inició la alimentación del lote alimentado con un caudal inicial de 0,7 ml.h-1, antes de aumentar en
20 forma exponencial durante 26 horas con una velocidad de crecimiento de 0,13 h-1 con el fin de obtener una concentración celular final de aproximadamente 20 g.L-1 .
Tabla 4: Composición del medio mineral del lote de precultivo (B1a y B1b)
- Compuesto
- Concentración de B1a (g.L -1) Concentración de B1b (g.L -1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0130 0,0130
- CuCl2.2H2O
- 0,0015 0,0015
- MnCl2.4H2O
- 0,0150 0,0150
- CoCl2.6H2O
- 0,0025 0,0025
- H3BO3
- 0,0030 0,0030
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0025 0,0025
- Fe(III) citrato H2O
- 0,1064 0,1064
- EDTA
- 0,0084 0,0084
- MgSO4.7H2O
- 1,00 1,00
- CaCl2.2H2O
- 0,08 0,08
- Ácido cítrico
- 1,70 1,70
- KH2PO4
- 4,56 4,56
- K2HPO4.3H2O
- 2,53 2,53
- (NH4)2HPO4
- 1,11 1,11
- Compuesto
- Concentración de B1a (g.L -1) Concentración de B1b (g.L -1)
- (NH4)2SO4
- 4,90 4,90
- (NH4)2S2O3
- 1,00 1,00
- Tiamina
- 0,01 0,01
- Vitamina B12
- 0,01 0,01
- Glucosa
- 30,00 5,00
- MOPS
- 30,00 0,00
- NH4OH 28%
- Ajustado hasta pH 6,8 Ajustado hasta pH 6,8
Tabla 5: Composición del medio mineral del lote alimentado de precultivo (F1)
- Compuesto
- Concentración (g.L -1)
- Zn(CH3COO)2.H2O
- 0,0104
- CuCl2.2H2O
- 0,0012
- MnCl2.4H2O
- 0,0120
- CoCl2.6H2O
- 0,0020
- H3BO3
- 0,0024
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0020
- Fe(III) citrato H2O
- 0,0524
- EDTA
- 0,0067
- MgSO4
- 5,00
- (NH4)2SO4
- 8,32
- Na2SO4
- 8,95
- (NH4)2S2O3
- 24,80
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 500,00
- Vitamina B12
- 0,01
- NH4OH 28%
- Ajustado hasta pH 6,8
Posteriormente, se rellenaron fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin) con 600 o 620 ml de medio mínimo (B2) y se inocularon hasta una concentración de biomasa de 3,2 g.L-1 con un volumen de precultivo que osciló entre 80 y 100 ml.
El desarrollo celular es controlado por fosfato, es por eso que la concentración de fosfato final en el medio del lote
5 B2 se ajustó hasta un valor comprendido entre 0 y 20 mM, por adición de distintas concentraciones de KH2PO4, K2HPO4 y (NH4)2HPO4. Del mismo modo, la concentración de fosfato final del medio F2 se ajustó hasta un valor comprendido entre 5 y 30 mM, por adición de distintas concentraciones de KH2PO4, K2HPO4 y (NH4)2HPO4. La concentración de tiosulfato en el medio del lote alimentado se puede ajustar con el fin de prevenir la privación de este compuesto durante el cultivo.
10 Tabla 6: Composición del medio mineral del lote de cultivo (B2)
- Compuesto
- Concentración (g.L -1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0130
- CuCl2.2H2O
- 0,0015
- MnCl2.4H2O
- 0,0150
- CoCl2.6H2O
- 0,0025
- H3BO3
- 0,0030
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0025
- Fe(III) citrato H2O
- 0,1064
- EDTA
- 0,0084
- MgSO4.7H2O
- 1,00
- CaCl2.2H2O
- 0,08
- Ácido cítrico
- 1,70
- (NH4)2S2O3
- 7,74
- Tiamina
- 0,01
- Vitamina B12
- 0,01
- Biotina
- 0,10
- Glucosa
- 10
- NH4OH 28%
- Ajustado hasta pH 6,8
- IPTG
- 0,0047
Tabla 7: Composición del medio del lote alimentado de cultivo (F2)
- Compuesto
- Concentración (g.L -1)
- Compuesto
- Concentración (g.L -1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0104
- CuCl2.2H2O
- 0,0012
- MnCl2.4H2O
- 0,0120
- CoCl2.6H2O
- 0,0020
- H3BO3
- 0,0024
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0020
- Fe(III) citrato H2O
- 0,0524
- EDTA
- 0,0067
- MgSO4
- 5,00
- (NH4)2S2O3
- 60,00
- Tiamina
- 0,01
- Vitamina B12
- 0,01
- Biotina
- 0,10
- Glucosa
- 500
- IPTG
- 0,0047
La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37 °C y el pH se mantuvo en el valor de trabajo (6.8) por adición automática de disoluciones de NH4OH (10% y 28%). La velocidad de agitación inicial se fijó a 200 RPM durante la fase de lote y se aumentó hasta 1000 RPM durante la fase de lote alimentado. El caudal de aire inicial se fijó en 40
5 NL.h-1 durante la fase de lote y se aumentó a 100 NL.h-1 al comienzo de la fase de lote alimentado. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores entre 20 y 40%, preferiblemente 30% de saturación, incrementando la agitación.
Se añadió IPTG a los medios de lote y lote alimentado cuando fue necesario en una concentración final de 20 µM. Cuando fue necesario, se añadieron antibióticos en una concentración de 50 mg.L-1 para espectinomicina, 30 mg.L-1
10 para cloranfenicol, 50 mg.ml1 para kanamicina y 100 mg.L-1 para ampicilina.
Cuando la masa de células alcanzó una concentración próxima a 5 g.L-1, comenzó el lote alimentado con un caudal inicial de 5 ml.h-1. La disolución de alimentación se inyectó con un perfil sigmoideo con un caudal en aumento que llegó a 24 ml.h-1 después de 25 horas. Las condiciones de alimentación precisas se calcularon mediante la ecuación:
15 en donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml.h-1 con p1 = 1,80, p2 = 22,4, p3 = 0,27, p4 = 6,50. Este caudal aumentó de 10 a 50%, preferiblemente entre 20 y 30% durante todo el cultivo.
Después de un lote alimentado durante 25 horas, la bomba de disolución de alimentación cesó y el cultivo finalizó después del agotamiento de la glucosa.
Los aminoácidos extracelulares se cuantificaron por HPLC después de la derivación OPA/Fmoc y otros metabolitos 20 relevantes se analizaron usando HPLC con detección refractrométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS
Para comparar el efecto de la hiperexpresión de ygaZH de E. coli y la hiperexpresión de homólogos de ygaZH en la misma base genética, el plásmido pME1247 que porta ygaZH de E. coli se transformó en la cepa 8, dando origen a la cepa 9.
Construcción de las cepas 10 a 17 – Hiperproducción de sistemas de secreción de L-metionina homóloga, 5 hiperexpresión de ygaZH del género y la especie que se mencionan en la tabla 10
Para expresar los genes homólogos de ygaZH enumerados en la tabla 10, cada par de genes se clonó en el plásmido de número de copias moderadas pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990) con el uso del promotor natural y el sitio de unión al ribosoma natural del gen de E. coli ygaZ como se describió previamente para los genes de E. coli ygaZH, Como se especifica en la tabla 11, los genes homólogos de ygaZH se ampliaron o bien a partir de ADN
10 genómico de la correspondiente cepa o se sintetizaron químicamente, con o sin optimización del uso de codones para E. coli (como lo propone el servicio GeneArt® Gene Synthesis con el software GeneOptimizer® -Lifetechnologies). Los fragmentos de ADN ampliados que comprenden los genes homólogos de ygaZH se describen en la SEQ ID indicada en la Tabla 11. Los plásmidos resultantes se denominaron como se menciona en la Tabla 11. Finalmente, cada plásmido se transformó en la cepa 8, dando las cepas 10 a 17, como se menciona en la tabla 11.
15 Tabla 10: Proteínas homólogas de YgaZH
- Organismo
-
ygaZ
imagen24 ygaH
- imagen25
- Número de acceso Nombre Número de acceso Nombre
- Citrobacter koseri
- YP_001455539.1 NC_009792.1. ABV15103.1 proteína hipotética CKO_04031 [Citrobacter koseri ATCC BAA-895] YP_001455540.1 ABV15104.1 proteína hipotética CKO_04032 [Citrobacter koseri ATCC BAA-895]
- permeasa
- Shigella flexneri
- WP_005122932.1 EIQ78635.1 proteína de membrana [Shigella flexneri] WP_005122930.1 EIQ78634.1 transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada
- imagen26
-
imagen27 imagen28 imagen29 [Shigella flexneri]
- Raoultella ornithinolytica
- YP_007877063.1 AGJ89511.1 WP_015585890.1 proteína hipotética RORB6_24155 [Raoultella ornithinolytica B6] YP_007877062.1 AGJ89510.1 exportador de L-valina [Raoultella ornithinolytica B6]
- permeasa
- Enterobacter sp.
- YP_008107733.1 AGN85393.1 WP_020454909.1 proteína de membrana [Enterobacter sp. R4-368] YP_008107734.1 WP_020454910.1 AGN85394.1 transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Enterobacter sp. R4
- imagen30
-
imagen31 imagen32 imagen33 368]
- Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica
- EKA28834.1 YWA314-01718 transportador de aminoácidos putativo [Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica WA314] EKA28833.1 ou YWA314-01713 proteína hipotética YE3239 [Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica WA-314]
- Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii
- NP_928590.1 CAE13573.1 proteína hipotética plu1279 [Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1] NP_928589.1 CAE13572.1 proteína hipotética plu1278 [Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1]
- Citrobacter youngae
- WP_006687199.1 EFE06904.1 proteína de membrana [Citrobacter youngae] proteína de resistencia a azaleucina putativa AzIC [Citrobacter youngae WP_006687198.1 EFE06903.1 permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Citrobacter youngae]
- Organismo
-
ygaZ
imagen34 ygaH
- imagen35
- Número de acceso Nombre Número de acceso Nombre
- imagen36
-
imagen37 ATCC 29220]imagen38 imagen39
- Citrobacter freundii
- WP_003839672.1 proteína hipotética [Citrobacter freundii] WP_003037297.1 permeasa transportadora ABC de aminoácidos de cadena ramificada [Citrobacter freundii]
Tabla 11: Plásmidos y cepas que portan genes homólogos de ygaZH
- Microorganismo
- Síntesis química Optimización de uso de codones SEQ ID N° Nombre del plásmido Nombre de la cepa
- Citrobacter koseri
- no no 28 pME1277 Cepa 10
- Shigella flexneri
- sí no 29 pME1274 Cepa 11
- Raoultella ornithinolytica
- sí sí 30 pME1275 Cepa 12
- Enterobacter sp.
- sí sí 31 pME1283 Cepa 13
- Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica
- no no 32 pME1287 Cepa 14
- Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii
- no no 33 pME1281 Cepa 15
- Citrobacter youngae
- sí sí 34 pME1311 Cepa 16
- Citrobacter freundii
- sí sí 35 pME1307 Cepa 17
Ejemplo 8: Producción de L-metionina por fermentación en experimentos en matraces
5 Se evaluaron productores de L-metionina recombinante que hiperproducen la metionina sintasa dependiente de cobalamina MetH además de distintos sistemas de secreción de L-metionina de diversos microorganismos (homólogos de YgaZH de E.coli) en matraces Erlenmeyer pequeños.
Las cepas de producción se evaluaron en matraces Erlenmeyer pequeños. Se desarrolló un precultivo de 5,5 ml a 30°C durante 21 horas en un medio mixto (10% medio LB (Sigma 25%) con 2,5 g.L-1 glucosa y 90% medio mínimo
10 PC1). Se usó para inocular un cultivo de 50 ml hasta un valor de OD600 de 0,2 en el medio PC1. Se añadió espectinomicina en una concentración de 50 mg.L-1 y gentamicina a 10 mg.L-1 cuando fue necesario. La temperatura de los cultivos fue 37°C. Cuando el cultivo había alcanzado un valor OD600 de 5 a 7, se cuantificaron los aminoácidos extracelulares por HPLC después de la derivación OPA/Fmoc y se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación.
15 Tabla 12: Composición de medio mínimo (PC1)
- Compuesto
- Concentración (g.L -1)
- ZnSO4.7H2O
- 0,0040
- Compuesto
- Concentración (g.L -1)
- CuCl2.2H2O
- 0,0020
- MnSO4.H2O
- 0,0200
- CoCl2.6H2O
- 0,0080
- H3BO3
- 0,0010
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0004
- MgSO4.7H2O
- 1,00
- Ácido cítrico
- 6,00
- CaCl2.2H2O
- 0,04
- K2HPO4
- 8,00
- Na2HPO4
- 2,00
- (NH4)2HPO4
- 8,00
- NH4Cl
- 0,13
- NaOH 4M
- Ajustado hasta pH 6,8
- FeSO4.7H2O
- 0,04
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 20,00
- Tiosulfato de amonio
- 5,61
- Vitamina B12
- 0,01
- MOPS
- 20,00
- IPTG
- 0,0048
Tabla13: Rendimiento de metionina (Ymet) en g de metionina/% g de glucosa producido en cultivo en matraces por las cepas de interés que hiperexpresan genes homólogos de ygaZH además de los genes metH, fldA y fpr. Para la definición precisa de rendimiento de metionina/glucosa, ver a continuación. "n" indica el número de repeticiones.
- Cepa
- Ymet
- Cepa 8 (n=2)
- 16,0
- Cepa 9 (E.coli) (n=10)
- 16,2
- Cepa 10 (C. koseri) (n=4)
- 18,4
Claims (1)
-
imagen1
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