ES2702207T3 - Fibras de algodón con contenido de glucosamina incrementado - Google Patents
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Abstract
Una célula de planta de algodón que comprende un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente: a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras, b) una región de ADN que codifica un polipéptido de GFAT en donde dicha GFAT es codificada por una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1, ii) o una variante de la misma, en la que uno o más nucleótidos difieren de la secuencia nucleotídica según SEQ ID 1, con la condición de que dicha variante no difiera en más de 20 nucleótidos de SEQ ID 1, que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) según SEQ ID 2 iii) o una secuencia complementaria de i) o ii), y c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación, en donde dicha célula de planta de algodón comprende adicionalmente un segundo gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente: a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras, b) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa y c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.
Description
DESCRIPCIÓN
Fibras de algodón con contenido de glucosamina incrementado
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la modificación de la reactividad química de fibras de algodón. En particular, la presente invención proporciona fibras de algodón que comprenden oligosacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas. Debido a los grupos amino estas fibras tienen una reactividad modificada que se puede explotar al unir otras sustancias a las fibras para alterar sus características. Estas sustancias pueden ser, p. ej., tintes reactivos u otros reaccionantes tales como pirorretardantes, agua, repelentes de aceite y manchas, agentes contra las arrugas, suavizantes, agentes antiestáticos, agentes blanqueadores fluorescentes, etc.
Esta invención proporciona métodos y medios para incrementar la eficacia de producción de oligómeros de glucosamina en células de plantas de algodón tales como células fibrilares.
Antecedentes de la invención
La fibra de algodón es el material textil simple más importante en el mundo. Aproximadamente 32 millones de hectáreas (80 millones de acres) de algodón son recogidos anualmente en todo el mundo. El algodón es el quinto cultivo más grande en los EE. UU. en cuanto a producción en hectáreas, con un promedio de 4,2 millones de hectáreas (10,3 millones de acres) plantados en los años 2006 a 2008. Aproximadamente 90% del algodón cultivado en el mundo es Gossypium hirsutum L., mientras que Gossypium barbadense responde de aproximadamente 8%. Sin embargo, como otras fibras naturales que contienen celulosa, las fibras de algodón no poseen la versatilidad química de las fibras sintéticas, debido a la naturaleza relativamente inerte de los monómeros de glucosa con uniones p-1-4 en la celulosa. Esta naturaleza inerte relativa es evidente, p. ej., durante el proceso de tinción de fibras y telas de algodón.
Generalmente, se usan dos tipos de tintes para colorear el algodón: tintes directos y tintes reactivos con fibras, que son ambos moléculas aniónicas. El propio algodón desarrolla una carga aniónica en agua, de modo que, sin tratamiento especial, la captación de tinte por la fibra o la tela es bastante complicada. Los tintes directos crean un enlace de hidrógeno relativamente débil con el polímero de celulosa formando una ligazón semipermanente. Los tintes directos son más fáciles de usar y menos costosos que los tintes reactivos con fibras, pero no soportan bien el lavado. Los tintes reactivos con fibras son moléculas que combinan cromóforos con un grupo reactivo que forma enlaces covalentes fuertes con la fibra a través de una reacción con grupos hidroxilo. Los enlaces covalentes proporcionan una buena resistencia de la fibra teñida contra el lavado. La decoloración se puede mejorar usando fijadores catiónicos.
Durante el procedimiento de teñido usando tintes directos, se necesitan grandes cantidades de electrolitos para proteger a los tintes aniónicos de las cargas de las fibras aniónicas. Los tintes sin reaccionar (hasta 40%) necesitan retirarse mediante una etapa de lavado, generando grandes volúmenes de agua residual, que también contiene los susodichos electrolitos.
Proveer a la fibra celulósica de una carga eléctrica positiva, p. ej. mediante la incorporación de compuestos químicos cargados positivamente tales como polisacáridos cargados positivamente, podría mejorar por lo tanto la capacidad de tinción de las fibras celulósicas, así como mejorar cualquier reacción química de la fibra celulósica modificada con compuestos químicos cargados negativamente. También haría posible el uso de tintes ácidos.
Varias publicaciones han descrito la incorporación o el revestimiento de oligómeros de quitosano en fibras celulósicas para formar combinaciones, hilos o telas de quitosano/celulosa. El quitosano es un polímero de glucosamina cargado positivamente, que se puede formar mediante la desacetilación de quitina, p. ej. mediante tratamientos alcalinos. La propia quitina es un polímero de N-acetilglucosamina (GIcNAc) con uniones U<el -4. Basándose en la función fisiológica del quitosano para inhibir, p. ej., dermatofitos, muchas ropas, telas y fibras funcionales emplean fibras de combinación de celulosa-quitosano, conjugados de fibra celulósica-quitosano y telas revestidas con resinas que contienen quitosano.
La solicitud de patente de EE. UU. US2003/0134120 describe el revestimiento de fibras naturales con quitosano. Liu y cols. (Carbohydrate Polymers 44(2003) 233-238) describen un método para revestir fibras de algodón con quitosano, mediante la oxidación de la hebra de algodón con peryodato potásico a 60°C en agua y el tratamiento posterior con una solución de quitosano en ácido acético acuoso. Con el revestimiento de quitosano, la superficie de la fibra de algodón se vuelve fisiológica y biológicamente activa. Puesto que la reactividad química del grupo amino es mayor que la del grupo hidroxilo de los monómeros de celulosa, la fibra tiene más potencial para una modificación
química adicional. Por otra parte, la superficie lisa de la fibra de algodón se vuelve áspera, sugiriendo un mayor potencial de absorción de fármacos y liberación controlada de los mismos.
El documento WO2006/136351 proporciona métodos y medios para la modificación de la reactividad de paredes celulares de planta, particularmente según se pueden encontrar en fibras naturales de plantas productoras de fibras mediante la inclusión de oligosacáridos o polisacáridos cargados positivamente en la pared celular. Esto se puede conseguir convenientemente al expresar un gen quimérico que codifica una N-acetilglucosamina transferasa, particularmente una N-acetilglucosamina transferasa capaz de ser dirigida a las membranas del aparato de Golgi en células de una planta. Una de las aplicaciones es un incremento en la capacidad de tinción.
El documento WO2011/089021 proporciona métodos y medios para la modificación de la reactividad de paredes celulares secundarias de plantas, particularmente en paredes celulares de algodón encontradas en fibras de algodón. Esto se puede conseguir convenientemente al expresar un gen quimérico que codifica una quitina sintasa de Saprolegnia monoica en plantas de algodón.
El documento WO2012/048807 proporciona métodos y medios alternativos para producir oligosacáridos cargados positivamente en la pared celular de plantas al introducir en dicha célula de planta una proteína de nodulación C (NOD C) fusionada a una secuencia de anclaje de señal del aparato de Golgi heteróloga.
El polisacárido quitina se forma a partir de residuos de N-acetilglucosamina. Se sintetiza a partir de UDP-N-acetilglucosamina que es el producto final de la ruta de biosíntesis de hexosamina también activa en plantas (Mayer y cols. 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107). La etapa primera y limitativa de la velocidad de esta ruta es la conversión de glutamina en glucosamina-6-fosfato que es catalizada por la enzima glutamina:fructosa-6-fosfatoamidotransferasa (GFAT).
El documento WO 2007/039314 describe plantas transgénicas que tienen la actividad de una hialuronano sintasa y adicionalmente una actividad incrementada de glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT). Estas plantas sintetizan una cantidad incrementada de hialuronano en comparación con plantas que tienen solamente la actividad de una hialuronano sintasa. Como la quitina, el hialuronano se sintetiza a partir de UDP-N-acetilglucosamina.
El documento WO 2011/089021 divulga plantas de algodón transgénicas que comprenden un gen quimérico de quitina sintasa y un gen quimérico de glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa bajo el control de un promotor selectivo de algodón. Las fibras procedentes de estas plantas de algodón transgénicas tienen un incremento en la cantidad de polímeros de N-acetilglucosamina que están uniformemente distribuidos en toda la pared celular.
Wang y Roosinck, 2006 (Plant Molecular Biology, vol.61, p.699-710) proporciona codones óptimos en doce especies de plantas, entre ellas algodón, y demuestra que la tendencia a la utilización de algodón está correlacionada positivamente con los niveles de transcritos génicos.
No obstante sigue habiendo una necesidad de métodos y medios mejorados para producir fibras de algodón que comprendan un nivel incrementado de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas. Estos y otros problemas se resuelven según se describe posteriormente en el sumario, las realizaciones detalladas, los ejemplos, los dibujos y las reivindicaciones.
Sumario de la invención
En una primera realización la invención proporciona una célula de planta de algodón que comprende un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente:
(a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
(b) una región de ADN para un polipéptido de GFAT en donde dicha GFAT es codificada por una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 o dicha variante de la misma y
(c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación que comprende un segundo gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente: (a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
(b) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa y
(c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.
En otra realización más, la invención proporciona una planta de algodón que consiste en las células de planta que se describen en la presente.
La invención también proporciona fibras tales como fibras de algodón que se pueden obtener de la planta que se describe en la presente. Por otra parte, se proporciona un hilo o una tela elaborados a partir de las fibras.
En otra realización de la invención, dicho método para producir fibras de algodón con polisacáridos cargados positivamente comprende las etapas de
i) expresar un primer gen quimérico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica GFAT según se describe en la presente anteriormente y un segundo gen quimérico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una quitina sintasa,
ii) regenerar una planta de algodón a partir de células de plantas de algodón de la etapa i) y
iii) opcionalmente aislar fibras de dicha planta de algodón.
Descripción de las figuras
Figura 1: Secuencia nucleotídica de la molécula de ácido nucleico sintética que codifica la glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) de E. colisegún SEQ ID 2 (SEQ ID 1).
Figura 2: Secuencia de aminoácidos de la glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (SEQ ID 2) de E. coli. Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que la expresión de una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) en células de planta, particularmente en células de planta de algodón de plantas de algodón conduce a la producción de una cantidad incrementada de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas en células de planta o fibras de estas plantas tales como fibras de algodón, en comparación con células o fibras de planta que no comprendan una proteína de GFAT o en comparación con células de planta que expresen un gen que codifica GFAT conocido en la técnica que no esté optimizado para la expresión en células de plantas de algodón. Este hallazgo inesperado también se puede conseguir mediante la expresión de una variante de SEQ ID 1 en una célula de planta, particularmente en una célula de planta de algodón, que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfatoamidotransferasa según SEQ ID 2, en donde dicha variante difiere de SEQ ID 1 en uno o más nucleótidos con la condición de que en total no difiera en más de 20 nucleótidos con respecto a SEQ ID 1.
Así, se describe en la presente una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
i) una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1,
ii) o una variante de la misma, en donde uno o más nucleótidos difieren de la secuencia nucleotídica de SEQ ID 1, con la condición de que dicha variante no difiera en más de 20 nucleótidos con respecto a SEQ ID 1, que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) según SEQ ID 2
iii) o una secuencia complementaria de i) o ii).
SEQ ID 1 codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa procedente de E. coli. La correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína se describe en SEQ ID 2. Esta enzima cataliza la conversión de fructosa-6-fosfato y glutamina en glucosamina-6-fosfato y glutamato como un producto secundario. Se ha descrito en el documento WO2007/039314 la producción de hialuronano en plantas. Durante la ruta de la hexosamina, glucosamina-6-fosfato se convierte además en UDP-N-acetilglucosamina que a su vez sirve como materia prima para la síntesis de glicosaminoglicanos tales como hialuronano o quitina si están presentes las enzimas apropiadas. El documento WO2007/039314 divulga una secuencia nucleotídica de GFAT que se derivaba del gen de E. coli que codifica GFAT pero estaba adaptada al uso de codones en células de planta. La secuencia nucleotídica divulgada como SEQ ID 1 en la presente solicitud varía con respecto a la secuencia nucleotídica descrita en el documento WO2007/039314 en aproximadamente 25%. Aunque la secuencia divulgada en el documento WO2007/039314 estaba optimizada para la expresión en células de planta en general, la expresión de un gen quimérico que comprende una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 conduce a resultados particularmente buenos en células de
algodón. Las células de algodón que comprenden una secuencia nucleotídica expresable en plantas según SEQ ID 1 o una variante de la misma que codifica una proteína de GFAT procedente de E. colisegún SEQ ID 2 y que difiere de SEQ ID 1 en uno o más nucleótidos con la condición de que en total no difiera en más de 20 nucleótidos con respeto a SEQ ID 1, o plantas de algodón constituidas por estas células de plantas de algodón, producen una cantidad incrementada de glucosamina en comparación con células de algodón que expresen una secuencia nucleotídica como la divulgada en el documento WO2007/039314 o plantas constituidas por estas células de algodón (véanse los datos experimentales).
Según se usa en la presente, "diferencia de no más de 20 nucleótidos con respecto a SEQ ID 1" significa, p. ej., 20 nt, 19 nt, 18 nt, 17 nt, 16 nt, 15 nt, 14 nt, 13 nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt, 2 nt o 1 nt diferente de SEQ ID 1, aunque codificando todavía la glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) según SEQ ID 2.
Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, mono- o bicatenario. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar químicamente o producirse mediante la expresión biológica in vitro o incluso in vivo. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar químicamente usando fosforamiditas de ribonucleósido protegidas apropiadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. En relación con el gen quimérico de la presente divulgación, ADN incluye ADNc y ADN genómico.
Además, se proporciona un gen quimérico que comprende como regiones de ADN ligadas operativamente
(a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
(b) una región de ADN que codifica un polipéptido de GFAT en donde dicha GFAT está codificada por una secuencia nucleotídica como la descrita en la presente anteriormente y
(c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.
Según se usa en la presente, el término "promotor expresable en plantas" significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripción en una célula de planta. Este incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripción en una célula de planta, es decir, ciertos promotores de origen viral o bacteriano tales como el CaMV35S, el promotor del virus del trébol subterráneo N° 4 o N° 7 (documento WO9606932) o promotores de ADN T y similares.
En un ejemplo, el promotor puede ser un promotor heterólogo no asociado naturalmente con la región de ADN ligada operativamente a él.
Estará claro que pueden ser adecuados para la invención promotores constitutivos expresables en plantas. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor procedente del gen de actina (McElroy y cols. (1990) Plant Cell 2: 163-171), el promotor CaMV35S (Odell y cols. (1985) Nature 313: 810-812), el promotor CaMV19S (Nilsson y cols. (1997) Physiol. Plant. 100: 456-462), el promotor GOS2 (de Pater y cols. (1992) Plant. J. 2(6): 837-44), el promotor procedente del gen de ubiquitina (Christensen y cols. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689), el promotor procedente del gen de ciclofilina de arroz (Buchholz y cols. (1994) Plant. Mol. Biol. 25(5): 837-43), el promotor procedente del gen de histona H3 de maíz (Lepetit y cols. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285) o el promotor procedente del gen de actina 2 (An y cols. (1996) Plant J. 10(1): 107-121).
También está claro que se pueden usar según la invención promotores inducibles, tales como un promotor inducible por temperatura o inducible químicamente o un promotor que es sensible a señales de desarrollo. También se pueden usar promotores selectivos en tejidos.
En un ejemplo, el gen quimérico comprende un promotor preferente en fibras o selectivo en fibras. El término "preferente en fibras" o "selectivo en fibras", con respecto a la expresión de un gen o con respeto a un promotor, se refiere, con propósitos prácticos, a la expresión altamente específica de un gen o la expresión dirigida por un promotor, en células fibrilares de plantas, tales como plantas de algodón. En otras palabras, los niveles de transcritos de un ADN en tejidos diferentes de células fibrilares bien están por debajo del límite de detección o bien son muy bajos (menores de aproximadamente 0,2 picogramos por microgramo de a Rn total).
El término "preferente en fibras" o "preferente en células fibrilares" con respecto a la expresión de un ADN según esta invención se refiere a un patrón de expresión por el que el ADN se expresa predominantemente en células fibrilares o fibras, pero la expresión se puede identificar en otros tejidos de la planta. Preferiblemente, la expresión en células fibrilares es de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces mayor en las células fibrilares que en otros tejidos.
Estos promotores incluyen el promotor procedente de algodón procedente de un Uiuch prom®e (como el descrito en el documento WO0210377), el promotor procedente de algodón procedente de un gen de actina específico en fibras (como el descrito en el documento WO0210413), el promotor procedente de un gen de proteína de transferencia de lípidos específico en fibras procedente de algodón (como el descrito en el documento US5792933), un promotor procedente de un gen de expansina procedente de algodón (documento WO9830698) o un promotor procedente de un gen de quitinasa en algodón (documento US2003106097) o los promotores de los genes específicos en fibras descritos en los documentos US6259003 o US6166294 o los promotores derivados de la familia E6 que se divulgan en el documento US6096950. Promotores selectivos en fibras como los descritos en el documento WO08/083969 (a partir de genes de glucanasa de algodón), el documento WO12/093032 (a partir del gen FS18 o SCW-PRP de algodón) o el documento US 2013/0081154 (a partir de genes tipo FB8 de algodón) también son promotores adecuados expresables en plantas. También es adecuado para la invención el promotor divulgado en el documento EP13172094 que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID No. 5 que se describe en la presente desde la posición nucleotídica 4208 a la posición nucleotídica 5615 o que tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID No. 5 desde la posición nucleotídica 75 a la 1482.
Los genes quiméricos de la presente descritos opcionalmente comprenden una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Se conoce en la técnica una variedad de regiones de ADN implicadas en la terminación de la transcripción y la poliadenilación funcionales en plantas y los expertos en la técnica conocerán secuencias terminadoras y de poliadenilación que pueden ser adecuadas al realizar los métodos descritos en la presente. La región de poliadenilación se puede derivar de un gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, de genes de ADN T o incluso de genomas virales de planta. La secuencia del extremo 3' que se va a añadir se puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de planta, o de cualquier otro gen eucariótico.
En una primera realización de la invención, se proporciona una planta de algodón que comprende un gen quimérico que comprende como regiones de ADN ligadas operativamente
(a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
(b) una región de ADN que codifica un polipéptido de GFAT en donde dicha GFAT está codificada por una secuencia nucleotídica como la descrita en la presente y
(c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación y que comprende adicionalmente un segundo gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente:
a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
b) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa y
c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.
El gen quimérico se puede introducir en una célula de planta mediante métodos muy conocidos en la técnica. "Introducir", en relación con la presente solicitud, se refiere a la colocación de información genética en una célula de planta o una planta por medios artificiales. Esto se puede efectuar mediante cualquier método conocido en la técnica para introducir ARN o ADN en células de planta, tejidos, protoplastos o plantas enteras.
El término "introducir" se puede referir a la introducción de una molécula de ADN exógena a una célula de planta mediante transformación, opcionalmente seguido por la regeneración de una planta a partir de la célula de planta transformada. El término también se puede referir a la introducción de la molécula de ADN recombinante mediante el cruzamiento de una planta transgénica que comprende la molécula de ADN recombinante con otra planta y la selección de plantas descendientes que han heredado la molécula de ADN recombinante o el transgén. Otro significado alternativo más de proporcionar se refiere a la introducción de la molécula de ADN recombinante mediante técnicas tales como fusión de protoplastos, opcionalmente seguida por regeneración de una planta a partir de los protoplastos fusionados.
Estará claro que los métodos de transformación usados son de poca relevancia para la presente invención. La transformación de plantas es actualmente una técnica habitual. Ventajosamente, se puede usar cualquier de varios métodos de transformación para introducir el ácido nucleico/gen de interés en una célula progenitora adecuada. Métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens y cols. (1982) Nature 296: 72-74 ; Negrutiu y cols. (1987) Plant. Mol.
Biol. 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito y cois. (1985) Bio/Technol. 3: 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway y cols. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179-185); bombardeo de partículas revestidas con ADN o ARN (Klein y cols. (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares.
También se conocen en la técnica métodos para transformar plantas de algodón. Las transformación de algodón mediada por Agrobacterium se ha descrito, p. ej., en la patente de EE. UU. 5.004.863 o en la patente de EE. UU.
6.483.013 y la transformación de algodón mediante bombardeo de partículas se presenta, p. ej., en el documento WO 92/15675. Otros métodos de transformación de algodón adecuados se divulgan, p. ej., en los documentos WO 00071733 y US 5.159.135.
Las moléculas de ADN recombinante descritas en la presente se pueden introducir en plantas de un modo estable o de un modo transitorio usando métodos muy conocidos en la técnica. Los genes quiméricos se pueden introducir en plantas o se pueden generar dentro de la célula de planta según se describe, p. ej., en EP 1339859.
Varias especificaciones sobre lo que se entiende por el término "promotor expresable en plantas" se dan anteriormente y se aplican igualmente para el segundo gen quimérico que comprende una región de ADN que codifica una quitina sintasa. Lo mismo es cierto para las especificaciones dadas anteriormente sobre la región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación y también para métodos y medios para proporcionar una célula de planta con un gen quimérico.
El primer gen quimérico y el segundo gen quimérico se pueden introducir en una célula de planta individualmente en cualquier orden o simultáneamente. Se pueden introducir en el mismo vector o en vectores separados.
La quitina sintasa puede ser cualquier proteína que tenga la actividad enzimática de una quitina sintasa (EC 2.4.1.16), es decir, que convierta UDP-N-acetil-D-glucosamina en quitina y UDP. Una quitina sintasa cataliza la reacción: UDP-N-acetil-alfa-D-glucosamina (1,4-(N-acetil-beta-D-glucosaminilo))(n) <=> UDP (1,4-(N-acetil-beta-D-glucosaminilo))(n+1). Es adecuada para la presente invención cualquier quitina sintasa derivada de cualquier organismo. Ejemplos de quitina sintasas adecuadas son quitina sintasa procedente de Saprolegnia monoica (documento WO 2011/089021) o quitina sintasas de tipo NOD C como las descritas en el documento WO 2006/136351 o en el documento WO 2012/048807, por ejemplo.
En una realización particular de la invención, la quitina sintasa en dicha célula de planta de algodón que se describe anteriormente es una N-acetilglucosamina transferasa del tipo NOD C. Se obtienen buenos resultados particulares si dicho polipéptido de quitina sintasa comprende una señal de localización en el aparato de Golgi.
Aunque se han conseguido buenos resultados con células de planta que comprenden una actividad de quitina sintasa además de la actividad de GFAT, la actividad de GFAT que se obtiene por los medios descritos en la invención también se puede combinar beneficiosamente con cualquier actividad enzimática que conduzca a la producción de glicosaminoglicanos procedentes del producto de GFAT glucosamina-6-fosfato o de UDP-N-acetilglucosamina. Según se describe en la introducción, glucosamina-6-fosfato se convierte adicionalmente en UDP-N-acetilglucosamina a través de la ruta de la hexosamina en plantas. Una de estas actividades enzimáticas que convierte UDP-N-acetilglucosamina en glicosaminoglicanos distintos a la quitina es la de una hialuronano sintasa. Así, también se puede usar una hialuronano sintasa en lugar de una quitina sintasa.
En otra realización particular, la invención proporciona una planta de algodón que consiste esencialmente en células de plantas de algodón que comprenden un primer y un segundo gen quimérico descrito en la presente anteriormente.
"Algodón" o "planta de algodón", según se usa en la presente, puede ser cualquier variedad útil para cultivar algodón. Las variedades de algodón más comúnmente usadas son Gossypium barbadense, G. hirsutum, G. arboreum y G. herbaceum. Variedades adicionales incluyen G. africanum y G. raimondii. También se incluye la progenie procedentes de cruces de cualquiera de las especies anteriores con otras especies o cruces entre estas especies.
Una célula de planta de algodón puede ser cualquier célula que comprenda esencialmente la información genética necesaria para definir una planta de algodón, que, aparte del gen quimérico divulgado en la presente, puede estar complementada mediante uno o más transgenes adicionales. Las células se pueden derivar de los diversos órganos y/o tejidos que forman una planta de algodón, incluyendo, pero no limitados a, frutos, semillas, embriones, tejido reproductivo, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, tallos, flores, tejido vascular, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas.
Aunque ciertas células de planta según la invención pueden ser capaces de regenerarse en plantas completas, en algunas realizaciones dichas células de planta no se pueden desarrollar adicionalmente o regenerar en una planta completa. En una realización de la invención, las células fibrilares se muelen. Las células fibrilares maduras son células muertas.
También se describen plantas productoras de fibras que comprenden una o más construcciones recombinantes descritas en la presente. Aunque la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de GFAT se ha optimizado para la expresión en plantas de algodón, se cree que la región codificante también se podría usar beneficiosamente en otras plantas productoras de fibras tales como cáñamo, yute, lino y plantas leñosas incluyendo, pero no limitadas a, Pinus spp., Populus spp., Picea spp., Eucalyptus spp., etc. La célula de planta se puede derivar de cualquier planta productora de tricomas.
Las plantas según la invención se pueden usar en un esquema de reproducción convencional para producir más plantas con las mismas características o para introducir los genes quiméricos descritos en la presente en otras variedades de la misma especie de planta o una relacionada, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas de las plantas transformadas contienen los genes quiméricos descritos en la presente como una inserción genómica estable y también son abarcadas por la invención.
El término "planta", según se usa en la presente, abarca plantas enteras, progenitores y descendencia de las plantas y partes de planta, incluyendo semillas, tallos, troncos, hojas, raíces (incluyen tubérculos), flores, fibras y tejidos y órganos, en donde cada uno de los susodichos comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células de planta, cultivos en suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, de nuevo en donde cada uno de los susodichos comprende el gen/ácido nucleico de interés.
En una realización específica, la invención proporciona fibras de algodón obtenibles de una planta de algodón según la invención.
Las fibras de algodón según la invención se pueden distinguir de fibras de algodón presentes en la naturaleza, es decir, fibras de algodón obtenidas de una línea isogénica que no comprende una secuencia de ácido nucleico como la descrita en la presente, por el contenido incrementado de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas. Los polímeros de GlcNAc o las oligoglucosaminas se pueden detectar directamente. Alternativamente, los polisacáridos cargados positivamente en las fibras de algodón se pueden detectar al medir el contenido de glucosamina después del tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para hidrolizar los polisacáridos. Las fibras de algodón según la invención también se pueden distinguir por su contenido de nitrógeno incrementado. Debido a la reactividad de los grupos que contienen nitrógeno dentro de los polímeros de glucosamina, las fibras de algodón según la invención se caracterizan por su reactividad química alterada en comparación con fibras obtenidas de plantas de algodón que no comprenden una región de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GFAT según se describe en la presente. Las fibras según la invención tienen una capacidad incrementada para reaccionar con tintes u otros productos químicos adecuados a través de los grupos que contienen nitrógeno.
Las fibras de algodón según la invención se caracterizan por un contenido incrementado de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas. "Contenido incrementado" significa que la cantidad de polisacáridos cargados positivamente presente en las células o fibras de planta es superior que en células o fibras de planta que no comprenden proteína de GFAT o en comparación con células o fibras de planta que expresan un gen codificante de GFAT conocido en la técnica que no está optimizado para la expresión en células de plantas de algodón. En un ejemplo, el contenido de glucosamina (GlcN) es al menos dos veces el de células o fibras procedentes de plantas que no expresan una construcción génica introducida artificialmente. Se observaba que este nivel de fondo era de aproximadamente 0,010 a 0,015% de GlcN del peso de fibra total. Preferiblemente, las fibras según la invención contienen más de 0,03% de GlcN del peso de fibra total. Más preferiblemente, el contenido de GlcN de fibras según la invención es mayor de 0,06%, aún más preferiblemente mayor de 0,08%, lo más preferiblemente mayor de 0,10% de GlcN del peso de fibra total. En otro ejemplo, el contenido de GlcN de las células de planta o las fibras de algodón según la invención es al menos cuatro veces el de células o fibras procedentes de plantas que no expresan una construcción génica introducida artificialmente. En otro ejemplo más, las células o las fibras de planta tienen un contenido de GlcN que es al menos cinco veces, preferiblemente al menos siete veces y lo más preferiblemente diez veces el de células o fibras procedentes de plantas que no expresan una construcción génica introducida artificialmente.
Una "fibra" se define botánicamente como una célula ahusada estrecha y larga, muerta y hueca en la madurez, con una pared celular rígida compuesta principalmente por celulosa y habitualmente lignina. Las fibras blandas o liberianas se encuentran en el floema (corteza interna) de troncos de dicotiledóneas (lino, yute, cáñamo, ramio). Las fibras duras o foliares se encuentran en haces vasculares de hojas de monocotiledóneas (sisal, cáñamo de Manila, piña). Las fibras superficiales se desarrollan a partir de la superficie de semillas (algodón), hojas o frutos (fibra de coco).
"Fibra de algodón", según se usa en la presente, se refiere a un tricoma seminal, más específicamente una sola célula de una planta productora de fibras, tal como algodón, que se inicia a partir de la epidermis del integumento externo de los óvulos, en o justo antes de la antesis. El desarrollo morfológico de las fibras de algodón ha estado bien documentado (Basra y Malik, 1984, Int Rev of Cytology 89: 65-113; Graves y Stewart, 1988, J. Exp. Bot. 39 (1):
59-69; Ramsey y Berlín, 1976, American Journal of Botany 63 (6): 868-876; Ruan y Chourey, 1998, Plant Physiology 118: 399-406; Ruan y cols. 2000, Aust. J. Plant Physiol. 27:795-800; Stewart, 1975, Am. J. Bot. 62, 723-730).
Por lo tanto, también se describen en la presente paredes celulares de células de planta tales como paredes celulares procedentes de células de algodón, que comprenden un nivel incrementado de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas en comparación con paredes celulares procedentes de células de planta no modificadas o de células de planta que no expresan una secuencia nucleotídica que codifica GFAT según se describe en la presente.
La invención también se refiere a hilos hechos de fibras según la invención así como telas hechas de estos hilos. Se describe un método para producir fibras de algodón con polisacáridos cargados positivamente, tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas, que comprende las etapas de
i) expresar un gen quimérico que comprende una región codificante de GFAT según se describe anteriormente en una célula de planta de algodón,
ii) regenerar una planta de algodón a partir de células de plantas de algodón de la etapa i) y
iii) opcionalmente aislar fibras de dicha planta de algodón.
En otra realización, se proporciona un método para producir fibras de algodón con polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas que comprende i) la expresión de un primer gen quimérico que comprende una región codificante de GFAT según se describe en la presente y un segundo gen quimérico que comprende una región codificante de quitina sintasa en una célula de planta de algodón, ii) la regeneración de una planta de algodón a partir de dichas células de plantas de algodón e iii) opcionalmente el aislamiento de fibras de dicha planta de algodón. Dichos primer y segundo gen quimérico se pueden introducir en la célula de planta simultáneamente o separadamente en cualquier orden según se describe anteriormente.
Se proporciona un método para producir fibras de algodón con un contenido incrementado de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas que comprende las etapas de i) expresar dicho primer y segundo gen quimérico en una célula de planta de algodón, ii) regenerar una planta de algodón a partir de dichas células de plantas de algodón e iii) opcionalmente aislar fibras de dicha planta de algodón. El término "contenido incrementado" se debe entender como se describe anteriormente.
Además, se proporciona un método para producir fibras de algodón con reactividad química alterada de las fibras que comprende las etapas de i) expresar un gen quimérico que comprende una región codificante de GFAT descrita en la presente en una célula de planta de algodón, y un segundo gen quimérico que comprende una región codificante de quitina sintasa según se describe en la presente ii) regenerar una planta de algodón de dichas células de plantas de algodón e iii) opcionalmente aislar fibras de dicha planta de algodón.
Se proporciona otro método para producir fibras de algodón con reactividad química alterada de las fibras que comprende las etapas de i) expresar un primer gen quimérico que comprende una región codificante de GFAT como la descrita anteriormente y un segundo gen quimérico que comprende una región codificante de quitina sintasa en una planta de algodón, ii) regenerar una planta de algodón de dichas células de plantas de algodón e iii) opcionalmente aislar fibras de dicha planta de algodón.
La molécula de ácido nucleico que se describe en la presente se puede usar para producir una planta de algodón con polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas en las fibras. En particular, se puede usar para incrementar la cantidad de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas en fibras. También se puede usar para la producción de fibras de algodón con reactividad química alterada. Esto podría permitir el acabado adicional cómodo, fácil y/o eficaz de las fibras. Las fibras obtenidas de una planta de algodón según la invención, p. ej., se pueden colorear con tintes reactivos que se unen a las fibras a través de enlaces covalentes con los grupos amino de los residuos de glucosamina en los polisacáridos. Alternativamente, otras sustancias se pueden ligar a través de reacciones químicas a los grupos amino de los residuos de glucosamina. Las sustancias también se pueden ligar a fibras según la invención a través de enlace electrostático o iónico a los grupos que contienen N de los polisacáridos. La ligazón de otras sustancias a fibras de algodón puede ser beneficiosa para transferir propiedades especiales a las fibras. Estos acabados pueden ser, pero no se limitan a, tinción, ligazón de pirorretardantes, agua, repelentes de aceite y manchas, agentes contra las arrugas, suavizantes, agentes antiestáticos, agentes blanqueadores fluorescentes o cualquier otro acabado textil. Según se usa en la presente, se debe entender que "que comprende" especifica la presencia de características, números enteros, etapas o componentes indicados que se mencionen, pero no excluye la presencia o la adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Así, p. ej., un ácido
nucleico o una proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados, es decir, puede estar incluida en un ácido nucleico o una proteína mayores. Un gen quimérico que comprende una región de ADN que está funcionalmente o estructuralmente definida puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.
Los siguientes ejemplos describen la generación de fibras de algodón con un contenido incrementado de polisacáridos cargados positivamente tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas.
A menos que se indique otra cosa en los ejemplos, todas las técnicas recombinantes se llevan a cabo según protocolos estándar como los descritos en "Sambrook J y Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York" y en "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA y Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Nueva York".
Materiales y referencias estándar se describen en "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" y en "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2a Edición, Academic Press, San Diego". Materiales y métodos estándar para reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden encontrar en "McPherson MJ y Moller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" y en "PCR Applications Manual, 3a Edición (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim o www.roche-applied-science.com".
Descripción de secuencias
Se hace referencia a lo largo de la solicitud a las siguientes secuencias representadas en el listado de secuencias llamado "BCS14-2002_ST25", que tiene 42 kB (tamaño según se mide en Microsoft Windows®), contiene 4 secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, que está archivado conjuntamente con la presente mediante presentación electrónica:
SEQ ID 1: Secuencia nucleotídica sintética que codifica una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) procedente de E. coli. La secuencia está optimizada para la expresión en células de plantas de algodón. La secuencia nucleotídica mostrada codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 2.
SEQ ID 2: Secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfatoamidotransferasa (GFAT) procedentes de E. coli. La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEQ ID 1.
SEQ ID 3: ADN T de pTDBI 252. Comprende una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 que codifica un polipéptido de GFAT procedente de E. coli bajo el control de un promotor SCW-PRP selectivo en fibras, una región de ADN que codifica una quitina sintasa NOD C bajo el control de un promotor SCW-PRP selectivo en fibras y el gen epsps como un marcador seleccionable.
SEQ ID 4: ADN T de pTDBI 250. Comprende una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 que codifica un polipéptido de GFAT procedente de E. coli bajo el control de un promotor tipo Fb8-1 selectivo en fibras, una región de ADN que codifica una quitina sintasa NOD C bajo el control de un promotor tipo Fb8-1 selectivo en fibras y el gen epsps como un marcador seleccionable.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de un gen quimérico que codifica una proteína de glutamina:fructosa-6-fosfatoamidotransferasa (GFAT) para la expresión en células de algodón (solamente para referencia)
Una molécula de ADN que tiene la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID 1 se sintetizó mediante Entelechon GmbH. La secuencia nucleotídica estaba diseñada i) para codificar un polipéptido según SEQ ID 2 e ii) para optimizar la secuencia nucleotídica para la expresión en células de plantas de algodón. Con este propósito, se tuvieron en cuenta factores tales como la utilización de codones, la estructura secundaria del ARNm, el contenido de AT, los sitios de empalme crípticos o los sitios de restricción.
La secuencia nucleotídica resultante que se divulga en SEQ ID 1 es 75% idéntica (1390 de bases coincidentes de 1830) con la secuencia nucleotídica publicada que codifica una proteína de GFAT procedente de E. coli que estaba adaptada a la utilización de codones en plantas (documento WO 2007/039314).
Usando técnicas de ADN recombinante estándar, se construyó el siguiente gen de GFAT quimérico: Un gen de glutamina-6-fosfato-amidotransferaso quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente:
i. la región promotora SCW-PRP selectiva en fibras según la secuencia desde la posición nucleotídica 61 a 1499 de SEQ ID 3,
ii. un fragmento de ADN que codifica los 35 aminoácidos N-terminales de Da ADN xiosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana que funciona como un péptido señalizador de la localización en el aparato de Golgi, iii. un fragmento de ADN que codifica NOD C de Azorhizobium caulinodans clonado en el marco con el fragmento de ADN previo,
iv. la secuencia no traducida 3' del transcrito 35S del virus del mosaico de la coliflor,
v. la región promotora SCW-PRP selectiva en fibras según la secuencia procedente de la posición nucleotídica 61 a 1499 de SEQ ID 3,
vi. una región de ADN que tiene la secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa procedente de E. colisegún SEQ ID 2,
vii. la secuencia no traducida 3' del gen de histona H4 de Arabidopsis thaliana.
Este gen quimérico se introdujo entre los límites de ADN T de un vector de ADN T junto con un gen sintético de 5-enol-piruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (epsps) con mutación doble procedente de Zea mays (maíz) que proporciona resistencia a N-(fosfonometil)glicina como un marcador seleccionable. El vector de ADN T resultante se denominó pTDBI 252. La secuencia del ADN T de este vector se proporciona en SEQ ID 3. Los elementos genéticos del ADN T de este vector se representan en la Tabla 1.
Se construyó otro gen de GFAT quimérico que contenía las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente: i. la región promotora tipo Fb8-1 selectiva en fibras según la secuencia desde la posición nucleotídica 60 a 1495 de SEQ ID 4,
ii. un fragmento de ADN que codifica los 35 aminoácidos N-terminales de Da ADN xilosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana que sirve como un péptido de localización en el aparato de Golgi,
iii. un fragmento de ADN que codifica NOD C de Azorhizobium caulinodans clonado en el marco con el fragmento de ADN previo,
iv. La secuencia no traducida 3' del transcrito 35S del virus del mosaico de la coliflor,
v. la región promotora tipo Fb8-1 selectiva en fibras según la secuencia desde la posición nucleotídica 60 a 1495 de SEQ ID 4,
vi. una región de ADN que tiene la secuencia nucleotídica según SEQ ID 1 que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa procedente de E. coli según SEQ ID 2,
vii. la secuencia no traducida 3' del gen de histona H4 de Arabidopsis thaliana.
Este gen quimérico se introdujo entre los límites a ADN T de un vector de ADN T junto con un gen epsps quimérico como un marcador seleccionable. El vector de ADN T resultante se denominó pTDBI 250. La secuencia del ADN T de este vector se proporciona en SEQ ID 4. Los elementos genéticos del ADN T se representan en la Tabla 2.
Como un control, se usó un gen quimérico que contenía las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente: i. la región promotora SCW-PRP selectiva en fibras según la secuencia desde la posición nucleotídica 61 a 1499 de SEQ ID 3,
ii. un fragmento de ADN que codifica los 35 aminoácidos N-terminales deU'a ADN xilosiltransferasa procedente de Arabidopsis thaliana,
iii. un fragmento de ADN que codifica NOD C de Azorhizobium caulinodans clonado en el marco con el fragmento de ADN previo,
iv. la secuencia no traducida 3' del transcrito 35S del virus del mosaico de la coliflor,
v. la región promotora SCW-PRP selectiva en fibras según una secuencia procedente de la posición nucleotídica 61 a 1499 de SEQ ID 3,
vi. una región de ADN que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa procedente de E. colique estaba optimizada para la utilización de codones en plantas según se describe en el documento WO 2007/039314 bajo SEQ ID 10 del mismo,
vii. la secuencia no traducida 3' del gen de histona H4 de Arabidopsis thaliana.
Este gen quimérico se introdujo entre los límites de ADN T de un vector de ADN T junto con un gen epsps quimérico como un marcador seleccionable. El vector de ADN T resultante se denominó pTGK 110, Este vector es idéntico a pTDBI252 excepto para la secuencia codificante de GFAT.
Ejemplo 2: Generación de plantas de algodón transgénicas que expresan una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (solamente para referencia)
Los vectores de ADN T se introdujeron en cepas de Agrobacterium tumefaciens que contenían un plásmido Ti cooperador y se usaron en la transformación de algodón esencialmente como se describe en el documento WO00/71733. Las plantas T0 se analizaron adicionalmente como se describe en el Ejemplo 3.
Ejemplo 3: Determinación del contenido de glucosamina de fibras de algodón (solamente para referencia)
Fibras procedentes de plantas T0 de algodón transgénicas se aislaron, se trataron con ácido trifluoroacético (TFA) para hidrolizar los polímeros de glucosamina y se analizaron con respecto al contenido de glucosamina mediante HPLC. Todas las etapas se llevaron a cabo siguiendo protocolos estándar.
Las fibras de líneas no transformadas contenían aproximadamente 0,01% de GlcN. Los resultados para el contenido de glucosamina medido de fibras de algodón procedentes de diferentes plantas T0 que expresaban el gen de GFAT descrito en la presente bajo el control del promotor SCW-PRP (transformado con pTDBI 252) se representan en la Tabla 3.
Tabla 3: Contenido de GlcN de fibras de algodón procedentes de plantas T0 individuales
GFAT optimizada (pTDBI 252) GFAT control (pTGK 110)
pl1 0,0115 * cpl1 0,0101 *
pl2 0,0118 * cpl2 0,0112 *
pl3 0,0136 * cpl3 0,0120 *
pl4 0,0141 * cpl4 0,0121 *
pl5 0,0318 cpl5 0,0125 *
pl6 0,0340 cpl6 0,0316
pl7 0,0371 cpl7 0,0330
pl8 0,0389 cpl8 0,0334
pl9 0,0401 cpl9 0,0349
pl10 0,0405 cpl10 0,0425
pl11 0,0431 cpl11 0,0446
pl12 0,0448 cpl12 0,0536
pl13 0,0472 cpl13 0,0546
pl14 0,0502 cpl14 0,0566
pl15 0,0530 cpl15 0,0589
pl16 0,0538 cpl16 0,0597
pl17 0,0558 cpl17 0,0599
pl18 0,0630 cpl18 0,0714
pl19 0,0674 Promedio: 0,0385
pl20 0,0762
pl21 0,0783
pl22 0,0811
pl23 0,0817
pl24 0,0910
pl25 0,0929
pl26 0,0965
Pl27 0,1016
pl28 0,1152
pl29 0,1243
pl30 0,1319
Promedio: 0,0607
Los valores representan % de GlcN del peso de fibras total; *: considerado como fondo
Los números dados representan el % de GlcN del peso total de fibras. Los valores por debajo de 0,015 se consideraban como fondo. La Tabla 3 también muestra en contenido de GlcN encontrado en fibras procedentes de plantas de algodón T0 individuales que se transformaban con el vector de control pTGK 110 que comprende una región de ADN codificante de GFAT que está optimizada para la utilización de codones en plantas y se conoce en la técnica.
La Tabla 4 muestra el contenido de GlcN promedio y máximo (medido en % del peso total de fibras) de fibras de algodón derivadas de plantas T0 que expresan el gen GFAT descrito en la presente bajo el control del promotor SCW-PRP o bajo el control del promotor tipo Fb8-1. Como un control, se dan valores para plantas que expresan el gen de GFAT optimizado para plantas descrito en el documento WO 2007/039314. El contenido promedio de GlcN de fibras que expresan la secuencia del gen de GFAT según SEQ ID 1 bajo el control del promotor SCW-PRP estaba aproximadamente cuatro veces por encima del nivel de fondo (0,061% frente a 0,015%) y casi dos veces el de plantas de control que expresan una secuencia del gen de GFAT optimizada para plantas publicada en el documento WO 2007/039314 (0,061% frente a 0,039%). El contenido de GlcN máximo que se medía en una planta T0 que expresa el gen GFAT descrito en la presente bajo el control del promotor SCW-PRP estaba casi 10 veces por encima del nivel de fondo de fibras procedentes de plantas que no expresan una construcción génica introducida artificialmente (0,132% frente a 0,015%). Por otra parte, era casi dos veces el de plantas de control que expresan una secuencia del gen de GFAT optimizada para plantas publicada en el documento WO 2007/039314 (0,132% frente a 0,071%). Asimismo, las plantas que expresan un gen de GFAT según SEQ ID 1 bajo el control del promotor tipo Fb8-1 tenían un incremento máximo en el contenido de GlcN de las fibras de más de 10 veces (0,178% frente a 0,015%) y un incremento promedio de 2 veces en el contenido de GlcN de las fibras (0,039% frente a 0,015%) en comparación con plantas que no expresan una construcción génica introducida artificialmente.
Tabla 4: Contenido de GlcN medio y promedio de fibras procedentes de plantas de algodón T0 que expresan un gen de GFAT según SEQ ID 1 bajo el control de diferentes promotores selectivos en fibras)
Promotor GFAT Ctrl. GFAT Ctrl. GFAT opt. GFAT opt.
promedio máx. promedio máximo
SCW-PRP 0,039 0,071 0,061 0,132
Tipo Fb8- 0,039 0,178
1
Los valores representan % de GlcN del peso total de fibras
Ejemplo 4: Fibras de algodón con reactividad incrementada
Plantas de algodón transgénicas que comprenden un gen de GFA quimérico y un gen de NOD C quimérico ligados operativamente a un promotor específico en fibras como el esbozado en el Ejemplo 1 se generan como se describe en el Ejemplo 2. Se recogen fibras de algodón maduras de estas plantas y se pueden colorear con tintes aniónicos tales como rojo Congo o se pueden hacer reaccionar con Alexa fluor 555 acoplado a aglutinina de germen de trigo (WGA). WGA se une específicamente a N-acetilglucosamina en células de planta y por lo tanto se puede usar como un reactivo de detección para N-acetilglucosamina. Además, las fibras de algodón maduras resultantes se pueden colorear con tintes comerciales incluyendo tintes reactivos para algodón (p. ej. Reactive Red 120, Levafix Blue CA), tintes ácidos (Acid Orange 7, Acid Blue 281) y tintes reactivos para lana (p. ej. Reactive Red 116, Realan Amber EHF).
Claims (7)
1. Una célula de planta de algodón que comprende un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente:
a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
b) una región de ADN que codifica un polipéptido de GFAT en donde dicha GFAT es codificada por una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1,
ii) o una variante de la misma, en la que uno o más nucleótidos difieren de la secuencia nucleotídica según SEQ ID 1. con la condición de que dicha variante no difiera en más de 20 nucleótidos de SEQ ID 1,
que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) según SEQ ID 2
iii) o una secuencia complementaria de i) o ii), y
c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación, en donde dicha célula de planta de algodón comprende adicionalmente un segundo gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente:
a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
b) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa y
c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.
2. Una célula de planta de algodón según la reivindicación 1, en la que dicha quitina sintasa es una N-acetilglucosamina transferasa del tipo Nod C.
3. Una célula de planta de algodón según la reivindicación 2, en la que dicho polipéptido de quitina sintasa comprende una señal de localización en el aparato de Golgi.
4. Una planta de algodón que consiste esencialmente en células de planta según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Fibras obtenibles de una planta de algodón según la reivindicación 4.
6. Un hilo o una tela hechos de fibras según la reivindicación 5.
7. Un método para producir fibras de algodón con polisacáridos cargados positivamente, tales como oligo-N-acetilglucosaminas u oligoglucosaminas, que comprende las etapas de
1) expresar en una célula de planta de algodón un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN ligadas operativamente:
a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
b) una región de ADN que codifica un polipéptido de GFAT en donde dicha GFAT está codificada por una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia nucleotídica según SEQ ID 1,
ii) o una variante de la misma, en donde uno o más nucleótidos difieren de la secuencia nucleotídica según SEQ ID 1, con la condición de que dicha variante no difiera en más de 20 nucleótidos de SEQ ID 1,
que codifica una glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa (GFAT) según SEQ ID 2
iii) o una secuencia complementaria de i) o ii), y
c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación, y comprende expresar un segundo gen quimérico que comprende
a) un promotor expresable en plantas tal como un promotor preferente en fibras,
b) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa y
c) opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación 2) regenerar una planta de algodón a partir de células de plantas de algodón de la etapa i) y
3) opcionalmente aislar fibras de dicha planta de algodón.
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