ES2708783T3 - Proceso para la purificación de saponinas - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificación de al menos una saponina en una solución que comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos una saponina en un primer disolvente que comprende un componente solubilizante; (b) reemplazar al menos una porción del componente solubilizante con un disolvente de intercambio por uno o más de: diafiltración, ultrafiltración o diálisis, produciendo así un disolvente reemplazado; (c) eliminar el disolvente reemplazado por liofilización, para producir un producto de saponina seco que comprende al menos una saponina; en el que el primer disolvente comprende al menos una saponina parcialmente purificada seleccionada del grupo QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21; y el primer disolvente comprende al menos 22 % en volumen/volumen de acetonitrilo; y el solvente reemplazado no comprende más del 21 % en volumen/volumen de acetonitrilo.
Description
DESCRIPCION
Proceso para la purificacion de saponinas
Campo de la invencion
La presente divulgacion se relaciona con la purificacion de productos biologicos. Mas espedficamente, la presente divulgacion se refiere a la purificacion de saponinas utiles como adyuvantes.
Antecedentes de la invencion
Saponinas, esteroides o glucosidos triterpenoides que se encuentran ampliamente en el reino vegetal, tienen una amplia gama de usos medicinales y comerciales. Se ha mostrado que las saponinas de algunas especies de plantas son utiles como adyuvantes que pueden usarse para mejorar las respuestas inmunes a antfgenos espedficos. Algunos tipos de adyuvantes de saponina de plantas no solo mejoran las respuestas inmunes a los antigenos, sino que tambien pueden inducir preferentemente tipos espedficos de respuestas inmunes mediadas por celulas.
Los procedimientos actuales para la purificacion de saponinas farmacologicamente utiles no son optimos en terminos de uniformidad, reconstituibilidad u homogeneidad del producto. Ademas, los procedimientos actuales de purificacion de saponinas pueden demorar hasta 14 dfas.
En vista de la utilidad potencial de las composiciones inmunogenicas que contienen saponinas, existe la necesidad de procedimientos de purificacion de saponinas mas eficientes.
El documento US5057540 divulga un procedimiento para el aislamiento de la saponina QS-21 de Quillaja.
El documento US6231859 divulga un procedimiento para purificar saponinas.
Sumario de la invencion
La presente divulgacion se relaciona con un procedimiento para purificar al menos una saponina en una solucion que comprende las etapas de:
a. proporcionar al menos una saponina en un primer disolvente que comprende un componente solubilizante; b. reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio por uno o mas de: diafiltracion, ultrafiltracion o dialisis, produciendo asf un disolvente reemplazado;
c. eliminar el disolvente reemplazado mediante liofilizacion, para producir un producto de saponina seco que comprende al menos una saponina;
en el que el primer disolvente comprende al menos una saponina parcialmente purificada seleccionada del grupo QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21; y
el primer disolvente comprende al menos 22 % en volumen/volumen de acetonitrilo; y
el disolvente reemplazado no comprende mas del 21 % en volumen/volumen de acetonitrilo.
Descripcion detallada de la invencion
Introduccion
La presente divulgacion se refiere a procedimientos para producir saponinas purificadas, tales como QS-21. El procedimiento divulgado aqu reduce a uno el numero de ciclos de liofilizacion necesarios, por una etapa de intercambio de disolventes y la exposicion posterior opcional del producto de saponina purificado a al menos una exposicion a gas seco, seguido de la exposicion a un vado para eliminar aun mas el producto de saponina purificada de moleculas de disolvente residual.
Las saponinas purificadas se usan con fines medicinales, industriales y en productos de alimentos y bebidas. Algunas saponinas, tales como las que se extraen de la corteza del arbol sudamericano Quillaja saponaria Molina (saponinas de Quillaja), por ejemplo, QS-21, tienen un valor farmacologico como adyuvantes inmunologicos porque exhiben baja toxicidad al tiempo que inducen respuestas inmunes fuertes de tipo Th1 y Th2 cuando se coadministran con un antfgeno. Ademas, se ha demostrado que tales saponinas provocan respuestas moderadas de linfocitos T citotoxicos a algunas protemas.
Para que se usen de manera segura, las saponinas deben separarse de otros materiales derivados de la planta, incluyendo, en el caso de las saponinas de Quillaja, otras saponinas mas toxicas. Aunque existen procedimientos para purificar saponinas, los procedimientos de purificacion actuales pueden demorar hasta 14 dfas. Las saponinas producidas por los procedimientos actuales pueden ser no homogeneas.
La purificacion de saponina por los procedimientos divulgados proporciona varios beneficios significativos sobre los procedimientos actuales. Espedficamente, el procedimiento divulgado aqm ofrece el beneficio de que puede reducir el tiempo requerido para los procedimientos de purificacion de saponina a gran escala en casi la mitad del tiempo requerido para los procedimientos actuales. Los procedimientos actuales pueden tardar hasta 14 dfas, mientras que el tiempo total de purificacion con el presente procedimiento puede ser de solo 6 dfas. Ademas, las saponinas purificadas por el procedimiento aqm descrito no retienen mas disolvente o agua que los productos de saponinas purificados obtenidos usando los procedimientos actuales, que tfpicamente involucran multiples etapas de liofilizacion que pueden durar el doble de tiempo. El agua en el producto final contribuye a la degradacion del producto en composiciones de saponina purificada. Ademas, los componentes de disolventes, como las moleculas organicas, generalmente deben reducirse significativamente de los productos de saponina secos para su uso farmacologico seguro.
El procedimiento divulgado aqm es mas beneficioso que los procedimientos actuales porque, al obviar la necesidad de una segunda liofilizacion, produce un producto de saponina seco mas homogeneo que los procedimientos actuales que requieren dos etapas de liofilizacion.
Por lo tanto, un aspecto de la presente divulgacion se relaciona con un procedimiento para producir composiciones de saponina altamente purificadas. El procedimiento divulgado aqm da como resultado la produccion de un producto de saponina purificada altamente homogeneo con poca o ningun agua residual o moleculas de disolvente. La divulgacion aqm proporciona un procedimiento para purificar al menos una saponina en una solucion proporcionando al menos una saponina en un primer disolvente que incluye un componente solubilizante; reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio por uno o mas de: diafiltracion, ultrafiltracion o dialisis, produciendo asf un disolvente reemplazado; eliminar el disolvente reemplazado por liofilizacion, para producir un producto de saponina seco que incluye al menos una saponina; en el que el primer disolvente comprende al menos una saponina parcialmente purificada seleccionada del grupo QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21; y el primer disolvente comprende al menos 22 % en volumen/volumen de acetonitrilo; y el disolvente reemplazado no comprende mas del 21 % en volumen/volumen de acetonitrilo. Una etapa opcional adicional comprende poner en contacto el producto de saponina seco con un gas seco de modo que cualquier molecula de disolvente que quede en el producto de saponina seca se disperse en el gas, produciendo asf un producto de saponina seca depurado con gas. En el contexto de la purificacion de saponinas, la purificacion incluye proporcionar una solucion que comprende al menos una saponina y reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio. Opcionalmente, antes de la purificacion de la solucion, las saponinas se pueden aislar de otros componentes de la solucion (e.g., material vegetal, tejido de un organismo, sustancias qmmicas y moleculas no deseadas, asf como otros residuos) mediante diversos procedimientos qmmicos o cromatograficos.
Opcionalmente, la saponina en un primer disolvente se puede purificar parcialmente mediante cromatograffa en columna. Por ejemplo, la saponina en un primer disolvente puede proporcionarse en forma de columna de HPLC o eluido de columna de cromatograffa de fenilo. Por ejemplo, la saponina en un primer disolvente se puede proporcionar en forma de eluido de columna de HPLC C8. Tfpicamente, el eluato de columna de HPLC C8 utilizado para la purificacion de saponina incluye al menos 22 % de acetonitrilo vol/vol. Por lo tanto, la saponina en un disolvente puede incluir al menos el 22 %. Por ejemplo, la saponina en un primer disolvente puede incluir al menos aproximadamente 50 % de acetonitrilo. Ademas, la saponina en un primer disolvente puede incluir entre aproximadamente 30 % y 65 % en volumen/volumen de acetonitrilo. Por ejemplo, entre aproximadamente 40 % y un 62 % en volumen/volumen de acetonitrilo es un intervalo adecuado. Por ejemplo, la saponina en un disolvente puede incluir aproximadamente entre aproximadamente 58 % y un 62 % en volumen/volumen de acetonitrilo. El termino aproximadamente se incluye en las concentraciones de acetonitrilo indicadas anteriormente para indicar que el valor dado es aproximado y puede variar en mas o menos 5 %.
Despues de obtener una solucion de saponinas en un disolvente, se puede realizar un reemplazo del disolvente. El reemplazo de al menos una parte del componente solubilizante se puede hacer intercambiando un volumen identico o no identico del primer disolvente con un disolvente de intercambio. El reemplazo del disolvente se logra mediante cualquiera de diafiltracion, ultrafiltracion o dialisis. Tfpicamente, el disolvente reemplazado contendra al menos 15 % vol/vol de acetonitrilo pero no mas de 21 % vol/vol de acetonitrilo.
Opcionalmente, la sustitucion de al menos una porcion del componente solubilizante se puede realizar en un sistema que incluye un recipiente de contencion semipermeable que es selectivamente permeable de modo que al menos un componente de disolvente pase a traves de la parte permeable del recipiente y al menos una saponina se retendra cuando al menos una saponina y un primer disolvente se introduzcan en el recipiente de contencion semipermeable. Por ejemplo, el recipiente de contencion semipermeable usado puede incluir una sola membrana semipermeable y el reemplazo del disolvente se puede lograr sumergiendo el recipiente de contencion semipermeable que comprende al menos una saponina y un primer disolvente en un disolvente de intercambio y permitiendo que los disolventes separados por la membrana alcancen el equilibrio por difusion.
Alternativamente, el recipiente de contencion semipermeable puede incluir un canal permeable a la solucion que incluye la al menos una saponina en un disolvente que esta rodeado por al menos una estructura semipermeable. En esta realizacion, la al menos una saponina y un primer disolvente se pueden mover a traves del canal del
recipiente de contencion a una presion positiva en relacion con el exterior del recipiente por medio de presion hidrostatica de manera que al menos un componente de la solucion es forzado hacia el exterior a traves de la porcion semipermeable del recipiente de contencion (e.g., cualquier porcion de la estructura semipermeable que no este en contacto con el canal) y al menos una molecula de la solucion recorre toda la longitud del canal. En esta realizacion, al menos una porcion del componente solubilizante puede reemplazarse con un disolvente de intercambio agregando el disolvente de intercambio al interior (e.g., el canal) del recipiente de contencion.
En otra realizacion, el recipiente de contencion semipermeable puede incluir un recipiente no permeable que incluye un primer compartimento y un segundo compartimento separados por una membrana semipermeable. En esta realizacion, la al menos una saponina y un primer disolvente se pueden colocar en el primer compartimento del recipiente de contencion, que luego se puede hacer una presion positiva en relacion con el segundo compartimento, de manera que al menos un componente de la solucion se pueda forzar a lo largo de la porcion semipermeable del recipiente de contencion y al menos una porcion del componente solubilizante puede reemplazarse con un disolvente de intercambio mediante la adicion del disolvente de intercambio al primer compartimento del recipiente. Despues del reemplazo del disolvente, el disolvente reemplazado se puede eliminar del producto de saponina para producir un producto de saponina seco. La eliminacion del disolvente reemplazado se realiza por liofilizacion. Se proporciona un procedimiento de liofilizacion de ejemplo en la seccion de Ejemplos. Sin embargo, la liofilizacion puede realizarse esencialmente por cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Opcionalmente, la liofilizacion se puede realizar en bandejas LYOGUARD™ desechables de la marca Gore. Opcionalmente, se puede realizar mas de una etapa de eliminacion, e.g., si se desea un secado adicional de la muestra.
Opcionalmente, despues de la eliminacion del disolvente, se puede eliminar aun mas del producto de saponina seco, cualquier molecula de disolvente restante poniendo en contacto el producto de saponina secada con un gas seco para producir un producto de saponina seca limpiada con gas. Opcionalmente, el producto de saponina seco puede ponerse en contacto con un gas seco de vado. En algunas realizaciones, el contacto del producto de saponina seco con un gas seco se realiza a una presion superior a 700 pbar. Por ejemplo, el producto de saponina seco puede ponerse en contacto con gas seco a 800 pbar de presion. Opcionalmente, el producto de saponina seco puede mantenerse en contacto con el gas seco durante al menos 1 minuto. Por ejemplo, el producto de saponina seco puede mantenerse en contacto con el gas seco durante 5 minutos o mas.
Opcionalmente, despues de poner en contacto el producto de saponina seco con un gas seco, se elimina el gas seco. Por ejemplo, tal eliminacion puede efectuarse por presion de vado. En algunas realizaciones, el gas seco se elimina mediante una presion de vado de menos de 100 pbar. Por ejemplo, el gas seco se puede eliminar con una presion de vado de 50 pbar. Opcionalmente, la presion de vado se puede aplicar durante mas de 1 minuto. Por ejemplo, la presion de vado se puede aplicar durante 30 minutos.
Opcionalmente, despues de la eliminacion del gas seco por presion de vado, se puede repetir una o mas de las etapas anteriores de poner en contacto el producto de saponina seco con un gas seco. Opcionalmente, la presion del vado puede elevarse a la presion atmosferica. En algunas realizaciones, el producto de saponina seco se mantiene en contacto con el gas seco durante al menos 1 minuto. Por ejemplo, el producto de saponina seco puede mantenerse en contacto con el gas seco durante 5 minutos o mas.
Si se desea, despues de la exposicion repetida al gas seco, la eliminacion de la presion de vado se puede repetir cualquier numero de veces. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el producto de saponina seco con un gas seco seguido de la etapa de eliminacion a presion de vado del gas seco se repite siete veces.
Opcionalmente, el contacto del producto de saponina seco con un gas seco seguido de la eliminacion de la presion de vado del gas seco puede ser superior a 2 °C. Por ejemplo, la puesta en contacto del producto de saponina seco con un gas seco seguido de la eliminacion a presion de vado del gas seco se puede realizar a mas de 34 °C.
En algunas realizaciones, un gas inerte, en particular nitrogeno, se usa como un gas seco. Sin embargo, se puede usar cualquier gas libre de agua, no reactivo (o debilmente reactivo).
El procedimiento aqrn divulgado es para producir productos de saponina purificada que contienen, al menos una saponina de Quillaja parcialmente purificada seleccionada del grupo QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21. Tfpicamente, las purificaciones incluyen al menos QS-21. Opcionalmente, sin embargo, las purificaciones podnan incluir mas de un tipo de saponina de Quillaja. Igualmente, las purificaciones podnan incluir Quil-A. De manera similar, la composicion tambien podna incluir una pluralidad de diferentes saponinas seleccionadas de diferentes clasificaciones (familias) de organismos.
La presente divulgacion tambien se relaciona con la QS-21 altamente purificada producida de acuerdo con los procedimientos divulgados aqrn.
La divulgacion se relaciona ademas con el uso del producto de saponina QS-21 altamente purificado producido por el procedimiento divulgado en una composicion inmunogenica. Tfpicamente, la composicion inmunogenica incluye un epftopo antigenico capaz de producir una reaccion inmunogenica a un antfgeno, e.g., de un patogeno y saponinas QS-21 altamente purificadas producidas por el procedimiento divulgado. Opcionalmente, la composicion
inmunogenica puede incluir ademas una o mas saponinas de Quillaja adicionales seleccionadas del grupo QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21. De manera similar, la composicion inmunogenica puede incluir ademas una o mas saponinas diferentes, seleccionadas de diferentes clasificaciones (familias) de organismos. Opcionalmente, la composicion inmunogenica tambien incluye un segundo adyuvante. El adyuvante puede ser, por ejemplo, liposomas. De manera similar, el adyuvante puede ser 3D-monofosforil lfpido A (3D-MPL). Opcionalmente, la composicion inmunogenica podna incluir tanto liposomas como 3D-MPL.
La abreviatura 3D-MPL representa el lfpido A monofosforilo 3-O-desacilado (tambien conocido como lfpido A monofosforilo 3-de-O-acilado, lfpido A 3-O-desacil-4'-monofosforilo, lfpido A 3D-monofosforilo y 3D-MLA), un derivado no toxico del lipopolisacarido que se sabe causa la induccion preferencial de las respuestas inmunes de las celulas T tipo 1. Garcon et al., EP822831B2 y Moore, Vaccine. 1999; 17:2517-27. 3D-MpL esta compuesto por moleculas de Kpido A 4-monofosforilo en las que la posicion 3 de la glucosamina terminal reductora se ha desacilado selectivamente. 3D-MPL se describe en el documento GB 2 220 211 (Ribi) como una mezcla de principalmente 3 tipos de lfpido A 3-de-O-acilado-4'-monofosforilo con 4, 5 o 6 cadenas de acilo y esta fabricado por Corixa dba GlaxoSmithKline. Una forma de 3D-MPL se divulga en el documento WO 92/116556.
Los liposomas son vesfculas preparadas artificialmente hechas de bicapa lipfdica. QS-21 es capaz de causar necrosis en el lugar de la inyeccion, pero esto puede evitarse mediante el uso de formulaciones que contengan una combinacion de QS-21 y un esterol. Los posibles esteroles para uso incluyen p-sitoesterol, estigmaesterol, ergoesterol, ergocalciferol y colesterol y las composiciones de la invencion son las que forman una estructura de liposoma. En general, tales liposomas estan compuestos por lfpidos neutros, por ejemplo, fosfatidilcolina, que es preferiblemente no cristalina a temperatura ambiente, por ejemplo, fosfatidilcolina de yema de huevo, dioleoilfosfatidilcolina o dilaurilfosfatidilcolina. Los liposomas tambien pueden contener un lfpido cargado, ya que esto aumentara la estabilidad de la estructura liposoma-saponina para liposomas compuestos de lfpidos saturados. Las formulaciones sugeridas de saponinas con lfpidos se describen en el documento WO 1996/033739(A1).
Terminos
A menos que se explique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aqrn tienen el mismo significado que entiende comunmente una persona con experiencia ordinaria en la tecnica a la que pertenece la presente divulgacion. Los terminos singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El termino "pluralidad" se refiere a dos o mas. Ademas, las limitaciones numericas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, como las concentraciones de los componentes del disolvente y las condiciones de reaccion, como las temperaturas, las presiones y los tiempos de ciclo, son aproximadas. Por lo tanto, donde se indica que una concentracion es al menos (por ejemplo) 22 % en volumen/volumen de acetonitrilo, se pretende que la concentracion se entienda que es al menos aproximadamente (o "alrededor de" o "~") 22 % en volumen/volumen acetonitrilo. Del mismo modo, el termino "aproximadamente" cuando se usa en referencia a un porcentaje establecido se usa para indicar que el valor dado es aproximado y puede variar en mas o menos 5 %.
Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqrn se pueden usar en la practica o prueba de la presente divulgacion, a continuacion, se describen los procedimientos y materiales adecuados. El termino "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entendera que la palabra "comprende" y las variaciones tales como "comprender" y "que comprende" implican la inclusion de un compuesto o composicion (e.g., saponina, disolvente, componente organico) o etapa, o grupo de compuestos o etapas determinadas, pero no con exclusion de cualquier otro compuesto, composicion, etapas o grupo estos. La abreviatura, "e.g." se deriva del latm exempli gratia, y se usa en este documento para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura " e.g." es sinonimo del termino "por ejemplo".
Para facilitar la revision de las diversas realizaciones de la presente divulgacion, se proporcionan las siguientes explicaciones de los terminos. Se pueden proporcionar terminos y explicaciones adicionales en el contexto de la presente divulgacion.
El verbo "purificar" (e.g., con respecto a una saponina en una solucion) significa separar una saponina en una solucion de algunos otros componentes no deseados en la solucion (e.g., componentes solubilizantes). Purificar es un termino relativo y no requiere que todas las trazas de los otros componentes no deseados se eliminen de la composicion. Por ejemplo, una saponina en una solucion se considera purificada por el procedimiento aqrn divulgado cuando al menos el 90 % de los componentes solubilizantes de la solucion se han separado de la saponina.
El termino "al menos una saponina en un primer disolvente" se refiere a una mezcla que se dispersa a nivel molecular o micelar de una o mas sustancias (e.g., una o varias saponinas), en una o mas otras sustancias (e.g., disolvente) que puede (pero no necesita necesariamente) estar compuesto principal o exclusivamente por componentes de fase lfquida. El termino "disolvente" se refiere a una sustancia, lfquida o miscible, mezcla parcialmente miscible o inmiscible de dos o mas lfquidos, capaces de dispersar completa o parcialmente otra
sustancia, e.g., una saponina, en solucion. Un "componente solubilizante" es un componente cuyas moleculas actuan para dispersar otras sustancias, como las saponinas en solucion.
El termino "molecula" se refiere a los atomos de un solo elemento qmmico, o de agrupaciones de dos o mas atomos de este o diferentes elementos qmmicos, conectados por enlaces covalentes. Una "molecula organica" se refiere a una molecula compuesta de al menos un atomo de carbono. Un "alcohol" es cualquier molecula organica en la que un grupo funcional hidroxilo (oxfgeno e hidrogeno, -OH) esta enlazado a un atomo de carbono. Esta estructura generalmente esta conectada covalentemente a otros atomos de carbono o hidrogeno. El termino acido significa cualquier producto qmmico que sea un donante de protones (es decir, produce iones de hidronio (H3O+) cuando se disuelve en agua). Una "base" es cualquier compuesto que sea un receptor de protones (es decir, produce iones de hidroxido (OH-) cuando se disuelve en agua). El termino acetonitrilo se refiere al compuesto que tiene la formula estructural CH3CN. La medida "volumen/volumen" (abreviado como % vol/vol) se usa para referirse al volumen de un lfquido en mL por 100 mL de la solucion resultante.
El verbo "reemplazar" (con respecto a reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio) significa sustituir al menos una molecula de un componente solubilizante de un primer disolvente con una o mas moleculas diferentes. No todas las moleculas del primer disolvente necesitan sustituirse por moleculas diferentes para que el disolvente se considere reemplazado. Por ejemplo, el reemplazo de mas del 40 % de un disolvente es suficiente para constituir un reemplazo. Por ejemplo, el reemplazo de aproximadamente el 75 % de un disolvente es suficiente para constituir un reemplazo.
El termino "componente solubilizante" significa cualquier molecula en una solucion.
El verbo "eliminar" (con respecto a un disolvente) significa disiparse convirtiendose en vapor. No todas las moleculas de un disolvente deben estar ausentes para que el disolvente se considere eliminado. Por ejemplo, se considera que el disolvente se ha eliminado de las saponinas purificadas por el procedimiento divulgado aqrn cuando al menos el 90 % de los componentes del disolvente se han separado de la saponina. Por ejemplo, la separacion de mas del 93 % de los componentes del disolvente es suficiente para constituir la eliminacion. Por ejemplo, el reemplazo de aproximadamente el 95 % de los componentes del disolvente es suficiente para constituir la eliminacion. Por lo tanto, el verbo "permanecer" (con respecto a las moleculas de disolvente en productos de saponina secas) se refiere espedficamente a las moleculas de disolvente (e.g., agua y/u otras moleculas de componentes solubilizantes) que persisten en un producto de saponina seca a pesar de los procedimientos de eliminacion que se han realizado en el producto de saponina para secarlo o, de lo contrario, deshacerse del disolvente. De hecho, debido a que no es infrecuente que algunas partfculas de disolvente a menudo persistan en un producto de saponina seco a pesar de los procedimientos de eliminacion que se han realizado para deshacerse de una porcion sustancial de disolvente, para que se considere "seco", un producto de saponina no necesita necesariamente estar completamente libre de moleculas de disolvente.
El termino "producto de saponina seco depurado con gas" se refiere a un producto de saponina que contiene tfpicamente menos de 50 ppm de acetonitrilo, menos de 5 % de agua en peso y menos de 0,40 % del principal subproducto de saponina degradado. Estas saponinas son el resultado del proceso de poner en contacto un producto de saponina seco con un gas seco para permitir que las moleculas de disolvente que permanecieron enlazadas dentro del producto de saponina despues de la eliminacion se dispersen en el gas seco. Como se usa aqrn, el termino "gas seco" significa cualquier gas que este sustancial o totalmente libre de moleculas de agua. Un gas seco puede estar compuesto por un solo tipo de moleculas de gas o un material compuesto de dos o mas tipos diferentes de moleculas de gas. El verbo "dispersar" (en relacion con las moleculas de disolvente) significa difundir, alejar, dispersar o propagar. No todas las moleculas de disolvente que permanecen dentro del producto de saponina despues de la eliminacion del disolvente deben desenlazarse para que se produzca la dispersion, como se define aqrn. Por ejemplo, la difusion mayor que el 10 % de las moleculas de disolvente remanente fuera del producto de saponina seco y en el gas seco es suficiente para constituir la difusion como se define aqrn. Por ejemplo, la difusion de aproximadamente el 15 % de las moleculas de disolvente remanentes fuera del producto de saponina seco en el gas seco es suficiente para constituir la difusion.
El termino "recipiente de contencion semipermeable" se refiere a cualquier estructura capaz de recibir algun volumen de una saponina en una solucion, una parte de la cual es permeable a los componentes del disolvente pero impermeable a uno o mas solutos (tal como las saponinas) de tal manera que al menos una saponina sera retenida por el recipiente de contencion, y al menos una partfcula de disolvente puede salir de la porcion del recipiente que actua para retener la saponina. Los terminos "contenedor" y "recipiente de contencion" representan estructuras capaces de contener un volumen de un lfquido. El termino "no permeable" como se aplica a una membrana o recipiente, se refiere a un material que bloquea sustancialmente el paso de todos los componentes de la solucion (como las saponinas y el disolvente) a traves de su superficie. El termino "totalmente permeable" se refiere a una porcion de una membrana o sustancia, que es permeable tanto a los componentes del disolvente como a uno o mas componentes del soluto (como las saponinas). Un "canal" es una via totalmente permeable a traves de la cual pueden viajar tanto los componentes del disolvente como los componentes del soluto. El verbo "retenido" (en lo que respecta a las saponinas que no pasan a traves de las porciones permeables de los recipientes de contencion) significa no viajar a traves de la membrana semipermeable y abandonar el recipiente de contencion.
El termino "membrana semipermeable" se refiere a una membrana o sustancia, permeable a los componentes del disolvente pero impermeable a uno o mas solutos (como las saponinas). El termino "barrera semipermeable" igualmente se refiere a una membrana o sustancia, permeable a los componentes del disolvente pero impermeable a uno o mas solutos (como las saponinas). Una membrana o barrera semipermeable puede facilitar la difusion pasiva de partmulas de disolvente dentro o fuera de un primer disolvente si se coloca entre disolventes de diferentes composiciones permitiendo que los componentes del disolvente se muevan hacia abajo de sus gradientes de concentracion al cruzar la membrana. Las partmulas de disolvente tambien pueden forzarse a traves de membranas o barreras semipermeables, mientras que los parciales de soluto se retienen selectivamente dentro de la membrana o barrera mediante aplicaciones de presion mayor que la presion del ambiente que rodea la membrana o barrera semipermeable a soluciones restringidas por la membrana o aplicaciones de presion de vado a porciones de la membrana o barrera semipermeable opuestas a soluciones restringidas por la membrana o barrera.
El verbo "sumergido" (en relacion con sumergir un recipiente de contencion semipermeable que contiene al menos una saponina en el primer disolvente en el disolvente de intercambio) significa que al menos una porcion del recipiente de contencion semipermeable esta simultaneamente en contacto tanto con un primer disolvente como uno de intercambio. No se requiere que todo el recipiente de contencion semipermeable entre en contacto con uno o ambos disolventes para que haya ocurrido la inmersion. Tampoco es necesario que toda la porcion semipermeable del recipiente de contencion este completamente en contacto con uno o ambos disolventes para que el recipiente se considere "sumergido".
El verbo "separado" (en referencia a los compartimentos del contenedor no permeable separados por una membrana semipermeable) significa que la membrana semipermeable actua como una barrera de intervencion que define un primer y segundo compartimentos del contenedor no permeable. La membrana semipermeable no necesita estar compuesta completamente de material semipermeable para que se considere "que separa" el primer y segundo compartimentos. Por ejemplo, alguna porcion de la membrana puede ser no permeable. Ademas, los compartimentos primero y segundo del contenedor no permeable pueden definirse individualmente unicamente por su separacion de otras partes del contenedor por la membrana semipermeable.
El termino "equilibrio" (e.g., en relacion con un primer disolvente y un disolvente de intercambio separados por una membrana semipermeable que permite alcanzar el equilibrio por difusion) se refiere a cuando las concentraciones de todas las partmulas de disolvente capaces de cruzar la membrana semipermeable en dos disolventes separados por una membrana semipermeable se vuelven iguales en el primer disolvente y el disolvente de intercambio. Este equilibrio puede ocurrir de manera pasiva debido a que las partmulas de disolvente viajan hacia abajo en sus gradientes de concentracion. Sin embargo, tambien se puede emplear alguna forma de agitacion o presion para acelerar este proceso.
El termino "vado" significa una region que tiene una presion de gas reducida en comparacion con la presion atmosferica local. Como se usa aqrn, "vado" no significa un espacio totalmente desprovisto de materia. El termino "presion negativa" tambien se refiere a las areas que tienen una presion mas baja que la presion atmosferica local en areas circundantes.
Como se usa aqrn, el termino "presion atmosferica" significa la fuerza ejercida sobre la superficie de una unidad de area dada por el peso del aire sobre esa superficie. La presion atmosferica estandar es de aproximadamente 1.000 milibares. Sin embargo, las mediciones precisas de la presion atmosferica son espedficas de la ubicacion y la elevacion y variaran entre los diferentes lugares. Igualmente, la presion atmosferica en un lugar tambien variara con el tiempo.
La medida "partes por millon" (abreviada como "ppm") se usa aqrn para expresar la concentracion en volumen o en peso de un contaminante lfquido o solido, respectivamente, por millon de partes de producto de saponina seco. El termino "agua en peso", como se usa aqrn con respecto a los valores porcentuales, se refiere al porcentaje del peso de un producto de saponina seco que es atribuible a agua.
Una "composicion inmunogenica" es una composicion de materia adecuada para la administracion a un sujeto humano o animal que es capaz de provocar una respuesta inmune espedfica, e.g., contra un patogeno. Como tal, una composicion inmunogenica incluye uno o mas antfgenos o epttopos antigenicos. El termino "antfgeno" es bien conocido por las personas experimentadas. El antfgeno puede estar en el contexto de una protema aislada o fragmento peptfdico de una protema, o puede ser una preparacion parcialmente purificada derivada de un patogeno. Alternativamente, el antfgeno puede estar en el contexto de un patogeno vivo completo o inactivado. Un antfgeno puede ser una protema, polisacarido, peptido, acido nucleico, conjugados de protema-polisacarido, molecula o hapteno que es capaz de provocar una respuesta inmune en un humano o animal. Los antfgenos pueden ser derivados, homologos o sintetizados para imitar, moleculas de virus, bacterias, parasitos, protozoos u hongos. El antfgeno tambien puede ser derivado, homologo a o sintetizado para imitar moleculas de una celula tumoral o neoplasia. En una realizacion adicional de la invencion, el antfgeno se deriva, es homologo a, o se sintetiza para imitar moleculas de una sustancia implicada en alergia, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, obesidad y dependencia de la nicotina. Tfpicamente, cuando una composicion o vacuna inmunogenica incluye un patogeno vivo, el patogeno se atenua, es decir, es incapaz de causar enfermedad en un sujeto inmunologicamente competente. En otros casos, una composicion o vacuna inmunogenica incluye un patogeno completo inactivado (o
muerto). El patogeno inactivado puede ser un organismo patogeno de tipo salvaje que de otro modo (si no se inactiva) causana enfermedad en al menos una porcion de sujetos inmunologicamente competentes, o una cepa o aislado atenuado o mutante del patogeno.
Saponinas
Los procedimientos actuales de purificacion de QS-21 generalmente involucran dos ciclos consecutivos de liofilizacion para secar el producto y eliminar el acetonitrilo residual en un grado aceptable. Estos procedimientos actuales no son optimos porque, ademas de tomar 14 dfas para devolver un producto QS-21 purificado, el polvo seco QS-21 producido por estos procedimientos es de consistencia heterogenea. Despues de la primera liofilizacion, el producto de saponina previamente secado se resuspende en agua para la segunda etapa de liofilizacion. Esto resulta en la heterogeneidad del producto de saponina final porque el producto de saponina secado preliminarmente rara vez se puede disolver completamente. La homogeneidad del producto final es un indicador de la pureza del producto altamente uniforme.
El procedimiento divulgado aqm permite la produccion de QS-21 purificada en menos de la mitad de la cantidad de tiempo de los procedimientos actuales. Ademas, como se muestra en la Tabla 1 a continuacion, las saponinas purificadas por este procedimiento no retienen mas disolvente y agua que los productos de saponina purificados obtenidos utilizando los procedimientos actuales, que tfpicamente incluyen multiples etapas de liofilizacion que pueden tomar el doble de tiempo. Ademas, el producto de saponina seca, depurado con gas, producido por el procedimiento divulgado es mas homogeneo que los productos de saponina seca producidos por los procedimientos actuales.
Las saponinas son glucosidos con actividad de superficie, generalmente de origen vegetal y mas raramente, otros organismos como las estrellas de mar o los pepinos de mar. Las saponinas estan compuestas por una region hidrofila (generalmente compuesta por una o mas cadenas de azucar) en asociacion con una region hidrofoba (generalmente compuesta por una estructura esteroide o triterpenoide). Las saponinas frecuentemente poseen actividad hemolftica, actividad adyuvante inmune, la capacidad de formar complejos con colesterol y en algunos casos, actividad antibiotica. Las saponinas tambien se caracterizan por la capacidad de generar una espuma similar al jabon cuando se agitan en soluciones acuosas. Las saponinas son bien conocidas.
Tabla 1: acetonitrilo residual (en ppm) y agua residual (en % de humedad) en un producto de saponina QS-21 purificado producido por el procedimiento divulgado.
Numero de Numero de Recoleccion de muestra Humedad ACN QS-21 ejecucion muestra (%) (ppm) (%)
A Despues del ciclo de liofilizacion 1,5 19 98,27
Despues del pulso 1,3 5 98,22 1
B Despues del ciclo de liofilizacion 1,6 16 98,24
Despues del pulso 1,3 3 98,25
Despues del ciclo de liofilizacion 1,0 44 98,19
A Despues del pulso 1,5 23 98,13
Polvo dispensado al contenedor final 1,3 4 98,17 2
Despues del ciclo de liofilizacion 1,1 28 98,16
B Despues del pulso 1,5 13 98,19
Polvo dispensado al contenedor final 1,7 8 98,24
Las saponinas de glicosidos triterpenicos de ejemplo constituyen hasta el 10 % de la corteza del arbol de Sudamerica Quillaja saponaria Molina. La accion inmunoestimulante de estas saponinas se ha evaluado durante mas de 50 anos. Se estima que hay cerca de 50 saponinas unicas de Quillaja Saponaria (referidas aqu como "saponinas de Quillaja"). La mayona tienen la misma base de triterpeno, acido quillaico, y son 3,28 bisdesmonosidos acetilados (con oligosacaridos unidos a los carbonos 3 y 28 del acido quillaico). La diferencia entre las saponinas de Quillaja unicas se encuentra principalmente en el patron de glicosilacion o el patron de acetilacion. Hasta la fecha, veintidos saponinas de Quillaja han sido aisladas y ampliamente caracterizadas. Seis de estas, QS-7, QS-17, QS-19, QS-18 y q S - 2 1 muestran una actividad adyuvante significativa en ratones y otros mairnferos. Sin embargo, estas saponinas vanan ampliamente en su toxicidad, con QS-18 y QS-19 siendo mas toxicas en dosis mas bajas que otras saponinas de Quillaja y QS-21 mostrando baja toxicidad, pero fuerte actividad adyuvante. QS-7 tambien tiene propiedades de modulacion inmune y muy baja toxicidad, pero requiere dosis mas altas para la actividad adyuvante. Para una revision de las diferentes propiedades adyuvantes de las saponinas de Quillaja, vease Kensil CR, et al., Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex. J Immunol.
146(2):431-7 (1991).
Se ha mostrado que las saponinas de Quillaja inducen una respuesta inmune fuerte de tipo Th1 y Th2 frente a antigenos, asf como respuestas moderadas de linfocitos T citotoxicos (CTL) a algunas protemas. Kensil CR. Saponins as vaccine adjuvants. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 13:1-55 (1996). En consecuencia, las saponinas de Quillaja pueden usarse como adyuvantes en una amplia gama de composiciones inmunogenicas. Por ejemplo, las saponinas de Quillaja se pueden usar para inducir respuestas Th1 contra patogenos intracelulares y celulas malignas, asf como para suprimir las respuestas alergicas mediadas por IgE. Sin embargo, dado que el extracto de Quillaja no purificado se compone de una mezcla heterogenea de saponinas con diferencias significativas en su toxicidad, se requiere la separacion de saponinas de Quillaja no toxicas de las otras saponinas mas toxicas para su uso inmunologico seguro.
Los primeros intentos de purificar adyuvantes de saponina de Quillaja se describen por Dalsgaard, Archiv fuer die gesamte Virusforschung 44:243 (1974). La preparacion de Dalsgaard, el extracto acuoso de saponinas de Quillaja parcialmente purificadas por intercambio de aniones y la filtracion en gel ahora esta disponible comercialmente bajo el nombre de "Quil-A" y se ha utilizado en vacunas veterinarias desde principios de los anos setenta. Aunque parcialmente purificadas, las saponinas de Quil A son considerablemente heterogeneas, mostrando unos 20-25 picos de cromatograffa de fase inversa. Una formulacion mas reciente de Quil A llamada Iscoprep 703 se purifica aun mas para que conste solo de 10 picos de cromatograffa de fase inversa, excluyendo los componentes mas toxicos.
En una realizacion particular, el procedimiento divulgado aqrn se puede usar para la purificacion de la saponina QS-21 de Quillaja. QS-21 constituye una fraccion purificada por HpLC de la corteza de arbol de Quillaja Saponaria Molina y se divulga un procedimiento para su aislamiento en la patente de los Estados Unidos No. 5,057,540. La saponina QS-21 de Quillaja tiene una toxicidad particularmente baja, pero induce una fuerte respuesta inmune de tipo Th1 y Th2 frente a antfgenos, asf como respuestas CTL moderadas a algunas protemas.
Obtener una saponina en un primer disolvente
Tambien debe entenderse que es bien conocido para las personas experimentadas en la tecnica de la purificacion de saponinas, que otros procedimientos cromatograficos se pueden usar para purificar cualquier otra saponina de Quillaja saponaria Molina, asf como saponinas de otros organismos, y que estos procesos de purificacion pueden tambien modificarse para obtener mezclas de mas de un tipo de saponina en un disolvente (como en Cox et al.
6,352,697 y Kensil et al. '540).
Tfpicamente, es deseable, en la purificacion de saponinas de Quillaja, usar acetonitrilo y agua en el procedimiento de purificacion, sin embargo, se puede usar una multitud de otros disolventes para la extraccion de saponinas de Quillaja y saponinas de otras especies de plantas, de material vegetal. Por ejemplo, es bien conocido por las personas experimentadas en la tecnica de purificacion de saponinas, que se pueden usar una gran cantidad de disolventes organicos (e.g., acetonitrilo, metanol, cloroformo y alcoholes, solo para nombrar algunos), agua y muchos acidos y bases para la extraccion de saponinas de materiales vegetales, asf como composiciones de disolventes organicos con acidos y/o agua para la purificacion de saponinas. (vease Kensil et al. '540 uso de metanol y composiciones de metanol y acido acetico, Cox et al. '697 uso de una composicion de acetonitrilo y agua acfdica, Kensil et al WO 98/24319, uso de una mezcla de cloroformo, metanol, agua y acido acetico). Una concentracion de mas del 40 % de acetonitrilo es optima para la elucion de QS-21 de una columna de HPLC C8. El acetonitrilo es un disolvente conveniente para usar en el presente procedimiento. Sin embargo, se puede usar cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente capaces de llevar saponinas a solucion y/o separar saponinas de otro material vegetal. Igualmente, el porcentaje preciso de acetonitrilo utilizado en los ejemplos se observa unicamente porque es optimo para la extraccion de la columna C8. Una persona experimentada en la tecnica de purificacion de saponinas igualmente sabna que una variedad de concentraciones de acetonitrilo, o cualquier disolvente utilizado, puede variar dependiendo del sistema de purificacion empleado.
Reemplazo de disolventes
Una vez que se ha obtenido y purificado una saponina en un disolvente, en un grado apropiado para el uso previsto de la saponina, puede ser necesario, dependiendo de las propiedades de congelacion del disolvente, reemplazar el disolvente aquel de las saponinas con un disolvente diferente para obtener un producto de liofilizacion homogeneo. La solubilidad de una saponina en el disolvente cambia a medida que la temperatura disminuye, por lo tanto, la homogeneidad de un producto de liofilizacion a menudo requiere concentraciones de disolvente mas bajas que las que deben usarse para llevarlos a solucion o eluirlas fuera de las columnas cromatograficas. Ademas, algunos disolventes que son miscibles con agua a temperatura ambiente se separan en dominios ricos en agua y ricos en disolventes durante la congelacion. Por ejemplo, este efecto se observa con soluciones acuosas de acetonitrilo, por lo que es necesario reducir el nivel de acetonitrilo a menos del 20 % para obtener un producto homogeneo de saponina en la congelacion (vease Zarzycki PK et al, Analyt Sci 22, 453-456[2006]). Las eluciones de las columnas cromatograficas de fase inversa a menudo requieren concentraciones de acetonitrilo de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %. Por lo tanto, los procedimientos de purificacion en curso pueden dar como resultado una concentracion de disolvente superior a la favorable para obtener un producto de liofilizacion homogeneo.
Hay un numero de formas en que se puede realizar el reemplazo de disolvente sobre una saponina en un disolvente. Por ejemplo, se puede utilizar diafiltracion, como se detalla anteriormente. La ultrafiltracion seguida de la dilucion del regulador retenido tambien es un medio adecuado para el reemplazo del regulador. La dialisis es otro procedimiento posible que se puede usar para reemplazar un disolvente. Sin embargo, como la diafiltracion permite que se intercambien volumenes mucho mas altos de disolvente mucho mas rapido que la dialisis, la diafiltracion se puede usar para realizar el intercambio de disolvente en purificaciones a gran escala.
Un ejemplo de un procedimiento de reemplazo de disolvente para una saponina en solucion de disolvente organico tambien se describe en detalle en los ejemplos a continuacion. Cuando el procedimiento divulgado aqrn se realiza en muestras de saponina en soluciones de acetonitrilo y se pretende purificar aun mas la muestra por liofilizacion, la concentracion final de disolvente organico despues del reemplazo del disolvente es menor que el 21 % en volumen a volumen de acetonitrilo (vol/vol). En ciertas realizaciones, la solucion consistina en menos de 20 % vol/vol de acetonitrilo. En una realizacion, se obtiene una concentracion final de aproximadamente 18 % vol/vol de acetonitrilo porque se requiere una concentracion de acetonitrilo menor que el 20 % para obtener un producto homogeneo al congelar (Zarzycki PK et al.). Por lo tanto, un 18 % vol/vol de acetonitrilo es una concentracion conveniente para lograr mediante reemplazo de disolvente.
El procedimiento de reemplazo de disolvente descrito en los Ejemplos se incluye solo a modo de ejemplo, y las personas experimentadas en la tecnica de purificacion de saponinas conocen bien que hay varios procedimientos funcionalmente similares o equivalentes al procedimiento de diafiltracion detallado en los ejemplos. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, dialisis y ultrafiltracion seguidos de dilucion. La diafiltracion se ejemplifica aqrn porque permite la produccion a gran escala de saponinas en disolventes reemplazados y porque la concentracion de las especies retenidas se puede controlar facilmente durante el procedimiento de diafiltracion de flujo continuo, proporcionando un procedimiento de reemplazo de disolventes delicado y reproducible. Por lo tanto, la diafiltracion es un procedimiento de reemplazo de disolvente conveniente para usar para lograr el reemplazo de disolvente. Sin embargo, como se indico, se pueden usar ultrafiltracion/dilucion y dialisis.
Eliminacion de disolventes
Despues del reemplazo del disolvente, el disolvente se puede eliminar del producto de saponina generando un producto de saponina seco. La eliminacion del disolvente de las saponinas despues de los procedimientos cromatograficos se logra mediante liofilizacion. La liofilizacion se lleva a cabo en una mezcla de disolvente/soluto al vacfo, lo que resulta en la sublimacion del disolvente y deja atras el soluto o solutos secos. Cualquier presion inferior a 100 microbar es probable que sea adecuada. Tfpicamente, un vacfo de al menos aproximadamente 500 mBar es suficiente para promover la sublimacion eficiente de un disolvente. Aunque la presion puede reducirse aun mas, hacerlo tiene poco efecto sobre la rata de secado, y bajo condiciones de muy baja presion, la eficiencia de la sublimacion disminuye.
Aunque la eliminacion del disolvente se podna realizar simplemente colocando una muestra lfquida en una camara de vacfo, debido a la formacion de espuma como se indico anteriormente, la perdida de producto y la disminucion de la homogeneidad del producto pueden resultar del uso de tal procedimiento. Para evitar la formacion de espuma, primero debe congelarse una saponina en un disolvente y luego se puede eliminar el disolvente por sublimacion al vacfo, un proceso llamado liofilizacion o secado por congelacion. En general, se utiliza una rata de enfriamiento relativamente lenta de entre 0,1 °C y 1,0 °C/minuto para promover el desarrollo de grandes cristales de hielo que propician la migracion de vapor.
Ademas, un procedimiento conveniente para la liofilizacion de soluciones de saponina es utilizar una bandeja desechable LYOGUARD™ de la marca Gore. Estas bandejas de liofilizacion de uso unico y autoclavables comprenden una bandeja qmmicamente inerte cubierta con una membrana semipermeable que permite que pase el vapor, pero no el lfquido y por lo tanto protege el producto de la contaminacion externa durante el uso. Las bandejas LYOGUARD™ son adecuadas para aplicaciones de secado por congelacion a gran escala de saponinas.
Un ejemplo de un procedimiento de liofilizacion que se puede realizar en una saponina en un disolvente reemplazado se describe en detalle en ejemplos a continuacion.
Por ejemplo, es bien conocido por las personas experimentadas en la tecnica de la purificacion de saponinas que la evaporacion por calor puede usarse para eliminar partfculas de disolvente de solutos no volatiles, como las saponinas, donde se aplica calor a una solucion, por encima del punto de ebullicion de los componentes del disolvente lfquido. Igualmente, la evaporacion del disolvente en forma de evaporacion rotatoria es bien conocida por las personas experimentadas en la tecnica de la purificacion de saponinas.
La evaporacion rotatoria implica la evaporacion del disolvente de los solutos, colocando las mezclas de soluto y disolvente en un recipiente que luego se gira sobre calor mientras simultaneamente se mantiene bajo vado a traves de un tubo que tambien actua como un condensador. El disolvente vaporizado sale del matraz a traves del tubo de conexion y se recolecta a medida que se vuelve a condensar en la seccion del condensador. Todas las partfculas de soluto no volatiles permanecen en el matraz. Aunque la evaporacion rotatoria se usa comunmente para recuperar solutos no volatiles eluidos despues de la separacion cromatografica, es probable que este procedimiento no sea optimo para purificaciones de saponina debido a la tendencia de las saponinas a producir espuma cuando se mezcla o experimenta cambios de temperatura y presion. Por lo tanto, la evaporacion rotativa puede conducir a la perdida de producto a traves de la lmea de vado/condensador. La exposicion controlada al calor tambien puede producir resultados suboptimos para la evaporacion de disolventes de las saponinas porque el calentamiento de la muestra puede resultar en una degradacion significativa del producto. Ademas, cualquier procedimiento que aumente la longitud de tiempo que tarda la purificacion de las saponinas aumenta la proporcion de subproductos de saponinas degradados que pueden acumularse en la muestra.
Depuracion con gas
Opcionalmente, luego de la eliminacion del disolvente de la saponina en el disolvente reemplazado, se pueden eliminar aun mas de las moleculas del disolvente, del producto de saponina seco, mediante la exposicion a un gas seco seguido de ciclos de vado que producen una saponina seca limpiada con gas (aqrn, despues de este procedimiento se denomina "limpieza con gas"). Este procedimiento actua para desorber cualquier producto parcial de disolvente enlazado ligeramente del producto de saponina seco. Si bien la mayona de los procedimientos de eliminacion de disolventes, como la liofilizacion, la evaporacion rotatoria y la exposicion al calor, se pueden emplear para eliminar una porcion sustancial de partfculas de disolvente de soluciones que comprenden saponinas en un disolvente, con frecuencia, algunas partfculas de disolvente persistiran o permaneceran pegadas dentro del producto final. Esto es particularmente probable que ocurra donde el componente solubilizante usado sea mas pesado que otros componentes disolventes, ya que estos se difundiran del producto de saponina seco mas lentamente que otros componentes disolventes mas livianos. Una limpieza de gas permite que estas partfculas atrapadas se dispersen lejos y fuera del producto de saponina seco.
Tfpicamente, aunque no necesariamente, el producto de saponina seco se transferira a una camara de vado limpia al inicio del ciclo de pulso. El producto de saponina seco se expone luego a un ciclo que consiste en cambiar las condiciones de la camara de vado a condiciones ricas en nitrogeno. Opcionalmente, un producto de saponina seca puede exponerse a mas de un ciclo de este tipo. Por ejemplo, se puede usar de uno a diez ciclos de este tipo. Opcionalmente, sin embargo, se pueden usar mas de diez ciclos de pulso. Aunque, tfpicamente, se realizan entre cuatro y ocho ciclos de este tipo. Por ejemplo, en una realizacion, se realizan siete ciclos de este tipo. Opcionalmente, este ciclo se puede realizar a una temperatura de anaquel superior a 20 grados centfgrados. Por ejemplo, se puede usar una temperatura de anaquel mayor a 30 grados centfgrados. En algunas realizaciones, este ciclo se realiza a 34 grados centfgrados.
Inicialmente, el producto de saponina seco en un vado limpio se expone a condiciones de vado, como una presion de aproximadamente 50 microbar. Aunque la presion puede reducirse aun mas, hacerlo tiene poco efecto sobre la eficacia de la limpieza del gas. Igualmente, cualquier presion inferior a 100 microbar es adecuada. Una vez que se alcanza el punto de ajuste de presion deseado, el vado debe mantenerse durante al menos 20 minutos. Tfpicamente, la presion de vado se mantendra durante aproximadamente 30 minutos. Luego de la aplicacion de la presion de vado, la presion de vado en la camara se libera con un gas seco como nitrogeno en lugar de aire ambiental. Esto evita cualquier absorcion adicional en la muestra, de agua del aire en forma de humedad. Ademas, un gas completamente seco tendra mas espacio libre en el que puede ocurrir la desorcion de partfculas de la muestra. Se debe ingresar gas seco en el sistema hasta que se alcance una presion de mas de 700 microbar. Tfpicamente se usa una presion de alrededor de 800 microbar. Sin embargo, cualquier presion por encima de la presion atmosferica es adecuada. Estas condiciones se mantienen durante unos 5 minutos. Esto representa un ciclo de pulso. Tfpicamente, siete de estos ciclos de pulso se realizan en un lote, seguido de la descarga del producto. Un procedimiento de ejemplo de ciclo de pulso tambien se describe y se detalla en los ejemplos a continuacion. Debe entenderse que el procedimiento descrito en los ejemplos se incluye solo a modo de ejemplo, y que cualquier gas libre de agua o cualquier combinacion de dos o mas gases libres de agua podna utilizarse en lugar de nitrogeno. Tambien debe entenderse que algunas variaciones en otros parametros del procedimiento senalados, como la temperatura, la presion, la duracion del gas y la exposicion a vado, podnan no obstante generar productos de saponina secados con gas de calidad identica o similar.
QS-21 purificado producido por los procedimientos divulgados
La presente divulgacion tambien se relaciona con QS-21 altamente purificada producida de acuerdo con los procedimientos divulgados aqrn. La saponina de Quillaja, QS-21 purificada por estos procedimientos es mas homogenea que la producida por otros procedimientos debido a la reduccion a uno del numero de liofilizaciones requeridas. Ademas, a pesar de que solo requiere una liofilizacion y la mitad del tiempo de los procedimientos actuales de purificacion de QS-21, el QS-21 purificado con los procedimientos actuales puede contener menos de 50 ppm de acetonitrilo y menos de 2 % de agua en peso. Por lo tanto, el procedimiento actual permite la produccion de un producto de QS-21 purificado que es mas homogeneo y comprende menos disolvente residual que el QS-21 purificado que se puede obtener a partir de procedimientos existentes en menos tiempo del que requieren los procedimientos existentes.
Adicionalmente, dado el gran valor farmacologico de QS-21 que se deriva de su baja toxicidad y capacidad para inducir fuertes respuestas inmunes Th1 y Th2 frente a antigenos, asf como respuestas moderadas de linfocitos T citotoxicos (CTL) a algunas protemas, la divulgacion actual tambien se relaciona con el uso de las saponinas QS-21 altamente purificadas obtenidas por los procedimientos divulgados como un adyuvante en composiciones inmunogenicas. Ademas, se puede evitar la posible necrosis que puede ser causada por QS-21 en el lugar de la inyeccion cuando se usa QS-21 como adyuvante, con el uso de formulaciones que contengan colesterol. La presente divulgacion se relaciona ademas con el uso de QS-21 purificada por los procedimientos divulgados en combinacion con colesterol, otros lfpidos y/o 3D-MPL.
Ejemplos
Purificacion de saponina QS-21 de material vegetal:
Una solucion de QS-21 purificada en un disolvente que comprende acetonitrilo se puede preparar a partir de un extracto acuoso de Quillaja saponaria usando procedimientos bien conocidos en la tecnica anterior (e.g., los documentos US6231858 o US6524584).
Intercambio de disolventes
Despues de la purificacion del material vegetal, se realizo un intercambio de disolvente. La solucion de QS-21 a una concentracion >20 g/L de QS-21 y en una mezcla de disolventes que consistfa en 60 % en volumen/volumen de acetonitrilo, agua al 40 %, se diafiltro usando una unidad de ultrafiltracion (presion transmembrana de aproximadamente 2,5 bar, temperatura ambiente) a traves de una membrana de lfmite de peso molecular de 1.000 Dalton, contra 4 volumenes de un disolvente que consiste en aproximadamente 18 % en volumen/volumen de acetonitrilo y agua al 82 %. (Aqrn se uso celulosa regenerada 1.000 Da, de Millipore Pellicon 2 P2PLA). Luego se recolecto el material retenido, se analizo el contenido de QS-21 mediante analisis de HPLC de fase inversa y se diluyo hasta una concentracion final de QS-21 de aproximadamente 18 gramos por litro agregando un disolvente que consiste en aproximadamente 18 % en volumen/volumen de acetonitrilo y agua al 82 %.
Eliminacion de disolventes
Despues del intercambio de disolvente, se realizo la eliminacion del disolvente. La solucion de QS-21 se liofilizo congelando el entrepano de liofilizacion a -56 °C, realizando un secado primario a una temperatura de entrepano de -45 °C y 570 pbar durante 15 horas, y un segundo segmento de secado primario a una temperatura de entrepano de -15 °C y 200 pbar durante 64 horas. A esto le siguio una etapa de secado secundario a una temperatura de 34 °C y 200 pbar durante 10 horas, un segmento de secado secundario posterior a una temperatura de 34 °C y 100 pbar durante 12 horas y un tercer segmento de secado secundario a una temperatura de entrepano de 34 °C y 50 pbar durante 12 horas.
Ciclo de pulso
Tras la evaporacion del disolvente se realizo el ciclo de pulso. El QS-21 liofilizado se transfirio a una camara de vacfo limpia, y se realizo un ciclo que consiste en cambiar las condiciones de la camara de vacfo (30 min, 50 pbar) a condiciones ricas en nitrogeno (5 min, 800 mbar) 7 veces a una temperatura de entrepano de 34 °C para desorber cualquier acetonitrilo suelto fuera del QS-21 liofilizado.
Siguiendo las tecnicas descritas anteriormente en los ejemplos de acuerdo con los procedimientos divulgados, se produjo un producto de saponina seca limpiada con gas.
La Tabla 1, arriba, representa el contenido de agua residual y acetonitrilo en un producto de saponina producido por los procedimientos divulgados (Numero de Ejecucion 1, Muestra A y B). La cantidad de acetonitrilo residual en la muestra se determino por HPLC. La cantidad de agua residual en la muestra se determino mediante la determinacion de Karl Fisher. Ambas muestras examinadas conteman menos de 50 ppm de acetonitrilo y menos de 2 % de contenido de agua residual.
Claims (21)
1. Un procedimiento de purificacion de al menos una saponina en una solucion que comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos una saponina en un primer disolvente que comprende un componente solubilizante; (b) reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio por uno o mas de: diafiltracion, ultrafiltracion o dialisis, produciendo as ûn disolvente reemplazado;
(c) eliminar el disolvente reemplazado por liofilizacion, para producir un producto de saponina seco que comprende al menos una saponina;
en el que el primer disolvente comprende al menos una saponina parcialmente purificada seleccionada del grupo QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21; y
el primer disolvente comprende al menos 22 % en volumen/volumen de acetonitrilo; y
el solvente reemplazado no comprende mas del 21 % en volumen/volumen de acetonitrilo.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el disolvente que comprende un componente solubilizante de la etapa (a) dispersa total o parcialmente la al menos una saponina en el disolvente.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer disolvente comprende entre 30 % y 65 % en volumen/volumen de acetonitrilo, entre 40 % y 62 % en volumen/volumen de acetonitrilo o entre 58 % y 62 % en volumen/volumen de acetonitrilo.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende reemplazar la al menos una porcion del componente solubilizante intercambiando un volumen identico o no identico del primer disolvente con un disolvente de intercambio.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el disolvente reemplazado comprende entre 15 % y 21 % en volumen/volumen de acetonitrilo.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende reemplazar la al menos una porcion del componente solubilizante en un sistema que comprende un recipiente de contencion semipermeable.
7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que el recipiente de contencion semipermeable es selectivamente permeable de modo que cuando el al menos un componente de disolvente pasa a traves de la porcion permeable del recipiente y se retendra al menos una saponina.
8. El procedimiento de la reivindicacion 6 o 7, en el que el recipiente de contencion semipermeable comprende una unica membrana semipermeable.
9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que la sustitucion de la al menos una porcion del componente solubilizante se logra sumergiendo el recipiente de contencion semipermeable que comprende la al menos una saponina y un primer disolvente en un disolvente de intercambio y permitiendo que los disolventes se separen por la membrana para alcanzar el equilibrio por difusion.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que el recipiente de contencion semipermeable comprende un canal que esta rodeado por una estructura semipermeable.
11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que el canal es completamente permeable a la solucion que incluye al menos una saponina en un disolvente.
12. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que el canal constituye el interior del recipiente de contencion, y cualquier porcion de la estructura semipermeable que no esta en contacto con el canal constituye el exterior del recipiente de contencion.
13. El procedimiento de la reivindicacion 12, que comprende mover la al menos una saponina y un primer disolvente a traves del canal del recipiente de contencion a una presion positiva en relacion con el exterior del recipiente, de manera que al menos un componente de la solucion es forzado a traves de la porcion semipermeable del recipiente de contencion.
14. El procedimiento de la reivindicacion 13, que comprende reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio agregando el disolvente de intercambio al interior del recipiente de contencion.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6-14, en el que el recipiente de contencion semipermeable comprende un contenedor no permeable que comprende un primer compartimento y un segundo compartimento separados por una membrana semipermeable.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, que comprende colocar la al menos una saponina y un primer disolvente en el primer compartimento del recipiente de contencion.
17. El procedimiento de la reivindicacion 16, que comprende hacer que el primer compartimento del recipiente de contencion sea una presion positiva con respecto al segundo compartimento, de manera que al menos un componente de la solucion se fuerce a traves de la porcion semipermeable del recipiente de contencion.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, que comprende reemplazar al menos una porcion del componente solubilizante con un disolvente de intercambio al agregar un disolvente de intercambio al primer compartimento del recipiente.
19. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la liofilizacion se realiza en bandejas desechables LYOGUARD™ de la marca Gore.
20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende repetir la etapa de eliminacion al menos una vez.
21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer disolvente comprende al menos QS-21 parcialmente purificado.
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