ES2710048T3 - Anticuerpos antagonistas del receptor ActRII - Google Patents

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ES2710048T3 ES15196071T ES15196071T ES2710048T3 ES 2710048 T3 ES2710048 T3 ES 2710048T3 ES 15196071 T ES15196071 T ES 15196071T ES 15196071 T ES15196071 T ES 15196071T ES 2710048 T3 ES2710048 T3 ES 2710048T3
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Abstract

Anticuerpo antagonista que se une específicamente a un polipéptido ActRIIB para utilizar en el tratamiento o prevención de atrofia muscular, sarcopenia, caquexia, síndrome de desgaste muscular, esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular, enfermedad neurodegenerativa, trastorno musculodegenerativo y neuromuscular.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos antagonistas del receptor ActRII
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de Serie 60/590.765, presentada el 23 de julio de 2004.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0002] La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) contiene una diversidad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Se sabe que estas protelnas ejercen efectos biologicos en una gran diversidad de tipos celulares tanto en vertebrados como en invertebrados. Los miembros de la superfamilia realizan importantes funciones durante el desarrollo embrionario en la formacion de patrones y especificacion de tejido, y pueden influenciar una diversidad de procesos de diferenciacion, incluyendo adipogenesis, miogenesis, condrogenesis, cardiogenesis, hematopoyesis, neurogenesis, y diferenciacion celular epitelial. La familia se divide en dos ramas generales: las ramificaciones BMP/GDF y TGF-beta/Activina/BMP10, cuyos miembros tienen efectos diversos, aunque complementarios. Mediante la manipulacion de la actividad de un miembro de la familia TGF-beta, con frecuencia es posible originar cambios fisiologicos importantes en un organismo. Por ejemplo, las crlas de ganado Piedmontese y Belgian Blue llevan una mutacion de perdida de funcion en el gen GDF8 (tambien denominada miostatina) que origina un marcado aumento en la masa muscular. Grobet y col., Nat Genet. 1997, 17(1): 71-4. Ademas, en los seres humanos, los alelos inactivos de GDF8 estan asociados con un aumento de la masa muscular, y al parecer, una fuerza excepcional. Schuelke y col., N Engl J Med 2004, 350: 2682-8.
[0003] Los cambios en musculo, hueso, cartllago y otros tejidos pueden lograrse mediante una senalizacion de agonizacion o antagonizacion que esta mediada por un miembro de la familia TGF-beta adecuado. Por lo tanto, existe la necesidad de agentes que funcionen como reguladores potentes de senalizacion de TGF-beta.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
[0004] La presente invention es como se describe en las reivindicaciones adjuntas.
[0005] En ciertos aspectos, la presente description proporciona polipeptidos ActRII. Dichos polipeptidos ActRII pueden usarse para el tratamiento de una diversidad de trastornos o afecciones, en particular, trastornos musculares y neuromusculares (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y atrofia muscular), crecimiento no deseado de hueso/cartllago, trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), trastornos metabolicos (por ejemplo, diabetes tipo 2), trastornos neurodegenerativos. En casos especlficos, los polipeptidos ActRII (por ejemplo, polipeptidos ActRII solubles) pueden antagonizar generalmente un receptor ActRII (por ejemplo ActRIIA o ActRIIB) en cualquier proceso asociado con la actividad de ActRII. Opcionalmente, los polipeptidos ActRII de la descripcion pueden estar disenados para antagonizar preferiblemente uno o mas ligandos de los receptores ActRII, tal como g DF8 (tambien denominado miostatina), GDF11, activina, Nodal y BMP7 (tambien denominado OP-1), o, por lo tanto, pueden ser utiles en el tratamiento de trastornos adicionales. Los ejemplos de polipeptidos ActRII incluyen los polipeptidos ActRII de origen natural, as! como variantes funcionales de los mismos.
[0006] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona preparaciones farmaceuticas que comprenden un polipeptido ActRII soluble (por ejemplo ActRIIA o ActRIIB) que se une a un ligando ActRII, tal como GDF8, GDF11, activina, BMP7 o nodal, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Opcionalmente, el polipeptido ActRII soluble se une a un ligando ActRII con un Kd menor de 10 micromolar o menor de 1 micromolar, 100, 10 o 1 nanomolar. Opcionalmente, el polipeptido ActRII soluble inhibe la senalizacion ActRII, tal como los eventos de transduction de senal intracelular desencadenados por un ligando ActRII. Un polipeptido ActRII soluble para su uso en una preparation de este tipo puede ser cualquiera de los descritos en este documento, tales como un polipeptido que tiene una secuencia aminoacldica seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12, o que tiene una secuencia aminoacldica que es al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% identica a una secuencia aminoacldica seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12. Un polipeptido ActRIIBA soluble puede incluir un fragmento funcional de un polipeptido ActRII natural, tal como uno que comprende 10, 20 o 30 aminoacidos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1-4 y 9-12, o una secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2, que carece de 10 a 15 aminoacidos C-terminal (la "cola"). Un polipeptido ActRII soluble puede incluir una o mas alteraciones en la secuencia aminoacldica (por ejemplo en el dominio de union a ligando) con respecto a un polipeptido ActRII de origen natural. La alteracion en la secuencia aminoacldica, por ejemplo, puede alterar la glucosilacion del polipeptido cuando se produce en un mamlfero, insecto u otra celula eucariotica, o alterar la escision proteolltica del polipeptido con respecto al polipeptido ActRII de origen natural. Un polipeptido ActRII soluble puede ser una protelna de fusion que tiene, como un dominio, un polipeptido ActRII (por ejemplo, un dominio de union a ligando de un ActRII) y uno o mas dominios adicionales que proporcionan una propiedad deseada, tal como farmacocineticas mejoradas, purificacion mas facil, direccion a tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un dominio de una protelna de fusion puede mejorar uno o mas de la estabilidad in vivo, semivida in vivo, captacion/administracion, localizacion o distribucion en tejido, formation de complejos de protelna, multimerizacion de protelna de fusion y/o purificacion. Una protelna de fusion ActRII soluble puede incluir un dominio de inmunoglobulina Fc (de tipo natural o mutante) o una albumina serica. En un caso preferido, una fusion ActRU-Fc comprende un enlazador relativamente no estructurado entre el dominio Fc y el dominio ActRII extracelular. Este enlazador no estructurado puede corresponder rigurosamente a una region no estructurada de 15 aminoacidos en el extremo C-terminal del dominio extracelular de ActRIIA o ActRIIB (la "cola"), o puede ser una secuencia artificial de entre 5 y 15, 20, 30, 50 o mas aminoacidos que estan relativamente libres de una estructura secundaria. Un enlazador puede tener alto contenido de residuos de glicina y prolina y, por ejemplo, puede contener secuencias de repetition de treonina/serina y glicinas (por ejemplo repeticiones TG4 o SG4). Una protelna de fusion puede incluir una subsecuencia de purificacion, tal como una etiqueta de epltopo, una etiqueta de FLAG, una secuencia de polihistidina, y una fusion GST. Opcionalmente, un polipeptido ActRII soluble incluye uno o mas residuos aminoacldicos modificados seleccionados entre: un aminoacido glucosilado, un aminoacido PEGilado, un aminoacido farnesilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado, un aminoacido conjugado a una portion lipldica, y un aminoacido conjugado a un agente de derivacion organico. Una preparacion farmaceutica tambien puede incluir uno o mas compuestos adicionales, tales como un compuesto que se usa para tratar un trastorno asociado con ActRII. Preferiblemente, una preparation farmaceutica esta substancialmente libre de pirogenos. En general, se prefiere que una protelna ActRII se exprese en una llnea celular de mamlfero que medie una glucosilacion natural adecuada de la protelna ActRII, para disminuir la probabilidad de una respuesta inmune no favorable en el paciente. Las llneas celulares humanas y CHO se han usado de forma exitosa, y se espera que sean utiles otros vectores de expresion de mamlferos comunes.
[0007] En ciertos aspectos, la description proporciona productos farmaceuticos envasados que comprenden una preparacion farmaceutica descrita en este documento y etiquetados para su uso en promover el crecimiento de un tejido o disminuir o prevenir la perdida de un tejido en un mamlfero. Los tejidos ejemplares incluyen hueso, cartllago, musculo, grasa y neuronas.
[0008] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona polipeptidos ActRII solubles que comprenden un dominio de union a ligando alterado (por ejemplo, union a GDF8) de un ActRII. Dichos dominios de union a ligando alterados de un receptor ActRII comprenden una o mas mutaciones en residuos aminoacldicos, tales como E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 y F101 de ActRIIB humano. Dichos dominios de union a ligando alterados de un receptor ActRII comprenden una o mas mutaciones en residuos aminoacldicos, tales como E38, E40, R41, K56, R57, Y61, K65, K75, W79, L80, D81,183 y F102 de ActRIIA humano. Opcionalmente, el dominio de union a ligando alterado puede tener una selectividad aumentada para un ligando tal como GDF8/GDF11 relativo al dominio de union a ligando de tipo natural de un receptor ActRII. Como ilustracion, estas mutaciones se demuestran en este documento para aumentar la selectividad del dominio de union a ligando alterado para GDF11 (y por lo tanto, presumiblemente, GDF8) con respecto a activina (presentado con respecto a ActRIIB): K74Y, K74F, K74I y D80I. Las siguientes mutaciones tienen el efecto inverso, aumentando la proporcion de union a activina con respecto a GDF11: D54A, K55A, L79A y F82A. La actividad de union general (GDF11 y activina) puede aumentarse mediante la inclusion de la region de la "cola" o, presumiblemente, una region enlazadora no estructurada, y tambien a traves del uso de una mutation, tal como A64R (de origen natural) o K74A. Otras mutaciones que originaron una disminucion general en la afinidad de union a ligando, incluyen: R40a , E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M y D80N. Las mutaciones pueden combinarse para lograr los efectos deseados. Por ejemplo, muchas de las mutaciones que afectan a la proportion de union a GDF11:Activina tienen un efecto negativo general en la union al ligando y, por lo tanto, estas se pueden combinar con mutaciones que generalmente aumentan la union al ligando para producir una protelna de union mejorada con selectividad de ligando.
[0009] Opcionalmente, el dominio de union a ligando alterado tiene una proporcion de Kd para la union de activina a Kd para la union de GDF8 que es de al menos 2, 5, 10, o incluso 100 veces mayor con respecto a la proporcion del dominio de union a ligando de tipo natural. Opcionalmente, el dominio de union a ligando alterado tiene una proporcion de IC50 para inhibir la activina con respecto a IC50 para inhibir GDF8/GDF11 que es al menos el 2, 5, 10, o incluso 100 veces mayor con respecto al dominio de union a ligando de tipo natural. Opcionalmente, el dominio de union a ligando alterado inhibe GDF8/GDF11 con un IC50 al menos 2, 5, 10, o incluso 100 veces mayor que el IC50 para inhibir activina. Estos polipeptidos ActRII solubles pueden ser protelnas de fusion que incluyen un dominio Fc de inmunoglobulina (ya sea tipo natural o mutante). En ciertos casos, los polipeptidos ActRII solubles en cuestion son antagonistas (inhibidores) de GDF8/GDF11.
[0010] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona acidos nucleicos que codifican un polipeptido ActRII soluble, que no codifica en polipeptido ActRII completo. Un polinucleotido aislado puede comprende una secuencia de codificacion para un polipeptido ActRII soluble, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, un acido nucleico aislado puede incluir una secuencia que codifica un dominio extracelular (por ejemplo, dominio de union a ligando) de un ActRII y una secuencia que puede codificar parte o todo el dominio de transmembrana y/o el dominio citoplasmico de un ActRII, pero codificar un codon de detencion colocado dentro del dominio de transmembrana o el dominio citoplasmico, o colocado entre el dominio extracelular y el dominio de transmembrana o dominio citoplasmico. Por ejemplo, un polinucleotido aislado puede comprender una secuencia polinucleotldica ActRIIB de longitud completa, tal como SEQ ID NO: 7 u 8, o una version parcialmente truncada, comprendiendo adicionalmente dicho polinucleotido aislado un codon de terminacion de la transcripcion al menos seiscientos nucleotidos antes del extremo 3' o por el contrario colocado de tal forma que la traduccion del polinucleotido de lugar a un dominio extracelular opcionalmente condensado a una parte truncada de un ActRIIB de longitud completa. Los acidos nucleicos descritos en este documento pueden enlazarse de forma operativa a un promotor para su expresion, y la descripcion proporciona celulas transformadas con dichos polinucleotidos recombinantes. Preferentemente, la celula es una celula de mamlfero, tal como una celula CHO.
[0011] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona procedimientos para elaborar un polipeptido ActRII soluble. Un procedimiento de este tipo puede incluir expresar cualquiera de los acidos nucleicos (por ejemplo SEQ ID NO: 5 o 6) descritos en este documento en una celula adecuada, tal como una celula de ovario de hamster chino (CHO). Un procedimiento de este tipo puede comprender; a) cultivar una celula en las condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido ActRII soluble, donde dicha celula se transforma con una construccion de expresion de ActRII soluble; y b) recuperar el polipeptido ActRII soluble ya expresado. Los polipeptidos ActRII solubles pueden recuperarse en forma de fracciones en bruto, parcialmente purificadas o altamente purificadas usando cualquiera de las tecnicas bien conocidas para obtener una protelna a partir de cultivos celulares.
[0012] En ciertos aspectos, un polipeptido ActRII descrito en este documento puede usarse en un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un trastorno asociado con perdida muscular o crecimiento muscular insuficiente. Dichos trastornos incluyen atrofia muscular, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y un trastorno de desgaste muscular (por ejemplo, caquexia, anorexia, slndrome DMD, slndrome BMD, slndrome de desgaste por SIDA, distrofias musculares, enfermedades neuromusculares, enfermedades de neurona motora, enfermedades de la union neuromuscular y miopatlas inflamatorias). Un procedimiento puede comprender administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
[0013] En ciertos aspectos, un polipeptido ActRII soluble descrito en este documento puede usarse en un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado con neurodegeneracion. Dichos trastornos incluyen enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrofica (ELA), enfermedad de Huntington (EH). Un procedimiento puede comprender administrar a un sujeto que necesite del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
[0014] En ciertos aspectos, un polipeptido ActRII soluble descrito en este documento puede usarse en un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado con un crecimiento y diferenciacion celular anormal. Dichos trastornos incluyen inflamacion, alergia, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y tumores. Un procedimiento puede comprender administrar a un sujeto que necesite del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble. Una protelna ActRII de union a activina selectiva puede ser particularmente util para el tratamiento de un cancer dependiente de activina, tal como un cancer de ovario.
[0015] En ciertos aspectos, el polipeptido ActRII soluble descrito en este documento puede usarse en un procedimiento para disminuir el contenido de grasa corporal o reducir la tasa de aumento de contenido de grasa corporal, y para tratar un trastorno asociado con ganancia de peso corporal no deseada, tal como obesidad, diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI), enfermedad cardiovascular, cancer, hipertension, osteoartritis, ictus, problemas respiratorios y enfermedad de la veslcula biliar. Estos procedimientos pueden comprender administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
[0016] En ciertos aspectos especlficos, un polipeptido ActRII soluble descrito en este documento puede usarse en un procedimiento para tratar un trastorno asociado con una actividad anormal de GDF8. Dichos trastornos incluyen trastornos metabolicos, tales como diabetes de tipo 2, tolerancia de glucosa alterada, slndrome metabolico (por ejemplo, slndrome X), y resistencia a insulina inducida por trauma (por ejemplo quemaduras o desequilibrio de nitrogeno); trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrofica (ELA); atrofia muscular; atrofia de organos; debilidad; slndrome del tunel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y otros slndromes de desgaste muscular, osteoporosis; osteoporosis inducida por glucocorticoides; osteopenia; osteoartritis; fracturas relacionadas con osteoporosis, masa osea de bajo nivel debido a terapia glucocorticoide cronica, fallo gonadal prematuro, supresion de androgenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa. El procedimiento puede comprender administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
[0017] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona un procedimiento para identificar un agente que estimula el crecimiento de un tejido, tal como hueso, cartllago, musculo, grasa y neuronas. El procedimiento comprende: a) identificar un agente de prueba que se una a un dominio de union a un ligando de un polipeptido ActRII de forma competitiva con un polipeptido ActRII soluble; y b) evaluar el efecto del agente en el crecimiento del tejido.
[0018] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona procedimientos para antagonizar la actividad de un polipeptido ActRII o un ligando ActRII (por ejemplo, GDF8, GDF11, activina, BMP7 y Nodal) en una celula. Los procedimientos comprenden poner en contacto la celula con un polipeptido ActRII soluble. Opcionalmente, la actividad del polipeptido ActRII o el ligando ActRIIB se supervisa mediante una transduccion de senalizacion mediada por el complejo de ActRII/ligando ActRII, por ejemplo, supervisando la proliferacion celular. Las celulas de los procedimientos incluyen un osteoblasto, un condrocito, un miocito, un adipocito, una celula muscular y una celula neuronal.
[0019] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona usos de un polipeptido ActRII soluble para elaborar un medicamento para el tratamiento de un trastorno o afeccion como se describe en este documento.
Breve Descripcion de los Dibujos
[0020]
La figura 1 muestra una secuencia de polipeptido soluble ActRIIA humano (extracelular) (SEQ ID NO: 1). La "cola" C-terminal esta subrayada.
La figura 2 muestra una secuencia de polipeptido soluble ActRIIB humano (extracelular) (SEQ ID NO: 2). La "cola" C-terminal esta subrayada.
La figura 3 muestra una secuencia de protelna precursora ActRIIA humana (SEQ ID NO: 3). El peptido senal esta subrayado; el dominio extracelular esta en letras negrita (tambien denominado como SEQ ID NO: 1); y los sitios de glucosilacion enlazados a N potenciales estan en un cuadro.
La figura 4 muestra una secuencia de protelna precursora ActRIIB humana (SEQ ID NO: 4). El peptido senal esta subrayado; el dominio extracelular esta en letras negrita (tambien denominado como SEQ ID NO: 2); y los sitios de glucosilacion enlazados a N potenciales estan en un cuadro.
La figura 5 muestra una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido soluble ActRIIA humano (extracelular), designado como SEQ ID NO: 5.
La figura 6 muestra una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido soluble ActRIIB humano (extracelular), designado como SEQ ID NO: 6.
La figura 7 muestra una secuencia de acido nucleico que codifica una protelna precursora ActRIIA humana, designada como SEQ ID NO: 7.
La figura 8 muestra una secuencia de acido nucleico que codifica una protelna precursora ActRIIB humana, designada como SEQ ID NO: 8.
La figura 9 muestra la expresion de los dominios extracelulares (solubles) de ActRIIA o ActRIIB. Las construcciones que expresan dominios extracelulares humanos de ActRIIA o ActRIIB se hicieron con cada una de las tres secuencias senal.
La figura 10 muestra tres polipeptidos ActRIIB solubles con diversas secuencias senal, SEQ ID NOs: 9-11.
La figura 11 muestra un polipeptido ActRIIA soluble con su secuencia senal original, SEQ ID NO: 12.
La figura 12 muestra el diseno de las fusiones Fc de los polipeptidos ActRIIA o ActRIIB. Se muestran la secuencia enlazadora flexible y la secuencia Fc (SEQ ID NO: 13). Pueden hacerse mutaciones en uno mas de los residuos aminoacldicos de la secuencia Fc. Los ejemplos de dichos residuos para las mutaciones estan subrayados, y se denominan Asp-265, lisina-322 y Asn-434.
La figura 13 muestra el bolsillo de union al ligando de un polipeptido ActRIIB. Los ejemplos de residuos aminoacldicos en el bolsillo de union a ligando se muestran como E39, K55, Y60, K74, W78, D80 y F101. Los polipeptidos ActRIIB de la descripcion pueden comprender mutaciones en uno o mas de estos residuos aminoacldicos.
La figura 14 muestra una alineacion de los dominios extracelulares de ActRIIA y ActRIIB, demostrando en este documento que las posiciones de las mutaciones, en ActRIIB, afectan a la union al ligando. La alineacion muestra que la posicion de estas mutaciones se conserva en ActRIIA.
La figura 15 muestra una representacion esquematica para el Ensayo del Gen Informador A-204. La figura muestra el vector informador: pGL3 (CAGA)12 (descrito en Dennler y col, 1998, EMBO 17: 3091-3100). El motivo CAGA12 esta presente en los genes que responden a TGF-Beta (gen PAI-1), por lo que este vector es de uso general para factores de senalizacion a traves de Smad2 y 3.
La figura 16 muestra los efectos de diversas mutaciones en ActRIIB-Fc en un GDF-11 en un Ensayo del Gen Informador A-204. La construction A64 antecedente mostro un efecto mlnimo en la actividad de GDF-11. La mutation A64K (tambien una forma de origen natural) provoco un aumento sustancial en la inhibition de GDF-11, y una combination de la mutacion A64K con la adicion de los 15 aminoacidos C-terminal del dominio extracelular (la "cola" de 15 aminoacidos) produjo una inhibicion incluso mas potente de la actividad de GDF-11.
La figura 17 muestra los efectos de diversas mutaciones en ActRIIB-Fc sobre una Activina A, Ensayo del Gen Informador A-204. La construccion A64 antecedente mostro un efecto mlnimo sobre la actividad de la Activina A. La mutacion K74A provoco un aumento sustancial de la inhibicion de Activina A. Una muestra de control carente de Activina A no mostro ninguna actividad.
Descripcion Detallada de la Invencion
1. Revision general
[0021] En ciertos aspectos, la presente descripcion se refiere a polipeptidos ActRII. Como se usa en este documento, el termino "ActRII" se refiere a una familia de protelnas de tipo II del receptor de activina (ActRII) y protelnas relacionadas con ActRIIB, obtenidas de cualquier especie. La referencia a ActRII en este documento se entendera como una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente, incluyendo ActRIIA (tambien conocido como ActRII) y ActRIIB. Los miembros de la familia ActRII generalmente son todas las protelnas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de union a ligando con una region con alto contenido en cistelna, un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmico con especificidad de serina/treonina cinasa predicha. Las secuencias aminoacldicas de la protelna precursora ActRIIA humana y la protelna precursora ActRIIB se ilustran en la figura 3 (SEQ ID NO: 3) y en la figura 4 (SEQ ID NO: 4), respectivamente.
[0022] La expresion "polipeptido ActRII" se usa para referirse a polipeptidos que comprenden cualquier polipeptido de origen natural de un miembro de la familia ActRII, as! como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomimeticas) que retienen una actividad util. Por ejemplo, los polipeptidos ActRII incluyen polipeptidos obtenidos de la secuencia de cualquier ActRII conocido que tenga una secuencia al menos aproximadamente el 80% identica a la secuencia de un polipeptido ActRII, y preferiblemente al menos de aproximadamente el 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o mayor de identidad.
[0023] En un caso especlfico, la descripcion se refiere a polipeptidos ActRII solubles. Como se describe en este documento, la expresion "polipeptido ActRII soluble" se refiere generalmente a polipeptidos que comprenden un dominio extracelular de una protelna ActRII. La expresion "polipeptido ActRII soluble", como se usa en este documento, incluye cualquier dominio extracelular de origen natural de una protelna ActRII, as! como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos y formas peptidomimeticas) que retienen una actividad util. Por ejemplo, el dominio extracelular de una protelna ActRII se une a un ligando y es generalmente soluble. Los ejemplos de polipeptidos ActRII solubles incluyen los polipeptidos solubles ActRIIA y ActRIIB ilustrados en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) y la figura 2 (SEQ ID NO: 2), respectivamente. Otros ejemplos de polipeptidos ActRII solubles comprenden una secuencia senal ademas del dominio extracelular de una protelna ActRII, por ejemplo, las secuencias ilustradas en la figura 10 (SEQ ID NO: 9-11) y la figura 11 (SEQ ID NO: 12). La secuencia senal puede ser una secuencia senal nativa de un ActRII, o una secuencia senal de otra protelna, tal como una secuencia senal del activador tisular del plasminogeno (TPA) o una secuencia senal de melitina de miel de abeja (HBM).
[0024] Las senales TGF-p estan mediadas por complejos heteromericos de receptores de serina/treonina cinasa de tipo I y II, que fosforilan y activan corriente abajo las protelnas Smad tras la estimulacion con ligando (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 169-178). Estos receptores de tipo I y tipo II son todos protelnas transmembrana, compuestos por un dominio extracelular de union a ligando con una region con alto contenido en cistelna, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmico con una especificidad de serina/treonina predicha. Los receptores de tipo I son esenciales para la senalizacion; y los receptores de tipo II son necesarios para unir ligandos y para la expresion de receptores de tipo I. Los receptores de activina de tipo I y tipo II forman un complejo estable despues de la union al ligando, dando como resultado una fosforilacion de receptores de tipo I por receptores de tipo II.
[0025] Se han identificado dos receptores de tipo II relacionados, ActRIIA y ActRIIB, como los receptores de tipo II para activinas (Mathews y Vale, 1991, Cell 65: 973-982; Attisano y col., 1992, Cell 68: 97-108). Ademas de las activinas, ActRIIA y ActRIIB pueden interactuar bioqulmicamente con otras diversas protelna de la familia TGF-p, incluyendo BMP7, Nodal, g Df8 y GDF11 (Yamashita y col., 1995, J. Cell Biol. 130: 217-226; Lee y McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 9306-9311; Yeo y Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh y col., 2002, Genes Dev.
16: 2749-54).
[0026] En ciertos casos, la presente description se refiere a la antagonizacion de un ligando de los receptores ActRII (tambien denominados como un ligando ActRII) con un polipeptido ActRII en cuestion (por ejemplo, un polipeptido ActRII soluble). Por lo tanto, las composiciones y procedimientos de la presente descripcion son utiles para tratar trastornos asociados con una actividad anormal de uno o mas ligandos de los receptores ActRII. Los ligandos ejemplares de los receptores ActRII incluyen algunos miembros de la familia TGF-p, tales como activina, Nodal, GDF8, GDF11 y BMP7. Estos ligandos de receptores ActRII se describen en mas detalle a continuation.
[0027] Las activinas son factores de crecimiento de polipeptidos dimericos y pertenecen a la superfamilia TGF-beta. Existen tres activinas (A, B y AB) que son homo/heterodlmeros de dos subunidades B estrechamente relacionadas (PaPa, PbPb y PaPb). En la superfamilia TGF-beta, las activinas son factores unicos y multifuncionales que pueden estimular la production de hormonas en celulas de ovario y placenta, soportar la supervivencia celular neuronal, influenciar positiva o negativamente el progreso del tipo ciclo celular, dependiendo del tipo celular, e inducir la diferenciacion mesodermica al menos en embriones de anfibio (DePaolo y col., 1991, Proc SocEp Biol Med. 198: 500-512; Dyson y col., 1997, Curr Biol. 7: 81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55: 953-963). Ademas, se descubrio que el factor de diferenciacion eritroide (EDF) aislado de celulas leucemicas monoclticas humanas estimuladas era identico a la activina A (Murata y col., 1988, PNAS, 85: 2434). Esto sugiere que la activina A actua como un regulador natural de la eritropoyesis en medula osea. En varios tejidos, la senalizacion de activina se antagoniza a traves de su heterodlmero relacionado, la inhibina. Por ejemplo, durante la liberation de la hormona follculo estimulante (FSH) de la pituitaria, la activina promueve la secretion y slntesis de FSH, mientras que la inhibina evita la secrecion y la slntesis de FSH. Otras protelnas que pueden regular la bioactividad de activina y/o unirse a activina incluyen folistatina (FS), protelna relacionada con folistatina (FSRP), a2-macroglobulina, Cerberus y endoglina, que se describen a continuacion.
[0028] Las protelnas nodales tienen funciones en la induction y formation del mesodermo y el endodermo, as! como la organization posterior de estructuras axiales, tales como estomago y corazon en una embriogenesis temprana. Se ha demostrado que el tejido dorsal en el desarrollo de un embrion de vertebrado contribuye predominantemente a las estructuras axiales de la placa notocorda y precorda al mismo tiempo que recluta las celulas circundantes para formar estructuras embrionarias no axiales. Nodal aparece para senalar a traves de receptores tanto de tipo I como de tipo II y efectores intracelulares conocidos como protelnas Smad. Estudios recientes apoyan la idea de que ActRIIA y ActRIIB sirven como receptores de tipo II para Nodal (Sakuma y col., Genes Cells. 2002, 7: 401-12). Se sugiere que los ligandos Nodal interactuan con sus cofactores (por ejemplo, cripto) para activar los receptores de tipo y tipo II de activina, que fosforilan Smad2. Las protelnas Nodal estan implicadas en muchos eventos importantes para el embrion vertebrado temprano, incluyendo la formacion del mesodermo, patron anterior y especificacion de eje izquierdo-derecho. La evidencia experimental ha demostrado que la senalizacion Nodal activa pAR-3-Lux, un informador de luciferasa mostrado previamente para responder especlficamente a activina y TGF-beta. Sin embargo, Nodal no tiene la capacidad de inducir pTIx2-Lux, un informador que responde especlficamente a las protelnas morfogeneticas de hueso. Los resultados recientes proporcionan una evidencia bioqulmica directa de que la senalizacion Nodal esta mediada por tanto la ruta activina-TGF-beta, Smads, Smad2 como Smad3. La evidencia adicional ha mostrado que la protelna cripto extracelular es necesaria para la senalizacion Nodal, haciendola distinta de la senalizacion de activina o TGF-beta.
[0029] El factor 8 de crecimiento y diferenciacion (GDF8) tambien se conoce como miostatina. GDF8 es un regulador negativo de la masa musculoesqueletica. GDF8 se expresa altamente en el desarrollo de musculo esqueletico adulto. La mutacion nula de GDF8 en ratones transgenicos esta caracterizada por una hipertrofia e hiperplasia marcada del musculo esqueletico (McPherron y col., Nature, 1997, 387: 83-90). Aumentos similares en masa musculoesqueletica son evidentes en mutaciones de origen natural de GDF8 en ganado (Ashmore y col., 1974, Growth, 38: 501-507; Swatland y Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38: 752-757; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 12457-12461; y Kambadur y col., Genome Res., 1997, 7: 910-915) y, sorprendentemente en seres humanos (Schuelke y col., N Engl J Med 2004; 350: 2682-8). Los estudios tambien han mostrado que el desgaste muscular asociado con infeccion por VIH en seres humanos esta acompanada por aumentos en la expresion de protelna GDF8 (Gonzalez-Cadavid y col., PNAS, 1998, 95: 14938-43). Ademas, Gd F8 puede modular la produccion de enzimas especlficas de musculo (por ejemplo creatina cinasa) y modular la proliferacion celular de mioblastos (documento WO 00/43781). El propeptido GDF8 puede unirse de forma no covalente al dlmero de dominio GDF8 maduro, inactivando su actividad biologica (Miyazono y col. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; y Brown y col. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Otras protelnas que se unen a GDF8 o protelnas estructuralmente relacionadas y que inhiben su actividad biologica incluyen folistatina y potencialmente protelnas relacionadas con folistatina (Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208: 222­ 232).
[0030] El factor 11 de crecimiento y diferenciacion (GDF11), tambien conocido como BMP11, es una protelna secretada (McPherron y col., 1999, Nat. Genet. 22: 260-264). Gd F11 se expresa en el brote de la cola, brote de la extremidad, arcos maxilares y mandibulares, y ganglios de ralz dorsal durante el desarrollo de ratones (Nakashima y col., 1999, Mech. Dev. 80: 185-189). GDF11 desempena una funcion unica en la generacion de patrones tanto de tejido mesodermicos como neurales (Gamer y col., 1999, Dev Biol., 208: 222-32). GDF11 mostro ser un regulador negativo de condrogenesis y miogenesis en el desarrollo de extremidades de pollos (Gamer y col., 2001, Dev Biol.
229: 407-20). La expresion de GDF11 en musculos tambien sugiere su funcion en la regulacion del crecimiento muscular de una forma similar a GDF8. Ademas, la expresion de GDF11 en el cerebro sugiere que GDF11 tambien puede poseer actividades que se relacionan con la funcion del sistema nervioso. De forma interesante, se descubrio que GDF11 inhibe la neurogenesis en el epitelio olfativo (Wu y col., 2003, Neuron. 37: 197-207). Por lo tanto, GDF11 puede tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades, tales como enfermedades musculares y enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo esclerosis lateral amiotrofica).
[0031] La protelna morfogenetica de hueso (BMP7), tambien llamada protelna-1 osteogenica (OP-1), se conoce bien para inducir la formacion de cartllago y hueso. Ademas, BMP7 regula una amplia formacion de procesos fisiologicos. Por ejemplo, BMP7 puede ser el factor osteoinductor responsable del fenomeno de la osteogenesis epitelial. Tambien se descubrio que BMP7 desempena una funcion importante en la regulacion de calcio y en la homeostasis de huesos. Al igual que la activina, BMP7 se une a receptores de tipo II, ActRIIA e IIB. Sin embargo, BMP7 y activina reclutan distintos receptores de tipo I en los complejos de receptor heteromerico. El receptor de tipo I BMP7 mayor observado fue ALK2, mientras que la activina se unio exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). BMP7 y activina provocaron distintas respuestas biologicas y activaron diferentes rutas Smad (Macias-Silva y col., 1998, J Biol Chem. 273: 25628-36).
[0032] En ciertos aspectos, la presente descripcion se refiere al uso de ciertos polipeptidos ActRII (por ejemplo polipeptidos ActRII solubles) para antagonizar receptores ActRII generalmente, en cualquier proceso asociado con la actividad de ActRII. Opcionalmente, los polipeptidos ActRII de la descripcipcion pueden antagonizar uno o mas ligandos de los receptores ActRIIB, tales como activina, Nodal, GDF8, g Df 11 y BMP7 y, por lo tanto, pueden ser utiles en el tratamiento de trastornos adicionales.
[0033] Por lo tanto, la presente descripcion contempla el uso de polipeptidos ActRII en el tratamiento o prevencion de enfermedades o afecciones que estan asociadas con una actividad anormal de un ActRII o un ligando ActRII.
ActRII y los ligandos ActRII estan implicados en la regulacion de muchos procesos biologicos importantes. Debido a sus funciones clave en estos procesos, pueden ser objetivos deseables para la intervencion terapeutica. Por ejemplo, pueden usarse polipeptidos ActRII (por ejemplo polipeptidos ActRII solubles) para tratar trastornos o afecciones humanas o animales. Los ejemplos de dichos trastornos o afecciones incluyen, pero sin limitacion, trastornos metabolicos, tales como diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, slndrome metabolico (por ejemplo, slndrome X) y resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrogeno); trastornos de tejido adiposo (por ejemplo obesidad); trastornos musculares y neuromusculares, tales como distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amitrofica (ELA); atrofia muscular; atrofia de organos; debilidad, slndrome de tunel carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva; y sarcopenia, caquexia y otros slndromes de desgaste muscular. Otros ejemplos incluyen osteoporosis, especialmente en mujeres de edad avanzada y/o posmenopausicas; osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteopenia, osteoartritis y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Aun ejemplos adicionales incluyen masa de hueso de bajo nivel debido a terapia glucocorticoide cronica, fallo gonadal prematuro, supresion de androgenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa. Estos trastornos y afecciones se describen a continuacion en la seccion "Usos Terapeuticos Ejemplares".
[0034] Los terminos utilizados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados habituales en la tecnica, dentro del contexto de esta invencion y en el contexto especlfico donde se usa cada termino. Ciertos terminos se analizan a continuacion o en cualquier parte de la memoria descriptiva, para proporcionar una gula adicional para el practicante en la descripcion de las composiciones y procedimientos de la description, y de como elaborarlas y usarlas. El alcance o significado de cualquier uso de un termino sera evidente a partir del contexto especlfico en que se usa el termino.
[0035] "Alrededor de" y "aproximadamente" significaran generalmente un grado de error aceptable para la cantidad de medida dada la naturaleza o precision de las medidas. Tlpicamente, los grados de error ejemplares estan dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y mas preferentemente dentro del 5% de un valor o intervalo de valores determinados.
[0036] Como alternativa, y particularmente en sistemas biologicos, las expresiones "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que estan dentro de un orden de magnitud, preferiblemente 5 veces, y mas preferentemente 2 veces de un valor determinado. Las cantidades numericas proporcionadas en este documento son aproximadas, a menos que se indique otra cosa, lo que significa que las expresiones "alrededor de" o "aproximadamente" pueden deducirse cuando no se manifieste de manera expresa.
[0037] Los procedimientos de la descripcion pueden incluir etapas para comparar secuencias entre si, incluyendo una secuencia tipo natural para uno o mas mutantes (variantes de secuencia). Dichas comparaciones normalmente comprenden alineaciones de secuencias polimericas, por ejemplo, usando programas de alineacion de secuencia y/o algoritmos que se conocen bien en la tecnica (por ejemplo BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar algunos). Los expertos en la tecnica pueden apreciar facilmente que en dichas alineaciones, donde una mutation contiene una insertion o elimination de residuo, la alineacion de secuencia introducira una "brecha" (normalmente representada por un punto, o "A") en la secuencia polimerica que no contiene el residuo insertado o eliminado.
[0038] El termino "homologo", en todas sus formas gramaticas y variaciones de deletreo, se refiere a la relation entre dos protelnas que poseen un "origen de evolution comun", incluyendo protelnas de superfamilias en la misma especie de organismos, as! como protelnas homologas de diferentes especies de organismo. Dichas protelnas (y sus acidos nucleicos codificantes) tienen una homologla de secuencia, como se refleja a traves de su similitud de secuencia, ya sea en terminos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos especlficos y posiciones conservadas.
[0039] La expresion "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos que pueden o no compartir un origen de evolucion comun.
[0040] Sin embargo, en uso comun y en la presente solicitud, el termino "homologo", cuando se modifica con adverbio, tal como "altamente", puede referirse a una similitud de secuencia y puede o no relacionarse con un origen de evolucion comun.
2. Polipeptidos ActRII
[0041] En ciertos aspectos, la descripcion se refiere a polipeptidos ActRII (por ejemplo, polipeptidos ActRII solubles). Preferiblemente, los fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas tienen actividades biologicas similares o iguales de sus polipeptidos ActRII de tipo natural correspondientes. Por ejemplo, un polipeptido ActRII de la descripcion puede unirse a e inhibir la funcion de un ActRII y/o una protelna de ligando ActRII (por ejemplo, activina, Nodal, GDF8, GDF11 o BMP7). Opcionalmente, un polipeptido ActRII modula el crecimiento de tejidos, tales como huesos, cartllago, musculo, grasa y/o neuronas. Los ejemplos de polipeptidos ActRII incluyen un polipeptido precursor ActRIIA humano (SEQ ID NO: 3), polipeptidos de precursor ActRIIB humanos (por ejemplo SEQ ID NO: 4), polipeptidos ActRIIA humanos solubles (por ejemplo, s Eq ID NOs: 1 y 12), polipeptidos ActRIIA humanos solubles (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y 9-11).
[0042] En ciertos casos, los fragmentos aislados de los polipeptidos ActRII pueden obtenerse clasificando polipeptidos producidos de forma recombinante a partir del fragmento correspondiente del acido nucleico que codifica el polipeptido ActRII (por ejemplo, uno de SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12). Ademas, los fragmentos pueden sintetizarse qulmicamente usando tecnicas conocidas en la tecnica, tales como qulmica f-Moc o t-Boc de fase solida Merrifield convencional. Los fragmentos pueden producirse (de forma recombinante o mediante slntesis qulmica) y probarse para identificar los fragmentos de peptidilo que pueden funcionar, por ejemplo, como antagonistas (inhibidores) o agonistas (activadores) de una protelna ActRII o un ligando ActRII.
[0043] En ciertos casos, una variante funcional de los polipeptidos ActRII tiene una secuencia aminoacldica que es al menos el 75% identica a una secuencia aminoacldica seleccionada entre SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12. En ciertos casos, la variante funcional tiene una secuencia aminoacldica al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o el 100% identica a una secuencia aminoacldica seleccionada entre SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12.
[0044] En ciertos casos, la presente descripcion contempla la elaboracion de variantes funcionales modificando la estructura de un polipeptido ActRII para propositos tales como mejorar la eficacia terapeutica, o la estabilidad (por ejemplo vida util ex vivo y resistencia a la degradacion proteolltica in vivo). Dichos polipeptidos ActRII modificados, cuando estan disenados para retener al menos una actividad de la forma de origen natural de los polipeptidos ActRII, se consideran equivalentes funcionales de los polipeptidos ActRII de origen natural. Los polipeptidos ActRII modificados tambien pueden producirse, por ejemplo, mediante sustitucion, eliminacion o adicion amoniacldica. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservadoras) no tengan un efecto importante en la actividad biologica de la molecula resultante. Los reemplazos conservadores son los que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que estan relacionados en sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia aminoacldica de un polipeptido ActRII da como resultado un homologo funcional puede determinarse facilmente evaluando la capacidad del polipeptido ActRII variante para producir una respuesta en las celulas de un modo similar al polipeptido ActRII de tipo natural.
[0045] En ciertos casos especlficos, la presente descripcion contempla elaborar mutaciones en el dominio extracelular (tambien denominado como dominio de union a ligando) de un polipeptido ActRII, de modo que el polipeptido ActRII variante (o mutante) tenga actividades de union a ligandos alteradas (por ejemplo afinidad de union o especificidad de union). En ciertos casos, dichos polipeptidos ActRII variantes tienen una afinidad de union alterada (elevada o reducida) para un ligando especlfico. En otros casos, los polipeptidos ActRII variantes tienen una especificidad de union alterada para sus ligandos.
[0046] Por ejemplo, el polipeptido ActRII variante se une preferiblemente a un ligando especlfico (por ejemplo, GDF8). Por ejemplo, los residuos aminoacldicos de la protelna ActRIIB, tales como E39, K55, Y60, K74, W78, d80 y F101 (mostrados en la figura 13), estan en el bolsillo de union a ligando y median la union a sus ligandos, tales como activina y GDF8. Por lo tanto, la presente descripcion proporciona un dominio de union al ligando alterado (por ejemplo dominio de union a GDF8) de un receptor ActRII, que comprende una o mas mutaciones en los residuos aminoacldicos. Opcionalmente, el dominio de union al ligando alterado puede tener un aumento de la selectividad para un ligando tal como GDF8 con respecto a un dominio de union a ligando de tipo natural de un receptor ActRII. Como ilustracion, estas mutaciones aumentan la selectividad del dominio de union a ligando para GDF8 con respecto a activina. Opcionalmente, el dominio de union a ligando alterado tiene una proporcion de Kd para la union de activina a Kd para la union de GDF8 que es de al menos el 2, 5, 10 o incluso 100 veces mayor con relacion a la proporcion para el dominio de union a ligando de tipo natural. Opcionalmente, el dominio de union al ligando alterado tiene una proporcion de IC50 para la inhibicion de activina con respecto a IC50 para la inhibicion de GDF8 que es al menos 2, 5, 10 o incluso 100 veces mas con respecto al dominio de union a ligando de tipo natural. Opcionalmente, el dominio de union a ligando alterado inhibe GDF8 con un IC50 de al menos 2, 5, 10 o incluso 100 veces menor que el IC50 para la inhibicion de activina.
[0047] Como un ejemplo especlfico, el residuo aminoacldico cargado en forma positiva Asp (D80) del dominio de union al ligando de ActRIIB, puede mutarse a un residuo aminoacldico diferente, de modo que el polipeptido ActRII variante se una preferiblemente a GDF8, pero no a activina. Preferiblemente, el residuo D60 se cambia a un residuo aminoacldico seleccionado entre el grupo que consiste en: un residuo aminoacldico no cargado, un residuo aminoacldico negativo, y un residuo aminoacldico hidrofobo. Como se reconocera por un experto en la tecnica, la mayor parte de las mutaciones descritas, variantes o modificaciones pueden hacerse al nivel del acido nucleico o, en algunos casos, mediante modificacion postraduccional o slntesis qulmica. Dichas tecnicas se conocen bien en la tecnica.
[0048] En ciertos casos, la presente descripcion contempla mutaciones especlficas de los polipeptidos ActRII, para alterar la glucosilacion del polipeptido. Los sitios de glucosilacion ejemplares en polipeptidos ActRIIA y ActRIIB se ilustran en las figuras 3 y 4, respectivamente. Dichas mutaciones pueden seleccionarse para introducir o eliminar uno mas sitios de glucosilacion, tal como sitios de glucosilacion ligados a O o ligados a N. Los sitios de reconocimiento de glucosilacion ligados a asparagina, generalmente comprenden una secuencia tripeptldica, asparagina-X-treonina (donde "X" es cualquier aminoacido) que se reconoce especlficamente por las enzimas de glucosilacion celulares adecuadas. La alteracion tambien puede elaborarse mediante la adicion de, o substitucion con, uno o mas residuos de serina o treonina a la secuencia del polipeptido ActRII de tipo natural (para sitios de glucosilacion ligandos a O). Una diversidad de substituciones o eliminaciones de aminoacidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones aminoacldicas de un sitio de reconocimiento de glucosilacion (y/o eliminacion de aminoacido en la segunda posicion) da como resultado una no glucosilacion en la secuencia tripeptldica modificada. Otro medio para aumentar el numero de restos de carbohidratos en un polipeptido ActRII, es mediante acoplamiento qulmico o enzimatico de glucosidos al polipeptido ActRII. Dependiendo del modo de acoplamiento usando, el azucar o azucares pueden unirse a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilos libres; (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cistelna; (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromaticos, tales como los de fenilalanina, tirosina o triptofano; o (f) el grupo amida de glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pags. 259-306. La eliminacion de uno o mas restos de carbohidratos presentes en un polipeptido ActRII se puede realizar qulmicamente y/o enzimaticamente. La desglucosilacion qulmica puede implicar, por ejemplo, la exposicion del polipeptido ActRII al compuesto de acido trifluorometanosulfonico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escision de la mayorla o todos los azucares, excepto el azucar de enlace ((N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando al mismo tiempo intacta la secuencia aminoacldica. La desglucosilacion qulmica se describe adicionalmente por Hakimuddin y col. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y por Edge y col. (1981) Anal. Biochem. 118: 131. La escision enzimatica de los restos de carbohidratos en los polipeptidos ActRII se puede lograr a traves del uso de una diversidad de endo y exoglucosidasas como se describe por Thotakura y col. (1987) Meth. Enzymol. 138: 350. La secuencia de un polipeptido ActRII puede ajustarse, segun sea adecuado, dependiendo del tipo de sistema de expresion usado, ya que las celulas de mamlfero, levadura, insecto y plantas pueden introducir patrones de glucosilacion diferentes que pueden verse afectados por la secuencia aminoacldica del peptido. En general, las protelnas ActRII para su uso en humanos se expresaran en una llnea celular de mamlfero que proporciona la glucosilacion adecuada, tal como las llneas celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que tambien sean utiles otras llneas celulares de expresion de mamlferos.
[0049] Esta descripcion contempla adicionalmente un procedimiento para generar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes de combination de un polipeptido ActRII, as! como mutantes de truncado; las agrupaciones de mutantes de combinacion son especialmente utiles para identificar secuencias de variantes funcionales. El proposito de clasificar dichas bibliotecas de combinacion puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipeptido ActRII que pueden actuar como agonistas o antagonistas o, como alternativa, que poseen actividades novedosas en conjunto. A continuation, se proporciona una diversidad de ensayos de clasificacion, y dichos ensayos pueden usarse para evaluar las variantes. Por ejemplo, una variante de polipeptido ActRII puede clasificarse por su capacidad de unirse a un polipeptido ActRII, para evitar la union de un ligando ActRII a un polipeptido ActRII.
[0050] La actividad de un polipeptido ActRII o sus variantes tambien puede probarse en un ensayo a base de celulas o in vivo. Por ejemplo, se puede evaluar el efecto de una variante de polipeptido ActRII en la expresion de genes implicados en la production de hueso en un osteoblasto o precursor. Esto, segun sea necesario, puede realizarse en presencia de una o mas protelnas de ligando ActRII recombinantes (por ejemplo BMP7), y las celulas pueden transfectarse para producir un polipeptido ActRII y/o variantes del mismo y, opcionalmente, un ligando ActRII. De igual manera, un polipeptido ActRII puede administrarse a un raton u otro animal, y pueden evaluarse una o mas propiedades de los huesos, tales como la densidad o el volumen. Tambien puede evaluarse la velocidad de curacion de fracturas oseas. De forma similar, la actividad de un polipeptido ActRII o sus variantes puede probarse en celulas de musculos, adipocitos y celulas neuronales para observar cualquier efecto en el crecimiento de estas celulas, por ejemplo, mediante los ensayos que se describen a continuacion. Dichos ensayos se conocen bien y son rutinarios en la tecnica.
[0051] Se pueden generar variantes obtenidas por combinacion, que tienen una potencia selectiva relativa a un polipeptido ActRII de origen natural. Dichas protelnas de variantes, cuando se expresan de construcciones de ADN recombinante, se pueden usar en protocolos de terapia genica. De igual manera, la mutagenesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares dramaticamente diferentes a las que corresponden a un polipeptido ActRII de tipo natural. Por ejemplo, la protelna alterada puede convertirse ya sea a mas estable o menos estable para la degradacion proteolltica u otros procesos celulares que dan como resultado la destruccion o, de otra forma, la inactivacion de un polipeptido ActRII nativo. Dichas variantes, y los genes que las codifican, pueden usarse para alterar los niveles de polipeptido ActRII modulando la semivida de los polipeptidos ActRII. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biologicos mas transitorios y, cuando es parte de un sistema de expresion inducible, puede controlar de manera mas ajustada los niveles de polipeptido ActRII recombinante dentro de la celula.
[0052] En un caso preferido, la biblioteca de combinacion se produce a modo de una biblioteca degenerada de genes que codifican una biblioteca de polipeptidos que incluyen cada uno al menos una porcion de secuencias de polipeptido ActRII potenciales. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleotidos sinteticos puede ligarse enzimaticamente a secuencias genicas de tal forma que el conjunto degenerado de secuencias nucleotldicas de polipeptido ActRII potenciales puedan expresarse como polipeptidos individuales o, como alternativa, como un conjunto de protelnas de fusion mayores (por ejemplo, por visualizacion de fagos).
[0053] Hay muchas maneras por la que la biblioteca de homologos potenciales puede generarse a partir de una secuencia de oligonucleotidos degenerados. La slntesis qulmica de una secuencia genica degenerada puede realizarse en un sintetizador automatico de ADN, y despues los genes sinteticos y se ligan a un vector apropiado para la expresion. La slntesis de oligonucleotidos degenerados se conoce bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura y col., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pags. 273-289; Itakura y col., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y col., (1984) Science 198: 1056; Ike y col., (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Dichas tecnicas se han empleado en la evolucion dirigida de otras protelnas (vease, por ejemplo, Scott y col., (1990) Science 249: 386-390; Roberts y col., (1992) PNAS USA 89: 2429-2433; Devlin y col., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla y col., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; as! como las Patentes de Estados Unidos N° 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).
[0054] Como alternativa, pueden utilizarse otras formas de mutagenesis para generar una biblioteca de combinacion. Por ejemplo, pueden generarse variantes de polipeptido ActRII (tanto de forma agonista como antagonista) y aislarse de una biblioteca mediante clasificacion usando, por ejemplo, mutagenesis de clasificacion de alanina y similares (Ruf y col., (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 3095­ 3099; Balint y col., (1993) Gene 137: 109-118; Grodberg y col., (1993) Eur. J. Biochem. 218: 597-601; Nagashima y col., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2888-2892; Lowman y col., (1991) Biochemistry 30: 10832-10838; y Cunningham y col., (1989) Science 244: 1081-1085), mediante mutagenesis de barrido de enlazador (Gustin y col., (1993) Virology 193: 653-660; Brown y col., (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight y col., (1982) Science 232: 316); mediante mutagenesis por saturation (Meyers y col., (1986) Science 232: 613); mediante mutagenesis por PCR (Leung y col., (1989) Method Cell Mol Biol 1: 11-19); o mediante mutagenesis aleatoria, incluyendo mutagenesis qulmica, etc. (Miller y col., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener y col., (1994) Strategies in Mol Biol 7: 32-34). La mutagenesis mediante enlazador, particularmente en una configuracion de combinacion, es un procedimiento atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipeptidos ActRII. En un caso especlfico, pueden usarse procedimientos similares para elaborar formas solubles de polipeptidos ActRII, que pueden actuar como agonistas o antagonistas de funciones ActRII.
[0055] Se conocen en la tecnica una amplia diversidad de tecnicas para clasificar productos genicos de bibliotecas de combinacion hechas por mutaciones o truncamientos puntuales, y, de hecho, para clasificar bibliotecas de ADNc para productos genicos que tienen una determinada propiedad. Dichas tecnicas se adaptaran generalmente para clasificar rapidamente las bibliotecas genicas generadas por la mutagenesis de combinacion de los polipeptidos ActRII. Las tecnicas mas ampliamente utilizadas para clasificar grandes bibliotecas genicas comprenden tlpicamente clonar la biblioteca genica en vectores de expresion replicables, transformar las celulas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes de combinacion en condiciones en las que la detection de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente facil del vector que codifica el gen cuyo producto se detecto. Cada uno de los ensayos ilustrativos que se describe a continuation son susceptibles de un analisis de alto rendimiento segun sea necesario para clasificar grandes numeros de secuencias degeneradas creadas por tecnicas de mutagenesis de combination.
[0056] En ciertos casos, los polipeptidos ActRII de la presente description incluyen peptidomimeticos. Como se usa en este documento, el termino "peptidomimetico" incluye peptidos modificados qulmicamente y moleculas similares a peptidos que contienen aminoacidos de origen sintetico, peptoides, y similares. Los peptidomimeticos proporcionan diversas ventajas sobre un peptido, incluyendo una mejor estabilidad cuando se administran a un sujeto. Se conocen bien en la tecnica procedimientos para identificar un peptidomimetico e incluyen la clasificacion de bases de datos que contienen bibliotecas de peptidomimeticos potenciales. Por ejemplo, la base de datos estructural de Cambridge contiene una coleccion de mas de 300.000 compuestos que tienen estructuras cristalinas conocidas (Allen y col., Acta Crystallogr. Section B, 35: 2331 (1979)). Cuando no esta disponible ninguna estructura cristalina de una molecula diana, puede generarse una estructura usando, por ejemplo, el programa CONCORD (Rusinko y col., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29: 251 (1989)). Otra base de datos, el Available Chemicals Directory (Molecular Design Limited, Informations Systems; San Leandro Calif.), contiene aproximadamente 100.000 compuestos que estan disponibles en el mercado y tambien pueden buscarse para identificar peptidomimeticos potenciales de los polipeptidos ActRII.
[0057] Como ilustracion, empleando mutagenesis de barrido para mapear los residuos aminoacldicos de un polipeptido ActRII que estan implicados en la union a otra protelna, pueden generarse compuestos peptidomimeticos que imitan los residuos implicados en la union. Por ejemplo, pueden generarse analogos peptldicos no hidrolizables de dichos residuos usando una benzodiazepina (vease, por ejemplo, Freidinger y col., en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Palses Bajos, 1988), azepina (vease, por ejemplo, Huffman y col., en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Palses Bajos, 1988), anillos gamma lactama sustituidos (Garvey y col., en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Palses Bajos, 1988), pseudopeptidos de ceto-metileno (Ewenson y col., (1986) J. Med. Chem. 29: 295; y Ewenson y col., en Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), nucleos del dipeptido b-tum (Nagai y col., (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; y Sato y col., (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231), y b-aminoalcoholes (Gordon y col., (1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419; y Dann y col., (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71).
[0058] En ciertos casos, los polipeptidos ActRII de la descripcion pueden comprender adicionalmente modificaciones postralacionales ademas de cualquiera que este presente de forma natural en los polipeptidos ActRII. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitation, acetilacion, carboxilacion, glucosilacion, fosforilacion, lipidacion y acilacion. Como resultado, los polipeptidos ActRII modificados pueden contener elementos no aminoacldicos, tales como polietilenglicoles, llpidos, poli o monosacaridos y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no aminoacldicos en la funcionalidad de un polipeptido ActRII pueden ensayarse como se describe en este documento para otras variantes de polipeptido ActRII. Cuando se produce un polipeptido ActRII en las celulas por escision de una forma incipiente del polipeptido ActRII, el procesamiento postraslacional tambien puede ser importante para un plegado correcto y/o la funcion de la protelna. Diferentes celulas (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen una maquinaria celular especlfica y mecanismos caracterlsticos para dichas actividades postraslacionales y pueden seleccionarse para asegurar la correcta modificacion y procesamiento de los polipeptidos ActRII.
[0059] En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipeptidos ActRII incluyen protelnas de fusion que tienen al menos una parte de los polipeptidos ActRII y uno o mas dominios de fusion. Los ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusion incluyen, pero sin limitacion, polihistidina, Glu-Glu, glutation S transferasa S (GST), tiorredoxina, protelna A, protelna G, una region constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), una protelna de union a maltosa (MBP) o albumina de suero humana. Puede seleccionarse un dominio de fusion para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusion son particularmente utiles para el aislamiento de las protelnas de fusion mediante cromatografla por afinidad. Para el proposito de purification por afinidad, se usan matrices relevantes para la cromatografla por afinidad, tales como resinas conjugadas con glutation, amilasa y nlquel o cobalto. Muchas de dichas matrices estan disponibles en forma de "kit", tal como el sistema de purificacion Pharmacia GST y el sistema QIAexpress™ (Qiagen) utiles con companeros de fusion (HIS6). Como otro ejemplo, puede seleccionarse un dominio de fusion para facilitar la detection de los polipeptidos ActRII. Los ejemplos de dichos dominios de detection incluyen las diversas protelnas fluorescentes (por ejemplo GFP), as! como "etiquetas de epltopo", que normalmente son secuencias de peptido cortas para las que esta disponible un anticuerpo especlfico. Las etiquetas de epltopo bien conocidas para las que estan facilmente disponibles anticuerpos monoclonales especlficos, incluyen FLAG, hemaglutinina de virus de influenza (HA) y etiquetas c-myc. En algunos casos, los dominios de fusion tienen un sitio de escision de proteasa, tal como para el factor Xa o Trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteinas de fusion y, de esta forma, libere las proteinas recombinantes de la misma. Despues, las proteinas liberadas posteriormente pueden aislarse del dominio de fusion mediante una separacion por cromatografia posterior. En ciertas realizaciones preferidas, se fusiona un polipeptido ActRII con un dominio que estabiliza el polipeptido ActRII in vivo (un dominio "estabilizante"). Por el termino "estabilizante" se entiende cualquier cosa que aumente la semivida en suero, sin importar si es debido a una destruccion disminuida, una elimiminacion disminuida a traves del rinon, u otro efecto farmacocinetico. Se sabe que las fusiones con la porcion Fc de una inmunoglobulina confieren propiedades farmacocineticas deseables en un amplio intervalo de proteinas. De igual manera, las fusiones a albumina de suero humana pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusion que pueden seleccionarse incluyen dominios de multimerizacion (por ejemplo, dimerizacion, tetramerizacion) y dominios funcionales (que confieren una funcion biologica adicional, tal como una estimulacion adicional del crecimiento muscular).
[0060] Como un ejemplo especifico, la presente descripcion proporciona una proteina de fusion en forma de un antagonista GDF8 que comprende un dominio extracelular (por ejemplo union a GDF8) fusionado a un dominio Fc (por ejemplo SEQ iD NO: 13).
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWD (A) VSHEDPEVKFNWYVDG
VEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK (A) VSNKALPVPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
PFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
[0061] Preferiblemente, el dominio Fc tiene una o mas mutaciones en residuos tales como Asp-265, Lisina 322 y Asn-434 (vease la figura 12). En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o mas de estas mutaciones (por ejemplo mutacion Asp-265) tiene una capacidad de union reducida al receptor Fcg con respecto al dominio Fc de tipo natural. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o mas de estas mutaciones (por ejemplo la mutacion Asp-434) tiene una capacidad aumentada para la union al receptor-Fc relacionado con MHC de clase I (FcRN) con respecto al dominio Fc de tipo natural.
[0062] Se entiende que los diferentes elementos de las proteinas de fusion pueden disponerse en cualquier forma que sea coherente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipeptido ActRII puede colocarse en C-terminal con respecto a un dominio heterologo, o como alternativa, un dominio heterologo puede colocarse en C-terminal con respecto a un polipeptido ActRII. El dominio de polipeptido ActRII y el dominio heterologo no necesitan estar adyacentes en una proteina de fusion, y los dominios o secuencias aminoacidicas adicionales pueden incluirse en C o N-terminal para cualquier dominio o entre los dominios.
[0063] En ciertos casos, los polipeptidos ActRII de la presente descripcion contienen una o mas modificaciones que tienen la capacidad de estabilizar los polipeptidos ActRII. Por ejemplo, dichas modificaciones mejoran la semivida in vitro de los polipeptidos ActRII, mejoran la semivida en circulacion de los polipeptidos ActRII o la degradacion proteolitica reductora de los polipeptidos ActRII. Dichas modificaciones de estabilizacion incluyen, pero sin limitation, proteinas de fusion (incluyendo, por ejemplo, proteinas de fusion que comprenden un polipeptido ActRII y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glucosilacion (incluyendo, por ejemplo, la adicion de un sitio de glucosilacion a un polipeptido ActRII), y modificaciones de un resto de carbohidratos (incluyendo, por ejemplo, la elimination de restos de carbohidratos de un polipeptido ActRII). En el caso de proteinas de fusion, se fusiona un polipeptido ActRII a un dominio estabilizador, tal como una molecula de IgG (por ejemplo, un dominio Fc). Como se usa en este documento, la expresion "dominio estabilizante" no se refiere unicamente a un dominio de fusion (por ejemplo Fc) como en el caso de las proteinas de fusion, sino que tambien incluye modificaciones no proteinaceas, tales como un resto de carbohidrato, o polimero no proteinaceo, tal como polietilenglicol.
[0064] En ciertos casos, la presente descripcion dispone las formas aisladas y/o purificadas de los polipeptidos ActRII, que estan aisladas de, o de otro modo sustancialmente libres de, otras proteinas.
[0065] En ciertos casos, los polipeptidos ActRII (modificados o no modificados) de la descripcion se pueden producir a traves de una diversidad de tecnicas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, dichos polipeptidos ActRII pueden sintetizarse usando tecnicas de qulmica de protelnas convencionales, tal como las descritas en Bodansky, M. Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) y Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman y Company, Nueva York (1992). Ademas, estan disponibles en el mercado sintetizadores de peptidos automaticos (por ejemplo, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Como alternativa, los polipeptidos, fragmentos o variantes de los mismos pueden producirse de forma recombinante usando diversos sistemas de expresion (por ejemplo E. coli, celulas de Ovario de Hamster Chino, celulas COS, baculovirus) como se conoce bien en la tecnica (vease tambien mas adelante). En una realizacion adicional, los polipeptidos ActRII modificados o no modificados pueden producirse mediante digestion de polipeptidos ActRII de longitud completa de origen natural o producidos de forma recombinante usando, por ejemplo, una proteasa, por ejemplo, tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima conversora de aminoacidos basicos emparejados (PACE). El analisis informatico (usando un software disponible en el mercado, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) se puede usar para identificar sitios de escision proteolltica. Como alternativa, dichos polipeptidos ActRII pueden producirse a partir de polipeptidos ActRII de longitud completa de origen natural o producidos de forma recombinante, tal como mediante tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, tal como mediante escision qulmica (por ejemplo bromuro de cianogeno, hidroxilamina).
3. Polipeptidos ActRII que Codifican Acidos Nucleicos
[0066] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona acidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipeptidos ActRII (por ejemplo, polipeptidos ActRII solubles), incluyendo fragmentos, variantes funcionales y protelnas de fusion descritas en este documento. Por ejemplo, SEQ ID NOs: 7-8 codifican un polipeptido precursor ActRII de origen natural, mientras que SEQ ID NOs: 5-6 codifican polipeptidos ActRII solubles. Los acidos nucleicos en cuestion pueden ser de una sola hebra o de hebra doble. Dichos acidos nucleicos pueden ser moleculas de ADN o ARN. Estos acidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, en procedimientos para elaborar polipeptidos ActRII o en forma de agentes terapeuticos directos (por ejemplo, en un enfoque de terapia genica).
[0067] En ciertos aspectos, se entiende adicionalmente que los acidos nucleicos en cuestion que codifican los polipeptidos ActRII, incluyen acidos nucleicos que son variantes de SEQ ID NO: 7 u 8. Las secuencias nucleotidicas de variantes incluyen secuencias que difieren por una o mas sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleotidos, tales como variantes alelicas; y, por lo tanto, incluiran secuencias codificantes que difieren de la secuencia codificante designada en SEQ ID NO: 7 u 8.
[0068] En ciertos casos, la descripcion proporciona secuencias de acido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o el 100% identicas a la SEQ ID NO: 5 o 6. Un experto en la tecnica apreciara que las secuencias de acido nucleico complementarias para SEQ ID NO: 5 o 6, y las variantes de SEQ ID NO: 5 o 6, tambien estan dentro del alcance de esta descripcion. En casos adicionales, las secuencias de acido nucleico de la descripcion pueden aislarse, recombinarse y/o condensarse con una secuencia nucleotidica heterologa, o en una biblioteca de ADN.
[0069] En otros casos, los acidos nucleicos de la descripcion tambien incluyen secuencias nucleotidicas que hibridan en condiciones altamente estrictas para la secuencia nucleotidica designada en SEQ ID NO: 5 o 6, la secuencia de complemento de SEQ ID NO: 5 o 6, o fragmentos de las mismas. Como se ha analizado anteriormente, un experto en la tecnica comprendera facilmente que las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridacion de ADN pueden variarse. Un experto en la tecnica comprendera facilmente que se pueden variar las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridacion de ADN. Por ejemplo, se puede realizar la hibridacion en 6,0 x cloruro sodico/citrato sodico (SSC) a aproximadamente 45 °C seguido de lavado de 2,0 x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentracion de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse entre una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C, hasta una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Ademas, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 °C. Se puede variar tanto la temperatura como la sal, o la temperatura o la concentracion de sal pueden mantenerse constantes mientras que se cambian otras variables. En un caso, la descripcion proporciona acidos nucleicos que hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 x SSC a temperatura ambiente seguido de un lavado de 2 x SSC a temperatura ambiente.
[0070] Los acidos nucleicos aislados que difieren de los acidos nucleicos tal como se exponen en la SEQ ID NO: 5-6 debido a la degeneracion en el codigo genetico, tambien estan dentro del alcance de la descripcion. Por ejemplo, varios aminoacidos estan disenados mediante mas de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoacido, o sinonimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinonimos para histidina) pueden dar como resultado mutaciones "silentes" que no afectan a la secuencia aminoacldica de la protelna. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de la secuencia de ADN que no conducen a cambios en la secuencias aminoacldicas de las protelnas en cuestion, existan entre celulas de mamlferos. Un experto en la tecnica apreciara que estas variaciones en uno o mas nucleotidos (hasta aproximadamente el 3-5% de los nucleotidos) de los acidos nucleicos que codifican una protelna particular, pueden existir entre individuos de una especie determinada debido a una variacion alelica natural. Cualesquiera y todas las variaciones de nucleotidos y polimorfismos de aminoacidos resultantes, estan dentro del alcance de esta descripcion.
[0071] En ciertos casos, los acidos nucleicos recombinantes de la descripcion pueden estar unidos operativamente a una o mas secuencias nucleotldicas reguladoras en una construccion de expresion. Las secuencias nucleotldicas reguladoras generalmente son adecuadas para la celula huesped utilizada para la expresion. Se conocen numerosos tipos de vectores de expresion adecuados y secuencias reguladoras adecuadas en la tecnica para una diversidad de celulas huesped. Normalmente, dicha una o mas secuencias nucleotldicas reguladoras pueden incluir, pero sin limitacion, secuencias promotoras, secuencias llderes o senal, sitios de union ribosomales, secuencias de inicio y terminacion de la transcripcion, secuencias de inicio y terminacion de la traduccion y secuencias mejoradoras o activadoras. Los promotores constitutivos o inducibles conocidos en la tecnica se contemplan por la descripcion. Los promotores pueden ser promotores que de origen natural o promotores hlbridos que combinan elementos de mas de un promotor. Puede estar presente una construccion de expresion en una celula en un episoma, tal como un plasmido, o la construccion de expresion puede insertarse en un cromosoma. En una realizacion preferida, el vector de expresion contiene un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de celulas huesped transformadas. Los genes marcadores seleccionables se conocen bien en la tecnica y variaran con la celula huesped usada.
[0072] En ciertos aspectos de la descripcion, el acido nucleico en cuestion se proporciona en un vector de expresion que comprende una secuencia nucleotldica que codifica un polipeptido ActRII y unido de forma operativa a al menos a una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la tecnica y seleccionan para dirigir la expresion del polipeptido ActRII. Por consiguiente, la expresion "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresion. Se describen secuencias reguladoras ejemplares en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de la expresion que controlan la expresion de una secuencia de ADN cuando se enlaza de forma operativa a esta, se pueden usar en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipeptido ActRII. Dicha secuencias de control y expresion utiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardlos de SV40, el promotor tet, promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, promotores RSV, el sistema tac y el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresion esta dirigida por polimerasa de ARN T7, las regiones mayores operadoras y promotoras del fago lambda, las regiones de control para la protelna de cubierta fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa, u otras enzimas glucollticas, los promotores de fosfatasa de acido, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de correspondencia a de levadura, el promotor de polihedron del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas por controlar la expresion de genes de celulas procarioticas o eucarioticas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Debe apreciarse que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se transformara y/o el tipo de protelna que se desea expresar. Ademas, tambien se deben considerar el numero de copias del vector, la capacidad para controlar el numero de copias y la expresion de cualquier otra protelna codificada por el vector, tal como marcadores antibioticos.
[0073] Un acido nucleico recombinante de la descripcion puede producirse ligando el gen clonado, o una porcion del mismo, en un vector adecuado para la expresion en celulas procarioticas, celulas eucarioticas (levadura, aviar, insecto o mamlfero) o ambas. Los vehlculos de expresion para la produccion de un polipeptido ActRII recombinante incluyen plasmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plasmidos de los tipos: plasmidos derivados de pBR322, plasmidos derivados de pEMBL, plasmidos derivados de pEX, plasmidos derivados de pBTac y plasmidos derivados de pUC para expresion en celulas procarioticas, tales como E. coli.
[0074] Algunos vectores de expresion de mamlfero contienen tanto secuencias procarioticas para facilitar la propagacion del vector en la bacteria, como una o mas unidades de transcripcion eucarioticas que se expresan en celulas eucarioticas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresion de mamlferos adecuados para la transfeccion de celulas eucarioticas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plasmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicacion y la seleccion de resistencia a farmacos en celulas tanto procarioticas como eucarioticas. Como alternativa, pueden usarse derivados de virus, tales como el virus de papiloma bovino (BPV-1), o virus Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresion transitoria de protelnas en celulas eucarioticas. Los ejemplos de otros sistemas de expresion vlrica (incluyendo retroviral) pueden encontrarse mas adelante en la descripcion de los sistemas de administracion de terapia genetica. Los diversos procedimientos empleados en la preparacion de los plasmidos y en la transformacion de organismos huesped se conocen en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados, tanto para celulas procarioticas como eucarioticas, as! como procedimientos recombinantes generales, vease Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Edicion, de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capltulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipeptidos recombinantes a traves del uso de un sistema de expresion de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresion de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tal como pAcUWI), y vectores derivados de pBlueBac (tal como el pBlueBac III que contiene b-gal).
[0075] En una realizacion preferida, un vector se disenara para la produccion de los polipeptidos ActRII en cuestion en celulas CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCl-neo (Promega, Madison, Wise). Como sera evidente, las construcciones genicas en cuestion pueden usarse para originar la expresion de los polipeptidos ActRII en cuestion en celulas propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir protelnas, incluyendo protelnas de fusion o protelnas de variantes, para purificacion.
[0076] Esta descripcion tambien pertenece a una celula huesped transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia de codificacion (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 u 8) para uno o mas de los polipeptidos ActRII en cuestion. La celula huesped puede ser cualquier celula procariotica o eucariotica. Por ejemplo, un polipeptido ActRII de la descripcion puede expresarse en celulas bacterianas, tales como E. coli, celulas de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresion de baculovirus), levadura o celulas de mamlfero. Se conocen otras celulas huesped adecuadas para los expertos en la tecnica.
[0077] Por consiguiente, la presente descripcion pertenece adicionalmente a procedimientos para producir los polipeptidos ActRII en cuestion. Por ejemplo, una celula huesped transfectada con un vector de expresion que codifica un polipeptido ActRII puede cultivarse en las condiciones adecuadas para permitir que tenga lugar la expresion del polipeptido ActRII. El polipeptido ActRII puede secretarse y aislarse a partir de una mezcla de celulas y medio que contiene el polipeptido ActRII. Como alternativa, el polipeptido ActRII puede retenerse de forma citoplasmica o en una fraccion de membrana, y las celulas se recolectaron, se lisaron y protelna se aislo. Un cultivo celular incluye celulas huesped, medios y otros subproductos. Se conocen en la tecnica medios adecuados para cultivo celular. Los polipeptidos ActRII en cuestion pueden aislarse de un medio de cultivo celular, celulas huesped, o ambos, usando tecnicas conocidas en la tecnica para purificar protelnas, incluyendo cromatografla de intercambio ionico, cromatografla de filtracion en gel, ultrafiltracion, electroforesis y purificacion por inmunoafinidad con anticuerpos especlficos para epltopos particulares de los polipeptidos ActRII. En un caso preferido, el polipeptido ActRII es una protelna de fusion que contiene un dominio que facilita su purificacion.
[0078] En otro caso, un gen de fusion que codifica una secuencia llder de purificacion, tal como una secuencia del sitio de escision de poli-(His)/enterocinasa en el termino N de la parte deseada del polipeptido ActRII recombinante, puede permitir la purificacion de la protelna de fusion expresada mediante cromatografla por afinidad usando una resina de metal Ni2+. Despues, la secuencia llder de purificacion puede eliminarse posteriormente mediante tratamiento con una enterocinasa para proporcionar el polipeptido ActRII purificado (por ejemplo, vease Hochuli y col., (1987) J. Chromatography 411: 177; y Janknecht y col., PNAS USA 88: 8972).
[0079] Se conocen bien tecnicas para elaborar genes de fusion. Esencialmente, la union de diversos fragmentos de a Dn que codifican diferentes secuencias polipeptldicas se realiza de acuerdo con tecnicas convencionales, empleando terminos de ligadura con extremo romo o un extremo escalonado, digestion de enzima de restriction para proporcionar terminos adecuados, llenado de extremos cohesivos segun sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una union no deseable, y ligadura enzimatica. En otro caso, el gen de fusion puede sintetizarse mediante tecnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automaticos. Como alternativa, la amplification PCR de los fragmentos de gen puede realizarse usando cebadores que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden hibridarse posteriormente para generar una secuencia genica quimerica (vease, por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons: 1992).
4. Anticuerpos
[0080] La presente invention se refiere a anticuerpos. Un anticuerpo que es especlficamente reactivo con un polipeptido ActRII (por ejemplo, un polipeptido ActRII soluble) y que se une de forma competitiva con el polipeptido ActRII puede usarse como un antagonista de las actividades del polipeptido ActRII. Por ejemplo, usando inmunogenos o derivados de un polipeptido ActRII, se pueden elaborar anticuerpos monoclonales o de anti-suero anti-protelna/anti-peptido mediante protocolos estandar (vease, por ejemplo Antibodies. A Laboratory Manual ed. by Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamlfero, tal como un raton, un hamster o conejo pueden inmunizarse con una forma inmunogenica del polipeptido ActRII, un fragmento antigenico que tiene la capacidad de provocar una respuesta del anticuerpo, o una protelna de fusion. Las tecnicas para conferir inmunogenecidad en una protelna o peptido incluyen conjugacion a vehlculos u otras tecnicas bien conocidas en la tecnica. Una parte inmunogenica de un polipeptido ActRII puede administrarse en presencia de un adyuvante. El desarrollo de la inmunizacion puede supervisarse mediante la deteccion de los tltulos de anticuerpo en plasma o en suero. Puede usarse ELISA convencional u otros inmunoensayos con el inmunogeno como un antlgeno para evaluar los niveles de anticuerpos.
[0081] Despues de la inmunizacion de un animal con una preparacion antigenica de un polipeptido ActRII, se puede obtener el anti-suero, y si se desea, se pueden aislar anticuerpos policlonales del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, las celulas productoras de anticuerpos (linfocitos) se pueden recolectar de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos de fusion de celula somatica estandar con celulas de inmortalizacion, tales como celulas de mieloma para producir celulas de hibridoma. Dichas tecnicas se conocen bien en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, la tecnica de hibridoma (desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la tecnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbar y col., (1983) Immunology Today, 4: 72), y la tecnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpo monoclonales humanos (Cole y col., (1985) Monoclonal Antibodies y Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pags. 77-96). Las celulas de hibridoma pueden clasificarse de forma inmunoqulmica para la production de anticuerpos especlficamente reactivos con un polipeptido ActRII y anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que comprende dichas celulas de hibridoma.
[0082] El termino "anticuerpo", como se usa en este documento, pretende incluir fragmentos de los mismos que tambien son especlficamente reactivos con un polipeptido ActRII en cuestion. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando tecnicas convencionales y los fragmentos se clasifican para su uso de la misma forma que se ha descrito anteriormente para anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)2 pueden generarse tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede tratarse para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo de la presente description pretende incluir adicionalmente moleculas bioespeclficas, de cadena unica, quimericas y humanizadas que tienen afinidad para un polipeptido ActRII conferido por al menos una region CDR del anticuerpo. En casos preferidos, el anticuerpo comprende adicionalmente una etiqueta unida al mismo y que tiene la capacidad de detectarse (por ejemplo, la etiqueta puede ser un radioisotopo, compuesto fluorescente, enzima o co-factor enzimatico).
[0083] En ciertos casos preferidos, un anticuerpo de la descripcion es un anticuerpo monoclonal, y en ciertos casos, la descripcion elabora procedimientos disponibles para generar anticuerpos novedosos. Por ejemplo, un procedimiento para generar un anticuerpo monoclonal que se une especlficamente a un polipeptido ActRII puede comprender administrar a un raton una cantidad de una composition inmunogenica que comprende el polipeptido ActRII eficaz para estimular una respuesta inmune detectable, obtener celulas productoras de anticuerpos (por ejemplo, celulas del bazo) del raton y condensar las celulas productoras de anticuerpos con celulas de mieloma para obtener hibridomas productores de anticuerpos, y ensayar los hibridomas productores de anticuerpos para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una especlficamente al polipeptido ActRII. Una vez obtenido, un hibridoma puede propagarse en un cultivo celular, opcionalmente en condiciones de cultivo donde las celulas derivadas de hibridoma producen el anticuerpo monoclonal que se une especlficamente al polipeptido ActRII. El anticuerpo monoclonal puede ser purificado del cultivo celular.
[0084] El adjetivo "especlficamente reactivo con", como se usa en referencia a un anticuerpo, pretende significar, como se entiende generalmente en la tecnica, que el anticuerpo es lo suficientemente selectivo entre el antlgeno de interes (por ejemplo, un polipeptido ActRII) y otros antlgenos que no son de interes ya que el anticuerpo es util, como mlnimo, para detectar la presencia del antlgeno de interes en un tipo particular de muestra biologica. En ciertos procedimientos que emplean el anticuerpo, tal como aplicaciones terapeuticas, puede ser deseable un mayor grado de especificidad en la union. Los anticuerpos monoclonales tienen generalmente una mayor tendencia (en comparacion con anticuerpos policlonales) a discriminar de forma eficaz entre los antlgenos deseados y los polipeptidos de reaction cruzada. Una caracterlstica que influencia la especificidad de una interaction anticuerpo:antlgeno es la afinidad de un anticuerpo para el antlgeno. Aunque la efectividad deseada puede alcanzarse con un intervalo de afinidades diferentes, generalmente los anticuerpos preferidos tendran una afinidad (una constante de disociacion) de aproximadamente 10'6, 10'7, 10'8, 10'9 o menos.
[0085] Ademas, las tecnicas usadas para clasificar anticuerpos con el fin de identificar un anticuerpo deseado pueden influenciar las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si un anticuerpo se usa para la union a un antlgeno en solucion, puede ser recomendable probar la union de la solucion. Una diversidad de diferentes tecnicas estan disponibles para probar la interaccion entre anticuerpos y antlgenos con el fin de identificar anticuerpos particularmente deseables. Dichas tecnicas incluyen ELISA, ensayos de union de resonancia de plasmon (por ejemplo, el ensayo de union Biacore, Bia-core AB, Uppsala, Suecia), ensayos de intercalado (por ejemplo, el sistema de perlas paramagneticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), transferencias Western, ensayo por inmunoprecipitacion e inmunohistoqulmica.
[0086] En ciertos aspectos, la descripcion proporciona anticuerpos que se unen a un polipeptido ActRII soluble. Dichos anticuerpos pueden generarse tal como se ha descrito anteriormente, usando un polipeptido ActRII soluble o un fragmento del mismo como un antlgeno. Los anticuerpos de este tipo pueden usarse, por ejemplo, para detectar polipeptidos ActRII en muestras biologicas y/o supervisar los niveles de polipeptido ActRII soluble en un individuo. En ciertos casos, puede usarse un anticuerpo que se une especlficamente a un polipeptido ActRII soluble para modular la actividad de un polipeptido ActRII y/o un ligando ActRII, regulando (promoviendo o inhibiendo) de esta forma el crecimiento de tejidos, tales como huesos, cartllago, musculo, grasa y neuronas.
5. Ensayos de Clasificacion
[0087] En ciertos aspectos, la presente descripcion se refiere al uso de los polipeptidos ActRII en cuestion (por ejemplo, los polipeptidos ActRII solubles) para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de los polipeptidos ActRII. Los compuestos identificados a traves de esta clasificacion pueden ensayarse en tejidos tales como hueso, cartllago, musculo, grasa y/o neuronas, para evaluar su capacidad para modular el crecimiento de tejido in vitro. Opcionalmente, estos compuestos pueden ensayarse adicionalmente en modelos animales para evaluar su capacidad para modular crecimiento de tejido in vivo.
[0088] Existen numerosos enfoques para clasificar los agentes terapeuticos para modular el crecimiento de tejido dirigiendo los polipeptidos ActRII. En ciertos casos, la clasificacion de alto rendimiento de los compuestos puede realizarse para identificar agentes que perturban los efectos mediados por ActRII en el crecimiento de huesos, cartllagos, musculo, grasa y/o neuronas. En ciertos casos, el ensayo se realiza para clasificar e identificar compuestos que inhiben especlficamente o reducen la union de un polipeptido ActRII a su companero de union, tal como un ligando ActRII (por ejemplo, activina, Nodal, GDF8, GDF11 o BMP7). Como alternativa, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que mejoran la union de un polipeptido ActRII a su protelna de union, tal como un ligando ActRII. En un caso adicional, los compuestos pueden identificarse por su capacidad para interactuar con un polipeptido ActRII.
[0089] Una diversidad de formatos de ensayo seran suficientes, y a la luz de la presente descripcion, los no descritos de manera expresa en este documento, podran considerarse por un experto en la tecnica. Como se describe en este documento, los compuestos de prueba (agentes) de la descripcion se pueden crear mediante cualquier procedimiento qulmico de combinacion. Como alternativa, los compuestos en cuestion pueden ser biomoleculas de origen natural sintetizadas in vivo o in vitro. Los compuestos (agentes) que se ensayaran para comprobar su capacidad para actuar como moduladores del crecimiento de tejido pueden producirse, por ejemplo, mediante bacterias, levaduras, plantas o otros organismos (por ejemplo, productos naturales), producirse qulmicamente (por ejemplo, moleculas pequenas, incluyendo peptidomimeticos), o producirse de forma recombinante. Los compuestos de prueba contemplados por la presente descripcion incluyen moleculas organicas de no peptidilo, peptidos, polipeptidos, peptidomimeticos, azucares, hormonas y moleculas de acido nucleico. En una caso especlfico, el agente de prueba es una molecula organica pequena que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 2.000 daltons.
[0090] Los compuestos de prueba de la descripcion pueden proporcionarse como entidades separadas, individuales o proporcionarse en bibliotecas de mayor complejidad, tal como elaboradas mediante qulmica de combinacion. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, esteres, aldehldos, eteres y otras clases de compuestos organicos. La presentacion de los compuestos de prueba al sistema de prueba puede ser de aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en las etapas de clasificacion iniciales. Opcionalmente, los compuestos pueden derivarse opcionalmente con otros compuestos y tienen grupos de derivacion que facilitan el aislamiento de los compuestos. Los ejemplos no limitantes de grupos de derivation incluyen biotina, fluorescelna, digoxigenina, protelna fluorescente verde, isotopos, polihistidina, fuentes magneticas, glutation S transferasa (GST), reticuladores fotoactivables o cualquier combinacion de los mismos.
[0091] En muchos programas de clasificacion de farmacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento con el objeto de maximizar el numero de compuestos estudiados en un perlodo de tiempo determinado. Los ensayos que se realizan en sistemas libres de celulas, tal como derivados con protelnas purificadas o semi-purificadas, con frecuencia se prefieren como clasificaciones "primarias", ya que pueden generarse para permitir un desarrollo rapido y una deteccion relativamente facil de una alteracion en una diana molecular que esta mediada por un compuesto de prueba. Ademas, los efectos de toxicidad celular o biodisponibilidad del compuesto de prueba pueden ignorarse generalmente en el sistema in vitro, enfocandose el ensayo mas bien principalmente en el efecto del farmaco en la diana molecular como puede manifestarse en una alteracion de afinidad de union entre un polipeptido ActRII y su protelna de union (por ejemplo, un ligando ActRII).
[0092] Meramente como ilustracion, en un ensayo de clasificacion ejemplar de la presente descripcion, el compuesto de interes se pone en contacto con un polipeptido ActRII aislado y purificado que tiene la capacidad ordinariamente de unirse a un ligando ActRII, segun sea adecuado para la intencion del ensayo. Despues, a la mezcla del compuesto y el polipeptido ActRII se le anade una composition que contiene un ligando ActRII. La deteccion y cuantificacion de los complejos de ActRII/ligando ActRII proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto en la inhibition (o potenciacion) de la formation de complejo entre el polipeptido ActRII y su protelna de union. La eficacia del compuesto puede evaluarse generando curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de prueba. Ademas, tambien se puede realizar un ensayo de control para proporcionar una referencia para comparacion. Por ejemplo, en un ensayo de control, el ligando ActRII aislado y purificado se anade a una composicion que contiene el polipeptido ActRII, y la formacion del complejo de ActRII/ligando ActRII se cuantifica en ausencia del compuesto de prueba. Se entendera que, en general, el orden en el que los reactivos pueden mezclarse puede variar, y pueden mezclarse de forma simultanea. Ademas, en lugar de protelnas purificadas, se pueden usar extractos celulares y lisados para hacer adecuado un sistema de ensayo libre de celulas.
[0093] La formacion de complejos entre el polipeptido ActRII y su protelna de union puede detectarse mediante una diversidad de tecnicas. Por ejemplo, la modulation de la formacion de complejos puede cuantificarse usando, por ejemplo, protelnas etiquetadas de forma detectable, tales como polipeptido ActRII radioetiquetado (por ejemplo, 32P, 35S, 14C o 3H), etiquetado de forma fluorescente (por ejemplo, FITC) o etiquetado de forma enzimatica o su protelna de union, mediante inmunoensayo, o mediante deteccion cromatografica.
[0094] En ciertos casos, la presente descripcion contempla el uso de ensayos de polarization de fluorescencia y ensayos de transferencia de energla de resonancia de fluorescencia (FRET) en la medicion, ya sea directa o indirectamente, del grado de interaction entre el polipeptido ActRII y su protelna de union. Ademas, otros modos de deteccion, tales como los basados en gulas de ondas opticas (Publication PCT WO 96/26432 y Patente de Estados Unidos N° 5.677.196), resonancia de plasmon superficial (SPR), detectores de carga superficial y detectores de fuerza superficial, son compatibles con muchos casos de la descripcion.
[0095] Ademas, la presente descripcion contempla el uso de un ensayo trap de interaccion, tambien conocido como el "ensayo de dos hlbridos" para identificar agentes que interrumpen o potencian una interaccion entre un polipeptido ActRII y su protelna de union. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.283.317; Zervos y col. (1993) Cell 72: 223-232; Madura y col. (1993) J Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14: 920-924; y Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8: 1693-1696). En un caso especlfico, la presente descripcion contempla el uso de sistemas de dos hlbridos inversos para identificar compuestos (por ejemplo, moleculas pequenas o peptidos) que disocian interacciones entre el polipeptido ActRII y su protelna de union. Vease, por ejemplo, Vidal y Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27: 919-29; Vidal y Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17: 374-81; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.525.490; 5.955.280; y 5.965.368.
[0096] En ciertos casos, los compuestos en cuestion se identifican por su capacidad de interactuar con un polipeptido ActRII de la descripcion. La interaccion entre el compuesto y el polipeptido ActRII puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, dicha interaccion puede identificarse en el nivel de la protelna usando procedimientos bioqulmicos in vitro, incluyendo fotoreticulacion, union de ligando radioetiquetado y cromatografla por afinidad (Jakoby WB y col., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). En ciertos casos, los compuestos pueden clasificarse en un ensayo basado en un mecanismo, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un polipeptido ActRII. Este puede incluir un evento de union de fase solida o fase llquida. Como alternativa, el gen que codifica un polipeptido ActRII puede transfectarse con un sistema informador (por ejemplo, b-galactosidasa, luciferasa, o protelna fluorescente verde) a una celula y clasificarse frente a la biblioteca preferiblemente mediante una clasificacion de alto rendimiento o con elementos individuales de la biblioteca. Pueden usarse otros ensayos de union basados en mecanismos, por ejemplo, ensayos de union que detectan cambios en la energla libre. Los ensayos de union pueden realizarse con la diana fijada a un pocillo, perla o trozo o capturarse por un anticuerpo inmovilizado, o resolverse mediante electroforesis capilar. Normalmente, los compuestos unidos pueden detectarse usando resonancia colorimetrica, de fluorescencia o de plasmon superficial.
[0097] En ciertos aspectos, la presente descripcion proporciona procedimientos y agentes para estimular el crecimiento muscular y aumentar la masa muscular, por ejemplo, antagonizando funciones de un ligando ActRII. Por lo tanto, cualquier compuesto identificado puede probarse en celulas completas o tejidos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular el crecimiento muscular. Se pueden usar diversos procedimientos en la tecnica para este fin. Por ejemplo, los procedimientos de la descripcion se realizan de tal forma que la transduccion de senal a traves de una protelna ActRII activada mediante union a un ligando ActRII (por ejemplo, GDF8) se haya reducido o inhibido. Se reconocera que el crecimiento de tejido muscular en el organismo puede dar como resultado un aumento de la masa muscular en el organismo en comparacion con la masa muscular de un organismo correspondiente (o poblacion de organismo) en el que no se ha efectuado la transduccion de senal a traves de una protelna ActRII.
[0098] Por ejemplo, el efecto de los polipeptidos ActRII o compuestos de prueba en el crecimiento y/o proliferacion celular muscular pueden determinarse midiendo la expresion genica de Pax-3 y Myf-5, que se asocian con la proliferacion de celulas miogenicas, y la expresion genica de MyoD que esta asociada con la diferenciacion muscular (por ejemplo Amthor y col., Dev Biol. 2002, 251: 241-57). Se sabe que GDF8 desactiva de forma descendente la expresion genica de Pax-3 y Myf-5, y evita la expresion genica de MyoD. Se espera que los polipeptidos ActRII o compuestos de prueba antagonicen esta actividad de GDF8. Otro ejemplo de ensayos basados en celulas incluye medir la proliferacion de mioblastos, tales como mioblastos C(2)C(12) en presencia de los polipeptidos ActRII o compuestos de prueba (por ejemplo, Thomas y col., J Biol Chem. 2000, 275: 40235-43).
[0099] La presente descripcion tambien contempla ensayos in vivo para medir la masa y fuerza muscular. Por ejemplo, Whittemore y col. (Biochem Biophys Res Commun. 2003, 300: 965-71) desvelan un procedimiento para medir la masa musculoesqueletica aumentada y el aumento de la fuerza de sujecion en ratones. Opcionalmente, este procedimiento se puede utilizar para determinar los efectos terapeuticos de los compuestos de prueba (por ejemplo, polipeptidos ActRII) en enfermedades o afecciones musculares, por ejemplo aquellas enfermedades para las que es limitante la masa muscular.
[00100] En ciertos aspectos, la presente descripcion proporciona procedimientos y agentes para modular (estimular o inhibir) la formacion osea y aumentar la masa osea. Por consiguiente, se puede probar cualquier compuesto identificado en celulas o tejidos completos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad de modulacion del crecimiento oseo y de cartllagos. Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la tecnica para este fin.
[00101] Por ejemplo, el efecto de los polipeptidos ActRII o compuestos de prueba en el crecimiento de huesos o cartllagos puede determinarse midiendo la induccion de Msx2 o la diferenciacion de celulas osteoprogenitoras en osteoblastos en ensayos basados en celulas (vease, por ejemplo, Daluiski y col., Nat Genet. 2001, 27(1): 84-8; Hino y col., Front Biosci. 2004, 9: 1520-9). Otro ejemplo de ensayos basados en celulas incluye analizar la actividad osteogenica de los polipeptidos ActRII y los compuestos de prueba en cuestion en celulas progenitoras mesenquimales y osteoblasticas. Como ilustracion, los adenovirus recombinantes que expresan un polipeptido ActRII se construyeron para infectar celulas C3H10T1/2 progenitoras mesenquimales pluripotentes, celulas C2C12 pre-osteoblasticas y celulas TE-85 osteoblasticas. Despues, la actividad osteogenica se determina midiendo la induccion de fosfatasa alcalina, osteocalcina y mineralizacion de matriz (vease, por ejemplo Cheng y col., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8): 1544-52).
[00102] La presente descripcion tambien contempla ensayos in vivo para medir el crecimiento de huesos o cartllagos. Por ejemplo, Namkung-Matthai y col., Bone, 28: 80-86 (2001) desvelan un modelo osteoporotico en ratas en el que se estudia la reparacion osea durante el perlodo temprano despues de la fractura. Kubo y col., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202 (1999) tambien desvelan un modelo osteoporotico de rata en el que se estudia la reparacion de huesos durante el perlodo tardlo despues de una fractura.
[00103] En ciertos aspectos, la presente descripcion aprovecha los ensayos de curacion de fracturas que se conocen en la tecnica. Estos ensayos incluyen tecnicas de fracturas, analisis histologicos y analisis bioqulmicos, que se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 6.521.750.
[00104] En ciertos aspectos, la presente descripcion proporciona procedimientos y agentes para controlar la ganancia de peso y la obesidad. A nivel celular, la proliferacion y diferenciacion de adipocitos es importante en el desarrollo de la obesidad, lo que conduce a la generacion de celulas de grasa adicionales (adipocitos). Por lo tanto, se puede probar cualquier compuesto identificado en celulas o tejidos complejos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular la adipogenesis midiendo la proliferacion o diferenciacion de adipocitos. Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la tecnica para este fin. Por ejemplo, el efecto de un polipeptido ActRII (por ejemplo, un polipeptido ActRII soluble) o compuestos de prueba en la adipogenesis puede determinarse midiendo la diferenciacion de los preadipocitos 3T3-L1 a adipocitos maduros en ensayos basados en celulas, tal como, observando la acumulacion de triacilglicerol en veslculas de tincion de Oil Red O y mediante la aparicion de ciertos marcadores de adipocitos, tales como FABP (aP2/422) y PPARg2. Vease, por ejemplo, Reusch y col., 2000, Mol Cell Biol. 20: 1008-20; Deng y col., 2000, Endocrinology. 141: 2370-6; Bell y col., 2000, Obes Res. 8: 249-54. Otro ejemplo de ensayos a base de celulas incluye analizar la funcion de los polipeptidos ActRII y los compuestos de prueba en la proliferacion de adipocitos o celulas precursoras de adipocitos (por ejemplo celulas 3T3-L1), tal como, supervisando las celulas positivas a bromodesoxiuridina (BrdU). Vease, por ejemplo, Pico y col., 1998, Mol Cell Biochem. 189: 1-7; Masuno y col., 2003, Toxicol Sci. 75: 314-20.
[00105] Se entendera que los ensayos de clasificacion de la presente descripcion se aplican no solo a los polipeptidos ActRII en cuestion y las variantes de los polipeptidos ActRII, sino tambien a cualquier compuesto de prueba incluyendo agonistas y antagonistas de los polipeptidos. Ademas, estos ensayos de clasificacion son utiles para propositos de verificacion de diana de farmaco y control de calidad.
6. Usos Terapeuticos Ejemplares
[00106] En ciertos casos, las composiciones (por ejemplo, polipeptidos ActRII) de la presente descripcion se pueden usar para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion que esta asociada con una actividad anormal de un polipeptido ActRII y/o un ligando ActRII (por ejemplo, GDF8). Estas enfermedades, trastornos o afecciones se denominan generalmente en este documento "afecciones asociadas a ActRII". En ciertos casos, la presente descripcion proporciona procedimientos para tratar o prevenir a un individuo que necesita de los mismos, a traves de la administracion al individuo de una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido ActRII, como se ha descrito anteriormente. Estos procedimientos estan dirigidos particularmente a tratamientos terapeuticos y profilacticos de animales, y mas particularmente, seres humanos.
[00107] Como se usa en este documento, un producto terapeutico que "previene" un trastorno o afeccion se refiere a un compuesto que, en una muestra estadlstica, reduce la aparicion del trastorno o afeccion en la muestra tratada con respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa la aparicion o reduce la gravedad de uno o mas slntomas del trastorno o afeccion con respecto a una muestra de control no tratada. El termino "tratamiento", como se usa en este documento, incluye la profilaxis de la afeccion nombrada o la mejora o elimination de la afeccion una vez se ha establecido.
[00108] Los complejos de ActRII/ligando ActRII, desempenan funciones esenciales en crecimiento de tejido, as! como procesos de desarrollo tempranos, tales como la formation correcta de diversas estructuras o en una o mas capacidades post-desarrollo incluyendo el desarrollo sexual, la production de hormona pituitaria y la creation de huesos y cartllagos. Por lo tanto, las afecciones asociadas a ActRII incluyen un crecimiento tisular anormal y defectos de desarrollo. Ademas, las afecciones asociadas a ActRII incluyen, pero sin limitation, trastornos del crecimiento y diferenciacion celular, tales como inflamacion, alergia, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y tumores.
[00109] Las condiciones asociadas a ActRII ejemplares incluyen trastornos neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular y atrofia muscular), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, slndrome desgaste muscular, sarcopenia, caquexia, trastornos del tejido adiposo (por ejemplo obesidad), diabetes tipo 2 y enfermedad degenerativa osea (por ejemplo osteoporosis). Otras afecciones asociadas a ActRII ejemplares incluyen trastornos musculodegenerativos y neuromusculares, reparation tisular (por ejemplo curacion de heridas), enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrofica), trastornos inmunologicos (por ejemplo trastornos relacionados con una proliferacion o funcion anormal de linfocitos), y obesidad o trastornos relacionados con la proliferacion anormal de adipocitos.
[00110] En ciertas realizaciones, las composiciones de la invention se usan como parte de un tratamiento para una distrofia muscular. La expresion "distrofia muscular" se refiere a un grupo de enfermedades musculo-degenerativas caracterizadas por el debilitamiento y deterioro gradual de los musculos esqueleticos y algunas veces los musculos del corazon y respiratorios. Las distrofias musculares son trastornos geneticos caracterizados por un desgaste y debilidad muscular progresiva que comienza con cambios microscopicos en los musculos. Conforme los musculos se degeneran con el tiempo, disminuye la fuerza muscular de la persona. Las distrofias musculares ejemplares que se pueden tratar con un regimen que incluye los polipeptidos ActRII en cuestion, incluyen: Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker (Bm D), Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), Distrofia Muscular de Limb-Girdle (LGMD), Distrofia Muscular Fasciocapulohumeral (FSH o FSHD) (tambien conocido como Landouzy-Dejerine), Distrofia Miotonica (MMD) (tambien conocida como enfermedad de Steinert), Distrofia Muscular Oculofarlngea (OPMD), Distrofia Muscular Distal (DD), Distrofia Muscular Congenita (CMD).
[00111] La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) se describio por primera vez por el neurologo Frances Guillaume Benjamin Amand Duchenne en los anos de 1860. La Distrofia Muscular de Becker (BMD) se nombro despues del doctor Aleman Peter Emil Becker, quien describio por primera vez esta variante de DMD en los anos de 1950. La DMD es una de las enfermedades hereditarias mas frecuentes en varones, afectando a uno de 3.500 hombres. La DMD tiene lugar cuando el gen de la distrofina, localizado en el brazo corto del cromosoma X, se rompe. Ya que los hombres unicamente llevan una copia del cromosoma X, unicamente tienen una copia del gen de la distrofina. Sin la protelna de distrofina, el musculo se dana facilmente durante los ciclos de contraccion y relajacion. Aunque en la etapa temprana en la enfermedad el musculo se compensa por regeneracion, posteriormente en el musculo las celulas progenitoras ya no pueden mantenerse con el dano en curso y el musculo sano se reemplaza por tejido fibrograso no funcional.
[00112] La BMD resulta de diferentes mutaciones en el gen de la distrofina. Los pacientes de BMD tienen cierta distrofina, aunque es insuficiente en cantidad o pobre en calidad. Habiendo algo de distrofina, se protege a los musculos de los que padecen BMD, de la degeneracion de forma tan mala o tan rapida como los de personas con DMD.
[00113] Por ejemplo, investigaciones recientes demuestran que el bloqueo o eliminacion de la funcion de GDF8 (un ligando ActRII) in vivo, puede tratar de forma eficaz al menos ciertos slntomas en pacientes con DMD y BMD (Bogdanovich y col., anteriormente; Wagner y col., anteriormente). Por lo tanto, los polipeptidos ActRII en cuestion pueden actuar como inhibidores GDF8 (antagonistas) y constituir un medio alternativo de bloqueo de las funciones de GDF8 y/o ActRII in vivo en pacientes con DMD y BMD.
[00114] De forma similar, los polipeptidos ActRII en cuestion proporcionan un medio eficaz para aumentar la masa muscular y otras afecciones de enfermedad que necesitan de crecimiento muscular. Por ejemplo, Gonzalez-Cadavid y col. (anteriormente) indicaron que la expresion se correlaciona de forma inversa con la masa libre de grasa en seres humanos y que el aumento de la expresion del gen GDF8 esta asociado con la perdida de peso en los hombres con slndrome de desgaste por SIDA. Mediante la inhibicion de la funcion de GDF8 en pacientes con SIDA pueden aliviarse al menos ciertos slntomas del SIDA, si no se eliminan completamente, mejorando as! significativamente la calidad de vida de los pacientes con SIDA.
[00115] Puesto que una perdida de la funcion GDF8 (un ligando ActRII) tambien esta asociada con perdida de grasa sin disminucion de la ingesta de nutrientes (Zimmers y col., anteriormente; McPherron y Lee, anteriormente), los polipeptidos ActRIIB en cuestion pueden usarse adicionalmente como un agente terapeutico para disminuir o prevenir el desarrollo de obesidad y diabetes tipo II.
[00116] El slndrome de anorexia-caquexia por cancer, se encuentra entre los aspectos mas debilitantes y arriesgados para la vida del cancer. La perdida de peso progresiva en el slndrome de anorexia-caquexia por cancer, es una caracterlstica comun de muchos tipos de cancer y es responsable no solo de una deficiente calidad de vida y una deficiente respuesta a la quimioterapia, sino tambien de un tiempo de supervivencia mas corto que se encuentra en pacientes con tumores comparables sin perdida de peso. Asociada con la anorexia, el desgaste de tejido graso y muscular, la ansiedad psicologica, y una menor calidad de vida, la caquexia surge de una interaccion compleja entre el cancer y el huesped. Es una de las causas mas comunes de muerte entre pacientes con cancer y esta presente en el 80% de las muertes. Es un ejemplo complejo de caos metabolico que afecta al metabolismo de las protelnas, carbohidratos y grasas. Los tumores producen anormalidades tanto directas como indirectas, que dan como resultado anorexia y perdida de peso. Actualmente, no existe un tratamiento para controlar o invertir el proceso. El slndrome de anorexia-caquexia por cancer afecta a la produccion de citocinas, la liberacion de factores de movilizacion de llpidos e induction de proteolisis, y las alteraciones en el metabolismo intermediario. Aunque la anorexia es comun, una ingesta de alimentos disminuida sola no tiene la capacidad de abarcar los cambios en la composition corporal observados en pacientes con cancer, y el aumento de la ingesta de nutrientes no tiene la capacidad de invertir el slndrome de desgaste. Debe sospecharse caquexia en pacientes con cancer, si tiene lugar una perdida de peso involuntaria mayor al cinco por ciento del peso premorbido en un periodo de seis meses.
[00117] Puesto que se descubrio que la sobreexpresion sistemica de GDF8 en ratones adultos induce una perdida de musculo y grasa profunda analoga a la observada en slndromes de caquexia humanos (Zimmers y col., anteriormente), los polipeptidos ActRII en cuestion, como composiciones farmaceuticas pueden usarse de forma beneficiosa para evitar, tratar o aliviar los slntomas del slndrome de caquexia, cuando se desea el crecimiento muscular.
[00118] En otras realizaciones, la presente descripcion proporciona procedimientos para inducir la formacion de hueso y/o cartllago, previniendo la perdida de hueso, aumentando la mineralizacion de huesos o evitando la desmineralizacion de huesos. Por ejemplo, los polipeptidos ActRII en cuestion y los compuestos identificados en la presente descripcion tienen aplicacion en el tratamiento de la osteoporosis y la curacion de las fracturas oseas y defectos en cartllagos en seres humanos y otros animales. Los polipetidos ActRII pueden ser utiles en pacientes que son diagnosticados con una baja densidad osea subcllnica, como una medida protectora contra el desarrollo de la osteoporosis.
[00119] En un caso especlfico, los procedimientos y composiciones de la presente descripcion pueden encontrar utilidad medica en la curacion de fracturas de huesos y defectos en cartllagos en seres humanos y otros animales. Los procedimientos y composiciones en cuestion tambien pueden tener un uso profilactico en la reduccion de fracturas tanto cerradas como abiertas, y tambien en la fijacion mejorada de articulaciones artificiales. La formacion de huesos de novo, inducida por un agente osteogenico contribuye a la reparacion de defectos craneofaciales congenitos, inducidos por trauma o inducidos por reseccion oncologica, y tambien es util en cirugla plastica cosmetica. Ademas, pueden usarse los procedimientos y composiciones de la descripcion en el tratamiento de enfermedad periodontal, y en otros procesos de reparacion dental. En ciertos casos, los polipeptidos ActRII en cuestion pueden proporcionar un ambiente para atraer a las celulas que forman huesos, estimular el crecimiento de celulas que forman huesos o inducir la diferenciacion de progenitores de celulas formadoras de huesos. Los polipeptidos ActRII de la descripcion tambien pueden ser utiles en el tratamiento de la osteoporosis. Ademas, los polipeptidos ActRII pueden usarse en la reparacion de defectos de cartllagos y para prevenir/invertir la osteoartritis.
[00120] En otra realizacion especlfica, la descripcion proporciona una composicion terapeutica para reparar fracturas y otras afecciones relacionadas a defectos en cartllagos y/o huesos o enfermedades periodontales. La descripcion proporciona adicionalmente procedimientos y composiciones terapeuticos para curar heridas y reparar tejidos. Los tipos de heridas incluyen, pero sin limitacion, quemaduras, incisiones y ulceras. Vease, por ejemplo la Publication PCT N° WO84/01106. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos uno de los polipeptidos ActRII de la descripcion en mezcla con vehlculo, transportador o matriz farmaceuticamente aceptables.
[00121] En otra realizacion especlfica, las procedimientos y composiciones de la descripcion pueden emplearse en afecciones que originan la perdida osea, tales como osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Cushing, tirotoxicosis, estado de diarrea cronica o mala absorcion, acidosis tubular renal, o anorexia nerviosa. Muchas personas saben que ser mujeres, tener un bajo peso corporal, y llevar un estilo de vida sedentario son factores de riesgo para la osteoporosis (perdida de densidad mineral osea, que conduce a riesgo de fractura). Sin embargo, la osteoporosis tambien puede resultar del uso a largo plazo de ciertos medicamentos. La osteoporosis resultante de farmacos y otra afeccion medica se conoce como osteoporosis secundaria. En una afeccion conocida como enfermedad de Cushing, la cantidad en exceso de cortisol producido por el cuerpo da como resultado osteoporosis y fracturas. Los medicamentos mas comunes asociados a la osteoporosis secundaria son los corticoesteroides, una clase de farmacos que actuan como el cortisol, una hormona producida de forma natural por las glandulas suprarrenales. Aunque los niveles adecuados de hormonas de tiroides (que se producen por la glandula tiroidea) son necesarias para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona tiroidea puede disminuir la masa osea con el tiempo. Los antiacidos que contienen aluminio pueden conducir a la perdida osea cuando se toman en altas dosis por personas con problemas de rinon, particularmente las que se someten a dialisis. Otros medicamentos que pueden causar la osteoporosis secundaria incluyen fenitolna (Dilantin) y barbituratos que se usan para prevenir las convulsiones; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un farmaco para algunas formas de artritis, cancer y trastornos inmunes; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), un farmaco utilizado para tratar algunas enfermedades autoinmunes y suprimir el sistema inmune en pacientes con trasplante de organos; agonistas de liberation de la hormona luteinizante (Lupron, Zoladex), usados para tratar el cancer de prostata y la endometriosis; heparina (Calciparine, Liquaemin), un medicamento anticoagulante; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), usados para tratar el colesterol alto. La enfermedad de la goma origina la perdida de hueso debido a que estas bacterias peligrosas en la boca obligan al cuerpo a defenderse contra ellas. Las bacterias producen toxinas de enzimas bajo la ilnea de goma, originando una infeccion cronica.
[00122] En un caso adicionai, ia presente descripcion proporciona procedimientos y agentes terapeuticos para tratar enfermedades o trastornos asociados con un crecimiento de huesos anormal o no deseado. Por ejemplo, pacientes que tienen la enfermedad conocida como Fibrodisplasia Osificante Progresiva (FOP), desarrollan un "segundo esqueleto" anormal que evita cualquier movimiento. Adicionalmente, el crecimiento anormal de hueso puede ocurrir despues de una cirugla de reemplazo de cadera y, por lo tanto, arruinar el resultado quirurgico. Esto es un ejemplo mas comun de crecimiento de hueso patologico y una situacion en la que los procedimientos y composiciones en cuestion pueden ser terapeuticamente utiles. Los mismos procedimientos y composiciones tambien pueden ser utiles para tratar otras formas de crecimiento anormal (por ejemplo, crecimiento patologico de huesos despues de trauma, quemaduras o lesion en la medula espinal) y para tratar o prevenir las condiciones indeseables asociadas con el crecimiento de huesos anormal observado en relacion con cancer de prostata metastatico u osteosarcoma. Los ejemplos de estos agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitacion, polipeptidos ActRII que antagonizan la funcion de un ligando ActRII (por ejemplo BMP7), compuestos que interrumpen la interaccion entre un ActRII y su ligando (por ejemplo, BMP7), y anticuerpos que se unen especlficamente a un receptor ActRII de modo que un ligando ActRII (por ejemplo BMP7) no pueda unirse al receptor ActRII.
[00123] En otras realizaciones, la presente descripcion proporciona composiciones y procedimientos para regular el contenido de grasa corporal en un animal, y para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el mismo, y particularmente, en afecciones que comprometen la salud, relacionadas con el mismo. De acuerdo con la presente descripcion, el hecho de regular (controlar) el peso corporal puede referirse a reducir o incrementar el peso corporal, reducir o aumentar la velocidad de ganancia de peso, o aumentar o reducir la velocidad de perdida de peso, y tambien incluye mantener activamente, o no cambiar significativamente el peso corporal (por ejemplo, frente influencias externas o internas que de otra manera pueden aumentar o disminuir el peso corporal). Una realizacion de la presente descripcion se refiere a regular el peso corporal, administrando a un animal (por ejemplo, un ser humano) que necesita del mismo un polipeptido ActRII.
[00124] En una realizacion especlfica, la presente descripcion se refiere a procedimientos y compuestos para reducir el peso corporal y/o reducir la ganancia de peso en un animal, y mas particularmente, para tratar o mejorar la obesidad en pacientes en riesgo de o que padecen de obesidad. En otro casi especlfico, la presente descripcion se dirige a procedimientos y compuestos para tratar a un animal que no tiene la capacidad de ganar o retener peso (por ejemplo, un animal con slndrome de desgaste). Dichos procedimientos son eficaces para aumentar el peso y/o la masa corporal, o para reducir el peso y/o la perdida de masa, o para mejorar las afecciones asociadas con, u originadas por un peso y/o masa corporal indeseablemente bajo (por ejemplo no saludable).
[00125] En otras realizaciones, los polipeptidos ActRII en cuestion pueden usarse para formar composiciones farmaceuticas que pueden usarse de forma beneficiosa para prevenir, tratar o aliviar los slntomas de un huesped de enfermedades que implican neurodegeneracion. Sin desear quedar ligando a teorla alguna, los polipeptidos ActRII en cuestion pueden antagonizar el mecanismo de retroalimentacion inhibidor mediado a traves del receptor ALK7 de tipo I, permitiendo as! un nuevo crecimiento y diferenciacion neuronal. Los polipeptidos ActRII en cuestion como composiciones farmaceuticas pueden usarse para prevenir, tratar o aliviar los slntomas de enfermedades con neurodegeneracion, incluyendo enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y enfermedad de Huntington (EH).
[00126] La EA es un trastorno del sistema nervioso central (SNC) cronico, incurable e imparable que tiene lugar de forma gradual, dando como resultado perdida de memoria, comportamiento inusual, cambios en la personalidad y una disminucion de las capacidades cognitivas. Estas perdidas estan relacionadas con la muerte de tipos especlficos de celulas cerebrales y la ruptura de conexiones entre ellas. La EA se ha descrito como un desarrollo de la infancia a la inversa. En la mayorla de la gente con EA, los slntomas aparecen despues de la edad de 60. Los slntomas mas tempranos incluyen perdida de la memoria reciente, juicio defectuoso y cambios de la personalidad. Posteriormente en la enfermedad, aquellos con EA pueden olvidar como hacer tareas simples como lavarse las manos. Con el tiempo, las personas con EA pierden todas las capacidades de razonamiento y llegan a depender de otras personas para su cuidado diario. Finalmente, la enfermedad llega a ser tan debilitante que los pacientes quedan postrados en cama y tlpicamente desarrollan enfermedades coexistentes. Los pacientes con EA comunmente mueren por neumonla, de 8 a 20 anos desde la aparicion de la enfermedad.
[00127] La EP es un trastorno del SNC cronico, incurable e imparable que tiene lugar de forma gradual y da como resultado movimientos corporales incontrolados, rigidez, temblores y dificultades para caminar. Estos problemas en el sistema del motor estan relacionados con la muerte de celulas cerebrales en un area del cerebro que produce la dopamina, una sustancia qulmica que ayuda a controla la actividad muscular. En la mayor parte de la gente con EP, los slntomas aparecen despues de los 50 anos de edad. Los slntomas iniciales de la EP son un temblor pronunciado que afecta a las extremidades, notablemente en las manos o labios. Los slntomas caracterlsticos posteriores de la Ep son rigidez o lentitud de movimiento, caminar arrastrando los pies, postura encorvada y equilibrio deteriorado. Hay un amplio intervalo de slntomas secundarios tales como perdida de memoria, demencia, depresion, cambios emocionales, dificultades de deglucion, discurso anormal, disfuncion sexual y problemas de la vejiga y del intestino. Estos slntomas comenzaran a interferir con las actividades rutinarias, como sostener un tenedor o leer un periodico. Finalmente, personas con EP quedan tan profundamente incapacitadas que estan postrados en cama. Las personas con EP generalmente mueren de neumonla.
[00128] La ELA, tambien denominada enfermedad de Lou Gehrig (enfermedad de la neurona motora) es un trastorno del SNC cronico, incurable e imparable que ataca a las neuronas motoras, los componentes del SNC que conectan el cerebro a los musculos esqueleticos. En la ELA, las neuronas motoras se deterioran y con el tiempo mueren, y aunque el cerebro de las personas normalmente permanece completamente funcional y en alerta, la orden de moverse nunca llega a los musculos. La mayorla de las personas que tienen ELA tienen entre 40 y 70 anos de edad. Las primeras de las neuronas motoras que se debilitan son las que dirigen los brazos o las piernas. Aquellos con ELA pueden tener problemas para caminar, pueden dejar caer las cosas, se caen, articulan mal al hablar y rlen o lloran descontroladamente. Con el tiempo, los musculos de las extremidades comienzan a atrofiarse de desuso. Esta debilidad muscular se convertira en debilitante y una persona necesitara una silla de ruedas o sera incapaz de manejarse fuera de la cama. La mayorla de los pacientes con ELA mueren de insuficiencia respiratoria o de complicaciones de la asistencia ventilatoria como neumonla, 3-5 anos desde el inicio de la enfermedad.
[00129] Las causas de estas enfermedades neurologicas han permanecido en gran parte desconocidas. Convencionalmente se definen como enfermedades distintas, pero aun muestran claramente similitudes extraordinarias en los procesos basicos y comunmente demuestran slntomas solapantes mucho mayor de lo que pudiera esperarse solo por azar. Las definiciones de las enfermedades actuales no tratan adecuadamente el problema de la superposicion y se ha reclamado una nueva clasificacion de los trastornos neurodegenerativos.
[00130] La EH es otra enfermedad neurodegenerativa resultante de la degeneracion geneticamente programada de neuronas en ciertas areas del cerebro. Esta degeneracion causa movimientos incontrolados, perdida de las facultades intelectuales y trastornos emocionales. La EH es una enfermedad familiar, se transmite de padres a hijos a traves de una mutacion dominante en el gen de tipo natural. Algunos slntomas tempranos de la EH son cambios de humor, depresion, irritabilidad o problemas en la conduccion, al aprender cosas nuevas, al recordar un hecho o al tomar una decision. Segun la enfermedad avanza, la concentracion en tareas intelectuales se hace cada vez mas diflcil y el paciente puede tener dificultad para alimentarse y en la deglucion. La tasa de progresion de la enfermedad y la edad de inicio varlan de persona a persona.
[00131] La enfermedad de Tay-Sachs y la enfermedad de Sandhoff son enfermedades por el almacenamiento de glucollpidos causadas por la falta de p-hexosaminidasa lisosomal (Gravel y col., in The Metabolic Basis of Inherited Disease, eds. Scriver y col., McGraw-Hill, Nueva York, pags. 2839-2879, 1995). En ambos trastornos, la gangliosida GM2 y los sustratos glucolipldicos relacionados para p-hexosaminidasa se acumulan en el sistema nervioso y desencadenan una neurodegeneracion aguda. En las formas mas graves, el inicio de los slntomas comienza en la infancia temprana. Entonces sobreviene una etapa neurodegenerativa estrepitosa, mostrando los ninos afectados disfuncion motora, convulsiones, perdida visual y sordera. La muerte ocurre generalmente a los 2-5 anos de edad. Se ha demostrado la perdida neuronal a traves de un mecanismo de apoptosis (Huang y col., Hum. Mol. Genet. 6: 1879-1885, 1997).
[00132] Es bien sabido que la apoptosis tiene una funcion en la patogenesis del SIDA en el sistema inmunologico. Sin embargo, el VIH-1 tambien induce enfermedad neurologica. Shi y col. (J. Clin. Invest. 98: 1979-1990, 1996) examinaron la apoptosis inducida por la infeccion por el VIH de los sistema de nervioso central (SNC) en un modelo in vitro y en el tejido cerebral de pacientes con SIDA, y descubrieron que la infeccion por VIH-1 de cultivos cerebrales primarios inducla apoptosis en neuronas y astrocitos in vitro. La apoptosis de neuronas y astrocitos tambien se detecto en el tejido cerebral de 10/11 pacientes con SIDA, incluyendo 5/5 pacientes con demencia por VIH-1 y 4/5 pacientes sin demencia.
[00133] La perdida neuronal es tambien una caracterlstica saliente de enfermedades prionicas, tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, la EEB en el ganado bovino (enfermedad de las vacas locas), enfermedad de Scrapie en ovejas y cabras y encefalopatla espongiforme felina (EEF) en gatos.
[00134] Los polipeptidos ActRII en cuestion son tambien utiles para prevenir, tratar y aliviar los slntomas de diversos trastornos del SNP, tales como los descritos a continuacion. El SNP esta compuesto por los nervios que conducen a o se ramifican desde el SNC. Los nervios perifericos manejan una gran variedad de funciones en el cuerpo, incluyendo las funciones sensoriales, motoras y autonomicas. Cuando un individuo tiene una neuropatla periferica, se han danado los nervios del SNP. El dano al nervio puede surgir de una serie de causas, tales como enfermedad, lesiones flsicas, envenenamiento o desnutricion. Estos agentes pueden afectar a los nervios aferentes o eferentes. Dependiendo de la causa del dano, el axon de la celula del nervio, su vaina protectora de la mielina, o ambos pueden lesionarse o destruirse.
[00135] La expresion "neuropatla periferica" incluye una amplia diversidad de trastornos en los que los nervios fuera del cerebro y los nervios perifericos de la medula espinal se han danado. La neuropatla periferica tambien puede referirse a neuritis periferica, o si estan involucrados muchos nervios, pueden utilizarse los terminos polineuropatla o polineuritis.
[00136] La neuropatla periferica es un desorden generalizado, y hay muchas causas subyacentes. Algunas de estas causas son comunes, como la diabetes, y otras son extremadamente raras, como el envenenamiento con acrilamida y ciertos trastornos hereditarios. La causa mas comun en todo el mundo de la neuropatla periferica es la lepra. La lepra es causada por la bacteria Mycobacterium leprae, que ataca los nervios perifericos de las personas afectadas. Segun las estadlsticas recogidas por la Organizacion Mundial de la Salud, 1,15 millones de personas estimadas en todo el mundo tienen lepra.
[00137] La lepra es extremadamente rara en los Estados Unidos, donde la diabetes es la causa mas comunmente conocida de la neuropatla periferica. Se ha estimado que mas de 17 millones de personas en los Estados Unidos y Europa tienen polineuropatla relacionadas con la diabetes. Muchas neuropatlas son idiopaticas, no puede encontrarse una causa conocida. La mas comun de las neuropatlas perifericas hereditarias en los Estados Unidos es la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, que afecta a aproximadamente 125.000 personas.
[00138] Otra de las neuropatlas perifericas mas conocidas es el slndrome de Guillain-Barre, que surge de las complicaciones asociadas con enfermedades virales, como citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), o una infeccion bacteriana, incluyendo Campylobacter jejuni y enfermedad de Lyme. La tasa de incidencia en todo el mundo es aproximadamente 1,7 casos por cada 100.000 personas anualmente. Otras causas conocidas de neuropatlas perifericas incluyen el alcoholismo cronico, infeccion del virus de la varicela zoster, botulismo y poliomielitis. La neuropatla periferica puede desarrollarse como un slntoma primario, o puede deberse a otra enfermedad. Por ejemplo, la neuropatla periferica es unicamente un slntoma de enfermedades tales como la neuropatla amiloide, ciertos tipos de cancer, o trastornos neurologicos hereditarios. Dichas enfermedades pueden afectar al sistema nervioso periferico (SNP) y el sistema nervioso central (SNC), as! como a otros tejidos del cuerpo.
[00139] Otras enfermedades del SNP tratables con los polipeptidos ActRII en cuestion incluyen: Neuropatlas del plexo braquial (enfermedades de las cervicales y primeras ralces toracicas, troncos del nervio, cordones y componentes perifericos del nervio del plexo braquial. Las manifestaciones cllnicas incluyen dolor regional, parestesia; debilidad muscular y disminucion de la sensibilidad en la extremidad superior. Estos trastornos pueden estar asociados con un trauma, incluyendo lesiones del nacimiento; slndrome de salida toracica; neoplasias, neuritis, radioterapia; y otras afecciones. Vease, Adams y col., Principles of Neurology, 6a ed., pags. 1351-2); Neuropatlas Diabeticas (trastornos del nervio perifericos, autonomicos y craneales que estan asociados con la diabetes mellitus). Estas afecciones suelen resultar de una lesion microvascular diabetica que involucra los vasos sangulneos pequenos que irrigan los nervios (vasa nervorum). La afecciones relativamente comunes que pueden estar asociadas con la neuropatla diabetica incluyen paralisis del tercer nervio; mononeuropatla; mononeuropatla multiple; amiotrofia diabetica; una polineuropatla dolorosa; neuropatla autonomica; y neuropatla toracoabdominal (vease Adams y col., Principles of Neurology, 6a ed., pag. 1325); mononeuropatlas (enfermedad o trauma que involucra a un solo nervio periferico en el aislamiento, o fuera de proporcion con evidencia de disfuncion del nervio periferico difuso). La mononeuropatla multiple se refiere a una afeccion caracterizada por multiples lesiones nerviosas aisladas. La mononeuropatlas pueden resultar de una variedad de causas, incluyendo isquemia; lesion traumatica; compresion; enfermedades del tejido conectivo; trastornos traumaticos acumulativos; y otras afecciones); Neuralgia (dolor intenso o dolor punzante que ocurre a lo largo del recorrido o la distribucion de un nervio periferico o craneal); Neoplasias del sistema nervioso periferico (neoplasias que se presentan en el tejido nervioso periferico. Esto incluye neurofibromas; Schwannomas; tumores de celulas granulares; y tumores de la vaina del nervio periferico malignos. Vease, DeVita Jr y col., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 5a ed., pags. 1750-1); Slndromes de compresion nerviosa (compresion mecanica de los nervios o ralces nerviosas por causas internas o externas.
Pueden producirse en un bloque de la conduccion de los impulsos nerviosos, debido, por ejemplo, a la disfuncion de la vaina de mielina, o la perdida axonal. Las lesiones del nervio y de la vaina del nervio pueden causarse por isquemia; inflamacion; un efecto mecanico directo; o Neuritis (un termino general que indica la inflamacion de un nervio craneal o periferico). La manifestacion cllnica puede incluir dolor; parestesias; paresia; o hipertesia; Polineuropatlas (enfermedades de los nervios perifericos multiples). Las diversas formas se clasifican por el tipo de nervio afectado (por ejemplo, sensorial, motor o autonomico), por la distribution de la lesion del nervio (por ejemplo, distal frente a proximal), por el componente del nervio afectado principalmente (por ejemplo, desmielinizante frente a axonal), por etiologla, o por el patron de herencia.
7. Composiciones farmaceuticas
[00140] En ciertos casos, los compuestos (por ejemplo, polipeptidos ActRII) de la presente description se formulan con un transportador farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, un polipeptido ActRII puede administrarse solo o como un componente de una formulation farmaceutica (composition terapeutica). Los compuestos en cuestion pueden formularse para su administration en cualquier forma conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria.
[00141] En ciertos casos, el procedimiento terapeutico de la descripcion incluye administrar la composicion por via topica, sistemica o local en forma de un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composicion terapeutica para su uso en esta descripcion, por supuesto, es una forma fisiologicamente aceptable, libre de pirogenos. Adicionalmente, la composicion puede encapsularse o inyectarse de forma deseada en una forma viscosa para la administracion a un sitio de tejido diana (por ejemplo, hueso, cartllago, musculo, grasa o neuronas), por ejemplo, un sitio que tiene un dano tisular. La administracion topica puede ser adecuada para curar heridas y reparar tejidos. Agentes terapeuticamente utiles distintos de los polipeptidos ActRII, que tambien pueden incluirse opcionalmente en la composicion como se ha descrito anteriormente, pueden, como alternativa o adicionalmente, administrarse de forma simultanea o secuencial con los compuestos en cuestion (por ejemplo polipeptidos ActRII) en los procedimientos de la descripcion.
[00142] En ciertos casos, las composiciones de la presente descripcion pueden incluir una matriz con la capacidad de suministrar uno o mas compuestos terapeuticos (por ejemplo, polipeptidos ActRII) a un sitio de tejido diana (por ejemplo, hueso, cartllago, musculo, grasa o neuronas), proporcionar una estructura para el desarrollo tisular y la capacidad optima de ser reabsorbida en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar una liberation lenta de los polipeptidos ActRII. Dichas matrices pueden formarse de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones medicas implantadas.
[00143] La election del material de matriz se basa en propiedades de biocompatibilidad, biodegradabilidad, mecanicas, apariencia cosmetica y propiedades de interfase. La aplicacion particular de las composiciones en cuestion definiran la formulacion adecuada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato calcico biodegradable y qulmicamente definido, tricalciofosfato, hidroxiapatita, acido polilactico y polianhldridos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biologicamente bien definidos, tal como colageno oseo o dermico. Las matrices adicionales pueden estar constituidas por protelnas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y qulmicamente definidas, tal como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras ceramicas. Las matrices pueden estar comprendidas de combinaciones de cualesquiera de los tipos de material que se han mencionado anteriormente, tales como acido polilactico e hidroxiapatita, o colageno y tricalciofosfato. Las bioceramicas pueden alterarse en su composicion, tal como en calcio-aluminato-fosfato y procesarse para alterar el tamano del poro, tamano de partlcula, forma de la partlcula y la biodegradabilidad.
[00144] En ciertas realizaciones, los procedimientos de la descripcion se pueden administrar por via oral, por ejemplo en forma de capsulas, sobres, plldoras, comprimidos, grajeas (usando una base con sabor, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, granulos o como una solution o una suspension en un llquido acuoso o no acuoso, o como una emulsion llquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia), y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un agente en forma de un ingrediente activo. Un agente tambien se puede administrar en forma de un bolo, compresa o pasta.
[00145] En formas de dosificacion solidas para administracion oral (por ejemplo capsulas, comprimidos, plldoras, grageas, polvos, granulos, y similares) se pueden mezclar uno o mas compuestos terapeuticos de la presente descripcion con uno o mas transportadores farmaceuticamente aceptables, tales como citrato sodico o fosfato dicalcico y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o acido silicico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agaragar, carbonato calcico, almidon de patata o tapioca, acido alginico, ciertos silicatos y carbonato sodico; (5) agentes retardantes de la solucion, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetilico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolina y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato calcico, estearato magnesico, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato sodico, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de capsulas, comprimidos y pildoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones solidas de un tipo similar tambien pueden emplearse como cargas en capsulas de gelatina de relleno blando o duro usando excipientes tales como lactosa o azucares de leche, asi como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
[00146] Las formas de dosificacion liquidas para administracion oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del ingrediente activo, las formas de dosificacion Kquidas pueden contener diluyentes inertes comunmente usados en la tecnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etilico, alcohol isopropilico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencilico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, semilla de algodon, nuez, maiz, germen, oliva, ricino y de sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfunlico, polietilenglicoles y esteres de acido graso de sorbitan y mezclas de los mismos. Ademas de los diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, agentes edulcorantes, saporiferos, colorantes, perfumantes y conservantes.
[00147] Las suspensiones, ademas de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspension tales como alcoholes isoestearilicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto y mezclas de los mismos.
[00148] Ciertas composiciones descritas en este documento se pueden administrar por via topica, ya sea a la piel o a las membranas mucosas. Las formulaciones topicas pueden incluir adicionalmente una o mas de una amplia variedad de agentes que se sabe que son eficaces conocidos como potenciadores de la penetracion en la piel o estratocorneos. Los ejemplos de estos son 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, propilenglicol, alcohol metilico o isopropilico, sulfoxido de dimetilo y azona. Los agentes adicionales pueden incluirse adicionalmente para hacer la formulacion cosmeticamente aceptable. Los ejemplos de estos son grasas, ceras, aceites, tintas, fragancias, agentes conservantes, estabilizantes y de superficie activa. Tambien pueden incluirse agentes queratoliticos, tales como los conocidos en la tecnica. Los ejemplos son acido salicilico y azufre.
[00149] Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica incluyen polvos, pulverizadores, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones esteriles con un transportador farmaceuticamente aceptable y con cualesquier conservante, tamponante o propulsor que pueda requerirse. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas del compuesto en cuestion de la descripcion (por ejemplo, un polipeptido ActRII), excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silicico, talco y oxido de zinc, o mezclas de los mismos.
[00150] Los polvos y pulverizadores pueden contener, ademas de un compuesto en cuestion, excipientes tales como lactosa, talco, acido silicico, hidroxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas substancias. Los pulverizadores pueden contener adicionalmente los propulsores habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volatiles sin sustituir, tales como butano y propano.
[00151] En ciertos casos, las composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion parenteral pueden comprender uno o mas polipeptidos ActRII en combinacion con una o mas soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotonicas, esteriles o polvos esteriles farmaceuticamente aceptables que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, solutos que convierten a la formulacion en isotonica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspension o espesantes. Los ejemplos de transportadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la descripcion incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, a traves del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersiones, y a traves del uso de tensioactivos.
[00152] Las composiciones de la descripcion tambien pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la accion de los microorganismos puede asegurarse mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido sorbico de fenol y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro sodico y similares en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceuticamente inyectable puede proporcionarse a traves de la inclusion de agentes, que retardan la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
[00153] Se entendera que el regimen de dosificacion se determinara por el especialista en cuestion, considerando diversos factores que modifiquen la accion de los polipeptidos en cuestion de la descripcion (por ejemplo, polipeptidos ActRII). Los diversos factores incluyen, pero sin limitacion, la cantidad de peso oseo deseado que se formara, el sitio de lesion del hueso, la afeccion del hueso danado, el tamano de una herida, el tipo de tejido danado, la edad, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infeccion, el tiempo de administracion y otros factores cllnicos. Opcionalmente, la dosificacion puede variar con el tipo de matriz usada en la reconstitucion y los tipos de compuestos en la composicion. La adicion de otros factores de crecimiento conocidos a la composition final tambien puede afectar a la dosificacion. El progreso puede supervisarse mediante evaluation periodica del crecimiento y/o reparation del hueso, por ejemplo, mediante rayos X, determinaciones histomorfometricas y etiquetado de tetraciclina.
[00154] En ciertos casos de la descripcion, pueden administrarse uno o mas polipeptidos ActRII, juntos (en forma simultanea) o en diferentes momentos (secuencialmente o solapante). Ademas, los polipeptidos ActRII pueden administrarse con otro tipo de agentes terapeuticos, por ejemplo, un agente inductor del cartllago, un agente inductor de los huesos, un agente inductor de los musculos, un agente reductor de la grasa o un agente inductor de las neuronas. Los dos tipos de compuestos se pueden administrar de forma simultanea o en diferentes momentos. Se espera que los polipeptidos ActRII de la descripcion puedan actuar junto con o posiblemente, de forma sinergica con otro agente terapeutico.
[00155] En un ejemplo especlfico, se han descrito una diversidad de factores osteogenicos, que inducen cartllagos y que inducen huesos, particularmente bisfosfonatos. Vease, por ejemplo las Solicitudes de Patente Europeas N° 148.155 y 169.016. Por ejemplo, otros factores que pueden combinarse con los polipeptidos ActRII en cuestion incluyen diversos factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes (TGF-a y TGF-b) y factor de crecimiento insullnico (IGF).
[00156] En ciertos casos, la presente descripcion tambien proporciona terapia genetica para la production in vivo de polipeptidos ActRII. Dicha terapia puede lograr su efecto terapeutico mediante la introduction de las secuencias de polinucleotido ActRII en celulas y tejidos que tienen los trastornos que se han descrito anteriormente. La administracion de las secuencias de polinucleotido ActRII puede lograrse utilizando un vector de expresion recombinante, tal como un virus quimerico o un sistema de dispersion coloidal. Se prefiere para la administracion terapeutica de secuencias de polinucleotido ActRII el uso de liposomas dirigidos.
[00157] Los diversos vectores vlricos que se pueden usar para terapia genica, como se muestra en este documento, incluyen adenovirus, herpes virus, vacunas o preferiblemente un virus de ARN, tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que puede insertarse un solo gen extrano incluyen, pero sin limitacion: virus de leucemia de murino Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma de murido Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario de murino (MuMTV), y Virus de Sarcoma de Rous (RSV). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incorporar multiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que las celulas transducidas puedan identificarse y generarse. Los vectores retrovirales pueden hacerse especlficos de la diana uniendo, por ejemplo, un azucar, un glucollpido o una protelna. La direction preferida se realiza usando un anticuerpo. Los expertos en la tecnica reconoceran que las secuencias polinucleotldicas especlficas pueden insertarse en el genoma retroviral o adherirse a una envoltura viral para permitir la administracion especlfica diana del vector retroviral que contiene el polinucleotido ActRII. En un caso preferido, el vector se dirige a celulas/tejidos de huesos, cartllagos, musculos o neuronas.
[00158] Como alternativa, las celulas de cultivo de tejidos pueden transfectarse directamente con plasmidos que codifican los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, mediante transfeccion de fosfato calcico convencional. Despues, estas celulas se transfectan con el plasmido de vector que contiene los genes de interes. Las celulas resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo.
[00159] Otro sistema de administration dirigido para polinucleotidos ActRII es un sistema de dispersion coloidal. Los sistemas de dispersion coloidal incluyen complejos de macromolecula, nanocapsulas, microesferas, perlas, un sistema a base de llpidos que incluye emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta description es un liposoma. Los liposomas son veslculas de membrana artificial que son utiles como vehlculos de administracion in vitro e in vivo. El ARN, ADN y los viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso y pueden administrarse a las celulas en una forma biologicamente activa (vease, por ejemplo, Fraley, y col., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Se conocen en la tecnica procedimientos para transferir genes de forma eficaz usando un vehlculo de liposoma, vease, por ejemplo, Mannino, y col., Biotechniques, 6: 682, 1988. La composition del liposoma normalmente es una combination de fosfollpidos, normalmente en combinacion con esteroides, especialmente colesterol. Tambien pueden usarse otros fosfollpidos u otros llpidos. Las caracterlsticas flsicas de los liposomas dependen del pH, la resistencia ionica y la presencia de cationes divalentes.
[00160] Los ejemplos de llpidos utiles en la production de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tal como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingollpidos, cerebrosidas y gangliosidas. Los fosfollpidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. La direction de los liposomas tambien es posible en base, por ejemplo, a la especificidad del organo, especificidad de las celulas y la especificidad del organelo y se conoce en la tecnica.
EJEMPLIFICACION
[00161] La presente invention se entendera mas facilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente con fines de ilustracion de ciertas realizaciones y realizaciones de la presente invencion.
Ejemplo 1. Generation de mutantes ActRIIB:
[00162] Los Solicitantes generaron una serie de mutaciones en el dominio extracelular de ActRIIB y produjeron estas protelnas mutantes como protelnas de fusion solubles entre ActRIIB extracelular y un dominio Fc. Una estructura co-cristalina de Activina y ActRIIB extracelular no mostro ninguna funcion para los 15 aminoacidos finales (C-terminal) (denominados como la "cola" en este documento) del dominio extracelular en la union a ligando. Esta secuencia no pudo resolver la estructura cristalina, sugiriendo que estos residuos estan presentes en un bucle flexible que no se empaqueto de forma uniforme en el cristal. Thompson y col. EMBO J. 1 de abril de 2003; 22(7): 1555-66. Esta secuencia tambien esta debilmente conservada entre ActRIIB y ActRIIA. Por consiguiente, estos residuos se omitieron en la construction de la fusion ActRIIB-Fc basica, o antecedente. Adicionalmente, la position 64 en la forma antecedente esta ocupada por una alanina, que se considera generalmente la forma "de tipo natural", aunque un alelo A64R aparece de forma natural. Por lo tanto, la fusion ActRIIB-Fc antecedente tiene la secuencia (portion Fc subrayada) (SeQ ID NO: 14):
Figure imgf000031_0001
[00163] De forma sorprendente, como se analiza a continuation, se descubrio que la cola C-terminal mejoraba la union a activina y GDF-11, asl, una version preferida de ActRIIB-Fc tiene una secuencia (porcion Fc subrayada) (SEQ ID NO:15):
Figure imgf000032_0001
[00164] Se introdujeron diversas mutaciones en la protelna ActRIIB-Fc antecedente. Se generaron mutaciones en el dominio extracelular ActRIIB mediante mutagenesis por PCR. Despues del analisis por PCR, los fragmentos se purificaron a traves de una columna Qiagen, se digirieron con Sfol y Agel y se purificaron con. Estos fragmentos se ligaron en un vector de expresion pAID4 de modo que tras la ligadura, se creo la quimera de fusion con IgG1 humano. Tras la transformacion en E. coli DH5 alfa, las colonias se recolectaron y se aislaron los ADN. Todos los mutantes se verificaron por secuencia.
[00165] Todos los mutantes se produjeron en celulas HEK293T mediante transfeccion temporal. En resumen, en una rueda giratoria de 500 ml, se ajustaron celulas HEK293T en 6 x 105 celulas/ml en un medio Freestyle (Invitrogen) en un volumen de 250 ml y crecieron durante una noche. Al siguiente dla, estas celulas se trataron con complejo de ADN:PEI (1:1) a una concentration final de ADN de 0,5 ug/ml. Despues de 4 horas, se anadieron 250 ml de medio y las celulas crecieron durante 7 dlas. El medio acondicionado se recolecto mediante giros de las celulas y se concentro.
[00166] Todos los mutantes se purificaron sobre una columna de protelna A y se eluyeron con tampon de glicina de pH bajo (3,0). Despues de la neutralization, se dializaron frente a PBS.
[00167] Los mutantes tambien se produjeron en celulas CHO mediante metodologla similar.
[00168] Los mutantes se ensayaron en ensayos y/o bioensayos de union que se describen a continuation. Las protelnas expresadas en celulas CHO y celulas HEK293 eran indistinguibles en los ensayos y bioensayos de union. Ejemplo 2. Union de GDF-11 y Activina A
[00169] La union de protelnas ActRIIB-Fc se ensayo en un ensayo BiaCore™.
[00170] Se inmovilizaron GDF-11 o Activina A ("ActA") en un chip BiaCore CM5 usando un procedimiento de acoplamiento amina convencional. El mutante ActRIIB-Fc o la protelna de tipo natural se cargo en el sistema, y la union se midio. Los resultados se resumen en la Tabla 1 que se muestra a continuacion.
Tabla 1: Union de ActRIIB-Fc soluble a GDF11 y Activina A (ensayo BiaCore).
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[00171] Como se muestra en la Tabla 1, las mutaciones tenlan efectos variables en la union a ligando. La adicion de los 15 aminoacidos C-terminales del dominio extracelular provoco un aumento sustancial en la afinidad de union tanto para Activina A como para GDF-11, y se espera que este efecto se traslado a basicamente todas las demas mutaciones. Otras mutaciones provocaron un aumento general en la afinidad de union a ligando, incluyendo el alelo A64R y K74A de origen natural. La mutacion R40A provoco un descenso moderado en la afinidad de union tanto para Activina A como para GDF-11. Muchas mutaciones suprimieron la union detectable a Activina A y GDF-11, incluyendo: E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M y D80N. Ciertas mutaciones provocaron un desplazamiento en la selectividad. Las siguientes mutaciones provocaron un aumento en la proporcion de GDF-11 para la union a Activina A: K74Y, K74F, K74I y D80I. Las siguientes mutaciones provocaron un descenso en la proporcion de GDF-11 para la union a Activina A: D54A, K55A, L79A y F82A.
Ejemplo 3. Bioensayo de senalizacion mediada por GDF-11 y Activina
[00172] Se uso un ensayo de Gen Informador A-204 para evaluar los efectos de las proteinas ActRIIB-Fc en la senalizacion mediante GDF-11 y Activina A. Linea celular: Rabdomiosarcoma humano (derivado de musculo). Vector informador: pGL3(CAGA)12 (Descrito en Dennler y col., 1998, EMBO 17: 3091-3100). Vease la figura 5. El motivo CAGA12 esta presente en genes que responden a TGF-Beta (gen PAI-1), de modo que este vector es de uso general para factores de senalizacion a traves de Smad2 y 3.
[00173] Dia 1: Division de celulas A-204 en placa de 48 pocillos.
[00174] Dia 2: Celulas A-204 transfectadas con 10 ug de pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAG A)12 (10 ug) pRLCMV (1 ug) y Fugene.
[00175] Dia 3: Anadir factores (diluidos en un medio BSA al 0,1%). Los inhibidores necesitan incubarse previamente con Factores durante 1 hora antes de anadirse a las celulas. 6 horas despues, las celulas se aclaran con PBS y se lisan las celulas.
[00176] Esto esta seguido de un ensayo de luciferasa. En la ausencia de cualesquier inhibidor, la Activina A mostro una estimulacion de 10 veces mas de la expresion del gen informador y un ED50 ~2 ng/ml. GDF-11: estimulacion 16 veces mayor, ED50: ~1,5 ng/ml.
[00177] Como se muestra en la figura 16, ActRIIB-Fc de tipo natural (A64 antecedente) inhibe la senalizacion de GDF-11 en el Ensayo del Gen Informador A-204. La construccion A64 antecedente mostro un efecto inhibidor sobre la actividad de GDF-11. La mutacion A64K (tambien una forma de origen natural) provoco un aumento sustancial en la inhibicion de GDF-11, y una combinacion de la mutacion A64K con la adicion de los 15 aminoacidos C-terminales del dominio extracelular (la "cola" de 15 aminoacidos) produjo un inhibidor incluso mas potente de la actividad de GDF-11. Como se muestra en la figura 17, la construccion A64 antecedente mostro un efecto inhibidor sobre la actividad de la Activina A. La mutacion K74A provoco un aumento sustancial en la inhibicion de la Activina A. Una muestra de control que carecia de Activina A no mostro ninguna actividad.
[00178] Estos datos del sistema de bioensayo se correlacionan bien con los ensayos de union mostrados en la Tabla 1 y demuestran que los efectos de las diversas mutaciones se trasladan a un sistema biologico.
Ejemplo 4: Proteinas de Fusion ActRIIA-Fc
[00179] Como se muestra en la figura 14, ActRIIA y ActRIIB estan altamente conservados. Por consiguiente, se espera que la mayor parte de las mutaciones ensayadas en ActRIIB tengan efectos similares en ActRIIA. Por lo tanto, una fusion ActRIIA-Fc antecedente puede construirse con la siguiente secuencia (porcion Fc subrayada) (SEQ ID NO: 16):
AILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQ
GCWLDDrNCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMGGGTHTCPPCPA
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPRE
POVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENrNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOK.SLSLSPGK
[00180] Como se analiza a continuacion, se descubrio que la cola C-terminal mejoraba la union a activina y GDF-11, por lo tanto, una version preferida de ActRIIA-Fc tiene una secuencia (porcion Fc subrayada) (SEQ ID NO: 17):
AILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQ
GCWLDDrNCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTP
KPPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKAL
PVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGO
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALKNHYTOKSLS
LSPGK
[00181] Pueden hacerse mutaciones adicionales, que corresponden a las hechas en ActRIIB, en la version antecedente de ActRIIA o la version "cola" de ActRIIA. La correspondencia entre las mutaciones ActRIIB y ActRIIA se muestra en la Tabla 2 que se indica a continuacion.
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[0182] Aunque se han descrito realizaciones especlficas de materia de la invention, la memoria anterior es ilustrativa y no limitativa. Muchas variaciones seran evidentes para los expertos en la materia tras la revision de la presente memoria y las reivindicaciones siguientes. El alcance completo de la invencion debe determinarse en referencia a las reivindicaciones.
[0183] La presente description se definira adicionalmente mediante las siguientes clausulas numeradas
1. Una preparation farmaceutica para tratar un trastorno asociado con ActRII, que comprende:
a) un polipeptido ActRII soluble; y
b) un portador farmaceuticamente aceptable.
2. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
en la que dicho polipeptido ActRII soluble tiene una o mas de las siguientes caracterlsticas:
i) se une a un ligando de ActRII con una Kd de al menos 10-5 M; y
ii) inhibe la serialization de ActRII en una celula.
3. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 2, en la que el ligando de ActRII se selecciona del grupo que consiste en: activina, BMP7, GDF8, GDF11 y Nodal.
4. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en: un polipeptido ActRIIA soluble y un polipeptido ActRIIA soluble.
5. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que el polipeptido ActRII soluble comprende una mutation en la SEQ ID NO: 1 o 2.
6. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 5, en la que la mutacion altera la union de un ligando de ActRII al polipeptido ActRII soluble.
7. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 6, en la que el residuo de aminoacidos Asp en la position 62 de la SEQ Id NO: 2 se muta a un residuo de aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: un aminoacido no cargado, un aminoacido negativo y un aminoacido hidrofobo.
8. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que el polipeptido ActRII soluble es una protelna de fusion que incluye, ademas de un dominio de polipeptido ActRII, una o mas partes de polipeptido que aumentan una o mas entre estabilidad in vivo, semivida in vivo, captacion/administracion, localization o distribucion tisular, formation de complejos de protelnas y/o purification.
9. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 8, en la que dicha protelna de fusion incluye una parte de polipeptido seleccionada del grupo que consiste en: un dominio Fc de inmunoglobulina y una albumina de suero.
10. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 8, en la que dicha protelna de fusion incluye una subsecuencia de purificacion seleccionada entre: una etiqueta epitopica, una etiqueta FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusion de GST.
11. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que dicho polipeptido ActRII soluble incluye uno o mas residuos de aminoacido modificados seleccionadas entre: un aminoacido glicosilado, un aminoacido PEGilado, un aminoacido farnesilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado, un aminoacido conjugado a un grupo lipldico, y un aminoacido conjugado a un agente de derivacion organico.
12. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que dicha preparacion esta sustancialmente libre de pirogenos.
13. La preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, en la que el polipeptido ActRII soluble se une a un ligando de ActRII con una Kd de menos de 1 micromolar.
14. Un producto farmaceutico envasado que comprende una preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, y que esta etiquetada para utilizar en la induction del crecimiento de un tejido o la disminucion o prevention de la perdida de tejido en un ser humano, en el que el tejido se selecciona del grupo que consiste en: hueso, cartllago, musculo, grasa y neurona.
15. un producto farmaceutico envasado que comprende una preparacion farmaceutica, segun la clausula 1, y que esta etiquetada para utilizar en la induccion del crecimiento de un tejido o la disminucion o prevencion de la perdida de tejido en un ser no humano, en el que el tejido se selecciona del grupo que consiste en: hueso, cartllago, musculo, grasa y neurona.
16. Un polipeptido ActRII estabilizado que comprende: un polipeptido ActRII soluble y una segunda parte que comprende un dominio estabilizante.
17. El polipeptido ActRII estabilizado, segun la clausula 16, en el que la segunda parte es un polipeptido fusionado covalentemente al polipeptido ActRII soluble.
18. El polipeptido ActRII estabilizado, segun la clausula 17, en el que la segunda parte es un polipeptido fusionado al extremo carboxilo del polipeptido ActRII soluble.
19. El polipeptido ActRII estabilizado, segun la clausula 17, en el que la segunda parte se selecciona del grupo que consiste en: albumina de suero y un dominio Fc de IgG.
20. El polipeptido ActRII estabilizado, segun la clausula 17, en el que la segunda parte es un grupo que no es aminoacido.
21. El polipeptido ActRII estabilizado, segun la clausula 17, en el que la segunda parte es comprende polietilenglicol.
22. Un polinucleotido aislado que comprende una secuencia codificante para una polipeptido ActRII soluble seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
en el que dicho polipeptido ActRII soluble tiene una o mas de las siguientes caracterlsticas:
i) se une a un ligando de ActRII con una Kd de al menos 10-5 M; y
ii) inhibe la serialization de ActRII en una celula.
23. Un polinucleotido aislado, que comprende:
a) una secuencia que codifica un polipeptido AcTRII;
b) un codon de parada; y
c) una secuencia que es identica al menos en un 90% con una secuencia que codifica un polipeptido ActRII; en el que el codon de parada se encuentra entre la secuencia de (a) y la secuencia de (c) o dentro de la secuencia de (c).
24. Un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de polinucleotidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 7 y 8, comprendiendo adicionalmente dicho polinucleotido aislado un codon de termination de la transcription no natural al menos seiscientos nucleotidos antes del extremo 3'.
25. Un polinucleotido recombinante que comprende una secuencia promotora unida operativamente a un polinucleotido segun las clausulas 22, 23 o 24.
26. Una celula transformada con un polinucleotido recombinante segun la clausula 25.
27. La celula, segun la clausula 26, en la que la celula es una celula de mamlfero.
28. La celula, segun la clausula 27, en la que la celula es una celula humana.
29. Un procedimiento de fabricacion de un polipeptido ActRII soluble, que comprende:
a) cultivar una celula en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido ActRII soluble, en el que dicha celula se transforma con un polinucleotido recombinante segun la clausula 25; y
b) recuperar el polipeptido ActRII soluble expresado de este modo.
30. Un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado con la perdida de musculo o el crecimiento insuficiente de musculo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
31. El procedimiento, segun la clausula 30, en el que el sujeto presenta atrofia muscular.
32. El procedimiento, segun la clausula 30, en el que el sujeto presenta distrofia muscular.
33. El procedimiento, segun la clausula 30, en el que el sujeto presenta ALS.
34. El procedimiento, segun la clausula 30, en el que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
d) un polipeptido ActRII estabilizado.
35. El procedimiento, segun la clausula 30, en el que el trastorno es un trastorno de desgaste muscular.
36. El procedimiento, segun la clausula 35, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en caquexia, anorexia, slndrome DMD, slndrome BMD, slndrome de desgaste por SIDA, distrofias musculares, enfermedades neuromusculares, enfermedades de neurona motora, enfermedades de la union neuromuscular y miopatlas inflamatorias.
37. El procedimiento, segun la clausula 35, en el que el polipeptido ActRII soluble presenta una o mas de las siguientes caracterlsticas:
i) se une a un ligando de ActRII con una Kd de al menos 10-5 M; y
ii) inhibe la senalizacion de ActRII en una celula.
38. Un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado con la neurodegeneracion, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
39. El procedimiento, segun la clausula 38, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD), esclerosis lateral amiotrofica (ALS), enfermedad de Huntington (HD).
40. El procedimiento, segun la clausula 38, en el que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
d) un polipeptido ActRII estabilizado.
41. Un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado con el crecimiento y la diferenciacion anormal de celulas, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
42. El procedimiento, segun la clausula 41, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en inflamacion, alergia, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y tumores.
43. El procedimiento, segun la clausula 41, en el que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
d) un polipeptido ActRII estabilizado.
44. Un procedimiento para incrementar el crecimiento de un tejido o disminuir la perdida de un tejido en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble suficiente para incrementar el crecimiento del tejido o disminuir la perdida del tejido, en el que el tejido se selecciona del grupo que consiste en: hueso, cartllago, musculo, grasa y neurona.
45. El procedimiento, segun la clausula 44, en el que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
d) un polipeptido ActRII estabilizado.
46. Un procedimiento para disminuir el contenido de grasa corporal o reducir la velocidad de incremento del contenido de grasa corporal en un sujeto, que comprende administrar al sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
47. Un procedimiento para el tratamiento de un trastorno asociado con la ganancia indeseable de peso corporal en un sujeto, que comprende administrar al sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
48. El procedimiento, segun la clausula 47, en el que dicho trastorno se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), enfermedad cardiovascular, cancer, hipertension, osteoartritis, ictus, problemas respiratorios y enfermedad de la veslcula biliar.
49. El procedimiento, segun la clausula 46 o 47, en el que el polipeptido ActRII soluble se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos identica al menos en un 90% con una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12; y
c) un polipeptido que comprende al menos 10 aminoacidos consecutivos seleccionado entre las SEQ ID Nos: 1-2 y 9-12,
d) un polipeptido ActRII estabilizado.
50. Un procedimiento para identificar un agente que estimula el crecimiento de un tejido selecciona del grupo que consiste en: hueso, cartllago, musculo, grasa y neurona, que comprende
a) identificar un agente de prueba que se une a un dominio de union a ligando de un polipeptido ActRII de manera competitiva con un polipeptido ActRII soluble; y
b) evaluar el efecto del agente en el crecimiento del tejido.
51. Un procedimiento para antagonizar la actividad de un polipeptido ActRII en una celula, que comprende poner en contacto la celula con un polipeptido ActRII soluble.
52. Un procedimiento para antagonizar la actividad de un ligando de ActRII en una celula, que comprende poner en contacto la celula con un polipeptido ActRII soluble, en el que el ligando de ActRII se selecciona del grupo que consiste en: activina, BMP7, GDF8, GDF11 y Nodal.
53. El procedimiento, segun la clausula 51 o 52, en el que la actividad se controla mediante la transduccion de la senalizacion mediada por el complejo de ActRII/ligando de ActRII.
54. El procedimiento, segun la clausula 51 o 52, en el que la actividad se controla mediante la proliferacion celular.
55. El procedimiento, segun la clausula 51 o 52, en el que la celula se selecciona del grupo que consiste en un osteoblasto, un condrocito, un miocito, un adipocito, una celula muscular y una celula neuronal.
56. Utilizacion de un polipeptido ActRII soluble para fabricar un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con una cantidad, desarrollo o actividad metabolica anormales de tejido oseo o cartllago, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
57. Utilizacion de un polipeptido ActRII soluble para fabricar un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con una cantidad, desarrollo o actividad metabolica anormales de tejido muscular, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
58. Utilizacion de un polipeptido ActRII soluble para fabricar un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con un contenido indeseable de grasa corporal, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
59. Utilizacion de un polipeptido ActRII soluble para fabricar un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con la neurodegeneracion, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
60. Un antagonista de GDF8, que comprende un dominio de union a GDF8 alterado de un receptor de ActRII que incluye una o mas mutaciones que incrementan la selectividad del dominio de union por GDF8 en relacion con el dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
61. El antagonista de GDF8, segun la clausula 60, en el que dichas una o mas mutaciones incrementan la selectividad del dominio de union alterado por GDF8 sobre activina.
62. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de Kd para la union a activina con respecto a Kd para la union a GDF8 que es al menos 2 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto a la proporcion para el dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
63. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de Kd para la union a activina con respecto a Kd para la union a GDF8 que es al menos 5 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto a la proporcion para el dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
64. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de Kd para la union a activina con respecto a Kd para la union a GDF8 que es al menos 10 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto a la proporcion para el dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
65. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de Kd para la union a activina con respecto a Kd para la union a GDF8 que es al menos 100 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto a la proporcion para el dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
66. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de IC50 para la inhibicion de activina con respecto a IC50 para la inhibicion de GDF8 que es al menos 2 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto al dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
67. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de IC50 para la inhibicion de activina con respecto a IC50 para la inhibicion de GDF8 que es al menos 5 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto al dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
68. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de IC50 para la inhibicion de activina con respecto a IC50 para la inhibicion de GDF8 que es al menos 10 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto al dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
69. El antagonista de GDF8, segun la clausula 61, en el que el dominio de union alterado presenta una proporcion de IC50 para la inhibicion de activina con respecto a IC50 para la inhibicion de GDF8 que es al menos 100 veces mayor para el dominio de union alterado con respecto al dominio de union a GDF8 de un receptor de tipo salvaje.
70. El antagonista de GDF8, segun la clausula 60, que inhibe GDF8 con una IC50 al menos 2 veces menor que la IC50 del antagonista para inhibir la activina.
71. El antagonista de GDF8, segun la clausula 60, que inhibe GDF8 con una IC50 al menos 5 veces menor que la IC50 del antagonista para inhibir la activina.
72. El antagonista de GDF8, segun la clausula 60, que inhibe GDF8 con una IC50 al menos 10 veces menor que la IC50 del antagonista para inhibir la activina.
73. El antagonista de GDF8, segun la clausula 60, que inhibe GDF8 con una IC50 al menos 100 veces menor que la IC50 del antagonista para inhibir la activina.
74. El antagonista de GDF8, segun cualquiera de las clausulas 60, 61, 62, 66 y 70, en el que el dominio de union a GDF8 alterado incluye una o mas mutaciones en un polipeptido ActRIIB en los residuos seleccionados del grupo que consiste en: E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 y F101.
75. El antagonista de GDF8, segun la clausula 60, en el que el antagonista de GDF8 es una protelna de fusion.
76. El antagonista de GDF8, segun la clausula 75, en el que dicho dominio de union a GDF8 alterado de un receptor de ActRII esta fusionado a un dominio Fc de IgG.
77. El antagonista de GDF8, segun la clausula 76, en el que dicho dominio Fc de IgG comprende una o mas mutaciones.
78. El antagonista de GDF8, segun la clausula 77, en el que el dominio Fc presenta una capacidad reducida de unirse al receptor de Fcy con respecto a un dominio Fc de tipo salvaje.
79. El antagonista de GDF8, segun la clausula 77, en el que el dominio de Fc presenta una capacidad incrementada de unirse al receptor de Fc relacionado con MHC clase I (FcRN) en relacion a un dominio Fc de tipo salvaje.
80. El antagonista de GDF8, segun la clausula 80, en el que el dominio de Fc presenta una mutacion en los residuos seleccionados del grupo que consiste en: Asp-265, lisina 322 y Asn-434.
81. El antagonista de GDF8, segun la clausula 77, en el que la mutacion se muestra en la figura 12.
82. El antagonista de GDF8, segun la clausula 76, en el que el dominio Fc de IgG tiene una secuencia de aminoacidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 13.
83. Un antagonista de GDF8 que comprende un dominio de union a GDF8 de un receptor ActRII fusionado a un dominio Fc, en el que el dominio Fc de IgG comprende una o mas mutaciones.
84. El antagonista de GDF8, segun la clausula 83, en el que el dominio Fc presenta una capacidad incrementada para unirse al receptor de Fc relacionado con MHC clase I (FcRN) en relacion a un dominio Fc de tipo salvaje.
85. El antagonista de GDF8, segun la clausula 83, en el que el dominio Fc presenta una capacidad incrementada para unirse al receptor de Fc relacionado con MHC clase I (FcRN) en relacion a un dominio Fc de tipo salvaje. 86. Un procedimiento para el tratamiento de un trastorno asociado con la actividad anormal de GDF8, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un polipeptido ActRII soluble.
87. El procedimiento, segun la clausula 86, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en: trastornos metabolicos, tales como diabetes de tipo 2, tolerancia de glucosa alterada, slndrome metabolico (por ejemplo, slndrome X), y resistencia a insulina inducida por trauma (por ejemplo quemaduras o desequilibrio de nitrogeno); trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrofica (ALS); atrofia muscular; atrofia de organos; debilidad; slndrome del tunel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y otros slndromes de desgaste muscular; osteoporosis; osteoporosis inducida por glucocorticoides; osteopenia; osteoartritis; fracturas relacionadas con osteoporosis; masa osea reducida debido a terapia cronica con glucocorticoides, insuficiencia gonadal prematura, supresion de androgenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa.
88. El antagonista de GDF8, segun cualquiera de las clausulas 60, 61, 62, 66 y 70, en el que el dominio de union a GDF8 alterado incluye una o mas mutaciones en un polipeptido ActRIIA en los residuos seleccionados del grupo que consiste en: E38, E40, R41, K56, R57, Y61, K65, K75, W79, L80, D81, 183 y F102.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo antagonista que se une especlficamente a un polipeptido ActRIIB para utilizar en el tratamiento o prevencion de atrofia muscular, sarcopenia, caquexia, slndrome de desgaste muscular, esclerosis lateral amiotrofica, distrofia muscular, enfermedad neurodegenerativa, trastorno musculodegenerativo y neuromuscular.
2. Utilizacion de un anticuerpo antagonista que se une especlficamente a un polipeptido ActRIIB para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de atrofia muscular, sarcopenia, caquexia, slndrome de desgaste muscular, esclerosis lateral amiotrofica, distrofia muscular, enfermedad neurodegenerativa, trastorno musculodegenerativo y neuromuscular.
3. Utilizacion, segun la reivindicacion 2, o anticuerpo antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo biespeclfico.
4. Utilizacion, segun la reivindicacion 2, o anticuerpo antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo de cadena unica.
5. Utilizacion, segun la reivindicacion 2, o anticuerpo antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico.
6. Utilizacion, segun la reivindicacion 2, o anticuerpo antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
7. Utilizacion, segun la reivindicacion 2, o anticuerpo antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. Utilizacion, segun la reivindicacion 2, o anticuerpo antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 1, en que el paciente tiene Distrofia Muscular de Duchenne, Distrofia Muscular de Becker o Distrofia Muscular Fasciocapulohumeral.
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