ES2710652T3

ES2710652T3 - Nuevo proceso SMB

Info

Publication number: ES2710652T3
Application number: ES12738160T
Authority: ES
Inventors: Adam Kelliher; Angus Morrison; Anil Oroskar; Rema Rakesh Vikraman Nair; Abhilesh Agarwal
Original assignee: BASF Pharma Callanish Ltd
Current assignee: BASF Pharma Callanish Ltd
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: JP2014523944A; CN103796724B; KR20140034923A; BR112014000152B1; WO2013005051A1; CA2815301C; BR112014000152A2; KR101603448B1; JP5990580B2; AU2012279993B2; PL2613862T3; CL2013003799A1; EP2613862B1; HUE043139T2; PE20142014A1; GB201111589D0; EP2613862A1; AU2012279993A1; CN103796724A; CA2815301A1

Abstract

Un proceso de separación cromatográfica para recuperar un producto de ácido graso poliinsaturado (PUFA) a partir de una mezcla de alimentación, proceso que comprende las etapas de: (i) purificar la mezcla de alimentación en una primera etapa de separación en un aparato de cromatografía de lecho móvil simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía unidas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, para obtener un producto intermedio; y (ii) purificar el producto intermedio obtenido en (i) en una segunda etapa de separación usando un aparato de cromatografía de lecho móvil simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía unidas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, para obtener el producto de PUFA; en el que (a) las primera y segunda etapas de separación se llevan a cabo secuencialmente en el mismo aparato de cromatografía, recuperándose el producto intermedio entre las primera y segunda etapas de separación y ajustándose las condiciones del proceso en el aparato de cromatografía entre las primera y segunda etapas de separación de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentación en cada etapa de separación; o (b) las primera y segunda etapas de separación se llevan a cabo en un primer y segundo aparatos de cromatografía independientes respectivamente, introduciéndose el producto intermedio obtenido de la primera etapa de separación en el segundo aparato de cromatografía, y separando el producto de PUFA de diferentes componentes de la mezcla de alimentación en cada etapa de separación; y en el que el eluyente disolvente orgánico acuoso usado en cada etapa de separación tiene una relación en volumen de agua:disolvente orgánico diferente; y en el que (1) el producto intermedio se recoge como la corriente de refinado en la primera etapa de separación, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de extracto en la segunda etapa de separación; o (2) el producto intermedio se recoge como la corriente de extracto en la primera etapa de separación, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de refinado en la segunda etapa de separación.

Description

DESCRIPCION

Nuevo proceso SMB

La presente invencion se refiere a un proceso de separacion cromatografica mejorado para purificar acidos grasos poliinsaturados (PUFA) y derivados de los mismos. En particular, la presente invencion se refiere a un proceso de separacion cromatografica en lecho movil simulado o real mejorado para purificar PUFA y derivados de los mismos. Los acidos grasos, en particular los PUFA, y sus derivados son precursores de moleculas biologicamente importantes, que desempenan un papel importante en la regulacion de funciones biologicas tales como la agregacion plaquetaria, la inflamacion y las respuestas inmunologicas. Por lo tanto, los PUFA y sus derivados pueden ser terapeuticamente utiles en el tratamiento de una amplia gama de afecciones patologicas que incluyen afecciones del SNC; neuropatfas, incluyendo neuropatfa diabetica; enfermedades cardiovasculares; afecciones generales del sistema inmunitario e inflamatorias, incluyendo enfermedades inflamatorias cutaneas.

Los PUFA se encuentran en materias primas naturales, tales como aceites vegetales y aceites marinos. Dichos PUFA, no obstante, frecuentemente estan presentes en dichos aceites en mezcla con acidos grasos saturados y otras muchas impurezas. Por tanto, de forma deseable, los PUFA deben purificarse antes de sus usos nutricional o farmaceutico.

Desafortunadamente, los PUFA son extremadamente fragiles. Por lo tanto, cuando se calientan en presencia de oxfgeno, son propensos a la isomerizacion, peroxidacion y oligomerizacion. Por lo tanto, el fraccionamiento y purificacion de los productos de PUFA para preparar acidos grasos puros es diffcil. La destilacion, incluso al vacfo, puede dar lugar a la degradacion en productos no aceptables.

La cromatograffa de lecho movil simulado o real son tecnicas conocidas, familiares para los expertos en la materia. El principio de funcionamiento implica el movimiento a contracorriente de una fase eluyente lfquida y una fase adsorbente solida. Esta operacion permite un uso mfnimo de disolvente haciendo que el proceso sea economicamente viable. Dicha tecnologfa de separacion tiene varias aplicaciones en distintas areas, incluyendo hidrocarburos, compuestos qufmicos industriales, aceites, azucares y API.

Como es bien sabido, en un sistema cromatografico de lecho estacionario convencional, una mezcla cuyos componentes se deben separar se percola a traves de un recipiente. El recipiente por lo general es cilfndrico, y generalmente se denomina columna. La columna contiene un relleno de un material poroso (generalmente denominado la fase estacionaria) que muestra una elevada permeabilidad a los fluidos. La velocidad de percolacion de cada componente de la mezcla depende de las propiedades ffsicas de ese componente, de modo que los componentes salen de la columna de forma sucesiva y selectiva. Por lo tanto, algunos de los componentes tienden a fijarse fuertemente a la fase estacionaria y, por lo tanto, se percolaran lentamente, mientras que otros tienden a fijarse debilmente y salen de la columna mas rapidamente. Se han propuesto muchos sistemas cromatograficos de lecho estacionario diferentes y se usan tanto para fines analfticos como de produccion industrial.

Por el contrario, un sistema cromatografico de lecho movil simulado consta de una serie de columnas individuales que contienen adsorbente que estan conectadas entre si en serie. El eluyente se hace pasar a traves de las columnas en una primera direccion. Los puntos de inyeccion de la carga de alimentacion y el eluyente, y los puntos de recogida de los componentes separados en el sistema, se desplazan periodicamente por medio de una serie de valvulas. El efecto global es simular el funcionamiento de una sola columna que contiene un lecho movil de adsorbente solido, moviendose el adsorbente solido en una direccion a contracorriente del flujo de eluyente. Por lo tanto, un sistema de lecho movil simulado consta de columnas que, como en un sistema de lecho estacionario convencional, contienen lechos estacionarios de adsorbente solido a traves de los cuales se hace pasar al eluyente, pero en un sistema de lecho movil simulado el funcionamiento es tal que simula un lecho movil continuo a contracorriente. “

Los procesos y el equipo para cromatograffa de lecho movil simulado se describen en varias patentes, como las patentes US-2.985.589, US- 3.696.107, US-3.706.812, US-3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148 y FR-A-2651149. El tema tambien se trata con mayor detalle en el documento “Preparative and Production Scale Chromatography”, editado por Ganetsos and Barker, Marcel Dekker Inc, Nueva York, 1993.

Un sistema de lecho movil real es similar en funcionamiento a un sistema de lecho movil simulado. Sin embargo, en lugar de desplazar los puntos de inyeccion de la mezcla de alimentacion y el eluyente, y los puntos de recogida del componente separado por medio de un sistema de valvulas, en su lugar una serie de unidades de adsorcion (es decir columnas) se mueven ffsicamente con respecto a los puntos de alimentacion y extraccion. De nuevo, el funcionamiento es tal que simula un lecho movil continuo a contracorriente.

Los procesos y el equipo para cromatograffa de lecho movil real se describen en varias patentes, como las patentes US-6.979.402, US- 5.069.883 y US-4.764.276.

El documento WO 2007/075499 describe un metodo para preparar composiciones usando cromatograffa de argentacion, que utiliza una resina cationica argentizada o una alumina argentizada acondicionada para separar compuestos que contienen cadenas de carbono saturadas o monoinsaturadas de compuestos que tienen cadenas de carbono poliinsaturadas presentes en una composicion de partida. El documento WO 2007/075499 tambien describe un metodo para preparar un adsorbente de alumina argentizado condicionado que tiene una mayor selectividad para compuestos que contienen una o mas cadenas de carbono poliinsaturadas.

La purificacion de productos de PUFA es particularmente dificultosa. Asf, muchas cargas de alimentacion adecuadas para preparar productos de PUFA son mezclas extremadamente complejas que contienen un gran numero de diferentes componentes con tiempos de retencion muy similares en aparatos de cromatograffa. Por lo tanto, es muy diffcil separar ciertos PUFA de dichas cargas de alimentacion. Sin embargo, se requiere un alto grado de pureza de productos de PUFA, particularmente para aplicaciones farmaceuticas y nutraceuticas. Historicamente, por lo tanto, cuando se requieren productos de PUFA de alta pureza se ha usado la destilacion. Existen, sin embargo, desventajas importantes asociadas al uso de la destilacion como tecnica de separacion para PUFA delicados tal como se ha descrito anteriormente.

Hasta ahora, no se ha puesto a disposicion ninguna tecnica cromatografica para conseguir productos de PUFA de alta pureza, por ejemplo con una pureza mayor del 95 o el 97 %, en particular a partir de cargas de alimentacion disponibles en el mercado tales como aceites de pescado.

Un aparato de cromatograffa de lecho movil simulado tfpico se ilustra con referencia a la Figura 1. El concepto de un proceso de separacion cromatografica de lecho movil simulado o real se explica considerando una columna cromatografica vertical que contiene una fase estacionaria S dividida en secciones, mas concretamente en cuatro subzonas superpuestas I, II, III y IV que van desde la parte inferior hasta la parte superior de la columna. El eluyente se introduce en la parte inferior en IE por medio de una bomba P. La mezcla de los componentes A y B que deben separarse se introduce en IA B entre la subzona II y la subzona III. Un extracto que contiene principalmente B se recoge en SB entre la subzona I y la subzona II, y se recoge un refinado que contiene principalmente A en SA entre la subzona III y la subzona IV.

En el caso de un sistema de lecho movil simulado, un movimiento hacia abajo simulado de la fase estacionaria S es causado por el movimiento de los puntos de introduccion y recogida con respecto a la fase solida. En el caso de un sistema de lecho movil real, un movimiento hacia abajo simulado de la fase estacionaria S es causado por el movimiento de las diversas columnas cromatograficas con respecto a los puntos de introduccion y recogida. En la Figura 1, el eluyente fluye hacia arriba y la mezcla A B es inyectada entre la subzona II y la subzona III. Los componentes se moveran de acuerdo con sus interacciones cromatograficas con la fase estacionaria, por ejemplo adsorcion sobre un medio poroso. El componente B que muestra una afinidad mas fuerte por la fase estacionaria (el componente que avanza mas lentamente) sera arrastrado mas lentamente por el eluyente y le seguira con retraso. El componente A que muestra la afinidad mas debil por la fase estacionaria (el componente que avanza mas rapido) sera arrastrado facilmente por el eluyente. Si el conjunto correcto de parametros, especialmente el caudal en cada subzona, estan correctamente estimados y controlados, el componente A que muestra la afinidad mas debil por la fase estacionaria se recogera entre la subzona III y la subzona IV como un refinado y el componente B que muestra la afinidad mas fuerte por la fase estacionaria se recogera entre la subzona I y la subzona II como un extracto.

Se apreciara, por lo tanto, que el sistema de lecho movil simulado convencional ilustrado esquematicamente en la Figura 1 esta limitado a un fraccionamiento binario.

Por consiguiente, existe una necesidad de un proceso de separacion cromatografica de lecho movil simulado o real que pueda separar PUFA o sus derivados de componentes que avanzan tanto rapido como lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares), para producir productos de PUFA de alta pureza a partir de cargas de alimentacion disponibles en el mercado tales como aceites de pescado. Es deseable, ademas, que el proceso incluya eluyentes economicos que funcionan en condiciones normalizadas de presion y temperatura.

Sumario de la invencion

Ahora se ha descubierto sorprendentemente que un producto de PUFA puede purificarse eficazmente a partir de cargas de alimentacion disponibles en el mercado tales como aceites de pescado mediante un aparato de lecho movil simulado o real usando un eluyente disolvente organico acuoso. La presente invencion proporciona, por lo tanto, un proceso de separacion cromatografica para recuperar un producto de acido graso poliinsaturado (PUFA) de una mezcla de alimentacion, proceso que comprende las etapas de:

(i) purificar la mezcla de alimentacion en una primera etapa de separacion en un aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatograffa unidas que contienen, como eluyente, un disolvente organico acuoso, para obtener un producto intermedio; y

(ii) purificar el producto intermedio obtenido en (i) en una segunda etapa de separacion usando un aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatograffa unidas que contienen, como eluyente, un disolvente organico acuoso, para obtener el producto de PUFA; en el que (a) las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo secuencialmente en el mismo aparato de cromatograffa, recuperandose el producto intermedio entre las primera y segunda etapas de separacion y ajustandose las condiciones del proceso en el aparato de cromatograffa entre las primera y segunda etapas de separacion de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion; o

(b) las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo en un primer y segundo aparatos de cromatograffa independientes respectivamente, introduciendose el producto intermedio obtenido de la primera etapa de separacion en el segundo aparato de cromatograffa, y separando el producto de PUFA de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion; y

en el que el eluyente disolvente organico acuoso usado en cada etapa de separacion tiene una relacion en volumen de agua:disolvente organico diferente; y

en el que (1) el producto intermedio se recoge como la corriente de refinado en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de extracto en la segunda etapa de separacion; o

(2) el producto intermedio se recoge como la corriente de extracto en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de refinado en la segunda etapa de separacion. Tambien se divulga en la presente memoria un producto de PUFA que se puede obtener mediante el proceso de la presente invencion.

Los productos de PUFA producidos mediante el proceso de la presente invencion se producen con alto rendimiento, y tienen alta pureza. Ademas, el contenido de las impurezas caracterfsticas que normalmente se producen tras la destilacion de PUFA es muy bajo. Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “impurezas isomericas” se usa para indicar aquellas impurezas normalmente producidas durante la destilacion de aceites naturales que contienen PUFA. Estas incluyen isomeros, productos de peroxidacion y oligomerizacion de PUFA.

La presente invencion tambien proporciona un programa informatico para controlar un aparato cromatografico tal como se define en la presente memoria, programa informatico que contiene un medio de codigo que, cuando se ejecuta ordena al aparato que lleve a cabo el proceso de la invencion.

Descripcion de las Figuras

La Figura 1 ilustra los principios basicos de un proceso de lecho movil simulado o real para separar una mezcla binaria.

La Figura 2 ilustra una primera realizacion preferida de la invencion que es adecuada para separar EPA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares). La Figura 3 ilustra una segunda realizacion preferida de la invencion que es adecuada para separar DHA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares). La Figura 4 ilustra con mas detalle la primera realizacion preferida de la invencion que es adecuada para separar EPA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares).

La Figura 5 ilustra con mas detalle la segunda realizacion preferida de la invencion que es adecuada para separar DHA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares).

La Figura 6 ilustra con mas detalle un metodo alternativo para la primera realizacion preferida de la invencion que es adecuada para separar EPA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares).

La Figura 7 ilustra con mas detalle un metodo alternativo para la segunda realizacion preferida de la invencion que es adecuada para separar DHA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares).

La Figura 8 ilustra una realizacion particularmente preferida de la invencion para purificar EPA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares).

La Figura 9 ilustra un metodo alternativo para una realizacion particularmente preferida de la invencion para purificar EPA de componentes que avanzan mas rapida y mas lentamente (es decir impurezas mas polares y menos polares).

La Figura 10 ilustra tres maneras en las que puede llevarse a cabo el proceso de separacion cromatografica de la invencion.

La Figura 11 muestra un analisis por HPLC de una carga de alimentacion rica en EPA que puede usarse adecuadamente como la mezcla de alimentacion en el proceso de la presente invencion.

La Figura 12 muestra un analisis por HPLC de las corrientes de refinado (R) y del extracto (E) obtenidas en la primera etapa de separacion de un proceso de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 13 muestra un analisis por HPLC de las corrientes de refinado (R) y del extracto (E) obtenidas en la segunda etapa de separacion de un proceso de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 14 muestra un analisis por HPLC mas detallado de la corriente del extracto obtenida en la segunda etapa de separacion de un proceso de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 15 muestra una huella de GC FAMES de un producto de DHA producido por SMB.

La Figura 16 muestra una huella de GC FAMES de un producto de DHA producido por destilacion.

Descripcion detallada de la invencion

El proceso de separacion cromatografica de la invencion es normalmente diferente de un proceso de separacion cromatografica para la recuperacion de un producto de acido graso poliinsaturado (PUFA), de una mezcla de alimentacion, proceso que comprende introducir la mezcla de alimentacion en un aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatograffa unidas que contienen, como eluyente, un alcohol acuoso, en el que el aparato tiene una pluralidad de zonas que comprenden al menos una primera zona y una segunda zona, teniendo cada zona una corriente de extracto y una corriente de refinado a partir de la cual puede recogerse lfquido de dicha pluralidad de columnas de cromatograffa unidas, y en el que (a) una corriente de refinado que contiene el producto de PUFA junto con componentes mas polares se recoge de una columna en la primera zona y se introduce en una columna no adyacente en la segunda zona, y/o (b) una corriente de extracto que contiene el producto de PUFA junto con componentes menos polares se recoge de una columna en la segunda zona y se introduce en una columna no adyacente en la primera zona, siendo dicho producto de PUFA separado de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada zona.

Tal como se usa en la presente memoria en esta realizacion, el termino “zona” se refiere a una pluralidad de columnas de cromatograffa unidas que contienen, como eluyente, un alcohol acuoso, y que tienen uno o mas puntos de inyeccion para una corriente de mezcla de alimentacion, uno o mas puntos de inyeccion para agua y/o alcohol, una corriente de extraccion de refinado a partir de la cual puede recogerse lfquido procedente de dicha pluralidad de columnas de cromatograffa unidas, y una corriente de extraccion de extracto a partir de la cual puede recogerse lfquido procedente de dicha pluralidad de columnas de cromatograffa unidas. Normalmente, cada zona tiene solo un punto de inyeccion para una mezcla de alimentacion. En una realizacion, cada zona tiene solo un punto de inyeccion para el eluyente de alcohol acuoso. En otra realizacion, cada zona tiene dos o mas puntos de inyeccion para agua y/o alcohol.

Detalles adicionales de esta realizacion se pueden consultar en la solicitud de patente internacional n° PCT/GB 10/002339. El proceso de separacion cromatografica de la invencion es normalmente diferente de los procesos desvelados en el documento PCT/GB 10/002339.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “producto de PUFA” se refiere a un producto que comprende uno o mas acidos grasos poliinsaturados (PUFA), y/o derivados de los mismos, normalmente de importancia nutricional o farmaceutica. Normalmente, el producto de PUFA es un unico PUFA o derivado del mismo. Como alternativa, el producto de PUFA es una mezcla de dos o mas PUFA o derivados de los mismos, por ejemplo dos. La expresion “acido graso poliinsaturado” (PUFA) se refiere a acidos grasos que contienen mas de un doble enlace. Dichos PUFA son bien conocidos por el experto en la materia. Tal como se usa en la presente memoria, un derivado de PUFA es un PUFA en forma de un mono-, di- o triglicerido, ester, fosfolfpido, amida, lactona o sal. Se prefieren trigliceridos y esteres. Se prefieren mas esteres. Los esteres son normalmente esteres alquflicos, preferiblemente esteres alquflicos de C¹-C⁶, mas preferiblemente esteres alquflicos de C¹-C⁴. Los ejemplos de esteres incluyen esteres metflicos y etflicos. Los esteres etflicos son los que mas se prefieren.

Normalmente, el producto de PUFA comprende al menos un PUFA w-3 u w-6, preferiblemente al menos un PUFA w-3. Los ejemplos de PUFA u>-3 incluyen acido alfa-linolenico (ALA), acido estearidonico (SDA), acido eicosatrienoico (ETE), acido eicosatetraenoico (ETA), acido eicosapentaenoico (EPA), acido docosapentaenoico (DPA) y acido docosahexaenoico (DHA). Se prefieren SDA, EPA, ^dP^ay DHA. Se prefieren mas EPA y DHA. Los ejemplos de PUFA w-6 incluyen acido linoleico (LA), acido gamma-linolenico (GLA), acido eicosadienoico, acido dihomo-gamma-linolenico (DGLA), acido araquidonico (ARA), acido docosadienoico, acido adrenico y acido docosapentaenoico (u>-6). Se prefieren LA, ARA, GLA y DGLA.

En una realizacion, el producto de PUFA es EPA y/o ester etflico (EE) del EPA.

En otra realizacion, el producto de PUFA es DHA y/o ester etflico (EE) del DHA.

En una realizacion adicional mas, el producto de PUFA es una mezcla de EPA y DHA y/o EE del EPA y EE del DHA. En una realizacion la mas preferida, el producto de PUFA es EPA o ester etflico del EPA que se produce con una pureza mayor del 90 %, preferiblemente con una pureza mayor del 95 %, y mas preferiblemente con una pureza mayor del 97 %.

Normalmente, ademas de dicho producto de PUFA, se recoge un producto de PUFA secundario adicional en el proceso de separacion cromatografica de la invencion. Preferiblemente, el producto de PUFA es EPA y el producto de PUFA secundario adicional es DHA.

En una realizacion adicional de la invencion, el aparato esta configurado para recoger un producto de PUFA que es una mezcla concentrada de EPA y DHA. Por lo tanto, se usa una mezcla de alimentacion que contiene EPA, DHA, componentes que son mas polares que EPA y DHA, y componentes que son menos polares que EPA y DHA. En la primera etapa de separacion, el material menos polar que EPA y DHA se retira normalmente. En la segunda etapa de separacion, el material que es mas polar que EPA y DHA se retira normalmente, y una mezcla concentrada de EPA y DHA se recoge como el producto de PUFA.

Mezclas de alimentacion adecuadas para fraccionamiento mediante el proceso de la presente invencion pueden obtenerse de fuentes naturales que incluyen aceites y grasas vegetales y animales, y de fuentes sinteticas que incluyen aceites obtenidos de plantas, animales y microorganismos incluyendo levaduras modificadas geneticamente. Los ejemplos incluyen aceites de pescado, aceites de algas y microalgas y aceites vegetales, por ejemplo aceite de borraja, aceite de Echium y aceite de onagra. En una realizacion, la mezcla de alimentacion es un aceite de pescado. En otra realizacion, la mezcla de alimentacion es un aceite de algas. Los aceites de algas son particularmente adecuados cuando el producto de PUFA deseado es EPA y/o DHA. El aceite de cartamo geneticamente modificado es particularmente adecuado cuando el producto de PUFA deseado es GLA. La levadura geneticamente modificada es particularmente adecuada cuando el producto de PUFA deseado es EPA.

En una realizacion particularmente preferida, la mezcla de alimentacion es un aceite de pescado o carga de alimentacion derivada de aceite de pescado. Se ha descubierto ventajosamente que, cuando se usa un aceite de pescado o carga de alimentacion derivada de aceite de pescado, puede producirse un producto de PUFA de EPA o ester etflico del EPA mediante el proceso de la presente invencion con mas del 90 % de pureza, preferiblemente mas del 95 % de pureza, y mas preferiblemente mas del 97 % de pureza.

La mezcla de alimentacion puede someterse a tratamiento qufmico antes de fraccionamiento mediante el proceso de la invencion. Por ejemplo, puede someterse a transesterificacion con gliceridos o hidrolisis de gliceridos seguida en algunos casos de procesos selectivos tales como cristalizacion, destilacion molecular, fraccionamiento con urea, extraccion con nitrato de plata u otras soluciones de sales metalicas, yodolactonizacion o fraccionamiento con fluido supercrftico. Como alternativa, una mezcla de alimentacion puede usarse directamente sin ninguna etapa de tratamiento inicial.

Las mezclas de alimentacion normalmente contienen el producto de PUFA y al menos un componente mas polar y al menos un componente menos polar. Los componentes menos polares tienen una adherencia mas fuerte al adsorbente usado en el proceso de la presente invencion que la del producto de PUFA. Durante el funcionamiento, dichos componentes menos polares normalmente se mueven con la fase adsorbente solida en preferencia con respecto a la fase eluyente lfquida. Los componentes mas polares tienen una adherencia mas debil al adsorbente usado en el proceso de la presente invencion que la del producto de PUFA. Durante el funcionamiento, dichos componentes mas polares normalmente se mueven con la fase eluyente lfquida en preferencia con respecto a la fase adsorbente solida. En general, los componentes mas polares se separaran en una corriente de refinado, y los componentes menos polares se separaran en una corriente de extracto.

Los ejemplos de los componentes mas y menos polares incluyen (1) otros compuestos que existen en aceites naturales (por ejemplo aceites marinos o aceites vegetales), (2) subproductos formados durante las etapas de almacenamiento, refinado y concentracion previa y (3) contaminantes procedentes de disolventes o reactivos que se utilizan durante etapas previas de concentracion o purificacion.

Los ejemplos de (1) incluyen otros PUFA no deseados; acidos grasos saturados; esteroles, por ejemplo colesterol; vitaminas; y contaminantes ambientales, tales como policlorobifenilo (PCB), pesticidas de hidrocarburos poliaromaticos (PAH), pesticidas clorados, dioxinas y metales pesados. PCB, PAH, las dioxinas y los pesticidas clorados son todos componentes altamente no polares.

Los ejemplos de (2) incluyen isomeros y productos de oxidacion o descomposicion del producto de PUFA, por ejemplo, productos polimericos de autooxidacion de acidos grasos o sus derivados.

Los ejemplos de (3) incluyen urea que puede anadirse para eliminar acidos grasos saturados o monoinsaturados de la mezcla de alimentacion.

Preferiblemente, la mezcla de alimentacion es un aceite marino que contiene PUFA (por ejemplo un aceite de pescado), mas preferiblemente un aceite marino (por ejemplo un aceite de pescado) que comprende EPA y/o DHA. Una mezcla de alimentacion tfpica para preparar (EE) EPA concentrado mediante el proceso de la presente invencion comprende 50-75 % de (EE) EPA, del 0 al 10 % de (EE) DHA, y otros componentes incluyendo otros acidos grasos u>-3 y u>-6 esenciales.

Una mezcla de alimentacion preferida para preparar (EE) EPA concentrado mediante el proceso de la presente invencion comprende 55 % de (EE) EPA, 5 % de (EE) DHA, y otros componentes incluyendo otros acidos grasos u>-3 y w-6 esenciales. (EE) DHA es menos polar que el (EE) EPA.

Una mezcla de alimentacion tfpica para preparar el (EE) DHA concentrado mediante el proceso de la presente invencion comprende 50-75 % (EE) DHA, del 0 al 10 % de (EE) EPA, y otros componentes incluyendo otros acidos grasos u>-3 y u>-6 esenciales.

Una mezcla de alimentacion preferida para preparar (EE) DHA concentrado mediante el proceso de la presente invencion comprende 75 % de (EE) DHA, 7 % (EE) EPA y otros componentes incluyendo otros acidos grasos u>-3 y w-6 esenciales. (EE) EPA es mas polar que (EE) DHA.

Una mezcla de alimentacion tfpica para preparar una mezcla concentrada de (EE) EPA y (EE) DHA mediante el proceso de la presente invencion comprende mas del 33 % de (EE) EPA, y mas del 22 % de (EE) DHA.

Cada etapa de separacion del proceso de la presente invencion se lleva a cabo en un aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real.

Cualquier aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real conocido puede utilizarse para los fines del metodo de la presente invencion, siempre que el aparato se use de acuerdo con el proceso de la presente invencion. Aquellos aparatos descritos en las patentes US- 2.985.589, US-3.696.107, US-3.706.812, US-3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148, FR-A-2651149, US-6.979.402, US-5.069.883 y US-4.764.276 pueden usarse todos si se configuran de acuerdo con el proceso de la presente invencion.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real” normalmente se refiere a una pluralidad de columnas de cromatograffa unidas que contienen, como eluyente, un disolvente organico acuoso, y que tienen uno o mas puntos de inyeccion para una corriente de mezcla de alimentacion, uno o mas puntos de inyeccion para agua y/o disolvente organico, una corriente de extraccion de refinado a partir de la cual puede recogerse lfquido de dicha pluralidad de columnas de cromatograffa unidas, y una corriente de extraccion de extracto a partir de la cual puede recogerse lfquido de dicha pluralidad de columnas de cromatograffa unidas.

El aparato de cromatograffa usado en cada etapa del proceso de la presente invencion tiene un unico conjunto de columnas de cromatograffa unidas en serie que contienen, como eluyente, un disolvente organico acuoso. Normalmente, cada una de las columnas de cromatograffa esta unida a las dos columnas en el aparato adyacentes a esa columna. Por lo tanto, la salida de una columna dada del conjunto esta conectada a la entrada de la columna adyacente del grupo, que esta aguas abajo con respecto al flujo de eluyente del grupo. Por lo tanto, el eluyente puede fluir alrededor del grupo de columnas de cromatograffa unidas. Normalmente, ninguna de las columnas de cromatograffa esta unida a columnas no adyacentes en el aparato.

Tal como se usa en la presente memoria la expresion “no adyacente” se refiere a columnas, en por ejemplo el mismo aparato, separadas por una o mas columnas, preferiblemente 3 o mas columnas, mas preferiblemente 5 o mas columnas, lo mas preferentemente aproximadamente 5 columnas.

Normalmente, cada aparato tiene solo un punto de inyeccion para una mezcla de alimentacion. En una realizacion, cada aparato tiene solo un punto de inyeccion para el eluyente disolvente organico acuoso. En otra realizacion, cada aparato tiene dos o mas puntos de inyeccion para agua y/o disolvente organico.

El termino “refinado” es bien conocido por el experto en la materia. En el contexto de la cromatograffa de lecho movil real y simulado se refiere a la corriente de componentes que se mueven mas rapidamente con la fase eluyente lfquida en comparacion con la fase adsorbente solida. Asf, una corriente de refinado esta normalmente enriquecida con componentes mas polares, y empobrecida en componentes menos polares en comparacion con una corriente de alimentacion.

El termino “extracto” es bien conocido por el experto en la materia. En el contexto de la cromatograffa de lecho movil real y simulado se refiere a la corriente de componentes que se mueven mas rapidamente con la fase adsorbente solida en comparacion con la fase eluyente lfquida. Por lo tanto, una corriente de extracto esta normalmente enriquecida en componentes menos polares, y empobrecida en componentes mas polares en comparacion con una corriente de alimentacion.

El numero de columnas usadas en cada aparato no esta particularmente limitado. Un experto en la materia serfa capaz facilmente de determinar un numero de apropiado de columnas a usar. El numero de columnas es normalmente 4 o mas, preferiblemente 6 o mas, mas preferiblemente 8 o mas, por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 columnas. En una realizacion preferida, se usan 5 o 6 columnas, mas preferiblemente 6 columnas. En otra realizacion preferida, se usan 7 u 8 columnas, mas preferiblemente 8 columnas. Normalmente, no hay mas de 25 columnas, preferiblemente no mas de 20, mas preferiblemente no mas de 15.

Los aparatos cromatograficos usados en las primera y segunda etapas de separacion normalmente contienen el mismo numero de columnas. Para algunas aplicaciones, puede haber diferentes numeros de columnas.

Las dimensiones de las columnas usadas en el aparato no estan particularmente limitadas, y dependeran del volumen de mezcla de alimentacion a purificar. Un experto en la materia serfa capaz facilmente de determinar columnas de un tamano apropiado a usar. El diametro de cada columna esta normalmente entre 10 y 1000 mm, preferiblemente entre 10 y 500 mm, mas preferiblemente entre 25 y 250 mm, aun mas preferiblemente entre 50 y 100 mm, y lo mas preferentemente entre 70 y 80 mm. La longitud de cada columna esta normalmente entre 10 y 300 cm, preferiblemente entre 10 y 200 cm, mas preferiblemente entre 25 y 150 cm, aun mas preferiblemente entre 70 y 110 cm, y lo mas preferentemente entre 80 y 100 cm.

Las columnas en los aparatos cromatograficos usados en las primera y segunda etapas de separacion normalmente tienen dimensiones identicas pero pueden tener, para algunas aplicaciones, diferentes dimensiones.

Los caudales introducidos en la columna estan limitados por presiones maximas a traves de la serie de columnas y dependeran de las dimensiones de la columna y el tamano de partfculas de las fases solidas. Un experto en la materia sera capaz facilmente de establecer el caudal requerido para cada dimension de columna para garantizar una desorcion eficiente. Columnas de diametro mas grande necesitaran en general flujos mas elevados para mantener el flujo lineal a traves de las columnas.

Para los tamanos de columna tfpicos descritos anteriormente, normalmente el caudal de eluyente que se introduce en el interior del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es de 1 a 4,5 l/min, preferiblemente de 1,5 a 2,5 l/min. Normalmente, el caudal del extracto procedente del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es de 0,1 a 2,5 l/min, preferiblemente de 0,5 a 2,25 l/min. En realizaciones donde parte del extracto procedente de la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion, el caudal de recirculacion es normalmente de 0,7 a 1,4 l/min, preferiblemente aproximadamente 1 l/min. Normalmente, el caudal del refinado procedente del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es de 0,2 a 2,5 l/min, preferiblemente de 0,3 a 2,0 l/min. En realizaciones donde parte del refinado procedente de la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion, el caudal de recirculacion es normalmente de 0,3 a 1,0 l/min, preferiblemente aproximadamente 0,5 l/min. Normalmente, el caudal de introduccion de la mezcla de alimentacion en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es de 5 a 150 ml/min, preferiblemente de 10 a 100 ml/min, mas preferiblemente de 20 a 60 ml/min.

Para los tamanos de columna tfpicos descritos anteriormente, normalmente el caudal de eluyente introducido en el interior del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion es de 1 a 4 l/min, preferiblemente de 1,5 a 3,5 l/min. Normalmente, el caudal del extracto procedente del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion es de 0,5 a 2 l/min, preferiblemente de 0,7 a 1,9 l/min. En realizaciones donde parte del extracto procedente de la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion, el caudal de recirculacion es normalmente de 0,6 a 1,4 l/min, preferiblemente de 0,7 a 1,1 l/min, mas preferiblemente aproximadamente 0,9 l/min. Normalmente, el caudal del refinado procedente del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion es de 0,5 a 2,5 l/min, preferiblemente de 0,7 a 1,8 l/min, mas preferiblemente aproximadamente 1,4 l/min. En realizaciones donde parte del refinado procedente de la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion, el caudal de recirculacion es normalmente de 0,3 a 1,0 l/min, preferiblemente aproximadamente 0,5 l/min.

Como apreciara el experto en la materia, las referencias a los caudales a los que se recoge o elimina lfquido mediante las diversas corrientes de extracto y refinado se refieren a volumenes de lfquido eliminado en una cantidad de tiempo, normalmente l/minuto. Analogamente, las referencias a los caudales a los que se recircula de vuelta lfquido al interior de un aparato, normalmente a una columna adyacente en el aparato, se refieren a volumenes de lfquido recirculados en una cantidad de tiempo, normalmente l/minuto.

El tiempo de etapa, es decir el tiempo entre el desplazamiento de los puntos de inyeccion de la mezcla de alimentacion y eluyente, y los diversos puntos de extraccion de las fracciones recogidas, no esta particularmente limitado, y dependera del numero y las dimensiones de las columnas usadas, y el caudal que fluye a traves del aparato. Un experto en la materia podra determinar facilmente los tiempos de etapa apropiados para usar en el proceso de la presente invencion. El tiempo de etapa es normalmente de 100 a 1000 segundos, preferiblemente de 200 a 800 segundos, mas preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 750 segundos. En algunas realizaciones, un tiempo de etapa apropiado es de 100 a 400 segundos, preferiblemente de 200 a 300 segundos, mas preferiblemente aproximadamente 250 segundos. En otras realizaciones, un tiempo de etapa apropiado es de 600 a 900 segundos, preferiblemente de 700 a 800 segundos, mas preferiblemente aproximadamente 750 segundos.

En el proceso de la presente invencion, se prefiere la cromatograffa de lecho movil real.

En el proceso de la presente invencion pueden usarse adsorbentes convencionales conocidos en la tecnica para sistemas de lecho movil real y simulado. Cada columna cromatografica puede contener el mismo o un adsorbente diferente. Normalmente, cada columna contiene el mismo adsorbente. Los ejemplos de dichos materiales usados habitualmente son perlas polimericas, preferiblemente poliestireno reticulado con DVB (divinilbenceno); y gel de sflice, preferiblemente gel de sflice de fase inversa unida a alcanos C8 o C18, especialmente C18. Se prefiere el gel de sflice de fase inversa unido a C18. El adsorbente usando en el proceso de la presente invencion es preferiblemente no polar.

La forma del material de fase estacionaria adsorbente puede ser, por ejemplo, perlas esfericas o no esfericas, preferiblemente perlas sustancialmente esfericas. Dichas perlas normalmente tienen un diametro de 5 a 500 micrometros, preferiblemente de 10 a 500 micrometros, mas preferiblemente de 15 a 500 micrometros, mas preferiblemente de 40 a 500 micrometros, mas preferiblemente de 100 a 500 micrometros, mas preferiblemente de 250 a 500 micrometros, aun mas preferiblemente de 250 a 400 micrometros, lo mas preferentemente de 250 a 350 micrometros. En algunas realizaciones, pueden usarse perlas con un diametro de 5 a 35 micrometros, normalmente de 10 a 30 micrometros, preferiblemente de 15 a 25 micrometros. Algunos tamanos de partfcula preferidos son algo mas grandes que los tamanos de partfcula de perlas usadas en el pasado en procesos de lecho movil simulado y real. El uso de partfculas mas grandes permite que se use una presion de eluyente mas baja en el sistema. Esto, a su vez, tiene ventajas en terminos de ahorros de costes, eficiencia y vida util del aparato. Se ha descubierto sorprendentemente que pueden usarse perlas adsorbentes de gran tamano de partfcula en el proceso de la presente invencion (con sus ventajas asociadas) sin ninguna perdida de resolucion.

El adsorbente normalmente tiene un tamano de poro de 10 a 50 nm, preferiblemente de 15 a 45 nm, mas preferiblemente de 20 a 40 nm, lo mas preferentemente de 25 a 35 nm.

Normalmente, el proceso de la presente invencion se realiza a una temperatura de 15 a 55 °C, preferiblemente de 20 a 40 °C, mas preferiblemente a aproximadamente 30 °C. Por lo tanto, el proceso se lleva a cabo normalmente a temperatura ambiente, pero pueden realizarse a temperaturas elevadas.

El proceso de la presente invencion comprende una primera y una segunda etapa de separacion.

Estas dos etapas pueden llevarse a cabo facilmente en un unico aparato cromatografico. Por lo tanto, en una realizacion, (a) las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo secuencialmente en el mismo aparato de cromatograffa, recuperandose el producto intermedio entre las primera y segunda etapas de separacion y ajustandose las condiciones del proceso en el aparato de cromatograffa entre las primera y segunda etapas de separacion de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. Una realizacion preferida de este proceso de separacion se muestra como Figura 10a. Por lo tanto, la primera etapa de separacion (lado izquierdo) se lleva a cabo en un aparato de SMB que tiene 8 columnas. Entre las primera y segunda etapas de separacion el producto intermedio se recupera en, por ejemplo, un recipiente, ajustandose las condiciones del proceso en el aparato de cromatograffa de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. La segunda etapa de separacion (lado derecho) se lleva a cabo entonces en el mismo aparato de SMB que tiene 8 columnas.

En la realizacion (a), ajustar las condiciones del proceso normalmente se refiere a ajustar las condiciones del proceso en el aparato como un todo, es decir modificar ffsicamente el aparato de modo que las condiciones sean diferentes. No se refiere a reintroducir simplemente el producto intermedio de nuevo en una parte diferente del mismo aparato donde podrfa ocurrir que las condiciones del proceso fueran diferentes.

Como alternativa, pueden usarse un primer y un segundo aparatos de cromatograffa independientes en las primera y segunda etapas de separacion. Por lo tanto, en otra realizacion, (b) las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo en un primer y un segundo aparatos de cromatograffa independientes respectivamente, siendo el producto intermedio obtenido de la primera etapa de separacion introducido en el segundo aparato de cromatograffa, y siendo el producto de PUFA separado de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion.

En la realizacion (b), las dos etapas de separacion pueden llevarse a cabo secuencial o simultaneamente.

Por lo tanto, en la realizacion (b) en el caso donde las dos etapas de separacion se llevan a cabo secuencialmente, las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo secuencialmente en un primer y un segundo aparatos de cromatograffa independientes respectivamente, recuperandose el producto intermedio entre las primera y segunda etapas de separacion y ajustandose las condiciones del proceso en los primer y segundo aparatos de cromatograffa de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. Una realizacion preferida de este proceso de separacion se muestra como Figura 10b. Por lo tanto, la primera etapa de separacion (lado izquierdo) se lleva a cabo en un aparato de SMB que tiene 8 columnas, del uno al ocho. Entre las primera y segunda etapas de separacion, el producto intermedio se recupera, por ejemplo en un recipiente, y a continuacion se introduce en un segundo aparato de SMB independiente. La segunda etapa de separacion (lado derecho) se lleva a cabo en el segundo aparato de SMB independiente que tiene 8 columnas, del nueve al dieciseis. Las condiciones del proceso en los dos aparatos de cromatograffa se ajustan de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion.

En la realizacion (b) en el caso donde las dos etapas de separacion se llevan a cabo simultaneamente, las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo en un primer y un segundo aparatos de cromatograffa independientes respectivamente, siendo el producto intermedio introducido en el aparato de cromatograffa usado en la segunda etapa de separacion, y ajustandose las condiciones del proceso en los primer y segundo aparatos de cromatograffa de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. Una realizacion preferida de este proceso de separacion se muestra como Figura 10c. Por lo tanto, la primera etapa de separacion (lado izquierdo) se lleva a cabo en un aparato de SMB que tiene 8 columnas, de la una a la ocho. El producto intermedio obtenido en la primera etapa de separacion se introduce a continuacion en el segundo aparato de cromatograffa independiente usado en la segunda etapa de separacion. El producto intermedio puede hacerse pasar de la primera etapa de separacion a la segunda etapa de separacion directa o indirectamente, por ejemplo mediante un recipiente. La segunda etapa de separacion (lado derecho) se lleva a cabo en el segundo aparato de SMB independiente que tiene 8 columnas, de la nueve a la dieciseis. Las condiciones del proceso en los dos aparatos de cromatograffa se ajustan de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion.

En la realizacion (b) en el caso donde las dos etapas de separacion se llevan a cabo simultaneamente, el eluyente circula por separado en los dos aparatos cromatograficos independientes. Por lo tanto, no se comparte el eluyente entre los dos aparatos cromatograficos independientes aparte de que el eluyente puede estar presente como disolvente en el producto intermedio que se purifica en la segunda etapa de separacion, y que se introduce en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. Las columnas cromatograficas no se comparten entre los dos aparatos cromatograficos independientes usados en las primera y segunda etapas de separacion.

Despues de obtener el producto intermedio en la primera etapa de separacion, el eluyente disolvente organico acuoso puede eliminarse parcial o totalmente antes de que el producto intermedio se purifique en la segunda etapa de separacion. Como alternativa, el producto intermedio puede purificarse en la segunda etapa de separacion sin la eliminacion de ningun disolvente presente.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. En la realizacion (a), las condiciones del proceso del aparato de SMB individual usado en ambas etapas de separacion se ajustan entre las primera y segunda etapas de separacion de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. En la realizacion (b), las condiciones del proceso en los dos aparatos de cromatograffa independientes usados en la primera y segunda etapas de separacion se ajustan de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion.

Por lo tanto, las condiciones del proceso en las primera y segunda etapas de separacion varfan. Las condiciones del proceso que varfan pueden incluir, por ejemplo, el tamano de las columnas usadas, el numero de columnas usadas, el relleno usado en las columnas, el tiempo de etapa del aparato de SMB, la temperatura del aparato, o el eluyente usado en las etapas de separacion.

El producto intermedio obtenido en la primera etapa de separacion esta normalmente enriquecido en el producto de PUFA en comparacion con la mezcla de alimentacion.

El producto intermedio obtenido en la primera etapa de separacion se introduce a continuacion en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

El producto intermedio se recoge normalmente como la corriente de refinado o extracto procedente del aparato cromatografico usado en el primer proceso de separacion.

En una realizacion, (1), el producto intermedio se recoge como la corriente de refinado en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de extracto en la segunda etapa de separacion. Por lo tanto, la corriente de refinado recogida en la primera etapa de separacion se usa como mezcla de alimentacion en la segunda etapa de separacion. La corriente de refinado recogida en la primera etapa de separacion normalmente contiene el producto de PUFA junto con componentes mas polares.

En otra realizacion, (2), el producto intermedio se recoge como corriente de extracto en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como corriente de refinado en la segunda etapa de separacion. Por lo tanto, la corriente de extracto recogida en la primera etapa de separacion se usa como mezcla de alimentacion en la segunda etapa de separacion. La corriente de extracto recogida en la primera etapa de separacion normalmente contiene el producto de PUFA junto con componentes menos polares.

El producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion. Normalmente, los componentes separados en cada etapa de separacion del proceso de la presente invencion tienen diferentes polaridades.

Preferiblemente, el producto de PUFA se separa de componentes menos polares de la mezcla de alimentacion en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se separa de componentes mas polares de la mezcla de alimentacion en la segunda etapa de separacion.

Normalmente, (a) parte de la corriente de extracto procedente del aparato usado en la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion; y/o (b) parte de la corriente de refinado procedente del aparato usado en la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion; y/o (c) parte de la corriente de extracto procedente del aparato usado en la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion; y/o (d) parte de la corriente de refinado procedente del aparato usado en la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion.

Preferiblemente, (a) parte de la corriente de extracto procedente del aparato usado en la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion; y (b) parte de la corriente de refinado procedente del aparato usado en la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion; y (c) parte de la corriente de extracto procedente del aparato usado en la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion; y (d) parte de la corriente de refinado procedente del aparato usado en la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion.

Esta recirculacion implica alimentar parte de la corriente de extracto o refinado fuera del aparato de cromatograffa usado en la primera o segunda etapa de separacion de vuelta al interior del aparato usado en esa etapa, normalmente en una columna adyacente. Esta columna adyacente es la columna adyacente que esta aguas abajo con respecto al flujo de eluyente en el sistema.

El caudal al cual el lfquido recogido mediante la corriente de extracto o refinado en la primera o segunda etapas de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato de cromatograffa usado en esa etapa es el caudal al cual el lfquido recogido mediante esa corriente es alimentado de vuelta al interior del aparato usado en esa etapa, normalmente al interior de una columna adyacente, es decir la columna que esta aguas abajo con respecto al flujo de eluyente en el sistema.

Esto puede verse con referencia a una realizacion preferida en la Figura 9. El caudal de recirculacion de extracto en la primera etapa de separacion es el caudal al cual el extracto recogido de la parte inferior de la columna 2 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es alimentado en la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion, es decir el caudal de lfquido al interior de la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

El caudal de recirculacion de extracto en la segunda etapa de separacion es el caudal con el cual el extracto recogido en la parte inferior de la columna 2 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion se alimenta al interior de la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion, es decir el caudal de lfquido introducido en el interior de la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

La recirculacion de las corrientes de extracto y/o refinado en las primera y/o segunda etapas de separacion se realiza normalmente alimentando el lfquido recogido mediante esa corriente en esa etapa de separacion al interior de un recipiente, y a continuacion bombeando una cantidad de ese lfquido desde el recipiente de vuelta al interior del aparato usado en esa etapa de separacion, normalmente al interior de una columna adyacente. En este caso, el caudal de recirculacion de lfquido recogido mediante una corriente de extracto o refinado particular en las primera y/o segunda etapas de separacion, normalmente de vuelta al interior de una columna adyacente, es el caudal al cual el lfquido es bombeado fuera del recipiente de vuelta al interior del aparato de cromatograffa, normalmente al interior de una columna adyacente.

Como apreciara el experto en la materia, la cantidad de liquido que es introducido en un aparato de cromatograffa mediante las corrientes de eluyente y carga de alimentacion se equilibra con la cantidad de liquido eliminado del aparato, y recirculado de vuelta al interior del aparato.

Por lo tanto, con referencia a la Figura 9, para la corriente de extracto, el caudal de eluyente (desorbente) introducido en el interior del aparato o aparatos cromatograficos usados en las primera y segunda etapas de separacion (D) es igual al caudal al cual el liquido recogido mediante la corriente de extracto en esa etapa de separacion se acumula en un recipiente (E1 y E2) anadido al caudal al cual el extracto se recircula de vuelta al interior del aparato cromatografico usado en esa etapa de separacion particular (D-E1 y D-E2).

Para la corriente de refinado procedente de una etapa de separacion, el caudal al cual el extracto se recircula de vuelta al interior del aparato cromatografico usado en esa etapa de separacion particular (D-E1 y D-E2) anadido al caudal al cual se introduce la carga de alimentacion en el aparato cromatografico usado en esa etapa de separacion particular (F y R1) es igual al caudal al cual el liquido recogido mediante la corriente de refinado en esa etapa de separacion particular se acumula en un recipiente (R1 y R2) anadido al caudal al cual el refinado se recircula de vuelta al interior del aparato cromatografico usado en esa etapa de separacion particular (D+F-E1-R1 y D+R1-E2-R2).

El caudal al cual el liquido recogido de una corriente de extracto o refinado particular procedente de un aparato de cromatograffa se acumula en un recipiente tambien puede considerarse como el caudal neto de eliminacion de esa corriente de extracto o refinado de ese aparato de cromatograffa.

El eluyente usado en el proceso de la presente invencion es un disolvente organico acuoso.

El disolvente organico acuoso normalmente comprende agua y uno o mas alcoholes, eteres, esteres, cetonas o nitrilos, o mezclas de los mismos.

Los disolventes alcoholicos son bien conocidos por el experto en la materia. Los alcoholes son normalmente alcoholes de cadena corta. Los alcoholes normalmente son de formula ROH, en la que R es un grupo alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado. El grupo alquilo C¹-C⁶esta preferiblemente sin sustituir. Los ejemplos de alcoholes incluyen metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, s-butanol y t-butanol. Los preferidos son metanol y etanol. El metanol es mas preferido.

Los disolventes de eter son bien conocidos por el experto en la materia. Los eteres son normalmente eteres de cadena corta. Los eteres son normalmente de formula R-O-R', en la que R y R' son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado. El grupo alquilo C¹-C⁶esta preferiblemente sin sustituir. Los eteres preferidos incluyen eter dietflico, eter diisopropflico, y eter metil t-butflico (MTBE).

Los disolventes de ester son bien conocidos por el experto en la materia. Los esteres son normalmente esteres de cadena corta. Los esteres normalmente son de formula R-(C=O)O-R', en la que R y R' son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado. Los esteres preferidos incluyen acetato de metilo y acetato de etilo.

Los disolventes cetonicos son bien conocidos por el experto en la materia. Las cetonas son normalmente cetonas de cadena corta. Las cetonas normalmente son de formula R-(C=O)-R', en la que R y R' son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado. El grupo alquilo C¹-C⁶esta preferiblemente sin sustituir. Las cetonas preferidas incluyen acetona, metiletilcetona y metil isobutil cetona (MIBK).

Los disolventes de nitrilo son bien conocidos por el experto en la materia. Los nitrilos son normalmente nitrilos de cadena corta. Los nitrilos normalmente son de formula R-CN, en la que R representa un grupo alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado. El grupo alquilo C¹-C⁶esta preferiblemente sin sustituir. Los nitrilos preferidos incluyen acetonitrilo. Normalmente, el disolvente organico acuoso es alcohol acuoso o acetonitrilo acuoso.

El disolvente organico acuoso es preferiblemente metanol acuoso o acetonitrilo acuoso. El metanol acuoso es mas preferido.

Normalmente, el eluyente no esta en un estado supercrftico. Normalmente, el eluyente es un liquido.

Normalmente, la relacion promedio de agua:disolvente organico, por ejemplo relacion de agua:metanol, del eluyente en todo el aparato es de 0,1:99,9 a 9:91 partes en volumen, preferiblemente de 0,25:99,75 a 7:93 partes en volumen, mas preferiblemente de 0,5:99,5 a 6:94 partes en volumen.

Cuando el disolvente organico acuoso es acetonitrilo acuoso, el eluyente normalmente contiene hasta el 30 % en peso de agua, el resto acetonitrilo. Preferiblemente, el eluyente contiene del 5 al 25 % en peso de agua, el resto acetonitrilo. Mas preferiblemente, el eluyente contiene del 10 al 20 % en peso de agua, el resto acetonitrilo. Aun mas preferiblemente, el eluyente contiene del 15 al 25 % en peso de agua, el resto acetonitrilo.

El eluyente de disolvente organico acuoso utilizado en cada etapa de separacion tiene una relacion de agua:disolvente organico diferente. La relacion de agua:disolvente organico utilizada en cada etapa de separacion se ajusta preferiblemente de manera que el producto de PUFA se pueda separar de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion.

La potencia de elucion del eluyente utilizado en cada una de las etapas de separacion es normalmente diferente. Preferiblemente, la potencia de elucion del eluyente usado en la primera etapa de separacion es mayor que la del eluyente usado en la segunda etapa de separacion. En la practica, esto se logra variando las cantidades relativas de agua y disolvente organico utilizadas en cada etapa de separacion.

Dependiendo de la eleccion del disolvente organico, pueden ser desorbentes mas potentes que el agua. Como alternativa, pueden ser desorbentes menos potentes que el agua. El acetonitrilo y los alcoholes, por ejemplo, son desorbentes mas potentes que el agua. Por lo tanto, cuando el disolvente organico acuoso es un alcohol o acetonitrilo acuoso, la cantidad de alcohol o acetonitrilo en el eluyente usado en la primera etapa de separacion es normalmente mayor que la cantidad de alcohol o acetonitrilo en el eluyente usado en la segunda etapa de separacion.

Normalmente, la relacion agua:disolvente organico del eluyente en la primera etapa de separacion es mas baja que la relacion agua:disolvente organico del eluyente en la segunda etapa de separacion. Por lo tanto, el eluyente en la primera etapa de separacion contiene normalmente mas disolvente organico, preferiblemente alcohol, mas preferiblemente metanol, que el eluyente en la segunda etapa de separacion.

En realizaciones en las que el disolvente organico acuoso usado en cada etapa de separacion tiene una relacion diferente de agua:disolvente organico, la relacion de agua:disolvente organico del eluyente en la primera etapa de separacion es normalmente de 0:100 a 5:95 partes en volumen, preferiblemente de 0,1:99,9 a 2,5:97,5 partes en volumen, mas preferiblemente de 0,25:99,75 a 2:98 partes en volumen, y lo mas preferiblemente de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes en volumen. En estas realizaciones, la relacion agua:disolvente organico del eluyente en la segunda etapa de separacion es normalmente de 2:98 a 8:92 partes en volumen, preferiblemente de 3:97 a 7:93 partes en volumen, mas preferiblemente de 4:96 a 6:94 partes en volumen, e incluso mas preferiblemente de 4,5:95,5 a 5,5:94,5 partes en volumen.

En una realizacion particularmente preferida donde el solvente organico acuoso usado en cada etapa de separacion tiene un contenido diferente de disolvente organico en agua, la relacion agua:disolvente organico del eluyente en la primera etapa de separacion es de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes en volumen y la relacion de agua:disolvente organico del eluyente en la segunda etapa de separacion es de 4,5:95:5 a 5,5:94,5 partes en volumen.

Se apreciara que las relaciones entre el agua y el disolvente organico en cada etapa de separacion referida anteriormente son relaciones promedio dentro de la totalidad del aparato cromatografico.

Normalmente, la relacion agua:disolvente organico del eluyente en cada etapa de separacion se controla introduciendo agua y/o disolvente organico en una o mas columnas en los aparatos cromatograficos utilizados en las etapas de separacion. Asf, por ejemplo, para lograr una relacion de agua/disolvente organico mas baja en la primera etapa de separacion que en la segunda etapa de separacion, el agua se introduce normalmente mas lentamente en el aparato cromatografico utilizado en la primera etapa de separacion que en la segunda etapa de separacion.

En algunas realizaciones, el disolvente organico esencialmente puro y el agua esencialmente pura se pueden introducir en diferentes puntos del aparato cromatografico utilizado en cada etapa de separacion. Los caudales relativos de estas dos corrientes determinaran el perfil global del disolvente en el aparato cromatografico. En otras realizaciones, se pueden introducir diferentes mezclas de disolvente organico/agua en diferentes puntos en cada aparato cromatografico utilizado en cada etapa de separacion. Eso implicara la introduccion de dos o mas mezclas diferentes de disolvente organico/agua en el aparato cromatografico utilizado en una etapa de separacion particular, teniendo cada mezcla de disolvente organico/agua una relacion diferente de disolvente organico:agua. Los caudales relativos y las concentraciones relativas de las mezclas de disolvente organico/agua en esta realizacion determinaran el perfil global del disolvente en el aparato cromatografico utilizado en esa etapa de separacion.

En el proceso de separacion cromatografica de la invencion, o bien (1) el producto intermedio que contiene el producto de PUFA junto con componentes mas polares se recoge como la corriente de refinado en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de extracto en la segunda etapa de separacion; o (2) el producto intermedio que contiene el producto de PUFA junto con componentes menos polares se recoge como la corriente de extracto en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de refinado en la segunda etapa de separacion.

La realizacion (1) es adecuada para purificar EPA de una mezcla de alimentacion.

Esta realizacion particularmente preferida (1) se ilustra en la Figura 2. Una mezcla de alimentacion F que comprende el producto de PUFA (B) y componentes mas polares (C) y menos polares (A) se purifica en la primera etapa de separacion. En la primera etapa de separacion, los componentes menos polares (A) se eliminan como corriente de extracto E1. El producto de PUFA (B) y los componentes mas polares (C) se recogen como corriente de refinado R1. La corriente de refinado R1 es el producto intermedio que a continuacion se purifica en la segunda etapa de separacion. En la segunda etapa de separacion, los componentes mas polares (C) se eliminan como corriente de refinado R2. El producto de PUFA (B) se recoge como corriente de extracto E2.

Esta realizacion se ilustra con mas detalle en la Figura 4. La Figura 4 es identica a la Figura 2, excepto que se muestran los puntos de introduccion del desorbente disolvente organico (D) y agua (W) al interior de cada aparato cromatografico. El desorbente disolvente organico (D) y el agua (W) juntos constituyen el eluyente. La fase (D) es normalmente disolvente organico esencialmente puro pero, en algunas realizaciones puede ser una mezcla de disolvente organico/agua que comprende principalmente disolvente organico. La fase (W) es normalmente agua esencialmente pura pero, en algunas realizaciones puede ser una mezcla de disolvente organico/agua que comprende principalmente agua, por ejemplo una mezcla del 98 % de agua/2 % de metanol.

Una ilustracion adicional de esta realizacion se muestra en la Figura 6. En este caso no hay punto de inyeccion de agua independiente, y en su lugar se inyecta en (D) un desorbente disolvente organico acuoso.

La separacion en corriente de refinado y de extracto puede facilitarse modificando la potencia de desorcion del eluyente dentro de cada aparato cromatografico. Esto puede conseguirse introduciendo el componente de disolvente organico (o rico en disolvente organico) del eluyente y el componente de agua (o rico en agua) en puntos diferentes en cada aparato cromatografico. Por lo tanto, normalmente, el disolvente organico se introduce aguas arriba del punto de extraccion de extracto y el agua se introduce entre el punto de extraccion de extracto y el punto de introduccion de la alimentacion en el aparato cromatografico, con respecto al flujo de eluyente en el sistema. Esto se muestra en la Figura 4.

Los disolventes tfpicos para su uso en esta realizacion la mas preferida son alcoholes acuosos o acetonitrilo acuoso, preferiblemente metanol acuoso.

Normalmente, en esta realizacion, el eluyente de disolvente organico acuoso usado en la primera etapa de separacion contiene mas disolvente organico que el eluyente usado en la segunda etapa de separacion, es decir, la relacion de agua:disolvente organico en la primera etapa es menor que la relacion de agua:disolvente organico en la segunda etapa.

En esta realizacion, la primera corriente de refinado en la primera etapa de separacion se elimina normalmente aguas abajo del punto de introduccion de la mezcla de alimentacion en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion, con respecto al flujo de eluyente.

En esta realizacion, la primera corriente de extracto en la primera etapa de separacion se elimina normalmente aguas arriba del punto de introduccion de la mezcla de alimentacion en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion, con respecto al flujo de eluyente.

En esta realizacion, la segunda corriente de refinado en la segunda etapa de separacion se elimina normalmente aguas abajo del punto de introduccion del producto intermedio en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion, con respecto al flujo de eluyente.

En esta realizacion, la segunda corriente de extracto en la segunda etapa de separacion se recoge normalmente aguas arriba del punto de introduccion del producto intermedio en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion, con respecto al flujo de eluyente.

Normalmente en esta realizacion, el disolvente organico o disolvente organico acuoso se introduce en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion aguas arriba del punto de eliminacion de la primera corriente de extracto, con respecto al flujo de eluyente.

Normalmente en esta realizacion, cuando se introduce agua en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion, el agua se introduce en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion aguas arriba del punto de introduccion de la mezcla de alimentacion pero aguas abajo del punto de eliminacion de la primera corriente de extracto, con respecto al flujo de eluyente.

Normalmente en esta realizacion, el disolvente organico o disolvente organico acuoso se introduce en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion aguas arriba del punto de eliminacion de la segunda corriente de extracto, con respecto al flujo de eluyente.

Normalmente en esta realizacion, cuando se introduce agua en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion, el agua se introduce en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion aguas arriba del punto de introduccion del producto intermedio pero aguas abajo del punto de eliminacion de la segunda corriente de extracto, con respecto al flujo de eluyente.

La realizacion preferida (2) es adecuada para purificar DHA de una mezcla de alimentacion.

La realizacion (2) se ilustra en la Figura 3. Una mezcla de alimentacion F que comprende el producto de PUFA (B) y componentes mas polares (C) y menos polares (A) se purifica en la primera etapa de separacion. En la primera etapa de separacion, los componentes mas polares (C) se eliminan como corriente de refinado R1. El producto de PUFA (B) y los componentes menos polares (A) se recogen como corriente de extracto E1. La corriente de extracto E1 es el producto intermedio que a continuacion se purifica en la segunda etapa de separacion. En la segunda etapa de separacion, los componentes menos polares (A) se eliminan como corriente de extracto E2. El producto de PUF^a(B) se recoge como corriente de refinado R2.

Esta realizacion se ilustra con mas detalle en la Figura 5. La Figura 5 es identica a la Figura 3, excepto que se muestran los puntos de introduccion del desorbente disolvente organico (D) y agua (W) en cada aparato cromatografico. Como anteriormente, la fase (D) es normalmente disolvente organico esencialmente puro, pero, en algunas realizaciones puede ser una mezcla de disolvente organico/agua que comprende principalmente disolvente organico. La fase (W) es normalmente agua esencialmente pura pero, en algunas realizaciones puede ser una mezcla de disolvente organico/agua que comprende principalmente agua, por ejemplo una mezcla de 98 % de agua /2 % de metanol.

Una ilustracion adicional de esta realizacion se muestra en la Figura 7. En este caso no hay punto de inyeccion de agua independiente, y en su lugar se inyecta en (D) un desorbente disolvente organico acuoso.

Normalmente en esta realizacion, el eluyente disolvente organico acuoso usado en la primera etapa de separacion contiene menos disolvente organico que el eluyente usado en la segunda etapa de separacion, es decir, la relacion agua:disolvente organico en la primera etapa de separacion es mayor que en la segunda etapa de separacion. En esta realizacion la primera corriente de refinado en la primera etapa de separacion se elimina normalmente aguas abajo del punto de introduccion de la mezcla de alimentacion en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion, con respecto al flujo de eluyente.

En una realizacion preferida de la invencion, cada uno del aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real usado en las primera y segunda etapas de separacion consta de ocho columnas cromatograficas. Estas se denominan columnas 1 a 8. En cada aparato las ocho columnas estan dispuestas en serie de modo que la parte inferior de la columna 1 esta unida a la parte superior de la columna 2, la parte inferior de la columna 2 esta unida a la parte superior de la columna 3... etc.... y la parte inferior de la columna 8 esta unida a la parte superior de la columna 1. Estas uniones pueden ser opcionalmente mediante un recipiente de retencion, con una corriente de recirculacion al interior de la siguiente columna. El flujo de eluyente a traves del sistema es de la columna 1 a la columna 2 a la columna 3 etc. El flujo efectivo de adsorbente a traves del sistema es de columna 8 a la columna 7 a la columna 6 etc.

Una realizacion la mas preferida se ilustra en la Figura 8. Una mezcla de alimentacion F que comprende el producto de PUFA (B) y componentes mas polares (C) y menos polares (A) se introduce en la parte superior de la columna 5 en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. El desorbente disolvente organico se introduce en la parte superior de la columna 1 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. Se introduce agua en la parte superior de la columna 4 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. En la primera etapa de separacion, los componentes menos polares (A) se eliminan como corriente de extracto E1 procedente de la parte inferior de la columna 2. El producto de PUFA (B) y los componentes mas polares (C) se eliminan como corriente de refinado R1 procedente de la parte inferior de la columna 7. La corriente de refinado R1 es el producto intermedio que a continuacion se purifica en la segunda etapa de separacion, al ser introducido en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion en la parte superior de la columna 5. El desorbente disolvente organico se introduce en la parte superior de la columna 1 en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. Se introduce agua en la parte superior de la columna 4 en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. En la segunda etapa de separacion, los componentes mas polares (C) se eliminan como corriente de refinado R2 en la parte inferior de la columna 7. El producto de PUFA (B) se recoge como corriente de extracto E2 en la parte inferior de la columna 2.

En esta realizacion la mas preferida, el disolvente organico se introduce normalmente en la parte superior de la columna 1 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, el agua se introduce normalmente en la parte superior de la columna 4 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, el disolvente organico se introduce normalmente en la parte superior de la columna 1 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, el disolvente organico se introduce normalmente en la parte superior de la columna 4 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, la corriente de alimentacion se introduce normalmente en la parte superior de la columna 5 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, una primera corriente de refinado se recoge normalmente como el producto intermedio procedente de la parte inferior de la columna 7 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. Este producto intermedio se purifica a continuacion en la segunda etapa de separacion y se introduce normalmente en la parte superior de la columna 5 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. La primera corriente de refinado puede recogerse opcionalmente en un recipiente antes de ser purificada en la segunda etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, una primera corriente de extracto se elimina normalmente de la parte inferior de la columna 2 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. La primera corriente de extracto puede recogerse opcionalmente en un recipiente y reintroducirse en la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, una segunda corriente de refinado se elimina normalmente de la parte inferior de la columna 7 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, una segunda corriente de extracto se recoge normalmente de la parte inferior de la columna 2 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. Esta segunda corriente de extracto normalmente contiene el producto de PUFA purificado. La segunda corriente de extracto puede recogerse opcionalmente en un recipiente y reintroducirse en la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, el eluyente usado es normalmente alcohol acuoso, preferiblemente metanol acuoso. La relacion de agua:alcohol es normalmente de 0,5:99,5 a 6:94 partes en volumen.

Normalmente, en esta realizacion mas preferida, la relacion de agua: disolvente organico en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es mas baja que la relacion de agua:disolvente organico en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. Por lo tanto, el eluyente en la primera etapa de separacion contiene normalmente mas disolvente organico que el eluyente usado en la segunda etapa de separacion.

La relacion de agua:disolvente organico en la primera etapa de separacion es normalmente de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes en volumen. La relacion de agua:disolvente organico en la segunda etapa de separacion es normalmente de 2:98 a 6:94 partes en volumen.

Aunque la realizacion de la Figura 8 esta configurada tal como se muestra en la Figura 10a, la configuracion mostrada en las Figuras 10b y 10c tambien podrfa usarse en esta realizacion.

Una realizacion la mas preferida adicional se ilustra en la Figura 9. Una mezcla de alimentacion F que comprende el producto de PUFA (B) y componentes mas polares (C) y menos polares (A) se introduce en la parte superior de la columna 5 en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. El desorbente disolvente organico acuoso se introduce en la parte superior de la columna 1 en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. En la primera etapa de separacion, los componentes menos polares (A) se eliminan como corriente de extracto E1 procedente de la parte inferior de la columna 2. El producto de PUFA (B) y los componentes mas polares (C) se eliminan como corriente de refinado R1 procedente de la parte inferior de la columna 7. La corriente de refinado R1 es el producto intermedio que se purifica en la segunda etapa de separacion al ser introducido en la parte superior de la columna 4 del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. El desorbente disolvente organico acuoso se introduce en la parte superior de la columna 1 en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. En la segunda etapa de separacion, los componentes mas polares (C) se eliminan como corriente de refinado R2 en la parte inferior de la columna 7. El producto de PUFA (B) se recoge como corriente de extracto E2 en la parte inferior de la columna 2.

En esta realizacion la mas preferida, el disolvente organico acuoso se introduce normalmente en la parte superior de la columna 1 en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, el disolvente organico acuoso se introduce normalmente en la parte superior de la columna 9 en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, la corriente de alimentacion se introduce normalmente en la parte superior de la columna 5 en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, una primera corriente de extracto se elimina normalmente de la parte inferior de la columna 2 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. La primera corriente de extracto puede recogerse opcionalmente en un recipiente y una parte reintroducirse en la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. El caudal de recirculacion de lfquido recogido mediante la corriente de extracto en la primera etapa de separacion de vuelta al interior del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es el caudal al cual el lfquido es bombeado desde este recipiente al interior de la parte superior de la columna 3.

En esta realizacion la mas preferida, una segunda corriente de refinado se elimina normalmente de la parte inferior de la columna 7 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion.

En esta realizacion la mas preferida, una segunda corriente de extracto se recoge normalmente de la parte inferior de la columna 2 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. Esta segunda corriente de extracto normalmente contiene el producto de PUFA purificado. La segunda corriente de extracto puede recogerse opcionalmente en un recipiente y una parte reintroducirse en la parte superior de la columna 3 del aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion. El caudal de recirculacion de lfquido recogido mediante la corriente de extracto procedente de la segunda etapa de separacion de vuelta al interior del aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion es el caudal al cual el lfquido es bombeado desde este recipiente al interior de la parte superior de la columna 3.

Normalmente, en esta realizacion la mas preferida, la relacion de agua: disolvente organico en el aparato cromatografico usado en la primera etapa de separacion es menor que la relacion de agua:disolvente organico en el aparato cromatografico usado en la segunda etapa de separacion. Por lo tanto, el eluyente usado en la primera etapa de separacion contiene normalmente mas disolvente organico que el eluyente usado en la segunda etapa de separacion.

La relacion de agua:disolvente organico en la primera etapa de separacion es normalmente de 0,5:99,5 a 1,5: 98,5 partes en volumen. La relacion de agua:disolvente organico en la segunda etapa de separacion es normalmente de 2:98 a 6:94 partes en volumen.

Aunque la realizacion de la Figura 9 esta configurada tal como se muestra en la Figura 10a, la configuracion mostrada en las Figuras 10b y 10c tambien podrfa usarse en esta realizacion.

El proceso de la invencion permite que se consigan purezas de producto de PUFA mucho mayores de lo que ha sido posible con las tecnicas cromatograficas convencionales. Los productos de PUFA producidos mediante el proceso de la invencion tienen tambien perfiles de impureza particularmente ventajosos, que son bastante diferentes de los observados en aceites preparados mediante tecnicas conocidas. Por lo tanto, en la presente memoria tambien se divulgan composiciones que comprenden un producto de PUFA, por ejemplo uno que se puede obtener mediante el proceso de la presente invencion.

En la practica, el proceso de la presente invencion estara controlado generalmente por un ordenador. La presente invencion, por lo tanto, tambien proporciona un programa informatico para controlar un aparato cromatografico tal como se define en la presente memoria, conteniendo el programa informatico un medio de codigo que cuando se ejecuta ordena al aparato que lleve a cabo el proceso de la invencion.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Una carga de alimentacion derivada de aceite de pescado (55 % en peso de EE del EPA, 5 % en peso de EE del DHA) se fracciona usando un sistema de cromatograffa de lecho movil real usando gel de sflice C18 unido (tamano de partfcula 5 pm) como fase estacionaria y metanol acuoso como eluyente de acuerdo con el sistema ilustrado esquematicamente en la Figura 9. Estan en conectadas en serie 8 columnas (diametro: 4,6 mm, longitud 250 mm), tal como se muestra en la Figura 9.

La mezcla de alimentacion se paso a traves del aparato SMB en una primera etapa de separacion. En la primera etapa de separacion, las condiciones del proceso se ajustaron para purificar el EPA del DHA y otras impurezas de avance lento. El EPA, junto con otras impurezas de avance rapido, se recogio en la corriente de refinado como producto intermedio. Se rechazo la corriente de extracto que contenfa DHA y otras impurezas de avance lento. Las condiciones de proceso del aparato SMB se ajustaron a continuacion para la segunda etapa de separacion. En la segunda etapa de separacion, las condiciones del proceso se ajustaron para purificar el EPA de las impurezas de avance mas rapido. El eluyente de metanol acuoso usado en la segunda etapa de separacion tenia una relacion mayor de agua:disolvente organico que el eluyente de metanol acuoso usado en la primera etapa de separacion. El producto intermedio se introdujo en el aparato SMB como la mezcla de alimentacion en la segunda etapa de separacion. Se recogio EPA de alta pureza como la corriente de extracto. Se rechazo la corriente de refinado que contiene impurezas de avance rapido.

El EPA se produjo con una pureza final de ~95 % y una recuperacion de ~ 95%.

Un analisis de HPLC de la materia prima se muestra en la Figura 11.

Los analisis de HPLC de las corrientes de refinado (R) y extracto (E) de la primera etapa de separacion se muestran en la Figura 12.

Los analisis de HPLC de las corrientes de refinado (R) y extracto (E) de la segunda etapa de separacion se muestran en la Figura 13. Un analisis de HPLC mas detallado de la corriente de extracto de la segunda etapa de separacion se muestra en la Figura 14.

Las Figuras 12 y 13 tambien muestran las condiciones del proceso para las etapas de separacion primera y segunda.

Ejemplo de referencia 1

Se llevo a cabo un experimento para comparar la cantidad de contaminantes ambientales presentes en dos productos de PUFA producidos por SMB con aceites similares preparados por destilacion. Los perfiles de los contaminantes de los aceites se muestran en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo de referencia 2

Se llevo a cabo un experimento para determinar la cantidad de impurezas isomericas presentes en un aceite preparado mediante SMB en comparacion con un aceite equivalente preparado por destilacion.

Una huella de GC del aceite rico en DHA preparado mediante SMB se muestra en la Figura 15. No hay indicios de impurezas isomericas en la huella de GC.

Una huella de GC del aceite preparado mediante destilacion se muestra en la Figura 16. Los cuatro picos con tiempos de elucion mas largos que el pico de DHA corresponden a isomeros de DHA. A partir de la huella de GC puede verse que el aceite preparado por destilacion contiene aproximadamente el 1,5 % en peso de impurezas isomericas.

Ejemplo de referencia 3

Dos productos ricos en EPA producidos mediante SMB se compararon con aceites ricos en EPA producidos mediante destilacion. El analisis del % en peso de sus PUFA componentes se muestran a continuacion.

Ejemplo de referencia 4

Un producto rico en EPA/DHA producido mediante SMB se comparo con un aceite rico en EPA/DHA producido mediante destilacion. El analisis del porcentaje en peso de sus PUFA componentes se muestra a continuacion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de separacion cromatografica para recuperar un producto de acido graso poliinsaturado (PUFA) a partir de una mezcla de alimentacion, proceso que comprende las etapas de:

(ii) purificar el producto intermedio obtenido en (i) en una segunda etapa de separacion usando un aparato de cromatograffa de lecho movil simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatograffa unidas que contienen, como eluyente, un disolvente organico acuoso, para obtener el producto de PUFA; en el que

(a) las primera y segunda etapas de separacion se llevan a cabo secuencialmente en el mismo aparato de cromatograffa, recuperandose el producto intermedio entre las primera y segunda etapas de separacion y ajustandose las condiciones del proceso en el aparato de cromatograffa entre las primera y segunda etapas de separacion de modo que el producto de PUFA se separa de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion; o

(2) el producto intermedio se recoge como la corriente de extracto en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se recoge como la corriente de refinado en la segunda etapa de separacion. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que cada aparato tiene una corriente de extracto y una corriente de refinado a partir de las cuales puede recogerse lfquido procedente de dicha pluralidad de columnas de cromatograffa unidas.

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el producto intermedio recuperado de la primera etapa de separacion esta enriquecido en el producto de PUFA en comparacion con la mezcla de alimentacion.

4. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de PUFA se separa de componentes menos polares de la mezcla de alimentacion en la primera etapa de separacion, y el producto de PUFA se separa de componentes mas polares de la mezcla de alimentacion en la segunda etapa de separacion.

5. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de PUFA comprende al menos un PUFA w-3 y en el que el producto de PUFA comprende preferiblemente EPA y/o DHA.

6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el eluyente es una mezcla de agua y un alcohol, un eter, un ester, una cetona o un nitrilo, y en el que el eluyente es preferiblemente una mezcla de agua y metanol.

7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de alimentacion es un aceite de pescado o una carga de alimentacion derivada de aceite de pescado, el producto de PUFA es EPA o ester etflico del EPA, y el producto de PUFA se produce con una pureza mayor del 90 %, preferiblemente con una pureza mayor del 95 % y mas preferiblemente con una pureza mayor del 97 %.

8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que

(a) parte de la corriente de extracto procedente del aparato usado en la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion; y/o

(b) parte de la corriente de refinado procedente del aparato usado en la primera etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la primera etapa de separacion; y/o

(c) parte de la corriente de extracto procedente del aparato usado en la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion; y/o

(d) parte de la corriente de refinado procedente del aparato usado en la segunda etapa de separacion se recircula de vuelta al interior del aparato usado en la segunda etapa de separacion.

9. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relacion de agua:disolvente organico usada en cada etapa de separacion se ajusta de tal manera que el producto de PUFA se puede separar de diferentes componentes de la mezcla de alimentacion en cada etapa de separacion.

10. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relacion en volumen de agua:disolvente organico del eluyente en la primera etapa de separacion es menor que la relacion en volumen de agua:disolvente organico del eluyente en la segunda etapa de separacion.

11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relacion en volumen de agua:disolvente organico del eluyente en la primera etapa de separacion es de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes en volumen, y la relacion en volumen de agua:disolvente organico del eluyente en la segunda etapa de separacion es de 4,5:95:5 a 5,5:94,5 partes en volumen.

12. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relacion en volumen de agua:disolvente organico del eluyente en la primera y segunda etapas de separacion se controla introduciendo agua y/o disolvente organico en una o mas columnas en los aparatos usados en la primera y segunda etapas de separacion.

13. Un programa informatico para controlar un aparato de cromatograffa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, programa informatico que contiene un medio de codigo que, cuando se ejecuta, indica al aparato que lleve a cabo un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.