ES2710662T3 - Compuestos de acilguanidina con actividad antiviral - Google Patents

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Abstract

Compuesto seleccionado del grupo que consiste en: (3-benzoil)cinamoilguanidina, 3(indan-4-il)-propenoilguanidina, 2,3-metilendioxicinamoilguanidina, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

DESCRIPCION
Compuestos de acilguanidina con actividad antiviral
Campo de invencion
La presente invencion se refiere a compuestos y composiciones novedosos que tienen actividad antiviral. La invencion tambien se refiere a metodos para retardar, reducir o inhibir de otro modo el crecimiento y/o la actividad funcional virales.
Antecedentes de la invencion
En la actualidad existe una gran necesidad de desarrollo de nuevos tratamientos que sean eficaces contra infecciones virales, en particular contra infecciones virales que esten asociadas con alta morbimortalidad y que afecten a poblaciones considerables. Los tratamientos disponibles actualmente son inadecuados o ineficaces en grandes proporciones de pacientes infectados.
Un gran numero de virus contribuyen al conjunto de patogenos humanos significativos. Los ejemplos de estos incluyen los virus de las familias de Lentivirus y Flavivirus, por ejemplo VIH, virus de la hepatitis C (VHC), virus del dengue.
Para mejorar la perspectiva de tratamiento y prevencion de infecciones virales, y para enfrentarse a la continua evolucion viral, hay una necesidad continua de identificar moleculas que puedan inhibir diversos aspectos del ciclo de vida viral. Varios de tales compuestos se dan a conocer en el documento PCT/AU2004/000866 (WO2004/112687). Sin embargo, existe todavfa la necesidad de composiciones y agentes novedosos adicionales con actividad antiviral.
Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 45, n.° 8. 1997, paginas 1282-1286 describe un metodo de smtesis basico para naftoilguanidina y derivados de halo y alcoxilo.
Arzneimittel-Forschung, vol. 25, n.° 10, 1975, paginas 1477-1482 describe la smtesis de una nueva serie de fenilacetilguanidinas. Varias de ellas presentan alta actividad anhihipertensora en la rata. El elemento mas potente de la serie es clorhidrato de N-amidino-2-(2,6-diclorofenil)acetamida [clorhidrato de 2,6-diclorofenilacetilguanidina, compuesto 19]. Se comentan las relaciones estructura-actividad en esta clase de compuestos.
El documento WO 94/26709 A1 describe compuestos, en particular compuestos que tienen benzoil-guanidina como estructura principal (vease la formula (I))
Figure imgf000002_0001
El documento US 4.251.545 A describe principalmente benzoilguanidinas, aunque tambien se describe alcoxi-naftilcomo sustituyente de carbamilguanidina principal. Se describe el uso de los compuestos para proteger plantas y partes de plantas del ataque fungico.
El documento JP 08 225513 A describe naftoilguanidinas del tipo:
Figure imgf000002_0002
en el que R es halogeno o alcoxilo. Los compuestos se dan a conocer para su uso contra canales ionicos celulares.
El documento DE 4421536 A1 describe compuestos que tienen grupos sustituyentes de per-fluoroalquilo en estructuras principales de benzoilguanidina.
El documento EP 0810206 A1 describe diversos compuestos de 2-naftoilguanidina sustituidos.
El documento EP 0744397 A2 describe diversos compuestos de fluorocinamoilguanidina.
Un objeto de la presente invencion es superar o mejorar al menos una de las desventajas de la tecnica anterior, o proporcionar una alternativa util.
Cualquier discusion de la tecnica anterior en toda la memoria descriptiva no debe considerarse en modo alguno una admision de que tal tecnica anterior se conozca ampliamente o forme parte del conocimiento general comun en el campo.
Sumario de la invencion
Los inventores han encontrado sorprendentemente que determinados compuestos que se encuentran dentro de la clasificacion de acilguanidinas sustituidas tienen actividad antiviral contra virus de una variedad de familias de virus diferentes. Varios de tales compuestos se dan a conocer en el documento PCT/AU2004/000866.
La presente invencion se refiere a determinados compuestos antivirales novedosos que se encuentran dentro de la clasificacion de acilguanidinas sustituidas.
Segun un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto seleccionado del grupo que consiste en (3-benzoil)cinamoilguanidina,
3(indan-4-il)-propenoilguanidina,
2,3-metilendioxicinamoilguanidina,
y sales farmaceuticamente aceptables del mismo.
Los grupos amina o imina de la parte guanidilo de los compuestos de formula I pueden estar presentes en cualquier forma convencional usada para proporcionar tales compuestos. Por ejemplo, pueden estar presentes como la base libre, un hidrato, una sal organica o inorganica o combinaciones de los mismos.
Preferiblemente, los compuestos de la invencion poseen actividad antiviral y pueden reducir, retardar o inhibir de otro modo el crecimiento y/o la replicacion virales.
Ejemplos de virus preferidos contra los que son activos los compuestos de la presente invencion, son virus de las familias de Lentivirus y Flavivirus. Mas preferiblemente, el virus es el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus del dengue. Lo mas preferiblemente, el virus es VHC, VIH-1 y VIH-2. Segun un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun el primer aspecto, y opcionalmente uno o mas portadores o derivados farmaceuticamente aceptables. Los compuestos activos pueden estar presentes en forma de cualquier sal, aducto, en formas anhidras o solvatadas adecuados.
En una realizacion, las composiciones de la invencion comprenden ademas uno o mas compuestos o moleculas conocidos que tienen actividad antiviral. Los compuestos antivirales conocidos pueden seleccionarse del grupo que consiste en vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, valaciclovir, cidofovir, famciclovir, ribavirina, amantadina, rimantadina, interferon, oseltamivir, palivizumab, rimantadina, zanamivir, inhibidores analogos de nucleosidos de la transcriptasa inversa (NRTI) tales como zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina y abacavir, inhibidores no nucleosidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) tales como nevirapina, delavirdina y efavirenz, inhibidores de proteasa tales como saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, y otros compuestos y preparaciones antivirales conocidos.
Segun un tercer aspecto, se proporciona un compuesto segun el primer aspecto o una composicion farmaceutica segun el segundo aspecto para su uso en reducir, retardar o inhibir de otro modo el crecimiento y/o la replicacion de un virus.
Segun un cuarto aspecto, se proporciona un compuesto segun el primer aspecto o una composicion farmaceutica segun el segundo aspecto para su uso en prevenir la infeccion de una celula expuesta a un virus.
Segun un quinto aspecto de la invencion, se proporciona un compuesto segun el primer aspecto o una composicion farmaceutica segun el segundo aspecto para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de un sujeto expuesto a o infectado con un virus.
Preferiblemente, el virus procede de las familias de Lentivirus y Flavivirus. Mas preferiblemente, el virus es el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus del dengue. Lo mas preferiblemente, el virus es VHC, VIH-1 y VIH-2.
Preferiblemente, el sujeto que se somete a tratamiento terapeutico o profilactico es un mairnfero, tal como, pero sin limitarse a, un ser humano, primate, animal de ganadena (por ejemplo oveja, vaca, caballo, burro, cerdo), animal de comparua (por ejemplo perro, gato), animal de laboratorio (por ejemplo raton, conejo, rata, cobaya, hamster), o animal salvaje en cautividad (por ejemplo zorro, ciervo). Preferiblemente, el sujeto es un primate. Lo mas preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
Preferiblemente, la composicion farmaceutica puede comprender ademas uno o mas compuestos o moleculas antivirales. Los compuestos antivirales conocidos pueden seleccionarse del grupo que consiste en vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, valaciclovir, cidofovir, famciclovir, ribavirina, amantadina, rimantadina, interferon, oseltamivir, palivizumab, rimantadina, zanamivir, inhibidores analogos de nucleosidos de la transcriptasa inversa (NRTI) tales como zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina y abacavir, inhibidores no nucleosidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) tales como nevirapina, delavirdina y efavirenz, inhibidores de proteasa tales como saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, y otros compuestos y preparaciones antivirales conocidos.
En el caso de cualquier incoherencia en la presente memoria descriptiva entre los compuestos nombrados y la formula estructural, ha de preferirse la formula estructural.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Inhibicion de V IH -W l mediante compuesto BIT y citotoxicidad celular en macrofagos humanos primarios. Las curvas de respuesta a la dosis de “%VC” representan las cifras en “porcentaje de crecimiento de virus de control” calculadas basandose en los niveles de virus medios (de pocillos por triplicado) en pocillos que contienen compuesto (en concentracion decreciente) en comparacion con los controles (sin compuesto). Se determinaron los niveles de VIH-1 usando ELISA de p24 y se convirtieron en el porcentaje de los valores de control basandose en los niveles de p24 del virus detectados en los pocillos de cultivo de control que no conteman compuesto. Se calculo la curva “de viabilidad en %” a partir de los datos de DO560nm generados a partir de ensayos de MTT como una medida de la viabilidad celular. Los valores de DO (media de pocillos por triplicado) se convirtieron en un porcentaje de controles (que no contienen compuesto). El nivel del 50% se indica mediante la lmea horizontal para permitir la estimacion de los valores de CI50 y CT50.
Figura 2. Citotoxicidad celular. Los compuestos se sometieron a prueba para determinar la citotoxicidad en un amplio intervalo de concentraciones.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se basa, en parte, en la sorprendente observacion de que determinadas acilguanidinas sustituidas tienen actividad antiviral contra una amplia variedad de virus incluyendo los de las familias de Lentivirus y Flavivirus.
La presente divulgacion se refiere en general a compuestos de formula I:
Figure imgf000004_0001
R1 es fenilo, fenilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido o R1 se selecciona de
Figure imgf000004_0002
y
n es 1, 2, 3 o 4;
Figure imgf000005_0005
F es independientemente
Figure imgf000005_0006
halogeno, alquilo, halo o polihaloalquilo;
Q es independientemente hidrogeno, alcoxilo especialmente metoxilo, alquilo especialmente metilo, cicloalquilo, tienilo, furilo, pirazolilo, pirazolilo sustituido, piridilo, piridilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, halo especialmente cloro o bromo, heterociclo “het”, o Q se selecciona inde endientemente de
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0004
X es hidrogeno o alcoxilo, y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Los compuestos particularmente utiles pueden seleccionarse de los siguientes:
(3-benzoil)cinamoilguanidina que comprende la estructura
Figure imgf000005_0001
2,3-metilendioxicinamoilguanidina que comprende la estructura
Figure imgf000005_0003
3(indan-4-il)-propenoilguanidina que comprende la estructura
Figure imgf000006_0001
y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los grupos amina o imina de la parte guanidilo de los compuestos de formula I pueden presentarse en cualquier forma convencional usada para proporcionar tales compuestos. Por ejemplo, pueden estar presentes como la base libre, un hidrato, una sal organica o inorganica o combinaciones de los mismos.
Los metodos desarrollados para examinar los compuestos de la presente invencion para determinar la actividad antiviral se describen en detalle en el documento WO2004/112687.
La referencia a “VIH”, “VHC” y “virus del dengue” y similares debe entenderse como una referencia a cualquier cepa de VIH, VHC o virus del dengue e incluyendo homologos y mutantes. La referencia a la “actividad funcional” de un virus debe entenderse como una referencia a una cualquiera o mas de las funciones que realiza un virus o en la que esta implicado.
La referencia a la “replicacion viral” debe entenderse que incluye una cualquiera o mas fases o aspectos del ciclo de vida viral, tal como inhibir el ensamblaje o la liberacion de viriones. Por consiguiente, el metodo de la presente invencion engloba la mediacion de replicacion viral por medio de la induccion de una cascada de etapas que conducen a la mediacion de uno cualquiera o mas aspectos o fases del ciclo de vida viral.
La referencia a una “celula” infectada con un virus debe entenderse como una referencia a cualquier celula, procariota o eucariota, que se ha infectado con un virus. Esto incluye, por ejemplo, lmeas celulares inmortales o primarias, cultivos bacterianos y celulas in situ.
Los expertos en la tecnica entenderan que los compuestos de la invencion pueden administrarse en forma de una composicion o formulacion que comprende portadores y/o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender ademas uno o mas compuestos o moleculas antivirales conocidos. Preferiblemente, los compuestos antivirales conocidos se seleccionan del grupo que consiste en vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, valaciclovir, cidofovir, famciclovir, ribavirina, amantadina, rimantadina, interferon, oseltamivir, palivizumab, rimantadina, zanamivir, inhibidores analogos de nucleosidos de la transcriptasa inversa (NRTI) tales como zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina y abacavir, inhibidores no nucleosidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) tales como nevirapina, delavirdina y efavirenz, inhibidores de proteasa tales como saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, y otros compuestos y preparaciones antivirales conocidos.
El sujeto de la inhibicion viral es un mairnfero, tal como, pero sin limitarse a, un ser humano, primate, animal de ganadena (por ejemplo oveja, vaca, caballo, burro, cerdo), animal de comparua (por ejemplo perro, gato), animal de laboratorio (por ejemplo raton, conejo, rata, cobaya, hamster), o animal salvaje en cautividad (por ejemplo zorro, ciervo). Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. Mas preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
La presente invencion es util en el tratamiento y la profilaxis de la infeccion viral tal como, por ejemplo, VIH, VHC, dengue y otras infecciones virales. Por ejemplo, puede afectarse la actividad antiviral en sujetos que se sabe que estan infectados con VIH con el fin de evitar la replicacion de VIH, evitando de ese modo la aparicion de sida. Alternativamente, la presente invencion puede usarse para reducir la carga viral en suero o para aliviar los smtomas de la infeccion viral. Este concepto se aplica a cualquier infeccion viral.
La presente invencion puede ser particularmente util o bien en las fases tempranas de la infeccion viral para evitar el establecimiento de un deposito viral en celulas afectadas o como tratamiento profilactico que va a aplicarse inmediatamente antes de o durante un periodo tras la exposicion a una posible fuente de virus.
La referencia en el presente documento a “terapeutico” y “profilactico” ha de considerarse en sus contextos mas amplios. El termino “terapeutico” no implica necesariamente que un mamffero se trate hasta la recuperacion total. De manera similar, “profilactico” no significa necesariamente que el sujeto no contraera finalmente un estado patologico. Por consiguiente, terapia y profilaxis incluyen mejora de los smtomas de un estado particular o prevencion o reduccion de otro modo del riesgo de desarrollar un estado particular. El termino “profilaxis” puede considerarse reduccion de la gravedad del comienzo de un estado particular. La terapia tambien puede reducir la gravedad de un estado existente o la frecuencia de ataques agudos.
Segun la presente invencion, puede coadministrarse mas de un compuesto o composicion con uno o mas de otros compuestos, tales como compuestos antivirales conocidos. Mediante “coadministrado” quiere decirse la administracion simultanea de la misma formulacion o en dos formulaciones diferentes por medio de la misma v^a o de vfas diferentes o la administracion secuencial mediante la misma via o vfas diferentes. Mediante administracion “secuencial” quiere decirse una diferencia de tiempo de segundos, minutos, horas o dfas entre la administracion de los dos o mas compuestos separados. Los compuestos antivirales objeto pueden administrarse en cualquier orden.
Las vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intracraneal, intradermica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracerebral, intranasal, transmucosa, o por via oral mediante infusion, por via rectal, por medio de goteo i.v., parche e implante. Se prefieren particularmente las vfas intravenosas.
Las composiciones adecuadas para su uso inyectable incluyen disoluciones acuosas esteriles (solubles en agua) y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones inyectable esteriles. El portador puede ser un medio de dispersion o disolvente que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La prevencion de la accion de microorganismos puede provocarse por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se preparan disoluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros componentes enumerados anteriormente, segun sea necesario, seguido por, por ejemplo, esterilizacion mediante filtro o esterilizacion mediante otros medios apropiados. Tambien se contemplan dispersiones y pueden prepararse incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vetuculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros componentes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, un metodo de preparacion preferido incluye secado a vacfo y la tecnica de liofilizacion que producen un polvo del principio activo mas cualquier componente deseado adicional a partir de una disolucion filtrada previamente de manera esteril.
Cuando los principios activos se protegen de manera adecuada, pueden administrarse por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible que puede asimilarse, o pueden encerrarse en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse para dar comprimidos. Para la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos que pueden ingerirse, comprimidos para chupar, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0,01% en peso, mas preferiblemente el 0,1% en peso, incluso mas preferiblemente el 1% en peso de compuesto activo. Naturalmente, el porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variarse y puede ser de manera conveniente de entre el 1 y el 99%, mas preferiblemente entre el 2 y el 90%, incluso mas preferiblemente entre el 5 y el 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapeuticamente utiles es de manera que se obtendra una dosificacion adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas segun la presente invencion se preparan de modo que una forma unitaria de dosificacion oral contiene entre 0,1 ng y 2000 mg de compuesto activo.
Los comprimidos, trociscos, pfldoras, capsulas y similares pueden contener los componentes tal como se enumeran a continuacion en el presente documento: puede anadirse un aglutinante tal como goma, goma arabiga, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato de dicalcio; un disgregante tal como almidon de mafz, almidon de patata, acido algmico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante tal como menta piperita, aceite de gaulteria o saborizante de cereza. Cuando la forma de unidad de dosificacion es una capsula, puede contener, ademas de materiales del tipo anterior, un portador lfquido. Pueden estar presentes otros materiales diversos como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la unidad de dosificacion. Por ejemplo, pueden recubrirse comprimidos, pfldoras o capsulas con goma laca, azucar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante tal como sabor a cereza o naranja. Cualquier material usado en la preparacion de cualquier forma de unidad de dosificacion debe ser farmaceuticamente puro y sustancialmente no toxico en las cantidades empleadas. Ademas, el/los compuesto(s) activo(s) puede(n) incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberacion sostenida.
La presente invencion tambien se extiende a formas adecuadas para aplicacion topica tales como cremas, lociones y geles. En tales formas, puede ser necesario modificar los peptidos anticoagulantes para permitir la penetracion de la barrera de superficie.
Procedimientos para la preparacion de formas de unidad de dosificacion y preparaciones topicas estan disponibles facilmente para los expertos en la tecnica a partir de textos tales como Pharmaceutical Handbook A Martindale Companion Volume Ed. Ainley Wade, Decimonovena edicion, The Pharmaceutical Press Londres, CRC Handbook of Chemistry and Physics Ed. Robert C. Weast Ph D. CRC Press Inc.; Goodman y Gilman's; The Pharmacological basis of Therapeutics. Novena ed. McGraw Hill; Remington; y The Science and Practice of Pharmacy.
Decimonovena ed. Ed. Alfonso R. Gennaro Mack Publishing Co. Easton, Pensilvania.
Los portadores y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retardo de la absorcion y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso del mismo en composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios.
Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. La forma de unidad de dosificacion tal como se usa en el presente documento se refiere unidades ffsicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos mairnferos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de unidad de dosificacion novedosas de la invencion se dictan por y dependen directamente de (a) las caractensticas unicas del material activo y el efecto terapeutico particular que va a lograrse y (b) las limitaciones inherentes a la tecnica de composicion.
Las cantidades eficaces contempladas por la presente invencion variaran dependiendo de la gravedad del estado y de la salud y la edad del receptor. En terminos generales, las cantidades eficaces pueden variar desde 0,01 ng/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.
Las cantidades alternativas incluyen desde aproximadamente 0,1 ng/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o desde 1,0 ng/kg de peso corporal hasta aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal. El sujeto de la inhibicion viral es generalmente un marnffero tal como, pero sin limitarse a un ser humano, primate, animal de ganadena (por ejemplo oveja, vaca, caballo, burro, cerdo), animal de comparMa (por ejemplo perro, gato), animal de laboratorio (por ejemplo raton, conejo, rata, cobaya, hamster), animal salvaje en cautividad (por ejemplo zorro, ciervo). Preferiblemente, el sujeto es un ser humano o primate. Mas preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
Ahora se describira la presente invencion en mas detalle con referencia a ejemplos espedficos que describen protocolos de smtesis, inhibicion viral y otras propiedades antivirales de los compuestos de la presente invencion. La smtesis y el examen para los compuestos que tienen actividad antiviral pueden lograrse mediante la variedad de metodologfas descritas en el presente documento o descritas en mas detalle en el documento WO2004/112687. Ejemplos
La actividad antiviral de todos los compuestos de la presente invencion puede y se ha determinado usando los metodos descritos en el presente documento o descritos en detalle en el documento PCT/AU2004/000866. Ademas, pueden usarse metodos para la smtesis de los compuestos de la invencion, tanto genericos como espedficos, descritos en el presente documento, descritos en publicaciones a las que se hace referencia o conocidos de otro modo por los expertos en la tecnica, para preparar todos los compuestos de la presente invencion.
Mas espedficamente, las acilguanidinas pueden sintetizarse mediante una variedad de metodos incluyendo haciendo reaccionar guanidina (generada generalmente in situ a partir de su sal de clorhidrato) con un derivado activado de manera adecuada de un acido carboxflico. Los ejemplos incluyen:
i) smtesis a partir de cloruros de acido, ejemplificada por Yamamoto et al., Chem. Pharm. Bull., 1997, 45, 1282 ii) smtesis a partir de esteres simples, ejemplificada por la patente estadounidense 2.734.904.
iii) smtesis a partir de acidos carboxflicos, a traves de activacion in situ mediante carbonildiimidazol, ejemplificada por la patente estadounidense 5.883.133
Los precursores de acido carboxflico requeridos para la preparacion de las acilguanidinas descritas en el presente documento se obtuvieron mediante una variedad de metodos diversos. Un gran numero de los acidos cinamicos sustituidos estan disponibles comercialmente. Ademas, en la tecnica se describen bien numerosos procedimientos para la smtesis de acidos cinamicos sustituidos y sus esteres simples, incluyendo:
i) La reaccion de acido malonico con un aldelddo aromatico y una base (la condensacion de Doebner), descrita en Chemical Reviews, 1944, 35, 156.
ii) La reaccion de antndrido acetico con un aldetndo aromatico y una base (la reaccion de Perkin), descrita en Organic Reactions, 1942, 1,210.
iii) La reaccion de acido acnlico y esteres simples del mismo con un haluro aromatico o triflato aromatico usando catalizador de paladio (la reaccion de Heck), descrita en Organic Reactions, 1982, 28, 345.
iv) La reaccion de un fosfonoacetato de trialquilo con un aldetndo aromatico y una base (la reaccion de Horner-Emmons), descrita en Organic Reactions, 1977, 25, 73.
Varios acidos naftoicos simples sustituidos con halo, hidroxilo y alcoxilo o bien estan disponibles comercialmente o bien se conocen en la tecnica y proporcionan los materiales de partida para las naftoilguanidinas sustituidas Los acidos naftoicos que estan sustituidos con grupos alquilo, cicloalquilo, arilo y heterodclico pueden prepararse a menudo haciendo reaccionar un acido halonaftoico con un reactivo organometalico adecuado usando un catalizador de metal de transicion. Una variante tal de esta metodologfa que se uso para preparar varios de los acidos naftoicos sustituidos usados como precursores para las naftoilguanidinas descritas en el presente documento, fue la reaccion de formacion de un enlace carbono-carbono catalizada por paladio entre acidos bromonaftoicos y un acido boronico sustituido de manera adecuada (o ester de boronato) que se conoce ampliamente en la tecnica como acoplamiento de Suzuki (descrito en Chemical Reviews, 1995, 95, 2457 y referencias en ella). La reaccion tiene una amplia aplicabilidad y puede usarse en una variedad de halonaftalenos sustituidos que entonces pueden elaborarse adicionalmente para introducir o desenmascarar el grupo de acido carboxflico requerido.
1. Metodologia de sintesis general
1.1 Procedimiento general A -Preparacion de triflatos de arilo
A una disolucion del fenol (10 mmol) en piridina (7 ml) a 0°C se le anadio lentamente anhfdrido trifluorometanosulfonico (11 mmol, 1,1 eq). Se agito la mezcla resultante a 0°C durante 5 minutos adicionales antes de dejar que se calentara hasta temperatura ambiente y se agito hasta que el analisis de CCF mostro que el fenol de partida se habfa consumido. Entonces se vertio la mezcla en agua y se extrajo con acetato de etilo (x3). Se lavaron los extractos combinados secuencialmente con agua, acido clortndrico acuoso 1 M, agua y salmuera, entonces se secaron (MgSO4) y se concentraron a vado para dar el producto en bruto. Los productos en bruto se cromatografiaron sobre gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los triflatos de arilo deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.2 Procedimiento general B - Esteres de cinamato por medio de reaccion de Heck de triflatos
Se calento una mezcla del triflato de fenilo (10 mmol), acrilato de metilo (14 mmol, 1,4 eq), trietilamina (40 mmol, 4 eq) y diclorobis(trifenilfosfina)paladio (0,3 mmol, 0,03 eq) en dimetilformamida (30 ml) a 90°C. Se monitorizo la reaccion mediante CG/EM y se anadieron lotes recien preparados de acrilato de metilo (1 eq), trietilamina (2 eq) y el catalizador de paladio (0,03 eq) segun fue necesario, en un esfuerzo por forzar la reaccion a completarse. Entonces se vertio la mezcla en agua y se extrajo con una mezcla de dietil eter/hexanos 1:1 (x3). Se lavaron los extractos combinados con agua, luego con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron a traves de un lecho de gel de sflice y se concentro el filtrado a vado para dar el producto en bruto como un aceite. Los productos en bruto se cromatografiaron sobre gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los cinamatos de metilo deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.3 Procedimiento general C - Esteres de cinamato por medio de reaccion de Heck de bromuros
Se anadieron el bromuro de arilo (10 mmol), acetato de paladio (0,1 mmol, 0,01 eq) y tri-o-tolilfosfina (0,4 mmol, 0,04 eq) al matraz de reaccion y se purgaron con nitrogeno. A esto, se le anadieron entonces acrilato de metilo (12,5 mmol, 1,25 eq), trietilamina (12,5 mmol, 1,25 eq) y dimetilformamida (1 ml) y se calento la mezcla a 100°C. Se monitorizo la reaccion mediante CG/EM y se anadieron lotes recien preparados de acetato de paladio (0,01 eq), trio-tolilfosfina (0,04 eq), acrilato de metilo (1,25 eq) y trietilamina (1,25 eq) segun fue necesario, en un esfuerzo por forzar la reaccion a completarse. Se vertio la mezcla en agua y se extrajo con una mezcla de dietil eter/hexanos 1:1 (x4). Se lavaron los extractos combinados con agua, luego con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron a traves de un lecho de gel de sflice y se concentro el filtrado a vado para dar el producto en bruto. Los productos en bruto se cromatografiaron sobre gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los cinamatos de metilo deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.4 Procedimiento general D - Esteres de cinamato por medio de reaccion de Horner-Emmons
Se añadió una disolucion de fosfonoacetato de trietilo (13 mmol, 1,3 eq) en tetrahidrofurano anhidro (10 ml), a lo largo de 5 minutos, a una suspension de hidruro de sodio (14,3 mmol, 1,4 eq) en tetrahidrofurano anhidro (10 ml) a 0°C bajo nitrogeno. Entonces se agito la mezcla a 0°C durante 20 minutos. Entonces se le anadio una disolucion del benzaldehfdo (10 mmol) en tetrahidrofurano (15 ml) a lo largo de 10 minutos a 0°C. Se agito la mezcla a 0°C durante 30 minutos adicionales antes de dejar en agitacion a temperatura ambiente hasta que el analisis de CG/EM o CCF mostro que el material de partida de benzaldehfdo se habfa consumido. Normalmente, las reacciones se dejaron en agitacion a temperatura ambiente durante la noche para garantizar el consumo completo del aldetndo de partida. Se vertio la mezcla en agua, se separo la fase organica y se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (x3). Entonces se lavaron los extractos organicos combinados con agua, luego con salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron a vado para dar el producto en bruto. Los productos en bruto se cromatografiaron sobre gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los cinamatos de etilo deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.5 Procedimiento general E - Preparacion de esteres 5-fenilpenta-2,4-dienoicos
Se añadió una disolucion de 4-fosfonocrotonato de trietilo (26 mmol, 1,3 eq) en tetrahidrofurano anhidro (10 ml), a lo largo de 5 minutos, a una suspension de hidruro de sodio (28 mmol, 1,4 eq, suspension del 60% en aceite) en tetrahidrofurano anhidro (15 ml) a 0°C bajo nitrogeno. Entonces se agito la mezcla a 0°C durante 20 minutos. Entonces se le un aaña ddiisóolucion del benzaldehndo (20 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml) a lo largo de 10 minutos a 0°C. Se agito la mezcla a 0°C durante 30 minutos adicionales y entonces se dejo en agitacion a temperatura ambiente hasta que el analisis de CG/EM mostro que el aldehndo de partida se habfa consumido. Se vertio la mezcla de reaccion en agua, se separo la fase organica y se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (x3). Entonces se lavaron los extractos organicos combinados con agua, luego con salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron a vado para dar el ester etflico en bruto como un aceite. Los productos en bruto se cromatografiaron sobre gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los esteres de etilo deseados como aceites incoloros.
1.6 Procedimiento general F - Hidrolisis de esteres
Se trato una disolucion del ester (10 mmol) en metanol (50 ml) y agua (5 ml) con una disolucion acuosa de hidroxido de potasio 6 M (20 mmol, 2 eq) y se calento la mezcla a reflujo hasta que el analisis de CCF mostro que no estaba presente mas material de partida (habitualmente 2-3 horas). Entonces se vertio la mezcla en agua (50-200 ml) y se acidifico con acido clorhndrico concentrado hasta aproximadamente pH 2. Se recogio el acido carboxflico resultante mediante filtracion, se lavo con agua y se seco durante la noche a alto vado.
1.7 Procedimiento general G - Reacciones de Suzuki de acidos bromonaftoicos
Se anadieron el acido bromo-2-naftoico (2 mmol), el acido boronico apropiado (o ester de boronato) (2,2 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,1 mmol) y carbonato de sodio solido (6,8 mmol) al matraz de reaccion que entonces se purgo con nitrogeno. Se anadieron acetonitrilo (6 ml) y agua (2,5 ml) y se calento la mezcla a reflujo con agitacion vigorosa hasta que el acido bromo-2-naftoico de partida se habfa consumido. Entonces se repartio la mezcla de reaccion entre tolueno (50 ml) y disolucion de hidroxido de sodio 0,5 M (100 ml). Se lavo la fase acuosa con tolueno (para eliminar cualquier trifenilfosfina, 3 x 20 ml), entonces se acidifico hasta pH 1 con acido clorhndrico concentrado. Se extrajeron los derivados de acido naftoico en acetato de etilo (4 x 20 ml). Se lavaron los extractos de acetato de etilo combinados con agua (3 x 20 ml) y salmuera (10 ml), entonces se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. Se analizo el residuo mediante 1H RMN, y se cromatografiaron sobre gel de sflice (si fue necesario).
1.8 Procedimiento general H - Preparacion de acilguanidinas
A una suspension/solucion de acido carboxflico (10 mmol, 1,0 eq) en diclorometano (30 ml) que contema una gota de dimetilformamida se le cloruro de o axñaalildoió (12 mmol, 1,2 eq) lo que hizo que la disolucion efervesciera. Tras agitar durante 2 h, se evaporo la disolucion resultante hasta la sequedad a presion reducida. Se disolvio el residuo en tetrahidrofurano seco (30 ml) y se a una disolucion de añ calodiróhidrato de guanidina (50 mmol, 5,0 eq) en hidroxido de sodio acuoso 2M (30 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 1h y entonces se separo la fase de tetrahidrofurano. Se extrajo la fase acuosa con cloroformo (100 ml) seguido por acetato de etilo (100 ml) y las fases organicas combinadas evaporadas a presion reducida. Se repartio el residuo resultante entre cloroformo (200 ml) e hidroxido de sodio acuoso 2 M (100 ml) y se separo la fase organica y se seco (Na2SO4). Se filtro la disolucion y se evaporo a presion reducida hasta el momento en que comenzo a precipitar un solido. En este punto se anadieron hexanos produciendo la precipitacion del producto que se recogio por filtracion y se seco a alto vado.
2. Ejemplos experimentales de sintesis
Ejemplo 1: 4-Hidroxiindano
Se añadió 4-aminoindano (3,0 g) a una disolucion de acido sulfurico concentrado (2,4 ml) en agua (15 ml). Se anadio mas agua (15 ml) y se enfrio la mezcla hasta 5°C. Se una disolucion de nitrito de s aoñdaidoió (1,71 g) en agua (4,5 ml) en porciones a la mezcla a la vez que se mantema la temperatura por debajo de 5°C. Una vez completa la adicion, de dejo que la mezcla se calentara hasta temperatura ambiente y se anadio urea (0,29 g). Se agito la mezcla durante 5 minutos adicionales antes de calentarse a 45°C durante 30 minutos. Entonces se enfrio la mezcla hasta temperatura ambiente y se extrajo con acetato de etilo. Se lavaron los extractos organicos combinados con hidroxido de sodio acuoso 2 M (2x100 ml) y se acidificaron entonces estos extractos acuosos con acido clorhndrico y se extrajeron con acetato de etilo (3x100 ml). Entonces se lavaron los extractos organicos combinados con salmuera y se secaron (Na2SO4) antes de concentrarse a vado. Se cromatografio el producto en bruto resultante sobre gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:7) dio 4-hidroxiindano como un aceite naranja (1,0 g).
Ejemplo 2: Triflato de 4-indanilo
A una disolucion de 4-hidroxiindano (1,2 g, 8,9 mmol) en piridina (5 ml) a 0°C se anadio lentamente anhndrido trifluorometanosulfonico (1,6 ml, 9,8 mmol). Se agito la mezcla resultante a 0°C durante 5 minutos antes de dejar que se calentara hasta temperatura ambiente y entonces se agito durante 45 minutos. Entonces se vertio la mezcla en agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). Se lavaron los extractos combinados secuencialmente con agua, acido clorhndrico acuoso 1 M, agua y salmuera, entonces se secaron (Na2SO4) y se concentraron a vado para dar el triflato en bruto como un aceite naranja (2,13 g, 89%).
Ejemplo 3: 3-(Indan-4-il)acrilato de metilo
Se calento una mezcla de triflato de 4-indanilo en bruto (2,13 g, 8,0 mmol), acrilato de metilo (1,01 ml, 11,2 mmol), trietilamina (4,4 ml, 32 mmol, 4 eq) y diclorobis(trifenilfosfina)paladio (170 mg, 0,24 mmol) en dimetilformamida (15 ml) a 85°C durante 71 horas. Se retiro una alfcuota pequena y se proceso para el analisis de CG/EM que revelo que todavfa estaba presente una cantidad significativa de material de partida. Se anadieron mas acrilato de metilo (0,7 ml), trietilamina (2 ml) y el catalizador de paladio (170 mg) y se calento la mezcla durante 24 horas adicionales. Entonces se vertio la mezcla en agua, se extrajo con acetato de etilo y se lavaron los extractos organicos con agua, luego con salmuera, se secaron (Na2SO4), y se concentraron a vado para dar el producto en bruto como un aceite (2,4 g). Se cromatografio el producto en bruto sobre gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:19) dio el triflato de partida (812 mg, 38%) como un aceite incoloro, seguido por el 3-(indan-4-il)acrilato de metilo deseado como un aceite marron (880 mg, 54%).
Ejemplo 4: 3-Benzoilcinamato de metilo
A una mezcla de 3-bromobenzofenona (5,0 g, 19 mmol), acetato de paladio (215 mg, 0,958 mmol) y tri-o-tolilfosfina (290 mg, 0,953 mmol) se le trietilamin aaña (d3ió,3 ml, 45 mmol), tolueno (4 ml) y acrilato de metilo (2,2 ml, 27 mmol). Se calento la mezcla a 100°C durante 18 horas, momento en el cual el analisis de CCF mostro que la reaccion todavfa estaba incompleta. Se anadieron porciones adicionales de acetato de paladio (215 mg, 0,958 mmol), tri-o-tolilfosfina (290 mg, 0,953 mmol), trietilamina (3,3 ml, 45 mmol) y acrilato de metilo (2,2 ml, 27 mmol), y se calento la mezcla a 110° durante 18 horas adicionales. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se vertio la mezcla en agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Se lavaron los extractos organicos combinados secuencialmente con agua y salmuera, y entonces se secaron (MgSO4) y se concentraron para dar un aceite marron (5,3 g). Se cromatografio el aceite sobre gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:9) proporciono 3-benzoilcinamato de metilo (4,6 g, 91%) como un solido amarillo.
Ejemplo 5: Acido 3-benzoilcinamico
Se añadió hidroxido de potasio acuoso 5 M (10 ml, 50 mmol) a una disolucion de 3-benzoilcinamato de metilo (2,5 g, 9,4 mmol) en metanol (20 ml) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentro la mezcla y se acidifico hasta pH 1 usando acido clorhndrico acuoso 1 M. Se recogio el precipitado resultante mediante filtracion y se seco a vado para dar acido 3-benzoilcinamico (2,2 g, 93%) como un solido amarillo.
Ejemplo 6: Acido 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico
Se evacuo una mezcla de acido 5-bromo-2-naftoico (2,12 g, 8,44 mmol), 1-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-tH-pirazol (1,84 g, 8,86 mmol) y tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (502 mg, 0,435 mmol) en un matraz de fondo redondo de 250 ml y se purgo con nitrogeno (en tres ciclos). Se anadieron acetonitrilo (40 ml) y carbonato de sodio acuoso 2 M (10 ml) a la mezcla mediante una jeringa, y se calento la mezcla a reflujo bajo nitrogeno durante 22 horas. Se dejo enfriar la mezcla de reaccion antes de la adicion de acido clorhndrico acuoso 1 M (30 ml) y entonces se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml). Se secaron las fases organicas combinadas (MgSO4), se filtraron y se concentraron a vado para proporcionar un producto en bruto (2,98 g tras secar al aire). Se disolvio este material en bruto en etanol caliente (150 ml) y se filtro mientras estaba caliente para eliminar una impureza amarilla (120 mg). Se concentro el filtrado a vado y se recristalizo el residuo en diclorometano (30 ml) para proporcionar acido 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico como un solido blanco (724 mg, 34%). Se obtuvo una segunda tanda de acido 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico (527 mg, 25%) a partir de las aguas madres concentradas mediante recristalizacion en diclorometano (20 ml).
Ejemplo 7: 5-(1-Metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoilguanidina
Se añadió cloruro de oxalilo (1,1 ml, 13 mmol) a una disolucion de acido 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico (1,19 g, 4,71 mmol) en diclorometano anhidro (200 ml (que se anadieron en porciones durante la reaccion para obtener la disolucion)) que contema dimetilformamida (2 gotas) bajo nitrogeno y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante 4,25 horas. Entonces se calento la mezcla de reaccion durante 1 hora a 40°C, antes de concentrarse a presion reducida. Se suspendio el cloruro de acido en bruto resultante en tetrahidrofurano anhidro (50 ml) y esta mezcla se añ gaotdaió a gota a una disolucion de clorhidrato de guanidina (2,09 g, 21,9 mmol) en hidroxido de sodio acuoso 2 M (15 ml, 30 mmol) y entonces se agito la mezcla de reaccion durante 30 minutos. Se separo la fase organica y se extrajo la fase acuosa con cloroformo (3 x 30 ml) seguido por acetato de etilo (3 x 30 ml). Se lavaron los extractos organicos combinados secuencialmente con hidroxido de sodio acuoso 1 M (60 ml) y agua (40 ml), entonces se secaron (Na2SO4) y se concentraron a vado para dar un solido vftreo (1,45 g tras secado a alto vado). Se disolvio este solido en diclorometano que entonces se dejo evaporar lentamente para dar 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoilguanidina como un solido amarillo (1,15 g, 83%).
Ejemplo 8: 2,3-Metilendioxicinamato de etilo
Se añadió fosfonoacetato de trietilo (4,05 ml, 20,2 mmol) gota a gota a una suspension con agitacion de hidruro de sodio (0,80 g, 20 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (20 ml) a 0°C bajo nitrogeno. Se agito la mezcla a 0°C durante 20 minutos. Se le una a dñisaodluiócion de 2,3-metilendioxibenzaldel'ndo (2,50 g, 16,7 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml) gota a gota a 0°C. Se agito la mezcla durante 2 horas, tiempo durante el cual se dejo que se calentara hasta temperature ambiente. Se vertio la mezcla en agua (250 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 ml). Entonces se lavaron los extractos organicos combinados con salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron a vado. Se cromatografio el producto en bruto sobre gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:10) dio 2,3-metilendioxicinamato de etilo como un solido incoloro (3,50 g, 92%).
Ejemplo 9: Acido 2,3-metilendioxicinamico
Se trato una disolucion de 2,3-metilendioxicinamato de etilo (3,40 g) en metanol (25 ml) y agua (5 ml) con una disolucion de hidroxido de potasio (4,3 g) en agua (25 ml). Se agito la mezcla durante la noche a temperatura ambiente antes de concentrarse a vado hasta la mitad de su volumen original. Entonces se acidifico el concentrado con HCl concentrado para dar acido 2,3-metilendioxicinamico como un solido incoloro (2,81 g, 95%) que se recogio mediante filtracion y se seco durante la noche a vado.
Ejemplo 10: 2,3-Metilendioxicinamoilguanidina
Se añadió cloruro de oxalilo (0,68 ml, 7,8 mmol) a una suspension de acido 2,3-metilendioxicinamico (500 mg, 2,6 mmol) en diclorometano (5 ml) que conterna una gota de dimetilformamida. Se agito la mezcla durante 2,5 horas y se evaporo la disolucion resultante hasta la sequedad a presion reducida. Se disolvio el residuo en tetrahidrofurano seco (5 ml) y se a una a dñiasdoilóucion de clorhidrato de guanidina (1,24 g, 13 mmol) en hidroxido de sodio acuoso 2 M (8 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 1 hora y entonces se le anadio cloroformo. Se recogio el precipitado resultante de producto en bruto (100 mg) mediante filtracion. Se extrajo el filtrado con cloroformo (3 x 30 ml) y acetato de etilo (20 ml). Se lavaron los extractos organicos combinados con hidroxido de sodio acuoso 2 M (20 ml), agua (20 ml), se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para dar una cantidad adicional de producto en bruto (400 mg). Se combinaron las dos tandas de producto en bruto, se suspendieron en cloroformo (10 ml) y se agitaron vigorosamente durante 20 minutos. Se recogio la 2,3-metilendioxicinamoilguanidina resultante (420 mg) mediante filtracion y se seco a vado.
Eiemplo 11: Ensayos de inhibicion viral
Tal como se indico anteriormente, los metodos usados para examinar la actividad antiviral de los compuestos de la presente invencion se han descrito en detalle en el documento WO2004/112687.
Se sometio a prueba la inhibicion espedficamente del crecimiento de VIH-1 mediante los compuestos de la invencion en macrofagos primarios in vitro usando un metodo similar al usado para evaluar la neutralizacion de anticuerpos (VanCott TC et al (1999)). En el presente caso, se uso la cepa de VlH-1 adaptada en laboratorio Ba-L, que se sabe que infecta a macrofagos.
11.1 Preparacion de macrofagos
Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de donantes sanos usando paquetes de capa leucocitaria obtenidos del servicio australiano de sangre de la Cruz Roja (ARCBS). Se recibio la sangre el dfa despues de la donacion, y se redujo en suero y plaquetas, dejando un volumen pequeno (menos de 100 ml) de leucocitos concentrados.
Se separaron los leucocitos de las celulas de la sangre y los granulocitos mediante centrifugacion en gradiente de densidad (Ficoll Paque) y se lavaron minuciosamente en PBS' (sin Ca/Mg) para eliminar las plaquetas. Se permitio que las celulas recuperadas se adhirieran a matraces de cultivo tisular de plastico (Becton Dickinson) durante 2 h, 37°C, 5% de CO2, en medio (DMEM (alta concentracion) / suero AB al 10% / gentamicina 50 ug/ml / L-glutamina 2 mM) tiempo durante el cual las celulas mieloides formaron una monocapa adherente que dejo linfocitos no unidos. Se retiraron los linfocitos no adherentes lavando con PBS+ caliente (con Ca/Mg) y se desecharon generalmente. En algunos casos, esas celulas se recuperaron y se congelaron en medios / DMSO al 10% para su uso en infecciones de reserva virales. Se recuperaron los monocitos adherentes rascando suavemente con un rascador de celulas de plastico. Entonces se sembraron las celulas mieloides en placas de 96 pocillos a una concentracion de celulas de 1,5 x 106/ml, y se dejo que se diferenciaran completamente a lo largo de un periodo de 14 dfas.
11.2 Protocolo del ensayo
Se dejo que los macrofagos se diferenciaran a lo largo de un periodo de 14 dfas, con cambios de medio segun fue necesario. En el dfa 14, se infectaron las celulas en presencia de concentraciones decrecientes de compuestos BIT en un intervalo de 0 -10 |iM. Se retiraron muestras de sobrenadantes de cultivo de 25 |il de cada pocillo en el dfa 7 y se añadió medio recien preparado mas dilucion de compuesto.
11.3 Analisis de inhibicion viral
Tras 7 dfas, se analizaron las muestras con y sin compuesto para evaluar el nivel de virus presente en los pocillos, usando un ELISA de p24 (Innotest). Se convirtieron los niveles de virus en las muestras en valores de “porcentaje de crecimiento de virus de control” basandose en los controles (que no conteman compuesto). A partir de esta curva de respuesta a la dosis (figura 1 de ejemplo) se calculo la CI50 y se uso como medida de la actividad anti-VIH del compuesto.
11.4 Citotoxicidad
Se determino la toxicidad de los compuestos de prueba para las celulas en el ensayo de inhibicion viral usando el ensayo de MTT (Pauwels R, et al. (1988); D'Cruz OJ et al. (1999); Joo H. (2003)). Este metodo utiliza azul de tiazolilo (MTT), que se añad aiól cultivo celular (100 ug/pocillo) y se incubo durante 4-5 horas mientras que las celulas vivas, metabolicamente activas convierten el compuesto qmmico en su metabolito de color purpura, que forma cristales intracelulares. El color purpura se mide colorimetricamente (570-590 nm) una vez que las celulas se han permeabilizado usando isopropanol acidificado que contema Triton X-100 al 10%. El desarrollo de color mas intenso se produce en los pocillos en los que las celulas metabolizantes son mas numerosas.
Los valores de DO medidos se convirtieron en cifras de “viabilidad en porcentaje” basandose en los controles (que no conteman compuestos) y entonces pudo estimarse el valor al se midio el 50% de viabilidad celular (CT50). Estos valores se estimaron manualmente a partir de las curvas de respuesta a la dosis de viabilidad en porcentaje frente a concentracion (figura 1).
11.5 Resultados
Se calcularon los valores de CI50 para cada compuesto a partir de los experimentos individuales realizados y se muestran en las figuras 1 y 2.
La toxicidad del compuesto para las celulas en cultivo se tuvo en cuenta en experimentos de inhibicion y en experimentos independientes que implicaban concentraciones aumentadas de compuesto. El valor del mdice antiviral (IA) se calculo usando la formula:
C T IA 0
C I50
Tabla 1. Valores de CI50, CT50 e IA para los compuestos de prueba contra V IH -W l en macrofagos primarios.
Compuesto n.° CI50 (uM) CT50 (uM) IA (3-benzoil)cinamoilguanidina 0,9 25 - 495 28 - 550 2,3-metilendioxicinamoilguanidina 1,1 >100 >91
5-metil-2-naftoilguanidina 1,56 >300 >192 3(indan-4-il)-propenoilguanidina >10 >100 >10 5-bromo-6-metoxi-2-naftoilguanidina 0,3 >300 >1000 5-tiofen-3-il-2-naftoilguanidina 1,0 >200 >100 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina 2,5 >200 >80
Todos los valores de CI50 se estimaron a partir de las curvas de respuesta a la dosis en la figura 1. Los valores de CT50 se estimaron en experimentos independientes (no mostrados) donde las concentraciones de compuesto fueron mayores.
Se sometieron a prueba compuestos adicionales usando el mismo sistema de ensayo y las curvas de respuesta a la dosis tal como se describio anteriormente, y se estimo su CI50. La tabla 2 muestra un resumen de los datos obtenidos.
Tabla 2: Valores de CI50 estimados para compuestos adicionales de la invencion
Compuesto n.° CI50(|iM)______________ CT50 (mMI) (1-metoxi-2-naftoil)guanidina < 2,5 > 50 (3-metoxi-2-naftoil)guanidina < 2,5 > 50 (5-bromo-2-naftoil)guanidina < 2,5 10 -50
(1,4-dimetoxi--2-naftoil)guanidina <10 10 -50 (6-(3-tienil)-2-naftoil)guanidina < 0,63 < 10 (6-metil-2-naftoil)guanidina <10 10 -50
(5-fenil-2-naftoil)guanidina < 0,63 10 -50
(5-(tien-2-il)-2-naftoil)guanidina < 0,63 10 -50 (5-(1,3,5-trimetilpirazol-4-il)-2-naftoil)guanidina > 10 > 50
(5-(1-isobutil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoil)guanidina < 2,5 10 -50 _______ (5-(3-furil)-2-naftoil)guanidina_______ < 0,63 10 -50
(5-ciclopropil-2-naftoil)guanidina < 0,63 10 -50
(5-cloro-2-naftoil)guanidina < 2,5 10 -50
Ejemplo 12: Actividad antiviral de los compuestos usando el metodo de bioensayo bacteriano
El metodo de bioensayo bacteriano usado en el presente ejemplo para someter a prueba la actividad antiviral de los compuestos contra diferente dianas virales se describio en detalle en el documento WO2004/112687. Los resultados de las pruebas de ensayo bacteriano se resumen en la tabla 3 a continuacion. Vpu, p7 y M a los que se hace referencia en la tabla son protemas de membrana pequenas codificadas por VIH, v Hc y los virus del dengue, respectivamente, que tienen actividades funcionales que soportan el crecimiento y/o la replicacion virales.
Tabla 2: Puntuaciones de ensayo medias del bioensayo bacteriano para los compuestos de la invencion Puntuacion promedio del ensayo bacteriano Nombre del compuesto BIT n.° Vpu p7 de VHC M de Den (3-benzoil)cinamoilguanidina 216 1,3 1,3 1,5 2,3-metilendioxicinamoilguanidina 217 1,8 1,0
5-metil-2-naftoilguanidina 218 1,8 1,7 1,3 3(indan-4-il)-propenoilguanidina 222 1,2 2,0 2,2 5-bromo-6-metoxi-2-naftoilguanidina 223 0 0,0
5-tiofen-3-il-2-naftoilguanidina 224 2,2 1,1 1,3 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina 225 1,4 1,2 0,9 3,4-diclorocinamoilguanidina 300 1,52 0,67 3,40 (1-metoxi-2-naftoil)guanidina 301 1,54 0,25 0,50 (3-metoxi-2-naftoil)guanidina 302 1,04 0,42 0,50 (5-bromo-2-naftoil)guanidina 303 0,22 0,00 2,10 (1,4-dimetoxi-2-naftoil)guanidina 304 0,62 0,33 1,90 (6-(3-tienil)-2-naftoil)guanidina 305 0,38 0,00 1,15 (6-metil-2-naftoil)guanidina 306 0,52 0,25 2,53 (5-fenil-2-naftoil)guanidina 307 0,12 0,08 2,40 (5-(tien-2-il)-2-naftoil)guanidina 308 0,45 0,08 2,40 (5-(1,3,5-trimetilpirazol-4-il)-2-naftoil)guanidina 309 0,12 0,00 0,00 (5-(1-isobutil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoil)guanidina 310 0,00 0,00 1,60 (5-(3-furil)-2-naftoil)guanidina 311 0,42 0,42 1,60 (5-ciclopropil-2-naftoil)guanidina 312 0,50 0,80 2,25 (5-cloro-2-naftoil)guanidina 313 0,30 1,30 3,00 Acetato de (6-(1-metilpirazol-4-il)-2-naftoil)guanidinio 314 0,00 3,30 1,60 (5-(2,6-dimetoxipiridin-3-il)-2-naftoil)guanidina 315 0,20 0,30 1,00 (5-(2-clorofenil)-2-naftoil)guanidina 316 0,20 0,80 0,50 (5-(4-(acetilamino)fenil)-2-naftoil)guanidina 317 0,00 0,20 0,40 (5-(3-(acetilamino)fenil)-2-naftoil)guanidina 318 2,00 0,30 0,35 (5-(4-((metilsulfonil)amino)fenil)-2-naftoil)guanidina 319 0,00 0,00 0,15 CONTROL POSITIVO DEL ENSAYO
(3-bromocinamoil)guanidina BIT067 2,88
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina BIT124 2,25
5-(2'-bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina BIT128 2,8
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
(3-benzoil)cinamoilguanidina,
3(indan-4-il)-propenoilguanidina,
2,3-metilendioxicinamoilguanidina,
y sales farmaceuticamente aceptables del mismo.
2. Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que los grupos amina o imina de la parte guanidilo de los compuestos de formula I pueden estar presentes como la base libre, un hidrato, una sal organica o inorganica o combinaciones de los mismos.
3. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el compuesto esta en forma de una sal, un aducto, o esta en forma anhidra o solvatada.
4. Composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, opcionalmente en combinacion con uno o mas portadores o adyuvantes farmaceuticamente aceptables.
5. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4, que comprende ademas uno o mas agentes antivirales conocidos.
6. Compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, para su uso en reducir, retardar o inhibir de otro modo el crecimiento y/o la replicacion de un virus.
7. Compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, para su uso en prevenir la infeccion de una celula expuesta a un virus.
8. Compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de un sujeto expuesto a o infectado por un virus.
9. Compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en el que el compuesto o la composicion farmaceutica esta en asociacion con uno o mas agentes antivirales conocidos, para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de un sujeto expuesto a o infectado por un virus.
10. Compuesto o composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el virus se selecciona de las familias de Lentivirus y Flavivirus.
11. Compuesto o composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 10, en el que el virus se selecciona del grupo que consiste en virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del dengue.
12. Compuesto o composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 11, en el que el virus se selecciona del grupo que consiste en VHC, VIH-1, VIH-2 y virus del dengue.
13. Compuesto o composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el sujeto que se somete a tratamiento terapeutico o profilactico es un mairnfero seleccionado del grupo que consiste en ser humano, primate, animal de ganadena, animal de comparua, animal de laboratorio o animal salvaje en cautividad.
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