ES2711422T3 - Procedimiento de captura de una molécula en una muestra - Google Patents

Abstract

Procedimiento de captura de una molécula en una muestra, que comprende las siguientes etapas: a) la mezcla de dicha muestra con partículas magnéticas, estando acoplada cada una de dichas partículas con un elemento adecuado para unirse selectivamente a dicha molécula que se va a capturar, de modo que se forme al menos un complejo que comprende una partícula magnética, dicho elemento y dicha molécula unida a dicho elemento, presentando dichas partículas magnéticas un diámetro comprendido entre 5 nm y 500 nm, después b) la deposición de una gota de la mezcla obtenida al final de la etapa a) sobre un soporte, siendo dicho soporte una placa plana en cuya superficie se disponen microfuentes de campo magnético ordenadas, c) inmovilización de dicho al menos un complejo sobre el soporte que comprende las microfuentes de campo magnético ordenadas, caracterizado por que la concentración de las partículas magnéticas en la mezcla obtenida al final de la etapa a) es superior a 106 partículas/ml.

Description

DESCRIPCION

Procedimiento de captura de una molecula en una muestra

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento de captura y a un procedimiento de deteccion, en concreto por inmunoanalisis ("immunoassay" segun la terminologfa anglosajona) de una molecula en una muestra, siendo tipicamente dicha molecula que se va a capturar o detectar un antigeno o un anticuerpo. Se describe tambien a continuacion un kit de captura de una molecula adecuado para llevar a cabo dichos procedimientos.

Antecedentes de la invencion

El ensayo ELISA (acronimo del termino anglosajon "Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay") se usa habitualmente para diagnosticar de forma cuantitativa marcadores moleculares (antfgenos o anticuerpos) presentes en fluidos, biopsias, cultivos o cualquier otra muestra.

Este ensayo se usa en particular para el diagnostico de infecciones (VIH, HPV, etc.), el estado del sistema cardiovascular e inmunitario (troponina C, anticuerpos espedficos, etc.), la presencia y el desarrollo de canceres (PSA, CEA, etc.).

Esta tecnica, que actualmente es el mas solido y mas extendido de los metodos de diagnostico, tiene, no obstante, inconvenientes, concretamente su complejidad, el uso de equipos automaticos caros y su duracion que puede llegar a varias horas.

El ensayo ELISA es una tecnica de inmunoanalisis en fase heterogenea, es decir, que necesita un soporte solido (tfpicamente una placa de valoracion que comprende una pluralidad de pocillos) en el que se fija previamente una molecula adecuada para capturar la molecula que se va a determinar.

Una vez que la molecula de interes se ha capturado sobre dicho soporte, un lavado permite retirar el resto de la muestra y proceder a la etapa de deteccion y cuantificacion de dicha molecula.

Por ejemplo, en el caso del ensayo ELISA llamado "sandwich" que permite determinar un antfgeno en una solucion, la superficie del soporte se recubre con una cantidad determinada de un anticuerpo llamado de captura, siendo adecuado dicho anticuerpo para unirse al antfgeno buscado.

Despues se aplica sobre el soporte la solucion que puede contener dicho antfgeno; dicho antfgeno se une entonces al anticuerpo de captura situado sobre la superficie del soporte.

A continuacion, se lleva a cabo un lavado del soporte para retirar el antfgeno no unido que queda posiblemente en la solucion.

Se deposita entonces sobre el soporte una solucion que contiene un anticuerpo llamado anticuerpo de deteccion, que es adecuado para unirse al antfgeno fijado sobre el soporte y que ademas esta acoplado a una enzima.

Se lleva a cabo una nueva etapa de lavado de modo que se conserve sobre el soporte el antfgeno unido al anticuerpo de deteccion, estando dicho anticuerpo el mismo acoplado con la enzima.

Finalmente, para la deteccion y cuantificacion del antfgeno, se deposita sobre el soporte un sustrato que la enzima convierte en una senal detectable (por ejemplo, un color, o de forma espectroscopica, es decir, por emision de fluorescencia) representativa de la union entre el antfgeno y el anticuerpo de deteccion.

Dicha senal se puede observar a simple vista o mediante un instrumento, tal como un espectrofotometro.

El ensayo ELISA comprende diferentes implementaciones, pero todas comprenden multiples etapas de injerto e incubacion separadas por etapas de lavado.

La importante duracion del ensayo ELISA se debe esencialmente a la sucesion de las diferentes etapas.

Ya se han descrito variantes de este ensayo que aplican microesferas magneticas.

El artfculo de D. Issadore et al, "Self-assembled magnetic filter for highly efficient immunomagnetic separation", Lab Chip, 2011, 11, 147, describe asf un procedimiento de captura de una molecula en una muestra, haciendo circular dicha muestra en un microcanal flmdico dispuesto debajo de una matriz de polidimetilsiloxano (PDMS) en la que se han inmovilizado granos magneticos de NdFeB.

Por el procedimiento de fabricacion llevado a cabo para dicho soporte, los granos se reparten de forma aleatoria en el espesor de la matriz y su orientacion magnetica es aleatoria.

Cada grano genera un gradiente de campo magnetico que puede atraer partfculas magneticas de un diametro de 1 |im acopladas a las moleculas que se van a detectar para formar complejos.

Sin embargo, dicho gradiente de campo magnetico es tanto menos eficaz cuanto menor es el tamano de las partfculas a capturar, de modo que este dispositivo tiene menor eficacia para la captura de partfculas magneticas de dimensiones inferiores a 1 |im, por ejemplo del orden de 500 nm o menos, y en concreto de nanopartfculas.

Por otra parte, la captura de las partfculas magneticas es relativamente lenta.

A esta etapa de captura le sigue un lavado de la superficie de la matriz de PDMS y despues una deteccion por fluorescencia de los complejos inmovilizados sobre dicha superficie.

Se conocen tambien del documento WO2007125129 estructuras de iman(es) permanente(s) para el atrapamiento y/o guiado y/o filtrado de partfculas diamagneticas o de susceptibilidad magnetica inferior a la susceptibilidad magnetica del medio que rodea las partfculas. Las microfuentes de campo magnetico estan ordenadas y dichas partfculas pueden ser microesferas funcionalizadas.

Por otra parte, se conocen procedimientos de captura de partfculas magneticas en una gota colocada sobre un soporte plano que contiene microfuentes de campos magneticos ordenados (ZANINI Luiz Fernando: "Bio-Mag-MEMS autonomes bases sur des aimants permanents", Tesis, 3 de mayo 2013, paginas 1-166).

Ademas, se conocen procedimientos de captura de moleculas magneticas presentes en el interior de un microcanal que contiene las microfuentes de campos magneticos (Guillaume BLAIRE et al: "Hybrid Bio-Mag-MEMS combining magnetophoresis and dielectrophoresis", The European Physical Journal B, vol. 86, n°4, 1 de abril de 2013).

El documento WO2013/174881 (tecnica anterior segun el artfculo 54(3) CBE) describe un procedimiento de fabricacion de un soporte que comprende microfuentes de campos magneticos ordenadas.

Breve descripcion de la invencion

Un objeto de la invencion es proponer un procedimiento de deteccion de una molecula tal como antfgeno o un anticuerpo, que necesite un numero limitado de etapas, incluso una sola etapa, y que sea sensiblemente mas corto que los ensayos conocidos.

Este procedimiento debe ser ademas compatible con los instrumentos usados ya por los biologos, tales como las placas de valoracion, fluonmetros, pipetas de multicanales, de modo que se pueda poner en practica directamente en los laboratorios de investigacion y analisis.

De acuerdo con la invencion, se propone un procedimiento de captura de una molecula en una muestra segun la reivindicacion 1.

Por "ordenadas", se entiende que las microfuentes de campo magnetico estan repartidas en el entorno de la superficie del soporte dirigida a estar en contacto con la muestra, segun un motivo determinado y que presentan ademas una orientacion magnetica determinada. Dicho ordenamiento excluye, de hecho, un reparto y/o una orientacion aleatoria de las microfuentes de campo magnetico.

Segun una realizacion de la invencion, el procedimiento comprende una etapa de lavado de dicho soporte para retirar dicha muestra, quedando retenidos los complejos sobre el soporte por las microfuentes de campo magnetico. Segun otra realizacion de la invencion, la deteccion de los complejos se puede llevar a cabo a nivel de las microfuentes de campo magnetico ordenadas, sin lavado previo del soporte.

Por molecula se entiende en el presente texto una protema, en concreto un anticuerpo, un acido nucleico (ADN o ARN), un virus, una bacteria, un antfgeno, una celula y de forma general cualquier objeto biologico.

Preferiblemente, las partfculas magneticas presentan un diametro comprendido entre 5 y 50 nm.

Segun una realizacion, el soporte comprende una matriz no magnetica que encierra una pluralidad de aglomerados tridimensionales ordenados de micro o nanopartfculas imantadas de un material magnetico duro o blando, formando dichos aglomerados las microfuentes de campo magnetico.

Segun otra realizacion, el soporte comprende una matriz no magnetica que encierra una pluralidad de microbobinas magneticas ordenadas segun un motivo determinado con respecto a la superficie del soporte.

Dicha matriz no magnetica puede ser flexible.

Ademas, dicha matriz no magnetica puede ser de un material traslucido o transparente.

Segun una forma de realizacion de la invencion, la molecula que se va a capturar es un antfgeno y el elemento capaz de unirse a dicha molecula es un anticuerpo receptor de dicho antfgeno.

Opcionalmente, se anade a dicha mezcla un anticuerpo llamado de deteccion que lleva un marcador fluorescente, luminiscente o colorimetrico, siendo capaz dicho anticuerpo de unirse al antigeno unido al anticuerpo acoplado a la partfcula magnetica. El anticuerpo de deteccion puede estar tambien marcado con una enzima que cataliza una reaccion de oxidorreduccion que permite una deteccion electroqmmica.

Segun otra forma de realizacion de la invencion, la molecula que se va a capturar es un anticuerpo y el elemento capaz de unirse a dicha molecula es un antfgeno reconocido por dicho anticuerpo.

Segun una realizacion, el soporte es una placa de valoracion que comprende una pluralidad de pocillos, estando dispuestas las microfuentes de campo magnetico en una pared de cada uno de dichos pocillos, depositandose la mezcla en al menos uno de dichos pocillos.

En el procedimiento de la invencion, el soporte es una placa plana que comprende una pluralidad de microfuentes de campo magnetico, depositandose la mezcla en forma de la menos una gota sobre dicho soporte.

Segun otra realizacion, el soporte es un canal microflmdico en donde al menos una de las paredes comprende las microfuentes de campo magnetico.

A continuacion, se describe un procedimiento de deteccion y, si procede, de cuantificacion de una molecula, en el que se captura dicha molecula sobre un soporte llevando a cabo el procedimiento de captura descrito mas arriba, y despues se lleva a cabo una etapa de deteccion de dicha molecula.

La deteccion de la molecula capturada sobre el soporte se puede hacer por fluorescencia, luminiscencia, colorimetna, electroqmmica y/o radiometna.

Una primera ventaja de este procedimiento es la reduccion significativa del numero de etapas previas a la deteccion y, si procede, a la cuantificacion (siendo necesarias solo una etapa de mezcla, y opcionalmente, una etapa de lavado), con respecto a los ensayos de inmunoanalisis conocidos (el ensayo de ELlSA sandwich convencional comprende como mmimo seis etapas).

De hecho, la atraccion de las partfculas magneticas por las microfuentes de campo magnetico permite por una parte extraer rapidamente los objetos asociados a dichas partfculas, y por otra parte, asegurar un lavado mas eficaz (en el caso en el que se lleve a cabo dicho lavado), reteniendo firmemente las fuerzas de interaccion magnetica los complejos inmovilizados que se desea conservar.

Ademas, este procedimiento ofrece una alternativa al conjunto de las posibles implementaciones del ensayo ELISA, y se puede llevar a cabo para realizar ensayos de tipo "sandwich" y tambien ensayos directos o ensayos competitivos seleccionando los antfgenos y anticuerpos adecuados.

Este procedimiento tambien se puede adaptar para realizar ensayos de inmunoprecipitacion.

Otra ventaja de este procedimiento es su gran simplicidad de aplicacion y su bajo coste, asociado a la ausencia de necesidad de fuente de energfa externa para la captura de los complejos y el lavado.

En la medida en que se pueda evitar la etapa de lavado previa a la deteccion, el procedimiento puede comprender solo una etapa unica de mezcla en contacto con el soporte que comprende las microfuentes de campo magnetico ordenadas.

Debido a esta simplicidad, el procedimiento se podna llevar a cabo en un dispositivo de ensayo integrado del tipo "point-of-care" (de diagnostico inmediato). Mas adelante se describe un kit de captura de una molecula para llevar a cabo el procedimiento de captura reivindicado.

Dichas partfculas magneticas presentan una superficie funcionalizada adecuada para el acoplamiento de un elemento capaz de unirse selectivamente a dicha molecula.

Segun una realizacion, el soporte es una placa de valoracion que comprende una pluralidad de pocillos, estando dispuestas las microfuentes de campo magnetico en al menos una pared de cada pocillo.

Segun una realizacion, el soporte es una placa plana en cuya superficie estan dispuestas las microfuentes de campo magnetico.

Segun una realizacion, el soporte es un microcanal flmdico, estando dispuestas las microfuentes de campo magnetico en la superficie de al menos una de las paredes de dicho microcanal.

Otra ventaja de este procedimiento es que permite una deteccion sin lavado de la molecula capturada, gracias a que el experimentador conoce las zonas donde son capturadas las partfculas magneticas. La senal espedfica se obtiene restando a la senal total una senal que corresponde a la captura no espedfica de moleculas.

Segun una realizacion, las moleculas son detectadas por fluorescencia, luminiscencia o colorimetna gracias a un anticuerpo de deteccion. Una imagen de fluorescencia, luminiscencia o absorbancia de la superficie que lleva los microimanes permite determinar la senal espedfica y no espedfica. La senal total corresponde a la presencia de moleculas a nivel de las zonas de fuerte gradiente del campo magnetico, la senal no espedfica corresponde a la presencia de moleculas en las zonas de gradientes debiles del campo magnetico.

Segun otra realizacion, las moleculas son detectadas por electroqmmica gracias a un anticuerpo de deteccion acoplado a una enzima que tiene propiedades de oxidorreduccion. Se disponen electrodos sobre la superficie del soporte de modo que permitan la medicion de la senal total y no espedfica. La senal total corresponde a los electrodos dispuestos a nivel de las microfuentes de campo magnetico ordenadas, la senal no espedfica corresponde a los electrodos dispuestos a nivel de zonas desprovistas de microfuentes de campo magnetico.

Breve descripcion de los dibujos

Otras caractensticas y ventajas de la invencion saldran de la siguiente descripcion detallada, en referencia a los dibujos adjuntos en los que:

- las figuras 1A a 1C son vistas esquematicas de las etapas para llevar a cabo el procedimiento de deteccion segun una realizacion,

- la figura 2 ilustra de forma esquematica una superficie magneticamente estructurada de modo que forma microfuentes de campo magnetico,

- las figuras 3A a 3D ilustran de forma esquematica las diferentes etapas del procedimiento de impresion termomagnetica que permite hacer un soporte que comprende microfuentes de campo magnetico,

- las figuras 4A a 4D ilustran de forma esquematica las diferentes etapas del procedimiento llamado "Micro Magnetic Imprinting",

- la figura 5 ilustra una forma de realizacion de la invencion en la que la mezcla se deposita sobre un soporte plano en forma de una gota,

- la figura 6 presenta una comparacion de los porcentajes de las bolas capturadas sobre un soporte plano y en un pocillo de valoracion en funcion del tiempo,

- las figuras 7A a 7E ilustran un procedimiento de fabricacion de un microcanal flmdico que comprende microfuentes de campo magnetico que permiten llevar a cabo el procedimiento segun la invencion,

- la figura 8 es una curva de la senal de fluorescencia en funcion de la cantidad de antfgeno obtenido durante los experimentos,

- la figura 9 representa las lmeas de corriente de un fluido que contiene partfculas magneticas puesto en contacto con un soporte que comprende dos dominios magneticos imantados en direcciones opuestas,

- la figura 10A representa la distribucion de complejos fluorescentes capturados por las partfculas magneticas a nivel de microfuentes de campo magnetico, determinada durante los experimentos y observada por microscopio; la figura 10B ilustra la relacion entre la senal espedfica y la senal no espedfica medida en las imagenes de microscopio del tipo de la figura 10A.

Descripcion detallada de realizaciones de la invencion

Las figuras 1A a 1C ilustran de forma esquematica las principales etapas del procedimiento de deteccion segun una realizacion de la invencion que corresponde a un ensayo de inmunoanalisis de tipo "sandwich".

En este caso la molecula que se va a detectar y determinar es un antfgeno.

Segun este procedimiento, se lleva a cabo una mezcla de los siguientes elementos:

- una muestra que puede contener el antfgeno 1 cuya presencia se desea detectar y cuantificar,

- partfculas magneticas 2 previamente acopladas a un anticuerpo de captura 3, es decir una protema receptora espedfica del antfgeno a detectar, en exceso con respecto al antfgeno,

- un anticuerpo de deteccion 4 que lleva un marcador 5 fluorescente, luminiscente o coloreado, en exceso con respecto al antfgeno.

Dicho marcador 5 lo puede llevar directamente el anticuerpo de deteccion o indirectamente, por medio de una enzima.

Dicha mezcla se realiza en un recipiente en el que, bajo el efecto de la difusion de los diferentes constituyentes, el antigeno 1 se une al anticuerpo de captura 3 acoplado a una partfcula magnetica 2, y despues el anticuerpo de deteccion 4 se une al antigeno 1.

Se forma asf un complejo "sandwich" formado por una partfcula magnetica 2, el anticuerpo de captura 3, el antigeno 1, el anticuerpo de deteccion 4 y el marcador 5.

Las uniones entre el antigeno y el anticuerpo de captura, y entre el anticuerpo de deteccion y el antigeno, son uniones no covalentes.

En cambio, el acoplamiento entre la partfcula magnetica y el anticuerpo es una union covalente.

Dicha mezcla se deposita, por ejemplo mediante una pipeta, sobre un soporte que comprende microfuentes de campo magnetico ordenadas.

Las microfuentes de campo magnetico tienen el efecto de atraer las partfculas magneticas y por consiguiente de inmovilizar los complejos precipitados sobre el soporte, segun un motivo que esta estrechamente relacionado con el ordenamiento de las microfuentes de campo magnetico en relacion con la superficie de dicho soporte. Por ejemplo, si las microfuentes de campo magnetico estan dispuestas en forma de tablero de ajedrez en el que dos casillas adyacentes presentan imantaciones de sentido opuesto, las partfculas magneticas se inmovilizaran a nivel de la union entre las dos microfuentes de campo magnetico, que es el sitio donde el campo de dispersion, asf como su gradiente, es mas intenso.

Los antfgenos no unidos a partfculas magneticas y los anticuerpos marcados no unidos al antfgeno no son atrafdos por las microfuentes de campo magnetico y quedan en suspension en la mezcla.

Una etapa opcional de lavado permite eliminar estos residuos y conservar en el soporte solo los complejos, estando estos retenidos por las microfuentes de campo magnetico por interaccion con las partfculas magneticas.

De hecho, la fuerza magnetica generada sobre los complejos por las microfuentes de campo magnetico (que son capaces de generar gradientes de campo magnetico muy fuertes) es superior a la fuerza de aspiracion ejercida durante el lavado.

Asf se capturan y mantienen sobre el soporte las moleculas de interes, acopladas a las partfculas magneticas. Sin embargo, como se expone en detalle mas adelante, tambien se puede no realizar la etapa de lavado. En efecto, el conocimiento del ordenamiento de las microfuentes de campo magnetico con respecto a la superficie del soporte y llevar a cabo una tecnica de deteccion adecuada, permiten detectar partfculas atrapadas por dichas microfuentes ordenadas sin que sea necesario retirar la muestra o lavar la superficie del soporte.

Una vez realizada esta captura, se puede llevar a cabo entonces un metodo de cuantificacion conocido por el experto en la tecnica, segun la naturaleza de los marcadores usados.

Entre estos metodos de cuantificacion, se pueden senalar la fluorescencia, luminiscencia, colorimetna, una reaccion de oxidorreduccion, radiactividad, turbidimetna, deteccion magnetica por micro y nanosensores magneticos, GMR localizados, etc.

La duracion total de este ensayo tfpicamente esta comprendida entre 10 y 20 minutos, mientras que esta comprendida entre 2 y 6 horas para un ensayo ELISA que lleva a cabo las etapas clasicas de mezcla y deteccion. Con respecto al ensayo ELISA que, como se ha indicado mas arriba, es un procedimiento de inmunoanalisis en fase heterogenea, el procedimiento segun la invencion se puede considerar como un procedimiento de inmunoanalisis en fase homogenea.

En efecto, la union entre el antfgeno que se va a determinar y el anticuerpo de deteccion se produce en el volumen de la muestra y no sobre la superficie del soporte, estando destinado dicho soporte unicamente a la inmovilizacion de los complejos durante el lavado previo a la deteccion y la cuantificacion o en vista de una deteccion directa sin lavado tal como se ha considerado mas arriba.

La presencia, en dicho volumen, de un gran numero de partfculas magneticas de dimensiones que pueden ser inferiores a las usadas en los procedimientos conocidos, y el coeficiente de difusion elevado que confiere a estas partfculas su pequeno tamano, aumenta su probabilidad de encontrarse con los antfgenos y los anticuerpos de deteccion.

Hay que indicar que, aunque el ejemplo dado antes se refiere a un ensayo de inmunoanalisis de tipo "sandwich", que puede reemplazar el ensayo ELISA sandwich clasico, el procedimiento se puede ajustar para ofrecer las mismas modalidades que otros ensayos de inmunoanalisis (de tipo ELISA directo o ELISA competitivo) u otros procedimientos que implican la captura de una molecula, tales como la inmunoprecipitacion.

Por ejemplo, un ensayo de inmunoprecipitacion esta dirigido a purificar una protema determinada en una muestra que comprende una pluralidad de protemas.

Este ensayo usa anticuerpos adecuados para unirse selectivamente a la protema que se desea detectar.

En dicho ensayo, dichos anticuerpos se acoplan a una pluralidad de partmulas magneticas y se introducen dichas partmulas en la muestra.

Los anticuerpos unidos a las partmulas magneticas se van a unir entonces a las protemas que son reconocidas espedficamente.

Las protemas que se quieren aislar estan unidas a los anticuerpos que estan ellos mismos acoplados a las partmulas magneticas, formando asf complejos.

Gracias a las microfuentes de campo magnetico ordenadas, se pueden inmovilizar entonces dichos complejos sobre un soporte y despues, si es necesario, proceder a un lavado para retirar el resto de la muestra.

Al contrario, en los procedimientos que no usan fuentes de campo magnetico, los anticuerpos se unen qmmicamente a los pocillos de la placa de valoracion que se ha funcionalizado previamente.

Con respecto al procedimiento de D. Issadore et al., el uso de un soporte que comprende microfuentes de campo magnetico ordenadas permite, para un tamano dado de las partmulas magneticas, aumentar el alcance de las microfuentes de campo magnetico y/o, para un alcance dado, aumentar la fuerza ejercida sobre las partmulas de pequeno tamano.

Por consiguiente, la invencion permite una captura mas rapida y mas eficaz.

Por otra parte, el ordenamiento de las microfuentes de campo magnetico permite realizar la deteccion sin proceder necesariamente al lavado del soporte, lo cual no es posible cuando las microfuentes de campo magnetico estan dispuestas aleatoriamente en el soporte, no pudiendo entonces el experto en la tecnica diferenciar las partmulas capturadas de las partmulas no capturadas.

Particulas magneticas

Las particulas usadas son particulas magneticas de dimensiones micrometricas (micropartmulas) o nanometricas (nanopartmulas).

De forma ventajosa, dichas particulas son equivalentes a bolas.

En el texto que sigue, las particulas se podran denominar por lo tanto por el termino "bolas" aunque su geometna no sea una esfera perfecta.

Dichas bolas estan disponibles en el mercado en grandes cantidades y bajo coste, en concreto para aplicaciones tales como la imagenologfa por resonancia magnetica (IRM) lo cual no encarece el coste del ensayo.

Preferiblemente, dichas bolas estan monodispersas, confiriendo la uniformidad dimensional de las bolas iguales propiedades y mejorando asf la difusion de las bolas en la mezcla y su captura por las microfuentes de campo magnetico.

En algunos casos, las bolas se comercializan en forma dispersa en una matriz poco o que no es magnetica, tal como un polfmero, sflice (SO2), etc.

Las bolas preferiblemente son biocompatibles.

Para permitir el acoplamiento por union covalente de un elemento destinado al acoplamiento selectivo con la molecula que se va a capturar, la superficie de las particulas se funcionaliza, por ejemplo, mediante protemas A o G. En el presente texto, el termino "nanopartmula" indica un objeto cuyas tres dimensiones estan en la escala nanometrica, es decir cuyo tamano caractenstico, por ejemplo, el diametro medio si se trata de una bola, tfpicamente es inferior a 100 nm.

El termino "micropartmula" indica un objeto cuyas tres dimensiones estan en la escala micrometrica, es decir cuyo tamano caractenstico, por ejemplo, el diametro medio si se trata de una bola, esta comprendido entre 100 nm y 1 O0 |im.

Salvo que se mencione lo contrario, el termino "partmula" o "bola" usados en el texto a continuacion abarca a la vez las nanopartmulas y las micropartmulas magneticas.

Por sus dimensiones, las particulas magneticas usadas presentan propiedades superparamagneticas.

Se recuerda que el termino "superparamagnetico" indica la propiedad de las partfculas de material ferromagnetico o ferrimagnetico de pequenas dimensiones de cambiar aleatoriamente de direccion de imantacion en ausencia de un campo magnetico aplicado, bajo el efecto de la agitacion termica.

El caracter de ser superparamagnetico implica que, en ausencia de cambio magnetico de excitacion exterior, las bolas no tienen ningun momento magnetico neto, de modo que no son atrafdas mutuamente, lo que evita su aglomeracion.

Con respecto a las micropartfculas, las nanopartfculas una vez acopladas con un anticuerpo, presentan rendimientos mucho mas importantes en terminos de captura de antigenos.

Esta mejora se puede explicar por la reduccion de escala de las nanopartfculas con respecto a las micropartfculas. Asf, para una reduccion de diametro de un factor 100 (por ejemplo, entre una microbola de 3 |im de diametro y una nanobola de 30 nm de diametro):

- el coeficiente de difusion se multiplica por 100,

- la relacion superficie/volumen se multiplica por 100,

- el numero de bolas por m3 se multiplica por 106.

Al fijarse los anticuerpos de captura sobre la superficie de las partfculas, el aumento de la relacion superficie/volumen permite, con la misma masa de partfculas, aumentar el numero de anticuerpo de captura y por consiguiente mejorar la sensibilidad del ensayo.

Ademas, la disminucion del tamano de las partfculas aumenta su velocidad de difusion en la mezcla y por lo tanto permite una formacion mas rapida de complejos.

Otra ventaja de las nanopartfculas es que son de dimensiones equivalentes a los objetos biologicos (cadenas de ADN, marcadores de cancer, protemas espedficas) que se quieren detectar.

Asf, tienen el mismo movimiento browniano que estos objetos, lo que permite aumentar la capacidad de la captura. Finalmente, el aumento del numero de anticuerpos de captura gracias a las nanopartfculas permite desplazar el equilibrio termodinamico de la reaccion de asociacion y, por lo tanto, podna permitir el uso de anticuerpos actualmente pasados por alto debido a su menor afinidad.

Por consiguiente, aunque el procedimiento segun la invencion se pueda llevar a cabo con cualquier tamano de partfcula magnetica, se seleccionaran preferiblemente partfculas que tengan un diametro comprendido entre 5 nm y 1 |im, de modo mas preferido entre 5 nm y 500 nm, incluso entre 5 nm y 100 nm o entre 5 y 50 nm.

Microfuentes de campo magnetico

Por microfuente de campo magnetico se entiende un iman cuyas tres dimensiones son de escala micrometrica, es decir cuya longitud, anchura y espesor son inferiores a 1 mm.

Segun una realizacion, dichas microfuentes de campo magnetico estan constituidas por un material magnetico duro que puede estar imantado de forma permanente.

Esto permite asegurar la autonoirna del dispositivo de ensayo, es decir evitar la necesidad de una alimentacion electrica o de un campo magnetico externo para permitir la captura de las partfculas superparamagneticas.

No obstante, es posible que dichas microfuentes esten hechas de un material magnetico blando, una fuente de campo magnetico exterior (por ejemplo, un iman permanente o un electroiman) teniendo que colocarse entonces en la cercama del soporte para imantarlos, temporalmente o de forma permanente.

El gradiente de campo magnetico en general es mas fuerte en la periferia de una microfuente de campo magnetico y, si procede, en la interfase entre dos microfuentes de campo magnetico orientadas de forma diferente.

Las microfuentes de campo magnetico usadas en la invencion generan campos magneticos comparables a los de los imanes macroscopicos actualmente disponibles, es decir, de una intensidad del orden de 0,1 a 1 x 106 A/m. En cambio, los gradientes de campo magnetico medidos encima de la superficie del soporte pueden alcanzar 106 T/m, es decir varios ordenes de magnitud superiores a los gradientes generados por imanes macroscopicos.

Las fuerzas magneticas inducidas sobre las partfculas magneticas son mucho mas importantes que las generadas por imanes macroscopicos (es decir, que presentan al menos dos dimensiones superiores a 1 mm), lo que puede explicarse por el cambio de escala.

Asf, la reduccion en un factor 1000 de la fuente de campo magnetico (por ejemplo, entre un iman cubico de 10 mm de lado y un iman de 10 pm) tiene como efecto multiplicar por 1000 la fuerza magnetica ejercida por la microfuente. Como resultado, dichas microfuentes de campo magnetico son actualmente el unico medio experimental demostrado que permite capturar eficazmente nanopartfculas.

Hasta ahora, los autores de la invencion han demostrado experimentalmente que estas microfuentes de campo magnetico son de hecho capaces de capturar nanopartfculas cuyo diametro es superior o igual a 5 nm.

Sin embargo, el interes de las microfuentes de campo magnetico no se limita a las nanopartfculas superparamagneticas.

De hecho, incluso para las micropartfculas, el aumento de la fuerza magnetica con respecto a la de los imanes macroscopicos convencionales facilita la captura de los complejos que comprenden las micropartfculas.

Las microfuentes de campo magnetico se pueden fabricar en concreto por uno de los siguientes procedimientos. Segun una realizacion de la invencion, las microfuentes se fabrican por estructuracion magnetica a escala micrometrica de una capa de material magnetico duro.

La produccion de imanes permanentes eficaces a escalas micrometricas puede comprender las dos siguientes etapas sucesivas:

- la smtesis de pelmulas magneticas espesas eficaces, que presentan un espesor comprendido entre 1 y 100 pm; - la produccion de microfuentes de campo magnetico (equivalentes a microimanes permanentes) por estructuracion magnetica de dicha pelfcula magnetica.

Smtesis de pelculas magneticas

Se describe un procedimiento de deposicion por via ffsica por pulverizacion por medio de triodo que permite la deposicion de un material magnetico en capas espesas (tfpicamente 1-100 pm) en N.M. Dempsey et al., App. Phys. Lett. 90, 092509 (2007).

A modo de ejemplo, se han sintetizado capas de NdFeB, FePt y SmCo y tienen notables propiedades magneticas. Se pueden considerar otros metodos de fabricacion de imanes en capas, en particular la deposicion electrolttica, deposicion de sol-gel, deposicion por evaporacion, deposicion por laser pulsado, etc.

Tambien se puede llevar a cabo la union de una capa de material magnetico sobre un sustrato.

Los materiales que se pueden usar para formar capas son materiales magneticos duros, que a continuacion se pueden imantar de forma permanente.

Entre los materiales adecuados para este uso, se pueden mencionar los imanes basados en tierras raras, de formula RFeB (donde R consiste esencialmente en Nd, Pr, Tb, Dy o una mezcla de varios de estos elementos), RCo o RCoCu (estructura cristalografica de tipo 1/5), RCoCuFe (estructuras cristalograficas de tipo 1/7 o 2/17), RFeN (donde R consiste esencialmente en Sm), aleaciones de metal de transicion de la serie 3d (Fe, Co, Ni)-metal noble (Pt o Pd como elemento mayoritario), imanes de ferrita, imanes de MnBi, MnAl, MnGa, FeGa, AINiCo.

Segun una realizacion ventajosa, se selecciona el material magnetico duro entre las familias de NdFeB, SmCo y FePt.

Por otra parte, la generacion de campos magneticos y gradientes de campos magneticos importantes requiere una microestructuracion magnetica de la capa de material magnetico duro. Es esta estructuracion la que asegura el ordenamiento de las microfuentes de campo magnetico.

De forma particularmente ventajosa, dicha capa se puede microestructurar magneticamente mediante una de las dos tecnicas presentadas a continuacion.

Estructuracion magnetica por el metodo llamado "topografico"

Esta tecnica consiste en estructurar antes de la deposicion, el sustrato sobre el que a continuacion se deposita el material magnetico duro y/o estructurar directamente la capa magnetica.

Las dimensiones de las estructuraciones topograficas determinan las dimensiones de los microimanes obtenidos. Cada parte de capa magnetica grabada y/o depositada sobre un microsaliente o en una microcavidad del sustrato se puede equiparar con un elemento magnetico independiente.

Observese que pueden ser necesarias etapas de planarizacion, litograffa optica, y ataque qmmico.

Estos microelementos hechos as â continuacion se imantan segun una direccion seleccionada.

Constituyen entonces un conjunto de microimanes independientes, que presentan todos la misma direccion de imantacion [A. Walther et al., J. Magn. Mag. Mat. 321 (2009) 590].

Estos microimanes individuales, opcionalmente situados a diferentes alturas, constituyen sistemas que presentan gradientes muy fuertes de campo magnetico a escalas micrometricas [M. Kustov et al., J. App. Phys. 108, 063914 (2010)].

La figura 2 ilustra de forma esquematica un ejemplo de microestructuracion topografica.

El sustrato 5 comprende una pluralidad de microcavidades que, en este ejemplo, se presentan en forma de zanjas paralelas.

Despues se deposita el material magnetico duro en estas zanjas de manera que forme regiones magneticas paralelepfpedas 6.

La formacion de dichas cavidades y el deposito del material magnetico son conocidos para el experto en la tecnica, y por lo tanto no se van a describir con detalle aqrn.

De ser necesario, se procede despues a un pulido de modo que se obtenga una placa plana cuya superficie presente una alternancia de regiones de sustrato 5 y regiones de material magnetico duro 6.

Despues se aplica un campo magnetico externo de modo que se imanten de forma permanente las regiones 6 del material magnetico duro.

El experto en la tecnica puede definir la intensidad del capo magnetico que se va a aplicar para obtener la imantacion deseada en funcion de los materiales usados.

Dichas microfuentes de campo magnetico generan un fuerte gradiente de campo magnetico y por lo tanto son adecuadas para la captura e inmovilizacion de las nano o micropartfculas magneticas.

Las dimensiones de las microfuentes son de escala submilimetrica y dependen de la precision de los procedimientos topograficos usados.

No hace falta decir que las formas de estas microfuentes no estan limitadas a formas paralelepfpedas; pueden por tanto estar dispuestas en forma de un tablero de ajedrez, pero tambien pueden presentar una forma circular, hexagonal, etc.

Estructuracion magnetica por el metodo llamado "impresion termomagnetica" (o "Thermo-MaaneticPatternina" segun la terminologia anglosajona)

El principio de la estructuracion por impresion termomagnetica es usar una fuente de calor para calentar localmente determinadas zonas de una capa magneticamente dura y asf crear volumenes imantados segun direcciones alternadas, que constituyen microfuentes de campo magnetico.

A modo de ejemplo, se puede usar como fuente de calor un laser pulsado de nanosegundo segun un metodo cuyo principio se describe con referencia a las figuras 3A a 3D.

Como se ilustra en la figura 3A, una capa 6 de un material magnetico duro se imanta en una direccion y sentido dados (representado por la flecha).

Despues esta capa 6 se coloca en un campo magnetico externo uniforme Hext (yoHext < yoHc) de direccion opuesta a la direccion de imantacion original, y despues se irradia localmente mediante un laser pulsado L (en este caso un laser de exdmeros de tipo KrF (248 nm), o un laser de Nd-YAG).

Como se ilustra en la figura 3B, dicha irradiacion se realiza a traves de una mascara M que, en este ejemplo, esta provista de un determinado numero de aberturas rectangulares paralelas.

La temperatura de la superficie de las zonas irradiadas aumenta muy rapidamente y despues el calor se difunde en el material (vease la figura 3C).

Dada la disminucion del campo coercitivo yoHc de un material cuando aumenta su temperatura, la inversion magnetica de las zonas irradiadas se puede obtener por aplicacion del campo magnetico externo Hext durante el pulso del laser.

Como se ilustra en la figura 3D, la capa esta constituida finalmente por una red de microimanes de imantaciones alternas representados por las flechas y de dimensiones definidas por las dimensiones de la mascara usada durante la irradiacion laser.

Los sistemas hechos por este procedimiento presentan gradientes de campo magnetico muy fuertes a escalas micrometricas [M. Kustov et al., J. App. Phys. 108, 063914 (2010)].

Para mas detalles relativos a este procedimiento, se puede mencionar el arffculo de F. Dumas-Bouchiat et al., App. Phys. Lett. 96, 102511 (2010).

Este principio de impresion termomagnetica se puede extender a cualquier tipo de capas magneticas duras, incluidas las que presentan imantaciones isotropas o en el plano.

Procedimiento llamado "Micro Magnetic Imprinting" (impresion micromagnetica)

Segun otra forma de realizacion de la invencion, las microfuentes 21 se presentan en forma de aglomerados ordenados de nano o microparffculas de un material magnetico duro encerradas en una matriz no magnetica e imantadas.

De forma particularmente ventajosa, dicha matriz puede ser de un material flexible, lo que permite obtener un soporte flexible.

Las figuras 4A a 4D ilustran etapas de un modo de fabricacion del soporte segun la invencion.

Con referencia a la figura 4A, se usa un sustrato maestro M1 para ordenar las nano o microparffculas antes de encerrarlas en una matriz no magnetica.

Dicho sustrato maestro M1 presenta una cara magnetica estructurada, es decir una cara M10 constituida por una pluralidad de microfuentes M10a, M10b de campo magnetico repartidas segun un motivo determinado.

La imantacion de las diferentes microfuentes se representa por una flecha.

En las figuras 4A a 4D, la cara magneticamente estructurada M10 del sustrato maestro es plana.

Sin embargo, en algunas formas de realizacion de la invencion, puede ser preferible usar un sustrato maestro cuya cara no sea plana, sino que presente cavidades o salientes, con el fin de reproducir en la peffcula formada a partir del sustrato maestro salientes o cavidades complementarias.

El sustrato maestro se puede fabricar por diferentes tecnicas conocidas por el experto en la tecnica.

En particular, se puede llevar a cabo un procedimiento de estructuracion por impresion termomagnetica o un procedimiento de estructuracion por topograffa tal como se han descrito mas arriba.

En un ejemplo no limitante ilustrado en la figura 4A, el sustrato maestro esta constituido por una capa M11 magneticamente dura de NdFeB que presenta un espesor de 5 |im sobre un sustrato soporte M12 de silicio y magneticamente estructurado por impresion termomagnetica de modo que forma regiones M10a de imantacion opuesta a la de las regiones M10b.

En este sustrato maestro, la intensidad del campo magnetico y del gradiente del campo magnetico es maxima a nivel de las interfases entre las regiones M10a y M10b que presentan imantaciones opuestas.

Por consiguiente, las nano o microparffculas que presentan una susceptibilidad magnetica positiva son atrafdas por la fuerza magnetoforetica hacia las interfases.

El sustrato maestro no obstante no esta limitado a esta forma particular, sino que puede estar constituido por un material magnetico duro o blando estructurado por topograffa.

El sustrato maestro puede ser opcionalmente un conductor electrico.

Cuando el sustrato maestro presenta una superficie estructurada por topograffa, es decir no plana, esta topograffa particular se puede aprovechar para imprimir una forma complementaria en la peffcula final.

Cuando se desea formar una peffcula plana a partir de dicho sustrato maestro, es necesario planarizarlo previamente, sea por extraccion de materia (por ejemplo, mediante un pulido mecanoqmmico para eliminar los salientes), o sea por adicion de materia (por ejemplo, mediante una tecnica de deposicion para llenar las cavidades). En relacion con la figura 4B, se mandan sobre la cara magneticamente estructurada del sustrato maestro 1 nano o microparffculas P de un material magnetico duro.

Bajo el efecto de la fuerza magnetoforetica de atraccion de la cara magneticamente estructurada del sustrato maestro, las partfculas P se aglomeran en los bordes de cada una de las microfuentes.

En la medida en que la fuerza disminuye a medida que uno se aleja de la cara del sustrato maestro, estos aglomerados 21 presentan en general una seccion triangular o trapezoidal, con una base mas amplia del lado del sustrato maestro M1 y que disminuye con la distancia.

Para favorecer el ordenamiento de las partfculas no unicamente en un plano sino tambien en una direccion perpendicular al sustrato maestro, se puede aplicar simultaneamente un campo magnetico externo que presente una direccion adecuada.

Cuando se envfan las partfculas, se agita ventajosamente el sustrato maestro de modo que se optimice el atrapamiento de las parrtculas a nivel de los bordes de las microfuentes de campo magnetico.

Por otra parte, durante o despues de este envfo, se puede proyectar un chorro de gas seco para favorecer el atrapamiento de las partfculas a nivel de dichos bordes y/o eliminar las partfculas no atrapadas antes de la deposicion de la matriz no magnetica.

Las partfculas son de un material magnetico duro, que puede ser uno de los materiales de la lista desarrollada mas arriba.

Por consiguiente, la aplicacion, despues de la formacion de la pelfcula, de un campo magnetico externo, permitira imantarla de forma permanente y por lo tanto formar una pelfcula magneticamente estructurada autonoma.

En relacion con la figura 4C, despues se deposita sobre las parrtculas aglomeradas sobre el sustrato maestro, una matriz 22 de un material no magnetico en forma de una capa fina.

El espesor de la matriz 22 rtpicamente esta comprendida entre 100 nm y 5 mm.

De forma ventajosa, la matriz es de un material elastomero, lo que permite conferir a la pelfcula una cierta flexibilidad.

Segun realizaciones preferidas de la invencion, la matriz es de uno de los siguientes materiales: polidimetilsiloxano (PDMS), resina epoxfdica, caucho, baquelita, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliestireno (PS), resina fotosensible, parileno, oxidos tales como SiO2, A^Oa, metales tales como Cu, Ag, materiales carbonados tales como grafito, DLC, etc.

Si es necesario, se deja la matriz 22 endurecer o reticular durante el tiempo adecuado.

Por otra parte, la matriz puede ser ventajosamente de un material transparente o traslucido.

El experto en la tecnica puede seleccionar una matriz adecuada entre los productos disponibles en el mercado, en funcion de las propiedades buscadas.

En relacion con la figura 4D, se deslamina la pelfcula 2 constituida por la matriz 22 y los aglomerados 21 de partfculas magneticas frente al sustrato maestro Ml.

En cuanto al sustrato maestro se puede reutilizar para la fabricacion de una nueva pelfcula.

Por lo tanto, aunque para el sustrato maestro es necesario llevar a cabo tecnicas de microfabricacion y, por consiguiente, presenta un cierto coste, se puede reutilizar indefinidamente, y la fabricacion de la propia pelfcula magneticamente estructurada no implica dichas tecnicas complejas y costosas, usando solo materiales poco caros. Este procedimiento ademas es facilmente industrializable y permite producir pelfculas de gran superficie y en gran cantidad con coste bajo.

Segun una forma de realizacion de la invencion, se puede depositar sobre el sustrato maestro, antes de depositar las partfculas, una capa de material que permita facilitar la deslaminacion de la pelfcula y que quede unida al sustrato maestro tras el deslaminado.

Teniendo en cuenta el pequeno tamano de las partfculas que se van a inmovilizar sobre el soporte, las microfuentes de campo magnetico ordenadas se disponen preferiblemente directamente en la superficie del soporte, o en las inmediaciones de la misma, en contacto con la muestra para proporcionar fuerzas de atraccion maximas.

Placa de multipocillos

De forma convencional, se usan placas de valoracion que comprenden una pluralidad de pocillos (por ejemplo, 96 o 384 pocillos) en los ensayos de inmunoanalisis.

Para inmovilizar los complejos, se pueden integrar en dicha placa las microfuentes de campo magnetico ordenadas como se han descrito anteriormente.

Esta integracion se puede obtener haciendo la propia placa en un material adecuado para formar microfuentes de campo magnetico ordenadas, segun uno de los procedimientos descritos mas arriba. Las microfuentes de campo magnetico se colocan entonces preferiblemente en el fondo de cada uno de los pocillos.

Segun otra forma de realizacion, se pueden insertar en el interior de cada pocillo un soporte del tamano de dichos pocillos sobre el que se disponen dichas microfuentes de campo magnetico ordenadas.

Segun otra realizacion, se puede hacer una placa de valoracion en la que los pocillos no tienen fondo, y llevar bajo dicha placa un soporte plano que contiene las microfuentes de campo magnetico ordenadas dispuestas a nivel de cada uno de los pocillos, de modo que constituya el fondo estanco de dichos pocillos.

Por lo tanto, el procedimiento es compatible con los soportes usados habitualmente en inmunoanalisis, por lo que no es necesaria la modificacion de los equipos de laboratorio existentes.

Soporte plano

Segun la invencion, el soporte sobre el que se inmovilizan los complejos no es una placa de valoracion sino un soporte de superficie plana donde se dispone una pluralidad de microfuentes magneticas ordenadas.

Dicho soporte se puede hacer por los diferentes procedimientos de microestructuracion de capas magneticas descritos mas arriba.

De forma alternativa, dicho soporte se puede hacer por el procedimiento de "Micro Magnetic Imprinting" descrito mas arriba.

Esta tecnica de fabricacion presenta la ventaja de poder fabricar con coste bajo una gran cantidad de soportes, siendo costoso solamente el sustrato maestro, que se puede reutilizar a discrecion.

Por otra parte, con esta tecnica, el soporte presenta la ventaja de poder hacerse con un material transparente o traslucido.

En algunos casos esta propiedad puede facilitar la deteccion y la cuantificacion por metodos opticos.

Por lo tanto, permite iluminar el soporte por debajo, lo que permite observar la coloracion por la parte de arriba del soporte con una camara y filtros que el experto en la tecnica sabra seleccionar.

Al contrario, esta transparencia puede ser molesta, por ejemplo, en el caso de la fluorescencia intensa, donde las senales podnan interferir entre ubicaciones contiguas.

Por lo tanto, se podna seleccionar el material del soporte en funcion del metodo de deteccion previsto.

Al usar dicho soporte plano, la mezcla de la molecula que se va a detectar, las partfculas magneticas y el elemento capaz de unirse selectivamente a dicha molecula, se hace en un recipiente y despues se extraen volumenes limitados de mezcla y se depositan sobre dicho soporte en forma de gota, como se ilustra en la figura 5.

El tamano de las gotas depende del volumen depositado y de la hidrofilia del material del soporte. Este tamano es por lo tanto ajustable, tipicamente comprendido entre 1 microlitro y 200 microlitros.

Las microfuentes de campo magnetico ordenadas se reparten ventajosamente sobre la superficie del soporte segun un motivo regular, de modo que permita la captura de complejos cualquiera que sea la region del soporte sobre la que se ha depositado la gota.

La ubicacion destinada a cada gota preferiblemente se marca sobre el soporte plano, por ejemplo, mediante un marcaje magnetico local, o qmmicamente (haciendo la superficie del soporte localmente hidrofila o hidrofoba), o tambien topograficamente, mediante un hueco de pequena profundidad realizado sobre la superficie del soporte. Tambien se puede marcar visualmente la ubicacion para ayudar al experimentador a localizarla.

De forma inesperada, se ha demostrado que la velocidad de captura de las bolas magneticas era sensiblemente mayor en gotas depositadas sobre dicho soporte plano que en una solucion depositada en un pocillo de una placa de valoracion.

La figura 6 presenta el porcentaje de bolas de 100 nm de diametro capturadas respetivamente en una gota (datos representados por un cfrculo) y la cantidad de bolas del mismo tipo capturadas en un pocillo (datos representados por un cuadrado).

Despues de 10 minutes, 75% de las bolas han sido capturadas por las microfuentes de campo magnetico ordenadas dispuestas en el fondo de los pocillos de valoracion, mientras que se ha recuperado mas de 90% de las bolas por las microfuentes de campo magnetico ordenadas dispuestas en el soporte que recibe la gota.

Este fenomeno se explica por la presencia de un movimiento de conveccion inducido en el interior del fluido por el transporte de las partteulas magneticas hacia las microfuentes de campo magnetico ordenadas que las capturan. La rapidez de difusion de las partteulas permite, por lo tanto, liberarse de cualquier dispositivo de vibracion que es necesario en los ensayos convencionales para acelerar la mezcla de la solucion.

Otra ventaja del soporte plano con respecto a una placa de valoracion convencional, es que permite, para una misma acumulacion del soporte, proporcionar mas sitios de captura de moleculas.

Cinetica de captura de nanoparticulas magneticas por un soporte que comprende microfuentes de campo magnetico ordenadas

La cinetica y la eficacia de captura notables de las nanoparticulas magneticas por soportes que comprenden microfuentes de campo magnetico ordenadas, se deben a un acoplamiento hidrodinamico entre las partteulas. De hecho, las partteulas magneticas mas cercanas a la superficie del soporte son atrafdas rapidamente por las microfuentes de campo magnetico ordenadas, y su arrastre conlleva de forma hidrodinamica el movimiento de partteulas mas alejadas hacia las microfuentes de campo magnetico, que una vez acercadas a la superficie del soporte, son a su vez magneticamente atratelas.

Este acoplamiento entre fuerzas magneticas y traccion hidrodinamica tiene como consecuencia la aparicion de una corriente de fluido de conveccion que mueve el fluido encima de las microfuentes de campo magnetico, lo que explica la eficacia y la cinetica de la captura a larga distancia de nanoparticulas a pesar del pequeno tamano de estas.

Esta interpretacion esta justificada por un modelo teorico y por un experimento que demuestra la existencia de este acoplamiento.

En este experimento, los autores de la invencion han visualizado el movimiento de una muestra fluida gracias a partteulas coloreadas no magneticas en suspension en un fluido depositado sobre una union lineal entre dos zonas imantadas.

Esta union simula un elemento de una matriz de microfuentes de campo magnetico ordenadas hecha por la tecnica de Thermo Magnetic Patterning descrita mas arriba.

Es en esta union donde se localizan los gradientes de campo magnetico mas elevados.

La medicion del movimiento y de la velocidad de las bolas (por una tecnica llamada "particle tracking velocimetry" (velocimetna por seguimiento de partteulas)) ha permitido reconstituir el movimiento y la velocidad del fluido.

En la figura 9, que ilustra las lmeas de corriente inducidas por la atraccion de las nanopartteulas superparamagneticas en suspension encima de una union entre dos dominios magneticos D1, D2, cuyos sentidos de imantacion estan representados por las flechas (el eje z designa el espesor del fluido encima de la union), se ve claramente que se crean dos vortices simetricos rapidamente de una parte a otra de la union, que mueven el lfquido en una distancia del orden de varios mm.

En ausencia de micropartteulas magneticas, no es evidente ningun movimiento ordenado del fluido.

El campo de velocidades del fluido medido corresponde, dentro del 10%, a lo que se calcula por el modelo de acoplamiento hidrodinamico-magnetico descrito antes.

Este acoplamiento se pone de manifiesto para concentraciones de partteulas magneticas superiores a 106 partteulas/ml, lo cual es lo que se observa efectivamente experimentalmente.

La formacion de corriente de conveccion esta mtimamente ligada al ordenamiento de las microfuentes de campo magnetico.

Sistema microfluidico

Segun otra realizacion ventajosa de la invencion, el soporte puede ser un sistema microflmdico de tipo "lab-on-chip". El soporte comprende entonces un microcanal y una red de microfuentes magneticas dispuestas de forma ordenada en al menos una pared de dicho canal.

Dicho microcanal se puede hacer segun un procedimiento de "Micro Magnetic Imprinting" descrito mas arriba.

En este caso, como se ilustran en las figuras 7A a 7E, la cara magneticamente estructurada del sustrato maestro 1 no es plano, sino que presenta al menos un saliente o una cavidad cuyo negativo estara presente en la pelfcula. En el ejemplo no limitante ilustrado en la figura 7A, la cara magneticamente estructurada 10 del sustrato maestro 1 presente un saliente en relieve 10', estando constituida la superficie del saliente por una pluralidad de microfuentes de campo magnetico 10a, 10b.

Por ejemplo, dicho saliente puede presentar una forma paralelepfpeda.

Segun las aplicaciones previstas, el resto de la superficie del sustrato maestro puede estar tambien magneticamente estructurado, pero tambien esta previsto que solo este estructurada magneticamente la superficie del saliente 10'; en este ultimo caso, las nano o micropartfculas suministradas solo se aglomeraran en los bordes de las microfuentes magneticas que constituyen la superficie del saliente 10', no reteniendo partfculas el resto de la superficie del sustrato maestro.

Como se ha explicado mas arriba, se suministran sobre el sustrato maestro las nano o micropartfculas magneticas, que se ordenan y se aglomeran en estructuras tridimensionales 20 en los bordes de las microfuentes de campo magnetico 10a, 10b (figura 7B).

Despues, en relacion con la figura 7C, se deposita la matriz no magnetica 3 sobre el sustrato maestro.

Al final del deslaminado, la pelfcula 4 asf obtenida ilustrada en la figura 7D presenta, por lo tanto, una cavidad 40 complementaria del saliente 10' del sustrato maestro.

Segun la forma del resalte, la pelfcula consiste asf en uno o varios pocillos, o en uno o varios canales.

A partir de dicha pelfcula se puede formar por lo tanto un microcanal flmdico.

Para este fin, como se ilustra en la figura 7E, solo es necesario aplicar contra dicha pelfcula 4 una pelfcula plana 4' o cualquier otra estructura que permite formar la cuarta pared de la cavidad 40.

De forma ventajosa, dicha pelfcula plana 4' se puede fabricar tambien segun la invencion y puede comprender en su superficie estructuras magneticas tridimensionales 20'.

Asf, a partir de las pelfculas 4 y 4' se forma un dispositivo 6 que comprende un microcanal 60 que presenta, sobre dos paredes opuestas 61a y 61b, una superficie magneticamente estructurada.

Un tratamiento de superficie puede permitir asegurar la estanqueidad de las dos pelfculas.

Por ejemplo, cuando las dos pelfculas tienen una matriz de PDMS, se puede realizar una activacion de las superficies por un plasma de oxfgeno.

Gracias a la presencia de las estructuras magneticas tridimensionales sobre las dos caras 61a y 61b del microcanal 61, se mejora el atrapamiento de las nano o micropartfculas en una solucion que circula en dicho microcanal.

Naturalmente, la naturaleza de las partfculas magneticas, asf como su reparto en relacion con la superficie de cada pared, pueden ser identicos para cada una de las dos paredes o bien ser diferentes.

En dicho sistema, se inyecta la mezcla a la entrada del microcanal: la solucion circula en el microcanal, quedando inmovilizados progresivamente los complejos sobre el fondo del microcanal por las microfuentes de campo magnetico.

Despues opcionalmente se puede proceder a una etapa de lavado para retirar los residuos de la solucion, quedando los complejos magneticamente atrapados por las microfuentes situadas sobre las paredes del canal.

Ejemplo de acoplamiento de un anticuerpo con una particula magnetica (protocolo comercial Dynabead)

A modo indicativo, el acoplamiento de un anticuerpo con una bola magnetica se puede hacer segun el siguiente procedimiento:

- suspender de nuevo las bolas agitando con vortice una solucion en la que se dispersan,

- extraer la cantidad de bolas deseada,

- retirar el lfquido sobrenadante con ayuda de una pipeta y un iman,

- anadir el anticuerpo diluido en PBS-Tween al 0,01%,

- incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion,

- retirar el Ifquido sobrenadante con ayuda de una pipeta y un iman,

- volver a suspender las bolas acopladas con el anticuerpo en PBS-Tween al 0,01%.

Validaciones experimentales

Una realizacion de la invencion se ha validado en un ensayo de determinacion de un antigeno de tipo "sandwich" realizado en las siguientes condiciones.

Se ha usado para este experimento como antigeno que se va a determinar la "coreprotein" (protema core) (biotinilada) del virus de la hepatitis C, como anticuerpo de captura un anticuerpo monoclonal espedfico de esta protema (Pierce Hepatitis C Virus Core Antigen Monoclonal Antibody (C7-50)), bolas superparamagneticas de 100 nm de diametro, funcionalizadas con la protema A (fluidMAG-Protein A, Chemicell) y como anticuerpo de deteccion puntos cuanticos funcionalizados con avidina (QD625, Invitrogen).

En este experimento, las concentraciones usadas eran 1,3 nM para el anticuerpo de captura, 109/ml para las bolas superparamagneticas y 1010/ml para los puntos cuanticos.

Los puntos cuanticos, las bolas funcionalizadas con el anticuerpo y el antigeno biotinilado se pusieron, en una misma etapa, sobre un sustrato flexible que comprendfa las microfuentes de campo magnetico.

La duracion de la mezcla/captura se fijo en 7 minutos.

Despues de este tiempo, se retiro el lfquido sobrenadante y se realizaron dos lavados con 50 |il de PBS.

Finalmente, se midio la cantidad de antigeno directamente sobre el soporte gracias a la fluorescencia de los puntos cuanticos.

La figura 8 ilustra la fluorescencia (en unidades arbitrarias) en funcion de la concentracion de antigeno.

El conjunto del ensayo se realizo en una decena de minutos.

El lfmite de deteccion es de 10 pM, lo cual es comparable con el lfmite de los ensayos ELISA disponibles en el mercado realizados en esta protema.

Mas alla de 5 nM, el ensayo era positivo, pero la respuesta del ensayo se saturaba debido a la camara usada.

En cualquier caso, dichas concentraciones estan mucho mas alla de los casos clmicos; ademas se puede diluir la muestra para repetir el ensayo si es necesario.

Deteccion sin lavado

La organizacion espacial de las microfuentes de campo magnetico ordenadas permite hacer una deteccion sin lavado del soporte ni marcaje de los inmunocomplejos.

Para ello solo hay que determinar la densidad de fluorescencia en la superficie de las microfuentes de campo magnetico ordenadas en las zonas de gradiente de campo magnetico fuerte (senal espedfica) y en las zonas de gradiente de campo magnetico debil (senal no espedfica).

Esta deteccion se puede hacer por fluorescencia, focalizando la toma de imagen sobre la superficie del soporte que contiene las microfuentes de campo magnetico, o disponiendo detectores en la superficie del propio soporte.

El siguiente experimento demuestra la viabilidad de dicha deteccion.

Se mezclaron nanopartmulas magneticas (50 nm, 109 ml'1) y nanopartmulas fluorescentes no magneticas (puntos cuanticos, 30 nm, 109 ml'1) funcionalizadas con biotina, con concentraciones pequenas de avidina, que es una protema que se une de forma casi irreversible a cuatro moleculas de biotina.

Este acoplamiento imita la formacion de inmunocomplejos: (nanopartmulas magneticas)-(anticuerpo de captura)-(antfgeno)-(anticuerpo de deteccion)-(marcador fluorescente) u otro.

Despues de 10 minutos de incubacion, se deposita una gota sobre la superficie de un soporte que comprende las microfuentes de campo magnetico ordenadas hecho por la tecnica de Micro-Magnetic Imprinting y se observa al microscopio optico de fluorescencia 10 minutos despues.

El microscopio se focaliza a nivel del soporte.

En la figura 10A, la imagen de arriba a la izquierda presenta la estructura del soporte que comprende las microfuentes de campo magnetico ordenadas observada con contraste de fase (estando dispuestas las microfuentes de campo magnetico segun una cuadncula que presenta un color mas oscuro que el resto de la matriz) mientras que la imagen de abajo a la izquierda presenta la distribucion de los puntos cuanticos biotinilados en la superficie del soporte en presencia de nanopartfculas magneticas biotiniladas y avidina, observada por fluorescencia (los puntos cuanticos presentan un color claro en esta imagen).

La superposicion de las dos imagenes a la derecha de la figura 10A permite ver los puntos cuanticos que resultan de una interaccion espedfica con las nanopartfculas magneticas: se ve claramente que los puntos cuanticos (de color claro) estan principalmente alineados a lo largo de la cuadncula (de color oscuro) definida por las microfuentes de campo magnetico (senal espedfica) y por lo tanto reproducen el motivo definido por las microfuentes de campo magnetico, solo algunos puntos cuanticos se encuentran en zonas situadas en el interior de esta cuadncula (senal no espedfica).

En ausencia de avidina, ningun motivo es visible.

La densidad de fluorescencia sobre las zonas de gradiente fuerte y debil del campo magnetico se midio sobre las imagenes de microscopfa mostradas en A.

La figura 10B muestra la evolucion de la relacion (senal espedfica)/(senal no espedfica), que es igual a la relacion de (fluorescencia espedfica x area de las regiones de gradiente debil del campo magnetico)/(fluorescencia no espedfica x area de las regiones de gradiente fuerte del campo magnetico) en funcion de la concentracion de avidina.

Si no tiene lugar ninguna interaccion espedfica, esta relacion es 1. La zona sombreada corresponde al intervalo de confianza de 6 sigmas. Todos los puntos fuera de esta zona son significativos con una probabilidad de error inferior a 10-6

Por lo tanto, una concentracion 50 nM es detectable con un nivel de significacion de 99,9997% (seis sigmas).

La microestructuracion de las microfuentes de campo magnetico ordenadas permite definir las regiones de interes "espedficas" y "no espedficas". Por lo tanto, se puede aprovechar para simplificar la deteccion.

Hay que indicar que las microfuentes de campo magnetico que se dispongan de forma aleatoria no permitiran esta deteccion sin lavado.

Referencias

D. Issadore et al, Self-assembled magnetic filter for highly efficient immunomagnetic separation, Lab Chip, 2011, 11,147

N.M. Dempsey et al., App. Phys. Lett. 90, 092509 (2007)

A. Walther et al., J. Magn. Mag. Mat. 321 (2009) 590

M. Kustov et al., J. App. Phys. 108, 063914 (2010)

F. Dumas-Bouchiat et al., App. Phys. Lett. 96, 102511 (2010)

WO2007/125129A1

ZANINI Luiz Fernando : "Bio-Mag-MEMS autonomes bases sur des aimants permanents", Tesis, 3 de mayo de 2013, paginas 1-166.

Guillaume BLAIRE et Al: "Hybrid Bio-Mag-MEMS combining magnetophoresis and dielectrophoresis", The European Physical Journal B, vol. 86, n°4, 1 de abril de 2013.

WO2013/174881 A1

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de captura de una molecula en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

a) la mezcla de dicha muestra con partfculas magneticas, estando acoplada cada una de dichas partfculas con un elemento adecuado para unirse selectivamente a dicha molecula que se va a capturar, de modo que se forme al menos un complejo que comprende una partfcula magnetica, dicho elemento y dicha molecula unida a dicho elemento, presentando dichas partfculas magneticas un diametro comprendido entre 5 nm y 500 nm, despues b) la deposicion de una gota de la mezcla obtenida al final de la etapa a) sobre un soporte, siendo dicho soporte una placa plana en cuya superficie se disponen microfuentes de campo magnetico ordenadas,

c) inmovilizacion de dicho al menos un complejo sobre el soporte que comprende las microfuentes de campo magnetico ordenadas,

caracterizado por que la concentracion de las partfculas magneticas en la mezcla obtenida al final de la etapa a) es superior a 106 partfculas/ml.

2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el soporte comprende una matriz no magnetica que encierra una pluralidad de aglomerados tridimensionales ordenados de micro o nanopartfculas imantadas de un material magnetico duro o blando, formando dichos aglomerados las microfuentes de campo magnetico.

3. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la molecula que se va a capturar es un antfgeno y por que el elemento capaz de unirse a dicha molecula es un anticuerpo receptor de dicho antigeno.

4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que se anade a dicha mezcla un anticuerpo llamado de deteccion que lleva un marcador fluorescente, luminiscente o colorimetrico, siendo capaz dicho anticuerpo de unirse al antfgeno unido al anticuerpo acoplado a la partfcula magnetica.

5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la molecula que se va a capturar es un anticuerpo y por que el elemento capaz de unirse a dicha molecula es un antfgeno reconocido por dicho anticuerpo.

6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende, despues de la inmovilizacion de dicho al menos un complejo sobre el soporte, una etapa de lavado de dicho soporte para retirar la muestra, quedando retenido dicho al menos un complejo sobre el soporte por las microfuentes de campo magnetico ordenadas.

7. Procedimiento de deteccion de una molecula en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

- captura de la molecula sobre un soporte mediante un procedimiento de captura segun una de las reivindicaciones 1 a 5,

- deteccion de la molecula capturada sobre el soporte por fluorescencia, luminiscencia colorimetna, electroqmmica y/o radiometna.

8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la etapa de deteccion se lleva a cabo directamente despues de la etapa de captura, sin etapa intermedia de lavado del soporte.

9. Procedimiento segun la reivindicacion 7, caracterizado por que comprende, entre la etapa de captura y la etapa de deteccion, una etapa de lavado de dicho soporte para retirar dicha muestra, quedando retenido dicho al menos un complejo sobre el soporte por las microfuentes de campo magnetico ordenadas.