ES2759617T3

ES2759617T3 - Animales no humanos humanizados con loci restringidos de cadena pesada de inmunoglobulina

Info

Publication number: ES2759617T3
Application number: ES13710268T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; John Mcwhirther; Naxin Tu; Sean Stevens; Andrew Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2020-05-11
Anticipated expiration: 2033-03-07
Also published as: MX364449B; CA2876172C; SMT202000026T1; KR102484480B1; CY1124320T1; JP2026040651A; LT3597037T; US20200093106A1; JP2015519076A; PL2858487T3; AU2022291579A1; US10238093B2; HUE055617T2; EP3912464A1; EP2858487B1; HRP20211126T1; KR20200074271A; AU2022291579B2; CA2876172A1; PL3597037T3

Abstract

Un ratón que tiene en su genoma: (a) una secuencia genómica humana no reordenada que comprende un único segmento génico VH humano, uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos, en donde el único segmento génico VH humano, el uno o más segmentos génicos DH humanos, y el uno o más segmentos génicos JH humanos están unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y en donde el único segmento génico VH humano es VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, o una variante polimórfica de los mismos; y (b) una secuencia que codifica una proteína ADAM6a de ratón o un fragmento funcional de la misma y una secuencia que codifica una proteína ADAM6b de ratón o un fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma y la proteína ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma son funcionales en un ratón macho, en donde dichas secuencias codificantes están ubicadas en una posición diferente de un locus ADAM6 de un ratón de tipo silvestre de modo que, en respuesta a la exposición a un antígeno, los linfocitos B del ratón expresan dominios variables de cadena pesada humanos expresados a partir de una secuencia humana de región variable de cadena pesada que incluye un segmento génico VH que es idéntico a o una versión hipermutada de forma somática de, VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, o una variante polimórfica de los mismos; en donde dicho ratón carece de un gen ADAM6 endógeno funcional.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales no humanos humanizados con loci restringidos de cadena pesada de inmunoglobulina

Campo

Se describen animales no humanos modificados genéticamente que comprenden una complejidad génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina reducida, en donde los animales no humanos son capaces de expresar una proteína ADAM6 o un fragmento funcional de la misma. Se describen animales no humanos modificados genéticamente que expresan anticuerpos de un número restringido de segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina y/o variantes de los mismos, en donde los animales no humanos carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional pero retienen la función ADAM6, incluidos los ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de región variable de cadena pesada (V^h) de inmunoglobulina que hace que el ratón sea incapaz de producir una proteína ADAM6 funcional y da como resultado una pérdida de fertilidad. Se describen los ratones modificados genéticamente que comprenden un locus VH de inmunoglobulina caracterizado por un número restringido de segmentos génicos V^h, por ejemplo, un único segmento V^hde inmunoglobulina, por ejemplo, un segmento génico V^h1-69 humano o un segmento génico V^h1-2 humano, y que además comprenden la función ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que restaura la fertilidad a un ratón macho.

Se describen ratones, células, embriones y tejidos genéticamente modificados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un locus ADAM6 funcional, en donde los ratones, células, embriones y tejidos expresan una cadena pesada de inmunoglobulina procedente de un único segmento génico V^hhumano. Adicionalmente, los ratones, células, embriones y tejidos carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional, pero conservan la función ADAM6 caracterizada por la presencia de una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica una proteína ADAM6. Se describen métodos para hacer secuencias de anticuerpos en animales fértiles no humanos que son útiles para unir patógenos, incluidos patógenos humanos.

Antecedentes

Los animales no humanos, por ejemplo, ratones, han sido modificados genéticamente para ser herramientas útiles en métodos para hacer secuencias de anticuerpos para su uso en tratamientos humanos basados en anticuerpos. Los ratones con loci humanizados de región variable (por ejemplo, genes V^h, D^hy J^h, y genes V^ly J^l) se usan para generar dominios variables de cadena pesada y ligera relacionados para su uso en tratamientos de anticuerpos. Los ratones que generan anticuerpos completamente humanos con cadenas pesadas y ligeras relacionadas son conocidos en la materia. Para la creación de estos ratones, fue necesario desactivar los genes endógenos de inmunoglobulina de ratón para que los transgenes completamente humanos aleatoriamente integrados funcionaran como el repertorio expresado de inmunoglobulinas en el ratón. Dichos ratones pueden hacer anticuerpos humanos adecuados para su uso como tratamientos humanos, pero estos ratones muestran problemas sustanciales con sus sistemas inmunitarios. Estos problemas conducen a varios obstáculos experimentales, por ejemplo, los ratones no son prácticos para generar repertorios de anticuerpos suficientemente diversos, requieren el uso de soluciones de reingeniería extensas, proporcionan un proceso de selección clonal subóptimo probablemente debido a la incompatibilidad entre elementos humanos y de ratón, y una fuente poco fiable de poblaciones grandes y diversas de secuencias variables humanas necesarias para ser realmente útil para elaborar tratamientos humanos.

Los tratamientos de anticuerpos humanos están diseñados en base a las características deseadas con respecto a los antígenos seleccionados. Los ratones humanizados se inmunizan con los antígenos seleccionados, y los ratones inmunizados se usan para generar poblaciones de anticuerpos a partir de las cuales identificar dominios variables de cadena pesada y ligera relacionados de alta afinidad con las características de unión deseadas. Algunos ratones humanizados, tales como los que tienen una humanización de solo regiones variables en loci endógenos de ratón, generan poblaciones de linfocitos B que son similares en carácter y número a las poblaciones de linfocitos B de ratón de tipo silvestre. Como resultado, una población extremadamente grande y diversa de linfocitos B está disponible en estos ratones para detectar anticuerpos, que reflejan una gran cantidad de diferentes reordenamientos de inmunoglobulinas, para identificar dominios variables de cadena pesada y ligera con las características más deseables.

Sin embargo, no todos los antígenos provocan una respuesta inmunitaria que exhibe una gran cantidad de reordenamientos de una amplia selección de segmentos variables (V). Esto es, la respuesta inmunitaria humoral humana a determinados antígenos aparentemente está restringida. La restricción se refleja en la selección clonal de linfocitos B que expresan solo determinados segmentos V que se unen a ese antígeno particular con una afinidad y especificidad suficientemente altas. Algunos de dichos antígenos son clínicamente significativos, es decir, varios son patógenos humanos bien conocidos. Se presume que el segmento V expresado en la respuesta inmunitaria humana es un segmento V que, en combinación con un segmento D humano y J humano, es más probable que genere un anticuerpo de alta afinidad útil que un segmento V seleccionado aleatoriamente que no se ha observado en una respuesta de anticuerpos humanos a ese antígeno.

Se presume que la selección natural, a lo largo de milenios de experiencia entre los seres humanos y el patógeno, ha seleccionado el fundamento o base más eficaz a partir de la cual diseñar su arma más eficaz para neutralizar el patógeno del segmento génico V seleccionado. Existe una necesidad en la materia de anticuerpos superiores que se unan y/o neutralicen antígenos como los patógenos discutidos anteriormente. Existe una necesidad de generar más rápidamente secuencias útiles a partir de segmentos génicos V seleccionados, incluidos segmentos génicos V seleccionados polimórficos y/o mutados de forma somática y generar más rápidamente poblaciones útiles de linfocitos B que tengan reordenamientos de los segmentos génicos V con diversos segmentos génicos D y J, que incluyen versiones mutadas de forma somática de los mismos, y en particular reordenamientos con regiones CDR3 únicas y útiles. Existe una necesidad de sistemas biológicos mejorados, por ejemplo, animales no humanos (tales como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, etc.) que puedan generar secuencias de regiones variables de anticuerpos terapéuticamente útiles a partir de segmentos génicos V seleccionados en mayor número y diversidad que, por ejemplo, se puede lograr en animales modificados existentes, al mismo tiempo que se reducen o eliminan los cambios nocivos que pueden resultar de las modificaciones genéticas. Existe una necesidad de sistemas biológicos mejorados genomanipulados para tener un sistema inmunitario humoral comprometido para seleccionar clonalmente secuencias variables de anticuerpos procedentes de segmentos génicos V restringidos y seleccionados, que incluyen, pero no se limitan a, dominios variables humanos de cadena pesada y ligera relacionados, útiles en la fabricación de tratamientos basados en anticuerpos humanos contra antígenos seleccionados, incluidos determinados patógenos humanos. Sigue existiendo una necesidad en la materia de fabricar ratones modificados genéticamente mejorados que sean útiles para generar secuencias de inmunoglobulina, incluidas secuencias de anticuerpos humanos, dirigidas a la eliminación de patógenos que afectan a la población humana.

Existe una necesidad en la materia de anticuerpos terapéuticos que sean capaces de neutralizar antígenos víricos, por ejemplo, VIH y VHC, incluidos anticuerpos específicos de antígeno que contienen cadenas pesadas procedentes de un único segmento génico humano variable. También existe una necesidad de más métodos y animales no humanos para fabricar anticuerpos útiles, incluidos anticuerpos que comprenden un repertorio de cadenas pesadas procedentes de un único segmento V^hhumano y que tienen un conjunto diverso de secuencias CDR que incluyen cadenas pesadas que se expresan con cadenas ligeras humanas relacionadas, y que incluyen la restauración de efectos desfavorables resultantes de la inserción de secuencias genómicas humanas en el genoma de los animales no humanos. Se necesitan métodos para seleccionar CDR para proteínas de unión basadas en inmunoglobulina que proporcionan una diversidad mejorada de proteínas de unión entre las cuales elegir, y una diversidad mejorada de dominios variables de inmunoglobulina, incluidas composiciones y métodos para generar dominios variables de inmunoglobulina mutados de forma somática y seleccionados clonalmente para su uso, por ejemplo, en la fabricación de tratamientos humanos.

Resumen

La invención proporciona un ratón que tiene en su genoma:

(a) una secuencia genómica humana no reordenada que comprende un único segmento génico V^hhumano, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y uno o más segmentos génicos J^hhumanos, en donde el único segmento génico V^hhumano, el uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y el uno o más segmentos génicos J^hhumanos están unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y en donde el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos; y

(b) una secuencia que codifica una proteína ADAM6a de ratón o un fragmento funcional de la misma y una secuencia que codifica una proteína ADAM6b de ratón o un fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma y la proteína ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma son funcionales en un ratón macho, en donde dichas secuencias codificantes están ubicadas en una posición diferente de un locus ADAM6 de un ratón de tipo silvestre de modo que, en respuesta a la exposición a un antígeno, los linfocitos B del ratón expresan dominios variables de cadena pesada humanos expresados a partir de una secuencia humana de región variable de cadena pesada que incluye un segmento génico V^hque es idéntico a o una versión hipermutada de forma somática de, V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos; en donde dicho ratón carece de un gen ADAM6 endógeno funcional.

La invención proporciona además un ratón que comprende en su genoma una secuencia de ácido nucleico que comprende un único segmento génico V^hhumano, al menos un segmento génico D^hhumano y al menos un segmento génico J^hhumano, en donde el único segmento génico V^hhumano, el uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y el uno o más segmentos génicos J^hhumanos están unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos, en donde el ratón carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, y en donde el ratón comprende secuencias ectópicas de ADAM6 de ratón que codifican una proteína ADAM6a o un fragmento funcional de la misma y una proteína ADAM6b o un fragmento funcional de la misma.

La invención proporciona adicionalmente una célula o tejido procedente de un ratón de la invención, en donde la célula o tejido comprende

(a) una secuencia genómica humana no reordenada que comprende un único segmento génico V^hhumano, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y uno o más segmentos génicos J^hhumanos, en donde el único segmento génico V^hhumano, el uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y el uno o más segmentos génicos J^hhumanos están unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos; y

(b) una secuencia que codifica una proteína ADAM6a o un fragmento funcional de la misma y una secuencia que codifica una proteína ADAM6b o un fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma y la proteína ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma son funcionales en un ratón macho, en donde dichas secuencias codificantes están ubicadas en una posición diferente de un locus ADAM6 de un ratón de tipo silvestre.

La invención también proporciona un método para fabricar un anticuerpo humano que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina procedente de un único segmento génico VH humano, comprendiendo el método (a) inmunizar un ratón de la invención con un antígeno de interés;

(b) permitir que dicho ratón genere una respuesta inmunitaria con respecto al antígeno de interés; y,

(c) identificar o aislar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo generado por el ratón, en donde el anticuerpo se une al antígeno de interés.

La invención proporciona además un método para modificar un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de un ratón para proporcionar un ratón cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que incluye un único segmento V^hhumano, comprendiendo el método:

(a) realizar una primera modificación del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que incluye la inserción de un único segmento V^hhumano y da como resultado una reducción o eliminación de la actividad ADAM6 endógena de ratón en un ratón macho, en donde el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos; y,

(b) realizar una segunda modificación del ratón para restaurar la actividad de ADAM6 en el ratón, que comprende la expresión de secuencias que codifican una proteína ADAM6a de ratón o un fragmento funcional de la misma y una proteína ADAM6b de ratón o un fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma y la proteína ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma son funcionales en un ratón macho.

La invención proporciona adicionalmente un método para generar un anticuerpo específico contra un antígeno que comprende las etapas de:

(a) inmunizar un ratón de la invención con el antígeno;

(b) aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo específico contra el antígeno; y

(c) cultivar al menos una célula que produce un anticuerpo de la etapa (b) y obtener dicho anticuerpo.

La invención también proporciona el uso de un ratón de acuerdo con la invención, para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio humano variable de cadena pesada de inmunoglobulina.

Se describen loci de inmunoglobulina genéticamente modificados que comprenden un número restringido de segmentos génicos de región variable de cadena pesada diferentes (es decir, genes V, genes V^h, segmentos génicos V^ho segmentos génicos V), por ejemplo, no más de uno, dos o tres genes V diferentes; o no más de un miembro de la familia del segmento génico V presente, por ejemplo, en una única copia o en múltiples copias y/o que comprende uno o más polimorfismos, y en varios aspectos los loci carecen de una secuencia que codifique una proteína ADAM6 funcional endógena.

Se describen los loci que son capaces de reordenar y formar un gen que codifica un dominio variable de cadena pesada que procede de un repertorio de genes V de cadena pesada que está restringido, por ejemplo, que es un único segmento génico V^ho seleccionado de una pluralidad de variantes polimórficas del único segmento génico V^h, en donde, en varios aspectos, los loci carecen de un gen ADAM6 funcional endógeno o fragmento funcional del mismo.

Se describen loci de inmunoglobulina modificados que incluyen loci que carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional y que comprenden secuencias humanas de inmunoglobulina, por ejemplo, un segmento V humano unido operativamente a una secuencia constante de inmunoglobulina humana o no humana (o quimérica humana/no humana) (y en unión operativa con, por ejemplo, un segmento D y/o J). Se describen loci modificados que comprenden múltiples copias de un único segmento génico VH, incluyendo en donde una o más de las copias comprenden una variante polimórfica, y una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 o un fragmento de la misma que es funcional en el animal no humano. Se describen loci modificados que comprenden múltiples copias de un solo segmento V^h, unidos operativamente con uno o más segmentos D y uno o más segmentos J, unidos operativamente a una secuencia constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de ratón o de rata o humana. También se describen animales no humanos que comprenden dichos loci humanizados, en donde los animales no humanos tienen fertilidad de tipo silvestre.

Se describen animales no humanos que comprenden un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, un transgén o como inserción o reemplazo en un locus variable de cadena pesada de animal no humano endógeno) que comprende un único segmento V^hunido operativamente a un segmento génico D y/o J. En diversos aspectos, el único segmento génico V^hestá unido operativamente a uno o más segmentos génicos D y/o uno o más J en el locus génico endógeno variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano. En diversos aspectos, los animales no humanos comprenden además una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 u homólogo u ortólogo de la misma que es funcional en el animal macho no humano que comprende el locus de cadena pesada modificado. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos ectópica es contigua al segmento VH único, un segmento génico D o un segmento génico J. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos ectópica es contigua a una secuencia no inmunoglobulina en el genoma del animal no humano. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica está en el mismo cromosoma que el locus de cadena pesada modificado. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica está en un cromosoma diferente que el locus de cadena pesada modificado.

Se describen animales no humanos que se modifican en sus loci de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina para eliminar todos o sustancialmente todos (por ejemplo, todos los segmentos funcionales, o casi todos los segmentos funcionales) los segmentos VH endógenos de inmunoglobulina y que comprenden un segmento V^h1-69 humano (o un segmento V^h1-2 humano) unido operativamente a un segmento D y J o un segmento J en el locus endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano. También se describen animales no humanos que comprenden dichos loci y que carecen de un gen(es) ADAM6 endógeno(s).

Se describen métodos para hacer secuencias humanas de inmunoglobulina en animales no humanos. En diversos aspectos, las secuencias humanas de inmunoglobulina proceden de un repertorio de secuencias V de inmunoglobulina que consisten esencialmente en un único segmento V humano, por ejemplo, V^h1-69 o V^h1-2, y uno o más segmentos D y J o uno o más segmentos J. Se describen métodos para hacer secuencias humanas de inmunoglobulina en animales, tejidos y células no humanos, en donde las secuencias humanas de inmunoglobulina se unen a un patógeno.

En un aspecto, se describen construcciones de ácido nucleico, células, embriones, ratones y métodos para fabricar ratones que comprenden una modificación que da como resultado una proteína ADAM6 de ratón endógena no funcional o un gen ADAM6 (por ejemplo, un ratón con genes inactivados o una eliminación en un gen ADAM6 endógeno), en donde los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, los ratones comprenden una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 de roedor u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma; en un aspecto específico, la proteína ADAM6 de roedor es una proteína ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se describen construcciones de ácido nucleico, células, embriones, ratones y métodos para hacer ratones que comprenden una modificación de un locus de inmunoglobulina de ratón endógeno, en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina de ratón endógeno es un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación reduce o elimina la actividad ADAM6 de una célula o tejido de un ratón macho. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina de ratón endógeno es un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación mantiene o sostiene la actividad ADAM6 de una célula o tejido de un ratón macho.

En un aspecto, se describe un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado que comprende un repertorio de segmento V de cadena pesada que está restringido con respecto a la identidad del segmento V, y que comprende uno o más segmentos D y uno o más segmentos J, o uno o más segmentos J. En un aspecto, el segmento V de cadena pesada es un segmento humano. En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado carece de un gen ADAM6 endógeno. En un aspecto, el locus de cadena pesada modificado comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6. En un aspecto específico, la secuencia de nucleótidos es contigua al segmento génico V, D y/o J en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado.

En un aspecto, el locus modificado es un locus no humano. En un aspecto, el locus no humano se modifica con al menos una secuencia humana de inmunoglobulina. En un aspecto, el locus no humano se modifica con al menos una secuencia humana de inmunoglobulina y una secuencia que codifica una proteína ADAM6.

En un aspecto, la restricción es para un miembro de la familia del segmento V. En un aspecto, el un miembro de la familia del segmento V está presente en dos o más copias. En un aspecto, el un miembro de la familia del segmento V está presente como dos o más variantes (por ejemplo, dos o más formas polimórficas del miembro de la familia del segmento V). En un aspecto, el segmento V es un miembro de la familia del segmento V humano. En un aspecto, el un miembro de la familia del segmento V está presente en una serie de variantes como se observa en la población humana con respecto a esa variante. En un aspecto, el miembro de la familia del segmento V se selecciona de la Tabla 1. En un aspecto, el miembro de la familia del segmento V está presente en una serie de variantes como se muestra, para cada segmento V, en varios alelos desde 1 alelo hasta el número de alelos que se muestran en la columna derecha de la Tabla 1.

En un aspecto, se describen ratones que comprenden una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo; también se describen ratones que comprenden una secuencia de nucleótidos endógena que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo, y al menos una modificación genética de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos endógena que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo se ubica en una posición ectópica en comparación con un gen ADAM6 endógeno de un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se describen métodos para hacer ratones que comprenden una modificación de un locus de inmunoglobulina de ratón endógeno, en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se describen métodos para hacer ratones que comprenden una modificación genética de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la aplicación de los métodos da como resultado ratones machos que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado (o una eliminación del mismo), y los ratones machos son capaces de generar descendencia mediante apareamiento. En un aspecto, los ratones machos son capaces de producir esperma que puede transitar desde el útero de un ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, se describen métodos para hacer ratones que comprenden una modificación genética de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la aplicación de los métodos da como resultado ratones machos que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado (o una eliminación del mismo), y los ratones machos exhiben una reducción en la fertilidad, y los ratones comprenden una modificación genética que restaura en todo o en parte la reducción en la fertilidad. En diversos aspectos, la reducción de la fertilidad se caracteriza por la incapacidad del esperma de los ratones machos para migrar desde el útero de un ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón. En diversos aspectos, la reducción de la fertilidad se caracteriza por el esperma que exhibe un defecto de migración in vivo. En diversos aspectos, la modificación genética que restablece total o parcialmente la reducción de la fertilidad es una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, la modificación genética comprende reemplazar los loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos con un número restringido, por ejemplo, no más de uno, dos o tres segmentos génicos variables de cadena pesada (V^h) diferentes, uno o más segmentos génicos de diversidad de cadena pesada (D^h) y uno o más segmentos génicos de unión de cadena pesada (J^h) de otra especie (por ejemplo, una especie que no es de ratón). En un aspecto, la modificación genética comprende la inserción de un único segmento génico V^hde inmunoglobulina ortólogo, al menos un segmento génico D^hy al menos un segmento génico J^hen loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos. En un aspecto específico, la especie es humana. En un aspecto, la modificación genética comprende la eliminación de un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno en su totalidad o en parte, en donde la eliminación da como resultado una pérdida de la función ADAM6 endógena. En un aspecto específico, la pérdida de la función ADAM6 endógena se asocia con una reducción de la fertilidad en ratones machos. En un aspecto, la modificación genética comprende la inactivación de un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno en su totalidad o en parte, en donde la eliminación no da como resultado una pérdida de la función ADAM6 endógena. La inactivación puede incluir el reemplazo o la eliminación de uno o más segmentos génicos endógenos que dan como resultado un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno que es sustancialmente incapaz de reordenarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo que comprende segmentos génicos endógenos. La inactivación puede incluir otras modificaciones que hacen que el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno sea incapaz de reordenarse para codificar la cadena pesada de un anticuerpo, en donde la modificación no incluye el reemplazo o la eliminación de segmentos génicos endógenos. Las modificaciones ejemplares incluyen inversiones cromosómicas y/o translocaciones mediadas por técnicas moleculares, por ejemplo, utilizando la colocación precisa de sitios de recombinación específicos del sitio (por ejemplo, tecnología Cre-lox).

En un aspecto, la modificación genética comprende la inserción en el genoma del ratón un fragmento de ADN que contiene un número restringido, por ejemplo, no más de uno, dos o tres segmentos génicos variables de cadena pesada (V^h) diferentes, uno o más segmentos génicos de diversidad de cadena pesada (D^h) y uno o más segmentos génicos de unión de cadena pesada (J^h) de otra especie (por ejemplo, una especie que no es de ratón) unido operativamente a una o más secuencias de región constante (por ejemplo, un gen IgM y/o un gen IgG). En un aspecto, el fragmento de ADN es capaz de sufrir un reordenamiento para formar una secuencia que codifica una cadena pesada de un anticuerpo. En un aspecto, la modificación genética comprende la inserción de un único segmento génico V^hde inmunoglobulina ortólogo, al menos un segmento génico D^hy al menos un segmento génico J^hen el genoma del ratón. En un aspecto específico, la especie es humana. En un aspecto, la modificación genética comprende la eliminación de un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno en su totalidad o en parte para hacer que el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno no sea funcional, en donde la eliminación da como resultado, además, una pérdida de la función ADAM6 endógena. En un aspecto específico, la pérdida de la función ADAM6 endógena se asocia con una reducción de la fertilidad en ratones machos.

En un aspecto, se describen ratones que comprenden una modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de un alelo ADAM6 endógeno de manera que un ratón macho, que tiene la modificación, exhibe una fertilidad reducida (por ejemplo, una capacidad muy reducida de generar descendencia por apareamiento), o es esencialmente infértil, debido a la reducción o eliminación de la función ADAM6 endógena, en donde los ratones comprenden además una secuencia ectópica de ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma. En un aspecto, la modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de ratón es una modificación (por ejemplo, una inserción, una eliminación, un reemplazo, etc.) en un locus de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, la reducción o pérdida de la función ADAM6 comprende una incapacidad o incapacidad sustancial del ratón para producir esperma que pueda viajar desde el útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón. En un aspecto específico, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los espermatozoides producidos en un volumen eyaculado del ratón son incapaces de viajar a través de un oviducto in vivo después de la copulación y fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, la reducción o pérdida de la función ADAM6 comprende una incapacidad para formar o una incapacidad sustancial para formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 en una superficie de una célula de esperma del ratón. En un aspecto, la pérdida de la función ADAM6 comprende una incapacidad sustancial para fertilizar un óvulo de ratón mediante la copulación con un ratón hembra.

En un aspecto, se describe un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional y comprende una proteína (o una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína) que confiere la funcionalidad ADAM6 en el ratón. En un aspecto, el ratón es un ratón macho y la funcionalidad comprende una fertilidad mejorada en comparación con un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional.

En un aspecto, la proteína está codificada por una secuencia genómica ubicada dentro de un locus de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En un aspecto específico, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En otro aspecto específico, el locus de cadena pesada comprende un único segmento génico V^hhumano, al menos un D^hhumano y al menos un J^hhumano. En otro aspecto específico, el locus de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos. En un aspecto, la proteína ectópica está codificada por una secuencia genómica ubicada dentro de un locus de no inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En un aspecto, el locus de no inmunoglobulina es un locus transcripcionalmente activo. En un aspecto específico, el locus transcripcionalmente activo es el locus ROSA26. En un aspecto específico, el locus transcripcionalmente activo está asociado con la expresión específica de tejido. En un aspecto, la expresión específica de tejido está presente en los tejidos reproductivos. En un aspecto, la proteína está codificada por una secuencia genómica insertada de forma aleatoria en la línea germinal del ratón. En un aspecto, el ratón comprende una cadena ligera humana o quimérica humana/de ratón o quimérica humana/de rata (por ejemplo, variable humana, constante de ratón o de rata) y una cadena pesada quimérica variable humana/constante de ratón o rata. En un aspecto específico, el ratón comprende un transgen que comprende un gen de cadena ligera quimérico variable humana/constante de rata o ratón constante unido operativamente a un promotor transcripcionalmente activo, por ejemplo, un promotor ROSA26. En un aspecto específico adicional, el transgén de cadena ligera quimérico humano/de ratón o rata comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica se ubica dentro de un locus de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En un aspecto específico, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En un aspecto, el locus de cadena pesada comprende un único segmento génico V^hhumano, al menos un D^hhumano y al menos un J^hhumano. En un aspecto específico, el locus de cadena pesada comprende un único segmento génico V^hhumano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica se ubica dentro de un locus de no inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En un aspecto, el locus de no inmunoglobulina es un locus transcripcionalmente activo. En un aspecto específico, el locus transcripcionalmente activo es el locus ROSA26. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica se coloca aleatoriamente insertada en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que complementa la pérdida de la función ADAM6 del ratón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica confiere al ratón la capacidad de producir descendencia que es comparable a un ratón de tipo silvestre correspondiente que contiene un gen ADAM6 endógeno funcional. En un aspecto, la secuencia confiere al ratón la capacidad de formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 en la superficie de la célula de esperma del ratón. En un aspecto, la secuencia confiere al ratón la capacidad de viajar desde el útero de un ratón a través de un oviducto de ratón a un óvulo de ratón para fertilizar el óvulo.

En un aspecto, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % del número de camadas de un ratón de tipo silvestre de la misma edad y cepa en un periodo de tiempo de seis meses.

En un aspecto, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce al menos aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, o aproximadamente 10 veces o más progenie cuando se cría durante un período de tiempo de seis meses que un ratón de la misma edad y la misma cepa o similar que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica que se cría sustancialmente durante el mismo período de tiempo y sustancialmente bajo las mismas condiciones.

En un aspecto, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce un promedio de al menos aproximadamente 2 veces, 3 o 4 veces mayor número de crías por camada en un período de reproducción de 4 o 6 meses que un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica, y que se cría durante el mismo período de tiempo. En un aspecto, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica es un ratón macho, y el ratón macho produce esperma que cuando se recupera de los oviductos aproximadamente a las 5-6 horas después de la copulación refleja una migración en el oviducto que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, 100 veces, 110 veces o 120 veces o más que la de un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica. En un aspecto, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica cuando copula con un ratón hembra genera esperma que es capaz de atravesar el útero y entrar y atravesar el oviducto dentro de aproximadamente 6 horas con una eficacia que es aproximadamente igual a la del esperma de un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces o aproximadamente 4 veces o más camadas en un período de tiempo comparable a un ratón que carece del gen ADAM6 funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende en su línea germinal una secuencia de ácido nucleico no de ratón que codifica una proteína de inmunoglobulina, en donde la secuencia de inmunoglobulina no de ratón comprende una inserción de un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina no de ratón comprende una secuencia humana de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia comprende una secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia comprende una secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia comprende un único segmento génico V^h, uno o más segmentos génicos D^hy uno o más segmentos génicos J^h; en un aspecto, la secuencia comprende uno o más segmentos génicos V^ly uno o más segmentos génicos J^l. En un aspecto, el único segmento génico V^h, uno o más D^h, y uno o más J^h, o uno o más segmentos génicos V^ly J^l, no se reordenan. En un aspecto, el único segmento génico V^h, uno o más D^h, y uno o más J^h, o uno o más segmentos génicos V^ly J^l, se reordenan. En un aspecto, después de la reordenación del único segmento génico V^h, uno o más D^h, y uno o más J^h, o uno o más segmentos génicos V^ly J^l, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, después de la reordenación, el ratón comprende en su genoma al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, después de la reordenación, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, el ratón comprende el gen ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo en un linfocito B. En un aspecto, el ratón comprende el gen ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo en un linfocito no B.

En un aspecto, se describen ratones que expresan una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o fragmento funcional de la misma a partir de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde los ratones comprenden una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico VH humano polimórfico. En un aspecto, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico V^h1-69 humano. En un aspecto, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico V^h1-2 humano.

En un aspecto, los ratones machos comprenden un único alelo ADAM6 endógeno no modificado u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un locus ADAM6 endógeno.

En un aspecto, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 de ratón ectópica u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma que codifica una proteína que confiere la función ADAM6.

En un aspecto, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma en una ubicación en el genoma del ratón que se aproxima a la ubicación del alelo ADAM6 endógeno del ratón, por ejemplo, en 3' de una secuencia del segmento génico V y en 5' de un segmento génico D inicial. En un aspecto específico, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de los mismos en 3' de un segmento génico V^hhumano y en 5' de un segmento génico D^hhumano. En otro aspecto específico, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma en 5' de un segmento génico V^hhumano. En otro aspecto específico, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma en 5' de un locus quimérico de cadena pesada que comprende un único segmento génico V^hhumano, uno o más segmentos génicos D^hy uno o más segmentos génico J^h. En un aspecto, el locus quimérico de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-69 humano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos. En un aspecto, el locus quimérico de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-2 humano, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos.

En un aspecto, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma flanqueada cadena arriba, cadena abajo o cadena arriba y cadena abajo (con respecto a la dirección de transcripción de la secuencia ADAM6) de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento génico variable de inmunoglobulina o un segmento génico de diversidad de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el segmento génico variable de inmunoglobulina es un segmento génico humano. En un aspecto, el segmento génico variable de inmunoglobulina es un segmento génico humano, y la secuencia que codifica el ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo funcional en un ratón está entre segmentos génicos V^hhumanos; en un aspecto, el ratón comprende un segmento génico V^hhumano, y la secuencia está en una posición 5' del segmento génico V^h; en un aspecto, la secuencia está en una posición 3' del segmento génico V^h; en un aspecto, la secuencia está en una posición entre el segmento génico V^hy el primer segmento génico D^h. En un aspecto específico, el segmento génico D^hes el primer segmento génico D^h. En un aspecto, el ratón comprende dos segmentos génicos V^h, y la secuencia está en una posición entre los dos segmentos génicos V^h; en un aspecto, la secuencia está en una posición entre un segmento génico V^hy un segmento génico D^h. En un aspecto específico, el segmento génico D^hes el primer segmento génico D^h.

En un aspecto, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma que se ubica en una posición en un locus endógeno de inmunoglobulina que es igual o sustancialmente igual que en un ratón macho de tipo silvestre. En un aspecto específico, el locus endógeno es incapaz de codificar la cadena pesada de un anticuerpo. En un aspecto específico, el locus endógeno se coloca en una ubicación en el genoma del ratón macho que lo hace incapaz de codificar la cadena pesada de un anticuerpo. En diversos aspectos, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 ubicada en el mismo cromosoma que los segmentos génicos humanos de inmunoglobulina y la secuencia ADAM6 codifica una proteína ADAM6 funcional.

En un aspecto, se describe un ratón macho que comprende un gen ADAM6 endógeno no funcional, o una eliminación de un gen ADAM6 endógeno, en su línea germinal; en donde las células de esperma del ratón son capaces de transitar un oviducto de un ratón hembra y fertilizar un óvulo. En un aspecto, los ratones comprenden una copia extracromosómica de un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, los ratones comprenden un gen ADAM6 ectópico de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se describen ratones que comprenden una modificación genética que reduce la función ADAM6 endógena del ratón, en donde el ratón comprende al menos alguna funcionalidad ADAM6 proporcionada por un alelo endógeno no modificado que es funcional en todo o en parte (por ejemplo, un heterocigoto), o por expresión de una secuencia ectópica que codifica un ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, los ratones comprenden la función ADAM6 suficiente para conferir a los ratones machos la capacidad de generar descendencia por apareamiento, en comparación con los ratones machos que carecen de un ADAM6 funcional. En un aspecto, la función ADAM6 se confiere por la presencia de una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica un ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, la función ADAM6 es conferida por un gen ADAM6 endógeno presente en un locus endógeno de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno de inmunoglobulina es incapaz de codificar la cadena pesada de un anticuerpo. Los homólogos u ortólogos de ADAM6 o fragmentos de los mismos que son funcionales en un ratón macho incluyen aquellos que restauran, total o parcialmente, la pérdida de capacidad de generar descendencia observada en un ratón macho que carece de suficiente actividad ADAM6 endógena de ratón, por ejemplo, la pérdida de capacidad observada en un ratón con genes inactivados ADAM6. En este sentido, los ratones con genes inactivados ADAM6 incluyen ratones que comprenden un locus endógeno o fragmento del mismo, pero que no es funcional, es decir, que no expresa ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) en absoluto, o que expresa ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) en un nivel que es insuficiente para soportar una capacidad esencialmente normal de generar descendencia de un ratón macho de tipo silvestre. La pérdida de función puede deberse, por ejemplo, a una modificación en un gen estructural del locus (es decir, en una región codificante ADAM6a o ADAM6b) o en una región reguladora del locus (por ejemplo, en una secuencia en 5' del gen ADAM6a o en 3' de la región codificante ADAM6a o ADAM6b, en donde la secuencia controla, total o parcialmente, la transcripción de un gen ADAM6, la expresión de un ARN ADAM6 o la expresión de una proteína ADAM6). En varios aspectos, los ortólogos u homólogos o fragmentos de los mismos que son funcionales en un ratón macho son aquellos que permiten que un espermatozoide de un ratón macho (o la mayoría de las células de esperma en la eyaculación de un ratón macho) transiten un oviducto de ratón y fertilicen un óvulo de ratón.

En un aspecto, los ratones machos que expresan la región variable de inmunoglobulina humana o fragmento funcional de la misma comprenden suficiente actividad ADAM6 para conferir a los ratones machos la capacidad de generar descendencia al aparearse con ratones hembras y, en un aspecto, los ratones machos exhiben una capacidad para generar descendencia cuando se aparean con ratones hembras que es, en un aspecto, al menos un 25 %, en un aspecto, al menos un 30 %, en un aspecto, al menos un 40 %, en un aspecto, al menos un 50 %, en un aspecto, al menos un 60 %, en un aspecto, al menos un 70 %, en un aspecto, al menos un 80 %, en un aspecto, al menos un 90 % y, en un aspecto, casi igual, a la de los ratones con uno o dos alelos endógenos no modificados ADAM6.

En un aspecto, los ratones machos expresan suficiente ADAM6 (o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) para permitir que una célula de esperma de los ratones machos atraviese un oviducto de ratón hembra y fertilice un óvulo de ratón.

En un aspecto, la funcionalidad ADAM6 se confiere por una secuencia de ácido nucleico que es contigua a una secuencia cromosómica de ratón (por ejemplo, el ácido nucleico se integra aleatoriamente en un cromosoma de ratón; o se coloca en una ubicación específica, por ejemplo, dirigiéndose el ácido nucleico a una ubicación específica, por ejemplo, mediante inserción mediada por recombinasa específica del sitio (por ejemplo, mediada por Cre) o recombinación homóloga). En un aspecto, la secuencia ADAM6 está presente en un ácido nucleico que es distinto de un cromosoma del ratón (por ejemplo, la secuencia ADAM6 está presente en un episoma, es decir, extracromosómicamente, por ejemplo, en una construcción de expresión, un vector, un YAC, un transcromosoma, etc.).

En un aspecto, se describen ratones y células modificados genéticamente que comprenden una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde los ratones expresan al menos una porción de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, al menos una porción de una secuencia humana, en donde los ratones comprenden una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, la modificación reduce o elimina la actividad ADAM6 del ratón. En un aspecto, el ratón se modifica de modo que ambos alelos que codifican la actividad ADAM6 están ausentes o expresan un ADAM6 que no funciona sustancialmente para soportar el apareamiento normal en un ratón macho. En un aspecto, el ratón comprende además una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, la modificación mantiene la actividad ADAM6 del ratón y hace que un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina sea incapaz de codificar una cadena pesada de un anticuerpo. En un aspecto específico, la modificación incluye inversiones y/o translocaciones cromosómicas que hacen que el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina sea incapaz de codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En un aspecto, se describen ratones y células modificados genéticamente que comprenden una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación reduce o elimina la actividad ADAM6 expresada a partir de una secuencia ADAM6 del locus, y en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma. En diversos aspectos, la proteína ADAM6 o fragmento de la misma está codificada por una secuencia ADAM6 ectópica. En diversos aspectos, la proteína ADAM6 o fragmento de la misma está codificada por un alelo ADAM6 endógeno. En diversos aspectos, el ratón comprende un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una primera modificación que reduce o elimina la expresión de un ADAM6 funcional del primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón comprende un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una segunda modificación que no reduce sustancialmente o no elimina la expresión de un ADAM6 funcional del segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, la segunda modificación se ubica en 3' (con respecto a la direccionalidad transcripcional del segmento génico V del ratón) de un segmento génico final V del ratón y se ubica en 5' (con respecto a la direccionalidad transcripcional de la secuencia constante) de un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (o quimera humano/ratón) o fragmento del mismo (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un humano y/o ratón: C^h1 y/o bisagra y/o C^h2 y/o C^h3).

En un aspecto, la modificación es en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus que codifica un primer alelo ADAM6, y la función ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 endógeno en un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus que codifica un ADAM6 funcional, en donde el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una modificación de un segmento génico V, D y/o J. En un aspecto específico, la al menos una modificación del segmento génico V, D y/o J es una eliminación, un reemplazo con un único V^hhumano, uno o más D^h, y/o uno o más segmentos génicos J^h, un reemplazo con un segmento génico V^h(o V^hh), D^hy/o J^hde camélido, un reemplazo con un segmento génico V^h(o VHH), DH y/o JH de camélido, un reemplazo de una secuencia de cadena pesada con una secuencia de cadena ligera y una combinación de las mismas. En un aspecto, la al menos una modificación es la eliminación de uno o más segmentos génicos V^h, D^hy/o J^hy un reemplazo con uno o más segmentos génicos V^ly/o J^l(por ejemplo, un segmento génico V^ly/o J^lhumano) en el locus de cadena pesada.

En un aspecto, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 ectópico en un locus no de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En un aspecto específico, el locus no de inmunoglobulina es el locus ROSA26. En un aspecto específico, el locus no de inmunoglobulina es transcripcionalmente activo en el tejido reproductivo.

En un aspecto, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 ectópico en el primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 ectópico en el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende un heterocigótico u homocigoto con genes inactivados de ADAM6. En un aspecto, el ratón comprende además una secuencia de inmunoglobulina modificada que es una secuencia humana de inmunoglobulina o humanizada, o una secuencia humana de inmunoglobulina o de ratón camelizada o camélida. En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina modificada está presente en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina modificada comprende una secuencia génica variable de cadena pesada humana en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, la secuencia génica variable de cadena pesada humana reemplaza una secuencia génica variable de cadena pesada de ratón endógena en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón incapaz de expresar un ADAM6 endógeno de ratón funcional a partir de un locus endógeno ADAM6 de ratón. En un aspecto, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6 o fragmento funcional del mismo, que es funcional en el ratón. En un aspecto específico, la secuencia de ácido nucleico ectópica codifica una proteína que rescata una pérdida en la capacidad de generar descendencia exhibida por un ratón macho que es homocigoto para un ADAM6 inactivado. En un aspecto específico, la secuencia de ácido nucleico ectópica codifica una proteína ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que carece de un locus ADAM6 endógeno funcional y que comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que confiere la función ADAM6 de ratón. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia endógena ADAM6 de ratón o un fragmento funcional de la misma. En un aspecto, la secuencia endógena ADAM6 de ratón comprende una secuencia codificante de ADAM6a y ADAM6b ubicada en un ratón de tipo silvestre entre el segmento génico V de cadena pesada (V^h) de inmunoglobulina de ratón en 3' y el segmento génico D de cadena pesada (D^h) de inmunoglobulina de ratón más en 5'.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma y/o una secuencia que codifica ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma, en donde la ADAM6a y/o ADAM6b o fragmento(s) funcional(es) de la misma está operativamente unida a un promotor. En un aspecto, el promotor es un promotor humano. En un aspecto, el promotor es el promotor ADAM6 de ratón. En un aspecto específico, el promotor ADAM6 comprende una secuencia ubicada entre el primer codón del primer gen ADAM6 más cercano al segmento génico D^hde ratón más en 5' y la secuencia señal de recombinación del segmento génico D^hmás en 5', en donde 5' se indica con respecto a la dirección de transcripción de los genes de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el promotor es un promotor vírico. En un aspecto específico, el promotor vírico es un promotor de citomegalovirus (CMV). En un aspecto, el promotor es un promotor de ubiquitina.

En un aspecto, el promotor es un promotor inducible. En un aspecto, el promotor inducible regula la expresión en tejidos no reproductivos. En un aspecto, el promotor inducible regula la expresión en tejidos reproductivos. En un aspecto específico, la expresión de las secuencias ADAM6a y/o ADAM6b de ratón o fragmentos funcionales de las mismas está regulada evolutivamente por el promotor inducible en los tejidos reproductivos.

En un aspecto, el ADAM6a y/o ADAM6b de ratón se seleccionan de ADAM6a de SEQ ID NO: 1 y/o ADAM6b de secuencia SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, el promotor ADAM6 de ratón es un promotor de SEQ ID NO: 3. En un aspecto específico, el promotor ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 directamente cadena arriba (con respecto a la dirección de transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 3 cadena arriba de la región codificante ADAM6. En otro aspecto específico, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a hasta aproximadamente 0,5 kb, 1kb, 2 kb o 3 kb o más cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a.

En un aspecto, el promotor ADAM6 de ratón es un promotor de SEQ ID NO: 73. En un aspecto específico, el promotor ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 73 directamente cadena arriba (con respecto a la dirección de transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 73 cadena arriba de la región codificante ADAM6.

En otro aspecto específico, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a hasta aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 2 kb o 3 kb o más cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a.

En un aspecto, el promotor ADAM6 de ratón es un promotor de SEQ ID NO: 77. En un aspecto específico, el promotor ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 77 directamente cadena arriba (con respecto a la dirección de transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 77 cadena arriba de la región codificante ADAM6. En otro aspecto específico, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a hasta aproximadamente 0,5 kb, 1kb, 2 kb o 3 kb o más cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma que cuando se coloca en un ratón que es infértil o que tiene baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o restaura la fertilidad a una fertilidad de tipo silvestre. En un aspecto, la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma confiere a un ratón macho la capacidad de producir una célula de esperma que es capaz de atravesar un oviducto de ratón hembra para fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 73 o un fragmento de la misma que cuando se coloca en un ratón que es infértil o que tiene baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o restaura la fertilidad a una fertilidad de tipo silvestre. En un aspecto, la SEQ ID NO: 73 o un fragmento de la misma confiere a un ratón macho la capacidad de producir una célula de esperma que es capaz de atravesar un oviducto de ratón hembra para fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 77 o un fragmento de la misma que cuando se coloca en un ratón que es infértil o que tiene baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o restaura la fertilidad a una fertilidad de tipo silvestre. En un aspecto, la SEQ ID NO: 77 o un fragmento de la misma confiere a un ratón macho la capacidad de producir una célula de esperma que es capaz de atravesar un oviducto de ratón hembra para fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una eliminación de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica una proteína ADAM6, un reemplazo de un segmento génico V^hendógeno de ratón con un segmento génico VH humano y una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, el ratón comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una eliminación de una secuencia de nucleótidos endógena de locus de inmunoglobulina que comprende un gen ADAM6 endógeno, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina, y en donde la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro o directamente adyacente a la secuencia de nucleótidos que codifica el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina.

En un aspecto, el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos con una secuencia de nucleótidos que codifica un único segmento génico V^hhumano, y la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro o directamente adyacente a, la secuencia de nucleótidos que codifica el único segmento génico V^hhumano. En un aspecto, el ratón comprende además un reemplazo de uno o más segmentos génicos D^hendógenos con uno o más segmentos génicos D^hhumanos en el locus génico D^hendógeno. En un aspecto, el ratón comprende además un reemplazo de uno o más segmentos génicos J^hendógenos con uno o más segmentos génicos J^hhumanos en el locus génico J^hendógeno. En un aspecto, el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^h, D^hy J^hendógenos y un reemplazo en los loci génicos V^h, D^hy J^hendógenos con un único segmento génico V^hhumano, uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y uno o más segmentos génicos J^hhumanos, en donde el ratón comprende una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En un aspecto específico, la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca cadena arriba o en 5' del único segmento génico V^hhumano. En otro aspecto específico, la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca cadena abajo o en 3' del único segmento génico V^hhumano. En otro aspecto específico, la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca entre el único segmento génico VH humano y el primer segmento génico DH humano presente. En otro aspecto específico, el ratón comprende una eliminación de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón, y un reemplazo con un único segmento génico V^hhumano, y la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca cadena abajo del segmento génico V^h1-69 humano y cadena arriba del segmento génico D^h1-1 humano. En otro aspecto específico, el ratón comprende una eliminación de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón, y un reemplazo con un único segmento génico V^hhumano, y la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca cadena abajo del segmento génico V^h1-2 humano y cadena arriba del segmento génico DH1-1 humano.

En un aspecto específico, el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hendógenos con una secuencia de nucleótidos que codifica un único segmento génico V^h, y la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro o directamente adyacente a, la secuencia de nucleótidos que codifica el único segmento génico V^hhumano.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está presente en un transgen en el genoma del ratón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está presente extracromosómicamente en el ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el ratón expresa un linfocito B que comprende una secuencia de inmunoglobulina reordenada unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada, y el linfocito B comprende en su genoma (por ejemplo, en un cromosoma de linfocitos B) un gen que codifica una ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina reordenada unida operativamente a la secuencia génica de la región constante de cadena pesada comprende una secuencia V, D y/o J de cadena pesada humana; una secuencia V, D y/o J de cadena pesada de ratón; una secuencia V y/o J de cadena ligera humana o de ratón. En un aspecto, la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de cadena pesada humana o de ratón seleccionada del grupo que consiste en una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina funcionalmente silenciado, en donde la función ADAM6 se mantiene en el ratón, y además comprende una inserción de uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina, en donde el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina incluyen un único segmento génico VH humano, uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina incluyen un segmento génico V^h1-69 humano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos JH humanos. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina incluyen un segmento génico V^h1-2 humano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos.

En un aspecto, se describe un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende un gen de cadena ligera de inmunoglobulina funcionalmente silenciado, y además comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos endógenos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con un único segmento génico humano de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el ratón carece de un locus ADAM6 endógeno funcional, y en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, se describe un ratón que carece de un locus o secuencia ADAM6 endógena de ratón funcional y que comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica un locus ADAM6 de ratón o fragmento funcional de un locus o secuencia ADAM6 de ratón, en donde el ratón es capaz de aparearse con un ratón del sexo opuesto para producir una progenie que comprende el locus o secuencia ADAM6 ectópica. En un aspecto, el ratón es macho. En un aspecto, el ratón es hembra.

En un aspecto, se describe un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende un segmento génico humano de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina en un locus génico endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, el ratón carece de una secuencia ADAM6 funcional endógena en el locus génico endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica que expresa la proteína ADAM6 de ratón es extracromosómica.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica que expresa la proteína ADAM6 de ratón está integrada en uno o más loci en un genoma del ratón. En un aspecto específico, uno o más loci incluyen un locus de inmunoglobulina. En un aspecto, se describe un ratón que expresa una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón modificado, en donde la cadena pesada procede de un segmento génico V humano, un segmento génico D y un segmento génico J, en donde el ratón comprende una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, el ratón comprende un único segmento génico V humano, una pluralidad de segmentos génicos D y una pluralidad de segmentos génicos J. En un aspecto, los segmentos génicos D son segmentos génicos D humanos. En un aspecto, los segmentos génicos J son segmentos génicos J humanos. En un aspecto, el ratón comprende además una secuencia de región constante de cadena pesada humanizada, en donde la humanización comprende un reemplazo de una secuencia seleccionada de una C^h1, bisagra, C^h2, C^h3, y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, la cadena pesada procede del segmento génico V humano, un segmento génico D humano, un segmento génico J humano, una secuencia CH1 humana, una secuencia bisagra humana o de ratón, una secuencia C^h2 de ratón y una secuencia C^h3 de ratón. En otro aspecto específico, el ratón comprende además una secuencia de región constante de cadena ligera humana.

En un aspecto, el ratón comprende un gen ADAM6 que está flanqueado en 5' y 3' por segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, los segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina son incapaces de codificar una cadena pesada de un anticuerpo. En un aspecto específico, el gen ADAM6 del ratón está en una posición que es la misma que en un ratón de tipo silvestre y los loci génicos endógenos variables de cadena pesada de inmunoglobulina del ratón son incapaces de reordenarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En un aspecto, el segmento génico V está flanqueado en 5' (con respecto a la dirección transcripcional del segmento génico V) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, el segmento génico V está flanqueado en 3' (con respecto a la dirección transcripcional del segmento génico V) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, el segmento génico D está flanqueado en 5' (con respecto a la dirección transcripcional del segmento génico D) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, el segmento génico J está flanqueado en 5' (con respecto a la dirección transcripcional del segmento génico J) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótidos ubicada en 5' del segmento génico D más en 5' y en 3' del único segmento génico V (con respecto a la dirección de transcripción del segmento génico V) del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón modificado.

En un aspecto, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótidos ubicada en 5' del segmento génico J más en 5' y en 3' del segmento génico J más en 3' (con respecto a la dirección de transcripción del segmento génico D) del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón modificado.

En un aspecto, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótidos ubicada en 5' del único segmento génico V humano (con respecto a la dirección de transcripción del segmento génico V) del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón modificado.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia seleccionada de una secuencia ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma, una secuencia ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos posicionada cadena arriba (en 5') o cadena abajo (en 3') del único segmento génico V humano se coloca en orientación de transcripción opuesta con respecto al segmento génico V humano. En un aspecto específico, la secuencia de nucleótidos codifica, de 5' a 3' con respecto a la dirección de transcripción de los genes ADAM6, y la secuencia ADAM6a seguida de una secuencia ADAM6b.

En un aspecto, el ratón comprende un único segmento génico V^hhumano yuxtapuesto o contiguo con una secuencia ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma.

En un aspecto, el ratón comprende un segmento génico V^h1-69 humano yuxtapuesto o contiguo con una secuencia ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma.

En un aspecto, el ratón comprende un segmento génico V^h1-2 humano yuxtapuesto o contiguo con una secuencia ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma.

En un aspecto, el ratón comprende un único segmento génico V^hhumano, y la secuencia ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma está yuxtapuesta o contigua con segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde los segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina son incapaces de reordenarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En un aspecto, la secuencia que codifica la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón es una secuencia ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en una célula portadora de ADN de linaje de linfocitos B no reordenados, pero no comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en un linfocito B que comprende loci de inmunoglobulina reordenados, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) ocurre en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la que aparece un gen ADAM6 de ratón en un ratón de tipo silvestre. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en todas o sustancialmente todas las células portadoras de ADN que no son de linaje de linfocitos B reordenados; en un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está presente en las células de la línea germinal de ratón, pero no en un cromosoma de un linfocito B reordenado.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en todas o sustancialmente todas las células portadoras de ADN, incluyendo linfocitos B que comprenden loci de inmunoglobulina reordenados, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) ocurre en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la que aparece un gen ADAM6 de ratón en un ratón de tipo silvestre. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está en un ácido nucleico que es contiguo al locus de inmunoglobulina reordenado. En un aspecto, el ácido nucleico, que es contiguo al locus reordenado de inmunoglobulina, está un cromosoma. En un aspecto, el cromosoma es un cromosoma que se encuentra en un ratón de tipo silvestre y el cromosoma comprende una modificación de un locus de inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende un linfocito B que comprende en su genoma una secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma. En un aspecto, la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el locus de cadena pesada comprende segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina que son incapaces de reordenarse para codificar la cadena pesada de un anticuerpo. En un aspecto, la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma está en un locus que no es de un locus de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia ADAM6 está en un transgen conducido por un promotor heterólogo. En un aspecto específico, el promotor heterólogo es un promotor no de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el linfocito B expresa una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, un 90 % o más de los linfocitos B del ratón comprenden un gen que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo de la misma o un homólogo de la misma o un fragmento de la misma que es funcional en el ratón. En un aspecto específico, el ratón es un ratón macho.

En un aspecto, el genoma del linfocito B comprende un primer alelo y un segundo alelo que comprende la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma. En un aspecto, el genoma del linfocito B comprende un primer alelo pero no un segundo alelo que comprende la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación mantiene uno o más alelos ADAM6 endógenos.

En un aspecto, la modificación hace que el ratón sea incapaz de expresar una cadena pesada funcional que comprende segmentos génicos endógenos de cadena pesada reordenados de al menos un alelo de cadena pesada y mantiene un alelo ADAM6 endógeno ubicado dentro del al menos un alelo endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional que comprende segmentos génicos endógenos de cadena pesada reordenados de al menos uno de los alelos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, y los ratones expresan una proteína ADAM6 de un alelo ADAM6 endógeno. En un aspecto específico, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional que comprende segmentos génicos endógenos de cadena pesada reordenados de dos alelos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, y los ratones expresan una proteína ADAM6 de uno o más alelos ADAM6 endógenos.

En un aspecto, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional de cada alelo endógeno de cadena pesada, y los ratones comprenden un alelo ADAM6 funcional ubicado dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 o más Mpb cadena arriba (con respecto a la dirección de transcripción del locus de cadena pesada de ratón) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto específico, el alelo ADAM6 funcional está en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, en una región V-D intergénica, entre dos segmentos génicos V, entre un segmento génico V y uno D, entre un segmento génico D y uno J, etc.). En un aspecto específico, el alelo ADAM6 funcional se ubica dentro de una secuencia intergénica de 90 a 100 kb entre el segmento génico V final de ratón y el primer segmento génico D de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos ADAM6 endógenos. En un aspecto, la modificación hace que el ratón sea incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional de al menos uno de los uno o más alelos ADAM6 endógenos. En un aspecto específico, el ratón es incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional de cada uno de los alelos ADAM6 endógenos.

En un aspecto, los ratones son incapaces de expresar una proteína ADAM6 funcional de cada alelo ADAM6 endógeno, y los ratones comprenden una secuencia ADAM6 ectópica.

En un aspecto, los ratones son incapaces de expresar una proteína ADAM6 funcional de cada alelo ADAM6 endógeno, y los ratones comprenden una secuencia ADAM6 ectópica ubicada dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 o más kb cadena arriba (con respecto a la dirección de transcripción del locus de cadena pesada de ratón) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto específico, la secuencia ADAM6 ectópica está en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, en una región V-D intergénica, entre dos segmentos génicos V, entre un segmento génico V y uno D, entre un segmento génico D y uno J, etc.). En un aspecto específico, la secuencia ADAM6 ectópica se ubica dentro de una secuencia intergénica de 90 a 100 kb entre el segmento génico V final de ratón y el primer segmento génico D de ratón. En otro aspecto específico, se elimina la secuencia V-D intergénica endógena de 90 a 100 kb, y la secuencia ADAM6 ectópica se coloca entre un único segmento génico V humano y un primer segmento génico D humano. En otro aspecto específico, se elimina la secuencia V-D intergénica endógena de 90 a 100 kb, y la secuencia ADAM6 ectópica se coloca en 5' o cadena arriba del único segmento génico V humano. En un aspecto, se describe un ratón macho infértil, en donde el ratón comprende una eliminación de dos o más alelos ADAM6 endógenos. En un aspecto, se describe un ratón hembra que es portador de un rasgo de infertilidad masculina, en donde el ratón hembra comprende en su línea germinal un alelo ADAM6 no funcional o genes inactivados de un alelo ADAM6 endógeno.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende un segmento génico endógeno V, D y/o J de cadena pesada de inmunoglobulina que es incapaz de reordenarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo, en donde la mayoría de los linfocitos B del ratón comprenden un gen ADAM6 funcional.

En un aspecto, el ratón comprende segmentos génicos endógenos intactos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina que son incapaces de reordenarse para codificar una cadena pesada funcional de un anticuerpo. En un aspecto, el ratón comprende al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J, y una combinación de los mismos; en donde el al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J son incapaces de reordenarse para codificar una región variable de cadena pesada de un anticuerpo. En un aspecto específico, el ratón comprende un gen ADAM6 funcional ubicado dentro de los segmentos génicos endógenos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina intacta. En un aspecto, el ratón comprende un locus endógeno de cadena pesada que incluye un locus ADAM6 endógeno, en donde el locus endógeno de cadena pesada comprende 89 segmentos génicos V, 13 segmentos génicos D y cuatro segmentos génicos J, en donde los segmentos génicos endógenos de cadena pesada son incapaces de reordenarse para codificar una región variable de cadena pesada de un anticuerpo y el locus ADAM6 codifica una proteína ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que carece de un segmento génico V, D y J endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la mayoría de los linfocitos B del ratón comprenden una secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, el ratón carece de segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionados de dos o más segmentos génicos V, dos o más segmentos génicos D, dos o más segmentos génicos J y una combinación de los mismos. En un aspecto, el ratón carece de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionados de al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el ratón carece de un fragmento de ADN genómico del cromosoma 12 que comprende aproximadamente tres megabases del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el ratón carece de todos los segmentos génicos endógenos V, D y J de cadena pesada funcionales. En un aspecto específico, el ratón carece de 89 segmentos génicos V^h, 13 segmentos génicos D^hy cuatro segmentos génicos J^h. En un aspecto, se describe un ratón, en donde el ratón tiene un genoma en la línea germinal que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación del locus de cadena pesada de inmunoglobulina comprende el reemplazo de una o más secuencias de región variable de inmunoglobulina de ratón con una secuencia de región variable de inmunoglobulina no de ratón, y en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En un aspecto preferido, las secuencias D^hy J^hy al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias VH del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina se reemplazan por secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina no de ratón. En otro aspecto preferido, las secuencias D^h, J^hy todas las V^hdel locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina se reemplazan por un único segmento génico V de inmunoglobulina no de ratón, uno o más segmentos génicos D y una o más secuencias del segmento génico J. Las secuencias de inmunoglobulina no de ratón pueden no reordenarse. En un aspecto preferido, las secuencias de inmunoglobulina no de ratón comprenden regiones DH y JH no reordenadas completas y una única secuencia VH no reordenada de las especies no de ratón. En otro aspecto preferido, las secuencias de inmunoglobulina no de ratón son capaces de formar una región variable completa, es decir, una región variable reordenada que contiene segmentos V^h, D^hy J^hunidos para formar una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada, de especies no de ratón. Las especies no de ratón pueden ser Homo sapiens y las secuencias de inmunoglobulina no de ratón pueden ser secuencias humanas.

En un aspecto, se describe un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un único segmento V humano funcional. En un aspecto, el único segmento V humano funcional se selecciona de un segmento V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-45, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-30-3, V^h3-30-5, V^h3-33, V^h3-35, V^h3-38, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-49, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-66, V^h3-72, V^h3-73, V^h3-74, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-1, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5-51, V^h6-1, V^h7-4-1, y V^h7-81. En un aspecto, el único segmento V humano funcional es un segmento V^h1-69; en un aspecto específico, el único segmento V humano funcional está presente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 formas polimórficas encontradas en la población humana. En un aspecto, el único segmento V humano funcional es un segmento V^h1-2; en un aspecto específico, el único segmento V humano funcional está presente en 1, 2, 3, 4, o 5 formas polimórficas encontradas en la población humana.

En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina es un locus modificado de un animal no humano. En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana modificado está presente en el animal no humano en una posición en el genoma en la que el locus no humano no modificado correspondiente se encuentra en el animal no humano de tipo silvestre. En un aspecto, el locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina no humana está presente en un transgén en un animal no humano.

En un aspecto, el único segmento génico V humano funcional es un segmento génico V^h1-69. En un aspecto, el segmento génico V^h1-69 comprende la SEQ ID NO: 37. En un aspecto, el segmento génico V^h1-69 procede de la SEQ ID NO: 37. En un aspecto, el segmento génico V^h1-69 es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 37.

En un aspecto, el único segmento génico V humano funcional está codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37.

En un aspecto, el único segmento génico V humano funcional es un segmento génico V^h1-2. En un aspecto, el segmento génico V^h1-2 comprende la SEQ ID NO: 63. En un aspecto, el segmento génico V^h1-2 procede de la SEQ ID NO: 63. En un aspecto, el segmento génico V^h1-2 es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 63.

En un aspecto, el único segmento génico V humano funcional está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 63.

En un aspecto, el único segmento V humano funcional está unido operativamente a uno o más segmentos D y uno o más segmentos J, o uno o más segmentos J. En un aspecto, el segmento V y uno o más segmentos D y/o J están unidos operativamente a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de una secuencia C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3 y una combinación de las mismas. En un aspecto, la C^h1, bisagra, C^h2, C^h3, o una combinación de las mismas son cada una secuencias constantes endógenas no humanas. En un aspecto, al menos una de la C^h1, bisagra, C^h2, C^h3, o combinación de las mismas es una secuencia humana. En un aspecto específico, la CH1 y/o la bisagra son secuencias humanas.

En un aspecto, se describe un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina no humano modificado, que comprende un reemplazo de todos los segmentos V funcionales con un único segmento V humano, en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humano es incapaz de reordenarse para formar un gen variable de

cadena pesada que procede de un segmento V que no es el único segmento V humano.

En un aspecto, el único segmento V humano es V^h1-69. En un aspecto, el único segmento V humano es V^h1-2.

En un aspecto, el locus comprende al menos un segmento D^hhumano o no humano, y un segmento J^hhumano o

no humano. En un aspecto específico, el locus comprende un segmento D^hhumano y un segmento J^hhumano. En

un aspecto específico, el locus comprende un segmento J^hhumano. En otro aspecto específico, el locus comprende

un V^h1-69 humano, todos los segmentos D^hhumanos funcionales y todos los segmentos J^hhumanos funcionales.

En un aspecto, los segmentos V, D y J humanos (o segmentos V y J) están unidos operativamente a un gen de

región constante de ratón en un locus endógeno de cadena pesada de ratón. En un aspecto específico, el locus de

cadena pesada de ratón comprende un repertorio de tipo silvestre de secuencias de región constante de

inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, se describe un animal no humano modificado genéticamente, en donde el único segmento génico V

de cadena pesada de inmunoglobulina funcional del animal no humano se selecciona de un segmento V^h1-2, V^h1-3,

V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-45, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-30-3, V^h3-30-5, V^h3-33, V^h3-35, V^h3-38, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-49,

V^h3-53, V^h3-64, V^h3-66, V^h3-72, V^h3-73, V^h3-74, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-1, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5-51, V^h6-1, V^h7-4-1, y V^h7-81 humano. En un aspecto, el segmento génico V de cadena

pesada es un segmento génico V^h1-69 humano. En un aspecto, el segmento génico V de cadena pesada es un

segmento génico V^h1-2 humano.

En un aspecto, se describe un animal no humano modificado genéticamente, en donde el animal no humano

comprende un único segmento VH humano funcional, y en donde el animal no humano es sustancialmente incapaz

de formar un gen de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina reordenado que carece del único

segmento V^hhumano funcional.

En un aspecto, se describe un animal no humano modificado genéticamente, en donde la única región variable de

cadena pesada de inmunoglobulina expresada en el animal no humano procede de uno de un segmento humano

seleccionado de un segmento génico V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-45, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5,

V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-30-3, V^h3-5, V^h3-33, V^h3-35, V^h3-38, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-49, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-66, V^h3-72, V^h3-73, V^h3-74, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-1, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5-51, V^h6-1, V^h7-4-1, y V^h7-81

humano. En un aspecto, el segmento humano es un segmento V^h1-69. En un aspecto, el segmento humano es un

segmento V^h1-2. En un aspecto, la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina expresada por el

ratón procede de un único miembro de la familia del segmento V y, en un aspecto, la única región variable de

cadena pesada de inmunoglobulina procede de una variante polimórfica del único miembro de la familia del

segmento V.

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos génicos V de cadena

pesada de inmunoglobulina restringido, en donde el animal no humano además comprende uno o más segmentos

variables de cadena ligera ^kde inmunoglobulina humanos (V^k). En un aspecto, el uno o más segmentos V^kestán

unidos operativamente a uno o más segmentos J humanos. En un aspecto específico, los segmentos J son

segmentos J^khumanos. En otro aspecto específico, el animal no humano no expresa una cadena ligera A de

inmunoglobulina. En otro aspecto específico, el animal no humano no comprende un locus humano funcional o

endógeno funcional variable de cadena ligera A de inmunoglobulina.

En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo en el locus endógeno Vk de inmunoglobulina no

humano de todos o sustancialmente todos los segmentos endógenos Vk funcionales con uno o más segmentos Vk

humanos funcionales. En un aspecto específico adicional, el reemplazo es con todos o sustancialmente todos los

segmentos Vk humanos funcionales de inmunoglobulina.

En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo en el locus endógeno J^kde inmunoglobulina no

humano de todos o sustancialmente todos los segmentos endógenos J^khumanos de inmunoglobulina con uno o

más segmentos Jk humanos funcionales de inmunoglobulina. En un aspecto específico adicional, el reemplazo es

con todos o sustancialmente todos los segmentos J^khumanos funcionales de inmunoglobulina.

En un aspecto específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de

inmunoglobulina que comprende un repertorio de segmentos V que consiste esencialmente en un único segmento V

y/o variantes polimórficas del mismo. En un aspecto, el único segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina es

un segmento V^h1-69 humano, y el animal no humano comprende además un reemplazo de todos los segmentos D^h

no humanos funcionales con todos los segmentos D^hhumanos funcionales, y además comprende un reemplazo de

todos los segmentos J^hno humanos funcionales con todos los segmentos J^hhumanos funcionales, y en donde el

locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina está unido operativamente a una secuencia génica de región constante humana o no humana. En un aspecto específico, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana endógena. En un aspecto específico, el animal no humano reordena segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humano para formar un gen que codifica la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia V^h1-69 humana, una secuencia D^hhumana, una secuencia J^hde ratón y una secuencia de región constante de ratón.

En un aspecto específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un repertorio de segmentos V que consiste esencialmente en un único segmento V y/o variantes polimórficas del mismo. En un aspecto, el único segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina es un segmento V^h1-2 humano, y el animal no humano comprende además un reemplazo de todos los segmentos D^hno humanos funcionales con todos los segmentos D^hhumanos funcionales, y además comprende un reemplazo de todos los segmentos J^hno humanos funcionales con todos los segmentos J^hhumanos funcionales, y en donde el locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina está unido operativamente a una secuencia génica de región constante humana o no humana. En un aspecto específico, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana endógena. En un aspecto específico, el animal no humano reordena segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humano para formar un gen que codifica la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia V^h1-2 humana, una secuencia D^hhumana, una secuencia J^hde ratón y una secuencia de región constante de ratón.

En un aspecto, se describe un linfocito B que comprende el gen reordenado. En un aspecto específico, el linfocito B es de un ratón como se describe que se ha inmunizado con un antígeno de interés, y el linfocito B codifica un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés. En un aspecto, el antígeno de interés es un patógeno. En un aspecto específico, el patógeno se selecciona de un virus de la gripe, un virus de hepatitis (por ejemplo, virus de hepatitis B o hepatitis C) y un virus de inmunodeficiencia humana. En un aspecto específico, el linfocito B codifica un anticuerpo de alta afinidad mutado de manera somática (por ejemplo, aproximadamente 10-9 K^do inferior) que comprende una región variable de cadena ligera humana (por ejemplo, una región variable de cadena ligera k humana) que se une específicamente al antígeno de interés.

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos V de cadena pesada de inmunoglobulina restringido, en donde el animal no humano comprende uno o más segmentos variables de cadena ligera A (VA) humanos. En un aspecto, el uno o más segmentos VA humanos están unidos operativamente a uno o más segmentos J humanos. En un aspecto específico, los segmentos J son segmentos JA humanos. En otro aspecto específico, el animal no humano no expresa una cadena ligera ^k. En otro aspecto específico, el animal no humano no comprende un locus humano o no humano funcional variable de cadena ligera ^k.

En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos VA no humanos funcionales de inmunoglobulina con uno o más segmentos VA humanos funcionales de inmunoglobulina. En un aspecto específico adicional, el reemplazo es con todos o sustancialmente todos los segmentos VA humanos funcionales de inmunoglobulina.

En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos JA no humanos funcionales de inmunoglobulina con uno o más segmentos JA humanos funcionales de inmunoglobulina. En un aspecto específico adicional, el reemplazo es con todos o sustancialmente todos los segmentos JA humanos funcionales de inmunoglobulina.

En un aspecto específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina que comprende solo un único segmento V^h, en donde el único segmento V^hes un segmento V^h1 -69 humano o un segmento V^h1-2 humano, y comprende además un reemplazo de todos los segmentos D^hno humanos funcionales con todos los segmentos DH humanos funcionales, y además comprende un reemplazo de todos los segmentos JH no humanos funcionales con todos los segmentos JH humanos funcionales, y en donde el locus de región VH está unido operativamente a una secuencia génica de región constante humana o no humana. En un aspecto específico, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana, por ejemplo, una secuencia génica constante no humana endógena. En un aspecto específico, el animal no humano reordena segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humano para formar un gen que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia VH1-69 humana (o una secuencia V^h1-2 humana), una secuencia D^hhumana, una secuencia J^hhumana y una secuencia endógena de región constante humana.

En un aspecto, se describe un linfocito B que comprende el gen reordenado. En un aspecto específico, el linfocito B es de un animal no humano como se describe que se ha inmunizado con un antígeno de interés, y el linfocito B codifica un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés. En un aspecto, el antígeno es una proteína humana seleccionada de un ligando, un receptor de superficie celular y una proteína intracelular. En un aspecto, el antígeno de interés es un patógeno. En un aspecto específico, el patógeno se selecciona de un virus de la gripe, un virus de hepatitis (por ejemplo, virus de hepatitis B o hepatitis C) y un virus de inmunodeficiencia humana. En un aspecto específico, el linfocito B codifica un anticuerpo de alta afinidad mutado de manera somática (por ejemplo, aproximadamente 10-9 K^do inferior) que comprende una región variable de cadena ligera humana (por ejemplo, una región variable de cadena ligera A humana) que se une específicamente al antígeno de interés.

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos V de cadena pesada de inmunoglobulina restringido, en donde el animal no humano comprende un segmento V^h1-69 humano (o un segmento V^h1-2 humano) en un transgen, en donde el segmento V^h1-69 humano está unido operativamente en el transgen a un segmento D^hhumano o no humano, y/o un segmento J humano o no humano, y el transgen comprende además un gen de región constante humano o no humano, o una región constante quimera humana/no humana (por ejemplo, una C^h1, bisagra, C^h2, C^h3 o una combinación de las mismas en donde al menos una secuencia es no humana, por ejemplo, seleccionada de bisagra, CH2 y CH3 y/o bisagra). En un aspecto, el animal no humano es un ratón o rata y el gen no humano D, J y/o región constante es un gen de ratón o rata o quimera humano/ratón o rata.

En un aspecto, el animal no humano comprende un transgen que comprende un locus de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende uno o más segmentos VA y segmentos JA humanos de inmunoglobulina, o uno o más segmentos V^ky segmentos J^khumanos de inmunoglobulina, y un gen humano de región constante de cadena ligera k o A de inmunoglobulina, de modo que el transgen se reorganice en el animal no humano para formar un gen reordenado de cadena ligera k o A de la inmunoglobulina.

En un aspecto específico, el animal no humano comprende un transgen que tiene un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un único segmento V que es un segmento V^h1-69 humano (o un segmento V^h1-2 humano), uno o más segmentos D humanos, uno o más segmentos J humanos, y un gen constante humano unido operativamente al locus variable de cadena pesada, de modo que el ratón expresa a partir del transgén un anticuerpo completamente humano procedente del segmento V^h1-69 (o el segmento V^h1-2). En un aspecto, el animal no humano no comprende un locus endógeno funcional de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el animal no humano comprende un locus endógeno no funcional de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una eliminación de un segmento endógeno D^hno humano y/o endógeno J^hno humano, de modo que el animal no humano es incapaz de reordenar el locus endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina para formar un gen de anticuerpo no humano reordenado. En un aspecto específico, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia de cambio unida operativamente a una región constante endógena de cadena pesada de ratón. En un aspecto específico, la secuencia de cambio es una p secuencia de cambio no humana (por ejemplo, de ratón). En otro aspecto, el animal no humano comprende además una carencia de un locus endógeno funcional variable de cadena ligera seleccionado de un locus k de inmunoglobulina y un locus A de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia Jk y/o JA, de modo que el animal no humano es incapaz de reordenar una cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena y/o región variable de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana endógena para formar una cadena ligera k de inmunoglobulina endógena no humana reordenada y/o un gen endógeno no humano reordenado de cadena ligera A de inmunoglobulina.

En un aspecto, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia endógena no humana de cadena ligera k de inmunoglobulina que da como resultado una inactivación funcional de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena. En un aspecto, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia endógena no humana de cadena ligera A de inmunoglobulina que da como resultado una inactivación funcional de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana endógena.

En un aspecto, se describe un roedor que comprende un repertorio variable de cadena pesada de inmunoglobulina procedente de no más de un segmento V^hhumano o uno o más polimorfos del mismo, de un segmento D seleccionado de un repertorio de uno o más segmentos D, y de un segmento J seleccionado de un repertorio de uno o más segmentos J; en donde el roedor comprende una ADAM6 ectópica u ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un roedor macho.

En un aspecto, el segmento V^hhumano está presente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más variantes polimórficas, en donde cada variante polimórfica está unida operativamente a un segmento D y/o J tal que cada variante polimórfica es capaz de reordenar y formar un dominio variable de cadena pesada reordenado con cualquiera de los uno o más segmentos D y cualquiera de los uno o más segmentos J. En un aspecto, un roedor es un ratón o una rata. En un aspecto, el repertorio de segmentos D comprende dos o más segmentos D. En un aspecto, el repertorio de segmentos J comprende dos o más segmentos J. En un aspecto, los segmentos D y/o J son segmentos humanos. En un aspecto, la secuencia ADAM6 ectópica es una secuencia ADAM6 de un roedor de tipo silvestre de la misma especie. En un aspecto, un roedor es un ratón o una rata. En un aspecto, la secuencia ADAM6 ectópica u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en el roedor macho está en el mismo cromosoma que el repertorio variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado; en un aspecto, está en un cromosoma diferente.

En un aspecto, se describe una construcción de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica un único segmento V^hhumano de cadena pesada de inmunoglobulina y/o variantes polimórficas de la misma y una o más D^hy una o más secuencias J, en donde la construcción comprende al menos un brazo de homología homólogo a un locus no humano variable de cadena pesada de inmunoglobulina, o un sitio de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, un sitio lox). En un aspecto, el segmento V es un segmento V^h1-69 o un segmento V^h1-2.

En un aspecto, se describe una construcción de nucleótidos, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un único segmento V humano de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el único segmento V^hes un segmento V^h1-69 (o V^h1-2). En un aspecto, la construcción comprende un sitio de reconocimiento de recombinasa específico del sitio. En un aspecto, la construcción comprende un primer brazo de homología de ratón cadena arriba del segmento V^h1-69 (o V^h1-2) y un segundo brazo de homología de ratón cadena abajo del segmento V^h1-69 (o V^h1-2), y en donde el primer brazo de homología de ratón es homólogo a una región de un cromosoma de ratón inmediatamente cadena arriba de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón pero sin incluir un segmento funcional variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, la construcción comprende la SEQ ID NO: 6. En un aspecto, la construcción comprende la SEQ ID NO: 74. En un aspecto, la construcción comprende la SEQ ID NO: 75. En un aspecto, la construcción comprende la SEQ ID NO: 76.

En un aspecto, el único segmento V^hrestringido está en un animal no humano, o el segmento V^hrestringido está en un locus no humano de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, in situ o en un transgen), y el animal no humano o locus no humano de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de un animal o locus de ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejemplo, tití o macaco de la India). En un aspecto específico, el animal no humano o locus es un locus de ratón o rata.

En un aspecto, se describe un vector de direccionamiento, que comprende (a) una secuencia de nucleótidos que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos del segmento génico humano de región variable; y, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón.

En un aspecto, el vector de direccionamiento comprende además un promotor unido operativamente a la secuencia que codifica el ADAM6 de ratón. En un aspecto específico, el promotor es un promotor ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se describe una construcción de nucleótidos para modificar un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde la construcción comprende al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa específico de sitio y una secuencia que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón.

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico, que comprende un brazo de homología cadena arriba y un brazo de homología cadena abajo, en donde el brazo de homología cadena arriba comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia humana de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, el brazo de homología cadena abajo comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de región variable de inmunoglobulina humana o de ratón, y dispuesta entre los brazos de homología cadena arriba y cadena abajo hay una secuencia que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En un aspecto específico, la secuencia que codifica el gen ADAM6 de ratón está unida operativamente con un promotor de ratón con el que está unida la ADAM6 de ratón en un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se describe una célula aislada de un ratón genéticamente modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, la célula es un linfocito. En un aspecto, el linfocito es un linfocito B. En un aspecto específico, el linfocito B comprende una secuencia ADAM6 ectópica u ortólogo u homólogo o secuencia que codifica un fragmento funcional de la misma, en donde el linfocito B expresa un dominio variable de cadena pesada procedente de un segmento génico V^hhumano.

En un aspecto, se describe una célula o tejido, en donde la célula o tejido procede de un animal no humano como se describe en el presente documento, y comprende un repertorio de segmentos V^hrestringido. En un aspecto, el repertorio de segmentos V^hestá restringido a un único miembro de la familia del segmento V^hy/o variantes polimórficas del mismo. En un aspecto específico, el único segmento V^hes un segmento V^h1-69 humano o un segmento V^h1-2 humano. En un aspecto, la célula o tejido procede del bazo, ganglio linfático o médula ósea del animal no humano.

En un aspecto, la célula es una célula ME. En un aspecto, la célula es un linfocito B. En un aspecto, la célula es una célula germinal.

En un aspecto, el tejido se selecciona de tejido conectivo, muscular, nervioso y epitelial. En un aspecto específico, el tejido es tejido reproductivo.

En un aspecto, la célula y/o tejido procedente de un ratón como se describe en el presente documento se aísla para su uso en uno o más ensayos ex vivo. En diversos aspectos, el uno o más ensayos ex vivo incluyen mediciones de propiedades físicas, térmicas, eléctricas, mecánicas u ópticas, un procedimiento quirúrgico, mediciones de interacciones de diferentes tipos de tejidos, el desarrollo de técnicas de imagen o una combinación de los mismos. En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se describe un embrión no humano que comprende segmentos V^hrestringidos de cadena pesada como se describe en el presente documento. En un aspecto, el embrión comprende una célula ME donante que comprende el segmento V^hrestringido y las células embrionarias hospedadoras.

En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, una célula no humana comprende un cromosoma o fragmento del mismo de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, la célula no humana comprende un núcleo de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, la célula no humana comprende el cromosoma o fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.

En un aspecto, se describe un núcleo procedente de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, el núcleo es de una célula diploide que no es un linfocito B.

En un aspecto, se describe una célula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente procedente de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto específico, la célula es una célula madre embrionaria (ME) de ratón.

En un aspecto, se describe una célula pluripotente inducida no humana que comprende un repertorio restringido de segmentos V^h. En un aspecto, la célula pluripotente inducida procede de un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un hibridoma, que comprende una secuencia de un linfocito de un ratón como se describe en el presente documento. En un aspecto, el linfocito es un linfocito B.

En un aspecto, se describe una hibridoma o cuadroma, procedente de una célula de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, el animal no humano es un ratón o rata.

En un aspecto, se describen células de ratón y embriones de ratón, que incluyen, pero no se limitan a, células ME, células pluripotentes y células pluripotentes inducidas, que comprenden modificaciones genéticas como se describe en el presente documento. Se describen células que son XX y células que son XY. Las células que comprenden un núcleo que contiene una modificación como se describe en el presente documento también se describen, por ejemplo, una modificación introducida en una célula mediante inyección pronuclear. También se describen células, embriones y ratones que comprenden un gen ADAM6 introducido por virus, por ejemplo, células, células, embriones y ratones que comprenden una construcción de transducción que comprende un gen ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se describe una célula de ratón modificada genéticamente, en donde la célula es incapaz de expresar una cadena pesada que comprende segmentos génicos endógenos reordenados de cadena pesada de inmunoglobulina, y la célula comprende un gen ADAM6 funcional que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un fragmento funcional de la misma. En un aspecto, la célula comprende además una inserción de segmentos génicos humanos de inmunoglobulina. En un aspecto específico, los segmentos génicos humanos de inmunoglobulina son segmentos génicos de cadena pesada que están unidos operativamente a las regiones constantes de cadena pesada de ratón, de modo que al reordenarse codifican una cadena pesada funcional de un anticuerpo que comprende una región variable humana.

En un aspecto, se describe una célula de ratón modificada genéticamente; en donde la célula carece de un locus ADAM6 endógeno funcional de ratón, y la célula comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un fragmento funcional de la misma. En un aspecto, la célula comprende además una modificación de una secuencia génica endógena variable de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la modificación de la secuencia génica endógena variable de cadena pesada de inmunoglobulina comprende una eliminación seleccionada de una eliminación de un segmento génico VH de ratón, una eliminación de un segmento génico D^hde ratón, una eliminación de un segmento génico J^hde ratón, y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, el ratón comprende un reemplazo de una o más secuencias V^h, D^hy/o J^hde inmunoglobulina de ratón con una secuencia humana de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la secuencia humana de inmunoglobulina se selecciona de un V^hhumano, un V^lhumano, un D^hhumano, un J^hhumano, un J^lhumano y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la célula es una célula totipotente, una célula pluripotente o una célula pluripotente inducida. En un aspecto específico, la célula es una célula ME de ratón.

En un aspecto, se describe un linfocito B de ratón, en donde el linfocito B de ratón comprende un gen reordenado de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el linfocito B comprende en un cromosoma del linfocito B una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, el linfocito B de ratón comprende dos alelos de la secuencia de ácido nucleico.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de linfocitos B) que es contigua al locus reordenado de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de linfocitos B) que es distinta de la molécula de ácido nucleico que comprende el locus reordenado de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, el linfocito B de ratón comprende una secuencia génica reordenada variable de inmunoglobulina no de ratón unida operativamente a un gen de región constante de inmunoglobulina humano o de ratón, en donde el linfocito B comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de linfocitos B) que se ubica en o dentro del locus génico más cercano con respecto a la secuencia génica reordenada variable de inmunoglobulina no humana.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de linfocitos B) que es contigua a la secuencia reordenada de región variable de inmunoglobulina no humana.

En un aspecto, se describe una célula de ratón somática, que comprende un cromosoma que comprende un locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma que el locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en un cromosoma diferente que el locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la célula somática comprende una única copia de la secuencia de ácido nucleico. En un aspecto, la célula somática comprende al menos dos copias de la secuencia de ácido nucleico. En un aspecto específico, la célula somática es un linfocito B. En un aspecto específico, la célula es una célula germinal. En un aspecto específico, la célula es una célula madre.

En un aspecto, se describe un célula germinal de ratón, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en cromosoma de la célula germinal, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está en una posición en el cromosoma que es diferente de una posición en un cromosoma de una célula germinal de ratón de tipo silvestre. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en un locus de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma de la célula germinal que un locus de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en un cromosoma diferente de la célula germinal que el locus de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina de ratón comprende un reemplazo de al menos una secuencia de inmunoglobulina de ratón con al menos una secuencia de inmunoglobulina no de ratón. En un aspecto específico, la al menos una secuencia de inmunoglobulina no de ratón es una secuencia humana de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia humana de inmunoglobulina es una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, se describe una secuencia de dominio variable de anticuerpo hecha en un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un tratamiento humano, que comprende un dominio variable de anticuerpo que comprende una secuencia procedente de un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un método para obtener una secuencia de región variable de anticuerpo de un animal no humano, en donde la secuencia de región variable de anticuerpo procede de un segmento V^h1-69 o un segmento V^h1-2 humano, en donde el método comprende (a) inmunizar un animal no humano con un antígeno de interés, en donde el animal no humano comprende un reemplazo en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de todos o sustancialmente todos los segmentos variables no humanos con un único segmento variable humano, en donde el único segmento variable humano es un segmento V^h1-69 o un segmento V^h1-2, y en donde el animal no humano es sustancialmente incapaz de formar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que no proceda de un segmento V^h1-69 humano o un segmento V^h1-2; (b) permitir que el animal no humano genere una respuesta inmunitaria con respecto al antígeno de interés; y, (c) identificar o aislar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano, en donde el anticuerpo se une al antígeno de interés.

En un aspecto, el único segmento variable humano es un segmento V^h1-69.

En un aspecto, la secuencia de región variable de anticuerpo procede de la SEQ ID NO: 37. En un aspecto, la secuencia de región variable de anticuerpo es al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 37. En un aspecto, la secuencia de región variable de anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 37.

En un aspecto, el único segmento variable humano es un segmento V^h1-2.

En un aspecto, la secuencia de región variable de anticuerpo procede de la SEQ ID NO: 63. En un aspecto, la secuencia de región variable de anticuerpo es al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 63. En un aspecto, la secuencia de región variable de anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 63.

En un aspecto, se describe un método para generar un repertorio de regiones humanas variables de anticuerpos en un animal no humano, en donde las regiones humanas variables de cadena pesada del repertorio proceden del mismo miembro de la familia de genes V^hy uno de una pluralidad de segmentos D^hy uno de una pluralidad de segmentos J^h, en donde el repertorio se caracteriza por tener secuencias de inmunoglobulina FR1 (marco 1), CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada de un único miembro de la familia de genes V^h. En un aspecto, el repertorio se caracteriza además por tener una pluralidad de diferentes secuencias CDR3 FR4.

En un aspecto, la única familia de genes V^hse selecciona de la familia V^h1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. En un aspecto específico, la única familia de genes V^hes la familia V^h1. En un aspecto, el único miembro de la familia de genes V^hse selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, y V^h3-23. En un aspecto específico, el único miembro de la familia de genes V^hes V^h1-69.

En un aspecto, el repertorio comprende secuencias de cadena pesada FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 procedentes de un segmento V^h1-69. En un aspecto específico, el repertorio comprende secuencias de cadena pesada FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 procedentes de la SEQ ID NO: 38. En un aspecto específico, el repertorio comprende secuencias de cadena pesada FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de la SEQ ID NO: 38.

En un aspecto, el repertorio comprende secuencias de cadena pesada FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 procedentes de un segmento V^h1-2. En un aspecto específico, el repertorio comprende secuencias de cadena pesada FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 procedentes de la SEQ ID NO: 64. En un aspecto específico, el repertorio comprende secuencias de cadena pesada FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de la SEQ ID NO: 64.

En un aspecto, se describe un método para generar una pluralidad de diferentes secuencias CDR3 y FR4 en un animal no humano, que comprende exponer un animal no humano que comprende un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina con un repertorio de segmentos VH restringido a un único miembro de la familia del segmento VH a un antígeno de interés, lo que permite que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno, en donde la respuesta inmunitaria genera un repertorio de linfocitos B cuyos dominios variables de cadena pesada proceden cada uno del miembro de la familia del único segmento VH y que comprende una pluralidad de diferentes secuencias CDR3 y FR4.

En un aspecto, el miembro de la familia del único segmento VH es humano. En un aspecto, el animal no humano se selecciona de un ratón, una rata, y un conejo. En un aspecto, el antígeno de interés se selecciona de un ligando, un receptor, una proteína intracelular y una proteína secretada. En un aspecto, el antígeno de interés es un patógeno humano.

En un aspecto, se describe una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de inmunoglobulina fabricada en un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o de cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo fabricada en un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o de cadena ligera de inmunoglobulina que codifica una región variable de un anticuerpo fabricado en un no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, Fab, F(ab)2, scFv) fabricado en un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un animal no humano genéticamente modificado, que comprende reemplazar uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina cadena arriba (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina) de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano con uno o más segmentos génicos humanos de cadena pesada de inmunoglobulina, y reemplazar uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina cadena abajo (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina) del locus ADAM6 del animal no humano con uno o más segmentos génicos humanos de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina que reemplazan uno o más segmentos génicos endógenos de inmunoglobulina cadena arriba de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano incluyen segmentos génicos V. En un aspecto, los segmentos génicos humanos de inmunoglobulina que reemplazan uno o más segmentos génicos endógenos de inmunoglobulina cadena arriba de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano incluyen segmentos génicos V y D. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina que reemplazan uno o más segmentos génicos endógenos de inmunoglobulina cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano incluyen segmentos génicos J. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina que reemplazan uno o más segmentos génicos endógenos de inmunoglobulina cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano incluyen segmentos génicos D y J. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos de inmunoglobulina que reemplazan uno o más segmentos génicos endógenos de inmunoglobulina cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano incluyen segmentos génicos V, D y J. En un aspecto específico, el uno o más segmentos génicos que reemplazan uno o más segmentos génicos endógenos de inmunoglobulina cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano incluyen un único segmento génico V, uno o más segmentos génicos D y uno o más segmentos génicos J.

En un aspecto, el uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina cadena arriba y/o cadena abajo del gen ADAM6 se reemplazan en una célula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente para formar una célula progenitora modificada genéticamente; la célula progenitora modificada genéticamente se introduce en un hospedador; y, el hospedador que comprende la célula progenitora modificada genéticamente se gesta para formar un animal no humano que comprende un genoma procedente de la célula progenitora modificada genéticamente. En un aspecto, el hospedador es un embrión. En un aspecto específico, el hospedador se selecciona de una premórula de ratón (por ejemplo, etapa de 8 o 4 células), un embrión tetraploide, un agregado de células embrionarias o un blastocisto.

En un aspecto, se describe un animal no humano, en donde el animal no humano tiene un repertorio de linfocitos B que expresa dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina procedentes de un miembro de la familia del único segmento V. En un aspecto, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % del repertorio de linfocitos B del dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina de animal no humano expresado en el repertorio de linfocitos B procede del mismo miembro de la familia del segmento V. En un aspecto específico, el porcentaje es al menos un 90 %. En un aspecto, el repertorio de linfocitos B consiste esencialmente en linfocitos B periféricos (de sangre). En un aspecto, el repertorio de linfocitos B consiste esencialmente en linfocitos B esplénicos. En un aspecto, el repertorio de linfocitos B consiste esencialmente en linfocitos B de médula ósea. En un aspecto, el repertorio de linfocitos B consiste esencialmente en linfocitos B periféricos, linfocitos B esplénicos y linfocitos B de médula ósea.

En un aspecto, se describe un animal no humano modificado genéticamente, en donde más de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o más de un 90 % de los linfocitos B del animal no humano que expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina procedente de un miembro de la familia del único segmento génico V^h. En un aspecto, al menos un 75 % de los linfocitos B del animal no humano que expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina procedente del miembro de la familia del único segmento génico V^h. En un aspecto específico, el porcentaje es al menos un 90 %. En un aspecto, todos los linfocitos B que expresan un dominio de cadena pesada proceden del único miembro de la familia del gen V^h.

En un aspecto, se describe un ratón genéticamente modificado que forma una población de linfocitos B específicos de antígeno en respuesta a la inmunización con un antígeno de interés, en donde al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más de un 90 %, de dicha población de linfocitos B específicos de antígeno expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que proceden todas del mismo segmento génico VH. En un aspecto, al menos un 75 % de la población de linfocitos B específicos de antígeno expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina procedentes del mismo segmento génico V^h. En un aspecto, todos linfocitos B específicos de antígeno expresan una cadena pesada que procede del mismo segmento génico VH.

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos génicos VH restringido, en donde la restricción es a un segmento génico V^h1-69 humano o un segmento génico V^h1-69 que es al menos aproximadamente un 75,5 %, 76,5 %, 86,7 %, 87,8 %, 94,9 %, 96,9 %, 98 % o 99 % idéntico a un segmento génico V^h1-69*01. En un aspecto específico, el repertorio restringido se selecciona de una o más de las variantes V^h1-69 de la Figura 7.

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos génicos VH restringido, en donde la restricción es a un segmento génico V^h1-2 humano o un segmento génico V^h1-2 que es al menos aproximadamente un 94,9 %, 95,9 %, 96,9 %, 98 % o 99 % idéntico a un segmento génico V^h1-2. En un aspecto específico, el repertorio restringido se selecciona de una o más de las variantes V^h1-2 de la Figura 10. En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos V^hhumanos restringido, que comprende además un locus humanizado de segmento variable de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la relación de cadenas ligeras A a ^kexpresadas en el ratón es aproximadamente la misma que en un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se describe un animal no humano, que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido caracterizado por la presencia de un único segmento génico V^h, uno o más segmentos génicos D^hy uno o más segmentos génicos J^h, en donde el único segmento génico V^hes un segmento génico V^hpolimórfico.

En un aspecto, el segmento génico V^hpolimórfico es un segmento génico V^hhumano que está asociado con un alto número de copias en poblaciones humanas. En un aspecto, el segmento génico V^hhumano se selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, V^h3 -23, o una variante polimórfica de los mismos. En un aspecto específico, el segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-69. En otro aspecto específico, el segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-2.

En un aspecto, el único segmento génico V^hestá unido operativamente a un gen humano, de ratón o quimera humano/de ratón de región constante de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el gen de región constante de inmunoglobulina es un gen de región constante de ratón. En un aspecto, el gen constante de inmunoglobulina comprende una secuencia humana seleccionada de un C^h1 humano, una bisagra humana, un C^h2 humano, un C^h3 humano y una combinación de los mismos. En un aspecto, el gen constante de ratón está en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, el animal no humano comprende además un segmento génico V^lhumano de inmunoglobulina unido operativamente a un segmento génico J y un gen constante de cadena ligera. En un aspecto específico, el segmento génico V^ly/o el segmento génico J se seleccionan de un segmento génico ^khumano y un segmento génico A humano. En un aspecto, los segmentos génicos V^ly/o J son segmentos génicos k humanos.

En diversos aspectos, el animal no humano comprende una eliminación de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hendógenos.

En diversos aspectos, el animal no humano comprende un locus génico endógeno inactivado de región variable de cadena pesada. En diversos aspectos, el locus génico endógeno inactivado variable de cadena pesada no está unido operativamente a un gen endógeno de región constante de cadena pesada.

En un aspecto, se describe un animal no humano, en donde el animal no humano se caracteriza por la expresión de inmunoglobulina sérica, en donde más de un 80 % de la inmunoglobulina sérica comprende un dominio humano variable de cadena pesada y un dominio humano variable de cadena ligera afín, en donde el dominio variable humano de cadena pesada procede de un repertorio de segmentos génicos V^hque consiste esencialmente en un único segmento génico V^hhumano y/o variantes polimórficas del mismo.

En un aspecto, el único segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-69 humano y/o variantes polimórficas del mismo. En un aspecto, el único segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-2 humano y/o variantes polimórficas del mismo.

En un aspecto, se describe un animal no humano, que comprende, en su línea germinal, un reemplazo en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hendógenos con un único segmento génico V^hhumano y/o variantes polimórficas del mismo.

En un aspecto, el animal no humano comprende además un reemplazo en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^lendógenos con uno o más segmentos génicos V^lhumanos. En un aspecto específico, el ratón comprende además uno o más segmentos génicos J^lhumanos unidos operativamente a los segmentos génicos V^lhumanos.

En un aspecto, se describe un animal no humano que expresa un anticuerpo que comprende al menos un polipéptido de inmunoglobulina de dominio variable humano/dominio constante no humano, en donde el animal no humano expresa una proteína ADAM6 no humana u ortólogo u homólogo de la misma de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina es incapaz de reordenarse para codificar una cadena pesada funcional de un anticuerpo.

En un aspecto, se describe un animal no humano que expresa un anticuerpo que comprende al menos un polipéptido de inmunoglobulina de dominio variable humano/dominio constante no humano, en donde el animal no humano expresa una proteína ADAM6 no humana u ortólogo u homólogo de la misma a partir de un locus distinto de un locus de inmunoglobulina.

En un aspecto, la proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma se expresa en un linfocito B del animal no humano, en donde el linfocito B comprende una secuencia de inmunoglobulina reordenada que comprende una secuencia variable humana y una secuencia constante no humana.

En un aspecto, la secuencia constante no humana es una secuencia de roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un animal no humano macho infértil, que comprende hacer que un alelo ADAM6 endógeno de una célula ME donante no sea funcional (o inactivar dicho alelo), introducir la célula ME donante en un embrión hospedador, gestar el embrión hospedador en una madre sustituta, y permitir que la madre sustituta dé a luz a una progenie procedente total o parcialmente de la célula ME donante. En un aspecto, el método comprende además la progenie reproductiva para obtener un animal no humano infértil macho.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un animal no humano con una modificación genética de interés, en donde el animal no humano es infértil, comprendiendo el método las etapas de (a) hacer una modificación genética de interés en un genoma; (b) modificar el genoma para inactivar un alelo ADAM6 endógeno, o hacer que un alelo ADAM6 endógeno no sea funcional; y, (c) emplear el genoma para hacer un animal no humano. En diversos aspectos, el genoma es de una célula ME o se utiliza en un experimento de transferencia nuclear.

En un aspecto, se describe un animal no humano hecho usando un vector de direccionamiento, construcción de nucleótidos o célula como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe una progenie de un apareamiento de un animal no humano como se describe en el presente documento con un segundo animal no humano que es un animal no humano de tipo silvestre o genéticamente modificado.

En un aspecto, se describe un método para mantener una cepa animal no humana, en donde la cepa animal no humana comprende un reemplazo de una secuencia no humana de cadena pesada de inmunoglobulina con una o más secuencias heterólogas de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la una o más secuencias heterólogas de cadena pesada de inmunoglobulina son secuencias humanas de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, la cepa animal no humana comprende una eliminación de uno o más segmentos génicos V^h, D^hy/o J^h. En un aspecto, el animal no humano comprende además un único segmento génico V^hhumano, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y/o uno o más segmentos génicos J^hhumanos. En un aspecto, el animal no humano comprende un único segmento V^hhumano, al menos 27 segmentos génicos D^hhumanos y al menos seis segmentos génicos J^hhumanos. En un aspecto específico, el animal no humano comprende un único segmento V^hhumano, 27 génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos, en donde dicho único segmento génico V^hhumano, 27 segmentos génicos D^hhumanos, y seis segmentos génicos J^hhumanos están unidos operativamente a un gen de región constante. En un aspecto, el gen de región constante es un gen de región constante no humano. En un aspecto, el gen de región constante comprende una secuencia génica de región constante de ratón o rata seleccionada de una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3, y/o una C^h4 o una combinación de las mismas. En diversos aspectos, el único segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-69 humano o un segmento génico V^h1-2 humano.

En un aspecto, el método comprende generar un heterocigoto de animal no humano macho para el reemplazo de la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, y criar el animal no humano macho heterocigoto con un animal no humano hembra de tipo silvestre o una hembra de tipo silvestre animal no humano que es homocigoto o heterocigoto para la secuencia de cadena pesada humana. En un aspecto, el método comprende mantener la cepa animal no humana criando repetidamente machos heterocigotos con hembras que son de tipo silvestre u homocigóticas o heterocigotas para la secuencia de cadena pesada humana.

En un aspecto, el método comprende obtener células de animales no humanos machos o hembras homocigotos o heterocigotos para la secuencia de cadena pesada humana, y emplear esas células como células donantes o núcleos a partir de ellas como núcleos donantes, y usar las células o núcleos para producir animales no humanos genéticamente modificados usando células hospedadoras y/o gestando las células y/o núcleos en madres sustitutas. En un aspecto, solo los animales machos no humanos que son heterocigotos para el reemplazo en el locus de cadena pesada se crían en animales hembras no humanos. En un aspecto específico, los animales hembras no humanos son homocigotos, heterocigotos o de tipo silvestre con respecto a un locus de cadena pesada reemplazado.

En un aspecto, los animales no humanos comprenden además un reemplazo de secuencias variables de cadena ligera A y/o k en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina con secuencias heterólogas de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, las secuencias heterólogas de cadena ligera de inmunoglobulina son secuencias humanas variables de cadena ligera A y/o k de inmunoglobulina.

En un aspecto, el animal no humano comprende además un transgen en un locus distinto de un locus endógeno de inmunoglobulina, en donde el transgen comprende una secuencia que codifica una secuencia heteróloga de cadena ligera A o k reordenada o no reordenada (por ejemplo, V^lno reordenada y J^lno reordenada, o V^lJ^lreordenadas) unida operativamente (para no reordenada) o fusionada (para reordenado) a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia heteróloga de cadena ligera A o ^kes humana. En un aspecto, la secuencia de región constante se selecciona de roedor, ser humano y primate no humano. En un aspecto, la secuencia de región constante se selecciona de ratón, rata, y hámster. En un aspecto, el transgen comprende un promotor no de inmunoglobulina que impulsa la expresión de las secuencias de cadena ligera. En un aspecto específico, el promotor es un promotor transcripcionalmente activo. En un aspecto específico, el promotor es un promotor ROSA26.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un animal no humano genéticamente modificado, que comprende insertar una secuencia de nucleótidos no humana que comprende un segmento génico no humano de inmunoglobulina en el genoma del animal para una primera modificación, en donde la inserción mantiene un gen ADAM6 endógeno, que hace que el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano no sea funcional para una segunda modificación. En un aspecto, la primera modificación se realiza cadena arriba de un gen endógeno de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y la segunda modificación se realiza para invertir, translocar o colocar fuera del enlace operativo el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de modo que el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina es incapaz de reordenarse para codificar una región variable de cadena pesada funcional.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un animal no humano genéticamente modificado, que comprende reemplazar una secuencia de nucleótidos no humana que comprende un segmento génico no humano de inmunoglobulina y una secuencia de nucleótidos de ADAM6 no humana (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma en un animal no humano macho) con una secuencia que comprende un segmento génico humano de inmunoglobulina para formar un primer locus quimérico, luego insertar una secuencia que comprende una secuencia que codifica ADAM6 no humano (o una secuencia que codifica un ortólogo u homólogo o funcional fragmento de la misma) en la secuencia que comprende el segmento génico humano de inmunoglobulina para formar un segundo locus quimérico.

En un aspecto, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico humano variable de cadena pesada (V^h) de inmunoglobulina. En un aspecto, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico humano variable de cadena ligera (V^l) de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico humano V^ho un segmento génico humano V^lunido operativamente a un segmento génico humano DH y un segmento génico humano JH. En un aspecto específico adicional, el segundo locus quimérico está unido operativamente a un tercer locus quimérico que comprende una secuencia C^h1 humana, o una secuencia C^h1 humana y bisagra humana, fusionada con una secuencia C^h2 C^h3 de ratón.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón que comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que comprende un locus o secuencia ADAM6 de ratón para hacer un ratón macho fértil, en donde el uso comprende aparear el ratón que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica que comprende el locus o secuencia ADAM6 de ratón con un ratón que carece de un locus o secuencia endógena ADAM6 de ratón funcional, y que obtiene una progenie que es una hembra capaz de producir progenie que tiene el locus o secuencia ADAM6 ectópica o que es un macho que comprende el locus o secuencia ADAM6 ectópica, y el macho exhibe una fertilidad que es aproximadamente la misma que la fertilidad que exhibe un ratón macho de tipo silvestre.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer una secuencia de nucleótidos de región variable de inmunoglobulina.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer un Fab completamente humano o un F(ab)2 completamente humano.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer una línea celular inmortalizada.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer un hibridoma o cuadroma.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer una biblioteca de fagos que contiene regiones variables de cadena pesada humana y regiones variables de cadena ligera humana. En un aspecto, las regiones variables de cadena pesada humana proceden de un segmento génico V^h1-69 humano que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 59.

En un aspecto, las regiones variables de cadena pesada humana proceden de un segmento génico V^h1-69 humano que comprende una secuencia seleccionada de S^eQ ID NO: 38, S^eQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62.

En un aspecto, las regiones variables de cadena pesada humana proceden todas de un segmento génico V^h1-2 humano que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 71.

En un aspecto, las regiones variables de cadena pesada humana proceden de un segmento génico V^h1-2 humano que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 72.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para generar una secuencia de región variable para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar un linfocito del ratón inmunizado de (a), (c) exponer el linfocito a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de región variable a partir del linfocito generando así una secuencia de región variable.

En un aspecto, el linfocito procede del bazo del ratón. En un aspecto, el linfocito procede de un ganglio linfático del ratón. En un aspecto, el linfocito procede de la médula ósea del ratón.

En un aspecto, el anticuerpo marcado es un anticuerpo conjugado con fluoróforo. En un aspecto, el uno o más anticuerpos conjugados con fluoróforo se seleccionan de una IgM, una IgG y/o una combinación de las mismas. En un aspecto, el linfocito es un linfocito B.

En un aspecto, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena pesada. En un aspecto, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena ligera. En un aspecto específico, la secuencia de región variable de cadena ligera es una secuencia de región variable de cadena ligera ^kde inmunoglobulina. En un aspecto, la una o más secuencia de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y una cadena ligera k.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar el bazo del ratón inmunizado de (a), (c) exponer los linfocitos B del bazo a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B generando así las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera k.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar uno o más ganglios linfáticos del ratón inmunizado de (a), (c) exponer los linfocitos B de uno o más ganglios linfáticos a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B generando así las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera k.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar la médula ósea del ratón inmunizado de (a), (c) exponer los linfocitos B de la médula ósea a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B generando así las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera k. En diversos aspectos, el uno o más anticuerpos marcados se seleccionan de una IgM, una IgG y/o una combinación de las mismas.

En diversos aspectos, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a sujetos humanos que incluyen, por ejemplo, un antígeno vírico. Los ejemplos de patógenos víricos incluyen, por ejemplo, principalmente los de las familias de Adenoviridae, bacterias Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Poliomavirus, Rhabdoviridae y Togaviridae. Dichos virus ejemplares normalmente varían entre 20-300 nanómetros de longitud. En diversos aspectos, el antígeno de interés es un antígeno vírico seleccionado de un virus de hepatitis (por ejemplo, HCV, HBV, etc.), un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o un virus de la gripe.

En diversos aspectos, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para producir un anticuerpo humano, que comprende además fusionar las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera amplificadas a las secuencias de región constante de cadena pesada y ligera humanas, que expresan las secuencias fusionadas de cadena pesada y ligera en una célula, y recuperan las secuencias expresadas de cadena pesada y ligera generando así un anticuerpo humano.

En diversos aspectos, las regiones constantes de cadena pesada humana se seleccionan de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. En varios aspectos específicos, la IgG se selecciona de una IgG1, una IgG2, una IgG3 y una IgG4. En diversos aspectos, la región constante de cadena pesada humana comprende una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3, una C^h4, y una combinación de las mismas. En diversos aspectos, la región constante de cadena ligera es una región constante k de inmunoglobulina. En diversos aspectos, la célula se selecciona de una célula HeLa, una célula DU145, una célula Lncap, una célula MCF-7, una célula MDA-MB-438, una célula PC3, una célula T47D, una célula THP-1, una célula U87, una célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), una célula Saos-2, una célula Vero, una célula CHO, una célula GH3, una célula PC12, una célula retiniana humana (por ejemplo, una célula PER.C6™) y una célula MC3T3. En un aspecto específico, la célula es una célula CHO.

En un aspecto, se describe un método para generar un anticuerpo quimérico de roedor-humano inverso específico contra un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo quimérico de ratónhumano inverso específico contra el antígeno, cultivar al menos una célula que produce el anticuerpo quimérico de ratón-humano inverso específico contra el antígeno, y obtener dicho anticuerpo.

En un aspecto, el anticuerpo quimérico humano-ratón inverso comprende un dominio variable de cadena pesada humano fusionado con un gen constante de cadena pesada de ratón o rata, y un dominio variable de cadena ligera humano fusionado con un gen constante de cadena ligera de ratón o rata o ser humano. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada humano contiene un segmento génico reordenado V^h1-69 humano o V^h1-2 humano.

En un aspecto, el cultivo de al menos una célula que produce el anticuerpo quimérico de roedor-humano inverso específico contra el antígeno se realiza en al menos una célula de hibridoma generada a partir de la al menos una célula aislada del ratón.

En un aspecto, se describe un método para generar un anticuerpo completamente humano específico contra un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo quimérico de roedor-humano inverso específico contra el antígeno, generar al menos una célula que produce un anticuerpo completamente humano procedente del anticuerpo quimérico de roedor-humano inverso específico contra el antígeno, y cultivar al menos una célula que produce el anticuerpo completamente humano, y obtener dicho anticuerpo completamente humano. En diversos aspectos, la al menos una célula aislada del ratón que produce un anticuerpo quimérico de roedorhumano inverso específico contra el antígeno es un esplenocito o un linfocito B.

En diversos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En diversos aspectos, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene un segmento génico reordenado V^h1-69 humano o V^h1-2 humano.

En diversos aspectos, la inmunización con el antígeno de interés se lleva a cabo con proteínas, ADN, una combinación de ADN y proteína, o células que expresan el antígeno.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina o fragmento de la misma. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico se usa para hacer un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo. En un aspecto, el ratón se usa para hacer una proteína de unión a antígeno seleccionada de un anticuerpo, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), un scFv, un scFv biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un V-NAr , un V^hh, un V^l, un F(ab), un F(ab)2, una DVD (por ejemplo, proteína de unión a antígeno de dominio variable doble), una SVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable único) o un activador de linfocitos T biespecífico (BiTE).

En un aspecto, se describe un método para fabricar una proteína de unión a antígeno humana, que comprende exponer un animal no humano modificado genéticamente como se describe en el presente documento a un antígeno de interés, permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno, obtener del animal no humano una secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada que codifica un dominio variable de cadena pesada humano que se une específicamente al antígeno de interés, fusionar la secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada con una secuencia de región constante humana, y expresar en una célula de mamífero un anticuerpo que comprende la secuencia de dominio variable de cadena pesada humana y la secuencia de región constante humana. En un aspecto, la célula de mamífero es una célula CHO. En un aspecto, el animal no humano comprende un repertorio de segmentos génicos V^hhumano que consiste esencialmente en un único segmento génico V^hhumano, opcionalmente presente en dos o más variantes polimórficas del mismo, unido operativamente a uno o más segmentos D y/o J humanos. En un aspecto, el repertorio de segmentos génicos V^hhumano está en un locus endógeno del segmento génico V^hno humano. En un aspecto, el repertorio de segmentos génicos V^hhumano está en un locus que no es endógeno del segmento génico V^h. En un aspecto, el segmento génico V^hhumano se reordena con un segmento D humano y un segmento J humano para formar un gen VDJ humano reordenado unido operativamente a una secuencia de región constante, en donde la secuencia de región constante se selecciona de una secuencia humana y una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o rata o hámster). En un aspecto, la secuencia de región constante comprende una secuencia seleccionada de una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3, y una combinación de las mismas; en un aspecto específico, la secuencia de región constante comprende una C^h1, una bisagra, una C^h2 y una C^h3. En un aspecto, el dominio variable humano y la secuencia constante se expresan en la célula de mamífero con un dominio variable de cadena ligera humano afín obtenido del mismo ratón (por ejemplo, secuencia obtenida del mismo linfocito B que la secuencia del dominio variable humano); en un aspecto, la secuencia que codifica el dominio variable de cadena ligera humano obtenida del ratón se fusiona con una secuencia que codifica una secuencia constante de cadena ligera humana, y la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada se expresan en la célula de mamífero.

En un aspecto, se describe un método para hacer un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que se une a un antígeno de interés, que comprende expresar en una única célula (a) una primera secuencia V^hde un animal no humano inmunizado como se describe en el presente documento, en donde la primera secuencia V^hse fusiona con una secuencia génica C^h; y (b) una secuencia génica V^lde un animal no humano inmunizado como se describe en el presente documento, en donde la secuencia génica V^lse fusiona con una secuencia génica C^lhumana; mantener la célula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo; y, aislar el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo. En un aspecto, la secuencia génica V^lestá relacionada con la primera secuencia V^h.

En un aspecto, la célula comprende una segunda secuencia génica V^hde un animal no humano inmunizado como se describe en el presente documento, en donde la segunda secuencia génica V^hse fusiona con una secuencia génica C^h, en donde la primera secuencia génica V^hcodifica un dominio V^hque se une específicamente a un primer epítopo, y la segunda secuencia génica V^hcodifica un dominio V^hque se une específicamente a un segundo epítopo, en donde el primer epítopo y el segundo epítopo no son idénticos.

En un aspecto, las secuencias de región constante son todas secuencias de región constante humanas.

En un aspecto, se describe un método para hacer un anticuerpo biespecífico humano, que comprende hacer el anticuerpo biespecífico usando secuencias génicas de región variable humanas de linfocitos B de un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el método comprende (a) identificar un linfocito seleccionado clonalmente del animal no humano, en donde el animal no humano ha sido expuesto a un antígeno de interés y se le ha permitido desarrollar una respuesta inmunitaria al antígeno de interés, y en donde el linfocito expresa un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés, (b) obtener del linfocito o del anticuerpo una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada humana que se une específicamente al antígeno de interés, y (c) emplear la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada humana que se une específicamente al antígeno de interés en la fabricación del anticuerpo biespecífico. En un aspecto específico, la región variable de cadena pesada humana comprende un segmento génico V^h1-2 o V^h1-69 reordenado.

En un aspecto, las etapas (a) a (c) se realizan por primera vez para que un primer antígeno de interés genere una primera secuencia de región variable de cadena pesada humana, y las etapas (a) a (c) se realizan una segunda vez para que un segundo antígeno de interés genere una segunda secuencia de región variable de cadena pesada humana, y en donde la primera secuencia de región variable de cadena pesada humana se expresa fusionada con una primera región constante de cadena pesada humana para formar una primera cadena pesada humana, la segunda secuencia de región variable de cadena pesada humana se expresa fusionada con una segunda región constante de cadena pesada humana para formar una segunda cadena pesada humana, en donde la primera y la segunda cadena pesada humana se expresan en presencia de una única cadena ligera humana expresada a partir de un segmento génico reordenado Vk1-39 humano o Vk3-20 humano. En un aspecto específico, la única cadena ligera humana comprende una secuencia de línea germinal.

En un aspecto, el método comprende (a) clonar regiones variables de cadena pesada de linfocitos B de un animal no humano como se describe en el presente documento que ha sido expuesto a un primer antígeno de interés, y el mismo animal no humano, o un animal no humano diferente que es genéticamente igual y ha sido expuesto a un segundo antígeno de interés; y (b) expresar en una célula las regiones variables de cadena pesada de (a) con la misma región constante de cadena pesada y la misma cadena ligera para producir un anticuerpo biespecífico.

En un aspecto, se describe el uso de un animal no humano como se describe en el presente documento, para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada humano. En un aspecto, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un aspecto, se describe el uso de un animal no humano como se describe en el presente documento, para obtener una célula que codifica un dominio variable de cadena pesada humano. En un aspecto, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer un dominio variable de anticuerpo humano. En un aspecto, se describe el uso de un animal no humano como se describe en el presente documento para hacer un anticuerpo humano. En un aspecto, el anticuerpo humano es un anticuerpo biespecífico humano. En diversos aspectos, el dominio variable y/o el anticuerpo comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un aspecto, se describe el uso de un animal no humano como se describe en el presente documento para seleccionar un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humano. En un aspecto, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para introducir una secuencia ADAM6 ectópica en un ratón que carece de una secuencia ADAM6 endógena funcional del ratón, en donde el uso comprende aparear un ratón como se describe en el presente documento con el ratón que carece de la secuencia ADAM6 endógena funcional de ratón.

En un aspecto, se describe el uso de material genético de un ratón como se describe en el presente documento para hacer un ratón que tenga una secuencia ADAM6 ectópica. En un aspecto, el uso comprende la transferencia nuclear usando un núcleo de una célula de un ratón como se describe en el presente documento. En un aspecto, el uso comprende clonar una célula de un ratón como se describe en el presente documento para producir un animal procedente de la célula. En un aspecto, el uso comprende emplear un esperma o un óvulo de un ratón como se describe en el presente documento en un proceso para hacer un ratón que comprende la secuencia ADAM6 ectópica.

En un aspecto, se describe un método para hacer un ratón macho fértil que comprende un locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende fertilizar una primera célula germinal de ratón que comprende una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina con una segunda célula germinal de ratón que comprende un gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho; formar una célula fertilizada; permitir que la célula fertilizada se convierta en un embrión; y, gestar el embrión en un sustituto para obtener un ratón.

En un aspecto, la fertilización se logra mediante el apareamiento de un ratón macho y un ratón hembra. En un aspecto, el ratón hembra comprende el gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo. En un aspecto, el ratón macho comprende el gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo.

En un aspecto, se describe el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo de la misma o un fragmento funcional de la proteína ADAM6 correspondiente para restaurar o mejorar la fertilidad de un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación reduce o elimina la función ADAM6 endógena.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está integrada en el genoma del ratón en una posición ectópica. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está integrada en el genoma del ratón en un locus endógeno de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el locus endógeno de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está integrada en el genoma del ratón en una posición distinta de la de un locus endógeno de inmunoglobulina.

En un aspecto, se describe el uso del ratón como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), o para la fabricación de una secuencia que codifica una secuencia variable de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), para el tratamiento de un trastorno o enfermedad humana. En un aspecto, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico polimórfico V^hhumano. En un aspecto, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico V^h1-69 humano. En un aspecto, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico V^h1-2 humano.

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina hecho en un ratón como se describe en el presente documento. En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano seleccionado de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23. En otro aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-2 humano. En otro aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-69 humano.

En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un aspecto específico, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que está asociado con un dominio variable de cadena pesada humano que comprende un segmento génico V^h1-69 humano reordenado. En un aspecto específico, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que está asociado con un dominio variable de cadena pesada humano que comprende un segmento génico V^h1-2 humano reordenado.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer una construcción de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina humano. En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que comprende un segmento génico Vk humano reordenado seleccionado de Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6, Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, V^k2-19, V^k3-20, V^k6-21, V^k1-22, V^k1-23, V^k2-24, V^k3-25, V^k2-26, V^k1-27, V^k2-28, V^k2-29, V^k2-30, V^k3-31, V^k1-32, V^k1-33, V^k3-34, V^k1-35, V^k2-36, V^k1-37, V^k2-38, V^k1-39 y V^k2-40.

En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1 -69 humano reordenado. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-2 humano reordenado.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para hacer un dominio variable de inmunoglobulina humano. En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que comprende un segmento génico Vk humano reordenado seleccionado de Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6, Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, V^k1-39 y V^k2-40.

En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-69 humano reordenado. En un aspecto específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-2 humano reordenado.

Los diversos aspectos y realizaciones son capaces de usarse juntos, a menos que se indique expresamente lo contrario o el contexto prohíba claramente el uso conjunto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento y de ingeniería molecular empleadas para hacer un vector de direccionamiento para la construcción de un locus modificado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^h1-69 humano, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La Figura 2 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento y de ingeniería molecular empleadas para hacer un vector de direccionamiento para la construcción de un locus modificado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^h1-2 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis JH humanos en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La Figura 3 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento y de ingeniería molecular empleadas para hacer un vector de direccionamiento para la construcción de un locus modificado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^h1-69 humano, veintisiete D^hhumanos, seis segmentos génicos J^hhumanos y un fragmento genómico ectópico que codifica ADAM6 de ratón en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La Figura 4 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento y de ingeniería molecular empleadas para hacer un vector de direccionamiento para la construcción de un locus modificado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^h1-2 humano, veintisiete D^hhumanos, seis segmentos génicos J^hhumanos y un fragmento genómico ectópico que codifica ADAM6 de ratón en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La Figura 5 muestra el alineamiento de nucleótidos del segundo exón para cada uno de los trece alelos informados para el gen V^h1-69 humano. Las bases en minúsculas indican diferencias de nucleótidos en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés) se indican con cuadros alrededor de la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para el alineamiento de secuencia adecuado. V^h1-69*01 (SEQ ID NO: 37); V^h1-69*02 (SEQ ID NO: 39); V^h1-69*03 (SEQ ID NO: 41); V^h1-69*04 (SEQ ID NO: 43); V^h1-69*05 (SEQ ID NO: 45); V^h1-69*06 (SEQ ID NO: 47); V^h1-69*07 (SEQ ID NO: 49); V^h1-69*08 (SEQ ID NO: 51); V^h1-69*09 (SEQ ID NO: 53); V^h1-69*10 (SEQ ID NO: 55); V^h1-69*11 (SEQ ID NO: 57); V^h1-69*12 (SEQ ID NO: 59); V^h1-69*13 (SEQ ID NO: 61).

La Figura 6 muestra el alineamiento de proteínas de la secuencia génica variable de cadena pesada madura para cada uno de los trece alelos informados para el gen V^h1-69 humano. Los aminoácidos en minúscula indican diferencias en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés) se indican con cuadros alrededor de la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para el alineamiento de secuencia adecuado. V^h1-69*01 (SEQ ID NO: 38); V^h1-69*02 (SEQ ID NO: 40); V^h1-69*03 (SEQ ID NO: 42); V^h1-69*04 (SEQ ID NO: 44); V^h1-69*05 (SEQ ID NO: 46); V^h1-69*06 (SEQ ID NO: 48); V^h1-69*07 (SEQ ID NO: 50); V^h1-69*08 (SEQ ID NO: 52); V^h1-69*09 (SEQ ID NO: 54); V^h1-69*10 (SEQ ID NO: 56); V^h1-69*11 (SEQ ID NO: 58); V^h1-69*12 (SEQ ID NO: 60); V^h1-69*13 (SEQ ID NO: 62).

La Figura 7 muestra una matriz de porcentaje de identidad/porcentaje de similitud para las secuencias de proteínas alineadas del gen variable maduro para cada uno de los trece alelos informados para el gen V^h1-69 humano. El porcentaje de identidad entre los alelos V^h1-69 se indica arriba de los cuadros sombreados y el porcentaje de similitud se indica debajo de los cuadros sombreados. Las puntuaciones para el porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud se puntuaron con una herramienta de alineamiento ClustalW (v1.83) utilizando el programa informático MacVector (MacVector, Inc., North Carolina).

La Figura 8 muestra el alineamiento de nucleótidos del segundo exón para cada uno de los cinco alelos informados para el gen V^h1-2 humano. Las bases en minúsculas indican diferencias de nucleótidos en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés) se indican con cuadros alrededor de la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para el alineamiento de secuencia adecuado. V^h1-2*01 (SEQ ID NO: 63); V^h1-2*02 (SEQ ID NO: 65); V^h1-2*03 (SEQ ID NO: 67); V^h1-2*04 (SEQ ID NO: 69); V^h1-2*05 (SEQ ID NO: 71).

La Figura 9 muestra el alineamiento de proteínas de la secuencia génica variable de cadena pesada madura para cada uno de los cinco alelos informados para el gen V^h1-2 humano. Los aminoácidos en minúscula indican diferencias en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés) se indican con cuadros alrededor de la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para el alineamiento de secuencia adecuado. V^h1-2*01 (SEQ ID NO: 64); V^h1-2*02 (SEQ ID NO: 66); V^h1-2*03 (SEQ ID NO: 68); V^h1-2*04 (SEQ ID NO: 70); V^h1-2*05 (SEQ ID NO: 72).

La Figura 10 muestra una matriz de porcentaje de identidad/porcentaje de similitud para las secuencias de proteínas alineadas del gen variable maduro para cada uno de los cinco alelos informados para el gen V^h1-2 humano. El porcentaje de identidad entre los alelos V^h1-2 se indica arriba de los cuadros sombreados y el porcentaje de similitud se indica debajo de los cuadros sombreados. Las puntuaciones para el porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud se puntuaron con una herramienta de alineamiento ClustalW (v1.83) utilizando el programa informático MacVector (MacVector, Inc., North Carolina).

Descripción detallada

Esta invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritas en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos y frases utilizadas en el presente documento incluyen que los términos y las frases que son habituales en la técnica, salvo que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa un término o frase. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales particulares.

La expresión "sustancial" o "sustancialmente" cuando se usa para referirse a una cantidad de segmentos génicos (por ejemplo, "sustancialmente todos" los segmentos génicos V) incluye segmentos génicos tanto funcionales como no funcionales e incluye, en varios aspectos, por ejemplo, un 80 % o más, un 85 % o más, un 90 % o más, un 95 % o más, un 96 % o más, un 97 % o más, un 98 % o más, o un 99 % o más de todos los segmentos génicos; en varios aspectos, "sustancialmente todos" los segmentos génicos incluyen, por ejemplo, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de segmentos génicos funcionales (es decir, no pseudogénicos).

El término "reemplazo" incluye en donde una secuencia de ADN se coloca en el genoma de una célula de tal manera que reemplaza una secuencia dentro del genoma con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón), en el locus de la secuencia genómica. La secuencia de ADN así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte del ADN fuente utilizado para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones no traducidas en 5' o 3', secuencias señal de recombinación apropiadas, etc.). Por ejemplo, en varios aspectos, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ADN así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ^aDⁿque codifica una proteína que tiene una función similar a una proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un gen o dominio de inmunoglobulina, y el fragmento de ADN codifica uno o más genes o dominios humanos de inmunoglobulina). En diversos aspectos, un gen endógeno o fragmento del mismo se sustituye con un gen humano correspondiente o fragmento del mismo. Un gen humano correspondiente o fragmento del mismo es un gen o fragmento humano que es un ortólogo de, un homólogo de, o es sustancialmente idéntico o el mismo en estructura y/o función, que el gen endógeno o fragmento del mismo que se sustituye.

El ratón como modelo genético se ha mejorado en gran medida mediante tecnologías transgénicas y de desactivación, que han permitido el estudio de los efectos de la sobreexpresión o eliminación dirigida de genes específicos. A pesar de todas sus ventajas, el ratón aún presenta obstáculos genéticos que lo convierten en un modelo imperfecto para enfermedades humanas y una plataforma imperfecta para probar tratamientos humanos o hacerlos. Primero, aunque aproximadamente un 99 % de los genes humanos tienen un homólogo de ratón (Waterston et al. 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420:520-562), los posibles tratamientos a menudo fallan en la reacción cruzada o reacción cruzada inadecuada, con ortólogos de ratón de las dianas humanas previstas. Para evitar este problema, los genes diana seleccionados se pueden "humanizar", esto es, el gen de ratón puede eliminarse y reemplazarse por la secuencia génica ortóloga humana correspondiente (por ejemplo, los documentos US 6.586.251, Us 6.596.541 y US 7.105.348). Inicialmente, los esfuerzos para humanizar genes de ratones mediante una estrategia de "humanización de inactivación más transgénica" implicaban cruzar un ratón que portaba una eliminación (es decir, inactivado) del gen endógeno con un ratón que portaba un transgén humano integrado aleatoriamente (véase, por ejemplo, Bril et al., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al., 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3 gamma- and CD3 gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Pero esos esfuerzos se vieron obstaculizados por limitaciones de tamaño; las tecnologías de inactivación convencionales no fueron suficientes para reemplazar directamente los genes grandes de ratón con sus grandes homólogos genómicos humanos. Raramente se intenta un enfoque sencillo de reemplazo homólogo directo, en el que un gen endógeno de ratón se reemplaza directamente por el gen homólogo humano en la misma ubicación genética precisa del gen de ratón (es decir,en el locus endógeno de ratón), debido a dificultades técnicas. Hasta ahora, los esfuerzos de reemplazo directo implicaban procedimientos elaborados y onerosos, lo que limitaba la longitud del material genético que podía manejarse y la precisión con la que podía manipularse.

Los transgenes humanos de inmunoglobulina introducidos exógenamente se reordenan en linfocitos B precursores en ratones (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Este hallazgo fue explotado por ratones genomanipulados utilizando el enfoque inactividad-más-transgénicos para expresar anticuerpos humanos (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). La cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y los loci de cadena ligera ^kse inactivaron en estos ratones mediante la eliminación dirigida de porciones pequeñas pero críticas de cada locus endógeno, seguido de la introducción de loci génicos humanos de inmunoglobulina como grandes transgenes aleatoriamente integrados, como se describió anteriormente, o minicromosomas (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Dichos ratones representaron un avance importante en ingeniería genética; los anticuerpos monoclonales completamente humanos aislados de ellos produjeron un posible tratamiento prometedor para tratar una variedad de enfermedades humanas (Gibson et al., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Pero, tal como se ha tratado anteriormente, estos ratones exhiben un desarrollo comprometido de linfocitos B y deficiencias inmunitarias en comparación con los ratones de tipo silvestre. Dichos problemas potencialmente limitan la capacidad de los ratones para soportar una respuesta humoral vigorosa y, por consiguiente, generar anticuerpos completamente humanos contra algunos antígenos. Las deficiencias pueden deberse a una funcionalidad ineficaz debido a la introducción aleatoria de los transgenes de inmunoglobulina humanos y la expresión incorrecta resultante debido a la falta de elementos de control cadena arriba y cadena abajo (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3' end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851), interacciones entre especies ineficaces entre dominios constantes humanos y componentes de ratón del complejo de señalización del receptor de linfocitos B en la superficie celular, que pueden afectar los procesos de señalización necesarios para la maduración, proliferación y supervivencia normal de linfocitos B (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762), e interacciones entre especies ineficaces entre inmunoglobulinas humanas solubles y receptores de Fc de ratón que podrían reducir la selección de afinidad (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) y concentraciones séricas de inmunoglobulina (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans y Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn y Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Estas deficiencias pueden corregirse mediante la humanización in situ de solo las regiones variables de los loci de inmunoglobulina de ratón dentro de sus ubicaciones naturales en los loci endógenos de cadena pesada y ligera. Esto daría como resultado de manera eficaz ratones que producen anticuerpos "quiméricos inversos" (es decir, V humano:C de ratón) que serían capaces de interacciones y selección normales con el entorno del ratón basándose en la retención de las regiones constantes de ratón. Tomando este enfoque, se puede construir una versión particular de un locus humanizado en función de la complejidad del locus quimérico que se desee. Además, dichos anticuerpos quiméricos inversos pueden reformatearse fácilmente en anticuerpos completamente humanos con fines terapéuticos.

Los animales genéticamente modificados que comprenden una inserción o un reemplazo en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina con secuencias heterólogas de inmunoglobulina (por ejemplo, de otra especie) pueden hacerse junto con inserciones o reemplazos en loci endógenos de cadena ligera de inmunoglobulina o junto con transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, transgenes quiméricos de cadena ligera de inmunoglobulina o completamente humano completamente de ratón, etc.). Las especies de las cuales proceden las secuencias heterólogas de cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar ampliamente; como con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina empleadas en reemplazos de secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina o transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina. Ejemplos de secuencias heterólogas de cadena pesada de inmunoglobulina incluyen secuencias humanas.

Las secuencias de ácido nucleico de región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, segmentos V, D y/o J, se obtienen en diversos aspectos de un animal humano o no humano. Los animales no humanos adecuados para proporcionar segmentos V, D y/o J incluyen, por ejemplo, peces óseos, peces cartilaginosos tales como tiburones y rayas, anfibios, reptiles, mamíferos, aves (por ejemplo, pollos). Los animales no humanos incluyen, por ejemplo, mamíferos. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, primates no humanos, cabras, ovejas, cerdos, perros, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, camellos, hurones y roedores y primates no humanos (por ejemplo, chimpancés, orangutanes, gorilas, titíes, macaco de la India, babuinos). Los animales no humanos adecuados se seleccionan de la familia de roedores que incluyen ratas, ratones y hámsteres. En un aspecto, los animales no humanos son ratones. Como se desprende del contexto, se pueden usar varios animales no humanos como fuentes de dominios variables o segmentos génicos de región variable (por ejemplo, tiburones, rayas, mamíferos, por ejemplo, camellos, roedores tales como ratones y ratas).

De acuerdo con el contexto, los animales no humanos también se usan como fuentes de secuencias de región constante para usarse en conexión con secuencias o segmentos variables, por ejemplo, secuencias constantes de roedores se pueden usar en transgenes unidos operativamente a secuencias variables humanas o no humanas (por ejemplo, secuencias variables de primates humanas o no humanas unidas operativamente a, por ejemplo, secuencias constantes de roedor, por ejemplo, ratón o rata o hámster). Por lo tanto, en varios aspectos, los segmentos V, D y/o J humanos están unidos operativamente a secuencias génicas de región constante de roedores (por ejemplo, ratones, ratas o hámsteres). En algunos aspectos, los segmentos V, D y/o J humanos (o uno o más genes VDJ o VJ reordenados) están unidos operativamente o fusionados a una secuencia génica de región constante de ratón, rata o hámster en, por ejemplo, un transgen integrado en un locus que no es un locus endógeno de inmunoglobulina.

En un aspecto específico, se describe un ratón que comprende un reemplazo de segmentos génicos V^h, D^hy J^hen un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina con un único V^hhumano, uno o más D^h, y uno o más segmentos génicos J^h, en donde el único V^hhumano, el uno o más D^h, y el uno o más segmentos génicos J^hestán unidos operativamente a un gen endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina; en donde el ratón comprende un transgen en un locus distinto de un locus endógeno de inmunoglobulina, en donde el transgén comprende un segmento génico V^lhumano y J^lhumano no reordenado o reordenado unido operativamente a una región constante de ratón o rata o humana. En diversos aspectos, el único segmento génico V^hhumano es un segmento génico polimórfico. En un aspecto, el único segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-69 humano o un segmento génico V^h1-2 humano.

Se describe un método para el reemplazo genético in situ del locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal de ratón con un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana y el reemplazo de los loci génicos variables de cadena ligera ^kde inmunoglobulina de la línea germinal de ratón con loci de cadena ligera k de inmunoglobulina de la línea germinal humana, mientras que se mantiene la capacidad de los ratones para generar descendencia. Específicamente, se describe el reemplazo preciso de seis megabases de los loci génicos variables de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón con secuencias humanas de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina, mientras se dejan intactas las regiones constantes del ratón. Como resultado, se han creado ratones que tienen un reemplazo preciso de todo su repertorio variable de inmunoglobulina de línea germinal con secuencias variables de inmunoglobulina de línea germinal humana, mientras se mantienen regiones constantes de ratón. Las regiones variables humanas están unidas a regiones constantes de ratón para formar loci quiméricos de ratón-humano de inmunoglobulina que se reordenan y expresan a niveles fisiológicamente apropiados. Los anticuerpos expresados son "quimeras inversas", es decir, comprenden secuencias de región variable humana y secuencias de región constante de ratón.

Los ratones genéticamente modificados descritos en el presente documento exhiben un sistema inmunitario humoral completamente funcional y proporcionan una fuente abundante de secuencias humanas de región variable de inmunoglobulina maduradas por afinidad natural para producir anticuerpos farmacéuticamente aceptables y otras proteínas de unión a antígeno que son eficaces para combatir antígenos patógenos, por ejemplo, antígenos víricos. La genomanipulación de secuencias humanas de inmunoglobulina en el genoma de un ratón, incluso en ubicaciones precisas, por ejemplo, en los loci endógenos de inmunoglobulina de ratón, puede presentar determinados desafíos debido a la evolución divergente de los loci de inmunoglobulina entre el ratón y el hombre. Por ejemplo, las secuencias intergénicas intercaladas dentro de los loci de inmunoglobulina no son idénticas entre ratones y seres humanos y, en algunas circunstancias, pueden no ser funcionalmente equivalentes. Las diferencias entre ratones y seres humanos en sus loci de inmunoglobulina aún pueden dar como resultado anormalidades en ratones humanizados, particularmente cuando se humanizan o manipulan determinadas porciones de loci endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Algunas modificaciones en los loci de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón son perjudiciales. Las modificaciones perjudiciales pueden incluir, por ejemplo, la pérdida de la capacidad de los ratones modificados para aparearse y producir descendencia. En diversos aspectos, la genomanipulación de secuencias humanas de inmunoglobulina en el genoma de un ratón incluye métodos que mantienen secuencias endógenas que, cuando están ausentes en cepas de ratón modificadas, son perjudiciales. Los efectos perjudiciales ejemplares pueden incluir la incapacidad de propagar cepas modificadas, la pérdida de la función de genes esenciales, la incapacidad de expresar polipéptidos, etc. Dichos efectos perjudiciales pueden estar relacionados directa o indirectamente con la modificación diseñada en el genoma del ratón.

A pesar de la función inmunitaria humoral casi de tipo silvestre observada en ratones con loci humanizados de inmunoglobulina, existen otros desafíos encontrados cuando se emplea un reemplazo directo de secuencias de inmunoglobulina que no se encuentran en algunos enfoques que emplean transgenes integrados aleatoriamente. Las diferencias en la composición genética de los loci de inmunoglobulina entre ratones y seres humanos ha conducido al descubrimiento de secuencias beneficiosas para la propagación de ratones con segmentos génicos reemplazados de inmunoglobulina. Específicamente, los genes ADAM de ratón ubicados dentro del locus endógeno de inmunoglobulina están presentes de manera óptima en ratones con loci reemplazados de inmunoglobulina, debido a su papel en la fertilidad.

Se realizó un reemplazo preciso e in situ de seis megabases de las regiones variables de los loci de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (V^h-D^h-J^h) con un locus humano restringido de cadena pesada de inmunoglobulina, dejando las secuencias de ratón flanqueantes intactas y funcionales dentro de loci híbridos, que incluyen todos los genes de cadena constante de ratón y regiones de control transcripcional de locus (Figura 1 y Figura 8). Se realizaron etapas de genomanipulación adicionales para mantener secuencias de ratón que confieren al ratón la capacidad de aparearse y producir descendencia de una manera comparable a un ratón de tipo silvestre (Figura 9 y Figura 10). Específicamente, se introdujeron un único V^hhumano, 27 D^h, y seis segmentos génicos J^hy genes ADAM6 de ratón a través de vectores de direccionamiento BAC quiméricos en células ME de ratón usando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).

Ratones con segmentos génicos restringidos variables de cadena pesada de inmunoglobulina

Se describen animales no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina que comprenden un número restringido de genes V^h, y uno o más genes D y uno o más genes J, al igual que los métodos para fabricarlos y usarlos. Cuando se inmunizan con un antígeno de interés, los animales no humanos generan poblaciones de linfocitos B con regiones variables de anticuerpo procedentes solo del gen V^hrestringido y preseleccionado o de un conjunto de genes V^h(por ejemplo, un gen V^hpreseleccionado y sus variantes). En diversos aspectos, se describen animales no humanos que generan poblaciones de linfocitos B que expresan dominios variables de anticuerpos humanos que son dominios humanos variables de cadena pesada, junto con dominios humanos variables de cadena ligera afines. En diversos aspectos, los animales no humanos reordenan segmentos génicos humanos variables de cadena pesada y segmentos génicos humanos variables de cadena ligera a partir de loci endógenos modificados de inmunoglobulina de ratón que comprenden un reemplazo o inserción de las secuencias de región variable no reordenadas no humanas con secuencias de región variable no reordenadas humanas.

Los primeros trabajos sobre la organización, estructura y función de los genes de inmunoglobulina se realizaron en parte en ratones con loci endógenos inactivados y se genomanipularon para tener loci transgénicos (colocados aleatoriamente) con genes humanos parciales de inmunoglobulina, por ejemplo, un repertorio parcial de genes humanos de cadena pesada unido con un gen constante humano, insertado aleatoriamente en el genoma, en presencia o ausencia de un transgén humanos de cadenas ligera. Aunque estos ratones eran algo menos que óptimos para producir anticuerpos útiles de alta afinidad, facilitaron determinados análisis funcionales de loci de inmunoglobulina. Algunos de estos ratones tenían tan solo dos o tres, o incluso un único, gen variable de cadena pesada.

Los ratones que expresan cadenas pesadas de inmunoglobulina completamente humanas procedentes de un único gen V^h5-51 humano y 10 genes D^hhumanos y seis genes J^hhumanos, con genes constantes humanos p y y1, en un transgen insertado aleatoriamente (y loci endógenos inactivados de inmunoglobulina) se han informado (Xu y Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37-45). Las cadenas pesadas de inmunoglobulina completamente humanas de estos ratones se expresan principalmente con una de las dos cadenas ligeras A completamente de ratón procedentes del locus endógeno de cadena ligera A de ratón (solo VA1-JA1 o VA2-JA2), y no pueden expresar ninguna cadena ligera k (los ratones son IgK-/"). Estos ratones exhiben disfunción severamente anormal en el desarrollo de linfocitos B y la expresión de anticuerpos. Según se informa, los números de linfocitos B son un 5-10 % de los tipos de tipo silvestre, los niveles de IgM un 5-10 % de los de tipo silvestre, y los niveles de IgG1 son solo un 0,1-1 % de los de tipo silvestre. El repertorio de IgM observado reveló una diversidad de unión altamente restringida. Las cadenas pesadas completamente humanas muestran una longitud de CDR3 en gran medida idéntica en todos los antígenos, el mismo uso de JH (JH2) en todos los antígenos y un resto Q de unión inicial, lo que refleja una determinada falta de diversidad de CDR3. Las cadenas ligeras A completamente de ratón casi todas tenían una sustitución W96L en JA1 como resto de unión inicial. Según los informes, los ratones no pueden generar ningún anticuerpo contra el polisacárido bacteriano. Debido a que los dominios variables humanos se acoplan con cadenas ligeras de ratón, la utilidad de las regiones variables humanas es muy limitada.

Se han informado de otros ratones que tienen un único gen humano V^h3-23, genes humanos D^hy J^hy genes de cadena ligera de ratón, pero exhiben una diversidad limitada (y, por lo tanto, una utilidad limitada) debido en parte al posible mal emparejamiento entre dominios V^hhumanos y V^lde ratón (véase, por ejemplo, Mageed et al., 2001, Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Clin. Exp. Immunol. 123:1-5). Del mismo modo, los ratones que llevan dos genes V^h(3-23 y 6-1) junto con los genes humanos D^hy J^hen un transgen que contiene el gen humano constante p (Bruggemann et al., 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100kb of the human IgH locus, Eur. J. Immmunol. 21:1323-1326) y los expresan en cadenas IgM humanas con cadenas ligeras de ratón pueden exhibir un repertorio limitado por mal emparejamiento (Mackworth-Young et al., 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420-425).

También se han informado de otros ratones transgénicos que expresan cadenas pesadas totalmente humanas restringidas a VH a partir de un transgen humano insertado aleatoriamente en el genoma, con un repertorio A humano limitado expresado a partir de un transgen insertado aleatoriamente completamente humano, (véase, por ejemplo, Taylor et al., 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res. 20(23):6287-6295; Wagner et al., 1994, Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8):1389-1393). Sin embargo, se sabe que los ratones transgénicos que expresan anticuerpos completamente humanos a partir de transgenes integrados aleatoriamente en el genoma de ratón, y que comprenden loci endógenos dañados, exhiben diferencias sustanciales en la respuesta inmunitaria en comparación con los ratones de tipo silvestre que afectan la diversidad de los dominios variables de anticuerpo obtenibles a partir de dicho ratón.

Los animales no humanos útiles que generan una población diversa de linfocitos B que expresan dominios variables de anticuerpos humanos a partir de un repertorio génico restringido V^hy uno o más genes D y uno o más genes J serán capaces de generar, preferentemente en algunos aspectos, repertorios de genes de región variable reordenados que serán suficientemente variados. En diversos aspectos, la diversidad incluye diversidad de unión, hipermutación somática y diversidad polimórfica en la secuencia génica V^h(para aspectos en donde los genes V^hestán presentes en formas polimórficas). La diversidad combinatoria ocurre en el emparejamiento del gen V^hcon uno de una pluralidad de dominios humanos variables de cadena ligera afines (que, en varios aspectos, comprenden diversidad de unión y/o hipermutaciones somáticas).

Los animales no humanos que comprenden un repertorio génico V^hhumanos restringidos y un repertorio génico V^lhumano completo o sustancialmente completo generarán, en diversos aspectos, poblaciones de linfocitos B que reflejan las diversas fuentes de diversidad, como la diversidad de unión (por ejemplo, VDJ, unión VJ, adiciones P, adiciones N), diversidad combinatoria (por ejemplo, cadenas ligeras humanas, cadenas pesadas humanas restringidas a V^hafines) e hipermutaciones somáticas. En aspectos que comprenden una restricción del repertorio de VH a un gen VH humano, el gen VH humano puede estar presente en dos o más variantes. En diversos aspectos, la presencia de dos o más formas polimórficas de un gen V^henriquecerá la diversidad de los dominios variables de la población de linfocitos B.

Las variaciones en las secuencias de la línea germinal de los segmentos génicos (por ejemplo, genes V) contribuyen a la diversidad de la respuesta de anticuerpos en seres humanos. La contribución relativa a la diversidad debido a las diferencias en la secuencia génica V varía entre los genes V.

El grado de polimorfismo varía entre las familias de genes y se refleja en una pluralidad de haplotipos (tramos de secuencia con polimorfismos heredados conjuntamente) capaces de generar una mayor diversidad como se observa en las diferencias de haplotipos V^hentre individuos relacionados y no relacionados en la población humana (véase, por ejemplo, Souroujon et al., 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VHIII Gene Family, J. Immunol. 143(2):706-711). Algunos han sugerido, en base a datos de familias de genes V^hhumanos polimórficos particularmente, que la diversidad de haplotipos en la línea germinal es un contribuyente importante a la heterogeneidad génica V^hen la población humana, que se refleja en la gran diversidad de diferentes genes V^hde línea germinal en la población humana (véase, Sasso et al., 1990, Prevalence and Polymorphism of Human VH3 Genes, J. Immunol. 145(8):2751-2757).

Aunque la población humana muestra una gran diversidad de haplotipos con respecto al repertorio génico V^hdebido al polimorfismo generalizado, determinados polimorfismos se reflejan en alelos prevalentes (es decir, conservados) observados en la población humana (Sasso et al., 1990). El polimorfismo de V^hse puede describir en dos formas principales. La primera es la variación que surge de la variación alélica asociada con diferencias entre la secuencia de nucleótidos entre alelos del mismo segmento génico. La segunda surge de las numerosas duplicaciones, inserciones y/o deleciones que se han producido en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina. Esto ha dado como resultado una situación única en la que los genes V^hprocedentes mediante duplicación de genes idénticos difieren de sus alelos respectivos por una o más sustituciones de nucleótidos. Esto también influye directamente en el número de copias de genes VH en el locus de cadena pesada.

Los alelos polimórficos de los segmentos génicos humanos variables de cadena pesada de inmunoglobulina (genes V^h) han sido en gran parte el resultado de la inserción/eliminación de segmentos génicos y diferencias de un único nucleótido dentro de las regiones codificantes, los cuales tienen el potencial de tener consecuencias funcionales en la molécula de inmunoglobulina. La Tabla 1 expone los genes V^hfuncionales enumerados por la familia de genes V^hhumanos y el número de alelos identificados para cada gen V^hen el locus humano de cadena pesada de inmunoglobulina. Hay algunos hallazgos que sugieren que los genes V^hpolimórficos han sido implicados en la susceptibilidad a determinadas enfermedades tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, mientras que en otros casos un vínculo entre V^hy una enfermedad ha sido menos claro. Esta ambigüedad se ha atribuido al número de copias y la presencia de varios alelos en diferentes poblaciones humanas. De hecho, varios genes V^hhumanos demuestran una variación en el número de copias (por ejemplo, V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2 -70, y V^h3 -23). En diversos aspectos, los ratones humanizados como se describen en el presente documento con repertorios de VH restringidos comprenden múltiples variantes polimórficas de un miembro de la familia del único V^h(por ejemplo, dos o más variantes polimórficas de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2 -70 o V^h3 -23, que reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos funcionales V^hde ratón en un locus endógeno de ratón. En un aspecto específico, las dos o más variantes polimórficas de ratones descritas en el presente documento están en número hasta e incluyendo el número indicado para el miembro de la familia V^hcorrespondiente en la Tabla 1 (por ejemplo, para V^h1-69, 13 variantes; para V^h1-2, cinco variantes; etc.).

Las variantes comúnmente observadas de genes V^hhumanos particulares se conocen en la materia. Por ejemplo, uno de los polimorfismos más complejos en el locus V^hpertenece al gen V^h1-69. El gen humano V^h1-69 tiene 13 alelos informados (Sasso et al., 1993, A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alleles, Journal of Clinical Investigation 91:2358-2367; Sasso et al., 1996, Expression of the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080) y existe en al menos tres haplotipos que llevan duplicaciones del gen V^h1-69, lo que da como resultado múltiples copias del gen VH en un locus dado. Estos alelos polimórficos incluyen diferencias en las regiones determinantes de complementariedad (CDR), que pueden influir dramáticamente en la especificidad del antígeno. La Tabla 2 establece los alelos informados para los genes V^h1-69 humanos y V^h1-2 humanos y las SEC ID NO para las secuencias de ADN y proteínas de las regiones variables maduras de cadena pesada.

El ADN genómico representativo y las secuencias de proteínas de longitud completa de un gen V^h1-69 se exponen en la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5, respectivamente. La Figura 5 y la Figura 6 establecen alineamientos de ADN y proteínas de trece alelos V^h1-69 informados, respectivamente. Las secuencias de ADN y proteínas representativas de un gen V^h1-2 se exponen en la SEQ ID NO: 63 y la SEQ ID NO: 64, respectivamente. La Figura 8 y la Figura 9 establecen alineamientos de ADN y proteínas de cinco alelos V^h1-2 informados, respectivamente. La Figura 7 y la Figura 10 establecen una matriz de porcentaje de identidad/similitud para secuencias de proteínas alineadas que corresponden a trece alelos V^h1-69 humanos informados y cinco alelos V^h1-2 humanos informados, respectivamente. En diversos aspectos, el locus modificado descrito en el presente documento comprende un gen V^hseleccionado de la Tabla 1, presente en dos o más números de copias, en donde el número de copias incluye hasta e incluye el número de alelos mostrados en la Tabla 1. En un aspecto, el locus modificado descrito en el presente documento comprende un gen V^h1-69 o V^h1-2 seleccionado de la Tabla 2, presente en dos o más números de copias, en donde el número de copias incluye hasta e incluye el número de alelos mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1

Familia V^hGen Vh Alelos

1-2 5

1-3 2

1-8 2

1-18 3

Familia V^h1 1-24 1

1-45 3

1-46 3

1-58 2

1-69 13

2-5 10

Familia V^h2 2-26 1

2-70 13

3-7 3

3-9 2

3-11 4

3-13 4

3-15 8

3-16 2

3-20 1

3-21 4

3-23 5

3-30 19

3-30-3 2

Familia V_h3 ^3-3

_3-3 ⁰

₃ ^-51

6

3-35 1

3-38 2

3-43 2

3-48 4

3-49 5

3-53 4

3-64 5

3-66 4

3-72 2

3-73 2

3-74 3

4-4 7

Familia V^h4 ^{4-28 6}

_{4-30-1 1}

4-30-2 5

4-30-4 6

4-31 10

4-34 13

4-39 7

4-59 10

4-61 8

Familia V^h5 5-51 5

Familia V^h6 6-1 2

7-4-1 5

Familia V^h7 7-81 1

Tabla 2

Alelo IgHV1-69 Número de acceso SEQ ID NO: (ADN/Proteína) IgHV1-69*01 L22582 37/38

IgHV1-69*02 Z27506 39/40

IgHV1-69*03 X92340 41/42

(continuación)

Alelo IgHV1-69 Número de acceso SEQ ID NO: (ADN/Proteína) IgHV1-69*04 M83132 43/44

IgHV1-69*05 X67905 45/46

IgHV1-69*06 L22583 47/48

IgHV1-69*07 Z29978 49/50

IgHV1-69*08 Z14309 51/52

IgHV1-69*09 Z14307 53/54

IgHV1-69*10 Z14300 55/56

IgHV1 -69*11 Z14296 57/58

IgHV1-69*12 Z14301 59/60

IgHV1-69*13 Z14214 61/62

Alelo IgHV1-2 Número de acceso SEQ ID NO: (ADN/Proteína) IgHV1-2*01 X07448 63/64

IgHV1-2*02 X62106 65/66

IgHV1-2*03 X92208 67/68

IgHV1-2*04 Z12310 69/70

IgHV1-2*05 HM855674 71/72

Uso de genes variables de cadena pesada dependiente de antígeno

El uso preferencial dependiente de antígeno de los genes V^hpuede explotarse en el desarrollo de tratamientos humanos dirigidos a antígenos clínicamente significativos. La capacidad de generar un repertorio de dominios variables de anticuerpos usando un gen V^hparticular puede proporcionar una ventaja significativa en la búsqueda de dominios variables de anticuerpos de alta afinidad para usar en tratamientos humanos. Los estudios sobre el uso de genes V^hde ratones y humanos indiferenciados en dominios variables de anticuerpos revelan que la mayoría de los dominios variables de cadena pesada no proceden de ningún gen V^hparticularmente único o utilizado de forma dominante. Por otro lado, los estudios de respuesta de anticuerpos a determinados antígenos revelan que, en algunos casos, una respuesta de anticuerpos particular muestra un uso sesgado de un gen VH particular en el repertorio de linfocitos B después de la inmunización.

Aunque el repertorio de V^hhumano es bastante diverso, según algunas estimaciones, la frecuencia esperada de uso de cualquier gen V^hdado, suponiendo una selección aleatoria de genes V^h, es de aproximadamente un 2 % (Brezinschek et al., 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunol. 155:190-202). Pero el uso de V^hen linfocitos B periféricos en seres humanos está sesgado. En un estudio, la abundancia del gen V funcional siguió el patrón V^h3 > V^h4 > V^h1 > V^h2 > V^h5 > V^h6 (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). Un estudio inicial estimó que la frecuencia de uso de la familia VH3 era de aproximadamente 0,65, mientras que la frecuencia de uso de la familia de V^h1 era de aproximadamente 0,15; estas y otras observaciones sugieren que la complejidad de la línea germinal del repertorio V^hhumano no se refleja con precisión en el compartimento de linfocitos B periféricos en seres humanos que tienen un repertorio V^hde línea germinal normal, una situación similar a la observada en el ratón, es decir, la expresión génica de V^hno es estocástica (Zouali y These, 1991, Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization, J.

Immunol. 146(8):2855-2864). De acuerdo con un informe, el uso del gen V^hen seres humanos, de mayor a menor, es V^h3 > V^h4 > V^h1 > V^h5 > V^h2 > V^h6; los reordenamientos en los linfocitos B periféricos revelan que el uso de la familia V^h3 es más alto de lo esperado en función del número relativo de genes V^h3 de la línea germinal (Brezinschek et al., 1995). De acuerdo con otro informe, el uso de V^hen seres humanos sigue el patrón V^h3 > V^h5 > V^h2 > V^h1 > V^h4 > V^h6, basado en el análisis de linfocitos B pequeños inmunocompetentes periféricos activados por mitógeno de hierba carmín (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). Un informe afirma que entre los miembros de la familia V^h3 más utilizados se encuentran 3-23, 3-30 y 3-54 (Brezinschek et al., 1995). En la familia V^h4, los miembros 4-59 y 4-4b se encontraron con mayor frecuencia (Id.), así como 4-39 y 4-34 (Brezinscheck et al., 1997, Analysis of the Human VH Gene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488-2501). Otros postulan que el repertorio de cadena pesada activado está sesgado a favor de una alta expresión de V^h5 y una menor expresión de V^h3 (Van Dijk-Hard y Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107:136-144). Otros estudios afirman que el gen V^hmás utilizado en el repertorio humano adulto es V^h4-59, seguido de V^h3-23 y V^h3-48 (Arnaout et al., 2001, High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE 6(8):108). Aunque los estudios de uso se basan en números de muestras relativamente pequeños y, por lo tanto, presentan una gran variación, en conjunto, los estudios sugieren que la expresión del gen V no es puramente estocástica. De hecho, estudios con antígenos particulares han establecido que, en determinados casos, el conjunto está firmemente apilado contra determinados usos y en favor de otros.

Con el paso del tiempo, se hizo evidente que el repertorio observado de dominios variables de cadena pesada humanos generados en respuesta a determinados antígenos está altamente restringido. Algunos antígenos se asocian casi exclusivamente con anticuerpos neutralizantes que tienen solo determinados genes V^hparticulares, en el sentido de que los anticuerpos neutralizantes eficaces proceden esencialmente de un único gen V^h. Tal es el caso de una serie de patógenos humanos clínicamente importantes.

Se han observado cadenas pesadas procedentes de V^h1-69 en una variedad de repertorios de anticuerpos específicos de antígeno de importancia terapéutica. Por ejemplo, V^h1-69 se observó con frecuencia en las transcripciones de cadena pesada de un repertorio de IgE de linfocitos de sangre periférica en niños pequeños con enfermedad atópica (Bando et al., 2004, Characterization of VHe gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous VH1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99-106). Las cadenas pesadas procedentes de V^h1-69 con un alto grado de hipermutación somática también se producen en los linfomas de linfocitos B (Pérez et al., 2009, Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments, British Journal of Dermatology 162:611-618), mientras que algunas cadenas pesadas procedentes de V^h1-69 con secuencias esencialmente de línea germinal (es decir, hipermutación somática escasa o nula) se han observado entre autoanticuerpos en pacientes con trastornos sanguíneos (Pos et al., 2008, VH1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421-428).

Adicionalmente, se ha descubierto que los anticuerpos neutralizantes contra antígenos víricos como el VIH, la gripe y la hepatitis C (VHC) utilizan secuencias procedentes de la línea germinal y/o de V^h1-69 mutadas somáticamente (Miklos et al., 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of V1-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878-3884; Kunert et al., 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20(7):755-762; Chan et al., 2001, VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4):1023-1026; Carbonari et al., 2005, Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174:6532-6539; Wang y Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):233-234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):265-273; Marasca et al., 2001, Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C VirusNegative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1):253-261).

El sesgo de uso de V^htambién se observa en la respuesta inmunitaria humoral a Haemophilus influenzae tipo b (Hib PS) en seres humanos. Los estudios sugieren que la familia V^hIII (la subfamilia VHmb en particular, V^h9.1) caracteriza exclusivamente la respuesta humoral humana a Hib PS, con diversos genes D y J (Adderson et al., 1991, Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5):1667-1674; Adderson et al., 1993, Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest. 91:2734-2743). Los genes J^hhumanos también muestran un uso sesgado; J^h4 y J^h6 se observan a aproximadamente un 38-41 % en linfocitos B periféricos en seres humanos (Brezinschek et al., 1995).

El uso de V^hen seres humanos infectados con VIH-1 está sesgado contra el uso de V^h3 y está a favor de las familias de genes V^h1 y V^h4 (Wisnewski et al., 1996, Human Antibody Variable Region Gene Usage in HIV-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviology 11(1): 31-38). Sin embargo, el análisis de ADNc de la médula ósea de pacientes afectados reveló un uso significativo de V^h3 no expresado en el repertorio funcional de linfocitos B, donde los Fabs que reflejan el uso de V^h3 exhibieron una neutralización in vitro eficaz del VIH-1 (Id.). Podría postularse que la respuesta inmunitaria humoral a la infección por VIH-1 posiblemente se atenúa debido a la restricción de V^h; los animales no humanos modificados como se describe en el presente documento (no infectables por VIH-1) podrían ser útiles para generar dominios de anticuerpos neutralizantes procedentes de genes V^hparticulares presentes en los animales genéticamente modificados descritos en el presente documento, pero procedentes de genes V^hdiferentes a los observados en el repertorio restringido de seres humanos afectados.

Por lo tanto, la capacidad de generar dominios variables de anticuerpos humanos de alta afinidad en ratones con restricción de V^h, por ejemplo, (restringido, por ejemplo, a un miembro de la familia de V^h3 y sus polimorfos) inmunizados con VIH-1 podría proporcionar un recurso rico para diseñar tratamientos humanos neutralizantes del VIH-1 eficaces mediante la extracción minuciosa del repertorio restringido (por ejemplo, restringido a un miembro de la familia V^h3 o sus variante(s)) de dicho ratón inmunizado.

La restricción de la respuesta de anticuerpos humanos a determinados patógenos puede reducir la probabilidad de obtener regiones variables de anticuerpos de seres humanos afectados que pueden servir como trampolines para diseñar anticuerpos neutralizantes de alta afinidad contra el patógeno. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria humana a la infección por VIH-1 está restringida clonalmente a lo largo de la infección por VIH-1 y hacia la progresión del SIDA (Muller et al., 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol. 38:327-334; Wisnewski et al., 1996). Adicionalmente, los genes V^hen general no están presentes en todas las formas polimórficas en los individuos; determinados individuos en determinadas poblaciones poseen una variante, mientras que los individuos en otras poblaciones poseen una variante diferente. Por lo tanto, la disponibilidad de un sistema biológico que está restringido a un único gen V^hy sus variantes proporcionará, en varios aspectos, una fuente de diversidad hasta ahora no explotada para generar regiones variables de anticuerpos (por ejemplo, dominios humanos de cadena pesada y ligera afines) basados en un gen V^hrestringido.

Los ratones genéticamente modificados que expresan regiones variables de cadena pesada humanas con un uso restringido del segmento génico V^hson útiles para generar un repertorio relativamente grande de regiones humanas variables de cadena pesada de inmunoglobulina de alta afinidad con unión diversa, combinatoriamente diversa y somáticamente mutadas de un repertorio restringido de otro modo. Un repertorio restringido, en este caso, se refiere a una limitación predeterminada en genes de la línea germinal que da como resultado que el ratón no pueda formar un gen de cadena pesada reordenado que proceda de cualquier gen V que no sea un gen V preseleccionado. En aspectos que emplean un gen V preseleccionado pero no un gen D y/o J preseleccionado, el repertorio está restringido con respecto a la identidad del gen V pero no del gen D y/o J. La identidad del gen V preseleccionado (y cualquier gen D y/o J preseleccionado) no se limita a ningún gen V particular.

El diseño de un ratón para que reordene un único gen V^h(presente como un único segmento o un conjunto de variantes) con una variedad de segmentos génicos D y J humanos (por ejemplo, segmentos D^hy J^h) proporciona una máquina de permutación de diversidad de unión in vivo/diversidad combinatoria/hipermutación somática que se puede utilizar para iterar mutaciones en secuencias resultantes de región variable de cadena pesada reordenadas (por ejemplo, V/D/J o V/J, según sea el caso). En dicho ratón, el proceso de selección clonal opera para seleccionar regiones variables adecuadas que se unen a un antígeno de interés que se basa en un único gen V^hpreseleccionado (o variantes del mismo). Debido a que los componentes de selección clonal del ratón están dedicados a la selección basada en el único segmento génico V^hpreseleccionado, el ruido de fondo se erradica en gran medida. Con una selección juiciosa del segmento génico V^h, se puede seleccionar un número relativamente mayor de anticuerpos específicos de antígeno seleccionados clonalmente en un período de tiempo más corto que con un ratón con una gran diversidad de segmentos V.

La preselección y la restricción de un ratón a un único segmento V proporciona un sistema para permutar las uniones V/D/J a una velocidad que es, en varios aspectos, más alta que la observada en ratones que de otro modo tendrían hasta 40 o más segmentos V para recombinar con regiones D y J. La eliminación de otros segmentos V libera el locus para formar más combinaciones V/D/J para el segmento V preseleccionado que lo observado de otra manera. El mayor número de transcripciones que resultan de la recombinación del V preseleccionado con uno de una pluralidad de D y uno de una pluralidad de segmentos J alimentará esas transcripciones en el sistema de selección clonal en forma de prelinfocitos B, y el sistema de selección clonal está así dedicado al ciclo de linfocitos B que expresan la región V preseleccionada. De esta forma, el organismo puede seleccionar más regiones V únicas procedentes del segmento V preseleccionado de lo que sería posible en un período de tiempo dado.

En diversos aspectos, se describen ratones que mejoran la diversidad de unión de las recombinaciones V/D para la región V preseleccionada, porque todas o sustancialmente todas las recombinaciones del locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina serán del segmento V preseleccionado y los segmentos D y J que se colocan en dichos ratones. Por lo tanto, los ratones proporcionan un método para generar una diversidad de segmentos CDR3 usando una base o un repertorio de genes V^hrestringido.

Ubicación genómica y función del ratón ADAM6

Los ratones machos que carecen de la capacidad de expresar cualquier proteína ADAM6 funcional exhiben sorprendentemente un defecto en la capacidad de los ratones para aparearse y generar descendencia. Los ratones carecen de la capacidad de expresar una proteína ADAM6 funcional en virtud de un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina de ratón con segmentos génicos humanos de región variable. La pérdida de la función ADAM6 se debe a que el locus ADAM6 se ubica dentro de una región del locus génico endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, proximal al extremo 3' del locus del segmento génico V^hque está cadena arriba de los segmentos génicos D^h. Con el fin de reproducir ratones que sean homocigotos para un reemplazo de todas o sustancialmente todas las secuencias endógenas variables de cadena pesada de ratón con una secuencia restringida de cadena pesada humana, generalmente es un enfoque engorroso establecer machos y hembras que sean homocigotos para la secuencia humana restringida de cadena pesada y aguardan un apareamiento productivo. Las camadas exitosas son bajas en frecuencia y tamaño. En cambio, los machos heterocigotos para la secuencia humana restringida de cadena pesada se han empleado para aparearse con hembras homocigotas para el reemplazo para generar una progenie que sea heterocigota para la secuencia humana restringida de cadena pesada, criándose luego un ratón homocigoto a partir de la misma. Los inventores han determinado que la causa probable de la pérdida de fertilidad en los ratones machos es la ausencia en los ratones machos homocigotos de una proteína ADAM6 funcional.

En diversos aspectos, los ratones machos que comprenden un gen ADAM6 dañado (es decir, no funcional o marginalmente funcional) exhiben una reducción o eliminación de la fertilidad. Debido a que en los ratones (y otros roedores) el gen ADAM6 se ubica en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina, los inventores han determinado que para propagar ratones, o crear y mantener una cepa de ratones, que comprende un locus humanizado de cadena pesada de inmunoglobulina, se emplean varios esquemas de reproducción o propagación modificados. La baja fertilidad, o infertilidad, de ratones machos homocigotos para un locus génico humanizado variable de cadena pesada de inmunoglobulina hace que sea difícil mantener dicha modificación en una cepa de ratón. En diversos aspectos, mantener la cepa comprende evitar los problemas de infertilidad exhibidos por los ratones machos homocigotos para el locus humanizado de cadena pesada.

En un aspecto, se describe un método para mantener una cepa de ratón como se describe en el presente documento. La cepa de ratón no necesita comprender una secuencia ectópica ADAM6 y, en varios aspectos, la cepa de ratón es homocigota o heterocigota para una inactivación (por ejemplo, una inactivación funcional) de ADAM6. La cepa de ratón comprende una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina que da como resultado una reducción o pérdida de fertilidad en un ratón macho. En un aspecto, la modificación comprende una eliminación de una región reguladora y/o una región codificante de un gen ADAM6. En un aspecto específico, la modificación comprende una modificación de un gen ADAM6 endógeno (región reguladora y/o codificante) que reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que comprende la modificación; en un aspecto específico, la modificación reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que es homocigoto para la modificación.

En un aspecto, la cepa de ratón es homocigota o heterocigota para una inactivación (por ejemplo, una inactivación funcional) o una eliminación de un gen ADAM6.

En un aspecto, la cepa de ratón se mantiene mediante el aislamiento de un ratón que es homocigoto o heterocigoto para la modificación de una célula, y el empleo de la célula donante en el embrión hospedador, y la gestación del embrión hospedador y la célula donante en una madre sustituta, y la obtención a partir de la madre sustituta de una progenie que comprende la modificación genética. En un aspecto, la célula donante es una célula ME. En un aspecto, la célula donante es una célula pluripotente, por ejemplo, una célula pluripotente inducida.

En un aspecto, la cepa de ratón se mantiene mediante el aislamiento de un ratón que es homocigoto o heterocigoto para la modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende la modificación, y la introducción de la secuencia de ácido nucleico en un núcleo hospedadora, y la gestación de una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico y el núcleo hospedador en un animal adecuado. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico se introduce en un embrión de ovocito hospedador.

En un aspecto, la cepa de ratón se mantiene mediante el aislamiento de un ratón que es homocigoto o heterocigoto para la modificación de un núcleo, y la introducción del núcleo en una célula hospedadora, y la gestación del núcleo y la célula hospedadora en un animal adecuado para obtener una progenie que es homocigota o heterocigota para la modificación.

En un aspecto, la cepa de ratón se mantiene mediante el empleo de la fertilización in vitro (FIV) de un ratón hembra (tipo silvestre, homocigoto para la modificación, o heterocigoto para la modificación) que emplea un espermatozoide de un ratón macho que comprende la modificación genética. En un aspecto, el ratón macho es heterocigoto para la modificación genética. En un aspecto, el ratón macho es homocigoto para la modificación genética.

En un aspecto, la cepa de ratón se mantiene mediante la cría de un ratón macho que es heterocigoto para la modificación genética con un ratón hembra para obtener una progenie que comprende la modificación genética, la identificación de una progenie masculina y una hembra que comprende la modificación genética, y el empleo de un macho que es heterocigoto para la modificación genética en una cría con una hembra que es de tipo silvestre, homocigota o heterocigota para la modificación genética para obtener la progenie que comprende la modificación genética. En un aspecto, la etapa de criar un macho heterocigoto para la modificación genética con una hembra de tipo silvestre, una hembra heterocigota para la modificación genética, o una hembra homocigota para la modificación genética se repite para mantener la modificación genética en la cepa de ratón.

En un aspecto, se describe un método para mantener una cepa de ratón que comprende un reemplazo de un locus génico endógeno variable de cadena pesada de inmunoglobulina con una o más secuencias humanas de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende criar la cepa de ratón para generar ratones machos heterocigotos, en donde los ratones machos heterocigotos se crían para mantener la modificación genética en la cepa. En un aspecto específico, la cepa no se mantiene mediante la reproducción de un macho homocigoto con una hembra de tipo silvestre, o una hembra homocigótica o heterocigótica para la modificación genética.

La proteína ADAM6 es miembro de la familia de proteínas desintegrina y metaloproteasa (ADAM, de sus siglas en inglés A Disintegrin And Metaloprotease), que es una gran familia de proteínas que tiene diversas funciones, incluida la adhesión celular. Algunos miembros de la familia ADAM están implicados en la espermatogénesis y la fertilización. Por ejemplo, ADAM2 codifica una subunidad de la proteína fertilina, que está implicada en las interacciones esperma-óvulo. ADAM3, o ciritestina, parece necesaria para la unión de los espermatozoides a la zona pelúcida. La ausencia de ADAM2 o ADAM3 da lugar a infertilidad. Se ha postulado que ADAM2, ADAM3 y ADAm6 forman un complejo en la superficie de los espermatozoides de ratón. El gen homólogo humano (ADAM6 humano), que normalmente se encuentra entre los segmentos génicos V^hhumanos V^h1-2 y V^h6-1 en el locus humano de cadena pesada de inmunoglobulina, parece ser un pseudogen. En ratones, hay dos genes ADAM6, ADAM6a y ADAM6b, que se encuentran en una región intergénica entre los segmentos génicos V^hy D^hde ratón, y en el ratón los genes ADAM6a y ADAM6b están orientados en orientación transcripcional opuesta a la de los segmentos génicos circundantes de inmunoglobulina. En ratones, aparentemente se requiere un locus ADAM6 funcional para la fertilización normal. Un locus o secuencia ADAM6 funcional, entonces, se refiere a un locus o secuencia ADAM6 que puede complementar, o rescatar, la fertilización reducida drásticamente exhibida en ratones machos con loci ADAM6 endógenos ausentes o no funcionales.

La posición de la secuencia intergénica en ratones que codifica ADAM6a y ADAM6b hace que la secuencia intergénica sea susceptible de modificación cuando se modifica una cadena pesada endógena de ratón. Cuando los segmentos génicos V^hse eliminan o reemplazan, o cuando los segmentos génicos D^hse eliminan o reemplazan, existe una alta probabilidad de que un ratón resultante exhiba un déficit severo en fertilidad. Para compensar el déficit, el ratón se modifica para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que complementará la pérdida en la actividad de ADAM6 debido a una modificación del locus endógeno ADAM6 de ratón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos complementaria es una que codifica un ADAM6a de ratón, un ADAM6b de ratón, o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que rescata el déficit de fertilidad. Alternativamente, se pueden emplear métodos adecuados para preservar el locus ADAM6 endógeno, mientras que las secuencias endógenas de cadena pesada de inmunoglobulina que flanquean el locus ADAM6 de ratón son incapaces de reordenarse para codificar una región variable endógena de cadena pesada funcional. Los métodos alternativos ejemplares incluyen la manipulación de grandes porciones de cromosomas de ratón que posicionan los loci endógenos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de tal manera que son incapaces de reordenarse para codificar una región variable de cadena pesada funcional que está unida operativamente a un gen endógeno constante de cadena pesada. En diversos aspectos, los métodos incluyen inversiones y/o translocaciones de fragmentos cromosómicos de ratón que contienen segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina.

La secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se puede colocar en cualquier posición adecuada. Se puede colocar en la región intergénica, o en cualquier posición adecuada en el genoma (es decir, ectópicamente). En un aspecto, la secuencia de nucleótidos se puede introducir en un transgen que se integra aleatoriamente en el genoma del ratón. En un aspecto, la secuencia se puede mantener episomalmente, esto es, en un ácido nucleico separado en lugar de en un cromosoma de ratón. Las posiciones adecuadas incluyen posiciones que son transcripcionalmente permisivas o activas, por ejemplo, un locus ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), un locus BT-5 (Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), o un locus Oct4 (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Las secuencias de nucleótidos dirigidas a loci transcripcionalmente activos se describen, por ejemplo, en el documento US 7.473.557.

Alternativamente, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se puede acoplar con un promotor inducible para facilitar la expresión óptima en las células y/o tejidos apropiados, por ejemplo, tejidos reproductivos. Los promotores inducibles ejemplares incluyen promotores activados por medios físicos (por ejemplo, promotor de choque térmico) y/o químicos (por ejemplo, IPTG o tetraciclina).

Adicionalmente, la expresión de la secuencia de nucleótidos se puede unir a otros genes para lograr la expresión en etapas específicas de desarrollo o dentro de tejidos específicos. Dicha expresión se puede lograr colocando la secuencia de nucleótidos en un enlace operativo con el promotor de un gen expresado en una etapa específica de desarrollo. Por ejemplo, las secuencias de inmunoglobulina de una especie genomanipulada en el genoma de una especie hospedadora se colocan en un enlace operativo con una secuencia promotora de un gen CD19 (un gen específico de linfocitos B) de la especie hospedadora. Se logra la expresión específica de linfocitos B en etapas de desarrollo precisas cuando se expresan las inmunoglobulinas.

Otro método más para lograr una expresión fuerte de una secuencia de nucleótidos insertada es emplear un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK y CAGG. De forma similar, la secuencia de nucleótidos deseada se coloca en un enlace operativo con un promotor constitutivo seleccionado, que proporciona un alto nivel de expresión de las proteínas codificadas por la secuencia de nucleótidos.

El término "ectópico" pretende incluir un desplazamiento, o una colocación en una posición que normalmente no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, la colocación de una secuencia de ácido nucleico en una posición que no es la misma posición en la que se encuentra la secuencia de ácido nucleico en un ratón de tipo silvestre). El término, en varios aspectos, se usa en el sentido de que su diana está fuera de su posición normal o adecuada. Por ejemplo, la expresión "una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica..." se refiere a una secuencia de nucleótidos que aparece en una posición en la que normalmente no se encuentra en el ratón. Por ejemplo, en el caso de una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón (o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que proporciona el mismo o similar beneficio de fertilidad en ratones machos), la secuencia se puede colocar en una posición diferente en el genoma de ratón a la que normalmente se encuentra en un ratón de tipo silvestre. En dichos casos, se crearán nuevas uniones de secuencia de secuencia de ratón mediante la colocación de la secuencia en una posición diferente en el genoma del ratón que en un ratón de tipo silvestre. Un homólogo u ortólogo funcional de ADAM6 de ratón es una secuencia que confiere un rescate de la pérdida de fertilidad (por ejemplo, la pérdida de la capacidad de un ratón macho de generar descendencia mediante apareamiento) que se observa en un ratón ADAM6 -/-. Los homólogos u ortólogos funcionales incluyen proteínas que tienen al menos aproximadamente un 89 % de identidad o más, por ejemplo, hasta un 99 % de identidad, con la secuencia de aminoácidos de ADAM6a y/o con la secuencia de aminoácidos de ADAM6b, y que puede complementar, o rescatar la capacidad de aparearse con éxito, de un ratón que tiene un genotipo que incluye una eliminación o inactivación de ADAM6a y/o ADAM6b.

La posición ectópica puede estar en cualquier lugar (por ejemplo, como con la inserción aleatoria de un transgen que contiene una secuencia ADAM6 de ratón), o puede estar, por ejemplo, en una posición que se aproxima (pero no es exactamente la misma) a su ubicación en un ratón de tipo silvestre (por ejemplo, en un locus endógeno modificado de inmunoglobulina de ratón, pero cadena arriba o cadena abajo de su posición natural, por ejemplo, dentro de un locus modificado de inmunoglobulina pero entre diferentes segmentos génicos, o en una posición diferente en una secuencia intergénica V-D de ratón). Un ejemplo de una colocación ectópica es mantener la posición que normalmente se encuentra en ratones de tipo silvestre dentro del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, mientras que los segmentos génicos endógenos circundantes de cadena pesada pueden reordenarse para codificar una cadena pesada funcional que contiene una región endógena constante de cadena pesada. En este ejemplo, esto se puede lograr mediante la inversión del fragmento cromosómico que contiene los loci endógenos variables de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, usando sitios de recombinación específicos de sitio genomanipulados colocados en posiciones que flanquean el locus de región variable. Por lo tanto, tras la recombinación, los loci endógenos de región variable de cadena pesada se colocan a una gran distancia de los genes endógenos de región constante de cadena pesada, evitando así que la reordenación codifique una cadena pesada funcional que contiene una región constante endógena de cadena pesada. Otros métodos ejemplares para lograr el silenciamiento funcional del locus génico endógeno variable de cadena pesada de inmunoglobulina mientras se mantiene un locus ADAM6 funcional resultará evidente para los expertos al leer esta divulgación y/o en combinación con métodos conocidos en la materia. Con dicha colocación del locus endógeno de cadena pesada, los genes ADAM6 endógenos se mantienen y el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina se silencia funcionalmente.

Otro ejemplo de una colocación ectópica es la colocación dentro de un locus humanizado de cadena pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, un ratón que comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos V^hendógenos con un único segmento génico V^hhumano, en donde el reemplazo elimina una secuencia ADAM6 endógena, puede ser genomanipulado para tener una secuencia ADAM6 del ratón ubicada dentro de una secuencia intergénica que se encuentra entre el único segmento génico V^hhumano y un segmento génico D^hhumano. Otro ejemplo de una colocación ectópica es la colocación de la secuencia ADAM6 de ratón en una posición 5' (con respecto a la dirección de transcripción del único segmento génico V^hhumano) al segmento génico V^hhumano. Una posición 5' del único segmento génico V^hhumano puede estar muy cerca, por ejemplo, de unos pocos cientos de pares de bases a unos pocos kb, o distante, por ejemplo, de varios kb a cientos de kb o incluso de una megabase o mayor, en relación con el segmento génico V^hhumano. La modificación resultante generaría una secuencia ADAM6 de ratón (ectópica) dentro o contigua, o incluso en el mismo cromosoma, con una secuencia génica humana, y la colocación (ectópica) de la secuencia ADAM6 de ratón dentro de la secuencia génica humana puede aproximarse a la posición de la secuencia ADAM6 de ratón (es decir, dentro de la región intergénica V-D). Las uniones de secuencia resultantes creadas por la unión de una secuencia ADAM6 de ratón (ectópica) dentro o adyacente a una secuencia génica humana (por ejemplo, una secuencia génica de inmunoglobulina) dentro de la línea germinal del ratón serían nuevas en comparación con la misma posición o similar en el genoma de un ratón de tipo silvestre.

En diversos aspectos, se describen animales no humanos que carecen de un ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo, en donde la falta hace que el animal no humano sea infértil, o reduce sustancialmente la fertilidad del animal no humano. En diversos aspectos, la falta de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo se debe a una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina. Una reducción sustancial en la fertilidad es, por ejemplo, una reducción en la fertilidad (por ejemplo, frecuencia de reproducción, crías por camada, camadas por año, etc.) de aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % o más. En diversos aspectos, los animales no humanos se complementan con un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un macho del animal no humano, en donde el gen ADAM6 complementado u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo rescata, por lo tanto, la reducción de la fertilidad en su totalidad o en parte sustancial. Un rescate de la fertilidad en parte sustancial es, por ejemplo, una restauración de la fertilidad de manera que el animal no humano exhiba una fertilidad de al menos un 70 %, 80 % o 90 % o más en comparación con un locus de cadena pesada no modificado (es decir, un animal sin una modificación del gen ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo).

La secuencia que confiere al animal genéticamente modificado (es decir, el animal que carece de un ADAM6 funcional u ortólogo u homólogo del mismo, debido a, por ejemplo, una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina) se selecciona, en varios aspectos, de un gen ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo. Por ejemplo, en un ratón, la pérdida de la función ADAM6 se rescata mediante la adición de, en un aspecto, un gen ADAM6 de ratón. En un aspecto, la pérdida de la función ADAM6 en el ratón se rescata mediante la adición de un ortólogo u homólogo de una especie estrechamente relacionada con respecto al ratón, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón de una cepa o especie diferente, una rata de cualquier especie, un roedor; en donde la adición del ortólogo u homólogo al ratón rescata la pérdida de fertilidad debido a la pérdida de la función ADAM6 o la pérdida de un gen ADAM6. Los ortólogos y homólogos de otras especies, en varios aspectos, se seleccionan de una especie relacionada filogenéticamente y, en varios aspectos, exhiben un porcentaje de identidad con el ADAM6 endógeno (u ortólogo) que es aproximadamente un 80 % o más, un 85 % o más, un 90 % o más, un 95 % o más, un 96 % o más, o un 97 % o más; y rescatan la pérdida de fertilidad relacionada con ADAM6 o el ortólogo de ADAM6 o (en un no ratón). Por ejemplo, en una rata macho genéticamente modificada que carece de la función ADAM6 (por ejemplo, una rata con una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena reemplazada por una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o un inactivado en la región de cadena pesada de inmunoglobulina de rata), la pérdida de fertilidad en la rata se rescata mediante la adición de un ADAM6 de rata o, en algunos aspectos, un ortólogo de un ADAM6 de rata (por ejemplo, un ortólogo ADAM6 de otra cepa o especie de rata, o, en un aspecto, de un ratón).

Por lo tanto, en varios aspectos, los animales genéticamente modificados que no exhiben fertilidad o exhiben una reducción en la fertilidad debido a la modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 (u ortólogo u homólogo de la misma) o una región reguladora unida operativamente con la secuencia de ácido nucleico, comprenden una secuencia de ácido nucleico que complementa, o restaura, la pérdida de fertilidad donde la secuencia de ácido nucleico que complementa o restaura la pérdida de fertilidad proviene de una cepa diferente de la misma especie o de una especie relacionada filogenéticamente. En diversos aspectos, la secuencia de ácido nucleico complementaria es un ortólogo u homólogo ADAM6 o un fragmento funcional del mismo. En diversos aspectos, el ortólogo u homólogo ADAM6 complementario o fragmento funcional del mismo es de un animal no humano que está estrechamente relacionado con el animal genéticamente modificado que tiene el defecto de fertilidad. Por ejemplo, cuando el animal modificado genéticamente es un ratón de una cepa particular, se puede obtener un ortólogo u homólogo ADAM6 o un fragmento funcional del mismo de un ratón de otra cepa, o un ratón de una especie relacionada. En un aspecto, donde el animal genéticamente modificado que comprende el defecto de fertilidad es del orden Rodentia, el ortólogo u homólogo ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de otro animal del orden Rodentia. En un aspecto, el animal genéticamente modificado que comprende el defecto de fertilidad es de un suborden Myomoropha (por ejemplo, jerbos, ratones saltarines, hámsteres como ratones, hámsteres, ratas y ratones del Nuevo Mundo, topillos, ratones y ratas verdaderas, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta, ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar, lirones espinosos, ratas topo, ratas de bambú, zokores), y el ortólogo u homólogo ADAM6 o fragmento funcional del mismo se selecciona de un animal de orden Rodentia, o del suborden Myomorpha.

En un aspecto, el animal genéticamente modificado es de la superfamilia Dipodoidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia Dipodoidea.

En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una especie diferente dentro de la superfamilia Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es de una familia seleccionada entre Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, topillos), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores); y el ortólogo u homólogo ADAM6 se selecciona de una especie diferente de la misma familia. En un aspecto específico, el roedor genéticamente modificado se selecciona de un ratón o rata auténtico (familia Muridae), y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una especie seleccionada de un jerbo, un ratón espinoso o una rata con cresta. En un aspecto, el ratón genéticamente modificado es de un miembro de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una especie diferente de la familia Muridae. En un aspecto específico, el roedor genéticamente modificado es un ratón de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una rata, jerbo, ratón espinoso o rata con cresta de la familia Muridae.

En diversos aspectos, uno o más ortólogos u homólogos ADAM6 de roedores o fragmentos funcionales de los mismos de un roedor en una familia restaura la fertilidad a un roedor genéticamente modificado de la misma familia que carece de un ortólogo u homólogo ADAM6 (por ejemplo, Cricetidae (por ejemplo, hámsteres, ratas y ratones del Nuevo Mundo, topillos); Muridae (por ejemplo, ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta)).

En diversos aspectos, se evalúa la funcionalidad de los ortólogos ADAM6, homólogos y fragmentos de del mismo para determinar si el ortólogo, homólogo o fragmento restaura la fertilidad a un animal no humano macho genéticamente modificado que carece de actividad ADAM6 (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o rata, que comprende un inactivado de ADAM6 o su ortólogo). En diversos aspectos, la funcionalidad se define como la capacidad de un espermatozoide de un animal genéticamente modificado que carece de un ADAM6 endógeno u ortólogo u homólogo del mismo para migrar a un oviducto y fertilizar un óvulo de la misma especie de animal genéticamente modificado.

En diversos aspectos, se pueden hacer ratones que comprenden eliminaciones o reemplazos del locus endógeno de región variable de cadena pesada o porciones del mismo que contienen una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína que confiere beneficios de fertilidad similares al ADAM6 del ratón (por ejemplo, un ortólogo u un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho). La secuencia de nucleótidos ectópica puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que es un homólogo u ortólogo ADAM6 (o fragmento de la misma) de una cepa de ratón diferente o una especie diferente, por ejemplo, una especie de roedor diferente, y que confiere un beneficio en la fertilidad, por ejemplo, mayor número de camadas durante un período de tiempo específico, y/o mayor número de crías por camada, y/o la capacidad de un espermatozoide de un ratón macho para atravesar un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, el ADAM6 es un homólogo u ortólogo que es al menos de un 89 % a un 99 % idéntico a una proteína ADAM6 de ratón (por ejemplo, al menos de un 89 % a un 99 % idéntico a ADAM6a de ratón o ADAM6b de ratón). En un aspecto, la secuencia de nucleótidos ectópica codifica una o más proteínas seleccionadas independientemente de una proteína al menos un 89 % idéntica a ADAM6a de ratón, una proteína al menos un 89 % idéntica a ADAM6b de ratón y una combinación de las mismas. En un aspecto, el homólogo u ortólogo es una proteína de rata, hámster, ratón o cobaya que es o se modifica para que sea aproximadamente un 89 % o más idéntica a ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón. En un aspecto, el homólogo u ortólogo es o es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a un ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón.

ADAM6 ectópico en ratones de cadena pesada humanizada

Los desarrollos en el direccionamiento de genes, por ejemplo, el desarrollo de cromosomas artificiales bacterianos (BAC, de sus siglas en inglés), ahora permiten la recombinación de fragmentos genómicos relativamente grandes. La ingeniería BAC ha permitido la posibilidad de realizar grandes eliminaciones, y grandes inserciones, en células ME de ratón.

Los ratones que producen anticuerpos humanos han estado disponibles desde hace algún tiempo. Aunque representan un avance importante en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos, estos ratones muestran una serie de anomalías significativas que limitan su utilidad. Por ejemplo, muestran un desarrollo comprometido de linfocitos B. El desarrollo comprometido puede deberse a una variedad de diferencias entre los ratones transgénicos y los ratones de tipo silvestre.

Los anticuerpos humanos podrían no interactuar de manera óptima con los receptores de prelinfocitos B o linfocitos B de ratón en la superficie de las células de ratón que indican la maduración, la proliferación o la supervivencia durante la selección clonal. Los anticuerpos completamente humanos podrían no interactuar óptimamente con un sistema de receptores Fc de ratón; los ratones expresan receptores Fc que no muestran una correspondencia individual con los receptores Fc humanos. Finalmente, varios ratones que producen anticuerpos completamente humanos no incluyen todas las secuencias genuinas de ratones, por ejemplo, elementos potenciadores cadena abajo y otros elementos de control de locus, que pueden ser necesarios para el desarrollo de linfocitos B de tipo silvestre.

Los ratones que producen anticuerpos completamente humanos generalmente comprenden loci endógenos de inmunoglobulina que están desactivados de alguna manera, y los transgenes humanos que comprenden segmentos génicos variables y constantes de inmunoglobulina se introducen en una ubicación aleatoria en el genoma del ratón. Mientras el locus endógeno esté lo suficientemente desactivado para no reordenar segmentos génicos para formar un gen funcional de inmunoglobulina, se puede lograr el objetivo de producir anticuerpos completamente humanos en dicho ratón, aunque con el desarrollo comprometido de linfocitos B.

Aunque obligado a producir anticuerpos completamente humanos a partir del locus transgénico humano, la generación de anticuerpos humanos en un ratón aparentemente es un proceso desfavorable. En algunos ratones, el proceso es tan desfavorable que da como resultado la formación de cadenas pesadas quiméricas variables humanas/ constantes de ratón (pero no cadenas ligeras) a través del mecanismo de conmutación trans. Mediante este mecanismo, las transcripciones que codifican anticuerpos completamente humanos experimentan el conmutación de isotipo en trans del isotipo humano a un isotipo de ratón. El proceso está en trans, porque el transgen completamente humano está ubicado aparte del locus endógeno que retiene una copia no dañada de un gen de región constante de cadena pesada de ratón. Aunque en dichos ratones la conmutación trans es evidente, el fenómeno aún es insuficiente para rescatar el desarrollo de linfocitos B, que sigue estando francamente afectado. En cualquier caso, los anticuerpos con conmutación trans producidos en dichos ratones retienen cadenas ligeras completamente humanas, ya que el fenómeno de la conmutación trans aparentemente no ocurre con respecto a las cadenas ligeras; la conmutación trans probablemente se basa en secuencias de conmutación en loci endógenos utilizados (aunque de manera diferente) en la conmutación de isotipo normal en cis. Por lo tanto, incluso cuando los ratones genomanipulados para producir anticuerpos completamente humanos seleccionan un mecanismo de conmutación trans para producir anticuerpos con regiones constantes de ratón, la estrategia sigue siendo insuficiente para rescatar el desarrollo normal de linfocitos B.

Una preocupación principal en la fabricación de tratamientos humanos basados en anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos antipatógenos, es identificar dominios variables útiles que reconocen específicamente epítopos particulares y los unen con una afinidad deseable, generalmente, pero no siempre, con alta afinidad. Los ratones, como se describe en el presente documento, que contienen un reemplazo preciso de las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con un número restringido de segmentos génicos humanos variables de cadena pesada de inmunoglobulina en los loci endógenos de ratón, muestran un desarrollo de linfocitos B de tipo silvestre y las regiones variables generadas en respuesta a la inmunización son completamente humanas, en donde las cadenas pesadas proceden de un único segmento génico V^hhumano. Por lo tanto, dichos ratones proporcionan una plataforma para generar un panel de regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada que están específicamente dirigidas a unirse a un antígeno dado, por ejemplo, un virus patogénico.

Los ratones, como se describe en el presente documento, contienen un reemplazo preciso a gran escala de loci génicos variables de línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) de ratón con un locus humano restringido variable de cadena pesada de inmunoglobulina y cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena ligera k, IgK) con un locus génico humano equivalente variable de cadena ligera k de inmunoglobulina, en los loci endógenos. Este reemplazo preciso da como resultado un ratón con loci híbrido de inmunoglobulina que produce cadenas pesadas y ligeras que tienen regiones variables humanas y una región constante de ratón. El reemplazo preciso de los segmentos V^h-D^h-J^hy VK-JK de ratón deja las secuencias de ratón flanqueantes intactas y funcionales en los loci híbridos de inmunoglobulina. El sistema inmunitario humoral del ratón funciona como el de un ratón de tipo silvestre. El desarrollo de linfocitos B no se ve obstaculizado en ningún aspecto significativo y se genera un panel somáticamente mutado de CDR de cadena pesada humana en el ratón tras la exposición al antígeno.

Los ratones, como se describe en el presente documento, son posibles porque los segmentos génicos de inmunoglobulina para las cadenas pesadas y ligeras k se reordenan de manera similar en seres humanos y ratones, lo que no quiere decir que sus loci sean iguales o incluso tan claramente que no lo sean. Sin embargo, los loci son lo suficientemente similares como para que la humanización del locus génico variable de cadena pesada se pueda lograr mediante el reemplazo de aproximadamente tres millones de pares de bases de secuencia contigua de ratón que contiene todos los segmentos génicos V^h, D^hy J^hcon una secuencia genómica humana contigua que contiene un locus humano restringido de cadena pesada.

En algunos aspectos, el reemplazo adicional de determinadas secuencias génicas de región constante de ratón con secuencias génicas humanas (por ejemplo, el reemplazo de la secuencia C^h1 de ratón con la secuencia C^h1 humana y el reemplazo de la secuencia C^lde ratón con la secuencia C^lhumana) da como resultado ratones con loci híbridos de inmunoglobulina que producen anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes parcialmente humanas, adecuadas para, por ejemplo, hacer fragmentos de anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, Fab's completamente humanos. Los ratones con loci híbridos de inmunoglobulina exhiben un reordenamiento normal de segmentos génicos variables, frecuencias de hipermutación somática normales y conmutación de clase normal. Estos ratones exhiben un sistema inmunitario humoral que es indistinguible de los ratones de tipo silvestre, y muestran poblaciones de células normales en todas las etapas del desarrollo de linfocitos B y estructuras de órganos linfoides normales, incluso cuando los ratones carecen de un repertorio completo de segmentos génicos humanos de región variable. La inmunización de estos ratones da como resultado fuertes respuestas humorales que muestran una amplia diversidad de CDR de cadena pesada y uso de segmentos génicos variables de cadena ligera.

El reemplazo preciso de segmentos génicos de la región variable de línea germinal de ratón permite producir ratones que tienen loci parcialmente humanos de inmunoglobulina. Debido a que los loci parcialmente humanos de inmunoglobulina se reordenan, hipermutan y conmutan de clase normalmente, los loci parcialmente humanos de inmunoglobulina generan anticuerpos en un ratón que comprende regiones variables humanas. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables pueden identificarse y clonarse, luego fusionarse (por ejemplo, en un sistema in vitro) con cualquier secuencia de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina adecuado para un uso particular, dando como resultado un anticuerpo o proteína de unión a antígeno procedente totalmente de secuencias humanas.

La humanización a gran escala mediante métodos de recombinación se utilizó para modificar las células madre embrionarias (ME) de ratón para reemplazar con precisión hasta tres megabases del locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón que incluía esencialmente todos los segmentos génicos V^h, D^hy J^hde ratón con una secuencia genómica humana que contiene un locus humano restringido de cadena pesada que incluye un único segmento génico V^hhumano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos. Se usó hasta un segmento de media megabase del genoma humano que comprende una de las dos repeticiones que codifican esencialmente todos los segmentos génicos humanos Vk y Jk para reemplazar un segmento de tres megabases del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que contiene esencialmente todos los segmentos génicos Vk y Jk de ratón.

Los ratones con dichos loci reemplazados de inmunoglobulina pueden comprender una interrupción o eliminación del locus ADAM6 endógeno de ratón, que normalmente se encuentra entre el segmento génico V^hmás en 3' y el segmento génico D^hmás en 5' en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. La interrupción en esta región puede conducir a la reducción o eliminación de la funcionalidad del locus ADAM6 endógeno de ratón. Si uno, o ambos, de los segmentos génicos V^hmás en 3' del repertorio humano de cadena pesada se usan en la construcción del locus humano restringido de cadena pesada, una región intergénica que contiene un pseudogen que parece ser un pseudogen ADAM6 humano está presente entre estos segmentos génicos V^h, es decir, entre V^h1-2 y V^h1-6 humanos. Sin embargo, los ratones machos que comprenden esta secuencia intergénica humana exhiben una reducción en la fertilidad (véase el documento USSⁿ13/404.075).

Se describen ratones que comprenden los loci humanos restringidos de cadena pesada y humanos equivalentes de cadena ligera ^kcomo se describió anteriormente, y que también comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6 de ratón, donde los ratones exhiben fertilidad esencialmente normal. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico ectópica comprende una secuencia ADAM6a de ratón y/o una secuencia ADAM6b de ratón o fragmentos funcionales de la misma colocados entre un V^h1-69 humano y un D^h1-1 humano en un locus endógeno modificado de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico ectópica es la SEQ ID NO: 77, colocada entre un V^h1-69 humano y un D^h1-1 humano en un locus endógeno modificado de cadena pesada. La dirección de transcripción de los genes ADAM6 de la SEQ ID NO: 77 es opuesta con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos circundantes. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico ectópica comprende una secuencia ADAM6a de ratón y/o una secuencia ADAM6b de ratón o fragmentos funcionales de la misma colocados cadena arriba (o en 5') de un segmento génico V^h1-2 humano en un locus endógeno modificado de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico ectópica es la SEQ ID NO: 73, colocada cadena arriba (o en 5') de un segmento génico V^h1-2 en un locus endógeno modificado de cadena pesada. La dirección de transcripción de los genes ADAM6 de la SEQ ID NO: 73 es opuesta con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos circundantes (por ejemplo, un segmento génico V^h1-2 humano).

Aunque los ejemplos en el presente documento muestran el rescate de la fertilidad mediante la colocación de la secuencia ectópica entre los segmentos génicos humanos indicados, las personas expertas reconocerán que se espera que la colocación de la secuencia ectópica en cualquier locus transcripcionalmente permisivo adecuado en el genoma de ratón (o incluso extracromosómicamente) rescate de manera similar la fertilidad en un ratón macho. El fenómeno de complementar un ratón que carece de un locus ADAM6 funcional con una secuencia ectópica que comprende un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo es un método general que es aplicable al rescate de cualquier ratón con loci ADAM6 endógeno no funcional o mínimamente funcional. Por lo tanto, una gran cantidad de ratones que comprenden una modificación disruptiva de ADAM6 del locus de cadena pesada de inmunoglobulina se puede rescatar con las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Por consiguiente, la presente divulgación comprende ratones con una amplia variedad de modificaciones de loci de cadena pesada de inmunoglobulina que comprometen la función endógena de ADAM6. Algunos ejemplos (no limitativos) se proporcionan en esta descripción. Además de los ratones descritos, las composiciones y métodos relacionados con ADAM6 se pueden usar en muchas aplicaciones, por ejemplo, cuando se modifica un locus de cadena pesada en una amplia variedad de formas.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hdel ratón con un único segmento génico V^hhumano, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos D^hde ratón y segmentos génicos J^hcon segmentos génicos D^hhumanos y J^hhumanos; en donde el ratón carece de una región C^h1 y/o bisagra. En un aspecto, el ratón produce una proteína de unión a un dominio variable único que es un dímero de las cadenas de inmunoglobulina seleccionadas de: (a) V^hhumano - C^h1 de ratón - C^h2 de ratón- C^h3 de ratón; (b) V^hhumano - bisagra de ratón -C^h2 de ratón- C^h3 de ratón; y, (c) V^hhumano - C^h2 de ratón - C^h3 de ratón.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se coloca cadena arriba (o en 5') de una secuencia humana de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena arriba de un segmento génico V^h1-2 o V^h1-69 humano) en un ratón que tiene un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (mVH, mDH, y/o ^itiJ^h) con uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena pesada de inmunoglobulina (hVH, hDH y/o hJH), y el ratón comprende además un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera ^kde inmunoglobulina de ratón (mVK y/o mJK) con uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena ligera ^kde inmunoglobulina (hVK y/o hJK). En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se coloca dentro de una secuencia humana de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, entre un segmento génico V^h1-69 o V^h1-2 humano y un DH1-1 humano) en un ratón que tiene un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (mVH, mDH, y/o itJ^h) con uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena pesada de inmunoglobulina (hVH, hDH y/o hJH), y el ratón comprende además un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón (mVk y/o mJk) con uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina (hVk y/o hJk).

En un aspecto, el uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón comprende aproximadamente tres megabases del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón comprende al menos 89 segmentos génicos V^h, al menos 13 segmentos génicos D^h, al menos cuatro segmentos génicos J^ho una combinación de los mismos del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena pesada de inmunoglobulina comprende un número restringido de (por ejemplo, uno, dos o tres) segmentos génicos V^h, al menos 27 segmentos génicos D^h, al menos seis segmentos génicos JH o una combinación de los mismos de un locus humano de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el número restringido de segmentos génicos V^hhumanos es uno.

En un aspecto, el uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón comprende aproximadamente tres megabases del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón comprende al menos 137 segmentos génicos V^k, al menos cinco segmentos génicos J^ko una combinación de los mismos del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina comprende aproximadamente media megabase de un locus humano de cadena ligera k de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena ligera ^kde inmunoglobulina comprende la repetición proximal (con respecto a la región constante k de inmunoglobulina) de un locus humano de cadena ligera k de inmunoglobulina. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos humanos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina comprende al menos 40 segmentos génicos Vk, al menos cinco segmentos génicos Jk o una combinación de los mismos de un locus humano de cadena ligera k de inmunoglobulina.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos se coloca entre dos segmentos génicos humanos de inmunoglobulina. En un aspecto específico, los dos segmentos génicos humanos de inmunoglobulina son segmentos génicos de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos se coloca entre un segmento génico V^h1-69 humano y un segmento génico DH1-1 humano. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos se coloca entre un segmento génico V^h12 humano y un segmento génico D^h1 -1 humano. En un aspecto, el ratón modificado de este modo comprende un reemplazo de segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con un único segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos, y un reemplazo de los segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón con al menos 40 segmentos génicos Vk humanos y cinco segmentos génicos Jk humanos.

En un aspecto, un locus ADAM6 funcional de ratón (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en medio de segmentos génicos de ratón que están presentes en el locus endógeno de región variable de cadena pesada de ratón, siendo dicho locus incapaz de reordenarse para codificar una cadena pesada funcional que contiene una región constante endógena de cadena pesada. En un aspecto, el locus endógeno de cadena pesada de ratón comprende al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V^h, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D^h, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J^hy una combinación de los mismos. En diversos aspectos, un locus ADAM6 funcional de ratón (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) codifica una o más proteínas ADAM6 que son funcionales en el ratón, en donde la una o más proteínas ADAM6 comprenden la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o una combinación de las mismas.

En un aspecto, un locus ADAM6 funcional de ratón (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en medio de segmentos génicos humanos que reemplazan segmentos génicos endógenos de ratón. En un aspecto, se eliminan al menos 89 segmentos génicos V^hde ratón y se reemplazan con uno, dos o tres segmentos génicos V^hhumanos, y el locus ADAM6 de ratón está presente inmediatamente adyacente al extremo 3' de los segmentos génicos V^hhumanos, o entre dos segmentos génicos V^hhumanos. En un aspecto, se eliminan al menos 89 segmentos génicos V^hde ratón y se reemplazan con un único segmento génico V^hhumano, y el locus ADAM6 de ratón está presente inmediatamente adyacente al extremo 3' del segmento génico V^hhumano. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón está presente en 3' del segmento génico V^hdentro de aproximadamente 20 kilobases (kb) a aproximadamente 40 kilobases (kb) del extremo 3' del segmento génico V^hhumano insertado. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón está presente en 3' del segmento génico V^hdentro de aproximadamente 29 kb a aproximadamente 31 kb del extremo 3' del segmento génico VH humano insertado. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón está presente dentro de aproximadamente 30 kb del extremo 3' del segmento génico V^hhumano insertado. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón está presente dentro de aproximadamente 30.184 pb del extremo 3' del segmento génico V^hhumano insertado.

En un aspecto específico, el reemplazo incluye segmentos génicos V^h1-69 y D^h1-1 humanos, y el locus ADAM6 de ratón está presente cadena abajo del segmento génico V^h1-69 y cadena arriba del segmento génico D^h1-1. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón está presente entre un segmento génico VH1-69 humano y un segmento génico D^h1-1 humano, en donde el extremo 5' del locus ADAM6 de ratón está a aproximadamente 258 pb del extremo 3' del segmento génico V^h1-69 humano y el extremo 3' del locus ADAM6 está a aproximadamente 3.263 pb en 5' del segmento génico D^h1-1 humano. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ I^dNO: 3 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ ID NO: 73 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ ID NO: 77 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En un aspecto específico, la disposición de los segmentos génicos humanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos): V^h1-69 humanolocus ADAM6 de ratón-DH1-1 humano. En un aspecto, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus de ADAM6 de ratón es opuesta con respecto a la dirección de transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón está presente en 5', o cadena arriba de, el único segmento génico V^hhumano.

En un aspecto específico, el reemplazo incluye segmentos génicos V^h1-2 y D^h1-1 humanos, y el locus ADAM6 de ratón está presente cadena abajo del segmento génico V^h1-2 y cadena arriba del segmento génico D^h1-1. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón está presente cadena arriba o en 5', de un segmento génico V^h1-2 humano y un segmento génico D^h1-1 humano, en donde el extremo 5' del locus ADAM6 de ratón está a aproximadamente 32.833 pb del extremo 5' del segmento génico V^h1-2 humano y el extremo 3' del locus ADAM6 está a aproximadamente 18.078 pb del extremo 5' del segmento génico V^h1-2 humano. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ ID NO: 73 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En un aspecto específico, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ ID NO: 77 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En un aspecto específico, la disposición de los segmentos génicos humanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos): locus ADAM6 de ratón-VH1-2 humano-DH1-1 humano. En un aspecto, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus de ADAM6 de ratón es opuesta con respecto a la dirección de transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón está presente en 3', o cadena abajo de, el único segmento génico V^hhumano.

Del mismo modo, un ratón modificado con uno o más segmentos génicos V^lhumanos (por ejemplo, segmentos Vk o VA) que reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos génicos endógenos V^hde ratón pueden modificarse para mantener el locus ADAM6 endógeno de ratón, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante el empleo de un vector de direccionamiento que tiene un brazo de homología cadena abajo que incluye un locus ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo, o para reemplazar un locus ADAM6 dañado de ratón con una secuencia ectópica posicionada entre dos segmentos génicos V^lhumanos o entre los segmentos génicos V^lhumanos y un segmento génico D^h(ya sea humano o de ratón, por ejemplo, VA m/hDH), o un segmento génico J (ya sea humano o de ratón, por ejemplo, V^k+ J^h). En un aspecto, el reemplazo incluye dos o más segmentos génicos V^lhumanos, y el locus ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo está presente entre los dos segmentos génicos V^lmás en 3'. En un aspecto específico, la disposición de los segmentos génicos V^lhumanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos): V^l3-1 humano-locus ADAM6 de ratón-VL3' humano. En un aspecto, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus de ADAM6 de ratón es opuesta con respecto a la dirección de transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos VL humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento génico V^lhumano más en 3' y el segmento génico DH más en 5'. Este puede ser el caso si el segmento DH más en 5' es de ratón o humano.

En un aspecto, se describe un ratón con un reemplazo de uno o más segmentos génicos VH endógenos de ratón, y que comprende al menos un segmento génico D^hendógeno de ratón. En dicho ratón, la modificación de los segmentos génicos VH endógenos de ratón puede comprender una modificación de uno o más de los segmentos génicos V^hmás en 3', pero no del segmento génico D^hmás en 5', donde se tiene cuidado para que la modificación de uno o más segmentos génicos V^hmás en 3' no interrumpa ni haga que el locus ADAM6 endógeno de ratón no sea funcional. Por ejemplo, en un aspecto, el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hendógenos de ratón con un único segmento génico V^hhumano, y el ratón comprende uno o más segmentos génicos D^hendógenos y un locus ADAM6 endógeno funcional de ratón.

En otro aspecto, el ratón comprende la modificación de los segmentos génicos V^hendógenos más en 3' de ratón, y una modificación de uno o más segmentos génicos D^hendógenos de ratón, y la modificación se lleva a cabo para mantener la integridad del locus ADAM6 endógeno de ratón en la medida en que el locus ADAM6 endógeno permanece funcional. En un ejemplo, dicha modificación se realiza en dos etapas: (1) reemplazar los segmentos génicos VH endógenos de ratón más en 3' con un único segmento génico VH humano utilizando un vector de direccionamiento con un brazo de homología cadena arriba y un brazo de homología cadena abajo en donde el brazo de homología cadena abajo incluye todo o una porción de un locus ADAM6 funcional de ratón; (2) luego reemplazar el segmento génico DH endógeno de ratón con un vector de direccionamiento que tiene un brazo de homología cadena arriba que incluye todo o una porción funcional de un locus ADAM6 de ratón.

En diversos aspectos, el empleo de ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo u homólogo funcional de la misma es útil cuando las modificaciones interrumpen la función de ADAM6 endógeno de ratón. La probabilidad de alterar la función ADAM6 endógena de ratón es alta cuando se realizan modificaciones en los loci de inmunoglobulina de ratón, en particular cuando se modifican las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y secuencias circundantes. Por lo tanto, dichos ratones proporcionan un beneficio particular cuando se hacen ratones con loci de cadena pesada de inmunoglobulina que se eliminan en su totalidad o en parte, se humanizan en su totalidad o en parte, o se reemplazan (por ejemplo, con secuencias V^ko VA) en su totalidad o en parte. Los expertos en la materia conocen los métodos para realizar las modificaciones genéticas descritas para los ratones descritos a continuación.

Los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón, o una proteína sustancialmente idéntica o similar que confiere los beneficios de fertilidad de una proteína ADAM6 de ratón, son particularmente útiles junto con modificaciones a un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que interrumpe o elimina la secuencia ADAM6 endógena de ratón. Aunque se describe principalmente en relación con ratones que expresan anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, dichos ratones son útiles en relación con cualquier modificación genética que altere los genes ADAM6 endógenos de ratón. Las personas expertas reconocerán que esto abarca una amplia variedad de ratones genéticamente modificados que contienen modificaciones de loci génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Estos incluyen, por ejemplo, ratones con una eliminación o un reemplazo de todos o una porción de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, independientemente de otras modificaciones. Se describen a continuación ejemplos no limitantes.

En algunos aspectos, se describen ratones genéticamente modificados que comprenden un gen ADAM6 ectópico de ratón, roedor u otro (u ortólogo u homólogo o fragmento) funcional en un ratón, y uno o más segmentos génicos humanos de región variable y/o de constante de inmunoglobulina. En diversos aspectos, otros genes ADAM6 ortólogos u homólogos o fragmentos funcionales en un ratón pueden incluir secuencias de bovinos, caninos, primates, conejos u otras secuencias no humanas.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con un único segmento génico V^hhumano; un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos D^hde ratón con uno o más segmentos génicos D^hhumanos; y un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos J^hde ratón con uno o más segmentos génicos J^hhumanos.

En un aspecto, el ratón comprende además un reemplazo de una secuencia de nucleótidos C^h1 de ratón con una secuencia de nucleótidos C^h1 humana. En un aspecto, el ratón comprende además un reemplazo de una secuencia de nucleótidos de bisagra de ratón con una secuencia de nucleótidos de bisagra humana. En un aspecto, el ratón comprende además un reemplazo de un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^ly J^l) con un locus humano variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, el ratón comprende además un reemplazo de una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón con una secuencia de nucleótidos humana de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la V^l, J^l, y C^lson secuencias de cadena ligera ^kde inmunoglobulina. En un aspecto específico, el ratón comprende una secuencia de región constante de inmunoglobulina C^h2 de ratón y C^h3 de ratón fusionada con una secuencia de bisagra humana y C^h1 humana, de modo que los loci de inmunoglobulina de ratón se reordenan para formar un gen que codifica una proteína de unión que comprende (a) una cadena pesada que tiene una región variable humana, una región C^h1 humana, una región bisagra humana y una región C^h2 de ratón y C^h3 de ratón; y (b) un gen que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable humano y una región constante humana.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^lhumanos y, opcionalmente, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y/o segmentos génicos JH con uno o más segmentos génicos DH humanos y/o segmentos génicos JH humanos u, opcionalmente, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y segmentos génicos J^hcon uno o más segmentos génicos J^lhumanos.

En un aspecto, el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^h, D^h, y J^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^l, uno o más D^h, y uno o más J (por ejemplo, J^ko JA), en donde los segmentos génicos están unidos operativamente a una región de bisagra endógena de ratón, en donde el ratón forma un gen reordenado de cadena de inmunoglobulina que contiene, de 5' a 3' en la dirección de la transcripción, V^lhumano - D^hhumano o de ratón - J humano o de ratón - bisagra de ratón - C^h2 de ratón - C^h3 de ratón. En un aspecto, la región J es una región Jk humana. En un aspecto, la región J es una región J^hhumana. En un aspecto, la región J es una región JA humana. En un aspecto, la región V^lhumana se selecciona de una región VA humana y una región VK humana.

En aspectos específicos, el ratón expresa un anticuerpo de dominio variable único que tiene una región constante de ratón o humana y una región variable procedente de una VK humana, una D^hhumana y una JK humana; una VK humana, una DH humana y una JH humana; una VA humana, una DH humana y una JA humana; una VA humana, una DH humana y una JH humana; una Vk humana, una DH humana y una JA humana; una VA humana, una DH humana y una J^khumana. En un aspecto específico, las secuencias de reconocimiento de recombinación se modifican para permitir que se produzcan reordenamientos productivos entre segmentos génico V, D y J citados o entre segmentos génicos V y J citados.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^lhumanos, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH de ratón y segmentos génicos JH con segmentos génicos J^lhumanos; en donde el ratón carece de una región C^h1 y/o bisagra.

En un aspecto, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio C^h1. En un aspecto, el ratón carece de una secuencia que codifica una región bisagra. En un aspecto, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio C^h1 y una región bisagra.

En un aspecto específico, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un dominio humano variable de cadena ligera de inmunoglobulina (A o ^k) fusionado a un dominio C^h2 de ratón que está unido a un dominio C^h3 de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^lhumanos, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos D^hy J^hde ratón con segmentos génicos J^lhumanos.

En un aspecto, el ratón comprende una eliminación de una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región C^h1, una región bisagra, una región C^h1 y una bisagra, o una región C^h1 y una región bisagra y una región C^h2.

En un aspecto, el ratón produce una proteína de unión a un dominio variable único que comprende un homodímero seleccionado entre los siguientes: (a) V^lhumano - C^h1 de ratón - C^h2 de ratón - C^h3 de ratón; (b) V^lhumano -bisagra de ratón - C^h2 de ratón- C^h3 de ratón; (c) V^lhumano - C^h2 de ratón - C^h3 de ratón.

En un aspecto, se describe un ratón con un locus endógeno desactivado de cadena pesada endógena de inmunoglobulina, que comprende un locus ADAM6 endógeno desactivado o eliminado de ratón, en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa un anticuerpo humano o de ratón o humano/de ratón u otro quimérico. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está presente en un transgen integrado que se integra aleatoriamente en el genoma del ratón. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico está en un episoma (por ejemplo, un cromosoma) que no se encuentra en un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, el ratón comprende además un locus endógeno desactivado de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona de un locus de cadena ligera kappa (^k) y lambda (A). En un aspecto específico, el ratón comprende un locus endógeno desactivado de cadena ligera k y un locus desactivado de cadena ligera A, en donde el ratón expresa un anticuerpo que comprende un dominio humano variable de cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio humano de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, el dominio humano de cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona de un dominio humano de cadena ligera k y un dominio humano de cadena ligera A.

En un aspecto, se describe un animal genéticamente modificado que expresa un anticuerpo quimérico y expresa una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma que es funcional en el animal genéticamente modificado.

En un aspecto, el animal genéticamente modificado se selecciona de un ratón y una rata. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un ratón, y la proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma es de una cepa de ratón que es una cepa diferente que el animal genéticamente modificado. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un roedor de la familia Cricetida (por ejemplo, un hámster, una rata o ratón del Nuevo Mundo, un topillo) y el ortólogo u homólogo de la proteína ADAM6 es de un roedor de la familia Muridae (por ejemplo, un ratón o rata auténtica, jerbo, ratón espinoso, rata con cresta). En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un roedor de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo de la proteína ADAM6 es de un roedor de la familia Cricetidae. En un aspecto, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y una secuencia de región constante de un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona de un roedor de la familia Cricetidae y un roedor de la familia Muridae. En un aspecto específico, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es un ratón. En un aspecto específico, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es una rata. En un aspecto, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y un dominio constante de un animal seleccionado de un ratón o rata; en un aspecto específico, el ratón o la rata se seleccionan de la familia Cricetidae y la familia Muridae. En un aspecto, el anticuerpo quimérico comprende un dominio humano variable de cadena pesada, un dominio humano variable de cadena ligera y una secuencia de región constante procedente de un roedor seleccionado de ratón y rata, en donde el dominio humano variable de cadena pesada y la cadena ligera humana son afines. En un aspecto específico, afín incluye que la cadena pesada humana y los dominios humanos variables de cadena ligera sean de un solo linfocito B que expresa el dominio humano variable de cadena ligera y el dominio humano variable de cadena pesada juntos y presenten los dominios variables juntos en la superficie de un linfocito B individual.

En un aspecto, el anticuerpo quimérico se expresa a partir de un locus de inmunoglobulina. En un aspecto, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un locus endógeno reordenado de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un locus endógeno reordenado de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico y/o el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un transgen reordenado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico reordenada procedente de una secuencia de ácido nucleico no reordenada integrada en el genoma animal en un locus que no sea un locus endógeno de inmunoglobulina). En un aspecto, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un transgen reordenado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico reordenada procedente de una secuencia de ácido nucleico no reordenada integrada en el genoma del animal en un locus distinto de un locus endógeno de inmunoglobulina).

En un aspecto específico, el transgen se expresa a partir de un locus transcripcionalmente activo, por ejemplo, un locus ROSA26, por ejemplo, un locus ROSA26 murino (por ejemplo, de ratón).

En un aspecto, se describe un animal no humano, que comprende un locus humanizado de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el locus humanizado de cadena pesada de inmunoglobulina comprende una secuencia ADAM6 no humana u ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, el ortólogo u homólogo ADAM6 no humano es una secuencia que es ortóloga y / u homóloga a una secuencia ADAM6 de ratón, en donde el ortólogo u homólogo es funcional en el animal no humano.

En un aspecto, el animal no humano es un roedor seleccionado de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, el animal no humano se selecciona de un ratón, una rata y un hámster y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un animal no humano seleccionado de un ratón, una rata, y un hámster. En un aspecto específico, el animal no humano es un ratón y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un animal que se selecciona de una especie de ratón diferente, una rata, y un hámster. En un aspecto específico, el animal no humano es una rata, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una especie diferente de rata, un ratón y un hámster. En un aspecto específico, el animal no humano es un hámster, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una especie de hámster diferente, un ratón y una rata.

En un aspecto específico, el animal no humano es del suborden Myomorpha, y la secuencia ADAM6 es de un animal seleccionado de un roedor de la superfamilia Dipodoidea y un roedor de la superfamilia Muroidea. En un aspecto específico, el roedor es un ratón de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un ratón o una rata o un hámster de la superfamilia Muroidea.

En un aspecto, el locus humanizado de cadena pesada comprende un único segmento génico V^hhumano, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y uno o más segmentos génicos J^hhumanos. En un aspecto específico, el segmento génico V^hhumano, el uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y el uno o más segmentos génicos J^hhumanos están unidos operativamente a uno, o más, genes humanos de región constante quiméricos y/o de roedor (por ejemplo, ratón o rata). En un aspecto, los genes de región constante son de ratón. En un aspecto, los genes de región constante son de rata. En un aspecto, los genes de región constante son de hámster. En un aspecto, la secuencia de región constante comprende una secuencia seleccionada de una bisagra, una C^h2, una C^h3, y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, los genes de región constante comprenden una secuencia bisagra, una CH2 y una CH3.

En un aspecto, la secuencia ADAM6 no humana es contigua a una secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia ADAM6 no humana se coloca dentro de una secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina comprende un segmento génico V, D y/o J.

En un aspecto, la secuencia ADAM6 no humana se yuxtapone con un segmento génico V. En un aspecto, la secuencia ADAM6 no humana se posiciona entre dos segmentos génicos V. En un aspecto, la secuencia ADAM6 no humana se yuxtapone entre un segmento génico V y uno D. En un aspecto, la secuencia ADAM6 de ratón se posiciona entre un segmento génico V y uno J. En un aspecto, la secuencia ADAM6 de ratón se yuxtapone entre un segmento génico D y uno J.

En un aspecto, se describe un animal no humano modificado genéticamente, que comprende un linfocito B que expresa un dominio V^hhumano afín con un dominio V^lhumano de un locus de inmunoglobulina, en donde el animal no humano expresa una proteína no humana no de inmunoglobulina del locus de inmunoglobulina. En un aspecto, la proteína no humana no de inmunoglobulina es una proteína ADAM. En un aspecto específico, la proteína ADAM es una proteína ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma.

En un aspecto, el animal no humano es un roedor (por ejemplo, ratón o rata). En un aspecto, el roedor es de la familia Muridae. En un aspecto, el roedor es de la subfamilia Muridae. En un aspecto específico, el roedor de la subfamilia Murinae se selecciona entre un roedor y una rata.

En un aspecto, la proteína no humana no de inmunoglobulina es una proteína de roedor. En un aspecto, el roedor es de la familia Muridae. En un aspecto, el roedor es de la subfamilia Muridae. En un aspecto específico, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, los dominios V^hy V^lhumanos están unidos directamente o a través de un enlazador a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la secuencia de dominio constante comprende una secuencia seleccionada de una bisagra, una C^h2, una C^h3, y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, el dominio V^lhumano se selecciona de un dominio Vk o VA.

En un aspecto, se describe un animal no humano modificado genéticamente, que comprende en su línea germinal una secuencia humana de inmunoglobulina, en donde el esperma de un animal macho no humano se caracteriza por un defecto de migración in vivo. En un aspecto, el defecto de migración in vivo comprende una incapacidad de los espermatozoides del animal macho no humano para migrar desde un útero a través de un oviducto de un animal hembra no humano de la misma especie. En un aspecto, el animal no humano carece de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 o un fragmento funcional de la misma. En un aspecto específico, la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma incluye una proteína ADAM6a y/o ADAM6b o fragmentos funcionales de la misma. En un aspecto, el animal no humano es un roedor. En un aspecto específico, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, se describe un animal no humano, que comprende una secuencia humana de inmunoglobulina contigua a una secuencia no humana que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma. En un aspecto, el animal no humano es un roedor. En un aspecto específico, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, la secuencia humana de inmunoglobulina es una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina comprende un único segmento génico V^h. En un aspecto, la secuencia humana de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos DH. En un aspecto, la secuencia humana de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos J^h. En un aspecto, la secuencia humana de inmunoglobulina comprende un único segmento génico V^h, uno o más segmentos génicos D^hy uno o más segmentos génicos JH.

En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina comprende un único segmento génico VH que está asociado con el polimorfismo en los repertorios humanos naturales. En un aspecto específico, el único segmento génico V^hse selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23 humano. En otro aspecto específico, el único segmento génico VH es VH1-2. En otro aspecto específico, el único segmento génico VH es VH1-69.

En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina comprende un único segmento génico VH que está asociado con múltiples copias en repertorios humanos naturales. En un aspecto específico, el único segmento génico V^hse selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23 humano. En otro aspecto específico, el único segmento génico VH es VH1-2. En otro aspecto específico, el único segmento génico VH es VH1-69.

En diversos aspectos, el segmento génico V^hse selecciona de V^h6-1, V^h1-2, V^h1-3, V^h2-5, V^h3-7, V^h1-8, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h1-18, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h1-24, V^h2-26, V^h4-28, V^h3-30, V^h4-31, V^h3-33, V^h4-34, V^h3-35, V^h3-38, V^h4-39, V^h3-43, V^h1-45, V^h1-46, V^h3-48, V^h3-49, V^h5-51, V^h3-53, V^h1-58, V^h4-59, V^h4-61, V^h3-64, V^h3-66, V^h1-69, V^h2-70, V^h3-72, V^h3-73 y V^h3-74.

En diversos aspectos, el segmento génico V^hse selecciona de la Tabla 1 y está representado en los repertorios humanos naturales por cinco o más alelos. En un aspecto específico, el gen V^hse selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-70, V^h3-15, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-49, V^h3-64, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5 -51 y V^h7-4-1.

En un aspecto, el animal no humano es un ratón, y el ratón comprende un reemplazo de segmentos génicos VH endógenos de ratón con un único segmento génico VH humano, en donde el segmento génico VH humano está unido operativamente a un gen de región C^hde ratón, tal que el ratón reordena el segmento génico V^hhumano y expresa una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina inversa que comprende un dominio V^hhumano y un C^hde ratón. En un aspecto, un 90-100 % de los segmentos génicos V^hde ratón no reordenados se reemplazan con un segmento génico V^hhumano no reordenado. En un aspecto específico, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hendógenos de ratón se reemplazan con un segmento génico V^hhumano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con un segmento génico V^h1-69 humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con un segmento génico V^h1-2 humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con un segmento génico V^h2-26 humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con un segmento génico V^h2-70 humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con un segmento génico V^h3-23 humano no reordenado.

En un aspecto, el ratón comprende un reemplazo de todos los segmentos D^hy J^hde ratón con al menos un segmento D^hhumano no reordenado y al menos un segmento J^hhumano no reordenado. En un aspecto, el al menos un segmento D^hhumano no reordenado se selecciona de 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el al menos un segmento J^hhumano no reordenado se selecciona de 1, 2, 3, 4, 5, 6 y una combinación de los mismos.

En diversos aspectos, la secuencia humana de inmunoglobulina está en un enlace operativo con una región constante en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, el roedor, por ejemplo, el ratón, rata o hámster). En un aspecto, la región constante es una región constante humana, quimérica humana/de ratón o quimérica humana/de rata o quimérica humana/de hámster, de ratón, de rata o de hámster. En un aspecto, la región constante es una región constante de roedor (por ejemplo, de ratón, rata o hámster). En un aspecto específico, el roedor es un ratón o una rata. En diversos aspectos, la región constante comprende al menos un dominio C^h2 y un dominio C^h3. En un aspecto, la secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina está ubicada en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, el roedor, por ejemplo, el ratón, la rata o el hámster). En un aspecto, la secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina está ubicada en un locus de cadena pesada no de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano, en donde el locus no de cadena pesada es un locus transcripcionalmente activo. En un aspecto específico, el locus no de cadena pesada es un locus ROSA26.

En diversos aspectos, el animal no humano comprende además una secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, una o más secuencias V y J de cadena ligera no reordenadas, o una o más secuencias VJ reordenadas) en la línea germinal del animal no humano. En un aspecto específico, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos V^l. En un aspecto, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos J^l. En un aspecto, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos V^ly uno o más segmentos génicos J^l. En un aspecto específico, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina comprende al menos 16 segmentos génicos Vk y cinco segmentos génicos Jk. En un aspecto específico, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina comprende al menos 30 segmentos génicos Vk y cinco segmentos génicos Jk. En un aspecto específico, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina comprende al menos 40 segmentos génicos Vk y cinco segmentos génicos Jk. En diversos aspectos, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina está en un enlace operativo con una región constante en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata o hámster). En un aspecto, la región constante es una región constante humana, quimérica humana/de roedor, de ratón, de rata o de hámster. En un aspecto específico, la región constante es una región constante de ratón o rata. En un aspecto específico, la región constante es una región constante ^kde ratón (nCK) o una región constante ^kde rata (rCK). En un aspecto, el animal no humano es un ratón y el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^ky J^kcon al menos seis segmentos génicos V^khumanos y al menos un segmento génico Jk. En un aspecto, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vk y Jk se reemplazan con al menos 16 segmentos génicos V^khumanos (V^khumanos) y al menos un segmento génico J^k. En un aspecto, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vk y Jk se reemplazan con al menos 30 segmentos génicos Vk humanos y al menos un segmento génico J^k. En un aspecto, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^ky J^kse reemplazan con al menos 40 segmentos génicos V^khumanos y al menos un segmento génico J^k. En un aspecto, el al menos un segmento génico Jk comprende dos, tres, cuatro o cinco segmentos génicos Jk humanos. En un aspecto, los segmentos génicos Vk humanos comprenden Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5 y Vk1-6. En un aspecto, los segmentos génicos Vk comprenden Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15 y Vk1-16. En un aspecto, los segmentos génicos Vk humanos comprenden Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29 y Vk2-30. En un aspecto, los segmentos génicos V^khumanos comprenden V^k3-31, V^k1-32, V^k1-33, V^k3-34, V^k1-35, V^k2-36, V^k1-37, V^k2-38, V^k1-39 y V^k2-40.

En un aspecto específico, los segmentos génicos Vk comprenden segmentos génicos humanos k contiguos de inmunoglobulina que abarcan el locus humano de cadena ligera k de inmunoglobulina desde Vk4-1 hasta Vk2-40, y los segmentos génicos Jk comprenden segmentos génicos contiguos que abarcan el locus humano de cadena ligera k de inmunoglobulina desde Jk1 hasta Jk5.

En un aspecto, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina está ubicada en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano. En un aspecto específico, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano es un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia humana de cadena ligera de inmunoglobulina está ubicada en un locus de cadena ligera no de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano que es transcripcionalmente activo. En un aspecto específico, el locus no de inmunoglobulina es un locus ROSA26.

En un aspecto, se describe un método para hacer un anticuerpo humano, en donde el anticuerpo humano comprende dominios variables procedentes de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable codificadas en una célula de un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un anticuerpo anti-idiotipo, en donde el anticuerpo anti-idiotipo comprende dominios variables procedentes de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable codificadas en una célula de un animal no humano como se describe en el presente documento, comprendiendo el método exponer un animal no humano como se describe en el presente documento a un anticuerpo que comprende dominios variables humanos. En un aspecto, el anticuerpo anti-idiotipo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena pesada. En un aspecto, el anticuerpo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena ligera.

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-idiotipo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena pesada, en donde el dominio humano variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h6 -1, V^h1-2, V^h1-3, V^h2-5, V^h3-7, V^h1-8, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h1-18, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h1-24, V^h2-26, V^h4-28, V^h3-30, V^h4-31, V^h3-33, V^h4-34, V^h3-35, V^h3-38, V^h4-39, V^h3-43, V^h1-45, V^h1-46, V^h3-48, V^h3-49, V^h5-51, V^h3-53, V^h1-58, V^h4-59, V^h4-61, V^h3-64, V^h3-66, V^h1-69, V^h2-70, V^h3-72, V^h3-73 y V^h3-74.

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-idiotipo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena pesada, en donde el dominio humano variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reordenado seleccionado de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-70, V^h3-15, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-49, V^h3-64, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5 -51 y V^h7-4-1.

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-idiotipo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena ligera, en donde el dominio humano variable de cadena ligera comprende un segmento génico V^khumano reordenado seleccionado de V^k4-1, V^k5-2, V^k7-3, V^k2-4, V^k1-5, V^k1-6, V^k3-7, V^k1-8, V^k1-9, V^k2-10, V^k3-11, V^k1-12, V^k1-13, V^k2-14, V^k3-15, V^k1-16, V^k1-17, V^k2-18, V^k2-19, V^k3-20, V^k6-21, V^k1-22, V^k1-23, V^k2-24, V^k3-25, V^k2-26, V^k1-27, V^k2-28, V^k2-29, V^k2-30, V^k3-31, V^k1-32, V^k1-33, V^k3-34, V^k1-35, V^k2-36, V^k1-37, V^k2-38, V^k1-39 y Vk2-40.

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-idiotipo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena ligera, en donde el dominio humano variable de cadena ligera comprende un segmento génico V^k1-39 humano reordenado.

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-idiotipo es específico o puede unirse a un dominio humano variable de cadena ligera, en donde el dominio humano variable de cadena ligera comprende un segmento génico VA humano reordenado seleccionado de VA3-1, VA4-3, VA2-8, VA3-9, VA3-10, VA2-11, VA3-12, VA2-14, VA3-16, VA2-18, VA3-19, VA3-21, VA3-22, VA2-23, VA3-25, VA3-27, VA3-32, VA2-33, VA2-34, VA1-36, VA1-40, VA7-43, VA1-44, MA5-45, VA7-46, VA1-47, VA5-48, VA9-49, VA1-50, VA1-51, VA5-52, VA10-54, VA11-55, VA6-57, VA4-60, VA8-61 y VA4-69.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un anticuerpo anti-idiotipo, en donde el anticuerpo anti-idiotipo comprende dominios variables procedentes de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable codificadas en una célula de un animal no humano que comprende un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un único segmento génico V^hhumano, 27 segmentos génicos D^hy seis segmentos génicos J^h, y en donde el anticuerpo anti-idiotipo es específico o es capaz de unirse a un dominio humano variable de cadena pesada que comprende un segmento génico V^h1-69 humano reordenado, comprendiendo el método exponer el animal no humano a un anticuerpo que comprende el segmento génico V^h1-69 humano reordenado y aislar el anticuerpo anti-idiotipo del animal no humano. En un aspecto específico, el único segmento génico V^hhumano se selecciona de un segmento génico V^h1-2 humano o un segmento génico V^h1-69 humano.

En un aspecto, se describe un método para fabricar un anticuerpo anti-idiotipo, en donde el anticuerpo anti-idiotipo comprende dominios variables procedentes de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable codificadas en una célula de un animal no humano que comprende un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un único segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH y seis segmentos génicos JH, y en donde el anticuerpo anti-idiotipo es específico o es capaz de unirse a un dominio humano variable de cadena ligera que comprende un segmento génico V^k1-39 humano reordenado, comprendiendo el método exponer el animal no humano a un anticuerpo que comprende el segmento génico Vk1-39 humano y aislar el anticuerpo del animal no humano. En un aspecto específico, el único segmento génico VH humano se selecciona de un segmento génico V^h1-2 humano o un segmento génico V^h1 -69 humano.

En un aspecto, se describe una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que procede de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable aisladas de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, el polipéptido es un anticuerpo. En un aspecto, el polipéptido es un anticuerpo solo de cadena pesada. En un aspecto, el polipéptido es un fragmento variable de cadena única (por ejemplo, un scFv).

En un aspecto, se describe el uso de un animal no humano como se describe en el presente documento para hacer un anticuerpo. En diversos aspectos, el anticuerpo comprende uno o más dominios variables que proceden de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable aisladas del animal no humano. En un aspecto específico, las secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto específico, las secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden segmentos génicos de cadena ligera de inmunoglobulina.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia cómo hacer y usar los métodos y composiciones descritos en el presente documento. A menos que se indique otra cosa, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.

Ejemplo 1

Construcción de un locus humanizado restringido de IgH

Un locus humano de cadena pesada genomanipulado de manera única que contiene un único segmento génico V^hhumano ubicado cadena arriba de todos los segmentos génicos D^hy J^hhumanos puede construirse mediante recombinación homóloga usando ADN de cromosoma bacteriano artificial (BAC). Los ejemplos de segmentos génicos VH humanos empleados para la construcción de dicho locus de cadena pesada de inmunoglobulina incluyen segmentos génicos V^hpolimórficos y/o segmentos génicos V^hasociados con una variación en el número de copias, tales como, por ejemplo, V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, y V^h3-23. La tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® puede emplearse para la creación de un locus de cadena pesada que contiene solo V^husando varias construcciones de selección (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. 6.586.251 y Valenzuela, D.M. et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnology 21(6): 652-659).

Estrategia ejemplar para la construcción de un locus humano restringido V^h1-69 de IgH (Figura 1). En la primera etapa, un BAC humano modificado que contenía múltiples segmentos génicos V^hhumanos distales (en 5'), incluido VH1-69, un casete de selección cadena arriba (por ejemplo, higromicina) y un brazo de homología de ratón en 5' se dirigió mediante recombinación homóloga con un segundo casete de selección (por ejemplo, espectinomicina), que también contenía una secuencia señal de recombinación modificada (Etapa 1, Figura 1). Esta secuencia señal de recombinación (SSR) modificada introdujo dos mutaciones puntuales (T a A y G a A) en la región de SSR en 3' del gen humano V^h1-69 cambiando el nonámero SSR a la secuencia consenso óptima. Por lo tanto, la Etapa 1 dio como resultado un fragmento genómico humano que contenía el segmento génico V^h1-69 humano con una SSR modificada en 3', un sitio de restricción AsiSI único a aproximadamente 180 pb cadena abajo de la SSR y un casete de espectinomicina.

La Etapa 2 incluyó el uso de un casete de neomicina (Neo) flanqueado por sitios Frt para eliminar el casete de selección (higromicina) y segmentos génicos adicionales VH humanos cadena arriba (en 5'). Esta modificación fue dirigida, mediante recombinación homóloga, de 5' al segmento génico VH1-69 humano para dejar intactos aproximadamente 8,2 kb de la región promotora del V^h1-69 humano y el brazo de homología de ratón en 5'.

La Etapa 3 incluyó otro casete de selección (espectinomicina) flanqueado por sitios de restricción genomanipulados de manera única (por ejemplo, Pl-Scel y AsiSI) dirigidos mediante recombinación homóloga a un fragmento genómico humano que contiene los primeros tres segmentos génicos funcionales VH humanos y todos los segmentos génicos D^hy J^hhumanos (Figura 1). El fragmento genómico humano estaba previamente dirigido mediante recombinación homóloga con un casete de neomicina y contenía brazos de homología en 5' y 3' que contenían la secuencia genómica de ratón en 5' y 3' del locus endógeno de cadena pesada, incluido el potenciador intrónico en 3' y el gen IgM. Esta modificación eliminó la secuencia genómica de ratón en 5' y los segmentos génicos V^hhumanos, dejando aproximadamente 3,3 kb de la región intergénica V^h-D^hcadena arriba del segmento génico DH1-1 humano, todos los segmentos DH y JH humanos, y el fragmento genómico de ratón en 3' que contenía el potenciador intrónico en 3' y el gen IgM (Figura 1).

La Etapa 4 se realizó mediante el uso de los sitios de restricción únicos (descritos anteriormente) para cortar, seguido de la unión de los dos BAC modificados de la Etapa 2 y la Etapa 3, que produjeron la construcción de direccionamiento final. La construcción de direccionamiento final para la creación de un locus modificado de cadena pesada que contiene un segmento génico V^h1-69 humano, todos los segmentos génicos D^hhumanos y todos los segmentos génicos J^hhumanos en las células ME contenían, de 5' a 3', un brazo de homología en 5' que contenía aproximadamente 20 kb de secuencia genómica de ratón cadena arriba del locus endógeno de cadena pesada, un sitio Frt en 5', un casete de neomicina, un sitio Frt en 3', aproximadamente 8,2 kb del promotor V^h1-69 humano, el segmento génico V^h1-69 humano con una SSR modificada en 3', 27 segmentos génicos D^hhumanos, seis segmentos J^hhumanos y un brazo de homología en 3' que contenía aproximadamente 8 kb de secuencia genómica de ratón cadena abajo de los segmentos génicos J^hde ratón, incluido el potenciador intrónico en 3' y el gen IgM (Figura 1).

Estrategia ejemplar para la construcción de un locus humano restringido V^h1-2 de IgH (Figura 2). De forma similar, se emplean otros segmentos génicos VH polimórficos en el contexto de regiones constantes de cadena pesada de ratón para construir una serie de ratones que tienen un número restringido de segmentos V de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5), en donde los segmentos V son variantes polimórficas de un miembro de la familia génica V. Los segmentos génicos V^hpolimórficos ejemplares proceden de segmentos génicos V^hhumanos que incluyen, por ejemplo, V^h1-2, V^h2-26, V^h2-70, y V^h3-23). Dichos segmentos génicos V^hhumanos se obtienen, por ejemplo, mediante síntesis de novo (por ejemplo, Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) usando secuencias disponibles en bases de datos publicadas. Por lo tanto, los fragmentos de ADN que codifican cada gen V^h, en algunos aspectos, se generan de forma independiente para su incorporación en vectores de direccionamiento, como se describe en el presente documento. De esta forma, los loci modificados múltiples de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden un número restringido de segmentos génicos V^hse genomanipulan en el contexto de regiones constantes de cadena pesada de ratón. En la Figura 2 se muestra una estrategia de direccionamiento ejemplar para crear un locus humanizado restringido de cadena pesada que contiene un segmento génico V^h1-2 humano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos.

En resumen, un clon BAC humano modificado que contiene tres segmentos génicos V^hhumanos (V^h6-1, V^h1-2, V^h1-3), 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos (véase el documento USSN 13/404.075; presentado el 24 de febrero de 2012) se utiliza para crear un locus humanizado restringido de cadena pesada que contiene un segmento génico V^h1-2 humano. Este clon BAC modificado une funcionalmente los segmentos génicos humanos de cadena pesada mencionados anteriormente con el potenciador intrónico de ratón y la región constante de IgM. El locus de cadena pesada basado en V^h1-2 humano restringido se logra mediante dos recombinaciones homólogas usando el clon BAC humano modificado descrito anteriormente. En la primera recombinación homóloga, 205 pb del segmento génico V^h6-1 humano (desde aproximadamente 10 pb cadena arriba (en 5') del codón de inicio VH6-1 en el exón 1 hasta aproximadamente 63 pb cadena abajo (en 3') del comienzo del exón 2) en el clon BAC humano modificado se elimina mediante recombinación homóloga bacteriana usando un casete de espectinomicina (aadA) flanqueado por sitios de restricción de Pl-Scel únicos (Figura 2, BHR 1). Esto permite la posterior eliminación del casete aadA sin interrumpir otros segmentos génicos humanos dentro del locus restringido de cadena pesada. En la segunda recombinación homóloga, el extremo 5' del clon BAC humano modificado que incluye todo el segmento génico V^h1-3 humano y aproximadamente 60 pb cadena abajo (en 3') del segmento génico se elimina mediante recombinación homóloga usando un casete de higromicina que contiene que contiene sitios de restricción flanqueantes AsiSl en 5' y Ascl en 3' (Figura 2, BHR 2). Tal como se ha descrito anteriormente, el casete de espectinomicina se elimina opcionalmente después de la confirmación del vector de direccionamiento final que incluye la eliminación de los dos segmentos génicos VH humanos que flanquean el segmento génico V^h1-2 humano (Figura 2, parte inferior). Un vector de direccionamiento V^h1-2 humano ejemplar se expone en la SEQ ID NO: 75.

El empleo de segmentos génicos polimórficos V^hen un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina representa un enfoque novedoso para generar anticuerpos, poblaciones de anticuerpos y poblaciones de linfocitos B que expresan anticuerpos que tienen cadenas pesadas con diversas CDR procedentes de un único segmento génico V^hhumano. La explotación de la maquinaria de hipermutación somática del animal hospedador junto con la asociación combinatoria con los dominios humanos reordenados variables de cadena ligera de inmunoglobulina dan como resultado la genomanipulación de cadenas pesadas únicas y pares V^h/V^lúnicos que expanden el repertorio inmunitario de animales genéticamente modificados y mejoran su utilidad como una plataforma de próxima generación para elaborar tratamientos humanos, especialmente útil como plataforma para fabricar anticuerpos neutralizantes específicos para patógenos humanos.

En base a la estructura final deseada del locus, uno de los otros segmentos génicos VH humanos puede sustituirse de manera similar usando clones BAC humanos que contienen el segmento génico VH humano deseado. Por lo tanto, el uso de la estrategia descrita anteriormente para la incorporación de segmentos génicos VH polimórficos adicionales y / u otros en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón permite la generación de nuevos repertorios de anticuerpos para su uso en la neutralización de patógenos humanos que de otro modo podrían evadir eficazmente el sistema inmunitario del hospedador.

Las células ME dirigidas anteriormente descritas se utilizan como células ME donantes y se introducen en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (supra). Se identifican ratones que tienen un locus humanizado de cadena pesada que contiene un único segmento génico VH humano, todos los segmentos génicos DH y JH humanos unidos operativamente a los genes de región constante de inmunoglobulina de ratón mediante genotipado usando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., Supra) que detectó la presencia del casete de neomicina, el segmento génico V^hhumano y una región dentro de los segmentos génicos D^hy J^hhumanos, así como las secuencias endógenas de cadena pesada. La Tabla 3 expone los cebadores y las sondas que se usan para confirmar que los ratones albergan un locus restringido de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^h1-69 humano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos. Los ratones que llevan un locus genomanipulado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^hhumano pueden criarse en una cepa de ratón delectora FLPe (véase, por ejemplo, Rodriguez, C.I. et al. (2000) Highefficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25: 139-140) para eliminar cualquier casete de neomicina Frt'ed introducido mediante el vector de direccionamiento que no se elimina, por ejemplo, en la fase de célula ME o en el embrión. Opcionalmente, el casete de neomicina se retiene en los ratones. Las crías se genotipan y una cría heterocigota para un locus humanizado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^hhumano, todos los segmentos D^hy J^hhumanos unidos operativamente a los genes endógenos constantes de inmunoglobulina de ratón se seleccionan para caracterizar el repertorio de cadena pesada de inmunoglobulina.

Tabla 3

Nombre (Región detectada) Secuencia (5'-3')_______________________ SEQ ID NO:

hyg Directo: TGCGGCCGAT CTTAGCC 7 (casete de higromicina) Inverso: TTGACCGATT CCTTGCGG 8 Sonda: ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C 9 neo Directo: GGTGGAGAGG CTATTCGGC 10 (casete de neomicina) Inverso: GAACACGGCG GCATCAG 11 Sonda: TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG 12 hlgH9T Directo: TCCTCCAACG ACAGGTCCC 13

Inverso: GATGAACTGA CGGGCACAGG 14 (secuencia genómica D^h- J^h

humana) Sonda: TCCCTGGAAC TCTGCCCCGA CACA 15

Directo: CTCTGTGGAA AATGGTATGG AGATT 16

77h3 Inverso: GGTAAGCATA GAAGGTGGGT ATCTTT 17 (segmento génico V^h1-69 humano) Sonda: ATAGAACTGT CATTTGGTCC AGCAATCCCA 18 mlgHA7 Directo: TGGTCACCTC CAGGAGCCTC 19

Inverso: GCTGCAGGGT GTATCAGGTG C 20 (secuencia genómica D^h- J^hde

ratón) Sonda: AGTCTCTGCT TCCCCCTTGT GGCTATGAGC 21

88710T Directo: GATGGGAAGA GACTGGTAAC ATTTGTAC 22 (secuencia genómica V^hde ratón en Inverso: TTCCTCTATT TCACTCTTTG AGGCTC 23

3') Sonda: CCTCCACTGT GTTAATGGCT GCCACAA 24 mlgHd10 Directo: GGTGTGCGAT GTACCCTCTG AAC 25

Inverso: TGTGGCAGTT TAATCCAGCT TTATC

(secuencia genómica V^hde ratón en Sonda: CTAAAAATGC TACACCTGGG GCAAAACACC

5') TG 2627 mlgHp2 Directo: GCCATGCAAG GCCAAGC 28 (secuencia genómica J^hde ratón) Inverso: AGTTCTTGAG CCTTAGGGTG CTAG 29

Sonda: CCAGGAAAAT GCTGCCAGAG CCTG 30 Ejemplo 2

Regenomanipulación de genes ADAM en un locus humanizado restringido de IgH

Los ratones con loci humanizados de cadena pesada de inmunoglobulina en los que los segmentos génicos endógenos de región variable (VDJ) han sido reemplazados y/o eliminados carecen de expresión de genes ADAM6 endógenos. En particular, los ratones machos que comprenden dichos loci humanizados de cadena pesada de inmunoglobulina demuestran una reducción en la fertilidad. Por lo tanto, la capacidad de expresar ADAM6 se regenomanipuló en ratones con loci humanizados de cadena pesada, aunque restringidos, para perpetuar las cepas modificadas de ratones utilizando métodos de reproducción normales.

Regenomanipulación de genes ADAM6 en un locus humano restringido V^h1-69 de IgH (Figura 3). Un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina que contiene un único segmento génico V^h1-69 humano ubicado cadena arriba de todos los segmentos génicos D^hy J^hhumanos se regenomanipularon para contener un fragmento genómico que codifica ADAM6a y ADAM6b de ratón (SEQ ID NO: 77) mediante recombinación homóloga usando ADN de BAC. Esto se logró mediante la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (supra) en una serie de seis etapas que incluyeron la modificación de ADN de BAC que contiene secuencias de ratones y humanas que produjeron un vector de direccionamiento final que contiene un locus humanizado restringido de cadena pesada contiguo con regiones constantes de cadena pesada de ratón y genes ADAM6 de ratón.

Primero, se preparó un fragmento genómico de ratón que codificaba ADAM6a y ADAM6b de ratón para su inserción en un locus humanizado de cadena pesada que contiene un único segmento génico V^hmediante una serie de tres recombinaciones bacterianas homólogas que implican diferentes casetes de selección para posicionar de manera única los sitios de restricción alrededor de los genes ADAM6 de ratón (Figura 3, Etapas 1 - 3). En la primera etapa, el ADN de BAC de ratón que contenía una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón se dirigió con un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación, que fue genomanipulado para contener sitios de restricción AsiSI únicos. En la segunda etapa, el fragmento modificado de ratón que contenía genes ADAM6 de ratón y el casete de neomicina se dirigió para eliminar los segmentos génicos D^hy J^hde ratón y reemplazarlos con un casete de espectinomicina que contenía un sitio de restricción Ascl único colocado en 5' del gen de selección. En la tercera etapa, el fragmento doblemente modificado de ratón que contenía un casete de neomicina colocado entre los genes ADAM6 del ratón y un casete de espectinomicina se dirigió para cambiar el casete de neomicina por un casete de higromicina. Esto se llevó a cabo de modo que el fragmento genómico modificado de ratón que contenía los genes ADAM6 pudiera insertarse mediante la unión de fragmentos genómicos compatibles en un locus humanizado de cadena pesada que contiene el único segmento génico V^h.

En la cuarta etapa, un locus humanizado de cadena pesada que contiene un segmento génico V^h1-69 humano, 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos J^hhumanos se dirigió por separado mediante recombinación homóloga bacteriana con un casete de espectinomicina que contiene sitios únicos de restricción I-Ceul y Ascl en ubicaciones en 5' y 3' en el casete, respectivamente (Figura 3, arriba a la izquierda). Después de esta etapa, el fragmento genómico modificado que contiene un locus humanizado restringido de cadena pesada, casetes de neomicina y espectinomicina y el fragmento de ratón modificado que contiene los genes ADAM6, casetes de higromicina y espectinomicina se digirieron por separado con enzimas de restricción I-Ceul y Ascl para crear fragmentos genómicos modificados mediante unión (Figura 3, centro). En la quinta etapa, los fragmentos genómicos digeridos apropiados se purificaron y se unieron para producir un locus humanizado regenomanipulado de cadena pesada que contiene un único segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos, seis segmentos génicos JH humanos y un fragmento genómico de ratón integrado que codifica ADAM6a y ADAM6b con resistencia a neomicina e higromicina. En la etapa final (Etapa 6), el casete de higromicina se eliminó mediante digestión con AsiSI seguido de la relegación de los extremos compatibles.

Esta etapa produjo el vector de direccionamiento final para la reinserción de secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en un locus humanizado restringido de cadena pesada, que contenía, de 5' a 3', un brazo de homología en 5' que contenía aproximadamente 20 kb de secuencia genómica de ratón cadena arriba del locus endógeno de cadena pesada, un sitio Frt en 5', un casete de neomicina, un sitio Frt en 3', aproximadamente 8,2 kb del promotor V^h1-69 humano, el segmento génico V^h1-69 humano con una SSR modificada en 3', un fragmento genómico de ratón que contenía aproximadamente 17711 pb de secuencia genómica de ratón que incluye genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (SEQ ID NO: 77), un fragmento genómico humano que contiene 27 segmentos génicos D^hhumanos y seis segmentos génicos JH humanos, y un brazo de homología en 3' que contenía aproximadamente 8 kb de la secuencia genómica del ratón cadena abajo del locus endógeno de cadena pesada que incluye el potenciador intrónico y el gen de la región constante de IgM (vector de direccionamiento V^h1-69/A6 humano, SEQ ID NO: 74; Figura 3, abajo).

Regenomanipulación de genes ADAM6 en un locus humano restringido V^h1-2 de IgH (Figura 4).

Un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina que contiene un único segmento génico V^h1-2 humano ubicado cadena arriba de todos los segmentos génicos D^hy J^hhumanos se regenomanipularon para contener un fragmento genómico que codifica ADAM6a y ADAM6b de ratón (SEQ ID NO: 73) mediante recombinación homóloga usando ADN de BAC. Esto se logró mediante la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (supra) en una serie de etapas que incluyeron la modificación de ADN de BAC que contiene secuencias de ratones y humanas que produjeron un vector de direccionamiento final que contiene un locus humanizado restringido de cadena pesada contiguo con regiones constantes de cadena pesada de ratón y genes ADAM6 de ratón.

Un clon BAC humano modificado que contiene un único segmento génico V^h1-2 humano flanqueado por casetes de higromicina en 5' y de espectinomicina en 3', 27 segmentos génicos D^hhumanos, seis segmentos génicos J^hhumanos, un potenciador intrónico de cadena pesada de ratón y una región constante de IgM de ratón (descrito anteriormente en el Ejemplo 1) se modificó para contener un fragmento genómico que codifica genes ADAM6 de ratón. Esto se logra mediante un método de ensamblaje de ADN isotérmico modificado denominado en el presente documento ensamblaje isotérmico mediado por oligonucleótido, que se basa en el método descrito en Gibson et al. (2009, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods 6(5):343-345). Este método modificado no requiere identidad de secuencia entre los fragmentos unidos. En cambio, la identidad de secuencia es impartida por un oligonucleótido que sirve para unir los dos fragmentos. Adicionalmente, el oligonucleótido sirve como plantilla que añade identidad de secuencia al final de uno de los fragmentos. El fragmento extendido permite la hibridación con el segundo fragmento. Específicamente, se empleó un ensamblaje isotérmico mediado por oligonucleótido para reemplazar el casete de higromicina con un fragmento Notl-Ascl que contiene un brazo de homología de IgH de ratón distal de 20 kb, el gen ADAM6a de ratón, un casete de neomicina flanqueado por sitios Frt y el gen ADAM6b de ratón.

En resumen, el clon BAC humano modificado que contiene un locus humano restringido de cadena pesada V^h1-2 (Figura 4, arriba a la izquierda) se digiere con AsiSI y Ascl para eliminar el casete de higromicina, y un BAC modificado de ratón que contiene los genes ADAM6 de ratón (Figura 4, arriba a la derecha) se digiere con Notl y Ascl para eliminar el fragmento que contiene el brazo del ratón en 5' y liberar los genes ADAM6 del ratón que

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ratón que tiene en su genoma:

(b) una secuencia que codifica una proteína ADAM6a de ratón o un fragmento funcional de la misma y una secuencia que codifica una proteína ADAM6b de ratón o un fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6a de ratón o fragmento funcional de la misma y la proteína ADAM6b de ratón o fragmento funcional de la misma son funcionales en un ratón macho, en donde dichas secuencias codificantes están ubicadas en una posición diferente de un locus ADAM6 de un ratón de tipo silvestre

de modo que, en respuesta a la exposición a un antígeno, los linfocitos B del ratón expresan dominios variables de cadena pesada humanos expresados a partir de una secuencia humana de región variable de cadena pesada que incluye un segmento génico V^hque es idéntico a o una versión hipermutada de forma somática de, V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos; en donde dicho ratón carece de un gen ADAM6 endógeno funcional.

2. El ratón de la reivindicación 1, en donde:

(I) el único segmento génico V^hhumano es una variante polimórfica de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26 o V^h2-70;

(II) las secuencias codificantes están presentes en una posición en el genoma de ratón diferente de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina;

(III) las secuencias codificantes están yuxtapuestas o contiguas con la secuencia genómica humana no reordenada;

(IV) la secuencia genómica humana no reordenada está presente en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina;

(V) la secuencia genómica humana no reordenada está presente en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina y las secuencias codificantes están presentes en una posición en el genoma de ratón diferente de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina;

(VI) el ratón comprende una eliminación de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos; o

(VII) el gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón está en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

3. El ratón de la reivindicación 1, en donde:

(I) el único segmento génico V^hhumano es V^h1-69; o

(II) el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2.

4. El ratón de la reivindicación 1, en donde:

(I) la secuencia genómica humana no reordenada comprende el segmento génico V^h1-69 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos; o

(II) la secuencia genómica humana no reordenada comprende el segmento génico V^h1-2 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos.

5. El ratón de la reivindicación 1 o 4, que comprende además en su genoma uno o más segmentos génicos Vk humanos y uno o más segmentos génicos Jk humanos, en donde, opcionalmente, el uno o más segmentos génicos Vk humanos y uno o más segmentos génicos Jk humanos están presentes en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina.

6. Un ratón que comprende en su genoma una secuencia de ácido nucleico que comprende un único segmento génico VH humano, al menos un segmento génico DH humano y al menos un segmento génico JH humano, en donde el único segmento génico V^hhumano, el uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y el uno o más segmentos génicos J^hhumanos están unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos, en donde el ratón carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, y en donde el ratón comprende secuencias ectópicas de ADAM6 de ratón que codifican una proteína ADAM6a o un fragmento funcional de la misma y una proteína ADAM6b o un fragmento funcional de la misma.

7. El ratón de la reivindicación 6, en donde:

(I) las secuencias ADAM6 ectópicas de ratón están presentes en un locus endógeno de inmunoglobulina; o (II) las secuencias ADAM6 ectópicas de ratón están presentes en el genoma de ratón en una posición distinta de un locus endógeno de inmunoglobulina.

8. Una célula o tejido procedente del ratón de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula o tejido comprende

9. Un método para fabricar un anticuerpo humano que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina procedente de un único segmento génico VH humano, comprendiendo el método

(a) inmunizar el ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con un antígeno de interés;

10. El método de la reivindicación 9, en donde:

(I) el dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina es al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 5;

(II) el dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina comprende la SEQ ID NO: 5;

(III) el dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina es al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 64; o

(IV) el dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina comprende la SEQ ID NO: 64.

11. Un método para modificar un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de un ratón para proporcionar un ratón cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que incluye un único segmento VH humano, comprendiendo el método:

(a) realizar una primera modificación del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que incluye la inserción de un único segmento VH humano y da como resultado una reducción o eliminación de la actividad ADAM6 endógena de ratón en un ratón macho, en donde el único segmento génico V^hhumano es V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, o una variante polimórfica de los mismos; y,

12. Un método para generar un anticuerpo específico contra un antígeno que comprende las etapas de:

(a) inmunizar el ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con el antígeno;

13. El método de la reivindicación 12, en donde:

(I) el cultivo en la etapa (c) se realiza en al menos una célula de hibridoma generada a partir de la al menos una célula obtenida en la etapa (b);

(II) la al menos una célula obtenida en la etapa (b) procede del bazo, un ganglio linfático o la médula ósea del ratón de la etapa (a); o

(III) la inmunización con el antígeno de la etapa (a) se lleva a cabo con proteína, ADN, una combinación de ADN y proteína, o células que expresan el antígeno.

14. Uso del ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio humano variable de cadena pesada de inmunoglobulina.