RS62121B1 - Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca - Google Patents

Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca

Info

Publication number
RS62121B1
RS62121B1 RS20210879A RSP20210879A RS62121B1 RS 62121 B1 RS62121 B1 RS 62121B1 RS 20210879 A RS20210879 A RS 20210879A RS P20210879 A RSP20210879 A RS P20210879A RS 62121 B1 RS62121 B1 RS 62121B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
mouse
gene
heavy chain
sequence
Prior art date
Application number
RS20210879A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
John Mcwhirther
Naxin Tu
Sean Stevens
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS62121B1 publication Critical patent/RS62121B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Opisane su genetskim inženjeringom modifikovane nehumane životinje koje sadrže varijabilni gen imunoglobulinskog teškog lanca smanjene kompleksnosti, pri čemu su nehumane životinje sposobne da izražavaju ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Opisane su genetskim inženjeringom modifikovane nehumane životinje koje izražavaju antitela iz ograničenog broja varijabilnih genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca i/ili njihovih varijanti, pri čemu nehumanim životinjama nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, ali zadržavaju ADAM6 funkciju, uključujući miševe koji sadrže modifikaciju endogenog lokusa varijabilnog (VH) regiona imunoglobulinskog teškog lanca koja čini miša nesposobnim da proizvodi funkcionalni ADAM6 protein i rezultuje gubitkom plodnosti. Opisani su genetskim inženjeringom modifikovani miševi koji sadrže imunoglobulinski VH lokus koji je karakterisan ograničenim brojem VH genskih segmenata, npr. samo jednim imunoglobulinskim VH segmentom, npr. humanim VH1-69 genskim segmentom ili humanim VH1-2 genskim segmentom, i koji dalje sadrže ADAM6 funkciju, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja ponovo uspostavlja plodnost kod mužjaka miša.
[0002] Opisani su genetskim inženjeringom modifikovani miševi, ćelije, embrioni, i tkiva koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni ADAM6 lokus, pri čemu miševi, ćelije, embrioni, i tkiva izražavaju imunoglobulinski teški lanac koji potiče od samo jednog humanog VH genskog segmenta. Dalje, miševima, ćelijama, embrionima, i tkivima nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, ali zadržavaju ADAM6 funkciju koja je karakterisana prisustvom ektopične sekvence nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein. Opisani su postupci za dobijanje sekvenci antitela u plodnim nehumanim životinjama koje su korisne za vezivanje patogena, uključujući humane patogene.
STANJE TEHNIKE
[0003] Nehumane životinje, npr. miševi, su genetskim inženjeringom modifikovane da bi postale korisna oruđa u postupcima za dobijanje sekvenci antitela za humane terapeutike bazirane na antitelima. Miševi sa humanizovanim lokusima varijabilnog regiona (npr. VH, DH, i JH genima, i VL i JL genima) se koriste za generisanje srodnih varijabilnih domena teškog i lakog lanca za primenu u terapeuticima sa antitelima. Miševi koji generišu potpuno humana antitela sa srodnim teškim i lakim lancima su poznati u odgovarajućoj oblasti. Za kreiranje ovih miševa je bilo neophodno da se onesposobe endogeni mišji imunoglobulinski geni, tako da bi slučajno integrisani potpuno humani transgeni funkcionisali tako da izražavaju repertoar imunoglobulina u mišu. Takvi miševi mogu proizvoditi humana antitela koja su podesna za primenu kao humani terapeutici, ali ove miševe odlikuju značajni problemi sa njihovim imunim sistemima. Ovi problemi su doveli do nekoliko eksperimentalnih prepreka, na primer, miševi su nepraktični za generisanje dovoljno raznovrsnih repertoara antitela, zahtevaju primenu opsežnih popravki re-inženjeringom, obezbeđuju suboptimalni proces klonske selekcije verovatno zbog nekompatibilnosti između humanih i mišjih elemenata, i potrebno je da nepouzdani izvor velikih i raznovrsnih populacija humanih varijabilnih sekvenci bude zaista koristan za dobijanje humanih terapeutika.
[0004] Humani terapeutici sa antitelima se dobijaju inženjeringom na osnovu željenih karakteristika u pogledu izabranih antigena. Humanizovani miševi se imunizuju izabranim antigenima, pa se imunizovani miševi koriste za generisanje populacija antitela iz kojih se identifikuju visoko-afinitetni srodni teški i laki varijabilni domeni sa željenim karakteristikama vezivanja. Neki humanizovani miševi, kao što su oni koji imaju humanizaciju samo varijabilnih regiona na endogenim mišjim lokusima, generišu populacije B ćelija koje su po karakteru i broju slične populacijama B ćelija kod miševa divljeg tipa. Kao rezultat ovoga, u ovim miševima se nalazi na raspolaganju ekstremno velika i raznovrsna populacija B ćelija iz koje se vrši skrining antitela, koja odražavaju veliki broj različitih imunoglobulinskih rearanžiranja, da bi se identifikovali teški i laki varijabilni domeni sa najpoželjnijim karakteristikama.
[0005] Međutim, svi antigeni ne provociraju imunu reakciju koju odlikuje veoma veliki broj rearanžiranja od široke selekcije varijabilnih (V) segmenata. To jest, humana humoralna imuna reakcija na izvesne antigene je očigledno ograničena. Ograničenje se odražava na klonsku selekciju B ćelija koje izražavaju samo izvesne V segmente koji se vezuju za specifični antigen sa dovoljno velikim afinitetom i specifičnošću. Neki takvi antigeni su klinički značajni, tj. više njih su dobro poznati humani patogeni. Polazi se od pretpostavke da je V segment koji se izražava u humanoj imunoj reakciji V segment koji će, u kombinaciji sa humanim D i humanim J segmentom, verovatnije generisati korisno antitelo sa visokim afinitetom nego slučajno izabrani V segment koji nije bio uočen u reakciji humanih antitela na taj antigen.
[0006] Pretpostavlja se da je prirodna selekcija, tokom milenijuma iskustava ljudi sa patogenom, izabrala najefikasniju osnovu ili bazu za kreiranje svog najefikasnijeg oružja za neutralizaciju patogena izabranog V genskog segmenta. U odgovarajućoj oblasti postoji potreba za superiornim antitelima koja vezuju i/ili neutralizuju antigene kao što su gore razmotreni patogeni. Postoji potreba za bržim generisanjem korisnih sekvenci od izabranih V genskih segmenata, uključujući polimorfne i/ili somatski mutirane izabrane V genske segmente i za bržim generisanjem korisnih populacija B ćelija koje imaju rearanžiranja V genskih segmenata sa različitim D i J genskim segmentima, uključujući njihove somatski mutirane verzije, a naročito rearanžiranja sa jedinstvenim i korisnim CDR3 regionima. Postoji potreba za poboljšanim biološkim sistemima, npr. nehumanim životinjama (kao što su, npr. miševi, pacovi, zečevi, itd.) koji mogu generisati terapeutski korisne sekvence varijabilnog regiona antitela od izabranih V genskih segmenata u većem broju i sa većom raznovrsnosti nego što, npr. može biti ostvareno kod postojećih modifikovanih životinja, dok se istovremeno smanjuju ili eliminišu štetne promene koje bi mogle nastati usled genetskih modifikacija. Postoji potreba za poboljšanim biološkim sistemima koji su genetski modifikovani tako da prisile humoralni imuni sistem na klonsku selekciju varijabilnih sekvenci antitela, koje potiču od ograničenih izabranih V genskih segmenata, uključujući, ali bez ograničavanja na srodne varijabilne domene humanog teškog i lakog lanca, koji su korisni u proizvodnji humanih terapeutika na bazi antitela protiv izabranih antigena, uključujući izvesne humane patogene. U odgovarajućoj oblasti ostaje potreba za dobijanjem poboljšanih genetski modifikovanih miševa koji su korisni za generisanje imunoglobulinskih sekvenci, uključujući sekvence humanih antitela, usmerenih na eliminaciju patogena koji opterećuju humanu populaciju.
[0007] Postoji potreba u odgovarajućoj oblasti za terapeutskim antitelima koja su sposobna da neutralizuju virusne antigene, npr. HIV i HCV, uključujući antigenspecifična antitela koja sadrže teške lance koji potiču od samo jednog humanog varijabilnog genskog segmenta. Takođe postoji potreba za drugim postupcima i nehumanim životinjama za dobijanje korisnih antitela, uključujući antitela koja sadrže repertoar teških lanaca koji potiču od samo jednog humanog VH segmenta i imaju raznovrsni set CDR sekvenci koje sadrže teške lance koji se izražavaju sa srodnim humanim lakim lancima, i sadrže ponovno uspostavljanje nepoželjnih efekata koji se pojavljuju usled insercije humanih genomskih sekvenci u genom nehumanih životinja. Potrebni su postupci za selekciju CDRs za vezujuće proteine na bazi imunoglobulina koji obezbeđuju povećanu raznovrsnost vezujućih proteina od kojih se biraju, i povećanu raznovrsnost imunoglobulinskih varijabilnih domena, uključujući kompozicije i postupke za generisanje somatski mutiranih i klonski selekcionisanih imunoglobulinskih varijabilnih domena za primenu, npr. u proizvodnji humanih terapeutika.
SUŠTINA
[0008] Pronalaskom je realizovan postupak dobijanja sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca iz miša, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca izvedena iz humanog VH1-69 genskog segmenta ili humanog VH1-2 genskog segmenta, pri čemu postupak obuhvata:
(a) imuniziranje miša sa antigenom od interesa, pri čemu miš sadrži u svom genomu (i) nerearanžiranu humanu genomsku sekvencu koja sadrži samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata, pri čemu su samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata operativno povezani sa genom konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, i pri čemu je samo jedan humani VH genski segment VH1-2, VH1-69, ili njihova polimorfna varijanta; i
(ii) sekvencu koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i sekvencu koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu su mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment funkcionalni kod mužjaka miša, pri čemu su pomenute kodirajuće sekvence smeštene na poziciji koja je različita od ADAM6 lokusa miša divljeg tipa i
gde miš nije u stanju da obrazuje sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinsog teškog lanca koja ne potiče od humanog VH1-69 genskog segmenta ili humanog VH1-2 genskog segmenta;
(b) dopuštanje pomenutom mišu da razvije imuni odgovor na antigen od interesa; i,
(c) identifikaciju ili izolaciju sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca iz miša, gde sekvenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca kodira varijabilni domen humanog imunoglobulinskog teškog lanca antitela koje se vezuje za antigen od interesa.
[0009] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za dobijanje potpuno humanizovanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji obuhvata imuniziranje miša kao gore koji dale obuhvata u njegovom genomu nearanžiranu humanu genomsku sekvencu koja sadrži jedan ili više humanih VL genskih segmenta i jedan ili više humanih JL genskih segmenata operativno vezanih za mišji konstanti region gena imunoglobulinskog lakog lanca sa pomenutim antigenom, izolovanje bar jedne ćelije iz miša koja proizvodi reverzno-himerno mišje-humano antitelo specifično za antigen, stvaranje bar jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo koje potiče od reverzno himernog mišjeg-humanog antitela specifičnog za antigen, kultivisanje bar jedne ćelije koja proizvodi potpuno humanizovano antitelo i dobijanje pomenutog potpuno humanog antitela.
[0010] Opisani su genetski modifikovani imunoglobulinski lokusi koji sadrže ograničeni broj različitih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca (tj. V gena, VH gena, VH genskih segmenata, ili V genskih segmenata), npr. ne više od jednog, dva ili tri različita V gena; ili nije prisutno više od jednog člana familije V genskih segmenata, npr. u samo jednoj kopiji ili u više kopija i/ili koji sadrže jedan jedan ili više polimorfizama, i prema različitim aspektima lokusima nedostaje sekvenca koja kodira endogeni funkcionalni ADAM6 protein.
[0011] Opisani su lokusi koji su sposobni za rearanžiranje i formiranje gena koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji potiče od repertoara V gena teškog lanca koji je ograničen, npr. to je samo jedan VH genski segment ili je izabran između mnoštva polimorfnih varijanti samo jednog VH genskog segmenta, pri čemu prema različitim aspektima lokusima nedostaje endogeni funkcionalni ADAM6 gen ili njegov funkcionalni fragment.
[0012] Opisani su modifikovani imunoglobulinski lokusi koji obuhvataju lokuse kojima nedostaje endogeni funkcionalni ADAM6 gen i sadrže humane imunoglobulinske sekvence, npr. humani V segment operativno povezan sa humanim ili (ili humanom/nehumanom himeričnom) nehumanom imunoglobulinskom konstantnom sekvencom (i u operativnoj vezi sa, npr. D i/ili J segmentom). Opisani su modifikovani lokusi koji sadrže više kopija samo jednog VH genskog segmenta, pri čemu je DNK ili više kopija sadrži polimorfnu varijantu, i ektopičnu nukeotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov fragment koji je funkcionalan kod nehumane životinje. Opisani su modifikovani lokusi koji sadrže više kopija samo jednog VH segmenta, operativno povezanog sa jednim ili više D segmenata i jednim ili više J segmenata, operativno povezanih sa nehumanom imunoglobulinskom konstantnom sekvencom, npr. mišjom ili pacovskom ili humanom sekvencom. Nehumane životinje koje sadrže takve humanizovane lokuse su takođe opisane, pri čemu nehumane životinje imaju plodnost kao kod divljeg tipa.
[0013] Opisane su nehumane životinje koje sadrže varijabilni lokus imunoglobulinskog teškog lanca (npr. jedan transgen ili kao inserciju ili zamenu na endogenom varijabilnom lokusu teškog lanca nehumane životinje) koji sadrži samo jedan VH segment operativno povezan sa D i/ili J genskim segmentom. Prema različitim aspektima, samo jedan VH genski segment je operativno povezan sa jednim ili više D i/ili jednim ili više J genskih segmenata na endogeni varijabilni genski lokus imunoglobulinskog teškog lanca nehumane životinje. Prema različitim aspektima, nehumane životinje dalje sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov homolog ili ortolog koji je funkcionalan kod mužjaka nehumane životinje koja sadrži modifikovani lokus teškog lanca. Prema različitim aspektima, ektopična nukleotidna sekvenca se graniči sa samo jednim VH segmentom, D genskim segmentom, ili J genskim segmentom. Prema različitim aspektima, ektopična nukleotidna sekvenca se graniči sa neimunoglobulinskom sekvencom u genomu nehumane životinje. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je na istom hromozomu kao modifikovani lokus teškog lanca. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je na različitom hromozomu od modifikovanog lokusa teškog lanca.
[0014] Opisane su nehumane životinje kojima su modifikovani njihovi lokusi varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca da bi se izbrisali svi ili u suštini svi (npr. svi funkcionalni segmenti, ili skoro svi funkcionalni segmenti) endogeni imunoglobulinski VH segmenti i koje sadrže humani VH1-69 segment (ili humani VH1-2 segment) operativno povezan sa D i J segmentom ili J segmentom na endogenomi lokusu varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca nehumane životinje. Takođe su opisane nehumane životinje koje sadrže takve lokuse i kojima nedostaje endogeni ADAM6 gen, odnosno geni.
[0015] Opisani su postupci za dobijanje humanih imunoglobulinskih sekvenci u nehumanim životinjama. Prema različitim aspektima humane imunoglobulinske sekvence potiču od repertoara imunoglobulinskih V sekvenci koje se u suštini sastoje od samo jednog humanog V segmenta, npr. VH1-69 ili VH1-2, i jednog ili više D i J segmenata ili jednog ili više J segmenata. Opisani su postupci za dobijanje humanih imunoglobulinskih sekvenci u nehumanim životinjama, tkivima, i ćelijama, pri čemu humane imunoglobulinske sekvence vezuju patogen.
[0016] Prema jednom aspektu, opisani su konstrukti nukleinske kiseline, ćelije, embrioni, miševi, i postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju koja rezultuje nefunkcionalnim endogenim mišjim ADAM6 proteinom ili ADAM6 genom (npr. nokautom (inaktivacijom) ili delecijom u endogenom ADAM6 genu), pri čemu miševi sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, miševi sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira glodarski ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment; prema specifičnom aspektu, glodarski ADAM6 protein je mišji ADAM6 protein.
[0017] Prema jednom aspektu, opisani su konstrukti nukleinske kiseline, ćelije, embrioni, miševi, i postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa, pri čemu miševi sadrže ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, endogeni mišji imunoglobulinski lokus je lokus imunoglobulinskog teškog lanca, i modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost ćelije ili tkiva mužjaka miša. Prema jednom aspektu, endogeni mišji imunoglobulinski lokus je lokus imunoglobulinskog teškog lanca, i modifikacija održava ili podržava ADAM6 aktivnost ćelije ili tkiva mužjaka miša.
[0018] Prema jednom aspektu, opisan je modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži repertoar V segmenata teškog lanca koji je ograničen u pogledu identičnosti V segmenta, i koji sadrži jedan ili više D segmenata i jedan ili više J segmenata, ili jedan ili više J segmenata. Prema jednom aspektu, V segment teškog lanca je humani segment. Prema jednom aspektu, modifikovanom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca nedostaje endogeni ADAM6 gen. Prema jednom aspektu, modifikovani lokus teškog lanca dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein. Prema specifičnom aspektu, nukleotidna sekvenca se graniči sa V, D i/ili J genskim segmentom na modifikovanom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0019] Prema jednom aspektu, modifikovani lokus je nehumani lokus. Prema jednom aspektu, nehumani lokus je modifikovan sa najmanje jednom humanom imunoglobulinskom sekvencom. Prema jednom aspektu, nehumani lokus je modifikovan sa najmanje jednom humanom imunoglobulinskom sekvencom i sekvencom koja kodira ADAM6 protein.
[0020] Prema jednom aspektu, ograničenje je na jednog člana familije V segmenata. Prema jednom aspektu, jedan član familije V segmenata je prisutan u dve ili više kopija. Prema jednom aspektu, jedan član familije V segmenata je prisutan kao dve ili više varijanti (npr. dva ili više polimorfnih oblika člana familije V segmenata). Prema jednom aspektu, jedan V segment je član familije humanih V segmenata. Prema jednom aspektu, jedan član familije V segmenata je prisutan u više varijanti uočenih u humanoj populaciji što se tiče te varijante. Prema jednom aspektu, član familije V segmenata je izabran iz Tabele 1. Prema jednom aspektu, član familije V segmenata je prisutan u više varijanti, kao što je prikazano, za svaki V segment, u više alela od 1 alela do više alela prikazanih u desnoj koloni Tabele 1.
[0021] Prema jednom aspektu, opisani su miševi koji sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment; takođe su opisani miševi koji sadrže endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment, i najmanje jednu genetsku modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. Prema jednom aspektu, endogena nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment je smeštena na ektopičnoj poziciji u poređenju sa endogenim ADAM6 genom miša divljeg tipa.
[0022] Prema jednom aspektu, opisane su metode za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa, pri čemu miševi sadrže ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0023] Prema jednom aspektu, opisani su postupci za dobijanje miševa koji sadrže genetsku modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu primena postupka rezultuje mužjacima miševa koji sadrže modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca (ili njegovu deleciju), i mužjaci miševa su sposobni da generišu potomstvo parenjem. Prema jednom aspektu, mužjaci miševa su sposobni da proizvode spermu koja može prelaziti iz mišje materice kroz mišji jajovod da bi oplodila mišje jajašce.
[0024] Prema jednom aspektu, opisani su postupci za dobijanje miševa koji sadrže genetsku modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu primena postupka rezultuje mužjacima miševa koji sadrže modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca (ili njegovu deleciju), i mužjake miševa odlikuje smanjena plodnost, i miševi sadrže genetsku modifikaciju koja ponovo uspostavlja u celini ili delimično smanjenu plodnost. Prema različitim aspektima, smanjenje plodnosti je karakterisano nemogućnošću sperme mužjaka miševa da migrira iz mišje materice kroz mišji jajovod da bi oplodila mišje jajašce. Prema različitim aspektima, smanjenje plodnosti je karakterisano spermom koju odlikuje in vivo defekt migracije. Prema različitim aspektima, genetska modifikacija koja ponovo uspostavlja u celini ili delimično smanjenu plodnost je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0025] Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži zamenu endogenih varijabilnih lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sa ograničenim brojem, npr. ne više od jednog, dva ili tri različita varijabilna (VH) genska segmenta teškog lanca, jednog ili više diverzitetnih (DH) genskih segmenata teškog lanca i jednog ili više spojnih (JH) genskih segmenata teškog lanca druge vrste (npr. nemišje vrste). Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži inserciju samo jednog ortologog imunoglobulinskog VH genskog segmenta, najmanje jednog DH genskog segmenta, i najmanje jednog JH genskog segmenta u endogene varijabilne lokuse imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, vrsta je čovek. Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži deleciju endogenog varijabilnog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca u celini ili delimično, pri čemu delecija rezultuje
1
gubitkom endogene ADAM6 funkcije. Prema specifičnom aspektu, gubitak endogene ADAM6 funkcije je povezan sa smanjenjem plodnosti kod mužjaka miševa. Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži inaktivaciju endogenog varijabilnog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca u celini ili delimično, pri čemu delecija ne rezultuje gubitkom endogene ADAM6 funkcije. Inaktivacija može obuhvatiti zamenu ili deleciju jednog ili više endogenih genskih segmenata što rezultuje endogenim lokusom imunoglobulinskog teškog lanca koji u suštini nije sposoban za rearanžiranje da bi kodirao teški lanac antitela koje sadrži endogene genske segmente. Inaktivacija može obuhvatiti druge modifikacije koje čine endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca nesposobnim za rearanžiranje da bi kodirao teški lanac antitela, pri čemu modifikacija ne obuhvata zamenu ili deleciju endogenih genskih segmenata. Ilustrativne modifikacije obuhvataju hromozomske inverzije i/ili translokacije posredovane molekularnim tehnikama, npr. korišćenjem preciznog postavljanja mesno specifičnih rekombinacionih mesta (npr. Cre-lox tehnologijom).
[0026] Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži inserciju u genom miša DNK fragmenta koji sadrži ograničeni broj, npr. ne više od jednog, dva ili tri različita varijabilna (VH) genska segmenta teškog lanca, jednog ili više diverzitetnih (DH) genskih segmenata teškog lanca i jednog ili više spojnih (JH) genskih segmenata teškog lanca druge vrste (npr. nemišje vrste) operativno povezanih sa jednom ili više sekvenci konstantnog regiona (npr. IgM i/ili IgG genom). Prema jednom aspektu, DNK fragment je sposoban da bude podvrgnut rearanžiranju da bi se formirala sekvenca koja kodira teški lanac antitela. Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži inserciju samo jednog ortologog imunoglobulinskog VH genskog segmenta, najmanje jednog DH genskog segmenta, i najmanje jednog JH genskog segmenta u genom miša. Prema specifičnom aspektu, vrsta je čovek. Prema jednom aspektu, genetska modifikacija sadrži deleciju endogenog varijabilnog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca u celini ili delimično da bi se endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca učinio nefunkcionalnim, pri čemu delecija dalje rezultuje gubitkom endogene ADAM6 funkcije. Prema specifičnom aspektu, gubitak endogene ADAM6 funkcije je povezan sa smanjenjem plodnosti kod mužjaka miševa.
[0027] Prema jednom aspektu, opisani su miševi koji sadrže modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 iz endogenog ADAM6 alela tako da mužjaka miša koji ima tu modifikaciju odlikuje smanjena plodnost (npr. veoma smanjena sposobnost da generiše potomstvo parenjem), ili je u suštini neplodan, zbog smanjenja ili eliminacije endogene ADAM6 funkcije, pri čemu miševi dalje sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili njen funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, modifikacija koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 je modifikacija (npr. insercija, delecija, zamena, itd.) u mišjem imunoglobulinskom lokusu. Prema jednom aspektu, imunoglobulinski lokus je lokus imunoglobulinskog teškog lanca.
[0028] Prema jednom aspektu, smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije obuhvata nesposobnost ili suštinsku nesposobnost miša da proizvodi spermu koja može da prođe iz mišje materice kroz mišji jajovod da bi oplodila mišje jajašce. Prema specifičnom aspektu, najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ćelija sperme proizvedenih u zapremini ejakulata miša nije sposobno da prođe kroz jajovod in vivo posle kopulacije i da oplodi mišje jajašce.
[0029] Prema jednom aspektu, smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije sadrži nesposobnost da se formira ili u suštini nesposobnost da se formira kompleks ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelija sperme miša. Prema jednom aspektu, gubitak ADAM6 funkcije sadrži suštinsku nesposobnost oplođenja mišjeg jajašca kopulacijom sa ženkom miša.
[0030] Prema jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, i koji sadrži protein (ili ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein) koji prenosi ADAM6 funkcionalnost na miša. Prema jednom aspektu, miš je mužjak miša, a funkcionalnost sadrži povećanu plodnost u poređenju sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen.
[0031] Prema jednom aspektu, protein je kodiran genomskom sekvencom koja je locirana unutar imunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Prema specifičnom aspektu, imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. Prema sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži samo jedan humani VH, najmanje jedan humani DH i najmanje jedan humani JH genski segment. Prema sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži jedan humani VH genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, ektopični protein je kodiran genomskom sekvencom koja je locirana unutar neimunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Prema jednom aspektu, neimunoglobulinski lokus je transkripciono aktivni lokus. Prema specifičnom aspektu, transkripciono aktivni lokus je ROSA26 lokus. Prema specifičnom aspektu, transkripciono aktivni lokus je povezan sa ekspresijom specifičnom za tkiva. Prema jednom aspektu, ekspresija specifična za tkiva je prisutna u reproduktivnim tkivima. Prema jednom aspektu, protein je kodiran genomskom sekvencom koja je slučajno umetnuta u germinativnu liniju miša.
[0032] Prema jednom aspektu, miš sadrži humani ili himerični humani/mišji ili himerični humani/pacovski laki lanac (npr. humani varijabilni, mišji ili pacovski konstantni) i himerični humani varijabilni/mišji ili pacovski konstantni teški lanac. Prema specifičnom aspektu, miš sadrži transgen koji sadrži gen himeričnog humanog varijabilnog/pacovskog ili mišjeg konstantnog lakog lanca koji je operativno povezan sa transkripciono aktivnim promoterom, npr. ROSA26 promoterom. Prema sledećem specifičnom aspektu, transgen himeričnog humanog/mišjeg ili pacovskog lakog lanca sadrži rearanžiranu sekvencu varijabilnog regiona humanog lakog lanca u germinativnoj liniji miša.
[0033] Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je smeštena unutar imunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Prema specifičnom aspektu, imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. Prema jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži samo jedan humani VH, najmanje jedan humani DH i najmanje jedan humani JH genski segment. Prema specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži samo jedan humani VH, 27 humanih DH genskih segmenata i šest humanih JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je smeštena unutar neimunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Prema jednom aspektu, neimunoglobulinski lokus je transkripciono aktivni lokus. Prema specifičnom aspektu, transkripciono aktivni lokus je ROSA26 lokus. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je postavljena tako što je slučajno umetnuta u germinativnu liniju miša.
[0034] Prema jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja upotpunjava gubitak mišje ADAM6 funkcije. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca obezbeđuje mišu sposobnost da proizvodi potomstvo koje je uporedivo sa odgovarajućim mišem divljeg tipa koji sadrži funkcionalni endogeni ADAM6 gen. Prema jednom aspektu, sekvenca obezbeđuje mišu sposobnost da formira kompleks ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelija sperme miša. Prema jednom aspektu, sekvenca obezbeđuje mišu sposobnost da migrira iz mišje materice kroz mišji jajovod do mišjeg jajašca da bi oplodio jajašce.
1
[0035] Prema jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% broja okota koji miš divljeg tipa iste starosti i soja proizvede u vremenskom periodu od šest meseci.
[0036] Prema jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi najmanje oko 1.5-struko, oko 2-struko, oko 2.5-struko, oko 3-struko, oko 4-struko, oko 6-struko, oko 7-struko, oko 8-struko, ili oko 10-struko ili više potomstva kada se pari tokom vremenskog perioda od šest meseci od miša iste starosti i istog ili sličnog soja kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca koji se pari tokom u suštini istog vremenskog perioda i pod u suštini istim uslovima.
[0037] Prema jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi prosečno najmanje oko 2-struko, 3-struko, ili 4-struko veći broj mladunaca po okotu u periodu parenja od 4- ili 6-meseci od miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca, i koji se pari tokom istog vremenskog perioda.
[0038] Prema jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu je mužjak miša, i taj mužjak miša proizvodi spermu koju kada se sakupi iz jajovoda oko 5-6 sati posle kopulacije odlikuje migracija kroz jajovod koja je najmanje 10-struko, najmanje 20-struko, najmanje 30-struko, najmanje 40-struko, najmanje 50-struko, najmanje 60-struko, najmanje 70-struko, najmanje 80-struko, najmanje 90-struko, 100-struko, 110-struko, ili 120-struko ili veća od miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.
[0039] Prema jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu kada kopulira sa ženkom miša generiše spermu koja može da migrira iz materice i da uđe i migrira kroz jajovod u roku od 6 sati sa efikasnosti koja je približno jednaka spermi miša divljeg tipa.
[0040] Prema jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi oko 1.5-struko, oko 2-struko, oko 3-struko, ili oko 4-struko ili više okota u komparabilnom vremenskom periodu od miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.
[0041] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji u svojoj germinativnoj liniji sadrži nemišju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski protein, pri čemu nemišja imunoglobulinska sekvenca sadrži inserciju mišjeg ADAM6 gena ili njegovog homologa ili ortologa ili funkcionalnog fragmenta. Prema jednom aspektu, nemišja imunoglobulinska sekvenca sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu. Prema jednom aspektu, sekvenca sadrži sekvencu humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, sekvenca sadrži sekvencu humanog imunoglobulinskog lakog lanca. Prema jednom aspektu, sekvenca sadrži samo jedan VH genski segment, jedan ili više DH genskih segmenata, i jedan ili više JH genskih segmenata; prema jednom aspektu, sekvenca sadrži jedan ili više VL genskih segmenata i jedan ili više JL genskih segmenata. Prema jednom aspektu, samo jedan VH, jedan ili više DH, i jedan ili više JH genskih segmenata, ili jedan ili više VL i JL genskih segmenata nisu rearanžirani. Prema jednom aspektu, samo jedan VH, jedan ili više DH, i jedan ili više JH genskih segmenata, ili jedan ili više VL i JL genski segmenata su rearanžirani. Prema jednom aspektu, posle rearanžiranja samo jednog VH, jednog ili više DH, i jednog ili više JH genskih segmenata, ili jednog ili više VL i JL genskih segmenata, miš sadrži u svom genomu najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, posle rearanžiranja miš sadrži u svom genomu najmanje dve sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, posle rearanžiranja miš sadrži u svom genomu najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, miš sadrži ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u B ćeliji. Prema jednom aspektu, miš sadrži ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u ne-B ćeliji.
[0042] Prema jednom aspektu, opisani su miševi koji izražavaju varijabilni region humanog imunoglobulinskog teškog lanca ili njegov funkcionalni fragment iz endogenog lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, varijabilni region humanog imunoglobulinskog teškog lanca sadrži polimorfni humani VH genski segment. Prema jednom aspektu, varijabilni region humanog imunoglobulinskog teškog lanca sadrži humani VH1-69 genski segment. Prema
1
jednom aspektu, varijabilni region humanog imunoglobulinskog teškog lanca sadrži humani VH1-2 genski segment.
[0043] Prema jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže samo jedan nemodifikovani endogeni ADAM6 alel ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment na endogenom ADAM6 lokusu.
[0044] Prema jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ektopičnu mišju ADAM6 sekvencu ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji kodira protein koji obezbeđuje ADAM6 funkciju.
[0045] Prema jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment na lokaciji u mišjem genomu koji aproksimira lokaciju endogenog mišjeg ADAM6 alela, npr. 3’ sekvence V genskog segmenta i 5’ inicijalnog D genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment 3’ humanog VH genskog segmenta i 5’ humanog DH genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment 5’ humanog VH genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment 5’ lokusa himeričnog teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više DH genskih segmenata, i jedan ili više JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, lokus himeričnog teškog lanca sadrži humani VH1-69 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, lokus himeričnog teškog lanca sadrži humani VH1-2 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata.
[0046] Prema jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji se graniči uzvodno, nizvodno, ili uzvodno i nizvodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6 sekvence) od sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski varijabilni genski segment ili imunoglobulinski diverzitetni genski segment. Prema specifičnom aspektu, imunoglobulinski varijabilni genski segment je humani genski segment. Prema jednom aspektu, imunoglobulinski varijabilni genski segment je humani genski segment, i sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment kod miša je između humanih VH genskih segmenata; prema jednom aspektu, miš sadrži jedan humani VH genski segment, i sekvenca je na poziciji 5’ VH genskog
1
segmenta; prema jednom aspektu, sekvenca je na poziciji 3’ VH genskog segmenta; prema jednom aspektu, sekvenca je na poziciji između VH genskog segmenta i prvog DH genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, DH genski segment je prvi DH genski segment. Prema jednom aspektu, miš sadrži dva VH genska segmenta, i sekvenca je na poziciji između dva VH genska segmenta; prema jednom aspektu, sekvenca je na poziciji između VH genskog segmenta i DH genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, DH genski segment je prvi DH genski segment.
[0047] Prema jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji je lociran na poziciji u endogenom imunoglobulinskom lokusu koja je ista ili je u suštini ista kao kod mužjaka miša divljeg tipa. Prema specifičnom aspektu, endogeni lokus nije sposoban da kodira teški lanac antitela. Prema specifičnom aspektu, endogeni lokus je smešten na lokaciji u genomu mužjaka miša koja ga čini nesposobnim za kodiranje teškog lanca antitela. Prema različitim aspektima, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu koja je locirana na istom hromozomu kao humani imunoglobulinski genski segmenti i ADAM6 sekvenca kodira funkcionalni ADAM6 protein.
[0048] Prema jednom aspektu, opisan je mužjak miša koji sadrži nefunkcionalni endogeni ADAM6 gen, ili deleciju endogenog ADAM6 gena, u svojoj germinativnoj liniji; pri čemu su ćelije sperme miša sposobne za prolazak kroz jajovod ženke miša i oplođenje jajašceta. Prema jednom aspektu, miševi sadrže ekstrahromozomsku kopiju mišjeg ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa ili funkcionalnog fragmenta koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, miševi sadrže ektopični mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0049] Prema jednom aspektu, opisani su miševi koji sadrže genetsku modifikaciju koja smanjuje endogenu mišju ADAM6 funkciju, pri čemu miš sadrži bar neku ADAM6 funkcionalnost koju obezbeđuje endogeni nemodifikovani alel koji je funkcionalan u celini ili delimično (npr. heterozigot), ili ekspresiju ektopične sekvence koja kodira ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0050] Prema jednom aspektu, miševi sadrže ADAM6 funkciju koja je dovoljna da obezbedi mužjacima miševa sposobnost da generišu potomstvo parenjem, u poređenju sa mužjacima miševa kojima nedostaje funkcionalni ADAM6. Prema jednom aspektu, ADAM6 funkcija je obezbeđena prisustvom ektopične nukleotidne
1
sekvence koja kodira mišji ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu,m ADAM6 funkcija je obezbeđena endogenim ADAM6 genom koji je prisutan u endogenom imunoglobulinskom lokusu, pri čemu endogeni imunoglobulinski lokus nije sposoban za kodiranje teškog lanca antitela. ADAM6 homolozi ili ortolozi ili njihovi fragmenti koji su funkcionalni kod mužjaka miša obuhvataju one koji ponovo uspostavljaju, u celini ili delimično, gubitak sposobnosti da generišu potomstvo uočen kod mužjaka miša kome nedostaje dovoljna endogena mišja ADAM6 aktivnost, npr. gubitak sposobnosti koji je uočen kod miša sa inaktiviranim ADAM6. U ovom smislu miševi sa inaktiviranim ADAM6 obuhvataju miševe koji sadrže endogeni lokus ili njegov fragment, ali koji nije funkcionalan, tj. koji ne izražava ADAM6 (ADAM6a i/ili ADAM6b) uopšte, ili koji izražava ADAM6 (ADAM6a i/ili ADAM6b) na nivou koji je nedovoljan da podrži u suštini normalnu sposobnost za generisanje potomstva kao kod mužjaka miša divljeg tipa. Gubitak funkcije može biti usled, npr. modifikacije u strukturnom genu lokusa (tj. u ADAM6a ili ADAM6b kodirajućem regionu) ili u regulatornom regionu lokusa (npr. u sekvenci 5’ ka ADAM6a genu, ili 3’ ADAM6a ili ADAM6b kodirajućeg regiona, pri čemu sekvenca kontroliše, u celini ili delimično, transkripciju ADAM6 gena, ekspresiju ADAM6 RNK, ili ekspresiju ADAM6 proteina). Prema različitim aspektima, ortolozi ili homolozi ili njihovi fragmenti koji su funkcionalni kod mužjaka miša su oni koji omogućavaju da sperma mužjaka miša (ili većina ćelija sperme u ejakulatu mužjaka miša) migrira kroz mišji jajovod i oplodi mišje jajašce.
[0051] Prema jednom aspektu, mužjaci miševa koji izražavaju humani imunoglobulinski varijabilni region ili njegov funkcionalni fragment sadrže dovoljnu ADAM6 aktivnost za obezbeđivanje mužjacima miševa sposobnost da generišu potomstvo parenjem sa ženkama miševa i, prema jednom aspektu, mužjake miševa odlikuje sposobnost da generišu potomstvo kada se pare sa ženkama miševa koja je prema jednom aspektu najmanje 25%, prema jednom aspektu, najmanje 30%, prema jednom aspektu najmanje 40%, prema jednom aspektu najmanje 50%, prema jednom aspektu najmanje 60%, prema jednom aspektu najmanje 70%, prema jednom aspektu najmanje 80%, prema jednom aspektu najmanje 90%, i prema jednom aspektu približno ista kao ona kod miševa sa jednim ili dva endogena nemodifikovana ADAM6 alela.
1
[0052] Prema jednom aspektu mužjaci miševa izražavaju dovoljno ADAM6 (ili ortologa ili homologa ili njegovog funkcionalnog fragmenta) da omoguće da ćelije sperme mužjaka miševa migriraju kroz jajovod ženke miša i oplode mišje jajašce.
[0053] Prema jednom aspektu, ADAM6 funkcionalnost je obezbeđena sekvencom nukleinske kiseline koja se graniči sa mišjom hromozomskom sekvencom (npr. nukleinska kiselina je slučajno integrisana u mišji hromozom; ili je postavljena na specifičnu lokaciju, npr. ciljanjem nukleinske kiseline na specifičnu lokaciju, npr. mesto-specifičnom rekombinazom-posredovanom (npr. Cre-posredovanom) insercijom ili homologom rekombinacijom). Prema jednom aspektu, ADAM6 sekvenca je prisutna na nukleinskoj kiselini koja je distinktivna od hromozoma miša (npr. ADAM6 sekvenca je prisutna na epizomu, tj. ekstrahromozomski, npr. u ekspresionom konstruktu, vektoru, YAC, transhromozomu, itd.).
[0054] Prema jednom aspektu, opisani su genetski modifikovani miševi i ćelije koje sadrže modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu miševi izražavaju bar deo sekvence imunoglobulinskog teškog lanca, npr. bar deo humane sekvence, pri čemu miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost miša. Prema jednom aspektu, miš je modifikovan tako da su oba alela koja kodiraju ADAM6 aktivnost odsutna ili izražavaju ADAM6 koji u suštini ne funkcioniše tako da podržava normalno parenje kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, modifikacija održava ADAM6 aktivnost miša i čini endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca nesposobnim za kodiranje teškog lanca antitela. Prema specifičnom aspektu, modifikacija obuhvata hromozomske inverzije i ili translokacije koje čine endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca nesposobnim da kodira teški lanac antitela.
[0055] Prema jednom aspektu, opisani su genetski modifikovani miševi i ćelije koji sadrže modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu ta modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost izraženu iz ADAM6 sekvence lokusa, i pri čemu miševi sadrže ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment. Prema različitim aspektima, ADAM6 protein ili njegov fragment je kodiran ektopičnom ADAM6 sekvencom. Prema različitim aspektima, e ADAM6 protein ili njegov fragment se izražava iz endogenog ADAM6 alela. Prema različitim aspektima, miš sadrži prvi alel imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži prvu
1
modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 iz prvog alela imunoglobulinskog teškog lanca, i miš sadrži drugi alel imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži drugu modifikaciju koja u suštini ne smanjuje ili ne eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 iz drugog alela imunoglobulinskog teškog lanca.
[0056] Prema jednom aspektu, druga modifikacija je locirana 3’ (u odnosu na smer transkripcije mišjeg V genskog segmenta) finalnog mišjeg V genskog segmenta i locirana je 5’ (u odnosu na smer transkripcije konstantne sekvence) konstantnog gena mišjeg (ili himeričnog humanog/mišjeg) imunoglobulinskog teškog lanca ili njegovog fragmenta (npr. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani i/ili mišji: CH1 i/ili zglob i/ili CH2 i/ili CH3).
[0057] Prema jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu koji kodira prvi ADAM6 alel, i ADAM6 funkcija rezultuje usled ekspresije endogenog ADAM6 na drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu koji kodira funkcionalni ADAM6, pri čemu drugi alel imunoglobulinskog teškog lanca sadrži najmanje jednu modifikaciju V, D, i/ili J genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, najmanje jedna modifikacija V, D, i ili J genskog segmenta je delecija, zamena sa samo jednim humanim VH, jednim ili više DH, i/ili jednim ili više JH genskih segmenata, zamena sa kamiljim VH (ili VHH), DH, i/ili JH genskim segmentom, zamena sa humanizovanim ili kamilizovanim VH (ili VHH), DH, i/ili JH genskim segmentom, zamena sekvence teškog lanca sa sekvencom lakog lanca, i njihova kombinacija. Prema jednom aspektu, najmanje jedna modifikacija je delecija jednog ili više VH, DH, i/ili JH genskih segmenata i zamena sa jednim ili više VL i/ili JL genskih segmenata (npr. humanim VL i/ili JL genskim segmentom) na lokusu teškog lanca.
[0058] Prema jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija rezultuje usled ekspresije ektopičnog ADAM6 na neimunoglobulinskom lokusu u germinativnoj liniji miša. Prema specifičnom aspektu, neimunoglobulinski lokus je ROSA26 lokus. Prema specifičnom aspektu, neimunoglobulinski lokus je transkripciono aktivan u reproduktivnom tkivu.
[0059] Prema jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija rezultuje usled ekspresije ektopičnog ADAM6 na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, modifikacija je
2
na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija rezultuje usled ekspresije ektopičnog ADAM6 na drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0060] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži heterozigotnu ili homozigotnu inaktivaciju ADAM6. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži modifikovanu imunoglobulinsku sekvencu koja je humana ili humanizovana imunoglobulinska sekvenca, ili kamilja ili kamilizovana humana ili mišja imunoglobulinska sekvenca. Prema jednom aspektu, modifikovana imunoglobulinska sekvenca je prisutna na endogenom mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Prema jednom aspektu, modifikovana imunoglobulinska sekvenca sadrži sekvencu varijabilnog gena humanog teškog lanca na endogenom mišjem lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilna genska sekvenca humanog teškog lanca zamenjuje endogenu varijabilnu gensku sekvencu mišjeg teškog lanca na endogenom mišjem lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0061] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji nije sposoban za izražavanje funkcionalnog endogenog mišjeg ADAM6 iz endogenog mišjeg ADAM6 lokusa. Prema jednom aspektu, miš sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6, ili njegov funkcionalni fragment, koji je funkcionalan kod miša. Prema specifičnom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline kodira protein koji sprečava gubitak sposobnosti generisanja potomstva od strane mužjaka miša koji je homozigotan za ADAM6 inaktivaciju. Prema specifičnom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline kodira mišji ADAM6 protein.
[0062] Prema jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i koji sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje mišju ADAM6 funkciju. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži endogenu mišju ADAM6 sekvencu ili njen funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, endogena mišja ADAM6 sekvenca sadrži ADAM6a- i ADAM6b-kodirajuću sekvencu lociranu u mišu divljeg tipa između 3’-najbližeg mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca V genskog segmenta (VH) i 5’-najbližeg mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca D genskog segmenta (DH).
[0063] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira mišji ADAM6a ili njegov funkcionalni fragment i/ili sekvencu koja kodira ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu su ADAM6a i/ili ADAM6b ili njihov funkcionalni fragment, odnosno fragmenti operativno povezani sa promoterom. Prema jednom aspektu, promoter je humani promoter. Prema jednom aspektu, promoter je mišji ADAM6 promoter. Prema specifičnom aspektu, ADAM6 promoter sadrži sekvencu koja je locirana između prvog kodona i prvog ADAM6 gena najbližeg mišjem 5’- najbližem DH genskom segmentu i rekombinacione signalne sekvence 5’-najbližeg DH genskog segmenta, pri čemu je 5’ označeno u odnosu na smer transkripcije mišjih imunoglobulinskih gena. Prema jednom aspektu, promoter je virusni promoter. Prema specifičnom aspektu, virusni promoter je citomegalovirusni (CMV) promoter. Prema jednom aspektu, promoter je ubikvitinski promoter.
[0064] Prema jednom aspektu, promoter je induktibilni promoter. Prema jednom aspektu, induktibilni promoter reguliše ekspresiju u nereproduktivnim tkivima. Prema jednom aspektu, induktibilni promoter reguliše ekspresiju u reproduktibilnim tkivima. Prema specifičnom aspektu, ekspresija mišje ADAM6a i/ili ADAM6b sekvence ili njihovog funkcionalnog fragmenta, odnosno fragmenata je razvojno regulisana pomoću induktibilnog promotera u reproduktivnim tkivima.
[0065] Prema jednom aspektu, mišji ADAM6a i/ili ADAM6b su izabrani između ADAM6a SEQ ID NO: 1 i/ili ADAM6b sekvence SEQ ID NO: 2.
[0066] Prema jednom aspektu, mišji ADAM6 promoter je promoter SEQ ID NO: 3. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 promoter sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 3 direktno uzvodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) prvog kodona ADAM6a i pruža se prema kraju SEQ ID NO: 3 uzvodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. Prema sledećem specifičnom aspektu, ADAM6 promoter je fragment koji se pruža u okviru od oko 5 do oko 20 nukleotida uzvodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili više uzvodno od start kodona ADAM6a.
[0067] Prema jednom aspektu, mišji ADAM6 promoter je promoter SEQ ID NO: 73. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 promoter sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 73 direktno uzvodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) prvog kodona ADAM6a i pruža se prema kraju SEQ ID NO: 73 uzvodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. Prema sledećem specifičnom aspektu, ADAM6 promoter je fragment koji se pruža u okviru od oko 5 do oko 20 nukleotida uzvodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili više uzvodno od start kodona ADAM6a.
[0068] Prema jednom aspektu, mišji ADAM6 promoter je promoter SEQ ID NO: 77. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 promoter sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 77 direktno uzvodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) prvog kodona ADAM6a i pruža se prema kraju SEQ ID NO: 77 uzvodno ADAM6 kodirajućeg regiona. Prema sledećem specifičnom aspektu, ADAM6 promoter je fragment koji se pruža u okviru od oko 5 do oko 20 nukleotida uzvodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili više uzvodno od start kodona ADAM6a.
[0069] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 3 ili njen fragment koji kada se stavi u miša koji je neplodan ili koji ima malu plodnost zbog nedostatka ADAM6, poboljšava plodnost ili ponovno uspostavlja plodnost do oko plodnosti divljeg tipa. Prema jednom aspektu, SEQ ID NO: 3 ili njen fragment obezbeđuje mužjaku miša sposobnost da proizvede ćeliju sperme koja je sposobna da migrira kroz jajovod ženke miša da bi oplodila mišje jajašce.
[0070] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 73 ili njen fragment koji kada se stavi u miša koji je neplodan ili koji ima malu plodnost zbog nedostatka ADAM6, poboljšava plodnost ili ponovo uspostavlja plodnost do oko plodnosti divljeg tipa. Prema jednom aspektu, SEQ ID NO: 73 ili njen fragment obezbeđuje mužjaku miša sposobnost da proizvodi ćeliju sperme koja je sposobna da migrira kroz jajovod ženke miša da bi oplodila mišje jajašce.
[0071] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 77 ili njen fragment koji kada se stavi u miša koji je neplodan ili koji ima malu plodnost zbog nedostatka ADAM6, poboljšava plodnost ili ponovo uspostavlja plodnost do oko plodnosti divljeg tipa. Prema jednom aspektu, SEQ ID NO: 77 ili njen fragment obezbeđuje mužjaku miša sposobnost da proizvodi ćeliju sperme koja je sposobna da migrira kroz jajovod ženke miša da bi oplodila mišje jajašce.
[0072] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži deleciju endogene nukleotidne sekvence koja kodira ADAM6 protein, zamenu endogenog mišjeg VH genskog segmenta sa humanim VH genskim segmentom, i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0073] Prema jednom aspektu, miš sadrži lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži deleciju endogenog imunoglobulinskog lokusa nukleotidne sekvence koji sadrži endogeni ADAM6 gen, sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata, i pri čemu je ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein u okviru ili direktno susedna nukleotidnoj sekvenci koja kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata.
[0074] Prema jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH genskih segmenata sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo jedan humani VH
2
genski segment, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je u okviru, ili direktno susedna nukleotidnoj sekvenci koja kodira samo jedan humani VH genski segment. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih DH genskih segmenata sa jednim ili više humanih DH genskih segmenata na endogenom DH genskom lokusu. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih JH genskih segmenata na endogenom JH genskom lokusu. Prema jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH, DH, i JH genskih segmenata i zamenu na endogenim VH, DH, i JH genskim lokusima sa samo jednim humanim VH, jednim ili više humanih DH, i jednim ili više humanih JH genskih segmenata, pri čemu miš sadrži ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein. Prema specifičnom aspektu, ektopična sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena uzvodno ili 5’ od samo jednog humanog VH genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, ektopična sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena nizvodno ili 3’ od samo jednog humanog VH genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, ektopična sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena između samo jednog humanog VH genskog segmenta i prvog prisutnog humanog DH genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, miš sadrži deleciju svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata, i zamenu sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena nizvodno od humanog genskog segmenta VH1-69 i uzvodno od humanog genskog segmenta DH1-1. Prema sledećem specifičnom aspektu, miš sadrži deleciju svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata, i zamenu sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena nizvodno od humanog genskog segmenta VH1-2 i uzvodno od humanog genskog segmenta DH1-1.
[0075] Prema specifičnom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH genskih segmenata sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo jedan VH genski segment, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je u okviru ili je direktno susedna sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo jedan humani VH genski segment.
[0076] Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je prisutna na transgenu u genomu miša. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je prisutna ekstrahromozomski u mišu.
[0077] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu miš izražava B ćeliju koja sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku sekvencu operativno povezanu sa genskom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca, i B ćelija sadrži u svom genomu (npr. na hromozomu B ćelije) gen koji kodira ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, rearanžirana imunoglobulinska sekvenca koja je operativno povezana sa genskom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca sadrži V, D, i/ili J sekvencu humanog teškog lanca; V, D, i/ili J sekvencu mišjeg teškog lanca; V i/ili J sekvencu humanog ili mišjeg lakog lanca. Prema jednom aspektu, genska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca sadrži sekvencu humanog ili mišjeg teškog lanca koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije.
[0078] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži funkcionalno utišani endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu je ADAM6 funkcija zadržana kod miša, i dalje sadrži inserciju jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata, pri čemu jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata sadrže samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata sadrže humani VH1-69 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata sadrže humani VH1-2 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata.
[0079] Prema jednom aspektu, opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš sadrži funkcionalno utišani gen imunoglobulinskog lakog lanca, i dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca sa samo jednim genskim segmentom varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu mišu nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja izražava mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
2
[0080] Prema jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus ili sekvenca i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 lokus ili funkcionalni fragment mišjeg ADAM6 lokusa ili sekvencu, pri čemu je miš sposoban za parenje sa mišem suprotnog pola da bi se proizvelo potomstvo koje sadrži ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu. Prema jednom aspektu, miš je mužjak. Prema jednom aspektu, miš je ženka.
[0081] Prema jednom aspektu, opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš sadrži genski segment varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca na endogenom genskom lokusu varijabilnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, mišu nedostaje endogena funkcionalna ADAM6 sekvenca na endogenom genskom lokusu varijabilnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja izražava mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0082] Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja izražava mišji ADAM6 protein je ekstrahromozomska. Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja izražava mišji ADAM6 protein je integrisana na jednom ili više lokusa u genomu miša. Prema specifičnom aspektu, jedan ili više lokusa obuhvataju imunoglobulinski lokus.
[0083] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji izražava sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca iz modifikovanog endogenog lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu teški lanac potiče od humanog V genskog segmenta, D genskog segmenta, i J genskog segmenta, pri čemu miš sadrži ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.
[0084] Prema jednom aspektu, miš sadrži samo jedan humani V genski segment, mnoštvo D genskih segmenata, i mnoštvo J genskih segmenata. Prema jednom aspektu, D genski segmenti su humani D genski segmenti. Prema jednom aspektu, J genski segmenti su humani J genski segmenti. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži humanizovanu sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, pri čemu humanizacija sadrži zamenu sekvence izabrane između CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. Prema specifičnom aspektu, teški lanac potiče od humanog V genskog segmenta, humanog D genskog segmenta, humanog J genskog segmenta, humane CH1 sekvence, humane ili mišje sekvence zgloba, mišje CH2 sekvence, i mišje CH3 sekvence. Prema sledećem specifičnom aspektu, miš dalje sadrži konstantnu sekvencu humanog lakog lanca.
2
[0085] Prema jednom aspektu, miš sadrži ADAM6 gen koji se graniči kod 5’ i 3’ sa endogenim genskim segmentima imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, endogeni genski segmenti imunoglobulinskog teškog lanca nisu sposobni da kodiraju teški lanac antitela. Prema specifičnom aspektu, ADAM6 gen miša je na poziciji koja je ista kao kod miša divljeg tipa i endogeni varijabilni genski lokusi imunoglobulinskog teškog lanca miša nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali teški lanac antitela.
[0086] Prema jednom aspektu, V genski segment se graniči kod 5’ (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.
[0087] Prema jednom aspektu, V genski segment se graniči kod 3’ (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.
[0088] Prema jednom aspektu, D genski segment se graniči kod 5’ (u odnosu na smer transkripcije D genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.
[0089] Prema jednom aspektu, J genski segment se graniči kod 5’ (u odnosu na smer transkripcije J genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.
[0090] Prema jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša rezultuje od ekspresije nukleotidne sekvence koja je smeštena kod 5’ od 5’-najbližeg D genskog segmenta i 3’ samo jednog V genskog segmenta (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) modifikovanog endogenog lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca.
[0091] Prema jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša rezultuje od ekspresije nukleotidne sekvence koja je smeštena kod 5’ od 5’-najbližeg J genskog segmenta i 3’ od 3’-najbližeg D genskog segmenta (u odnosu na smer transkripcije D genskog segmenta) modifikovanog endogenog lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca.
[0092] Prema jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša rezultuje od ekspresije nukleotidne sekvence koja je smeštena kod 5’ od samo jednog humanog V genskog segmenta (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) modifikovanog endogenog lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca.
2
[0093] Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu koja je izabrana između mišje ADAM6b sekvence ili njenog funkcionalnog fragmenta, mišje ADAM6a sekvence ili njenog funkcionalnog fragmenta, i njihove kombinacije.
[0094] Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja je smeštena uzvodno (5’) ili nizvodno (3’) od samo jednog humanog V genskog segmenta je postavljena sa suprotnom transkripcionom orijentacijom u odnosu na humani V genski segment. Prema specifičnom aspektu, nukleotidna sekvenca kodira, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije ADAM6 gena, i ADAM6a sekvencu praćenu ADAM6b sekvencom.
[0095] Prema jednom aspektu, miš sadrži samo jedan humani VH genski segment koji je susedan ili se graniči sa mišjom ADAM6 sekvencom ili njenim funkcionalnim fragmentom.
[0096] Prema jednom aspektu, miš sadrži humani VH1-69 genski segment koji je susedan ili se graniči sa mišjom ADAM6 sekvencom ili njenim funkcionalnim fragmentom.
[0097] Prema jednom aspektu, miš sadrži humani VH1-2 genski segment koji je susedan ili se graniči sa mišjom ADAM6 sekvencom ili njenim funkcionalnim fragmentom.
[0098] Prema jednom aspektu, miš sadrži samo jedan humani VH genski segment, i mišju ADAM6 sekvencu ili njen funkcionalni fragment koji je susedan ili se graniči sa endogenim genskim segmentima imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu endogeni genski segmenti imunoglobulinskog teškog lanca nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali teški lanac antitela.
[0099] Prema jednom aspektu, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša je mišja ADAM6 sekvenca ili njen funkcionalni fragment.
[0100] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) u ćeliji koja nosi DNK iz loze nerearanžiranih B ćelija, ali ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) u B ćeliji koja sadrži rearanžirane imunoglobulinske lokuse, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) pojavljuje u genomu na poziciji koja je različita od pozicije na kojoj se mišji ADAM6 gen pojavljuje kod miša divljeg tipa. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) je prisutna u svim ili u suštini u svim ćelijama koje nose DNK
2
koje nisu iz loze rearanžiranih B ćelija; prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna u germinativnoj ćelijskoj liniji miša, ali ne u hromozomu rearanžirane B ćelije.
[0101] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) u svim ili u suštini u svim ćelijama koje nose DNK, uključujući B ćelije koje sadrže rearanžirane imunoglobulinske lokuse, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) pojavljuje u genomu na poziciji koja je različita od pozicije na kojoj se mišji ADAM6 gen pojavljuje kod miša divljeg tipa. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) je na nukleinskoj kiselini koja se graniči sa rearanžiranim imunoglobulinskim lokusom. Prema jednom aspektu, nukleinska kiselina koja se graniči sa rearanžiranim imunoglobulinskim lokusom je hromozom. Prema jednom aspektu, hromozom je hromozom koji se nalazi kod miša divljeg tipa i taj hromozom sadrži modifikaciju mišjeg imunoglobulinskog lokusa.
[0102] Prema jednom aspektu, opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš sadrži B ćeliju koja sadrži u svom genomu ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. Prema jednom aspektu, ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog je na lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži endogene genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca koji nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali teški lanac antitela. Prema jednom aspektu, ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog je na lokusu koji nije imunoglobulinski lokus. Prema jednom aspektu, ADAM6 sekvenca je na transgenu koji aktivira heterologi promoter. Prema specifičnom aspektu, heterologi promoter je neimunoglobulinski promoter. Prema specifičnom aspektu, B ćelija izražava ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog.
[0103] Prema jednom aspektu, 90% ili više B ćelija miša sadrži gen koji kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod miša. Prema specifičnom aspektu, miš je mužjak miša.
[0104] Prema jednom aspektu, genom B ćelija sadrži prvi alel i drugi alel koji sadrže ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. Prema jednom aspektu, genom B ćelija sadrži prvi alel, ali ne i drugi alel koji sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.
2
[0105] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži modifikaciju na jednom ili više endogenih alela imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu modifikacija zadržava jedan ili više endogenih ADAM6 alela.
[0106] Prema jednom aspektu, modifikacija čini miša nesposobnim da izražava funkcionalni teški lanac koji sadrži rearanžirane endogene genske segmente teškog lanca iz bar jednog alela teškog lanca i zadržava endogeni ADAM6 alel koji je lociran u okviru najmanje jednog endogenog alela imunoglobulinskog teškog lanca.
[0107] Prema jednom aspektu, miševi nisu sposobni da izražavaju funkcionalni teški lanac koji sadrži rearanžirane endogene genske segmente teškog lanca iz najmanje jednog od endogenih imunoglobulinskih alela teškog lanca, i miševi izražavaju i ADAM6 protein iz endogenog ADAM6 alela. Prema specifičnom aspektu, miševi nisu sposobni da izražavaju funkcionalni teški lanac koji sadrži rearanžirane endogene genske segmente teškog lanca iz dva endogena alela imunoglobulinskog teškog lanca, i miševi izražavaju ADAM6 protein iz jednog ili više endogenih ADAM6 alela.
[0108] Prema jednom aspektu, miševi nisu sposobni da izražavaju funkcionalni teški lanac iz svakog endogenog alela teškog lanca, i miševi sadrže funkcionalni ADAM6 alel koji je lociran u okviru 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više Mbp uzvodno (u odnosu na smer transkripcije lokusa mišjeg teškog lanca) od sekvence konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, funkcionalni ADAM6 alel je na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca (npr. u intergenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i D genskog segmenta, između D i J genskog segmenta, itd.). Prema specifičnom aspektu, funkcionalni ADAM6 alel je lociran u okviru 90 do 100 kb intergenske sekvence između poslednjeg mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta.
[0109] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži modifikaciju na jednom ili više endogenih ADAM6 alela.
[0110] Prema jednom aspektu, modifikacija čini miša nesposobnim da izražava funkcionalni ADAM6 protein iz najmanje jednog od jednog ili više endogenih ADAM6 alela. Prema specifičnom aspektu, miš nije sposoban za izražavanje funkcionalnog ADAM6 proteina iz svakog od endogenih ADAM6 alela.
[0111] Prema jednom aspektu, miševi nisu sposobni za izražavanje funkcionalnog ADAM6 proteina iz svakog endogenog ADAM6 alela, i miševi sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu.
[0112] Prema jednom aspektu, miševi nisu sposobni za izražavanje funkcionalnog ADAM6 proteina iz svakog endogenog ADAM6 alela, i miševi sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu koja je locirana u okviru 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više kb uzvodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa teškog lanca) sekvence konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, ektopična ADAM6 sekvenca je na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca (npr. u intergenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i D genskog segmenta, između D i J genskog segmenta, itd.). Prema specifičnom aspektu, ektopična ADAM6 sekvenca je locirana u okviru 90 do 100 kb intergenske sekvence između poslednjeg mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, endogena 90 do 100 kb intergenska V-D sekvenca se uklanja, i ektopična ADAM6 sekvenca se stavlja između samo jednog humanog V genskog segmenta i prvog humanog D genskog segmenta. Prema sledećem specifičnom aspektu, endogena 90 do 100 kb intergenska V-D sekvenca se uklanja, i ektopična ADAM6 sekvenca se stavlja kod 5’ ili uzvodno od samo jednog humanog V genskog segmenta.
[0113] Prema jednom aspektu, opisan je neplodni mužjak miša, pri čemu miš sadrži deleciju dva ili više endogenih ADAM6 alela. Prema jednom aspektu, opisana je ženka miša koja je nosilac osobine neplodnosti mužjaka, pri čemu ženka miša sadrži u svojoj germinativnoj liniji nefunkcionalni ADAM6 alel ili inaktivaciju endogenog ADAM6 alela.
[0114] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži endogene V, D, i ili J genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca koji nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali teški lanac antitela, pri čemu većina B ćelija miša sadrži funkcionalni ADAM6 gen.
[0115] Prema jednom aspektu, miš sadrži intaktne endogene V, D, i J genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca koji nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali funkcionalni teški lanac antitela. Prema jednom aspektu, miš sadrži najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta, i njihovu kombinaciju; pri čemu najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela. Prema specifičnom aspektu, miš sadrži funkcionalni ADAM6 gen koji je lociran u okviru intaktnih endogenih V, D, i J genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca. Prema
1
jednom aspektu, miš sadrži endogeni lokus teškog lanca koji sadrži endogeni ADAM6 lokus, pri čemu endogeni lokus teškog lanca sadrži 89 V genskih segmenata, 13 D genskih segmenata, i četiri J genska segmenta, pri čemu endogeni genski segmenti teškog lanca nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela i ADAM6 lokus kodira ADAM6 protein koji je funkcionalan kod miša.
[0116] Prema jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje endogeni V, D, i J genski segment imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu većina B ćelija miša sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.
[0117] Prema jednom aspektu, mišu nedostaju endogeni genski segmenti imunoglobulinskog teškog lanca izabrani između dva ili više V genskih segmenata, dva ili više D genskih segmenata, dva ili više J genskih segmenata, i njihove kombinacije. Prema jednom aspektu, mišu nedostaju genski segmenti imunoglobulinskog teškog lanca izabrani između najmanje jednog i do 89 V genskih segmenata, najmanje jednog i do 13 D genskih segmenata, najmanje jednog i do četiri J genska segmenta, i njihove kombinacije. Prema jednom aspektu, mišu nedostaje genomski DNK fragment iz hromozoma 12 koji sadrži oko tri megabaze endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, mišu nedostaju svi funkcionalni endogeni V, D, i J genski segmenti teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, mišu nedostaje 89 VH genskih segmenata, 13 DH genskih segmenata i četiri JH genska segmenta.
[0118] Prema jednom aspektu, opisan je miš, pri čemu miš ima genom u germinativnoj liniji koji sadrži modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu modifikacija lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sadrži zamenu jedne ili više sekvenci mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona sa jednom sekvencom nemišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona, i pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 protein. Prema poželjnom aspektu, DH i JH sekvence i najmanje 3, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 40, najmanje 60, ili najmanje 80 VH sekvenci endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca su zamenjene sa sekvencama nemišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prema sledećem poželjnom aspektu, DH, JH, i sve VH sekvence endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca su zamenjene sa sekvencama samo jednog nemišjeg imunoglobulinskog V genskog segmenta, jednog ili više D genskih segmenata, i jednog ili više J genskih segmenata. Nemišje imunoglobulinske sekvence mogu biti nerearanžirane. Prema poželjnom aspektu, nemišje imunoglobulinske sekvence
2
sadrže kompletno nerearanžirane DH i JH regione i samo jednu nerearanžiranu VH sekvencu nemišje vrste. Prema sledećem poželjnom aspektu, nemišje imunoglobulinske sekvence su sposobne za formiranje kompletnog varijabilnog regiona, tj. rearanžiranog varijabilnog regiona koji sadrži VH, DH, i JH segmente koji su međusobno povezani da bi formirali sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca nemišje vrste. Nemišja vrsta može biti Homo sapiens i nemišje imunoglobulinske sekvence mogu biti humane sekvence.
[0119] Prema jednom aspektu, opisan je imunoglobulinski lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan funkcionalni humani V segment. Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V segment je izabran između VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, i VH7-81 segmenata. Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V segment je VH1-69 segment; prema specifičnom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V segment je prisutan u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili 13 polimorfnih oblika koji se nalaze u ljudskoj populaciji. Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V segment je VH1-2 segment; prema specifičnom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V segment je prisutan u 1, 2, 3, 4, ili 5 polimorfnih oblika koji se nalaze u ljudskoj populaciji.
[0120] Prema jednom aspektu, imunoglobulinski lokus teškog lanca je modifikovani lokus nehumane životinje. Prema jednom aspektu, modifikovani lokus nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca je prisutan u nehumanoj životinji na poziciji u genomu na kojoj se odgovarajući nemodifikovani nehumani lokus nalazi kod nehumane životinje divljeg tipa. Prema jednom aspektu, modifikovani lokus nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca je prisutan na transgenu u nehumanoj životinji.
[0121] Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V genski segment je VH1-69 genski segment. Prema jednom aspektu, VH1-69 genski segment sadrži SEQ ID NO: 37. Prema jednom aspektu, VH1-69 genski segment potiče od SEQ ID NO: 37. Prema jednom aspektu, VH1-69 genski segment je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa SEQ ID NO: 37.
[0122] Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V genski segment je kodiran nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 37.
[0123] Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V genski segment je VH1-2 genski segment. Prema jednom aspektu, VH1-2 genski segment sadrži SEQ ID NO: 63. Prema jednom aspektu, VH1-2 genski segment potiče od SEQ ID NO: 63. Prema jednom aspektu, VH1-2 genski segment je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa SEQ ID NO: 63.
[0124] Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V genski segment je kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO: 63.
[0125] Prema jednom aspektu, samo jedan funkcionalni humani V segment je operativno povezan sa jednim ili više D segmenata i jednim ili više J segmenata, ili jednim ili više J segmenata. Prema jednom aspektu, V segment i jedan ili više D i/ili J segmenata su operativno povezani sa sekvencom konstantnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu sekvenca konstantnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca je izabrana između CH1, zgloba, CH2, CH3 sekvence, i njihove kombinacije. Prema jednom aspektu, svaki od CH1, zgloba, CH2, CH3, ili njihova kombinacija su nehumane endogene konstantne sekvence. Prema jednom aspektu, najmanje jedan od CH1, zgloba, CH2, CH3, ili njihova kombinacija su humana sekvenca. Prema specifičnom aspektu, CH1 i/ili zglob su humane sekvence.
[0126] Prema jednom aspektu, opisan je modifikovani endogeni lokus nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži zamenu svih funkcionalnih V segmenata sa samo jednim humanim V segmentom, pri čemu lokus nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca nije sposoban za rearanžiranje da bi se formirao varijabilni gen teškog lanca koji potiče od V segmenta drugačijeg od samo jednog humanog V segmenta.
[0127] Prema jednom aspektu, samo jedan humani V segment je VH1-69. Prema jednom aspektu, samo jedan humani V segment je VH1-2.
[0128] Prema jednom aspektu, lokus sadrži najmanje jedan humani ili nehumani DH segment, i jedan humani ili nehumani JH segment. Prema specifičnom aspektu, lokus sadrži humani DH segment i humani JH segment. Prema specifičnom aspektu, lokus sadrži humani JH segment. Prema sledećem specifičnom aspektu, lokus sadrži humani VH1-69, sve funkcionalne humane DH segmente, i sve funkcionalne humane JH segmente. Prema jednom aspektu, humani V, D, i J segmenti (ili V i J segmenti) su operativno povezani sa mišjim genom konstantnog regiona na endogenom lokusu mišjeg teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, lokus mišjeg teškog lanca sadrži repertoar sekvenci mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona divljeg tipa.
4
[0129] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana nehumana životinja, pri čemu je samo funkcionalni V genski segment imunoglobulinskog teškog lanca nehumane životinje izabran između humanih VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, i VH7-81 segmenata. Prema jednom aspektu, V genski segment teškog lanca je humani VH1-69 genski segment. Prema jednom aspektu, V genski segment teškog lanca je humani VH1-2 genski segment.
[0130] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana nehumana životinja, pri čemu nehumana životinja sadrži samo jedan funkcionalni humani VH segment, i pri čemu nehumana životinja u suštini nije sposobna za formiranje rearanžiranog gena varijabilnog domena imunoglobulinskog teškog lanca kome nedostaje samo jedan funkcionalni humani VH segment.
[0131] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana nehumana životinja, pri čemu samo varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca izražen u nehumanoj životinji potiče od jednog humanog segmenta izabranog između humanih VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, i VH7-81 genskih segmenata. Prema jednom aspektu, humani segment je VH1-69 segment. Prema jednom aspektu, humani segment je VH1-2 segment. Prema jednom aspektu, samo varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca izražen od strane miša potiče od samo jednog člana familije V segmenata, i prema jednom aspektu samo varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca potiče od polimorfne varijante samo jednog člana familije V segmenata.
[0132] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži ograničeni repertoar V genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu nehumana životinja dalje sadrži jedan ili više varijabilnih segmenata humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca (Vκ). Prema jednom aspektu, jedan ili više Vκ segmenata su operativno povezani sa jednim ili više humanih J segmenata. Prema specifičnom aspektu, J segmenti su humani Jκ segmenti. Prema sledećem specifičnom aspektu, nehumana životinja ne izražava imunoglobulinski λ laki lanac. Prema sledećem specifičnom aspektu, nehumana životinja ne sadrži funkcionalni humani ili funkcionalni endogeni varijabilni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca.
[0133] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš.
[0134] Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži zamenu na endogenom nehumanom imunoglobulinskom Vκ lokusu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih Vκ segmenata sa jednim ili više funkcionalnih humanih Vκ segmenata. Prema sledećem specifičnom aspektu, zamena je sa svim ili u suštini svim funkcionalnim humanim imunoglobulinskim Vκ segmentima.
[0135] Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži zamenu na endogenom nehumanom imunoglobulinskom Jκ lokusu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih nehumanih imunoglobulinskih Jκ segmenata sa jednim ili više funkcionalnih humanih imunoglobulinskih Jκ segmenata. Prema sledećem specifičnom aspektu, zamena je sa svim ili u suštini svim funkcionalnim humanim imunoglobulinskim Jκ segmentima.
[0136] Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži repertoar V segmenata koji se u suštini sastoji od samo jednog V segmenta i/ili njegovih polimorfnih varijanti. Prema jednom aspektu, samo jedan V segment imunoglobulinskog teškog lanca je humani VH1-69 segment, i nehumana životinja dalje sadrži zamenu svih funkcionalnih nehumanih DH segmenata sa svim funkcionalnim humanim DH segmentima, i dalje sadrži zamenu svih funkcionalnih nehumanih JH segmenata sa svim funkcionalnim humanim JH segmentima, pri čemu je lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca operativno povezan sa genskom sekvencom humanog ili nehumanog konstantnog regiona. Prema specifičnom aspektu, genska sekvenca konstantnog regiona je endogena genska sekvenca nehumanog konstantnog regiona. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja rearanžira segmente na nehumanom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca da bi formirala gen koji kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži humanu VH1-69 sekvencu, humanu DH sekvencu, humanu JH sekvencu, i mišju sekvencu konstantnog regiona.
[0137] Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži repertoar V segmenata koji se u suštini sastoji od samo jednog V segmenta i/ili njegovih polimorfnih varijanti. Prema jednom aspektu, samo jedan V segment imunoglobulinskog teškog lanca je humani VH1-2 segment, i nehumana životinja dalje sadrži zamenu svih funkcionalnih nehumanih DH segmenata sa svim funkcionalnim humanim DH segmentima, i dalje sadrži zamenu svih funkcionalnih nehumanih JH segmenata sa svim funkcionalnim humanim JH segmentima, pri čemu je lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca operativno povezan sa genskom sekvencom humanog ili nehumanog konstantnog regiona. Prema specifičnom aspektu, genska sekvenca konstantnog regiona je endogena genska sekvenca nehumanog konstantnog regiona. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja rearanžira segmente na lokusu nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca da bi se formirao gen koji kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži humanu VH1-2 sekvencu, humanu DH sekvencu, humanu JH sekvencu, i mišju sekvencu konstantnog regiona.
[0138] Prema jednom aspektu, opisana je B ćelija koja sadrži rearanžirani gen. Prema specifičnom aspektu, B ćelija je od miša koji je opisan imunizovanog sa antigenom od interesa, i B ćelija kodira antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa. Prema jednom aspektu, antigen od interesa je patogen. Prema specifičnom aspektu, patogen je izabran između influenca virusa, hepatitis virusa (npr. hepatitis B ili hepatitis C virusa), i virusa humane imunodeficijencije. Prema specifičnom aspektu, B ćelija kodira somatski mutirano, visokoafinitetno (npr. oko 10<-9>KD ili manje) antitelo koje sadrži varijabilni region humanog lakog lanca (npr. varijabilni region humanog κ lakog lanca) koji specifično vezuje antigen od interesa.
[0139] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži ograničeni repertoar V segmenata imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu nehumana životinja sadrži jedan ili više varijabilnih (Vλ) segmenata humanog λ lakog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više humanih Vλ segmenata su operativno povezani sa jednim ili više humanih J segmenata. Prema specifičnom aspektu, J segmenti su humani Jλ segmenti. Prema sledećem specifičnom aspektu, nehumana životinja ne izražava κ laki lanac. Prema sledećem specifičnom aspektu, nehumana životinja ne sadrži funkcionalni varijabilni lokus humanog ili nehumanog κ lakog lanca.
[0140] Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih nehumanih imunoglobulinskih Vλ segmenata sa jednim ili više funkcionalnih humanih imunoglobulinskih Vλ segmenata. Prema sledećem specifičnom aspektu, zamena je sa svim ili u suštini svim funkcionalnim humanim imunoglobulinskim Vλ segmentima.
[0141] Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih nehumanih imunoglobulinskih Jλ segmenata sa jednim ili više funkcionalnih humanih imunoglobulinskih Jλ segmenata. Prema sledećem specifičnom aspektu, zamena je sa svim ili u suštini svim funkcionalnim humanim imunoglobulinskim Jλ segmentima.
[0142] Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži lokus varijabilnog (VH) regiona imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži samo jedan VH segment, pri čemu je samo jedan VH segment humani VH1-69 segment ili humani VH1-2 segment, i dalje sadrži zamenu svih funkcionalnih nehumanih DH segmenata sa svim funkcionalnim humanim DH segmentima, i dalje sadrži zamenu svih funkcionalnih nehumanih JH segmenata sa svim funkcionalnim humanim JH segmentima, i pri čemu je lokus VH regiona operativno povezan sa genskom sekvencom humanog ili nehumanog konstantnog regiona. Prema specifičnom aspektu, genska sekvenca konstantnog regiona je genska sekvenca nehumanog konstantnog regiona, npr. endogena nehumana konstantna genska sekvenca. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja rearanžira segmente na lokusu nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca da bi se formirao gen koji kodira varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži humanu VH1-69 sekvencu (ili humanu VH1-2 sekvencu), humanu DH sekvencu, humanu JH sekvencu, i endogenu sekvencu nehumanog konstantnog regiona.
[0143] Prema jednom aspektu, opisana je B ćelija koja sadrži rearanžirani gen. Prema specifičnom aspektu, B ćelija je od nehumane životinje koja je opisana imunizovane sa antigenom od interesa, i B ćelija kodira antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa. Prema jednom aspektu, antigen je humani protein koji je izabran između liganda, ćelijskog površinskog receptora i intracelularnog proteina. Prema jednom aspektu, antigen od interesa je patogen. Prema specifičnom aspektu, patogen je izabran između influenca virusa, hepatitis virusa (npr. hepatitis B ili hepatitis C virusa), i virusa humane imunodeficijencije. Prema specifičnom aspektu, B ćelija kodira somatski mutirano, visokoafinitetno (npr. sa oko 10<-9>KD ili manje) antitelo koje sadrži varijabilni region humanog lakog lanca (npr. varijabilni region humanog λ lakog lanca) koji specifično vezuje antigen od interesa.
[0144] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži ograničeni repertoar V segmenata imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu nehumana životinja sadrži humani VH1-69 segment (ili humani VH1-2 segment) na transgenu, pri čemu je humani VH1-69 segment operativno povezan na transgenu sa humanim ili nehumanim DH segmentom, i/ili humanim ili nehumanim J segmentom, i transgen dalje sadrži gen humanog ili nehumanog konstantnog regiona, ili himerični humani/nehumani konstantni region (npr. CH1, zglob, CH2, CH3 ili njihovu kombinaciju, pri čemu je najmanje jedna sekvenca nehumana, npr. izabrana je između zgloba, CH2, i CH3 i/ili zgloba). Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš ili pacov i nehumani gen D, J i/ili konstantnog regiona je mišji ili pacovski gen ili himerični humani/mišji ili pacovski.
[0145] Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži transgen koji sadrži lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži jedan ili više humanih imunoglobulinskih Vλ segmenata i Jλ segmenata, ili jedan ili više humanih imunoglobulinskih Vκ segmenata i Jκ segmenata, i gen konstantnog regiona humanog imunoglobulinskog κ ili λ lakog lanca, tako da se transgen rearanžira u nehumanoj životinji da bi formirao rearanžirani gen imunoglobulinskog κ ili λ lakog lanca.
[0146] Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži transgen koji ima varijabilni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži samo jedan V segment koji je humani VH1-69 segment (ili humani VH1-2 segment), jedan ili više humanih D segmenata, jedan ili više humanih J segmenata, i humani konstantni gen koji je operativno povezan sa varijabilnim lokusom teškog lanca, tako da miš izražava iz transgena potpuno humano antitelo koje potiče od VH1-69 segmenta (ili VH1-2 segmenta). Prema jednom aspektu, nehumana životinja ne sadrži funkcionalni endogeni lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži nefunkcionalni endogeni lokus varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži deleciju endogenog nehumanog DH i/ili endogenog nehumanog JH segmenta, tako da nehumana životinja nije sposobna za rearanžiranje endogenog lokusa varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca da bi formirala rearanžirani gen nehumanog antitela. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži deleciju sekvence promene operativno povezane sa endogenim konstantnim regionom mišjeg teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, sekvenca promene je nehumana (npr. mišja) sekvenca promene. Prema sledećem aspektu, nehumana životinja dalje sadrži nedostatak funkcionalnog endogenog varijabilnog lokusa lakog lanca izabranog između imunoglobulinskog κ lokusa i imunoglobulinskog λ lokusa. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži deleciju Jκ i/ili Jλ sekvence, tako da nehumana životinja nije sposobna za rearanžiranje endogenog varijabilnog regiona nehumanog imunoglobulinskog κ lakog lanca i/ili endogenog nehumanog imunoglobulinskog λ lakog lanca da bi formirala rearanžirani gen endogenog nehumanog imunoglobulinskog κ lakog lanca i/ili rearanžirani gen endogenog nehumanog imunoglobulinskog λ lakog lanca.
[0147] Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži deleciju sekvence endogenog nehumanog imunoglobulinskog κ lakog lanca koja rezultuje funkcionalnom inaktivacijom endogenog nehumanog imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži deleciju sekvence endogenog nehumanog imunoglobulinskog λ lakog lanca koja rezultuje funkcionalnom inaktivacijom endogenog nehumanog imunoglobulinskog λ lakog lanca.
[0148] Prema jednom aspektu, opisan je glodar koji sadrži varijabilni repertoar imunoglobulinskog teškog lanca koji potiče od ne više od jednog humanog VH segmenta ili jednog ili više njegovih polimorfa, od D segmenta izabranog iz repertoara od jednog ili više D segmenata, i od J segmenta izabranog iz repertoara od jednog ili više J segmenata; pri čemu glodar sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u mužjacima glodara.
[0149] Prema jednom aspektu, humani VH segment je prisutan u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više polimorfnih varijanti, pri čemu je svaka polimorfna varijanta operativno povezana sa D i/ili J segmentom tako da je svaka polimorfna varijanta sposobna za rearanžiranje i formiranje rearanžiranog varijabilnog domena teškog lanca sa bilo kojim od jednog ili više D segmenata i bilo kojim od jednog ili više J segmenata. Prema jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. Prema jednom aspektu, repertoar D segmenata sadrži dva ili više D segmenata. Prema jednom aspektu, repertoar J segmenata sadrži dva ili više J segmenata. Prema jednom aspektu, D i/ili J segmenti su humani segmenti. Prema jednom aspektu, ektopična ADAM6 sekvenca je ADAM6 sekvenca glodar divljeg tipa iste vrste. Prema jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. Prema jednom aspektu, ektopična ADAM6 sekvenca ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u mužjacima glodara je na istom hromozomu kao varijabilni repertoar modifikovanog imunoglobulinskog teškog lanca; prema jednom aspektu, on je na različitom hromozomu.
[0150] Prema jednom aspektu, opisan je nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira samo jedan VH segment humanog imunoglobulinskog teškog lanca i/ili njegove polimorfne varijante i jednu ili više DH i jednu ili više J sekvenci, pri čemu konstrukt sadrži najmanje jedan homologi krak koji je homolog sa varijabilnim lokusom
4
nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca, ili mesto prepoznavanja rekombinaze (npr. lox mesto). Prema jednom aspektu, V segment je VH1-69 segment ili VH1-2 segment.
[0151] Prema jednom aspektu, opisan je nukleotidni konstrukt, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira samo jedan V segment humanog imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu je samo jedan VH segment VH1-69 (ili VH1-2) segment. Prema jednom aspektu, konstrukt sadrži mesno specifično mesto prepoznavanja rekombinaze. Prema jednom aspektu, konstrukt sadrži prvi mišji homologi krak uzvodno od VH1-69 (ili VH1-2) segmenta i drugi mišji homologi krak nizvodno od VH1-69 (ili VH1-2) segmenta, pri čemu je prvi mišji homologi krak homolog sa regionom mišjeg hromozoma neposredno uzvodnim od varijabilnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, ali ne sadrži funkcionalni varijabilni segment mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, konstrukt sadrži SEQ ID NO: 6. Prema jednom aspektu, konstrukt sadrži SEQ ID NO: 74. Prema jednom aspektu, konstrukt sadrži SEQ ID NO: 75. Prema jednom aspektu, konstrukt sadrži SEQ ID NO: 76.
[0152] Prema jednom aspektu, ograničeni samo jedan VH segment je u nehumanoj životinji, ili je ograničeni VH segment na lokusu nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca (npr. in situ ili u transgen) i nehumana životinja ili lokus nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca je izabran između mišjeg, pacovskog, zečjeg, svinjskog, goveđeg (npr. kravljeg, bivoljeg, bizonskog), jelenskog, ovčijeg, kozjeg, pilećeg, mačjeg, psećeg, feretkinog, primatskog (npr. marmozetovog, rezus majmunskog) lokusa ili životinje. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja ili lokus je mišji ili pacovski lokus.
[0153] Prema jednom aspektu, opisan je ciljajući vektor, koji sadrži (a) nukleotidnu sekvencu koja je identična ili je u suštini identična sa nukleotidnom sekvencom genskog segmenta humanog varijabilnog regiona; i, (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u mišu [0154] Prema jednom aspektu, ciljajući vektor dalje sadrži promoter koji je operativno povezan sa sekvencom koja kodira mišji ADAM6. Prema specifičnom aspektu, promoter je mišji ADAM6 promoter.
[0155] Prema jednom aspektu, opisan je nukleotidni konstrukt za modifikaciju varijabilnog lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu konstrukt sadrži najmanje jedno mesno specifično mesto prepoznavanja rekombinaze i sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u mišu.
[0156] Prema jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline, koji sadrži uzvodni homologi krak i nizvodni homologi krak, pri čemu uzvodni homologi krak sadrži sekvencu koja je identična ili u suštini identična sa sekvencom varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca, a nizvodni homologi krak sadrži sekvencu koja je identična ili u suštini identična sa sekvencom humanog ili mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona, i između uzvodnog i nizvodnog homologog kraka je smeštena sekvenca koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein. Prema specifičnom aspektu, sekvenca koja kodira mišji ADAM6 gen je operativno povezana sa mišjim promoterom sa kojim je povezan mišji ADAM6 u mišu divljeg tipa.
[0157] Prema jednom aspektu, ovde je opisana ćelija koja je izolovana iz ovde opisanog genetski modifikovanog miša. Prema jednom aspektu, ćelija je limfocit. Prema jednom aspektu, limfocit je B ćelija. Prema specifičnom aspektu, B ćelija sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu ili ortolog ili homolog ili sekvencu koja kodira njegov funkcionalni fragment, pri čemu B ćelija izražava varijabilni domen teškog lanca koji potiče od humanog VH genskog segmenta.
[0158] Prema jednom aspektu, opisana je ćelija ili tkivo, pri čemu ćelija ili tkivo potiču od ovde opisane nehumane životinje, i sadrže ograničeni repertoar VH segmenata. Prema jednom aspektu, repertoar VH segmenata je ograničen na samo jednog člana porodice VH segmenata i/ili njegove polimorfne varijante. Prema specifičnom aspektu, samo jedan VH segment je humani VH1-69 segment ili humani VH1-2 segment. Prema jednom aspektu, ćelija ili tkivo potiče od slezine, limfnog čvora ili koštane srži nehumane životinje.
[0159] Prema jednom aspektu, ćelija je ES ćelija. Prema jednom aspektu, ćelija je B ćelija. Prema jednom aspektu, ćelija je germinativna ćelija.
[0160] Prema jednom aspektu, tkivo je izabrano između vezivnog, mišićnog, nervnog i epitelnog tkiva. Prema specifičnom aspektu, tkivo je reproduktivno tkivo.
[0161] Prema jednom aspektu, ćelija i/ili tkivo koji potiču od ovde opisanog miša se izoluju za primenu u jednom ili više ex vivo testova. Prema različitim aspektima, jedan ili više ex vivo testova obuhvataju merenja fizičkih, toplotnih, električnih, mehaničkih ili optičkih svojstava, hiruršku proceduru, merenja interakcija različitih tipova tkiva, razvoj tehnika snimanja ili njihovu kombinaciju.
[0162] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš.
[0163] Prema jednom aspektu, opisan je nehumani embrion koji sadrži ograničene VH segmente teškog lanca. Prema jednom aspektu, embrion sadrži ES ćeliju donora koja sadrži ograničeni VH segment, i embrionske ćelije domaćina.
[0164] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš.
[0165] Prema jednom aspektu, nehumana ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment od ovde opisane nehumane životinje. Prema jednom aspektu, nehumana ćelija sadrži nukleus ovde opisane nehumane životinje. Prema jednom aspektu, nehumana ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat nuklearnog transfera.
[0166] Prema jednom aspektu, opisan je nukleus koji potiče od ovde opisane nehumane životinje. Prema jednom aspektu, nukleus je od diploidne ćelije koja nije B ćelija.
[0167] Prema jednom aspektu, opisana je pluripotentna, indukovana pluripotenta, ili totipotentna ćelija koja potiče od ovde opisane nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, ćelija je mišja embrionska matična (ES) ćelija.
[0168] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana indukovana pluripotentna ćelija koja sadrži ograničeni repertoar VH segmenata. Prema jednom aspektu, indukovana pluripotentna ćelija potiče od ovde opisane nehumane životinje.
[0169] Prema jednom aspektu opisan je hibridom, koji sadrži sekvencu limfocita ovde opisanog miša. Prema jednom aspektu, limfocit je B ćelija.
[0170] Prema jednom aspektu, opisan je hibridom ili kvadrom, koji potiče od ćelije ovde opisane nehumane životinje. Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš ili pacov.
[0171] Prema jednom aspektu, opisane su mišje ćelije i mišji embrioni, uključujući, ali bez ograničenja na ES ćelije, pluripotentne ćelije, i indukovane pluripotentne ćelije, koje sadrže ovde opisane genetske modifikacije. Opisane su ćelije koje su XX i ćelije koje su XY. Takođe su opisane ćelije koje sadrže nukleus koji sadrži ovde opisanu modifikaciju, npr. modifikaciju koja je uvedena u ćeliju pronuklearnom injekcijom. Takođe su opisani ćelije, embrioni, i miševi koji sadrže virusno uvedeni ADAM6 gen, npr. ćelije, embrioni, i miševi koji sadrže transdukcioni konstrukt koji sadrži ADAM6 gen koji je funkcionalan kod miša.
[0172] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana mišja ćelija, pri čemu ta ćelija nije sposobna za izražavanje teškog lanca koji sadrži rearanžirane endogene genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca, i ćelija sadrži funkcionalni ADAM6
4
gen koji kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, ćelija dalje sadrži inserciju humanih imunoglobulinskih genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, humani imunoglobulinski genski segmenti su genski segmenti teškog lanca koji su operativno povezani sa konstantnim regionima mišjeg teškog lanca tako da posle rearanžiranja kodiraju funkcionalni teški lanac antitela koji sadrži humani varijabilni region.
[0173] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana mišja ćelija; pri čemu ćeliji nedostaje funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus, i ćelija sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, ćelija dalje sadrži modifikaciju varijabilne genske sekvence endogenog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, modifikacija varijabilne genske sekvence endogenog imunoglobulinskog teškog lanca sadrži deleciju izabranu između delecije mišjeg VH genskog segmenta, delecije mišjeg DH genskog segmenta, delecije mišjeg JH genskog segmenta, i njihove kombinacije. Prema specifičnom aspektu, miš sadrži zamenu jednog ili više mišjih imunoglobulinskih VH, DH, i/ili JH sekvenci sa humanom imunoglobulinskom sekvencom. Prema specifičnom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je izabrana između humanog VH, humanog VL, humanog DH, humanog JH, humanog JL, i njihove kombinacije.
[0174] Prema jednom aspektu, ćelija je totipotentna ćelija, pluripotentna ćelija, ili indukovana pluripotentna ćelija. Prema specifičnom aspektu, ćelija je mišja ES ćelija.
[0175] Prema jednom aspektu, opisana je mišja B ćelija, pri čemu mišja B ćelija sadrži rearanžirani gen imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu B ćelija sadrži hromozom B ćelije, a sekvenca nukleinske kiseline kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, mišja B ćelija sadrži dva alela sekvence nukleinske kiseline.
[0176] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na molekulu nukleinske kiseline (npr. hromozomu B ćelije) koji se graniči sa rearanžiranim lokusom mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca.
[0177] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na molekulu nukleinske kiseline (npr. hromozomu B ćelije) koji je različit od molekula nukleinske kiseline koji sadrži rearanžirani lokus mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca.
[0178] Prema jednom aspektu, mišja B ćelija sadrži rearanžiranu nemišju imunoglobulinsku varijabilnu gensku sekvencu operativno povezanu sa genom mišjeg ili humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona, pri čemu B ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.
[0179] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na molekulu nukleinske kiseline (npr. hromozomu B ćelije) koji je lociran na ili u okviru najbližeg genskog lokusa u odnosu na rearanžiranu nehumanu imunoglobulinsku varijabilnu gensku sekvencu.
[0180] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na molekulu nukleinske kiseline (npr. hromozomu B ćelije) koji se graniči sa rearanžiranom sekvencom nehumanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona.
[0181] Prema jednom aspektu, opisana je somatska mišja ćelija, koja sadrži hromozom koji sadrži modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na istom hromozomu kao modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, nukleinska kiselina je na različitom hromozomu od modifikovanog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, somatska ćelija sadrži samo jednu kopiju sekvence nukleinske kiseline. Prema jednom aspektu, somatska ćelija sadrži najmanje dve kopije sekvence nukleinske kiseline. Prema specifičnom aspektu, somatska ćelija je B ćelija. Prema specifičnom aspektu, ćelija je germinativna ćelija. Prema specifičnom aspektu, ćelija je matična čelija.
[0182] Prema jednom aspektu, opisana je mišja germinativna ćelija, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) na hromozomu germinativne ćelije, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) na poziciji u hromozomu koja je različita od pozicije na hromozomu germinativne ćelije miša divljeg tipa. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na mišjem imunoglobulinskom lokusu. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na istom hromozomu germinativne ćelije kao mišji imunoglobulinski lokus. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na različitom hromozomu germinativne ćelije od mišjeg imunoglobulinskog lokusa. Prema jednom aspektu, mišji imunoglobulinski lokus sadrži zamenu najmanje jedne mišje imunoglobulinske sekvence sa najmanje jednom nemišjom imunoglobulinskom sekvencom. Prema specifičnom aspektu, najmanje jedna nemišja imunoglobulinska
4
sekvenca je humana imunoglobulinska sekvenca. Prema jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je sekvenca imunoglobulinskog teškog lanca.
[0183] Prema jednom aspektu, opisana je sekvenca varijabilnog domena antitela napravljena u ovde opisanoj nehumanoj životinji.
[0184] Prema jednom aspektu, opisan je humani terapeutik, koji sadrži varijabilni domen antitela koji sadrži sekvencu koja potiče od ovde opisane nehumane životinje.
[0185] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje sekvence varijabilnog regiona antitela iz nehumane životinje, pri čemu sekvenca varijabilnog regiona antitela potiče od humanog VH1-69 segmenta ili VH1-2 segmenta, pri čemu postupak sadrži (a) imunizaciju nehumane životinje sa antigenom od interesa, pri čemu nehumana životinja sadrži zamenu na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca svih ili u suštini svih nehumanih varijabilnih segmenata sa samo jednim humanim varijabilnim segmentom, pri čemu je samo jedan humani varijabilni segment VH1-69 segment ili VH1-2 segment, i pri čemu nehumana životinja u suštini nije sposobna da formira sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koja ne potiče od humanog VH1-69 segmenta ili VH1-2 segmenta; (b) dopuštanje nehumanoj životinji da razvije imunu reakciju na antigen od interesa; i, (c) identifikaciju ili izolaciju sekvence varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca nehumane životinje, pri čemu se antitelo vezuje za antigen od interesa.
[0186] Prema jednom aspektu, samo jedan humani varijabilni segment je VH1-69 segment.
[0187] Prema jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona antitela potiče od SEQ ID NO: 37. Prema jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona antitela je najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO: 37. Prema jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona antitela sadrži SEQ ID NO: 37.
[0188] Prema jednom aspektu samo jedan humani varijabilni segment je VH1-2 segment.
[0189] Prema jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona antitela potiče od SEQ ID NO: 63. Prema jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona antitela je najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO: 63. Prema jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona antitela sadrži SEQ ID NO: 63.
4
[0190] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za generisanje repertoara varijabilnih regiona humanog antitela u nehumanoj životinji, pri čemu varijabilni regioni humanog teškog lanca repertoara potiču od istog člana familije VH gena i jednog od mnoštva DH segmenata i jednog od mnoštva JH segmenata, pri čemu je repertoar karakterističan po tome što ima FR1 (okvir 1) imunoglobulinskog teškog lanca, CDR1, FR2, CDR2, i FR3 sekvence iz samo jednog člana familije VH gena. Prema jednom aspektu, repertoar je dalje karakterističan po tome što ima mnoštvo različitih CDR3 FR4 sekvenci.
[0191] Prema jednom aspektu, samo jedna familija VH gena je izabrana između VH familija 1, 2, 3, 4, 5, 6, i 7. Prema specifičnom aspektu, samo jedna familija VH gena je VH familija 1. Prema jednom aspektu, samo jedan član familije VH gena je izabran između VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, i VH3-23. Prema specifičnom aspektu, samo jedan član familije VH gena je VH1-69.
[0192] Prema jednom aspektu, repertoar sadrži FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 sekvence teškog lanca koje potiču od VH1-69 segmenta. Prema specifičnom aspektu, repertoar sadrži FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 sekvence teškog lanca koje potiču od SEQ ID NO: 38. Prema specifičnom aspektu, repertoar sadrži FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 38.
[0193] Prema jednom aspektu, repertoar sadrži FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 sekvence teškog lanca koje potiču od VH1-2 segmenta. Prema specifičnom aspektu, repertoar sadrži FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 sekvence teškog lanca koje potiču od SEQ ID NO: 64. Prema specifičnom aspektu, repertoar sadrži FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 64.
[0194] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za generisanje mnoštva različitih CDR3 i FR4 sekvenci u nehumanoj životinji, koji sadrži izlaganje nehumane životinje koja sadrži varijabilni genski lokus imunoglobulinskog teškog lanca sa repertoarom VH segmenata ograničenim na samo jednog člana familije VH segmenata antigena od interesa, dopuštanje nehumanoj životinji da razvije imunu reakciju na antigen, pri čemu imuna reakcija generiše repertoar B ćelija čiji svaki od varijabilnih domena teškog lanca potiče od samo jednog člana familije VH segmenata i koji sadrži mnoštvo različitih CDR3 i FR4 sekvenci.
[0195] Prema jednom aspektu, samo jedan član familije VH segmenata je humani. Prema jednom aspektu, nehumana životinja je izabrana između miša, pacova i zeca. Prema jednom aspektu, antigen od interesa je izabran između liganda, receptora,
4
intracelularnog proteina i izlučenog proteina. Prema jednom aspektu, antigen od interesa je humani patogen.
[0196] Prema jednom aspektu, opisana je nukleotidna sekvenca koja kodira imunoglobulinski varijabilni region koji je napravljen u ovde opisanoj nehumanoj životinji.
[0197] Prema jednom aspektu, opisana je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca ili imunoglobulinskog lakog lanca antitela koja je napravljena u ovde opisanoj nehumanoj životinji.
[0198] Prema jednom aspektu, opisana je nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca ili imunoglobulinskog lakog lanca koja kodira varijabilni region antitela i koja je napravljena u ovde opisanoj nehumanoj životinji.
[0199] Prema jednom aspektu, opisano je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr. Fab, F(ab)2, scFv) koji su napravljeni u ovde opisanoj nehumanoj životinji.
[0200] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje genetski modifikovane nehumane životinje, koji sadrži zamenu jednog ili više genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca uzvodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca) od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje sa jednim ili više genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca, i zamenu jednog ili više imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca) ADAM6 lokusa nehumane životinje sa jednim ili više genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca ili lakog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata uzvodno od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje obuhvataju V genske segmente. Prema jednom aspektu, humani imunoglobulinski genski segmenti koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata uzvodno od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje obuhvataju V i D genske segmente. Prema jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje obuhvataju J genske segmente. Prema jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje obuhvataju D i J genske segmente. Prema jednom
4
aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje obuhvataju V, D i J genske segmente. Prema specifičnom aspektu, jedan ili više genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa nehumane životinje obuhvataju samo jedan V genski segment, jedan ili više D genskih segmenata i jedan ili više J genskih segmenata.
[0201] Prema jednom aspektu, jedan ili više genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca uzvodno i/ili nizvodno od ADAM6 gena su zamenjeni u pluripotentnoj, indukovano pluripotentnoj, ili totipotentnoj ćeliji da bi se formirala genetski modifikovana progenitorska ćelija; genetski modifikovana progenitorska ćelija se uvodi u domaćina; i, domaćin koji sadrži genetski modifikovanu progenitorsku ćeliju se oplođava da bi se formirala nehumana životinja koja sadrži genom koji potiče od genetski modifikovane progenitorske ćelije. Prema jednom aspektu, domaćin je embrion. Prema specifičnom aspektu, domaćin je izabran između mišje pre-morule (npr. stadijuma sa 8- ili 4-ćelija), tetraploidnog embriona, agregata embrionskih ćelija, ili blastocista.
[0202] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja, pri čemu nehumana životinja ima repertoar B ćelija koji izražava varijabilne domene imunoglobulinskog teškog lanca koji potiču od samo jednog člana familije V segmenata. Prema jednom aspektu, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90, ili najmanje 95% repertoara B ćelija varijabilnog domena imunoglobulinskog teškog lanca nehumane životinje izraženog u repertoaru B ćelija potiče od istog člana familije V segmenata. Prema specifičnom aspektu, procenat je najmanje 90%. Prema jednom aspektu, repertoar B ćelija se u suštini sastoji od perifernih (krvnih) B ćelija. Prema jednom aspektu, repertoar B ćelija se u suštini sastoji od slezinskih B ćelija. Prema jednom aspektu, repertoar B ćelija se u suštini sastoji od B ćelija koštane srži. Prema jednom aspektu, repertoar B ćelija se u suštini sastoji od perifernih B ćelija, slezinskih B ćelija, i B ćelija koštane srži.
[0203] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana nehumana životinja, pri čemu više od 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili više od 90% B ćelija nehumane životinje koje izražavaju varijabilni domen imunoglobulinskog teškog lanca izražava varijabilni domen imunoglobulinskog teškog lanca koji potiče od samo jednog
4
člana familije VH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, najmanje 75% B ćelija nehumane životinje koje izražavaju varijabilni domen imunoglobulinskog teškog lanca izražava varijabilni domen imunoglobulinskog teškog lanca koji potiče od samo jednog člana familije VH genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, procenat je najmanje 90%. Prema jednom aspektu, sve B ćelije izražavaju domen teškog lanca koji potiče od samo jednog člana porodice VH gena.
[0204] Prema jednom aspektu, opisan je genetski modifikovani miš koji proizvodi populaciju antigen-specifičnih B ćelija kao reakciju na imunizaciju sa antigenom od interesa, pri čemu najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili više od 90%, pomenute populacije antigen-specifičnih B ćelija izražava imunoglobulinske teške lance koji svi potiču od istog VH genskog segmenta. Prema jednom aspektu, najmanje 75% populacije antigen-specifičnih B ćelija izražava imunoglobulinske teške lance koji potiču od istog VH genskog segmenta. Prema jednom aspektu, sve antigenspecifične B ćelije izražavaju teški lanac koji potiče od istog VH genskog segmenta.
[0205] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži ograničeni repertoar VH genskih segmenata, pri čemu je ograničenje na humani VH1-69 genski segment ili na VH1-69 genski segment koji je najmanje oko 75.5%, 76.5%, 86.7%, 87.8%, 94.9%, 96.9%, 98%, ili 99% identičan sa VH1-69*01 genskim segmentom. Prema specifičnom aspektu, ograničeni repertoar je izabran između jedne ili više VH1-69 varijanti sa FIG.7.
[0206] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži ograničeni repertoar VH genskih segmenata, pri čemu je ograničenje na humani VH1-2 genski segment ili na VH1-2 genski segment koji je najmanje oko 94.9%, 95.9%, 96.9%, 98%, ili 99% identičan sa VH1-2 genskim segmentom. Prema specifičnom aspektu, ograničeni repertoar je izabran između jedne ili više VH1-2 varijanti sa FIG.10.
[0207] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš.
[0208] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži ograničeni repertoar humanih VH segmenata, koja dalje sadrži humanizovani lokus varijabilnog segmenta imunoglobulinskog lakog lanca, pri čemu je odnos λ prema κ lakom lancu izraženom u mišu približno isti kao kod miša divljeg tipa.
[0209] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja, koja sadrži ograničeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji je karakterističan po prisustvu samo jednog VH genskog segmenta, jednog ili više DH genskih segmenata, i jednog ili više JH genskih segmenata, pri čemu je samo jedan VH genski segment polimorfni VH genski segment.
[0210] Prema jednom aspektu, polimorfni VH genski segment je humani VH genski segment koji je povezan sa velikim brojem kopija u humanim populacijama. Prema jednom aspektu, humani VH genski segment je izabran između VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, VH3-23, ili njihove polimorfne varijante. Prema specifičnom aspektu, humani VH genski segment je VH1-69 genski segment. Prema sledećem specifičnom aspektu, humani VH genski segment je VH1-2 genski segment.
[0211] Prema jednom aspektu, samo jedan VH genski segment je operativno povezan sa a humanim, mišjim, ili himeričnim humanim/mišjim genom imunoglobulinskog konstantnog regiona. Prema specifičnom aspektu, gen imunoglobulinskog konstantnog regiona je mišji gen konstantnog regiona. Prema jednom aspektu, imunoglobulinski konstantni gen sadrži humanu sekvencu izabranu između humanog CH1, humanog zgloba, humanog CH2, humanog CH3, i njihove kombinacije. Prema jednom aspektu, mišji konstantni gen je na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0212] Prema jednom aspektu, nehumana životinja dalje sadrži humani imunoglobulinski VL genski segment koji je operativno povezan sa J genskim segmentom i konstantnim genom lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, VL genski segment i/ili J genski segment su izabrani između humanog κ genskog segmenta i humanog λ genskog segmenta. Prema jednom aspektu, VL i/ili J genski segmenti su humani κ genski segmenti.
[0213] Prema različitim aspektima, nehumana životinja sadrži deleciju svih ili u suštini svih endogenih VH genskih segmenata.
[0214] Prema različitim aspektima, nehumana životinja sadrži inaktivirani endogeni varijabilni genski lokus teškog lanca. Prema različitim aspektima, inaktivirani endogeni varijabilni genski lokus teškog lanca nije operativno povezan sa endogenim genom konstantnog regiona teškog lanca.
[0215] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja, pri čemu je nehumana životinja karakteristična po ekspresiji serumskog imunoglobulina, pri čemu više od 80% serumskog imunoglobulina sadrži humani varijabilni domen teškog lanca i srodni varijabilni domen humanog lakog lanca, pri čemu humani varijabilni domen teškog lanca potiče od repertoara VH genskih segmenata koji se u suštini sastoji od samo jednog humanog VH genskog segmenta i/ili njegovih polimorfnih varijanti.
1
[0216] Prema jednom aspektu, samo jedan humani VH genski segment je humani VH1-69 genski segment i/ili njegove polimorfne varijante. Prema jednom aspektu, samo jedan humani VH genski segment je humani VH1-2 genski segment i/ili njegove polimorfne varijante.
[0217] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja, koja sadrži, u svojoj germinativnoj liniji, zamenu na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca svih ili u suštini svih endogenih VH genskih segmenata sa samo jednim humanim VH genskim segmentom i/ili njegovim polimorfnim varijantama.
[0218] Prema jednom aspektu, nehumana životinja dalje sadrži zamenu na endogenom lokusu imunoglobulinskog lakog lanca svih ili u suštini svih endogenih VL genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, miš dalje sadrži jedan ili više humanih JL genskih segmenata operativno povezanih sa humanim VL genskim segmentima.
[0219] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja izražava antitelo koje sadrži najmanje jedan imunoglobulinski polipeptid humanog varijabilnog domena/nehumanog konstantnog domena, pri čemu nehumana životinja izražava nehumani ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog iz endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca nije sposoban za rearanžiranje da bi kodirao funkcionalni teški lanac antitela.
[0220] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja izražava antitelo koje sadrži najmanje jedan imunoglobulinski polipeptid humanog varijabilnog domena/nehumanog konstantnog domena, pri čemu nehumana životinja izražava nehumani ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog iz lokusa koji je različit od imunoglobulinskog lokusa.
[0221] Prema jednom aspektu, ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog se izražava u B ćeliji nehumane životinje, pri čemu B ćelija sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku sekvencu koja sadrži humanu varijabilnu sekvencu i nehumanu konstantnu sekvencu.
[0222] Prema jednom aspektu, nehumana konstantna sekvenca je glodarska sekvenca. Prema jednom aspektu, glodar je izabran između miša, pacova i hrčka.
[0223] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za pravljenje mužjaka nehumane životinje neplodnim, koji sadrži pravljenje endogenog ADAM6 alela ES ćelija donora nefunkcionalnim (ili inaktivaciju pomenutog alela), uvođenje ES ćelija donora u
2
embrion domaćina, unošenje embriona domaćina u surogat majku, i omogućavanje surogat majci da dobije potomstvo koje potiče u celini ili delimično od ES ćelije donora. Prema jednom aspektu, postupak dalje sadrži parenje potomstva da bi se dobili neplodni mužjaci nehumane životinje.
[0224] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje nehumane životinje sa genetskom modifikacijom od interesa, pri čemu je nehumana životinja neplodna, a taj postupak sadrži korake (a) pravljenja genetske modifikacije od interesa u genomu; (b) modifikaciju genoma da bi se inaktivirao endogeni ADAM6 alel, ili pravljenje endogenog ADAM6 alela nefunkcionalnim; i, (c) korišćenje genoma za dobijanje nehumane životinje. Prema različitim aspektima, genom je iz ES ćelije ili se upotrebljava u eksperimentu sa nuklearnim transferom.
[0225] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja napravljena korišćenjem ovde opisanog ciljajućeg vektora, nukleotidnog konstrukta, ili ćelije.
[0226] Prema jednom aspektu, opisano je potomstvo dobijeno parenjem ovde opisane nehumane životinje sa drugom nehumanom životinjom koja je nehumana životinja divljeg tipa ili genetski modifikovana.
[0227] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za održavanje soja nehumane životinje, pri čemu soj nehumane životinje sadrži zamenu sekvence nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca sa jednom ili više sekvenci heterologog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, jedna ili više sekvenci heterologog imunoglobulinskog teškog lanca su sekvence humanog imunoglobulinskog teškog lanca.
[0228] Prema jednom aspektu, soj nehumane životinje sadrži deleciju jednog ili više nehumanih VH, DH, i/ili JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, nehumana životinja dalje sadrži samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i/ili jedan ili više humanih JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, nehumana životinja sadrži samo jedan humani VH segment, najmanje 27 humanih DH genskih segmenata, i najmanje šest JH genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja sadrži samo jedan humani VH segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata, pri čemu su pomenuti samo jedan humani VH genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata operativno povezani sa genom konstantnog regiona. Prema jednom aspektu, gen konstantnog regiona je gen nehumanog konstantnog regiona. Prema jednom aspektu, gen konstantnog regiona sadrži gensku sekvencu mišjeg ili pacovskog konstantnog regiona koja je izabrana između CH1, zgloba, CH2, CH3, i/ili CH4 ili njihove kombinacije. Prema različitim aspektima, samo jedan humani VH genski segment je humani VH1-69 ili humani VH1-2 genski segment.
[0229] Prema jednom aspektu, postupak sadrži generisanje mužjaka nehumane životinje koji su heterozigotni za zamenu sekvence nehumanog imunoglobulinskog teškog lanca, i parenje heterozigotnih mužjaka nehumane životinje sa ženkama nehumane životinje divljeg tipa ili ženkama nehumane životinje koja je homozigotna ili heterozigotna za sekvencu humanog teškog lanca. Prema jednom aspektu, postupak sadrži održavanje soja nehumane životinje ponovljenim parenjem heterozigotnih mužjaka sa ženkama koje su divljeg tipa ili homozigotne ili heterozigotne za sekvencu humanog teškog lanca.
[0230] Prema jednom aspektu, postupak sadrži dobijanje ćelija od mužjaka ili ženki nehumane životinje koje su homozigotne ili heterozigotne za sekvencu humanog teškog lanca, i korišćenje tih ćelija kao ćelija donora ili nukleusa iz njih kao nukleusa donora, i korišćenje ćelija ili nukleusa za dobijanje genetski modifikovane nehumane životinje korišćenjem ćelija domaćina i/ili unošenjem ćelija i/ili nukleusa u surogat majke.
[0231] Prema jednom aspektu, samo mužjaci nehumane životinje koji su heterozigotni za zamenu na lokusu teškog lanca se pare sa ženkama nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, ženke nehumane životinje su homozigotne, heterozigotne, ili divljeg tipa u pogledu zamenjenog lokusa teškog lanca.
[0232] Prema jednom aspektu, nehumane životinje dalje sadrže zamenu varijabilnih sekvenci λ i/ili κ lakog lanca na endogenom lokusu imunoglobulinskog lakog lanca sa heterologim sekvencama imunoglobulinskog lakog lanca. Prema jednom aspektu, heterologe sekvence imunoglobulinskog lakog lanca su varijabilne sekvence humanog imunoglobulinskog λ i/ili κ lakog lanca.
[0233] Prema jednom aspektu, nehumana životinja dalje sadrži transgen na lokusu drugačijem od endogenog imunoglobulinskog lokusa, pri čemu transgen sadrži sekvencu koja kodira rearanžiranu ili nerearanžiranu heterologu sekvencu λ ili κ lakog lanca (npr. nerearanžiranu VL i nerearanžiranu JL, ili rearanžiranu VLJL) operativno povezanu (za nerearanžiranu) ili fuzionisanu (za rearanžiranu) sa sekvencom konstantnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca. Prema jednom aspektu, heterologa sekvenca λ ili κ lakog lanca je humana. Prema jednom aspektu, sekvenca konstantnog regiona je izabrana između glodarske, humane, i od nehumanog primata.
4
Prema jednom aspektu, sekvenca konstantnog regiona je izabrana između mišje, pacovske, i hrčkove. Prema jednom aspektu, transgen sadrži neimunoglobulinski promoter koji aktivira ekspresiju sekvenci lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, promoter je transkripciono aktivni promoter. Prema specifičnom aspektu, promoter je ROSA26 promoter.
[0234] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje genetski modifikovane nehumane životinje, koji sadrži umetanje nehumane nukleotidne sekvence koja sadrži nehumani imunoglobulinski genski segment u genom životinje radi prve modifikacije, pri čemu insercija zadržava endogeni ADAM6 gen, a onda činjenje endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca nehumane životinje nefunkcionalnim radi druge modifikacije. Prema jednom aspektu, prva modifikacija se izvodi uzvodno od gena konstantnog regiona endogenog imunoglobulinskog teškog lanca i druga modifikacija se izvodi da se preokrene, premesti, ili izmesti operativna veza endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca tako da endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca ne bude sposoban za rearanžiranje da bi kodirao funkcionalni varijabilni region teškog lanca.
[0235] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje genetski modifikovane nehumane životinje, koji sadrži zamenu nehumane nukleotidne sekvence koja sadrži nehumani imunoglobulinski genski segment i nehumanu ADAM6 (ili njen ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka nehumane životinje) nukleotidnu sekvencu sa sekvencom koja sadrži humani imunoglobulinski genski segment da bi se formirao prvi himerični lokus, a onda umetanje sekvence koja sadrži nehumanu ADAM6-kodirajuću sekvencu (ili sekvencu koja kodira njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) u sekvencu koja sadrži humani imunoglobulinski genski segment da bi se formirao drugi himerični lokus.
[0236] Prema jednom aspektu, drugi himerični lokus sadrži varijabilni (VH) genski segment humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, drugi himerični lokus sadrži varijabilni (VL) genski segment humanog imunoglobulinskog lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, drugi himerični lokus sadrži humani VH genski segment ili humani VL genski segment operativno povezan sa humanim DH genskim segmentom i humanim JH genskim segmentom. Prema sledećem specifičnom aspektu, drugi himerični lokus je operativno povezan sa trećim himeričnim lokusom koji sadrži humanu CH1 sekvencu, ili su sekvence humanog CH1 i humanog zgloba, fuzionisane sa mišjom CH2 CH3 sekvencom.
[0237] Prema jednom aspektu, opisana je primena miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji ADAM6 lokus ili sekvencu da bi se dobio plodni mužjak miša, pri čemu primena sadrži parenje miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji ADAM6 lokus ili sekvencu sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus ili sekvenca, i dobijanje potomstva koje je ženka koja može da proizvede potomstvo koje ima ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu ili koje je mužjak koji sadrži ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu, i mužjaka odlikuje plodnost koja je približno ista kao plodnost koja odlikuje mužjaka miša divljeg tipa.
[0238] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje nukleotidne sekvence imunoglobulinskog varijabilnog regiona.
[0239] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje potpuno humanog Fab ili potpuno humanog F(ab)2.
[0240] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje imortalizovane ćelijske linije.
[0241] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje hibridoma ili kvadroma.
[0242] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje biblioteke faga koja sadrži varijabilne regione humanog teškog lanca i varijabilne regione humanog lakog lanca.
[0243] Prema jednom aspektu, varijabilni regioni humanog teškog lanca potiču od humanog VH1-69 genskog segmenta koji sadrži sekvencu koja je izabrana između SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 59.
[0244] Prema jednom aspektu, varijabilni regioni humanog teškog lanca potiču od humanog VH1-69 genskog segmenta koji sadrži sekvencu koja je izabrana između SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 62.
[0245] Prema jednom aspektu, svi varijabilni regioni humanog teškog lanca potiču od humanog VH1-2 genskog segmenta koji sadrži sekvencu koja je izabrana između SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 i SEQ ID NO: 71.
[0246] Prema jednom aspektu, varijabilni regioni humanog teškog lanca potiču od humanog VH1-2 genskog segmenta koji sadrži sekvencu koja je izabrana između SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 i SEQ ID NO: 72.
[0247] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju ovde opisanog miša sa antigenom od interesa, (b) izolaciju limfocita iz miša imunizovanog pod (a), (c) izlaganje limfocita jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju limfocita koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona iz limfocita čime se generiše sekvenca varijabilnog regiona.
[0248] Prema jednom aspektu, limfocit potiče iz slezine miša. Prema jednom aspektu, limfocit potiče iz limfnog čvora miša. Prema jednom aspektu, limfocit potiče iz koštane srži miša.
[0249] Prema jednom aspektu, obeleženo antitelo je antitelo konjugovano sa fluoroforom. Prema jednom aspektu, jedno ili više antitela konjugovanih sa fluoroforom su izabrana između IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.
[0250] Prema jednom aspektu, limfocit je B ćelija.
[0251] Prema jednom aspektu, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca. Prema jednom aspektu, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca je sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.
[0252] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju ovde opisanog miša sa antigenom od interesa, (b) izolaciju slezine iz miša imunizovanog pod (a), (c) izlaganje B limfocita iz slezine jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita pod (c) koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se generišu sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.
[0253] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju ovde opisanog miša sa antigenom od interesa, (b) izolaciju jednog ili više limfnih čvorova iz miša imunizovanog pod (a), (c) izlaganje B limfocita iz jednog ili više limfnih čvorova jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita pod (c) koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se generišu sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.
[0254] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju ovde opisanog miša sa antigenom od interesa, (b) izolaciju koštane srži iz miša imunizovanog pod (a), (c) izlaganje B limfocita iz koštane srži jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita pod (c) koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se generišu sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca. Prema različitim aspektima, jedno ili više obeleženih antitela su izabrani između IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.
[0255] Prema različitim aspektima, antigen od interesa je patogen koji pogađa humane subjekte uključujući, npr. virusni antigen. Ilustrativni virusni patogeni obuhvataju, npr. uglavnom one iz familija Adenoviridae, bakterija Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae, i Togaviridae. Takvi ilustrativni virusi obično imaju dužinu u opsegu između 20-300 nanometara. Prema različitim aspektima, antigen od interesa je virusni antigen izabran između hepatitis virusa (npr. HCV, HBV, itd.), virusa humane imunodeficije (HIV), ili influenca virusa.
[0256] Prema različitim aspektima, opisana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja dalje sadrži fuzionisanje amplifikovanih sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca sa sekvencama konstantnog regiona humanog teškog i lakog lanca, izražavanje fuzionisanih sekvenci teškog i lakog lanca u ćeliji, i rekuperaciju izraženih sekvenci teškog i lakog lanca čime se generiše humano antitelo.
[0257] Prema različitim aspektima, konstantni regioni humanog teškog lanca su izabrani između IgM, IgD, IgA, IgE i IgG. Prema različitim specifičnim aspektima, IgG je izabran između IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Prema različitim aspektima, konstantni region humanog teškog lanca sadrži CH1, zglob, CH2, CH3, CH4, ili njihovu kombinaciju. Prema različitim aspektima, konstantni region lakog lanca je imunoglobulinski κ konstantni region. Prema različitim aspektima, ćelija je izabrana između HeLa ćelije, DU145 ćelije, Lncap ćelije, MCF-7 ćelije, MDA-MB-438 ćelije, PC3 ćelije, T47D ćelije, THP-1 ćelije, U87 ćelije, SHSY5Y (humane neuroblastoma) ćelije, Saos-2 ćelije, Vero ćelije, CHO ćelije, GH3 ćelije, PC12 ćelije, humane retinalne ćelije (npr. PER.C6™ ćelije), i MC3T3 ćelije. Prema specifičnom aspektu, ćelija je CHO ćelija.
[0258] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za generisanje reverznohimeričnog glodarsko-humanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji sadrži korake imunizacije ovde opisanog miša sa antigenom, izolaciju najmanje jedne ćelija iz miša koji proizvodi reverzno-himerično mišje-humano antitelo specifično protiv antigena, kultivaciju najmanje jedne ćelije koja proizvodi reverzno-himerično mišjehumano antitelo specifično protiv antigena, i dobijanje pomenutog antitela.
[0259] Prema jednom aspektu, reverzno-himerično mišje-humano antitelo sadrži humani varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa konstantnim genom mišjeg ili pacovskog teškog lanca, i varijabilni domen humanog lakog lanca fuzionisan sa konstantnim genom mišjeg ili pacovskog ili humanog lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, humani varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH1-69 ili humani VH1-2 genski segment.
[0260] Prema jednom aspektu, kultivacija najmanje jedne ćelije koja proizvodi reverzno-himerično glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena se izvodi na najmanje jednoj hibridoma ćeliji koja je generisana od najmanje jedne ćelije izolovane iz miša.
[0261] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za generisanje potpuno humanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji sadrži korake imunizacije ovde opisanog miša sa antigenom, izolaciju najmanje jedne ćelija iz miša koji proizvodi reverzno-himerično glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena, generisanje najmanje jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo koje potiče od reverznohimeričnog glodarsko-humanog antitela specifičnog protiv antigena, i kultivaciju najmanje jedne ćelija koja proizvodi potpuno humano antitelo, i dobijanje pomenutog potpuno humanog antitela.
[0262] Prema različitim aspektima, najmanje jedna ćelija izolovana iz miša koji proizvodi reverzno-himerično glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena je splenocit ili B ćelija.
[0263] Prema različitim aspektima, antitelo je monoklonsko antitelo.
[0264] Prema različitim aspektima, antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži rearanžirani humani VH1-69 ili humani VH1-2 genski segment.
[0265] Prema različitim aspektima, imunizacija sa antigenom od interesa se izvodi sa proteinom, DNK, kombinacijom DNK i proteina, ili ćelijama koje izražavaju antigen.
[0266] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski varijabilni region ili njegov fragment. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline se upotrebljava za dobijanje humanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Prema jednom aspektu, miš se upotrebljava za dobijanje antigen-vezujućeg proteina izabranog između antitela, multi-specifičnog antitela (npr. bi-specifičnog antitela), scFv, bispecifičnog scFv, diatela, triatela, tetratela, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (tj. dualnog varijabilnog domena antigen-vezujućeg proteina), SVD (tj. samo jednog varijabilnog domena antigen-vezujućeg proteina), ili bispecifičnog zahvatača T-ćelija (BiTE).
[0267] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje humanog antigenvezujućeg proteina, koji sadrži izlaganje genetskim inženjeringom modifikovane ovde opisane nehumane životinje antigenu od interesa, dopuštanje da nehumana životinja razvije imunu reakciju na antigen, dobijanje od nehumane životinje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog domena teškog lanca koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca koji specifično vezuje antigen od interesa, fuzionisanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog domena teškog lanca sa sekvencom humanog konstantnog regiona, i izražavanje u sisarskoj ćeliji antitela koje sadrži sekvencu humanog varijabilnog domena teškog lanca i sekvence humanog konstantnog regiona. Prema jednom aspektu, sisarska ćelija je CHO ćelija. Prema jednom aspektu nehumana životinja sadrži repertoar humanog VH genskog segmenta koji se u suštini sastoji od samo jednog humanog VH genskog segmenta, opciono prisutnog u dve ili više svojih polimorfnih varijanti, operativno povezanih sa jednim ili više humanih D i/ili J segmenata. Prema jednom aspektu, repertoar humanog VH genskog segmenta je na endogenom lokusu nehumanog VH genskog segmenta. Prema jednom aspektu, repertoar humanog VH genskog segmenta je na lokusu koji nije endogeni lokus VH genskog segmenta. Prema jednom aspektu, humani VH genski segment se rearanžira sa humanim D segmentom i humanim J segmentom da bi formirao rearanžirani humani VDJ gen operativno povezan sa sekvencom konstantnog regiona, pri čemu je sekvenca konstantnog regiona izabrana između humane sekvence i glodarske sekvenca (npr. mišje ili pacovske ili hrčkove sekvence). Prema jednom aspektu, sekvenca konstantnog regiona sadrži sekvencu koja je izabrana između CH1, zgloba, CH2, a CH3, i njihove kombinacije; prema specifičnom aspektu, sekvenca konstantnog regiona sadrži CH1, zglob, CH2, i CH3. Prema jednom aspektu, humani varijabilni domen i konstantna sekvenca su izraženi u sisarskoj ćeliji sa srodnim varijabilnim domenom humanog lakog lanca dobijenog od istog miša (npr. sekvenca dobijena od iste B ćelije kao sekvenca humanog varijabilnog domena); prema jednom aspektu sekvenca koja kodira varijabilni domen humanog lakog lanca dobijen od miša se onda fuzioniše sa sekvencom koja kodira konstantnu sekvencu humanog lakog lanca, i sekvenca lakog lanca i sekvenca teškog lanca su izražene u sisarskoj ćeliji.
[0268] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje varijabilnog domena teškog lanca antitela koje se vezuje za antigen od interesa, koji sadrži izražavanje u samo jednoj ćeliji (a) prve VH sekvence od ovde opisane imunizovane nehumane životinje, pri čemu se prva VH sekvenca fuzioniše sa CH genskom sekvencom; i (b) VL genske sekvence ovde opisane imunizovane nehumane životinje, pri čemu se VL genska sekvenca fuzioniše sa humanom CL genskom sekvencom; održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim za izražavanje antitela; i, izolaciju varijabilnog domena teškog lanca antitela. Prema jednom aspektu, VL genska sekvenca je srodna sa prvom VH sekvencom.
[0269] Prema jednom aspektu, ćelija sadrži drugu VH gensku sekvencu ovde opisane imunizovane nehumane životinje, pri čemu se druga VH genska sekvenca fuzioniše sa CH genskom sekvencom, pri čemu prva VH genska sekvenca kodira VH domen koji specifično vezuje prvi epitop, i druga VH genska sekvenca kodira VH domen koji specifično vezuje drugi epitop, pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.
[0270] Prema jednom aspektu, sve sekvence konstantnog regiona su sekvence humanog konstantnog regiona.
1
[0271] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, koji sadrži dobijanje bispecifičnog antitela korišćenjem genskih sekvenci humanog varijabilnog regiona B ćelija ovde opisane nehumane životinje.
[0272] Prema jednom aspektu, postupak sadrži (a) identifikaciju klonski izabranog limfocita nehumane životinje, pri čemu je nehumana životinja bila izložena antigenu od interesa i dopušteno je da razvije imunu reakciju na antigen od interesa, i pri čemu limfocit izražava antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa, (b) dobijanje iz limfocita ili antitela nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni region humanog teškog lanca koji specifično vezuje antigen od interesa, i (c) korišćenje nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni region humanog teškog lanca koja specifično vezuje antigen od interesa praveći bispecifično antitelo. Prema specifičnom aspektu, varijabilni region humanog teškog lanca sadrži rearanžirani VH1-2 ili VH1-69 genski segment.
[0273] Prema jednom aspektu, koraci (a) do (c) se izvode po prvi put za prvi antigen od interesa da bi se generisala prva sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca, a koraci (a) do (c) se izvode po drugi put za drugi antigen od interesa da bi se generisala druga sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca, pri čemu se prva sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca izražava fuzionisano sa prvim konstantnim regionom humanog teškog lanca da bi se formirao prvi humani teški lanac, a druga sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca se izražava fuzionisano sa drugim konstantnim regionom humanog teškog lanca da bi se formirao drugi humani teški lanac, pri čemu se prvi i drugi humani teški lanac izražavaju u prisustvu samo jednog humanog lakog lanca koji se izražava od rearanžiranog humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, samo jedan humani laki lanac sadrži sekvencu germinativne linije.
[0274] Prema jednom aspektu, postupak sadrži (a) kloniranje varijabilnih regiona teškog lanca iz B ćelija ovde opisane nehumane životinje koja je bila izložena prvom antigenu od interesa, i iste nehumane životinje, ili različite nehumane životinje koja je genetski ista i bila je izložena drugom antigenu od interesa; i (b) izražavanje u ćeliji varijabilnih regiona teškog lanca pod (a) sa istim konstantnim regionom teškog lanca i istim lakim lancem da bi se napravilo bispecifično antitelo.
[0275] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisane nehumane životinje, da bi se dobila sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2 i VH1-69.
2
[0276] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisane nehumane životinje, da bi se dobila ćelija koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2 i VH1-69.
[0277] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisane nehumane životinje da bi se dobio varijabilni domen humanog antitela. Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisane nehumane životinje za dobijanje humanog antitela. Prema jednom aspektu, humano antitelo je humano bispecifično antitelo. Prema različitim aspektima, varijabilni domen i/ili antitelo sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2 i VH1-69.
[0278] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisane nehumane životinje za selekciju varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2 i VH1-69.
[0279] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za uvođenje ektopične ADAM6 sekvence u miša kome nedostaje funkcionalna endogena mišja ADAM6 sekvenca, pri čemu ta primena sadrži parenje ovde opisanog miša sa mišem kome nedostaje funkcionalna endogena mišja ADAM6 sekvenca.
[0280] Prema jednom aspektu, opisana je primena genetskog materijala iz ovde opisanog miša za dobijanje miša koji ima ektopičnu ADAM6 sekvencu. Prema jednom aspektu, primena sadrži nuklearni transfer uz korišćenje nukleusa ćelije ovde opisanog miša. Prema jednom aspektu, primena sadrži kloniranje ćelije ovde opisanog miša da bi se proizvela životinja koja potiče od ćelije. Prema jednom aspektu, primena sadrži korišćenje sperme ili jajašca ovde opisanog miša u procesu za dobijanje miša koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu.
[0281] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje plodnog mužjaka miša koji sadrži modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži oplođenje prve mišje germinativne ćelije koja sadrži modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sa drugom mišjom germinativnom ćelijom koja sadrži ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša; formiranje oplođene ćelije; dopuštanje da se oplođena ćelija razvije u embrion; i, unošenje embriona u surogat da bi se dobio miš.
[0282] Prema jednom aspektu, oplođenje se ostvaruje parenjem mužjaka miša i ženke miša. Prema jednom aspektu, ženka miša sadrži ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment. Prema jednom aspektu, mužjak miša sadrži ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment.
[0283] Prema jednom aspektu, opisana je primena sekvence nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment odgovarajućeg ADAM6 proteina radi ponovnog uspostavljanja ili povećanje plodnosti miša koji ima genom koji sadrži modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu ta modifikacija smanjuje ili eliminiše endogenu ADAM6 funkciju.
[0284] Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u mišji genom na ektopičnoj poziciji. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u mišji genom na endogenom imunoglobulinskom lokusu. Prema specifičnom aspektu, endogeni imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u mišji genom na poziciji koja je drugačija od endogenog imunoglobulinskog lokusa.
[0285] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za proizvodnju leka (npr. antigen-vezujućeg proteina), ili za proizvodnju sekvence koja kodira varijabilnu sekvencu leka (npr. antigen-vezujućeg proteina), za lečenje humane bolesti ili poremećaja. Prema jednom aspektu, varijabilna sekvenca leka sadrži polimorfni humani VH genski segment. Prema jednom aspektu, varijabilna sekvenca leka sadrži humani VH1-69 genski segment. Prema jednom aspektu, varijabilna sekvenca leka sadrži humani VH1-2 genski segment.
[0286] Prema jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji kodira imunoglobulinski varijabilni domen koji je napravljen u ovde opisanom mišu. Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ili VH3-23. Prema sledećem specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži humani VH1-2 genski segment. Prema sledećem specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži humani VH1-69 genski segment.
[0287] Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen κ lakog lanca koji je srodan sa humanim varijabilnim domenom teškog lanca koji sadrži rearanžirani humani VH1-69 genski segment. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen κ lakog lanca koji je srodan sa humanim varijabilnim domenom teškog lanca koji sadrži rearanžirani humani VH1-2 genski segment.
4
[0288] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje konstrukta nukleinske kiseline koji kodira humani imunoglobulinski varijabilni domen. Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen lakog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen κ lakog lanca koji sadrži rearanžirani humani Vκ genski segment izabran između Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i Vκ2-40.
[0289] Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ili VH3-23. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH1-69 genski segment. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH1-2 genski segment.
[0290] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje humanog imunoglobulinskog varijabilnog domena. Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen lakog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen κ lakog lanca koji sadrži rearanžirani humani Vκ genski segment koji je izabran između Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i Vκ2-40.
[0291] Prema jednom aspektu, varijabilni domen je varijabilni domen teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabrani između VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ili VH3-23. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH1-69 genski segment. Prema specifičnom aspektu, varijabilni domen teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH1-2 genski segment.
[0292] Različiti aspekti i aspekti mogu da se upotrebljavaju zajedno, osim ako eksplicitno nije drugačije navedeno ili kontekst jasno ne dozvoljava njihovu zajedničku upotrebu.
KRATKI OPIS SLIKA NACRTA
[0293]
FIG. 1 prikazuje opšti prikaz, koji nije u razmeri, niza koraka ciljanja i molekularnog inženjeringa koji se koriste za pravljenje ciljajućeg vektora za konstrukciju modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH1-69 genski segment, dvadeset sedam humanih DH i šest humanih JH genskih segmenata na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
FIG. 2 prikazuje opšti prikaz, koji nije u razmeri, niza koraka ciljanja i molekularnog inženjeringa koji se koriste za pravljenje ciljajućeg vektora za konstrukciju modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH1-2 genski segment, dvadeset sedam humanih DH i šest humanih JH genskih segmenata na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
FIG. 3 prikazuje opšti prikaz, koji nije u razmeri, niza koraka ciljanja i molekularnog inženjeringa koji se koriste za pravljenje ciljajućeg vektora za konstrukciju modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH1-69 genski segment, dvadeset sedam humanih DH, šest humanih JH genskih segmenata i ektopični genomski fragment koji kodira mišji ADAM6 na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
FIG. 4 prikazuje opšti prikaz, koji nije u razmeri, niza koraka ciljanja i molekularnog inženjeringa koji se koriste za pravljenje ciljajućeg vektora za konstrukciju modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH1-2 genski segment, dvadeset sedam humanih DH, šest humanih JH genskih segmenata i ektopični genomski fragment koji kodira mišji ADAM6 na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
FIG. 5 prikazuje poravnanje nukleotida drugog egzona za svaki od trinaest navedenih alela za humani VH1-69 gen. Baze napisane malim slovima označavaju razlike u nukleotidima germinativnih linija između alela. Regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) su označeni okvirima oko sekvence. Crtice označavaju veštačke zazore za pravilno poravnanje sekvenci. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 37);
VH1-69*02 (SEQ ID NO: 39); VH1-69*03 (SEQ ID NO: 41); VH1-69*04 (SEQ ID NO:
43); VH1-69*05 (SEQ ID NO: 45); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 47); VH1-69*07 (SEQ
ID NO: 49); VH1-69*08 (SEQ ID NO: 51); VH1-69*09 (SEQ ID NO: 53); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 55); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 57); VH1-69*12 (SEQ ID NO: 59); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 61).
FIG. 6 prikazuje poravnanje proteina zrelog teškog lanca varijabilne genske sekvence za svaki od trinaest navedenih alela za humani VH1-69 gen. Aminokiseline napisane malim slovima označavaju razlike u germinativnoj liniji između alela. Regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) su označeni okvirima oko sekvence. Crtice označavaju veštačke zazore za pravilno poravnanje sekvenci. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 38); VH1-69*02 (SEQ ID NO: 40); VH1-69*03 (SEQ ID NO: 42); VH1-69*04 (SEQ ID NO: 44); VH1-69*05 (SEQ ID NO: 46); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 48); VH1-69*07 (SEQ ID NO: 50); VH1-69*08 (SEQ ID NO: 52); VH1-69*09 (SEQ ID NO: 54); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 56); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 58); VH1-69*12 (SEQ ID NO: 60); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 62).
FIG. 7 prikazuje matricu procenta identičnosti/procenta sličnosti za poravnate proteinske sekvence zrelog varijabilnog gena za svaki od trinaest navedenih alela za humani VH1-69 gen. Procenat identičnosti između VH1-69 alela je označen gore osenčenim okvirima, a procenat sličnosti je označen dole osenčenim okvirima. Skorovi za procenat identičnosti i procenat sličnosti su bili određeni pomoću ClustalW (v1.83) alata za poravnanje uz korišćenje MacVector softvera (MacVector, Inc., Severna Karolina).
FIG. 8 prikazuje poravnanje nukleotida drugog egzona za svaki od pet navedenih alela za humani VH1-2 gen. Baze napisane malim slovima označavaju razlike u nukleotidima germinativnih linija između alela. Regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) su označeni okvirima oko sekvence. Crtice označavaju veštačke zazore za pravilno poravnanje sekvenci. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 63); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 65); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 67); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 69); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 71).
FIG. 9 prikazuje poravnanje proteina varijabilne genske sekvence zrelog teškog lanca za svaki od pet navedenih alela za humani VH1-2 gen. Aminokiseline napisane malim slovima označavaju razlike u germinativnoj liniji između alela. Regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) su označeni okvirima oko sekvence. Crtice označavaju veštačke zazore za pravilno poravnanje sekvenci. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 64); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 66); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 68); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 70); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 72).
FIG. 10 prikazuje matricu procenta identičnosti/procenta sličnosti za poravnate proteinske sekvence zrelog varijabilnog gena za svaki od pet navedenih alela za humani VH1-2 gen. Procenat identičnosti između VH1-2 alela je označen gore osenčenim okvirima, a procenat sličnosti je označen dole osenčenim okvirima. Skorovi za procenat identičnosti i procenat sličnosti su bili određeni pomoću ClustalW (v1.83) alata za poravnanje uz korišćenje MacVector softvera (MacVector, Inc., Severna Karolina).
DETALJNI OPIS
[0294] Ovaj pronalazak nije ograničen na specifične opisane postupke i eksperimentalne uslove, pošto takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe se podrazumeva da je ovde korišćena terminologija namenjena samo za svrhe opisivanja specifičnih aspekata, i da je ne treba smatrati ograničavajućom, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan patentnim zahtevima.
[0295] Ukoliko nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze koji se ovde koriste imaju značenja koja se tim izrazima i frazama pripisuju u odgovarajućoj oblasti, osim ako suprotno nije jasno naglašeno ili je jasno očigledno iz konteksta u kome se taj izraz ili fraza upotrebljavaju. Mada se bilo u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska mogu upotrebiti bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, sada će biti opisani specifični postupci i materijali.
[0296] Fraza "suštinski" ili "u suštini", kada se koristi, se odnosi na količinu genskih segmenata (npr. "u suštini sve" V genske segmente) koja obuhvata i funkcionalne, i nefunkcionalne genske segmente i obuhvata, u različitim primerima izvođenja, npr.
80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, ili 99% ili više od svih genskih segmenata; u različitim primerima izvođenja, "u suštini svi" genski segmenti obuhvata, npr. najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% funkcionalnih (tj. nepseudogenskih) genskih segmenata.
[0297] Izraz "zamena" obuhvata postavljanje DNK sekvence u genom ćelije tako da zameni sekvencu u okviru genoma sa heterologom sekvencom (npr. humanom sekvencom u mišu) na lokusu genomske sekvence. Tako postavljena DNK sekvenca može sadržati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvora DNK upotrebljenog za dobijanje tako postavljene sekvence (npr. promoteri, pojačavači, 5’-ili 3’-netranslirani regioni, podesne rekombinacione signalne sekvence, itd.). Na primer, u različitim aspektima, zamena je zamena endogene sekvence heterologom sekvencom koja rezultuje proizvodnjom genskog proizvoda od DNK sekvence koja je tako postavljena (koja sadrži heterologu sekvencu), ali ne i ekspresijom endogene sekvence; zamena je endogena genomska sekvenca sa DNK sekvencom koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom genomskom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira imunoglobulinski gen ili domen, a DNK fragment kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih gena ili domena). U različitim aspektima, endogeni gen ili njegov fragment se zamenjuje sa odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, homolog, ili je u suštini identičan ili isti po strukturi i/ili funkciji, kao endogeni gen ili njegov fragment koji se zamenjuje.
[0298] Miš kao genetski model je znatno poboljšan tehnologijama transgena i inaktivacije, koje su omogućile proučavanje efekata usmerene prekomerne ekspresije ili delecije specifičnih gena. Uprkos svim svojim prednostima, miš još uvek postavlja genetske prepreke koje rezultuju nesavršenim modelom za humane bolesti i nesavršenom platformom za testiranje ili dobijanje humanih terapeutika. Prvo, mada oko 99% humanih gena ima mišji homolog (Waterston et al. (2002) Initial sequencing and comparative analysis of mouse genome. Nature 420, 520-562.), potencijalni terapeutici često ne reaguju unakrsno, ili neadekvatno reaguju unakrsno, sa mišjim ortolozima ciljanih humanih ciljeva. Da bi se rešio ovaj problem, izabrani ciljani geni se mogu "humanizovati", to jest mišji gen može biti eliminisan i zamenjen odgovarajućom humanom ortologom genskom sekvencom (npr. US 6,586,251, US 6,596,541 i US 7,105,348). Inicijalno, napori da se humanizuju mišji geni strategijom "inaktivacija-plus-transgenska humanizacija" zahtevaju ukrštanje miša koji nosi deleciju (tj. inaktivaciju) endogenog gena sa mišem koji nosi slučajno integrisan humani transgen (vidi, npr. Bril et al. 2006) Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb Haemost 95, 341-347; Homanics et al.2006) Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai et al.2006) A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia. Genomics 88(3):309-15; Pan et al. (2006) Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice. Mol Imunol 43, 1741-1750). Ali ovi napori su bili osujećeni ograničenjima veličine; uobičajene tehnologije inaktivacije nisu bile dovoljne za direktnu zamenu velikih mišjih gena sa njihovim velikim humanim genomskim parnjacima. Neposredan pristup sa direktnom homologom zamenom, prema kome se endogeni mišji gen direktno zamenjuje humanim genom parnjakom na istoj preciznoj genetskoj lokaciji mišjeg gena (tj. na endogenom mišjem lokusu), retko je pokušavan, zbog tehničkih poteškoća. Sve do sada, napori na direktnoj zameni su uključivali složene i teške procedure, što je ograničavalo dužinu genetskog materijala kojim se moglo rukovati i preciznost kojom se njime moglo manipulisati.
[0299] Egzogeno uvedeni humani imunoglobulinski transgeni se rearanžiraju u prekursorskim B ćelijama u miševima (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Ovo otkriće je bilo iskorišćeno za genetski inženjering miševa uz korišćenje inaktivacionog-plus-transgenskog pristupa za izražavanje humanih antitela (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Lokusi mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca i κ lakog lanca su bili inaktivirani u ovim miševima ciljanom delecijom malih, ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, praćenim uvođenjem humanih imunoglobulinskih genskih lokusa kao slučajno integrisanih velikih transgena, kao što je gore definisano, ili minihromozoma (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Takvi miševi predstavljali su važan napredak u genetskom inženjeringu; potpuno humana monoklonska antitela izolovana iz njih dala su obećavajući terapeutski potencijal za lečenje niza humanih bolesti (Gibson et al., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Ali, kao što je gore razmotreno, ove miševe odlikuje kompromitovani razvoj B ćelija i imune deficijencije u poređenju sa miševima divljeg tipa. Takvi problemi potencijalno ograničavaju sposobnost miševa da podnesu snažnu humoralnu reakciju i, sledstveno, da generišu potpuno humana antitela protiv nekih antigena. Deficijencije mogu biti usled neefikasne funkcionalnosti zbog slučajnog uvođenja humanih imunoglobulinskih transgena i rezultujuće neadekvatne ekspresije zbog gubitka uzvodnih i nizvodnih kontrolnih elemenata (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3’ end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3’ IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5’ flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851), neefikasnih interakcija među vrstama između humanih konstantnih domena i mišjih komponenata B-ćelijskog receptorskog signalnog kompleksa na površini ćelije, što može pogoršati procese signalizacije koji su potrebni za normalno sazrevanje, proliferaciju i preživljavanje B ćelija (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762), i neefikasnih interakcija među vrstama između rastvorljivih humanih imunoglobulina i mišjih Fc receptora, što bi moglo smanjiti afinitetnu selekciju (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) i koncentracija imunoglobulinskog seruma (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fcreceptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Ove deficijencije se mogu korigovati pomoću in situ humanizacije samo varijabilnih regiona mišjih
1
imunoglobulinskih lokusa u okviru njihovih prirodnih lokacija na endogenim lokusima teških i lakih lanaca. Ovo bi moglo efektivno rezultovati miševima koji proizvode "reverzno himerična" (tj. humana V: mišja C) antitela koja bi mogla biti sposobna za normalne interakcije i selekciju sa mišjim okruženjem na bazi zadržavanja mišjih konstantnih regiona. Usvajanjem ovog pristupa može biti konstruisana specifična verzija humanizovanog lokusa koja je bazirana na kompleksnosti himeričnog lokusa koji je poželjan. Dalje, takva reverzno himerična antitela se mogu lako reformatirati u potpuno humana antitela za terapeutske svrhe.
[0300] Genetski modifikovane životinje koje sadrže inserciju ili zamenu na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca sa heterologim (npr. od neke druge vrste) imunoglobulinskim sekvencama mogu biti dobijene zajedno sa zamenama na endogenim imunoglobulinskim lokusima lakog lanca ili zajedno sa transgenima za lake lance imunoglobulina (npr. transgenima za himerične lake lance imunoglobulina ili potpuno humane potpuno mišje itd.). Vrste od kojih heterologe imunoglobulinske sekvence teškog lanca potiču mogu jako varirati; kao i imunoglobulinske sekvence lakog lanca upotrebljene u zamenama imunoglobulinske sekvence lakog lanca ili transgenima za lake lance imunoglobulina. Ilustrativne heterologe sekvence imunoglobulinskog teškog lanca obuhvataju humane sekvence.
[0301] Imunoglobulinske sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona, npr. V, D, i/ili J segmenti, prema različitim aspektima se dobijaju od humane ili nehumane životinje. Nehumane životinje koje su podesne za obezbeđivanje V, D, i/ili J segmenata obuhvataju, na primer, košljoribe, hrskavičave ribe, kao što su ajkule i raže, vodozemce, gmizavce, sisare, ptice (npr. piliće). Nehumane životinje obuhvataju, na primer, sisare. Sisari obuhvataju, na primer, nehumane primate, koze, ovce, svinje, pse, goveda (npr. kravu, bivola, bizona), jelene, kamile, feretke i glodare i nehumane primate (npr. šimpanze, orangutane, gorile, marmozete, rezus majmune, pavijane). Podesne nehumane životinje su izabrane iz porodice glodara, koja obuhvata pacove, miševe, i hrčkove. U jednom primeru izvođenja, nehumane životinje su miševi. Kao što je jasno iz konteksta, različite nehumane životinje se mogu koristiti kao izvori genskih segmenata varijabilnih domena ili varijabilnih regiona (npr. ajkule, raže, sisari (npr. kamile, glodari kao što su miševi i pacovi).
[0302] U skladu sa kontekstom, nehumane životinje se takođe upotrebljavaju kao izvori sekvenci konstantnog regiona koje treba da budu korišćene zajedno sa varijabilnim sekvencama ili segmentima, na primer, glodarske konstantne sekvence
2
se mogu koristiti u transgenima operativno povezane sa humanim ili nehumanim varijabilnim sekvencama (npr. humane ili nehumane primatske varijabilne sekvence operativno povezane, npr. sa konstantnim sekvencama glodara, npr. miša ili pacova ili hrčka). Shodno tome, u različitim primerima izvođenja, humani V, D, i/ili J segmenti su operativno povezani sa glodarskim (npr. mišjim ili pacovskim ili hrčkovim) genskim sekvencama konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, humani V, D, i/ili J segmenti (ili jedan ili više rearanžiranih VDJ ili VJ gena) su operativno povezani ili fuzionisani sa mišjom, pacovskom ili hrčkovom genskom sekvencom konstantnog regiona, npr. u transgenu integrisanom na lokusu koji nije endogeni imunoglobulinski lokus.
[0303] Prema specifičnom aspektu, opisan je miš koji sadrži zamenu VH, DH, i JH genskih segmenata na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca sa samo jednim humanim VH, jednim ili više DH, i jednim ili više JH genskih segmenata, pri čemu su samo jedan humani VH, jedan ili više DH, i jedan ili više JH genskih segmenata operativno povezani sa endogenim genom imunoglobulinskog teškog lanaca; pri čemu miš sadrži transgen na različitom lokusu od endogenog imunoglobulinskog lokusa, pri čemu transgen sadrži nerearanžirani ili rearanžirani humani VL i humani JL genski segment operativno povezane sa mišjim ili pacovskim ili humanim konstantnim regionom. Prema različitim aspektima, samo jedan humani VH genski segment je polimorfni genski segment. Prema jednom aspektu, samo jedan humani VH genski segment je humani VH1-69 genski segment ili humani VH1-2 genski segment.
[0304] Opisan je postupak za in situ genetsku zamenu varijabilnog genskog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca mišje germinativne linije sa ograničenim lokusom imunoglobulinskog teškog lanca humane germinativne linije i zamena varijabilnih genskih lokusa imunoglobulinskog κ lakog lanca mišje germinativne linije sa lokusima imunoglobulinskog κ lakog lanca humane germinativne linije, uz zadržavanje sposobnosti miševa da generišu potomstvo. Specifično, opisana je precizna zamena šest megabaza mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih lokusa teškog lanca i κ lakog lanca sa humanim sekvencama imunoglobulinskog teškog lanca i κ lakog lanca, pri čemu mišji konstantni regioni ostaju intaktni. Kao rezultat ovoga, stvoreni su miševi koji imaju preciznu zamenu svog celog imunoglobulinskog varijabilnog repertoara germinativne linije sa imunoglobulinskim varijabilnim sekvencama humane germinativne linije, dok su zadržani mišji konstantni regioni. Humani varijabilni regioni su povezani sa mišjim konstantnim regionima da bi se formirali himerični humani-mišji imunoglobulinski lokusi koji se rearanžiraju i izražavaju na fiziološki podesnim nivoima. Izražena antitela su "reverzne himere" tj. ona sadrže sekvence humanog varijabilnog regiona i sekvence mišjeg konstantnog regiona.
[0305] Ovde opisane genetski modifikovane miševe odlikuje potpuno funkcionalni humoralni imuni sistem i oni obezbeđuju izdašan izvor prirodnih afinitetno sazrelih sekvenci humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona za dobijanje farmaceutski prihvatljivih antitela i drugih antigen-vezujućih proteina koji su efektivni u borbi protiv patogenih antigena, npr. virusnih antigena.
[0306] Genetski inženjering humanih imunoglobulinskih sekvenci u genomu miša, čak i na preciznim lokacijama, npr. na endogenim mišjim imunoglobulinskim lokusima, može predstavljati izvesne izazove zbog divergentne evolucije imunoglobulinskih lokusa između miša i čoveka. Na primer, intergenske sekvence koje se nalaze u okviru imunoglobulinskih lokusa nisu identične kod miševa i ljudi i, pod izvesnim okolnostima, ne moraju biti funkcionalno ekvivalentne. Razlike između miševa i ljudi u pogledu njihovih imunoglobulinskih lokusa još mogu rezultovati abnormalnostima kod humanizovanih miševa, a naročito kada se humanizuju ili se manipuliše izvesnim delovima endogenih imunoglobulinskih mišjih lokusa teškog lanca. Neke modifikacije na mišjim imunoglobulinskim lokusima teškog lanca su štetne. Štetne modifikacije mogu obuhvatati, na primer, gubitak sposobnosti modifikovanih miševa da se pare i proizvode potomstvo. U različitim primerima izvođenja, genetski inženjering humanih imunoglobulinskih sekvenci u genomu miša obuhvata postupke koji održavaju endogene sekvence za koje je štetno da budu odsutne u modifikovanim sojevima miševa. Primeri štetnih efekata mogu obuhvatati nesposobnost razmnožavanja modifikovanih sojeva, gubitak funkcije bitnih gena, nesposobnost izražavanja polipeptida, itd. Takvi štetni efekti mogu biti direktno ili indirektno povezani sa modifikacijom genetskim inženjeringom u genomu miša.
[0307] Uprkos humoralnoj imunoj funkciji skoro divljeg tipa koja je uočena kod miševa sa humanizovanim imunoglobulinskim lokusima, postoje drugi izazovi koji se pojavljuju kada se koristi direktna zamena imunoglobulinskih sekvenci koje se ne pojavljuju kod nekih pristupa koji koriste slučajno integrisane transgene. Razlike u genetskoj kompoziciji imunoglobulinskih lokusa između miševa i ljudi su dovele do otkrića sekvenci koje su korisne za razmnožavanje miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim genskim segmentima. Konkretno, optimalno je da mišji ADAM geni
4
locirani u okviru endogenog imunoglobulinskog lokusa budu prisutni kod miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima, zbog njihove uloge u plodnosti.
[0308] Precizno, bila je izvršena in situ zamena šest megabaza imunoglobulinskih lokusa varijabilnih regiona mišjeg teškog lanca (VH-DH-JH) sa ograničenim lokusom humanog imunoglobulinskog teškog lanca, dok su susedne mišje sekvence ostavljene intaktnim i funkcionalnim u okviru hibridnih lokusa, uključujući sve gene mišjeg konstantnog lanca i transkripcione kontrolne regione lokusa (FIG. 1 i FIG. 8). Dalji koraci genetskog inženjeringa su bili izvedeni da bi se zadržale mišje sekvence koje obezbeđuju mišu sposobnost da se pari i da proizvodi potomstvo na način koji je uporediv sa mišem divljeg tipa (FIG.9 i FIG.10). Specifično, samo jedan humani VH, 27 DH, i šest JH genskih segmenata i mišji ADAM6 geni su bili uvedeni preko himeričnih BAC ciljajućih vektora u mišje ES ćelije korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (vidi, npr. US pat. br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Highthroughput engineering of mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).
Miševi sa ograničenim varijabilnim genskim segmentima imunoglobulinskog teškog lanca
[0309] Opisane su nehumane životinje koje sadrže imunoglobulinske lokuse koji sadrže ograničeni broj VH gena, i jedan ili više D gena i jedan ili više J gena, kao i postupci za njihovo dobijanje i primenu. Kada se imunizuju sa antigenom od interesa, nehumane životinje generišu populacije B ćelija sa varijabilnim regionima antitela koji potiču samo od ograničenog, prethodno izabranog VH gena ili seta VH gena (npr. prethodno izabranog VH gena i njegovih varijanti). Prema različitim aspektima, opisane su nehumane životinje koje generišu populacije B ćelija koje izražavaju varijabilne domene humanog antitela koji su varijabilni domeni humanog teškog lanca, zajedno sa srodnim varijabilnim domenima humanog lakog lanca. Prema različitim aspektima, nehumane životinje rearanžiraju varijabilne genske segmente humanog teškog lanca i varijabilne genske segmente humanog lakog lanca iz modifikovanih endogenih mišjih imunoglobulinskih lokusa koji sadrže zamenu ili inserciju sekvenci nehumanog nerearanžiranog varijabilnog regiona sa sekvencama humanog nerearanžiranog varijabilnog regiona.
[0310] Rani rad na organizaciji, strukturi i funkciji imunoglobulinskih gena je bio izvršen delimično na miševima sa onesposobljenim endogenim lokusima i podvrgnutim genetskom inženjeringu da bi imali transgenske lokuse (slučajno postavljene) sa delimično humanim imunoglobulinskim genima, npr. parcijalnim repertoarom gena humanog teškog lanca povezanih sa humanim konstantnim genom, slučajno umetnutim u genom, u prisustvu ili odsustvu transgena humanog lakog lanca. Mada su ovi miševi bili nešto manje od optimalnog za dobijanje korisnih visoko-afinitetnih antitela, oni su olakšali izvesne funkcionalne analize imunoglobulinskih lokusa. Neki od ovih miševa su imali nekoiiko, kao što je dva ili tri, ili čak samo jedan varijabilni gen teškog lanca.
[0311] Miševi koji izražavaju potpuno humane imunoglobulinske teške lance koji potiču od samo jednog humanog VH5-51 gena i 10 humanih D H gena i šest humanih JH gena, sa humanim μ i γ1 konstantnim genima, na slučajno umetnutom transgenu (i onesposobljenim endogenim imunoglobulinskim lokusima) su bili opisani (Xu i Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37-45). Potpuno humani imunoglobulinski teški lanci ovih miševa su pretežno izraženi sa jednim od samo dva potpuno mišja λ laka lanca koja potiču od endogenog lokusa mišjeg λ lakog lanca (Vλ1-Jλ1 ili Vλ2-Jλ2 samo), i ne mogu izražavati κ laki lanac (miševi su Igκ<-/->). Ove miševe odlikuje jako abnormalna disfunkcija u razvoju B ćelija i ekspresiji antitela. Brojevi B ćelija su prema navodima 5-10% od onog kod divljeg tipa, IgM nivoi su od 5-10% od onog kod divljeg tipa, i IgG1 nivoi su samo od 0.1-1% od onog kod divljeg tipa. Uočeni IgM repertoar otkriva veoma ograničeni spojni diverzitet. Potpuno humane teške lance odlikuje uglavnom identična dužina CDR3 među antigenima, isto korišćenje JH (JH2) među antigenima, i inicijalni spojni Q ostatak, što odražava izvesni nedostatak CDR3 diverziteta. Skoro svi potpuno mišji λ laki lanci su imali W96L zamenu u Jλ1 kao inicijalnom spojnom ostatku. Navedeno je da miševi nisu bili sposobni da generišu antitela protiv bakterijskih polisaharida. Pošto se humani varijabilni domeni spajaju sa mišjim lakim lancima, primenljivost humanih varijabilnih regiona je veoma ograničena.
[0312] Opisani su i drugi miševi koji imaju samo jedan humani VH3-23 gen, humane DH i JH gene, i gene mišjeg lakog lanca, ali koje odlikuje ograničen diverzitet (i shodno tome ograničena primenljivost) delimično zbog potencijala za pogrešno uparavanje između humanih VH i mišjih VL domena (vidi, npr. Mageed et al., 2001, Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Clin. Exp. Immunol.123:1-5). Slično tome, miševi koji nose dva VH gena (3-23 i 6-1) zajedno sa humanim DH i JH genima u transgenu koji sadrži humani μ konstantni gen (Bruggemann et al., 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100kb of the human IgH locus, Eur. J. Immmunol. 21:1323-1326) i izražavaju ih u humanim IgM lancima sa mišjim lakim lancima mogu ispoljavati repertoar koji je ograničen pogrešnim uparivanjem (Mackworth-Young et al., 2003, The role of antigene in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420-425).
[0313] Takođe su bili opisani drugi transgenski miševi koji izražavaju VH-ograničene potpuno humane teške lance od humanog transgena koji je slučajno umetnut u genom, sa ograničenim humanim λ repertoarom izraženim iz potpuno humanog slučajno umetnutog transgena (vidi, npr. Taylor et al., 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res.20(23):6287-6295; Wagner et al., 1994, Antibodies generated from human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8):1389-1393). Međutim, za transgenske miševe koji izražavaju potpuno humana antitela iz transgena slučajno integrisanih u mišji genom, i koji sadrže oštećene endogene lokuse, je poznato da izražavaju suštinske razlike u imunoj reakciji u poređenju sa miševima divljeg tipa, što utiče na diverzitet varijabilnih domena antitela koji se mogu dobiti od takvih miševa.
[0314] Korisne nehumane životinje koje generišu raznovrsnu populaciju B ćelija koja izražava varijabilne domene humanog antitela iz ograničenog VH genskog repertoara i jedan ili više D gena i jedan ili više J gena će biti sposobni za generisanje, a prvenstveno prema nekim aspektima, repertoara rearanžiranih gena varijabilnog regiona koji će biti dovoljno raznovrsni. Prema različitim aspektima, diverzitet obuhvata spojni diverzitet, somatsku hipermutaciju i polimorfni diverzitet u VH genskoj sekvenci (za aspekte gde su VH geni prisutni u polimorfnim oblicima). Kombinatorni diverzitet se pojavljuje pri uparivanju VH gena sa jednim od mnoštva srodnih varijabilnih domena humanog lakog lanca (koji, prema različitim aspektima, sadrže spojni diverzitet i/ili somatske hipermutacije).
[0315] Nehumane životinje koje sadrže ograničeni humani VH genski repertoar i kompletni ili u suštini kompletni humani VL genski repertoar će prema različitim aspektima generisati populacije B ćelija koje odražavaju različite izvore diverziteta, kao što je spojni diverzitet (npr. VDJ, VJ spajanje, P adicije, N adicije), kombinatorni diverzitet (npr. srodni VH-ograničeni humani teški, humani laki), i somatske hipermutacije. Prema aspektima koji sadrže ograničenje VH repertoara na jedan humani VH gen, jedan humani VH gen može biti prisutan u dve ili više varijanti. Prema različitim aspektima, prisustvo dva ili više polimorfnih oblika VH gena će obogatiti diverzitet varijabilnih domena populacije B ćelija.
[0316] Varijacije u sekvencama genskih segmenata germinativne linije (npr. V genima) će doprineti diverzitetu reakcije antitela kod ljudi. Relativni doprinos diverzitetu zbog razlika u V genskim sekvencama varira među V genima. Stepen polimorfizma varira u okviru familija gena i odražava se mnoštvom haplotipova (pružanja sekvenci sa konasleđenim polimorfizmima) koji su sposobni za dalje generisanje diverziteta, kao što je uočeno kod razlika u VH haplotipu između srodnih i nesrodnih pojedinaca u ljudskoj populaciji (vidi, npr. Souroujon et al., 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VHIII Gene Family, J. Immunol. 143(2):706-711). Neki su sugerisani, na bazi podataka o ovim posebno polimorfnim humanim VH genskim familijama, da je diverzitet haplotipova u germinativnoj liniji glavni faktor koji doprinosi heterogenosti VH gena u ljudskoj populaciji, što se odražava velikim diverzitetom VH gena različitih germinativnih linija u ljudskoj populaciji (vidi, Sasso et al., 1990, Prevalence and Polymorphism of Human VH3 Genes, J. Immunol.145(8):2751-2757).
[0317] Mada ljudsku populaciju odlikuje veliki diverzitet haplotipova u pogledu VH genskog repertoara zbog široko rasprostranjenog polimorfizma, izvesni polimorfizmi se odražavaju u preovlađujućim (tj. konzerviranim) alelima uočenim u ljudskoj populaciji (Sasso et al., 1990). VH polimorfizam se može opisati u dva glavna oblika. Prvi je varijacija koja se pojavljuje usled alelske varijacije povezane sa razlikama između nukleotidnih sekvenci između alela istog genskog segmenta. Drugi se pojavljuje usled brojnih duplikacija, insercija, i/ili delecija koje su se pojavile na lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. Ovo je rezultovalo jedinstvenom situacijom u kojoj se VH geni koji potiču od duplikacije identičnih gena razlikuju od svojih odgovarajućih alela po jednoj ili više nukleotidnih supstitucija. Ovo takođe direktno utiče na broj kopija VH gena na lokusu teškog lanca.
[0318] Polimorfni aleli varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca (VH geni) su pretežno rezultat insercije /delecije genskih segmenata i samo jedne od nukleotidnih razlika u okviru kodirajućih regiona, od kojih oba imaju potencijal da imaju funkcionalne posledice na imunoglobulinski molekul. Tabela 1 prikazuje funkcionalne VH gene navedene po familijama humanih VH gena i broju identifikovanih alela za svaki VH gen u lokusu humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Postoje neki nalazi koji sugerišu da su polimorfni VH geni uključeni u podložnost izvesnim bolestima kao što je, na primer, reumatoidni artritis, dok je u drugim slučajevima veza između VH i bolesti manje jasna. Ova nejasnoća se pripisuje broju kopija i prisustvu različitih alela u različitim ljudskim populacijama. U stvari, nekoliko humanih VH gena odlikuje varijacija broja kopija (npr. VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, i VH3-23). Prema različitim aspektima, ovde opisani humanizovani miševi sa ograničenim VH repertoarima sadrže više polimorfnih varijanti pojedinačnih članova VH familije (npr. dve ili više polimorfnih varijanti VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ili VH3-23, koje zamenjuju sve ili u suštini sve funkcionalne mišje VH segmente na endogenom mišjem lokusu). Prema specifičnom aspektu, navedene su dve ili više polimorfnih varijanti ovde opisanih miševa i one obuhvataju broj koji je naveden za odgovarajućeg člana VH familije u Tabeli 1 (npr. za VH1-69, 13 varijanti; za VH1-2, pet varijanti; itd.).
[0319] Uobičajeno uočene varijante specifičnih humanih VH gena su poznate u odgovarajućoj oblasti. Na primer, jedan od najkompleksnijih polimorfizama u VH lokusu pripada VH1-69 genu. Za humani VH1-69 gen je navedeno 13 alela (Sasso et al., 1993, A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alleles, Journal of Clinical Investigation 91:2358-2367; Sasso et al., 1996, Expression of the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080) i on postoji u najmanje tri haplotipa koji nose duplikacije VH1-69 gena, što rezultuje sa više kopija VH gena na datom lokusu. Ovi polimorfni aleli sadrže razlike u regionima koji određuju komplementarnost (CDRs), a koje mogu dramatično uticati na specifičnost za antigen. Tabela 2 prikazuje navedene alele za humane VH1-69 i humane VH1-2 gene i SEQ ID NOs za sekvence DNK i proteina varijabilnih regiona zrelog teškog lanca.
[0320] Reprezentativne sekvence genomskog DNK i proteina cele dužine VH1-69 gena su navedene u SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, respektivno. FIG. 5 i FIG. 6 prikazuju poravnanja DNK i proteina za trinaest opisanih VH1-69 alela, respektivno. Reprezentativne sekvence DNK i proteina VH1-2 gena su navedene u SEQ ID NO: 63 i SEQ ID NO: 64, respektivno. FIG.8 i FIG.9 prikazuju poravnanja DNK i proteina za pet opisanih VH1-2 alela, respektivno. FIG.7 i FIG.10 prikazuju matricu procentualne identičnosti/sličnosti za poravnate sekvence proteina koje odgovaraju za trinaest opisanih humanih VH1-69 i pet opisanih humanih VH1-2 alela, respektivno. Prema različitim aspektima, ovde opisani modifikovani lokus sadrži VH gen izabran iz Tabele 1, koji je prisutan u broju kopija od dve ili više, pri čemu broj kopija obuhvata do i sadrži broj alela prikazan u Tabeli 1. Prema jednom aspektu, ovde opisani modifikovani lokus sadrži VH1-69 ili VH1-2 gen izabrani iz Tabele 2, koji je prisutan u broju kopija od dve ili više, pri čemu broj kopija obuhvata do i sadrži broj alela prikazan u Tabeli 1.
1
2
Antigen-zavisno korišćenje varijabilnih gena teškog lanca
[0321] Antigen-zavisno preferencijalno korišćenje VH gena se može iskoristiti u razvoju humanih terapeutika koji ciljaju klinički značajne antigene. Sposobnost da se generiše repertoar varijabilnih domena antitela korišćenjem specifičnog VH gena može obezbediti značajnu prednost u istraživanju visoko-afinitetnih varijabilnih domena antitela za primenu u humanim terapeuticima. Studije u vezi korišćenja naivnih mišjih i humanih VH gena u varijabilnim domenima antitela otkrivaju da većina varijabilnih domena teškog lanca ne potiče od nekog specifičnog samo jednog ili dominantno korišćenog VH gena. Sa druge strane, studije reakcije antitela na izvesne antigene otkrivaju da u izvesnim slučajevima specifičnu reakciju antitela odlikuje preovlađujuće korišćenje specifičnog VH gena u repertoaru B ćelija posle imunizacije.
[0322] Mada je humani VH repertoar veoma raznovrstan, prema nekim procenama očekivana frekvencija korišćenja bilo kog datog VH gena, pretpostavljajući slučajnu selekciju VH gena, je oko 2% (Brezinschek et al., 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunol. 155:190-202). Ali postoji sklonost prema korišćenju VH u perifernim B ćelijama kod ljudi. U jednoj studiji, mnoštvo funkcionalnih V gena je pratilo obrazac VH3 > VH4 > VH1 > VH2 > VH5 > VH6 (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol.45:62-73). Jedna rana studija je procenila da je frekvencija korišćenja VH3 familije bila oko 0.65, dok je frekvencija korišćenja VH1 familije bila oko 0.15; ova i druga zapažanja sugerišu da se kompleksnost germinativnih linija humanog VH repertoara nije precizno odrazila u odeljku perifernih B ćelija kod ljudi koji su imali normalni VH repertoar germinativnih linija, u situaciji koja je slična onome što je bilo uočeno kod miševa--tj. ekspresija VH gena je nestohastička (Zouali i These, 1991, Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization, J. Immunol. 146(8):2855-2864). Prema jednom izveštaju, korišćenje VH gena kod ljudi, od najvećeg do najmanjeg, je VH3 > VH4 > VH1 > VH5 > VH2 > VH6; rearanžiranja u perifernim B ćelijama otkrivaju da je korišćenje VH3 familije veće nego što je očekivano na osnovu relativnog broja gena VH3 germinativne linije (Brezinschek et al., 1995). Prema sledećem izveštaju, korišćenje VH kod ljudi prati sledeći obrazac VH3 > VH5 > VH2 > VH1 > VH4 > VH6, što je bazirano na analizi perifernih malih imunokompetentnih B ćelija aktiviranih mitogenom vinobojkom (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol.45:62-73). Jedan izveštaj tvrdi da su među najčešće korišćenim članovima VH3 familije 3-23, 3-30 i 3-54 (Brezinschek et al., 1995). U VH4 familiji, članovi 4-59 i 4-4b su pronađeni relativno češće (Id.), kao i 4-39 i 4-34 (Brezinscheck et al., 1997, Analysis of the Human VH Gene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488-2501). Drugi postuliraju da je aktivirani repertoar teškog lanca sklon većoj ekspresiji VH5 i manjoj ekspresiji VH3 (Van Dijk-Hard i Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107:136-144). Druge studije tvrde da je najčešće korišćeni VH gen u humanom repertoaru kod odraslih VH4-59, koji je praćen sa VH3-23 i VH3-48 (Arnaout et al., 2001, High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE
4
6(8):108). Mada su studije korišćenja bazirane na relativno malom broju uzoraka i zato ih odlikuje velika varijansa, uzete zajedno, ove studije sugerišu da ekspresija V gena nije čisto stohastička. Zaista, studije sa specifičnim antigenima su ustanovile da – u izvesnim slučajevima – postoje čvrsti dokazi protiv izvesnih korišćenja i u korist drugih.
[0323] Tokom vremena je postalo očigledno da je uočeni repertoar varijabilnih domena humanog teškog lanca generisan kao reakcija na izvesne antigene veoma ograničen. Neki antigeni su povezani skoro isključivo sa neutralizujućim antitelima koja imaju samo izvesne specifične VH gene, u smislu da efektivna neutralizujuća antitela potiču u suštini od samo od jednog VH gena. Tako je u slučaju više klinički važnih humanih patogena.
[0324] Teški lanci koji potiču od VH1-69 su bili uočeni u mnoštvu repertoara antigenspecifičnih antitela od terapeutskog značaja. Na primer, VH1-69 je često bio uočen u transkriptima teškog lanca IgE repertoara limfocita iz periferne krvi kod mlađe dece sa atopičnom bolesti (Bando et al., 2004, Characterization of VHε gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous VH1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99-106). Teški lanci koji potiču od VH1-69 sa visokim stepenom somatske hipermutacije se takođe pojavljuju u limfomima B ćelija (Perez et al., 2009, Primary cutaneous B-cells lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments, British Journal of Dermatology 162:611-618), dok su neki teški lanci koji potiču od VH1-69 sa u suštini sekvencama germinativne linije (tj. sa malo do bez ikakve somatske hipermutacije) bili uočeni među autoantitelima kod pacijenata sa krvnim poremećajima (Pos et al., 2008, VH1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421-428).
[0325] Dalje, otkriveno je da neutralizujuća antitela protiv virusnih antigena kao što su HIV, influenca i hepatitis C (HCV) koriste sekvence koje potiču od germinativne linije i/ili somatski mutirane, koje potiču od VH1-69 (Miklos et al., 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of V1-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878-3884; Kunert et al., 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG i IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I and neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20(7):755-762; Chan et al., 2001, VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4):1023-1026; Carbonari et al., 2005, Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174:6532-6539; Wang i Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):233-234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):265-273; Marasca et al., 2001, Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 i VH4-34 Segments in Hepatitis C Virus-Positive i Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1):253-261).
[0326] Sklonost ka korišćenju VH je takođe uočena kod humoralne imune reakcije na Haemophilus influenzae tip b (Hib PS) kod ljudi. Studije sugerišu da VHIII familija (VHIIIb subfamilija, a naročito, VH9.1) isključivo karakteriše humanu humoralnu reakciju na Hib PS, sa različitim D i J genima (Adderson et al., 1991, Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5):1667-1674; Adderson et al., 1993, Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest.91:2734-2743). Humane JH gene takođe odlikuje sklonost ka korišćenju; JH4 i JH6 su uočeni sa 38-41% u perifernim B ćelijama kod ljudi (Brezinschek et al., 1995).
[0327] VH korišćenje kod ljudi inficiranih sa HIV-1 je primarno u odnosu na korišćenje VH3 i u korist VH1 i VH4 genskih familija (Wisnewski et al., 1996, Human Antibody Variable Region Gene Usage in HIV-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviology 11(1):31-38). Međutim, kDNK analiza koštane srži pogođenih pacijenata je otkrila da je značajno korišćenje VH3, koje bilo izraženo u repertoaru funkcionalnih B ćelija, gde Fabs odražavaju korišćenje VH3, ispoljilo efektivnost kod in vitro neutralizacije HIV-1 (Id.). Moglo bi se pretpostaviti da je humoralna imuna reakcija na HIV-1 infekciju eventualno oslabljena usled restrikcije VH; shodno tome, ovde opisane modifikovane nehumane životinje (koje ne mogu biti inficirane sa HIV-1) bi mogle biti korisne za generisanje domena neutralizujućih antitela koji potiču od specifičnih VH gena prisutnih u ovde opisanim genetski modifikovanim životinjama, ali koje potiču od drugačijih VH gena od onih koji su uočeni u ograničenom repertoaru pogođenih ljudi.
[0328] Shodno tome, sposobnost da generišu varijabilne domene visoko-afinitetnog humanog antitela u VH-ograničenim miševima, npr. (ograničenim, npr. na član VH3 familije i njegov polimorf, odnosno polimorfe) imunizovanim sa HIV-1 bi mogla obezbediti bogat izvor za kreiranje efektivnih HIV-1-neutralizujućih humanih terapeutika pažljivom analizom ograničenog (npr. ograničenog na član VH3 familije ili njegovu varijantu, odnosno varijante) repertoara takvog imunizovanog miša.
[0329] Ograničenje reakcije humanih antitela na izvesne patogene može smanjiti verovatnoću dobijanja varijabilnih regiona antitela od pogođenih ljudi koji mogu poslužiti kao odskočna daska za kreiranje visoko-afinitetnih neutralizujućih antitela protiv patogena. Na primer, humana imuna reakcija na HIV-1 infekciju je klonski ograničena doživotna HIV-1 infekcija i progresija u AIDS-u (Muller et al., 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol. 38:327-334; Wisnewski et al., 1996). Dalje, VH geni generalno nisu prisutni u svim polimorfnim oblicima kod pojedinaca; izvesni pojedinci u izvesnim populacijama poseduju jednu varijantu, dok pojedinci u drugim populacijama poseduju drugačiju varijantu. Shodno tome, raspoloživost biološkog sistema koji je ograničen na samo jedan VH gen i njegove varijante će prema različitim aspektima obezbediti do sada neiskorišćeni izvor raznovrsnosti varijabilnih regiona za generisanje antitela (npr. humane teške i lake srodne domene) na bazi ograničenog VH gena.
[0330] Genetski modifikovani miševi koji izražavaju varijabilne regione humanog teškog lanca sa ograničenim korišćenjem VH genskog segmenta su korisni za generisanje relativno velikog repertoara spojno raznovrsnih, kombinatorno raznovrsnih, i somatski mutiranih visoko-afinitetnih varijabilnih regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca od inače ograničenog repertoara. Ograničeni repertoar, u ovom slučaju se odnosi na unapred određeno ograničenje u genima germinativne linije koje rezultuje mišem koji nije sposoban da formira rearanžirani gen teškog lanca koji potiče od bilo kog V gena koji je drugačiji od prethodno izabranog V gena. Prema aspektima koji koriste prethodno izabrani V gen, ali ne i prethodno izabrani D i/ili J gen, repertoar je ograničen u pogledu identičnosti V gena, ali ne i D i/ili J gena. Identičnost prethodno izabranog V gena (i bilo kog od prethodno izabranih D i/ili J gena) nije ograničen na bilo koji specifični V gen.
[0331] Kreiranje miša takvog da rearanžira samo jedan VH gen (koji je prisutan kao samo jedan segment ili set varijanti) sa mnoštvom humanih D i J genskih segmenata (npr. DH i JH segmenata) obezbeđuje in vivo spojnu diverzitetnu/somatsku hipermutacionu permutacionu mašinu koja se može koristiti za iteraciju mutacija koje rezultuju rearanžiranim sekvencama varijabilnog regiona teškog lanca (npr. V/D/J ili V/J, kao što može biti slučaj). U takvom mišu, proces klonske selekcije funkcioniše tako da vrši selekciju podesnih varijabilnih regiona koji vezuju antigen od interesa, a koji su bazirani na samo jednom prethodno izabranom VH genu (ili njegovim varijantama). Pošto su komponente klonske selekcije miša posvećene selekciji koja je bazirana na samo jednom prethodno izabranom VH genskom segmentu, pozadinski šum je uglavnom eliminisan. Uz razumnu selekciju VH genskog segmenta, relativno veći broj klonski selekcionisanih, antigen-specifičnih antitela može biti podvrgnut skriningu u toku kraćeg vremenskog perioda nego kod miša koji ima veliku raznovrsnost V segmenata.
[0332] Prethodna selekcija i ograničenje miša na samo jedan V segment obezbeđuje sistem za permutaciju V/D/J spajanja na stepen koji je prema različitim aspektima veći od onoga koji je uočen kod miševa koji inače imaju do 40 ili više V segmenata za rekombinaciju sa D i J regionima. Uklanjanje drugih V segmenata oslobađa lokus da bi se formiralo više V/D/J kombinacija za prethodno izabrani V segment nego što je inače uočeno. Povećani broj transkripata koji nastaje usled rekombinacije prethodno izabranog V sa jednim od mnoštva D i jednog od mnoštva J segmenata će dovesti te transkripte u sistem za klonsku selekciju u obliku pre-B ćelija, i shodno tome, sistem za klonsku selekciju je usmeren na B ćelije koje kruže i koje izražavaju prethodno izabrani V region. Na ovaj način, više jedinstvenih V regiona koji potiču od prethodno izabranog V segmenta može biti podvrgnuto skriningu od strane organizma, što bi inače bilo moguće u toku datog vremenskog perioda.
[0333] Prema različitim aspektima, opisani su miševi koji povećavaju spojnu raznovrsnost V/D rekombinacija za prethodno izabrani V region, jer će sve ili u suštini sve rekombinacije varijabilnog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca biti prethodno izabrani V segment i D i J segmenti koji su smešteni u takvim miševima. Zato ovi miševi obezbeđuju postupak za generisanje raznovrsnih CDR3 segmenata koji koriste osnovni ili ograničeni repertoar VH gena.
Genomska lokacija i funkcija mišjeg ADAM6
[0334] Mužjake miševa kojima nedostaje sposobnost da izraze bilo koji funkcionalni ADAM6 protein kao iznenađujuće odlikuje defekt u sposobnosti miševa da se pare i da generišu potomstvo. Miševima nedostaje sposobnost da izraze funkcionalni ADAM6 protein zahvaljujući zameni svih ili u suštini svih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona sa genskim segmentima humanog varijabilnog regiona. Gubitak ADAM6 funkcije nastaje zbog toga što je ADAM6 lokus lociran u okviru regiona endogenog genskog lokusa varijabilnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, bližeg 3’ kraju lokusa VH genskog segmenta koji je uzvodno od DH genskih segmenata. Da bi se ukrštali miševi koji su homozigotni za zamenu svih ili u suštini svih endogenih varijabilnih sekvenci mišjeg teškog lanca sa sekvencom ograničenog humanog teškog lanca, generalno je nepodesan pristup da se dobiju mužjaci i ženke koji su svi homozigotni za sekvencu ograničenog humanog teškog lanca i da se čeka produktivno parenje. Uspešna legla su malobrojna po učestanosti i veličini. Umesto toga, mužjaci koji su heterozigotni za sekvencu ograničenog humanog teškog lanca su korišćeni za parenje sa ženkama koje su homozigotne za zamenu da bi se generisalo potomstvo koje je heterozigotno za sekvencu ograničenog humanog teškog lanca, a onda se od njega odgaja homozigotni miš. Pronalazači su utvrdili da je verovatno uzrok gubitka plodnosti kod mužjaka miševa odsustvo funkcionalnog ADAM6 proteina kod homozigotnih mužjaka miševa.
[0335] Prema različitim aspektima, mužjake miševa koji sadrže oštećeni (tj. nefunkcionalni ili marginalno funkcionalni) ADAM6 gene odlikuje smanjenje ili eliminacija plodnosti. Pošto je kod miševa (i drugih glodara) ADAM6 gen lociran u lokusu imunoglobulinskog teškog lanca, pronalazači su utvrdili da se u cilju da se miševi razmnože, ili kreira i održi soj miševa koji sadrže humanizovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, koriste različite šeme modifikovanog ukrštanja ili odgoja. Niska plodnost ili neplodnost mužjaka miševa koji su homozigotni za varijabilni genski lokus humanizovanog imunoglobulinskog teškog lanca čini održavanje takve modifikacije u soju miševa teškim. Prema različitim aspektima, održavanje soja sadrži izbegavanje problema neplodnosti koji odlikuju mužjake miševa koji su homozigotni za humanizovani lokus teškog lanca.
[0336] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za održavanje ovde opisanog soja miševa. Soj miševa ne mora da sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu, i prema različitim aspektima soj miševa je homozigotan ili heterozigotan za inaktivaciju (npr. funkcionalnu inaktivaciju) ADAM6.
[0337] Soj miševa sadrži modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koja rezultuje smanjenjem ili gubitkom plodnosti kod mužjaka miša. Prema jednom aspektu, modifikacija sadrži deleciju regulatornog regiona i/ili kodirajućeg regiona ADAM6 gena. Prema specifičnom aspektu, modifikacija sadrži modifikaciju endogenog ADAM6 gena (regulatornog i/ili kodirajućeg regiona) koja smanjuje ili eliminiše plodnost mužjaka miša koji sadrži modifikaciju; prema specifičnom aspektu, modifikacija smanjuje ili eliminiše plodnost mužjaka miša koji je homozigotan za modifikaciju.
[0338] Prema jednom aspektu, soj miševa je homozigotan ili heterozigotan za inaktivaciju (npr. funkcionalnu inaktivaciju) ili deleciju ADAM6 gena.
[0339] Prema jednom aspektu, soj miševa se održava izolacijom ćelije iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju, i korišćenjem ćelije donora u embrionu domaćina, i usađivanjem embriona domaćina i ćelije donora u surogat majku, i dobijanje od surogat majke potomstva koje sadrži genetsku modifikaciju. Prema jednom aspektu, ćelija donora je ES ćelija. Prema jednom aspektu, ćelija donora je pluripotentna ćelija, npr. indukovana pluripotentna ćelija.
[0340] Prema jednom aspektu, soj miševa se održava izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja sadrži modifikaciju, i uvođenje sekvence nukleinske kiseline u nukleus domaćina, i usađivanje ćelije koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline i nukleus domaćina u podesnu životinju. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline se uvodi u oocit embriona domaćina.
[0341] Prema jednom aspektu, soj miševa se održava izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju nukleusa, i uvođenje nukleusa u ćeliju domaćina, i usađivanje nukleusa i ćelije domaćina u podesnu životinju da bi se dobilo potomstvo koje je homozigotno ili heterozigotno za modifikaciju.
[0342] Prema jednom aspektu, soj miševa se održava korišćenjem in vitro fertilizacije (IVF) ženke miša (divljeg tipa, homozigotna za modifikaciju, ili heterozigotna za modifikaciju) korišćenjem sperme od mužjaka miša koji sadrži genetsku modifikaciju. Prema jednom aspektu, mužjak miša je heterozigotan za genetsku modifikaciju. Prema jednom aspektu, mužjak miša je homozigotan za genetsku modifikaciju.
[0343] Prema jednom aspektu, soj miševa se održava ukrštanjem mužjaka miša koji je heterozigotan za genetsku modifikaciju sa ženkom miša da bi se dobilo potomstvo koje sadrži genetsku modifikaciju, identifikaciju potomstva mužjaka i ženki koje sadrži genetsku modifikaciju, i korišćenje mužjaka koji su heterozigotni za genetsku modifikaciju za ukrštanje sa ženkama koje su divljeg tipa, homozigotne, ili heterozigotne za genetsku modifikaciju da bi se dobilo potomstvo koje sadrži genetsku modifikaciju. Prema jednom aspektu, korak ukrštanja mužjaka koji su heterozigotni za genetsku modifikaciju sa ženkom divljeg tipa, ženkom koja je heterozigotna za genetsku modifikaciju, ili ženke koja je homozigotna za genetsku modifikaciju se ponavlja da bi se zadržala genetska modifikacija u soju miševa.
[0344] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za održavanje soja miševa koji sadrži zamenu endogenog varijabilnog genskog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sa jednom ili više sekvenci humanog imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži ukrštanje soja miševa tako da se generišu heterozigotni mužjaci miša, pri čemu se heterozigotni mužjaci miševa ukrštaju da bi se zadržala genetska modifikacija u soju. Prema specifičnom aspektu, soj se ne održava ukrštanjem homozigotnog mužjaka sa ženkom divljeg tipa, ili ženkom koja je homozigotna ili heterozigotna za genetsku modifikaciju.
[0345] ADAM6 protein je član A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) familije proteina, koja je velika familija proteina koji imaju raznovrsne funkcije, uključujući ćelijsku adheziju. Neki članovi ADAM familije su uključeni u spermatogenezu i oplođenje. Na primer, ADAM2 kodira podjedinicu proteina fertilin, koji je uključen u interakcije sperma-jajašce. Izgleda da je ADAM3 ili ciritestin neophodan za vezivanje sperme za zonu pelucida. Odsustvo ADAM2 ili ADAM3 rezultuje neplodnošću. Pretpostavljeno je da ADAM2, ADAM3, i ADAM6 formiraju kompleks na površini ćelije mišje sperme. Izgleda da je humani gen parnjak (humani ADAM6), koji se normalno nalazi između humanih VH genskih segmenata VH1-2 i VH6-1, pseudogen. Kod miševa, postoje dva ADAM6 gena-ADAM6a i ADAM6b-koji se nalaze u intergenskom regionu između mišjih VH i DH genskih segmenata, a u mišu su ADAM6a i ADAM6b geni orijentisani u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji od one kod okolnih imunoglobulinskih genskih segmenata. Kod miševa, funkcionalni ADAM6 lokus je očigledno neophodan za normalnu fertilizaciju. Funkcionalni ADAM6 lokus ili sekvenca se onda odnosi na ADAM6 lokus ili sekvencu koja može da nadomeštava,
1
ili očuva drastično smanjenu plodnost koja odlikuje mužjake miševa sa nedostajućim ili nefunkcionalnim endogenim ADAM6 lokusima.
[0346] Pozicija intergenske sekvence kod miševa koja kodira ADAM6a i ADAM6b čini intergensku sekvencu podložnom modifikaciji kada se modifikuje endogeni mišji teški lanac. Kada su VH genski segmenti izbrisani ili zamenjeni, ili kada su DH genski segmenti izbrisani ili zamenjeni postoji visoka verovatnoća da će rezultujućeg miša odlikovati ozbiljan deficit plodnosti. Da bi se kompenzovao taj deficit, miš se modifikuje tako da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji će nadomestiti gubitak ADAM6 aktivnosti zbog modifikacije endogenog mišjeg ADAM6 lokusa. U različitim aspektima, nadomeštavajuća nukleotidna sekvenca je ona koja kodira mišji ADAM6a, mišji ADAM6b, ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji sprečava deficit plodnosti. Alternativno, mogu se koristiti podesni metodi za očuvanje endogenog ADAM6 lokusa, dok se endogene imunoglobulinske sekvence teškog lanca koje okružuju mišji ADAM6 lokus čine nesposobnim za rearanžiranje da bi kodirale funkcionalni endogeni varijabilni region teškog lanca. Ilustrativni alternativni metodi obuhvataju manipulaciju velikim delovima mišjih hromozoma koji pozicioniraju endogene imunoglobulinske lokuse varijabilnog regiona teškog lanca, tako da oni nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali funkcionalni varijabilni region teškog lanca koji je operativno povezan sa endogenim konstantnim genom teškog lanca. U različitim aspektima, metodi mogu obuhvatati inverzije i/ili translokacije mišjih hromozomskih fragmenata koji sadrže endogene imunoglobulinske genske segmente teškog lanca.
[0347] Nukleotidna sekvenca koja obezbeđuje plodnost može biti postavljena na bilo kojoj podesnoj poziciji. Ona može biti postavljena u intergenski region, ili na bilo koju podesnu poziciju u genomu (tj. ektopično). Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca može biti uvedena u transgen koji je slučajno integrisan u mišji genom. Prema jednom aspektu, sekvenca se može održavati epizomski, to jest, na posebnoj nukleinskoj kiselini umesto na mišjem hromozomu. Podesne pozicije obuhvataju pozicije koje su transkripciono permisivne ili aktivne, npr. ROSA26 lokus (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), BT-5 lokus (Michael et al., 1999, Mech. Dev.
85:35-47), ili Oct4 lokus (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Ciljanje nukleotidnih sekvenci na transkripciono aktivne lokuse je opisano, npr. u US 7,473,557.
[0348] Alternativno, nukleotidna sekvenca koja obezbeđuje plodnost se može kuplovati sa induktibilnim promoterom tako da se olakša optimalna ekspresija u
2
podesnim ćelijama i/ili tkivima, npr. reproduktivnim tkivima. Ilustrativni induktibilni promoteri obuhvataju promotere aktivirane fizičkim (npr. promoter toplotnog šoka) i/ili hemijskim sredstvima (npr. IPTG ili tetraciklin).
[0349] Dalje, ekspresija nukleotidne sekvence može biti povezana sa drugim genima tako da se ostvari ekspresija u specifičnim stadijumima razvoja ili u okviru specifičnog tkiva. Takva ekspresija se može ostvariti stavljanjem nukleotidne sekvence u operativnu vezu sa promoterom gena izraženim u specifičnom stadijumu razvoja. Na primer, imunoglobulinske sekvence jedne vrste inženjeringom ubačene u genom vrste domaćina se stavljaju u operativnu vezu sa sekvencom promotera CD19 gena (gena specifičnog za B ćeliju) od vrste domaćina. Ostvarena je ekspresija specifična za B ćeliju u preciznim stadijumima razvoja kada se izražavaju imunoglobulini.
[0350] Jedan drugi postupak za ostvarivanje robusne ekspresije umetnute nukleotidne sekvence je korišćenje konstitutivnog promotera. Ilustrativni konstitutivni promoteri obuhvataju SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK i CAGG. Na sličan način, željena nukleotidna sekvenca se postavlja u operativnu vezu sa izabranim konstitutivnim promoterom, koji obezbeđuje visoki nivo ekspresije jednog, odn. više proteina kodiranih nukleotidnom sekvencom.
[0351] Izraz "ektopična" treba da obuhvati premeštanje, ili postavljanje na poziciji koja se normalno ne pojavljuje u prirodi (npr. postavljanje sekvence nukleinske kiseline na poziciji koja nije ista pozicija kao ona na kojoj se sekvenca nukleinske kiseline nalazi kod miša divljeg tipa). Izraz se, u različitim aspektima, upotrebljava u smislu da se njegov objekat nalazi izvan svoje normalne, ili prave pozicije. Na primer, fraza " ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira ..." se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja se pojavljuje na poziciji na kojoj se normalno ne pojavljuje kod miša. Na primer, u slučaju ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji obezbeđuje istu ili sličnu korist za plodnost kod mužjaka miševa), sekvenca može biti postavljena na drugačiju poziciju u mišjem genomu od one koja se normalno nalazi kod miša divljeg tipa. U takvim slučajevima novi sekventni spojevi mišje sekvence će biti stvoreni stavljanjem sekvence na drugačije pozicije u mišjem genomu nego kod miša divljeg tipa. Funkcionalni homolog ili ortolog mišjeg ADAM6 je sekvenca koja obezbeđuje čuvanje od gubitka plodnosti (npr. gubitka sposobnosti mužjaka miša da generiše potomstvo parenjem) koja je uočena kod ADAM6<-/->miša. Funkcionalni homolozi ili ortolozi sadrže proteine koji imaju najmanje oko 89% identičnosti ili više, npr. do 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6a i/ili aminokiselinskom sekvencom ADAM6b, i koja može da nadomesti ili očuva sposobnost uspešnog parenja kod miša koji ima genotip koji sadrži deleciju ili inaktivaciju ADAM6a i/ili ADAM6b.
[0352] Ektopična pozicija može biti bilo gde (npr. kod slučajne insercije transgena koji sadrži mišju ADAM6 sekvencu), ili može biti, npr. na poziciji koja približno odgovara (ali koja nije precizno potpuno ista) njenoj lokaciji kod miša divljeg tipa (npr. u modifikovanom endogenom mišjem imunoglobulinskom lokusu, već je uzvodno ili nizvodno od njene prirodne pozicije, npr. u okviru modifikovanog imunoglobulinskog lokusa, ali između drugačijih genskih segmenata, ili na drugačijoj poziciji u mišjoj V-D intergenskoj sekvenci). Jedan primer ektopičnog postavljanja je zadržavanje pozicije koja se normalno nalazi kod miševa divljeg tipa unutar endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, dok okolni endogeni genski segmenti teškog lanca mogu da se rearanžiraju da bi kodirali funkcionalni teški lanac koji sadrži varijabilne lokuse endogenog konstantnog regiona. U ovom primeru, ovo može biti ostvareno inverzijom hromozomskog fragmenta koji sadrži endogene imunoglobulinske varijabilne lokuse teškog lanca, npr. korišćenjem mesno-specifičnih rekombinacionih mesta inženjeringom postavljenih na pozicije koje okružuju lokus varijabilnog regiona. Shodno tome, posle rekombinacije endogeni lokusi varijabilnog regiona teškog lanca su postavljeni na velikom rastojanju od endogenih genskih konstantnih regiona teškog lanca, čime je sprečeno rearanžiranje radi kodiranja funkcionalnog teškog lanca koji sadrži endogeni konstantni region teškog lanca. Drugi ilustrativni metodi za ostvarivanje funkcionalnog utišavanja endogenog imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca, uz zadržavanje funkcionalnog ADAM6 lokusa će biti očigledni stručnjacima posle čitanja ovog otkrivanja i/ili u kombinaciji sa metodima koji su poznati iz odgovarajuće oblasti. Takvim postavljanjem endogenog lokusa teškog lanca se zadržavaju endogeni ADAM6 geni, a endogeni imunoglobulinski lokus teškog lanca je funkcionalno utišan.
[0353] Sledeći primer ektopičnog postavljanja je postavljanje unutar lokusa humanizovanog imunoglobulinskog teškog lanca. Na primer, miš koji sadrži zamenu jednog ili više endogenih VH genskih segmenata sa humanim VH genskim segmentima, pri čemu zamena odstranjuje endogenu ADAM6 sekvencu, može biti genetski modifikovan tako da ima mišju ADAM6 sekvencu lociranu unutar intergenske sekvence koja leži između samo jednog humanog VH genskog segmenta i humanog DH genskog segmenta. Sledeći primer ektopičnog postavljanja je postavljanje mišje
4
ADAM6 sekvence na poziciju 5' (u odnosu na smer transkričcije samo jednog humanog VH genskog segmenta) na humanom VH genskom segmentu. Pozicija 5’ na samo jednom humanom VH genskom segmentu može biti u neposrednoj blizini, npr. od nekoliko stotina parova baza do nekoliko kb, ili može biti udaljena, npr., od nekoliko kb do stotina kb ili čak megabaza ili više, u odnosu na humani VH genski segment. Rezultujuća modifikacija bi generisala (ektopičnu) mišju ADAM6 sekvencu u okviru humane genske sekvence, dok (ektopično) stavljanje mišje ADAM6 sekvence unutar humane genske sekvence može približno odgovarati poziciji humanog ADAM6 pseudogena (tj. između dva V segmenta) ili može približno odgovarati poziciji mišje ADAM6 sekvence (tj. u okviru V-D intergenskog regiona). Rezultujući spojevi sekvenci nastali spajanjem (ektopične) mišje ADAM6 sekvence u okviru ili susedno humanoj genskoj sekvenci (npr. imunoglobulinskoj genskoj sekvenci) u okviru germinativne linije miša bi bilo novo u poređenju sa istom ili sličnom pozicijom u genomu miša divljeg tipa.
[0354] Prema različitim aspektima, opisane su nehumane životinje kojima nedostaje ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, pri čemu taj nedostatak čini nehumanu životinju neplodnom, ili u suštini smanjuje plodnost nehumane životinje. Prema različitim aspektima, nedostatak ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa je usled modifikacije endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. Značajno smanjenje plodnosti je, npr. smanjenje plodnosti (npr. učestanost parenja, broj mladunaca po okotu, godišnji broj okota, itd.) od oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95% ili više. Prema različitim aspektima, nehumanim životinjama je nadomešten mišji ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjacima nehumane životinje, pri čemu obezbeđeni ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment nadomeštava smanjenje plodnosti u celini ili u značajnoj meri. Obezbeđivanje plodnosti u značajnoj meri je, npr. ponovno uspostavljanje plodnosti tako da nehumanu životinju odlikuje plodnost koja je najmanje 70%, 80%, ili 90% ili veća u poređenju sa nemodifikovanim lokusom teškog lanca (tj. životinjom bez modifikacije ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa).
[0355] Sekvenca koja prenosi genetski modifikovanoj životinji (tj. životinji kojoj nedostaje funkcionalni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, zbog, npr. modifikacije lokusa imunoglobulinskog teškog lanca) je, prema različitim aspektima, izabrana između ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa. Na primer, kod miša, gubitak ADAM6 funkcije je nadomešten dodavanjem, prema jednom aspektu, mišjeg ADAM6 gena. Prema jednom aspektu, gubitak ADAM6 funkcije kod miša je nadomešten dodavanjem ortologa ili homologa blisko srodne vrste u odnosu na miša, npr. glodara, npr. miša različitog soja ili vrste, pacova bilo koje vrste, glodara; pri čemu dodavanje ortologa ili homologa mišu nadomeštava gubitak plodnosti usled gubitka ADAM6 funkcije ili gubitka ADAM6 gena. Ortolozi i homolozi od druge vrste, prema različitim aspektima, su izabrani između filogenetski srodnih vrsta i, prema različitim aspektima, odlikuje ih procentualna identičnost sa endogenim ADAM6 (ili ortologom) koja je oko 80% ili veća, 85% ili veća, 90% ili veća, 95% ili veća, 96% ili veća, ili 97% ili veća; i koji nadomeštavaju gubitak plodnosti povezan sa ADAM6 ili (kod nemiša) ADAM6 ortologom. Na primer, kod genetski modifikovanih mužjaka pacova kojima nedostaje ADAM6 funkcija (npr. kod pacova sa endogenim varijabilnim regionom imunoglobulinskog teškog lanca zamenjenim sa varijabilnim regionom humanog imunoglobulinskog teškog lanca, ili inaktivacijom regiona imunoglobulinskog teškog lanca kod pacova), gubitak plodnosti kod pacova se nadomeštava dodavanjem pacovskog ADAM6 ili, prema nekim aspektima, ortologa pacovskog ADAM6 (npr. ADAM6 ortologa od drugog soja ili vrste pacova, ili, prema jednom aspektu, od miša).
[0356] Shodno tome, prema različitim aspektima, genetski modifikovane životinje koje odlikuje neplodnost ili smanjenje plodnosti usled modifikacije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog) ili regulatornog regiona operativno povezanog sa sekvencom nukleinske kiseline, sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja dopunjava ili ponovno uspostavlja izgubljenu plodnost, gde je sekvenca nukleinske kiseline koja dopunjava ili ponovo uspostavlja izgubljenu plodnost od drugačijeg soja iste vrste ili od filogenetski srodne vrste. Prema različitim aspektima, dopunjavajuća sekvenca nukleinske kiseline je ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment. Prema različitim aspektima, dopunjavajući ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je od nehumane životinje koja je blisko srodna genetski modifikovanoj životinji koja ima defekat plodnosti. Na primer, kada je genetski modifikovana životinja miš specifičnog soja, onda se ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment može dobiti od miša drugog soja, ili miša srodne vrste. Prema jednom aspektu, kada je genetski modifikovana životinja koja ima defekat plodnosti iz reda Rodentia, onda je ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment iz druge životinje iz reda Rodentia. Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja koja ima defekat plodnosti je iz podreda Myomoropha (npr. jerboa, skočimiševi, mišu-slični hrčci, hrčci, američki pacovi i miševi, voluharice, pravi miševi i pacovi, gerbili, bodljikavi miševi, grivasti pacovi, miševi penjači, planinski miševi, belorepi pacovi, Malagazi pacovi i miševi, bodljikavi miševi, krtičasti pacovi, bambusni pacovi, zokori), a ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je izdvojen iz životinje reda Rodentia, ili podreda Myomorpha.
[0357] Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je iz nadporodice Dipodoidea, a ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je iz nadporodice Muroidea. Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je iz nadporodice Muroidea, a ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je iz nadporodice Dipodoidea.
[0358] Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je glodar. Prema jednom aspektu, glodar je izabran iz nadporodice Muroidea, a ADAM6 ortolog ili homolog je od drugačije vrste u okviru nadporodice Muroidea. Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je iz porodice izabrane između Calomyscidae (npr. mišu-slični hrčci), Cricetidae (npr. hrčkovi, američki pacovi i miševi, voluharice), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, bodljikavi miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, planinski miševi, belorepi pacovi, Malagazi pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr. bodljikavi miš), i Spalacidae (npr. krtičasti pacovi, bambusni pacovi, i zokori); a ADAM6 ortolog ili homolog je izabran između različitih vrsta iste porodice. Prema specifičnom aspektu, genetski modifikovani glodar je izabran između pravog miša ili pacova (porodica Muridae), a ADAM6 ortolog ili homolog je od vrste koja je izabrana između gerbila, bodljikavog miša ili grivastog pacova. Prema jednom aspektu, genetski modifikovani miš je član porodice Muridae, a ADAM6 ortolog ili homolog je od drugačije vrste iz porodice Muridae. Prema specifičnom aspektu, genetski modifikovani glodar je miš iz porodice Muridae, a ADAM6 ortolog ili homolog je od pacova, gerbila, bodljikavog miša ili grivastog pacova iz porodice Muridae.
[0359] Prema različitim aspektima, jedan ili više glodarskih ADAM6 ortologa ili homologa ili njihovih funkcionalnih fragmenata glodara u familiji ponovo uspostavlja plodnost genetski modifikovanog glodara iz iste familije kome nedostaje ADAM6 ortolog ili homolog (npr. Cricetidae (npr. hrčci, američki pacovi i miševi, voluharice); Muridae (npr. pravi miševi i pacovi, gerbili, bodljikavi miševi, grivasti pacovi)).
[0360] Prema različitim aspektima, ADAM6 ortolozi, homolozi, i njihovi fragmenti su ispitani u pogledu funkcionalnosti utvrđivanjem da li taj ortolog, homolog, ili fragment ponovo uspostavlja plodnost kod genetski modifikovanih mužjaka nehumane životinje kojima nedostaje ADAM6 aktivnost (npr. glodara, npr. miša ili pacova, koji sadrži inaktivaciju ADAM6 ili njegovog ortologa). Prema različitim aspektima, funkcionalnost je definisana kao sposobnost sperme genetski modifikovane životinje kojoj nedostaje endogeni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog da migrira kroz jajovod i da oplodi jajašce iste vrste genetski modifikovane životinje.
[0361] Prema različitim aspektima, miševi koji sadrže delecije ili zamene endogenog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca ili njegovih delova se mogu napraviti tako da sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji obezbeđuje slične koristi u pogledu plodnosti na mišji ADAM6 (npr. njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša). Ektopična nukleotidna sekvenca može obuhvatati nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji je ADAM6 homolog ili ortolog (ili njegov fragment) različitog soja miša ili različite vrste, npr. različite vrste glodara, i koji obezbeđuje korist u pogledu plodnosti, npr. povećani broj okota u toku specifikovanog vremenskog perioda, i/ili povećani broj mladunaca po okotu, i/ili sposobnost ćelija sperme mužjaka miša da prođe kroz mišji jajovod da bi oplodio mišje jajašce.
[0362] Prema jednom aspektu, ADAM6 je homolog ili ortolog koji je najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6 proteinom (npr. najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6a ili mišjim ADAM6b). Prema jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca kodira jedan ili više proteina nezavisno izabranih između proteina koji je najmanje 89% identičan sa mišjim ADAM6a, proteina koji je najmanje 89% identičan sa mišjim ADAM6b, i njihove kombinacije. Prema jednom aspektu, homolog ili ortolog je pacovski, hrčkov, mišji ili zamorčetov protein je identičan ili je modifikovan tako da bude oko 89% ili više identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b. Prema jednom aspektu, homolog ili ortolog je identičan ili je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b.
Ektopični ADAM6 u miševima sa humanizovanim teškim lancem
[0363] Razvoji u ciljanju gena, npr. razvoj bakterijskih veštačkih hromozoma (BACs), sada omogućava rekombinaciju relativno velikih genomskih fragmenata. BAC inženjering je obezbedio mogućnost da se prave velike delecije, i velike insercije, u mišjim ES ćelijama.
[0364] Miševi koji prave humana antitela se već neko vreme nalaze na raspolaganju. Mada oni predstavljaju važan napredak u razvoju humanih terapeutskih antitela, ove miševe odlikuje i više značajnih abnormalnosti koje ograničavaju njihovu korisnost. Na primer, njih odlikuje kompromitovani razvoj B ćelija. Kompromitovani razvoj može biti uzrokovan mnoštvom razlika između transgenskih miševa i miševa divljeg tipa.
[0365] Humana antitela možda ne mogu optimalno da sadejstvuju sa receptorima mišjih pre B ćelija ili B ćelija na površini mišjih ćelija što signalizira sazrevanje, proliferaciju, ili preživljavanje u toku klonske selekcije. Potpuno humana antitela možda ne mogu optimalno sadejstvovati sa mišjim Fc receptorskim sistemom; miševi izražavaju Fc receptore koji ne ispoljavaju korespodenciju jedan-na-jedan sa humanim Fc receptorima. Konačno, različiti miševi koji prave potpuno humana antitela ne sadrže sve originalne mišje sekvence, npr. nizvodne pojačavačke elemente i druge kontrolne elemente lokusa, koji mogu biti potrebni za razvoj B ćelija divljeg tipa.
[0366] Miševi koji prave potpuno humana antitela generalno sadrže endogene imunoglobulinske lokuse koji su onesposobljeni na neki način, i humani transgeni koji sadrže varijabilne i konstantne imunoglobulinske genske segmente se uvode na slučajnu lokaciju u mišjem genomu. Sve dok je endogeni lokus dovoljno onesposobljen da ne rearanžira genske segmente tako da ne formiraju funkcionalni imunoglobulinski gen, cilj dobijanja potpuno humanog antitela u takvom mišu se može ostvariti-mada sa kompromitovanim razvojem B ćelija.
[0367] Mada je prinuđen da pravi potpuno humana antitela od humanog transgenskog lokusa, generisanje humanih antitela u mišu je očigledno nepovoljan proces. Kod nekih miševa, proces je toliko nepovoljan da rezultuje formiranjem himeričnih humanih varijabilnih/mišjih konstantnih teških lanaca (ali ne i lakih lanaca) putem mehanizma trans-promene. Pomoću ovog mehanizma transkripti koji kodiraju potpuno humana antitela se podvrgavaju promeni izotipa u trans, od humanog izotipa u mišji izotip. Proces je u trans, jer je potpuno humani transgen lociran odvojeno od endogenog lokusa koji zadržava neoštećenu kopiju mišjeg gena konstantnog regiona teškog lanca. Mada je kod takvih miševa trans-promena lako uočljiva, taj fenomen je još uvek nedovoljan za obezbeđivanje razvoja B ćelija, koje ostaje jedva pogođeno. U bilo kom slučaju, trans-promenjena antitela napravljena u takvim miševima zadržavaju potpuno humane lake lance, pošto se fenomen trans-promene očigledno ne događa u vezi lakih lanaca; trans-promena se prvenstveno oslanja na promenu sekvenci u upotrebljenim endogenim lokusima (mada različito) u normalni izotip promenom u cis. Shodno tome, čak i kada miševi dobijeni inženjeringom prave potpuno humana antitela izborom mehanizma trans-promene da bi pravili antitela sa mišjim konstantnim regionima, ta strategija je još uvek nedovoljna za obezbeđivanje razvoja normalnih B ćelija.
[0368] Primarni problem pri pravljenju humanih terapeutika baziranih na antitelima, npr. anti-patogenih antitela, je identifikacija korisnih varijabilnih domena koji specifično prepoznaju specifične epitope i vezuju ih sa željenim afinitetom, obično, ali ne uvek – sa visokim afinitetom. Ovde opisane miševe, koji sadrže preciznu zamenu varijabilnih regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca sa ograničenim brojem varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca na endogenim mišjim lokusima, odlikuje razvoj B ćelija skoro divljeg tipa, a varijabilni regioni generisani kao reakcija na imunizaciju su potpuno humani, pri čemu teški lanci potiču od samo jednog humanog VH genskog segmenta. Shodno tome, takvi miševi obezbeđuju platformu za generisanje panela regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) teškog lanca koji su specifično usmereni na vezivanje datog antigena, npr. patogenog virusa.
[0369] Ovde opisani miševi sadrže preciznu, obimnu zamenu varijabilnih genskih lokusa germinativne linije mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca (IgH) sa ograničenim varijabilnim lokusom humanog imunoglobulinskog teškog lanca, i imunoglobulinskog lakog lanca (npr. κ lakog lanca, Igκ) sa ekvivalentnim varijabilnim genskim lokusom humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca, na endogenim lokusima. Ova precizna zamena rezultuje mišom sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji prave teške i lake lance koji imaju humane varijabilne regione i mišji konstantni region. Precizna zamena mišjih VH-DH-JH i VK-JK segmenata ostavlja susedne mišje sekvence intaktnim i funkcionalnim na hibridnim imunoglobulinskim lokusima. Funkcije humoralnog imunog sistema miša su kao one kod miša divljeg tipa. Razvoj B ćelija je neometan u bilo kom značajnom pogledu i somatski mutirani panel CDRs humanog teškog lanca se generiše u mišu posle opterećenja antigenom.
[0370] Ovde opisani miševi su mogući jer se imunoglobulinski genski segmenti za teške i κ lake lance rearanžiraju slično kod ljudi i miševa, što ne znači da su njihovi lokusi isti ili čak skoro isti – jasno je da nisu. Međutim, lokusi su dovoljno slični, tako da može da se realizuje humanizacija varijabilnog genskog lokusa teškog lanca zamenom oko tri miliona parova baza susedne mišje sekvence koja sadrži sve VH, DH, i JH genske segmente sa susednom humanom genomskom sekvencom koja sadrži ograničeni humani lokus teškog lanca.
[0371] Prema nekim aspektima, dalje zamena izvesnih genskih sekvenci mišjeg konstantnog regiona sa humanim genskim sekvencama (npr. zamena mišje CH1
1
sekvence sa humanom CH1 sekvencom, i zamena mišje CL sekvence sa humanom CL sekvencom) rezultuje miševima sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji prave antitela koja imaju humane varijabilne regione i delimično humane konstantne regione, a koja su podesna, npr. za pravljenje fragmenata potpuno humanih antitela, npr. potpuno humanih Fab’s. Miševe sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima odlikuje normalno rearanžiranje varijabilnih genskih segmenata, normalna učestanost somatskih hipermutacija, i normalna promena klase. Ove miševe odlikuje humoralni imuni sistem koji se ne razlikuje od miševa divljeg tipa, i odlikuju ih normalne populacije ćelija u svim stadijumima razvoja B ćelija i normalne strukture limfoidnih organa – čak i tamo gde miševima nedostaje potpuni repertoar genskih segmenata humanog varijabilnog regiona. Imunizacija ovih miševa rezultuje robusnim humoralnim reakcijama koje odlikuje velika raznovrsnost CDRs teškog lanca i korišćenje varijabilnih genskih segmenata lakog lanca.
[0372] Precizna zamena genskih segmenata varijabilnog regiona mišje germinativne linije omogućava dobijanje miševa koji imaju delimično humane imunoglobulinske lokuse. Pošto se delimično humani imunoglobulinski lokusi rearanžiraju, hipermutiraju i menjaju klasu normalno, delimično humani imunoglobulinski lokusi generišu antitela u mišu koja sadrže humane varijabilne regione. Nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione mogu biti identifikovane i klonirane, pa zatim fuzionisane (npr. u vitro sistemu) sa bilo kojim sekvencama po izboru, npr. bilo kojim imunoglobulinskim izotipom koji je podesan za specifičnu primenu, što rezultuje antitelom ili antigenvezujućim proteinom koji u celini potiče od humanih sekvenci.
[0373] Humanizacija u velikim razmerama postupcima rekombinacije je bila primenjena za modifikaciju mišjih embrionskih matičnih (ES) ćelija da bi se precizno zamenile do tri megabaze lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca koji je u suštini sadržao sve mišje VH, DH, i JH genske segmente sa humanom genomskom sekvencom koja sadrži ograničeni lokus humanog teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata. Segment humanog genoma veličine do jedne polovine megabaze koji je sadržao jedno od dva ponavljanja koja kodiraju u suštini sve humane Vκ i Jκ genske segmente je bio upotrebljen za zamenu tri megabaze segmenta lokusa mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca koji je u suštini sadržao sve mišje Vκ i Jκ genske segmente.
1 1
[0374] Miševi sa tako zamenjenim imunoglobulinskim lokusima mogu sadržati prekid ili deleciju endogenog mišjeg ADAM6 lokusa, koji se normalno nalazi između 3’-najbližeg VH genskog segmenta i 5’-najbližeg DH genskog segmenta na lokusu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prekid u ovom regionu može dovesti do smanjenja ili eliminacije funkcionalnosti endogenog mišjeg ADAM6 lokusa. Ako se jedan, ili oba od 3’-najbližih VH genskih segmenata repertoara humanog teškog lanca upotrebe u konstrukciji ograničenog lokusa humanog teškog lanca, izgleda da je intergenski region koji sadrži humani ADAM6 pseudogen prisutan između ovih VH genskih segmenata, tj. između humanih VH1-2 i VH1-6. Međutim, mužjake miševa koji sadrže ovu humanu intergensku sekvencu odlikuje smanjenje plodnosti (vidi USSN 13/404,075).
[0375] Opisani su miševi koji sadrže ograničene lokuse humanog teškog lanca i ekvivalentnog humanog κ lakog lanca kao što je gore opisano, i koji takođe sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6, gde te miševe u suštini odlikuje normalna plodnost. Prema jednom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline sadrži mišju ADAM6a i/ili mišju ADAM6b sekvencu ili njihove funkcionalne fragmente smeštene između humanog VH1-69 i humanog DH1-1 na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Prema jednom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je SEQ ID NO: 77, koja je smeštena između humane VH1-69 i humane DH1-1 na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Smer transkripcije ADAM6 gena sa SEQ ID NO: 77 je suprotan u odnosu na smer transkripcije okolnih humanih genskih segmenata. Prema jednom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline sadrži mišju ADAM6a i/ili mišju ADAM6b sekvencu ili njihove funkcionalne fragmente koji su smešteni uzvodno (ili 5’) od humanog VH1-2 genskog segmenta na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Prema jednom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je SEQ ID NO: 73, koja je smeštena uzvodno (ili 5’) od humanog VH1-2 genskog segmenta na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Smer transkripcije ADAM6 gena sa SEQ ID NO: 73 je suprotan u odnosu na smer transkripcije okolnih humanih genskih segmenata (npr. humanog VH1-2 genskog segmenta).
[0376] Mada ovde primeri prikazuju očuvanje plodnosti stavljanjem ektopične sekvence između naznačenih humanih genskih segmenata, stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se može očekivati da postavljanje ektopične
1 2
sekvence na bilo kom podesnom transkripciono dopustivom lokusu u mišjem genomu (ili čak ekstrahromozomski) na sličan način očuva plodnost kod mužjaka miša.
[0377] Fenomen komplementiranja miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom koja sadrži mišji ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je generalno postupak koji se može primeniti za očuvanje miševa sa nefunkcionalnim ili minimalno funkcionalnim endogenim ADAM6 lokusima. Shodno tome, znatna većina miševa koji sadrže modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sa prekidom ADAM6 može biti očuvana sa ovde opisanim kompozicijama i postupcima. Shodno tome, predmetno otkrivanje obuhvata miševe sa velikim mnoštvom modifikacija lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koje kompromituju endogenu ADAM6 funkciju. Neki (neograničavajući) primeri su dati u ovom opisu. Pored opisanih miševa, kompozicije i postupci povezani sa ADAM6 se mogu primeniti u velikom broju primena, npr. kada se vrši modifikacija lokusa teškog lanca na veliko mnoštvo načina.
[0378] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata sa humanim DH i humanim JH genskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region. Prema jednom aspektu, miš pravi samo jedan protein koji vezuje varijabilni domen, a koji je dimer imunoglobulinskih lanaca koji je izabran između: (a) humanog VH - mišjeg CH1 - mišjeg CH2 - mišjeg CH3; (b) humanog VH -mišjeg zgloba - mišjeg CH2 - mišjeg CH3; i, (c) humanog VH - mišjeg CH2 - mišjeg CH3.
[0379] Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja očuvava plodnost se postavlja uzvodno (ili 5’) od sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca (npr. uzvodno od humanog VH1-2 ili VH1-69 genskog segmenta) u mišu koji ima zamenu jednog ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca (mVH’s, mDH’s, i/ili mJH’s) sa jednim ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca (hVH’s, hDH’s, i/ili hJH’s), i miš dalje sadrži zamenu jednog ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca (mVκ’s i/ili mJκ’s) sa jednim ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca (hVκ’s i/ili hJκ’s).
1
[0380] Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja očuvava plodnost se postavlja u okviru sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca (npr. između humanog VH1-69 ili humanog VH1-2 i humanog DH1-1 genskog segmenta) u mišu koji ima zamenu jednog ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca (mVH’s, mDH’s, i/ili mJH’s) sa jednim ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca (hVH’s, hDH’s, i/ili hJH’s), i miš dalje sadrži zamenu jednog ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca (mVκ’s i/ili mJκ’s) sa jednim ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca (hVκ’s i/ili hJκ’s).
[0381] Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca sadrži oko tri megabaze lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca sadrži najmanje 89 VH genskih segmenata, najmanje 13 DH genskih segmenata, najmanje četiri JH genska segmenta ili njihovu kombinaciju lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog teškog lanca sadrži ograničeni broj (npr. jedan, dva ili tri) VH genskih segmenata, najmanje 27 DH genskih segmenata, najmanje šest JH genskih segmenata ili njihovu kombinaciju lokusa humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, ograničeni broj humanih VH genskih segmenata je jedan.
[0382] Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži oko tri megabaze lokusa mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži najmanje 137 Vκ genskih segmenata, najmanje pet Jκ genskih segmenata ili njihovu kombinaciju lokusa mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži oko jedne polovine megabaze lokusa humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži bliže ponavljanje (u odnosu na imunoglobulinski κ konstantni region) lokusa humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži najmanje 40Vκ genskih segmenata, najmanje
1 4
pet Jκ genskih segmenata ili njihovu kombinaciju lokusa humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca.
[0383] Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca se postavlja između dva humana imunoglobulinska genska segmenta. Prema specifičnom aspektu, dva humana imunoglobulinska genska segmenta su genski segmenti teškog lanca. Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca se postavlja između humanog VH1-69 genskog segmenta i humanog DH1-1 genskog segmenta. Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca se postavlja između humanog VH12 genskog segmenta i humanog DH1-1 genskog segmenta. Prema jednom aspektu, miš se modifikuje tako da sadrži zamenu varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, 27 humanih DH genskih segmenata i šest humanih JH genskih segmenata, i zamenu varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca sa najmanje 40 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata.
[0384] Prema jednom aspektu, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment) je prisutan usred mišjih genskih segmenata koji su prisutni na endogenom lokusu varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca, pri čemu pomenuti lokus nije sposoban za rearanžiranje da bi kodirao funkcionalni teški lanac koji sadrži endogeni konstantni region teškog lanca. Prema jednom aspektu, endogeni lokus mišjeg teškog lanca sadrži najmanje jedan i do 89 VH genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 DH genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri JH genska segmenta i njihovu kombinaciju. Prema različitim aspektima, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment) kodira jedan ili više ADAM6 proteina koji su funkcionalni u mišu, pri čemu jedan ili više ADAM6 proteina sadrže SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i/ili njihovu kombinaciju.
[0385] Prema jednom aspektu, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment) je prisutan usred humanih genskih segmenata koji zamenjuju endogene mišje genske segmente. Prema jednom aspektu, najmanje 89 mišjih VH genskih segmenata se odstranjuje i zamenjuje sa jednim, dva ili tri humana VH genska segmenta, a mišji ADAM6 lokus je prisutan neposredno pored 3’ kraja humanih VH genskih segmenata, ili između dva humana VH genska segmenta. Prema jednom aspektu, najmanje 89 mišjih VH genskih segmenata se odstranjuje i zamenjuje sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, a mišji ADAM6 lokus je prisutan neposredno pored 3’ kraja humanog VH genskog segmenta. Prema specifičnom
1
aspektu, mišji ADAM6 lokus je prisutan 3’ od VH genskog segmenta u okviru od oko 20 kilo baza (kb) do oko 40 kilo baza (kb) od 3’ kraja umetnutog humanog VH genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus je prisutan 3’ od VH genskog segmenta u okviru od oko 29 kb do oko 31 kb od 3’ kraja umetnutog humanog VH genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus je prisutan u okviru oko 30 kb od 3’ kraja umetnutog humanog VH genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus je prisutan u okviru oko 30,184 bp od 3’ kraja umetnutog humanog VH genskog segmenta.
[0386] Prema specifičnom aspektu, zamena uključuje humane genske segmente VH1-69 i DH1-1, i mišji ADAM6 lokus je prisutan nizvodno od VH1-69 genskog segmenta i uzvodno od DH1-1 genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus je prisutan između humanog VH1-69 genskog segmenta i humanog DH1-1 genskog segmenta, pri čemu je 5’ kraj mišjeg ADAM6 lokusa oko 258 bp od 3’ kraja humanog VH1-69 genskog segmenta i 3’ kraj ADAM6 lokusa je oko 3,263 bp od 5’ od humanog DH1-1 genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO:3 ili njegov fragment koji obezbeđuje ADAM6 funkciju unutar ćelija miša. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO: 73 ili njegov fragment obezbeđuje ADAM6 funkciju unutar ćelija miša. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO: 77 ili njegov fragment koji obezbeđuje ADAM6 funkciju unutar ćelija miša. Prema specifičnom aspektu, onda je raspored humanih genskih segmenata sledeći (od uzvodnog prema nizvodnom u odnosu na smer transkripcije humanih genskih segmenata): humani VH1-69-mišji ADAM6 lokushumani DH1-1. Prema jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b od mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih genskih segmenata. Alternativno tome, mišji ADAM6 lokus je prisutan 5’ od, ili uzvodno od samo jednog humanog VH genskog segmenta.
[0387] Prema specifičnom aspektu, zamena uključuje humane genske segmente VH1-2 i DH1-1, a mišji ADAM6 lokus je prisutan uzvodno od VH1-2 genskog segmenta i uzvodno od DH1-1 genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus je prisutan uzvodno, ili 5’ od humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog DH1-1 genskog segmenta, pri čemu je 5’ kraj mišjeg ADAM6 lokusa oko 32,833 bp od 5’ kraja humanog VH1-2 genskog segmenta i 3’ kraj ADAM6 lokusa je oko 18,078 bp od 5’ kraja humanog VH1-2 genskog segmenta. Prema specifičnom aspektu, mišji
1
ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO:3 ili njegov fragment koji obezbeđuje ADAM6 funkciju unutar ćelija miša. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO: 73 ili njegov fragment koji obezbeđuje ADAM6 funkciju unutar ćelija miša. Prema specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO: 77 ili njegov fragment koji obezbeđuje ADAM6 funkciju unutar ćelija miša. Prema specifičnom aspektu, raspored humanih genskih segmenata je onda sledeći (od uzvodnog prema nizvodnom u odnosu na smer transkripcije humanih genskih segmenata): mišji ADAM6 lokushumani VH1-2-humani DH1-1. Prema jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b od mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih genskih segmenata. Alternativno tome, mišji ADAM6 lokus je prisutan 3’ od ili nizvodno od samo jednog humanog VH genskog segmenta.
[0388] Slično tome, miš koji je modifikovan sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata (npr. Vκ ili Vλ segmentima), koji zamenjuju sve ili u suštini sve endogene mišje VH genske segmente, može biti modifikovan tako da zadrži endogeni mišji ADAM6 lokus, kao što je gore opisano, npr. korišćenjem ciljajućeg vektora koji ima nizvodno homologi krak koji sadrži mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment, ili da se zameni oštećeni mišji ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom lociranom između dva humana VL genska segmenta ili između humanih VL genskih segmenata i DH genskog segmenta (bilo humanog ili mišjeg, npr. Vλ m/hDH), ili J genskog segmenta (bilo humanog ili mišjeg, npr. Vκ JH). Prema jednom aspektu, zamena uključuje dva ili više humanih VL genskih segmenata, a mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment je prisutan između dva 3’-najbliža VL genska segmenta. Prema specifičnom aspektu, raspored humanih VL genskih segmenata je onda sledeći (od uzvodnog prema nizvodnom u odnosu na smer transkripcije humanih genskih segmenata): humani VL3’-1 - mišji ADAM6 lokus - humani VL3’. Prema jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u odnosu na orijentaciju humanih VL genskih segmenata. Alternativno tome, mišji ADAM6 lokus je prisutan u intergenskom regionu između 3’-najbližeg humanog VL genskog segmenta i 5’-najbližeg DH genskog segmenta. Ovo može biti slučaj bilo da je 5’-najbliži DH segment mišji ili humani.
[0389] Prema jednom aspektu, opisan je miš sa zamenom jednog ili više endogenih mišjih VH genskih segmenata, koji sadrži najmanje jedan endogeni mišji DH genski
1
segment. Kod takvog miša, modifikacija endogenih mišjih VH genskih segmenata može sadržati modifikaciju jednog ili više od 3’-najbližih VH genskih segmenata, ali ne i 5’-najbližeg DH genskog segmenta, gde se vodi računa da modifikacija jednog ili više 3’-najbližih VH genskih segmenata ne prekine ili ne učini endogeni mišji ADAM6 lokus nefunkcionalnim. Na primer, prema jednom aspektu miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih mišjih VH genskih segmenata sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, i miš sadrži jedan ili više endogenih DH genskih segmenata i funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus.
[0390] Prema sledećem aspektu, miš sadrži modifikaciju endogenih mišjih 3’-najbližih VH genskih segmenata, i modifikaciju jednog ili više endogenih mišjih DH genskih segmenata, a modifikacija se izvodi tako da se zadrži integritet endogenog mišjeg ADAM6 lokusa do te mere da endogeni ADAM6 lokus ostane funkcionalan. U jednom primeru, takva modifikacija se izvodi u dva koraka: (1) zamena 3’-najbližih endogenih mišjih VH genskih segmenata sa samo jednim humanim VH genskim segmentom korišćenjem ciljajućeg vektora sa uzvodnim homologim krakom i nizvodnim homologim krakom, pri čemu nizvodni homologi krak sadrži ceo ili deo funkcionalnog mišjeg ADAM6 lokusa; i (2) zatim zamena endogenog mišjeg DH genskog segmenta sa ciljajućim vektorom koji ima uzvodni homologi krak koji sadrži ceo ili funkcionalni deo mišjeg ADAM6 lokusa.
[0391] Prema različitim aspektima, korišćenje miševa koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni homolog je korisno kada modifikacije narušavaju funkciju endogenog mišjeg ADAM6. Verovatnoća narušavanja endogene mišje ADAM6 funkcije je velika kada se prave modifikacije na mišjim imunoglobulinskim lokusima, a naročito kada se modifikuju varijabilni regioni mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca i okolne sekvence. Zbog toga, takvi miševi obezbeđuju posebnu korist kada se prave miševi sa lokusima imunoglobulinskog teškog lanca koji su izbrisani u celini ili delimično, humanizovani su u celini ili delimično, ili su zamenjeni (npr. sa Vκ ili Vλ sekvencama) u celini ili delimično. Postupci za dobijanje genetskih modifikacija koji su opisani za miševe u nastavku su poznati stručnjacima u odgovarajućoj oblasti.
[0392] Miševi koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein, ili u suštini identični ili slični protein koji obezbeđuje koristi plodnosti mišjeg ADAM6 proteina, su posebno korisni zajedno sa modifikacijama na varijabilnom genskom lokusu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca koje prekidaju ili brišu endogenu mišju
1
ADAM6 sekvencu. Mada su primarno opisani u vezi sa miševima koji izražavaju antitela sa humanim varijabilnim regionima i mišjim konstantnim regionima, takvi miševi su korisni zajedno sa bilo kojim genetskim modifikacijama koje prekidaju endogene mišje ADAM6 gene. Stručnjaci će shvatiti da ovo obuhvata veliko mnoštvo genetski modifikovanih miševa koji sadrže modifikacije varijabilnih genskih lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Oni obuhvataju, na primer, miševe sa delecijom ili zamenom celog ili dela genskih segmenata na genskim segmentima mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, bez obzira na druge modifikacije. Neograničavajući primeri su opisani u nastavku.
[0393] Prema nekim aspektima, opisani su genetski modifikovani miševi koji sadrže ektopični mišji, glodarski, ili drugi ADAM6 gen (ili ortolog ili homolog ili fragment) koji je funkcionalan u mišu, i jedan ili više genskih segmenata humanog imunoglobulinskog varijabilnog i/ili konstantnog regiona. Prema različitim aspektima, drugi ortolozi ili homolozi ili fragmenti ADAM6 gena funkcionalni u mišu mogu sadržati sekvence iz goveđih, psećih, primatskih, zečjih ili drugih nehumanih sekvenci.
[0394] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein, zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa samo jednim humanim VH genskim segmentom; zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata sa jednim ili više humanih DH genskih segmenata; i zamenu svih ili u suštini svih mišjih JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih JH genskih segmenata.
[0395] Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži zamenu mišje CH1 nukleotidne sekvence sa humanom CH1 nukleotidnom sekvencom. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži zamenu mišje zglobne nukleotidne sekvence sa humanom zglobnom nukleotidnom sekvencom. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži zamenu varijabilnih lokusa (VL i JL) imunoglobulinskog lakog lanca sa varijabilnim lokusom humanog imunoglobulinskog lakog lanca. Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži zamenu nukleotidne sekvence konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca sa nukleotidnom sekvencom konstantnog regiona humanog imunoglobulinskog lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, VL, JL, i CL su sekvence imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, miš sadrži sekvencu konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog CH2 i mišjeg CH3 fuzionisanu sa sekvencom humanog zgloba i humanog CH1, tako da se mišji imunoglobulinski lokusi rearanžiraju da bi formirali gen koji kodira vezujući protein koji sadrži (a) teški lanac koji ima humani
1
varijabilni region, humani CH1 region, humani zglobni region, i mišji CH2 i mišji CH3 region; i (b) gen koji kodira imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani varijabilni domen i humani konstantni region.
[0396] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein, zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata, i opciono zamenu svih ili u suštini svih DH genskih segmenata i/ili JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih DH genskih segmenata i/ili humanih JH genskih segmenata, ili opciono zamenu svih ili u suštini svih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih JL genskih segmenata.
[0397] Prema jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH, DH, i JH genskih segmenata sa jednim ili više VL, jednim ili više DH, i jednim ili više J genskih segmenata (npr. Jκ ili Jλ), pri čemu su genski segmenti operativno povezani sa endogenim mišjim zglobnim regionom, pri čemu miš formira rearanžirani lanac imunoglobulinskog gena koji sadrži, od 5’ do 3’ u smeru transkripcije, humani VL -humani ili mišji DH -humani ili mišji J - mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3. Prema jednom aspektu, J region je humani Jκ region. Prema jednom aspektu, J region je humani JH region. Prema jednom aspektu, J region je humani Jλ, region. Prema jednom aspektu, humani VL region je izabran između humanog Vλ regiona i humanog VK regiona.
[0398] Prema specifičnim aspektima, miš izražava samo jedan varijabilni domen antitela koji ima mišji ili humani konstantni region i varijabilni region koji potiče od humanog VK, humanog DH i humanog JK; humanog VK, humanog DH, i humanog JH; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vκ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jκ. Prema specifičnom aspektu, rekombinantne sekvence za prepoznavanje su modifikovane tako da omoguće da dođe do produktivnih rearanžiranja između navedenih V, D, i J genskih segmenata ili između navedenih V i J genskih segmenata.
[0399] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata sa humanim JL genskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region.
11
[0400] Prema jednom aspektu, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen. Prema jednom aspektu, mišu nedostaje sekvenca koja kodira zglobni region. Prema jednom aspektu, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen i zglobni region.
[0401] Prema specifičnom aspektu, miš izražava vezujući protein koji sadrži humani varijabilni domen imunoglobulinskog lakog lanca (λ ili κ) fuzionisan sa mišjim CH2 domenom koji je vezan za mišji CH3 domen.
[0402] Prema jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH i JH genskih segmenata sa humanim JL genskim segmentima.
[0403] Prema jednom aspektu, miš sadrži deleciju genske sekvence konstantnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koja kodira CH1 region, zglobni region, CH1 i zglobni region, ili CH1 region i zglobni region i CH2 region.
[0404] Prema jednom aspektu, miš pravi samo jedan varijabilni domen vezujući protein koji sadrži homodimer izabran između sledećih: (a) humani VL - mišji CH1 -mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VL - mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3; (c) humani VL - mišji CH2 - mišji CH3.
[0405] Prema jednom aspektu, opisan je miš sa onesposobljenim endogenim lokusom imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži onesposobljeni ili izbrisani endogeni mišji ADAM6 lokus, pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja izražava humano ili mišje ili humano/mišje ili drugo himerično antitelo. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna na transgenu integrisanom tako da je slučajno integrisan u mišji genom. Prema jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline na epizomu (npr. hromozomu) se ne nalazi u mišu divljeg tipa.
[0406] Prema jednom aspektu, miš dalje sadrži onesposobljeni endogeni lokus imunoglobulinskog lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, endogeni lokus imunoglobulinskog lakog lanca je izabran između lokusa kapa (κ) i lambda (λ) lakog lanca. Prema specifičnom aspektu, miš sadrži onesposobljeni endogeni lokus κ lakog lanca i onesposobljeni lokus λ lakog lanca, pri čemu miš izražava antitelo koje sadrži varijabilni domen humanog imunoglobulinskog teškog lanca i domen humanog imunoglobulinskog lakog lanca. Prema jednom aspektu, domen humanog imunoglobulinskog lakog lanca je izabran između domena humanog κ lakog lanca i domena humanog λ lakog lanca.
[0407] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana životinja koja izražava himerično antitelo i izražava ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog koji je funkcionalan u genetski modifikovanoj životinji.
[0408] Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je izabrana između miša i pacova. Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je miš, i ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog je od mišjeg soja koji je različit od soja od koga je genetski modifikovana životinja. Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je glodar iz porodice Cricetidae (npr. hrčak, američki pacov ili miš, voluharica), i ortolog ili homolog ADAM6 proteina je od glodara iz porodice Muridae (npr. pravi miš ili pacov, gerbil, bodljikavi miš, grivasti pacov). Prema jednom aspektu, genetski modifikovana životinja je glodar iz porodice Muridae, i ortolog ili homolog ADAM6 proteina je iz glodara iz porodice Cricetidae.
[0409] Prema jednom aspektu, himerično antitelo sadrži humani varijabilni domen i sekvencu konstantnog regiona glodara. Prema jednom aspektu, glodar je izabran između glodara iz porodice Cricetidae i glodara iz porodice Muridae. Prema specifičnom aspektu, glodar iz porodice Cricetidae i iz porodice Muridae je miš. Prema specifičnom aspektu, glodar iz porodice Cricetidae i iz porodice Muridae je pacov. Prema jednom aspektu, himerično antitelo sadrži humani varijabilni domen i konstantni domen od životinje izabrane između miša ili pacova; prema specifičnom aspektu, miš ili pacov je izabran između porodice Cricetidae i porodice Muridae. Prema jednom aspektu, himerično antitelo sadrži varijabilni domen humanog teškog lanca, varijabilni domen humanog lakog lanca i sekvencu konstantnog regiona koja potiče od glodara izabranog između miša i pacova, pri čemu su varijabilni domen humanog teškog lanca i humanog lakog lanca srodni. Prema specifičnom aspektu, srodni obuhvata da su varijabilni domeni humanog teškog lanca i humanog lakog lanca od samo jedne B ćelije koja izražava zajedno varijabilni domen humanog lakog lanca i varijabilni domen humanog teškog lanca i prezentuje varijabilne domene zajedno na površini pojedinačne B ćelije.
[0410] Prema jednom aspektu, himerično antitelo se izražava iz imunoglobulinskog lokusa. Prema jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca himeričnog antitela se izražava iz rearanžiranog endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen lakog lanca himeričnog antitela se izražava iz rearanžiranog endogenog lokusa imunoglobulinskog lakog lanca. Prema jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca himeričnog antitela i/ili varijabilni domen lakog lanca himeričnog antitela se izražava iz rearanžiranog transgena (npr. rearanžirane sekvence nukleinske kiseline koja potiče od nerearanžirane sekvence nukleinske kiseline integrisane u genom životinje na lokusu drugačijem od endogenog imunoglobulinskog lokusa). Prema jednom aspektu, varijabilni domen lakog lanca himeričnog antitela se izražava iz rearanžiranog transgena (npr. rearanžirane sekvence nukleinske kiseline koja potiče od nerearanžirane sekvence nukleinske kiseline integrisane u genom životinje na lokusu drugačijem od endogenog imunoglobulinskog lokusa).
[0411] Prema specifičnom aspektu, transgen se izražava iz transkripciono aktivnog lokusa, npr. ROSA26 lokusa, npr. mišovog (npr. mišjeg) ROSA26 lokusa.
[0412] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja, koja sadrži humanizovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, pri čemu humanizovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca sadrži nehumanu ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.
[0413] Prema jednom aspektu, nehumani ADAM6 ortolog ili homolog je sekvenca koja je ortologa i/ili homologa sa mišjom ADAM6 sekvencom, pri čemu je ortolog ili homolog funkcionalan u nehumanoj životinji.
[0414] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je glodar koji je izabran između miša, pacova i hrčka.
[0415] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je izabrana između miša, pacova, i hrčka i ADAM6 ortologa ili homologa iz nehumane životinje izabrane između miša, pacova, i hrčka. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja je miš i ADAM6 ortolog ili homolog je iz životinje koja je izabrana između različitih vrsta miševa, pacova, i hrčaka. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja je pacov, i ADAM6 ortolog ili homolog je iz glodara koji je izabran između različitih vrsta pacova, miševa, i hrčaka. Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja je hrčak, i ADAM6 ortolog ili homolog je iz glodara koji je izabran između različitih vrsta hrčaka, miševa, i pacova.
[0416] Prema specifičnom aspektu, nehumana životinja je iz podreda Myomorpha, i ADAM6 sekvenca je iz životinje izabrane između glodara iz nadporodice Dipodoidea i glodara iz nadporodice Muroidea. Prema specifičnom aspektu, glodar je miš iz nadporodice Muroidea, i ADAM6 ortolog ili homolog je iz miša ili pacova ili hrčka iz nadporodice Muroidea.
[0417] Prema jednom aspektu, humanizovani lokus teškog lanca sadrži samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili
11
više humanih JH genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata su operativno povezani sa jednim ili više humanih, himeričnih i/ili glodarskih (npr. mišjih ili pacovskih) gena konstantnog regiona. Prema jednom aspektu, geni konstantnog regiona su mišji. Prema jednom aspektu, geni konstantnog regiona su pacovski. Prema jednom aspektu, geni konstantnog regiona su hrčkovi. Prema jednom aspektu, geni konstantnog regiona sadrže sekvencu izabranu između zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. Prema specifičnom aspektu, geni konstantnog regiona sadrže zglobnu, CH2, i CH3 sekvencu.
[0418] Prema jednom aspektu, nehumana ADAM6 sekvenca se graniči sa sekvencom humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena u okviru sekvence humanog imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog teškog lanca sadrži V, D i/ili J genski segment.
[0419] Prema jednom aspektu, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena pored V genskog segmenta. Prema jednom aspektu, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena između dva V genska segmenta. Prema jednom aspektu, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena između V i D genskog segmenta. Prema jednom aspektu, mišja ADAM6 sekvenca je postavljena između V i J genskog segmenta. Prema jednom aspektu, mišja ADAM6 sekvenca je postavljena između D i J genskog segmenta.
[0420] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana nehumana životinja, koja sadrži B ćeliju koja izražava humani VH domen srodan sa humanim VL domenom iz imunoglobulinskog lokusa, pri čemu nehumana životinja izražava neimunoglobulinski nehumani protein iz imunoglobulinskog lokusa. Prema jednom aspektu, neimunoglobulinski nehumani protein je ADAM protein. Prema specifičnom aspektu, ADAM protein je ADAM6 protein ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment.
[0421] Prema jednom aspektu nehumana životinja je glodar (npr. miš ili pacov). Prema jednom aspektu, glodar je iz porodice Muridae. Prema jednom aspektu, glodar je iz potporodice Murinae. Prema specifičnom aspektu, glodar iz potporodice Murinae je izabran između miša i pacova.
[0422] Prema jednom aspektu, neimunoglobulinski nehumani protein je glodarski protein. Prema jednom aspektu, glodar je iz porodice Muridae. Prema jednom aspektu, glodar je iz potporodice Murinae. Prema specifičnom aspektu, glodar je izabran između miša, pacova, i hrčka.
[0423] Prema jednom aspektu, humani VH i VL domeni su vezani direktno ili preko linkera za sekvencu imunoglobulinskog konstantnog domena. Prema specifičnom aspektu, sekvenca konstantnog domena sadrži sekvencu koja je izabrana između zglobne, CH2, CH3, i njihove kombinacije. Prema specifičnom aspektu, humani VL domen je izabran između Vκ ili Vλ domena.
[0424] Prema jednom aspektu, opisana je genetski modifikovana nehumana životinja koja sadrži u svojoj germinativnoj liniji humanu imunoglobulinsku sekvencu, pri čemu je sperma mužjaka nehumane životinje karakterisana defektom migracije in vivo. Prema jednom aspektu, defekat migracije in vivo sadrži nesposobnost sperme mužjaka nehumane životinje da migrira iz materice kroz jajovod ženke nehumane životinje iste vrste. Prema jednom aspektu, nehumanoj životinji nedostaje nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Prema specifičnom aspektu, ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment obuhvata ADAM6a i/ili ADAM6b protein ili njegove funkcionalne fragmente. Prema jednom aspektu, nehumana životinja je glodar. Prema specifičnom aspektu, glodar je izabran između miša, pacova, i hrčka.
[0425] Prema jednom aspektu, opisana je nehumana životinja koja sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu koja se graniči sa nehumanom sekvencom koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. Prema jednom aspektu, nehumana životinja je glodar. Prema specifičnom aspektu, glodar je izabran između miša, pacova, i hrčka.
[0426] Prema jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je sekvenca imunoglobulinskog teškog lanca. Prema jednom aspektu, imunoglobulinska sekvenca sadrži samo jedan VH genski segment. Prema jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više DH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više JH genskih segmenata. Prema jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži samo jedan VH genski segment, jedan ili više DH genskih segmenata i jedan ili više JH genskih segmenata.
[0427] Prema jednom aspektu, imunoglobulinska sekvenca sadrži samo jedan VH genski segment koji je povezan sa polimorfizmom u prirodnim humanim repertoarima. Prema specifičnom aspektu, samo jedan VH genski segment je izabran između
11
humanih VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ili VH3-23. Prema sledećem specifičnom aspektu samo jedan VH genski segment je VH1-2. Prema sledećem specifičnom aspektu, samo jedan VH genski segment je VH1-69.
[0428] Prema jednom aspektu, imunoglobulinska sekvenca sadrži samo jedan VH genski segment koji je povezan sa brojem višestrukih kopija u prirodnim humanim repertoarima. Prema specifičnom aspektu, samo jedan VH genski segment je izabran između humanih VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ili VH3-23. Prema sledećem specifičnom aspektu samo jedan VH genski segment je VH1-2. Prema sledećem specifičnom aspektu, samo jedan VH genski segment je VH1-69.
[0429] Prema različitim aspektima, VH genski segment je izabran između VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 i VH3-74.
[0430] Prema različitim aspektima, VH genski segment je izabran iz Tabele 1 i predstavljen je u prirodnim humanim repertoarima sa pet ili više alela. Prema specifičnom aspektu VH gen je izabran između VH1-2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 i VH7-4-1.
[0431] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš, i miš sadrži zamenu endogenih mišjih VH genskih segmenata sa samo jednim humanim VH genskim segmentom, pri čemu je humani VH genski segment operativno povezan sa genom mišjeg CH regiona, tako da miš rearanžira humani VH genski segment i izražava reverzni himerični imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani VH domen i mišji CH. Prema jednom aspektu, 90-100% nerearanžirani mišji VH genski segmenti su zamenjeni sa jednim nerearanžiranim humanim VH genskim segmentom. Prema specifičnom aspektu, svi ili u suštini svi endogeni mišji VH genski segmenti su zamenjeni sa jednim nerearanžiranim humanim VH genskim segmentom. Prema jednom aspektu, zamena je sa nerearanžiranim humanim VH1-69 genskim segmentom. Prema jednom aspektu, zamena je sa nerearanžiranim humanim VH1-2 genskim segmentom. Prema jednom aspektu, zamena je sa nerearanžiranim humanim VH2-26 genskim segmentom. Prema jednom aspektu, zamena je sa nerearanžiranim humanim VH2-70 genskim segmentom. Prema jednom aspektu, zamena je sa nerearanžiranim humanim VH3-23 genskim segmentom.
11
[0432] Prema jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih mišjih DH i JH segmenata sa najmanje jednim nerearanžiranim humanim DH segmentom i najmanje jednim nerearanžiranim humanim JH segmentom. Prema jednom aspektu, najmanje jedan nerearanžirani humani DH segment je izabran između 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, i njihove kombinacije. Prema jednom aspektu, najmanje jedan nerearanžirani humani JH segment je izabran između 1, 2, 3, 4, 5, 6, i njihove kombinacije.
[0433] Prema različitim aspektima, humana imunoglobulinska sekvenca je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji nehumane životinje (npr. glodara, npr. miša, pacova, ili hrčka). Prema jednom aspektu, konstantni region je humani, himerični humani/mišji ili himerični humani/pacovski ili himerični humani/hrčkov, mišji, pacovski, ili hrčkov konstantni region. Prema jednom aspektu, konstantni region je glodarski (npr. mišji ili pacovski ili hrčkov) konstantni region. Prema specifičnom aspektu, glodar je miš ili pacov. Prema različitim aspektima, konstantni region sadrži bar CH2 domen i CH3 domen.
[0434] Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog teškog lanca je locirana na lokusu imunoglobulinskog teškog lanca u germinativnoj liniji nehumane životinje (npr. glodara, npr. miša ili pacova ili hrčka). Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog teškog lanca je locirana na lokusu neimunoglobulinskog teškog lanca u germinativnoj liniji nehumane životinje, pri čemu je lokus ne-teškog lanca transkripciono aktivni lokus. Prema specifičnom aspektu, lokus ne-teškog lanca je ROSA26 lokus.
[0435] Prema različitim aspektima, nehumana životinja dalje sadrži sekvencu humanog imunoglobulinskog lakog lanca (npr. jednu ili više nerearanžiranih V i J sekvenci lakog lanca, ili jednu ili više rearanžiranih VJ sekvenci) u germinativnoj liniji nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, sekvenca imunoglobulinskog lakog lanca je sekvenca imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži jedan ili više VL genskih segmenata. Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži jedan ili više JL genskih segmenata. Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži jedan ili više VL genskih segmenata i jedan ili više JL genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži najmanje 16 Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, sekvenca humanog
11
imunoglobulinskog lakog lanca sadrži najmanje 30 Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata. Prema specifičnom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži najmanje 40 Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata. Prema različitim aspektima, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji nehumane životinje (npr. glodara, npr. miša ili pacova ili hrčka). Prema jednom aspektu, konstantni region je humani, himerični humani/glodarski, mišji, pacovski, ili hrčkov konstantni region. Prema specifičnom aspektu, konstantni region je mišji ili pacovski konstantni region. Prema specifičnom aspektu, konstantni region je mišji κ konstantni (mCκ) region ili pacovski κ konstantni (rCκ) region.
[0436] Prema jednom aspektu, nehumana životinja je miš i miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih Vκ i Jκ genskih segmenata sa najmanje šest humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. Prema jednom aspektu, svi ili u suštini svi Vκ i Jκ genski segmenti su zamenjeni sa najmanje 16 humanih Vκ genskih segmenata (humanih Vκ) i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. Prema jednom aspektu, svi ili u suštini svi Vκ i Jκ genski segmenti su zamenjeni sa najmanje 30 humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. Prema jednom aspektu, svi ili u suštini svi Vκ i Jκ genski segmenti su zamenjeni sa najmanje 40 humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. Prema jednom aspektu, najmanje jedan Jκ genski segment sadrži dva, tri, četiri, ili pet humanih Jκ genskih segmenata.
[0437] Prema jednom aspektu, humani Vκ genski segmenti sadrže Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, i Vκ1-6. Prema jednom aspektu, Vκ genski segmenti sadrže Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15 i Vκ1-16. Prema jednom aspektu, humani Vκ genski segmenti sadrže Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, i Vκ2-30. Prema jednom aspektu, humani Vκ genski segmenti sadrže Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i Vκ2-40.
[0438] Prema specifičnom aspektu, Vκ genski segmenti sadrže susedne humane imunoglobulinske κ genske segmente koji obuhvataju lokus humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca od Vκ4-1 do Vκ2-40, i Jκ genski segmenti sadrže susedne genske segmente koji obuhvataju lokus humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca od Jκ1 do Jκ5.
11
[0439] Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca je locirana na lokusu imunoglobulinskog lakog lanca u germinativnoj liniji nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, lokus imunoglobulinskog lakog lanca u germinativnoj liniji nehumane životinje je lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca. Prema jednom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca je locirana na lokusu neimunoglobulinskog lakog lanca u germinativnoj liniji nehumane životinje koji je transkripciono aktivan. Prema specifičnom aspektu, neimunoglobulinski lokus je ROSA26 lokus.
[0440] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje humanog antitela, pri čemu humano antitelo sadrži varijabilne domene koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona kodiranoj u ćeliji ovde opisane nehumane životinje.
[0441] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje anti-idiotipskog antitela, pri čemu anti-idiotipsko antitelo sadrži varijabilne domene koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona kodiranoj u ćeliji ovde opisane nehumane životinje, pri čemu postupak sadrži izlaganje ovde opisane nehumane životinje antitelu koje sadrži humane varijabilne domene. Prema jednom aspektu, antiidiotipsko antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje humanog varijabilnog domena teškog lanca. Prema jednom aspektu, antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca.
[0442] Prema specifičnom aspektu, anti-idiotipsko antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog teškog lanca, pri čemu varijabilni domen humanog teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 i VH3-74.
[0443] Prema specifičnom aspektu, anti-idiotipsko antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog teškog lanca, pri čemu varijabilni domen humanog teškog lanca sadrži rearanžirani humani VH genski segment koji je izabran između VH1-2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 i VH7-4-1.
11
[0444] Prema specifičnom aspektu, anti-idiotipsko antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca, pri čemu varijabilni domen humanog lakog lanca sadrži rearanžirani humani Vκ genski segment koji je izabran između Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i Vκ2-40.
[0445] Prema specifičnom aspektu, anti-idiotipsko antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca, pri čemu varijabilni domen humanog lakog lanca sadrži rearanžirani humani Vκ1-39 genski segment.
[0446] Prema specifičnom aspektu, anti-idiotipsko antitelo je specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca, pri čemu varijabilni domen humanog lakog lanca sadrži rearanžirani humani Vλ genski segment koji je izabran između Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, Vλ3-32, Vλ2-33, Vλ2-34, Vλ1-36, Vλ1-40, Vλ7-43, Vλ1-44, Mλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ5-48, Vλ9-49, Vλ1-50, Vλ1-51, Vλ5-52, Vλ10-54, Vλ11-55, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61, i Vλ4-69.
[0447] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje anti-idiotipskog antitela, pri čemu anti-idiotipsko antitelo sadrži varijabilne domene koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnih regiona kodiranih u ćeliji nehumane životinje koja sadrži ograničeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment, 27 DH genskih segmenata, i šest JH genskih segmenata, i pri čemu je anti-idiotipsko antitelo specifično za ili je sposobno za vezivanje za varijabilni domen humanog teškog lanca koji sadrži rearanžirani humani VH1-69 genski segment, pri čemu taj postupak sadrži izlaganje nehumane životinje antitelu koje sadrži rearanžirani humani VH1-69 genski segment i izolaciju antiidiotipskog antitela iz nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, samo jedan humani VH genski segment je izabran između humanog VH1-2 i humanog VH1-69 genskog segmenta.
[0448] Prema jednom aspektu, opisan je postupak za dobijanje anti-idiotipskog antitela, pri čemu anti-idiotipsko antitelo sadrži varijabilne domene koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnih regiona kodiranih u ćeliji nehumane životinje koja sadrži ograničeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži samo
12
jedan humani VH genski segment, 27 DH genskih segmenata, i šest JH genskih segmenata, i pri čemu je anti-idiotipsko antitelo specifično za ili je sposobno za vezivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca koji sadrži rearanžirani humani Vκ1-39 genski segment, pri čemu taj postupak sadrži izlaganje nehumane životinje antitelu koje sadrži humani Vκ1-39 genski segment i izolaciju antitela iz nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, samo jedan humani VH genski segment je izabran između humanog VH1-2 i humanog VH1-69 genskog segmenta.
[0449] Prema jednom aspektu, opisana je farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid koji sadrži antitelo ili fragment antitela koji potiče od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnih regiona izolovanih iz ovde opisane nehumane životinje. Prema jednom aspektu, polipeptid je antitelo. Prema jednom aspektu, polipeptid je samo teški lanac antitela. Prema jednom aspektu, polipeptid je samo jedan varijabilni fragment lanca (npr. scFv).
[0450] Prema jednom aspektu, opisana je primena ovde opisane nehumane životinje za dobijanje antitela. Prema različitim aspektima, antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona izolovane iz nehumane životinje. Prema specifičnom aspektu, sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrže genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca. Prema specifičnom aspektu, sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrže genske segmente imunoglobulinskog lakog lanca.
PRIMERI
[0451] Sledeći primeri su predviđeni za opisivanje za one koji su prosečni stručnjaci u odgovarajućoj oblasti kako da izvedu i primene ovde opisane postupke i kompozicije. Osim ako nije drugačije specifikovano, temperatura je navedena u Celzijusima, a pritisak je atmosferski ili približno atmosferski.
Primer 1
Konstrukcija ograničenog humanizovanog IgH lokusa
[0452] Jedinstveni inženjeringom dobijeni lokus humanog teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment lociran uzvodno od svih humanih DH i JH genskih segmenata može biti konstruisan homologom rekombinacijom uz korišćenje Bakterijske veštačke hromozomske (BAC) DNK. Ilustrativni humani VH genski segmenti koji se upotrebljavaju za konstrukciju takvog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca obuhvataju polimorfne VH genske segmente i/ili VH genske segmente povezane sa varijacijom broja kopija, kao što su, na primer VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, i VH3-23. VELOCIGENE® tehnologija genetskog inženjeringa se može primeniti za kreiranje lokusa teškog lanca koji sadrži samo jedan VH uz korišćenje nekoliko ciljajućih konstrukata (vidi, npr. US pat. br. 6,586,251 i Valenzuela, D.M. et al., 2003, High-throughput engineering of mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnology 21(6): 652-659).
[0453] Ilustrativna strategija za konstrukciju humanog VH1-69 ograničenog IgH lokusa (FIG. 1). U prvom koraku modifikovani humani BAC koji je sadržao više distalnih (5’) humanih VH genskih segmenata, uključujući VH1-69, uzvodnu selekcionu kasetu (npr. higromicinsku) i 5’ mišji homologi krak, je bio ciljan homologom rekombinacijom sa drugom selekcionom kasetom (npr. spektinomicinskom), koja je takođe sadržala modifikovanu rekombinantnu signalnu sekvencu (Korak 1, FIG. 1). Ova modifikovana rekombinantna signalna sekvenca (RSS) je uvela dva mesta mutacija (T do A i G do A) u 3’ RSS regionu humanog VH1-69 gena koji menja RSS nonamer sa optimalnom konsensuznom sekvencom. Shodno tome, Korak 1 je rezultovao humanim genomskim fragmentom koji je sadržao humani VH1-69 genski segment sa modifikovanim 3’ RSS, jedinstvenim AsiSI restrikcionim mestom oko 180 bp nizvodno od RSS i spektinomicinskom kasetom.
[0454] Korak 2 uključivao je korišćenje neomicinske (Neo) kasete okružene Frt mestima da bi se izabrala selekciona kaseta (higromicinska) i dodatni uzvodni (5’) humani VH genski segmenti. Ova modifikacija je bila ciljana, homologom rekombinacijom, da bi 5’ do humanog VH1-69 genskog segmenta ostao intaktan oko 8.2 kb od regiona promotera humanog VH1-69 i 5’ mišjeg homologog kraka.
[0455] Korak 3 je sadržao sledeću selekcionu kasetu (spektinomicinsku) okruženu jedinstvenim inženjeringom dobijenim restrikcionim mestima (npr. Pl-Scel i AsiSI) ciljanjem homologom rekombinacijom na humani genomski fragment koji je sadržao prva tri funkcionalna humana VH genska segmenta i sve humane DH i JH genske segmente (FIG. 1). Humani genomski fragment je prethodno bio ciljan homologom rekombinacijom sa neomicinskom kasetom i sadržao je 5’ i 3’ homologe krakove koji su sadržali mišju genomsku sekvencu 5’ i 3’ endogenog lokusa teškog lanca uključujući 3’ intronski pojačavač i IgM gen. Ova modifikacija je izbrisala 5’ mišju genomsku sekvencu i humane VH genske segmente, ostavljajući oko 3.3 kb VH-DH intergenskog regiona uzvodno od humanog DH1-1 genskog segmenta, sve humane DH i JH segmente, i 3’ mišji genomski fragment koji je sadržao 3’ intronski pojačavač i IgM gen (FIG.1).
[0456] Korak 4 je bio ostvaren korišćenjem jedinstvenih restrikcionih mesta (opisanih gore) za sečenje praćenim ligacijom dva modifikovana BACs iz Koraka 2 i Koraka 3, čime je dobijen finalni ciljajući konstrukt. Finalni ciljajući konstrukt za kreiranje modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži humani VH1-69 genski segment, sve humane DH, i sve humane JH genske segmente u ES ćelijama je sadržao, od 5’ do 3’, 5’ homologi krak koji je sadržao oko 20 kb mišje genomske sekvence uzvodno od endogenog lokusa teškog lanca, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, oko 8.2 kb humanog VH1-69 promotera, humani VH1-69 genski segment sa modifikovanim 3’ RSS, 27 humanih DH genskih segmenata, šest humanih JH segmenata, i 3’ homologi krak koji sadrži oko 8 kb mišje genomske sekvence nizvodnih mišjih JH genskih segmenata koji sadrže 3’ intronski pojačavač i IgM gen (FIG.1).
[0457] Ilustrativna strategija za konstrukciju humanog VH1-2 ograničenog IgH lokusa (FIG. 2). Na sličan način, drugi polimorfni VH genski segmenti u kontekstu konstantnih regiona mišjeg teškog lanca se koriste za konstrukciju niza miševa koji imaju ograničeni broj V segmenata imunoglobulinskog teškog lanca (npr.1, 2, 3, 4, ili 5), pri čemu su V segmenti polimorfne varijante člana familije V gena. Ilustrativni polimorfni VH genski segmenti potiču od humanih VH genskih segmenata uključujući, npr. VH1-2, VH2-26, VH2-70 i VH3-23. Takvi humani VH genski segmenti se dobijaju, npr. pomoću de novo sinteze (npr. Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) uz korišćenje sekvenci koje su raspoložive u publikovanim bazama podataka. Shodno tome, DNK fragmenti koji kodiraju svaki VH gen su, prema nekim aspektima, generisani nezavisno radi ugrađivanja u ciljajuće vektore, kao što je ovde opisano. Na ovaj način je genetskim inženjeringom dobijeno više modifikovanih lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrže ograničeni broj VH genskih segmenata u kontekstu konstantnih regiona mišjeg teškog lanca. Ilustrativna ciljajuća strategija za kreiranje ograničenog humanizovanog lokusa teškog lanca koji sadrži humani VH1-2 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata je prikazana na FIG.2.
12
[0458] Ukratko, modifikovani humani BAC klon koji sadrži tri humana VH genska segmenta (VH6-1, VH1-2, VH1-3), 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata (vidi USSN 13/404,075; podneta 24. februara 2012.) se koristi za kreiranje ograničenog lokusa humanizovanog teškog lanca koji sadrži humani VH1-2 genski segment. Ovaj modifikovani BAC klon funkcionalno povezuje gore navedene humane genske segmente teškog lanca sa mišjim intronskim pojačavačem i IgM konstantnim regionom. Ograničeni humani, na VH1-2 bazirani lokus teškog lanca je dobijen pomoću dve homologe rekombinacije korišćenjem gore opisanog modifikovanog humanog BAC klona. U prvoj homologoj rekombinaciji, 205 bp humanog VH6-1 genskog segmenta (od oko 10 bp uzvodno (5’) od VH6-1 start kodona u egzonu 1 do oko 63 bp nizvodno (3’) od početka egzona 2) u modifikovanom humanom BAC klonu je izbrisano bakterijskom homologom rekombinacijom uz korišćenje spektinomicinske (aadA) kasete okružene jedinstvenim Pl-Scel restrikcionim mestima (FIG. 2, BHR 1). Ovo omogućava sukcesivno odstranjivanje aadA kasete bez kidanja drugih humanih genskih segmenata u okviru ograničenog lokusa teškog lanca. U drugoj homologoj rekombinaciji, 5’ kraj modifikovanog humanog BAC klona koji sadrži celi humani VH1-3 genski segment i oko 60 bp nizvodno (3’) od genskog segmenta je obrisan homologom rekombinacijom uz korišćenje higromicinske kasete koja sadrži susedna 5’ AsiSl i 3’ Ascl restrikciona mesta (FIG.2, BHR 2). Kao što je gore opisano, spektinomicinska kaseta se opciono uklanja posle potvrde finalnog ciljajućeg vektora koji sadrži deleciju dva humana VH genska segmenta koji okružuju humani VH1-2 genski segment (FIG. 2, dole). Ilustrativni humani VH1-2 ciljajući vektor je prikazan u SEQ ID NO: 75.
[0459] Korišćenje polimorfnih VH genskih segmenata u ograničenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca predstavlja novi pristup za generisanje antitela, populacija antitela, i populacija B ćelija koje izražavaju antitela koja imaju teške lance sa raznovrsnim CDRs koji potiču od samo jednog humanog VH genskog segmenta. Korišćenje mašinerije somatske hipermutacije životinje domaćina zajedno sa kombinatornom asocijacijom sa rearanžiranim varijabilnim domenima humanog imunoglobulinskog lakog lanca rezultuje inženjeringom jedinstvenih teških lanaca i jedinstvenim VH/VL parovima koji proširuju imuni repertoar genetski modifikovanih životinja i povećavaju njihovu korisnost kao platforme sledeće generacije za dobijanje humanih terapeutika, a naročito korisnost kao platforme za dobijanje neutralizujućih antitela specifičnih za humane patogene.
[0460] Na bazi finalne željene strukture lokusa, jedan od drugih humanih VH genskih segmenata može biti zamenjen na sličan način uz korišćenje humanih BAC klonova koji sadrže željeni humani VH genski segment. Shodno tome, korišćenje gore opisane strategije za ugrađivanje dodatnih i/ili drugih polimorfnih VH genskih segmenata u lokus mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca omogućava generisanje novih repertoara antitela za primenu u neutralizaciji humanih patogena koji bi inače mogli da efektivno ugroze imuni sistem domaćina.
[0461] Gore opisane ciljane ES ćelije su korišćene kao ES ćelije donora i uvedene su u mišji embrion u stadijumu od 8-ćelija pomoću VELOCIMOUSE® postupka (supra). Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment, sve humane DH i JH genske segmente operativno povezane sa genima mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona su identifikovani genotipizacijom uz korišćenje modifikacije alelskog testa (Valenzuela et al., supra) koji je detektovao prisustvo neomicinske kasete, humanog VH genskog segmenta i regiona u okviru humanih DH i JH genskih segmenata, kao i endogenih sekvenci teškog lanca. Tabela 3 prikazuje prajmere i probe koji su bili upotrebljeni za potvrdu da miševi nose ograničeni lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH1-69 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata i šest humanih JH genskih segmenata.
[0462] Miševi koji nose inženjeringom dobijeni lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment se mogu ukrštati sa sojem FLPe deletorskih miševa (vidi, npr. Rodriguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25: 139-140) da bi se uklonila bilo koja Frt’ed neomicinska kaseta koja je uvedena ciljajućim vektorom koji nije odstranjen, npr. u stadijumu ES ćelija ili u embrionu. Opciono, neomicinska kaseta se zadržava u miševima.
[0463] Mladunci su genotipizirani i mladunci koji su heterozigotni za humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment, sve humane DH i JH segmente operativno povezane sa endogenim mišjim imunoglobulinskim konstantnim genima su izabrani za karakterizaciju repertoara imunoglobulinskog teškog lanca.
12
Primer 2
Reinženjering ADAM gena u ograničeni humanizovani IgH lokus
[0464] Miševima sa humanizovanim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca u kojima su endogeni genski segmenti varijabilnog regiona (VDJ) zamenjeni i/ili izbrisani nedostaje ekspresija endogenih ADAM6 gena. Naročito, mužjake miševa koji sadrže takve humanizovane lokuse imunoglobulinskog teškog lanca odlikuje smanjenje
12
plodnosti. Shodno tome, sposobnost da izraze ADAM6 je bila reinženjeringom vraćena u miševe sa humanizovanim, ali ograničenim lokusima teškog lanca da bi se održali sojevi modifikovanih miševa korišćenjem normalnih metoda parenja.
[0465] Reinženjering ADAM6 gena u humani VH1-69 ograničeni IgH lokus (FIG.
3). Ograničeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji je sadržao samo jedan humani VH1-69 genski segment lociran uzvodno od svih humanih DH i JH genskih segmenata je bio podvrgnut reinženjeringu da bi sadržao genomski fragment koji kodira mišji ADAM6a i ADAM6b (SEQ ID NO: 77) homologom rekombinacijom uz korišćenje BAC DNK. Ovo je bilo izvedeno pomoću VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (supra) u nizu od šest koraka koji su sadržali modifikaciju BAC DNK koja je sadržala mišje i humane sekvence koja je dala finalni ciljajući vektor koji je sadržao ograničeni humanizovani lokus teškog lanca koji se graniči sa konstantnim regionima mišjeg teškog lanca i mišjim ADAM6 genima.
[0466] Prvo je mišji genomski fragment koji kodira mišji ADAM6a i ADAM6b bio pripremljen za inserciju u humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan VH genski segment nizom od tri bakterijske homologe rekombinacije koje su obuhvatale različite selekcione kasete za jedinstveno pozicioniranje restrikcionih mesta oko mišjih ADAM6 gena (FIG.3, koraci 1 - 3). U prvom koraku, mišja BAC DNK koja sadrži deo lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca je bila ciljana neomicinskom kasetom okruženom sa rekombinacionim mestima, koja je bila podvrgnuta genetskom inženjeringu tako da sadrži jedinstvena AsiSI restrikciona mesta. U drugom koraku, modifikovani mišji fragment koji sadrži mišje ADAM6 gene i neomicinsku kasetu je onda bio ciljan da bi se izbrisali mišji DH i JH genski segmenti i zamenili sa spektinomicinskom kasetom koja je sadržala jedinstveno Ascl restrikciono mesto pozicionirano kod 5’ selekcionog gena. U trećem koraku, dvostruko modifikovani mišji fragment koji sadrži neomicinsku kasetu pozicioniran između mišjih ADAM6 gena i spektinomicinske kasete je bio ciljan da bi se zamenila neomicinska kaseta sa higromicinskom kasetom. Ovo je bilo izvedeno tako da je modifikovani mišji genomski fragment koji sadrži ADAM6 gene mogao biti umetnut ligacijom kompatibilnih genomskih fragmenata u humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan VH genski segment.
[0467] U koraku četiri, humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži humani VH1-69 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata je bio odvojeno ciljan bakterijskom homologom rekombinacijom sa
12
spektinomicinskom kasetom koja sadrži jedinstvena I-Ceul i Ascl restrikciona mesta na 5’ i 3’ lokacijama u kaseti, respektivno (FIG. 3, gore levo). Posle ovog koraka, modifikovani genomski fragment koji sadrži ograničeni humanizovani lokus teškog lanca, neomicinsku i spektinomicinsku kasetu i modifikovani mišji fragment koji sadrži ADAM6 gene, higromicinsku i spektinomicinsku kasetu su bili odvojeno digestirani sa I-Ceul i Ascl restrikcionim enzimima da bi se napravili modifikovani genomski fragmenti za ligaciju (FIG.3, sredina). U koraku pet, odgovarajući digestirani genomski fragmenti su bili prečišćeni i ligatirani zajedno da bi se dobio reinženjeringovani humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, šest humanih JH genskih segmenata i integrisani mišji genomski fragment koji kodira ADAM6a i ADAM6b sa neomicinskom i higromicinskom rezistencijom. U završnom koraku (korak 6), higromicinska kaseta je bila izbrisana AsiSI digestijom praćenom religacijom kompatibilnih krajeva.
[0468] Ovim korakom je proizveden finalni ciljajući vektor za reinserciju mišjih ADAM6a i ADAM6b sekvenci u ograničeni humanizovani lokus teškog lanca, koji je sadržao, od 5’ do 3’, 5’ homologi krak koji sadrži oko 20 kb mišje genomske sekvence uzvodno od endogenog lokusa teškog lanca, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, oko 8.2 kb humanog VH1-69 promotera, humani VH1-69 genski segment sa modifikovanim 3’ RSS, mišji genomski fragment koji sadrži oko 17711 bp mišje genomske sekvence uključujući mišje ADAM6a i ADAM6b gene (SEQ ID NO: 77), humani genomski fragment koji sadrži 27 humanih DH i šest humanih JH genskih segmenata, i 3’ homologi krak koji sadrži oko 8 kb mišje genomske sekvence nizvodno od endogenog lokusa teškog lanca koji sadrži intronski pojačavač i gen IgM konstantnog regiona (humani VH1-69/A6 ciljajući vektor, SEQ ID NO: 74; FIG.3, dole).
Reinženjering ADAM6 gena u humani VH1-2 ograničeni IgH lokus (FIG.4).
[0469] Ograničeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži samo jedan humani VH1-2 genski segment lociran uzvodno od svih humanih DH i JH genskih segmenata je podvrgnut reinženjeringu da bi sadržao genomski fragment koji kodira mišji ADAM6a i ADAM6b (SEQ ID NO: 73) homologom rekombinacijom uz korišćenje BAC DNK. Ovo je ostvareno VELOCIGENE® tehnologijom genetskog inženjeringa (supra) u nizu koraka koji su obuhvatali modifikaciju BAC DNK koja sadrži mišje i humane sekvence, a koja je dala finalni ciljajući vektor koji sadrži ograničeni
12
humanizovani lokus teškog lanca koji se graniči sa konstantnim regionima mišjeg teškog lanca i mišjim ADAM6 genima.
[0470] Modifikovani humani BAC klon koji sadrži samo jedan humani VH1-2 genski segment okružen sa 5’ higromicinskom i 3’ spektinomicinskom kasetom, 27 humanih DH genskih segmenata, šest humanih JH genskih segmenata, intronski pojačavač mišjeg teškog lanca, i mišji IgM konstantni region (opisan gore u Primeru 1) je bio modifikovan da bi sadržao genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene. Ovo je ostvareno postupkom modifikovanog izotermnog DNK spajanja koji se ovde naziva oligo-posredovanim izotermnim spajanjem, koji je baziran na postupku koji je opisan u Gibson et al. (2009, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods 6(5):343-345). Ovaj modifikovani postupak ne zahteva identičnost sekvenci između ligatiranih fragmenata. Umesto toga, identičnost sekvenci je preneta pomoću oligo koji služi za spajanje dva fragmenta. Dalje, oligo služi kao šablon koji dodaje identičnost sekvenci na kraj jednog od fragmenata. Produženi fragment omogućava hibridizaciju sa drugim fragmentom. Specifično, oligoposredovano izotermno spajanje je bilo upotrebljeno za zamenu higromicinske kasete sa Notl-Ascl fragmentom koji sadrži 20 kb distalni mišji IgH homologi krak, mišji ADAM6a gen, neomicinsku kasetu okruženu Frt mestima, i mišji ADAM6b gen.
[0471] Ukratko, modifikovani humani BAC klon koji sadrži ograničeni humani VH1-2 lokus teškog lanca (FIG.4, gore levo) je digestiran sa AsiSI i Ascl da bi se odstranila higromicinska kaseta, i modifikovani mišji BAC koji sadrži mišje ADAM6 gene (FIG.4, gore desno) je digestiran sa Notl i Ascl da bi se odstranio fragment koji sadrži 5’ mišji krak i oslobodili mišji ADAM6 geni koji okružuju neomicinsku kasetu. Dva digestirana BAC fragmenta su posle toga pomešana zajedno sa 5’ i 3’ spojnim oligonukleotidima i inkubirana su 1 sat na 50°C u smeši za reakciju spajanja (T5 egzonukleaza, Phusion DNK polimeraza, Taq DNK ligaza, 10mM DTT, 5% PEG8000 (w/v), 1mM NAD, 0.2mM dNTPs, 10mM MgCl2, i 100mM Tris-HCI).5’ spojni oligo sadrži 38 bp preklapanje sa sekvencom 5’ od AsiSI mesta modifikovanog humanog BAC klona koji sadrži humani VH1-2, i 30 bp preklapanje sa Notl mestom i susednom 3’ sekvencom modifikovanog mišjeg BAC klona koji sadrži ADAM6 gene.3’ spojni oligo sadrži 26 bp preklapanje sa sekvencom 5’ od Ascl mesta modifikovanog mišjeg BAC klona koji sadrži ADAM6 gene, Ascl mesto, i 35 bp preklapanje sa sekvencom 3’ Ascl mesta modifikovanog humanog BAC klona koji sadrži humani VH1-2. Reakcija spajanja je transformisana u E. coli i korektni proizvod je bio izabran selekcijom sa kanamicinom i spektinomicinom.
12
Da bi se napravio finalni ciljajući vektor, spektinomicinska kaseta je odstranjena Pl-Scel digestijom praćenom religacijom.
[0472] Finalni ciljajući vektor sadrži, od 5’ do 3’, 20 kb distalni mišji IgH homologi krak, mišji ADAM6a gen, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, mišji ADAM6b gen, ~18 kb humani genomski fragment, humani VH1-2 genski segment, ~46.6 kb humani genomski fragment, inaktivirani humani VH6-1 genski segment, 27 humanih DH genskih segmenata, šest humanih JH genskih segmenata, i 8 kb 3’ mišji homologi krak koji sadrži mišji IgH intronski pojačavač i IgM konstantni region (SEQ ID NO: 76)
[0473] Svaki od finalnih ciljajućih vektora (opisanih gore) je bio upotrebljen za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje su sadržale izbrisani endogeni lokus teškog lanca da bi se napravile modifikovane ES ćelije koje sadrže mišju genomsku sekvencu ektopično postavljenu tako da sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence u okviru ograničenog humanizovanog lokusa teškog lanca. Pozitivne ES ćelije koje sadrže ektopični mišji genomski fragment u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca su bile identifikovane kvantitativnim PCR testom uz korišćenje TAQMAN™ proba (Lie i Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5’nuclease assays, Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48).
[0474] Ciljane ES ćelije koje su opisane gore su bile upotrebljene kao ES ćelije donora i uvedene su u mišji embrion u stadijumu od 8-ćelija pomoću VELOCIMOUSE® postupka inženjeringa miševa (vidi, npr. US pat. br. 7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ograničeni broj humanih genskih segmenata i ektopičnu mišju genomsku sekvencu koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence su bili identifikovani genotipizacijom uz korišćenje modifikacije alelskog testa (Valenzuela et al., 2003) koji je detektovao prisustvo mišjih ADAM6a i ADAM6b gena u okviru ograničenog humanizovanog lokusa teškog lanca, kao i sekvenci humanog teškog lanca.
[0475] Mladunci su genotipizirani, pa je izabran mladunac koji je heterozigotan za ograničeni humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopični mišji genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence za karakterizaciju ekspresije mišjeg ADAM6 gena i plodnosti.
1
11
��
�
14
1
1
�
�
�
14
��
��
��
��
��
��
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
�
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
�
�
�
�
1
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
�
21
22
�
24
�
�
�
�
�
��
��
��
��
��
��
��
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
�
21
22
�
��
�
�
�
2
�
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
�
�
�
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
�
2
�

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Postupak dobijanja sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca iz miša, gde sekvenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca potiče iz humanog VH1-69 genskog segmenta ili humanog VH1-2 genskog segmenta, gde postupak obuhvata:
(a) imuniziranje miša sa antigenom od interesa, pri čemu miš sadrži u svom genomu:
(i) nerearanžiranu humanu genomsku sekvencu koja sadrži samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata, pri čemu su samo jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata operativno povezane sa genom konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, i pri čemu je samo jedan humani VH genski segment VH1-2, VH1-69, ili njihova polimorfna varijanta; i
(ii) sekvencu koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i sekvencu koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu su mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment funkcionalni kod mužjaka miša, pri čemu su pomenute kodirajuće sekvence smeštene na poziciji koja je različita od ADAM6 lokusa miša divljeg tipa; i
gde miš nije u stanju da obrazuje sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koja ne potiče od humanog VH1-69 genskog segmenta ili humanog VH1-2 genskog segmenta;
(b) dopuštanje pomenutom mišu da razvije imuni odgovor na antigen od interesa; i,
(c) identifikaciju ili izolaciju sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca iz miša, gde sekvenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog teškog lanca kodira varijabilni domen humanog imunoglobulinskog teškog lanca antitela koje se vezuje za antigen od interesa.
2. Postupak prema zahtevu 1, gde miš dalje sadrži u svom genomu:
nerearanžiranu humanu genomsku sekvencu koja sadrži jedan ili više humanih VL genskih segmenata i jedan ili više humanih JL genskih segmenata operativno vezanih za konstantan region gena mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca.
3. Postupak za dobijanje potpuno humanizovanog antitela specifičnog za antigen od interesa, koji obuhvata imunizaciju miša koji je definisan u patentnom zahtevu 2 sa pomenutim antigenom, izolovanje bar jedne ćelije iz miša koja proizvodi reverznohimerno mišje-humano antitelo specifično za antigen, dobijanje bar jedne ćelije koja proizvodi potpuno humanizovano antitelo koje potiče iz reverzno himernog mišjeg-humanog antitela specifičnog za antigen, kultivisanje bar jedne ćelije koja proizvodi potpuno humanizovano humano antitelo, i dobijanje pomenutog potpuno humanizovanog antitela.
4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-3, gde pojedinačni humani VH genski segment je polimorfna varijanta VH1-2 ili VH1-69.
5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-4, gde sekvenca koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i sekvenca koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment su:
(i) prisutne na položaju u mišjem genomu koji je drugačiji od endogenog mišjeg lokusa imunoglobulina teškog lanca ; ili
(ii) susedne ili se graniče sa nerearanžiranom humanom genomskom sekvencom.
6. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde nerearanžirana humana genomska sekvenca koja sadrži jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata je prisutna na endogenom lokusu mišijeg imunoglobulinskog teškog lanca.
7. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde :
4
nerearanžirana humana genomska sekvenca koja sadrži jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata je prisutna na endogenom lokusu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, i
sekvenca koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i sekvenca koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment su prisutne na položaju u mišjem genomu koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca.
8. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde miš sadrži deleciju svih funkcionalnih endogenih VH genskih segmenata.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde konstantni region gena mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca je endogeni lokus mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca.
10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde jedan humani VH genski segment je VH1-69.
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-9, gde jedan humani VH genski segment je VH1-2.
12. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde :
(i) nerearanžirana humana genomska sekvenca sadrži jedan humani VH genski segment, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata koji sadrže humani VH1-69 genski segment, dvadeset sedam humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata ; ili
(ii) nerearanžirana humana genomska sekvenca sadrži jedan humani VH genski segment , jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata koji sadrže humani VH1-2 genski segment, dvadeset sedam humanih DH genskih segmenata, i šest humanih JH genskih segmenata.
41
13. Postupak prema zahtevu 12, gde jedan ili više humanih VL genskih segmenata i jedan ili više humanih JL genskih segmenata su jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata.
14. Postupak prema zahtevu 13, gde jedan ili više humanih genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata je prisutno na endogenom lokusu mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca.
15. Postupak prema zahtevu 3 ili prema bilo kom od zahteva 4-14 zavisnih od zahteva 3, gde bar jedna ćelija izolovana iz miša koji proizvodi reverzno-himerno mišjehumano antitelo specifično za antigen je splenocit ili B ćelija.
RS20210879A 2012-06-12 2013-03-07 Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca RS62121B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261658466P 2012-06-12 2012-06-12
US201261663131P 2012-06-22 2012-06-22
EP19190845.8A EP3597037B1 (en) 2012-06-12 2013-03-07 Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62121B1 true RS62121B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=47892070

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210879A RS62121B1 (sr) 2012-06-12 2013-03-07 Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca
RS20200076A RS59890B1 (sr) 2012-06-12 2013-03-07 Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200076A RS59890B1 (sr) 2012-06-12 2013-03-07 Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca

Country Status (26)

Country Link
US (5) US10238093B2 (sr)
EP (3) EP2858487B1 (sr)
JP (6) JP2015519076A (sr)
KR (8) KR102650439B1 (sr)
CN (1) CN104540383B (sr)
AU (6) AU2013204582B2 (sr)
BR (1) BR112014030852B1 (sr)
CA (1) CA2876172C (sr)
CY (2) CY1122482T1 (sr)
DK (2) DK3597037T3 (sr)
ES (2) ES2759617T3 (sr)
HR (2) HRP20200093T1 (sr)
HU (2) HUE047266T2 (sr)
IL (1) IL235892A (sr)
LT (2) LT2858487T (sr)
ME (1) ME03551B (sr)
MX (3) MX364449B (sr)
NZ (2) NZ717848A (sr)
PL (2) PL2858487T3 (sr)
PT (2) PT2858487T (sr)
RS (2) RS62121B1 (sr)
RU (1) RU2656155C2 (sr)
SG (3) SG10201913429WA (sr)
SI (2) SI3597037T1 (sr)
SM (2) SMT202100426T1 (sr)
WO (1) WO2013187953A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
CN102652175B (zh) 2009-12-09 2016-02-10 宝洁公司 织物和家居护理产品
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
CN103025884B (zh) 2010-07-26 2015-11-25 特里安尼公司 转基因动物和使用方法
ME02106B (me) 2011-02-25 2015-10-20 Regeneron Pharma Miševi sa adam6
HUE047278T2 (hu) 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
SG11201401181YA (en) 2011-10-17 2014-04-28 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP3597038B1 (en) * 2012-02-01 2021-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
ME03551B (me) * 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
MY178882A (en) * 2013-02-20 2020-10-21 Regeneron Pharma Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US20140331344A1 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 Kymab Ltd. Transgenic Animals
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10034463B2 (en) 2014-01-24 2018-07-31 Children's Medical Center Corporation High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
EP4414484A3 (en) 2016-02-04 2025-01-15 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
CN113831407B (zh) 2016-05-20 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
HUE060608T2 (hu) * 2017-12-05 2023-03-28 Regeneron Pharma Genetikailag módosított immunglobulin lambda könnyûlánccal rendelkezõ egerek és azok alkalmazása
CN108486125B (zh) * 2018-03-27 2024-01-05 重庆金迈博生物科技有限公司 一种核酸分子及其在制备人源单域抗体中的应用
IL318469A (en) * 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
JP2023529846A (ja) 2020-06-02 2023-07-12 バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物
US20220090060A1 (en) 2020-09-11 2022-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CN116848254B (zh) 2020-12-16 2026-03-17 瑞泽恩制药公司 表达人源化Fcα受体的小鼠
CA3165366A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
TW202600011A (zh) * 2023-01-18 2026-01-01 美商基利科學股份有限公司 具有經改變重鏈基因座之嵌合基因轉殖免疫球蛋白小鼠及其製造及使用方法
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993008210A1 (en) 1991-10-18 1993-04-29 Beth Israel Hospital Association Vascular permeability factor targeted compounds
CZ140195A3 (en) 1992-12-01 1996-06-12 Protein Desing Labs Humanized antibodies reacting with l-selectin
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
CN1203922A (zh) 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
NL1007580C2 (nl) 1997-11-19 1999-05-20 Hoogovens Corporate Services B Vervaardiging van een middel voor de vermindering van de uitwerking van een externe mechanische stoot en het aldus vervaardigde middel.
RU10506U1 (ru) 1999-04-08 1999-08-16 Кривулин Виталий Николаевич Ручной культиватор
AU5043200A (en) 1999-05-27 2000-12-18 Human Genome Sciences, Inc. Adam polynucleotides and polypeptides
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
EA013564B1 (ru) 2000-08-03 2010-06-30 Терапеутик Хьюман Поликлоналз Инк. Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
CN1789416B (zh) 2001-05-11 2011-11-16 协和发酵麒麟株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
US7473557B2 (en) 2001-06-06 2009-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
EP1417659A1 (en) * 2001-07-13 2004-05-12 Juan Carlos Cordoba An alarm system for a portable device
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
EP2319301B1 (en) 2001-11-30 2017-09-06 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human Ig lambda light chain genes
DK2314629T4 (da) 2002-07-18 2023-02-06 Merus Nv Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
JP4745242B2 (ja) * 2003-05-20 2011-08-10 アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド Ｃｄ２０結合分子
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
ES2473596T3 (es) 2003-07-15 2014-07-07 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Loci de inmunoglobulina humanizada
US20050153392A1 (en) 2003-08-11 2005-07-14 Roland Buelow Transgenesis with humanized immunoglobulin loci
EP2272566A3 (en) * 2003-08-18 2013-01-02 MedImmune, LLC Humanisation of antibodies
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
WO2005038001A2 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer
WO2006029459A1 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Evogenix, Inc Antibodies specific for hepatocellular carcinoma and other carcinomas and uses thereof
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
AU2006242854A1 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Transgenic animals and methods of making recombinant antibodies
DE602005011421D1 (de) 2005-06-30 2009-01-15 Borealis Tech Oy Überzug-Schicht für Energie- oder Kommunikationskabel
AU2007219159B8 (en) 2006-01-25 2012-06-28 Roger Kingdon Craig Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
JP5307708B2 (ja) 2006-06-02 2013-10-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
PL2602323T3 (pl) 2007-06-01 2018-06-29 Open Monoclonal Technology, Inc. Kompozycje i sposoby hamowania endogennych genów immunoglobin i wytwarzania transgenicznych ludzkich przeciwciał typu idiotypowego
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
JP5588866B2 (ja) * 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
WO2009042589A1 (en) 2007-09-24 2009-04-02 Vanderbilt University Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and uses thereof
US7659842B2 (en) 2007-10-24 2010-02-09 Infineon Technologies Ag Quantization error reduction in PWM full-MASH converters
KR20100103810A (ko) * 2007-12-10 2010-09-28 알리바 바이오파마수티컬스, 아이엔씨. 동종 재조합에 의한 표적화된 영역의 순차적인 치환 방법
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
US8012714B2 (en) 2008-04-14 2011-09-06 Innovative Targeting Solutions, Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
EP2669298A3 (en) 2008-05-23 2014-02-26 Ablexis, LLC Single variable immunoglobulin domain comprising VL-DH-JL
AU2009298458B2 (en) 2008-09-30 2015-10-08 Ablexis, Llc Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
EP2356154A4 (en) * 2008-11-06 2012-12-19 Alexion Pharma Inc DEVELOPMENT OF REDUCED IMMUNOGENICITY ANTIBODIES AND METHODS OF MANUFACTURING THEREOF
JP5827127B2 (ja) 2008-12-18 2015-12-02 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用
GB0905023D0 (en) * 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
DK3622815T3 (da) * 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
RU2425880C2 (ru) 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
ES2724975T3 (es) 2009-12-10 2019-09-18 Regeneron Pharma Ratones que producen anticuerpos de cadena pesada
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
CN103228130B (zh) * 2010-06-17 2016-03-16 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
SMT201700023T1 (it) 2010-08-02 2017-03-08 Regeneron Pharma Topi che producono proteine leganti vl
EP2638155A1 (en) 2010-11-08 2013-09-18 Kymab Limited Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination
ME02106B (me) 2011-02-25 2015-10-20 Regeneron Pharma Miševi sa adam6
HUE047278T2 (hu) 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
SG11201401181YA (en) 2011-10-17 2014-04-28 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SG10201605675WA (en) 2011-12-20 2016-09-29 Regeneron Pharma Humanized light chain mice
EP3597038B1 (en) 2012-02-01 2021-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
EP2825036B1 (en) 2012-03-16 2018-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
SG11201405059XA (en) 2012-03-28 2014-09-26 Kymab Ltd Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies
ME03551B (me) 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
MY178882A (en) 2013-02-20 2020-10-21 Regeneron Pharma Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
EP4545567A3 (en) 2013-03-13 2025-08-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire

Also Published As

Publication number Publication date
MX364449B (es) 2019-04-26
CA2876172C (en) 2021-01-19
SMT202000026T1 (it) 2020-03-13
KR102484480B1 (ko) 2023-01-04
CY1124320T1 (el) 2022-07-22
JP2026040651A (ja) 2026-03-09
LT3597037T (lt) 2021-06-10
US20200093106A1 (en) 2020-03-26
JP2015519076A (ja) 2015-07-09
PL2858487T3 (pl) 2020-06-01
AU2022291579A1 (en) 2023-03-30
US10238093B2 (en) 2019-03-26
HUE055617T2 (hu) 2021-12-28
EP3912464A1 (en) 2021-11-24
EP2858487B1 (en) 2019-10-23
HRP20211126T1 (hr) 2021-10-15
KR20200074271A (ko) 2020-06-24
AU2022291579B2 (en) 2025-12-18
CA2876172A1 (en) 2013-12-19
PL3597037T3 (pl) 2021-10-25
MX2021000829A (es) 2021-03-25
IL235892A0 (en) 2015-01-29
KR102126217B1 (ko) 2020-06-24
HUE047266T2 (hu) 2020-04-28
IL235892A (en) 2017-04-30
AU2013204582A1 (en) 2014-01-09
HRP20200093T1 (hr) 2020-04-03
DK2858487T3 (da) 2020-01-20
KR20240042174A (ko) 2024-04-01
US20130333057A1 (en) 2013-12-12
PT3597037T (pt) 2021-06-01
MX379274B (es) 2025-03-10
US10542735B2 (en) 2020-01-28
SG10201609277PA (en) 2017-01-27
RS59890B1 (sr) 2020-03-31
AU2013204582B2 (en) 2016-01-14
EP3597037A1 (en) 2020-01-22
EP2858487A1 (en) 2015-04-15
JP6697430B2 (ja) 2020-05-20
US20240065238A1 (en) 2024-02-29
US11666040B2 (en) 2023-06-06
NZ703689A (en) 2016-05-27
JP2022090103A (ja) 2022-06-16
KR102381716B1 (ko) 2022-04-01
WO2013187953A1 (en) 2013-12-19
KR20220044871A (ko) 2022-04-11
AU2026201796A1 (en) 2026-04-02
JP2023165683A (ja) 2023-11-16
AU2018201501B2 (en) 2020-01-02
KR20230012073A (ko) 2023-01-25
US11559050B2 (en) 2023-01-24
CN104540383A (zh) 2015-04-22
LT2858487T (lt) 2019-12-27
MX2019004871A (es) 2019-09-04
US20190200588A1 (en) 2019-07-04
EP3597037B1 (en) 2021-04-28
SI3597037T1 (sl) 2021-07-30
ES2759617T3 (es) 2020-05-11
JP2018029623A (ja) 2018-03-01
CY1122482T1 (el) 2021-01-27
KR20190006611A (ko) 2019-01-18
KR102436654B1 (ko) 2022-08-26
ME03551B (me) 2020-07-20
BR112014030852B1 (pt) 2023-04-11
AU2020202185A1 (en) 2020-04-16
MX2014015261A (es) 2015-06-23
SI2858487T1 (sl) 2019-12-31
AU2016201612A1 (en) 2016-03-31
AU2020202185B2 (en) 2022-09-29
DK3597037T3 (da) 2021-06-28
KR102650439B1 (ko) 2024-03-26
KR102266274B1 (ko) 2021-06-17
KR20150027793A (ko) 2015-03-12
NZ717848A (en) 2019-03-29
JP2020110187A (ja) 2020-07-27
BR112014030852A2 (sr) 2017-08-15
SG10201913429WA (en) 2020-03-30
KR20220123322A (ko) 2022-09-06
RU2656155C2 (ru) 2018-05-31
JP7106596B2 (ja) 2022-07-26
ES2874515T3 (es) 2021-11-05
US20200281175A1 (en) 2020-09-10
RU2014153673A (ru) 2016-08-10
SMT202100426T1 (it) 2021-09-14
CN104540383B (zh) 2017-08-29
AU2018201501A1 (en) 2018-03-22
KR20200126439A (ko) 2020-11-06
HK1203762A1 (en) 2015-11-06
SG11201407789RA (en) 2014-12-30
PT2858487T (pt) 2020-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022291579B2 (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
RS58761B1 (sr) Miševi sa humanizovanim lakim lancem
RS62942B1 (sr) Miševi sa ograničenim teškim lancem imunoglobulina
HK40064570A (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
HK40021356B (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
HK40021356A (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
HK1203762B (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci