ES2764973T3

ES2764973T3 - Proteínas de fusión de P97

Info

Publication number: ES2764973T3
Application number: ES15705169T
Authority: ES
Inventors: Timothy Z Vitalis; Reinhard Gabathuler
Original assignee: Bioasis Technologies Inc
Current assignee: Bioasis Technologies Inc
Priority date: 2014-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: BR112016017933A2; IL246348A0; AU2015210612A1; CA2935195A1; WO2015117121A1; EP3102608B1; HK1232234A1; JP6603227B2; IL246348B; US20160347821A1; EP3102608A1; AU2015210612B2; JP2017505614A; US11643454B2; US20190315837A1

Abstract

Una proteína de fusión de p97 (melanotransferrina)-trastuzumab que comprende una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio, en donde la secuencia de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión de P97

Antecedentes

Campo técnico

Realizaciones de la presente invención se refieren a proteínas de fusión de p97 (melanotransferrina)-trastuzumab y proteínas de fusión de anticuerpos y métodos de uso relacionados de estas, por ejemplo, para facilitar el suministro de trastuzumab a través de la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) y/o mejorar la penetración tisular del anticuerpo en el CNS y tejidos periféricos y tratar y/o diagnosticar, de este modo, cánceres positivos para HER2, incluidos los del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés).

Descripción de la técnica relacionada

Superar las dificultades de suministrar agentes terapéuticos o de diagnóstico a regiones específicas del cerebro representa un importante desafío para el tratamiento o diagnóstico de muchos trastornos del sistema nervioso central (CNS), incluidos los cerebrales. En su papel neuroprotector, la función de la barrera hematoencefálica (BBB) es dificultar el suministro de muchos agentes de diagnóstico y terapéuticos posiblemente importantes al cerebro. Las moléculas terapéuticas y genes que podrían de cualquier otra manera ser eficaces en el diagnóstico y tratamiento no cruzan la BBB en cantidades adecuadas y frecuentemente tienen escasa penetración tisular, incluso en tejidos periféricos. Se ha informado que más de 95 % de todas las moléculas terapéuticas no cruzan la barrera hematoencefálica.

Por consiguiente, existe la necesidad de composiciones y métodos que faciliten el suministro de agentes terapéuticos y otras moléculas a través de la barrera hematoencefálica, por ejemplo, para tratar de manera eficaz ciertas enfermedades del sistema nervioso central (CNS) como cánceres, particularmente aquellos que han hecho metástasis en el CNS. La presente invención satisface estas necesidades y ofrece otras ventajas relacionadas. Breve compendio de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión de p97 (melanotransferrina o MTf)-trastuzumab, que comprenden una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio, en donde la secuencia de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR. La presente invención se refiere, además, a proteínas de fusión de p97 (melanotransferrina)-trastuzumab, que comprenden una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo C de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio, en donde la secuencia de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos D^{s s}H^aFTLDELR. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de cadena pesada de trastuzumab truncada fusionada al extremo C de la secuencia de p97.

En algunas realizaciones, la secuencia de cadena pesada de trastuzumab truncada consiste esencialmente en la región constante de cadena pesada o un fragmento de esta y carece sustancialmente o completamente de la región variable de cadena pesada. En ciertas realizaciones, la secuencia de cadena pesada de trastuzumab truncada consiste esencialmente en el dominio CH1 o un fragmento de este, la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. En ciertas realizaciones, la secuencia de cadena pesada de trastuzumab truncada consiste esencialmente en la región bisagra o un fragmento de esta, el dominio CH2 y el dominio CH3.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende (a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en las SEQ ID NOs:37-46 o 96-109; (b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 % idéntica a una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs:37-46 o 96-109; (c) o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que difiere de SEQ ID NOs:37-46 o 96-109 por la adición, sustitución, inserción o eliminación de aproximadamente 1-50 aminoácidos. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en una o más de las SEQ ID NOs:37-46 o 96-109.

También se describe en la presente memoria una proteína de fusión que comprende una secuencia de cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo N de la secuencia de p97. También se describe en la presente memoria una proteína de fusión que comprende una secuencia de cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo C de la secuencia de p97. También se describe en la presente memoria una proteína de fusión que comprende (a) una secuencia de aminoácidos ligera expuesta en las SEQ ID NOs:110-121; (b) una secuencia de aminoácidos ligera al menos 90 % idéntica a una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 110-121; (c) o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que difiere de las SEQ ID NOs: 110-121 por la adición, sustitución, inserción o eliminación de aproximadamente 1-50 aminoácidos. La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena ligera expuesta en las SEQ ID NOs: 110-121.

La secuencia de p97 según la invención consiste en la SEQ ID NO:14 (MTfp o MTfpep).

También se incluyen polinucleótidos aislados que codifican la proteína de fusión de p97 descrita en la presente memoria. En algunos aspectos, los polinucleótidos aislados se optimizan por codón para su expresión en una célula hospedante. En algunas realizaciones, la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana.

También se incluyen células hospedantes recombinantes, que comprenden un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria, opcionalmente donde el polinucleótido aislado está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores. En ciertas realizaciones, la célula hospedante recombinante comprende un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena ligera de trastuzumab (sin fusión), que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores. En ciertas realizaciones, la célula hospedante recombinante comprende un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión), que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores. En ciertas realizaciones, la célula hospedante recombinante comprende un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena ligera de trastuzumab (sin fusión) y un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión), que están funcionalmente enlazados a uno o más elementos reguladores.

Ciertas realizaciones se refieren a vectores que comprenden un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión de p97 de cualquiera de las realizaciones anteriores, que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores. En algunas realizaciones, el vector comprende un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena ligera de trastuzumab (sin fusión), que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores. En algunas realizaciones, el vector comprende un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión), que está funcionalmente enlazado a uno o más elementos reguladores. En algunas realizaciones, el vector comprende un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena ligera de trastuzumab (sin fusión) y un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión), que están funcionalmente enlazados a uno o más elementos reguladores. También se incluyen células hospedantes recombinantes que comprenden uno o más vectores según se describen en la presente memoria.

Algunas realizaciones se refieren a proteínas de fusión de p97-anticuerpo que comprenden dos secuencias de cadena ligera de trastuzumab (sin fusión), y una o dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab descritas en la presente memoria, donde la una o dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab comprenden una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio (ver, p. ej., las Figuras 1A y 1B). En algunas realizaciones, la proteína de fusión p97-anticuerpo comprende dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab (ver, p. ej., las Figuras 1A y 1E). En ciertas realizaciones, la proteína de fusión p97-anticuerpo comprende una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab y una secuencia de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión) (ver, p. ej., la Figura 1B). También se incluyen proteínas de fusión de p97-anticuerpo que comprenden una secuencia de cadena ligera de trastuzumab, una secuencia de cadena pesada de trastuzumab y una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab de cualquiera de las realizaciones anteriores, donde la proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab comprende una cadena pesada de trastuzumab truncada fusionada al extremo C de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio (ver, p. ej., la Figura 1C).

En algunas realizaciones, la proteína de fusión de p97-anticuerpo comprende dos secuencias de cadena ligera de trastuzumab y dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab descritas en la presente memoria, donde las proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab comprenden una cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo C de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio (ver, p. ej., la Figura 1D).

En algunas realizaciones, la proteína de fusión de p97-anticuerpo comprende dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab descritas en la presente memoria y dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab descritas en la presente memoria, donde las proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab comprenden una cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio, y donde las proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab comprenden una cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio (ver, p. ej., la Figura 1F).

Los ejemplos específicos de proteínas de fusión de p97-anticuerpo incluyen aquellos que comprenden dos conjuntos de cadenas pesadas y ligeras, donde al menos un conjunto se selecciona de uno o más de:

a) la cadena pesada de la SEQ ID NO:82 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:83;

b) la cadena pesada de la SEQ ID NO:84 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:85;

c) la cadena pesada de la SEQ ID NO:86 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:87;

d) la cadena pesada de la SEQ ID NO:88 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:89;

e) la cadena pesada de la SEQ ID NO:90 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:91;

f) la cadena pesada de la SEQ ID NO:92 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:93; y

g) la cadena pesada de la SEQ ID NO:94 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:95; incluidos fragmentos/variantes de estas de cualesquiera de las anteriores (los ejemplos a), b) y d) - g) son ejemplos de referencia). La fusión de p97-anticuerpo puede ser un homodímero que comprende dos conjuntos de a), dos conjuntos de b), dos conjuntos de c), dos conjuntos de d), dos conjuntos de e), dos conjuntos de f) o dos conjuntos de g). La fusión de p97-anticuerpo puede ser un heterodímero que comprende cualquier combinación de a)-g) indicada anteriormente. La fusión de p97-anticuerpo puede ser un heterodímero que comprende un primer conjunto de conjuntos de cadenas pesadas y ligeras seleccionado de a)-g) indicados anteriormente, y un segundo conjunto de cadenas pesadas y ligeras de trastuzumab (sin fusión), por ejemplo, las SEQ ID NO: 29-35 o 122 (cadenas pesadas) y 36 o 123 (cadenas ligeras). Ciertas realizaciones se refieren a células hospedantes recombinantes que comprenden una proteína de fusión de p97-anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores. En ciertas realizaciones, la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana. En ciertas realizaciones, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) o una célula HEK-293. También se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de p97-anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores.

Algunas realizaciones incluyen métodos para el tratamiento de un cáncer que sobreexpresa HER2 en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una proteína de fusión de p97-anticuerpo o composición farmacéutica descrita en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, el cáncer que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer que sobreexpresa HER2 ha hecho metástasis en el CNS del sujeto. En ciertas realizaciones, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico o cáncer uterino.

En realizaciones específicas, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2. En ciertas realizaciones, el cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer de mama que sobreexpresa HER2 ha hecho metástasis en el CNS del sujeto.

En ciertas realizaciones, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un adenocarcinoma gástrico o de unión gastroesofágica metastásico que sobreexpresa HER2. En ciertas realizaciones, el adenocarcinoma gástrico o de unión gastroesofágica metastásico que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En ciertas realizaciones, el adenocarcinoma gástrico o de unión gastroesofágica metastásico que sobreexpresa HER2 ha hecho metástasis en el CNS del sujeto.

En ciertas realizaciones, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un carcinoma seroso uterino (USC, por sus siglas en inglés) que sobreexpresa HER2. En ciertas realizaciones, el USC que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En ciertas realizaciones, el USC que sobreexpresa HER2 ha hecho metástasis en el CNS del sujeto.

Ciertos métodos incluyen administrar la proteína de fusión de p97-anticuerpo o composición farmacéutica como parte de un tratamiento adyuvante para un cáncer de mama que sobreexpresa HER2. En ciertas realizaciones, el tratamiento adyuvante comprende doxorrubicina, ciclofosfamida y paclitaxel o docetaxel. En ciertas realizaciones, el tratamiento adyuvante comprende docetaxel y carboplatino.

Algunos métodos incluyen administrar la proteína de fusión de p97-anticuerpo o composición farmacéutica como un único agente después de terapia basada en antraciclina multimodal.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano de sexo femenino.

Ciertos métodos incluyen administrar la proteína de fusión de p97-anticuerpo o composición farmacéutica mediante infusión intravenosa (IV).

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1G ilustran la estructura general de las proteínas de fusión de p97-anticuerpo ilustrativas (los círculos negros representan p97). La Figura 1A ilustra una proteína de fusión de anticuerpo homodimérica compuesta por dos cadenas ligeras de trastuzumab y dos cadenas pesadas de trastuzumab cada una fusionada al extremo N de p97. La Figura 1B ilustra una proteína de fusión de anticuerpo heterodimérica compuesta por dos cadenas ligeras de trastuzumab, una cadena pesada de trastuzumab no fusionada y una cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de p97. La Figura 1C ilustra una proteína de fusión de anticuerpo heterodimérica compuesta por una cadena ligera de trastuzumab, una cadena pesada de trastuzumab no fusionada y una cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo C de p97. Las Figuras 1D-1E ilustran fusiones de anticuerpo compuestas por dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab y dos cadenas ligeras de trastuzumab (sin fusión). La Figura 1F ilustra una fusión de anticuerpo compuesta por dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab y dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab. La Figura 1G ilustra una fusión de anticuerpo compuesta por dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab y dos secuencias de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión).

Las Figuras 2A-2D muestran el análisis de octetos que demuestra la afinidad de las fusiones de anticuerpo con Her2 con respecto al testigo de IgG1. La Figura 2A muestra los resultados para IgG1 humana, la Figura 2B muestra los resultados para TZM HC-MTf, la Figura 2C muestra los resultados para MTfp NH-TZM y la Figura 2D muestra los resultados para TZM HC-MTfp (ver el Ejemplo 1).

Las Figuras 3A-3B muestran la evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) de fusiones de anticuerpo en células cancerosas de mama BT-474 en comparación con los testigos Herceptin® y Fc de IgG1 humana (ver el Ejemplo 2). Estos datos muestran que las fusiones de p97-anticuerpo trastuzumab indujeron una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo significativa en células cancerosas de mama.

Descripción detallada

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante que están dentro de la experiencia en la técnica, muchas de las cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican de manera completa en la literatura. Ver, p. ej., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratorio Manual (3a edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, tomos I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5a ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3a edición 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3a edición, 2005).

Definiciones

A menos que se definan de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la técnica a los cuales corresponde la invención. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la puesta en práctica o evaluación de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. A los efectos de la presente invención, se definen los siguientes términos a continuación.

Los artículos "un/uno" y "una" se usan en la presente memoria para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Se entiende por "aproximadamente" una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, monto, peso o longitud que varía tanto como 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, monto, peso o longitud de referencia. Según se usa en la presente memoria, se pretende que el término "aminoácido" signifique aminoácidos de origen natural y de origen no natural, así como análogos y miméticos de aminoácidos. Los aminoácidos de origen natural incluyen los 20 (L)-aminoácidos usados durante la biosíntesis proteica, así como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que conoce un experto en la técnica. Los análogos de aminoácidos incluyen formas modificadas de aminoácidos de origen natural y de origen no natural. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustitución o reemplazo de grupos y restos químicos en el aminoácido o la derivación del aminoácido. Los miméticos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, estructuras orgánicas que exhiben propiedades funcionalmente similares, tales como características de carga y espaciamiento de carga del aminoácido de referencia. Por ejemplo, una estructura orgánica que imita Arginina (Arg o R) tendría un resto de carga positiva ubicado en un espacio molecular similar y que tendría el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino en la cadena lateral del aminoácido Arg de origen natural. Los miméticos también incluyen estructuras restringidas para mantener un espaciamiento óptimo e interacciones de carga del aminoácido o de los grupos funcionales del aminoácido. Los expertos en la técnica saben o pueden determinar qué estructuras constituyen análogos de aminoácidos o miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, se entenderá que las palabras "comprenden", " comprende" y "que comprende/n" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Se entiende por "consiste en" que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "consiste en". Por lo tanto, la frase "consiste en" indica que los elementos indicados son necesarios u obligatorios, y que ningún otro elemento puede estar presente. Se entiende por "consiste esencialmente en" que incluye cualesquiera elementos indicados después de la frase y se limita a otros elementos que no interfieren en ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción de los elementos indicados. Por lo tanto, la frase "consiste esencialmente en" indica que los elementos indicados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes, dependiendo de si afectan o no materialmente la actividad o acción de los elementos indicados.

Se pretende que el término "conjugado" haga referencia a la entidad formada como resultado de un acoplamiento o enlace covalente o no covalente de un agente u otra molécula, p. ej., una molécula biológicamente activa, con un polipéptido de p97 o secuencia de p97. Un ejemplo de un polipéptido conjugado es una "proteína de fusión" o "polipéptido de fusión", es decir, un polipéptido que se crea a través de la unión de dos o más secuencias codificantes, que originalmente codificaban polipéptidos separados; la traducción de las secuencias codificantes unidas genera un polipéptido de fusión simple, típicamente con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipéptidos separados. Los términos "fusión de anticuerpo" y "proteína de fusión de anticuerpo" se usan de manera intercambiable en la presente memoria para hacer referencia a un anticuerpo o molécula similar a anticuerpo que comprende al menos una proteína de fusión descrita en la presente memoria.

Según se usan en la presente memoria, los términos "función" y "funcional" y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

"Homología" se refiere al número porcentual de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservadoras. La homología se puede determinar mediante el uso de programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Research. 12, 387-395, 1984). De este modo, se podrían comparar secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente con las mencionadas en la presente memoria mediante la inserción de espacios en la alineación, tales como espacios que se determinan, por ejemplo, mediante el algoritmo de comparación usado por GAP.

Se entiende por "aislado" material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. Por ejemplo, un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, según se usa en la presente memoria, incluye el aislamiento y/o la purificación in vitro de una molécula de péptido o polipéptido de su entorno natural celular, y de la asociación con otros componentes de la célula; es decir, no está asociado significativamente con sustancias in vivo.

El término "enlace", "enlazador", "resto enlazador" o "L" se usa en la presente memoria para hacer referencia a un enlazador que se puede usar para separar un polipéptido de p97 de un agente de interés, o para separar un primer agente de otro agente, por ejemplo, donde dos o más agentes se enlazan para formar un conjugado de p97. El enlazador puede ser fisiológicamente estable o puede incluir un enlazador liberable tal como un enlazador enzimáticamente degradable (p. ej., enlazadores proteolíticamente escindibles). En ciertos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador peptídico, por ejemplo, como parte de una proteína de fusión de p97. En ciertos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no peptídico o un enlazador no proteínico. En ciertos aspectos, el enlazador puede ser una partícula, tal como una nanopartícula.

Los términos "modular" y "alterar" incluyen "aumentar", "potenciar" o " estimular", así como "disminuir" o "reducir" típicamente en una cantidad o grado estadísticamente significativo o fisiológicamente significativo con respecto a un testigo. Una cantidad "aumentada", "estimulada" o "potenciada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces mayor (p. ej., 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, p. ej., 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) que la cantidad producida sin la composición (p. ej., la ausencia de una proteína de fusión o fusión de anticuerpo de la invención) o una composición, muestra o sujeto de prueba testigo. Una cantidad "disminuida" o "reducida" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % en la cantidad producida sin composición o mediante una composición testigo, incluidos todos los números enteros entremedio. Como un ejemplo no limitante, un testigo podría comparar la actividad, tal como la cantidad o la velocidad de transporte/suministro a través de la barrera hematoencefálica, la velocidad y/o los niveles de distribución al tejido del sistema nervioso central y/o la Cmáx para el plasma, tejidos del sistema nervioso central o cualesquiera otros tejidos que no pertenecen al sistema nervioso central sistémicos o periféricos, de una proteína de fusión o fusión de anticuerpo de p97 con respecto al agente/anticuerpo solo. Otros ejemplos de comparaciones y cantidades "estadísticamente significativas" se describen en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, la "pureza" de un agente dado (p. ej., un conjugado de p97 tal como una proteína de fusión o fusión de anticuerpo) se puede definir específicamente en una composición. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % puro, incluidos todos los decimales entremedio, según se mide, por ejemplo, y de ningún modo como limitación, mediante cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés), una forma conocida de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en la presente memoria para hacer referencia a un polímero de residuos aminoacídicos y a variantes y análogos sintéticos de los mismos. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros aminoacídicos en lo que uno o más residuos aminoacídicos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros aminoacídicos de origen natural. Los polipéptidos descritos en la presente memoria no se limitan a una longitud específica del producto; por lo tanto, se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas dentro de la definición de polipéptido, y dichos términos se pueden usar de manera intercambiable en la presente memoria a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera. Los polipéptidos descritos en la presente memoria también pueden comprender modificaciones postexpresión, tales como glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. Un polipéptido puede ser una proteína entera, o una subsecuencia, fragmento, variante o derivado de esta.

Una unión "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es una unión que hace reacción con agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas. La tendencia de una unión a hidrolizarse en agua dependerá no solo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes acoplados a estos átomos centrales. Los enlaces hidrolíticamente inestables o débiles adecuados incluyen, pero no se limitan a: éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídrido, acetal, cetal, éter de aciloxialquilo, imina, ortoéster, tio éster, tiol éster, carbonato e hidrazona, péptidos y oligonucleótidos.

Un "enlazador liberable" incluye, pero no se limita a, un enlazador fisiológicamente escindible y un enlazador enzimáticamente degradable. Por lo tanto, un "enlazador liberable" es un enlazador que puede sufrir hidrólisis espontánea o escisión mediante algún otro mecanismo (p. ej., catalizado por enzima, catalizado por ácido, catalizado por base, entre otros) en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, un "enlazador liberable" puede implicar una reacción de eliminación que tiene una abstracción de base de un protón (p. ej., un átomo de hidrógeno ionizable, Ha), como la fuerza impulsora. A efectos de la presente memoria, un "enlazador liberable" es sinónimo de un "enlazador degradable". Un "enlace enzimáticamente degradable" incluye un enlace, p. ej., una secuencia de aminoácidos que se somete a degradación mediante una o más enzimas, p. ej., peptidasas o proteasas. En realizaciones específicas, un enlazador liberable tiene una semivida a pH 7,4, 25 °C, p. ej., un pH fisiológico, temperatura corporal humana (p. ej., in vivo), de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o menos.

El término "secuencia de referencia" se refiere generalmente a una secuencia codificante de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, con la que se compara otra secuencia. Todas las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas descritas en la presente memoria se incluyen como secuencias de referencia, incluidas las descritas por nombre y las descritas en el Listado de secuencias.

Los términos "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprenden una "secuencia 50 % idéntica a", según se usan en la presente memoria, hacen referencia a la medida en que dichas secuencias son idénticas en función de una ventana de comparación nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido. Por lo tanto, un "porcentaje de identidad de secuencia" se puede calcular al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación y determinar la cantidad de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, I) o el residuo aminoacídico idéntico (p.ej., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para proporcionar la cantidad de posiciones coincidentes, dividir la cantidad de posiciones coincidentes entre la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen nucleótidos y polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente memoria (ver, p. ej., el Listado de secuencias), típicamente donde la variante polipeptídica mantiene al menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.

Los términos usados para describir relaciones secuenciales entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene al menos 12, pero frecuentemente 15 a 18 y a menudo al menos 25 unidades monoméricas, que incluyen nucleótidos y residuos aminoacídicos, de longitud. Dado que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos típicamente se llevan a cabo al comparar secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud secuencial. Una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente, aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente, aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia con la misma cantidad de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) de aproximadamente 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante implementaciones informáticas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por la inspección y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el porcentaje de homología más alto en la ventana de comparación) generadas mediante cualesquiera de los diversos métodos seleccionados. También se puede consultar la familia de programas BLAST como, por ejemplo, la descrita por Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997. Se puede encontrar una descripción detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.

Se entiende por "estadísticamente significativo" que es improbable que el resultado se produjera por casualidad. La significación estadística se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Las mediciones de la significación usadas comúnmente incluyen el valor de la p, que es la frecuencia o probabilidad de que se produjera el evento observado, si la hipótesis nula fuera verdadera. Si el valor de la p obtenido es menor que el nivel de significación, entonces la hipótesis nula se rechaza. En casos simples, el nivel de significación se define por un valor de la p de 0,05 o menor.

El término "solubilidad" se refiere a la propiedad de una proteína de disolverse en un disolvente líquido y formar una disolución homogénea. La solubilidad típicamente se expresa como una concentración, ya sea en masa de soluto por unidad volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dL (100 mL), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fracción molar u otras descripciones de la concentración similares. La cantidad de soluto en equilibrio máximo que se puede disolver por la cantidad de disolvente es la solubilidad de dicho soluto en dicho disolvente en las condiciones especificadas, incluidas temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide a pH fisiológico, u otros pH, por ejemplo, a pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 o pH 7,4. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en agua o un tampón fisiológico tal como PBS o NaCl (con o sin NaP). En realizaciones específicas, la solubilidad se mide a pH relativamente más bajo (p. ej., pH 6,0) y sal relativamente más alta (p. ej., 500mM NaCl y 10mM NaP). En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en un fluido biológico (disolvente) tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (p. ej., aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) o aproximadamente temperatura corporal (~37 °C). En ciertas realizaciones, un polipéptido o conjugado de p97 tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a aproximadamente 37 °C.

Un "sujeto", según se usa en la presente memoria, incluye cualquier animal que exhibe un síntoma, o está en riesgo de exhibir un síntoma, que se puede tratar o diagnosticar con una proteína de fusión de p97 o fusión de anticuerpo relacionada de la invención. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobayo), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes humanos.

"Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de alguna cantidad dada.

"Sustancialmente libre" se refiere a la ausencia casi completa o completa de una cantidad dada, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o menos de alguna cantidad dada. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden estar "sustancialmente libres" de proteínas celulares, membranas, ácidos nucleicos, endotoxinas u otros contaminantes.

"Tratamiento" o "tratar", según se usa en la presente memoria, incluye cualquier efecto deseable en los síntomas o la patología de una enfermedad o afección, y puede incluir incluso cambios o mejoras mínimos en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se está tratando. "Tratamiento" o "tratar" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o síntomas asociados a estas. El sujeto que recibe este tratamiento es un cualquier sujeto que lo necesita. Los marcadores ilustrativos de mejora clínica serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica.

El término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de dicho gen o producto génico cuando se aísla de una fuente de origen natural. Un gen o producto génico natural (p. ej., un polipéptido) es el que se observa más frecuentemente en una población y, por lo tanto, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "natural" del gen.

Proteínas de fusión

Realizaciones de la presente invención se refieren generalmente a proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica de p97 (melanotransferrina; MTf) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR, una secuencia de trastuzumab o un fragmento de unión a antígeno de esta, anticuerpos que comprenden dichas proteínas de fusión (es decir, fusiones de anticuerpo), polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión, células hospedantes y métodos para producir proteínas de fusión/anticuerpos, y composiciones y métodos de uso relacionados de estos. Se describen secuencias polipeptídicas de p97 y secuencias de trastuzumab ilustrativas más adelante. También se describen métodos y componentes ilustrativos, tales como péptidos enlazadores, para acoplar una secuencia polipeptídica de p97 a una secuencia de trastuzumab.

Secuencias de p97. Una secuencia polipeptídica de p97 usada en una composición y/o proteína de fusión descrita en la presente memoria comprende, consiste esencialmente, o consiste en una secuencia de referencia de p97 humana proporcionada en la Tabla 1 a continuación. También se incluyen variantes y fragmentos de esta. La secuencia polipeptídica de p97 usada en una composición y/o proteína de fusión de la invención consiste en la secuencia de p97 humana proporcionada como SEQ ID NO: 14 en la Tabla 1.

Una secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede comprender una secuencia que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad o homología, a lo largo de su longitud, con respecto a una secuencia de p97 humana en la Tabla 1, o un fragmento de esta.

Una secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede comprender un fragmento de una secuencia de p97 humana en la Tabla 1. Un fragmento polipeptídico de p97 descrito en la presente memoria puede tener aproximadamente, al menos aproximadamente, o hasta aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 700, 710, 720, 730 o más aminoácidos de longitud, incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio, y que puede comprender toda o una porción de la secuencia de una secuencia de referencia de p97.

Un fragmento polipeptídico de p97 descrito en la presente memoria puede tener aproximadamente 5-700, 5-600, 5 500, 5-400, 5-300, 5-200, 5-100, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-700, 10-600, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 20-700, 20-600, 20-500, 20-400, 20-300, 20-200, 20-100, 20-50, 20-40, 20-30, 20-25, 30-700, 30-600, 30-500, 30-400, 30-300, 30-200, 30-100, 30-50, 30-40, 40-700, 40-600, 40-500, 40-400, 40-300, 40-200, 40-100, 40-50, 50-700, 50-600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 60-700, 60-600, 60-500, 60-400, 60-300, 60-200, 60-100, 60-70, 70-700, 70-600, 70-500, 70-400, 70-300, 70-200, 70-100, 70-80, 80-700, 80-600, 80-500, 80-400, 80-300, 80-200, 80-100, 80-90, 90-700, 90-600, 90-500, 90-400, 90-300, 90 200, 90-100, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-250, 100-200, 100-150, 200-700, 200-600, 200 500, 200-400, 200-300 o 200-250 aminoácidos de longitud, y comprende toda o una porción de una secuencia de referencia de p97.

Las secuencias polipeptídicas de p97 descritas en la presente memoria incluyen secuencias de aminoácidos de p97, subsecuencias y/o variantes de p97 que son eficaces para transportar un agente de interés a través de la barrera hematoencefálica y hacia el sistema nervioso central (CNS). La variante o fragmento descrito en la presente memoria puede comprender el lóbulo N de p97 humana (residuos 20-361 de la SEQ ID NO:1). En aspectos específicos, la variante o fragmento descrito en la presente memoria puede comprender un sitio de unión a Fe3+ intacto y funcional.

Una secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede ser una forma soluble de un polipéptido de p97 (ver Yang et al., Prot Exp Purif. 34:28-48, 2004), o un fragmento o variante de esta. En algunos aspectos, el polipéptido de p97 soluble puede tener una eliminación de todo o de una porción del dominio hidrófobo (residuos 710-738 de la SEQ ID NO:1), sola o en combinación con una eliminación de todo o de una porción del péptido señal (residuos 1-19 de la SEQ ID NO:1). En aspectos específicos, el polipéptido de p97 soluble puede comprender o consistir en la SEQ ID NO:2 (residuos 20-711 de la SEQ ID NO:1), incluidas variantes y fragmentos de esta.

El polipéptido de p97 de la invención consiste en la secuencia DSSHAFTLDELR (SEQ ID NO:14 o MTfp).

Para aquellos que emplean liposomas, la secuencia polipeptídica de p97 descrita en la presente memoria puede ser una forma soluble lipídica de un polipéptido de p97. Por ejemplo, algunos de estos y polipéptidos relacionados pueden incluir un polipéptido de p97 que comprende todo o una porción del dominio hidrófobo, opcionalmente con o sin el péptido señal.

El fragmento o variante de p97 descrito en la presente memoria puede ser capaz de unirse específicamente a un receptor de p97, un receptor de LRP1 y/o un receptor de LRP1B.

Las variantes y fragmentos de polipéptidos de p97 de referencia descritos en la presente memoria y otros polipéptidos de referencia se describen en mayor detalle más adelante.

Secuencias de Trastuzumab. En ciertas realizaciones, una secuencia de anticuerpo trastuzumab usada en una proteína de fusión de la invención comprende, consiste esencialmente, o consiste en la(s) secuencia(s) de cadena pesada de trastuzumab ilustrada(s) en la Tabla 2 a continuación.

También se incluyen variantes y fragmentos de unión a antígeno de las secuencias de cadena pesada y ligera de trastuzumab descritas en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el anticuerpo trastuzumab, fragmento de unión a antígeno de este, o proteína de fusión o fusión de anticuerpo relacionada se une específicamente a Her2/neu o a un epítopo o fragmento de este.

En realizaciones específicas, el(los) fragmento(s) de cadena pesada de trastuzumab, p. ej., las regiones Fc de fragmentos de cadena pesada, se modifican para aumentar una combinación de cadenas preferida, por ejemplo, mediante el uso de la tecnología botones en ojales (knobs-into-holes (KiH, por sus siglas en inglés)) (ver, p. ej., Klein et al., mAbs. 4:6, 653-663, 2012) u otras tecnologías, tales como las descritas en la solicitud estadounidense núm.

2012/0149876. Como un ejemplo, para aumentar la formación de una fusión de anticuerpo heterodimérica (p. ej., un anticuerpo que comprende una fusión p97-cadena pesada de trastuzumab y una cadena pesada de trastuzumab normal; ver, p. ej., las Figuras 1B y 1C), una de las cadenas pesadas puede tener modificaciones de aminoácidos para generar el "botón" y la otra cadena pesada puede tener modificaciones de aminoácidos para formar el "ojal". Los ejemplos no limitantes, específicos, de modificaciones KiH a las secuencias de cadena pesada de trastuzumab se ilustran en la Tabla 2 que figura más atrás. Como otro ejemplo, un fragmento de cadena pesada podría comprender un dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácidos seleccionadas de una o más de T350V, L351Y, D399R, D399 (p. ej., D399R, D399W, D399Y, D399K), S400 (p. ej., S400E, S400D, S400R, S400K), F405 (p. ej., F4051, F405M, F405T, F405S, F405V, F405W), Y407A, Y4071, Y407V, incluidas combinaciones de estas, y el otro podría comprender un dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácidos seleccionadas de una o más de T350V, T366V, T366I, T366L, T366M, N390 (p. ej., N390R, N390K, N390D), K392 (p. ej., K392V, K392M, K392R, K392L, K392F, K392E), F405 (p. ej., F4051, F405M, F405T, F405S, F405V, F405W), K409F, K409Wy T411 (p. ej., T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E, T411W) incluidas combinaciones de estos (ver la solicitud estadounidense núm. 2012/0149876).

El término "fragmento de unión a antígeno" según se usa en la presente memoria se refiere a un fragmento polipeptídico que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une al antígeno de interés. En este sentido, un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en la presente memoria puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de una secuencia de VH y VL de anticuerpos que se unen a una diana terapéutica o de diagnóstico.

El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula a la que se puede unir un agente de unión selectivo, tal como un anticuerpo, y adicionalmente que también se puede usar en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de dicho antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante polipeptídico, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocito T. Un epítopo es una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. En ciertas realizaciones, los determinantes del epítopo incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de cambio específicas. Los epítopos pueden ser contiguos o no contiguos en relación con la estructura primaria del antígeno.

Un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno de este, se dice que exhibe "unión específica" o "unión preferencial" si hace reacción o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferencialmente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, con más facilidad y/o con mayor duración que cuando se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o se une preferencialmente a un epítopo específico es un anticuerpo que se une a dicho epítopo específico con mayor afinidad, avidez, con más facilidad y/o con mayor duración que cuando se une a otros epítopos. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específicamente o preferencialmente a una primera diana puede unirse o no específicamente o preferencialmente a una segunda diana. Como tal, "unión específica" o "unión preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, una referencia a unión significa unión preferencial.

La unión inmunológica generalmente se refiere a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica, por ejemplo, a modo de ilustración y no como limitación, como resultado de atracciones o repulsión electrostática, iónica, hidrófila e/o hidrófoba, fuerzas estéricas, uniones de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y otras interacciones. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se pueden expresar en relación con la constante de disociación (K^d) de la interacción, en donde una K^dmás pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de la unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos implica medir los índices de formación y disociación de complejos sitio de unión a antígeno/antígeno, en donde dichos índices dependen de las concentraciones de las partes del complejo, la afinidad de la interacción, y de parámetros geométricos que influyen de igual manera sobre el índice en ambas direcciones. Por lo tanto, la "constante de asociación" (K^on) y la "constante de disociación" (K^off) se pueden determinar al calcular las concentraciones y los índices reales de asociación y disociación. La relación K^off/K^onpermite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad y, por lo tanto, es igual a la constante de disociación K^d.

Las propiedades de la unión inmunológica de proteínas tales como trastuzumab, fragmentos de unión a antígeno de este y proteínas de fusión y fusiones de anticuerpo relacionadas se pueden cuantificar mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (ver Davies et al., Annual Rev. Biochem. 59:439-473, 1990). En algunas realizaciones, se dice que una proteína se une específicamente a un antígeno o epítopo de este cuando la constante de disociación en equilibrio es aproximadamente <10^"7o 10^-8M. En algunas realizaciones, la constante de disociación en equilibrio de una proteína puede ser aproximadamente <10^-9M o <10^{'1 °}M. En ciertas realizaciones ilustrativas, una proteína tiene una afinidad (K^d) para un antígeno o diana descrito en la presente memoria (al cual se une específicamente) de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1°, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 o 50 nM.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de estos según se describen en la presente memoria incluyen un conjunto de CDR de una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente intercalados entre un conjunto de región marco (FR) de una cadena pesada y una cadena ligera que proporcionan sostén a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. Según se usa en la presente memoria, el término "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Partiendo desde el extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3" respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada región V de una cadena pesada y una ligera. Un polipéptido que comprende una CDR simple, (p. ej., una CDR1, CDR2 o CDR3) se denomina en la presente memoria "unidad de reconocimiento molecular". El análisis cristalográfico de varios complejos antígeno-anticuerpo ha demostrado que los residuos aminoacídicos de las CDR forman un contacto extensivo con el antígeno unido, en donde el contacto con el antígeno más extensivo es con la CDR3 de cadena pesada. Por lo tanto, las unidades de reconocimiento molecular son principalmente responsables de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Según se usa en la presente memoria, el término "conjunto de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueadores que enmarcan las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos residuos de FR pueden hacer contacto con el antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables de plegar la región V en el sitio de unión a antígeno, particularmente, los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, ciertos residuos amino y ciertas características estructurales están muy altamente conservados. En este sentido, todas las secuencias de la región V contienen un bucle disulfuro interno de aproximadamente 90 residuos aminoacídicos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se exhiben como motivos en bucle que se proyectan y forman una superficie de unión a antígeno. Se reconoce generalmente que existen regiones estructurales conservadas de FR que influyen sobre la forma plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras "canónicas", independientemente de la secuencia de aminoácidos de CDR precisa. Además, se sabe que ciertos residuos de FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar tomando en cuenta Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edición. US Department of Health and Human Services. 1987, y actualizaciones de este.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea en donde el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y de origen no natural) que participan en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un único epítopo. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de estos (tales como Fab, Fab', F(ab')², Fv), de cadena simple (ScFv), variantes de estos, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un epítopo. No se pretende que esté limitado en relación con la fuente del anticuerpo ni la manera en que se produce (p. ej., mediante hibridoma, selección en fagos, expresión recombinante, animales transgénicos). El término incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos etc. descritos anteriormente en la definición de "anticuerpo".

La enzima proteolítica papaína escinde preferencialmente moléculas de IgG para proporcionar diversos fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluido el fragmento F(ab')2 que comprende ambos sitios de unión a antígeno. Un fragmento Fv para su uso según ciertas realizaciones de la presente invención se puede producir mediante escisión proteolítica preferencial de una IgM, y en raras ocasiones de una molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Los fragmentos Fv, sin embargo, se derivan más comúnmente mediante el uso de técnicas recombinantes conocidas en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero Vh::Vl no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que conserva gran parte de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de anticuerpo natural. Ver Inbar et al., PNAS USA. 69:2659-2662, 1972; Hochman et al., Biochem. 15:2706-2710, 1976; y Ehrlich et al., Biochem.

19:4091-4096, 1980.

En ciertas realizaciones, se contemplan anticuerpos de Fv de cadena simple o scFV. Por ejemplo, se pueden preparar cuerpos Kappa (III et al., Prot. Eng. 10:949-57, 1997); minicuerpos (Martin et al., EMBO J 13:5305-9, 1994); diacuerpos (Holliger et al., PNAS 90: 6444-8, 1993); o Janusinas (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-59, 1991; y Traunecker et al., Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52, 1992), mediante el uso de técnicas de biología molecular estándares de conformidad con las enseñanzas de la presente solicitud en relación con la selección de anticuerpos que tienen la especificidad deseada.

Un polipéptido de Fv (sFv) de cadena simple es un heterodímero Vh::Vl enlazado covalentemente que se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican Vh- y Vl- enlazados mediante un enlazador que codifica un péptido. Huston et al. (PNAS USA. 85(16):5879-5883, 1988). Se han descrito diversos métodos para diferenciar estructuras químicas para convertir las cadenas polipeptídicas ligera y pesada naturalmente aglomeradas, pero químicamente separadas, de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Ver, p. ej., las patentes estadounidenses núms. 5091 513 y 5 132405, de Huston et al.; y la patente estadounidense núm. 4946778, de Ladner et al.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno están humanizados. Estas realizaciones hacen referencia a una molécula quimérica, generalmente preparada mediante el uso de técnicas recombinantes, que tiene un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados con dominios constantes o solo las CDR injertadas en las regiones marco adecuadas en los dominios variables. Los sitios de unión a epítopo pueden ser naturales o modificados mediante una o más sustituciones de aminoácidos. Esto elimina la región constante como un inmunógeno en individuos humanos, pero persiste la posibilidad de una respuesta inmunitaria a la región variable extraña (LoBuglio et al., PNAS USA 86:4220-4224, 1989; Queen et al., (PnAs USA.. 86:10029-10033, 1988; Riechmann et al., Nature. 332:323-327, 1988). Los métodos ilustrativos para la humanización de anticuerpos incluyen los métodos descritos en la patente estadounidense núm. 7462697.

Otra estrategia se centra no solo en proporcionar regiones constantes derivadas de humanos, sino en modificar las regiones variables, así como reconformarlas lo más próximo posible a la forma humana. Se sabe que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen tres regiones de determinación de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) que varían en su respuesta a los epítopos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones marco (FR, por sus siglas en inglés) que están relativamente conservadas en una especie dada y que proporcionan putativamente un andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un epítopo en particular, las regiones variables se pueden "reconformar" o "humanizar" al injertar CDR derivadas de un anticuerpo no humano en las FR presentes en el anticuerpo humano que se va a modificar. La aplicación de esta estrategia a varios anticuerpos ha sido descrita por Sato et al., Cancer Res. 53:851-856, 1993; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988; Kettleborough et al., Protein Engineering. 4:773-3783, 1991; Maeda et al., Human Antibodies Hybridoma 2:124-134, 1991; Gorman et al., PNAS USA. 88:4181-4185, 1991; Tempest et al., Bio/Technology 9:266-271, 1991; Co et al., PNAS USA. 88:2869-2873, 1991; Carter et al., PNAS USA. 89:4285-4289, 1992; y Co et al., J Immunol. 148:1149-1154, 1992. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR de los anticuerpos de ratón). En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que se alteran con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

Enlazadores. Según se indicó anteriormente, ciertas proteínas de fusión pueden emplear uno o más grupos enlazadores, incluidos enlazadores peptídicos. Dichos enlazadores pueden ser enlazadores estables o enlazadores liberables.

Por ejemplo, para conjugados polipéptido-polipéptido, los enlazadores peptídicos pueden separar los componentes una distancia suficiente para garantizar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia de enlazador peptídico se puede incorporar en la proteína de fusión mediante el uso de técnicas estándares descritas en la presente memoria y conocidas en la técnica. Las secuencias de enlazador peptídico adecuadas se pueden elegir en función de los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podrían interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la carencia de residuos hidrófobos o cargados que podrían hacer reacción con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; la patente estadounidense núm. 4935233 y la patente estadounidense núm. 4751 180.

En ciertas realizaciones ilustrativas, un enlazador peptídico tiene entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos, entre 5 y 10 aminoácidos, entre 5 y 25 aminoácidos, entre 5 y 50 aminoácidos, entre 10 y 25 aminoácidos, entre 10 y 50 aminoácidos, entre 10 y 100 aminoácidos, o cualquier intervalo intermedio de aminoácidos. En otras realizaciones ilustrativas, un enlazador peptídico comprende aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de longitud. Los enlazadores particulares puede tener una longitud de aminoácidos general de aproximadamente 1-200 aminoácidos, 1-150 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-90 aminoácidos, 1-80 aminoácidos, 1-70 aminoácidos, 1-60 aminoácidos, 1-50 aminoácidos, 1-40 aminoácidos, 1-30 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 1 10 aminoácidos, 1-5 aminoácidos, 1-4 aminoácidos, 1-3 aminoácidos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos.

Un enlazador peptídico puede emplear uno cualquiera o más aminoácidos de origen natural, aminoácido(s) de origen no natural, análogos de aminoácidos y/o miméticos de aminoácido según se describe en otra parte en la presente memoria y se conoce en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., PNAS USA.

83:8258-8262, 1986; la patente estadounidense núm. 4935233 y la patente estadounidense núm. 4751 180. Las secuencias de enlazador peptídico particulares contienen residuos Gly, Ser y/o Asn. Se pueden emplear otros aminoácidos casi neutros, tales como Thry Ala en la secuencia de enlazador peptídico, si se desea.

Ciertos enlazadores ilustrativos incluyen enlazadores que contienen Gly, Ser y/o Asn, como los siguientes: enlazadores [G]^x, [S]^x, [N]^x, [GS]^x, [GGS]^x, [GSS]^x, [GSGS]^x(SEQ ID NO:47), [GGSG]^x(SEQ ID NO:48), [GGGS]^x(SEQ ID NO:49), [GGGGS]^x(SEQ ID NO:50), [GN]^x, [GGN]^x, [GNN]^x, [GNGN]^x(SEQ ID NO:51), [GGNG]^x(SEQ ID NO:52), [GGGN]^x(SEQ ID NO:53), [GGGGN]^x(SEQ ID NO:54), donde ^xes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más. Otras combinaciones de estos y aminoácidos relacionados serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica. En realizaciones específicas, el enlazador comprende o consiste en una secuencia [GGGGS]^a(SEQ ID NO:55) o GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55).

En realizaciones específicas, la secuencia de enlazador comprende una secuencia de enlazador Gly3, que incluye tres residuos glicina. En realizaciones específicas, los enlazadores flexibles se pueden diseñar racionalmente mediante el uso de un programa informático capaz de modelar sitios de unión a ADN y los propios péptidos (Desjarlais & Berg, PNAS. 90:2256-2260, 1993; y PNAS. 91:11099-11103, 1994) o mediante métodos de visualización en fagos.

Los enlazadores peptídicos pueden ser fisiológicamente estables o pueden incluir un enlazador liberable tal como un enlazador fisiológicamente degradable o enzimáticamente degradable (p. ej., enlazador proteolíticamente escindible). En ciertas realizaciones, uno o más enlazadores liberables pueden dar como resultado una semivida más corta y aclaramiento más rápido del conjugado. Estas y realizaciones relacionadas se pueden usar, por ejemplo, para potenciar la solubilidad y tiempo de circulación en sangre de conjugados de p97 en el torrente circulatorio, mientras también se suministra un agente en el torrente circulatorio (o a través de la BBB) que, después de la degradación del enlazador, está sustancialmente libre de la secuencia de p97. Estos aspectos son especialmente útiles en aquellos casos donde polipéptidos u otros agentes, cuando están conjugados de manera permanente a una secuencia de p97, demuestran actividad reducida. Mediante el uso de los enlazadores, según se proporcionan en la presente memoria, dichos anticuerpos pueden mantener su actividad terapéutica cuando están en forma conjugada. De estas y otras maneras se pueden adaptar de manera más eficaz las propiedades de los conjugados de p97 para equilibrar la bioactividad y la semivida en circulación de los anticuerpos con el tiempo.

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: una secuencia de aminoácidos escindida por una serina proteasa tal como trombina, quimotripsina, tripsina, elastasa, calicreína o substilisina. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por trombina incluyen, pero no se limitan a: -Gly-Arg-Gly-Asp-(SEQ ID NO:56), -Gly-Gly-Arg-, -Gly- Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-(SEQ ID ⁿO:57), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-(SEQ ID NO:58), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-(SEQ ID NO:59), -Gly-Pro- Arg-, -Val-Pro-Arg- y -Phe- Val -Arg-. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por elastasa incluyen, pero no se limitan a: -Ala-Ala-Ala-, -Ala-Ala-Pro-Val-(SEQ ID NO:60), -Ala-Ala-Pro-Leu-(SEQ ID NO:61), -Ala-Ala-Pro-Phe-(SEQ ID NO:62), -Ala-Ala-Pro-Ala-(SEQ ID NO:63) y-Ala-Tyr-Leu-Val-(SEQ ID NO:64).

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas de la presente invención también incluyen secuencias de aminoácidos que se pueden escindir mediante una metaloproteinasa de matriz tal como colagenasa, estromelisina y gelatinasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por metaloproteinasa de matriz incluyen, pero no se limitan a: -Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:65), -Gly-Pro-, Leu-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:66), -Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:67) y-Ala-Pro-Gly-Leu-Z-(SEQ ID NO: 68), donde Y y Z son aminoácidos. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por colagenasa incluyen, pero no se limitan a: -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Z-(SEQ ID NO:69), -Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-(SEQ ID NO:70), -Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-(SEQ ID NO:71), -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-(SEQ ID NO:72), -Pro-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala-(SEQ ID NO:73), -Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:74) y -Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:75), donde Z es un aminoácido. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de aminoácidos escindible por estromelisina es -Pro-Tyr-Ala-Tyr-Tyr-Met-Arg-(SEQ ID NO:76); y un ejemplo de una secuencia de aminoácidos escindible por gelatinasa es -Pro-Leu-Gly-Met-Tyr- Ser-Arg-(SEQ iD NO:77).

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas de la presente invención también incluyen secuencias de aminoácidos que se pueden escindir mediante una enzima convertidora de angiotensina tales como, por ejemplo, -Asp-Lys-Pro-, -Gly-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:78) y -Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:79).

Los enlaces enzimáticamente degradables adecuados para su uso en realizaciones específicas de la presente invención también incluyen secuencias de aminoácidos que se pueden degradar mediante catepsina B, tales como, por ejemplo, -Val-Cit-, -Ala-Leu-Ala-Leu-(SEQ ID NO:80), -Gly-Phe-Leu-Gly-(SEQ ID NO:81) y -Phe-Lys-.

En algunas realizaciones, el enlazador comprende, consiste o consiste esencialmente en 125 (SEQ ID NO:124), incluidos fragmentos y variantes de esta.

En ciertas realizaciones, sin embargo, uno cualquiera o más de los enlazadores no peptídicos o peptídicos son opcionales. Por ejemplo, las secuencias de enlazador pueden no ser necesarias en una proteína de fusión donde el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C no esenciales que se pueden usar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Proteínas de Fusión y fusiones de anticuerpo. Ciertas realizaciones se refieren a proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica de p97 fusionada a una secuencia polipeptídica de trastuzumab, tal como una secuencia de cadena pesada o ligera de trastuzumab, y fusiones de anticuerpo que las comprenden. Una "fusión de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo o molécula de inmunoglobulina similar a un anticuerpo que comprende una o más proteínas de fusión p97-trastuzumab y opcionalmente una o más secuencias de trastuzumab sin fusión, es decir, secuencias de cadena ligera o cadena pesada de trastuzumab, o variantes/fragmentos de estas, que no están fusionadas a una secuencia de p97. En algunos casos, una fusión de anticuerpo comprende dos secuencias de cadena ligera y dos secuencias de cadena pesada, que se seleccionan individualmente a partir de cualesquiera secuencias de cadena ligera/pesada y/o secuencias de proteína de fusión descritas en la presente memoria. En algunos casos, una fusión de anticuerpo comprende una secuencia de cadena ligera y dos secuencias de cadena pesada, que se seleccionan individualmente a partir de cualesquiera secuencias de cadena ligera/pesada y/o secuencias de proteína de fusión descritas en la presente memoria.

Los ejemplos específicos, no limitantes, de proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab se ilustran en la Tabla 3 a continuación, y en la Tabla E1 (ver los Ejemplos).

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión p97-trastuzumab comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de la secuencia de p97. La secuencia de p97 descrita en la presente memoria puede ser una p97 soluble humana, por ejemplo, que comprende o consiste en la SEQ ID NO:2, o una variante/fragmento de esta. La secuencia de p97 de la invención consiste en la SEQ ID NO:14. En algunas realizaciones, la secuencia de cadena pesada de trastuzumab se selecciona de la SEQ ID NO:29-35 o 122, o una variante/fragmento de esta. Opcionalmente, la proteína de fusión comprende un enlazador peptídico entremedio las secuencias de p97 y trastuzumab. En realizaciones específicas, el enlazador es un enlazador (GGGGS)2 o (GGGGS)3 o un enlazador EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID No :124). La proteína de fusión de p97-trastuzumab descrita en la presente memoria comprende, consiste o consiste esencialmente en la SEQ ID NO:37 (cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de p97 soluble) o una variante/fragmento de esta. El enlazador puede ser un enlazador (GGGGS)3 y la proteína de fusión opcionalmente puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la SEQ ID NO:38 (cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de p97 soluble humana y separada mediante un enlazador (GGGGS)3) o una variante/fragmento de esta. Otras combinaciones serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica.

La proteína de fusión de p97-trastuzumab comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo C de una secuencia de p97. La secuencia de p97 descrita en la presente memoria puede ser una p97 soluble humana, por ejemplo, que comprende o consiste en la SEQ ID NO:2, o una variante/fragmento de esta. La secuencia de p97 de la invención consiste en la SEQ ID NO:14. En algunas realizaciones, la secuencia de cadena pesada de trastuzumab se selecciona de la SEQ ID NO:29-35 o 122, o una variante/fragmento de esta. En algunas realizaciones, la secuencia de cadena pesada de trastuzumab es una secuencia truncada que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:31-33 o 34, o una variante/fragmento de esta. La proteína de fusión de p97-trastuzumab descrita en la presente memoria puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la SEQ ID NO:39, 41, 43 o 45 (cadena pesada de trastuzumab truncada fusionada al extremo C de p97 soluble humana) o una variante/fragmento de esta. Opcionalmente, la proteína de fusión puede comprender un enlazador peptídico entremedio las secuencias de p97 y trastuzumab. En realizaciones específicas, el enlazador es un enlazador (GGGGS)2 o (GGGGS)3 o un enlazador EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:124). Generalmente, el enlazador puede ser un enlazador (GGGGS)3 y la proteína de fusión opcionalmente puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la SEQ ID NO:40, 42, 44 o 46 (cadena pesada de trastuzumab truncada fusionada al extremo C de p97 soluble humana y separada mediante un enlazador (GGGGS)3) o una variante/fragmento de esta.

La proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab puede comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia polipeptídica seleccionada de las SEQ ID NOs:37-46 y 96-109, o una variante/fragmento de esta.

Otras combinaciones serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica.

También se describen en la presente memoria proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab. Los ejemplos específicos, no limitantes, de proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab se ilustran en la Tabla 4 a continuación, y en la Tabla E1 (ver los Ejemplos).

La proteína de fusión de p97-trastuzumab descrita en la presente memoria puede comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia de cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97. La secuencia de p97 puede ser una p97 soluble humana, por ejemplo, que comprende o consiste en la SeQ ID NO:2, o una variante/fragmento de esta. La secuencia de p97 puede comprender o consistir en la SEQ ID NO:14, o una variante/fragmento de esta. La secuencia de cadena ligera de trastuzumab puede comprender o consistir en la SEQ ID NO:36 o 123, o una variante/fragmento de esta. La proteína de fusión de p97-trastuzumab puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la secuencia seleccionada de las SEQ ID NOs:110-115 (cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo N de p97pep) o una variante/fragmento de esta. Opcionalmente, la proteína de fusión puede comprender un enlazador peptídico entremedio de p97 y la secuencia de trastuzumab, por ejemplo, según se ilustra en la SEQ ID NO:111-112 o 114-115. El enlazador puede ser un enlazador (GGGGS)2 o (Gg Gg S)3 o un enlazador EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:124). Otras combinaciones serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica.

La proteína de fusión de p97-trastuzumab descrita en la presente memoria puede comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia de cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo C de una secuencia de p97. La secuencia de p97 puede ser una p97 soluble humana, por ejemplo, que comprende o consiste en la SeQ ID NO:2, o una variante/fragmento de esta. La secuencia de p97 puede comprender o consistir en la SEQ ID NO:14, o una variante/fragmento de esta. La secuencia de cadena ligera de trastuzumab puede comprender o consistir en la SEQ ID NO:36 o 123, o una variante/fragmento de esta. La proteína de fusión de p97-trastuzumab puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la SEQ ID NOs:116-121 (cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo C de p97pep) o una variante/fragmento de esta. Opcionalmente, la proteína de fusión puede comprender un enlazador peptídico entremedio las secuencias de p97 y trastuzumab, según se ilustra, por ejemplo, en las SEQ ID NOs:117-118 y 120-121. El enlazador puede ser un enlazador (GGGGS)2 o (GGGGS)3 o un enlazador EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:124). Otras combinaciones serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica.

También se incluyen proteínas de fusión p97-anticuerpo, que comprenden una o más proteínas de fusión de p97-cadena pesada o ligera de trastuzumab descritas en la presente memoria. En realizaciones particulares, la proteína de fusión de p97-anticuerpo comprende dos secuencias de cadena ligera de trastuzumab (sin fusión), y una o dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab descritas en la presente memoria, donde la una o dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab comprenden una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio. En algunas realizaciones, la proteína de fusión p97-anticuerpo comprende dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab (ver, p. ej., las Figuras 1Ay 1E), incluidas fusiones de anticuerpo homodiméricas que comprenden las mismas proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab. En algunas realizaciones, la proteína de fusión p97-anticuerpo comprende una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab (ver, p. ej., la Figura 1B).

En algunas realizaciones, la proteína de fusión de p97-anticuerpo comprende una o dos secuencias de cadena ligera de trastuzumab, una secuencia de cadena pesada de trastuzumab y una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab descritas en la presente memoria, donde la proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab comprende una cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo C de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio. En algunas realizaciones, la proteína de fusión p97-anticuerpo comprende una secuencia de cadena ligera de trastuzumab, una secuencia de cadena pesada de trastuzumab y una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab que tiene una cadena pesada de trastuzumab truncada (sin fusión) (ver, p. ej., la Figura 1C).

La proteína de fusión de p97-anticuerpo descrita en la presente memoria puede comprender una o dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab descritas en la presente memoria, y dos secuencias de cadena pesada de trastuzumab, donde la una o dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab comprenden una cadena ligera de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio. La proteína de fusión p97-anticuerpo descrita en la presente memoria puede comprender dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab descritas en la presente memoria (ver, p. ej., la Figura 1G).

La fusión de p97-anticuerpo puede comprender uno o dos conjuntos de cadenas pesadas y ligeras seleccionados de uno o más de los siguientes:

a) la cadena pesada de la SEQ ID NO:82 y la cadena

ligera de la SEQ ID NO:83;

b) la cadena pesada de la SEQ ID NO:84 y la cadena

ligera de la SEQ ID NO:85;

c) la cadena pesada de la SEQ ID NO:86 y la cadena

ligera d

SEQ ID NO:87;

d) la cadena pesada de la SEQ ID NO:88 y la cadena

ligera de la SEQ ID NO:89;

e) la cadena pesada de la SEQ ID NO:90 y la cadena

ligera d

SEQ ID NO:91;

f) la cadena pesada de la SEQ ID NO:92 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:93;

g) la cadena pesada de la SEQ ID NO:94 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:95;

incluidos fragmentos/variantes de estas (los ejemplos a), b) y d) - g) son ejemplos de referencia). La fusión de p97-anticuerpo puede ser un homodímero que comprende dos conjuntos de a), dos conjuntos de b), dos conjuntos de c), dos conjuntos de d), dos conjuntos de e), dos conjuntos de f) o dos conjuntos de g). La fusión de p97-anticuerpo puede ser un heterodímero que comprende un primer conjunto de conjuntos de cadenas pesadas y ligeras seleccionado de a)-g) indicados anteriormente, y un segundo conjunto de cadenas pesadas y ligeras compuesto por cualquier combinación de p97-cadenas pesadas o ligeras de trastuzumab descritas en la presente memoria (por ejemplo, a)-g) indicados anteriormente; SEQ ID NOS:37-46, 96-109 y 110-121) y/o cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras de trastuzumab (sin fusión) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 29-35 o 122 (cadenas pesadas) y 36 o 123 (cadenas ligeras)).

Los ejemplos no limitantes de fusiones de p97-anticuerpo se ilustran en las Figuras 1A-1G. La Figura 1A ilustra una fusión de anticuerpo compuesta por dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab y dos cadenas ligeras de trastuzumab (sin fusión). La Figura 1B ilustra una fusión de anticuerpo compuesta por una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab, una cadena pesada de trastuzumab (sin fusión) y dos cadenas ligeras de trastuzumab (sin fusión). La Figura 1C ilustra una proteína de fusión de anticuerpo compuesta por una proteína de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab (que tiene una cadena pesada de trastuzumab truncada), una cadena ligera de trastuzumab (sin fusión) y una cadena pesada de trastuzumab (sin fusión). Las Figuras 1D y 1E ilustran fusiones de anticuerpo compuestas por dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab y dos cadenas ligeras de trastuzumab (sin fusión). La Figura 1F ilustra una fusión de anticuerpo compuesta por dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab y dos proteínas de fusión de p97-cadena pesada de trastuzumab. La Figura 1G ilustra una fusión de anticuerpo compuesta por dos proteínas de fusión de p97-cadena ligera de trastuzumab y dos secuencias de cadena pesada de trastuzumab (sin fusión). En cualquiera de las fusiones de anticuerpo descritas en la presente memoria, el primer conjunto de cadenas ligera/pesada puede ser igual o diferente que el segundo conjunto de cadenas ligera/pesada.

En algunas realizaciones, la fusión de p97-anticuerpo es un homodímero, por ejemplo, que está compuesto por dos conjuntos idénticos de cadenas ligera y/o pesada, al menos uno de los cuales es una proteína de fusión de p97-trastuzumab. En algunas realizaciones, la fusión de p97-anticuerpo es un heterodímero, por ejemplo, que está compuesto por un primer conjunto de cadenas ligera y/o pesada y un segundo conjunto de cadenas pesada/ligera, donde el primer conjunto comprende al menos una proteína de fusión de p97-cadena pesada y/o ligera de trastuzumab y el segundo conjunto comprende solo secuencias de cadena pesada y/o ligera de trastuzumab.

Otras combinaciones serán evidentes para las personas con experiencia en la técnica. Por lo tanto, cualquiera de las secuencias de p97 descritas en la presente memoria se puede combinar con cualquiera de las secuencias de trastuzumab descritas en la presente memoria, para generar una proteína de fusión de p97-cadena ligera o cadena pesada de trastuzumab, y cualesquiera de dichas proteínas de fusión se pueden combinar con la(s) misma(s) proteína(s) de fusión o diferentes o con cualquiera de las secuencias de cadena pesada o cadena ligera de trastuzumab para generar una fusión de anticuerpo deseada.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de p97-anticuerpo se une específicamente al receptor HER2/neu humano. En realizaciones específicas, la proteína de fusión de p97-anticuerpo se une específicamente al dominio IV del segmento extracelular del receptor HER2/neu humano (ver Cho et al., Nature. 421:756-760, 2003). En realizaciones específicas, la proteína de fusión de p97-anticuerpo es un antagonista del receptor HER2/neu. Generalmente, conjugados de p97-anticuerpo conocidos y composiciones y métodos relacionados, que se pueden usar en métodos para el tratamiento de cánceres tales como cánceres que expresan Her2/neu y Herl/EGFR se describen en la publicación internacional WO 2013/006706 A1.

Las propiedades funcionales de las proteínas de fusión y fusiones de anticuerpo descritas en la presente memoria se pueden evaluar mediante el uso de una variedad de métodos conocidos para el experto, que incluyen, p. ej., ensayos de afinidad/unión (por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales, ensayos de inhibición competitiva); ensayos de citotoxicidad, ensayos de viabilidad celular, ensayos de proliferación o diferenciación celular, inhibición de células cancerosas y/o de crecimiento tumoral mediante el uso de modelos in vitro o in vivo. Por ejemplo, las proteínas de fusión descritas en la presente memoria se pueden someter a prueba para determinar los efectos en la internalización del receptor, la eficacia in vitro e in vivo, etc., incluida la tasa de transporte a través de la barrera hematoencefálica. Dichos ensayos se pueden llevar a cabo mediante el uso de protocolos establecidos conocidos para el experto (ver, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober2001 John Wiley & Sons, NY, NY); o kits disponibles comercialmente. Secuencias variantes. Ciertas realizaciones incluyen variantes de las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de referencia descritas en la presente memoria, ya estén descritas por nombre o por referencia a un identificador de secuencia, incluidas secuencias de p97 y secuencias de trastuzumab (ver, p. ej., el Listado de secuencias). Las secuencias naturales o más prevalentes de estos polipéptidos se conocen en la técnica y se pueden usar como comparación para las variantes y fragmentos descritos en la presente memoria.

Una secuencia "variante", según se usa el término en la presente memoria, se refiere a una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que difiere de una secuencia de referencia descrita en la presente memoria en una o más sustituciones, eliminaciones (p. ej., truncamientos), adiciones e/o inserciones. Ciertas variantes, por lo tanto, incluyen fragmentos de una secuencia de referencia descrita en la presente memoria. Los polipéptidos variantes son biológicamente activos, es decir, continúan teniendo la actividad enzimática o de unión de un polipéptido de referencia. Dichas variantes pueden originarse a partir de, por ejemplo, polimorfismo genético y/o a partir de manipulación humana.

En muchos casos, una variante biológicamente activa contendrá una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente incambiadas. Según se describió anteriormente, se pueden hacer modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención y todavía obtener una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante o porción equivalente, o incluso mejorada, de un polipéptido de la invención, un experto en la técnica típicamente cambiará uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante según la Tabla A a continuación.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína son lo que definen la actividad biológica funcional de dicha proteína, ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos se pueden hacer en una secuencia proteica, y, evidentemente, su secuencia codificante de ADN y obtener, no obstante, una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, se contempla que se pueden hacer diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones descritas o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad.

Al hacer dichos cambios, se puede tomar en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir la función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultate que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte & Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tiene un índice o puntuación hidropático similar y todavía dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, aquellos dentro de ±1 se prefieren particularmente y aquellos dentro de ±0,5 se prefieren incluso más particularmente.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer de manera eficaz en función de la hidrofilicidad. La patente estadounidense 4554101 indica que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, según se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Según se detalla en la patente estadounidense 4554 101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos aminoacídicos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente y, en particular, inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, aquellos dentro de ±1 se prefieren particularmente y aquellos dentro de ±0,5 se prefieren incluso más particularmente.

Según se señaló anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente, por lo tanto, en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas que toman varias de las características anteriores en consideración son conocidas para los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, adicionalmente, en función de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de extremo polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Una variante puede también, o alternativamente, contener cambios no conservadores. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia natural o de referencia por la sustitución, eliminación o adición de menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 aminoácidos, o incluso 1 aminoácido. Las variantes también

(o alternativamente) se pueden modificar, por ejemplo, por la eliminación o adición de aminoácidos que influyen mínimamente en la inmunogenicidad, estructura secundaria, actividad enzimática y/o naturaleza hidropática del polipéptido.

En ciertas realizaciones, una secuencia polipeptídica tiene aproximadamente, al menos aproximadamente o hasta aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 700, 710, 720, 730, 780, 790, 800, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970,

aminoácidos contiguos de longitud, incluidos todos los números enteros entremedio, y que puede comprender toda o una porción de una secuencia de referencia (ver, p. ej., Listado de secuencias).

En otras realizaciones específicas, una secuencia polipeptídica consiste en aproximadamente o no más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,

0, 340, 350, 0, 570, 580,

0, 800, 800, aminoácidos contiguos, incluidos todos los números enteros entremedio, y que puede comprender toda o una porción de una secuencia de referencia (ver, p. ej., Listado de secuencias).

En todavía otras realizaciones específicas, una secuencia polipeptídica tiene aproximadamente 10-1000, 10-900, 10

800, 10-700, 10-600, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 20-1000, 20-900, 20-800,

20-700, 20-600, 20-500, 20-400, 20-300, 20-200, 20-100, 20-50, 20-40, 20-30, 50-1000, 50-900, 50-800, 50-700, 50

600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400,

100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400 o 200-300 aminoácidos contiguos, incluidos todos los intervalos entremedio, y comprende toda o una porción de una secuencia de referencia. En ciertas realizaciones, la región del extremo C o el extremo N de cualquier polipéptido de referencia se puede truncar en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100,

110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 o 800 o más aminoácidos, o en aproximadamente 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400,

400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800 o más aminoácidos, incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio (p. ej., 101, 102, 103, 104, 105), siempre que el polipéptido truncado conserve las propiedades de unión y/o la actividad del polipéptido de referencia. Típicamente, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 25 %, o aproximadamente 50 % de una actividad del polipéptido de referencia biológicamente activo del que se deriva.

En general, las variantes exhibirán al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %,

80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 % 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de similitud o identidad de secuencia u homología de secuencia con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia. Asimismo, se contemplan secuencias que difieren de las secuencias naturales u originales por la adición (p. ej., adición en el extremo C, adición en el extremo N, ambas), eliminación, truncamiento, inserción o sustitución (p. ej., sustitución conservadora) de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos (incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio), pero que conservan las propiedades o actividades de una secuencia polipeptídica original o de referencia.

En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes difieren con respecto a la secuencia de referencia en al menos

uno, pero menos de 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos aminoacídicos. En otras realizaciones, los polipéptidos variantes difieren con respecto a la secuencia de referencia en al menos 1 %, pero menos de 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos. (Si esta comparación requiere alineación, las secuencias se deben alinear para la máxima similitud. Las secuencias "en bucle" a partir de eliminaciones o inserciones, o emparejamientos incorrectos se consideran diferencias).

Los cálculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan de manera intercambiable en la presente memoria) se llevan a cabo de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para una comparación óptima (p. ej., se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para la alineación óptima y se pueden ignorar las secuencias no homólogas a los fines de la comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia de referencia alineada para comparación es de al menos 30 %, preferiblemente, al menos 40 %, más preferiblemente, al menos 50 %, 60 %, e incluso más preferiblemente, al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoacídico o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en dicha posición.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que se deben introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación el porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr mediante el uso de un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del algoritmo de Needleman and Wunsch, (J. %mol. Biol.

48: 444-453, 1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG, mediante el uso de una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un valor de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En todavía otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el uso del programa GAP en el paquete informático GCG, mediante el uso de una matriz NWSgapdna.CMP y un valor de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que se debe usar a menos que se especifique de cualquier otra manera) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por espacio de 12, una penalización extendida de espacio de 4 y una penalización de espacio de desplazamiento de marco de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se puede determinar mediante el uso del algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Cabios. 4:11-17, 1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), mediante el uso de una tabla de valor de residuo PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12 y una penalización por espacio de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteicas descritas en la presente memoria se pueden usar como una "secuencia de consulta" para llevar a cabo una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo mediante el uso de los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., (1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10). Las búsquedas de nucleótidos por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteína por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteicas de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para comparación, se puede usar Gapped BLAST según se describe en Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST).

En una realización, según se indicó anteriormente, los polinucleótidos y/o polipéptidos se pueden evaluar mediante el uso de la herramienta de alineación BLAST. Una alineación local consiste simplemente en un par de segmentos de secuencia, uno de cada una de las secuencias que se van a comparar. Una modificación de los algoritmos de Smith-Waterman o Sellers encontrará todos los pares de segmentos cuyas puntuaciones no se pueden mejorar por medio de extensión o recorte, llamados pares de segmentos con alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés). Los resultados de las alineaciones por BLAST incluyen mediciones estadísticas para indicar la probabilidad de que la puntuación de BLAST se pueda esperar solo por casualidad.

La puntuación bruta, S, se calcula a partir de la cantidad de espacios y sustituciones asociados a cada secuencia alineada en donde las puntuaciones de similitud más alta indican una alineación más significativa. Las puntuaciones de sustitución se proporcionan mediante una tabla de búsqueda (ver PAM, BLOSUM).

Las puntuaciones de espacio se calculan típicamente como la suma G, la penalización de apertura de espacio y L, la penalización de extensión de espacio. Para un espacio de longitud n, el costo del espacio sería G+Ln. La elección de los costos de espacio, G y L es empírica, pero es habitual elegir un valor alto para G (10-15), p. ej, 11, y un valor bajo para L (1-2) p. ej., 1.

La puntuación de trozo, S', se deriva de la puntuación de alineación bruta S en la que se han tomado en cuenta las propiedades estadísticas del sistema de puntuación usado. Las puntuaciones de trozo se normalizan con respecto al sistema de puntuación, por lo tanto, se pueden usar para comparar puntuaciones de alineación de diferentes búsquedas. Los términos "puntuación de trozo" y "puntuación de similitud" se usan de manera intercambiable. La puntuación de trozo proporciona una indicación de cuán buena es la alineación; cuanto mayor es la puntuación, mejor es la alineación.

El valor E, o valor esperado, describe la probabilidad de que una secuencia con una puntuación similar aparezca en la base de datos por casualidad. Es una predicción de la cantidad de diferentes alineaciones con puntuaciones equivalentes a o mejores que S que se espera que aparezcan en una búsqueda de base de datos por casualidad.

Cuanto menor es el valor E, más significativa es la alineación. Por ejemplo, una alineación que tiene un valor E de e-117 significa que es muy improbable que una secuencia con una puntuación similar aparezca simplemente por casualidad. Además, la puntuación esperada por alinear un par aleatorio de aminoácidos debe ser negativa, de lo contrario las alineaciones largas tenderían a tener una puntuación alta independientemente de si los segmentos alineados estuviesen relacionados. Además, el algoritmo BLAST usa una matriz de sustitución, nucleótido o aminoácido adecuada y para alineaciones con espacios usa penalizaciones de creación y extensión de espacios.

Por ejemplo, la alineación y la comparación de secuencias polipeptídicas por BLAST típicamente se llevan a cabo mediante el uso de la matriz BLOSUM62, una penalización de existencia de espacio de 11 y una penalización de extensión de espacio de 1.

En una realización, las puntuaciones de similitud de secuencia se informan a partir de análisis por BLAST llevados a cabo mediante el uso de la matriz BLOSUM62, una penalización de existencia de espacio de 11 y una penalización de extensión de espacio de 1.

En una realización específica, las puntuaciones de identidad/similitud de secuencia proporcionadas en la presente memoria se refieren al valor obtenido mediante el uso de GAP Versión 10 (GCG, Accelrys, San Diego, Calif.) con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleotídica mediante el uso de un valor de GAP de 50 y un valor de Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos mediante el uso de un valor de GAP de 8 y un valor de Longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, PNAS USA. 89:10915-10919, 1992). GAP usa el algoritmo de Needleman and Wunsch (J Mol Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de espacios.

En una realización específica, el polipéptido variante comprende una secuencia de aminoácidos que se puede alinear de manera óptima con una secuencia polipeptídica de referencia (ver, p. ej., el Listado de secuencias) para generar puntuaciones de trozo o puntuaciones de similitud de secuencia por BLAST de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 970, 980, 990, 1000 o más, incluidos todos los números enteros e intervalos entremedio, en donde la alineación BLAST usó la matriz BLOSUM62, una penalización por existencia de espacio de 11 y una penalización de extensión de espacio de 1.

Según se indicó anteriormente, un polipéptido de referencia se puede alterar de varias maneras que incluyen sustituciones, eliminaciones, truncamientos, adiciones e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia nucleotídica se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (PNAS USA. 82: 488 492, 1985); Kunkel et al., (Methods in Enzymol. 154: 367-382, 1987), la patente estadounidense núm. 4873 192, Watson, J. D. et al., ("Molecular Biology of the Gene," cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) y las referencias mencionadas en estas. Se puede encontrar orientación para sustituciones de aminoácidos adecuadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

Los métodos para barrer productos génicos en bibliotecas combinatorias elaboradas mediante dichas modificaciones y para barrer bibliotecas de ADNc para encontrar productos génicos que tienen una propiedad seleccionada se conocen en la técnica. Dichos métodos son adaptables para el barrido rápido de las bibliotecas génicas generadas mediante mutagénesis combinatoria de polipéptidos de referencia. Como ejemplo, la mutagénesis de ensamble recursivo (REM, por sus siglas en inglés), una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de barrido para identificar variantes de polipéptidos (Arkin and Yourvan, PNAS USA 89: 7811-7815, 1992; Delgrave et al., Protein Engineering. 6: 327-331, 1993).

Polinucleótidos, células Hospedantes y métodos de producción. Ciertas realizaciones se refieren a polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión y fusiones de anticuerpo descritas en la presente memoria, y vectores que comprenden dichos polinucleótidos, por ejemplo, donde los polinucleótidos están funcionalmente enlazados a uno o más elementos reguladores. También se incluyen células hospedantes recombinantes que comprenden dichos polinucleótidos, vectores, proteínas de fusión y fusiones de anticuerpo y métodos de producción recombinante de los anteriores.

Las proteínas de fusión y fusiones de anticuerpo se pueden preparar mediante el uso de técnicas estándar. Preferiblemente, sin embargo, una proteína de fusión se expresa como una proteína recombinante en un sistema de expresión, según se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Las proteínas de fusión pueden contener una o múltiples copias de una secuencia de p97 y una o múltiples copias de una secuencia de trastuzumab, presentes en cualquier disposición deseada.

Los polinucleótidos y polinucleótidos de fusión pueden contener una o múltiples copias de un ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica de p97 y/o una o múltiples copias de un ácido nucleico que codifica una secuencia de trastuzumab.

Para las proteínas de fusión, los componentes de secuencias de ADN que codifican la secuencia polipeptídica de p97, la secuencia de trastuzumab de interés y, opcionalmente, un enlazador peptídico se puede ensamblar por separado y a continuación ligarse en un vector de expresión adecuado. El extremo hacia 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se puede ligar, con o sin un enlazador peptídico, al extremo hacia 5' de una secuencia de ADN que codifica el(los) otro(s) componente(s) polipeptídico(s) de manera que los marcos de lectura de las secuencias estén dentro del mismo marco. Las secuencias de ADN ligadas se enlazan funcionalmente a elementos reguladores de la transcripción y/o traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN habitualmente solo se ubican hacia 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, los codones de terminación necesarios para detener las señales de terminación de traducción y transcripción están solo presentes hacia 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido más cercano al extremo C. Esto permite la traducción en un único polipéptido de fusión que conserva la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Se pueden aplicar técnicas similares, principalmente la disposición de los elementos reguladores tales como promotores, codones de terminación y señales de terminación de la transcripción, para la producción recombinante de proteínas que no tienen fusión, por ejemplo, secuencias de trastuzumab sin fusión para la producción de anticuerpos que comprenden una proteína de fusión descrita en la presente memoria.

Se pueden elegir o construir vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, fagos, p. ej., víricos o fagémidos, según sea adecuado. Para obtener detalles adicionales ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, o actualizaciones posteriores de este.

Como lo entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que poseen codones de origen no natural. Por ejemplo, se pueden seleccionar los codones preferidos por un hospedante procariota o eucariota particular para aumentar la tasa de expresión proteica o para producir un transcrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tal como una semivida que es más extensa que la de un transcrito generado a partir de la secuencia de origen natural. Dichos polinucleótidos se denominan comúnmente "optimizados por codón". Cualesquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria se pueden usar en una forma optimizada por codón. En ciertas realizaciones, un polinucleótido se puede optimizar por codón para su uso en bacterias específicas tales como E. coli o levadura tal como S. cerevisiae (ver, p. ej., Burgess-Brown et al., Protein Expr Purif. 59:94-102, 2008).

Las secuencias polinucleotídicas ilustrativas se proporcionan en la Tabla 5 a continuación.

Por lo tanto, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión o fusión de anticuerpo descrita en la presente memoria, o una porción de estas, puede comprender una o más secuencias polinucleotídicas de la Tabla 5 (p. ej., SEQ ID N^oS:125-138), o un fragmento/variante de estas.

En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos o vectores que codifican un polipéptido de p97 objeto, un polipéptido de trastuzumab (p. ej., polipéptido de cadena ligera, polipéptido de cadena pesada) y/o una proteína de fusión de p97-trastuzumab se introducen directamente en una célula hospedante, y la célula se incuba en condiciones suficientes para inducir la expresión del(de los) polipéptido(s) codificado(s). Por lo tanto, según ciertas realizaciones relacionadas, se proporciona una célula hospedante recombinante que comprende un polinucleótido o un polinucleótido de fusión que codifica una o más proteínas de fusión descritas en la presente memoria, opcionalmente en combinación con otros componentes (sin fusión) de un anticuerpo, y que comprende opcionalmente secuencias polinucleotídicas heterólogas adicionales.

La expresión de una proteína de fusión o fusión de anticuerpo en la célula hospedante se puede lograr al cultivar las células hospedantes recombinantes (que contienen el(los) polinucleótido(s)) en condiciones adecuadas. Después de la producción por expresión, el(los) polipéptido(s), proteínas de fusión y/o fusiones de anticuerpo se pueden aislar y/o purificar mediante el uso de cualquier técnica adecuada y después usarse según se desee. El término "célula hospedante" se usa para hacer referencia a una célula en la que se ha introducido, o que es capaz de tener introducida en ella, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de los polipéptidos descritos en la presente memoria, y que expresa, además, o es capaz de expresar un gen de interés seleccionado, tal como un gen que codifica cualquier polipéptido descrito en la presente memoria. El término incluye la progenie de la célula original, sea o no la progenie idéntica en morfología o en composición genética al genitor original, siempre que el gen seleccionado esté presente. Las células hospedantes se pueden elegir por ciertas características, por ejemplo, la expresión de una aminoacil ARNt sintetasa(s) que puede incorporar aminoácidos no naturales en el polipéptido.

Los sistemas para la clonación y la expresión de una proteína en una variedad de células hospedantes diferentes se conocen. Las células hospedantes adecuadas incluyen células de mamífero, bacterias, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de bebé de hámster, células HEK-293, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Los ejemplos adicionales de líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles incluyen la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATc C CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep g2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluidas células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para acceder a una reseña de ciertas líneas celulares hospedantes de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpo, ver, p. ej., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, tomo 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), págs. 255-268. Ciertos sistemas de expresión en células de mamíferos preferidos incluyen los sistemas de expresión basados en células CHO y HEK293. Los sistemas de expresión en mamíferos pueden usar líneas celulares acopladas, por ejemplo, en matraces T, frascos rotativos o fábricas celulares, o cultivos en suspensión, por ejemplo, en centrifugadores de 1L y 5L, biorreactores de tanque con agitación de 5L, 14L, 40L, 100L y 200L o biorreactores WAVE de 20/50L y 100/200L, entre otros conocidos en la técnica.

Un hospedante bacteriano común preferido es E. coli. La expresión de proteínas en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. Para acceder a una reseña, ver, por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology. 9:545-551 (1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción recombinante de polipéptidos (ver, Ref, Curr. Opinion Biotech. 4:573-576, 1993; y Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553-560, 1995). En realizaciones específicas, la expresión proteica se puede controlar mediante una ARN polimerasa T7 (p. ej., la serie de vectores pET). Estas y realizaciones relacionadas pueden usar la cepa hospedante para expresión b L21(DE3), un lisógeno ADE3 de BL21 que admite la expresión mediada por T7 y carece de Ion y ompT proteasas para una estabilidad mejorada de la proteína diana. También se incluyen cepas hospedantes de expresión que llevan plásmidos que codifican ARNt rara vez usados en E. coli, tales como las cepas Rosetta™ (DE3) y Rosetta 2 (DE3). La lisis celular y la manipulación de muestras también se pueden mejorar mediante el uso de reactivos tales como nucleasa Benzonase® y reactivo de extracción proteica BugBuster®. Para el cultivo celular, los medios autoinductores pueden mejorar la eficacia de muchos sistemas de expresión, incluidos sistemas de expresión de alto rendimiento. Los medios de este tipo (p. ej., el sistema de autoinducción Overnight Express™) gradualmente desencadenan la expresión proteica a través de desplazamiento metabólico sin la adición de agentes inductores artificiales tales como IPTG. Realizaciones específicas emplean etiquetas de hexahistidina (tales como fusiones His^Tag®) y posterior purificación mediante cromatografía de afinidad con inmovilización en metal (IMAC, por sus siglas en inglés) o técnicas relacionadas. En ciertos aspectos, sin embargo, las proteínas de grado clínico se pueden aislar a partir de cuerpos de inclusión de E. coli, sin o sin el uso de etiquetas de afinidad (ver, p. ej., Shimp et al., Protein Expr Purif. 50:58-67, 2006). Como ejemplo adicional, ciertas realizaciones pueden emplear un sistema de producción de alto rendimiento en E. coli inducido por choque frío, dado que la sobreexpresión de proteínas en Escherichia coli a baja temperatura mejora su solubilidad y estabilidad (ver, p. ej., Qing et al., Nature Biotechnology. 22:877-882, 2004).

Además, una cepa de célula hospedante se puede elegir por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, modificaciones postraducción tales como acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraducción, que escinde una forma "prepro" de la proteína, también se puede usar para facilitar la correcta inserción, plegado y/o función. Se pueden elegir diferentes células hospedantes tales como levadura, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, además de células bacterianas, que tienen o incluso carecen de maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraducción, para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína de fusión o fusión de anticuerpo de interés.

Para una producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere generalmente una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de interés se pueden transformar mediante el uso de vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en un vector separado. Después de la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante aproximadamente 1-2 días en medios enriquecidos antes de pasarlas a medios selectivos. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable se pueden proliferar mediante el uso de técnicas de cultivo de tejido adecuadas para el tipo celular. También se puede emplear la producción transitoria, tal como por transfección o infección transitoria. Los sistemas de expresión en mamíferos ilustrativos que son adecuados para la producción transitoria incluyen sistemas basados en HEK293 y CHO.

Las células hospedantes transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. Ciertas realizaciones específicas usan sistemas de expresión celular sin suero. Los ejemplos incluyen células HEK293 y células CHO que pueden crecer en medio sin suero (ver, p. ej., Rosser et al., Protein Expr. Purif. 40:237-43, 2005; y la patente estadounidense número 6210922).

La(s) proteína(s) producida mediante una célula recombinante se puede(n) purificar y caracterizar según una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Los sistemas ilustrativos para llevar a cabo la purificación proteica y analizar la pureza de la proteína incluyen cromatografía de líquidos de proteína rápida (FPLC, por sus siglas en inglés) (p. ej., los sistemas de FPLC AKTA y Bio-Rad), cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) (p. ej., HPLC de Beckman and Waters). Las químicas ilustrativas para la purificación incluyen cromatografía de intercambio iónico (p. ej., Q, S), cromatografía de exclusión por tamaño, gradientes de sal, purificación por afinidad (p. ej., Ni, Co, FLAG, maltosa, glutatión, proteína A/G), filtración en gel, fase inversa, cromatografía de intercambio iónico en cerámica HyperD® y columnas de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés), entre otras conocidas en la técnica. También se incluyen métodos analíticos tales como SDS-PAGE (p. ej., coomassie, tinción con plata), inmunotransferencia, Bradford y ELISA, que se pueden usar durante cualquier etapa del proceso de producción o purificación, típicamente para medir la pureza de la composición proteica.

Se incluyen, además, métodos para concentrar proteínas producidas de manera recombinante, p. ej., anticuerpos. Los ejemplos incluyen liofilización, que se emplea típicamente cuando la disolución contiene pocos componentes solubles distintos de la proteína de interés. La liofilización se lleva a cabo frecuentemente después de un ciclo de HPLC y puede retirar la mayoría o todos los componentes volátiles de la mezcla. También se incluyen técnicas de ultrafiltración que emplean, típicamente, una o más membranas permeables selectivas para concentrar una disolución proteica. La membrana permite que el agua y moléculas pequeñas pasen a través de ella y retiene la proteína; la disolución se puede impulsar contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación, entre otras técnicas.

En ciertas realizaciones, las proteínas de fusión o proteínas de fusión de anticuerpo tienen una pureza de al menos aproximadamente 90 %, según se mide de acuerdo con técnicas rutinarias en la técnica. En ciertas realizaciones, tales como composiciones de diagnóstico o ciertas composiciones terapéuticas, las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo tienen una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En realizaciones específicas, tales como composiciones terapéuticas o farmacéuticas, las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo tienen una pureza de al menos aproximadamente 97 % o 98 % o 99 %. En otras realizaciones, tales como cuando se usan como reactivos de referencia o investigación, las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo pueden tener una pureza menor, y pueden tener una pureza de al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 % u 80 %. La pureza se puede medir en general o en relación con componentes seleccionados, tales como otras proteínas, p. ej., pureza en función de una proteína.

En ciertas realizaciones, según se indicó anteriormente, las composiciones descritas en la presente están aproximadamente libres sustancialmente de endotoxinas, incluso, por ejemplo, aproximadamente 95 % libres de endotoxinas, preferiblemente, aproximadamente 99 % libres de endotoxinas y, más preferiblemente, aproximadamente 99,99 % libres de endotoxinas. La presencia de endotoxinas se puede detectar según técnicas rutinarias en la técnica, según se describen en la presente memoria. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo se producen a partir de una célula eucariota tal como una célula de mamífero o humano en medios sustancialmente sin suero.

Métodos de uso Composiciones farmacéuticas

Ciertas realizaciones se refieren a métodos de uso de las proteínas de fusión de p97-trastuzumab y/o proteínas de fusión de anticuerpo relacionadas descritas en la presente memoria. Los ejemplos de dichos métodos incluyen métodos de tratamiento y métodos de diagnóstico, el último incluye, por ejemplo, la generación de imágenes con fines médicos de ciertos órganos/tejidos, tales como los del sistema nervioso central. Realizaciones específicas incluyen métodos para tratar y/o diagnosticar trastornos o afecciones del sistema nervioso central (CNS), o trastornos o afecciones que tienen un componente del CNS. También se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de p97-trastuzumab y/o proteínas de fusión de anticuerpo relacionadas descritas en la presente memoria.

Por consiguiente, ciertas realizaciones incluyen métodos para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar una proteína de fusión de p97-trastuzumab o proteína de fusión de anticuerpo descritas en la presente memoria. En realizaciones específicas, los métodos comprenden administrar una proteína de fusión de p97-anticuerpo que comprende una o más proteínas de fusión de p97-trastuzumab descritas en la presente memoria (p. ej., como al menos un componente del anticuerpo o molécula similar a anticuerpo), y opcionalmente otros componentes de anticuerpo sin fusión (p. ej., cadena(s) ligera(s) sin fusión, cadena(s) pesada(s) sin fusión). También se incluyen métodos para suministrar dichas moléculas al sistema nervioso (p. ej., tejidos del sistema nervioso central) de un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una proteína de fusión de p97-trastuzumab o fusión de anticuerpo descritas en la presente memoria.

En algunas realizaciones, los métodos aumentan la tasa y/o cantidad de suministro de anticuerpo trastuzumab (o fragmento de unión a antígeno de este) a los tejidos del sistema nervioso central del sujeto, con respecto, por ejemplo, al suministro mediante una composición que comprende el anticuerpo trastuzumab (o fragmento de unión a antígeno de este) solo. En ciertas realizaciones, los métodos reducen la distribución del anticuerpo trastuzumab (o fragmento de unión a antígeno de este) a los tejidos del corazón del sujeto, con respecto, por ejemplo, a la distribución mediante una composición que comprende el anticuerpo trastuzumab (o fragmento de unión a antígeno de este) solo, y reducen, de este modo, la cardiotoxicidad asociada a trastuzumab.

En algunos casos, un sujeto tiene una enfermedad, trastorno o afección que está asociado al sistema nervioso central (CNS) o que tiene un componente del CNS, donde un mayor suministro del anticuerpo trastuzumab (o fragmento de unión a antígeno de este) a través de la barrera hematoencefálica a los tejidos del CNS con respecto a tejidos periféricos puede mejorar el tratamiento, por ejemplo, al aumentar la concentración en el tejido del anticuerpo en el CNS, y/o al reducir los efectos secundarios asociados a la exposición del anticuerpo a tejidos/órganos periféricos.

Ciertas realizaciones incluyen el tratamiento de diversos cánceres. "Cáncer" se refiere generalmente a una clase de enfermedades o afecciones en las que un grupo de células exhiben uno o más de crecimiento no controlado (es decir, división más allá de los límites normales), invasión (es decir, intrusión en y destrucción de tejidos adyacentes), y/o metástasis (es decir, expansión a otras ubicaciones en el cuerpo a través de la linfa o sangre). Estas propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los cánceres benignos, que están autolimitados y típicamente no invaden ni hacen metástasis. Se incluyen cánceres del sistema nervioso central (CNS), o cánceres neurológicos, tales como cánceres cerebrales.

En algunos casos, el cáncer neurológico es cáncer cerebral metastásico. Los ejemplos de cánceres que pueden hacer metástasis en el cerebro incluyen, sin limitación, cánceres de mama, cánceres de pulmón, cánceres del aparato genitourinario, cánceres del tracto gastrointestinal (p. ej., cánceres colorrectales, carcinomas pancreáticos), osteosarcomas, melanomas, cánceres de vías respiratorias y digestivas altas, cánceres de próstata (p. ej., adenocarcinomas prostáticos) y linfomas. Ciertas realizaciones incluyen, por lo tanto, métodos para tratar, inhibir o prevenir la metástasis de un cáncer al administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión descrita en la presente memoria (p. ej., en una cantidad que, después de la administración, inhibe, previene o retarda la metástasis de un cáncer de manera estadísticamente significativa, es decir, con respecto a un testigo adecuado, como lo sabrán los expertos en la técnica). En realizaciones específicas, el sujeto tiene un cáncer que presenta riesgo, pero todavía no ha hecho metástasis en el sistema nervioso central, incluido uno o más de los cánceres mencionados anteriormente, entre otros conocidos en la técnica.

En algunos aspectos, el sujeto tiene un cáncer asociado a la expresión de Her2/neu. En aspectos específicos, el sujeto tiene un cáncer que expresa Her2/neu o sobreexpresa Her2/neu. Por consiguiente, ciertas realizaciones incluyen métodos para el tratamiento de un cáncer que sobreexpresa HER2 en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una (p. ej., cantidad terapéuticamente eficaz de una) proteína de fusión de p97-anticuerpo (descrita en la presente memoria) o una composición farmacéutica que la comprende. En algunas realizaciones, el cáncer que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En realizaciones específicas, el cáncer que sobreexpresa HER2 ha hecho metástasis en el CNS del sujeto. En algunos aspectos, la fusión de anticuerpo se administra en una cantidad que inhibe, previene o retarda la progresión y/o metástasis del cáncer de manera estadísticamente significativa (es decir, con respecto a un testigo adecuado, como lo sabrán los expertos en la técnica). Se incluyen cantidades que inhiben, previenen o retardan la progresión y/o metástasis en tejidos del CNS, y aquellas que inhiben, previenen o retardan la progresión y/o metástasis dentro de los tejidos del CNS.

En ciertos aspectos, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico o cáncer uterino. En aspectos específicos, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un cáncer de mama metastásico, cáncer de ovario metastásico, cáncer gástrico metastásico o una forma metastásica o agresiva de cáncer uterino. En algunos aspectos, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un cáncer de mama que sobreexpresa HER2, tal como un cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2. En ciertos casos, el cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En ciertos casos, el cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2 ya ha hecho metástasis en el CNS del sujeto. En algunos casos, la fusión de p97-anticuerpo se administra con paclitaxel para un tratamiento de primera línea del cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2. En casos específicos, la fusión de p97-anticuerpo se administra como un único agente para el tratamiento de un cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2 en pacientes que han recibido uno o más regímenes de quimioterapia para la enfermedad metastásica.

Ciertas realizaciones incluyen administrar la de fusión de p97-anticuerpo o composición farmacéutica como parte de un tratamiento adyuvante para un cáncer de mama que sobreexpresa HER2. En algunos aspectos, el tratamiento adyuvante comprende doxorrubicina, ciclofosfamida y paclitaxel o docetaxel. En algunos aspectos, el tratamiento adyuvante comprende docetaxel y carboplatino. Ciertos aspectos incluyen administrar la de fusión de p97-anticuerpo o composición farmacéutica como un único agente después de terapia basada en antraciclina multimodal.

En algunos aspectos, el cáncer que sobreexpresa HER2 es un adenocarcinoma gástrico o de unión gastroesofágica metastásico que sobreexpresa HER2. En algunos casos, el adenocarcinoma gástrico o de unión gastroesofágica metastásico que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En ciertos casos, el adenocarcinoma gástrico o de unión gastroesofágica metastásico que sobreexpresa HER2 ya ha hecho metástasis en el CNS del sujeto. En algunos casos, la fusión de p97-anticuerpo se administra en combinación con cisplatino y capecitabina o 5-fluorouracilo, opcionalmente donde el sujeto o paciente no ha recibido tratamiento previo para la enfermedad metastásica.

En ciertos aspectos, el cáncer uterino que sobreexpresa HER2 es un carcinoma seroso uterino (USC) que sobreexpresa HER2 (ver, p. ej., Santin et al., Int J Gynaecol Obstet. 102:128-31, 2008). El USC, también conocidos como carcinoma seroso papilar uterino (UPSC, por sus siglas en inglés) y adenocarcinoma seroso uterino, es una forma de cáncer de endometrio que típicamente aparece en mujeres postmenopáusicas. En algunos casos, el USC que sobreexpresa HER2 presenta riesgo de hacer metástasis en el CNS del sujeto. En ciertos casos, el USC que sobreexpresa HER2 ya ha hecho metástasis en el CNS del sujeto.

Los métodos para identificar sujetos con una o más de las enfermedades o afecciones descritas en la presente memoria se conocen en la técnica.

También se incluyen métodos para generar imágenes de un componente orgánico o tisular en un sujeto, que comprenden (a) administrar al sujeto una composición que comprende una proteína de fusión o fusión de anticuerpo descrita en la presente memoria, que se conjuga con una entidad detectable, y (b) visualizar la entidad detectable en el sujeto, órgano o tejido.

En realizaciones específicas, el compartimiento de órgano o tejido comprende el sistema nervioso central (p. ej., cerebro, tronco encefálico, médula espinal). En realizaciones específicas, el compartimiento de órgano o tejido comprende el cerebro o una porción de este, por ejemplo, el parénquima del cerebro.

Se puede emplear una variedad de métodos para visualizar la entidad detectable en el sujeto, órgano o tejido. Los métodos no invasivos ilustrativos incluyen radiografía, tal como fluoroscopía y radiografías de proyección, TC o TAC (tomografía computarizada (TC) o tomografía axial computarizada (TAC)), ya sea con el empleo de TC por rayos X, tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) o tomografía de emisión monofotónica (SPECT, por sus siglas en inglés) y ciertos tipos de generación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés), especialmente los que usan agentes de contraste, incluidas combinaciones de estos.

Meramente a modo de ejemplo, la PET se puede llevar a cabo con agentes de contraste o radioisótopos emisores de positrones tales como 18F, la SPECT se puede llevar a cabo con agentes de contraste o radioisótopos emisores de gamma tales como 201Tl, 99mTC, 123I y 67Ga, y la MRI se puede llevar a cabo con agentes de contraste o radioisótopos tales como 3H, 13C, 19F, 17O, 23Na, 31P y 129Xe, y Gd (gadolidinio; complejos de Gd (III) orgánicos quelados). Uno cualquiera o más de estos agentes de contraste o radioisótopos ilustrativos se pueden conjugar o incorporar de cualquier otra manera en un polipéptido de p97 y administrarse a un sujeto con el fin de generar imágenes. Por ejemplo, los polipéptidos de p97 se pueden etiquetar directamente con uno o más de estos radioisótopos, o conjugarse con moléculas (p. ej., moléculas pequeñas) que comprenden uno o más de estos agentes de contraste radioisotópicos, o cualesquiera otros descritos en la presente memoria.

Para el uso in vivo, por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad humana, generación de imágenes para fines médicos o evaluación, las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo descritas en la presente memoria se incorporan generalmente en una composición farmacéutica antes de la administración. Una composición farmacéutica comprende una o más de las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo descritas en la presente memoria en combinación con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable, farmacéuticamente aceptables o de grado farmacéutico.

Para preparar una composición farmacéutica, se mezcla una cantidad eficaz o deseada de una o más proteína de fusión o fusiones de anticuerpo con cualquier portador(es) farmacéutico(s) o excipiente conocido para los expertos en la técnica por ser adecuado para el modo de administración específico. Un portador farmacéutico puede ser líquido, semilíquido o sólido. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir, por ejemplo, un diluyente estéril (tal como agua), disolución salina (p. ej., disolución salina tamponada con fosfato; PBS, por sus siglas en inglés), aceite fijo, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro disolvente sintético; agentes antimicrobianos (tales como alcohol bencílico y metilparabenos); antioxidantes (tales como ácido ascórbico y bisulfito sódico) y agentes quelantes (tales como ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA)); tampones (tales como acetatos, citratos y fosfatos). Si se administran por vía intravenosa (p. ej., mediante infusión IV), los portadores adecuados incluyen disolución salina fisiológica o disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y disoluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol, polipropilenglicol y mezclas de estos.

La administración de proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo descritas en la presente memoria, en forma pura o en una composición farmacéutica adecuada, se puede llevar a cabo a través de cualquier modo de administración aceptado de agentes que sirven para utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar al combinar una composición que contiene una proteína de fusión o fusión de anticuerpo con un portador, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable adecuado, y se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, disoluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Además, otros ingredientes farmacéuticamente activos (incluidas otras moléculas pequeñas según se describen en otra parte en la presente memoria) y/o excipientes adecuados tales como sales, tampones y estabilizadores pueden estar presentes dentro de la composición, pero no necesariamente.

La administración se puede lograr mediante una variedad de vías diferentes, incluidas oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica. Los modos de administración preferidos dependen de la naturaleza de la afección que se va a tratar o prevenir. Realizaciones específicas incluyen administración por infusión IV.

Los portadores pueden incluir, por ejemplo, portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se expone a ellos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una disolución tamponada por pH acuosa. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 20 (TWEEN™) polietilenglicol (PEG) y poloxámeros (PLURONICS™) y similares.

En ciertos aspectos, una proteína de fusión o fusión de anticuerpo se une a o encapsula dentro de una partícula, p. ej., una nanopartícula, perla, formulación lipídica, partícula lipídica o liposoma, p. ej., inmunoliposoma. Las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). La(s) partícula(s) o liposomas pueden comprender, además, otros agentes terapéuticos o de diagnóstico, tales como agentes citotóxicos.

La dosificación exacta y la duración del tratamiento dependen de la enfermedad que se está tratando y se pueden determinar empíricamente mediante el uso de protocolos de prueba conocidos o mediante la evaluación de las composiciones en sistemas modelo conocidos en la técnica y la extrapolación a partir esta. También se pueden llevar a cabo ensayos clínicos controlados. Las dosificaciones pueden variar también según la gravedad de la afección que se va a aliviar. Una composición farmacéutica generalmente se formula y administra para ejercer un efecto terapéuticamente útil, mientras se minimizan los efectos secundarios indeseables. La composición se puede administrar una vez o se puede dividir en varias dosis más pequeñas para administrarlas en intervalos de tiempo. Para cualquiera sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo según la necesidad del individuo.

Las vías de administración típicas de estas y composiciones farmacéuticas relacionadas incluyen, por lo tanto, sin limitación, oral, tópica, transdérmica, inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral, según se usa en la presente memoria, incluye inyecciones subcutáneas, técnicas de inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraesternal. Las composiciones farmacéuticas según ciertas realizaciones de la presente invención se formulan para permitir que los ingredientes activos contenidos en ellas estén biodisponibles después de la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o más dosificaciones unitarias donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una dosificación unitaria simple, y un contenedor de un conjugado descrito en la presente memoria en forma de aerosol puede alojar una pluralidad dosificaciones unitarias. Los métodos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composición que se va a administrar típicamente contendrá una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión o fusión de anticuerpo descrita en la presente memoria, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés.

Una composición farmacéutica puede estar en forma de un sólido o líquido. En una realización, el(los) portador(es) están particulados, de manera que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimido o polvo. El(los) portador(es) pueden ser líquidos, con las composiciones que son, por ejemplo, un aceite oral, un líquido inyectable o un aerosol, que es útil, por ejemplo, en la administración por inhalación. Cuando se prevé la administración oral, la composición farmacéutica preferiblemente está en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, suspensión y gel se incluyen dentro de las formas consideradas en la presente memoria como sólidas o líquidas.

Como una composición sólida para administración oral, la composición farmacéutica se puede formular en polvo, gránulo, comprimido, pastilla, cápsula, goma de mascar, oblea o similares. Dicha composición sólida típicamente contendrá uno o más diluyentes inertes o portadores comestibles. Además, uno o más de los siguientes pueden estar presentes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato sódico, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; fluidificantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja; y un agente colorante. Cuando la composición farmacéutica está en forma de cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo indicado anteriormente, un portador líquido tal como polietilenglicol o aceite.

La composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, disolución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para suministro mediante inyección, como dos ejemplos. Cuando está prevista para administración oral, la composición preferida contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y potenciador de sabor. En una composición prevista para administración mediante inyección, se puede incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sean disoluciones, suspensiones u otras formas similares, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, disolución salina, preferiblemente disolución salina fisiológica, disolución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilenodiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral se puede alojar en ampollas, jeringas descartables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico. La disolución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.

Una composición farmacéutica líquida prevista para administración parenteral u oral debería contener una cantidad de una proteína de fusión o fusión de anticuerpo tal que se obtuviera una dosificación adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos 0,01 % del agente de interés en la composición. Cuando está prevista para administración oral, esta cantidad se puede variar entre 0,1 y aproximadamente 70 % del peso de la composición. Ciertas composiciones farmacéuticas orales contienen entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 75 % del agente de interés. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y preparaciones según la presente invención se preparan de manera que una dosificación unitaria parenteral contenga entre 0,01 y 10 % en peso del agente de interés antes de la dilución.

La composición farmacéutica puede estar prevista para administración tópica, en tal caso el portador puede comprender, de manera adecuada, una base de disolución, emulsión, ungüento o gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. Puede haber agentes espesantes presentes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si está prevista para administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis.

La composición farmacéutica puede estar prevista para administración rectal en forma de, por ejemplo, un supositorio, que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa tal como un excipiente no irritante adecuado. Duchas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.

La composición farmacéutica puede incluir diversos materiales que modifican la forma física de una dosificación unitaria sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una cubierta de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de recubrimiento son típicamente inertes y se pueden seleccionar de, por ejemplo, azúcar, laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Alternativamente, los ingredientes activos se pueden encapsular en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une al conjugado o agente y ayuda, de este modo, en el suministro del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar de este modo incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales, una o más proteínas o un liposoma.

La composición farmacéutica puede consistir esencialmente en dosificaciones unitarias que se pueden administrar como un aerosol. El término aerosol se usa para denotar una variedad de sistemas que varían de los de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en envases presurizados. El suministro puede hacerse mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dispensa los ingredientes activos. Los aerosoles se pueden suministrar en un sistema de fase simple, bifásicos o trifásicos para suministrar el(los) ingrediente(s) activo(s). El suministro del aerosol incluye el contenedor, activadores, válvulas, subcontenedores y similares necesarios, que juntos pueden formar un kit. Un experto en la técnica sin experimentación indebida puede determinar los aerosoles preferidos.

Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden preparar con portadores que protegen las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como formulaciones o recubrimientos de liberación prolongada. Dichos portadores incluyen formulaciones de liberación controlada, tales como, pero sin limitarse a, implantes y sistemas de suministro microencapsulados, y polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenvinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido poliláctico y otros conocidos para los expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante metodología conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica prevista para administración mediante inyección puede comprender uno o más de sales, tampones y/o estabilizadores, con agua estéril, destilada para formar una disolución. Se puede agregar un tensioactivo para facilitar la formación de una disolución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interactúan de manera no covalente con el conjugado para facilitar la disolución o suspensión homogénea del conjugado en el sistema de suministro acuoso.

Las composiciones se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará dependiendo de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado; la estabilidad metabólica y la extensión de la acción del compuesto; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el modo y tiempo de administración; la velocidad de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o afección específico; y si el sujeto se somete a tratamiento. Generalmente, una dosis diaria terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,001 mg/kg (es decir, ~ 0,07 mg) a aproximadamente 100 mg/kg (es decir, ~ 7,0 g); preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,01 mg/kg (es decir, ~ 0,7 mg) a aproximadamente 50 mg/kg (es decir, ~ 3,5 g); más preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 1 mg/kg (es decir, ~ 70 mg) a aproximadamente 25 mg/kg (es decir, ~ 1,75 g).

Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar también simultáneamente con, antes o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos distintos, según se describió en la presente memoria. Por ejemplo, en una realización, el conjugado se administra con un agente antiinflamatorio. Los fármacos o agentes antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (incluidos betametasona, budesónida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) incluidas aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.

En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar junto con cualquier cantidad de agentes quimioterapéuticos o citotóxicos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos o citotóxicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluidas altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados de ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos incluidos, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolido y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Dicha politerapia puede incluir la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica, que contiene un compuesto de la invención (es decir, proteína de fusión, proteína de fusión de anticuerpo) y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de composiciones que comprenden conjugados de la invención y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, una proteína de fusión o fusión de anticuerpo según se describe en la presente memoria y el otro agente activo se pueden administrar al paciente juntos en una única composición de dosificación oral tal como un comprimido o cápsula, o cada agente se administra en formulaciones de dosificación orales separadas. De manera similar, una proteína de fusión o fusión de anticuerpo según se describe en la presente memoria y el otro agente activo se pueden administrar al paciente juntos en una única composición de dosificación parenteral tal como en una disolución salina u otra disolución fisiológicamente aceptable, cada agente se administra en formulaciones de dosificación parenterales separadas. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, las composiciones que comprenden las proteínas de fusión o fusiones de anticuerpo y uno o más agentes activos adicionales se pueden administrar esencialmente al mismo tiempo, es decir, concomitantemente, o en momentos separados en el tiempo, es decir, secuencialmente y en cualquier orden; se entiende que la politerapia incluye todos estos regímenes.

Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria se pueden combinar para proporcionar realizaciones adicionales. Se pueden modificar aspectos de las realizaciones, si es necesario para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitud y publicaciones para proporcionar todavía realizaciones adicionales.

Estos y otros cambios se pueden hacer a las realizaciones en virtud de la descripción detallada anteriormente. Ejemplos

Ejemplo 1

Unión de proteínas de fusión de p97-Trastuzumab a Her2/Neu humano

Se prepararon construcciones de fusión de p97 humana (MTf)-trastuzumab y se evaluó su actividad. Las secuencias de aminoácidos de las construcciones de fusión de MTf-trastuzumab se muestran en la Tabla E1 a continuación (las SEQ ID NOs: 82, 84, 88, 90, 92 y 94 son ejemplos de referencia).

Se llevaron a cabo ensayos de unión in vitro para medir la unión de las construcciones de fusión de MTf-trastuzumab a la proteína Her2/Neu humana identificada con His (Her2-His). Se cargó Her2-His en un biosensor penta-His a una concentración de 20 ^g/ml y se sumergió en las proteínas de fusión TZM HC-MTf, MTfp NH-TZM y TZM HC-MTfp (ver la Tabla E1) y un testigo de IgG1 humana en concentraciones variables.

Los resultados del análisis de octetos en las Figuras 2A-2Dy la Tabla E2 (a continuación) demuestran la afinidad de las fusiones MTf-trastuzumab con Her2.

Las proteínas de fusión de MTf-trastuzumab demostraron una estrecha unión a Her2 humana, como se muestra mediante la constante de disociación en equilibrio (K^d), la constante de índice de asociación (Kon) y la constante de índice de disociación (Kof).

Ejemplo de referencia 2

Actividad de destrucción celular ADCC de proteínas de fusión de p97-Trastuzumab

Se evaluaron las construcciones de fusión de MTf-trastuzumab para determinar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) en células cancerosas de mama BT-474 en comparación con los testigos Herceptin® (trastuzumab) y Fc de IgG1 humana como testigos positivo y negativo, respectivamente.

Las células BT-474 se adquirieron a ATCC y se cultivaron en medio Hybri-Care complementado con 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y suero fetal bovino al 10 %. Se aislaron en el momento células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante centrifugación Histopaque y se incubaron con las células BT-474 diana etiquetadas con succinimidil éster carboxifluoresceína (CFSE, por sus siglas en inglés) en una relación de aproximadamente 30:1.

Las muestras de prueba se coincubaron con la mezcla de efector:célula diana durante cuatro horas en diez concentraciones diferentes (hasta 100 |jg / ml). Los testigos negativos incluyeron efector:células diana solo como un testigo sin anticuerpo y 100 jg/mL de Fc de IgG. Cada tratamiento se llevó a cabo por duplicado. Después de la coincubación de 4 horas, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI, por sus siglas en inglés) y se analizaron mediante citometría de flujo (FACS). El porcentaje de Pl/células CFSE+ se cuantificó como una indicación de la citotoxicidad. Se generó una curva de respuesta a la dosis al graficar la media ± rango de puntos de datos para las diez concentraciones diferentes y se calculó la CE50. Los resultados se muestran en las Figuras 3A-3B.

La Figura 3A muestra la evaluación de la ADCC de la fusión TZM/MTf en células cancerosas de mama BT-474 en comparación con Herceptin® y Fc de IgG1 humana. Aquí, la fusión de homodímero TZM/MTf indujo la ADCC con una CE50 de 0,6 jg/ml en comparación con la Herceptin® a 0,2 jg/ml.

La Figura 3B muestra la evaluación de la ADCC de las fusiones LC-MTfp/Fc-MTfp, LC-MTfp/Fc y LC/Fc-MTfp en células cancerosas de mama BT-474 en comparación con Herceptin® y Fc de IgG1 humana. Las fusiones LC-MTfp/Fc-MTfp, LC-MTfp/Fc y LC/Fc-MTfp indujeron la ADCC con una CE50 de 0,216 jg/ml, 0,171 jg/ml y 1,025 jg/ml, respectivamente. Estos datos muestran que las construcciones de fusión de MTf-trastuzumab indujeron una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo significativa en células cancerosas de mama.

Ejemplo de referencia 3

Eficacia antitumoral in vivo de proteínas de fusión de p97-Trastuzumab

Las proteínas de fusión de p97-trastuzumab se evalúan para determinar su eficacia antitumoral y efectos sobre la supervivencia en ratones a los que se inyectó intracranealmente células tumorales de mama BT-474 humanas. Específicamente, se evalúan las construcciones de fusión TZM HC-MTf y MTfp NH-TZM con respecto a Herceptin® (Trastuzumab, AMM: 5621037, ROCHE).

Compuestos de prueba. Se diluyen disoluciones concentradas de las construcciones TZM HC-MTf y MTfp NH-TZM en PBS y se administran respectivamente a 60 mg/kg y 30 mg/kg (dosis equivalente a 30 mg/kg de Herceptin®). Se prepara Herceptin® de la siguiente manera: se diluye un vial que contiene 150 mg de Herceptin® en NaCl al 0,9 % (Aguettant, Lyon, Francia) hasta una concentración final de 20 mg/mL. La disolución concentrada se almacena a 4 °C durante todo el estudio. Cada día de administración a los ratones, la disolución concentrada se diluye en NaCl al 0,9 % hasta alcanzar una concentración final de 3 mg/mL. Se administra Herceptin® a 30 mg/kg.

Todos los compuestos se administran mediante inyección intravenosa (IV, bolo) en la vena de la cola de ratones a un volumen de dosis de 10 mL/kg/iny. (es decir, para un ratón que pesa 20 g, se administran 200 jL de sustancia de prueba).

Línea celular cancerosa. La línea celular BT-474 se adquiere a ATCC. Se aisló originalmente a partir de un carcinoma de mama ductal invasivo sólido de una paciente de sexo femenino caucásica de 60 años (Lasfargues et al., J Natl Cancer Inst. 61:967-78, 1978). Las células tumorales se cultivan como una monocapa a 37 °C en una atmósfera humidificada (CO2 al 5 %, aire al 95 %). El medio de cultivo contiene DMEM complementado con 2mM de L glutamina (ref.: BE12-604F, Lonza, Verviers, Bélgica) y suero fetal bovino al 10 % (ref.: 3302, Lonza). Las células son adherentes a matraces plásticos. Para uso experimental, las células tumorales se desprenden del matraz de cultivo mediante un tratamiento de 5 minutos con tripsina-verseno (ref.: BE02-007E, Lonza), en medio de Hanks sin calcio ni magnesio (ref.: BE10-543F, Lonza) y se neutralizan mediante la adición de medio de cultivo completo. Las células se cuentan en un hemocitómetro y se evalúa su viabilidad mediante un ensayo de exclusión con azul tripán al 0,25 %.

Animales. Se obtienen sesentaiún ratones hembra Balb/C nu/nu (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) sanos, de 5-6 semanas de CHARLES RIVER (L'Arbresles). Los animales se mantienen en habitaciones de alojamiento en condiciones ambientales controladas: Temperatura: 22 ± 2 °C, Humedad 55 ± 10 %, Fotoperíodo (12 h luz/12 h oscuridad), aire filtrado por HEPA, 15 intercambios de aire por hora sin recirculación.

Los recintos para los animales proporcionan un especio estéril y adecuado con material de cama, alimento y agua, enriquecimiento ambiental y social (alojamiento en grupo) según se describe: Jaulas tipo III o IV Eurostandard con filtro superior de policarbonato, camas de zuro de maíz (ref.: LAB COB 12, SERLAB, Francia), dieta irradiada 25 kGy (Ssniff® Soest, Alemania), alimento completo para roedores inmunodeficientes - pieza extruida de NM, alimento completo para roedores inmunocompetentes - pieza extruida de R/M-H, estéril, filtrada a 0,2 pm de agua (complementada con 2,5 pg/mL de estradiol), enriquecimiento ambiental (SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, Francia).

Inducción de tumores BT-474. Para la inyección estereotáxica de células tumorales, los ratones se anestesian mediante una inyección intraperitoneal de 70 mg/kg de Ketamina (Ketamine500®, Ref. 043KET204, Centravet, Francia) y 5 mg/kg de Xilazina (Rompun®, Ref. 002ROM001, Centravet, Francia) en disolución de NaCl al 0,9 % a 10 mL/kg/iny. Los tumores se inducen mediante la inyección estereotáxica de 1x105 de células BT-474 en 2 pL de RPMI 1640 de 52 animales hembra. La implantación de la célula tumoral BT-474 se lleva a cabo 24 a 72 horas después de una irradiación de todo el cuerpo con una fuente de ^y(2 Gy, 60Co, BioMep, Breteniéres, Francia).

La suspensión de células tumorales se inyecta en el núcleo caudado del hemisferio cerebral derecho a una velocidad de 0,5 pL/min. Cinco minutos después de finalizar la inyección, la aguja se retira lentamente 1 mm cada minuto. Se inyecta carprofeno (dosis: 5 mg/kg) subcutáneamente al finalizar la cirugía y 24 h después de la cirugía. El día de la implantación de la célula tumoral se considera como el día cero (D0).

Pauta de tratamiento. El tratamiento se inicia el día cinco (D5). Cuarenta animales (40) de los cincuenta y dos (52) se aleatorizan según su peso corporal individual en 4 grupos cada uno de 10 animales mediante el uso del programa informático Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, France). Se lleva a cabo una prueba estadística (análisis de varianza) para evaluar la homogeneidad entre grupos. La pauta de tratamiento es la siguiente:

• Los ratones del grupo 1 reciben dos administraciones IV semanales de vehículo durante 6 semanas consecutivas.

• Los ratones del grupo 2 reciben dos administraciones IV semanales de TZM HC-MTf a una dosis equivalente de 30 mg/kg de Herceptin® durante 6 semanas consecutivas.

• Los ratones del grupo 3 reciben dos administraciones IV semanales de MTfp NH-TZM a una dosis equivalente de 30 mg/kg de Herceptin® durante 6 semanas consecutivas.

• Los ratones del grupo 4 reciben dos administraciones IV semanales de Herceptin® a 30 mg/kg durante 6 semanas consecutivas.

La pauta de tratamiento se resume en la Tabla E3 a continuación:

Monitorización. Todos los datos del estudio, incluidas las mediciones del peso corporal de los animales, los registros clínicos y de mortalidad y el tratamiento se pautan y registran en la base de datos de Vivo Manager® (Biosystemes, Dijon, Francia). La viabilidad y conducta se registran cada día. Los pesos corporales se miden dos veces por semana.

Se miden los siguientes criterios de valoración humanos (Workman et al., Br J Cancer. 102:1555-77, 2010).

• Signos de dolor, sufrimiento o malestar: postura de dolor, máscara de dolor, conducta

• pérdida de 20 % de peso corporal durante 3 días consecutivos

Mala condición corporal, demacración, caquexia, deshidratación

Ausencia prolongada de respuestas voluntarias a estímulos externos

Respiración dificultosa rápida, anemia, sangrado significativo

Signos neurológicos: caminaren círculos, convulsión, parálisis

Disminución constante de la temperatura corporal

Dilatación abdominal

La necropsia (examen macroscópico) se lleva a cabo en todos los animales sacrificados en el estudio y, si es posible, en todos los animales moribundos sacrificados o hallados muertos.

Los siguientes criterios de evaluación de la salud se determinan usando el programa informático Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Francia).

• Pesos corporales individuales y medios de los animales

• Cambio del peso corporal medio (MBWC, por sus siglas en inglés): Se calcula el cambio en peso promedio de animales tratados en porcentaje (el peso en el día B menos el peso en el día A dividido entre el peso en el día A). Los intervalos en los que se calcula el MBWC se eligen en función de las curvas de peso corporal y los días de medición del peso corporal

Generación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Los experimentos de generación de imágenes se llevan a cabo en un imán horizontal 4.7T (PharmaScan, Bruker Biospin GmbH, Alemania) equipado con un sistema en gradiente blindado activamente. Para el análisis de las imágenes, los ratones se posicionan decúbito prono en una cuna para cuerpo de ratón dedicada que se desliza en una bobina de volumen (diámetro interno de 38 mm) dentro del Pharmascan y se adquieren las imágenes con ParaVision (PV5.1, Bruker Biospin).

Durante todas las adquisiciones de imágenes, los ratones se anestesian de manera continua con el uso de isoflurano (Minerve, Bondoufle, Francia) en una mezcla de aire a través de un accesorio nasal. La temperatura corporal de los animales se mantiene dentro de niveles fisiológicos mediante un flujo de aire caliente. La velocidad de la respiración se monitoriza de manera continua mediante el uso de un sensor de presión adherido a su abdomen. Las señales fisiológicas se monitorizan a través de un ordenador portátil colocado próximo a la estación de trabajo de MRI y conectado a los sensores mediante cables de fibra óptica (SA Instruments, EE. UU.).

El agente de contraste Gadopentetato dimeglumina (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Alemania) se inyecta intravenosamente (IV) a 0,4 mmol/kg a través de la vena de la cola de los ratones.

Las imágenes se transfieren a una estación de trabajo para analizarlas mediante ImageJ (4). Las regiones de interés (ROI, por sus siglas en inglés) se dibujan manualmente en imágenes anatómicas. El volumen tumoral se calcula a partir de las ROI al multiplicar la cantidad de vóxeles de ROI por el volumen de vóxeles (en mm3). Los volúmenes tumorales en mm3 se tabulan en cada punto de tiempo y para cada nimal.

Recolección de muestras. Todos los ratones se sacrifican catorce días después del último tratamiento. Se usa recolección de sangre intracardíaca en procedimientos terminales con anestesia por gas profunda. Se recogen aproximadamente 200 ^L de sangre de diez animales por grupo en tubos de recolección de sangre con activador de coagulación. Los tubos se centrifugan 30 minutos después de obtener la muestra a 1300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para obtener el suero. Las muestras de suero se almacenan en tubos de propileno a 80 °C hasta el análisis. Inmediatamente después del sacrificio, se recogen muestras del cerebro, corazón, pulmón, hígado y riñón de cada animal, se pesan y se almacenan para el análisis.

Parámetros de eficacia. La eficacia del tratamiento se evalúa en relación con los efectos de la sustancia de prueba en los volúmenes tumorales de animales tratados con respecto a los animales testigo, según se mide mediante MRI (ver más adelante). Los parámetros de eficacia se expresan como un porcentaje de supervivencia de los tratados con respecto a los testigos (T/C%). T es la mediana de los tiempos de supervivencia de animales tratados con sustancias de prueba y C es la mediana de los tiempos de supervivencia de animales testigos tratados con vehículo. Los sistemas de supervivencia indican un grado de éxito cuando el porcentaje de T/C supera el 125 % (7). El T/C% se expresa de la siguiente manera:

^{T (mediana de tiempo de supervivencia de animales tratados)}T/C%

C (mediana de tiempo de supervivencia de vehículo - animales tratados)

Se dibujan las curvas de supervivencia y se calculan la mediana de los tiempos de supervivencia y la media.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión de p97 (melanotransferrina)-trastuzumab que comprende una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo N de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio, en donde la secuencia de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

2. Una proteína de fusión de p97 (melanotransferrina)-trastuzumab que comprende una secuencia de cadena pesada de trastuzumab fusionada al extremo C de una secuencia de p97 y un enlazador opcional entremedio, en donde la secuencia de p97 consiste en la secuencia de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la secuencia de cadena pesada de trastuzumab comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el enlazador es un enlazador que contiene Gly, Ser y/o Asn como se indica a continuación: enlazadores [G]x, [S]x, [N]x, [GS]x, [GGS]x, [GSS]x, [GSGS]x (SEQ I D NO:47), [GGSG]x (SEQ ID NO:48), [GGGS]x (SEQ ID NO:49), [GGGGS]x (SEQ ID NO:50), [GN]x, [GGN]x, [GNN]x, [GNGN]x (SEQ ID NO:51), [GGNG]x (SEQ ID NO:52), [GGGN]x (SEQ ID NO:53), [GGGGN]x (SEQ ID NO:54), donde x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS.

6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de fusión comprende dos secuencias de cadena ligera de trastuzumab que no están fusionadas a una secuencia de p97 y dos secuencias de cadena pesada de trastuzumab que están fusionadas a una secuencia de p97.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, en donde la secuencia de cadena ligera de trastuzumab comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína de fusión se une específicamente al receptor HER2/neu humano.

9. Una célula hospedante recombinante que comprende una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. La célula hospedante recombinante de la reivindicación 9, donde la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana.

11. La célula hospedante recombinante de la reivindicación 10, donde la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula HEK-293.