ES2765507T3 - Soluciones hipoalergénicas ultrapuras de sacrosidasa - Google Patents

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Abstract

Una solución de sacrosidasa procedente de Saccaromyces cerevisiae en aproximadamente 1:1 de glicerol/agua que tiene una actividad enzimática de al menos aproximadamente 7.500 UI/ml y una concentración de papaína residual de menos de 10 ng/ml para su uso en un método para tratar los síntomas de deficiencia de sacarasa-isomaltasa (SID) en un paciente humano, en donde una dosis diaria de la solución de aproximadamente 2-10 ml al día no induce una reacción alérgica en el paciente humano y en donde la estructura primaria de la sacrosidasa es un polipéptido de 513 aminoácidos que está glucosilado.

Description

DESCRIPCIÓN
Soluciones hipoalergénicas ultrapuras de sacrosidasa
Antecedentes de la invención
La deficiencia de sacarosa-isomaltasa congénita (CSID, por sus siglas en inglés) es una enfermedad crónica, autosómica recesiva, hereditaria, fenotípicamente heterogénea con actividad enzimática variable. La CSID generalmente se caracteriza por un sujeto que tiene una falta completa o casi completa de actividad de sacarasa endógena humana, junto con una reducción muy marcada en la actividad de isomaltasa, una disminución moderada de la actividad de maltasa y el sujeto puede tener niveles normales o anormales de lactasa.
La enzima humana sacarasa-isomaltasa se produce de forma natural en el borde en cepillo del intestino delgado, principalmente el duodeno distal y el yeyuno. La enzima humana natural hidroliza el disacárido sacarosa en sus componentes monosacáridos, glucosa y fructosa. La isomaltasa descompone los disacáridos del almidón en azúcares sencillos.
En ausencia de enzima sacarasa-isomaltasa endógena humana, como en la CSID, la sacarosa no se metaboliza. La sacarosa y el almidón sin hidrolizar no se absorben en el intestino y su presencia en la luz intestinal conduce a la retención osmótica de agua. Esto puede provocar heces blandas o diarrea. La sacarosa no absorbida en el colon se fermenta por la flora bacteriana para producir mayores cantidades de hidrógeno, metano y agua. Como consecuencia, puede producirse un exceso de gases, hinchazón, calambres abdominales, náuseas, vómitos y diarrea explosiva. La absorción defectuosa crónica de disacáridos puede producir desnutrición. Los pacientes con CSID no diagnosticados/no tratados con frecuencia no crecen y se quedan atrás en sus curvas de desarrollo y crecimiento esperadas. Antes de la aprobación de la FDA del producto de reemplazo comercial solución oral Sucraid® (sacrosidasa), el tratamiento de CSID ha requerido el uso continuado de una dieta estricta sin sacarosa con éxito limitado en el tratamiento de la enfermedad.
Actualmente, la CSID se trata por administración oral, con comidas, de una solución de sacrosidasa en glicerol-agua (1:1 p/p), que proporciona la terapia de reemplazamiento de la enzima para la CSID. Esta solución se proporciona en el mercado como Sucraid® (sacrosidasa) en solución oral distribuida por QOL Medical LLC. Cada mililitro (ml) de Sucraid® contiene 8.500 Unidades Internacionales (U.I.) de la enzima sacrosidasa, el principio activo. El nombre químico de esta enzima es p,D-fructofuranósido fructohidrolasa. La enzima procede de la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae), por digestión enzimática con papaína.
El producto Sucraid® era típico de la época con respecto a la pureza. La especificación de pureza fijada por la FDA no fue inferior al 85 % en la(s) banda(s) principal(es) mediante un análisis de densitometría SDS-PAGE reducida después de la tinción con Coomassie. Esta es una relación de bandas de sacrosidasa a otras proteínas de aproximadamente 6:1.
La FDA especificó que la pureza no comprendía más de 10 pg/ml de papaína en la sustancia farmacéutica sacrosidasa. La "sustancia farmacéutica" es la solución precursora glicerol:agua de sacrosidasa que puede diluirse más y envasarse para producir Sucraid®, que se conoce como el "producto farmacéutico" acabado. La etiqueta original aprobada por la FDA en 1998 notificó el potencial para reacciones alérgicas, y advirtió a los médicos para que trataran pacientes con CSID por primera vez dentro de su unidad en caso de que surgieran reacciones alérgicas. Nuevamente, en 2008, como resultado de un cambio de sitio del fabricante de la sustancia farmacéutica, la FDA solo aprobó el relanzamiento de este medicamento con la imposición de una Estrategia de Evaluación y Mitigación de Riesgos (REMS) que solo exige la FDA para medicamentos con posibilidad de problemas de seguridad graves.
Se ha publicado que la estructura primaria de sacrosidasa consiste en 513 aminoácidos con un peso molecular aparente de 100.000 g/mol para el monómero glucosilado (intervalo 60.000-116.000 g/mol). Los informes también sugieren que la proteína existe en solución como un monómero, dímero, tetrámero y octómero que varía de 100.000 g/mol a 800.000 g/mol. Tiene un punto isoeléctrico de 4,1 (pI = 4,093).
Actualmente, Sucraid® se suministra en botellas que contienen 118 ml de la solución de sacrosidasa. Una dosis típica es 1 o 2 ml con cada comida o aperitivo. La solución se embotella de forma aséptica; sin embargo, puede contaminarse después de la abertura debido a la necesidad de administración frecuente, por lo que los pacientes deben desechar la botella 4 semanas después de la apertura.
Sumario de la invención
Esta invención proporciona una sacrosidasa hipoalergénica ultrapura que cumple con las normas farmacéuticas para uso de prescripción humana. La sacrosidasa también se mejora organolépticamente, ya que sus soluciones acuosas son inodoras.
Se proporciona una solución de sacrosidasa derivada de Saccharomyces cerevisiae en aproximadamente glicerol/agua 1:1 que tiene una actividad enzimática de al menos aproximadamente 7.500 Ul/ml y una concentración de papaína residual de menos de 10 ng/ml para su uso en un método para tratar los síntomas de la deficiencia de sacarasa-isomaltasa (SID) en un paciente humano, en donde una dosis diaria de la solución de aproximadamente 2­ 10 ml al día no induce una reacción alérgica en el paciente humano y en donde la estructura primaria de la sacrosidasa es un polipéptido de 513 aminoácidos que está glucosilado.
Una realización proporciona una composición proteica que consiste en sacrosidasa y que no contiene otras proteínas según se determina por SDS-PAGE de hasta aproximadamente 15 |jg de dicha composición. Las técnicas de SDS-PAGE, descritas a continuación en el presente documento, pueden emplear condiciones reductoras y tinción con azul de Coomassie. Por lo tanto, una realización proporciona una composición de proteína que consiste esencialmente en sacrosidasa que tiene una relación en la franja de volumen de sacrosidasa a otras proteínas de al menos aproximadamente 35:1, por ejemplo, aproximadamente 35-55:1, según se determina por SDS-PAGE de aproximadamente 20 jg de dicha composición. La composición de proteína de una realización se produce por un proceso que comprende la diafiltración del producto de la digestión de levadura y no emplea la purificación cromatográfica de dicha sacrosidasa.
Se desvela una sustancia farmacéutica y un producto farmacéutico que consiste esencialmente en una solución de sacrosidasa en agua que comprende aproximadamente 45-54 % en peso de glicerol y que contiene menos de 10 ng/ml, preferentemente menos de aproximadamente 3,0 ng/ml de papaína en combinación con al menos aproximadamente 7.500 Ul/ml de sacrosidasa. En una realización, la solución consiste esencialmente en al menos aproximadamente 7.500-9.500 Ul/ml, preferentemente alrededor de 8.500 Ul/ml de sacrosidasa en aproximadamente 1:1 de glicerol:agua que contiene menos de aproximadamente 3,0 ng/ml de papaína. Esta formulación de sacrosidasa no induce una reacción alérgica en un ser humano tal como un paciente con CSID, cuando se administra a una dosis de hasta aproximadamente 2,0 ml (dosis diarias de 2-10 ml).
En otra realización la solución de sacrosidasa en agua/glicerol tiene una actividad de al menos aproximadamente 10.000 Ul/ml y que tiene menos de 10 ng/ml de papaína residual. En una realización, la solución tiene una relación de aproximadamente 1:1 en peso de agua a glicerol. En otra realización, la solución tiene un pH de aproximadamente 4,1-4,5.
La cantidad de papaína puede determinarse por las técnicas de ELlSA. La solución tampoco se produce por un proceso que comprende la purificación cromatográfica de dicha sacrosidasa.
Como se usa en el presente documento el término "aproximadamente" pretende abarcar la variación en el parámetro mencionado, tales como concentración, pH, actividad enzimática, tiempo y similares que el experto en la materia reconocería como necesariamente inherente en la determinación del parámetro, por ejemplo, véase la Figura 1.
Puede encontrarse información adicional sobre Sucraid® y sacrosidasa en el documento US2014250942.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama de flujo del proceso actual de fabricación de la sustancia farmacéutica sacrosidasa. Figura 2. Gel de SDS-PAGE con carga óptima teñido con azul de Coomassie. Sustancia farmacéutica a granel Sacrosidasa (Figura 1) de dos fabricantes (5 jg de proteína). Carril 1: Marcador de P.M. de intervalo bajo 17, 28, 34, 40, 73 y 102 kD; carril 2: Patrón de referencia c 4546; carril 3: STS-199NS; carril 4: STS-220NS; carril 5: STS-241NS; carril 6: 125275; carril 7: 125434; carril 8: 125722; carril 9: Patrón de referencia C3955; carril 10: Marcador de P.M. de intervalo amplio (21, 34, 45, 66, 97 kD y 200 kD).
Figura 3. Gel de SDS-PAGE sobrecargado teñido con Coomassie. Sustancia farmacológica a granel Sacrosidasa de dos fabricantes (20 jg de proteína). Carril 1: Marcador de P.M. de intervalo bajo; carril 2: Patrón de referencia C4546; carril 3: STS-199NS; carril 4: STS-220NS; carril 5: STS-241NS; carril 6: 125275; carril 7: 125434; carril 8: 125722; carril 9: Patrón de Referencia C3955; carril 10: Marcador de P.M. de intervalo amplio.
Figura 4. Gel natural sobrecargado teñido con Coomassie. Sustancia farmacéutica a granel Sacrosidasa de dos fabricantes (15 jg de proteína). carril 1: Patrón de referencia C4546; carril 2: STS-199NS; carril 3: STS-220NS; carril 4: STS-241NS; carril 5: 125275; carril 6: 125434; carril 7: 125722; carril 8: Patrón de referencia C3955.
Figura 5. La estructura primaria de aminoácidos de Sacrosidasa consiste en 513 aminoácidos. Sacrosidasa tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra más adelante (SEQ lD NO: 1).
Descripción detallada de la invención
Esta invención proporciona una sacrosidasa hipoalergénica ultrapura que cumple las normas farmacéuticas para su uso en la prescripción humana, con propiedades alérgenas reducidas. La sacrosidasa también está organolépticamente mejorada, ya que sus soluciones acuosas son inodoras. Las soluciones de sacrosidasa que son menos puras pueden presentar propiedades organolépticas desagradables, como un olor a "levadura", un color desagradable y otros olores.
Nombres comunes: invertasa, sacrosidasa
Nombre comercial: Sucraid ® (sacrosidasa) solución oral (Producto farmacéutico) USAN: Sacrosidasa
Producto químico: p-D-fructofuranosida fructohidrolasa
Sinónimos: p-D-fructofuranosidasa
p-D-fructofuranosidasa
p-fructofuranosidasa
p-fructofuranosida fructohidrolasa
p-fructopiranosidasa
p-fructosidasa
p-invertasa
Fructosilinvertasa
Invertasa
Invertina
Glucosucrasa
Sacarasa
Sucrasa
Sacarosa hidrolasa
Exo-p-(2,6)-fructofuranosidasa
Maxivert L 1000
Levadura sucrasa (YS)
Número CAS: 85897-35-4
9001-57-4
Sumario del proceso de purificación
Esta invención proporciona un procedimiento sin cromatografía para producir proteína sacrosidasa ultrapura que cumple con las normas farmacéuticas para su uso en la prescripción humana. Nunca antes se ha desarrollado un método no cromatográfico para producir dicha proteína de ultra alta pureza, concretamente sacrosidasa, superando defectos anteriores debido a una pureza inadecuada. Un proceso de purificación no cromatográfico genera ahorros significativos de tiempo y costes durante la fabricación. En el presente documento se proporciona el estudio de caracterización del fármaco, las pruebas de pureza y por último la prueba clínica de la formulación hipoalergénica única mejorada.
Las etapas de una realización preferida del presente proceso de aislamiento y purificación de sacrosidasa se resumen en la figura 1.
1. Digerir levadura Saccharomyces cerevisiae con papaína en una solución acuosa tamponada a un pH de aproximadamente 7,0 y a una temperatura de aproximadamente 30-34 °C.
2. La digestión con papaína escinde todas las proteínas en fragmentos de pequeño peso molecular que después pueden filtrarse de forma eficaz lejos de la enzima sacrosidasa muy grande, resistente a la papaína, que en solución tiene un peso molecular de solución natural aparente de 500.000+ gramos por mol (Daltons). La sacrosidasa que tiene la glucosilación extensa producida en la levadura es resistente a la digestión con papaína.
3. Se prefiere el uso de tierra de diatomeas con dos tamaños diferentes de poro y/o partícula para retirar la mayoría de los componentes insolubles y probablemente otras impurezas solubles e insolubles. Al pH, fuerza iónica y concentraciones elegidos, se produce un gran aumento de la pureza utilizando estas dos etapas en serie que también preparan la solución libre de partículas resultante para la diafiltración. La retirada de componentes insolubles también evita que se obstruyan los filtros de membrana de diálisis en la unidad de ultrafiltración. Esto aumenta la velocidad de tratamiento.
4. Diafiltración usando un filtro de tamaño de poro óptimo determinado experimentalmente para equilibrar la pureza con el rendimiento. El presente proceso emplea un filtro de umbral mínimo de 40 kiloDalton para conseguir una solución inodora ultrapura hipoalergénica de sacrosidasa. La solución tiene una actividad sacrosidasa de al menos aproximadamente 22.000 Ul/ml, preferentemente al menos aproximadamente 17.000 Ul/ml. Los filtros de poro más grandes dan una pureza equivalente, pero a costa del rendimiento. Los filtros de tamaño de poro más pequeño no proporcionan suficiente pureza final. También se determinó experimentalmente el número de volúmenes de lotes contra los cuales diafiltrar: solo 4+ volúmenes de diafiltración permiten una pureza adecuada para cumplir los requisitos de una sustancia farmacéutica a granel regulada para uso farmacéutico humano.
5. La formulación final de la sustancia farmacéutica con glicerol, emplea preferentemente filtración estéril para garantizar la carga biológica del lote que cumple con las normas de la FDA. La sustancia farmacéutica se almacena en tambores a aproximadamente -18 °C a -25 °C para el almacenamiento a largo plazo, hasta que se procesa/ajusta la concentración/se envasa para producir el producto farmacéutico Sucraid®. En este momento, la actividad sacrosidasa es de al menos aproximadamente 10.000 UI/ml.
La invención se describirá además haciendo referencia a los siguientes ejemplos detallados, en donde los términos "SDS-PAGE" y "ELISA" como se usan en el presente documento se definen con referencia a las técnicas siguientes.
Análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Las muestras de la sustancia farmacéutica a granel sacrosidasa que contienen cantidades predeterminadas de proteína total, fueron analizadas por Charles Rivers Laboratory, Malvern, PA. y los ensayos fueron validados por Tekagen, Inc., Malvern, PA.
Para separar mezclas de polipéptidos (en un campo eléctrico) en bandas distintas se usa SDS-PAGE (dodecil-sulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida) reductora. La movilidad en estas condiciones viene determinada principalmente por el tamaño molecular. La tinción con azul de Coomassie coloidal permite el análisis visual y/o densimétrico de las bandas resueltas. Este método es lineal para cargas de 0,25 |jg a 15 |jg con un límite de detección inferior de 0,1 jg por banda, por ejemplo, los límites de detección y cuantificación de sacrosidasa se determinaron en 0,1 jg . El área de la banda de sacrosidasa medida está correlacionada linealmente con la carga de proteína.
En los ensayos a continuación en el presente documento, las muestras descritas que contienen sacrosidasa se redujeron con 2-mercaptoetanol en tampón de muestra SDS. Las muestras se ajustaron a aproximadamente 1,0 mg/ml con agua y se trataron con un volumen del mercaptoetanol en tampón SDS a 100 °C durante 3 min para desnaturalizar/reducir la proteína. Las muestras se procesaron en un XCell SureLock Mini-Cell® (Invitrogen) usando Novex® 4,20 % de gel Tris-Glicina (Invitrogen) usando un tampón corriente de SDS durante 90 min a 120 voltios. Los geles se tiñeron con azul Coomassie y se lavaron con agua. Se exploraron los geles utilizando un densímetro SI personal (Molecular Dynamics).
Análisis cuantitativo de papaína mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA)
Las muestras de la sustancia farmacéutica a granel sacrosidasa se dializaron contra PBS y toda la papaína se inhibió con E-64. La muestra se ensayó para el contenido de papaína por Warnex Laboratories, Quebec, Canadá, usando un ELISA cuantitativo de tipo sándwich. Un anticuerpo de captura policlonal (conejo) específico para papaína se recubre en cada pocillo de una microplaca. Cuando está presente en las muestras, la papaína se une al anticuerpo de captura. Se añade un segundo anticuerpo anti-papaína (cabra) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) que se une a toda la papaína capturada. Después del lavado, se añade el sustrato O-fenilendiamina con 0,03 % de H2O2 para producir una reacción de color enzimático con HRP. La reacción se detiene con una solución de ácido sulfúrico (solución de parada). La intensidad de color formada por la reacción enzimática se mide por espectrofotometría.
La cantidad de papaína en las muestras se calculó en base a una curva patrón, donde los valores medios de la DO de cada uno de los patrones están en el eje Y y la concentración correspondiente de papaína está en el eje X. Para determinar la concentración final de papaína en las muestras, la concentración obtenida de la curva patrón se multiplica por el factor de dilución. La cantidad de papaína se calcula automáticamente mediante el programa informático Gen5. El límite inferior de cuantificación de la papaína es 3,13 ng/ml. El límite inferior de detección de la papaína es de 1,56 ng/ml.
Ejemplo 1: Procedimiento de fabricación de sacrosidasa ultrapura
Se carga agua desionizada (1.700 kg) en un reactor de 3.785 litros (1.000 galones) y se calienta a 32 ± 2 °C, momento en el cual se añade levadura Saccharomyces cerevisiae (360 kg) y la suspensión se mezcla durante 20-30 min. Se comprueba el pH y si se encuentra por debajo de 6,9, se ajusta el pH usando una solución de hidróxido de sodio al 25 % hasta que el pH sea de 7,0 ± 0,1.
Se añade papaína (3,4 kg) 100 TU/mg seguido de peróxido de hidrógeno (35 %, 2,8 kg). La suspensión se agita a 32 ± 2 °C durante las siguientes 17,5 a 20 h; después de cada 3,5-4 h el pH se ajusta a 7,0 ± 0,1 y se añade peróxido de hidrógeno (34 %, 2,8 kg por porción, 11,2 kg en total).
Una vez transcurridas las 17,5-20 horas de mezcla, la mezcla se enfría a entre 22 °C y 26 °C, en cuyo momento se añaden 25 kg de ácido fosfórico al 85 % durante 20-30 min. Se comprueba el pH de la suspensión y el pH se ajusta más a 4,0 ± 0,1 añadiendo ácido fosfórico al 85 %.
Se añade a la mezcla tierra de diatomeas (Celpure® S1000, 210 kg) seguido de 700 kg adicionales de agua desionizada y la suspensión se mezcla durante 30-40 minutos. La suspensión se filtra en cuatro partes iguales a través de un filtro Sparkler para retirar los restos de células y cualquier otro sólido del producto en solución. Para cada porción de la filtración, una vez se detiene el ritmo de recolección de filtrado, el haz de filtros se lava con agua desionizada fresca (400 kg). Estos lavados se combinan con los filtrados iniciales.
Una vez completada la cuarta filtración, los filtrados y lavados combinados se devuelven al reactor de 3.785 litros (1.000 galones) y se tratan con peróxido de hidrógeno (34 %, 2,0 kg). La solución se decolora mediante tratamiento con carbón activado (malla 20x40, 60 kg) y sulfato de aluminio (9,4 kg); la suspensión resultante se mezcla durante 1,5-2 h.
Se añade tierra de diatomeas (Celpure® S100, 32 kg) y se mezcla durante 30 min adicionales. Los sólidos se retiran por filtración a través del filtro Sparkler. El reactor se limpia para retirar los sólidos residuales que puedan estar presentes y el filtrado de la decoloración se devuelve al reactor a través de un filtro en línea de 0,2 micrómetros. La solución se concentra después a aproximadamente 250 kg usando una unidad de ultrafiltración que ha sido equipada con filtros de corte de 40 kilo-Dalton.
La solución concentrada de sacrosidasa se purifica después por diafiltración contra al menos cuatro volúmenes (~1000 l) de solución tampón de ácido cítrico. Esta solución tampón se prepara a partir de agua desionizada (1000 kg), ácido cítrico (9,2 kg), citrato de sodio (11,2 kg) y el pH de la solución se ajusta a 4,6 ± 0,1 mediante la adición de hidróxido de sodio al 25 %. Pueden usarse más volúmenes de tampón para aumentar la pureza proteica general mientras se continúan reduciendo las cantidades residuales de impurezas en la solución formulada final. Por lo general, cuatro volúmenes (~1000 l) de tampón de ácido cítrico han sido suficientes durante la diafiltración para purificar la proteína sacrosidasa retenida en la solución a > 99 % de pureza y para conseguir concentraciones de papaína <50 ppb.
Una vez completada la diafiltración, la solución se concentra adicionalmente hasta que el material tiene un valor de ensayo > 26,000 UI/ml en la prueba de ensayo de sacrosidasa. Después se comprueba el pH de la solución y se ajusta a 4,3 ± 0,1 mediante el uso de una solución de hidróxido de sodio al 25 % si el pH es <4,15 o mediante el uso de ácido fosfórico al 85 % si el pH de la solución es > 4,45.
Una vez completado el ajuste del pH, la solución se transfiere a un recipiente de mezclado y se añade aproximadamente el mismo peso de glicerina para producir la sustancia farmacéutica sacrosidasa. La solución acuosa resultante de glicerina se mezcla durante 10 min. La sustancia farmacéutica diana tiene > 10.000 UI/ml de sacrosidasa y aproximadamente un 45-54 % en peso de glicerol. Una vez completada la mezcla, la solución se transfiere a los tambores a través de dos filtros en línea de nailon de 0,2 micrómetros que se configuran en serie. La solución en tambores o "sustancia farmacéutica" se almacena a temperatura ambiente durante 8-36 h antes de trasladarse a un almacenamiento a largo plazo a aproximadamente -20 °C. Las porciones pueden retirarse a medida que se necesite y diluir y envasar para producir el producto farmacéutico Sucraid®.
Ejemplo 2: Gel de SDS-PAGE reducido y teñido con azul Coomassie con densitometría - carga óptima
El gel que se muestra en la Figura 2 es un SDS-PAGE reducido, teñido con Coomassie que compara 3 lotes de un fabricante anterior de sacrosidasa (carriles 3, 4 y 5) que se fabricó con un proceso de fabricación anterior, con 3 lotes de sacrosidasa (carriles 6, 7 y 8) fabricados usando el nuevo proceso de fabricación hipoalergénico ultrapuro. El patrón de referencia C4546 es el patrón de referencia actualmente en uso y se produjo a partir del proceso anterior. El patrón de referencia C3955 es un patrón de referencia aún más antiguo del fabricante de Sacrosidasa original.
La exploración de densitometría de este gel de SDS-PAGE con carga óptima se muestra a continuación (Tabla 1). Estos resultados demuestran claramente que la sacrosidasa fabricada usando el nuevo procedimiento es ultrapura, sin impurezas proteicas detectables. La validación de cGMP de este método fijó un límite de detección inferior a 0,1 microgramos.
T l 1
Figure imgf000006_0001
Ejemplo 3: Gel de SDS-PAGE reducido y teñido con Coomassie con densitometría - gel sobrecargado En un segundo protocolo, los geles de SDS-PAGE reducidos se sobrecargaron con 20 |jg de proteína (Figura 3). En los geles teñidos con Coomassie, una pequeña banda de impurezas es visible en la presente sustancia farmacéutica sacrosidasa, pero la pureza absoluta de la sacrosidasa de la invención (~97 %, carriles 6, 7 y 8) es aún superior a la sacrosidasa anterior (~ 90 %, carriles 3, 4, 5). La Tabla 2 resume la información de este gel.
Tabla 2
Figure imgf000007_0001
Ejemplo 4: Geles óptimos y nativos sobrecargados
En un tercer protocolo, se introdujeron muestras no reducidas en geles de PAGE nativos. Tanto la proteína óptima (5 jg de proteína) como la sobrecargada (20, 30 y 60 jg de proteína) se aplicaron a geles de poliacrilamida y después se tiñeron con azul de Coomassie.
La Figura 4 representa un gel nativo teñido con Coomassie sobrecargado (15 jg). La exploración por densitometría del gel muestra valores de pureza de 97,59, 99,02 y 99,31 para sacrosidasa realizada por el proceso más antiguo de sacrosidasa y 100 %, 100 % y 100 % para la sacrosidasa fabricada usando el presente proceso ultrapuro. Este gel demuestra claramente la calidad ultrapura de la sacrosidasa fabricada utilizando el nuevo proceso. La tabla 3 resume la información de este gel.
T l
Figure imgf000007_0002
continuación
Figure imgf000008_0001
Ejemplo 5: Reducción de tres órdenes de magnitud (1.000 veces) en una impureza de proteínas
La FDA retiró todos los productos tópicos de papaína en 2008 debido al riesgo de reacciones de hipersensibilidad (www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/2008/ucm116956.htm) y se requirió una REMS para sacrosidasa ese mismo año (www.fda.gov/downloads/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPients andProviders/UCM144251.pdf). El presente procedimiento demuestra una impresionante reducción de tres órdenes de magnitud en las concentraciones de papaína de la sustancia farmacéutica a concentraciones casi indetectables con un ELISA muy sensible (LOQ de 3 ng/ml) usando este nuevo procedimiento sin cromatografía. LOQ es el límite de cuantificación. Estos lotes a continuación fueron el resultado final de tres lotes de validación de proceso del presente proceso (lotes 125275, 125897, 125907) frente a lotes de fabricante anterior (STS-199NS, STS-220NS, STS-241NS) que tenían un límite de papaína impuesto por la FDA 10.000 ng/ml.
T l 4
Figure imgf000008_0002
Este ejemplo muestra el nivel sustancial de reducción de papaína a concentraciones indetectables. La papaína a 23 kilo-Daltons es una proteína marcadora clave que es probablemente representativa de cualquier otra proteína por debajo del límite umbral de 40 KD del filtro de ultrafiltración utilizado, junto con las proteínas escindidas por papaína que caen por encima del límite de peso molecular de 40 KD, con la excepción de sacrosidasa que es resistente a la escisión de papaína en su forma natural tridimensional en solución.
Ejemplo 6: Propiedades organolépticas mejoradas
Mientras se diafiltraba la solución después de la concentración, se le encomendó a un operador que observara el color y el olor de la solución concentrada de sacrosidasa. Como el número de volúmenes de lavado aumentó desde ningún (cero) volumen de lavado de diafiltración hasta cuatro (4) volúmenes de lavado de diafiltración, el operador observó que todo el olor a levadura se eliminó de la solución de sacrosidasa y el color amarillo se redujo drásticamente a casi ningún color amarillo. Estas propiedades organolépticas de esta nueva formulación ultrapura son importantes para la observancia del joven paciente pediátrico ya que el "olor a levadura" no es bien tolerado por algunos pacientes jóvenes lo que lleva a una observancia deficiente con su dosis de Sucraid recetada.
Ejemplo 7: Pruebas clínicas de seguridad mejorada y eficacia continuada
A una paciente con CSID de 5 años de edad se le administró la formulación antigua de Sucraid en agosto de 2012, y fue instruida por el etiquetado aprobado por la FDA (prospecto del envase) debido a la posibilidad de reacciones alérgicas, se la administró la primera dosis en el consultorio de su médico. Este paciente manifestó un caso de urticaria en todo el cuerpo inmediatamente después de administrar la antigua formulación de Sucraid. Por lo tanto, se excluyó una administración adicional con Sucraid. La familia estaba ansiosa por encontrar una solución a los problemas gastrointestinales de sus hijas, por lo que accedieron a un segundo desafío con diferentes lotes de la formulación antigua de Sucraid aproximadamente dos meses después. Una vez más, se manifestó la urticaria, por lo que este paciente se vio imposibilitado permanentemente de utilizar Sucraid aprobado por la FDA y comercializado para tratar su insuficiencia de sacarasa genéticamente determinada.
Una vez desarrollada esta nueva formulación de sacrosidasa hipoalergénica ultrapura, la FDA presentó y autorizó un IND, junto con la aprobación de la Institucional Review Board (IRB) en la Clínica Mayo en Rochester Minnesota para un protocolo de administración de prueba en este mismo paciente en noviembre de 2013. Después tratamiento con la nueva formulación ultrapura hipoalergénica de sacrosidasa, esta paciente de 5 años ya no manifestó reacciones alérgicas o síntomas, incluida la urticaria. Además, después de tomar la nueva formulación ultrapura hipoalergénica de Sucraid sus síntomas de CSID mejoraron completamente, incluida la normalización de 1-2 heces formadas al día frente a > 6+ evacuaciones tipo diarrea acuosa al día, eliminación de su dolor abdominal y eliminación de su distensión abdominal, por lo que este paciente pediátrico ahora puede utilizar esta medicación transformadora para tratar su enfermedad. La nueva formulación ultrapura hipoalergénica de sacrosidasa se está administrando a esta paciente

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una solución de sacrosidasa procedente de Saccaromyces cerevisiae en aproximadamente 1:1 de glicerol/agua que tiene una actividad enzimática de al menos aproximadamente 7.500 UI/ml y una concentración de papaína residual de menos de 10 ng/ml para su uso en un método para tratar los síntomas de deficiencia de sacarasa-isomaltasa (SID) en un paciente humano, en donde una dosis diaria de la solución de aproximadamente 2-10 ml al día no induce una reacción alérgica en el paciente humano y en donde la estructura primaria de la sacrosidasa es un polipéptido de 513 aminoácidos que está glucosilado.
2. La solución de sacrosidasa para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1 que contiene menos de aproximadamente 3,0 ng/ml de papaína.
3. La solución de sacrosidasa para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1 que no contiene papaína detectable cuantificable mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima que tiene un límite inferior de cuantificación de 3,13 ng/ml.
4. La solución de sacrosidasa para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1 que no contiene papaína detectable según se determina por SDS-PAGE de hasta aproximadamente 15 |jg de dicha composición.
5. La solución de sacrosidasa para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que tiene una actividad enzimática de aproximadamente 7.500-9.500 UI/ml.
6. La solución de sacrosidasa para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para tratar los síntomas de la Deficiencia de Sacarasa-Isomaltasa Congénita.
7. La solución de sacrosidasa para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución se adapta para administrarse oralmente.
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