TR201815539T4 - Sakrosidazın çok arıtılmış hipoalerjenik çözeltileri. - Google Patents

Abstract

Bir yön, çok arıtılmış hipoalerjenik sakrosidaz sağlamaktadır. Başka yönü, en az yaklaşık 7500 IU/mL enzimatik aktiviteye ve yaklaşık 2.0 mL/gün dozunda verildiğinde bir insan hastada bir alerjik reaksiyon içermeyen bir kalıntı papain konsantrasyona sahip yaklaşık 1:1 gliserol/suda sakrosidazın bir çözeltisini sağlamaktadır.

Description

TARIFNAME SAKROSIDAZIN ÇOK ARITILMIS HIPOALERJENIK ÇÖZELTILERI Önceki Teknik Konjenital sakaroz-izomaltaz eksikligi (CSID), degisken enzim aktivitesi ile bir kronik, otozomal resesif, irsi, fenotip olarak heterojen bir hastallktlü CSID, endojen insan sükraz aktivitesinin tamamen veya neredeyse tamamen eksikligi ile birlikte izomaltaz aktivitesinde çok belirli bir azalma, maltaz aktivitesinde hafif bir azalmaya sahip bir suje tarafIan genellikle karakterize edilmektedir ve suje normal veya anormal Iaktaz seviyelerine sahip olabilmektedir.

Insan enzimi sükraz-izomaltaz, dogal olarak ince baglBagI fEamsllenarlarlEtla, birincil olarak distal duodenum ve jejunumda üretilmektedir. Dogal insan enzimi, disakkarit sakarozu kendi bileseni monosakkarit, glikoz ve fruktoza hidrolize etmektedir. Izomaltaz, nisastadan disakkaritleri kendi basit sekerlerine parçalamaktadlE] CSID'de oldugu gibi, endojen insan sükraz-izomaltaz enziminin yoklugunda, sakaroz metabolize olmamaktadE Hidrolize olmayan sakaroz ve nisasta, baglBaktan absorbe edilmemektedir ve intestinal Iümendeki varl[gll3uyun ozmotik tutulmaslöb yol açmaktadB Bu, dlgklîlkayblîlveya diyare ile sonuçlanabilmektedir. Kolonda absorbe edilmeyen sakaroz, hidrojen, metan ve suyun artan miktarlarlElüüretmek için bakteriyel flora ile fermente edilmektedir. Bunun bir sonucu olarak, aslEngaz, siskinlik, abdominal kramplar, bulantÇl kusma ve siddetli diyare meydana gelebilmektedir. Disakkaritlerin kronik malabsorbsiyonu, dengesiz beslenme ile sonuçlanabilmektedir. Teshis konulmamlgltedavi edilmemis CSID hastalarlîgenellikle, iyi gelismede basarElîl olmaktadlElbr ve kendi beklenmeyen büyüme ve gelisme egrilerinin gerisinde kalmaktadlîllar. Sucraid® (sakrosidaz) Oral Çözelti ticari yer degistirme ürünün FDA onayEöncesinde, CSID'nIn tedavisi, hastallgil yönetilmesinde sIlEllü basarEile sIKElbir sakarozsuz diyetin devamiüliyguIanmasllîgjerektirmistir.

CSID için enzim replasman terapisi saglayan sakrosidazI bir gliserol-su (aglHllE cinsinden 1:1) çözeltisinin yemeklerle birlikte oral uygulamasEIile mevcut durumda CSID tedavi edilmektedir. Bu çözelti, QOL Medical LLC tarafIan daglElEiEyapllân Sucraid® (sakrosidaz) Oral Çözelti gibi ticari olarak saglanmaktadlEl Sucraid®'in her mililitresi (mL), aktif bilesen, enzim sakrosidaz. 8500 UluslararasEBirimi'ni (I.U.) içermektedir. Bu enzimin kimyasal adEI ß,D-frukt0furanozid fruktohidrolazdlEl Enzim, papainin enzimatik sindirimi ile ekmek mayaleUan (Saccharomyces cerevisilae) türetilmektedir.

Sucraid® ürünü, safligb göre dönemin tipik bir ürünüdür. FDA yerlesik salim sartnamesi, Koomassie boyamasIDtakiben azaltllBilg SDS-PAGE dansitometrisi ile ana bant(lar)da SafIlEl sakrosidaz ilaç maddesinde 10 ug/mL'den daha fazla papain içermeyecek sekilde FDA tarafIan belirtilmistir. “Ilaç maddesi", bitmis “ilaç ürünü” olarak ifade edilen ürün Sucraid®'e ayrlîia seyreltilebilen ve ambalajlanabilen sakrosidaz. prekürsör gliserol:su çözeltidir. Orijinal etiket, alerjik reaksiyonlar için potansiyel dikkate alIrak 1998 y-da FDA tarafIan onaylandEi/e alerjik reaksiyonlari meydana gelmesi durumunda kendi biriminde ilk defa CSID hastalarIElledavi etmesi için doktorlarEikaz etti. Yeniden 2008'de, ilaç maddesi üreticisinin bir bölge degisiminin sonucu olarak, FDA, ciddi güvenlik problemleri için potansiyele sahip ilaçlar için sadece FDA tarafIan gerek duyulan bir Risk Degerlendirme ve Hafifletme Stratejisi'nin (REMS) yüklenmesi ile bu ilaclEltekrar baslatlliiaslîbnaylandlîl bir molekül aglEliUZl 100,000 g/mol'e sahip 513 amino asitten olustugu rapor edilmistir. tetramer ve oktomer olarak çözeltide protein bulundugunu ileri sürmektedir. 4.1 izoelektrik Su an, Sucraid®, 118 mL sakrosidaz çözeltisi içeren siselerde bulunmaktadE Tipik bir doz, her yemek veya atlStlEina ile 1 veya 2 mL'dir. Çözelti aseptik olarak siselenmektedir; bununla birlikte, silZIlKla uygulanmasEl gerektiginden dolaylZlaçIithan sonra kontamine olmaya baslayabilmektedir, böylece hastalar açIIKtan 4 hafta sonra siseyi atmalarElkonusunda bilgilendirilmektedir.

Bulusun Kßla Açililamaslîl Bu bulus, insan reçete kullanIilZIiçin farmasötik standartlarElkarsliâyan bir çok ariiîllBiE hipoalerjenik sakrosidaz saglamaktadlEl Sakrosidaz, organoleptik olarak ayrlEia gelistirilmektedir, çünkü bunlar. sulu çözeltileri kokusuzdur.

Bir yapllândlülna, bir sakrosidazdan olusan protein bilesimi saglamaktadlîl ve söz konusu bilesimin yaklasllZl 15 ug'BDS-PAGE ile belirlenecek sekilde hiç baska protein içermemektedir.

SDS-PAGE teknikleri, asagida burada aÇEEIandlgllgibi, indirgeme kosullarü/e Koomassie Mavi Boyama'yükullanabilmektedir. Dolaylîma, bir yapilândlîrina, söz konusu bilesimin yaklasiEl 20 ug'sinin SDS-PAGE ile belirlendigi gibi, sakrosidaz. diger proteinlere örnegin yaklaslla 35 ila 5521, en az yaklaslEl 35:1 bant hacmi oranli-ala sahip temel olarak sakrosidazdan olusan bir protein bilesimi saglamaktadlEl Bir yapHândlElnanI protein bilesimi, maya sindiriminin diyafiltrasyonunu içeren bir proses (ileri sürüldügü gibi) tarafIan üretilmektedir ve söz konusu sakrosidaz. kromatografik saflastlîilnasIERuIIanmamaktad E Diger yapllândlana, aglEIlllZl cinsinden yaklaslK145 ila 54 gliserol içeren ve yaklaslK] en az 7500 ng/mL'den daha az olmayan papain içeren esasen sakrosidaz. bir çözeltisini içeren bir ilaç ürünü ve bir ilaç maddesi saglamaktadB Bir yapllândüina esasen yaklaslla 3.0 ng/mL tercihen yaklas[lZl 8500 IU/mL sakrosidazdan olusan bir çözelti saglamaktadü Bu sakrosidaz formülasyonu, yaklaslKl , bir CSID hastaslîgiibi bir insan sujede bir alerjik reaksiyonu uyarmamaktadlü Diger yapllândlüna, yaklas[lZl en az 10,000 IU/mL aktiviteye sahip ve 10 ng/mL'den daha az kalan papaine sahip su/gliserolda bir sakrosidaz çözeltisi saglamaktadß Bir yapllândlünada, çözelti aglEIlBZl cinsinden yaklaslEI 1:1 suyun gliserole oranlEla sahiptir. Diger yapllândünada, çözelti 4.1 ila 4.5 pH'a sahiptir.

Papain miktarÇl ELISA teknikleri ile belirlenebilmektedir. Çözelti, söz konusu sakrosidaz. kromatografik saflastßnaslüçeren bir proses ile üretilmemektedir.

Burada kullanIigilgibi “yaklasllZl' terimi ile, konsantrasyon, pH, enzimatik aktivite, zaman ve parametrenin belirlenmesinde gerekli sekilde irsi olan teknik alanda uzman kisi tarafIan tan-bilecek benzer parametreler gibi referansllîlparametredeki degiskeni kapsamasEl amaçlanmaktadlÜ örnegin, bakIlZlSekiI 1. bulunabilmektedir.

Sekillerin Klgla Acililamaslîl Sekil 1, mevcut sakrosidaz ilaç maddesi üretim prosesinin bir aklgldiyagramIlB Sekil 2. Koomassie Mavisi ile BoyanmlglIdeaI Yüklü SDS-PAGE jeli. Iki üreticiden (5 pg protein) sakrosidaz ylgiI ilaç maddesi (Sekil 1). Yol 1: Düsük aralilaMW isaretleyici 17, 28, Sekil 3. Coomassie ile Boyanmlgl Çok Yüklü SDS-PAGE jeli. Iki üreticiden (20 iJg protein) sakrosidaz ylgJI ilaç maddesi (Sekil 1). Yol 1: Düsük aralllZl MW isaretleyicisi; Yol 2: aralllZlMW isaretleyicisi.

Sekil 4. Coomassie ile Boyanmg Çok Yüklü Dogal jel. Iki üreticiden (15 pg protein) sakrosidaz ylglI ilaç maddesi (Sekil 1). Yol 1: Referans StandartEC4546; Yol 2: STS- Sekil 5. Sakrosidaz. birincil amino asit yapEIZI513 amino asitten olusmaktadlü Sakrosidaz asagi gösterilen amino asit sekans- sahiptir (SEKANS KIMLIK NUMARASI:1).

Bulusun AvrItmlJclBlamasEl Bu bulus, azaltllmlgl alerjenik özelliklere sahip, insan reçete kullanIEliçin farmasötik standartlarEkarsllâyan çok ariÜIIhlgl bir hipoalerjenik sakrosidaz saglamaktadlü Sakrosidaz, organoleptik olarak ayri& gelistirilmektedir, çünkü bunlar. sulu çözeltileri kokusuzdur. Daha az saf olan sakrosidaz çözeltileri, “mayaliîl koku, istah kaçlElEErenk ve diger kokular gibi istenmeyen organoleptik özellikler gösterebilmektedir.

Ortak Adlar: Invertaz, Sakrosidaz Ticari Ad: Sucraid® (sakrosidaz) oral çözelti (Ilaç Ürünü) USAN: Sakrosidaz Kimyasal: ß-D-fruktofuranosit fruktohidrolaz Esanlamlllârlîlß-D-fruktofuranosidaz ß-D-fruktofuranosidaz ß-fruktofuranosidaz ß-fruktofura nosit fruktohidrolaz ß-fruktopiranosidaz ß-fruktosidaz ß-invertaz Frukto silinvertaz Invertaz Invertin Glukosükraz Sükraz Sakaroz hidrolaz Ekzo-ß-(2,6)-Fruktofuraosidaz Maksivert L 1000 Maya Sükraz (YS) 9001-57-4 Saflastlîilna Prosesinin Klîla AcllZlamasü Bu bulus, insan reçete kullan Egin farmasötik standartlarEkarsllâyan çok arlEllIl'iISlsakrosidaz üretmek için bir kromatografisiz proses saglamaktadE Yetersiz safIlKtan dolayÇl önceki dezavantajlari üstesinden gelerek, bu tür çok arlEllüilglsaflitha protein, özellikle sakrosidaz üretmek için daha önce bir kromatografik olmayan yöntem gelistirilmemistir. Bir kromatografik olmayan saflastlElna prosesi, üretim slBaletla önemli maliyet ve zaman tasarrufu yaratmaktadlEl Burada çallglna ilaclearakterizasyonu, saflllZl kanlElEl/e son olarak gelistirilmis benzersiz hipoalerjenik formülasyonun klinik kanEllEaglanmaktadlEl Mevcut sakrosidaz izolasyonu ve saflastlElna prosesinin tercih edilen bir yapllândlElnasII adIilarÇlSekil 1'de klîlaca açlElanmaktadlEl 1.Yaklas[El7.0 pH'da ve yaklasllîl 30 ila 34°C slîlaklEglüda bir sulu tamponlanmlglçözeltide papain ile saccharomyces cerevisiae mayaslîs'indirilmektedir. 2.Papain sindirimi, çözeltide mol (Dalton) bas. 500,000+ gram belirgin bir dogal çözelti molekül aglEIligil sahip çok büyük, papaine dirençli, sakrosiclaz enziminden etkili bir sekilde daha sonra diyafiltrelenebilen küçük molekül aglEllIKlEfragmanlara tüm proteinleri bölmektedir. Mayada üretilen kapsamlüglikosilasyona sahip sakrosidaz, papain sindirimine dirençlidir. 3.Iki farkllîlgözenek ve/veya partikül boyutuna sahip diyatomik topragI kullanIiÇl çözünmeyen bilesenlerin ve muhtemelen diger çözünen ve çözünmeyen kirliliklerin çogunun uzaklastlEllBiasEl tercih edilmektedir. Seçilen pH, iyonik güç ve konsantrasyonlarda, safliEtaki büyük bir artEl diyafiltrasyon için elde edilen katEI partikülsüz çözelti hazlEllayan dizideki iki adllEJ kullanilBiaslîla meydana gelmektedir. Çözünmeyen bilesenlerin uzaklastlEllBiasü ayrlEla ultra-filtrasyonda diyaliz membran nitrelerinin thianmasIEönlemektedir. Bu, islem görme h-ßrttlülnaktadlîl 4.Diyafiltrasyon verimli safliglEIdengelemek için deneysel olarak belirlenmis bir ideal gözenek boyutlu filtreyi kullanmaktadlE Mevcut proses, sakrosidazlEl bir çok arlfllIhlgl hipoalerjenijk kokusuz çözeltisine ulasmak için minimum bir 40 kiIoDaIton kesim filtresini maliyetinde esdeger safliKl vermektedir. Küçük gözenek boyutlu filtreler, yeterli son saflUZl saglamamaktadlB Deneysel olarak belirlenen, diyafiltreye karsEl seri hacimlerinin numarasIlB sadece 4+ diyafiltrasyon hacmi, insan farmasötik kullanma yönelik regüle edilmis bir yigiI ilaç maddesi için yeterli safligll gereklilikleri karsilâmas- olanak saglamaktadlEl .Gliserollu ilaç maddesinin son formülasyonu, tercihen FDA standartlarIEkarsilâyan lot biyolojik yükünü kesinlestirmek için steril filtrasyon kullanmaktadlEl Ilaç maddesi, Sucraid® ilaç ürünü vermesi için islem görene/konsantrasyonu ayarlanana/ambalajlanana kadar, uzun bir depolama süresince yaklasilg -18°C ila -25°C'de silindirlerde depolanmaktadß Bu noktada, sakrosidaz aktivitesi yaklaslKlen az 10,000 IU/mL'dir.

Bulus, asag-ki ayrlEtHJIbrneklere referans ile ayrlîia açiElanacaktlÜ burada kullanIiglEgibi buradaki terimler "SDS-PAGE” ve "ELISA", asagldiaki tekniklere referans ile tan IanmaktacllEl Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) Analizi Daha önceden belirlenmis toplam protein miktarIElçeren sakrosidaz ylgll ilaç maddesinin numuneleri, Charles Rivers LaboratuvarlÇlMaIvern, PA'da analiz edildi ve deneyler Tekagen, SDS-PAGE'in (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez) indirgenmesi, polipeptitlerin karlglmlarlübir elektrik alanIa) ayrEbantIara aylElnak için kullanilIhaktadlEl Bu kosullar aItIa mobilite, temel olarak moleküler boyut ile belirlenmektedir. Kolloidal Koomassie Mavisi ile boyama, çözümlenmis bantlar. görsel ve/veya dansitometrik analizlerine olanak saglamaktadlE Bu yöntem, bant baslEh 0.1 pg tespit alt sIlEllZile 0.25 pg ila 15 pg yükleri için lineerdir, örnegin, sakrosidaz. tespit ve miktar belirleme lellElhrlÇlOJ pg olarak belirlenmistir. Ölçülen sakrosidaz bant alanüprotein yükü ile lineer olarak korelasyon içindeydi.

Burada asag- açlElanan deneylerde, açlKlanan sakrosidaz-içeren numuneler, SDS numune tamponunda 2-merkaptoetanol ile indirgenmistir. Numuneler, yaklaslKl 1.0 mg/mL su ile ayarlanmlg ve proteini denature etmek/indirgemek için 3 dk. boyunca 100°C'de SDS tamponunda merkaptoetanolün bir hacmi ile muamele görmüstür. Numuneler 120 voltta 90 dk boyunca çalElan bir SDS kullanilârak, Novex® %4'20 Tris-Glisin Jeli (Invitrogen) kullanilârak bir XCeII SureLock Mini-Cell®'de (Invitrogen) çallgtlîllüilgtlü Jeller, Koomassie Mavisi ile boyanmE ve su ile ylKlanmlStE Jeller, bir Kisisel Dansitometre SI (Molecular Dynamics) kullanllârak taranmlstIE Enzim-Baölülmmünosorbent Denevi (ELISA) ile Papain MiktarII Belirlenmesi Sakrosidaz y@I ilaç maddesinin numuneleri PBS'ye karslîliyaliz edilmistir ve hiç bir papain E- 64 ile inhibe edilmemistir. Numune, bir niceliksel sandviç türü ELISA kullanilarak, Warnex Laboratories, Quebec, Kanada tarafIdan papain için deneye tabi tutulmustur. Papaine özgü bir poliklonal yakalama antikoru (tavsan), bir mikroplakanI her kuyucugunda kaplanmaktadlîl Numunelerde bulundugunda, papain yakalama antikoruna baglanmaktadlEl At turpu peroksidazEQHRP) ile konjuge olmus bir ikinci anti-papain antikoru (keçi), herhangi bir yakalanmlgl papaine baglanarak eklenmektedir. YilZlandlKtan sonra, O-fenilendiamin substratüHRP ile bir enzimatik renk reaksiyonu üretmek için %003 HZOZ ile eklenmektedir.

Reaksiyon, sülfürik asidin bir çözeltisi (durdurma çözeltisi) ile durdurulmaktadlEl Enzimatik reaksiyon ile olusan renk yogunlugu, spektrofotometri ile ölçülmektedir.

Numunelerdeki papain miktarü bir standart egri temel aIIrak hesaplanmlgtlü burada standartlar. her birinin ortalama 0D degeri, Y-ekseni üzerindedir ve papainin karslDKl gelen konsantrasyonu X-ekseni üzerindedir. Numunelerde papainin son konsantrasyonunu belirlemek için, standart egriden elde edilen konsantrasyon seyreltme faktörü ile çarpUIhaktadlE Papain miktarüGenS yazUJIIliEile otomatik olarak hesaplanmaktadE Papainin miktarII belirlenmesinin alt sIlEll3.13 ng/mL'dir. Papainin alt sIlEtespiti 1.56 ng/mL'dir. Örnek 1: Çok arEElE'nlSl Sakrosidaz için Üretim Prosesi Deiyonize su (1700 kg), bir 1000 galon reaktöre yüklenmektedir ve Saccharomyces karlgtlEIllIhaktadlB pH kontrol edilmektedir ve eger 6.9'un aItIa oldugu bulunursa, pH 7.0 ± 0.1 olana kadar %25 sodyum hidroksit çözeltisi kullanüârak pH ayarlanmaktadE Papain (3.4 kg) takiben ilave edilmektedir. sa'ten sonra pH 7.0 ± 0.1'e ayarlanmaktadßve hidrojen peroksit (34%, her bölüm 2.8 kg, dk. boyunca eklendigi noktada 22°C ve 26°C araleUa sogutulmaktadlE BulamaçI pH'l: kontrol edilmektedir ve %85 fosforik asidin eklenmesiyle pH ayrlüa 4.0 ± 0.1'e ayarlanmaktadE eklenmektedir ve 30 ila 40 dk. boyunca bulamaç karlgtlElEaktadlE Bulamaç, çözeltideki üründen hücre kallEtlgü/e herhangi baska bir katlîELizakIastlElnak için bir parlaylEIZfiltre aracUJgllýla dört esit bölümde filtrelenmektedir. Filtrasyonun her bölümü için, filtrat toplam hlîlîldurdugunda, filtre demeti, deiyonize su (400 kg) ile yllîlanmaktadlîl Bu yllZlamalar, baslanglglfiltratlarliile birlestirilmektedir.

Dördüncü filtrasyon tamamlandüîtan sonra, birlesmis filtratlar ve yilZlamalar 1000 galon reaktöre geri döndürülmektedir ve hidrojen peroksit (%34, 2.0 kg) ile muamele görmektedir. Çözelti, aktif karbon (20x40 ag, 60 kg) ve alüminyum sülfat (9.4 kg) ile islem vasltâslsîla renk degistirmektedir ve elde edilen bulamaç 1.5 ila 2 sa boyunca karlStlEllIhaktadE Diyatomik toprak (Celpure® S100, 32 kg) eklenmektedir ve Ilave 30 dk. boyunca karlStlEllIhaktadlEl Katliâr parlaylEEliiltre arac[[[g]üla ültrasyon ile uzaklastlülîhaktadlü Reaktör, mevcut olabilen herhangi kalan katlîcEl uzaklastünak için temizlenmektedir ve renk degisiminden filtrat, aynElçizgideki filtrede bir 0.2 mikron ile reaktöre geri dönmektedir. Çözelti daha sonra, 40 kilo-Dalton kesim filtreleri ile donatlanlglolan bir ultrafiltrasyon birimi kullanüârak yaklasüZlZSO kg'a konsantre edilmektedir.

Konsantre sakrosidaz çözeltisi, ard Ian sitrik asit tampon çözeltisinin en az dört hacmine (- 1000 L) karsEdiyafiltrasyon ile saflastlBIB1aktadlEI Bu tampon çözeltisi, deiyonize su (1000 kg), sitrik asit (9.2 kg), sodyum sitrattan (11.2 k) haziEllanmaktadlElve çözeltinin pH'lZP/025 sodyum hidroksitin eklenmesiyle 4.6 ± 0.1'e ayarlanmaktadlB Tamponun ilave hacimleri, toplam protein safl@Il:Iarttlîilnak için kullanllâbilirken, son formüle edilmis çözeltideki kirliliklerin kallütljseviyelerini azaltmak için devam etmektedir. Tipik olarak sitrik asit tamponunun dört hacmi (-1000 L), çözeltide kalan sakrosidaz proteininin safl[g]Il:i>°/o99 safl[gla ulastlElnak ve papain seviyelerini <50 ppb'ye ulastIEnak için diyafiltrasyon leasIa yeterli idi.

Diyafiltrasyon bir kere tamamlandiglia, çözelti daha sonra malzeme sakrosidaz deney testinde 2 26,000 IU/mL deney degerine sahip olana kadar konsantre edilmektedir. Çözeltinin pH'llrdlEdan kontrol edilmektedir ve eger pH < 4.15 ise %25 sodyum hidroksit çözeltisinin kullanIiEüe ve eger çözeltinin pH'ü› 4.45 ise %85 fosforik asit kullanIiEile 4.3 ± 0.1'e ayarlanmaktadE pH ayarlamasütamamlandlglia, çözelti bir karlglm kabI aktarlEhaktadE ve gliserinin yaklasüZJ esit aglBlUZlarüsakrosidaz ilaç maddesi üretmek için ilave edilmektedir. Elde edilen su-gliserin çözeltisi 10 dk. boyunca karlStlEllBiaktadlE Hedef ilaç maddesi sakrosidaz. > ,000 IU/mL'si ve yaklasüa gliserolün agEllllZl cinsinden %45 ila 54'üne sahiptir. KarStlEina tamamlandlglIa, çözelti, dizilerde ayarlanan iki 0.2 mikron naylon aynEçizgideki filtreden silindirlere aktarllB'iaktadE Silindirlerdeki çözelti veya “ilaç maddesi”, uzun süreli yaklaslEl-ZO °C'de depolanmadan önce, 8 ila 36 sa boyunca oda lelakllglia depolanmaktadlEI Bölümler Sucraid® ilaç ürününü vermesi için gerektiginde uzaklastlîlmiaktadlîlve seyreltilmektedir ve ambalajlanmaktadlü Örnek 2: Dansitometri - Ideal Yük ile Koomassie Mavisi ile Boyanmß Indirgenmis SDS-PAGE Jeli Sekil 2'de gösterilen jel, yeni çok arltjlîhlgl hipoalerjenik üretim prosesi kullanüârak üretilen sakrosidazlEl(Y0llar 6, 7, 8) 3 Iotu ile, daha eski bir üretim prosesi ile üretilmis olan bir önceki sakrosidaz üreticisinin (Yollar 3, 4, 5) 3 Iotu ile karsllâst.[glEUa, bir Koomassie boyalÇl indirgenmis SDS-PAGE'dir. Referans StandartElC4546, mevcut kullannda olan referans standardIlEI ve eski prosesten üretilmistir. Referans StandartEC3955, Orijinal Sakrosidaz üreticisinden daha eski bir referans standardIE Ideal olarak yüklü bu SDS-PAGE jelinin dansitometri taramasÇl asagi gösterilmektedir (Tablo 1). Bu sonuçlar, yeni proses kullanilârak üretilen sakrosidaz. hiç tespit edilebilir protein kirliligine sahip olmayan çok arlEllillgoldugunu belirgin bir sekilde göstermektedir. Bu yöntemin cGMP dogrulamasElD.1 mikrogramdan daha az bir tespit sIlElERurmustur.

Numune Türü Lot Numarasi] Yol No: Bant No: Bant Hacmi °/o Yogunluk StandartEl 2. 2. 110 5.69 3. 2. 127 5.07 4. 2 154 5.17 . 2. 152 5.54 *Kromatografi ile saflastlElüiSl Sadece deneye ait numune. Örnek 3: Dansitometri - AslEÜYüklü Jel ile Koomassie BoyalElIndirgenmis SDS- PAGE Jeli Bir ikinci protokolde, indirgenmis SDS-PAGE jelleri, 20 ug protein ile aslEÜiüklenmistir (Sekil 3). Koomassie boyalEljellerde, mevcut sakrosidaz ilaç maddesinde küçük bir kirlilik bantD görülebilirdir, ancak bulusun sakrosidazlüllûl mutlak safl[g]E(-%97, Yollar 6, 7, 8) daha eski sakrosidazlEkinden üstündür (-%90, Yollar 3, 4, 5). Tablo 2, bu jelden bilgiyi kisaca açlElamaktadlB Numune Türü Numune Protein Mik Yol Bant Bant Bant Hacmi Bant % Lotu (i.ig) No. No: rf Topla Y0gunluk Örnek 4: Ideal ve AsEÜüklü Dogal Jeller Bir üçüncü protokolde, indirgenmemis numuneler dogal PAGE jelleri üzerinde çaligtlEllEîlgtlü Hem ideal (Spg protein) hem de aslEIEl/üklü (20, 30 & 60 i.ig protein) protein, Koomassie Mavisi ile daha sonra boyanmlglpoliakrilamid jellere uygulanmlgtß Sekil 4, bir aslEEýükIü (15 pg) Koomassie boyallîlogal jeli göstermektedir. Jelin dansitometri taramasEmevcut çok arlîllBiE proses kullanilarak üretilen sakrosidaz için %100, %100 ve 99.31 saflilîl degerlerini göstermektedir. Bu jel yeni proses kullanilârak üretilen sakrosidaz. çok ariflanlSlkalitesini açliga göstermektedir. Tablo 3, bu jelden bilgiyi kisaca açiKlamaktadE Numune Numune Protein Mik Yol Bant Bant Bant Bant % 1. 3. 0.711 0.70 2. 4. 0.896 0.91 Örnek 5: Bir protein kirliligindeki Indirgeme büyüklügünün (1,000 kat) üç slIbsEl AsiEEliassasiyet reaksiyonlarIan dolayE2008 y-a FDA tüm topikal papain ürünlerini geri topladEI (www.fda.gov[News- sakrosidaz için gerekliydi (www.fda.qov/downloads/Druqs/DruqSafety/PostmarketDruqSafetyInformationf orPatientsandProviders/UCM 144251.pdf). kullanilârak, çok hassas bir ELISA (3 ng/mL LOQ) ile neredeyse tespit edilemeyen seviyelere Mevcut proses, yeni kromatografisiz proses ilaç maddesinin papain seviyelerinde indirgemenin büyüklügünün etkili bir üç süslü göstermektedir. LOQ, miktar belirleme sIlEEEl Asag-ki bu Iotlar, mevcut prosesteri (Lotlar ng/mL papain sI-Ellasligeski üreticilerin lotlarII (STS- son sonucu idi. ng/mL olarak papain konsantrasyonu ile sakrosidaz lot numarasD Bu örnek, tespit edilemeyen seviyelere papainin indirgenmesinin büyük orandaki seviyelerini göstermektedir. 23 kilo-Dalton'daki papain, çözeltide üç boyutlu dogal formda papain bölünmesine dirençli olan sakrosidaz dlglütla 40 KD molekül aglîllilZlElkesim üzerinde bulunan papain taraf-an bölünen proteinler ile birlikte, kullanllân ultrafiltrasyon filtresinin 40 KD kesim sIlEllBltIdaki diger proteinlerin olasEliemsili olan bir anahtar isaretleyici proteindir. Örnek 6: Gelistirilen Organoleptik Özellikler Konsantrasyondan sonra çözelti diyafiltrelenirken, bir operatör, konsantre sakrosidaz çözeltisinin rengi ve kokusunu gözlemleme görevine sahipti. YiElamaIar hacimleri saylîlglhiç (SEID diyafiltrasyon y[lZbma hacmi olmadan dört (4) diyafiltrasyon yllîhma hacmine arttEIZça, operatör, tüm maya kokusunun sakrosidaz çözeltisinden uzaklast-[gllElve sarElrengin neredeyse hiç sarElrenk olmayana kadar büyük oranda indirgendigini gözlemlemistir.

Reçetelendirilmis Sucroid dozlamaslîlile zaylt] uygunluga yol açarak bazügenç hastalar tarafIan “mayallloku” tolere edilmedikçe, genç pediyatrik hasta sikayeti için bu yeni çok arlElIE1l$formülasyonunun bu organoleptik özellikleri, önemli olmaktadlE Örnek 7: Gelismis Güvenlik ve DevamlEEtkililîgin Klinik KanlfEl yas-a bir disi CSID hastasÇlAgustos 2012'de Sucroid'in eski formülasyonu ile ilk dozunu almlgtlîlve alerjik reaksiyonlar. olasiligiian dolayIZFDA onayllîiatiketleme (ambalaj eki) ile bilgilendirildigi gibi, ilk dozu kendi doktorlar.. ofisinde almlgtß Sucroid'in eski formülasyonu ile dozlandlKtan sonra bu hastanI tüm vücudu ürtiker göstermistir. Sucroid ile ilave doz bu yüzden düsünülmemistir. Aile, kendi klZarII gastrointestinal problemlerine bir çözüm bulmak Için hevesli idi, bu yüzden yaklastlîl 2 ay sonra Sucroid'in eski formülasyonun farkIEI lotu ile ikinci bir zorluga yanasilîhlStlEl Tekrar ürtiker göstermis ve bu yüzden bu hasta, genetik olarak belirlenmis sükraz eksikliginin tedavi edilmesi için ticari olarak piyasada bulunan FDA onayIE$ucroid kullan!. devamlüilarak dahil edilmemistir.

Bu yeni çok arlfllüilgl hipoalerjenik sakrosidaz formülasyonu gelistirildikten sonra, KasIi 2013'de aynEhastada bir test dozlama protokolü için Rochester Minnesota'da Mayo Klinik'te Hastane Etik Kurulu (IRB) onayElile birlikte bir IND dosyalanmlgl ve FDA tarafIdan yetkilendirilmistir. Yeni çok arlfllîhlgl hipoalerjenik sakrosidaz formülasyonu ile tedavi edildikten sonra, bu 5 yaslEUaki hasta ürtiker de dahil artIlZJ hiç bir alerjik reaksiyon veya semptom göstermemistir. Ayrlîla, Sucraid'in yeni çok arifilîhlgl hipoalerjenik formülasyonu aIIlKtan sonra, gün baslEla 1 ila 2 olusan dlgklýb karsI gün bas. >6+ sulu dlgkEtürü baglEkak hareketleri, abdominal agrII yok olmasEl/e abdominal siskinligin yok olmasEda dahil CSID semptomlarEltamamen iyilesmistir, bu yüzden pediyatrik hasta su an, kendi hastaliglEI tedavisi için bu hayat degistirici ilacEkuIlanabilmektedir. SakrosidazI yeni çok arElEhlî hipoalerjenik formülasyonu, kendi CSID hastal[g]II kontrolü için mükemmel sonuçlar ile Mayo IRB ile birlikte FDA tarafIan onaylElND'ye uygun olarak kronik kullanIi için bu hastaya saglanmaktadlEl SEKANS LISTESI <110> Reardan, Dayton T. Ph.D., RAC Seekamp, Christopher QOL Medical LLC <120> SAKROSIDAZIN ÇOK ARITILMIS HIPOALERJENIK ÇÖZELTILERI <160> 1 <170> Windows Versiyon 4.0 için FastSEQ <210> 1 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiyen <400> 1 Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Glu Lys 25 30 Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Cin Tyr Asn Prc› Asn Asp Thr Val 40 45 Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Leu Thr 50 55 60 Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp Ser 65 70 75 80 GlyThr SEKIL i Üretim Prosesinin AklîlDivaciramEl Adli / Ekipman Malzeme Proses Kontrol ÇlKtllâr » deiyonize su Hücre kallEtlgDe reaktörde) mayanl » maya pH = 7 ± 0.1 sahip karlSlBi. sindîrIImesi » sodyum hidroksit, 17.5 ila 22 saat tutma .L %25 çözelti 2. Sindirimin » hidrojen peroksit Hücre kallEtlEEle asitlestirilmesi 3. Hücre kalßtllârII uzaklastlElÜiasEl (Parlaylîlîlûltre) 4. Filtrenin renk degistirmesi . Katllârl UzaklastEllÜiasEl ( ParlavlEElliltre) 6. Ultrafiltrasyon aracüiglîla Konsantrasyon (Ultraûltrasyon Rig) 7. Konsantrasyonu takiben diyafiltrasyon (Ultraûltrasyori Rig) 8. pH ayarlanmasEGIOOÜ L Tote aglîlllEl cinsinden Devirli Pompa) 9. Gliserinler ile karlgtlEina . HDPE silindirleri içine filtrasyon » fosforik asit, %85 » diyatomik toprak » deiyonize su (Filtrelenmis) » filtre kag IEl » aktif karbon » hidrojen peroksit çözeltisi » alüminyum sülfat » diyatomik toprak » filtre kag IE! > > 40 kDa Moleküler Ag IEIliEl Kesim polietersülfIE] filtre membran El » deiyonize su (filtrelenmis) » sodyum sitrat » sitrik asit » sodyum hidroksit, » fosforik asit, %85 » sodyum hidroksit, » gliserin » dizi halinde iki 0.2 mikron filtre aracUJIjlsîla ayn Eizgideki filtre 22° - 26° ° - 25° 23° - 27° ila 60 dk. tutma.

S_ kalan eser miktar karbondan daha fazlaslîl yok. Bir 0.2 mikron filtre valeislîla aynlgizgideki filtre. 22° - 28°; UF rig.'e uymasEIçin seriye yönelik yeterli hacim indirgemesi. 222.0001U/mL hedef sükraz aktivitesi >10.000 IU/mL hacminde hedef sükraz deneyi ve aglEllllZça %45 ile 54 gliserin içerigi. çözünmüs proteinlere sahip karlglm. Papain inaktive edilmis.

Protein çözeltisi.

Karbon, alüminyum hidroksit topaklarüle çözünmüs proteinlere sahip karlglm.

Belirginlesen protein çözeltisi.

Konsantre Sakrosidaz çözeltisi (~250 L) Konsantre, çok arlfllüilgl Sakrosidaz çözeltisi.

Büyük oranda indirgenmis Papain konsantrasyonu.

Ideal pH ile Konsantre Sakrosidaz Gliserin içeren, konsantre Sakrosidaz çözeltisi.

Filtrelenmis, gliserin içeren konsantre Sakrosidaz çözeltisi. 1 SMTNETSDRP LVHFTPNKGW MNDPNGLWYD EKDAKWHLYF QYNPNDTVWG 51 TPLFWGHATS DDLTNWEDQP IAIAPKRNDS GAFSGSMWD YNNTSGFFND 101 TIDPRQRCVA IWTYNTPESE EQYISYSLDG GYTFTEYQKN PVLAANSTQF 151 RDPKVFWYEP SQKWIMTAAK SQDYKIEIYS SDDLKSWKLE SAFANEGFLG 201 YQYECPGLIE VPTEQDPSKS YWVMFISINP GAPAGGSFNQ YFVGSFNGTH 251 FEAFDNQSRV VDFGKDYYAL QTFFNTDPTY GSALGIAWAS NWEYSAFVPT 301 NPWRSSMSLV RKFSLNTEYQ ANPEFELINL KAEPILNISN AGPWSRFATN 351 `I'I'LTKANSYN VDLSNSTGTL EFELWAVNT TQTISKSVFA DLSLWFKGLE 401 DPEEYLRMGF EVSASSFFLD RGNSKVKFVK ENPYFI'NRMS VNNQPFKSEN 451 DLSYYKWGL LDQNILELYF NDGDWSTNT YFMTI'GNALG SVNMTI'GVDN 501 LFYIDKFQVR EVK Sakrosidaz için amino asit bilesimi asaglîzlh gösterilmektedir. 3.13 !1 frekans (°/o) 0.4 05 3.5 “-9 1.1 ABCD FGHIKL NPQRSTVWYZ Amino asit bilesimine bagllîblarak, Sakrosidaz için moleküler agiaiua

Claims (10)

ISTEMLER
1. . En az yaklasllZ] 7500 IU/mL enzimatik aktiviteye ve 10 ng/mL'den daha az bir kallEtEl papain konsantrasyonuna sahip yaklasllg 1:1 gliseroI/suda Saccharomyces cerei//5/aédan türetilen sakrosidaz. bir çözeltisi olup, burada günde yaklasllg 2 ila 10 mL çözeltinin bir günlük dozu, konjenital sakaroz-izomaltaz eksikliginden muzdarip olan bir insan hastada bir alerjik reaksiyonu tetiklememektedir, burada sakrosidaz. birincil yapEüglikolise olan bir 513 amino asit polipeptididir.
2. . Yaklas[lZJ3.0 ng/mL'dan daha az papain içeren istem 1'e göre sakrosidaz çözeltisi.
3. . 3.13 ng/mL miktar belirleme alt sI- sahip bir enzim-baglümmünosorbant deneyi ile ölçülebilen hiç tespit edilebilir papain içermeyen istem 1'e göre sakrosidaz çözeltisi.
4. . Söz konusu bilesimin yaklasllîl 15 ug'lEb kadar SDS-PAGE ile belirlendigi üzere, hiç tespit edilebilir papain içermeyen istem 1'e göre sakrosidaz çözeltisi.
5. . Yaklasllîl7500-9500 IU/mL enzimatik aktiviteye sahip, önceki istemlerden herhangi birine göre sakrosidaz çözeltisi.
6. . Bir proses ile hazlEllanan çok arltjlîhlg hipoalerjenik sakrosidaz olup, asagldbkileri içermektedir: (a) söz konusu süspansiyonda sakrosidaz bölünmeden, söz konusu süspansiyonda sakrosidaz olmayan proteinleri bölmek için etkili bir papain miktarElIe yaklasllZl 7.0 pH'da saccharomyces cerevisiae'nin bir sulu süspansiyonunun sindirilmesi; (b) bir asitlestirilmis filtratI elde edilmesine yönelik hücre kallEt-ülizaklastlîrlnak için sindirilmis süspansiyonun asitlestirilmesi ve filtrelenmesi; (c) rengi degismis bir süspansiyon vermesi için bir veya daha fazla renk degistirme ajanlîle asitlestirilen HItratI Islem görmesi; (d) bir konsantre sakrosidaz çözeltisini vermesi Için rengi degismis süspansiyonun filtrelenmesi ve konsantre edilmesi; (e) hipolarjenik sakrosidaz. bir çözeltisini vermesi için konsantre sakrosidaz çözeltisinin diyafiltrelenmesi, burada sakrosidazlEl birincil yaplâlîglikosile 513 amino asit polipeptididir ve burada çözelti yaklaslEJ 4.6 ± 0.1 pH'da ve 50 ppb'den daha az (50 nanogram/mL) papaine sahip suda en az yaklasiEl 22,000 IU/mL sakrosidaz aktivitesine sahiptir.
7. 7. Adi (d)'nin ultrafiltrasyonu takiben parlaylîlîlfiltrasyon içerdigi, istem 6'ya göre 5 sakrosidaz.
8. 8. Renk degistirme ajanlariBJI aktif kömür içerdigi, istem 6 veya 7'ye göre sakrosidaz.
9. 9. Diyafiltrasyonun dört veya daha fazla sitrat tamponu hacmine karsEigerçekIestirildigi, 10 istemler 6 ila 8'den herhangi birine göre sakrosidaz.
10. 10.Aglîl][lZJ cinsinden yaklasHZl %45 ila 54 gliserolun sakrosidaz. sulu çözeltisine eklenmesini içeren istemler 6 ila 9'dan herhangi birine göre sakrosidaz.