ES2766751T3

ES2766751T3 - Composiciones para la regulación de integrinas

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Publication number: ES2766751T3
Application number: ES13778057T
Authority: ES
Inventors: Vineet Gupta
Original assignee: GB006 Inc
Current assignee: GB006 Inc
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2020-06-15
Anticipated expiration: 2033-04-22
Also published as: WO2013159082A1; US9328105B2; EP2838614A1; US10239871B2; AU2013248972A1; US20160151336A1; CA2882853C; CA2882853A1; US20150105435A1; EP2838614A4; EP2838614B1

Abstract

Agonista de integrina β2 que tiene la fórmula**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para usar en la reducción de la cantidad de leucocitos inflamatorios en un tumor de cáncer de mama y la reducción del crecimiento del tumor de mama para tratar el cáncer de mama.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para la regulación de integrinas

[0001] La presente invención está en el campo de primado o activación de la familia p2 (beta2) de integrinas con diferentes agentes. Se describe el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones que implican la familia beta2 de las integrinas.

2. TÉCNICA ANTERIOR

[0002] Las integrinas están ligadas no covalentemente a receptores heterodiméricos a/p que median en la adhesión celular, la migración y la señalización. Junto con sus ligandos, las integrinas juegan un papel central en muchos procesos incluyendo el desarrollo, la hemostasia, la inflamación y la inmunidad, y en afecciones patológicas, tales como la invasión del cáncer y la enfermedad cardiovascular. Las funciones de los leucocitos clave, tales como la activación, la migración, el reclutamiento de tejido y la fagocitosis, son esenciales para su respuesta inmunitaria normal a la lesión y la infección y en diversas afecciones, incluyendo trastornos inflamatorios y autoinmunes [1, 2]. Las integrinas p2 (b2), una subfamilia de receptores de integrina heterodiméricos a/p, tienen una subunidad p común (p2, CD18) pero distintas subunidades a (CD11a, CD11b, CD11c y CD11d [3]) [4]. Regulan funciones de los leucocitos, incluyendo a través de integrinas CD11a/CD18 altamente expresadas (también conocidas como LFA-1) y CD11b/CD18 (también conocido como Mac-1, CR3 y aMp2) [2] que reconocen una variedad de ligandos. Por ejemplo, CD11b/CD18 reconoce > 30 ligandos, incluyendo el fragmento del complemento iC3b, fibrinógeno, CD40L y ICAM-1 como ligandos, entre varios otros. CD11b/CD18 se ha implicado en muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Estas incluyen la lesión por isquemia-reperfusión (incluyendo insuficiencia renal aguda y aterosclerosis), la esclerosis múltiple (MS), lesión tisular, transplante, lupus, lupus nefritis, degeneración macular, glaucoma, accidente cerebrovascular, engrosamiento neointimal en respuesta a la lesión vascular y la resolución de procesos inflamatorios [5-9]. Por ejemplo, la infiltración de leucocitos y las placas de desmielinización en el cerebro y la médula espinal de los pacientes son un sello de MS y se ha demostrado que CD11 b/CD18 desempeñan un papel clave en la mediación de la adhesión, la migración y el tráfico de leucocitos en MS y es una diana validada para MS. Del mismo modo, el influjo de leucocitos inflamatorios potencia la nefritis anti-GBM, que es un modelo de glomerulonefritis rápidamente progresiva y lupus nefritis, y se caracteriza por proteinuria, infiltración de leucocitos y formación de semilunas glomerulares [10, 11]. Los leucocitos desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la nefritis anti-GBM, y su número se correlaciona con el porcentaje de glomérulos con semilunas. Los animales CD11b-/- no muestran proteinuria y una fuerte protección de la función renal [12], lo que sugiere que los agentes que reconocen esta integrina tienen un potencial para tratar esta enfermedad.

[0003] De acuerdo con la Sociedad Americana del Cáncer, en todo el mundo, casi 8 millones de personas mueren de cáncer cada año. Este número se espera que aumente a 13,1 millones de muertes al año en el año 2030. Hubo 13,2 millones de nuevos casos de cáncer en el mundo en 2008, con una carga de costes asociados de $ 290B, y se espera que estos casos aumenten a 22,2 millones en 2030, con una carga de costes de $ 458B. El mundo en vías de desarrollo ve el doble de nuevos casos de cáncer que el mundo desarrollado. El cáncer es la segunda causa más común de muerte en los EE.UU.; se espera que cerca de 600.000 estadounidenses mueran de cáncer en 2013, casi 1.600 personas por día, lo que representa casi 1 de cada 4 muertes. Se espera que se diagnostiquen aproximadamente 1,6 millones de casos de cáncer en 2013.

[0004] El cáncer de mama (BC) es el segundo cáncer más común entre las mujeres en los EE.UU.; 1 de cada 8 mujeres tendrán BC en su vida; BC es también una causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres de todas las razas; ~226,000 nuevos casos de BC invasivo en 2012; casi 40.000 mujeres mueren cada año de BC. Además de ser hembras, la edad es el factor de riesgo más importante para BC. BC no produce síntomas cuando el tamaño del tumor es pequeño y los grandes tumores resultan evidentes como una masa de mama, pero también son a menudo indoloros. El dolor de mama es más probablemente causado por las condiciones benignas y no es un síntoma temprano común de BC.

[0005] En la actualidad, la extirpación quirúrgica de parte o de toda la mama es el tratamiento más eficaz en las primeras etapas de BC, en combinación con radioterapia y quimioterapia. Las mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama en estadio temprano que dan positivo para los receptores de hormonas se benefician del tratamiento con un inhibidor de aromatasa (por ejemplo, letrozol, anastrozol o exemestano) además de, o en lugar de, el tamoxifeno. Para las mujeres cuyo cáncer da positivo para HER2/neu, las terapias dirigidas aprobadas incluyen trastuzumab (Herceptin) y, para la enfermedad avanzada, lapatinib (Tykerb) y pertuzumab (Perjetal). La Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) revocó la aprobación de bevacizumab (Avastin) para el tratamiento del cáncer de mama metastásico en 2011 debido a la evidencia de que muestra un beneficio mínimo y algunos efectos secundarios potencialmente peligrosos. Por lo tanto, los agentes terapéuticos adicionales que son más eficaces y tienen menos efectos secundarios son muy necesarios. Además, los agentes terapéuticos adyuvantes que pueden reducir significativamente la dosis de los regímenes tóxicos de quimioterapia y radioterapia en pacientes con BC son muy necesarios.

[0006] Además, la mayoría de las terapias contra el cáncer que se utilizan actualmente tienen importantes problemas de seguridad cardiovascular. La disfunción progresiva del ventrículo izquierdo (VI) dependiente de la dosis que se manifiesta como una insuficiencia cardíaca sintomática está bien documentada en los pacientes que recibieron antraciclinas. En las mujeres con cáncer de mama temprano, en particular las de > 65 años de edad, la enfermedad cardiovascular (CVD) es la causa más común de muerte según lo indicado por los datos relacionados con Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER)-Medicare. Además, estas mujeres también están en mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares en comparación con las mujeres de la misma edad sin antecedentes de cáncer de mama. Paclitaxel es un fármaco citotóxico arritmogénica y conduce a la bradicardia, con una tasa de incidencia con paclitaxel que va desde 0,5% al 5% (y 1,7% con docetaxel). Aunque la cardiotoxicidad principal de los taxanos es la bradicardia, también se ha descrito la isquemia. Es importante destacar que, los ensayos clínicos con los agentes terapéuticos más nuevos, tales como anticuerpos monoclonales dirigidos a receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) (es decir, trastuzumab) y otros inhibidores de molécula pequeña de dianas múltiples más nuevos muestran que interfieren con las vías moleculares cruciales a la homeostasis cardiaca normal, lo que da lugar incidencias relativamente altas de toxicidad subclínica y cardiaca evidente. Aún más significativamente, aunque la toxicidad cardiaca con nuevas terapias puede ser reversible, la recuperación de la función LV después de la interrupción del tratamiento es incierta en este momento. Trastuzumab (Herceptin, un anticuerpo monoclonal humanizado contra el receptor de la tirosina quinasa HER2) muestra la incidencia de la disminución de LVEF o insuficiencia cardiaca asintomática (HF) en un ~ 7%, pero puede elevarse al 13% cuando el trastuzumab se administra con paclitaxel de forma simultánea y al 27 % con antraciclinas de forma simultánea. Por lo tanto, hay una gran necesidad de nuevos agentes terapéuticos para BC que, además de ser más eficaz, también disminuya el riesgo cardiovascular.

[0007] Los leucocitos inflamatoris reclutados a un microentorno tumoral son dianas para la terapia contra el cáncer. La inflamación está directamente relacionada con el crecimiento y recrecimiento tumoral después del tratamiento con cirugía, agentes anti-cáncer y la radiación. Los leucocitos CD45+ se regulan por incremento significativamente en tumores de mama humanos no tratados previamente y después de la quimioterapia. Las células mieloides (por ejemplo, neutrófilos y macrófagos) son algunos de los tipos de células que están altamente regulados por incremento en los tumores, especialmente después de tratamiento. En varios modelos animales, la reducción de la infiltración de células mieloides conduce a una reducción significativa en la carga tumoral, mejora la eficacia de las terapias contra el cáncer y reduce la metástasis de BC. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que los anticuerpos anti-CD11b mejoran la respuesta del tumor a la radiación en modelos de carcinoma de células escamosas.

[0008] Las integrina 132 leucocitarias también modulan la infiltración tumoral. Por ejemplo, los tumores también secretan citocinas inflamatorias para reclutar células mieloides que expresan CD11b para facilitar la neovascularización [13]. Durante los tratamientos de cáncer, los tumores irradiados reclutan grandes cantidades de leucocitos específicos, tales como células mieloides que expresan CD11b derivadas de médula ósea que expresan metaloproteinasa-9 de matriz (MMP-9), que restauran la vasculatura del tumor y permiten el recrecimiento y la recurrencia del tumor [14] . Estudios recientes han demostrado que el tratamiento con antagonistas de CD11b (anticuerpo anti-CD11b) reduce la infiltración de células mieloides que expresan CD11b y una mejora de la respuesta tumoral a la radiación en ratones [14], lo que sugiere que agentes que reconocen esta integrina tienen potencial para ser utilizados como agentes terapéuticos en oncología.

[0009] Además, la exposición a radiación ionizante (IR) provoca lesiones en los animales, provocando un influjo de leucocitos inflamatorios que es en parcialmente responsable de la lesión temprana (aguda) y tardía (crónica) y del deterioro funcional progresivo de múltiples órganos críticos en los mamíferos [15-20]. Estos incluyen el sistema hematopoyético. Las consecuencias de la exposición a la radiación ionizante (IR) son de gran preocupación para los pacientes que, por ejemplo, se han sometido a terapia de radiación y personas que están expuestas a IR debido a un accidente o ataque nuclear. Además, la exposición a IR subletal también causa una lesión dependiente de la dosis, incluyendo la toxicidad hematológica y también afecta tanto al número de células madre hematopoyéticas (HSC) y su función (daño funcional), incluyendo su capacidad de repoblación a largo plazo [21-26] . Por lo tanto, el bloqueo o la reducción de las respuestas inflamatorias después de exposición a la radiación podrían ayudar a mitigar los efectos tempranos (agudos) y tardíos (crónicos) de la radiación en pacientes expuestos.

[0010] Además, la insuficiencia de la médula ósea adquirida (BMF) se desarrolla después de una lesión en la médula ósea (BM) por la radiación ionizante (IR), los medicamentos de quimioterapia y antibióticos (por ejemplo, busulfán y cloranfenicol), productos químicos tóxicos (benceno, tetracloruro de carbono), o infección viral (hepatitis, VIH, CMV, parvovirus). Otra forma de BMF adquirida llamada anemia aplástica es una BMF mediada por el sistema inmune que se desarrolla después de la infusión de linfocitos, y se caracteriza por el deterioro funcional mediado por el sistema inmune de células madre hematopoyéticas (HSC). El daño funcional en las HSC puede con el tiempo llevar al desarrollo de BMF adquirida.

[0011] CD11b/CD18 también se expresa en la repoblación a corto plazo de células madre hematopoyéticas (HSC) y progenitores hematopoyéticos (HPC), y se ha demostrado que participa en la retención y el anclaje de HPC en la médula ósea durante la movilización forzada, lo que sugiere que agentes que reconocen CD11b/CD18 pueden tener un efecto protector sobre el número y función de las HSC y h Pc , in vitro, ex vivo, e in vivo.

[0012] Los estudios en los últimos años han demostrado que el bloqueo de CD11b/CD18 y sus ligandos con anticuerpos y miméticos de ligando (terapia anti-adhesión) [24-26] y la ablación genética de CD11b o CD18 disminuye la gravedad de la respuesta inflamatoria in vivo en muchos modelos experimentales [27, 28]. Sin embargo, tales agentes de bloqueo han tenido poco éxito en el tratamiento de enfermedades inflamatorias/autoinmunes en los seres humanos [28, 29], tal vez porque el bloqueo completo de CD11b/CD18 con anticuerpos es difícil debido a la disponibilidad de una gran grupo intracelular movilizable de CD11b/CD18 [30, 31] o porque la supresión del reclutamiento de leucocitos con agentes de bloqueo requiere la ocupación de > 90% de los receptores de la integrina activas [32]. Los anticuerpos anti-integrina 132 también han demostrado efectos secundarios inesperados [33]. Además, si la activación transitoria de una fracción de los receptores de integrina nativos in vivo, tal como se espera de un tratamiento con un agente de activación, tendrá algún efecto biológico significativo en lel entorno fisiológicamente relevante sigue siendo una pregunta abierta.

[0013] Un número de informes publicados en la literatura muestran que, además de aumentar la adhesión celular y modular la migración, la activación de CD11b/CD18 media en una serie de eventos de señalización intracelular, median en una serie de eventos de señalización intracelular, incluyendo la producción de especies reactivas de oxígeno y la modulación de una serie de genes proinflamatorios y antiinflamatorios en las células inflamatorias [27 32]. La activación de la integrina y la unión a ligando conduce a su agrupamiento de unión en la superficie celular e inicia la señalización fuera-dentro, incluyendo la activación de las vías PI3-K/Akt y MAPK/ERK1/2 [28, 33], imitando de ese modo las señales de prosupervivencia dependiente de anclaje en la mayoría de las células. La ligación y la agrupación de integrinas también potencia sinérgicamente la señalización intracelular por otros receptores (tales como, receptores de tipo Toll (TLR) y receptores de citocinas, receptor de interleucina-1 (IL-1R) y TNFR) y ambos inducen la expresión dependiente del factor de transcripción (tal como, NF-kB) de citocinas proinflamatorias (por ejemplo; IL1 p, IL6, TNF-a), así como la liberación de otros factores (por ejemplo, factor tisular). La deficiencia de CD11b/CD18 aumenta la producción provocada por TLR4 de citocinas proinflamatorias. Lo anterior sugiere que CD11b/CD18 y su activación tienen un papel protector en mamíferos sanos y que en afecciones o enfermedades inflamatorias, la activación de CD11b/CD18 suprimiría también la inflamación, la lesión inflamatoria y enfermedad regulando negativamente vías proinflamatorias en células que expresan CD11b/CD18 [34-36].

[0014] Lo anterior también sugiere que existe un potencial considerable para agentes que modulen la función de CD11b/CD18 como agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas afecciones inflamatorias. CD11b/CD18 se expresa normalmente en una conformación constitutivamente inactiva en los leucocitos circulantes y en muchas otras células, pero se activa rápidamente para mediar sus diversas funciones biológicas [23]. CD11b/CD18 también se expresa en muchos tipos de células y tejidos, incluyendo microgila, hepatocitos, HSCs, HPC y un subtipo de linfocitos T y las células B. CD11b/CD18 también se encuentra en su forma escindida, soluble en algunos casos [37].

[0015] Las integrinas beta2 de bloqueo, incluyendo CD11b/CD18, y sus ligandos con anticuerpos y miméticos de ligando (terapia anti-adhesión) [38-40] y la ablación genética de CD11a, CD11b, CD11c o CD18 disminuyen la gravedad de la respuesta inflamatoria in vivo en muchos modelos experimentales [41-43]. Sin embargo, tales agentes de bloqueo han tenido poco éxito en el tratamiento de enfermedades inflamatorias/autoinmunes en seres humanos [42, 44], tal vez porque el bloqueo completo de las integrinas con anticuerpos es difícil debido a la disponibilidad de una gran grupo intracelular movilizable de tales integrinas (por ejemplo, CD11b/CD18) [45, 46] o porque la supresión de reclutamiento de leucocitos con agentes de bloqueo requiere una ocupación de > 90% de los receptores de la integrina activos [47]. Los anticuerpos anti-integrina 32 también han mostrado efectos secundarios inesperados [48]. Además, si la activación transitoria de una fracción de receptores de integrina nativos in vivo, tal como se espera de un tratamiento con un agente de activación, tendrá algún efecto biológico significativo en la configuración fisiológicamente relevante sigue siendo una pregunta abierta.

[0016] Por lo tanto, existe una considerable necesidad de nuevos agentes, tales como anticuerpos, proteínas, péptidos, compuestos químicos y moléculas pequeñas, que regulan selectivamente la unión a ligando y la función de integrinas 32, incluyendo integrinas CD11a/CD18, CD11b/CD18 y CD11c/CD18. Además, hay una necesidad de agentes que activan integrinas (agonistas). Tales agonistas pueden mejorar la función de integrinas 32, por ejemplo, el reconocimiento o la unión a un sitio regulador alostérico, como el bolsillo hidrofóbico sitio-para-isoleucina (SILEN) en CD11b/CD18, y otros sitios similares, pero no el sitio de unión a ligando en la integrina. Por lo tanto, hay una necesidad de agentes de activación de integrina que no bloqueen las funciones de unión a ligando de las integrinas. Además, los agentes y procedimientos para mejorar o promover la adhesión celular y funciones celulares mediadas por integrina son muy deseados. Sin embargo, el avance hacia la identificación de tales agonistas ha sido lento, especialmente agonistas que se reconocen selectivamente y activan integrinas 32, incluyendo CD11b/CD18, con sólo unos pocos descubrimientos descritos [49, 50].

[0017] La presente invención describe nuevos agonistas CD11b/CD18 y un enfoque novedoso que implica el cebado de la integrina CD11b/CD18 para la activación o la activación, en lugar de su bloqueo, como una estrategia para modular la función de CD11b/CD18. Tales funciones biológicas incluyen la adhesión celular, la unión a ligando, la migración, fagocitosis, y la generación de moléculas efectoras, tales como citocinas. La presente invención describe adicionalmente compuestos y enfoques para modular la función de células que expresan CD11b/CD18 (tales como leucocitos, microglia, hepatocitos y linfocitos), incluyendo su adhesión, migración, reclutamiento y otras funciones biológicas. Se propusieron estrategias de que diversos agentes, tales como moléculas pequeñas, que se administran fácilmente in vivo y se pueden optimizar fácilmente para su uso en diferentes mamíferos, serían el mejor enfoque para la activación de integrinas. Aquí, se muestra que, sin limitación, la enfermedad inflamatoria puede ser reducida por la activación de CD11b/CD18 con nuevas moléculas pequeñas. Esto demuestra que la activación de la integrina es una metodología nueva, útil, farmacológicamente dirigible para tratar, sin limitación, una variedad de enfermedades y afecciones inflamatorias y autoinmunes.

[0018] La presente invención también muestra que los agentes activantes CD11b/CD18 que activan la forma de tipo salvaje normal de CD11b/CD18 y cualquiera de sus formas mutantes, tales como el mutante R77H, encontradas comúnmente en muchos pacientes portadores de enfermedades autoinmunes [51], serían altamente beneficiosos. Esta invención describe una nueva estrategia, como una alternativa a la estrategia anti-adhesión que se practica actualmente en la literatura, para la regulación de la función biológica de integrinas y células que expresan integrinas. Muchos tipos diferentes de agentes pueden activar las integrinas, tales como productos biológicos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas, lípidos, oligonucleótidos y compuestos químicos.

[0019] Un requisito importante de los agonistas útiles y composiciones que regulan las integrinas p2, incluyendo CD11b/CD18, es que no afectan negativamente a la viabilidad de las células, tejidos y animales. Es un objeto de la presente invención describir tales agonistas, composiciones y procedimientos. Además, es un objetivo de la presente invención mostrar que la activación transitoria de una fracción de receptores nativos in vivo, tal como se espera de un tratamiento con un agonista y procedimiento de esta invención, tiene un efecto biológico en sistemas modelo fisiológicamente relevantes. Además, la presente invención proporciona otras ventajas relacionadas. Además, un requisito importante de los compuestos y composiciones útiles que regulan las integrinas beta2, incluyendo CD11b/CD18, es que no afectan negativamente a la viabilidad de las células, tejidos y animales. Algunos han sugerido que los agonistas de integrinas podrían inducir la muerte de las células diana (Yang et al., J Biol Chem 281, 37904 (2006)), que no es deseable. Además, hay alguna técnica anterior en la familia de compuestos de tiazolidina-ona, incluyendo US 5.225.426, US 7.566.732, US 7.348.348, US 2006/0281798, US 2006/0183782, US 2006/0106077, US 2008/0108677, US 2010/0056503, WO 2009026346, WO/1995/029243. Sin embargo, no hay compuestos o procedimientos con las propiedades deseables anteriormente descritas hasta ahora que se haya descrito en la literatura. Es un objeto de la invención describir tales compuestos y procedimientos. Además, la presente invención proporciona otras ventajas relacionadas.

[0020] Además, las integrinas se ha demostrado ahora que existen en más de dos conformaciones (cerrada y abierta). Por ejemplo, CD11a/CD18 se ha demostrado que existen en al menos tres conformaciones - cerrada, intermedia y abierta - en base a su afinidad por su ligando ICAM-1 en cada uno de estos estados [52]. Esto también sugiere, aunque no se ha demostrado previamente, que estas diferentes conformaciones de integrina inducirán diferentes vías de señalización intracelulares. Es un objetivo de la presente invención describir agonistas de integrina p2 que, tras la unión a integrinas 132, activan las integrinas p2 e inducen vías de señalización intracelular que son diferentes de la conformación o conformaciones de integrina p2 unida a ligando.

[0021] Además, un número de agentes actualmente en desarrollo como agentes anti-inflamatorios están dirigidos a quinasas específicas, tales como la tirosina quinasa de bazo (Syk), proteína quinasa asociada a receptor de células T (ZAP70), quinasas de Janus (JAK) y tirosina quinasa de Bruton (BTK) [53]. Sigue habiendo una necesidad de compuestos y procedimientos que traten eficazmente la inflamación, especialmente que reconocen esas quinasas.

[0022] El documento US 2012/010255 describe compuestos, composiciones y procedimientos que son útiles en el reconocimiento de integrinas beta2, incluyendo CD11b/CD18, para uso en el tratamiento de varias enfermedades de mamíferos, incluyendo enfermedades y afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunes y cáncer. El documento US2004/002526 se refiere a inhibidores de la fosfolipasa D (PLD) y al tratamiento de enfermedades relacionadas con PLD. Por ejemplo, el documento US 2004/002526 da a conocer el tratamiento del cáncer mediante la inhibición de PLD en las células cancerosas. Sin embargo, ni el documento US 2012/010255 ni el documento US 2004/002526 describen el agonista de integrina beta2 descrito en la presente invención para uso en la reducción de la cantidad de leucocitos inflamatorios en un tumor de cáncer de mama o para su uso en el tratamiento de la nefropatía diabética.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0023] En un aspecto, la presente invención proporciona un agonista de integrina p2 que tiene la formula

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

para su uso en la reducción de la cantidad de leucocitos inflamatorios en un tumor de cáncer de mama y reducción en el crecimiento del tumor de mama para tratar el cáncer de mama. En una realización, la reducción del crecimiento del tumor de mama comprende reducir la incidencia y el tamaño de las metástasis. El tratamiento puede, por ejemplo, ser administrado en combinación con radiación o quimioterapia. Por ejemplo, el tratamiento puede ser administrado en combinación con paclitaxel.

[0024] En otro aspecto, la presente invención proporciona un agonista de integrina p2 que tiene la fórmula

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

para usar en el tratamiento de la nefropatía diabética.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0025] Otras ventajas de la presente invención se aprecian fácilmente cuando la misma se entiende mejor por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en conexión con los dibujos adjuntos en los que: La Figura 1 es una fotografía que muestra que el agonista de integrina p2 leucadherinas, tales como LA1, aceleran la degradación de MyD88;

Las figuras 2A-2C muestran que la leucadherina LA1 reduce la tasa de crecimiento del tumor tras el tratamiento, la figura 2a es un gráfico del crecimiento del tumor, la figura 2B es una imagen de bioluminiscencia in vivo de un grupo de control, y la figura 2C es una imagen de bioluminiscencia in vivo de un grupo de tratamiento con LA1;

La Figura 3 es un gráfico que muestra que las leucadherinas reducen la lesión renal en animales diabéticos;

Las Figuras 4A-4B muestran que el aumento de la adhesión de macrófagos disminuye la migración celular y la curación de heridas in vitro, la figura 4A es un histograma que muestra la cuantificación de los datos de curación de heridas presentados en la fotografía de la figura 4B, imágenes representativas mostradas de un pocillo de un experimentos con pocillos por triplicado de uno de al menos dos o tres experimentos independientes, las líneas de puntos representan los bordes de la herida al inicio del experimento (0 horas), barra de escala negra representa 50 mm;

Las figuras 5A-5B muestran que los anticuerpos de activación, pero no LA1, inducen la agrupación CD11b/CD18 en células vivas, la Figura 5A muestra imágenes de microscopía confocal de distribución de CD11b sobre la superficie de células K562 WT, y la Figura 5B es un histograma que muestra la cuantificación basada en ImageJ del número de macroagrupaciones de CD11b por célula de cada una de las condiciones mostradas en la Figura 5A;

Las figuras 6A-6D son gráficos e inmunotransferencias que muestran que los anticuerpos de activación inducen la señalización intracelular de MAPK que mimetiza el estado unido a ligando, pero LA1 no, la figura 6A es una inmunotransferencia de lisados de células enteras de células K562 WT tratadas en suspensión durante 45 minutos a 37 °C, con agonista de PKC PMA (control positivo), DMSO (vehículo), agonista no selectivo de Mn2+ (1 mM), mAb de activación KIM127 (dilución 1:100 de fluido ascítico), mAb de activación 24 (20 mg/ml) o el agonista LA1 (15 mM) sondados para ERK fosforilada (pERK; pThr202/pTyr204) y ERK total, la Figura 6B es una inmunotransferencia de lisados celulares sondados para JNK fosforilada (pJNK; pThr183/pTyr185) y JNK total, las figuras 6C y 6D son inmunotransferencias de lisados de células enteras de células K562 WT tratadas como en 6A y 6B, pero en presencia de ligando fibrinógeno (50 mg/ml);

Las Figuras 7A-7B muestran que el agonista LA1 no induce cambios conformacionales globales en CD11b/CD18, la Figura 7A es un histograma que muestra el nivel de expresión de CD11b/CD18 en la superficie de las células K562 WT vivas usando de peso vivo usando anticuerpo específico de heterodímero IB4 (derecha) y el isotipo IgG2a de control de mAb (izquierda), tal como se mide usando citometría de flujo, y la figura 7B es un análisis FACS en células K562 WT vivas que muestran la reactividad de los anticuerpos sonda indicadores de la conformación de CD11b/CD18 KIM127 (dilución 1:50 de ascitis) y mAb 24 (15 ug/ml) en diversas condiciones;

Las figuras 8A-8D muestran que los agonistas LA1 y ED7 reducen de manera similar el influjo de macrófagos en las arterias lesionadas, las figuras 8A-8C son representaciones de análisis FACS representativos de suspensiones de células individuales para macrófagos CD11b+ (basados en la unión con anticuerpo anti-CD11b de rata WT.5 ) en las arterias de 7 días después de la lesión con globo de las ratas tratadas después de la cirugía con un vehículo de control (8A), mAb de activación anti-CD11b ED7 (3,3 mg/kg/d) (8B) o LA1 (1 mg/kg/d) (8C), y la figura 8D es un gráfico de barras que muestra la cuantificación de macrófagos CD11b+ en las arterias lesionadas de varios animales (n = 4-6/grupo);

Las figuras 9A-9D muestran que el agonista LA1 es mejor en la mejora de la lesión vascular en comparación con el anticuerpo de activación anti-CD11b ED7, las figuras 9A-9C son fotomicrografías representativas de las arterias 21 días después de la lesión con globo de ratas tratadas después de la cirugía con un control de IgG de ratón irrelevante (mIgG1, 4 mg/kg/d) (9A), mAb de activación anti-CD11b ED7 (4 mg/kg/d) (9B) o LA1 (1 mg/kg/d) (9C) (las flechas apuntan al engrosamiento neoinitmal), y la figura 9D es un gráfico de barras que muestra la proporción de neoíntima con respecto al medio determinada por análisis morfométrico de las arterias lesionadas de los animales tratados (n = 6-7/grupo);

La Figura 10A muestra la estructura química del agonista LA2 y la figura 10B muestra la estructura química del agonista LA15 (ejemplos comparativos),

La Figura 11 es un histograma que muestra que las células que expresan CD11b/CD18 muestran un aumento de la adhesión en presencia de leucadherinas;

La Figura 12 es un histograma que muestra que el aumento de la adhesión de macrófagos con leucadherinas disminuye la migración celular y la curación de heridas in vitro;

Las figuras 13A-13B muestran que los anticuerpos de activación, pero no las leucadherinas LA2 y LA15, inducen la agrupación de CD11b/CD18 en células vivas, la figura 13A son imágenes de microscopía confocal de la distribución de CD11b sobre la superficie de células K562 WT, la Figura 13B es un histograma que muestra la cuantificación basada en ImageJ del número de macroagrupaciones de CD11b por célula de cada una de las condiciones que se muestran en 13A anterior (ejemplos comparativos),

las figuras 14A-14D muestran que el agonista LA1 reduce dependiendo de la dosis la lesión vascular en ratas de tipo salvaje, las figuras 14A-14C son fotomicrografías representativas de las arterias 21 días después de la lesión por globo de las ratas tratadas después de la cirugía con control de vehículo (14A), baja dosis de agonista LA1 (0,05 mg/kg/d) (14B) o una dosis más eficaz de LA1 (1 mg/kg/d) (14C) (las flechas apuntan al engrosamiento neointimal), y la Figura 14D es un gráfico de barras que muestra la proporción de neoíntima con respecto al medio determinada mediante análisis morfométrico de las arterias lesionadas de los animales tratados (n = 6-7/grupo).

Las figuras 15A-15G son gráficos que muestran que los niveles de ARNm de factores pro-inflamatorios que están regulados por incremento mediante el tratamiento con LPS se reducen significativamente en células co-tratadas con LA1;

Las figuras 16A-16G son gráficos que muestran que los niveles de ARNm de factores pro-inflamatorios que están regulados por incremento mediante el tratamiento con LPS se reducen significativamente en células co-tratadas con LA1;

La Figura 17 es un gráfico que muestra que los niveles de una serie de micro ARNs son modulados;

Las figuras 18A-18B son gráficos que muestran células resistentes a la separación en flujo de cizalladura;

Las figuras 19A-19B son gráficos que muestran el comportamiento adhesivo de varios transfectantes de CD11b/CD18 tratados con vehículo, Mn2+ o LA bajo la tensión de cizalladura (o tangencial) de la pared de 0,3 dyn/cm2;

La Figura 20 muestra que las mediciones bioquímicas en suero e hígado de las ratas tratadas con LA1 no reveló cambios apreciables en los niveles de enzima o constituyentes del suero, tales como proteínas, colesterol, urea y creatinina;

La figura 21 muestra que no había alteraciones significativas discernibles en el peso relativo de los órganos o su histología en la autopsia terminal;

Las Figuras 22A-22E son imágenes confocales de células endoteliales de vena umbilical humana teñidas con DAPI; la Figura 23 es un gráfico que muestra la concentración de leucadherina LA1 en sangre de ratón con el tiempo después de la administración a través de dos rutas diferentes;

la figura 24A es un gráfico de crecimiento relativo tumoral y la figura 24B es un gráfico de volumen relativo del tumor; La Figura 25 es un gráfico de porcentaje de supervivencia de diferentes grupos de tratamiento;

las figuras 26A-26C son gráficos que muestran el análisis de la hematopoyesis y el compartimiento de HSC en grupos tratados con LA1 (barras rojas), control de vehículo (barras azules) de ratones a las 4 semanas después de 6 Gy de irradiación corporal total (TBI);

La Figura 27 es un gráfico que muestra la proliferación de células T con dosis de LA1;

La Figura 28 es un gráfico de la liberación de TNF-a; y la

Figura 29 es una transferencia Western de la fosforilación de Syk.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0026] La presente invención describe diversos agentes, incluyendo compuestos químicos denominados leukadherinas, y procedimientos para el cebado o la activación de integrinas 132, especialmente CD11b/CD18. En otras palabras, los agentes descritos en el presente documento actúan como agonistas de integrinas p2, en lugar de antagonistas. Los agonistas y procedimientos son útiles para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer, entre otras enfermedades.

[0027] Los compuestos descritos en este documento son, por ejemplo, los compuestos de Fórmula (I)

en la que

A está ausente o se selecciona entre alquilo y alquenilo;

B está ausente o se selecciona entre alquilo, alquenilo, O, S y NR4;

N es nitrógeno;

X e Y se seleccionan independientemente entre O y S;

Z se selecciona entre CR4, O, S y NR4;

U, V y W se seleccionan independientemente entre CR4, O, S y NR4;

R1 y R3 se seleccionan independientemente entre acilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, tioalquilo, arilo, aralquilo, carboxiarilo, alcoxialquilo, alcoxiarilo, alcoxicarbonilarilo, aminoarilo, amidoarilo, haloarilo, heteroarilo, heteroaralquilo, carbociclilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, sulfonato, alquilsulfonato, arilsulfonato, sulfona, alquilsulfona, arilsulfona, sulfóxido, alquilsulfóxido, arilsulfóxido, alquilsulfonamida, arilsulfonamida, y sulfonamida, piperidinilo, morfolinilo, pirrolidinilo, fenilo, piridilo, pirimidinilo, furilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, triazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, indolilo, naftilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinoxalinilo, bencilo, benzofurilo, dibenzofurilo, benzotienilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, bencimidazolilo, piridoimidazolilo, pirimidoimidazolilo, piridopirazolilo, pirazolopirimidinilo, y cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con 1-6 sustituyentes independientes;

R2 se selecciona entre hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, tioalquilo, alcoxialquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, y heterociclilalquilo; y

R4 está ausente o se selecciona entre hidrógeno y alquilo.

[0028] El agonista de integrina beta2 para el uso de la presente invención pertenece al grupo de compuestos de Fórmula (II)

en la que

A está ausente o se selecciona de alquilo y alquenilo;

B está ausente o se selecciona de alquilo, alquenilo, O, S y NR4;

N es nitrógeno;

X e Y se seleccionan independientemente entre O y S;

Z se selecciona entre CR4, O, S y NR4;

U, V y W se seleccionan independientemente entre CR4, O, S y NR4;

R2 se seleccionan entre hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, tioalquilo, alcoxialquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, y heterociclilalquilo; y

R4 está ausente o se selecciona entre hidrógeno y alquilo.

[0029] Ejemplos de compuestos de Fórmula II son

[0030] El agonista de integrina beta2 para el uso de la presente invención es el Compuesto 1.

[0031] Un compuesto de fórmula II seleccionado entre los siguientes compuestos es menos preferido

[0032] Otros compuestos descritos son compuestos de Fórmula (III)

en la que

A está ausente o se selecciona entre alquilo y alquenilo;

B está ausente o se selecciona entre alquilo, alquenilo, O, S y NR4;

N es nitrógeno;

X e Y se seleccionan independientemente entre O y S;

Z se selecciona entre CR4, O, S y NR4;

U, V y W se seleccionan independientemente entre CR4, O, S y NR4;

R3 es 1-6 sustituyentes independientes presentes en la posición o posiciones 1-6 del anillo arilo;

R4 está ausente o se selecciona entre hidrógeno y alquilo.

[0033] Los compuestos descritos en el presente documento puede tener una polaridad de extremo a extremo inherente, de tal manera que los compuestos son más polares en un extremo de la molécula, por ejemplo, en el extremo superior (lado N-sustituido del anillo de tiazolidina) o el extremo inferior (lado furanilo sustituido del anillo de tiazolidina) según lo dibujado, en comparación con el otro extremo de la molécula. Alternativamente, los compuestos con dos extremos polares pueden estar desfavorecidos.

[0034] Los compuestos descritos en el presente documento pueden estar en una configuración única pura o sustancialmente pura, tal como una configuración Z.

[0035] Ciertos compuestos descritos en este documento pueden existir, en particular, en formas geométricas o estereoisoméricas, incluyendo isómeros cis- y trans-, enantiómeros R y S, diastereómeros, (d)-isómeros, (l)-isómeros, las mezclas racémicas de los mismos, y otras mezclas de los mismos. Átomos de carbono asimétricos adicionales pueden estar presentes en un sustituyente, tal como un grupo alquilo.

[0036] Los agonistas de integrina beta2 son útiles en un procedimiento de tratamiento de la inflamación, mediante administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina p2 a un paciente, y reducción de la inflamación. La integrina p2 puede ser CD11b/CD18. La inflamación puede reducirse mediante la reducción de la migración de células inflamatorias y el reclutamiento mediante el aumento de la adhesión celular mediada por CD18/CD11b. Las células inflamatorias pueden ser macrófagos o cualquier otra célula que contribuya a la inflamación.

[0037] La inflamación también se puede reducir mediante la unión del agonista de integrina p2 a un bolsillo alostérico en el dominio aA en CD11b. Tal unión se produce sin inducir cambios conformacionales globales en CD11b/CD18 y previene la señalización fuera-dentro. La unión induce adicionalmente el cebado de CD11b/CD18 y convierte CD11b/CD18 en una conformación intermedia estabilizada. La unión del agonista de integrina p2 se produce preferiblemente con uno o más residuos dentro de la secuencia E162-L170 de CD11b, es decir, SEQ ID NO: 1 (EQLKKSKTL).

[0038] El tratamiento de la inflamación pueden incluir además la reducción de la lesión vascular mecánica y la prevención y la reducción de la hiperplasia neointimal. La inflamación también se puede reducir mediante la aceleración de la degradación de MyD88, la inducción más rápida de la amortiguación de las vías mediadas por TLR4, y la inducción de la fosforilación de Syk. Varios factores pro-inflamatorios pueden regularse por incremento o por disminución mediante la administración del agonista de integrina p2. Los factores que pueden regularse por incremento incluyen hsa-miR-125b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-363, hsa-miR-134, hsa-miR-523, hsa-miR-1266, hsamiR-15b*, hsa-miR-877*, hsa-miR-130b*, hsa-miR-1237, hsa-miR-26b*, hsa-miR-191*, y combinaciones de los mismos. Los factores que pueden regularse por disminución incluyen hsa-miR-181d, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-526b, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-95, hsa-miR-551a, hsa-miR-365*, hsa-miR-1908, hsa-miR-624*, hsa-miR-1913, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR 224*, hsa-miR-505*, y combinaciones de los mismos.

[0039] Los agonistas de integrina Beta2 pueden usarse además en un procedimiento de tratamiento del cáncer, mediante la administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina p2 a un paciente, y la reducción de crecimiento del tumor. La reducción del crecimiento del tumor puede implicar la reducción de la incidencia y del tamaño de las metástasis, la reducción de la velocidad de recrecimiento del tumor, la reducción de la cantidad de leucocitos inflamatorios, la reducción de la vascularización del tumor, la reducción del injerto del tumor y combinaciones de los mismos. La reducción del crecimiento del tumor puede implicar además la reducción de la proliferación de células T, la disminución de la producción de IFN-g por células T, la reducción de la liberación de TNF-a.

[0040] Una forma intermedia de integrinas b2 es inducida por la unión de un agonista de integrina a una integrina B2, por ejemplo, CD11b/CD18. La unión de agonistas descritos en este documento induce una conformación intermedia de CD11b/CD18 en células que expresan CD11b/CD18. La inducción de la conformación intermedia conduce a diferentes tipos de señalización intracelular que la señalización que es inducida tras activación de la integrina con ligandos de proteínas. La unión de un agonista descrito aquí a una integrina b2 puede inducir diferente señalización intracelular que la unión de un anticuerpo de activación a una integrina b2. Por lo tanto, mediante la interacción de la integrina p2 con un agonista, y la estabilización de la integrina b2 en una conformación de afinidad intermedia activa las integrinas beta2.

[0041] Los agonistas y procedimientos aquí descritos se pueden utilizar en combinación con agentes que reconocen Syk, Btk, JAK, JAK1, JAK2, JAK3 y su dosificación se puede aumentar o se puede bajar en combinación con los compuestos descritos en este documento. También se pueden administrar fármacos anti-coagulación, esteroides, moduladores del receptor de esfingosina-fosfato, y medios de stent liberadores de fármacos. Debido a la sinergia con cualquiera de estos compuestos, las dosis se pueden reducir y los efectos secundarios negativos pueden reducirse o eliminarse asociados con dosis típicas.

[0042] Los agonistas y procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar en combinación con fármacos anti-inflamatorios, tales como, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINES), tales como salicilatos (aspirina), derivados de ácido acético (indometacina), derivados del ácido propiónico (ibuprofeno o naproxeno), o inhibidores de Coxll, tales como celecoxib (CELEBREX®, Pfizer, Inc.) o rofecoxib (VIOXX®, Merck). La dosificación es generalmente de 10 a 3.200 mg para los medicamentos anti-inflamatorios por día, que se puede disminuir en combinación con los agonistas descritos en este documento debido a la sinergia de la combinación. Además, debido a la sinergia, los efectos secundarios pueden reducirse que están asociados con una dosis típica de los fármacos anti-inflamatorios.

[0043] Los agonistas y procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar en combinación con compuestos contra el cáncer, tales como cilengitide, un ciclopéptido (RGDfV). La dosificación generalmente puede ser de 120 a 2.400 mg/m2, y puede disminuirse en combinación con los compuestos descritos en este documento debido a la sinergia de la combinación, reduciendo de este modo los efectos secundarios asociados con una dosis típica de los compuestos contra el cáncer.

[0044] Los agonistas y procedimientos descritos en este documento pueden usarse en combinación con medicamentos anti-rechazo, tales como, tacrolimus, ciclosporina, y varios esteroides. La dosificación para tacrolimus puede ser de 0,25 mg a 1 mg por día y puede disminuirse en combinación con los agonistas descritos en este documento. La dosificación para la ciclosporina puede ser de 1 a 12 mg/kg por día y puede disminuirse en combinación con los agonistas descritos en este documento debido a la sinergia de la combinación.

[0045] Los agonistas y procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar en combinación con tratamientos contra el cáncer, tales como quimioterapia, radiación o cirugía. La dosificación de los tratamientos contra el cáncer se puede disminuir en combinación con los compuestos descritos en este documento debido a la sinergia de la combinación, y por lo tanto reducir los efectos secundarios asociados con la dosificación típica de estos tratamientos. Los compuestos descritos en el presente documento también se pueden utilizar como adyuvantes a diversos tratamientos contra el cáncer, tales como la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía. Los compuestos descritos en el presente documento reducen el crecimiento de tumores, el recrecimiento de tumores, la vascularización del tumor, el reclutamiento de leucocitos en respuesta a las células tumorales o lesión a los tumores, metástasis tumoral, el injerto del tumor, y la obesidad y su respuesta a los tumores.

[0046] Los agonistas descritos en este documento también pueden usarse para prevenir la lesión inducida por exposición a la radiación en los pacientes y las células. Los agonistas de integrina Beta2 se pueden usar en un procedimiento de prevención de los efectos de la radiación, mediante la administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina (32 a un paciente antes de la exposición a la radiación, y la prevención de los efectos de la exposición a la radiación en el paciente.

[0047] Los compuestos descritos en este documento también pueden utilizarse para mitigar los efectos de la exposición a la radiación. En particular, los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar a pacientes después de la exposición a la radiación (administración retardada). Los compuestos descritos en este documento también protegen diversos órganos y compartimentos del daño por radiación, incluyendo el sistema hematopoyético. Los compuestos descritos en este documento son radiomitigantes eficaces y se pueden utilizar en un escenario de tratamiento retrasado. Además, el tratamiento con los compuestos descritos en este documento acelera la recuperación de la hematopoyesis y da lugar a una mejora significativa en la recuperación del compartimiento de HSC después de exposición a radiación, incluyendo radiación subletal. Por lo tanto, los agonistas de integrina beta2 se puede usar en un procedimiento de tratamiento de un paciente expuesto a radiación, mediante la administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina p2 al paciente después de exposición a la radiación, y la mitigación de los efectos de la exposición a la radiación en el paciente.

[0048] La insuficiencia de la médula ósea adquirida (BMF) se desarrolla después de una lesión en la médula ósea (BM) mediante radiación ionizante (IR), medicamentos de quimioterapia y antibióticos (por ejemplo, busulfán y cloranfenicol), productos químicos tóxicos (benceno, tetracloruro de carbono) o infección viral (hepatitis, VIH, CMV, parvovirus) (1). Otra forma de BMF adquirida llamada anemia aplástica es una BMF mediada por el sistema inmunitario que se desarrolla después de la infusión de linfocitos, y se caracteriza por un deterioro funcional mediado por el sistema inmunitario de células madre hematopoyéticas (HSC). Los agonistas descritos en este documento también pueden usarse para prevenir, mitigar o retrasar el desarrollo de BMF adquirida o reducir la amplitud de BMF adquirida. Por lo tanto, los agonistas de integrina beta2 también se puede usar en un procedimiento de tratamiento de la insuficiencia de la médula ósea adquirida (BMF) mediante administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina p2 a un paciente.

[0049] Los agonistas descritos en este documento pueden usarse además para mejorar la revascularización en los pacientes con daño en la pared vascular. Por lo tanto, los agonistas de integrina beta2 se pueden usar en un procedimiento para mejorar la salud de la vasculatura dañada en un paciente mediante la administración de un agonista de integrina p2 al paciente, y la mejora de la revascularización en el paciente.

[0050] Al interactuar la integrina (32 con un agonista, preferiblemente uno de los compuestos descritos en el presente documento, las integrinas beta2 pueden activarse. Los compuestos descritos en este documento pueden estabilizar la integrina b2 en una conformación de afinidad intermedia.

[0051] Los agonistas también puede corregir o reducir el déficit funcional en células que expresan formas mutantes de integrinas 132. Por ejemplo, las mutaciones en CD11b, tales como la mutación R77H, se han relacionado con el lupus y nefritis lúpica. Los agonistas descritos en el presente documento pueden reducir o superar los defectos funcionales en las células, organismos, y los animales que llevan formas mutantes de las integrinas 32. Por lo tanto, se pueden tratar o prevenir las enfermedades o afecciones que se asocian con la actividad de las integrinas 32, tales como, la nefropatía diabética, el lupus y la nefritis lúpica.

[0052] Más específicamente, los agonistas de integrinas beta pueden usarse en un procedimiento de tratamiento de nefropatía, mediante la administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina p2 a un paciente, y la mejora de la salud de los riñones del paciente. La nefropatía puede ser nefropatía diabética. La salud de los riñones mejora mediante la reducción del número de leucocitos infiltrantes en los riñones, la conservación de la función renal, y la reducción del daño glomerular y la esclerosis mesangial glomerular.

[0053] Los agonistas descritos en este documento también pueden, más en general, modular la función biológica in vitro o in vivo, tal como, la expresión génica, el perfil epigenético, la expresión de proteínas, los niveles de proteína, modificaciones de la proteína, modificaciones post-traduccionales y la señalización. Preferiblemente, los agonistas descritos en el presente documento modulan la función biológica en leucocitos, microglia y células madre. Alternativamente, los agonistas descritos en el presente documento pueden modular la función biológica en otras células o tejidos.

[0054] Los agonistas descritos en el presente documento pueden también modular otras funciones biológicas in vitro o in vivo, tales como, la diferenciación de las células madre, la diferenciación de células pluripotentes, mantenimiento de las células en cultivo o en el almacenamiento a largo plazo, movilización de células, tales como leucocitos, desde la médula ósea en células progenitoras endoteliales o de circulación a sitios de inflamación o lesión y aumentar la retención de ciertas células en sus nichos, tales como células de leucemia en la médula.

[0055] El tratamiento del paciente en cualquiera de los procedimientos anteriores se puede confirmar mediante la detección de la activación de las integrinas 132. Esto puede lograrse tomando una muestra del paciente y realizando un ensayo, tal como la detección de niveles de expresión de la integrina p2 en la superficie de los leucocitos en la muestra biológica o el nivel de integrina p2 activada en tales células. Otro enfoque para confirmar el tratamiento de un paciente es evaluar los niveles de los otros marcadores conocidos en el paciente que normalmente están asociados con dicha enfermedad, tales como niveles de IL-6 en las muestras de sangre, o síntomas de la enfermedad en el paciente.

[0056] Se pueden utilizar algoritmos de modelaje basados en ordenador para analizar las estructuras y conformaciones de los agonistas que se unen a integrinas 32, especialmente CD11b/CD18, para identificar características estructurales que contribuyen a una unión exitosa. Dicha información puede ser analizada conjuntamente con información sobre la estructura o conformación de CD11b/CD18 o un bolsillo de unión de la misma, tal como información estructural obtenida mediante análisis de CD11b/CD18 usando técnicas analíticas, tales como cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear, para analizar interacciones entre agonistas de unión y el bolsillo de unión con el que interactúan. Dichos análisis se pueden utilizar para predecir la parte de CD11b/CD18 que interactúa con el agonista para seleccionar agonistas que poseen características estructurales correlacionadas con la actividad de unión deseada a partir de una biblioteca de agonistas de ensayo, o para el diseño de estructuras que se espera que exhiban unión con CD11b/CD18 para el ensayo in vivo o in vitro usando ensayos, tal como se describe en el presente documento.

[0057] Los algoritmos de modelaje basados en ordenador también se pueden utilizar para identificar nuevos agonistas que se unen a integrinas p2, especialmente CD11b/CD18, utilizando características estructurales de los agonistas de compuestos químicos descritos en el presente documento. Se pueden utilizar saltos de andamio, reemplazo de átomos, sustitución de residuos y/o procedimientos de reemplazo de moléculas. La información puede ser analizada conjuntamente con información sobre la estructura o conformación de CD11b/CD18 o un bolsillo de unión de la misma, tal como información estructural obtenida mediante análisis de CD11b/CD18 usando técnicas analíticas, tales como cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear, para analizar interacciones entre agonistas de unión y el bolsillo de unión con el que interactúan. Dichos análisis se pueden utilizar para predecir la parte de CD11b/CD18 que interactúa con el agonista para seleccionar agonistas que poseen características estructurales correlacionadas con la actividad de unión deseada a partir de una biblioteca de agonistas de ensayo, o para el diseño de estructuras que se espera que exhiban unión con CD11b/CD18 para el ensayo in vivo o in vitro usando ensayos, tal como se describe en el presente documento.

[0058] Se proporciona un procedimiento para detectar o diagnosticar una afección o enfermedad en un paciente, mediante la administración de un agonista de integrina p2, tal como se describe en el presente documento, la detección de la unión del agonista de integrina p2 a una integrina p2, y confirmación de la presencia de la enfermedad. Preferiblemente, la integrina p2 es CD11b/CD18. En otras palabras, si la unión está presente, el paciente tiene una enfermedad, tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmune, y mediante la detección de la unión del agonista a CD11b/CD18, se puede confirmar que un paciente tiene esas enfermedades. También un agonista descrito en el presente documento se puede administrar a las muestras biológicas obtenidas de un paciente con el fin de detectar o diagnosticar una afección o una enfermedad en un paciente. El agonista administrado puede ser derivatizado, etiquetado, polimerizado, encapsulado o incrustado en una forma tal que permita la detección fácil. El agonista puede ser etiquetado con un trazador, un radiomarcador o una etiqueta fluorescente usando un enlazador. El agonista se puede detectar utilizando Imagen por Resonancia Magnética (MRI) y otras técnicas de diagnóstico, tal como se conoce en la técnica. Otro procedimiento de detección puede ser el siguiente. Puede tomarse una muestra biológica de un paciente, tal como sangre o plasma, y puede realizarse un ensayo, tal como para detectar la unión del agonista de integrina p2 a la integrina p2 o medir otros marcadores (por ejemplo, los niveles de IL-6) en la muestra.

[0059] Los agonistas de integrina Beta2 son útiles en un procedimiento para mejorar el bienestar general de un paciente mediante la administración de una cantidad eficaz de un agonista de integrina p2, y la activación de integrinas 32. En otras palabras, mediante la administración de los agonistas descritos en este documento mejora la salud de un paciente y el bienestar debido a que los agonistas tratan muchas enfermedades diferentes, tal como se describió anteriormente.

[0060] La dosificación de los agonistas y/o composiciones descritas en este documento puede variar dependiendo de muchos factores, tales como las propiedades farmacodinámicas del agonista, el modo de administración, la edad, salud y peso del receptor, la naturaleza y el alcance de los síntomas, la frecuencia del tratamiento y el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, y la tasa de depuración del agonista en el animal a tratar. Un experto en la técnica puede determinar la dosificación apropiada basándose en los factores anteriores. Los agonistas descritos en este documento pueden administrarse inicialmente en una dosificación adecuada que puede ajustarse según se requiera, dependiendo de la respuesta clínica.

[0061] Los agonistas de molécula pequeña descritas (denominadas "leucadherinas") activan CD11b/CD18 mediante la unión al dominio aA de unión al ligando de la integrina (también conocido como dominio CD11bA-dominio y el dominio aI [54]), un dominio de factor de von Willebrand de tipo A de aproximadamente 200 aminoácidos (VWFA) en la cadena de CD11b. Los estudios de modelaje mostraron que las leucadherinas se unen a un bolsillo alostérico en el dominio aA, desplazando el equilibrio a su conformación más activa, promoviendo con ello el acoplamiento del ligando por CD11b/CD18 [55]. La activación de integrina mediada por leucadherina aumenta la adhesión dependiente de CD11b/CD18 de los leucocitos, lo que conduce a una reducción significativa en su migración in vitro e in vivo y da lugar a una disminución significativa de la lesión inflamatoria. Un número de anticuerpos monoclonales (mAbs) que activan CD11b/CD18 y otras integrinas b2 o que se unen de una manera sensible a la activación (juntos referidos como "mAbs de activación") también se han descrito previamente en la literatura [56-65]. KIM127 es un anticuerpo dependiente de la activación que también activa CD11b/CD18 humana mediante el reconocimiento de los sitios en el dominio EGF2 de CD18 que están enterrados en la conformación inactiva de integrina [57, 61, 66]. El anticuerpo 24 (mAb 24) detecta y estabiliza la conformación activa unida al ligando de las integrinas b2 humanas y reconoce un epítopo sensible a la activación en el dominio A de CD18 (dominio aA) [59]. Del mismo modo, los anticuerpos de activación contra integrinas b2 murinas y de rata también se han descrito en la literatura. M18/2 reconoce la cadena de CD18 murina y simula la adhesión celular dependiente de CD11b/CD18 y formación de rosetas [67-69]. Los anticuerpos anti-CD11b de rata ED7 y ED8 mejoran la adhesión y la agregación homotípica de granulocitos dependiente de CD11b/CD18, lo que sugiere que activan CD11b/CD18 [70].

[0062] Como agente terapéutico, los compuestos de moléculas pequeñas y los agentes biológicos basados en anticuerpos tienen cada uno ventajas y desventajas distintas. Mientras que las moléculas pequeñas se administran fácilmente (típicamente por vía oral), se eliminan rápidamente y requieren una dosificación frecuente, aunque la vía de administración oral hace que sea un proceso fácil. La vía de administración de agentes biológicos basados en anticuerpos es menos que deseable, ya que son típicamente inyectados por vía intravenosa en la circulación, aunque sus largas vidas medias in vivo significan que necesitan ser administrados típicamente semanalmente o cada dos semanas. Sin embargo, esta depuración retardada de los agentes biológicos basados en anticuerpos es también una responsabilidad, en caso de que conduzcan a efectos secundarios graves, ya que los efectos secundarios necesitan mucho más tiempo para disminuir. Además, los agentes biológicos tienen el potencial de desarrollar una respuesta inmune contra ellos, generando nuevas complicaciones en los pacientes tratados. Habiendo establecido que la activación de CD11 b/CD18 es un mecanismo nuevo y farmacológicamente útil para el desarrollo de agentes terapéuticos anti-inflamatorios, nos preguntamos si ambos tipos de agonistas de integrina, compuestos químicos basados en moléculas pequeñas y los agentes biológicos basados en anticuerpos, serían igualmente eficaces y razonables para utilizar in vivo para tratar la inflamación a través de este mecanismo de acción (MOA). Para abordar esta cuestión, se realizó una prueba de cabeza a cabeza de los dos tipos de agentes utilizando los compuestos de leucadherinas recién desarrollados y un conjunto de anticuerpos anti-CD11b/CD18 que están ampliamente disponibles.

[0063] Aquí, se describen los hallazgos de que de hecho la activación de CD11b/CD18 a través de ambos tipos de reactivos (las leucadherinas químicas y los mAb de activación biológicos) aumenta la adhesión celular mediada por integrina y disminuye la migración celular y la curación de heridas in vitro, mostrando que ambos tipos de agentes tienen un mecanismo de acción similar. Sin embargo, también se muestra que aunque las leucadherinas no inducen la agrupación de CD11b/CD18 en la superficie celular o vías de señalización intracelular en las células tratadas, los anticuerpos de activación produjeron una agrupación significativa de CD11b/CD18 y aumentaron la fosforilación de las proteínas de señalización intracelular clave. Esto demuestra que a diferencia de la unión con leucadherinas, el acoplamiento de CD11b/CD18 con mAb de activación mimetiza un estado unido a ligando e induce una señalización fuera-dentro significativa. Otras investigaciones mecanicistas utilizando sondas específicas de conformación mostraron que la unión a leucadherina no indujo grandes cambios conformacionales globales en CD11b/CD18 que se asocian típicamente con la unión de ligandos o anticuerpos de activación [28, 71, 72]. Esto explica la falta de señalización fuera-dentro mimética de ligando por leucadherinas. Finalmente, en una comparación cabeza a cabeza en un modelo de lesión vascular in vivo, mientras que LA1 y ED7 redujeron de manera similar y significativa el influjo de macrófagos en las arterias lesionadas, solamente la leucadherina LA1 redujo de forma dependiente de la dosis la lesión vascular y mostró significativamente una eficacia más elevada que el anticuerpo de activación anti-CD11b ED7. Los resultados muestran que estos agonistas de molécula pequeña de CD11b/CD18 tienen una ventaja terapéutica clara sobre el anticuerpo de activación biológico. En conjunto, los datos presentados aquí indican que los agonistas de molécula pequeña de CD11b/CD18 tienen ventajas significativas sobre los agonistas biológicos, lo que puede requerir una optimización significativa antes de que los agonistas biológicos puedan utilizarse in vivo para aprovechar las ventajas de este nuevo mecanismo de acción para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos anti inflamatorios. Por lo tanto, las leucadherinas representan una clase preferida de agentes para el desarrollo en futuros agentes terapéuticos anti-inflamatorios.

[0064] El compuesto para uso de la presente invención se administra y se dosifica de acuerdo con las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual, el sitio y procedimiento de administración, la programación de la administración, la edad del paciente, el sexo, el peso del cuerpo y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad eficaz" farmacéuticamente para los propósitos en el presente documento se determina de este modo por tales consideraciones tal como se conocen en la técnica. La cantidad debe ser eficaz para conseguir una mejora incluyendo una mejora de la tasa de supervivencia o una recuperación más rápida, o mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores tal como se seleccionan como medidas apropiadas por los expertos en la técnica.

[0065] El compuesto para uso de la presente invención se puede administrar de diversas maneras. Cabe señalar que se puede administrar como el compuesto y se puede administrar solo o como ingrediente activo en combinación con portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos se pueden administrar por vía oral, por vía subcutánea o por vía parenteral, incluyendo por vía intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intraamigdalino y administración intranasal, así como técnicas intratecales e infusión. Los implantes de los compuestos son también útiles. El paciente que está siendo tratado es un animal de sangre caliente y, en particular, mamíferos, incluyendo el hombre. Los portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, así como los portadores de implantes se refieren generalmente a rellenos inertes, sólidos no tóxicos o rellenos líquidos, diluyentes o material de encapsulación que no reaccionen con los ingredientes activos de la invención.

[0066] Las dosis pueden ser dosis únicas o dosis múltiples durante un período de varios días. El tratamiento generalmente tiene una duración proporcional a la duración del proceso de la enfermedad y la eficacia del fármaco y la especie del paciente que se está tratando.

[0067] Cuando se administra el compuesto para el uso de la presente invención parenteralmente, generalmente se formulará en una unidad de dosificación en forma inyectable (solución, suspensión, emulsión). Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales.

[0068] La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Los vehículos no acuosos, tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de girasol, o aceite de cacahuete y ésteres, tales como miristato de isopropilo, también pueden utilizarse como sistemas disolventes para composiciones de compuestos. Además, se pueden añadir diversos aditivos que aumentan la estabilidad, esterilidad, e isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de microorganismos se puede asegurar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, y ácido sórbico. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares y cloruro de sodio. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Según la presente invención, sin embargo, cualquier vehículo, diluyente, o aditivo utilizado tendría que ser compatible con los compuestos.

[0069] Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los compuestos utilizados en la práctica de la presente invención en la cantidad requerida del disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes, según se desee.

[0070] Se puede administrar una formulación farmacológica al paciente en una formulación inyectable que contiene cualquier portador compatible, tales como diversos vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes; o los compuestos utilizados en la presente invención se pueden administrar parenteralmente al paciente en forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de administración dirigidos, tales como anticuerpos monoclonales, administración vectorizada, iontoforéticos, matrices poliméricas, liposomas y microesferas. Ejemplos de sistemas de administración útiles en la presente invención incluyen: 5225.182; 5.169.383; 5.167.616; 4.959.217; 4.925.678; 4.487.603; 4.486.194; 4.447.233; 4.447.224; 4.439.196; y 4.475.196. Muchos otros de dichos implantes, sistemas de administración y módulos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0071] La invención se describe adicionalmente en detalle por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustración solamente.

EJEMPLO 1

Procedimientos de síntesis

[0072] Los compuestos descritos en este documento pueden sintetizarse fácilmente usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como los descritos, por ejemplo, en Advanced Organic Chemistry. Marzo, 4a edición, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1992; Advanced Organic Chemistry, Carey y Sundberg, vol. A y B, 3a Ed, Plenum Press, Inc., Nueva York, NY., 1990; Protective groups in Organic Synthesis, Green and Wuts, 2a Ed, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1991; Comprehensive Organic Transformations, Larock, VCH Publishers, Inc., Nueva York, NY, 1988 y referencias allí citadas. Los materiales de partida para los compuestos descritos en la presente invención pueden prepararse usando transformaciones de síntesis estándar de precursores químicos que están fácilmente disponibles de fuentes comerciales, tales como, Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI); Sigma Chemical Co. (St. Louis , MO); Lancaster Synthesis (Windham, NH); Ryan Scientific (Columbia, Carolina del Sur); Maybridge (Cornwall, Reino Unido); Matrix Scientific (Columbia, Carolina del Sur); Arcos, (Pittsburgh, PA) y Trans World Chemicals (Rockville, MD ).

Material y procedimientos, reactivos y anticuerpos.

[0073] El anticuerpo monoclonal anti-CD11b (mAb) 44a (una inmunoglobulina G (IgG) 2a (IgG2a) isotipo) [73], el mAb IB4 específico de heterodímero (IgG2a) [74, 75], el mAb anti-CD18 mAb KIM127 activante (IgG1) [61] y el mAb anti-CD11b ED8 (IgG1) [76] fueron de ATCC. El mAb anti-CD18 24 activante (IgG1) [59] se obtuvo de Abcam, el mAb anti-CD11b Ed7 activante (IgG1) [76] era de Sigma-Aldrich, el mAb anti-CD18 M18/2 activante (IgG2a) [67] era de eBiosciences, el mAb anti-CD11b OX42 de bloqueo (IgG2a) [77] se obtuvo de Millipore y los anticuerpos de control de isotipo clon X40 (IgG1) y clon X39 (IgG2a), mAb A85-1 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (de rata anti-IgG1 de ratón), R19-15 conjugado a FITC (de rata anti-IgG2a de ratón), anticuerpo de cabra conjugado con FITC contra inmunoglobulina de ratón, anticuerpo de rata contra GR1 de ratón (GR1-FITC), y anticuerpo de rata conjugado a ficoeritrina (PE) contra CD11b de ratón se obtuvieron de BD Pharmingen. M1/70, un mAb de rata contra CD11b de ratón (IgG2b) [78] era del núcleo de anticuerpo monoclonal en la Universidad de California, San Francisco (UCSF). El fibrinógeno humano (agotado de plasminógeno, factor de von Willebrand, y fibronectina) era de Enzyme Research Laboratories, albúmina de suero bovino (BSA) fue de Sigma, LPS (O111:B4) fue de Invivogen, y acetato de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) era de Cell Signaling. Las placas de 384 pocillos Maxisorp y Highbind se obtuvieron de Nalgene y Corning, respectivamente. La leche sin grasa se obtuvo de BioRad. Todos los reactivos de cultivo de células eran de Invitrogen Corp. y Mediatech. El suero fetal bovino (FBS) se adquirió de Atlanta Biologicals, Inc. El antibiótico G418 se adquirió de Invivogen.

[0074] Las ratas de tipo salvaje Sprague-Dawley (SD) se compraron en Harlan Laboratories. El cuidado y los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales.

Células y líneas celulares.

[0075] Las células K562 transfectadas de forma estable con un plásmido que codifica la integrina CD11b/CD18 de tipo salvaje (células K562 WT) se han descrito anteriormente [49, 79] y se mantuvieron en medio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) suplementado con 10% FBS y G418 (0,5 mg/ml). La línea celular de macrófagos murina (RAW 264.7) se obtuvo de ATCC y se mantuvieron las células en DMEM suplementado con FBS inactivado con calor al 10% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los macrófagos peritoneales de rata primaria fueron aislados de ratas Fisher 344 de tipo salvaje que habían sido inyectadas previamente con 5 ml de caldo de tioglicolato de Brewer (Sigma-Aldrich). La pureza de macrófagos se analizó directamente mediante citometría de flujo de un solo canal usando anticuerpos monoclonales específicos de macrófagos de rata ED1 (AbD Serotec, Raleigh, NC), WT.5 (BD Biosciences) y His36 (BD Biosciences). La pureza fue típicamente > 85%. Los macrófagos se utilizaron en ensayos inmediatamente después del aislamiento.

Ensayos de adhesión celular.

[0076] Se llevaron a cabo ensayos de adhesión celular usando células RAW 264.7 murinas, K562WT y los macrófagos primarios de rata como se ha descrito anteriormente y se utilizó fibrinógeno inmovilizado como ligando de CD11b/CD18 [49]. Se preparó una solución madre de la familia leucadherinas de agonistas de molécula pequeña LA1, LA2, y L15 disolviendo cada compuesto en DMSO a una concentración de 10 mM. La concentración final de DMSO en el ensayo fue de aproximadamente 1%. Las células se suspendieron en DMEM libre de suero y se incubaron en presencia de diversos agentes en los pocillos recubiertos de ligando en una placa de 384 pocillos durante 10 minutos a 37 °C. LA1, LA2 y LA15 se utilizaron a una concentración final de 15 pM cada una y los mAbs se utilizaron a una concentración final de 20 pg/ml cada uno en los ensayos (LA2 y LA15 se muestran en la Figura 10). Las placas de ensayo fueron entonces invertirdas suavemente y se mantuvieron en la posición invertida durante 30 minutos a temperatura ambiente para desalojar las células no adherentes. Las células adherentes restantes se fijaron usando formaldehído al 4% y se cuantificaron mediante microscopía de formación de imágenes como se ha descrito anteriormente (22, 63). Los ensayos se realizaron en pocillos por triplicado. Los datos mostrados son de uno de al menos tres experimentos independientes.

Ensayo de curación de heridas

[0077] Se desarrollaron células macrófagos RAW 264.7 murinas medio FBS con DMEM 10% en matraces T75 a 70% de confluencia. Las células se separaron por tratamiento con tripsina durante 10 minutos a 37 °C y de manera uniforme se volvieron a sembrar en placas de 24 pocillos y se dejaron alcanzar > 70% de confluencia. Se introdujo un rayado horizontalmente a través del pocillo usando una punta de 200 ml aplicando fuerza incluso durante todo el rascado y manteniendo la punta en un ángulo de aproximadamente 80 grados. Los pocillos se lavaron posteriormente y se introdujo medio fresco que contenía diversos grupos de tratamiento. La herida fue fotografiada utilizando objetivo de 10x. Las células se dejaron crecer durante 48 horas y la herida se volvió a fotografiar en el mismo campo después de 48 horas. El grado promedio de cierre de la herida se evaluó mediante la medición de la anchura de la herida. La zona de curado se analizó usando el software ImageJ y se expresó como porcentaje de curación después de 48 horas.

Microscopía de inmunofluorescencia.

[0078] Para examinar la localización y la agrupación de CD11b/CD18 en la superficie celular, se suspendieron 1 x 104 células K562 CD11b/CD18 en IMDM exento de suero y se incubaron en presencia del control de DMSO (1%), leucadherinas LA1, LA2, o LA15 (15 mM cada una), mAb KIM127 (dilución 1:100 de ascitis), mAb 24 (20 mg/ml) o Mn2+ (1 mM) durante 1 hora a 37 °C, tal como se ha descrito anteriormente [55, 72]. Para visualizar cambios tras la unión a ligando, se añadió también fibrinógeno (50 mg/ml) a los medios de suspensión celular en un segundo conjunto de incubaciones. Las células se fijaron en suspensión y se incubaron con mAb IB4, que es específico para CD11b/CD18, seguido de anticuerpo de cabra conjugado con 488 Alexa Fluor contra Ig de ratón (Sigma). Las imágenes de fluorescencia se registraron con un microscopio de deconvolución Leica DMI16000, utilizando un objetivo HCX APO 40 x/0,75 DRY con una cámara DCF360FX y con el software Leica LAS-AF. Una representación en 3 dimensiones de la intensidad de fluorescencia de CD11b/CD18 y el análisis del número de grupos de CD11b/CD18 por célula se realizaron utilizando el software ImageJ tal como se ha descrito [80]. La determinación de la agrupación se llevó a cabo mediante el recuento de picos fluorescentes individuales que se proyectaron desde la parte basal a la parte apical de la célula y estaban por lo menos un 50% por encima de los niveles de la línea base. Las imágenes presentadas son representativas de al menos 20 células analizadas para cada condición de al menos tres experimentos independientes.

Análisis de transferencia Western.

[0079] Las células K562 WT se incubaron con LA1, LA2, LA15 (15 mM), o fibrinógeno (200 mg) en medio libre de suero durante 1 hora a 37 °C. Los lisados celulares se separaron en geles SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris del 4-12% usando tampón de ejecución MES y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (ThermoScientific) utilizando protocolos establecidos. Las membranas se incubaron con una dilución 1:1000 de los anticuerpos anti-fosfo-proteína (anticuerpo anti fosfo-p44/42 MAPK (pERK1/2) (Thr202/Tyr204, Cell Signaling) o anticuerpo anti-fosfo-SAPK/JNK (pJNK) (Thr183/Tyr185, Cell Signaling # 81E11)), o con un anticuerpo contra ERK1/2 total (p44/42 MAPK (Erk1/2), Cell Signaling # 137F5) o JNK total (SAPK/JNK, Cell Signaling # 56G8) y se desarrollaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ThermoScientific). Las proteínas se cuantificaron por densitometría usando el software ImageJ. Los datos presentados son representativos de dos a tres experimentos independientes.

Citometría de flujo.

[0080] Los análisis de citometría de flujo de células K562 WT se realizaron de acuerdo con protocolos publicados [55, 57, 81]. Brevemente, las células se suspendieron en el tampón de ensayo (solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 1 mM de iones Ca2+ y/o Mg2+ y 0,1% BSA). Las células (5 X 105) se incubaron con mAb primario (dilución 1:100 de ascitis IB4 o controles de isotipo, dilución 1:50 de ascitis KIM127 o 15 g/ml de mAb 24) en 100 ml de tampón en ausencia o presencia de 20 mM de agonista LA1 en hielo (a excepción de mAbs KIM127 y 24 y los controles de isotipo correspondientes, donde se realizaron incubaciones a 37 °C) durante 30 minutos. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con el tampón de ensayo y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón-APC (1 mg/ml, Invitrogen) durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con el tampón de ensayo y se analizaron usando citómetro de flujo FACSCaliber (BD Biosciences, CA), contando al menos 10.000 eventos. Los datos se analizaron usando el software CellQuest (BD Biosciences). Los datos expuestos son de uno de al menos tres experimentos independientes.

Lesión arterial inducida por balón en ratas.

[0081] Todas las cirugías se realizan bajo anestesia mediante isoflurano (Baxter). Se administraron mAb de activación ED7 (4 mg/kg/d), el control de isotipo mIgG1 (4 mg/kg/d, Rockland) y la leucadherina LA1 (1 mg/kg/d) cada uno por vía intraperitoneal (ip) en solución salina cada día hasta el final del experimento. La lesión por balón en la arteria ilíaca derecha fue infligida con un catéter 2F Fogarty (Baxter) adaptado a un kit angiográfico personalizado (Boston Scientific, Scimed) [82]. Se realizó una aortotomía en la aorta abdominal para insertar un catéter hasta el nivel de la arteria ilíaca derecha. El globo se infló hasta de 1,5 a 1,6 atmósferas y se retrajo al sitio de la arteriotomía tres veces. La escisión de la aorta se reparó con ocho puntos de sutura. La cavidad abdominal se cerró por planos con un patrón de sutura interrumpida. Se recogieron muestras arteriales 21 días después de la lesión y se fijaron en formalina al 45-PBS (Sigma-Aldrich) durante 5 minutos y se analizaron mediante histología e inmunotinción. Se midió la neoíntima en los portaobjetos teñidos con H & E utilizando ImagePro.

Análisis de citometría de flujo para la cuantificación de los macrófagos arteriales en arterias lesionadas.

[0082] Se sacrificaron ratas Fisher 344 tratadas con agonistas y lesionadas con balón de control 7 días después de la cirugía en el inicio de la inflamación. Las arterias ilíacas lesionadas y no lesionadas se microdiseccionaron y se digirieron con mezclas de colagenasa/elastasa (Worthington Biochemical, NY) en DMEM que contenía FBS al 2% durante 2 horas a 37 °C. La suspensión de células individuales resultantes se lavó con PBS frío que contenía FBS al 2% y se filtró a través de un tamiz de 70 mM. Las células se resuspendieron en PBS frío que contenía FBS al 2% a una concentración de 106 células por 100 ml y se tiñeron con anticuerpo anti-CD11b de rata biotinilado (clon WT.5, BD Biosciences) durante 1 hora a 4 °C. Posteriormente, las células se lavaron y se incubaron con APC-estreptavidina durante 30 minutos a 4 °C. Las células teñidas se fijaron con formalina al 4% en PBS durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con el tampón de ensayo y se analizaron usando el citómetro FACS II Canto y se analizaron los datos utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc.). Los datos presentados son de 4-6 muestras independientes/grupo.

Análisis estadístico.

[0083] Los datos se analizaron con GraphPad Prism y se comparó con la prueba de la t de Student o mediante análisis de una vía de la varianza (ANOVA) con análisis post hoc, cuando sea apropiado. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Ensayo de cámara de flujo

[0084] El ensayo de cámara de flujo se realizó tal como se describe en la literatura (Chen, JF, Salas, A. & Springer, T.A. Bistable regulation of integrin adhesiveness by a bipolar metal ion cluster. Nat. Struct. Biol. 10, 995 a 1001 (2003)). Se recubrió una placa de Petri de poliestireno con un diámetro de 5 mm 20 ml con una mancha de 20 ml de 20 g/ml de h-ICAM-1/Fc purificado (R & D) o 20 mg/ml de fibrinógeno en tampón de recubrimiento (PBS, 10 mM NaHCO³, pH 9,0) durante 1 hora a 37 °C, seguido de BSA al 2% en tampón de recubrimiento durante 1 hora a 37 °C para bloquear sitios de unión no específicos. Se lavaron células 293T transfectadas transitorias dos veces con tampón de lavado (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM/BSA al 0,5%), posteriormente una vez con HBS que contenía Ca²⁺1 mM y Mg²⁺1 mM (HBS⁺⁺), y finalmente se resuspendieron a la concentración de 5x10⁶/ml en HBS⁺⁺(HBS libre de Ca²⁺y Mg²⁺, BSA al 0,5%) y se mantuvo en hielo. Las células se incubaron en DMSO al 2% con o sin 25 mM LA1 a 37 °C durante 30 minutos. Y, posteriormente, se infusionaron en la cámara de flujo utilizando una bomba de jeringa programable con aparato de Harvard. Las células se dejaron sedimentar durante 5 minutos, y se acumularon durante 30 segundos a 0,3 dyn/cm²y 10 segundos a 0,4 dyn/cm². A continuación, se incrementó la tensión de cizalladura cada 10 segundos desde 1 dyn/cm²hasta 32 dyn/cm²en incrementos de 2 veces. Se determinó el número de células restantes que abundaban al final de cada intervalo de 10 s. La velocidad de rodamiento en cada esfuerzo de cizalladura se calculó a partir de la distancia media recorrida por las células rodantes en 3 segundos. Se definieron células adherentes rodantes con una velocidad de más de 1 mm/s. Se muestra el comportamiento adhesivo de transfectantes CD11b/CD18 tratados con vehículo, Mn2+ o LA bajo una tensión de cizalladura de pared.

Resultados

[0085] Los agonistas de integrina tienen varias ventajas sobre los antagonistas. La investigación con antagonistas durante los últimos años ha demostrado que son subóptimos. En primer lugar, se ha demostrado que la supresión de reclutamiento de leucocitos con antagonistas requiere una ocupación de > 90% de los receptores de la integrina activos [32], lo que normalmente requiere altos niveles de anticuerpos de bloqueo in vivo. En segundo lugar, el bloqueo completo de CD11b/CD18 expresado en la superficie celular, incluso con anticuerpos, es difícil debido a la disponibilidad de un gran conjunto intracelular movilizable de CD11b/CD18 [30, 31]. En tercer lugar, varios otros antagonistas, tales como el factor inhibidor de neutrófilos mimético de ligando (NIF) [67] y dominio aA recombinante [68], fueron eficaces en modelos animales pero su gran tamaño e inmunogenicidad excluye su uso como agente terapéutico. El NIF recombinante (UK-279276) falló en ensayos clínicos. Del mismo modo, los péptidos derivados de anticuerpos anti-CD11b/CD18 o ligandos CD11b/CD18 no son muy eficaces en el bloqueo de la unión del ligando in vitro [69], tal vez debido a su conformación inadecuada en solución o a su tamaño pequeño en relación con la región de unión a ligando de CD11b/CD18. Por último, muchos anticuerpos antagonistas (tales como rhuMAb CD18, anti-CD18 LeukArrest (Hu23F2G) y mAb anti-ICAM-1 Enlimomab (R6.5)) fracasado en el tratamiento de enfermedades inflamatorias/autoinmunes en varios ensayos clínicos [28, 29] y se ha observado que los bloqueantes de integrina p2 muestran efectos secundarios inesperados y han tenido que ser retirados del mercado [33].

[0086] Los agonistas químicos y biológicos de integrina CD11b/CD18 mejoran la adhesión celular. Se propuso que la activación de integrina podría ser un nuevo mecanismo para el desarrollo de agentes terapéuticos anti inflamatorios de próxima generación que reducen la migración y el reclutamiento de células inflamatorias mediante el aumento, en lugar de reducción, de la adhesión celular [49, 55]. A tal fin, el Solicitante describió recientemente nuevos agonistas de molécula pequeña de CD11b/CD18, que el Solicitante denominó leucadherinas [55], que el Solicitante identificó utilizando un ensayo de cribado de alto rendimiento basado en células [49, 50]. La leucadherina-1 (LA1) mostró una alta afinidad por CD11b/CD18 y aumentó la adhesión celular mediante la unión a un bolsillo alostérico del domonio aA de unión al ligando (también conocido como dominio al) de CD11b y estabilizándolo en una forma activa [55 - véase la Figura 1B]. El solicitante también identificó análogos adicionales de LA1 que mostraron actividad similar (incluyendo LA2 y LA15, Figura 10). Del mismo modo, se ha desarrollado en los últimos años un conjunto de agonistas biológicos de CD11b/CD18 (y otras integrinas b2), en forma de anticuerpos de activación, por otros, incluyendo anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD18 KIM127 [83] y mAb anti-CD1824 [59].

[0087] Para determinar cómo los dos tipos de agonistas - químicos (LA1) y biológicos (mAbs KIM127 y 24) -afectan a la unión del ligando por CD11b/CD18, se llevó a cabo una comparación de cabeza a cabeza de LA1, mAb KIM127 y mAb 24 por sus capacidades relativas para aumentar la adhesión de CD11b/CD18 a ligando fisiológico inmovilizada de fibrinógeno utilizando células K562 que expresan establemente CD11b/CD18 de tipo salvaje (K562 WT). Las células K562 WT expresan constitutivamente CD11b/CD18 de tipo salvaje en un estado de baja afinidad (como en los leucocitos normales) [66, 79], por lo tanto, proporcionando un excelente sistema para examinar el nivel de activación de la integrina proporcionada por diversos agentes [55, 66]. K562 WT mostró una adhesión mínima al fibrinógeno inmovilizado en presencia de cationes divalentes fisiológicos (Ca2+ más Mg2+, cada uno a 1 mM). El activador de integrina no selectivo conocido Mn2+ [84, 85] aumentó significativamente la adhesión celular, aumentándola a un nivel máximo, que se bloqueó de manera significativa a los niveles basales por un anticuerpo anti-CD11b 44a de bloqueo que se une al dominio aA [73]. Del mismo modo, los agonistas LA1 y mAbs KIM127 y 24 activantes aumentaron significativamente la adhesión de células K562 WT al fibrinógeno inmovilizado, en comparación con la condición basal de Ca2+ más Mg2+. Sin embargo, se encontró que el agonista mAb 24 produjo un incremento menor en el nivel de adhesión celular en comparación con los otros dos agonistas - LA1 y KIM127. En todos los casos, la adhesión de K562 WT al fibrinógeno inmovilizado también se redujo significativamente por el m Ab anti-CD11b de bloqueo 44a, lo que confirma adicionalmente que el aumento de la adhesión celular por todos estos agonistas estaba mediada por CD11b/CD18. Tal como el solicitante ha demostrado antes, este efecto agonista de leucadherinas no se limita a un único compuesto, ya que leucadherinas adicionales LA2 y LA15 aumentó de forma similar la adhesión celular mediada por CD11b/CD18 (FIGURA 11). La Figura 11 es un histograma que muestra el porcentaje de adhesión de las células K562 al fibrinógeno inmovilizado en presencia de iones fisiológicos Ca2+ 1 mM y Mg2+ 1 mM (Control), el agonista de integrina no selectivo Mn2+ (1 mM), o los agonistas LA2 (15 pM) y LA15 (15 pM) en ausencia o presencia de anticuerpo anti-CD11b de bloqueo 44a (dilución 1:100 de fluido ascítico). Los datos mostrados son la media ± el error estándar de la media (SEM) (n = 3 a 6 repeticiones por condición) y son de uno de al menos tres experimentos independientes. *** p <0,0001.

[0088] A continuación, para examinar si los agonistas químicos y biológicos de CD11b/CD18 tienen un efecto similar sobre la unión a ligando por CD11b/CD18 de diferentes especies, se utilizaron la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 y los macrófagos primarios de rata que tienen una expresión en superficie constitutiva de CD11b/CD18. El compuesto de molécula pequeña LA1 se une a un bolsillo alostérico en el dominio aA de CD11b (referido como Socket para isoleucina (SILEN) [86] en CD11b o IDAS en CD11a [87]) que está altamente conservado a través de varias especies [88], lo que sugiere que LA1 debería ser capaz de activar CD11b/CD18 de varias especies. Sin embargo, los agonistas biológicos (por ejemplo; mAbs de activación) son altamente selectivos de especies. Por lo tanto, se utilizó un anticuerpo anti-ratón de activación bien caracterizado (M18/2) [67] con células RAW 264.7 murinas y se utilizó el anticuerpo anti-CD11b anti-rata de activación ED7 [70, 76] con los macrófagos primarios de rata. El mAb anti-CD18 de ratón M18/2 es un anticuerpo no bloqueante que se ha descrito que simula la adhesión de células dependiente de CD11b/CD18 y de formación de rosetas [67-69]. Los anticuerpos anti-CD11b de rata ED7 (y otro mAb ED8) han demostrado que mejoran la adhesión de granulocitos dependiente de CD11b/CD18 y la agregación homotípica en determinadas condiciones, lo que sugiere que activan CD11b/CD18 [70].

[0089] Las células RAW 264.7 mostraron un nivel mínimo de adhesión al fibrinógeno inmovilizado en presencia de Ca2+ y Mg2+ 1 mM fisiológicos, lo que aumentó significativamente (hasta niveles máximos) con el agonista de Mn2+. Al igual que con las células K562 WT, los agonistas LA1 y el mAb de activación (M18/2) aumentó significativamente y de manera similar el nivel de adhesión celular, en comparación con la condición basal. Además, en ambos casos, la adición de mAb anti-CD11b de bloqueo M1/70 [78] eliminó el aumento de la adhesión celular debido a los dos agonistas, confirmando de nuevo que CD11b/CD18 mediaba en la adhesión celular aumentada en ambos tipos de agonistas. Del mismo modo, los macrófagos primarios de rata casi no mostraron adhesión a fibrinógeno inmovilizado en presencia de, iones fisiológicos Ca2+ y Mg2+ no activantes, pero se unieron de forma más significativa después de la activación con Mn2+. Una vez más, ambos tipos de agonistas - la LA1 química y el mAb de activación ^eD7 - mejoraron también significativamente el nivel de adhesión de macrófagos, en comparación con la condición de no activación, y, en ambos casos, la adición de mAb anti-CD11b de bloqueo OX42 [77] redujo en gran medida los efectos de los dos agonistas, lo que confirma que el aumento de la adhesión celular de macrófagos de rata por ambos agonistas estaba mediada por CD11b/CD18. Sorprendentemente, ED8, que se ha se ha descrito como un agonista similar a ED7 y que tiene un epítopo superposición con ED7 [70, 76], no produjo ninguna mejora significativa en la adhesión de los macrófagos primarios de rata a fibrinógeno inmovilizado (datos no mostrados), mostrando que ED7 es un agonista más fuerte que ED8. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que los agonistas selectivos de la integrina CD11b/CD18, ya sean químicos o biológicos, mejoran la adhesión de células dependiente de CD11 b/CD18. Además, se muestra que mientras los biológicos tienen una fuerte dependencia de la especie, las leucadherinas son igualmente eficaces en CD11 b/CD18humanos, murinos y de rata.

Activación de CD11 b/CD18 reduce la migración celular de macrófagos y la curación de heridas.

[0090] Los ensayos de curación de heridas se utilizan rutinariamente como un procedimiento clásico para el estudio de la migración de células y para evaluar los efectos de diversas perturbaciones de los procesos biológicos subyacentes en dicha función celular clave, [89, 90]. Los macrófagos juegan un papel importante en la curación de heridas [91] y monocapas confluentes de macrófagos, cuando se dañan o rayan artificialmente con una punta de pipeta, responden a la alteración de los contactos célula-célula mediante la curación de la herida a través de una combinación de proliferación y la migración [89]. Los macrófagos y otros leucocitos utilizan la adhesión celular dependiente deCD11b/CD18 (así como otras integrinas b2) para migrar sobre superficies bidimensionales [92]. El solicitante ha demostrado previamente que el agonista de CD11b/CD18 LA1, mediante la congelación de la integrina en un estado unido a ligando, altera la quimiotaxis de neutrófilos [55]. Sin embargo, cómo LA1 se compara con un agonista biológicao de la integrina CD11b/CD18 en una comparación cabeza a cabeza no se conoce. Aquí, se utilizó un ensayo de curación de heridas basado en células de macrófagos murinos para comparar la eficacia relativa de LA1 con un agonista biológico de CD11b/CD18 (el mAb anti-CD18 de activación M18/2) usando las células RAW 264.7 [93]. Las células RAW 264.7 se cultivaron en placa hasta la confluencia y las células fueron “heridas” mediante raspado de una ubicación marcada en la placa con una punta de pipeta.

[0091] Tal como se muestra en las Figuras 4A y 4B, la estimulación con lipopolisacárido (LPS) o con el forbol éster de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) indujo significativamente la migración de macrófagos de nuevo al área de la herida, en comparación con las células no estimuladas (DMSO). El gráfico de la Figura 4A muestra el porcentaje del área de la herida que se cura a través de la migración de macrófagos RAW 264.7 en la herida bajo diversas condiciones 48 horas después de la lesión inducida por la punta de la pipeta. ** p <0,001, *** p <0,0001, ns = no significativo. Para la Figura 4B, las células RAW 264.7 se cultivaron en placa en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (2 x 106 células/pocillo) y se dejaron adherir en medio completo durante 12 horas. Las monocapas de células se trataron con vehículo (DMSO, agonista LA1 (15 mM), anticuerpo de activación M18/2 (20 mg/ml) y con LPS (100 ng/ml) o PMA (100 nM) que aceleran la migración celular y la curación de la herida, durante 1 hora antes de la herida con una punta de pipeta. Además, las monocapas de células en pocillos adicionales fueron tratadas con LPS (100 ng/ml) o PMA (100 nM) en presencia de LA1 (15 mM) o M18/2 (20 mg/ml) para investigar si el aumento de la adhesión de células dependiente de CD11b/CD18 impactará en el proceso de curación de heridas en estas condiciones. Posteriormente, se incubaron los cultivos de células en monocapa heridas durante 48 horas. Las imágenes de las células en cultivo se obtuvieron inmediatamente antes (0 horas) y después de la finalización del experimento (48 horas) utilizando un microscopio de contraste de fase invertida unido a una cámara de vídeo.

[0092] Como era de esperar, el tratamiento con los agonistas LA1 y M18/2 solos mostró un aumento no significativo en la migración de macrófagos en el área de la herida, en comparación con células no estimuladas (DMSO). Sin embargo, ambos agonistas de CD11b/CD18 redujeron de manera significativa, y en un grado similar, la migración de los macrófagos estimulados con LPS o PMA. Adicionalmente, los compuestos LA2 y LA15 redujeron de manera similar la migración de macrófagos estimulados con LPS (figura 12), lo que muestra que la familia de compuestos de leucadherinas tiene un efecto similar sobre la migración de macrófagos. La Figura 12 es un histograma que muestra el porcentaje de área de la herida que se cura a través de la migración de macrófagos RAW 264.7 en la herida bajo diversas condiciones 48 horas después de la lesión inducida por la punta de la pipeta. Se cultivaron células RAW 264.7 en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (2 x 106 células/pocillo) y se dejaron adherir en medio completo durante 12 horas. Las monocapas de células se trataron con vehículo (DMSO), agonista LA2 (15 mM) o agonista LA15 (15 mM) y con LPS (100 ng/ml) durante 1 hora antes de la herida con una punta de pipeta. Además, las monocapas de células en pocillos adicionales fueron tratadas con LPS (100 ng/ml) en presencia de LA2 (15 mM) o LA15 (15 mM) para investigar si el incremento de la adhesión celular dependiente de CD11b/CD18 impactará en el proceso de curación de heridas bajo estas condiciones. Posteriormente, se incubaron cultivos de células en monocapa heridas durante 48 horas. Las imágenes de las células en cultivo se obtuvieron inmediatamente antes (0 horas) y después de la finalización del experimento (48 horas) utilizando un microscopio de contraste de fase invertida unido a una cámara de vídeo y se cuantificó con ImageJ. Los datos representativos que se muestran aquí son de un experimento en pocillos por triplicado de uno de al menos dos o tres experimentos independientes. ** p <0,001, *** p <0,0001. Estos resultados muestran que la activación de la integrina CD11b/CD18 a través de cualquier tipo de agonista igualmente deteriora la capacidad migratoria de los macrófagos.

Anticuerpos de activación, pero no LA1, inducen la agrupación de integrinas y la señalización intracelular.

[0093] A continuación, se evaluó si había diferencias significativas en la señalización mediada por la unión a integrina que es inducida por los dos tipos de agonistas. Mientras que los anticuerpos de activación y leucadherinas aumentan la adhesión celular dependiente de CD11b/CD18 y reducen la migración de células, es posible que la activación de integrinas pueda inducir una señalización intracelular indeseable, tal como las que se han descrito para los antagonistas de integrina, lo que puede limitar su eficacia y utilidad en la clínica [94-100]. Por ejemplo, los antagonistas allbb3 y avb3 inducen la señalización fuera-dentro [94, 96]. Del mismo modo, la unión de CD11b/CD18 con ligandos o anticuerpos de bloqueo induce el agrupamiento de CD11b/CD18 [28] y la señalización fuera-dentro a través de la activación y la fosforilación de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPKs), incluyendo la quinasa c-Jun NH2-terminal (JNK), la MAPK p38 y la quinasa regulada por señal extracelular (^eR^k) [28, 33, 71, 101], regulando por incremento de este modo la señalización NF-kB proinflamatoria [29, 32, 102]. Además, puede inducirse la CD11b/CD18 inactiva y activa para formar macrogrupos, pero los dos tipos de macrogrupos transducen diferentes señales intracelulares [28], lo que sugiere que se necesita un análisis de la agrupación y de la señalización intracelular para estudiar completamente los efectos de los dos tipos de agonistas de CD11b/CD18.

[0094] Por lo tanto, para investigar, se utilizó una combinación de microscopía confocal (para estudiar la agrupación) y los ensayos de transferencia Western (para estudiar la señalización intracelular) utilizando células K562 WT. En primer lugar, se estudió la distribución en la superficie celular de CD11b/CD1 y la macroagrupación en diversas condiciones utilizando microscopía confocal. Se incubaron células K562 WT en suspensión con diversos agonistas, se fijaron con paraformaldehído y la CD11b/CD18 expresada en superficie se tiñó con fluorescencia con mAb anti-CD11b/CD18 IB4. Los resultados se presentan en las Figuras 5A y 5B. Para la figura 5A, las suspensiones de células se incubaron durante 45 minutos a 37 °C con DMSO (vehículo), agonista no selectivo Mn2+ (1 mM), agonista LA1 (15 uM), mAb de activación KIM127 (dilución 1:100 de fluido ascítico) o el mAb de activación 24 (20 mg/ml) en ausencia (panel superior, -Fg) o la presencia de ligando fibrinógeno (50 mg/ml) (panel inferior, Fg) y las células se fijaron con paraformaldehído (4%) antes del marcaje de la CD11b expresada en la superficie con mAb anti-CD11b/CD18 IB4 y se fotografiaron. Las imágenes de fluorescencia mostradas son representativas de tres experimentos independientes. La barra de escala blanca representa 25 mm. También se muestra debajo de cada imagen una representación en 3D de la intensidad de fluorescencia de CD11b para las células seleccionadas, analizadas en ImageJ en la Figura 5B, los datos mostrados son la media ± SEM de > 40 células por condición y de > 3 experimentos independientes para cada condición. *** p <0,0001, ns = no significativo.

[0095] Las células K562 WT mostraron una distribución uniforme de CD11b/CD18 en la superficie celular, con una macroagrupación mínima, en ausencia de cualquier estímulo, ligando, agonista o anticuerpo (Figura 5A, panel superior, DMSO). Tal como se ha descrito antes, la incubación de las células con ligando fibrinógeno (Fg) dio lugar a una macroagrupación significativa de CD11b/CD18 (Figura 5A, panel inferior, DMSO) cuando se cuantificó usando ImageJ [80] (Figura 5B). El agonista de Mn2+, que se ha demostrado que también induce la agrupación de CD11b/CD18 [28], reprodujo el fenotipo de agrupamiento aquí (figuras 5A y 5B). La incubación de las células con los anticuerpos de activación KIM127 y mAb 24 también dio lugar a una macroagrupación significativa de CD11b/CD18 en la superficie de las células y este nivel aumentado de macroagrupación de integrinas no cambió significativamente tras la adición del ligando fibrinógeno fisiológico, lo que sugiere que los anticuerpos de activación anti-CD11b/CD18 inducen la activación y agrupación de CD11b/CD18, incluso en ausencia de un ligando. Estudios previos han demostrado también que otros anticuerpos de activación anti-CD11b, incluyendo VIM12 (que se une cerca de la región C-terminal extracelular de CD11b [56]) y la inmunoglobulina de longitud completa (IgG), así como el fragmento Fab de LFA-1/2 (que se une el dominio EGF3 de CD18 [57, 58]), inducen la agrupación de CD11b/CD18 [28, 71]. Sin embargo, la incubación de las células con el agonista LA1 sola no indujo ningún macroagrupamiento significativo de CD11b/CD18 (Figura 5A, panel superior, LA1) en ausencia de ligando fibrinógeno, pero lo hizo en presencia de fibrinógeno [55]. Las leucadherinas LA2 y LA15 mostraron resultados similares (figuras 13A y 13B). En la Figura 13A, las suspensiones de células se incubaron durante 45 minutos a 37 °C con DMSO (vehículo), agonista no selectivo Mn2+ (1 mM), agonista LA2 (15 uM) o agonista LA15 (15 uM) en ausencia (panel superior, -Fg) o presencia de ligando fibrinógeno (50 mg/ml) (panel inferior, Fg) y las células se fijaron con paraformaldehído (4%) antes del marcaje de CD11b expresada en superficie con mAb anti-CD11b/CD18 iB4 y se fotografiaron. Las imágenes de fluorescencia mostradas son representativas de tres experimentos independientes. La barra de escala blanca representa 25 mm. También se muestra debajo de cada imagen una representación en 3D de la intensidad de fluorescencia de CD11b para las células seleccionadas, analizadas en ImageJ. Para la Figura 13B, los datos mostrados son la media ± SEM de > 40 células por condición y de > 3 experimentos independientes para cada condición. *** p <0,0001, ns = no significativo. Estos datos en las Figuras 5A-5B y 13A-13B muestran que los dos tipos de agonistas de integrina tienen efectos muy diferentes en las integrinas sobre la distribución y agrupación de CD11 b/CD18 en la superficie de células vivas.

[0096] En segundo lugar, un efecto de la unión de integrina, la macroagrupación y la redistribución en la membrana plasmática es la activación de señalización intracelular fuera-dentro en las células a través de diversas MAPKs [103]. La activación de tales señales de MAPK también estimula rápidamente la transcripción y secreción de una variedad de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias en los leucocitos [29]. Para la prueba, se investigaron dos de tales vías de MAPK - la vía de ERK y la vía de c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) - mediante la medición de los niveles relativos de ERK fosforilada (pERK) y JNK fosforilada (pJNK) utilizando transferencia Western. Las células K562 WT incubadas con vehículo (DMSO) solo mostraron una activación mínima de ERK y JNK (figuras 6A-6D) en comparación con células que fueron incubadas con el fibrinógeno ligando o se activaron con el agonista de proteína quinasa C (PKC) forbol éster PMA (control positivo, [104]). En las figuras 6A-6B, los resultados de inmunotransferencia de dos experimentos independientes se cuantificaron usando el software ImageJ y se determinó la proporción de proteína fosforilada con respecto a la proteína total. También se muestran los histogramas que muestran esta cuantificación para cada conjunto. Los datos mostrados son la media ± SEM. * P <0,05, *** p <0,0001, ns = no significativo. En las Figuras 6C-6D, los resultados de inmunotransferencia de dos experimentos independientes se cuantificaron y también se muestran, como en las figuras 6A y 6B.

[0097] La incubación de células con agonista de Mn2+ o los anticuerpos de activación KIM127 o mAb 24 mostraron una activación significativa de ERK y JNK. Estudios publicados anteriormente también han demostrado que la incubación de células que expresan CD11b/CD18 con el agonista de Mn2+ [101], mAb de bloqueo, ligando ICAM-1 u otros mAb de activación anti-integrina [71], induce de manera similar la fosforilación de ERK y la señalización de MAPK. La incubación de las células con el agonista LA1 sola no indujo ninguna pERK o pJNK significativa en ausencia de ligando fibrinógeno. Adicionalmente, las leucadherinas LA2 y LA15 mostraron resultados similares (no mostrados). La unión de CD11b/CD18 con fibrinógeno mostró altos niveles de pERK y pJNK en todas las condiciones, lo que sugiere que dicha señalización de MAPK puede mimetizar un estado unido a ligando de la célula. Por lo tanto, se concluye que la unión de CD11b/CD18 a anticuerpos de activación mimetiza su estado unio a ligando e induce la señalización de MAPK intracelular, mientras que la unión de CD11b/CD18 a leucadherinas no. Vale la pena señalar que los leucocitos de animales knock-in que expresan integrinas constitutivamente activas CD11a/CD18 (LFA-1) o ^4 ^7 no muestran señalización de MAPK en ausencia de ligando [105-107], similar a los resultados obtenidos con las leucadherinas.

[0098] En conjunto, estos resultados muestran que mientras que los dos tipos de agonistas de integrina pueden tener algunos efectos funcionales comunes en células que expresan CD11b/CD18 (que mejoran la unión a ligando y la adhesión celular), también pueden tener diferencias significativas que muestran que uno puede ser más beneficioso para el uso in vivo sobre el otro.

[0099] LA1 no induce cambios conformacionales globales en CD11b/CD18. La unión a ligando induce la extensión del heterodímero de integrina y cambios conformacionales grandes, globales que conducen a la señalización fueradentro [28, 69, 71]. La unión de anticuerpos de activación también induce cambios conformacionales globales en el heterodímero de integrina y dichos cambios conformacionales grandes mimetizan los inducidos tras la unión del ligando [71, 72]. Por ejemplo, el anticuerpo de activación KIM127 reconoce una región en el dominio EGF2 de CD18 que está enterrada en la conformación, doblada inactiva de los heterodímeros de integrina CD11/CD18 y estabiliza una conformación extendida tras la unión [57, 61, 66], que también conduce a la separación de las colas citoplasmáticas del heterodímero [71, 108]. Por lo tanto, mAb KIM127 a menudo se utiliza como un reportero para la conformación extendida de integrinas beta2 [70, 79, 83]. Del mismo modo, mAb 24 se une a un epítopo dependiente de la activación en el dominio aA que imita la conformación unida al ligando de los diversos heterodímeros CD11/CD18 [59]. Para determinar la base mecanicista para la falta de señalización fuera-dentro por LA1 en las células tratadas, se investigó la extensión de los cambios conformacionales causados por la unión de LA1 a CD11b/CD18 expresada en la superficie celular en células K562, utilizando mAbs KIM127 y 24 como reporteros de cambios conformacionales grandes/globales. La incubación de células K562 WT en tampón fisiológico solo mostró un nivel basal de unión a KIM127 y mAb 24, medida por citometría de flujo (figuras 7A y 7B). La unión por isotipo de anticuerpo de control IgG1 (15 ug/ml) se muestra en los paneles superiores. Se incubaron células con mAb KIM127 o 24 en ausencia de agonistas (Control), en presencia de LA1 (15 uM) o iones Mn2+ (1 mM). Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes.

[0100] Como era de esperar, la adición de agonista de integrina de iones Mn2+ fue suficiente para inducir un aumento máximo en la cantidad de KIM127 y mAb 24 unidos, mimetizando los cambios globales inducidos por la unión a ligando en el heterodímero CD11b/CD18 tal como se ha descrito en la literatura [59, 70, 79, 83]. Sin embargo, la incubación de estas células con agonista de molécula pequeña LA1 produjo un aumento muy pequeño en la unión a KIM127 (Figura 7B), indicando que la actividad de □A mediada por lA1 no expone el epítopo de KIM127 en el EGF2 de CD18 y mostrando que la unión de LA1 conduce a cambios conformacionales limitados a dominio, pero no cambios conformacionales globales grandes en el heterodímero CD11b/CD18 en la superficie de las células vivas. Los cambios conformacionales globales en integrinas desencadenan la separación de piernas citoplasmáticas y generan la señalización fuera-dentro [71, 108]. Del mismo modo, la unión a LA1 mostró un pequeño aumento en la unión de la segunda sonda reportera conformacional, el mAb 24, sobre el nivel basal de la unión por el mAb 24 a CD11b/CD18 expresada en la superficie celular. En ambos casos, el nivel de unión de la sonda reportera a CD11b/CD18 en presencia de LA1 fue sustancialmente menor en comparación con su unión en presencia de agonistas miméticos de ligando de iones Mn2+.

[0101] Aunque LA1 reduce significativamente la lesión vascular mecánica en ratas, el anticuerpo de activación anti-CD11b ED7 es ineficaz. La intervención coronaria percutánea (PCI) es uno de los procedimientos más eficaces de desbloqueo de arterias ocluidas y facilita la revascularización coronaria en seres humanos [109]. A pesar de los avances tecnológicos significativos en PCI, la reestenosis (re-estrechamiento) secundaria a la hiperplasia neointimal sigue siendo una complicación importante que limita el éxito de las intervenciones coronarias en el 5-25% de los pacientes [110-112]. El reclutamiento de macrófagos inflamatorios y otros leucocitos precede la hiperplasia neointimal [5]. La denudación del revestimiento de células endoteliales en el sitio de la lesión vascular mecánica durante un procedimiento PCI conduce a la deposición de fibrina y plaquetas, donde la unión selectiva entre el receptor de la superficie celular de plaquetas GP lb^ y CD11b/CD18 leucocítica conduce a la migración y el reclutamiento de estas células inflamatorias [113]. De hecho, en modelos experimentales, se ha demostrado que la ablación genética de CD11b (animales CD11b -/-) o su bloqueo (usando antagonistas biológicos) pueden reducir la formación de neoíntima después de angioplastia o implantación de stent [5, 39]. El solicitante también ha demostrado previamente que LA1 reduce significativamente la acumulación de macrófagos en el sitio de la lesión vascular mecánica, dando lugar a una hiperplasia neointimal reducida significativamente [55]. Aquí, se utilizó este modelo de lesión de balón arterial experimental para examinar la eficacia relativa de los dos tipos de agonistas, en una comparación de cabeza a cabeza, en las respuestas inflamatorias in vivo. En primer lugar, se determinó la dependencia con la dosis de LA1 en este sistema modelo. LA1 se administró en dos dosis diferentes (0,05 o 1 mg/kg/d, intraperitoneal (ip)), o el vehículo (DMSO), en una solución salina a ratas macho SD 30 minutos antes de la lesión y continuó con inyecciones diarias durante las siguientes tres semanas y posteriormente se midió la magnitud de la lesión vascular a través de la histología del tejido (figuras 14A-14D). Los datos mostrados son la media ± SEM. * p <0,05, ** p <0,001. Las arterias lesionadas de las ratas tratadas con LA1 desarrollaron hiperplasia neointimal significativamente menor (Figuras 14B y 14C) en comparación con la de los animales que recibieron vehículo solo (Figura 14A). Además, LA1 mostró una reducción dependiente de la dosis en la extensión de la lesión vascular mecánica inducida por catéter de balón, produciendo la mayor dosis una reducción más significativa en ella en comparación con el control tratado con vehículo.

[0102] A continuación, para determinar si cualquiera de los tipos de agonista (LA1 químico y anticuerpo de activación biológico) tiene una ventaja terapéutica sobre el otro, se realizó una comparación de cabeza a cabeza utilizando este modelo in vivo. Como el estudio implica el uso de ratas como sistema de modelo experimental, se eligió el mAb ED7 de activación anti-CD11b de rata para la comparación con LA1. Informes anteriores muestran que la administración de ED7 redujo la enfermedad renal y la enfermedad inflamatoria intestinal en ratas [114, 115]. El mAb ED7 se obtuvo con alta pureza a partir de fluido ascítico de acuerdo con protocolos publicados [116]. La tinción y análisis citométrico de flujo mostraron un alto grado de unión por el mAb anti-CD11b ED7, pero no el mAb de control mlgG1, a los macrófagos primarios de rata purificados y una mejora selectiva en la adhesión celular de macrófagos al fibrinógeno inmovilizado por ED7 vs el mAb de control IgG1. Para examinar los efectos de los dos tipos de agonistas sobre la migración y el influjo de macrófagos inflamatorios en arterias lesionadas en este modelo de lesión vascular, LA1 o ED7 se administraron a las ratas de tipo salvaje 30 minutos antes de la lesión con balón y continuó diariamente durante los siguientes 7 días. La dosificación de ED7 utilizada se basó en los estudios publicados [114, 115, 117]. A continuación, se analizaron las arterias para cuantificar el número de macrófagos infiltrados en presencia de agonistas LA1 o ED7 y se compararon con animales tratados con vehículo. Las arterias se recogieron de los animales 7 días después de la lesión con balón y se analizaron suspensiones de células individuales por citometría de flujo (utilizando anticuerpo anti-CD11b de rata WT.5) para cuantificar macrófagos CD11b+ en cada muestra. Los datos de citometría de flujo, que se muestran en las figuras 8A-8D, refleja la distribución de los macrófagos dentro de la pared arterial y la adventicia circundante. Los datos mostrados son representativos de al menos 4-6 mediciones independientes. Los datos mostrados son la media ± SEM. * p <0,05, ** p <0,001, ns = no significativo. Consistente con los resultados anteriores, las arterias lesionadas de animales tratados con LA1 contenían significativamente menos macrófagos CD11b/CD18 que los que hay en ratas tratadas con vehículo de control. También se encontró que el tratamiento con ED7 también disminuyó de manera similar y significativamente la cantidad de macrófagos infiltrados en la arteria lesionada y de una manera dependiente de la dosis (se analizaron dos dosis de 1 mg/kg/día y 3,3 mg/kg/día), mostrando que la dosis de ED7 utilizada aquí es muy eficaz in vivo. Estos resultados muestran que ambos tipos de agonistas pueden reducir de manera similar el influjo de macrófagos en el tejido.

[0103] A continuación, con el fin de examinar la eficacia relativa de LA1 y ED7, LA1 (1 mg/kg/d) o ED7 (4 mg/kg/d) se administraron a ratas macho SD 30 minutos antes de la lesión con globo y continuó diariamente durante los próximos 21 días. Un anticuerpo control de isotipo (mIgG1, 4 mg/kg/d) se administró al grupo de control de animales. El análisis histoquímico de las arterias de rata lesionadas demostraron un engrosamiento de la neoíntima reducido en animales tratados con ED7 y LA1, en comparación con el grupo de control tratado con mAb IgG1 (figuras 9A-9D). Los datos mostrados son la media ± SEM. * p <0,05, *** p <0,0001, ns = no significativo. Sin embargo, sólo LA1 mostró una reducción significativa en la hiperplasia neointimal (NIH), en comparación con el grupo de control y también mostró significativamente menos formación de neoíntima en comparación con el grupo de ED7, mostrando que LA1 es más eficaz que el mAb de activación de CD11b ED7 in vivo en el modelo de lesión por balón de rata. Juntos, estos resultados muestran que la leucadherina LA1 reduce de forma dependiente de la dosis la lesión vascular (tal como se mide por el engrosamiento neointimal) y muestra una mayor eficacia que el mAb anti-CD11b de activación ED7 in vivo y, por tanto, tiene una ventaja terapéutica clara.

[0104] Las leucadherinas son una familia de compuestos de moléculas pequeñas que son nuevos agonistas de la integrina CD11b/CD18. Las leucadherinas aumentan la adhesión celular dependiente de CD11b/CD18, reducen la migración de leucocitos y la lesión inflamatoria in vivo. La eficacia in vitro e in vivo de leucadherinas sugirió que podrían desarrollarse muchos agentes que activan CD11b/CD18 y mejoran la adhesión celular en agentes terapéuticos farmacológicamente útiles para tratar la inflamación. Sin embargo, en este estudio, se encontró que no todos los agonistas de integrina son iguales y que, en comparación con los productos químicos de molécula pequeña (leucadherinas), los agonistas biológicos de CD11b/CD18, tales como anticuerpos anti-CD11b de activación, tienen efectos adicionales sobre la señalización intracelular por CD11b/CD18 que pueden reducir su potencial como agentes terapéuticos. Tales efectos también se han descrito con una serie de antagonistas de integrina miméticos de ligando-mimético que han mostrado peores resultados clínicos, ttal vez debido a la inducción de señalización fuera-dentro [118, 119]. Se ha encontrado que la activación de CD11b/CD18 a través de ambos tipos de reactivos (las leucadherinas químicas y los mAb de activación biológicos) aumenta la adhesión celular mediada por integrina y disminuye la migración celular y la curación de heridas in vitro. Sin embargo, a diferencia de las leucadherinas, los anticuerpos anti-CD11b/CD18 de activación biológicos indujeron la agrupación inducida de CD11b/CD18 expresada en la superficie celular y la fosforilación de proteínas de señalización intracelular clave, incluyendo las quinasas JNK y ERK MAP, lo que muestra que el acoplamiento de CD11b/CD18 con anticuerpos de activación mimetiza el estado unido a ligando. Las FIGURAS 6A-6D muestran claramente que aunque ambos tipos de agonistas de CD11b/CD18, LA1 químico y los anticuerpos de activación, se unen y alostéricamente activan los receptores de la integrina, los dos tipos de agonistas inducen claramente diferente señalización fuera-dentro en las células en ausencia de un ligando (fibrinógeno). Las FIGURAS 6A-6D muestran también que a una alta concentración de ligando, los dos tipos de agonistas no interfieren con la típica tal señalización fuera-dentro inducida por la unión al ligando, y que dicha señalización es la mismo en ambos casos. Sin embargo, claramente un anticuerpo de activación por sí solo es suficiente para inducir una señalización fuera-dentro significativa, mientras que la unión de LA1 per se no indujo ninguna de dichas señalizaciones. Es importante señalar aquí que el fibrinógeno resulta apreciable para la adhesión y la activación de leucocitos sólo después de la deposición superficial [120-122]. La deposición de fibrinógeno en la superficie endotelial expone los crípticos 390-396 residuos en fibrinógeno que son reconocidos por la integrina CD11b/CD18 en los leucocitos para el acoplamiento de alta afinidad, lo que conduce al reclutamiento de leucocitos de la circulación en las arterias lesionadas. Además, se usaron sondas de anticuerpos de conformación específica para ilustrar un potencial razonamiento detrás de estas diferencias observadas en la señalización entre los dos tipos de agonistas. La unión a leucadherinas no indujo grandes cambios conformacionales globales en la integrina CD11b/CD18, mientras que se ha demostrado que los anticuerpos activantes inducen tales cambios que mimetizan una integrina unida a ligando [71, 72]. Por lo tanto, mientras que la unión de anticuerpos de activación induce señalización fuera-dentro mimética de ligando en las células, la unión de leucadherinas parece inducir cambios más modestos, locales de la integrina, lo que probablemente no es suficiente para inducir la señalización fuera-dentro en las células (figuras 9A-9D). También se ha descrito previamente en la literatura que los mutantes de integrina constitutivamente activos, donde el dominio aA de unión al ligando de CD11b está bloqueado en su conformación activa, no inducen la señalización intracelular [72]. Del mismo modo, ratones knock-in que expresan mutantes de integrina constitutivamente activos (□ 4 □ 7 [106], CD11a/CD18 [107]) no muestran ningún aumento en la señalización fuera-dentro en los leucocitos que expresan integrinas constitutivamente activas. Esto demuestra que la activación del dominio aA, por sí mismo, no es probablemente suficiente para inducir cambios conformacionales miméticos de unión a ligando y la señalización fuera-dentro, mientras que la unión de agonistas de anticuerpo grandes, ciertamente induce cambios conformacionales globales en integrinas, produciendo de este modo una señalización fuera-dentro mimética de unión a ligando. Por lo tanto, muestra, además, que el uso de anticuerpos de activación biológicos puede tener consecuencias imprevistas adicionales, mientras que las leucadherinas químicoas parecen tener efectos negativos limitados en función de los leucocitos. Además, cuando se comparan en un estudio de cabeza a cabeza en un modelo de lesión vascular in vivo, mientras que ambos tipos de agentes redujeron de manera similar el influjo de macrófagos inflamatorios en las arterias lesionadas, la leucadherina LA1 redujo de manera dependiente de la dosis la lesión vascular y mostró una eficacia significativamente mayor que el anticuerpo anti-CD11b de activación ED7, mostrando que esta agonista de molécula pequeña de CD11b/CD18 tiene una ventaja terapéutica clara sobre el anticuerpo de activación biológico. Sin embargo, también serán necesarios estudios mecanísticos más detallados en el futuro para proporcionar más conocimientos sobre las diferencias entre las funciones in vivo de los dos tipos de agonistas. Tomados en conjunto, los datos presentados en este documento muestran que las leucadherinas, que son nuevos agonistas de molécula pequeña de CD11b/CD18 recientemente descubiertas, son agentes antiinflamatorios eficaces in vivo, y se pueden desarrollar en nuevos productos terapéuticos, mientras que los agonistas biológicos de CD11b/CD18, en la forma de anticuerpos anti-CD11b/CD18 de activación, son subóptimos y pueden requerir una cantidad significativa de optimización antes de que estén listos para el uso in vivo.

[0105] Durante los últimos más de 15 años, ha habido por lo menos tres informes publicados sobre el uso del anticuerpo anti-CD11b de activación ED7 en la reducción de lesiones inflamatorias in vivo [114, 115, 117]. Por lo tanto, fue bastante sorprendente encontrar que no era más eficaz en la reducción de la lesión vascular inducida por el catéter de balón en ratas aquí. Podría haber varias razones para esta falta de eficacia de ED7. En primer lugar, es concebible que la dosis de eD7 utilizada aquí (4 mg/kg/d) fuera inadecuada. No se cree que este sea un problema aquí porque se ha demostrado previamente (en múltiples estudios) que dosis similares de ED7 reducían efectivamente - a) la movilización de leucocitos en la cavidad peritoneal después de inyección con tioglicolato [123], b) daños intestinales en un modelo de colitis aguda [115], y c) un daño estructural y funcional en ratas con nefrosis inducida por adriamicina [114]. La literatura anterior también muestra que una dosis incluso más baja de ED7 (1-3 mg/kg) es eficaz incluso cuando se administra cada dos días o incluso semanalmente [114, 115, 117] y que tales cantidades de anticuerpos anti-CD11b son suficientes para revestir completamente los leucocitos circulantes en la sangre en 1 hora después de la inyección y mantenerlos durante al menos 48 horas [115, 124]. También se ha descrito previamente que los anticuerpos de activación a dicho nivel elevado de unión a receptor de integrina en las células tienen un efecto sobre la unión del ligando - que aumenta la unión del ligando a estas dosis [71]. Por lo tanto, se optó por utilizar esta dosis de ED7 descritas como "eficaces" en los animales con las arterias lesionadas para prevenir la inflamación y el desarrollo de enfermedades. En segundo lugar, ED7 es un anticuerpo anti-rata de ratón y se podría argumentar que la depuración inmunitaria por el sistema roedor limitaba su eficacia. Sin embargo, como se ha demostrado previamente que ED7 tiene al menos alguna eficacia in vivo en ratas de tipo salvaje y se demostró que la administración intraperitoneal de ED7 reducía la nefropatía inducida por adriamicina en los animales [114, 115, 117], se cree que esto tampoco es un problema. En tercer lugar, ya que sólo ED7 se ensayó como un agente de prueba de modelo que representa anticuerpos de activación, se podría razonar que otros anticuerpos de activación pueden ser agentes biológicos más eficaces in vivo. Si bien no es necesariamente así (ver el siguiente punto), se cree que los estudios futuros con anticuerpos de activación anti-CD11b serían un paso lógico para investigar esta posibilidad. Una limitación aquí es que no hay muy muchos anticuerpos anti-CD11b/CD18 de activación disponibles para su uso en los roedores, y que no tienen reactividad cruzada entre especies, limitando así su validación en múltiples especies. En cuarto lugar, se utilizó la molécula de IgG completa de ED7 en los estudios presentados aquí. Dado que la IgG ED7, además de activar CD11b/CD18, dimerizaría CD11b/CD18 tras la unión de la integrina en la superficie celular de leucocitos, también es plausible que una razón para las diferencias observadas entre los dos tipos de agonistas sea debido a la dimerización inducida por IgG, lo que sugiere que un puede ser mejor un fragmento Fab no dimerizante de los anticuerpos de activación. Sin embargo, Lefort, et al. recientemente demostraron que los fragmentos Fab no dimerizantes de mAb de activación anti-CD1b son suficientes para inducir la señalización fuera-dentro en las células, mientras que el Fab del mAb anti-CD11b 44 de bloqueo, no activante, [71] no. También mostraron que la activación de CD11b/CD18 usando mAb de activación, pero no agrupamiento, era suficiente para inducir la señalización fuera-dentro en las células. Informes recientes han sugerido que los anticuerpos de activación pueden inducir cambios conformacionales globales en el heterodímero de la integrina y que tales cambios mimetizan la señalización dentro-fuera inducida por la unión a ligando [71, 72]. También se ha descrito anteriormente de que los mutantes de integrina constitutivamente activos, donde el dominio □ A de unión a ligando de CD11b está bloqueado en su conformación activa, no afectan a la señalización intracelular [72]. Estas observaciones y nuestros datos sugieren que la unión de LA1 al dominio □A de CD11b puede inducir únicamente cambios conformacionales locales, limitados al dominio, en CD11b/CD18, mientras que los anticurpos de activación (ya sea IgG o Fab) y los ligandos inducen una activación conformacional más global de todo el heterodímero de integrina y la señalización fuera-dentro concomitante. Es probable que los agonistas de molécula pequeña, como LA1, ceban la integrina CD11b/CD18 e inducen conformaciones de afinidad intermedia [70]. Esto podría ser relevante en el contexto de la reparación vascular, donde los hallazgos en el presente documento sugerirían que los leucocitos unidos a ED7 podrían ser más "pro-inflamatorios" en la naturaleza y mejoran la enfermedad en comparación con las células unidas a LA1. Futuros estudios estructurales y funcionales definirán aún más el estado de activación real de CD11b/CD18 unida a LA1. Así, mientras que es plausible que fragmentos Fab de otros agonistas biológicos de CD11b/CD18 puedan mostrar eficacia en un grupo selecto de modelos inflamatorios, también es muy posible que los anticuerpos de activación anti-integrina, en general, debido a su expresión de algunos de los efectos secundarios indeseables que se han descrito para los antagonistas de integrina [94-100], puedan tener una eficacia y utilidad limitadas como agente terapéutico. Esto demuestra que las moléculas pequeñas son más adecuadas para el desarrollo de agonistas de integrina como agentes terapéuticos.

[0106] En conclusión, los agonistas basados en moléculas pequeñas de CD11b/CD18 representan un enfoque farmacológico preferido y eficaz para el diseño de nuevos agentes para tratar una variedad de enfermedades inflamatorias y autoinmunes en mamíferos.

EJEMPLO 2

[0107] La señalización mediada por TLR4 requiere de la participación de la proteína adaptadora MyD88 (43) y ratones MyD88-/- se protegen del daño renal siguiendo IRI. La activación de TLR4 conduce a la unión y estabilización de la proteína adaptadora MyD88, que recluta quinasas aguas abajo para iniciar la señalización pro inflamatoria mediada por Nf-kB. Posteriormente, la señalización de TLR4 induce un bucle de realimentación negativa mediante activación endógena de CD11b/CD18, que activa Syk para fosforilar MyD88, marcándolo para su destrucción mediada por ubiquitina. Esto demuestra que los agonistas de CD11b/CD18 conducen a una degradación acelerada de MyD88, induciendo de este modo una amortiguación más rápida de las vías de señalización pro inflamatorias mediadas por TLR4. Se llevó a cabo un experimento piloto para validar esta hipótesis mediante la determinación de los niveles de MyD88 en las células THP-1 monocíticas humanas. Se encontró que el agonista de TLR4 LPS produjo una señal de MyD88 robusta que fue estable durante al menos 4 horas (figura 1). Sin embargo, el co-tratamiento de células con lA1 conduce a una degradación mucho más rápida de MyD88. De hecho, la incubación de las células con LA1 sola (en ausencia de LPS) dio lugar a una degradación completa de MyD88 en menos de 2 horas, demostrando que la activación de CD11b/CD18 puede modular a la baja la señalización intracelular dependiente de MyD88 en leucocitos. Esto apoya las afirmaciones de que cebado mediado por leucadherinas de las integrinas para la activación regula negativamente la señalización intracelular, incluyendo la señalización de NF-kB inflamatoria. Además, el tratamiento con LA1 de las células dio lugar a la inducción de la fosforilación de Syk en leucocitos mediante análisis basado en transferencia de Western de Psyk (no mostrado). Los leucocitos se incubaron con LA1 durante 0-60 minutos y se analizaron los niveles de Syk fosforilado, el total de Syk y GAPDH, mostrando que LA1 induce la fosforilación de Syk.

EJEMPLO 3

[0108] En este experimento, se utilizaron cuatro grupos de animales portadores de tumores (n = 16/grupo) y el crecimiento del tumor se muestra en la Figura 2A: 1) El tratamiento con vehículo solo (control, línea azul), 2) Tratamiento con leucadherina LA1 sola (línea verde), 3) El tratamiento con taxol solo (línea púrpura) y 4) Cotratamiento con LA1 y taxol (línea roja). Se introdujo ortotópicamente la línea celular de adenocarcinoma mamario murino singénico CI66 (moderadamente metastásica y está relacionada con la línea celular 4T1 altamente metastásica) en ratones Balb/c, los animales mediante la inyección de ~ 5 * 105 células CI66 debajo de la almohadilla de grasa mamaria izquierda de ratones WT BALB/c (aprox. 8-10 semanas de edad). El tamaño del tumor se midió usando calibradores cada dos días hasta el final del experimento (aprox. 5 semanas). 7 días después de la implantación, los tumores en todos los animales resultaron palpables, con un tamaño promedio de ~ 100 mm3. En ese momento, los animales en cada grupo fueron tratados tal como se describe. LA1 se administró diariamente durante las dos primeras semanas y a continuación cada dos días hasta el final del experimento. Los animales en el grupo 1 recibieron inyecciones de solución salina, como control. Los resultados en esta figura muestran una reducción significativa en la tasa de crecimiento del tumor en Taxol y, sorprendentemente, en los animales tratados con LA1 (Figura 2C, el grupo de control se muestra en la Figura 2B). Además, y de manera similar, sorprendentemente, los animales co-tratados con el compuesto LA1 y Taxol mostraron la mayor reducción en la tasa de crecimiento del tumor. Esto demuestra que la reducción mediada por leucadherinas en leucocitos inflamatorios puede reducir significativamente el crecimiento del tumor. También puede mejorar la eficacia de la quimioterapia tradicional en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama, para producir una respuesta sinérgica al tratamiento. También puede reducir la incidencia y el tamaño de las metástasis.

EJEMPLO 4

[0109] La eficacia de LA1 se ensayó en un modelo experimental de nefropatía diabética (DN), donde la inflamación juega un papel importante. Se supuso que la reducción de la activación, el reclutamiento y el influjo de leucocitos puede ser una estrategia beneficiosa para el desarrollo de terapias contra el DN. Se encontró que LA1 significativamente previene y/o trata DN, tal como se ve en un modelo murino, que se ha demostrado que mimetiza más próximamente la enfermedad humana (modelo de ratón BTBR ob/ob). La administración diaria de nuestro compuesto redujo significativamente el número de leucocitos infiltrantes en el riñón y conservó la función renal en animales completamente diabéticos. LA1 redujo el daño glomerular y la esclerosis glomerular mesangial. Los datos se muestran en la Figura 3.

[0110] Además, en un modelo de trasplante con aloinjerto, el cotratamiento de los animales con LA1 (con ciclosporina) proporcionó un injerto mucho del riñón donado, lo que sugiere que LA1 tiene un valor terapéutico para nefropatía con aloinjerto y otros trasplantes similares (datos no mostrados).

EJEMPLO 5

[0111] Se demostró que el agonista integrina p2 leucdherina LA1 modula los niveles de expresión de diversos factores pro-inflamatorios en las células. Los macrófagos humanos se trataron con LPS en ausencia o presencia de LA1 in vitro y se determinaron los niveles de ARNm en las células a diversos puntos de tiempo utilizando un conjunto de inflamación Nanostring (184 genes) y paneles de microARN Exiqon. Los datos muestran que los niveles de ARNm (y por tanto la expresión) de una serie de factores pro-inflamatorios (Figuras 15A-15G y figuras 16A-16G, lista en la Figura 17), que se regulan positivamente por el tratamiento con LPS de estas células se reduce significativamente en las células cotratados con LA1.

[0112] Esto apoya la conclusión de que el cebado de integrinas mediado por leukcadherinas para la activación regula negativamente la señalización intracelular, incluyendo la señalización inflamatoria NF-kB.

EJEMPLO 6

[0113] Las Figuras 18A-18B y las Figuras 19A-19B muestran un comportamiento adhesivo de diversas células transfectantes CD11b/CD18 tratadas con vehículo, Mn2+ o LA bajo la tensión de cizalladura. Las Figuras 18A-18B muestran células resistentes al desprendimiento en el flujo de cizalladura. Se representó el número total de células que permanecen unidas en el extremo de cada tensión de cizalladura. Las barras de error son ± s:d: (n = 3) *: P <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001; y NS, no significativo. En las Figuras 19A-19B, las barras de error son ± s:d: (n = 3) *:. P <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 y ns, no significativo. Los resultados muestran que LA1, a diferencia de Mn2+, induce el cebado de CD11b/CD18 y la convierte en la conformación intermedia.

EJEMPLO 7

[0114] LA1 no es tóxica in vivo. Se realizó una evaluación de la toxicidad subaguda de LA1 en ratas. LA1 administrada IP (~ 3 mg/kg/d durante 21 días) no pudo inducir ninguna toxicidad manifiesta o mortalidad en ratas SD de ambos sexos. La Figura 20 muestra que las mediciones bioquímicas en suero e hígado de las ratas tratadas con LA1 no revelaron cambios apreciables en los niveles de enzima o constituyentes del suero, tales como proteínas, colesterol, urea y creatinina. Las constantes hematológicas en ratas tratadas con LA1 estaban a la par con las de los controles.

[0115] LA1 no tuvo ningún efecto sobre la ingesta diaria de alimentos o el crecimiento. La autopsia no reveló alteraciones en el peso relativo de los órganos de varios órganos vitales (pulmón, corazón, bazo, hígado y riñón) o sus histoarquitectura (FIGURA 21). Esto demuestra que LA1 no produce ninguna toxicidad aguda y acumulativa significativa a las dosis administradas.

EJEMPLO 7

[0116] Las Figuras 22A-22E muestran que las leucadherinas son inofensivas para las células endoteliales y son imágenes confocales de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs, azul) teñidas con DAPI que muestran que la adhesión mediada por LA1 de neutrófilos no aumenta la apoptosis de HUVEC, tal como se mide mediante el ensayo de marcado de final de corte de dUTP de Terminal deoxinucleotidil transferasa (TUNEL), donde la incorporación de dUTP marcado marca las células apoptóticas (verde). Esto demuestra que mientras que las células de control positivo muestran una gran tinción TUNEL (verde), las células tratadas con LA1 no. Las leucadherinas sólo promueven temporalmente la interacción natural entre endotelio inflamado o denudado y los leucocitos, pero no a "endotelio sano" (ya que las células sanas no expresan ligandos CD11b/CD18, tales como ICAM-1 y CD40). En apoyo de este argumento, ni nosotros ni otros que estudian animales knock-in que expresan mutantes constitutivamente activos de integrinas LFA-1 [54, 55] y □ 4 □ 7 [56] han observado ningún signo de lesión vascular en ningún modelo experimental. Las Figuras 22A-22E muestran una ausencia de apoptosis en co-cultivos de leucocitos activados con LA-1 y células HUVEC.

[0117] La Figura 23 muestra la concentración de leukadherina LA1 en sangre de ratón con el tiempo después de la administración a través de dos rutas diferentes, mostrando que es biodisponible en animales. Con dosificación oral (PO) e intraperitoneal (IP) de LA1 a 10 mg/kg en animales (ratones) mostró altas concentraciones de LA1 en plasma (según se mide mediante LC-MS), demostrando que LA1 es biodisponible y tiene niveles micromolares en sangre con un tiempo medio de residencia de al menos un par de horas.

[0118] Las Figuras 24A-24B muestran que la leukadherina LA1 reduce la tasa de re-crecimiento del tumor tras el tratamiento. Muestra (24A) la tasa de crecimiento tumoral en animales en los diversos grupos, así como (24B) el volumen relativo del tumor en los animales al final del estudio. Los datos mostrados son media ± SEM. *, P <0,05; **, P <0,001 (mediante ANOVA de una vía). En este experimento, se utilizaron cuatro grupos de animales portadores de tumores (n = 11/grupo): 1) El tratamiento con solución salina sola (línea roja), 2) Tratamiento con leucadherias LA1 solas (línea naranja), 3) tratamiento con una sola dosis de irradiación 20 Gy (dos 10% 10% vértices) solo (línea de color negro) y 4) tratamiento con una sola dosis de irradiación de 20 Gy y a continuación LA1 diaria (-2 horas) (línea azul). Se introdujo ortotópicamente línea celular de adenocarcinoma mamario murino singénico CI66 (moderadamente metastásico y que está relacionado con la línea celular 4T1 altamente metastásica) en animales Balb/c, mediante la inyección de aproximadamente 5 x 105 células CL66 debajo de la almohadilla de grasa mamaria izquierda de ratones WT BALB/c (aproximadamente 10 semanas de edad). El tamaño del tumor se midió usando calibradores cada dos días hasta el final del experimento (aproximadamente 5 semanas). 7 días después de la implantación, los tumores en todos los animales resultaron palpables, con un tamaño medio de ~100mm3. En ese momento, los animales en los grupos 3 y 4 fueron tratados con irradiación. Los animales del grupo 4 recibieron LA1, a partir de 2 horas antes de la irradiación. LA1 se administró diariamente durante la primera semana y después cada dos días hasta el final del experimento (cuando el tamaño del tumor alcanzó el 10% del peso corporal). Los animales en el grupo 1 recibieron inyecciones de solución salina, como control. Los resultados en las Figuras 24A-24B muestran una reducción significativa en la tasa de crecimiento del tumor después de la irradiación en animales tratados con LA1. Además, y bastante sorprendentemente, los animales tratados con el compuesto LA1 solo, en ausencia de cualquier irradiación (Grupo 2) también mostraron una tasa reducida de crecimiento del tumor, hasta un nivel similar a la tasa que se observó con irradiación sola.

[0119] La Figura 25 muestra una curva de supervivencia que muestra que el tratamiento de animales con la leucadherina LA1, con o sin irradiación total subletal del cuerpo, no afecta negativamente a la mortalidad del animal. Los grupos de control (16 ratones por grupo) de ratones C57BL/6J de 6-8 semanas de edad recibieron una única dosis subletal (6 Gy) de radiación corporal total (TBI) y se monitorizó la supervivencia con radiación sola. Los grupos experimentales (16 ratones por grupo) de C57BL/6J de 6-8 semanas de edad recibieron una única dosis subletal (6 Gy) de radiación corporal total (TBI) y se administró leucadherina LA1 (20 mg/animal) durante siete días consecutivos. Además, se monitorizaron dos grupos de control adicionales de los animales - animales con ningún tratamiento en absoluto o animales a los que se les administró LA1 durante siete días consecutivos en ausencia de cualquier irradiación. Los resultados, mostrados en la Figura 25, demuestran que el tratamiento de LA1 no dio como resultado ningún aumento de la mortalidad de los animales sobre los animales sin tratar con LA1. De hecho, el tratamiento con LA1 muestra un efecto protector, mostrando que una dosis optimizada de LA1 sería aún más protectora.

[0120] Las Figuras 26A-26C muestran el análisis de la hematopoyesis y el compartimiento de HSC en grupos tratados con LA1 (barras rojas), control de vehículo (barras azules) de ratones a las 4 semanas después de 6 Gy de irradiación corporal total (TBI), mostrando que LA1 es altamente radioprotector y un radiomitigador. Las Figuras 26A-26C muestran que LA1 protege hematopoyesis y compartimentos y células HSC después de IR subletal incluso cuando se retrasa el tratamiento con LA1, mitigando por lo tanto de manera eficaz los efectos adversos de IR subletal sobre el sistema hematopoyético y HSC. Los ratones fueron expuestos a 6 Gy de TBI (a 0,5 Gy/min) y se trataron por vía intraperitoneal (i.p.) con LA1 (1 mg/kg) o vehículo solo durante 7 días consecutivos a partir de las 24 horas después de la TBI. El análisis de HSCs 4 semanas después de TBI mostró una mejora significativa en el grupo tratado con LA1, medido mediante la celularidad de BM, la frecuencia de células BM LKS+ y células BM CD150+ CD48- LKS+ (altamente enriquecidas en LTR-HSC). Se observó la misma tendencia a las 8 y 12 semanas después de TBI (datos no mostrados), indicando que el tratamiento retrasado con LA1 acelera la recuperación de la hematopoyesis y conserva HSC o facilita la recuperación de compartimiento de HSC después de IR subletal.

[0121] La FIGURA 27 muestra que LA1 reduce de forma dependiente de la dosis la proliferación de células T, tal como se mide mediante una reacción mixta de linfocitos (MLR). Además, LA1 disminuyó la producción de IFN^ por células T en un antígeno de una manera dependiente de la dosis (péptido MOG, datos no mostrados) cuando se evaluaron las células T reactivas al antígeno de los ganglios linfáticos drenantes de ratones.

[0122] La Figura 28 muestra que el tratamiento con LA1 de macrófagos humanos procedentes de pacientes con lupus con ARNds (un antígeno de lupus) redujo significativamente la liberación de TNF-a, mientras que la exposición de los macrófagos a LA1 sola no tuvo ningún efecto sobre la morfología celular y LA1 sola no indujo TNF-a durante 24 horas. Esto también muestra que LA1 atenúa significativamente el fenotipo pro-inflamatorio en macrófagos y neutrófilos de pacientes con lupus, incluidos los de los sujetos con la variante de codificación R77H.

[0123] La Figura 29 muestra que LA1 induce la fosforilación de Syk en leucocitos mediante análisis basado en transferencia Western de la fosforilación de Syk. Los leucocitos se incubaron con LA1 durante 0-60 minutos y se analizaron los niveles de Syk fosforilado, Syk total y GAPDH, mostrando que LA1 induce la fosforilación de Syk.

Resultados

[0124] LA1 no es tóxica in vivo. Un ensayo piloto in vitro de ADME (neutrófilos, hepatocitos, hERG) no mostró hallazgos adversos con LA1 (hasta 100 mM) (no mostrado). A continuación, se realizo una evaluación de la toxicidad subaguda de LA1 en ratas en el núcleo de Patología Comparativa. La LA1 administrada IP (~ 3 mg/kg/d durante 21 días) no pudo inducir ninguna toxicidad manifiesta o mortalidad en ratas SD de ambos sexos. Además, no hubo alteraciones significativas discernibles en el peso relativo de los órganos o su histología en la autopsia terminal. LA1 no tuvo ningún efecto sobre la ingesta diaria de alimentos o el crecimiento. La autopsia no reveló alteraciones en el peso relativo de órganos de varios órganos vitales (pulmón, corazón, bazo, hígado y riñón) o su histoarquitectura. Las constantes hematológicas en ratas tratadas con LA1 estaban a la par con las de los controles. Las mediciones bioquímicas en suero e hígado de las ratas tratadas con LA1 no revelaron cambios apreciables en los niveles de enzimas o constituyentes del suero, tales como proteínas, colesterol, urea y creatinina. Esto demuestra que LA1 no produce ninguna toxicidad aguda y acumulativa significativa a las dosis administradas.

[0125] Evaluación piloto de vehículo oral. Se caracterizaron Cinco sales diferentes de LA1 (Na, K, NH4, Ca y Mg) utilizando XPRD, DCS y TGA y se ensayó la solubilidad acuosa (no mostrado), que mostró una forma cristalina mejorada para LA1 en su sal de magnesio, aunque una solubilidad acuosa en equilibrio mala (~0,6 pg/ml). Además, se prepararon ocho formulaciones de vehículo diferentes utilizando la sal de Mg de LA1, usando metilcelulosa (MC), mezcla MC/SDS, Tween, ETPGS, Captisol, sacarosa, gelatina o propilenglicol. Se prepararon muestras de emulsión de 10 mg/ml de LA1 en cada una de las ocho formulaciones y se examinó la solubilidad de LA1 utilizando LC-MS. Al menos tres - Tween80 al 10%, ETPGS al 20% y Captisol al 30% - mostraron una solubilidad mejorada de LA1 (3-4 mg/ml). Posteriormente, se analizó la re-dispersabilidad de LA1 usando dos fluidos biológicos simulados - fluido gástrico simulado (SGF) y Fluido Gástrico Simulado en Estado de Ayuno (FaSSIF, en inglés). Los resultados mostraron que LA1 tenía una solubilidad mucho mayor en cada una de las tres formulaciones, hasta ~0,15 mg/ml en el caso de Tween80 al 10%, lo que muestra que dichos enfoques de cribado de vehículos tienen el potencial de mejorar significativamente la administración y dosificación de LA1 a los animales.

[0126] Sse utilizó un modelo de xenoinjerto singénico para tratar los efectos de reclutamiento de células inflamatorias en el re-crecimiento de células tumorales después de radioterapia. En este experimento piloto, se decidió utilizar cuatro grupos de animales portadores de tumores (n = 11/grupo): 1) Tratamiento con solución salina sola, 2) Tratamiento con leucadherias LA1 solas, 3) Tratamiento con una sola dosis de irradiación de 20 Gy (usando el procedimiento de LATTICE, dos 10% 10% vértices) sola y 4) Tratamiento con una sola dosis de irradiación de 20 Gy y LA1 (a las -2 h). Se introdujo ortotópicamente línea celular de adenocarcinoma mamario murino CI66 (moderadamente metastásico y que está relacionado con la línea celular 4T1 altamente metastásica) en todos los animales, mediante la inyección de ~5 x 105 células CI66 debajo de la almohadilla de grasa mamaria izquierda de ratones WT BALB/c (10 semanas de edad). El tamaño del tumor se midió usando calibradores cada dos días hasta el final del experimento (aproximadamente 5 semanas). 7 días después de la implantación, los tumores en todos los animales resultaron palpables, con un tamaño medio de ~100mm3. En ese momento, los animales en los grupos 3 y 4 fueron tratados con irradiación. Los animales del grupo 4 recibieron LA1, a partir de 2 horas antes de la irradiación. LA1 se administró diariamente durante la primera semana y después cada dos días hasta el final del experimento (cuando el tamaño del tumor alcanzó el 10% del peso corporal). Los animales en el grupo 1 recibieron inyecciones de solución salina, como control. Los resultados preliminare de este experimento se presentan en las Figuras 24A-24B. Muestran una reducción significativa en la tasa de crecimiento del tumor después de la irradiación en animales tratados con LA1. Además, y bastante sorprendentemente, los animales tratados con el compuesto LA1 solo, en ausencia de cualquier irradiación (Grupo 2) también mostraron una tasa reducida de crecimiento del tumor, hasta un nivel similar a la tasa que se observó con irradiación sola.

[0127] El tratamiento de macrófagos humanos (así como las células dendríticas y neutrófilos, que no se muestran) de voluntarios sanos normales y de pacientes con lupus con antígeno de ARNds (R848) estimuló significativamente la liberación de TNF-a en comparación con los macrófagos solos, tal como se muestra en la Figura 28 (n = 14). Cuando las células se expusieron a R848 y LA1, su capacidad para liberar TNF-a se vio afectada de manera significativa (p = 0,05). Cabe indicar que la exposición de las células a LA1 sola no tuvo ningún efecto sobre la morfología celular y la LA1 sola no indujo TNF-a durante 24 horas. Se obtuvieron resultados similares con FMLP y otros reactivos. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención atenúan significativamente el fenotipo pro inflamatorio en leucocitos (tales como macrófagos, células dendríticas y neutrófilos) de los pacientes, incluidos los de los sujetos con la variante de codificación de CD11 b, tal como la variante R77H.

[0128] A lo largo de esta solicitud, varias publicaciones, incluyendo las patentes de los Estados Unidos, son referenciados por autor y año y las patentes por número. Las citas completas de las publicaciones se enumeran a continuación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Agonista de integrina p2 que tiene la fórmula

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

para usar en la reducción de la cantidad de leucocitos inflamatorios en un tumor de cáncer de mama y la reducción del crecimiento del tumor de mama para tratar el cáncer de mama.

2. Agonista de integrina p2 para usar, según la reivindicación 1, en el que la reducción del crecimiento del tumor de mama comprende reducir la incidencia y el tamaño de las metástasis.

3. Agonista de integrina p2 para usar, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tratamiento se administra en combinación con radiación o quimioterapia.

4. Agonista de integrina p2 para usar, según la reivindicación 3, en el que el tratamiento se administra en combinación con paclitaxel.

5. Agonista de integrina p2 que tiene la formula

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

para usar en el tratamiento de la nefropatía diabética.