ES2773072T3

ES2773072T3 - Transformación de plantas mediada por Ochrobactrum

Info

Publication number: ES2773072T3
Application number: ES16763644T
Authority: ES
Inventors: Ajith Anand; Steven Henry Bass; Sean M Bertain; Hyeon-Je Cho; Anthony J Kinney; Theodore M Klein; Michael Lassner; Kevin E Mcbride; York Moy; Barabara Ann Marie Rosen; Jun-Zhi Wei
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2020-07-09
Anticipated expiration: 2036-08-26
Also published as: JP2018527931A; EP3341483A1; AU2016315655A1; CA2992488A1; DK3341483T3; AU2016315655A8; EP3341483B1; US11236347B2; WO2017040343A1; US20180216123A1; CN108513584A; BR112018004108A2

Abstract

Una Ochrobactrum haywardense HI aislada, en donde dicha Ochrobactrum se deposita bajo el NRRL B-67078.

Description

DESCRIPCIÓN

Transformación de plantas mediada por Ochrobactrum

Campo de la descripción

La presente divulgación se refiere al campo de la biotecnología vegetal. En particular, la divulgación se refiere a métodos para producir plantas transgénicas y células vegetales usando administración mediada por bacterias.

Antecedentes

Introducidos por primera vez en 1997, los cultivos genéticamente modificados (GM) en 2014 representaron alrededor del 80-94 % de la superficie total plantada en los Estados Unidos. A nivel mundial, las hectáreas mundiales de cultivos GM han aumentado más de 100 veces desde 1996 a 2013, con 1,7 millones de hectáreas plantadas en 1996 y más de 175 millones de hectáreas plantadas en 2013. Se han adoptado cultivos modificados en unos 30 países de todo el mundo. Muchos, si no la mayoría de los cultivos genéticamente modificados se generaron utilizando la transformación mediada por Agrobacterium para integrar los rasgos de interés. Sin embargo, aún existen muchos desafíos con el uso de la transformación mediada por Agrobacterium, incluidas las modificaciones requeridas para Agrobacterium, la transformación independiente del genotipo de algunas plantas económicamente importantes, así como los problemas para obtener de manera constante una expresión predecible y estable de transgenes. Si bien Agrobacterium ha sido el vehículo principal para la transformación de plantas mediada por bacterias, no es igualmente eficaz para todas las plantas de interés. Los estudios indican que otras bacterias también se pueden utilizar para la transformación de plantas. Por ejemplo, el documento US7888552B2 describe el uso de especies no agrobacterianas para la transformación de plantas.

Hasta la fecha, otras cepas bacterianas han tenido normalmente eficacias de transformación significativamente más bajas en comparación con Agrobacterium en las condiciones utilizadas en las plantas analizadas. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos y cepas bacterianas adicionales que no sean de Agrobacterium para la transformación de plantas y para mejorar la eficacia de la transformación de plantas.

Resumen

Se proporcionan métodos y composiciones para la transformación de plantas mediada por Ochrobactrum. Los métodos incluyen, pero sin limitación, usar una cepa de Ochrobactrum para transferir un polinucleótido de interés a una célula vegetal. Estos métodos incluyen métodos dependientes de VirD2. Las composiciones incluyen una cepa de Ochrobactrum, ADN de transferencia y construcciones y/o plásmidos. Estas composiciones incluyen cepas de Ochrobactrum que tienen un plásmido que comprende uno o más genes de virulencia, región extrema y/u origen de replicación. También se proporcionan células vegetales, tejidos, plantas y semillas que comprenden un polinucleótido de interés producido por los métodos.

La invención proporciona una Ochrobactrum haywardense HI aislada, en donde dicha Ochrobactrum se deposita bajo el NRRL B-67078.

La invención proporciona además un método para producir una célula vegetal transformada, comprendiendo el método:

a. poner en contacto una célula vegetal con Ochrobactrum como se definió anteriormente, que comprende en un enlace operativo un primer ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico comprende una región génica vir, y un segundo ácido nucleico, en donde el segundo ácido nucleico comprende una o más secuencias borde de ADN-T unidas operativamente a una secuencia de interés;

b. cultivar la célula vegetal en condiciones que permitan que Ochrobactrum transfiera la secuencia de interés a la célula vegetal; y

c. identificar una célula vegetal transformada que comprenda la secuencia de interés en su genoma.

Aún más, la invención proporciona un método para producir una célula vegetal transformada, comprendiendo el método:

poner en contacto una célula vegetal con Ochrobactrum como se definió anteriormente que comprende en un primer vector en enlace operativo:

a) un origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli;

b) un origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum sp.

c) un gen marcador de selección; y

d) genes de virulencia de Rhizobiaceae teniendo los genes de virulencia virB1-B11 las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virB1-B11 las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virC1-C2 las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virC1-C2 las SEQ ID NO: 92-93, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virD1-D2 las SEQ ID NO: 18-19, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virD1-D2 las SEQ ID NO: 94-95, respectivamente, y teniendo un gen de virulencia virG la SEQ ID NO: 15 o teniendo un gen de virulencia r-virG la SEQ ID NO: 91, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virB1-B11, r-virC1-C2, r-virD1-D2, y r-virG además comprende un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma; y

un segundo vector que comprende en un enlace operativo una o más secuencias borde de ADN-T unidas operativamente a una secuencia de interés;

cultivar la célula vegetal en condiciones que permitan que Ochrobactrum transfiera la secuencia de interés a la célula vegetal; e

identificar una célula vegetal transformada que comprenda la secuencia de interés en su genoma.

La invención proporciona además un kit que comprende:

(a) la Ochrobactrum como se definió anteriormente; y

(b) instrucciones para su uso en la transformación de una planta.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A y la Figura 1B muestran un análisis filogenético molecular basado en la secuencia de ADNr 16S usando un método de máxima verosimilitud, la flecha indica la posición de Ochrobactrum haywardense H1 (EP1A09).

Las Figuras 2A-2D muestran experimentos de transformación de la planta del tabaco. Los brotes transformados de manera estable que expresan DsRED (Figura 2B) se muestran a partir de discos de hoja de tabaco transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 tres semanas después de la selección en medio bialafos 3 mg/l. Los brotes transformados de manera estable que expresan DsRED (Figura 2D) se muestran a partir de discos de hoja de tabaco transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprenden además PHP70365 siete semanas después de la selección en medio bialafos 3 mg/l. La Figura 2a (que muestra el tejido de la Figura 2B) y la Figura 2C (que muestra el tejido de la Figura 2D) muestran imágenes de brotes de tabaco transformados usando luz ambiental sin la configuración de filtro DsRED.

Las Figura 3A-Figura 3D muestran resultados de transformación de explantes de semi-semilla de soja. La Figura 3C y la Figura 3D muestran los explantes de semi-semilla de soja transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que además comprenden PHP70365 que muestra la expresión transitoria de DsRED (Figura 3D) cinco días después de la infección. La Figura 3C muestra la imagen del tejido de explante de semisemilla de soja de la Figura 3D bajo luz ambiental y la Figura 3D muestra la expresión transitoria de DsRED5. En cambio, los explantes de semi-semilla de soja transformados con Ochrobactrum Haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 de tipo silvestre sin el vector PHP70365 no mostraron expresión de DsRED (Figura 3B).

Las Figura 4A-Figura 4J muestran etapas secuenciales de transformación de soja infectada con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprenden además el plásmido PHP70365 (pVIR8). La Figura 4A y la Figura 4B muestran el inicio del brote de brotes transformados de manera estable que muestran la expresión de DsRED (Figura 4B) observado de dos a cuatro semanas después de la transformación. La Figura 4A muestra la imagen de tejido de la Figura 4B pero bajo luz ambiental. La Figura 4C muestra el alargamiento del brote en el que los explantes se subcultivaron para un mayor alargamiento del brote. Las Figura4D-Figura 4G muestran la expresión de DsRed de tejido de soja. La Figura 4D y la Figura 4F son imágenes bajo luz ambiental. La Figura 4E muestra la expresión de DsRed del tejido de la Figura 4D. La Figura 4G muestra la expresión de DsRed del tejido de la Figura 4F. La Figura 4H y la Figura 4I muestran el enraizamiento en el que toda la plántula produjo raíces que mostraron expresión de DsRED. La Figura 4H es una imagen bajo luz ambiental. La Figura 4I muestra la expresión de DsRed del tejido de la Figura 4H. La Figura 4J muestra una planta de soja en maceta que se transformó con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que además comprende el plásmido PHP70365.

Las Figura 5A-Figura 5D muestran explantes de eje embrionario de soja transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que además comprenden el plásmido PHP70365. La Figura 5A muestra el inicio de brotes y callos en los que los brotes y callos transformados de manera estable mostraron expresión de DsRED (Figura 5B) en la región meristemática observados dos semanas después de la transformación. La Figura 5A muestra la imagen de tejido de la Figura 5B bajo luz ambiental. La Figura 5C y la Figura 5D muestran el alargamiento del brote en el que se produjeron brotes positivos DsRED transformados de manera estable (Figura 5D) de 1-1,5 cm de tamaño de seis a ocho semanas después de la transformación. La Figura 5C muestra la imagen de tejido de la Figura 5D bajo luz ambiental. En la Figura 5A y la Figura 5B, la raya es igual a 2 mm. En la Figura 5C y la Figura 5D, la raya es igual a 5 mm.

Las Figura 6A-Figura 6f muestran una comparación de la expresión transitoria de DsRED de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 (Figura 6B), Ochrobactrum cytisi (Figura 6D) y Ochrobactrum pecoris (Figura 6F) en semi-semillas de la cultivariedad de soja 93Y21 cinco días después de la infección. La Figura 6A, la Figura 6C y la Figura 6E muestran las imágenes de tejido de la Figura 6B, la Figura 6D y la Figura F, respectivamente, bajo luz ambiental.

Descripción detallada

Ochrobactrum es un género bacteriano en el orden Rhizobiales, familia Brucellaceae. Las cepas de Ochrobactrum son bacilos cortos gramnegativos, rectos o ligeramente curvados con un extremo en forma de llama. Las células tienen aproximadamente 0,6 pm de ancho y de 1,2 a 2 pm de longitud. Ochrobactrum no forma esporas y es estrictamente aeróbica y no fermentadora. Los genomas de la mayoría de las especies de Ochrobactrum son complejos con dos cromosomas circulares independientes a menudo asociados a plásmidos. Holmes describió el género Ochrobactrum en 1988 (Holmes et al. (1988) Int J Syst Bacteriol 38:408) y se propuso Ochrobactrum anthropi como la especie tipo del género. El trabajo posterior condujo al reconocimiento de otras especies que incluyen O. ciceri, O. cytisi, O. daejeonense, O. gallinifaecis, O. grignonense, O. guangzhouense, O. haematophilum, O. intermedium, O. lupini, O. oryzae, O. pecoris, O. pituitosum, O. pseudintermedium, O. pseudogrignonense, O. rhizosphaerae, O. thiophenivorans, y O. tritici.

En algunos ejemplos de la presente divulgación, se proporciona una Ochrobactrum para la transformación de células. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum es una Ochrobactrum grignonense. En algunos ejemplos, la cepa de Ochrobactrum es Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078. La Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 puede denominarse en el presente documento Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, Ochrobactrum haywardense H1, o EP1A09. En algunos ejemplos, el vector Ochrobactrum comprende uno o más genes de virulencia, una región borde y/u origen de replicación. En algunos ejemplos, el vector comprende un marcador o marcadores de selección para la transformación de plantas y bacterias. En algunos ejemplos, uno o más genes de virulencia se seleccionan del grupo que consiste en virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, y variantes de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos, uno o más genes vir se seleccionan del grupo que consiste en virA, virJ, virB1, virB2, virB3, virB4, virB5, virB6, virB7, virB8, virB9, virB10, virB11, virG, virC1, virC2, virD1, virD2, virD3, virD4, virD5, virE1, virE2, virE3 (Broothaerts et al., (2005) Nature 433: 629-633; documento US20050289667; documento US20050289672), y variantes de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes de virulencia. En algunos ejemplos, se proporcionan uno o más genes de virulencia en un plásmido Ti. En algunos ejemplos, se incorporan uno o más genes de virulencia en el genoma de Ochrobactrum. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende más de una copia de uno o más genes de virulencia. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende un primer ácido nucleico que comprende una región génica vir de un plásmido Ti, en donde la región génica vir actúa para introducir un ácido nucleico que codifica una secuencia de interés en una célula vegetal de una manera dependiente de VirD2. VirD2 es una endonucleasa bacteriana implicada en el corte de la secuencia(s) de repetición del borde en el ADN-T para producir la molécula de ADN monocatenario (ADNmc), con una única proteína VirD2 unida covalentemente al ADNmc (Young & Nester (1988) Journal of Bacteriology 170:3367-3374).

En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende un ácido nucleico que comprende una o más secuencias extremas de ADN-T unidas operativamente a un ácido nucleico que codifica una secuencia de interés. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende un ácido nucleico que comprende dos o más secuencias extremas de ADN-T. En algunos ejemplos, las secuencias extremas de ADN-T se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia del borde izquierdo, una secuencia del borde derecho y/u otras secuencias. En algunos ejemplos, el gen(es) vir y la secuencia de interés están en una sola molécula polinucleotídica. En algunos ejemplos, el gen(es) vir y la secuencia de interés están en moléculas polinucleotídicas separadas. Se puede usar cualquier origen(es) de replicación funcional en una bacteria. En algunos ejemplos, el origen(es) de replicación es un origen que es funcional en Agrobacterium, E. coli o ambos. En algunos ejemplos, el origen(es) de replicación se seleccionan del grupo que consiste en pVS1, pSa, RK2, pRiA4b, incPa, incW, colE1 y variantes o derivados funcionales de los mismos. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende un plásmido Ti o Ri. En algunos ejemplos, el plásmido Ti o Ri se selecciona del grupo que consiste en pTiBo542, pTiC58, pTiAch5, pTiChrys5, pTF 101.1, pBIN19, pUCD2, pCGN y variantes o derivados funcionales o fragmentos de los mismos. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende además un marcador de selección. En algunos ejemplos, el marcador de selección está en el ácido nucleico que codifica la secuencia de interés. En algunos ejemplos, el marcador de selección es la secuencia de interés.

Por "fragmento" se entiende una parte de un polinucleótido o una parte de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, proteína codificada por la misma. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteínas que conservan la actividad biológica de la proteína nativa. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar desde al menos aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 15 nucleótidos, aproximadamente 16 nucleótidos, aproximadamente 17 nucleótidos, aproximadamente 18 nucleótidos, aproximadamente 19 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 22 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 75 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 300 nucleótidos, aproximadamente 400 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 600 nucleótidos y hasta el polinucleótido de longitud completa empleado.

Por "derivado" se entiende un polinucleótido o una parte de un polinucleótido que posee una actividad que es sustancialmente similar a la actividad biológica del polinucleótido de referencia. Un derivado de un polinucleótido del gen de virulencia será funcional y retendrá la actividad del gen de virulencia.

Se entiende que "variante" significa una secuencia sustancialmente similar. Para los polinucleótidos, una variante comprende una eliminación y/o adición y/o sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Una variante de un polinucleótido del gen de virulencia retendrá la actividad del gen de virulencia. Como se usa en el presente documento, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un gen de virulencia. Los polinucleótidos variantes incluyen también polinucleótidos obtenidos sintéticamente, tales como los generados, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida, pero continúan conservando la actividad deseada. En general, las variantes de un polinucleótido particular divulgado (es decir, un gen de virulencia) tendrán al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia para ese polinucleótido particular según lo determinado por los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en el presente documento. Las variantes de un polinucleótido particular divulgado (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos cualquiera se puede calcular usando programas de alineación de secuencia y parámetros descritos en otra parte en el presente documento. Cuando cualquier par dado de polinucleótidos divulgados empleados se evalúa mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartida por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia.

Como se usa en el presente documento, "pPHP" se refiere al plásmido PHP, que es seguido de dígitos numéricos. Por ejemplo, pPHP70365 se refiere al plásmido PHP70365. Por ejemplo, pVIR7 se refiere al plásmido VIR7.

La Tabla 19 proporciona una lista de números de identificación de secuencia (SEQ ID NO:) proporcionados en esta divulgación.

También se proporcionan métodos para transformar una célula. En algunos ejemplos, la célula es una célula vegetal. En algunos ejemplos, el método comprende poner en contacto una célula con una Ochrobactrum que comprende uno o más de un gen de virulencia, una región extrema y/u origen de replicación, y una secuencia de interés; cultivar la célula vegetal en condiciones que permitan que Ochrobactrum transfiera la secuencia de interés a la célula; e, identificar una célula transformada que comprenda la secuencia de interés en su genoma. En algunos ejemplos, la célula es una célula vegetal, y el método comprende además regenerar una planta que comprende la secuencia de interés en su genoma. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum es Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum es Ochrobactrum grignonense, Ochrobactrum cytisi, o Ochrobactrum pectoris. En algunos ejemplos, la célula vegetal es de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En algunos ejemplos, la célula vegetal es de una planta seleccionada del grupo que consiste en soja, tabaco, girasol, Arabidopsis, cártamo, alfalfa, maíz, trigo, arroz, sorgo, cebada, avena, mijo, colza, Brassica, algodón y caña de azúcar. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum se cultiva en presencia de acetosiringona u otro compuesto que induce la función del gen vir antes de poner en contacto con la célula.

En algunos ejemplos, la célula vegetal se compone de un explante de una semilla vegetal, una plántula, callo, una suspensión celular, un cotiledón, un meristemo, una hoja, una raíz o un tallo; y el explante se pone en contacto con la Ochrobactrum. En algunos ejemplos, el explante comprende un meristemo embrionario, un meristemo somático, callo, suspensión celular, un cotiledón, un nodo cotiledonario, o comprende tejido de una hoja, una raíz o un tallo. En algunos ejemplos, la identificación de una célula vegetal que comprende la secuencia de interés se lleva a cabo en ausencia de un agente de selección. En otros ejemplos, la identificación de una célula vegetal que comprende la secuencia de interés comprende cultivar la célula vegetal en presencia de un agente de selección, en donde la secuencia de interés confiere tolerancia al agente de selección o se administra conjuntamente con un marcador de selección que confiere tolerancia al agente de selección. En algunos ejemplos, el agente de selección es glifosato, kanamicina, bialafós, 2,4-D o dicamba. En algunos ejemplos, la secuencia de interés no está físicamente unida a un gen marcador de selección. En estos ejemplos, el gen marcador y la secuencia de interés se segregan genéticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la célula vegetal que comprende la secuencia de interés. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende además un tercer ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de interés, y por lo que la célula transformada comprende la segunda secuencia de interés en su genoma. En algunos ejemplos, la regeneración de una planta a partir de la célula vegetal comprende inducir la formación de uno o más brotes a partir de un explante que comprende la célula vegetal y cultivar al menos un primer brote en una planta fértil completa. En algunos ejemplos, la regeneración ocurre mediante organogénesis.

El orden bacteriano Rhizobiales comprende bacterias comunes del suelo y junto con Agrobacterium spp. incluye Rhizobium spp., Mesorhizobium spp., Sinorhizobium spp., y Ochrobactrum spp. Además de Agrobacterium sp., se sabe que otros miembros de Rhizobiales tal como Rhizobium spp., se asocian simbióticamente con raíces de plantas en nódulos especializados de fijación de nitrógeno (por ejemplo, Long (2001) Plant Physiol 125: 69-72). Además de la nodulación específica del hospedador de las raíces de las plantas, especialmente de las leguminosas, se conocen algunos efectos promotores del crecimiento de las plantas por parte de los miembros de las Rhizobiales en ausencia de nodulación (por ejemplo, Noel et al. (1996) Can J Microbiol 42:279-283). Se han publicado informes que describen la transformación de plantas mediante bacterias distintas de Agrobacterium sp. (por ejemplo, Broothaerts et aI. (2005) Nature 433:629-633; documento US20050289667; documento US20050289672; Weller et aI. (2004) Appl Env Microbiol 70:2779-2785; Weller et aI. (2005) Pl Pathol 54:799-805). Se ha demostrado la transformación de plantas para Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, y Ensifer en la familia Rhizobiaceae, mientras que la transferencia de ADN solo se ha mostrado para Mezorhizobium en la familia Phyllobacteriaceae.

En aspectos, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Agrobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp., Ochrobactrum spp., o Bradyrhizobium spp. En un aspecto, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Rhizobium spp. En un aspecto, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Sinorhizobium spp. En un aspecto, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Mesorhizobium spp. En un aspecto, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Phyllobacterium spp. En un aspecto, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Ochrobactrum spp. En un aspecto, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Bradyrhizobium spp.

En aspectos, los genes de virulencia de Rhizobiaceae son genes de Agrobacterium spp. En un aspecto, los genes Agrobacterium spp. son genes de Agrobacterium albertimagni, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium tumefaciens, o Agrobacterium vitis. En un aspecto, los genes de Agrobacterium spp. son de Agrobacterium rhizogenes o Agrobacterium tumefaciens. En un aspecto, los genes de Agrobacterium spp. son de Agrobacterium rhizogenes. En un aspecto, los genes de Agrobacterium spp. son de Agrobacterium tumefaciens.

Se pueden utilizar varias cepas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes de tipo silvestre y desarmadas (no patógenas) que albergan plásmidos Ti o Ri para la transferencia de genes a las plantas. Los genes de síntesis de fitohormonas ubicados en el ADN-T de Agrobacteria de tipo silvestre que albergan un plásmido Ti o Ri se expresan en las células vegetales después de la transformación, y causan la formación de tumores o un fenotipo de raíz pilosa dependiendo de la cepa o especie de Agrobacterium. El ADN-T de Agrobacteria se puede genomanipular para reemplazar muchos de sus determinantes de virulencia y patogenicidad (mediante desarme) con una o más secuencias de interés y retener la capacidad de transferir el ADN-T modificado a una célula vegetal e integrarse en un genoma. Las cepas que contienen dichos plásmidos Ti desarmados se usan ampliamente para la transformación de plantas.

En algunos aspectos, una construcción vectorial comprende un plásmido Ti (Agrobacterium tumefaciens) o un plásmido Ri (Agrobacterium rhizogenes). En algunos aspectos, la construcción comprende uno o más genes de virulencia. Los genes de virulencia pueden ser de un plásmido Ti y se representan en el presente documento como las SEQ ID NO: 4-27 y las SEQ ID NO: 42-49 (véase la Tabla 19 en el presente documento). Los genes de virulencia pueden ser de un plásmido Ri y se representan en el presente documento como las SEQ ID NO: 79-101. Los genes de virulencia del plásmido Ri descritos en el presente documento se representan usando una "r" antes del nombre del gen vir. Por ejemplo, r-virA (SEQ ID NO: 79), r-virB1 (SEQ ID NO: 80), r-virB2 (SEQ ID NO: 81), r-virB3 (SEQ ID NO: 82), r-virB4 (SEQ ID NO: 83), r-virB5 (SEQ ID NO: 84), r-virB6 (SEQ ID NO: 85), r-virB7 (SEQ ID NO: 86), r-virB8 (SEQ ID NO: 87), r-virB9 (SEQ ID NO: 88), r-virb10 (SEQ ID NO: 89), r-virB11 (SEQ ID NO: 90), r-virG (SEQ ID NO: 91), rvirCI (SEQ ID NO: 92), r-virC2 (SEQ ID NO: 93), r-virD1 (SEQ ID NO: 94), r-virD2 (SEQ ID NO: 95), r-virD3 (SEQ ID NO: 96), r-virD4 (SEQ ID NO: 97), r-virD5 (SEQ ID NO: 98), r-virF (SEQ ID NO: 99), r-virE3 (SEQ ID NO: 100), y rgalls (SEQ ID NO: 101). Véase la Tabla 19 en el presente documento. En el presente documento pueden usarse diferentes combinaciones de los genes de virulencia (vir y r-vir). El gen r-galls (SEQ ID NO: 101) es necesario para la virulencia con los genes vir del plásmido Ri descritos en el presente documento.

En un aspecto, el vector comprende además uno o más genes de virulencia de Agrobacterium virA, virD3, virD4, virD5, virEI, virE2, virE3, virH, virHI, virH2, virJ, virK, virL, virM, virP, o virQ, o variantes y derivados de los mismos, o uno o más genes de virulencia de Agrobacterium r-virA, r-virD3, r-virD4, r-virD5, r-virE3, o r-virF, o variantes y derivados de los mismos, y r-galls, o variantes y derivados del mismo.

Una Ochrobactrum usada en la presente divulgación puede comprender ácidos nucleicos introducidos, por ejemplo, mediante electroporación. Los ácidos nucleicos introducidos pueden comprender polinucleótidos requeridos para la transferencia conjugada independiente de la función de VirD2, o uno o más genes de virulencia. Las secuencias introducidas pueden insertarse en el genoma de Ochrobactrum. En otros ejemplos, las secuencias introducidas están en uno o más plásmidos. En otros ejemplos, los polinucleótidos se pueden transferir a Ochrobactrum mediante transferencia conjugada desde otra especie bacteriana. Por ejemplo, aparte del sistema de administración de cadena T dependiente de T4SS, Agrobacterium tiene sistemas de movilización de plásmidos adicionales que también pueden transferir e integrar plásmidos, tal como el plásmido IncQ pRSF1010, entre células bacterianas y en el genoma de la planta mediante transferencia conjugada (Buchanan-Wollaston et al. (1987) Nature 328:172-175, Shadenkov et al. (1996) Mol Biol 30:272-275; Chen et aI. (2002) J Bacteriol 184:4838-4845). Adicionalmente, la proteína de transferencia conjugada MobA, junto con las proteínas MobB y MobC del plásmido RSF1010, escinde el sitio oriT (origen de transferencia), se une al extremo 5' y transfiere el ADNmc en células independientes del sistema T4SS (Bravo-Angel (1999) J Bacteriol 181:5758-5765, y referencias en el mismo). Los sistemas de transferencia conjugada están ampliamente presentes en las bacterias, lo que da como resultado el intercambio de información genética entre las células bacterianas. En Rhizobium, donde Rhizobium está filogenéticamente relacionado pero distinto de Agrobacterium (véase, por ejemplo, Spaink et aI. (ed.), The Rhizobiaceae, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos, 1998; y, Farrand et aI. (2003) Int J Syst Evol Microbiol. 53:1681-1687), el sistema de transferencia conjugada se ha caracterizado parcialmente en algunas especies (véase, por ejemplo, Freiberg et aI. (1997) Nature 387:394-401; Turner et al. (2002) FEMS Microbiol Ecol 42:227-234; Tun-Garrido et al. (2003) J Bacteriol 185:1681-1692; y, Perez-Mendoza et al. (2004) J Bacteriol 186:5753-5761). El sistema conjugado utiliza un oriT como sitio de corte y TraA o Mob como enzima de corte, en contraste con los elementos convencionales utilizados en la movilización de a DN-T (sitios VirD2 y RB y LB, respectivamente). A diferencia de VirD2, que se encontró que tenía una señal de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) de la planta en su extremo C para la focalización nuclear de la planta, ni TraA ni Mob tienen un NLS obvio.

La región Vir en el plásmido Ti/Ri es una colección de genes cuya función agregada es escindir la región ADN-T del plásmido y promover su transferencia e integración en el genoma de la planta. El sistema vir se induce mediante señales producidas por las plantas en respuesta a las heridas. Los compuestos fenólicos tales como la acetosiringona, el siringaldehído o la acetovanilona activan el gen virA, que codifica un receptor que es una proteína transmembrana expresada constitutivamente. El gen virA activado actúa como una cinasa, fosforilando el gen virG. En su forma fosforilada, virG actúa como un activador transcripcional para los restantes operones del gen vir. El operón virB codifica proteínas que producen una estructura similar a poro/fimbria. VirC se une a la secuencia de sobreiniciadora. VirDI y virD2 tienen actividad endonucleasa, y realizan cortes de cadena única dentro de los bordes izquierdo y derecho, y virD4 es una proteína de acoplamiento. VirE se une al ADN-T monocatenario, protegiéndolo durante la fase de transporte del proceso. Una vez en la célula vegetal, se sintetiza la cadena complementaria del ADN-T.

Estos y otros genes vir funcionan en trans, por lo que ninguno de estos genes necesita ser incluido en los vectores de clonación. Por ejemplo, las cepas de Agrobacterium modificadas pueden proporcionar todas las funciones Vir necesarias en los plásmidos donde se ha eliminado la región ADN-T, permitiendo que la célula proporcione las funciones vir para la transferencia de ADN-T. En un ejemplo, hay cepas procedentes de C58 en las que se usó una parte de pBR322 (Bolivar et al., (1977). Gene. 2 (2):75-93; Bolivar et al (1977) Gene 2 (2):95-113) para reemplazar la región de ADN-T y proporcionar resistencia a la ampicilina.

Al diseñar una construcción vectorial para el proceso de transformación, se seleccionan uno o más componentes genéticos que se introducirán en la célula o tejido vegetal. Los componentes genéticos pueden incluir cualquier ácido nucleico que se introduce en una célula o tejido vegetal usando las composiciones y/o métodos de Ochrobactrum. Los componentes genéticos pueden incluir ADN no vegetal, ADN vegetal o ADN sintético. En algunos ejemplos, los componentes genéticos se incorporan en una molécula de ADN, tal como un plásmido recombinante bicatenario o una molécula de vector que comprende al menos uno o más de los siguientes componentes genéticos: un promotor que funciona en las células vegetales para provocar la producción de una secuencia de ARN; una secuencia de ADN estructural que provoca la producción de una secuencia de ARN; y, secuencia de ADN no traducida en 3' que dirige la poliadenilación del extremo 3' de la secuencia de ARN.

Se proporcionan construcciones que incluyen una o más secuencias de interés para la expresión y/o inserción en un genoma celular. Las construcciones pueden estar contenidas dentro de un vector tal como binario (Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 62/252229) ternarios o de ADN-T. Una construcción se refiere a una molécula polinucleotídica compuesta de varios tipos de secuencias de nucleótidos que tienen diferentes funciones y/o actividades. Varios tipos de secuencias incluyen enlazadores, adaptadores, regiones reguladoras, intrones, sitios de restricción, potenciadores, aisladores, marcadores de cribado, marcadores de selección, promotores, casetes de expresión, polinucleótidos codificantes, polinucleótidos de silenciamiento, secuencias de terminación, orígenes de replicación, sitios de recombinación, casetes de escisión, recombinasas, factores de proliferación celular, trampas de promotor, otros sitios que ayudan en la construcción o análisis de vectores, o cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos, una construcción comprende uno o más casetes de expresión, en donde un polinucleótido está operativamente unido a una secuencia reguladora. "Unido operativamente" es un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, una unión operativa entre un polinucleótido codificante y una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido codificante. Los elementos unidos operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usa para hacer referencia a la unión de dos regiones codificantes de proteínas, por unido operativamente se entiende que las regiones codificantes están en la misma fase de lectura. Un polinucleótido codificante incluye cualquier polinucleótido que codifique un polipéptido o que codifique un polinucleótido de silenciamiento que reduzca la expresión de genes diana. Los ejemplos no limitantes de un polinucleótido de silenciamiento incluyen un ARN de interferencia pequeño, microARN, ARN antisentido y una estructura de horquilla. La construcción también puede contener una serie de componentes genéticos para facilitar la transformación de la célula o tejido vegetal y para regular la expresión de cualquier secuencia de ácido nucleico estructural. En algunos ejemplos, los componentes genéticos están orientados para expresar un ARNm, opcionalmente el ARNm se traduce en una proteína. La expresión de una secuencia codificante estructural vegetal (un gen, ADNc, ADN sintético u otro ADN) que existe en forma bicatenaria implica la transcripción del ARN mensajero (ARNm) de una cadena del ADN mediante la enzima ARN polimerasa y procesamiento posterior de la transcripción primaria de ARNm dentro del núcleo. Este procesamiento implica una región no traducida en 3' que poliadenila los extremos 3' del ARNm.

El mecanismo de transferencia de ADN-T a las células vegetales mediante Agrobacterium es bien conocido. En resumen, el ADN-T está delimitado por dos secuencias de borde de regiones, el borde derecho (RB, por sus siglas en inglés) y el borde izquierdo (LB, por sus siglas en inglés). Estos bordes son cortados por la proteína de virulencia VirD2 para producir un ADN transferido de cadena sencilla (la "cadena T") con unión covalente de VirD2 en su extremo 5'. El complejo proteína-ADN, que también incluye la proteína VirE2 de Agrobacterium, sale de las células de Agrobacterium a través del sistema de secreción Tipo 4, que incluye tanto la proteína de virulencia como un transportador de ADNmc, y se transfiere a las células vegetales. El ADN transferido se somete a un procesamiento adicional en la célula vegetal y se integra en el genoma vegetal con la ayuda de las proteínas de virulencia de Agrobacterium y los factores vegetales. El uso de vectores mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Fraley et aI. (1985) Bio/Technology 3:629-635; Rogers et aI. (1987) Methods Enzymol 153:253-277; y la Patente de Estados Unidos 5.563.055). Estos mismos elementos y mecanismos se pueden transferir para producir un sistema para transformar células vegetales.

En algunos ejemplos, una construcción comprende un plásmido Ti o Ri. En algunos ejemplos, la construcción comprende uno o más genes de virulencia. En algunos ejemplos, el plásmido Ti o Ri es pC5105, pC5106, o una variante o derivado de los mismos. En algunos ejemplos, la construcción proporcionada es competente para la transferencia independiente de virD2 a partir de Ochrobactrum y carece de secuencia de borde de ADN-T, comprendiendo la construcción una secuencia oriT y una secuencia traA o mob, unida operativamente, de manera opcional, a una secuencia de interés. También se proporciona una Ochrobactrum transformada con dicha construcción. En algunos ejemplos, la Ochrobactrum comprende un plásmido Ti que contiene una región de ADN-T, en donde la secuencia de interés se ubica dentro del ADN-T, opcionalmente entre los bordes izquierdo y derecho del ADN-T. Los genes informadores apropiados incluyen GUS o una proteína fluorescente, que incluye, pero sin limitación, GFP, YFP, CFP, RFP, DsRed, ZsGreen y ZsYellow.

En algunos ejemplos, un método de transformación proporcionado en el presente documento puede comprender seleccionar una célula vegetal transformada con una secuencia de interés en ausencia de un agente de selección. La selección de una célula vegetal transformada con una secuencia de interés puede comprender cultivar la célula vegetal en presencia de un agente de selección, en donde la secuencia de interés confiere tolerancia al agente de selección o se une operativamente a un ácido nucleico que confiere tolerancia al agente de selección. Ejemplos de dichos agentes de selección incluyen glifosato, kanamicina, bialafos o dicamba. En otros aspectos más, la secuencia de interés no está físicamente unida a un gen marcador de selección. Por ejemplo, el gen marcador y la secuencia de interés pueden segregarse genéticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la célula vegetal transformada con la secuencia de interés.

Un regulador del crecimiento vegetal o una hormona vegetal incluye compuestos que afectan el crecimiento vegetal. Los reguladores del crecimiento vegetal incluyen, pero sin limitación, auxinas, fitocininas, ABA, giberelinas, etileno, brasinoesteroides y poliaminas. Las auxinas afectan el alargamiento de los brotes y las raíces a baja concentración, pero inhiben el crecimiento a niveles más altos. Las auxinas comúnmente utilizadas incluyen picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), IAA (ácido indol-3-acético), NAA (ácido anaftaleneacético) y dicamba (ácido 3,6-dicloroanisico). Las fitocininas causan división celular, diferenciación celular y diferenciación de brotes. Las fitocininas comúnmente utilizadas incluyen cinetina, BA (6-bencilaminopurina), 2-ip (2-isopenteniladenina), BAP (6-bencilaminopurina), tidiazurón (TDZ), ribozeatina y zeatina.

La transformación se refiere a un proceso de introducción de una secuencia de ácido nucleico exógeno en una célula o tejido. La transformación puede ser transitoria o estable. En transformaciones estables, parte o la totalidad del ácido nucleico exógeno se incorpora (por ejemplo, integrado o mantenido de forma estable) en el ADN genómico nuclear, ADN de plastidio, o es capaz de replicación autónoma en el núcleo o plastidio.

El término polinucleótido no se limita a composiciones que comprenden solo ADN. Los polinucleótidos pueden comprender ribonucleótidos o ácidos nucleicos peptídicos, y combinaciones de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural, como análogos sintéticos y moléculas modificadas. Los polinucleótidos también abarcan todas las formas de secuencias incluyendo, pero sin limitación, formas mono-, bi- o multicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle y plásmidos circulares.

Una variedad de métodos y sistemas comerciales para preparar construcciones tales como casetes, plásmidos o vectores que contienen los componentes genéticos deseados son bien conocidos en la técnica. Las construcciones normalmente consisten en una serie de componentes genéticos, que incluyen, pero sin limitación, elementos reguladores tales como promotores, líderes, intrones y secuencias de terminación. Los elementos reguladores también se denominan elementos reguladores cis o trans, dependiendo de la proximidad del elemento a los genes de secuencia que controlan.

En algunos ejemplos, una construcción comprende un promotor operativamente unido a un polinucleótido codificante. El término promotor indica una región de ADN implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción de una secuencia codificante. Los promotores pueden ser promotores de origen natural, una variante o un fragmento de los mismos, o derivados sintéticamente. El término promotor se refiere a las secuencias mínimas necesarias para dirigir la transcripción (promotor mínimo), así como a las secuencias que comprenden el promotor mínimo y cualquier número de elementos adicionales, tales como secuencias operadoras, potenciadores, moduladores, sitios de restricción, sitios de recombinación, secuencias ubicadas entre el promotor mínimo y la secuencia codificante, y las secuencias de la región no traducida en 5' (5'-UTR, por sus siglas en inglés), que es la región de una transcripción que se transcribe, pero no se traduce en un polipéptido, que puede o no influir en los niveles de transcripción de una manera deseable. Un promotor vegetal se refiere a un promotor aislado de una planta o un promotor procedente de la misma o un promotor heterólogo que funciona en una planta, por ejemplo, un promotor de un virus vegetal. El promotor puede seleccionarse en función del patrón de expresión o resultado deseado (para una revisión de promotores vegetales, véase Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol 40:1-22).

Se han descrito en la técnica varios promotores que son activos en células vegetales. También se puede usar una variedad de promotores que están regulados en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas y/o de desarrollo, para la expresión de cualquier construcción en células vegetales, incluyendo, por ejemplo, promotores regulados por calor (por ejemplo, Callis et al. (1988) Plant Physiol 88:965-968, luz (por ejemplo, promotor RbcS-3A de guisante, Kuhlemeier et aI. (1989) Plant Cell 1:471-478; y, promotor RbcS de maíz, Schaffner et aI. (1991) Plant Cell 3:997-1012), hormonas, tal como ácido abscísico (Marcotte et aI. (1989) Plant Cell 1:969-976), heridas (por ejemplo, Wuni et aI. (1989) Plant Cell 1:961-968), u otras señales o productos químicos. Ejemplos que describen promotores incluyen, sin limitación, la Patente de Estados Unidos 6.437.217 (promotor RS81 de maíz), la Patente de Estados Unidos 5.641.876 (promotor de actina de arroz, OsActl), la Patente de Estados Unidos 6.426.446, (promotor RS324 de maíz), la Patente de Estados Unidos 6.429.362, (promotor PR-I de maíz), la Patente de Estados Unidos 6.232.526, (promotor A3 de maíz), las Patentes de Estados Unidos 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 y 5.530.196 (promotor 35S, 35Senh), la Patente de Estados Unidos 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de maíz), la Patente de Estados Unidos 6.429.357 (promotor de actina 2 de arroz e intrón de actina 2 de arroz), la Patente de Estados Unidos 5.837.848 (promotor específico de raíz), la Patente de Estados Unidos 6.294.714 (promotores inducibles por luz), la Patente de Estados Unidos 6.140.078 (promotores inducibles por sal), la Patente de Estados Unidos 6.252.138 (promotores inducibles por patógenos), la Patente de Estados Unidos 6.175.060 (promotores inducibles por deficiencia en fósforo), la Patente de Estados Unidos 6.635.806 (promotor de gammacoixina) y la Patente de Estados Unidos 7.151.204 (promotor de cloroplasto de aldolasa de maíz). Los promotores adicionales que pueden encontrar uso son un promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al. (1987) PNAS 84:5745-5749), el promotor de octopina sintasa (Oc S) (de plásmidos inductores de tumores de A. tumefaciens), los promotores de caulimovirus tales como el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, por sus siglas en inglés) (Lawton et al. (1987) Plant Mol Biol 9:315-324), el promotor 35S del CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (Walker et al. (1987) PNAS 84:6624; Patentes de Estados Unidos 6.051.753; 5.378.619), el promotor de la sacarosa sintasa (Yang et aI. (1990) PNAS 87:4144-4148), el promotor del complejo génico R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), promotor génico de la proteína de unión a clorofila a/b, o promotor PClSV del caulimovirus de la raya clorótica del maní (Patente de Estados Unidos 5.850.019). En algunos ejemplos, se pueden utilizar promotores At.Act 7 (n.° de registro U27811), At.ANTI (documento US20060236420), FMy'35S-EFla (documento US20050022261), eIF4AlO (n.° de registro X79008) y AGRtu.nos (registro de GenBank V00087; Depicker et aI. (1982) J Mol Appl Genet 1:561-573; Bevan et aI. (1983) Nature 304:184-187), de la fosfato de triosa isomerasa citosólica del arroz (OsTPI; Patente de Estados Unidos 7.132.528), y del gen 15 de la actina del arroz (OsAct15; documento US20060162010). En algunos casos, un promotor puede incluir una 5'UTR y/o un primer intrón.

Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos desvelados en el documento WO1999/43838 y la Patente de Estados Unidos 6.072.050; el promotor central de CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al., (1989) Plant Mol Biol 12:619-632; y, Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689); pEMU (Last et al., (1991) Theor Appl Genet 81:581-588); MAS (Velten et al., (1984) EMBO J 3:2723-2730); promotor ALS (Patente de Estados Unidos 5.659.026), el promotor nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium (Bevan et al. (1983) Nucl Acids Res 11:369-385); promotor del virus del mosaico de Mirabilis (MMV, por sus siglas en inglés) (Dey y Maiti (1999) Plant Mol Biol 40:771-782; Dey y Maiti (1999) Transgenics 3:61-70); histona 2B (H2B) (documento WO1999/43797); promotor del virus del rayado del banano (BSV, por sus siglas en inglés) (Remans et al. (2005) Virus Research 108:177-186); promotor del virus del mosaico estriado del cloris (CSMV) (Zhan et al. (1993) Virology 193:498-502); promotor del virus del mosaico venoso de la mandioca (CSVMV, por sus siglas en inglés) (Verdaguer et al. (1998) Plant Mol Biol 37:1055-1067); promotor del virus del mosaico de la escrofularia (FMV, por sus siglas en inglés) (Patente de Estados Unidos 6.018.100); promotor de alfa-tubulina de arroz (OsTUBA1) (Jeon et al. (2000) Plant Physiol 123:1005-1014); promotor del citocromo C de arroz (OsCC1) (Jang et al. (2002) Plant Physiol 129:1473-1481); promotor de la alcohol deshidrogenasa1 de maíz (ZmADH1) (Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357); un promotor de oleosina. Se describen otros promotores constitutivos en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.

En algunos ejemplos, se puede usar un promotor inducible en las composiciones y/o métodos. Los promotores inducibles por heridas, que pueden responder al daño causado por la alimentación de insectos, incluyen el promotor del gen inhibidor de la proteinasa de la patata (pin II); wun1 y wun2 divulgados en la Patente de Estados Unidos 5.428.148; sistemina; WIP1; y el promotor del gen MPI. Además, se pueden emplear promotores inducibles por patógenos, incluyendo dichos promotores inducibles por patógenos los de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de infección por un patógeno; por ejemplo, pero sin limitación, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa y quitinasa. Véase, por ejemplo, el documento WO1999/43819. Se pueden usar promotores que se expresan localmente, en o cerca del sitio de infección por patógenos. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.750.386 (inducible por nemátodos); y el promotor inducible para el gen PRms del maíz, cuya expresión se induce por el patógeno Fusarium moniliforme.

Se pueden usar promotores regulados por productos químicos para modular la expresión de un gen en una célula o planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. El promotor puede ser un promotor inducible por productos químicos, donde la aplicación del producto químico induce expresión génica, o un promotor reprimible por productos químicos, donde la aplicación del producto génico reprime la expresión génica. Se conocen en la técnica promotores inducibles por productos químicos e incluyen, pero sin limitación, el promotor de In2-2 de maíz, que se activa mediante protectores herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor de g St de maíz, que se activa mediante compuestos electrófilos hidrófobos que se usan como herbicidas preemergentes, y el promotor de PR-1a del tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores de interés regulados por productos químicos incluyen promotores sensibles a esteroides tales como el promotor inducible por glucocorticoides y los promotores inducibles por tetraciclina y represibles por tetraciclina (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.814.618 y 5.789.156).

Los promotores preferidos en tejidos se pueden utilizar para dirigir la expresión polipeptídica potenciada en un tejido vegetal particular. Los promotores preferidos en tejidos son conocidos en la técnica e incluyen aquellos promotores que se pueden modificar para expresión débil. Los promotores preferidos en las hojas, preferidos en la raíz o específicos de la raíz se pueden seleccionar de los conocidos en la técnica, o aislarse de novo a partir de varias especies compatibles. Ejemplos de promotores específicos de la raíz incluyen aquellos promotores del gen de la glutamina sintetasa de soja, el elemento de control en el gen GRP 1.8 del frijol francés, el gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens y el clon de ADNc de longitud completa que codifica la glutamina sintetasa (GS) citosólica. Los promotores específicos de la raíz también incluyen aquellos aislados de genes hemoglobina de la fijadora del nitrógeno no leguminosa Parasponia andersonii y la no fijadora del nitrógeno no leguminosa relacionada Trema tomentosa, promotores de los genes inductores de raíces altamente expresados rolC y rolD de Agrobacterium rhizogenes, el promotor específico de la punta de la raíz de la octopina sintasa, y el promotor específico de raíz de los genes TR2' y TR1'. Los promotores adicionales preferidos de la raíz incluyen el promotor del gen VfENOD-GRP3 y el promotor roIB. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 5.837.876; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 y 5.023.179. Las secuencias reguladoras preferidas de la raíz de Arabidopsis thaliana se divulgan en el documento US20130117883.

Los promotores preferidos de semillas incluyen tanto promotores específicos de semillas (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla, tales como promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) como promotores de germinación de semillas (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Dichos promotores preferidos de semillas incluyen, pero sin limitación, Cim1 (mensaje inducido por fitocinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); y milps (mioinositol-1-fosfato sintasa) (véase, la Patente de Estados Unidos 6.225.529). Gammazeína y Glb-1 son promotores específicos de endospermo. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero sin limitación, el inhibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3), la p-faseolina de frijol, napina, p-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja y cruciferina. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero sin limitación, zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, Y-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. En dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero sin limitación, el promotor del revestimiento de semillas de Arabidopsis, pBAN; y los promotores tempranos de semillas de Arabidopsis, p26, p63 y p63tr (Patentes de Estados Unidos 7.294.760 y 7.847.153). Un promotor que tiene expresión "preferida" en un tejido particular se expresa en ese tejido en mayor grado que en al menos otro tejido vegetal. Algunos promotores preferidos de tejido muestran expresión casi exclusivamente en el tejido particular.

Las quimeras promotoras también se pueden construir para mejorar la actividad transcripcional (Patente de Estados Unidos 5.106.739), o para combinar la actividad transcripcional deseada, inducibilidad, especificidad de tejido, especificidad de desarrollo o cualquier combinación de las mismas. Los promotores que funcionan en plantas incluyen, pero sin limitación, promotores que son inducibles, víricos, sintéticos, constitutivos, regulados temporalmente, regulados espacialmente y/o regulados espacio-temporalmente. Otros promotores que son potenciados en los tejidos, específicos de los tejidos y/o regulados por el desarrollo también se conocen en la técnica y se pueden usar con las composiciones y/o métodos proporcionados en el presente documento.

Los promotores utilizados en las construcciones de ADN (es decir, genes vegetales quiméricos/recombinantes) pueden modificarse, si se desea, para afectar las características de control o expresión. Los promotores pueden proceder mediante la unión con regiones operadoras, mutagénesis aleatoria o controlada u otros medios. Además, los promotores pueden alterarse para contener múltiples secuencias potenciadoras para ayudar a elevar la expresión génica.

La terminación de la transcripción puede lograrse mediante una secuencia de ADN no traducida en 3' unida operativamente a una secuencia de interés u otra secuencia. La región no traducida en 3' de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación que funciona en las plantas para causar la adición de nucleótidos de adenilato al extremo 3' del ARN. La región de terminación se puede obtener a partir de varios genes que se expresan en células vegetales y puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, el polinucleótido unido operativamente y/o la célula hospedadora, o la región de terminación puede proceder de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga) al promotor, el polinucleótido, la célula hospedadora o cualquier combinación de los mismos. Están disponibles regiones de terminación convenientes del gen inhibidor de la proteinasa de patata (PinII) o del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa (Fraley et al. (1983) PNAS 80:4803-4807). Véase también Guerineau et al. (1991) Mol Gen Genet 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucl Acids Res 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucl Acid Res 15:9627-9639. Las moléculas de poliadenilación de un gen RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et aI. (1984) EMBO J 3:1671-1679), AGRtu.nos (registro de Genbank E01312), E6 (n.° de registro U30508), glutelina de arroz (Okita et al. (1989) J Biol Chem 264:12573) y TaHsp17 (gen de proteína de choque térmico de bajo peso molecular del trigo; n.° de registro de GenBank X13431) también están disponibles.

Un casete de expresión puede contener adicionalmente secuencias líder en 5'. Dichas secuencias líder pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder EMCV (región no codificante en 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS 86: 6126 6130); líderes de potyvirus, por ejemplo, líder TEV (virus de ataque químico del tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165: 233-238, y proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90 94); líder no traducido del ARNm de la proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622 625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y líder del virus moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382385). Véase también, Della Cioppa et al. (1987) Plant Physiol 84:965968.

La construcción puede, o no, incluir una secuencia que codifica un marcador de selección. En algunos aspectos, el gen marcador de selección facilita la selección de células o tejidos transformados. Las secuencias marcadoras de selección incluyen secuencias que codifican resistencia a antibióticos, tal como la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como secuencias que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ejemplos adicionales de secuencias marcadoras de selección adecuadas incluyen, pero sin limitación, secuencias que codifican resistencia a cloranfenicol, metotrexato, estreptomicina, espectinomicina, bleomicina, sulfonamida, bromoxinilo, fosfinotricina y glifosato (véase, por ejemplo, los documento US20030083480 y US20040082770).

En algunos ejemplos, una construcción puede incluir una secuencia que codifica una recombinasa y/o sus sitios de recombinación correspondientes. En algunos ejemplos, la recombinasa está flanqueada por los dos o más sitios de recombinación y los sitios de recombinación están en la misma orientación paralela. Orientación paralela significa que las dos o más secuencias de recombinación están ambas o todas en la orientación 3' a 5', o están ambas o todas en la orientación 5' a 3'. Un conjunto de sitios de recombinación dispuestos en la misma orientación, como se describe en el presente documento, dará como resultado la escisión, en lugar de la inversión, de la secuencia de ADN intermedia entre los sitios de recombinación. La inversión ocurre cuando los sitios de recombinación están orientados en orientaciones opuestas o mixtas.

Una recombinasa, también conocida como recombinasa específica del sitio, es un polipéptido que cataliza la recombinación conservadora específica del sitio entre sus sitios de recombinación compatibles. Una recombinasa puede incluir polipéptidos nativos, variantes y/o fragmentos que retienen la actividad recombinasa. Una secuencia que codifica una recombinasa puede incluir polinucleótidos nativos, variantes y/o fragmentos que codifican una recombinasa que retiene la actividad recombinasa. Las recombinasas adecuadas que están codificadas incluyen recombinasas nativas o fragmentos o variantes biológicamente activos de la recombinasa, tales como las que catalizan la recombinación conservadora específica de sitio entre sitios de recombinación específicos. Un polipéptido o polinucleótido nativo comprende una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de origen natural. La recombinasa y sus sitios compatibles pueden denominarse un sistema de recombinasa. Se puede usar cualquier sistema de recombinasa. En algunos ejemplos se utilizan recombinasas de las familias integrasa y resolvasa.

En algunos ejemplos, se puede usar una recombinasa quimérica. Una recombinasa quimérica es una proteína de fusión recombinante que es capaz de catalizar la recombinación específica de sitio entre sitios de recombinación que se originan a partir de diferentes sistemas de recombinación. Por ejemplo, si el conjunto de sitios de recombinación comprende un sitio FRT y un sitio LoxP, se puede utilizar una recombinasa quimérica FLP/Cre o una variante activa o fragmento de la misma, o se pueden proporcionar ambas recombinasas por separado. Los métodos para la producción y uso de dichas recombinasas quiméricas o variantes activas o fragmentos de las mismas se describen, por ejemplo, en el documento WO99/25840.

Se puede utilizar cualquier sitio de recombinación adecuado o conjunto de sitios de recombinación en los métodos y composiciones, incluyendo, pero sin limitación: un sitio FRT, una variante funcional de un sitio FRT, un sitio LOX y una variante funcional de un sitio LOX, cualquier combinación de los mismos, o cualquier otra combinación de sitios de recombinación conocidos. Los sistemas de recombinasa incluyen, sin limitación, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli, la PinB, PinD y PinF de Shigella, y el sistema R/RS de Zygosaccharomyces rouxii.

Las variantes funcionales incluyen sitios de recombinación quiméricos, tal como un sitio FRT fusionado a un sitio LOX. Por ejemplo, se pueden utilizar sitios de recombinación del sistema de recombinación específico de sitio Cre/Lox. Dichos sitios de recombinación incluyen, por ejemplo, sitios LOX nativos y diversas variantes funcionales de LOX (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.465.254 y el documento WO01/111058). Los sitios de recombinación FRT modificados recombinógenos se pueden utilizar en varios métodos de recombinación específicos de sitio in vitro e in vivo que permiten la integración dirigida, el intercambio, la modificación, la alteración, la escisión, la inversión y/o la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés, véase, por ejemplo, el documento WO99/25821, el documento WO99/25854, el documento WO99/25840, el documento WO99/25855, el documento WO99/25853 y el documento WO2007/011733.

En algunos ejemplos, una construcción puede incluir uno o más factores de proliferación celular. En algunos ejemplos, un factor de proliferación celular es de la familia de proteínas AP2/ERF. La familia de proteínas AP2/ERF es una clase de supuestos factores de transcripción específicos de la planta que regulan una amplia variedad de procesos de desarrollo y se caracterizan por la presencia de un dominio de unión al ADN AP2/ERF. Las proteínas AP2/ERF se han subdividido en distintas subfamilias en función de la presencia de dominios conservados. Inicialmente, la familia se dividió en dos subfamilias en función del número de dominios de unión al ADN, con la subfamilia ERF con un dominio de unión al ADN y la subfamilia AP2 con dos dominios de unión al ADN. A medida que se identificaron más secuencias, la familia se subdividió posteriormente en cinco subfamilias: AP2, DREB, ERF, RAV y otras. Los miembros de la familia de proteínas APETALA2 (AP2) funcionan en una variedad de eventos biológicos que incluyen, pero sin limitación, desarrollo, regeneración de plantas, división celular, embriogénesis y proliferación celular. La familia AP2 incluye, pero sin limitación: AP2, ANT, Glossy15, AtBBM, BnBBM y ODP2 (BBM) del maíz.

Una construcción puede comprender una o más secuencias de interés. En algunos ejemplos, la secuencia de interés confiere un rasgo a la célula o planta transformada. En algunos ejemplos, una secuencia de interés confiere resistencia a insectos. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas tales como el gusano de la raíz, el gusano trozador, el barrenador europeo del maíz, el gusano falso medidor de la soja, el nematodo del quiste de la soja y los pulgones. Ejemplos incluyen polinucleótidos que codifican delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis, tales como proteínas Cry, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.188.960; 5.366.892 5.593.881 5.689.052 5.723.756 5.736.514 5.747.450 5.880.275 5.986.177 6.023.013 6.033.874; 6.060.594 6.063.597 6.077.824 6.083.499 6.127.180 6.218.188 6.326.351 6.399.330 6.340.593 6.548.291; 6.620.988 6.624.145 6.642.030 6.248.535 6.713.259 6.893.826 6.949.626 7.064.249 7.105.332 7.179.965; 7.208.474 7.227.056 7.288.643 7.323.556 7.329.736 7.378.499 7.385.107 7.476.781 7.449.552 7.462.760; 7.468.278 7.504.229 7.510.878 7.521.235 7.544.862 7.605.304 7.696.412 7.629.504 7.705.216 7.772.465; 7.790.846 7.803.943 7.858.849 el documento WO1991/14778; el documento WO1999/31248; el documento WO2001/12731; el documento WO1999/24581; el documento WO1997/40162; el documento US20060112447; el documento US20060191034; el documento US20120278954; el documento US20110064710; y el documento WO2012/139004. Otros ejemplos de delta endotoxinas también incluyen, pero sin limitación, una toxina DIG-3 o DIG-11 (eliminación N-terminal de las variantes a-helix 1 y/o a-helix 2 de proteínas Cry tal como Cry1A) de las Patentes de Estados Unidos 8.304.604 y 8.304.605; quimeras Cry1A/F de las Patentes de Estados Unidos 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063; una proteína Cry3A que incluye, pero sin limitación, una proteína insecticida híbrida genomanipulada (eHIP) creada mediante la fusión de combinaciones únicas de regiones variables y bloques conservados de al menos dos proteínas Cry diferentes (Documento US20100017914); TIC807 del documento US20080295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TlC127, TIC128 del documento PCT/US2006/033867; proteínas AXMI tales como las de las Patentes de Estados Unidos 8.236.757, 7.923.602, 8.084.416, 8.334.431, 8.318.900; el documento WO2006/083891; el documento WO2005/038032; el documento WO2005/021585; el documento US20040250311; el documento US20040216186; el documento US20040210965; el documento US20040210964; el documento US20040197917; el documento US20040197916; el documento WO2006/119457; el documento WO2004/074462; el documento US20110023184; el documento US20110263488; el documento US20100197592; el documento WO2011/103248; el documento WO2011/103247; el documento US20100298211; el documento US20090144852; el documento US20100005543; y proteínas Cry tales como Cry1A y Cry3A que tienen sitios proteolíticos modificados de la Patente de Estados Unidos 8.319.019. Más de una proteína plaguicida bien conocida por un experto en la técnica también se puede expresar en plantas tales como Vip3Ab y Cry1Fa (Documento US20120317682); Cry1BE y Cry1F (Documento US20120311746); Cry1CA y CrylAB (Documento US20120311745); Cry1F y CryCa (Documento US20120317681); Cry1 DA y Cry1BE (Documento US20120331590); Cry1DA y CrylFa (Documento US20120331589); CrylAB y Cry1BE (Documento US20120324606); y Cry1Fa, Cry2Aa, Cry11 o Cry1E (Documento US20120324605). Las proteínas plaguicidas también incluyen lipasas insecticidas, incluidas las acil hidrolasas lipídicas de la Patente de Estados Unidos 7.491.869. Las proteínas plaguicidas también incluyen toxinas VIP (proteínas insecticidas vegetativas) de las Patentes de EE.UU.

5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 y 8.237.020. Otras proteínas VIP son bien conocidas por un experto en la técnica. Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas del complejo de toxinas (TC, por sus siglas en inglés), que se pueden obtener de organismos tales como Xenorhabdus, Photorhabdus y Paenibacillus (véanse, las Patentes de Estados Unidos 7.491.698 y 8.084.418).

Los polinucleótidos que codifican proteínas antifúngicas también son útiles (por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 6.875.907, 7.498.413, 7.589.176, 7.598.346, 8.084.671, 6.891.085 y 7.306.946;). También son útiles los polinucleótidos que codifican cinasas similares al receptor LysM para la percepción de fragmentos de quitina como primera etapa en la respuesta de defensa de la planta contra patógenos fúngicos (Documento US20120110696). Otros polinucleótidos adecuados incluyen los que codifican un péptido de momento hidrófobo, tales como los descritos en el documento WO1995/16776 y la Patente de Estados Unidos 5.580.852, derivados peptídicos de taquiplesina que inhiben los hongos fitopatógenos, y el documento WO1995/18855 y la Patente de Estados Unidos 5.607.914 (péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a enfermedades). Otros polinucleótidos adecuados incluyen aquellos que codifican péptidos de desintoxicación tales como fumonisina, beauvericina, moniliformina y zearalenona y sus derivados relacionados estructuralmente. Por ejemplo, véanse, las Patentes de Estados Unidos 5.716.820; 5.792.931; 5.798.255; 5.846.812; 6.083.736; 6.538.177; 6.388.171 y 6.812.380 y los genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089).

En otros ejemplos, las secuencias de interés pueden alterar la composición de una planta, tejido vegetal, parte de la planta o semilla. En algunos ejemplos, estas incluyen modificar el contenido o perfil de ácidos grasos, alterar el contenido o perfil de aminoácidos, alterar el contenido o perfil de hidratos de carbono, alterar el contenido o perfil de fibra y/o alterar la digestibilidad o procesabilidad de una planta o parte de ella. Los ejemplos de una secuencia de interés incluyen, pero sin limitación, genes que afectan la producción de almidón (Patentes de Estados Unidos 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), la producción de aceite modificado (Patentes de Estados Unidos 6.444.876; 6.426.447; 6.380.462), la alta producción de aceite (Patentes de Estados Unidos 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; 6.476.295), el contenido de ácidos grasos modificados (Patentes de Estados Unidos 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), la alta producción de proteínas (Patente de Estados Unidos 6.380.466), la maduración del fruto (Patente de Estados Unidos 5.512.466), la nutrición animal y humana mejorada (Patentes de Estados Unidos 6.723.837; 6.653.530; 6,5412,59; 5.985.605; 6.171.640), los biopolímeros (Patente de Estados Unidos RE37.543; las Patentes de Estados Unidos 6.228.623; 5.958.745 y el documento US20030028917), los rasgos de procesamiento mejorados (Patente de Estados Unidos 6.476.295), la digestibilidad mejorada (Patente de Estados Unidos 6.531.648), el bajo nivel de rafinosa (Patente de Estados Unidos 6.166.292), la producción de enzimas industriales (Patente de Estados Unidos 5.543.576), el sabor mejorado (Patente de Estados Unidos 6.011.199), la fijación de nitrógeno (Patente de Estados Unidos 5.229.114), la producción de semillas híbridas (Patente de Estados Unidos 5.689.041), la producción de fibra (Patentes de Estados Unidos 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) y la producción de biocombustible (Patente de Estados Unidos 5.998.700).

Por ejemplo, la disminución de estearoil-ACP puede aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véase, el documento WO1999/64579; aumento del ácido oleico mediante la modificación del gen FAD-2 y/o disminución del ácido linolénico mediante la modificación del gen FAD-3 (véanse, las Patentes de Estados Unidos 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 y el documento WO1993/11245); alteración del contenido de ácido linolénico o linoleico conjugado, tal como en el documento WO2001/12800; alteración de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, milps, diversos genes Ipa, tales como Ipa1, Ipa3, hpt o hggt. Por ejemplo, véanse, el documento WO2002/42424, el documento WO1998/22604, el documento WO2003/011015, el documento WO2002/057439, las Patentes de Estados Unidos 6.423.8866.197.561 y 6.825.397, los documentos US20030079247 y US20030204870; polinucleótidos que codifican delta-8 desaturasa para la fabricación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (Patentes de Estados Unidos 8.058.571 y 8.338.152) y delta-9 desaturasa para reducir las grasas saturadas (Patente de Estados Unidos 8.063.269); polinucleótidos y proteínas codificadas asociadas con la regulación del metabolismo de los lípidos y el azúcar, en particular, la proteína del metabolismo de los lípidos (LMP, por sus siglas en inglés) utilizada en métodos de producción de plantas transgénicas y modulación de los niveles de compuestos de almacenamiento de semillas, incluidos lípidos, ácidos grasos, almidones o proteínas de almacenamiento de semillas y su uso en métodos de modulación del tamaño de semilla, número de semillas, peso de las semillas, longitud de raíz y tamaño de hoja de plantas (Documento EP 2404499); alterar la expresión de una expresión de alto nivel de proteína inducible por azúcar 2 (HSI2, por sus siglas en inglés) en la planta para aumentar o disminuir la expresión de HSI2 en la planta. El aumento de la expresión de HSI2 aumenta el contenido de aceite, mientras que la disminución de la expresión de HSI2 disminuye la sensibilidad al ácido abscísico y/o aumenta la resistencia a la sequía (Documento US20120066794); la expresión del citocromo b5 (Cb5) solo o con FAD2 para modular el contenido de aceite en la semilla de la planta, particularmente para aumentar los niveles de ácidos grasos omega-3 y mejorar la proporción de ácidos grasos omega-6 a omega-3 (Documento US20110191904); y polinucleótidos que codifican polipéptidos de tipo 1 arrugados para modular el metabolismo del azúcar (Patente de Estados Unidos 8.217.223). Los genes de modificación de ácidos grasos también pueden usarse para afectar el contenido y/o composición de almidón a través de la interrelación de las rutas de almidón y aceite; contenido o composición antioxidante alterada, tal como la alteración de tocoferol o tocotrienoles. Por ejemplo, véanse, la Patente de Estados Unidos 6.787.683, los documentos US20040034886 y WO2000/68393, que implican la manipulación de los niveles de antioxidantes, y mediante la alteración de una homogenización de geranil geranil transferasa (hggt) (documento WO2003/082899); y aminoácidos esenciales alterados en semillas. Por ejemplo, véanse, la Patente de Estados Unidos 6.127.600 (método para aumentar la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), la Patente de Estados Unidos 6.080.913 (métodos binarios para aumentar la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), la Patente de Estados Unidos 5.990.389 (nivel alto de lisina), el documento WO1999/40209 (alteración de composiciones de aminoácidos en semillas), el documento WO1999/29882 (métodos para alterar el contenido de aminoácidos de las proteínas), la Patente de Estados Unidos 5.850.016 (alteración de composiciones de aminoácidos en semillas), el documento WO1998/20133 (proteínas con niveles mejorados de aminoácidos esenciales), la Patente de Estados Unidos 5.885.802 (nivel alto de metionina), la Patente de Estados Unidos 5.885.801 (nivel alto de treonina), la Patente de Estados Unidos 6.664.445 (enzimas biosintéticas de aminoácidos vegetales), la Patente de Estados Unidos 6.459.019 (aumentos de lisina y treonina), la Patente de Estados Unidos 6.441.274 (subunidad beta de triptófano sintasa vegetal), la Patente de Estados Unidos 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), la Patente de Estados Unidos 5.939.599 (nivel alto de azufre), la Patente de Estados Unidos 5.912.414 (metionina aumentada), el documento WO1998/56935 (enzimas biosintéticas de aminoácidos vegetales), el documento WO1998/45458 (proteína de semilla genomanipulada que tiene un mayor porcentaje de aminoácidos esenciales), el documento WO1998/42831 (lisina aumentada), la Patente de Estados Unidos 5.633.436 (aumento del contenido de aminoácidos de azufre), la Patente de Estados Unidos 5.559.223 (proteínas de almacenamiento sintéticas), el documento WO1996/01905 (treonina aumentada), el documento WO1995/15392 (lisina aumentada), el documento US20030163838, el documento US20030150014, el documento US20040068767, la Patente de Estados Unidos 6.803.498 y el documento WO2001/79516. Los polinucleótidos que confieren digestibilidad a las plantas también son útiles. Por ejemplo, la alteración del nivel de xilano presente en la pared celular de una planta se puede lograr modulando la expresión de xilano sintasa (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 8.173.866).

En algunos ejemplos, la secuencia(s) de interés incluyen polinucleótidos que controlan la esterilidad masculina, incluyendo, sin limitación, los divulgados en las Patentes de los Estados Unidos 4.654.465 y 4.727.219 y las Patentes de los Estados Unidos 3.861.709 y 3.710.511. Además de estos, la Patente de Estados Unidos 5.432.068, describe un sistema de esterilidad nuclear masculina. Para ejemplos adicionales de sistemas y genes de esterilidad nuclear masculina y femenina, véanse también las Patentes de Estados Unidos 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014; y 6.265.640.

En algunos ejemplos, la secuencia(s) de interés que son útiles en los aspectos incluyen polinucleótidos que afectan la resistencia al estrés abiótico, que incluyen, pero sin limitación, la floración, el desarrollo de las mazorcas y las semillas, la mejora de la eficiencia de la utilización de nitrógeno, la respuesta al nitrógeno alterada, la resistencia o tolerancia a la sequía, la resistencia o tolerancia al frío y la resistencia o tolerancia a la sal y el aumento del rendimiento bajo estrés. Por ejemplo, véanse: el documento WO2000/73475 en donde la eficacia del uso del agua se altera a través de la alteración del malato; las Patentes de Estados Unidos 5.892.009, 5.965.705, 5.929.305, 5.891.859, 6.417.428, 6.664.446, 6.706.866, 6.717.034, 6.801.104, el documento WO2000/060089, el documento WO2001/026459, el documento WO2001/035725, el documento WO2001/034726, el documento WO2001/035727, el documento WO2001/036444, el documento WO2001/036597, el documento WO2001/036598, el documento WO2002/015675, el documento WO2002/017430, el documento WO2002/077185, el documento WO2002/079403, el documento WO2003/013227, el documento WO2003/013228, el documento WO2003/014327, el documento WO2004/031349, el documento WO2004/076638, el documento WO199809521; el documento WO199938977 que describen genes que incluyen genes de CBF y factores de transcripción eficaces para mitigar los efectos negativos de la congelación, la alta salinidad y la sequía en plantas, así como que confieren en otras plantas efectos positivos sobre el fenotipo de la planta; los documentos US20040148654 y WO2001/36596 en donde el ácido abscísico se altera en plantas dando como resultado un fenotipo mejorado de la planta tal como un mayor rendimiento y/o una mayor tolerancia al estrés abiótico; el documento WO2000/006341, el documento WO2004/090143, las Patentes de Estados Unidos 7.531.723 y 6.992.237 en donde la expresión de fitocininas se modifica dando como resultado plantas con mayor tolerancia al estrés, tal como tolerancia a la sequía, y/o mayor rendimiento. Véanse también, el documento WO2002/02776, el documento WO2003/052063, el documento JP2002/281975, la Patente de Estados Unidos 6.084.153, el documento WO2001/64898, la Patente de Estados Unidos 6.177.275 y la Patente de Estados Unidos 6.107.547 (mejora de la utilización de nitrógeno y capacidad de respuesta al nitrógeno alterada); para la alteración del etileno, véanse, los documentos US20040128719, US20030166197 y WO2000/32761; para factores de transcripción vegetales o reguladores transcripcionales del estrés abiótico, véanse, por ejemplo, los documentos US20040098764 o US20040078852; polinucleótidos que codifican polipéptidos que aumentan la expresión de pirofosfatasa vacuolar tal como AVP1 (Patente de Estados Unidos 8.058.515) para aumentar el rendimiento; ácido nucleico que codifica un polipéptido HSFA4 o HSFA5 (factor de choque térmico de la clase A4 o A5), un polipéptido de proteína transportadora de oligopéptido (similar a OPT4); un polipéptido similar a plastocrón2 (similar a PLA2) o un polipéptido similar a homeosecuencia 1 (similar a WOX1) relacionado con Wuschel (Documento US20110283420); disminución de polinucleótidos que codifican proteínas poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) para modular la muerte celular programada (Patente de Estados Unidos 8.058.510) para aumentar el vigor; polinucleótido que codifica polipéptidos DTP21 para conferir resistencia a la sequía (Documento US20110277181); secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas ACC Sintasa 3 (ACS3) para modular el desarrollo, modular la respuesta al estrés y modular la tolerancia al estrés (Documento US20100287669); polinucleótidos que codifican proteínas que confieren un fenotipo de tolerancia a la sequía (DTP, por sus siglas en inglés) para conferir resistencia a la sequía (Documento WO2012/058528); polinucleótidos de tocoferol ciclasa (TC) para conferir tolerancia a la sequía y la sal (Documento US20120272352); polinucleótidos que codifican proteínas de la familia amino terminal CAAX para la tolerancia al estrés (Patente de Estados Unidos 8.338.661); las mutaciones en los polipéptidos que codifican SAL1 han aumentado la tolerancia al estrés, incluido el aumento de la resistencia a la sequía (Documento US20100257633); expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: polipéptido GRF, polipéptido similar a RAA1, polipéptido SYR, polipéptido ARKL y polipéptido YTP que aumenta los rasgos relacionados con el rendimiento (Documento US20110061133); modulación de la expresión en una planta de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la fosfato trehalosa clase III fosfatasa (TPP, por sus siglas en inglés) para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, particularmente aumentando el rendimiento de las semillas (Documento US20100024067).

En algunos ejemplos, las secuencias de interés incluyen otros polinucleótidos que afectan el crecimiento de las plantas y los rasgos agronómicos, tales como el rendimiento, la floración, el crecimiento de las plantas y/o la estructura de las plantas, véanse, por ejemplo, los documentos WO1997/49811 (LHY), WO1998/56918 (ESD4), WO1997/10339 y la Patente de Estados Unidos 6.573.430 (TFL), la Patente de Estados Unidos 6.713.663 (FT), los documentos WO1996/14414 (CON), WO1996/38560, WO2001/21822 (VRN1), WO2000/44918 (VRN2), WO1999/49064 (GI), WO2000/46358 (FR1), WO1997/29123, la Patente de Estados Unidos 6.794.560, la Patente de Estados Unidos 6.307.126 (GAI), el documento WO1999/09174 (D8 y Rht) y el documento WO2004/031349 (factores de transcripción).

En algunos ejemplos, la secuencia(s) de interés incluyen polinucleótidos que confieren mayor rendimiento. Por ejemplo, una planta de cultivo se puede transformar con un ácido nucleico que codifica el polipéptido similar a 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa (ACCDP, por sus siglas en inglés), en donde la expresión en la planta de cultivo da como resultado un mayor crecimiento de la raíz de la planta y/o un mayor rendimiento, y/o mayor tolerancia al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta (Patente de Estados Unidos 8.097.769); se ha demostrado que la sobreexpresión del gen de proteína con dedo de zinc de maíz (Zm-ZFP1) usando un promotor preferido de semilla mejora el crecimiento de la planta, aumenta el número de grano y el peso total del grano por planta (Documento US20120079623); se ha demostrado que la sobreexpresión constitutiva de la proteína del dominio de los bordes de los órganos laterales del maíz (LOB) (Zm-LOBDP1) aumenta el número y el peso total del grano por planta (Documento US20120079622); mejora de los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a VIM1 (variante en metilación 1) o un polipéptido similar a VTC2 (GDP-L-galactosa fosforilasa) o un polipéptido DUF1685 o un polipéptido similar a ARF6 (factor de sensible a auxina) (Documento WO2012/038893); la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a Ste20 o un homólogo del mismo da lugar a plantas que tienen un mayor rendimiento en relación con las plantas de control (Documento EP2431472); y polinucleótidos que codifican polipéptidos de nucleósido difosfatasa cinasa (NDK, por sus siglas en inglés) y sus homólogos para modificar la arquitectura de la raíz de la planta (Documento US20090064373).

Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular, los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a dicha resistencia, en particular, las mutaciones S4 y/o HRA), genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); glifosato (por ejemplo, el gen de EPSPS y el gen gat; véanse, por ejemplo, los documentos US20040082770 y WO03/092360); u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptII codifica aminoglucósido 3'-fosfotransferasa y proporciona resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina, geneticina y paromomicina, y los mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón.

En un ejemplo de la presente divulgación, la construcción contiene un gen marcador de selección, de cribado o de puntuación. El ADN que sirve como un dispositivo de selección o cribado puede funcionar en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que conferiría al tejido vegetal resistencia a un compuesto que de otro modo sería tóxico. En la técnica se conocen y se pueden usar varios genes marcadores de selección o de cribado. Se proporcionan ejemplos de marcadores y genes de selección en Miki y McHugh ((2004) J Biotechnol 107193-232). Los genes de interés para su uso como marcador de selección, de cribado o de puntuación incluyen, pero sin limitación, gus, GFP (proteína fluorescente verde), proteína fluorescente roja (RFP; DsRED), proteína fluorescente amarilla (YFP; ZsYELLOW), proteína fluorescente cian (CFP), luciferasa (LUX), genes que confieren tolerancia a antibióticos como kanamicina (Dekeyser et aI. (1989) Plant Physiol 90:217-223), neomicina, kanamicina, paromomicina, G418, aminoglucósidos, espectinomicina, estreptomicina, higromicina B, bleomicina, fleomicina, sulfonamidas, estreptotricina, cloranfenicol, metotrexato, 2-desoxiglucosa, betaína aldehído, S-aminoetil L-cisteína, 4-metiltriptófano, D-xilosa, D-manosa, benziladenina-N-3-glucuronidasa, genes que codifican enzimas que dan tolerancia a herbicidas como el glifosato (por ejemplo, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS): Della-Cioppa et al. (1987) Bio/Technology 5:579-584; las Patentes de Estados Unidos 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; 5.094.945; los documentos WO04074443 y WO04009761; glifosato oxidorreductasa (GOX; Patente de Estados Unidos 5.463.175); glifosato descarboxilasa (documentos WO05003362 y US20040177399); o glifosato N-acetiltransferasa (GAT; documento US20030083480), dalapon (por ejemplo, dehI que codifica la ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa que confiere tolerancia al ácido 2,2-dicloropropiónico (Dalapon; documento WO199927116), bromoxinilo (haloarilnitrilasa (Bxn) para conferir tolerancia al bromoxinil (documento WO198704181; Patente de Estados Unidos 4.810.648; documento WO198900193A)), herbicidas de sulfonilo (por ejemplo, acetohidroxiácido sintasa o acetolactato sintasa que confieren tolerancia a los inhibidores de acetolactato sintasa tales como sulfonilurea, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos y ftalida; (Patentes de Estados Unidos 6.225.105; 5.767.366; 4.761.373; 5.633.437; 6.613.963; 5.013.659; 5.141.870; 5.378.824; y 5.605.011)); que codifica ALS, GST-II), bialafos o fosfinotricina o derivados (por ejemplo, fosfinotricina acetiltransferasa (bar) que confiere tolerancia a fosfinotricina o glufosinato (Patentes de los Estados Unidos 5.646.024; 5.561.236; 5.276.268; 5.637.489; y 5.273.894; y documento EP275.957); atrazina (que codifica GST-III), dicamba (dicamba monooxigenasa (DMO; documentos US20030115626, US20030135879) y setoxidim (acetilcoenzima A carboxilasa modificada para conferir tolerancia a ciclohexanodiona (setoxidim) y ariloxifenoxipropionato (haloxyfop) (Patente de Estados Unidos 6.414.222), entre otros. También se pueden implementar otros procedimientos de selección, incluidos los mecanismos de selección positiva, tal como el uso del gen manA de E. coli, que permite el crecimiento en presencia de mañosa (véase también Miki y McHugh (2004) J Biotechnol 107193-232).

La secuencia(s) de interés también incluyen un polinucleótido que codifica un polirribonucleótido para silenciar o reducir la expresión de una secuencia diana a través de tecnologías de silenciamiento génico tales como supresión conjunta, antisentido, ARNi, expresión de miARN (naturales o genomanipulados), expresión de ARNip de acción trans, y expresión de ribozimas (véase, por ejemplo, el documento US20060200878). El polirribonucleótido puede comprender una horquilla promotora, un microARN o un ARN no codificante. Una horquilla promotora puede incluir una estructura ribonucleotídica bicatenaria, como una estructura de tallo-bucle o una secuencia invertida repetida que puede estar implicada en el ARN de interferencia (ARNi) o ARN de interferencia pequeño (ARNip). Se describen ejemplos de promotores de horquilla, por ejemplo, en el documento US20070199100.

Cualquier ARNm producido mediante una construcción de ADN también puede contener una secuencia líder no traducida en 5'. Esta secuencia puede proceder del promotor seleccionado para expresar el gen y se puede modificar específicamente para aumentar o disminuir la traducción del ARNm. Las regiones no traducidas en 5' también se pueden obtener a partir de ARN víricos, a partir de genes eucariotas adecuados o a partir de una secuencia genética sintética. Las secuencias potenciadoras pueden usarse para aumentar o alterar la eficacia traduccional del ARNm resultante. La secuencia líder no traducida puede proceder del promotor instantáneo/región reguladora u, opcionalmente, de cualquier promotor o gen no relacionado (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.362.865). Los ejemplos de secuencias líder incluyen líderes de la proteína de choque térmico de maíz y petunia (Patente de Estados Unidos 5.362.865), líderes de la proteína de cubierta del virus vegetal, líderes de rubisco vegetal, GmHsp (Patente de Estados Unidos 5.659.122), PhDnaK (Patente de Estados Unidos 5.362.865), AtAnt1, TEV (Carrington & Freed (1990) J Virol 64:1590-1597), OsAct1 (Patente de Estados Unidos 5.641.876), OsTPI (Patente de Estados Unidos 7.132.528), OsAct15 (documento US20060162010) y AGRtu.nos (registro de GenBank V00087; Bevan et aI. (1983) Nature, 304:184-187). Otros componentes genéticos que sirven para mejorar la expresión o afectar la transcripción o traducción de un gen también se consideran componentes genéticos. Por ejemplo, se ha demostrado que las secuencias de intrones ayudan en la expresión de transgenes en células vegetales. Ejemplos de intrones incluyen el intrón de actina (Patente de Estados Unidos 5.641.876), el intrón HSP70 de maíz (ZmHSP70; Patente de Estados Unidos 5.859.347; Patente de Estados Unidos 5.424.412) e intrón TPI de arroz (OsTPI; Patente de Estados Unidos 7.132.528).

Para la transformación mediada por Ochrobactrum, la construcción se introduce normalmente en un hospedador adecuado tal como E. coli y se une a otro hospedador adecuado tal como Ochrobactrum. Alternativamente, la construcción se transforma directamente (por ejemplo, mediante electroporación) en Ochrobactrum competente. La construcción puede estar en un plásmido Ti o Ri, o puede proporcionarse por separado. El plásmido Ti o Ri puede ser un plásmido de origen natural, tal como de Agrobacterium, y puede inducir tumores o raíces peludas, respectivamente (véase, por ejemplo, Hooykaas et al. (1977) J Gen Microbiol 98:477-484, y Weller et al. (2004) Appl Env Microbiol 70:2779-2785). En otros ejemplos, un plásmido Ti o Ri se puede desarmar alternativamente y no es capaz de causar la proliferación de células vegetales. Dado que Ochrobactrum y Agrobacterium tienen diferentes mecanismos de infección, el contacto de las células vegetales con Ochrobactrum puede aumentar la frecuencia de la transformación de la línea germinal y/o tener menos efectos nocivos en la célula o planta diana durante la transformación una vez que se introduce el plásmido auxiliar Ti o Ri.

Se proporcionan composiciones y métodos que utilizan Ochrobactrum para introducir uno o más componentes genéticos en células, tejidos y/o plantas. En algunos ejemplos, los hospedadores contienen plásmidos Ti o Ri desarmados que no contienen los oncogenes que causan tumorigénesis o rizogénesis, derivados de los cuales se usan como vectores y contienen los genes de interés que posteriormente se introducen en las plantas. En otro aspecto, Ochrobactrum transfiere ADN a las células vegetales mediante un mecanismo independiente T4SS, a saber, transferencia conjunta mediada por oriT. Las funciones necesarias para la transferencia de ADN independiente de T4SS pueden residir en el plásmido que contiene el ADN a transferir, o pueden residir en el cromosoma u otro plásmido, incluido un plásmido Ti o Ri, también presente en dicha célula bacteriana.

Se puede utilizar cualquier medio de cultivo de plantas adecuado para desarrollar o mantener un cultivo de tejidos vegetales, complementado según sea apropiado con reguladores de crecimiento de plantas adicionales que incluyen, pero sin limitación, auxinas tales como picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y dicamba (ácido 3,6-dicloroanisico); fitocininas tales como BAP (6-bencilaminopurina) y cinetina; ABA; y gliberelinas. Otros aditivos de medios pueden incluir, pero sin limitación, aminoácidos, macroelementos, hierro, microelementos, inositol, vitaminas y compuestos orgánicos, hidratos de carbono, componentes de medios indefinidos, tales como hidrolizados de caseína, con o sin un agente gelificante apropiado, tal como una forma de agar, tal como una agarosa o fitagel de bajo punto de fusión. Una variedad de medios de cultivo de tejidos son bien conocidos en la técnica, que cuando se complementan adecuadamente, apoyan el crecimiento y desarrollo del tejido vegetal y son adecuados para la transformación y regeneración de la planta. Ejemplos de dichos medios incluyen, pero sin limitación, Murashige & Skoog ((1962) Physiol Plant 15:473-497), N6 (Chu et al. (1975) Scientia Sinica 18:659), Linsmaier & Skoog ((1965) Physiol Plant 18:100), Uchimiya & Murashige ((1962) Plant Physiol 15:473), medio de Gamborg (Gamborg et al. (1968) Exp Cell Res 50:151), medio D (Duncan et al. (1985) Planta 165:322-332), medio vegetal Woody de McCown (McCown & Lloyd (1981) Planta 165:322-332), Nitsch & Nitsch ((1969) Science 163:85-87), y, Schenk & Hildebrandt (1972 Can J Bot 50:199-204) o derivados de estos medios complementados en consecuencia. Como es bien sabido en la técnica, los medios y los suplementos de medios, tales como nutrientes y reguladores del crecimiento para su uso en la transformación y la regeneración, así como otras condiciones de cultivo, tales como la intensidad de la luz durante la incubación, el pH y las temperaturas de incubación, se pueden modificar u optimizar para la célula, tejido y/o planta de interés particular.

Los expertos en la técnica conocen las etapas normales en el proceso de transformación vegetal. La Ochrobactrum que se utilizará se puede preparar mediante la inoculación de un medio líquido directamente de una solución madre de glicerol o mediante el sembrado en estrías de la bacteria en un medio solidificado de una solución madre de glicerol, permitiendo que la bacteria crezca bajo las condiciones selectivas apropiadas. La Ochrobactrum puede inducirse previamente mediante el crecimiento en condiciones nutricionales o culturales, incluida la presencia de acetosiringona en una cantidad que facilita la transformación. Los expertos en la técnica están familiarizados con los procedimientos para el crecimiento y las condiciones de cultivo adecuadas para las bacterias, así como con los procedimientos de inoculación posteriores. La densidad del cultivo bacteriano utilizado para la inoculación y la relación entre el número de células bacterianas y la cantidad de tejido de explante pueden variar de un sistema a otro y, por lo tanto, se espera la optimización de estos parámetros para cualquier método de transformación.

La siguiente etapa del proceso de transformación es la inoculación. En esta etapa, las plantas, tejidos vegetales o explantes preparados adecuadamente y la suspensión de células bacterianas se mezclan. La duración y el estado de la inoculación y la densidad celular bacteriana variarán dependiendo del sistema de transformación de la planta. El crecimiento o la inoculación de bacterias transformantes puede ocurrir en presencia de acetosiringona u otro inductor conocido de expresión de los genes de virulencia ubicados en los plásmidos Ti o Ri.

Después de la inoculación, se puede eliminar cualquier exceso de suspensión bacteriana y las bacterias y el material vegetal diana se cultivan conjuntamente. El cultivo conjunto se refiere al tiempo posterior a la inoculación y antes de la transferencia a un medio opcional de retraso o selección. Se puede usar cualquier número de medios de cultivo de tejidos vegetales para la etapa de cultivo conjunto. Los tejidos vegetales después de la inoculación con bacterias pueden cultivarse en un medio líquido o semisólido. El cultivo conjunto se realiza normalmente durante aproximadamente uno a cuatro días.

Después del cultivo conjunto con bacterias, los tejidos o explantes vegetales inoculados se pueden colocar opcionalmente directamente en medios selectivos. Alternativamente, después del cultivo conjunto con bacterias, podrían colocarse en medios sin el agente selectivo y posteriormente colocarse en medios selectivos. Los expertos en la técnica conocen las numerosas modificaciones en los regímenes selectivos, los medios y las condiciones de crecimiento que pueden variar según el sistema de la planta y el agente selectivo. Los agentes selectivos normales incluyen, pero sin limitación, antibióticos tal como geneticina (G418), kanamicina o paromomicina, o los herbicidas glifosato, glufosinato o dicamba. Se pueden añadir componentes de medios apropiados adicionales al medio de selección o de retraso para inhibir el crecimiento bacteriano. Dichos componentes del medio pueden incluir, pero sin limitación, antibióticos tales como carbenicilina o cefotaxima.

Los cultivos se transfieren posteriormente a un medio adecuado para la recuperación de plántulas transformadas. Los expertos en la técnica conocen el número de métodos para recuperar plantas transformadas. Se puede implementar y optimizar una variedad de medios y requisitos de transferencia para cada sistema vegetal para la transformación vegetal y la recuperación de plantas transgénicas. Por consiguiente, dichos medios y condiciones de cultivo divulgados o proporcionados en el presente documento se pueden modificar o sustituir con componentes nutricionalmente equivalentes, o procesos similares para la selección y recuperación de eventos transgénicos, y todavía están dentro del alcance de la presente divulgación.

Los transformantes producidos, y su progenie, pueden analizarse posteriormente para determinar la presencia o ausencia de una secuencia particular de interés contenida en el vector de transformación, o un fenotipo molecular producido mediante la administración de una secuencia de interés. Los análisis moleculares pueden incluir, pero sin limitación, transferencias Southern, análisis de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), secuenciación de ácidos nucleicos, análisis de actividades enzimáticas, enfoques inmunodiagnósticos, análisis de expresión de proteínas, análisis de perfiles de expresión, análisis y/o perfiles metabólicos, fenotipificación y evaluaciones de campo. Estos y otros métodos bien conocidos se pueden realizar para confirmar el genotipo, el fenotipo y/o la estabilidad de las células, tejidos, plantas y semillas producidos por los métodos divulgados.

El término planta incluye plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, vástagos, frutos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, protoplastos, tejidos, callo, embriones, así como, flores, vástagos, frutos, hojas, raíces y progenie. Una planta transgénica es una planta transformada actualmente o previamente con un ácido nucleico y, por lo tanto, consiste al menos en parte de células transgénicas. Una parte de la planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido de células vegetales a partir de los que pueden regenerarse plantas, callos de plantas, agrupaciones de plantas y células vegetales que están intactos en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, vainas, tallos, raíces, puntas de raíz y anteras. Las células vegetales incluyen, pero sin limitación, protoplastos y células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y micrósporas. El tejido verde se refiere a aquellas partes de la planta que, cuando se cultivan en condiciones que incluyen un período de luz, contienen clorofila y fotosintetizan. El tejido verde puede incluir tejido regenerativo, tejido calloso y tejido cultivado in vitro, tal como el que contiene estructuras de tipo meristemo de brotes múltiples. Estos tejidos tienen un alto porcentaje de células capaces de división celular sostenida y son competentes para la regeneración durante largos períodos.

Los métodos y composiciones pueden ser adecuados para cualquier planta, incluyendo, pero sin limitación, monocotiledóneas o dicotiledóneas. Las plantas de interés incluyen plantas de cereales que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Los ejemplos de especies vegetales de interés incluyen, pero sin limitación, judías, colza, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente las especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), panizo (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max, Glycine soja), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), brécol, repollo, zanahoria, coliflor, apio, berenjena, hinojo, alubias, rábano, calabacín, puerro, repollo chino, quimbombó, cebolla, guisantes, pimiento, calabaza redonda, espinaca, calabaza, maíz dulce, lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), alubias de lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), melones, sandía, cantalupo (C. cantalupensis) y melón almizclero (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo.

Las coníferas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino tea (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino torcido (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus Petuniahybridaradiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); tsuga de Alberta (Tsuga canadensis); pícea de Sitka (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto blanco (Abies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo del Pacífico (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis).

Ejemplos

Los expertos en la técnica apreciarán las muchas ventajas de los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento. Los siguientes ejemplos proporcionan estudios, métodos y composiciones específicos detallados, sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden hacer muchos cambios en los ejemplos específicos divulgados y aún así obtener un resultado similar o parecido.

Ejemplo 1 - Construcción de plásmidos

El plásmido pVir8 (PHP70365; SEQ ID NO: 106) es un vector de 38,8 kb con genes vir y un ADN-T que se construyó en E. coli utilizando métodos estándar de biología molecular. Tiene dos orígenes (ColE1, pVS1) para una replicación estable en una amplia gama de bacterias, y codifica la resistencia al antibiótico gentamicina. Contiene ~ 27 kb de genes vir del plásmido Ti pTiBo542 hipervirulento y un ADN-T que codifica un marcador de selección bar (gen de resistencia al herbicida bialafos) y un marcador visual de proteína fluorescente roja para plantas. Se aislaron copias de los genes vir a partir del plásmido Ti pTiBo542 (número de registro de Genbank DQ058764 y NC_010929) contenido en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens (Lazo et al. (1991) Biotechnology 10:963-967) usando PCR. Los genes vir incluyen: virA, virJ, virB1-B11, virG, virC1-C2, virD1-D5 y virE1-E3. Se eliminó una secuencia de inserción IS66 entre virA y virJ y una región entre virJ y virB1 para mejorar la estabilidad y reducir el tamaño.

Otras mejoras pueden ser posibles utilizando variantes funcionales o derivados de estos genes vir también. Los productos de p Cr superpuestos se aislaron y ensamblaron. Se incluyó un origen de replicación pBR322 ColEI de 1,2 kb (Bolivar et al. (1977) Gene 2:95-113) para la replicación en E. coli. Se incluyó una versión del origen de replicación pVS1 de amplia gama de hospedadores (Heeb et al. (2000) Molecular Plant-Microbe Interactions 13:232-237) para la replicación estable en una variedad de hospedadores bacterianos. Se incluyó un gen aacC1 que codifica una gentamicina acetil transferasa a partir de Tn1696 para la resistencia a gentamicina (Poteete et al. (2006) BioTechniques 41:261-264). El plásmido RV013684 (SEQ ID 113) es un vector de destino, que sirve como un intermediario de construcción para alterar la composición de ADN-T usando la tecnología de clonación por recombinación Gateway™ y MultiSite Gateway® (Thermo Fisher Scientific Inc.). Este plásmido tiene los sitios de recombinasa Gateway™ ATTR4 y ATTR3 dentro de los bordes derecho e izquierdo del ADN-T. Esto permite reemplazar fácilmente la región de ADN-T con otras construcciones de ADN-T en un vector de tipo de entrada que contiene sitios ATTL4 y ATTL3 flanqueantes.

Varias series de plásmidos adicionales se construyeron de manera similar en un esfuerzo por optimizar el sistema del vector de transformación. Estos incluyeron separar los genes vir y los ADN-T en plásmidos binarios y auxiliares separados, respectivamente, para formar sistemas de "habitación conjunta". También se crearon y probaron diseños "integrados conjuntamente" similares a PHP70365 descritos anteriormente. Se sabe que diferentes orígenes de replicación pueden afectar la frecuencia de eventos de copia única en plantas (Zhi et al., 2015 Plant Cell Report; 34:745-754); por lo tanto, se construyeron y probaron una variedad de orígenes de replicación tanto para plásmidos cohabitantes como cointegradores e incluyeron los que se describen a continuación. Otras mejoras pueden ser posibles utilizando variantes funcionales o derivados de estos u otros orígenes de replicación también.

Se incluyó un ADN-T, que comprendía los siguientes componentes: un borde derecho de octopina con sobreiniciación, el promotor 10 de ubiquitina de Arabidopsis thaliana, la 5'UTR y el intrón1 (GenBank NM_202787) que impulsa la expresión de DsRED2INT, en el que los primeros 363 pb de la secuencia codificante de la proteína fluorescente roja de Discosoma sp. (DsRed, Clontech) se interrumpieron mediante la inserción del ST-LS1 INTRON2 seguido por los últimos 315 pb de DsRed. Se incluyó un gen bar que codifica una fosfinotricina acetil transferasa de Streptomyces hygroscopicus con el uso de codones de soja Glycine max para resistencia al herbicida Basta o Bialafos. Los plásmidos PHP72277, PHD4673 y PHD4674 tenían la misma cadena principal de ADN que PHP70365, pero diferentes casetes de expresión en el ADN-T como se muestra en la Tabla 1A.

El plásmido PHP81185 tenía la misma cadena principal de ADN y casete de expresión que el ADN-T en PHP70365, pero diferentes copias de los genes vir del plásmido Ri de K599 de Agrobacterium rhizogenes como se muestra en la Tabla 1A. La cepa K599 NCPPB2659 de A. rhizogenes se obtuvo de la Colección Nacional de Bacterias Patógenas de Plantas del Laboratorio Central de Ciencias, Sand Hutton, York YO41 1LZ England (www.ncppb.com).

Tabla 1A. Plásmidos

Los vectores cointegradores PHP79752 (BBR1 ORI), PHP79765 (repABC), PHP79767 (PVS1 ORI), PHP81092 (RK2micro), PHP81093 (PSA ORI), PHP81094 (RK2full) y PHP81095 (PSA ORI+PARDE) contenían una cadena principal de ADN y ADN-T idénticos pero un origen de replicación diferente como se muestra en la Tabla 1B. Los vectores auxiliares PHP79077 (repABC), PHP79759 (BBR1 ORI), PHP79760 (RSF1010 ORI), PHP79761 (PVS1 ORI), PHP80398 (RK2micro), PHP80399 (PSA ORI+PARDE), PHP80402 (PSA ORI), PHP80403 (RK2full), PHP80566 (RK2micro+PARDE), RV005393 (RK2full+PARDE) no contenían ADN-T pero una cadena principal de ADN idéntica y diferentes orígenes de replicación como se muestra en la Tabla 1B. Los vectores binarios PHP79763 (BBR1 ORI), PHP79764 (RSF1010 ORI), PHP79766 (repABC), PHP79768 (PVS1 ORI), PHP80404 (RK2full PARDE), PHP80569 (RK2full), RV005199 (PSA ORI), RV005200 (PSA ORI+PARDE) y RV005201 (Rk2micro) contenían una cadena principal de ADN y ADN T idénticos pero diferentes orígenes de replicación como se muestra en la Tabla 1B. Los cuadros vacíos en la Tabla 1B indican que el componente plasmídico no estaba presente.

(continuación)

(continuación)

Ejemplo 2 - Detección de bacterias usando expresión transitoria de DsRED en cultivo en suspensión de BY-2 de tabaco

Las células BY-2 de tabaco fueron proporcionadas por RIKEN BRC a través del Proyecto Nacional de Bio-Recursos del MEXT, Japón. El método de mantenimiento de cultivos en suspensión de BY-2 de tabaco fue descrito esencialmente por Nagata et al. (Int Rev Cytol (1992) 132:1-30) y la expresión transitoria de DsRED se llevó a cabo utilizando el método modificado de células BY-2 en suspensión (Newman et al. (1993) Plant Cell 5:701-714).

A partir de cepas resistentes a gentamicina transformadas con PHP70365, 24 cepas de bacterias mostraron diversos niveles de expresión de DsRED en células BY-2 como se observa bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia Leica.

Ejemplo 3- Extracción de ADN y PCR de ADNr 16S

Se realizaron varios análisis para determinar las especies de Ochrobactrum utilizadas para la transformación vegetal. Primero, se prepararon los ADN genómicos usando el Kit de purificación de ADN MasterPure™ (n.° de Cat. MCD85201, Epibio, Madison, WI, Estados Unidos). Se realizó PCR con un controlador térmico programable PTC-100TM (MJ Research, Inc., San Francisco, CA, Estados Unidos) utilizando ADN genómicos extraídos de 24 bacterias. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron:

SEQ ID NO: 10216S-F 5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'

SEQ ID NO: 10316S-R 5' ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3'

La mezcla de PCR consistió en 5 pl (100-200 ng) de ADN de bacterias, 1,25 pl de MgCb 50 mM, 0,25 pl de ADN polimerasa Taq (5 U/pl, GIBCO BRL, Cleveland), 2,5 pl de 10 x tampón Taq (G iBCO BRL), 0,5 pl de dNTP 10 mM, 0,5 pl de cebadores 10 pM y 15 pl de agua destilada estéril. Las muestras se calentaron a 94 °C durante 1 min, seguido de 30 ciclos a 94 °C (30 segundos), 50 °C (30 segundos), 72 °C (90 segundos) y luego 72 °C durante 10 min. Los productos de la PCR se limpiaron usando la placa MultiScreen® HTS PCR de 96 pocillos (n.° de Cat. MSNU 03010, EMD Millipore, Alemania).

Los productos de la PCR resultantes se secuenciaron por Elim Biopharmaceuticals (Hayward, CA, Estados Unidos) y estas secuencias se utilizaron para buscar en la base de datos de NCBI GenBank. Los resultados principales de la búsqueda BLAST de NCBI GeneBank utilizando 1.318 pb de la secuencia de ADNr 16S de EP1A09 (Se Q ID NO: 105) se muestran en la Tabla 2. Los resultados de búsqueda mostraron que EP1A09 tiene una homología de ADNr 16S muy alta con varias especies de Ochrobactrum (Tabla 2).

T l 2. L 1 m r r l l BLA T N BI nB nk

Ejemplo 4 - Identificación adicional de bacterias mediante secuencia de ADNr 16S, ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) -Tiempo de vuelo (TOF)

En un intento por identificar las especies de EP1A09, se usaron los siguientes métodos: búsquedas detalladas de homología de ADNr 16S de (SEQ ID NO: 104), análisis cromatográfico de gases de ésteres etílicos de ácidos grasos (FAME, por sus siglas en inglés) microbianos extraídos y espectronomía de masas en tiempo de vuelo utilizando desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Estos análisis se llevaron a cabo por MIDI Labs (Newark, DE, Estados Unidos).

El gen ARNr 16S se amplificó por PCR a partir de ADN genómico aislado de colonias bacterianas puras. Los cebadores utilizados son cebadores universales 16S que corresponden a las posiciones 0005F y 0531R. Los productos de amplificación se purificaron del exceso de cebadores y dNTP y se verificó la calidad y cantidad haciendo pasar una porción de los productos en un gel de agarosa. La secuenciación del ciclo de los productos de amplificación de ARNr 16S se llevó a cabo usando ADN polimerasa y química de terminación de colorante. El exceso de terminadores marcados con colorante se eliminó de las reacciones de secuenciación. Las muestras se sometieron a electroforesis en el analizador genético 3130 (User Bulletin n.° 2 (2001) ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems). La secuencia de ADNr 16S de 469 pb de la cepa EP1A09 no coincidía con la biblioteca validada de MIDI Labs, pero en comparación con GenBank dio como resultado una coincidencia de un 99 % a nivel de género con Ochrobactrum anthropi como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Resultados de búsqueda de GenBank con secuencia de ADNr 16S de la cepa EP1A09 (informe de coincidencia de ADN D16M2 or MIDI Labs

Los análisis de ácidos grasos (FAME) se realizaron utilizando un sistema analítico de cromatografía de gases de acuerdo con los procedimientos estándar de MIDI Labs (Sasser (1990) en Methods in Phytobacteriology, eds. Klement et al., págs. 199-204, Adademiai, Kiado, Budapest; Norman & Yuen (1998) Can J Plant Pathol 20:171-175) y los resultados mostraron que el nivel de especie coincide con O. anthropi, que es la única especie de Ochrobactrum en la biblioteca FAME en MIDI Labs (Tablas 4).

Tabla 4A. Análisis FAME de EP1A09

continuación

Tabla 4B. Análisis FAME de EP1A09

MALDI-TOF se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar (Bizzini et al. (2010) J Clin Micro 5:1549-1554) y los resultados mostraron coincidencia de nivel de especie con O. grignonense de una biblioteca MALDI-TOF de MIDI Labs que contiene múltiples cepas de O. anthropi, O. gallinifaecis, O. grignonense, O. intermedium, Ochrobactrum sp. y O. tritici (Tabla 5). Las puntuaciones para cada coincidencia se evaluaron utilizando el valor de puntuación clave.

Tabla 5A. Coincidencias del análisis MALDI-TOF

T l B. R f r n i n i n r n li i MALDI-T F

Ejemplo 5 - Ensamblajes del genoma y caracterización de aislados de Ochrobactrum mediante estimaciones de divergencia evolutiva entre secuencias de ARNr 16S

Se construyeron proyectos de ensamblajes genómicos para la nueva cepa de Ochrobactrum junto con varias cepas de recolección de cultivo de Ochrobactrum con identidades conocidas (Tabla 6). El ADN genómico se preparó de acuerdo con un protocolo de construcción de biblioteca desarrollado por Illumina y secuenciado usando el Illumina MiSeq. En resumen, después de que el ADN genómico se corta con un instrumento Covaris S220, los fragmentos de ADN resultantes se repararon por el extremo y sus extremos 3' se trataron para la adición de la base A. Después de la unión de los adaptadores específicos de Illumina y la selección del tamaño basada en gel, los fragmentos de ADN unidos al adaptador se sometieron a una amplificación limitada mediante PCR con cebadores de PCR específicos de Illumina. La generación de complejos y la secuenciación de ambos extremos de los fragmentos de ADN amplificados se realizaron en un Illumina MiSeq, de acuerdo con las instrucciones de Illumina. Se cargó una única cubeta de lectura con los fragmentos de ADN de la cepa. Se generaron secuencias y puntuaciones de calidad con el programa informático en fase de desarrollo Illumina para análisis de imágenes y tipificación de bases. Después de la tipificación y el procesamiento de la base inicial, los archivos de secuencia generados por los productos en fase de desarrollo Illumina se convirtieron al formato FASTQ y se realizó un filtrado de calidad personalizado adicional, de modo que las lecturas se recortaron si albergaban una o más bases en su extremo 3' con una puntuación de calidad < 15. Las lecturas de ambos extremos de Illumina (2x150 pb) se ensamblaron con SPAdes 3.1.1 (Bankevich et al. (2012) J Comp Biol 19:455-477) utilizando los valores predeterminados de kmer. Además, la corrección de errores de lectura y la corrección de emparejamiento incorrecto/INDEL bajo se realizó con las opciones en fase de desarrollo SPAdes. Los contigs ensamblados menores de 500 pb se eliminaron de la salida final.

Tabla 6. Ce as secuenciadas

El número de diferencias de bases por secuencia entre secuencias en la alineación CLUSTALW y los análisis evolutivos se realizaron en MEGA6 (Tamura et al. (2013) Mol Biol Evol 30:2725-2729). El porcentaje de identidad se calculó dividiendo el número de diferencias entre cada par de secuencias por 1.337 pb de ADNr 16S (Tablas 7-9).

Tabla 7. Estimaciones de diver encia^ evolutiva % entre secuencias de ARNr 16S

Tabla 8. Nombres de or anismos enumerados en la Tabla 7

Tabla 9. Estimaciones de diver encia evolutiva % entre EP1A09 otras secuencias de ARNr 16S

Ejemplo 6 - Tipificación de secuencia multilocus de cepas de Ochrobactrum

El análisis de secuencia multilocus (MLSA, por sus siglas en inglés) de cepas de Ochrobactrum se llevó a cabo utilizando el esquema descrito por Romano et al. 2009. Estos son los siete loci utilizados para el esquema del MLSA:

(1) >gi|256809827|gb|ACV31014.1| corismato sintasa, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188];

(2) >gi|256809699|gb|ACV30950.1| proteína de choque térmico de 70 kDa, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188];

(3) >gi|256809647|gb|ACV30924.1| gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188];

(4) >gi|256809455|gb|ACV30828.1| proteína de membrana externa de 25 kDa, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188];

(5) >gi|256809287|gb|ACV30744.1| recombinasa A, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188];

(6) >gi|256809135|gb|ACV30668.1| subunidad beta de ARN polimerasa dependiente de ADN, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188]; y

(7) >gi|256808991|gb|ACV30596.1| antranilato sintasa, parcial [Ochrobactrum anthropi ATCC 49188].

La historia evolutiva se infirió usando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo Tamura-Nei (Tamura y Nei (1993) Mol Biol Evol 10:512-526). El árbol de consenso bootstrap inferido de 100 réplicas se tomó para representar la historia evolutiva de los taxones analizados (Felsenstein (1985) Evolution 39:783-791). Las ramas correspondientes a particiones reproducidas en menos de un 50 % de réplicas de bootstrap se colapsaron. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de bootstrap (100 repeticiones) se mostró junto a las ramas. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas usando el enfoque de máxima verosimilitud compuesta (m Cl , por sus siglas en inglés), y luego seleccionando la topología con un valor de probabilidad de registro superior. El análisis implicó 42 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1a 2a 3a No codificante. Se eliminaron todas las posiciones que contienen huecos y falta de datos. Hubo un total de 3456 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA6 (Tamura et al. (2013) Mol Biol Evol 30:2725-2729). El árbol final se dibujó con el programa FigTree (disponible en línea en tree-dot-bio-dot-ed-dotac-dot-uk/software/figtree/) como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B. Este árbol filogenético resultante demuestra que el EP1A09 aislado es una nueva especie de Ochrobactrum. Este nuevo aislado, EP1A09, se depositó en 07/10/015 con el número de registro NRRL B-67078 en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola (NRRL, por sus siglas en inglés) y se nombró Ochrobactrum haywardense H1.

Ejemplo 7 - Transformación estable del tabaco

La transformación del disco de la hoja de tabaco se realizó esencialmente según lo descrito por Gallois y Marinho (Methods Mol Biol (1995) 49:39-48). Las plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv Petite Havana SRI, n.° de catálogo NT-02-20-01, Lehle Seeds, Round Rock, TX) se cultivan asépticamente en el recipiente de polipropileno estéril (n.° de catálogo 0701, International Container Corp, Severn, MD) que contiene medio de Murashige y Skoog (MS) de resistencia media con sacarosa al 1,5 % y gelrita al 0,3 % bajo 16 horas de luz (80-110 pE/m2/s de lámparas fluorescentes blancas frías) a 24 °C in vitro. Los tallos con un nodo se cortaron de las plántulas cultivadas y luego se transfirieron a MS fresco de media resistencia cada 4-6 semanas en las mismas condiciones ambientales.

Los cultivos en fase logarítmica de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, con y sin el vector de transformación vegetal PHP70365, se centrifugaron a 1.500 xg durante 10 minutos y el sedimento celular de Ochrobactrum se diluyó luego a una DO600 nm de 0,5 con medio de cultivo conjunto líquido compuesto de medio MS ( pH 5,2) con 2 mg/l de N6-benciladenina (BA), glucosa al 1 % y acetosiringona 200 pM. Se obtuvieron discos de hojas de plantas de tabaco de 3-4 semanas de edad cultivadas in vitro. Las hojas de tabaco estériles se cortaron de las plantas y se remojaron en 20 ml de EP1A09 (DO = 0,5) (Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078) en medio de cultivo conjunto líquido en placas Petri de 100 x 25 mm durante 5 min. Las hojas se cortaron luego en segmentos de 3 x 3 mm y las piezas de las hojas se sumergieron completamente en 20 ml de Ochrobactrum durante 5 minutos. Los segmentos de las hojas se transfirieron a papel de filtro esterilizado en autoclave, luego se incubaron en un medio de cultivo conjunto sólido compuesto por medio MS (pH 5,2) con 2 mg/l de BA, glucosa al 1 %, acetosiringona 200 pM y Phytoagar (n.° de catálogo A175, PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS) bajo 16 horas de luz (80-110 pE/m2/s, lámparas fluorescentes blancas frías) a 24 °C. Después de 3 días de cultivo conjunto, se transfirieron 20 segmentos de hoja/placa a medio de inducción de brotes compuesto por medio sólido MS (pH 5,7) con 2 mg/l de BA, sacarosa al 3 %, gelrita al 0,3 %, 3 mg/l de bialafos y 250 pg/ml de Cefotaxima. Los niveles de expresión para la proteína fluorescente DsRED se observaron bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia Leica (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con un conjunto de filtros para excitación a 530-560 nm y emisión a 590 650 nm. Se observaron expresiones transitorias de focos DsRED después de tres días de cultivo conjunto y se observaron callos resistentes a bialafos y yemas de brotes que expresaban DsRED estable tres semanas después de la transformación (Figura 2B). Los callos y brotes resistentes a Bialafos se transfirieron a medio nuevo de inducción de brotes para la propagación del brote y los resultados se visualizan con expresión de DsRED siete semanas (Figura 2D) después de la transformación. La Figura 2D demostró que Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, que comprende además PHP70365, puede transformar de manera estable las plantas de tabaco.

El callo de algodón se inició a partir de Coker 312 y se transformó con cultivos de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que albergaban PHP72477.

Ejemplo 8 - Transformación de semi-semilla de soia

La transformación de la soja se realizó esencialmente según lo descrito por Paz et al. ((2006) Plant Cell Rep 25:206-213) y la Patente de Estados Unidos 7.473.822. Las semillas maduras de las líneas de soja se esterilizaron en superficie durante 16 horas usando gas cloro, producido mediante la mezcla de 3,5 ml de HCl 12 N con 100 ml de blanqueador comercial (hipocloruro de sodio al 5,25 %), según lo descrito por Di et al. ((1996) Plant Cell Rep 15:746-750). Las semillas desinfectadas se remojaron en agua destilada estéril a temperatura ambiente durante 16 horas (100 semillas en una placa de Petri de 25x100 mm). Las composiciones de diversos medios de cultivo utilizados para la transformación de semi-semillas de soja y la regeneración de plantas se resumen en la Tabla 10.

Se añadió a las semillas empapadas un volumen de 10 ml de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que contenía además la suspensión del vector PHP70365 (SEQ ID NO: 106) a DO600 = 0,5 en medio de infección que contenía acetosiringona 300 pM. Luego, las semillas se dividieron cortando longitudinalmente a lo largo del hilio para separar los cotiledones, y las capas de semillas, los brotes primarios y los ejes embrionarios se eliminaron en la suspensión de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, generando así explantes de semisemilla. Los explantes de semi-semilla se colocaron con el lado plano hacia abajo en una placa profunda con 4 ml de medio fresco de Ochrobactrum/infección sin superposición de cotiledones. Las placas se sellaron con parafilm ("Parafilm M" VWR n.° de cat. 52858), luego se sonicaron (Sonicator-VWR modelo 50T) durante 30 segundos. Tras la sonicación, los explantes de semi-semilla se transfirieron a una sola capa de papel de filtro esterilizado en autoclave (VWR n.° 415/n.° de catálogo 28320-020) en medio sólido de cultivo conjunto (18-22 explantes por placa; lado plano hacia abajo). Las placas se sellaron con cinta Micropore (n.° de catálogo 1530-0, 3M, St. Paul, MN) y se incubaron bajo luz tenue (5-10 pE/m2/s, lámparas fluorescentes blancas frías) durante 16 horas a 21 °C durante 5 días.

Después del cultivo conjunto, los explantes de semi-semilla se lavaron en medio líquido de inducción de brotes (SI, por sus siglas en inglés) una vez que los explantes se cultivaron en medio solidificado de inducción de brote con agar al 0,7 % en ausencia de selección. La base del explante (es decir, la parte del explante de donde se extrajo el eje embrionario) estaba incrustada en el medio, mirando hacia arriba. La inducción del brote se llevó a cabo en una incubadora biológica Percival a 24 °C con un fotoperíodo de 18 horas y una intensidad de luz de 130-160 pE/m2/s. Después de 14 días, los explantes se transfirieron a medio fresco de inducción de brotes que contenía 3 mg/l de bialafos. Los explantes de semi-semilla se transfirieron a medio fresco cada dos semanas. Después de cuatro semanas de cultivo en medio de inducción de brotes, los explantes se transfirieron al medio de alargamiento de brotes (SE, por sus siglas en inglés) que contenía 5 mg/l de bialafos (Tabla 10). Seis a diez semanas después, se aislaron brotes alargados (> 1-2 cm) y se transfirieron al medio de enraizamiento (Tabla 10) que contenía 1 mg/l de bialafos.

La expresión transitoria de DsRED en explantes transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 se obtuvo cinco días después del cultivo conjunto, pero los explantes de soja transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 vacío (vector) no mostraron ninguna expresión de DsRED (Figura 3B). Se observaron brotes positivos para DsRED en cultivariedades de élite Jack y DuPont Pioneer 2-3 semanas después de la transformación con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 (PHP70365) en el medio de iniciación del brote que contiene bialafos 3 mg/l (Figura 4B). Se observaron brotes positivos para DsRED transformados de forma estable de 1-2 cm de tamaño 10-12 semanas después de la transformación con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, que comprende además PHP70365 (Figura 4C-Figura 4G) y pudieron enraizarse con éxito (Figura 4H-Figura 4I). Estas plántulas T0 se transfirieron posteriormente al suelo (Figura 4J).

Las eficacias de transformación de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 en cultivariedades de soja de élite DuPont Pioneer se resumen en la Tabla 11. Se recuperaron brotes positivos para DsRED a un promedio de 1,6 por 100 cotiledones infectados. Alrededor del 70 % de estas plantas positivas para DsRED se enraizaron con éxito en el medio de enraizamiento de bialafos.

Los extractos brutos se prepararon a partir de los tejidos foliares de los eventos de soja positivos para DsRED y resistentes a bialafos transformados con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 utilizando morteros de sedimento (n.° de cat. Nalge Nunc International, Rochester, NY, Estados Unidos) en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Se colocó una tira de AgraStrip® LL (n.° de cat, 7800019, Romer Labs Inc, Union, MO, Estados Unidos) en cada muestra de extracción y se dejó que se desarrollara durante 2-10 minutos. Todos los eventos positivos para DsRED dieron una reacción positiva en la prueba AgraStrip® LL que indica la expresión del gen bar, mientras que una planta de control sin transformar (TS) mostró un resultado negativo (sin expresión del gen bar).

Tabla 11. Eficacias de transformación estables de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que com rende además PHP70365 en cultivariedades de soa de élite DuPont Poneer.

Ejemplo 9 - Fenotipos de plantas y segregaciones de semillas T1 de soja transgénica

Las plántulas transgénicas transformadas con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 se transfirieron a gránulos de turba Jiffy-7 humedecidos (Jiffy Products Ltd, Shippagan, Canadá), y se mantuvieron encerrados en cajas de bandejas de plástico transparente hasta que se aclimataron en la incubadora Percival en condiciones de fotoperíodo de 16 horas a 60-100 |jE/m2/s, temperaturas de 26 °C/24 °C día/noche (Figura 4J). Las plántulas endurecidas se colocaron en macetas de 2 galones que contenían la mezcla de propagación SunGro 702 humedecida (770 Silver Street, AGAWAM, MA 01001) y se cultivaron hasta la madurez para la cosecha en un invernadero. Cinco de las plantas transgénicas parecían ser morfológicamente normales, mientras que una estaba atrofiada posiblemente debido a la sobreexpresión de DsRED. Se observaron signos de toxicidad DsRED o de regeneración reducida o efectos fenotípicos con las plantas de soja transgénicas que sobreexpresan DsRED in vitro y en invernadero, en comparación con las plantas de tipo silvestre no transformadas. Se recolectaron tejidos foliares de plantas T0 en el invernadero y se realizaron análisis de qPCR para determinar los números de copias de transgenes en ADN-T (RB-ATUBQ10:DsRED:PINII Term-GMUBQ:BAR GMOT:UBQ14Term-LB) de PHP70365. Cuatro (números de evento 277793891, 279161306, 279161388 y 278728430) de cinco eventos T0 contenían una sola copia de los casetes de expresión DsRED y BAR de ADN-T de PHP70365 (Tabla 12), el evento 274749446 tenía más de una copia de algunos de las secuencias introducidas.

Tabla 12. Número de copias de transgenes en plantas de soja T0 transgénicas transformadas con Ochrobactrum h w r n H1 D i NRRL B- 7 7 m r n m PHP7 m i n n li i P R.

Las cinco plantas T0 florecieron normalmente y produjeron semillas T1. Las semillas T1 de estos cinco eventos exhibieron una fuerte expresión de DsRED bajo microscopía de fluorescencia y luz ambiental. Las proporciones observadas de DsRED que expresan y que no expresan las semillas T1 de 5 eventos transgénicos fueron 391:146, 162:48, 98:26, 119:49 y 170:66, respectivamente, que son consistentes con una proporción de segregación mendeliana 3:1 para un gen dominante en un solo locus (Tabla 13).

Tabla 13. Número de semillas T1 recogidas y segregación DsRED a partir de plantas de soja transgénicas r n f rm n hr r m h w r n H1 D i NRRL B- 7 7 m r n m PHP7 .

Ejemplo 10 - Transformación de soja

Las semillas secas maduras se desinfectaron usando gas de cloro y se embebieron en medio semisólido que contenía 5 g/l de sacarosa y 6 g/l de agar a temperatura ambiente en oscuridad. Después de incubación durante la noche, la semilla se remojó en agua destilada durante 3-4 horas adicionales a temperatura ambiente en oscuridad. El eje embrionario intacto se aisló del cotiledón usando una cuchilla de bisturí. La transformación del eje embrionario mediada por Ochrobactrum se llevó a cabo utilizando los protocolos descritos en el Ejemplo 9. La expresión transitoria de DsRED en la región del meristemo del eje embrionario transformada con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 se observó 3-4 días después del cultivo conjunto. Se observaron primordios de brotes y callos positivos para DsRED en la región del meristemo 2-3 semanas después de la transformación con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 en el medio de iniciación del brote que contiene bialafos 3 mg/l (Figura 5B). Se produjeron brotes positivos para DsRED transformados de forma estable de 1-1.5 cm de tamaño en 6-8 semanas después de la transformación con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 (Figura 5D).

Ejemplo 11 - Cepas alternativas de Ochrobactrum para transformar células vegetales

Dieciséis cepas de Ochrobactrum eran de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania) y se obtuvieron 2 cepas del Dr. Tamas Torok, Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley, CA) como se muestra en la Tabla 14 y las cepas se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Las 16 cepas fueron susceptibles a gentamicina a 100 mg/l, pero solo 8 cepas (Ochrobactrum cytisi, O. daejeonense, O. lupine, O. oryzae, O. pecoris, y O. tritici, LBNL124-A-10 y HTG3-C-07) se transformaron con PHP70365 con selección de gentamicina después de la electroporación. Estas 8 cepas y la Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 se probaron por su capacidad para transformar genéticamente las células BY-2 de tabaco (usando PHP72277 que tiene un casete de expresión YFP) y semi-semilla de soja (usando PHP70365 que tiene un casete DsRED). Además de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, O. cytisi y O. pecoris fueron capaces de transformar células BY-2 (Tabla 14) y explantes de soja (Figura 6). O. daejeonense, O. lupine, O. oryzae, y O. tritici también fueron capaces de transformar las células BY-2 de tabaco, pero sus eficacias de transformación fueron significativamente (10-50 veces) más bajas que Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078, O. cytisi y O. pecoris. En la Tabla 14, "X" señala que no se obtuvieron colonias transformadas con el plásmido PHP70365. "O" señala que se obtuvieron colonias transformadas con el plásmido PHP70365. "ND" señala no determinado. Más mostró una mayor expresión de proteína fluorescente transitoria.

Tabla 14. Ce as de Ochrobactrum

continuación

Ejemplo 12 - Transformación de Arabidopsis

Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además el plásmido PHD4673 como se describe en el Ejemplo 3 se inoculó en 50 ml de medio líquido LB que contenía gentamicina 100 mg/l y se cultivó a 28 °C, 250 rpm durante 18-24 horas. Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además cultivos de PHD4673 se centrifugó a 4.000 rpm, 20 °C durante 15 minutos y los sedimentos se resuspendieron en 75 ml de sacarosa recién preparada al 5 % con tensioactivo Silwet L-77 al 0,02 % (v/v) (Helena Chemical Company 225 Schilling Blvd. Collierville, TN 38017). La transformación de Arabidopsis thaliana Col-0 se llevó a cabo utilizando un método de inmersión floral modificado (Clough & Bent (1998) Plant J 16:735-743). Después de la inmersión floral con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHD4673, se permitió que las plantas crecieran en la cámara de crecimiento de plantas a 21 °C, fotoperíodo de 16 horas a 60-100 pE/m2/s y las semillas se recogieron después de que las vainas se volvieran marrones. Las semillas se esterilizaron en superficie bajo una campana laminar con etanol al 95 % durante 1 minuto, lejía al 20 % más una gota de Tween-20 durante 15 minutos y se lavaron 3 veces con agua estéril. Se sembraron 30 mg de semilla esterilizada en el medio de selección de agar compuesto con 1x sales MS con vitaminas, sacarosa al 1 % (pH 5,7), agar TC al 0,8 %, 100 mg/l de Timentin y 50 mg/l de kanamicina en placas de Petri de 150 x 25 mm (n.° de cat. 351013, Falcon Large Petri Dishes, VWR). Las placas se secaron bajo flujo laminar y se sellaron con parafilm y se cultivaron a 21 °C durante 16 horas con fotoperíodo a 60-100 pE/m2/s para germinación y crecimiento. 9 días después de la selección en medio de kanamicina 50 mg/l, se contaron los supuestos eventos que germinan y se ponen verdes y se observó expresión de DsRED bajo el microscopio fluorescente. Las eficacias de transformación que muestran resistencia a kanamicina y plántulas germinadas positivas para DsRED variaron un 0,53 -1 % y las eficacias de transformación promedio fueron un 0,77 % (Tabla 15). La resistencia a kanamicina y las plántulas germinadas positivas para DsRED se trasplantaron al suelo para un mayor crecimiento y análisis.

Tabla 15. Eficacias de transformación que muestran semillas de Arabidopsis resistentes a kanamicina y positivas para DsRED transformadas con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además

PHD4673.

continuación

Ejemplo 13 - Expresión transitoria en disco de hoja de sorgo

Ochrobactrum Haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 vacía (sin vector) y Ochrobactrum Haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHD4674 cultivados durante la noche se centrifugaron a 4.000 rpm, 20 °C durante 20 min y los sedimentos se resuspendieron en MgSO4 10 mM con acetosiringona 400 pM ajustando la densidad celular estrechamente a 1,0 a DO 600. Las plantas Sorghum bicolor DuPont Pioneer TX430 se cultivaron en cámaras de crecimiento con 16 h de luz a 375-450 pE/m2/s, 26 °C día y 22 °C noche. La infiltración se realizó según lo descrito por Kapila et al. (Plant Sci (1997) 122:101-108) y Siehl et al. (Plant Physiol (2014) 166: 1162-76.). Las hojas de las plantas de sorgo de 5 semanas de edad se infiltraron con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 vacía y Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 (PHD4674) para la expresión transitoria de DsRED y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia Leica a los 4 días después de la infiltración (ddi). La expresión de DsRED se observó en hojas de sorgo infiltradas con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que además comprendía PHD4674 pero no con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 vacía. La primera confirmación de la expresión exitosa de DsRED se detectó 4 días después de la infiltración (ddi) mediante microscopía de fluorescencia, pero la cuantificación se retrasó hasta 7 ddi para permitir una mayor acumulación del producto génico. La cuantificación de DsRED se realizó en todas las muestras tratadas por GE Typhoon Trio (generador de imágenes en modo variable) GE Healthcare Bio-Sciences, P.O. Box 643065 Pittsburgh, PA 15264/-3065. Antes del escaneo, los extractos se filtraron para detectar restos celulares y se normalizaron mediante el ensayo de Bradford a 150 pg de proteína soluble total en un volumen final de 100 pl de tampón CCLR/por muestra medida, luego se analizó el escaneo final mediante el programa informático de análisis de imagen ImageQuantTL (GE Healthcare Bio-Sciences, P.O. Box 643065 Pittsburgh, PA 15264-3065). Los promedios de la unidad fluorescente relativa del extracto de hoja de sorgo infiltrado con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprendía además PHD4674 fueron 3,5-23 veces más altos que los de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 vacía. Los resultados mostraron claramente que O. haywardense H1 que comprende además PHD4674 puede administrar ADN y expresarse en células de sorgo.

Tabla 16. Expresión relativa de DsRED de los extractos de hojas de sorgo infiltradas con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 vacía y Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprendía además PHD4674. Se incluyeron 12-18 muestras de hojas para las unidades fluorescentes relativas en cada tratamiento.

Ejemplo 14 - Comparación de PHP70365 (construcción Ti vir) frente a PHP81185 (construcción Ri vir)

Las transformaciones de soja se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 10. La expresión transitoria de DsRED en la región del meristemo del eje embrionario transformada con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende PHP70365 o PHP81185 se observó 7 días después del cultivo conjunto. Los explantes infectados con ambas construcciones mostraron niveles iguales de expresión transitoria de DsRed. Se produjeron brotes positivos para DsRED transformados de forma estable de 1-1,5 cm de tamaño 6-8 semanas después de la transformación con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 o PHP81185. Las eficiencias de transformación estables con Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que comprende además PHP70365 o PHP81185 fueron similares a las mostradas en la Tabla 17.

Tabla 17. Eficacias de transformación estables de Ochrobactrum haywardense H1 Depósito NRRL B-67078 que com rende además PHP70365 SEQ ID NO: 106 o PHP81185 SEQ ID NO: 114

Ejemplo 15- Comparación de varios orígenes de replicón en sistemas de vector de integración conjunta y habitación conjunta

Los vectores de integración conjunta y las combinaciones de vectores auxiliares y binarios enumerados en la Tabla 1B y la Tabla 18 se introdujeron en Ochrobactrum haywardense H1 y la expresión transitoria de la proteína fluorescente roja (RFP) se llevó a cabo utilizando el método modificado de células en suspensión BY-2 de tabaco como se describe en el ejemplo 2. Se observaron expresiones de RFP bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia Leica 7 días después de la infección. Los plásmidos que muestran la expresión de RFP en células BY-2 de tabaco se resumen en la Tabla 18.

Los vectores de integración conjunta PHP79762 (BBR1 ORI), PHP79767 (PVS1 ORI) y PHP81092 (RK2micro) son isogénicos para pVir 8, excepto por el origen de la replicación. El origen de replicación se indica en () después de cada plásmido PHP. Todos estos vectores mostraron expresión transitoria de RFP. Todos los orígenes de replicación anteriores fueron funcionales para la transformación de la planta.

A continuación, independientemente del número de plásmido PHP, los plásmidos auxiliares son isogénicos aparte del origen de replicación. Asimismo, los vectores binarios son isogénicos aparte del origen de replicación. El origen de replicación se indica en () después de cada plásmido PHP. Las siguientes combinaciones del sistema de vector de habitación conjunta, (1) el plásmido auxiliar PHP79759 (BBR1 ORI) con vectores binarios PHP79763 (BBR1 ORI), RV005199 (PSA ORI), PHP79768 (PVS1 ORI), PHP79766 (repABC), PHP80569 (Rk2full) y PHP80404 (RK2full+PARDE), (2) el plásmido auxiliar PHP80402 (PSA ORI) con vectores binarios PHP80569 (RK2full) y PHP80404 (RK2full+PARDE), (3) el plásmido auxiliar PHP80399 (PSA ORI+PARDE) con vectores binarios PHP79768 (PVS1 ORI), PHP79766 (repABC), PHP80569 (Rk2full) y PHP80404 (RK2full+PARDE), (4) el plásmido auxiliar PHP79761 (PVS1 ORI) con vectores binarios RV005199 (PSA ORI), PHP79768 (PVS1 ORI), PHP79766 (repABC), PHP79764 (RSF1010 ORI), PHP80569 (Rk2full) y PHP80404 (RK2full+PARDE), (5) el plásmido auxiliar PHP79760 (RSF1010 ORI) con vectores binarios RV005199 (PSA ORI), PHP79768 (PVS1 ORI), PHP79766 (repABC), PHP79764 (RSF1010 ORI) y PHP80404 (RK2full+PARDE), (6) el plásmido auxiliar RV005393 (RK2full+PARDE) con vectores binarios RV005199 (PSA ORI), PHP79768 (PVS1 ORI) y PHP79766 (repABC), (7) el plásmido auxiliar PHP80398 (RK2micro) con vectores binarios RV005199 (PSA ORI), PHP79766 (repABC) y RV005201 (RK2micro), y (8) el plásmido auxiliar PHP80566 (RK2micro+PARDE) con el vector binario p Hp 79768 (Pv S1 ORI), todos mostraron varios niveles de expresión de RFP. Todos los orígenes de replicación enumerados anteriormente fueron funcionales para la transformación de la planta.

Tabla 18. Origen del replicón que muestra la expresión transitoria de RFP en células BY-2 de tabaco transformadas con la cepa H1 de Ochrobactrum haywardense que alberga vectores de integración conjunta o habitación conjunta (auxiliares con binarios). Los cuadros vacíos en la Tabla 18 indican que el componente plasmídico no estaba resente.

(continuación)

(continuación)

Ejemplo 16: Transformación de plantas con Ochrobactrum

La transformación con Ochrobactrum también puede usarse para la mejora genética de las plantas. La transformación aleatoria mediada por Ochrobactrum puede usarse para administrar casetes de expresión que contienen genes de interés en un vector binario de ADN-T con o sin plásmidos auxiliares. El material vegetal útil en estas transformaciones aleatorias puede ser plantas dicotiledóneas que incluyen, pero sin limitación, girasol, Arabidopsis, cártamo, soja, alfalfa, colza, Brassica, y algodón o plantas monocotiledóneas que incluyen, pero sin limitación, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, sorgo, mijo y caña de azúcar.

Ejemplo 17: Integración específica del sitio con Ochrobactrum

La transformación con Ochrobactrum como se divulga en el presente documento puede usarse para la localización de genes específicos del sitio mediada por recombinasas. La transformación con Ochrobactrum puede usarse para crear líneas que contienen uno o más sitios de recombinación no idénticos para proporcionar un locus diana. La transformación con Ochrobactrum se puede usar luego para la integración específica del sitio (SSI, por sus siglas en inglés) en el locus diana para permitir la administración de un casete de transferencia que contenga una o más construcciones como se describe en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/296639.

Ejemplo 18: Modificación del genoma mediada por nucleasa con Ochrobactrum

La transformación con Ochrobactrum como se divulga en el presente documento puede usarse para realizar modificaciones genómicas mediadas por nucleasas CRISPR-Cas. Los métodos para realizar modificaciones genómicas mediadas por nucleasas CRISPR-Cas se describen en los documentos WO 2013/141680, US 2014/0068797 y WO 2015/026883.

Ejemplo 19: Orígenes de replicación (Ori) alternativos con transformación con Ochrobactrum para mejorar modificaciones del genoma mediadas por SSI, nucleasas CRISPR-Cas9 y endonucleasas utilizando casetes de transferencia y/o plásmidos auxiliares con diferentes orígenes de replicación

La transformación con Ochrobactrum usando vectores con diferentes Oris puede usarse para mejorar la edición del genoma SSI y CRISPR-Cas9. Los métodos para realizar modificaciones genómicas mediadas por nucleasas CRISPR-Cas se describen en los documentos WO 2013/141680, US 2014/0068797 y WO 2015/026883. Los casetes de transferencia con diferentes Oris bacterianos que dan como resultado números variados de copias de plásmidos que incluyen, pero sin limitación, RepABC, pRi, pVS1, RK2 pueden usarse para modular la cantidad de moléculas de ADN administradas a la célula vegetal utilizada en la edición del genoma SSI y CRISPR-Cas9. Alternativamente, los casetes de transferencia que albergan diferentes Oris se pueden combinar con plásmidos auxiliares que transportan genes de virulencia adicionales. Estos plásmidos auxiliares pueden tener diferentes orígenes de replicación bacterianos (Tabla 1B), con un número variado de copias de plásmidos.

EJEMPLO 20: NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA (SEQ ID NO:)

Tabla 19.

(continuación)

(continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una Ochrobactrum haywardense HI aislada, en donde dicha Ochrobactrum se deposita bajo el NRRL B-67078.

2. La Ochrobactrum de la reivindicación 1, que comprende un vector en enlace operativo que comprende:

a. un primer ácido nucleico que comprende una región génica vir, en donde la región génica v iractúa para introducir un ácido nucleico que codifica una secuencia de interés en una célula vegetal de una manera dependiente de VirD2; y

b. un segundo ácido nucleico que comprende una o más secuencias borde de ADN-T unidas operativamente a una secuencia de interés.

3. La Ochrobactrum de la reivindicación 2, en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están:

(a) en una sola molécula polinucleotídica; o

(b) en moléculas polinucleotídicas separadas;

y/o que comprende además un gen marcador de selección; preferentemente en donde el gen marcador de selección proporciona resistencia a gentamicina, neomicina/kanamicina, higromicina o espectinomicina; y/o en donde el gen marcador de selección es un gen aacCI, un gen nptl, un gen npt2, un gen hpt, un gen SpcN, un gen aph o un gen aadA; más preferentemente en donde:

(i) dicho gen aacCI tiene la SEQ ID NO: 1, o variantes y fragmentos de la misma;

(ii) dicho gen aadA tiene la SEQ ID NO: 39, o variantes y fragmentos de la misma;

(iii) dicho gen npt1 tiene la SEQ ID NO: 40, o variantes y fragmentos de la misma;

(iv) dicho gen npt2 tiene la SEQ ID NO: 41, o variantes y fragmentos de la misma; o

(v) dicho gen hpt tiene la SEQ ID NO: 67, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o en donde el gen marcador de selección:

(vi) no es un gen marcador de selección de tetraciclina;

(vii) no es un gen tetAR; o

(viii) es un gen contramarcador de selección; preferentemente en donde el gen contramarcador de selección es un gen sacB, un gen rpsL (strA), un gen pheS, un gen dhfr (folA), un gen lacY, un gen Gata-1, un gen ccdB o un gen thyA;

y/o en donde la región génica vir comprende:

(a) genes de virulencia de Rhizobiaceae virB1-B11 que tienen las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virB1-B11 que tienen las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virB1-B11 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(b) genes de virulencia de Rhizobiaceae virC1-C2 que tienen las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virC1-C2 que tienen las SEQ ID NOS: 92-93, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virC1-C2 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(c) genes de virulencia de Rhizobiaceae virD1-D2 que tienen las SEQ ID NO: 18-19, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virD1-D2 que tienen las SEQ ID NO: 94-95, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virD1-D2 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(d) un gen de virulencia de Rhizobiaceae virG que tiene la SEQ ID NO: 15 o variantes y derivados de la misma o un gen de virulencia r-virG que tiene la SEQ ID NO: 91 o variantes y derivados de la misma, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virG comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(e) uno o más genes de virulencia de Rhizobiaceae virA, virD3, virD4, virD5, virEI, virE2, virE3, virH, virHI, virH2, virK, virL, virM, virP, virQ, r-virA, r-virD3, r-virD4, r-virD5, r-virE3, o r-virF o variantes y derivados de los mismos, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virA, r-virD3, r-virD4, r-virD5, r-virE3, o r-virF comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma; preferentemente:

(i) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae es virA que tiene la SEQ ID NO: 26 o variantes y derivados o un gen de virulencia r-virA que tiene la SEQ ID NO: 79 o variantes y derivados de la misma, en donde el vector que comprende el gen de virulencia r-virA comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(ii) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virD3-D5 tienen, respectivamente, las SEQ ID NO: 20 22, o variantes y derivados de las mismas o los genes de virulencia r-virD3-D5 que tienen las SEQ ID NO: 96 98, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende el gen de virulencia r-virD3-D5 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(ii) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virE1-E3 tienen, respectivamente, las SEQ ID NO: 23 25, o variantes y derivados de las mismas o un gen de virulencia r-virE3 que tiene la SEQ ID NO: 100, o variantes y derivados de la misma, en donde el vector que comprende el gen de virulencia r-virE3 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(iv) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virH-H1 tienen, respectivamente, las SEQ ID NO: 42-43, o variantes y derivados de las mismas;

(v) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae virk tiene la SEQ ID NO: 45 o variantes y derivados de la misma;

(vi) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae virL tiene la SEQ ID NO: 46 o variantes y derivados de la misma;

(vii) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae virM tiene la SEQ ID NO: 47 o variantes y derivados de la misma;

(viii) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae virP tiene la SEQ ID NO: 48 o variantes y derivados de la misma;

(ix) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae virQ tiene la SEQ ID NO: 49 o variantes y derivados de la misma;

(x) que comprende los genes de virulencia de Rhizobiaceae virD3-D5 y virE1-E3 o variantes y fragmentos de los mismos, o r-virD3-D5 y r-virE3, o variantes y derivados de los mismos, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virD3-D5 y r-virE3 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma; o

(xi) que comprende los genes de virulencia de Rhizobiaceae virA, virD3-D5, y virE1-E3, o variantes y fragmentos de los mismos, o r-virA, r-virD3-D5, y r-virE3, o variantes y derivados de los mismos, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virA, r-virD3-D5, y r-virE3 además comprende un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma.

4. La Ochrobactrum de la reivindicación 2 o 3, que comprende además un origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli; preferentemente en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede de un origen de replicación Col E1, pSC101, p15A, o R6K y variantes o derivados de los mismos; más preferentemente en donde:

(a) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación ColE1 tiene la s Eq ID NO: 2, o variantes y fragmentos del mismo;

(b) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación pSC101 tiene la SEQ ID NO: 50, o variantes y fragmentos del mismo;

(c) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación p15A tiene la SEQ ID NO: 51, o variantes y fragmentos del mismo; o

(d) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación R6K tiene la SEQ ID NO: 52, o variantes y fragmentos del mismo;

y/o que comprende además un origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum; preferentemente en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum es:

(i) un número alto de copias de origen de replicación;

(ii) un número intermedio de copias de origen de replicación;

(iii) un número bajo de copias de origen de replicación:

(iv) procedente de un origen de replicación pRi, pVS1, pRSF1010, pRK2, pSa, o pBBR1; preferentemente en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum:

(a) es una variante del origen de replicación pRK2;

(b) procede del origen de replicación pRSF1010;

(c) procede del origen de replicación pVS1;

(d) procede del origen de replicación pSa; o

(e) tiene la SEQ ID NO: 3, 37, 38, 53, 57, 58, 59, 60, o 112 o variantes y fragmentos de las mismas; o

(v) un origen de replicación repABC compatible; preferentemente en donde el origen de replicación repABC compatible tiene la SEQ ID NO: 57, 58, 59, o 60, o variantes y fragmentos de las mismas;

y/o en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli y el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum sp. son el mismo origen de replicación; preferentemente en donde el origen de replicación procede de un origen de replicación pRK2, de un origen de replicación pSa o de un origen de replicación pRSF1010; más preferentemente en donde:

(a) dicho origen de replicación pRK2 tiene la SEQ ID NO: 38, o variantes y fragmentos de la misma;

(b) dicho origen de replicación pSa tiene la SEQ ID NO: 53, o variantes y fragmentos de la misma;

(c) dicho origen de replicación pRSF1010 tiene la SEQ ID NO: 37, o variantes y fragmentos de la misma;

(d) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación micro pRK2; preferentemente en donde dicho origen de replicación micro pRK2 tiene la SEQ ID NO: 54, o variantes y fragmentos de la misma;

(e) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación mini pRK2; preferentemente en donde dicho mini pRK2 tiene la SEQ ID NO: 66, o variantes y fragmentos de la misma;

(f) dicho origen de replicación pRK2 comprende las secuencias trfA y OriV; preferentemente en donde el origen de replicación pRK2 comprende las SEQ ID NO: 64 y 65, o variantes y fragmentos de las mismas;

y/o que comprende además una secuencia procedente del operón par DE; preferentemente en donde el operón par DE tiene la SEQ ID NO: 55, o variantes y fragmentos de la misma.

5. Un método para producir una célula vegetal transformada, comprendiendo el método:

a. poner en contacto una célula vegetal con la Ochrobactrum de la reivindicación 1, que comprende en un enlace operativo un primer ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico comprende una región génica vir, y un segundo ácido nucleico, en donde el segundo ácido nucleico comprende una o más secuencias borde de a DN-T unidas operativamente a una secuencia de interés;

6. El método de la reivindicación 5:

(a) que comprende además regenerar una planta que comprende la secuencia de interés en su genoma; preferentemente en donde la regeneración de una planta a partir de la célula vegetal comprende inducir la formación de uno o más brotes a partir de un explante que comprende la célula vegetal y cultivar al menos un primer brote en una planta fértil completa; más preferentemente en donde la regeneración se produce mediante organogénesis; y/o en donde la célula vegetal es de:

(i) una monocotiledónea o una dicotiledónea; o

(ii) una planta seleccionada del grupo que consiste en soja, tabaco, girasol, Arabidopsis, cártamo, alfalfa, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, mijo, colza, Brassica, algodón y caña de azúcar;

y/o en donde la Ochrobactrum se cultiva en presencia de acetosiringona u otro compuesto que induce la función génica vir o r-vir antes de poner en contacto con la célula;

y/o en donde la célula vegetal se compone de un explante de una semilla vegetal, plántula, callo, suspensión celular, cotiledón, meristemo, hoja, raíz o tallo; y el explante se pone en contacto con la Ochrobactrum; preferentemente en donde

el explante comprende un meristemo embrionario, un meristemo somático, callo, suspensión celular; un cotiledón, un nodo cotiledonario, o comprende tejido de una hoja, una raíz o un tallo;

(b) en donde la identificación de una célula vegetal que comprende la secuencia de interés se lleva a cabo en ausencia de un agente de selección;

(c) en donde la identificación de una célula vegetal que comprende la secuencia de interés comprende cultivar la célula vegetal en presencia de un agente de selección, en donde la secuencia de interés confiere tolerancia al agente de selección o se administra conjuntamente con un marcador de selección que confiere tolerancia al agente de selección; preferentemente en donde:

(i) el agente de selección es clorsulfuron, etametsulfurón, imazapyr, glifosato, kanamicina, espectinomicina, bialafós, 2,4-D o dicamba; o

(ii) la secuencia de interés no está físicamente unida a un gen marcador de selección; más preferentemente en donde el gen marcador y la secuencia de interés se segregan genéticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la célula vegetal que comprende la secuencia de interés;

(d) en donde la Ochrobactrum comprende además un tercer ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de interés, y por lo que la célula transformada comprende la segunda secuencia de interés en su genoma;

(e) en donde la Ochrobactrum comprende además un marcador de selección; preferentemente en donde el marcador de selección proporciona resistencia a gentamicina, neomicina/kanamicina, higromicina o espectinomicina; y/o en donde el gen marcador de selección es un gen aacCI, un gen npt1, un gen npt2, un gen hpt, un gen SpcN, un gen aph o un gen aadA; más preferentemente en donde:

(iv) dicho gen npt2 tiene la SEQ ID NO: 41, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o en donde el gen marcador de selección:

(vi) no es un gen marcador de selección de tetraciclina;

(vii) no es un gen tetAR; o

y/o en donde la región génica vir comprende:

(a) genes de virulencia de Rhizobiaceae virb1-b11 que tienen las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virB1-B11 que tienen las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virB1-B11 comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma;

(d) un gen de virulencia de Rhizobiaceae virG que tiene la SEQ ID NO: 15 o variantes y derivados de la misma o un gen de virulencia r-virG que tiene la SEQ ID NO: 91 o variantes y derivados de la misma, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virG comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma; o

(e) uno o más genes de virulencia de Rhizobiaceae virA, virD3, virD4, virD5, virE1, virE2, virE3, virH, virH1, virH2, virK, virL, virM, virP, virQ, r-virA, r-virD3, r-virD4, r-virD5, r-virE3, o r-virF o variantes y derivados de los mismos, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virA, r-virD3, r-virD4, r-virD5, r-virE3, o r-virF comprende además un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados de la misma; preferentemente:

(iv) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virH-H2 tienen, respectivamente, las SEQ ID NO: 42-43, o variantes y derivados de las mismas;

7. El método de la reivindicación 5 o 6, en donde la Ochrobactrum comprende además un origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli; preferentemente en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede de un origen de replicación Col E1, pSC101, p15A, o R6K y variantes o derivados de los mismos; más preferentemente en donde:

y/o en donde la Ochrobactrum comprende además un origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum; preferentemente en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum es:

(i) un número alto de copias de origen de replicación;

(ii) un número intermedio de copias de origen de replicación;

(iii) un número bajo de copias de origen de replicación;

(a) es una variante del origen de replicación pRK2;

(b) procede del origen de replicación pRSF1010;

(c) procede del origen de replicación pVS1;

(d) procede del origen de replicación pSa;

y/o en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli y el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum son el mismo origen de replicación; preferentemente en donde el origen de replicación procede de un origen de replicación pRK2, de un origen de replicación pSa o de un origen de replicación pRSF1010; más preferentemente en donde:

(d) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación micro pRK2; preferentemente en donde dicho origen de replicación micro pRK2 tiene la SEQ ID NO: 54, o variantes y fragmentos de la misma; o

y/o en donde el origen de replicación pRK2 comprende las secuencias trfA y OriV; preferentemente en donde el origen de replicación pRK2 comprende las SEQ ID NO: 64 y 65, o variantes y fragmentos de las mismas;

8. La Ochrobactrum de la reivindicación 1, que comprende:

un primer vector que comprende en unión operativa:

c) un gen marcador de selección; y

d) los genes de virulencia de Rhizobiaceae virB1-B11 o r-virB1-B11, virC1-C2 o r-virC1-C2, virD1-D2 o r-virD1-D2, y virG o r-virG, o variantes y derivados de los mismos, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virB1-B11, r-virC1-C2, r-virD1-D2, y r-virG comprende además un gen de virulencia r-galls, que tiene la SEQ ID NO: 101 o variantes y derivados de la misma; y

un segundo vector que comprende en un enlace operativo una o más secuencias borde de ADN-T unidas operativamente a una secuencia de interés.

9. La Ochrobactrum de la reivindicación 8:

(A) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae son virB1-B11 que tienen las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virB1-B11 que tienen las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas;

(B) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae son virC1-C2 que tienen las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virC1-C2 que tienen las SEQ ID NOS: 92-93, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas;

(C) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae son virD1-D2 que tienen las SEQ ID NO: 18-19, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virD1-D2 que tienen las SEQ ID NO: 94-95, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas;

(D) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae es virG que tiene la SEQ ID NO: 15 o variantes y derivados de la misma o un gen de virulencia r-virG que tiene la SEQ ID NO: 91 o variantes y derivados de la misma;

(E) que comprende además uno o más genes de virulencia de Rhizobiaceae virA, virD3, virD4, virD5, virE1, virE2, virE3, virH, virH1, virH2, virK, virL, virM, virP, virQ, r-virA, r-virD3, r-virD4, r-virD5, r-virE3, o r-virF o variantes y derivados de los mismos;

y/o en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede de un origen de replicación Col e 1, pSC101, p15A, o R6K o variantes o derivados de los mismos; preferentemente en donde:

(i) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación ColE1 tiene la SEQ Id NO: 2, o variantes y fragmentos del mismo;

(ii) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación pSC101 tiene la SEQ ID NO: 50, o variantes y fragmentos del mismo;

(iii) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación p15A tiene la s Eq ID NO: 51, o variantes y fragmentos del mismo; o

(iv) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación R6K tiene la SEQ ID NO: 52, o variantes y fragmentos del mismo;

y/o en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum es:

(a) un número alto de copias de origen de replicación;

(b) un número intermedio de copias de origen de replicación;

(c) un número bajo de copias de origen de replicación;

(d) procedente de un origen de replicación pRi, pVS1, pRSF1010, pRK2, pSa, o pBBR1; preferentemente en donde dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum sp. es una variante del origen de replicación pRK2;

(e) la SEQ ID NO: 3, 37, 38, 53, 57, 58, 59, 60, o 112 o variantes y fragmentos de las mismas;

(f) un origen de replicación repABC compatible; preferentemente en donde el origen de replicación repABC compatible tiene la SEQ ID NO: 57, 58, 59, o 60, o variantes y fragmentos de las mismas;

(i) dicho origen de replicación pRK2 tiene la SEQ ID NO: 38, o variantes y fragmentos de la misma;

(ii) dicho origen de replicación pSa tiene la SEQ ID NO: 53, o variantes y fragmentos de la misma;

(iii) dicho origen de replicación pRSF1010 tiene la SEQ ID NO: 37, o variantes y fragmentos de la misma; (iv) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación micro pRK2; preferentemente en donde el origen de replicación micro pRK2 tiene la SEQ ID NO: 54, o variantes y fragmentos de la misma;

(v) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación mini pRK2; preferentemente en donde el mini pRK2 tiene la SEQ ID NO: 66, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o en donde el origen de replicación pRK2 comprende las secuencias trfA y OriV; preferentemente en donde el origen de replicación pRK2 comprende las SEQ ID NO: 64 y 65, o variantes y fragmentos de las mismas; y/o que comprende además una secuencia procedente del operón par DE; preferentemente en donde el operón par DE tiene la SEQ ID NO: 55, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o en donde el marcador de selección proporciona resistencia a gentamicina, neomicina/kanamicina, higromicina o espectinomicina; preferentemente en donde el gen marcador de selección es un gen aacC1, un gen npt1, un gen npt2, un gen hpt, un gen SpcN, un gen aph o un gen aadA; más preferentemente en donde:

(a) dicho gen aacC1 tiene la SEQ ID NO: 1, o variantes y fragmentos de la misma;

(b) dicho gen aadA tiene la SEQ ID NO: 39, o variantes y fragmentos de la misma;

(c) dicho gen npt1 tiene la SEQ ID NO: 40, o variantes y fragmentos de la misma;

(d) dicho gen npt2 tiene la SEQ ID NO: 41, o variantes y fragmentos de la misma;

(e) dicho gen hpt tiene la SEQ ID NO: 67, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o en donde el gen marcador de selección:

(f) no es un gen marcador de selección de tetraciclina;

(g) no es un gen tetAR; o

(h) es un gen contramarcador de selección; preferentemente en donde el gen contramarcador de selección es un gen sacB, un gen rpsL (strA), un gen pheS, un gen dhfr (folA), un gen lacY, un gen Gata-1, un gen ccdB o un gen thyA;

y/o en donde el primer vector no comprende la SEQ ID NO: 61, o variantes o fragmentos de la misma; y/o en donde el primer vector no comprende la SEQ ID NO: 62, o variantes o fragmentos de la misma; y/o en donde el primer vector no comprende una secuencia de operón tra o una secuencia de operón trb, o variantes o fragmentos de la misma; preferentemente en donde el primer vector no comprende la SEQ ID NO: 63, o variantes o fragmentos de la misma;

(F) en donde el primer vector tiene la SEQ ID NO: 34, o variantes y fragmentos de la misma;

(G) en donde el primer vector tiene la SEQ ID NO: 35, o variantes y fragmentos de la misma; o

(H) en donde el primer vector tiene la SEQ ID NO: 36, o variantes y fragmentos de la misma.

10. La Ochrobactrum de la reivindicación 1, que comprende:

(A) un primer vector que comprende en unión operativa:

a. un origen de replicación para propagación en Escherichia coli que tiene la SEQ ID NO: 2, o variantes y fragmentos de la misma;

b. un origen de replicación para propagación en Ochrobactrum que tiene la SEQ ID NO: 3, o variantes y fragmentos de la misma;

c. un gen marcador de selección que tiene la SEQ ID NO: 1, o variantes y fragmentos de la misma; y d. genes de virulencia que comprenden los genes de virulencia de Agrobacterium spp. teniendo los genes de virulencia virB1-B11 las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virB1-B11 las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virC1-C2 las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virC1-C2 las SEQ ID NO: 92-93, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virD1-D2 las SEQ ID NO: 18-19, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virD1-D2 las SEQ ID NO: 94-95, respectivamente, y teniendo un gen de virulencia virG la SEQ ID NO: 15 o teniendo un gen de virulencia r-virG la SEQ ID NO: 91, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virB1-B11, r-virC1-C2, r-virD1-D2, y r-virG además comprende un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados del mismo; y

(B) un primer vector que comprende en unión operativa:

c. un gen marcador de selección que tiene la SEQ ID NO: 1, o variantes y fragmentos de la misma; y d. secuencias que comprenden los genes de virulencia de Agrobacterium spp. teniendo los genes de virulencia virB1-B11 las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virB1-B11 las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virC1-C2 las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virC1-C2 las SEQ ID NO: 92-93, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virD1-D5 las SEQ ID NO: 18-22, respectivamente o teniendo los genes de virulencia r-virD1-D5 las SEQ ID NO: 94-98, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virE1-E3 las SEQ ID NO: 23-25, respectivamente, o teniendo un gen de virulencia r-virE3 la SEQ ID NO: 100 y teniendo un gen de virulencia virG la SEQ ID NO: 15 o teniendo un gen de virulencia r-virG la SEQ ID NO: 91, o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virB1-B11, r-virC1-C2, r-virD1-D5, r-virE3, y r-virG además comprende un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados del mismo, y

un segundo vector que comprende en un enlace operativo una o más secuencias borde de ADN-T unidas operativamente a una secuencia de interés; o

(C) un primer vector que comprende en unión operativa:

c. un gen marcador de selección que tiene la SEQ ID NO: 1; y

d. secuencias que comprenden los genes de virulencia de Agrobacteriumspp. teniendo un gen de virulencia virA la SEQ ID NO: 26 o teniendo un gen de virulencia r-virA la SEQ ID NO: 79, teniendo los genes de virulencia virB1-B11 las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virB1-B11 las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virC1-C2 las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o teniendo los genes de virulencia r-virC1-C2 las SEQ ID NO: 92-93, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virD1-D5 las SEQ ID NO: 18-22, respectivamente o teniendo los genes de virulencia r-virD1-D5 las SEQ ID NO: 94-98, respectivamente, teniendo los genes de virulencia virE1-E3 las SEQ ID NO: 23-25, respectivamente o teniendo un gen de virulencia r-virE3 la SEQ ID NO: 100, teniendo un gen de virulencia virG la SEQ ID NO: 15 o teniendo un gen de virulencia r-virG la SEQ ID NO: 91,y teniendo un gen de virulencia virJ la SEQ ID NO: 27 o variantes y derivados de las mismas, en donde el vector que comprende los genes de virulencia r-virA, r-virB1-B11, r-virC1-C2, r-virD1-D5, r-virE3, y r-virG además comprende un gen de virulencia r-galls que tiene la SEQ ID NO: 101, o variantes y derivados del mismo, y

11. Un método para producir una célula vegetal transformada, comprendiendo el método:

poner en contacto una célula vegetal con la Ochrobactrum de la reivindicación 1, que comprende en un primer vector en enlace operativo:

c) un gen marcador de selección; y

12. El método de la reivindicación 11:

(a) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virB1-B11 tienen las SEQ ID NO: 4-14, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virB1-B11 tienen las SEQ ID NO: 80-90, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas;

(b) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virC1-C2 tienen las SEQ ID NO: 16-17, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virC1-C2 tienen las SEQ ID NO: 92-93, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas;

(c) en donde los genes de virulencia de Rhizobiaceae virD1-D2 tienen las SEQ ID NO: 18-19, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas o r-virD1-D2 que tienen las SEQ ID NO: 94-95, respectivamente, o variantes y derivados de las mismas;

(d) en donde el gen de virulencia de Rhizobiaceae virG tiene la SEQ ID NO: 15 o variantes y derivados de la misma o un gen de virulencia r-virG que tiene la SEQ ID NO: 91 o variantes y derivados de la misma; o

y/o en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede de un origen de replicación Col E1, pSC101, p15A, o R6K o variantes o derivados de los mismos; preferentemente en donde:

(iii) dicho origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Escherichia coli procede del origen de replicación p15A tiene la SEQ ID NO: 51, o variantes y fragmentos del mismo; o

y/o en donde el origen de replicación para propagación y mantenimiento estable en Ochrobactrum:

(a) es un número alto de copias de origen de replicación;

(b) es un número intermedio de copias de origen de replicación;

(c) es un número bajo de copias de origen de replicación;

(d) procede de un origen de replicación pRi, pVS1, pRSF1010, pRK2, pSa, o pBBR1;

(e) es una variante del origen de replicación pRK2;

(f) tiene la SEQ ID NO: 3, 37, 38, 53, 57, 58, 59, 60, o 112 o variantes y fragmentos de las mismas; o

(g) es un origen de replicación repABC compatible; preferentemente en donde el origen de replicación repABC compatible tiene la SEQ ID NO: 57, 58, 59, o 60, o variantes y fragmentos de las mismas;

(iii) dicho origen de replicación pRSF1010 tiene la SEQ ID NO: 37, o variantes y fragmentos de la misma;

(iv) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación micro pRK2; preferentemente en donde dicho origen de replicación micro pRK2 tiene la SEQ ID NO: 54, o variantes y fragmentos de la misma; o

(v) dicho origen de replicación pRK2 es un origen de replicación mini pRK2; preferentemente en donde dicho mini pRK2 tiene la SEQ ID NO: 66, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o que comprende además una secuencia procedente del operón par DE; preferentemente en donde el operón par DE tiene la SEQ ID NO: 55, o variantes y fragmentos de la misma;

y/o en donde el marcador de selección proporciona resistencia a gentamicina, neomicina/kanamicina, higromicina o espectinomicina; preferentemente en donde el gen marcador de selección es un gen aacCI, un gen nptl, un gen npt2, un gen hpt, un gen SpcN, un gen aph o un gen aadA; más preferentemente en donde:

(a) dicho gen aacC1 tiene la SEQ ID NO: 1, o variantes y fragmentos de la misma;

(b) dicho gen aadA tiene la SEQ ID NO: 39, o variantes y fragmentos de la misma;

(c) dicho gen npt1 tiene la SEQ ID NO: 40, o variantes y fragmentos de la misma;

(d) dicho gen npt2 tiene la SEQ ID NO: 41, o variantes y fragmentos de la misma; o

y/o en donde el gen marcador de selección:

(f) no es un gen marcador de selección de tetraciclina;

(g) no es un gen tetAR; o

y/o en donde el primer vector no comprende la SEQ ID NO: 61, o variantes o fragmentos de la misma;

y/o en donde el primer vector no comprende la SEQ ID NO: 62, o variantes o fragmentos de la misma;

y/o en donde el primer vector no comprende una secuencia de operón tra o una secuencia de operón trb, o variantes o fragmentos de la misma;

y/o en donde el primer vector no comprende la SEQ ID NO: 63, o variantes o fragmentos de la misma; y/o en donde:

(i) el primer vector tiene la SEQ ID NO: 34, o variantes y fragmentos de la misma;

(ii) el primer vector tiene la SEQ ID NO: 35, o variantes y fragmentos de la misma;

(iii) el primer vector tiene la SEQ ID NO: 36, o variantes y fragmentos de la misma.

13. El método de la reivindicación 11:

(A) que comprende además regenerar una planta que comprende la secuencia de interés en su genoma; preferentemente en donde la regeneración de una planta a partir de la célula vegetal comprende inducir la formación de uno o más brotes a partir de un explante que comprende la célula vegetal y cultivar al menos un primer brote en una planta fértil completa; más preferentemente en donde la regeneración de una planta se produce mediante organogénesis;

y/o en donde la célula vegetal es:

(a) de una monocotiledónea o una dicotiledónea; o

(b) de una planta seleccionada del grupo que consiste en soja, tabaco, girasol, Arabidopsis, cártamo, alfalfa, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, mijo, colza, Brassica, algodón y caña de azúcar;

y/o en donde la célula vegetal se compone de un explante de una semilla vegetal, plántula, callo, suspensión celular, cotiledón, meristemo, hoja, raíz o tallo; y el explante se pone en contacto con la Ochrobactrum; preferentemente en donde el explante comprende un meristemo embrionario, un meristemo somático, callo, suspensión celular; un cotiledón, un nodo cotiledonario, o comprende tejido de una hoja, una raíz o un tallo; (B) en donde la identificación de una célula vegetal que comprende la secuencia de interés se lleva a cabo en ausencia de un agente de selección;

(C) en donde la identificación de una célula vegetal que comprende la secuencia de interés comprende cultivar la célula vegetal en presencia de un agente de selección, en donde la secuencia de interés confiere tolerancia al agente de selección o se administra conjuntamente con un marcador de selección que confiere tolerancia al agente de selección; preferentemente en donde el agente de selección es clorsulfuron, etametsulfurón, imazapyr, glifosato, kanamicina, espectinomicina, bialafós, 2,4-D o dicamba;

(D) en donde la secuencia de interés no está físicamente unida a un gen marcador de selección; preferentemente en donde el gen marcador y la secuencia de interés se segregan genéticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la célula vegetal que comprende la secuencia de interés; o

(E) en donde la Ochrobactrum comprende además un tercer vector en unión operativa que comprende una segunda secuencia de interés.

14. Un kit que comprende:

(a) la Ochrobactrum de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4 u 8-10; y

(b) instrucciones para su uso en la transformación de una planta.

15. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 8, 10 u 11, en donde el vector comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 34, 35, 36, 106, 113 o 114.