ES2784194T3 - Moduladores de células iNKT y métodos para uso el mismo - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene una estructura: **(Ver fórmula)** en donde n es 1, 2 o 3; o una sal del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores de células iNKT y métodos para uso el mismo

Antecedentes

Las células T asesinas naturales (NKT) han sido implicadas en una gama de mecanismos de vigilancia inmunológica importantes, tales como la defensa del huésped contra patógenos externos, tolerancia inmunitaria y malignidad. Las células NKT se pueden dividir en dos subconjuntos, los llamados Tipo I y Tipo II. Las células tipo I NKT han recibido la mayor atención. Estas células también se conocen como células NKT invariantes (iNKT) debido a su expresión de un receptor de células T de cadena a invariante (TCR; cadena Va14-Ja18 en ratones y cadena Va24-Ja18 en humanos), que se combina con una cadena p más variable. En contraste, las células NKT de tipo II tienen un repertorio de TCR diverso y están menos bien definidas, aunque se ha demostrado que un subconjunto es reactivo a la sulfatida. El TCR de células iNKT reconoce los antígenos lipídicos presentados en el contexto de la proteína de tipo I no polimórfica MHC de clase I, CD1d. Se ha demostrado que la molécula CD1d se une a una gama de lípidos y glicolípidos de dialquilo y el consiguiente reconocimiento de TCR de células iNKT del complejo de lípidos CDld conduce a la rápida proliferación y liberación de una gran cantidad de citoquinas (tanto proinflamatorias como reguladoras). La activación de las células iNKT es un paso importante para 'impulsar' las respuestas inmunes adaptativas a través de la activación y maduración de las células dendríticas (DC) y las células B a través de las interacciones CD40-CD40L, y la activación de las células asesinas naturales (NK) después de la liberación de interferón gamma (IFN^y). Dado que se ha demostrado que la estructura de los ligandos de CD Id gobierna el perfil de citoquinas liberadas, el desarrollo de moléculas de lípidos que promueven la activación específica de las células iNKT podría encontrar una aplicación muy útil en el tratamiento de una amplia gama de trastornos.

De la gama de lípidos que se unen a CD1d, la a-galactosilceramida de glucolípido (a-GalCer) es una de las más potentes. a-GalCer es un derivado de las agelasfinas, que son glicolípidos naturales que se aislaron de la esponja marina Agelas mauritianus. El reconocimiento del complejo a-GalCer-CD1d por el TCR de células iNKT da como resultado la secreción de una variedad de citoquinas y el inicio de una potente respuesta inmune.

Aunque a-GalCer sigue siendo uno de los agonistas de células iNKT más potentes y ha demostrado potencial en el tratamiento de diversas afecciones, puede resultar difícil utilizar esta molécula ampliamente como un agente terapéutico útil, al menos como un activador directo de células iNKT: la activación de las células iNKT mediada por a-GalCer no solo conduce a la secreción de citoquinas T auxiliares Tipo 1 (Th1) (por ejemplo, IFN-y) y T auxiliar Tipo 2 (Th2) (por ejemplo, interleucina-4 (IL-4)) y, por lo tanto, una respuesta inmune mixta, pero lo que es más importante, la sobreestimulación de las células iNKT, lo que puede provocar que entren en un estado anérgico a largo plazo, es decir, falta de respuesta a la posterior estimulación de a-GalCer y la producción preferencial de IL-4, lo que podría ser perjudicial para la terapia a largo plazo. La pérdida de los niveles circulantes de células iNKT podría representar una limitación terapéuticamente significativa con las terapias basadas en células iNKT si se requieren regímenes de dosificación múltiple. Por lo tanto, existe la necesidad de otros activadores de células iNKT. El documento WO 2010106215 A1 (CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION; UNIV BARCELONA AUTONOMA; UNIV BARCELONA) describe ciertos compuestos de aminociclitol y sus usos como composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades asociadas con alteraciones en células iNKT, más específicamente enfermedades autoinmunes, cáncer, infecciones causadas por microorganismos patógenos o enfermedades inflamatorias. También se describen métodos para obtener los compuestos.

Resumen

Por consiguiente, la presente invención proporciona un compuesto que tiene una estructura:

en donde n es 1, 2 o 3;

o una sal del mismo.

Opcionalmente en un compuesto o sal n es 1, o n es 2 o 3.

La invención también proporciona una composición que comprende un compuesto o una sal del mismo como se define aquí y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones preferidas de la invención comprenden además una segunda terapéutica seleccionada del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente modificador de la respuesta biológica y un agente inmunoterapéutico.

La invención proporciona además un compuesto o sal aquí definido para uso como medicamento.

La invención proporciona adicionalmente un método in vitro para activar una célula T asesina natural (NKT) que comprende poner en contacto la célula con el compuesto o la sal de la invención como se define aquí en una cantidad efectiva para activar la célula NKT.

La invención también proporciona un compuesto o sal como se define aquí para uso en el tratamiento del cáncer. En el aspecto preferido, el cáncer tratado de acuerdo con el compuesto o sal para uso es melanoma.

Opcionalmente, el compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer se administra en combinación con un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente modificador de la respuesta biológica y un agente inmunoterapéutico.

La segunda terapéutica puede comprender una inmunoterapéutica que comprende una vacuna contra el cáncer; o el segundo agente terapéutico comprende una inmunoterapéutica que comprende un antígeno canceroso o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno canceroso.

Más particularmente, el segundo agente terapéutico puede comprender un agente inmunoterapéutico que comprende al menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo antirreceptor Her2/neu, un anticuerpo anti-CD52, un anticuerpo anti-CD33, un anti anticuerpo CD20, un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo antirreceptor CD25 IL-2, un anticuerpo anti-CD40/CD40L, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1 (anti-CD279), un anti-PDL-1, un anticuerpo anti-GITR y un anticuerpo anti-OX-40 (anti-CD134). Aún más particularmente, el anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-PDL1, un anticuerpo anti-OX40 y un anticuerpo anti-GITR.

Cualquier anticuerpo comprendido en el agente inmunoterapéutico puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.

La invención proporciona además un paquete que contiene un compuesto o sal como se define en este documento y un segundo agente terapéutico como una preparación combinada para uso simultáneo separado o secuencial en el tratamiento del cáncer.

La invención proporciona adicionalmente un kit que comprende (a) un compuesto o sal como se define en este documento y (b) un agente inmunoterapéutico, empaquetados juntos pero no mezclados.

En un kit preferido, el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo.

En el presente documento se describen compuestos, composiciones de materia y métodos para fabricar y usar los compuestos y composiciones que son útiles en relación con la activación de iNKT y todas las aplicaciones (incluidas las aplicaciones médicas terapéuticas o profilácticas) relacionadas con la activación de iNKT.

A modo de ejemplo, se describen compuestos que tienen una estructura de fórmula (1):

en donde R1 es alquilo C⁵-C²⁵, alquenilo C⁵-C²⁵, alquinilo C⁵-C²⁵, heteroalquilo C⁵-C²⁵, heteroalquenilo C⁵-C²⁵ o heteroalquinilo C⁵-C²⁵; R3 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH, SH, amino o amino sustituido; R4 es alquilo C⁵-C²⁰, alquenilo C⁵-C²⁰, alquinilo C⁵-C²⁰, heteroalquilo C⁵-C²⁰, heteroalquenilo C⁵-C²⁰ o heteroalquinilo C⁵-C²⁰; R6 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo y alquenilo, o R6 y R5 juntos forman un anillo de cicloalquilo o cicloalquenilo de 6, 7 u 8 miembros: X es O, S, SO², SO(NH), SO(N(alquilo)), NH, N(alquilo) o CH² ; Y es O, nH, N(alquilo) o S; Z es O, S, NH, N(alquilo) o CH² ; con la condición de que con la condición de que (a) cuando Y y X son cada uno O y R5 y R6 son cada uno H, Z no es CH² ; y (b) cuando Y es O, R6 y R5 juntos forman un anillo de cicloalquilo de 6 miembros, y Z es CH² , el anillo de cicloalquilo no está sustituido con -CH²OH, -OH, -CH³ o -CH²OCH³ , o una sal, éster, solvato o hidrato de los mismos En algunas realizaciones, los compuestos descritos aquí que tienen una estructura (IA), (IB), (IC) o (ID):

en donde n es 1, 2 o 3; m es 0, 1 o 2; p es 1 o 2; y la línea discontinua es un doble enlace opcional. En algunos conjuntos específicos de compuestos, la línea discontinua es un enlace doble, mientras que en otros conjuntos de compuestos la línea discontinua es un enlace simple.

En varios casos, los compuestos descritos en este documento tienen estereoquímica como se indica en la estructura (IE):

En varios casos, el compuesto tiene una estructura de:

en donde n es 1, 2 o 3, o una sal, éster, solvato o hidrato del mismo, o más específicamente una estructura de: en donde n es 1 (IMM60), 2 (IMM70) o 3 (IMM80), o una sal, éster, solvato o hidrato del mismo.

En algunas variaciones, el compuesto se purifica y/o aísla.

Además se describen en el presente documento composiciones que comprenden un compuesto como se describe en el presente documento y uno o más diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables (composiciones farmacéuticas). En algunas variaciones, la composición se formula y/o empaqueta como una dosis unitaria para la administración a un sujeto. En algunas variaciones, se proporciona una jeringa u otro dispositivo de administración que contiene el compuesto o composición.

En el presente documento también se describen métodos para activar una célula NKT poniendo en contacto la célula con un compuesto o composición como se describe en el presente documento. La activación de la célula NKT puede comprender uno o más de inducir la secreción de una citoquina de la célula NKT, estimular la proliferación de la célula NKT y regular la expresión de un marcador de superficie celular en la célula NKT. La citoquina puede ser una o más de IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-15, TNF-a, TNF-p e IFN-^y. La activación puede comprender la regulación positiva de al menos un marcador de superficie celular seleccionado de CD69, CD25, un receptor de IL-12 y CD40L.

En algunas variaciones, la activación se realiza ex vivo, por ejemplo, usando una muestra biológica que contiene una célula NKT que se ha eliminado de un organismo. En otras variaciones, la activación se realiza in vivo, por ejemplo, administrando el compuesto o composición al organismo por una ruta a través de la cual el compuesto o composición o metabolito del mismo entra en contacto con la célula NKT.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden comprender administrar un compuesto o composición como se describe en la presente memoria a un sujeto que necesita activación de células NKT. Los sujetos de ejemplo son sujetos mamíferos, que incluyen sujetos humanos. En algunos casos, el sujeto sufre de cáncer.

Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender la administración de un compuesto o composición como se describe en el presente documento a un sujeto que padece un cáncer seleccionado de carcinoma de células basales, cáncer de mama, leucemia, linfoma de Burkitt, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, leucemia de células pilosas, tumor de Wilms, cáncer de tiroides, timoma, carcinoma tímico, cáncer testicular, linfoma de células T, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de células renales y melanoma.

Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además administrar un segundo agente terapéutico al sujeto. Por ejemplo, los métodos pueden comprender administrar un agente quimioterapéutico o inmunoterapéutico, una vacuna contra el cáncer, un antígeno tumoral o un polinucleótido que codifica un antígeno tumoral. El segundo agente terapéutico puede administrarse simultáneamente con el compuesto o composición como se describe en el presente documento, y en algunos casos específicos, los dos se formulan conjuntamente. El segundo agente terapéutico puede administrarse secuencialmente con el compuesto o composición como se describe en el presente documento, por ejemplo, antes o después del compuesto o composición. Se contempla la administración repetida de uno o ambos agentes.

Los métodos descritos aquí también pueden caracterizarse como métodos de tratamiento o profilaxis. Por ejemplo, en el presente documento se describen métodos de tratamiento o profilaxis de un sujeto que padece cualquiera de las afecciones descritas en el presente documento, comprendiendo dicho método administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en el presente documento. En algunas variaciones, el compuesto o composición se administra en una cantidad efectiva para estimular la activación de NKT. En algunas variaciones, se utilizan otros puntos de referencia terapéuticos. Por ejemplo, el compuesto o composición se administra en una cantidad efectiva para retrasar el crecimiento, reducir el tamaño o eliminar un tumor u otro cáncer. En algunas variaciones, la administración se repite varias veces.

Se contemplan todas las combinaciones de características descritas en este documento, incluso si la combinación de características no se encuentran juntas en la misma oración, párrafo o sección de este documento.

Con respecto a los aspectos de la invención descritos o reivindicados con "un" o "una", debe entenderse que estos términos significan "uno o más" a menos que el contexto requiera inequívocamente un significado más restringido. Con respecto a los elementos descritos como uno o más dentro de un conjunto, debe entenderse que se contemplan todas las combinaciones dentro del conjunto. Si los aspectos de la invención se describen como "que comprenden" una característica, las realizaciones también se contemplan "que consisten en" o "que consisten esencialmente en" la característica.

En el presente documento se describen combinaciones de dos o más compuestos o agentes en relación con un método de tratamiento (o uso médico), ya sea administrado por separado (secuencial o simultáneamente) o en combinación (coformulado o mezclado). Por lo tanto, se describe de esta manera una composición que comprende los dos o más compuestos o agentes formulados conjuntamente o mezclados entre sí; y esto incluye un kit o dosis unitaria que contiene los dos o más compuestos/agentes empaquetados juntos, pero no mezclados. Opcionalmente, tales composiciones, kits o dosis incluyen además uno o más vehículos mezclados con uno o ambos agentes o empaquetados conjuntamente para la formulación antes de la administración a un sujeto. Lo contrario también es cierto: las composiciones útiles para la terapia pueden contener dos o más agentes terapéuticos. Se contemplan específicamente métodos y usos equivalentes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la actividad biológica de seis compuestos como se describe en el presente documento, a-GalCer y ThrCer según lo determinado por su capacidad para estimular el hibridoma de células iNKT DN32, después de la pulsación de células C1R-mCD1d con cada compuesto, medido por la IL-2 resultante liberada en el sobrenadante.

La Figura 2 muestra la actividad biológica de los mismos compuestos que la Figura 1, pero esta vez en un modelo de célula humana, con células iNKT humanas cocultivadas con células ClR-hCD1d y pulsadas con un compuesto o vehículo de 100 ng/ml, y la IL-2 resultante liberada en el sobrenadante medido.

La Figura 3 muestra los resultados de un experimento de 1 |jg de lípidos inyectados en ratones C57 BL/6 o C57 BL/6 CD1d -/-(deficientes en células NKT) de tipo salvaje, y se midieron los niveles de IL-4 e IFN^y.

La Figura 4 muestra el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de las células recolectadas de los bazos de los ratones en el experimento de la Figura 3, para determinar el grado de maduración de las células dendríticas (DC).

La Figura 5 muestra los experimentos SPR utilizados para medir la afinidad y la cinética de los receptores de células T de células iNKT humanas (TCR) para células hCDld cargadas con a-GalCer, ThrCer, a-GalCer tioamida, a-GalCer carbamato, ThrCer tioamida y ThrCer análogos de carbamato.

Figura 6. Afinidad de unión de iNKT TCR al complejo ThrCer6 y ThrCer7 CD1d. Las células C1R-hCD1d fueron pulsadas con diversos ligandos, como se indicó, y la afinidad del tetrámero iNKT TCR se determinó mediante citometría de flujo medida por la intensidad fluorescente media (MFI).

Figura 7. Afinidad de unión de iNKT TCR en presencia de diferentes ligandos. Las células C1R-hCD1d pulsadas con diversos ligandos, como se indicó, y los niveles de IFNy se midieron en su sobrenadante mediante ELISA.

Figura 8. Recuperación de células iNKT de la anergia inducida por activación. Esplenocitos cultivados durante 60 h en presencia de diversos ligandos y niveles de IFNy medidos en el sobrenadante por ELISA.

Figura 9. Actividad adyuvante de diversos ligandos. Los esplenocitos se pusieron en contacto durante 18 horas con 800 jg de OVA, 1 jg de lípidos y péptidos MHC I específicos de OVA (Figura 9A) y MHCII (Figura 9B). Niveles de IFN^y medidos después de 18 horas por ELISpot y expresados como manchas por millón de esplenocitos.

Figura 10. Actividad adyuvante de varios ligandos. Los esplenocitos se pusieron en contacto durante 18 horas con 800 jg de OVA, 1 jg de lípidos y péptidos MHC I y ^m H^c II específicos de OVA. Niveles de IgG OVA medidos después de 18 horas.

La Figura 11 contiene gráficos que muestran las respuestas de células T (panel izquierdo) y células B (panel derecho) al antígeno (OVA) después de la exposición a varios lípidos. Los datos indican que IMM60 indujo respuestas más fuertes de células T y B en comparación con IMM47 e IMM70.

La Figura 12 es un esquema que muestra el diseño experimental para los experimentos descritos a continuación (Título de la sección: Anergia in vivo de células iNKT).

La Figura 13 es un gráfico que muestra el nivel de expresión de IFNy en ratones ingenuos y en ratones 18 horas después de ser inmunizados con alfa-GalCer, IMM47, iMm60 o IMM70.

La Figura 14 es un gráfico que muestra el nivel de expresión de PD1 en ratones ingenuos y en ratones 28 días después de ser inmunizados con alfa-GalCer, IMM47, IMM60 o IMM70.

La Figura 15 es un gráfico que muestra la medición de la anergia de las células iNKT (como se define por las mediciones de IFNy) después de la estimulación con varios ligandos.

La Figura 16 es un gráfico que muestra que los ratones IMM70 preacondicionados demostraron la mayor respuesta de células T.

La Figura 17 es un gráfico que muestra que IMM60 causó la mayor destrucción de células dendríticas en comparación con los otros compuestos probados.

La Figura 18 es un esquema que muestra el diseño de experimentos realizados para analizar la capacidad de IMM47, IMM60 e IMM70 para inducir respuestas de células T y B. (Título a continuación: Cebado directo de células

T y B por IMM47, IMM60 e IMM70).

La Figura 19 es un gráfico que analiza el tamaño del tumor en ratones en diversos momentos después de la exposición al tumor en ratones tratados con los compuestos indicados. Los datos muestran que IMM60 (ThrCer6) indujo la regresión tumoral.

Descripción detallada

Se describen en el presente documento compuestos que tienen una estructura general de fórmula (I):

en donde R1 es alquilo C5-C25, alquenilo C5-C25, alquinilo C5-C25, heteroalquilo C5-C25, heteroalquenilo C5-C25 o heteroalquinilo C⁵-C²⁵; R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de H, OH, SH, amino o amino sustituido; R4 es alquilo C⁵-C²⁰, alquenilo C⁵-C²⁰, alquinilo C⁵-C²⁰, heteroalquilo C⁵-C²⁰, heteroalquenilo C⁵-C²⁰ o heteroalquinilo C5-C20; R6 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo y alquenilo, o R6 y R5 juntos forman un anillo de cicloalquilo o cicloalquenilo de 6, 7 u 8 miembros; X es O, S, SO² , SO(nH), SO(N(alquilo)),

NH, N(alquilo) o CH2; Y es O, NH, N(alquilo) o S; Z es O, S, NH, N(alquilo) o Ch2; con la condición de que (a) cuando Y y X son cada uno O y R5 y R6son cada uno H, Z no es CH² ; y (b) cuando Y es O, R6 y R5 juntos forman un anillo de cicloalquilo de 6 miembros, y Z es CH² , el anillo de cicloalquilo no está sustituido con -CH²OH, -OH, -CH³ o -CH2OCH3, o una sal, éster, solvato o hidrato de los mismos.

Los compuestos descritos en este documento pueden estimular las células iNKT. En varios casos, los compuestos estimulan las células iNKT, según lo medido por un ensayo in vitro utilizando células de hidridoma dN32. En diversos casos, los compuestos estimulan las células iNKT, según lo medido por un ensayo in vitro utilizando células iNKT humanas cocultivadas con células C1R-hCD1d. En diversos casos, los compuestos estimulan las células iNKT in vivo.

Los compuestos descritos en este documento tienen una estructura (IA), (IB), (IC) o (ID):

en donde n es 1, 2 o 3; m es 0, 1 o 2; p es 1 o 2; y la línea discontinua es un doble enlace opcional. En algunos conjuntos específicos de compuestos, la línea discontinua es un enlace doble, mientras que en otros conjuntos de compuestos, la línea discontinua es un enlace simple.

La estereoquímica de los compuestos descritos en este documento puede ser cualquier orientación. En algunos casos específicos, los compuestos descritos aquí tienen una estructura de fórmula (IE):

Se excluyen específicamente de los compuestos de fórmula (I) descritos aquí los compuestos que tienen las siguientes estructuras:

Ċ

Los compuestos específicos descritos aquí incluyen

cadena lineal o ramificada de uno a cuarenta átomos de carbono, que incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, tert-butilo, n-hexilo y similares. También se contemplan alquilos de uno a seis átomos de carbono. El término "alquilo" incluye "alquilo con puente", es decir, un grupo hidrocarburo bicíclico o policíclico, por ejemplo, norbornilo, adamantilo, biciclo[2.2.2]octilo, biciclo[2.2.1]heptilo, biciclo[3.2.1]octilo. o decahidronaftilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con hidroxi (OH), haluro, tiol (SH), arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo y amino. Se contempla específicamente que en los compuestos descritos en el presente documento el grupo alquilo consiste en 1-40 átomos de carbono, preferiblemente 1-25 átomos de carbono, preferiblemente 1-15 átomos de carbono, preferiblemente 1-12 átomos de carbono, preferiblemente 1-10 átomos de carbono, preferiblemente 1-8 átomos de carbono, y preferiblemente 1-6 átomos de carbono. Un grupo "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más de N, S y O.

El término "cicloalquilo" usado aquí se refiere a un grupo hidrocarburo dispuesto en un anillo. El grupo cicloalquilo puede estar sustituido con uno o más sustituyentes, tales como alquilo, halo, OH, SH, amino, amino sustituido, carboxilo, arilo o heteroarilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo y ciclodecilo. El término "heterocidoalquilo" se refiere a un grupo cicloalquilo que tiene uno o más de N, S y O.

El término "alquenilo" usado en el presente documento se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de dos a diez átomos de carbono que contiene al menos un doble enlace de carbono que incluye, pero no se limita a, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metilo -1-propenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo y similares. El término "cicloalquenilo" se refiere a un grupo cicloalquilo que tiene uno o más dobles enlaces. Un grupo "heteroalquenilo" se refiere a un grupo alquenilo que tiene uno o más de N, S y O.

El término "alquinilo" usado aquí se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de dos a diez átomos de carbono que contiene al menos un triple enlace de carbono que incluye, pero no se limita a, 1 -propinilo, 2-propinilo, 1 -butinilo , 2-butinilo y similares. Un grupo "heteroalquinilo" se refiere a un grupo alquinilo que tiene uno o más de N, S y O.

El término "alquileno" usado aquí se refiere a un grupo alquilo que tiene un sustituyente. Por ejemplo, el término "alquileno arilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. El grupo alquileno está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes enumerados previamente como un sustituyente alquilo opcional. Por ejemplo, un grupo alquileno puede ser -CH²CH²- o -CH²-.

Como se usa en el presente documento, el término "arilo" se refiere a un grupo aromático monocíclico o policíclico, preferiblemente un grupo aromático monocíclico o bicíclico, por ejemplo, fenilo o naftilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo arilo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más, y en particular uno a cuatro grupos seleccionados independientemente de, por ejemplo, halo, alquilo, alquenilo, CF³, NO² , CN, NC, OH, alcoxi, amino , CO²H, CO²alquilo, arilo y heteroarilo. Ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, clorofenilo, metilfenilo, metoxifenilo, trifluorometilfenilo, nitrofenilo, 2,4-metoxiclorofenilo y similares. Como se usa en el presente documento, el término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico o bicíclico que contiene uno o dos anillos aromáticos y que contiene al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático. A menos que se indique lo contrario, un grupo heteroarilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más, y en particular de uno a cuatro, sustituyentes seleccionados de, por ejemplo, halo, alquilo, alquenilo, CF³ , NO², CN, Nc, OH, alcoxi, amino, CO²H, CO²alquilo, arilo y heteroarilo. En algunos casos, el grupo heteroarilo está sustituido con uno o más grupos alquilo y alcoxi. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, tienilo, furilo, piridilo, oxazolilo, quinolilo, tiofenilo, isoquinolilo, indolilo, triazinilo, triazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, benzotiazolilo, pirazinilo, pirimidinilo, tiazolilo, y tiadiazolilo.

El término "amino" como se usa en el presente documento se refiere a -NR² , donde R es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. Ejemplos no limitantes de grupos amino incluyen NH² , NH (CH³) y N(CH³)². En algunos casos, R es independientemente hidrógeno o alquilo.

El término "carboxi" o "carboxilo" usado en el presente documento se refiere a -COOH o su forma desprotonada -COO-. Carboxi C^1-10 se refiere a grupos alquilo o alquenilo opcionalmente sustituidos que tienen una unidad estructural carboxi. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH²COOH, -CH²CH(COOH)CH³ y -CH²CH²CH²COOH. En algunos casos, el (los) grupo(s) sustituyente(s) es(n) uno o más grupos seleccionados individualmente e independientemente de alquilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, ciano, halo, carbonilo, tiocarbonilo, alcoxicarbonilo, nitro, sililo, trihalometanosulfonilo, trifluorometilo y amino, incluidos los grupos amino mono y disustituidos, y los derivados protegidos de los mismos.

Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos. Todos estos isómeros, incluidos los diastereómeros y enantiómeros, así como sus mezclas, están destinados a ser incluidos en el alcance de la divulgación en este documento. En ciertos casos, los compuestos pueden existir en formas tautoméricas. Todas las formas tautoméricas están destinadas a ser incluidas en el alcance de la divulgación en este documento. Del mismo modo, cuando los compuestos contienen un grupo alquenilo o alquenileno, existe la posibilidad de formas isoméricas cis y trans de los compuestos. Se contemplan los isómeros cis y trans, así como las mezclas de isómeros cis y trans.

Las sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables, de los agentes terapéuticos descritos pueden prepararse haciendo reaccionar la base o ácido apropiado con un equivalente estequiométrico del agente terapéutico.

Los ácidos comúnmente empleados para formar sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como bisulfuro de hidrógeno, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, así como ácidos orgánicos tales como ácido para-toluenosulfónico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido bitartárico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido besílico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido fórmico, ácido glutámico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido parabromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico y ácido acético, así como ácidos inorgánicos y orgánicos relacionados. Dichas sales farmacéuticamente aceptables incluyen sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, capilato, acrilato, formiato, isobutato, caprato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexeno-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, tereftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, O-hidroxibutirato, glicolato, maleato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato y otras sales.

Las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico y ácido bromhídrico, y especialmente aquellas formadas con ácidos orgánicos tales como ácido maleico.

Las sales de adición básica farmacéuticamente aceptables pueden formarse con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Las sales farmacéuticamente aceptables de compuestos también se pueden preparar con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio y de amonio cuaternario. Los carbonatos o carbonatos de hidrógeno también son posibles. Ejemplos de metales utilizados como cationes son sodio, potasio, magnesio, amonio, calcio o férrico, y similares. Ejemplos de aminas adecuadas incluyen isopropilamina, trimetilamina, histidina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína.

De manera similar, los derivados farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ésteres), metabolitos, hidratos, solvatos y profármacos de la terapéutica pueden prepararse mediante métodos generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Así se describen compuestos que son profármacos de un compuesto activo. En general, un profármaco es un compuesto que se metaboliza in vivo (por ejemplo, mediante una transformación metabólica como la desaminación, la desalquilación, la desesterificación y similares) para proporcionar un compuesto activo. Un "profármaco farmacéuticamente aceptable" significa un compuesto que es, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuado para uso farmacéutico en un paciente sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, y efectivo para el uso previsto, incluido un medicamento éster aceptable, así como una forma zwitteriónica, cuando sea posible, de la terapéutica. Como se usa en el presente documento, el término "éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a ésteres que se hidrolizan in vivo e incluyen aquellos que se descomponen fácilmente en el cuerpo humano para dejar el compuesto original o una sal del mismo. Los grupos éster adecuados incluyen, por ejemplo, los derivados de ácidos carboxílicos alifáticos farmacéuticamente aceptables, particularmente ácidos alcanoicos, alquenoicos, cicloalcanoicos y alcanodioicos, en los que cada unidad estructural alquilo o alquenilo tiene ventajosamente no más de 6 átomos de carbono. Ejemplos representativos de ésteres particulares incluyen, pero no se limitan a, formiatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos y etilsuccinatos. Ejemplos de tipos de profármacos farmacéuticamente aceptables se describen en Higuchi y Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Los compuestos y composiciones descritos en el presente documento también pueden incluir metabolitos. Como se usa en el presente documento, el término "metabolito" significa un producto del metabolismo de un compuesto de las realizaciones o una sal, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, que exhibe una actividad similar in vitro o in vivo a un agente terapéutico divulgado. Los compuestos y composiciones descritos en el presente documento también pueden incluir hidratos y solvatos. Como se usa en el presente documento, el término "solvato" se refiere a un complejo formado por un soluto (en el presente documento, la terapéutica) y un disolvente. Tales disolventes preferiblemente no deberían interferir negativamente con la actividad biológica del soluto. Los disolventes pueden ser, a modo de ejemplo, agua, etanol o ácido acético.

Síntesis de compuestos

Los compuestos descritos en el presente documento pueden sintetizarse usando cualquier medio conocido por el químico orgánico sintético. A continuación se describen esquemas sintéticos para sintetizar varios de los compuestos descritos aquí, y se pueden usar como guía para la síntesis de los compuestos descritos aquí.

La formación completamente selectiva de a-galactósidos ha sido tradicionalmente difícil; sin embargo, en los últimos años se han desarrollado algunas soluciones excelentes para este problema. Se empleó la metodología de glicosilación deshidratante de Nishida y Kobayashi; así, la reacción de 2,3,4,6-tetra-O-bencil-galactosa 14 con CBr⁴/PPh³ proporcionó el bromuro de galactosilo correspondiente, que reaccionó in situ con el aceptor 15, en presencia de tetrametilurea (TMU) y Bu⁴NBr, para proporcionar un buen rendimiento del galactósido 16 deseado como un único anómero a (Esquema 1). La reducción de Staudinger de la azida en 16 con PMe³ en THF húmedo proporcionó la amina 17, que reaccionó con cloruro de hexacosanoilo para proporcionar la amida 18 con un rendimiento no optimizado del 40% de la azida 16. La formación de la urea 19 correspondiente a partir de la amina 17 requirió la síntesis de un isocianato apropiado, formado por un reordenamiento de Curtius en la azida de ácido correspondiente. El uso de ácido hexacosanoico como punto de partida conduciría a un producto de urea que contiene 27 átomos (26 carbonos y un nitrógeno) en la cadena de acilo. El bolsillo de unión A 'hidrofóbico en CD1d acomoda de manera óptima una longitud de cadena de acilo que contiene 26 átomos de carbono. Entonces, se usó ácido tetracosanoico ya que este se procesaría a través de un producto de urea que contiene 25 átomos en la cadena de acilo (24 carbonos y un nitrógeno). Dado que el análogo de a-GalCer que contiene una cadena de acilo C24 muestra una actividad biológica similar a la de a-GalCer que contiene una cadena de C26, las diferencias en la actividad biológica entre un análogo de ureido que contiene 25 átomos en la cadena de acilo (es decir, 7) y a-GalCer serían atribuibles a un cambio de amida-urea y no es el resultado de la longitud de la cadena de alquilo ligeramente truncada. El isocianato de tricosanilo se preparó debidamente a partir de ácido tetracosanoico en tres pasos. El tratamiento del cloruro de tetracosanoilo con NaN³ proporcionó la azida ácida correspondiente, que se sometió a un reordenamiento de Curtius al calentar en tolueno a reflujo para proporcionar isocianato de tricosanilo. Sin purificación, el isocianato se hizo reaccionar con la amina 17 para proporcionar urea 19 con un rendimiento del 68%. La hidrogenólisis de los grupos bencilo en la amida 18 y la urea 19 efectuó una desprotección global y proporcionó urea 7, junto con a-GalCer 1, que serviría como control en los estudios biológicos (Esquema 1).

Síntesis de a-GalCer 1 y urea 7. (a) 14, PPh³, CBr⁴ , CH²Cl², t.a., 3 h; luego Me²C(O) NMe² , Bu⁴NBr, CH²Ch; luego 15, CH²Cl², 3 A MS, t.a., 3 d, 62%. (b) PMe³, THF, t.a., 4 h, luego H²O, 1 h, 72%. (c) CH³(CH²)²⁴C(O)Cl, Et³N, CH²CI² , 0°C a temperatura ambiente, 8 h, 18 (54%). (d) CH³(CH²)²²NCO, tolueno, reflujo, 8 h, 19 (68%). (e) Pd(OH)²/C, H² , THF, t.a., 22 h: 1 (68% de 17); 7 (73% de 17).

Aunque comúnmente se emplean benciléteres en grupos protectores, particularmente en la química de carbohidratos, los efectos conformacionales pueden significar que algunos grupos son particularmente tercos para eliminar. De hecho, este resultó ser el caso con uno de los benciléteres en la unidad de fitoesfingosina de la amida 18 y la urea 19; la desbencilación a menudo era lenta, y con frecuencia requería filtración de la mezcla de reacción y adición de catalizador nuevo para efectuar la desprotección completa. Para abordar este problema complejo, se investigó un aceptor de fitoesfingosina modificado en donde el 1,2-diol interno estaba protegido como un acetal de isopropilideno. El uso de un acetal para proteger el 1,2-diol interno en la fitoesfingosina probablemente requeriría una desprotección en dos pasos después de la glicosilación; sin embargo, una hidrólisis del acetal en etapa tardía no fue problemática y, lo que es más importante, el paso de desbencilación sería significativamente más fácil. Además, el paso de desprotección adicional se mitigaría mediante su síntesis directa de dos pasos a partir de fitoesfingosina, en comparación con la síntesis de tres pasos requerida para acceder al dibencil éter 15.

Aunque la elección de los pares donante/aceptor puede afectar la estereoselectividad de las reacciones de glicosilación, se pudo acceder al galactósido 20 en condiciones estándar con un rendimiento similarmente bueno y una vez más con a-estereoselectividad completa (Esquema 2). La posterior reducción de Staudinger proporcionó la amina 21, que fue acilada como antes para proporcionar la amida 22. Alternativamente, la reacción con un carbonato mixto, preparado a partir de 1-tetracosanol y carbonato de N,N'-disuccinimidilo proporcionó carbamato 23. Una hidrólisis/desbencilación de acetal en dos etapas secuencia en 22 y 23 procedió sin incidentes en ambos casos, para proporcionar a-GalCer y derivado de carbamato 8, respectivamente. Finalmente, la tioamida 6 se preparó a partir de a-GalCer en una secuencia de tres pasos, que implica la peracetilación para proporcionar 24, la quimioselectiva de la amida con el reactivo de Lawesson para proporcionar tioamida 25, seguido de desacetilación en condiciones de Zémplen (Esquema 2).

E sq u em a 2

Síntesis mejorada de a-GalCer 1 y síntesis de carbamato ⁸ y tioamida ⁶. (a) PMe³ , THF, 3 h, t.a., luego H²O, 1 h, 93%. (b) CH³(CH²)²⁴C(O)Cl, Et³N, CH²CU 0°C a t.a., 12 h, 22 (85%). (c) carbonato de N-succinimidil-tetracosanilo, Et³N, CH²Cl², t.a., 4 h, 23 (82%). (d) de 22: (i) TFA, CH²O ²-H²O, 10:1, 2 h, t.a.; (ii) Pd(OH)²/C, H², THF, ⁶ h, 1 (75%). (e) de 23: (i) TFA, CH²Cl²-MeOH, 2:1, 2 h, t.a.; (ii) Pd(OH)²/C, H², THF, ⁶ h, ⁸ (75%). (f) Ac²O, piridina, t.a., 10 h, 94%. (g) Reactivo de Lawesson, tolueno, 80°C, 4 h, 85%. (h) NaOMe, MeOH, t.a., 2 h, 90%.

La síntesis de ThrCer 2 y sus tres análogos 9, 10 y 11 se describe a continuación. El fácil acceso a un intermedio avanzado, a saber, la amina 26, utilizando una ligera modificación de la metodología establecida previamente junto con la desarrollada para generar los tres análogos de a-GalCer, proporcionó acceso directo a los análogos de ThrCer correspondientes como se resume en el Esquema 3. ThrCer 2 fue sintetizado de la amina 26 en una secuencia de tres pasos que implica acilación, seguido de desprotección de silil éter e hidrólisis de acetal. La tionación del producto de acilación 27 proporcionó tioamida ^{2 8} , que se sometió a los mismos dos pasos de desprotección para proporcionar el primer objetivo ThrCer, a saber, el análogo de tioamida 9. Alternativamente, el tratamiento de la amina 26 con el carbonato mixto derivado de la reacción de 1-tetracosanol con N,N'-disuccinimidilo carbonato, provisto de carbamato 29, y con isocianato de tricosanilo, proporcionó urea 30, y de allí los dos objetivos finales, carbamato 11 y urea 10, después de la desprotección de sililo y la hidrólisis del acetal (Esquema 3).

Síntesis de ThrCer 2 y análogos de tioamida, urea y carbamato. (a) CH³(CH²)²⁴C(O)Cl, Et³N, CH²Cl², 0°C a t.a., 12 h, 85%. (b) Reactivo de Lawesson, tolueno, 80°C, 5 h, 88%. (c) Bu⁴NF, THF, t.a., 4 h. (d) TFA, CH²Cl²-MeOH (10:1), t.a.; 2 (74% de 27); 9 (73% de 28); 10 (72% de 30); 11 (70% de 29). (e) carbonato de N-succinimidil-tetracosanilo, Et³N, CH²Cl², t.a., 5 h, 29 (86%). (f) CH³(CH²)²⁴NCO, tolueno, reflujo, 8 h, 30 (80%).

El esquema 4 muestra una síntesis general para preparar compuestos de sulfamidato como se describe en el presente documento.

El esquema 5 muestra una síntesis general para preparar compuestos anulares de siete miembros como se describe en el presente documento.

Esquema 5

El esquema 6 muestra una síntesis general para preparar compuestos de anillo de seis miembros como se describe en el presente documento.

Esquema 6

El esquema 7 muestra una síntesis general para preparar compuestos de anillo de ocho miembros como se describe en este documento.

Como en el presente documento, los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse en composiciones farmacéuticas con un excipiente farmacéuticamente aceptable. El compuesto o composición que comprende el compuesto se administra por cualquier ruta que permita el tratamiento de la enfermedad o afección. Una ruta de administración es la administración oral. Además, el compuesto o composición que comprende el compuesto puede administrarse a un paciente usando cualquier vía de administración estándar, incluyendo parenteralmente, tal como por vía intravenosa, intraperitoneal, intrapulmonar, subcutánea o intramuscular, intratecal, tópica, transdérmica, rectal, oral, nasal o inhalación. Las formulaciones de liberación lenta también pueden prepararse a partir de los agentes descritos en el presente documento para lograr una liberación controlada del agente activo en contacto con los fluidos corporales en el tracto gastrointestinal y para proporcionar un nivel sustancial constante y efectivo del agente activo en el plasma sanguíneo. La forma cristalina se puede incrustar para este propósito en una matriz polimérica de un polímero biológicamente degradable, un polímero soluble en agua o una mezcla de ambos, y opcionalmente tensioactivos adecuados. La inclusión puede significar en este contexto la incorporación de micropartículas en una matriz de polímeros. Las formulaciones de liberación controlada también se obtienen a través de la encapsulación de micropartículas dispersas o microgotas emulsionadas a través de tecnologías conocidas de recubrimiento por dispersión o emulsión.

La administración puede tomar la forma de administración de dosis única, o un compuesto como se describe en el presente documento puede administrarse durante un período de tiempo, ya sea en dosis divididas o en una formulación de liberación continua o método de administración (por ejemplo, una bomba). Sin embargo, los compuestos se administran al sujeto, las cantidades de compuesto administradas y la ruta de administración elegida deben seleccionarse para permitir un tratamiento eficaz de la condición de enfermedad.

Las composiciones farmacéuticas se formulan con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, disolventes, estabilizadores, adyuvantes, diluyentes, etc., dependiendo del modo particular de administración y la forma de dosificación. Las composiciones farmacéuticas generalmente deben formularse para lograr un pH fisiológicamente compatible, y pueden variar de un pH de aproximadamente 3 a un pH de aproximadamente 11, preferiblemente de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, dependiendo de la formulación y la vía de administración. Alternativamente, el pH se ajusta a un rango de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8. Más particularmente, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de al menos un compuesto como se describe en el presente documento, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una combinación de los compuestos descritos aquí, o pueden incluir un segundo ingrediente activo útil en el tratamiento o prevención de infección bacteriana (por ejemplo, agentes antibacterianos o antimicrobianos).

Las formulaciones, por ejemplo, para administración parenteral u oral, son más típicamente sólidos, soluciones líquidas, emulsiones o suspensiones, mientras que las formulaciones inhalables para administración pulmonar son generalmente líquidos o polvos. Una composición farmacéutica también se puede formular como un sólido liofilizado que se reconstituye con un disolvente fisiológicamente compatible antes de la administración. Se pueden formular composiciones farmacéuticas alternativas como jarabes, cremas, pomadas, tabletas y similares.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente para la administración de un agente farmacéutico, tal como los compuestos descritos aquí. El término se refiere a cualquier excipiente farmacéutico que pueda administrarse sin toxicidad indebida.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences).

Los excipientes adecuados pueden ser moléculas transportadoras que incluyen macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Otros excipientes de ejemplo incluyen antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), carbohidratos (por ejemplo, dextrina, hidroxialquilcelulosa y/o hidroxialquilmetilcelulosa), ácido esteárico, líquidos (por ejemplo, aceites, agua, solución salina, glicerol y/o etanol) agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras de pH y similares. Los liposomas también se incluyen dentro de la definición de excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se formulan en cualquier forma adecuada para un método de administración pretendido. Cuando están destinadas para uso oral, por ejemplo, se pueden preparar tabletas, grageas, pastillas, suspensiones acuosas o oleosas, soluciones no acuosas, polvos o gránulos dispersables (incluyendo partículas micronizadas o nanopartículas), emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes o elíxires. Las composiciones destinadas a uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y tales composiciones pueden contener uno o más agentes que incluyen agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, para proporcionar un preparación paladeable.

Excipientes farmacéuticamente aceptables particularmente adecuados para su uso junto con tabletas incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como celulosas, carbonato de calcio o sodio, lactosa, fosfato de calcio o sodio; agentes desintegrantes, tales como povidona entrecruzada, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, tales como povidona, almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Las tabletas pueden no ser recubiertas o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas que incluyen microencapsulación para retrasar la desintegración y la adsorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera.

Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo celulosas, lactosa, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con medio no acuoso o aceitoso, como glicerina, propilenglicol, polietilenglicol, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como suspensiones que comprenden un compuesto mezclado con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para la fabricación de una suspensión.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión mediante la adición de excipientes adecuados.

Los excipientes adecuados para uso en conexión con suspensiones incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto, goma arábiga); agentes dispersantes o humectantes (por ejemplo, un fosfátido natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetileneoxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitano); y agentes espesantes (por ejemplo, carbómero, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico). Las suspensiones también pueden contener uno o más conservantes (por ejemplo, ácido acético, metil o n-propil p-hidroxibenzoato); uno o más agentes colorantes; uno o más agentes aromatizantes; y uno o más agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina.

Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, como el aceite de oliva o el aceite de araquis, un aceite mineral, como parafina líquida, o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas naturales, tales como goma arábiga y goma de tragacanto; fosfátidos de origen natural, tales como lecitina de soja, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos; anhídridos de hexitol, tales como monooleato de sorbitán; y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como monooleato de polioxietilensorbitán. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y aromatizantes. Los jarabes y elíxires pueden formularse con agentes edulcorantes, tales como glicerol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservante, un saborizante o un agente colorante.

Además, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, tal como una emulsión acuosa inyectable estéril o suspensión oleaginosa. Esta emulsión o suspensión puede ser formulada por un experto en la materia utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados, incluidos los mencionados anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como una solución en 1,2-propano-diol.

La preparación inyectable estéril también se puede preparar como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringery solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se pueden emplear aceites fijos estériles como solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además también pueden usarse ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico) en la preparación de inyectables.

Para obtener una forma de dosis estable soluble en agua de una composición farmacéutica, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto descrito en este documento puede disolverse en una solución acuosa de un ácido orgánico o inorgánico, tal como una solución de ácido succínico 0.3 M, o más preferiblemente, ácido cítrico. Si no se dispone de una forma de sal soluble, el compuesto puede disolverse en un codisolvente o combinación de codisolventes adecuados. Ejemplos de codisolventes adecuados incluyen alcohol, propilenglicol, polietilenglicol 300, polisorbato 80, glicerina y similares en concentraciones que varían de aproximadamente 0 a aproximadamente 60% del volumen total. En un ejemplo, el compuesto activo se disuelve en DMSO y se diluye con agua.

La composición farmacéutica también puede estar en forma de una solución de una forma de sal del ingrediente activo en un vehículo acuoso apropiado, tal como agua o solución salina isotónica o solución de dextrosa. También se contemplan compuestos que han sido modificados por sustituciones o adiciones de unidades estructurales químicas o bioquímicas que los hagan más adecuados para la administración (por ejemplo, aumentan la solubilidad, la bioactividad, la palatabilidad, disminuyen las reacciones adversas, etc.), por ejemplo por esterificación, glicosilación, PEGilación etc.

Algunos compuestos descritos en el presente documento pueden formularse para administración oral en una formulación a base de lípidos adecuada para compuestos de baja solubilidad. Las formulaciones a base de lípidos generalmente pueden mejorar la biodisponibilidad oral de tales compuestos.

Como tales, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un compuesto descrito en este documento, junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos de cadena media y sus ésteres de propilenglicol (por ejemplo, ésteres de propilenglicol de ácidos grasos comestibles, como los ácidos grasos caprílico y cáprico) y tensioactivos farmacéuticamente aceptables, como el aceite de ricino hidrogenado polioxil 40.

Se pueden añadir algunas ciclodextrinas como potenciadores de la solubilidad acuosa. Ejemplos de ciclodextrinas incluyen derivados de hidroxipropilo, hidroxietilo, glucosilo, maltosilo y maltotriosilo de a-, p- y Y-ciclodextrina. Un potenciador específico de la solubilidad de la ciclodextrina es la hidroxipropil-o-ciclodextrina (BPBc ), que se puede agregar a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente para mejorar aún más las características de solubilidad acuosa de los compuestos. La composición puede comprender de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 20% de hidroxipropil-o-ciclodextrina, más preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% de hidroxipropil-o-ciclodextrina, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 2.5% a aproximadamente 10% de hidroxipropil-o-ciclodextrina. La cantidad de potenciador de solubilidad empleado dependerá de la cantidad del compuesto en la composición.

Métodos de tratamiento

Se describen en el presente documento métodos para tratar diferentes tipos de cáncer en un sujeto (por ejemplo, un mamífero) que lo necesita, que comprende administrar al sujeto el compuesto o composición como se describe en el presente documento en una cantidad efectiva para tratar dicho cáncer. En algunos casos, el sujeto mamífero es un sujeto humano. También se contempla la práctica de los métodos descritos en este documento en otros sujetos mamíferos, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en humanos (por ejemplo, primates, porcinos, caninos o conejos). Se utilizan estudios estándar de dosisrespuesta para optimizar la dosis y el horario de dosificación.

Los métodos descritos son útiles para tratar el cáncer, por ejemplo, inhibir el crecimiento del cáncer, incluida la remisión completa del cáncer, para inhibir la metástasis del cáncer y para promover la resistencia al cáncer. El término "crecimiento del cáncer" generalmente se refiere a cualquiera de una serie de índices que sugieren un cambio dentro del cáncer a una forma más desarrollada. Por lo tanto, los índices para medir una inhibición del crecimiento del cáncer incluyen, entre otros, una disminución en la supervivencia de las células cancerosas, una disminución en el volumen del tumor o la morfología (por ejemplo, según se determina mediante tomografía computarizada (TC), ecografía u otro método de imagen), un crecimiento tumoral retrasado, una destrucción de la vasculatura tumoral, un mejor rendimiento en la prueba cutánea de hipersensibilidad retardada, un aumento en la actividad de los linfocitos T citolíticos y una disminución en los niveles de antígenos específicos de tumor.

El término "resistencia al cáncer" se refiere a una capacidad mejorada de un sujeto para resistir el crecimiento del cáncer, en particular el crecimiento de un cáncer que ya tenía. En otras palabras, el término "resistencia al cáncer" se refiere a una disminución de la propensión al crecimiento del cáncer en un sujeto.

Los cánceres pueden comprender un tumor sólido, por ejemplo, un carcinoma y un sarcoma. Los carcinomas incluyen neoplasmas malignos derivados de células epiteliales que se infiltran, por ejemplo, invaden los tejidos circundantes y dan lugar a metástasis. Los adenocarcinomas son carcinomas derivados del tejido glandular, o de tejidos que forman estructuras glandulares reconocibles. Otra categoría amplia de cánceres incluye sarcomas y fibrosarcomas, que son tumores cuyas células están incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea, como el tejido conectivo embrionario. También se describen en el presente documento métodos de tratamiento de cánceres de sistemas mieloides o linfoides, que incluyen leucemias, linfomas y otros cánceres que típicamente no están presentes como una masa tumoral, pero se distribuyen en los sistemas vascular o linforreticular. Se contemplan además métodos para el tratamiento de oncología pediátrica y de adultos, crecimiento de tumores sólidos/tumores malignos, carcinoma mixoide y de células redondas, tumores localmente avanzados, metástasis de cáncer, incluidas metástasis linfáticas. Los cánceres enumerados aquí no pretenden ser limitantes. La edad (niño y adulto), sexo (hombre y mujer), primario y secundario, pre y postmetastásico, agudo y crónico, benigno y maligno, ejemplos de cáncer de localización anatómica y variaciones son objetivos contemplados. Los cánceres se agrupan por origen embrionario (por ejemplo, carcinoma, linfomas y sarcomas), por órgano o sistema fisiológico, y por agrupación miscelánea. Los cánceres particulares pueden superponerse en su clasificación, y su inclusión en un grupo no los excluye de otro.

Los carcinomas que pueden ser abordados incluyen adrenocortical, acinar, células acínicas, acinosas, adenoquísticas, adenoides quísticas, adenoides, células escamosas, cáncer adenomatoso, adenoescamoso, anexel, cáncer de corteza suprarrenal, adrenocortical, productor de aldosterona, secreción de aldosterona, alveolar, células alveolares, cáncer de glándula tiroides ameloblástico, ampular y anaplásico, glándula apocrina, célula basal, célula basal, alveolar, célula basal de comedón, célula basal quística, célula basal similar a la morfea, célula basal multicéntrica, célula basal nódulo-ulcerativa, célula basal pigmentada, célula basal esclerosante, célula basal superficial, basaloide, células basoescamosas, conducto biliar, conducto biliar extrahepático, conducto biliar intrahepático, bronquioalveolar, bronquiolar, bronquioloalveolar, broncoalveolar, células broncoalveolares, broncogénico, cerebriforme, colangiocelular, coriónico, plexo coroideo, células claras, anal cloacogénico, coloide, comedón, cuerpo, cáncer de cuerpo uterino, cortisol, cribiforme, cilíndrico, células cilíndricas, conducto, ductal, cáncer ductal de próstata, cáncer ductal in situ (DCIS), ecrino, embrionario, cáncer en coraza, endometrial, cáncer de endometrio, endometroide, epidermoide, cáncer de tumor mixto, cáncer de pleomorfo adenoma, exofítico, fibrolamelar, cáncer fibroso, cáncer folicular de la glándula tiroides, gástrico, gelatina, gelatinosa, células gigantes, cáncer de células gigantes de la glándula tiroides, cáncer gigantocelular, glandular, células granulosas, hepatocelular, células de Hürthle, hipernefroide, embrionario infantil, carcinoma de células de islote, cáncer inflamatorio de seno, cáncer in situ, intraductal, intraepidérmico, intraepitelial, juvenil embrionario, células de Kulchitsky, células grandes, leptomeníngeas, lobulares, lobulares infiltrantes, lobular invasivo, cáncer lobular in situ (CLIS), linfoepitelial, cáncer medular, medular, cáncer medular de glándula tiroides, tiroides medular, melanótica, meníngea, célula de Merkel, célula metatípica, micropapilar, mucinoso, cáncer de muciparum, cáncer mucocelular, mucoepidermoide, cáncer mucoso, mucoso, nasofaríngeo, cáncer neuroendocrino de la piel, cáncer no infiltrante, cáncer de pulmón de células no pequeñas, (NSCLC), células avena, cáncer osificante, osteoide, cáncer de Paget, papilar, cáncer papilar de la glándula tiroides, periampular, preinvasivo de células espinosas, intraestásico primario, células renales, cicatriz, vejiga esquistosómica, schneideriana, escirrea, sebácea, células de anillo de sello, cáncer simple, células pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), células fusiformes, cáncer esponjoso, escamoso, células escamosas, conducto terminal, tiroides anaplásico, tiroides folicular, tiroides medular, tiroides papilar, cáncer de piel trabecular, cáncer de células de transición, tubulares, cáncer indiferenciado de la glándula tiroides, cuerpo uterino, verrugoso, velloso, cáncer vellositario, saco vitelino, células escamosas en particular de la cabeza y cuello, células escamosas esofágicas y cánceres y carcinomas orales.

Los sarcomas que pueden abordados incluyen adiposo, parte blanda alveolar, ameloblástico, aviar, botrioide, sarcoma botrioides, pollo, cloromatoso, condroblástico, sarcoma de células claras de riñón, embrionario, estroma endometrial, epitelioide, Ewing, fascial, fibroblástico, ave, células gigantes, granulocíticas, hemangioendoteliales, Hodgkin, hemorragia idiopática múltiple pigmentada, sarcoma inmunoblástico de células B, sarcoma inmunoblástico de células T, Jensen, Kaposi, células Kupffer, leucocíticas, linfáticas, melanóticas, células mixtas, múltiples, linfangio, hemorrágico idiopática sarcoma primario multipotencial de hueso, osteoblástico, osteogénico, parosteal, polimorfo, pseudokaposi, células reticulares, sarcoma de células reticulares del cerebro, rabdomiosarcoma, rous, tejidos blandos, células fusiformes, sinovial, telangiectásico, sarcoma (osteosarcoma)/histiocitoma fibroso maligno de hueso y sarcomas de tejidos blandos.

Los linfomas que pueden ser abordados incluyen relacionados con SIDA, no Hodgkin, Hodgkin, células T, leucemia/linfoma de células T, africano, células B, monocitoides de células B, maligno bovino, Burkitt, centrocítico, linfoma cutáneo, difuso, difuso, de células grandes, difuso, mezclado de células pequeñas y grandes, difuso, de células divididas pequeñas, folicular, célula central folicular, folicular, mezclado de células pequeñas divididas y grandes, folicular, predominantemente de células grandes, folicular, predominantemente de células divididas, folículo gigante, folicular gigante, granulomatoso, histiocítico, células grandes, inmunoblástico, célula hendida grande, célula no hendida grande, Lennert, linfoblástico, linfocítico, intermedio; linfocítico, intermedio diferenciado, plasmacitoide; linfocitos poco diferenciados, linfocitos pequeños, linfocitos bien diferenciados, linfoma de ganado; MALT, célula del manto, zona del manto, zona marginal, linfoma mediterráneo mixto linfocito-histiocítico, nodular, plasmacitoide, pleomórfico, sistema nervioso central primario, derrame primario, célula B pequeña, célula pequeña escindida, células pequeñas conescindidas, linfomas de células T; células T contorneadas, células T cutáneas, células T linfocíticas pequeñas, linfoma indefinido, células U, indiferenciadas, relacionadas con el sida, sistema nervioso central, células T cutáneas, derrame (basado en la cavidad corporal), linfoma tímico y linfomas cutáneo de células T.

Las leucemias y otras neoplasias malignas de células sanguíneas que pueden ser dirigidas incluyen linfoblástica aguda, mieloide aguda, linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, mielógena crónica, células pilosas, eritroleucemia, linfoblástica, mieloide, linfocítica, mielógena, leucemia, células pilosas, Células T, monocíticas, mieloblásticas, granulocíticas, macroscópica, células espejo de mano, basófilo, hemoblástico, histiocítico, leucopénico, linfático, de Schilling, de células madre, mielomonocítico, monocítico, prolinfocítico, promielocítico, micromieloblástico, megacarioblástico, megacarioctítico, células rieder, bovina, aleucémica, mastocitos, mielocítico, célula de plasma, subleucémico, mieloma múltiple, no linfocítico, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, síndrome mielodisplásico y mielodisplasia y leucemias mielocíticas crónicas.

Los cánceres y tumores del cerebro y del sistema nervioso central (SNC) que pueden ser abordados incluyen astrocitomas (incluidos cerebeloso y cerebral), glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales, gliomas malignos, ependimoma, glioblastoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, ruta visual y gliomas hipotalámicos, linfoma primario del sistema nervioso central, ependimoma, glioma del tronco encefálico, ruta visual y glioma hipotalámico, tumor extracraneal de células germinales, meduloblastoma, síndromes mielodisplásicos, oligodendroglioma, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, neuroblastoma, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, linfoma del sistema nervioso central, tumores cerebrales intrínsecos, tumores cerebrales astrocíticos, gliomas e invasión de células tumorales metastásicas en el sistema nervioso central.

Los cánceres gastrointestinales que pueden ser abordados incluyen cáncer de conducto biliar extrahepático, cáncer de colon, cáncer de colon y recto, cáncer colorrectal, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, cánceres de vejiga, carcinoma de células islote (páncreas endocrino), cáncer de páncreas, cáncer de páncreas de células islote, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de glándulas salivales, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon y pólipos asociados con neoplasia colorrectal.

Los cánceres de pulmón y respiratorios que pueden ser abordados incluyen adenomas/carcinoides bronquiales, cáncer de esófago, cáncer esófagico, , cáncer de hipofaringe, cáncer de laringe, cáncer de hipofaringe, tumor carcinoide de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, carcinoma de células pequeñas de los pulmones, mesotelioma, cavidad nasal y cáncer de seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer oral, cáncer de cavidad oral y labio, cáncer orofaríngeo; cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, y blastoma pleuropulmonar.

Los cánceres del tracto urinario y reproductivo que pueden ser abordados incluyen cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer epitelial de ovario, tumor extragonadal de células germinales, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, tumor de células germinales de ovario, tumor gestacional trofoblástico, bazo, cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de pene, cáncer de células renales (incluidos carcinomas), cáncer de células renales, pelvis renal y uréter (cáncer de células de transición), cáncer de células transicionales del pelvis renal y uréter, tumor trofoblástico gestacional, cáncer testicular, uréter y pelvis renal, cáncer de células transicionales, cáncer uretral, cáncer uterino endometrial, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, carcinoma de ovario, neoplasias epiteliales peritoneales primarias, carcinoma cervical, cáncer uterino y tumores sólidos en el folículo ovárico), tumores vesicales superficiales, carcinoma invasivo de células de transición de la vejiga y cáncer de vejiga invasivo muscular.

Los cánceres de piel y melanomas (así como los no melanomas) que pueden ser abordados incluyen linfoma cutáneo de células T, melanoma intraocular, progresión tumoral de queratinocitos de piel humana, carcinoma de células basales y cáncer de células escamosas. Los cánceres de hígado que pueden ser abordados incluyen cáncer de conducto biliar extrahepático y cánceres hepatocelulares. Los cánceres oculares que pueden ser abordados incluyen melanoma intraocular, retinoblastoma y melanoma intraocular. Los cánceres hormonales que pueden ser abordados incluyen: cáncer de paratiroides, tumores neuroectodérmicos primitivos pineales y supratentoriales, tumor hipofisario, timoma y carcinoma tímico, timoma, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de la corteza suprarrenal y tumores productores de ACTH.

Otros cánceres diversos que pueden ser abordados incluyen cánceres avanzados, relacionados con el SIDA, cáncer anal, cortical suprarrenal, anemia aplásica, anilina, betel, mejilla buyo, cerebriforme, de deshollinador, tubo de arcilla, coloide, por contacto, quístico, dendrítico, cáncer a deux, de ductos, teñido, encefaloide, cáncer en coraza, endometrial, endotelial, epitelial, glandular, cáncer in situ, kang, kangri, latente, medular, melanótico, del mulero, células no pequeñas de pulmón, cáncer oculto, por parafina, de trabajadores de la brea, de cicatriz, vejiga esquistosómica, escirro, ganglio linfático, pulmón de células pequeñas, cánceres blandos, por hollín, células fusiformes, de pantano, por alquitrán y cánceres tubulares.

Otros tipos de cáncer que pueden ser abordados también incluyen la enfermedad de Castleman carcinoide (gastrointestinal y bronquial) trastornos mieloproliferativos crónicos, sarcoma de células claras de vainas tendinosas, familia de tumores de Ewing, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de labio y cavidad oral, macroglobulinemia de Waldenstrom, cáncer de cuello escamoso metastásico con síndrome de neoplasia endocrina primaria oculta, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, tumor de Wilms, micosis fungoide, feocromocitoma, síndrome de Sezary, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, sitio primario desconocido, derrame peritoneal, derrame pleural maligno, neoplasmas trofobláticos y hemangiopericitoma.

Además se describen en el presente documento métodos para estimular una respuesta inmune en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descritos en el presente documento. En algunos métodos, el compuesto o composición se administra directamente al sujeto de la misma manera que una vacuna. En algunos métodos, los compuestos descritos aquí son útiles para la inducción de una respuesta inmune a un antígeno tumoral, uno o más organismos patógenos u otro antígeno como se describe aquí.

Dosificación

Los términos "cantidad terapéuticamente efectiva" y "cantidad profilácticamente efectiva", como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad de un compuesto suficiente para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad o afección identificada, o para exhibir una terapia terapéutica, profiláctica detectable, o efecto inhibitorio. El efecto puede detectarse, por ejemplo, mediante una mejora en el estado clínico, reducción en los síntomas, o mediante cualquiera de los ensayos o pruebas de diagnóstico clínico descritos en este documento. La cantidad efectiva precisa para un sujeto dependerá del peso corporal, el tamaño y la salud del sujeto; la naturaleza y extensión de la condición; y la terapéutica o combinación de terapias seleccionadas para la administración. Las cantidades terapéuticamente y profilácticamente efectivas para una situación dada pueden determinarse mediante experimentación de rutina que está dentro de la habilidad y el criterio del tratante clínico.

Las dosis del agente terapéutico se pueden administrar como una dosis medida en mg. Las dosis contempladas de los agentes terapéuticos descritos incluyen aproximadamente 0.1 mg a 5000 mg (5 g). Los intervalos específicos de dosis en mg incluyen aproximadamente 1 mg a aproximadamente 4000 mg, aproximadamente 2 mg a aproximadamente 3000 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 2000 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 20 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 30 mg a aproximadamente 200 mg y aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg. Las dosis pueden ser cantidades diarias totales administradas a un sujeto o la dosis administrada en cualquier momento. Por lo tanto, la dosis se puede administrar como una dosis única o en dosis divididas a lo largo del día (por ejemplo, en dos, tres, cuatro o cinco dosis en el transcurso de un día).

Las dosis terapéuticas se pueden administrar alternativamente como una dosis medida en mg/kg (mg de compuesto por kilogramo de peso corporal para el sujeto tratado). Las dosis contempladas de mg/kg de la terapéutica descrita incluyen aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg. Los rangos específicos de dosis en mg/kg incluyen aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, y aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

Terapia de combinación

Los métodos descritos en el presente documento también pueden incluir el uso de un compuesto o compuestos como se describe en el presente documento junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de enfermedades. Así, por ejemplo, la combinación de ingredientes activos puede: (1) formularse conjuntamente y administrarse o administrarse simultáneamente en una formulación combinada; (2) administrarse por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por cualquier otro régimen de terapia de combinación conocido en la técnica. Cuando se administran en terapia de alternancia, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender administrar o suministrar los ingredientes activos secuencialmente, por ejemplo, en solución, emulsión, suspensión, tabletas, píldoras o cápsulas separadas, o mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia de alternancia, una dosis efectiva de cada ingrediente activo se administra secuencialmente, es decir, en serie, mientras que en la terapia simultánea, las dosis efectivas de dos o más ingredientes activos se administran juntas. También se pueden usar varias secuencias de terapia de combinación intermitente. En algunos casos, un compuesto descrito en este documento se administra y/o formula con un segundo agente terapéutico.

El segundo agente terapéutico puede ser uno o más de un agente quimioterapéutico o inmunoterapéutico. En algunos casos específicos, el segundo agente terapéutico es una citoquina, un agente antiinflamatorio, una vacuna contra el cáncer, un antígeno canceroso o un polinucleótido que codifica un antígeno canceroso. En algunos casos, la segunda terapéutica es radiación.

Los productos quimioterapéuticos contemplados para su uso en terapias combinadas como se describen en el presente documento incluyen aspirina, sulindaco, curcumina, agentes alquilantes que incluyen: mostazas nitrogenadas, tales como meclorometamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan y clorambucilo; nitrosoureas, tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) y semustina (metil-CCNU); etileniminas/metilmelamina tales como trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); alquil sulfonatos tales como busulfan; triazinas tales como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos que incluyen análogos de ácido fólico como metotrexato y trimetrexato, análogos de pirimidina como 5-fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinósido (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxititidina, análogos de purina como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); productos naturales que incluyen fármacos antimitóticos tales como paclitaxel, alcaloides de la vinca que incluyen vinblastina (VLB), vincristina y vinorrelbina, taxotere, estramustina y fosfato de estramustina; epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C y actinomicina; y enzimas como la L-asparaginasa.

Los agentes modificadores de la respuesta biológica contemplados para su uso en terapias combinadas como se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, interferón alfa, IL-2, G-CSF y GM-CSF; agentes diversos que incluyen complejos de coordinación de platino como cisplatino y carboplatino, antracenodionas como mitoxantrona, urea sustituida como hidroxiurea, derivados de metilhidrazina que incluyen N-metilhidrazina (MIH) y procarbazina, supresores adrenocorticales como mitotano (o, p'-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas que incluyen antagonistas de adrenocorticosteroides tales como prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol; estrógenos tales como dietilestilbestrol y equivalentes de etinilestradiol; antiestrógeno tal como tamoxifeno; andrógenos que incluyen propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tales como flutamida, análogos de hormonas liberadoras de gonadotropina y leuprolida; antiandrógenos no esteroideos tales como flutamida; inhibidores de la quinasa, inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de la metilación, inhibidores del proteasoma, anticuerpos monoclonales, oxidantes, antioxidantes, inhibidores de la telomerasa, miméticos de BH3, inhibidores de la ubiquitina ligasa, inhibidores del estado e inhibidores de la tirosina quinasa del receptor como el mesilato de imatinib (comercializado como Gleevac o Gliva) y erlotinib (un inhibidor del receptor de EGF) ahora comercializado como Tarveca; y antivirales como el fosfato de oseltamivir, anfotericina B y palivizumab.

Los agentes inmunoterapéuticos contemplados para su uso en las terapias de combinación descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo receptor Her2/neu tal como trastuzumab (comercializado como Herceptin®), un anticuerpo anti-CD52 tal como alemtuzumab (comercializado como Campath®). MabCampath® o Campath-1H), un anticuerpo anti-CD33 como gemtuzumab vinculado a caliqueamicina (comercializado como Mylotarg®), un anticuerpo anti-CD20 como rituximab (comercializado como Rituxan® y MabThera®), Ibritumomab tiuxetan (comercializado como Zevalin®), anticuerpos anti-TNFa como infliximab (comercializado como Remicade®) o adalimmumab (comercializado como Humira®), una molécula soluble de TNFR2 como etanercept (comercializado como Enbrel®), un anticuerpo contra la cadena CD25 de la IL-2 receptores como el basiliximab (comercializado como Simulect®), un anticuerpo anti CD40/CD40L como el anticuerpo humanizado IgG1 anti-CD40 humano (SGN-40), un anticuerpo bloqueante anti-CTLA-4 como iplimumab (comercializado como MDX-101 o MDX-010) o tremelimumab, una muerte anti-programada anticuerpo de la proteína 1 (PD-1) (es decir, un anticuerpo anti-CD279), un anticuerpo anti-programado del ligando de muerte celular (PDL-1), un anticuerpo relacionado con el gen TNFR (GITR) inducido por anti-glucocorticoides, un anti-anticuerpo OX-40 (CD134), modulador inmune basado en el gen 3 de activación de linfocitos solubles (también conocido como LAG3 o CD223) como LAG3-Ig (IMP321), agonistas de los receptores tipo Toll como el lípido A de monofosforilo (MPL®), CpG , ARN monocatenario, nucleótidos, análogo de nucleótido, CL087 (un ligando específico de TLR7), loxorribina, ácido poliinosina-policitidílico, flagelina, resiquimod, immiquimod, gardiquimod, ligandos NOD tales como dipéptido muramilo, murabutido, peptidoglican y muramildipéptido .

Una terapia de combinación como se describe en el presente documento comprende la administración de un compuesto descrito en el presente documento, tal como un compuesto que tiene una estructura:

en donde n es 1, 2 o 3, o una sal, éster, solvato o hidrato del mismo y uno o más anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-CTLA-4 un anticuerpo anti-GITR y un anticuerpo anti-OX40.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD1 es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de la superficie celular humana inmunorreguladora negativo PD-1 con actividad de inmunopotenciación. Un ejemplo de anticuerpo anti-PDl es el anticuerpo monoclonal humano MDX-1106 que se une y bloquea la activación de PD-1 por sus ligandos PD-L1 y PD-L2, lo que resulta en la activación de células T y respuestas inmunes mediadas por células contra el tumor celular. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el ligando de proteína PD-L1 con actividades inmunomoduladoras y antineoplásicas. Un ejemplo de anticuerpo anti-PD-L1 es el anticuerpo monoclonal humano MDX-1105 que se une a PD-L1 y bloquea su unión y activación de su receptor PD-1, lo que puede mejorar la respuesta inmune mediada por células T a las neoplasias y revertir la inactivación de células T en la enfermedad de infecciones crónicas. PD-L1 se expira ampliamente en tejidos hematopoyéticos y parenquimatosos.

El anticuerpo anti-CTLA-4 puede ser un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína del receptor de células T proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). Un ejemplo de anticuerpo anti-CTLA-4 es el anticuerpo monoclonal IgG2 humano tremelimumab que se une a CTLA4 y bloquea la unión de los ligandos de células presentadoras de antígeno B7-1 y B7-2 a CTLA-4, lo que resulta en la inhibición de la regulación negativa mediada por B7-CTLA4 de la activación de células T. Otro ejemplo de anticuerpo anti-CTLA-4 es el anticuerpo monoclonal IgG1 humano ipilimumab que se une a CTLA4 y bloquea la unión de los ligandos de células presentadoras de antígeno B7-1 y B7-2 a CTLA-4, lo que resulta en la inhibición de la regulación negativa mediada por B7-CTLA4 de la activación de células T. Ipilimumab se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento del carcinoma de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de próstata resistente a las hormonas metastásico.

El anticuerpo anti-GITR puede ser un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor del factor de necrosis tumoral (GITR) inducido por glucocorticoides que bloquea la interacción de GITR con su ligando, mejora la citotoxicidad de las células asesinas humanas naturales y/o reduce la expresión de GITR en periféricos linfocitos de la sangre El anticuerpo anti-OX40 puede ser un anticuerpo monoclonal agonista que imita el ligando natural de OX40 y se une selectivamente al receptor OX40 y lo activa. La activación del receptor induce la proliferación de la memoria y las células T efectoras.

Las citoquinas que son eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral/metástasis se contemplan para su uso en la terapia de combinación. Dichas citoquinas, linfoquinas u otros factores hematopoyéticos incluyen, entre otros, M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFa, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoyetina, factor de células madre y eritropoyetina.

Un agente inmunoterapéutico puede ser una vacuna contra el cáncer. Una vacuna contra el cáncer es un agente, molécula o inmunógeno que estimula o provoca una respuesta inmune endógena en un individuo o sujeto contra uno o más antígenos tumorales.

Como se usa en el presente documento, un antígeno canceroso se define ampliamente como un antígeno expresado específicamente por un tumor o una célula cancerosa. Un antígeno canceroso que está presente en la superficie de las células cancerosas en un individuo pero que no está presente en la superficie de las células somáticas normales del individuo, es decir, el antígeno está expuesto al sistema inmune en las células cancerosas pero no en las células somáticas normales. El antígeno puede expresarse en la superficie celular de la célula tumoral donde es reconocido por los componentes del sistema inmune humoral, como los linfocitos B (células B). Los antígenos tumorales intracelulares se procesan en fragmentos peptídicos más cortos que forman complejos con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y se presentan en la superficie celular de las células cancerosas, donde son reconocidos por los receptores de células T (TCR) de los linfocitos T (células T). Preferiblemente, el antígeno de cáncer es uno que no se expresa por las células normales, o al menos no se expresa al mismo nivel que en las células tumorales. Un agente inmunoterapéutico, como una vacuna contra el cáncer, puede estar compuesto por uno o más epítopos o determinantes antigénicos, por ejemplo, epítopos peptídicos o determinantes antigénicos de un tumor o antígeno de cáncer, de modo que la respuesta inminente generada por la vacuna contra el cáncer es reactiva contra el antígeno.

Una vacuna contra el cáncer puede mejorar la presentación de uno o más antígenos de cáncer a las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) y/o a otras células inmunes tales como células T, células B y células NK. En algunos ejemplos, las preparaciones y/o formulaciones de vacunas contra el cáncer se pueden usar junto con uno o más adyuvantes que son bien conocidos en la técnica, para inducir una respuesta inmune o aumentar una respuesta inmune.

Los antígenos de cáncer pueden incluir, por ejemplo, antígenos de testículo de cáncer codificados por genes de línea germinal de cáncer. Los antígenos de cáncer de testículo (CT) constituyen un grupo único de genes que se expresan predominantemente en células de la línea germinal humana, como la placenta y los testículos, pero que se reactivan en diversas neoplasias malignas (Simpson et al., Nature Rev (2005) 5, 615-625). La mayoría de estos genes están ubicados como familias multigénicas en el cromosoma X y también se conocen como antígenos CT-X (Simpson et al., Nature Rev (2005) 5, 615-625). Se han elaborado analogías entre su patrón de expresión durante la maduración de gérmenes y la transformación neoplásica, lo que sugiere su participación en varios pasos de la tumorigénesis (Simpson et al., Nature Rev (2005) 5, 615-625). Los antígenos CT-X se expresan ampliamente en una amplia variedad de tipos de cáncer que incluyen, por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cerebro, glioma, glioblastoma, carcinoma hepatocelular y melanoma. Además, su patrón de expresión está estrechamente relacionado con la enfermedad avanzada y los malos resultados y, por lo tanto, podría ser de relevancia diagnóstica y/o pronóstica (Gure et al., Clin Cancer Res (2005) 11,8055-8062; Velázquez et al., Cancer Immun (2007) 7, 1 1; Andrade et al., Cancer Immun (2008) 8, 2; Tinguely et al., Cancer Science (2008); Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn (2008) 198, 99 e91-97. Debido a su expresión altamente restringida en tejidos malignos, sus epítopos peptídicos asociados a tumores proporcionan objetivos prometedores para la inmunoterapia anticancerígena (Scanlan et al., Immunol Rev (2002) 188, 22-32). De hecho, los ensayos clínicos que evalúan el papel de los antígenos CT, a saber, MAGE-A3, Prame y NY-ESO-I, como objetivos para inmunoterapia específica ya se han iniciado en una serie de tumores malignos diferentes (Bender et al., Cancer Immunol (2007) 7, 16; Atanackovic et al., PNAS (2008) 105, 1650-1655; Jager et al., PNAS (2006) 103, 14453-14458; van Baren et al., J Clin Oncol (2005) 23, 9008-9021; V almori et al., PNAS (2007) 104, 8947-8952; Odunsi et al., PNAS (2007) 104, 12837-12842; Davis et al., PNAS (2004) 101, 10697-10702 (9-15). Antígenos tumorales que pueden estar compuestos por la secuencia de polipéptidos de longitud completa del antígeno tumoral o un fragmento inmunogénico, o epítopo derivado de la secuencia de polipéptidos de longitud completa del antígeno tumoral. Los antígenos tumorales incluyen la secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica el polipéptido de longitud completa, el fragmento inmunogénico o el epítopo derivado de la secuencia de polipéptidos de longitud completa del antígeno tumoral.

Un fragmento de un antígeno de cáncer es un tramo contiguo de residuos de aminoácidos de la secuencia del antígeno que es más corto que el antígeno de longitud completa (es decir, consiste en menos residuos de aminoácidos). Por ejemplo, un fragmento puede comprender menos de 500, menos de 400, menos de 300, menos de 200, menos de 100 aminoácidos o menos de 50 aminoácidos. Un fragmento generalmente constará de al menos 5 aminoácidos, por ejemplo, al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos o al menos 35 aminoácidos. Los fragmentos de antígenos cancerosos pueden incluir regiones inmunogénicas o epítopos que se unen a moléculas de MHC de clase I o clase II y son reconocidos por los TCR de linfocitos T. Muchos de estos epítopos de antígenos cancerosos son conocidos en la técnica. www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.

El antígeno canceroso puede ser un péptido asociado a un tumor, o una proteína que induce o mejora la respuesta inmune y se deriva de genes asociados al tumor y proteínas codificadas que incluyen, por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-A13, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-1, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (AGE-B4), tirosinasa, glucógeno fosforilasa cerebral, Melan-A, MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, alfa-actinina-4, proteína de fusión Bcr-Abl, Casp-8, betacatenina, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-1, proteína de fusión dek-can, EF2, proteína de fusión ETV6-AML1, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasa AS, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-2 y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, pml-RAR.alpha. proteína de fusión, PTPRK, K-ras, N-ras, isómeros de triosefosfato, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, Mage-C2, NA-88, /Lage-2, SP17 y TRP2-Int2, (MART -I), gp100 (Pmel 17), TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, p15(58), CEA, NY-ESO (LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19­ 9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, .beta.-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, .alfa.-fetoproteína, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344 , MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/170K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP y TPS. Por ejemplo, los péptidos antigénicos característicos de tumores incluyen los enumerados en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 20000/020581 y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2010/0284965.

En algunos ejemplos, el antígeno es un antígeno tumoral seleccionado del grupo que consiste en MUC1, MAGE, BAGE, RAGE, CAGE, SSX-2, NY-ESO-1, PRAME, PSMA, tirosinasa, melan-A y mezclas del mismo. En algunas variaciones, el antígeno del cáncer es una proteína de mamífero. En algunas variaciones, el antígeno del cáncer es una proteína humana. En algunas variaciones, la proteína de longitud completa se emplea como antígeno. En algunas variaciones, los péptidos que comprenden un fragmento antigénico de estas proteínas se usan como antígeno tumoral.

Otros antígenos adecuados incluyen antígenos de cáncer en las siguientes clases: antígenos de testículo de cáncer (por ejemplo, HOM-MEL-40), antígenos de diferenciación (por ejemplo, HOM-MEL-55), productos génicos sobreexpresados (HOM-MD-21), productos genéticos mutados (N^y -^c O^l-2), variantes de empalme (HOM-MD-397), productos de amplificación génica (HOM-NSCLC-11) y autoantígenos relacionados con el cáncer (HOM-MEL-2.4) como se revisó en Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley y Carroll, Cambridge University Press, Cambridge. Otros ejemplos incluyen, MART-1 (Antígeno de melanoma reconocido por las células T-1) MAGE-A (MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A10, MAGE-A12), MAGE B (MAGE-B1- MAGE-B24), MAGE-C (MAGE-C1/CT7, CT10), GAGE (GAGE-1, GAGE-8, PAGE-1, PAGE-4, XAGE-1, XAGE-3), LAGE (LAGE-1a(1S), -1b(1L), NY-ESO-1), SSX (SSX1-SSX-5), BAGE, SCP-1, PRAME (MAPE), SART-1, SART-3, CTp11, TSP50, CT9/BRDT, gp100, MART-1, TRP-1, TRP-2, MELAN-A/MART-1, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico (PSA), MUCIN (MUC-1) y Tirosinasa. Los TAA se revisan en Cancer Immunology (2001) Kluwer Academic Publishers, Países Bajos. Los antígenos asociados al cáncer adicionales incluyen Her 2, survivina y TERT.

El término "antígeno" se refiere a proteína o péptido a introducir en un sujeto. Como se describe en el presente documento, se puede proporcionar un antígeno mediante la administración de un péptido o proteína o mediante la administración de un ácido nucleico que codifica un péptido o proteína.

Por "antígeno" en el contexto de la presente divulgación también se pretende incorporar un péptido antigénico derivado de un antígeno. En particular, se pretende que el "antígeno asociado al cáncer" abarque un péptido derivado de un antígeno asociado al cáncer.

Se puede proporcionar un antígeno tal como un antígeno asociado al cáncer para su uso como medicamento de varias maneras diferentes. Se puede administrar como parte de un vector.

Se puede usar cualquier vector adecuado para introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que codifica una de las proteínas de antígeno tumoral en el huésped. Los vectores de ejemplo que se han descrito en la literatura incluyen vectores retrovirales deficientes en replicación, que incluyen, pero no se limitan a, vectores lentivirus [Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, octubre de 1998, págs. 4346.]; vectores virales adenoasociados (AAV) [Patente de los Estados Unidos No. 5,474,935; Patente de los Estados Unidos No, 5,139,941; Patente de los Estados Unidos No. 5.622.856; Patente de los Estados Unidos No. 5,658,776; Patente de los Estados Unidos No. 5,773,.289; Patente de los Estados Unidos No. 5,789,390; Patente de los Estados Unidos No. 5,834,441; Patente de los Estados Unidos No. 5.863.541; Patente de los Estados Unidos No. 5,851,521; Patente de los Estados Unidos No. 5,252,479; Gnatenko et al., J. Invest. Med., 45: 8798 (1997)]; vectores adenovirales (AV) [Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,792,453; Patente de los Estados Unidos No. 5,824,544; Patente de los Estados Unidos No. 5,707,618; Patente de los Estados Unidos No. 5,693,509; Patente de los Estados Unidos No. 5,670,488; Patente de los Estados Unidos No. 5,585,362; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 89: 2581 2584 (1992); Stratford Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626630 (1992); and Rosenfeld et al., Cell, 68: 143 155 (1992)]; un quimérico viral adenoasociado adenoviral (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,856,152) o una vacuna viral o un herpesvírico (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,879,934; Patente de los Estados Unidos No. 5,849,571; Patente de los Estados Unidos No. 5,830,727; Patente de los Estados Unidos No. 5,661,033; Patente de los Estados Unidos No. 5,328,688; Transferencia génica mediada por lipofectina (BRL); vectores liposómicos [Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No.

5,631,237 (Liposomas que comprenden proteínas del virus Sendai)] y combinaciones de los mismos.

En la técnica se conocen vacunas adecuadas contra el cáncer y pueden producirse mediante cualquier técnica conveniente.

Por ejemplo, una vacuna contra el cáncer puede generarse total o parcialmente por síntesis química. Por ejemplo, una vacuna basada en péptidos o inmunógeno puede sintetizarse usando métodos de síntesis en fase líquida o sólida; en solución; o por cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y química de la solución, por ejemplo, completando primero la porción peptídica respectiva y luego, si se desea y es apropiado, después de la eliminación de cualquier grupo protector presente, mediante la introducción del residuo X por reacción del ácido carbónico o sulfónico respectivo o un derivado reactivo del mismo. La síntesis química de péptidos es bien conocida en la técnica (J.M. Stewart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984); M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nueva York (1984); J.H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford University Press, Oxford 1991; en Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California; G.A. Grant, (Ed.) Synthetic Péptidos, A User's Guide. W. H. Freeman & Co., New York 1992, E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. IRL Press 1989 y en G.B. Fields, (Ed.) Solid-Phase Peptide Synthesis (Methods in Enzymology Vol. 289). Academic Press, New York and London 1997).

Alternativamente, las vacunas contra el cáncer basadas en péptidos pueden generarse total o parcialmente mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un antígeno canceroso puede expresarse en una célula huésped y el antígeno expresado puede aislarse y/o purificarse a partir del cultivo celular. Por ejemplo, el antígeno puede expresarse en E. coli en forma soluble o en cuerpos de inclusión, que pueden solubilizarse y replegarse. Después de la expresión, el antígeno puede aislarse y/o purificarse. El antígeno del cáncer se puede analizar mediante técnicas estándar, como la espectrometría de masas y el análisis de inmunotransferencia Western.

El uso de antígenos tumorales para generar respuestas inmunes está bien establecido en la técnica (véase, por ejemplo; Kakimi K, et al. Int J Cancer. 2011 Feb 3; Kawada J, Int J Cancer. 2011 Mar 16; Gnjatic S, et al. Clin Cancer Res. 2009 Mar 15;15(6):2130-9; Yuan J, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Dec 23;105(51):20410-5; Sharma P, et al. J Immunother. 2008 Nov-Dec;31(9):849-57; Wada H, et al. Int J Cancer. 2008 Nov 15;123(10):2362-9; Diefenbach CS, et al. Clin Cancer Res. 2008 May 1;14(9):2740-8; Bender A, et al. Cancer Immun. 2007 Oct 19;7:16; Odunsi K, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Jul 31;104(31):12837-42; Valmori D, et al. Proc Natl Acad Sci USA.

2007 May 22;104(21):8947-52; Uenaka A, et al. Cancer Immun. 2007 Apr 19;7:9; Kawabata R, et al. Int J Cancer.

2007 May 15 ; 120(10):2178-84; Jager E, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Sep 26;103(39):14453-8; Davis ID Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jul 5;102(27):9734; Chen Q, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 22;101(25):9363-8; Jager E, Proc Natl Acad Sci U S A . 2000 Oct 24;97(22):12198-203; Carrasco J, et al. J Immunol. 2008 Mar 1;180(5):3585-93; van Baren N, et al. J Clin Oncol. 2005 Dec 10;23(35):9008-21; Kruit WH, et al. Int J Cancer. 2005 Nov 20;117(4):596-604; Marchand M, et al. Eur J Cancer. 2003 Jan;39(1):70-7; Marchand M et al. Int J Cancer. 1999 Jan 18;80(2):219-30; Atanackovic D, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Feb 5;105(5):1650-5).

Típicamente, un agente inmunoterapéutico, tal como una vacuna contra el cáncer, se administra al individuo cuyo cáncer expresa dicho antígeno. Se pueden analizar las células cancerosas del individuo para identificar el antígeno del cáncer y luego se identifica a los pacientes para la administración del agente inmunoterapéutico o la vacuna apropiados contra el cáncer. Por ejemplo, un método como se describe en el presente documento puede comprender la etapa de identificar un antígeno de cáncer que se muestra por una o más células cancerosas en una muestra obtenida del individuo.

Se puede obtener una muestra biológica del sujeto tal como una biopsia, muestra de sangre o de médula ósea y analizarse para detectar la presencia de células cancerosas que pueden identificarse por mostrar el antígeno canceroso usando cualquier técnica estándar que incluye pero no se limita a técnicas inmunológicas, tales como inmunocitoquímica e inmunohistoquímica. Técnicas adicionales incluyen análisis inmunológicos tales como la determinación serológica de una respuesta inmune autóloga a dicho antígeno de cáncer, véase el documento WO2001/007917. El análisis de la expresión génica se puede realizar utilizando métodos conocidos en la técnica, como la reacción en cadena de la polimerasa o el análisis de microarreglos.

Composiciones de terapia combinada: Una composición farmacéutica puede comprender, además de (1) el compuesto como se describe en el presente documento, (2) un agente inmunoterapéutico tal como una vacuna contra el cáncer, (3) un adyuvante y (4) un excipiente, vehículo, regulador, estabilizador u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia farmacéuticamente aceptables. Los materiales adecuados serán estériles y libres de pirógenos, con una isotonicidad y estabilidad adecuadas. Ejemplos de excipientes, vehículos, reguladores, estabilizadores u otros materiales farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina estéril (por ejemplo, NaCl al 0.9%), agua, dextrosa, glicerol, etanol o similares o combinaciones de los mismos. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del compuesto activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración, que puede ser por bolo, infusión, inyección o cualquier otra ruta adecuada, como se describe a continuación. La composición puede contener además sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes reguladores de pH o similares.

Un adyuvante es una sustancia incorporada o administrada con antígeno que potencia la respuesta inmune. Los adyuvantes pueden mejorar la respuesta inmunológica al proporcionar un reservorio de antígeno (extracelularmente o dentro de los macrófagos), activando los macrófagos y estimulando conjuntos específicos de linfocitos. Los adyuvantes de muchos tipos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos específicos de adyuvantes incluyen monofosforil lípido A (MPL, SmithKline Beecham), un congénere obtenido después de la purificación e hidrólisis ácida del lipopolisacárido Salmonella Minnesota Re 595; saponinas que incluyen QS21 (SmithKlineBeecham), una saponina QA-21 pura purificada del extracto de Quillja saponaria; DQS21, descrito en la solicitud PCT WO96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 y QS-L1 (So et al., Mol Cells (1997) 7: 178-186); Adyuvante ISCOMATRIX, una estructura similar a una jaula compuesta de saponina, fosfolípido y colesterol (véase, por ejemplo, Maraskovsky et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10: 2879-2890); adyuvante incompleto de Freund; adyuvante de Freund completo; montanida alumbre; Oligonucleótidos CpG (véase, por ejemplo, Kreig et al., Nature 374: 546-9, 1995) y otros oligonucleótidos inmunoestimuladores que incluyen poli-IC y poli-ICLC (Hiltonol®); y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biodegradables tales como escualeno y/o tocoferol. La vacuna contra el cáncer puede administrarse junto con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen sales de aluminio, tales como alumbre (dodecahidrato de sulfato de aluminio y potasio), hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio y compuestos orgánicos, como escualeno.

Además de un antígeno de cáncer, una formulación inmunoterapéutica, inmunogénica o de vacuna puede comprender un adyuvante. Por ejemplo, una formulación puede comprender 1-500 |jg, preferiblemente 1-50 |jg, de antígeno canceroso y 0.5 a 20 mg, preferiblemente 1-10 mg, de adyuvante en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable como se mencionó anteriormente.

Una formulación de vacuna puede comprender un ligando del receptor de tipo Toll (TLR). Los ligandos TLR adecuados incluyen ácido polinosinicpolicitidílico (poli I:C), lipopolisacárido (LPS), oligodesoxinucleótido CpG, poli LC, poli ICLC, MPL (Corixa Corp) e imidazoquinolinas, tales como imiquimod y R848. El uso de ligandos TLR para modular las respuestas inmunes es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Weiner et al (1997) PNAS USA 9410833-10837; Vabulas et al J. Immunol. (2000) 1642372-2378; Gunzer et al (2005) Blood 1062424-2432). Las formulaciones de agentes inmunoterapéuticos, tales como vacunas contra el cáncer, son bien conocidas en la técnica e incluyen ASCI MAGE-A3, ASCI NY-ESO-1 y ASCI PRAME (GSK Bio); Provenge (Dendreon), Abogovomab (Meranini), M-Vax (Avax), Allovectin-7 (Vial) para melanoma metastásico, GSK1572932A (GSK Bio) Belagenpumatucel-L (Novarex) BMP-25 (Merck Serono), BiovaxID (Biovest/Accentia), MDX-1379 (Medarex/BMS), Ipilimumab (BMS), oncófago Trovax (Oxford Biomedical) y péptido de leucemia PR1 (The Vaccine Company).

La invención se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos que detallan realizaciones de ejemplo de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Todas las citas a lo largo de la divulgación se incorporan expresamente por referencia.

Ejemplos

Síntesis de compuestos

6-yodo-((2R,3S,4R)-benciloxi)-metil-a-D-galactosa (46) (Ejemplo de referencia). Una solución de glucósido 45/49/52 (206 mg, 0.44 mmol) y PPh³ (139 mg, 0.53 mmol) en tolueno (5 ml) se calentó a reflujo durante 10 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a 80°C, y luego se añadieron imidazol (89 mg, 1.32 mmol) e I² (142 mg, 0.57 mmol). La mezcla se calentó a reflujo durante 20 minutos antes de concentrarse a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc (50 ml) y se lavó con solución de Na²S²O³ (20 ml) y H²O (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (8% de EtOAc en hexanos) para dar yoduro 46 como un aceite incoloro (183 mg, 72%).

(2R,3S,4S)-2,3,4-tris(benciloci)hex-5-enal (47) (Ejemplo de referencia). Se preactiva polvo de zinc por agitación en HCl (50 ml de solución 1.0 M) a temperatura ambiente durante 15 minutos, antes de filtrarse y lavarse secuencialmente con H²O (30 ml), acetona (30 ml) y Et²O (30 ml). Luego se secó el zinc bajo alto vacío con una pistola de calor. El zinc activado (0.706 mg, 10.8 mmol) se añadió a una solución de glucósido 46 (620 mg, 1.08 mmol) y TMSCl (0.137 ml, 1.08 mmol) en THF (20 ml) y la mezcla de reacción se sometió a sonicación a 40°C. Después de 5 h, se añadieron Et²O (50 ml) y H²O (50 ml) a la suspensión, que luego se filtró a través de Celite. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con Et²O (3 x 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H²O (2 x 15 ml) y salmuera (15 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 8% en hexanos) para dar aldehído 47 como un aceite incoloro.

6-((tert-butildifenilsilil)oxi)-metil-a-D-galactosa (50) (Ejemplo de referencia). Se agregaron secuencialmente imidazol (0.77 g, 11.30 mmol) y TBDPSCl (1.74 ml, 6.70 mmol) a una solución de metil a-D-galactopiranósido (1.00 g, 5.15 mmol) en DMF (5 ml). Después de 24 h, la mezcla de reacción se diluyó con Et²O (30 ml), se lavó con H²O (20 ml) y solución de NH⁴Cl (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (30% de hexanos en EtOAc) para dar silil éter 50 como un aceite incoloro (2.10 g, 94%).

2,3,4-benciloxi-6-((tert-butildifenilsilil)oxi)-metil-a-D-galactosa (51) (Ejemplo de referencia). Se añadió NaH (60% en peso en aceite mineral, 0.61 g, 15.5 mmol ) a una solución de glucósido 50 (1.20 g, 2.78 mmol) en DMF (10 ml) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos, luego se añadió BnBr(1.33 ml, 11.1 mmol) a 0°C. Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con la adición lenta de MeOH, y luego se diluyó con EtOAc (30 ml). La capa orgánica se lavó con H²O (20 ml), se secó sobre Na²SO⁴ , se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (10% de EtOAc en hexanos) para dar tribencil éter 51 como un aceite incoloro.

2,3,4-tribenciloxi-metil-a-D-galactosa (Ejemplo de referencia). Se añadió TBAF (solución IM en THF, 1.27 ml, 1.27 mmol) a una solución de glucósido 51 (460 mg, 0.63 mmol) en THF (5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche antes de ser detenida con H²O (15 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el producto bruto, que se usó directamente en la siguiente reacción sin purificación adicional. Rf = 0.19 (40% EtOAc en hexanos)

(5S,6S,7S)-5,6,7-tris(benciloxi)nona-1,8-dien-4-ol (53) (Ejemplo de referencia). Se añadió bromuro de alilmagnesio (1.0 M en Et²O, 1.44 ml, 1.44 mmol) gota a gota durante 5 minutos a una solución de aldehído 47 (200 mg, 0.48 mmol) en THF (10 ml) a -78°C. La mezcla de reacción se dejó agitando a esta temperatura durante 4 h antes de ser detenida con solución de NH⁴Cl (30 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H²O (20 ml) y salmuera (20 ml), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 0-4% en hexanos; gradiente) para dar el producto 53 como una mezcla de dos diastereoisómeros.

(4R,5S,6S,7S)-5,6,7-tris(benciloxi)cidohept-2-enol (54a) y (4S,5S,6S,7S)-5,6,7-tris(benzitoxi)cidohept-2-enol (54b) (Ejemplo de referencia). Una solución de dieno 53 (270 mg, 0.59 mmol) en CH²Cl² , (60 ml) se desgasificó de acuerdo con el procedimiento general. Se añadió catalizador de metátesis Ru de segunda generación de Grubbs (8 mg, 0.009 mmol) y la solución se calentó a reflujo. Después de 2 h, la solución se concentró a presión reducida y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 20% en hexanos) para dar los productos 54a y 54b.

(2R,3R,4R)-2-amino-1((tert-butildifenilsilil)oxioctadecano-3,4-diol (Ejemplo de referencia) (64). Se añadió TBDPSCl (2.46 ml, 9.45 mmol) a una solución de fitoesfingosina (2.0 g, 6.3 mmol) en piridina. Después de agitar durante la noche, la reacción se interrumpió con MeOH (5 ml), luego se eliminó el disolvente a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 50% en hexanos, EtOAc, 0% - 7% MeOH en EtOAc) para proporcionar esfingosina 64 como un aceite incoloro.

2R-N-bencil-1-((tert-butildifenilsilil)oxi)-(3R,4R-O-isopropilideno)octadecano 65 (Ejemplo de referencia). Se añadió benzaldehído (86 pL, 0.85 mmol) a una suspensión agitada de amina 66 (420 mg, 0.71 mmol) y NaBH(OAc)³ (377 mg, 1.78 mmol) en THF (5 ml). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se diluyó con Et²O (20 ml) y solución de NaHCO³ (20 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con Et²O (3 x 20 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera (20 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 0-2% en hexanos, gradiente) para dar la amida 65 como un aceite incoloro.

2R-amino-2-((tert-butildifenilsilil)oxi)-3R,4R-O-isopropilideno)octadecano (66) (Ejemplo de referencia). Se añadió H²SO⁴ concentrado (4 gotas) a una solución de esfingosina 64 ( 450 mg, 0.81 mmol) en acetona seca (10 ml) a 0°C y agitada durante 5 h. La mezcla de reacción se inactivó con solución de NaHCO³ (20 ml), luego se concentró a presión reducida. La mezcla se extrajo luego con EtOAc (3 x 20 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴ , se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 20% en hexanos) para proporcionar el acetónido 67 como un aceite incoloro.

Se añadió 2R-N-bencil-(3R,4R-O-isopropilideno)octadecano-1-ol (68) (Ejemplo de referencia) TBAF (solución IM en THF, 1.27 ml, 1.27 mmol) a una solución de acetónido 66 (440 mg, 0.64 mmol) en THF (20 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche antes de ser detenida con H²O (15 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3x15 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 25% en hexanos) para proporcionar alcohol 68 como un aceite incoloro.

(R)-3-bencil-4-((4R,5R)-2,2-dimetil-5-tetradecil-1,3-dioxolan-4-il)-1,2,3-oxatiazolidina 2,2-dióxido (70) (Ejemplo de referencia). Se añadió gota a gota una solución de amida 68 (280 mg, 063 mmol) en CH²Cl² (5 ml) durante 30 minutos a una solución de SOCl² a -50°C (50 j L, 0.69 mmol), imidazol (172 mg, 2.52 mmol) y NEt³ (194 j L, 1.39 mmol) en CH²Cl² (6 ml). La mezcla de reacción se calentó a 0°C y se agitó durante 21 h, antes de añadir H²O (10 ml). La capa orgánica se aisló y se lavó con salmuera (5 ml), se secó sobre Na²SO⁴ , se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar la sulfamidita cruda, que se usó inmediatamente. Rf = 0.88 (30% de EtOAc en hexanos).

Se añadieron secuencialmente NaIO⁴ (148 mg, 0.69 mmol), RuCh (14 mg, 0.064 mmol) y H²O (5 ml) a una solución de sulfamidita cruda en MeCN (5 ml) a 0°C. Después de 2.5 h, la mezcla de reacción se diluyó con H²O (50 ml) y Et²O (50 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con Et²O (3 x 35 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con H²O (30 ml), salmuera (20 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴ , se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 10% en hexanos) para dar sulfamidato 70 como un aceite incoloro.

(R)-N-bencil-1-((4R,5S)-2,2-dimetil-5-tetradecil1-1,3-dioxolan-4-il)-2-(((1R,5S,6S,7S)-5,6,7-tris(benciloxi) ciclohept-3-en-1-il)oxi)etanamina (71) (Ejemplo de referencia). Se añadió NaH (40% en peso en aceite mineral, 10 mg, 0.24 mmol) a una solución de alcohol 54b (34 mg, 0.079 mmol) en DMF (0.25 ml) y THF (0.05 ml) a 0°C. Después de agitar durante 1 h, se añadió una solución de sulfamidato 70 (40 mg, 0.079 mmol) en THF (0.2 ml) a 0°C. Después de agitar durante la noche a 40°C, la mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en Et²O (10 ml). Se añadió solución ac. de H²SO⁴ al 20% (10 ml) a 0°C y la mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos antes de neutralizarse con K²CO³ (1 g). Después de 40 minutos, se añadió Et²O (20 ml) y H²O (20 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con Et²O (3 x 35 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con H²O (30 ml), solución de NaHCO³ (20 ml) y salmuera (20 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 10% en hexanos) para dar el éter 71 como un aceite incoloro.

(1S,2S,3R,4R)-4-(((2R,3R,4S)-2-amino-3-4-dihidroxioctadecil)oxi)ciclofentano-1,2,3-triol (72) (Ejemplo de referencia). Se añadió una solución 1 M de HCl (150 j L, 0.15 mmol y Pd-C (10% en peso, 32 mg, 0.03 mmol) a una solución de éter 71 (130 mg, 0.15 mmol) y ciclohexeno (2 ml) en MeOH (10 ml) y se calentó a reflujo. Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con una solución 5:1 de CHCh: MeOH, antes de filtrarse a través de un lecho de Celite. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el amina cruda 72, que se usó directamente en el siguiente paso.

Se añadió N-((2R,3R,4S)-3,4-dihidroxi-1-(((1S,2R,3S,4S)-2,3,4-trihidroxicicloheptilo)oxi)octadecan-2-il)hexacosanamida (73) (COCl)² (2 ml) a ácido hexacosanoico (139 mg, 0.39 mmol) y se calentó a 70°C durante 2 h, después de lo cual la solución se enfrió a temperatura ambiente y el (COCl)² fue eliminado bajo una corriente de argón seco. Los volátiles residuales se eliminaron a presión reducida. El cloruro de acilo bruto resultante se disolvió en THF (0,5 ml) y se añadió con agitación vigorosa a una solución de amina 72 (81 mg, 0,18 mmol) en THF/NaOAc (aq) (8 M) (1:1, 2 ml). Se mantuvo la agitación vigorosa durante 2 h, después de las cuales la mezcla de reacción se dejó en reposo y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con THF (3 x 2.0 ml) y las capas orgánicas se combinaron y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH al 10% en CHCh) para dar la amida 73 como un sólido blanco.

(1S-1'S)-1-1'-(4S,5S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4,5-diil)bis(prop-2-en-1-ol) (75) (Ejemplo de referencia). Una solución de (2R,3R)-2,3-O-isopropilideno tartrato (1.5 g, 6.9 mmol) en tolueno (25 ml) se desgasificó de acuerdo con el procedimiento general. DIBALH (1.0 M en tolueno, se añadieron 14.4 ml, 14.4 mmol) gota a gota durante 10 minutos a la solución a -78°C, que se dejó agitar durante 2.5 h a esa temperatura. Después de 2.5 h, se añadieron bromuro de vinilo y magnesio (1.0 M en THF, 20.6 ml, 20.6 mmol) y la mezcla de reacción se dejó agitar durante 2 h a -78°C, antes de dejar que se calentara lentamente a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió cuidadosamente con solución de NH⁴Cl (50 ml) y las capas resultantes se separaron. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 35 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con H²O (20 ml) y salmuera (20 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto se purificó por cromatografía en columna (25% EtOAc en hexanos) a dar dieno 75 como el producto principal en una mezcla de diastereoisómeros con una proporción de 3:1.

3S,3'S-O-isopropiNdeno-cidohex-1-en-2S,2'S-diol (76) (Ejemplo de referencia). Se desgasificó una solución de dieno 75 (217 mg, 1.01 mmol) en CH²Cl² (230 ml) de acuerdo con el procedimiento general. Se añadió catalizador de metátesis Ru de segunda generación de Grubbs (12 mg, 0.015 mmol) y la solución se calentó a reflujo. Después de 2 h, la solución se concentró a presión reducida y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH al 5% en CHCh) para dar diol 76.

4S-(tert-butildimetilsitil)oxi)-5S,6S-O-isopropilideno-cidohex-2-enol (77) (Ejemplo de referencia). Imidazol (275 mg, 4.04 mmol) y TBDMSCl (486 mg, 3.23 mmol) se añadieron secuencialmente a una solución de diol 76 (500 mg, 2.69 mmol) en ^d M^f (5 ml). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se diluyó con Et²O (30 ml), se lavó con H²O (15 ml) y solución de NH⁴Cl (15 ml). La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 20% en hexanos) para dar el alcohol 77 como un aceite incoloro.

(2'R)-N-bencil-1-((1S,2S,3S,4S)-4-((tert-butildimetilsilil)oxi)-2,3-O-isopropilideno-ciclohex-5-eno)-3'R,4'S-O-isopropilideno-octadecano (78) (Ejemplo de referencia) Se añadió NaH (40% en peso en aceite mineral, 78 mg, 1.95 mmol) a una solución de alcohol 77 (195 mg, 0.65 mmol) en DMF (2 ml) y THF (1 ml) a 0°C. Después de agitar durante 1 h, se añadió una solución de sulfamidato 70 (397 mg, 0.78 mmol) en THF (1 ml) a 0°C. Después de agitar durante la noche a 40°C, la mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en Et²O (10 ml). Se añadió solución al 20% acuosa de H²SO⁴ (10 ml) a 0°C y la mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos antes de neutralizarse con K²CO³ (1 g). Después de 40 minutos, se añadió Et²O (20 ml) y H²O (20 ml). Las capas resultantes se separaron y la capa acuosa se extrajo con Et²O (3 x 35 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con H²O (30 ml), solución de NaHCO3^{( 20} ml) y salmuera (20 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 10% en hexanos) para dar éter 78 como un aceite incoloro.

(2R,3R,4S)-2-amino-1-((1S,2S,3S,4S)-4-((tert-butildimetilsilil)oxi)-2,3-O-isopropilideno-ciclohexano) octadecano-3,4-diol (79) (Ejemplo de referencia). Una solución 1M de HCl (71 pL, 0.071 mmol) y Pd-C (10% en peso, 15 mg, 0.014 mmol) se agregaron a una solución de éter 78 (50 mg, 0.071 mmol) y ciclohexeno (1 mL) en MeOH (5 mL) y se calentó bajo reflujo. Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con una solución 5:1 de CHC¹³: MeOH, antes de filtrarse a través de un lecho de celite. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar la amina cruda 79, que se usó directamente en el siguiente paso.

N-((2R,3R,4S)-3,4-dihidroxi-1-(((1S,2R,3S,4S)-2,3,4-trihidroxicidohexil)oxi)octadecan-2-il)hexacosanamida (81). Se añadió TFA puro (2 ml) al éter 79 (suponiendo una conversión del 100%, 0.071 mmol) durante 15 minutos antes de eliminar el TFA a presión reducida. Este procedimiento se repitió si fuera necesario para proporcionar la amina 80 cruda, que se usó directamente en la siguiente reacción. Rf = 0.33 (30% de MeOH en CHCh).

Se añadió (COCl⁾² (2 ml) al ácido hexacosanoico (21 mg, 0.054 mmol) y se calentó a 70°C durante 2 h, después de lo cual la solución se enfrió a temperatura ambiente y se eliminó el (COCl⁾² bajo una corriente de argón seco. Los volátiles residuales se eliminaron a presión reducida. El cloruro de acilo bruto resultante se disolvió en THF (0.5 ml) y se añadió con agitación vigorosa a una solución de amina 80 (20 mg, 0.045 mmol) en THF/NaOAc (aq) ^{( 8} M) (1:1, 2 ml). Se mantuvo la agitación vigorosa durante 2 h, después de las cuales la mezcla de reacción se dejó en reposo y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con THF (3 x 2.0 ml) y las capas orgánicas se combinaron y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH al 10% en CHC¹³) para dar la amida 81 como un sólido blanco.

(1S,1'S)-1,1'-(4S,5S)-2,2-dimetil-1,3-dioxotano-4,5-diil)bis(but-3-en-1-ol) (89) (Ejemplo de referencia). Se desgasificó una solución de (2R,3R)-2,3-0-tartrato de isopropilideno (1.88 g, ^{8 . 6} mmol) en tolueno (25 ml). Se añadió DIBALH (1.0 M en tolueno, 18.1 ml, 18.1 mmol) gota a gota durante 10 minutos a la solución a -78°C, que se dejó agitar durante 2.5 h a esa temperatura. Después de 2.5 h, se añadió bromuro de alilmagnesio (1.0 M en THF, 25.9 ml, 25.9 mmol) y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante 2 h a -78°C, antes de dejar que se calentara lentamente hasta temperatura ambiente. La reacción se interrumpió cuidadosamente con solución de NH⁴Cl (50 ml) y las capas resultantes se separaron. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 35 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con H²O ^{( 20} ml) y salmuera ^{( 20} ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴ , se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 25% en hexanos) para dar dieno 89.

4S,4'S-O-isopropilideno-ciclooct-1-en-4,4'-diol (90) (Ejemplo de referencia). Se desgasificó una solución de dieno 89 (400 mg, 1.65 mmol) en CH²Cl² (750 ml). Se añadió el catalizador de metátesis Ru de segunda generación de Grubbs (21 mg, 0.025 mmol) y la solución se calentó a reflujo. Después de 2 h, la solución se concentró a presión reducida y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 40% en hexanos) para dar diol 90.

6-(tert-butildimetilsilil)oxi)-7S,3S-O-isopropilideno-cidooct-3-en-1-ol (91) (Ejemplo de referencia) Imidazol (140 mg, 2.1 mmol) y TBDMSCl (187 mg, 1.2 mmol) se agregaron secuencialmente a una solución de diol 90 (220 mg, 1.0 mmol) en DMF (5 ml). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se diluyó con Et²O (30 ml), se lavó con H²O (15 ml) y solución de NH⁴Cl (15 ml). La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 20% en hexanos) para dar el alcohol 91 como un aceite incoloro.

Biología - Análogos de enlazadores

La actividad biológica de cada uno de los análogos de a-GalCer tioamida 6, a-GalCer urea 7 y a-GalCer carbamato 8 y los análogos de ThrCer tioamida 9, ThrCer urea 10 y ThrCer carbamato 11 se investigaron junto con a-GalCer 1 y ThrCer 2. En un examen preliminar, se evaluó la capacidad de los ocho compuestos para estimular el hibridoma de células iNKT DN32, después de la pulsación de células C1R-mCD1d con diversas concentraciones de ligandos. La concentración de IL-2 en el sobrenadante liberado después de la activación de la célula iNKT se midió usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). De manera alentadora, estos experimentos demostraron que tanto ThrCer-tioamida 9 como ThrCer-carbamato 11 indujeron una mayor activación en comparación con ThrCer 2, mientras que el análogo ThrCer-urea 10 condujo a una estimulación débil y solo a altas concentraciones (Figura 1B). Se observó una jerarquía similar para los análogos de a-GalCer, aunque las diferencias, particularmente a altas concentraciones, fueron menos pronunciadas (Figuras 1A).

En otro experimento in vitro para probar la actividad funcional, esta vez usando un modelo humano, se cultivaron conjuntamente células iNKT humanas durante 40 h con células C1R-hCD1d que se habían pulsado con concentraciones de vehículo de 100 ng mL-1, a -GalCer 1, a-GalCer-tioamida 6, a-GalCer-urea 7 y a-GalCercarbamato 8 (Figura 2A) y ThrCer 2, ThrCer-tioamida 9, ThrCer-urea 10 y ThrCer-carbamato 11 ( Figura 2b ). En este ensayo, se evaluó la capacidad de los diversos ligandos para activar las células iNKT determinando los niveles de producción de IFNy después de 40 h por ELISA. Una vez más, se demostró que los tres análogos de ThrCer estimulan las células ^ínK^t humanas, aunque a niveles más bajos que los análogos de aGalCer, lo que está de acuerdo con el comportamiento de los dos compuestos originales. De acuerdo con los datos de las células murinas iNKT (Figura 1), el ligando más débil a 100 ng mL'1 fue nuevamente ThrCer-urea 10; sin embargo, en este ensayo, ThrCer-tioamida 9 y ThrCer-carbamato 11 ahora eran más comparables a ThrCer en su comportamiento (Figura 2B). Todos los análogos de a-GalCer estimularon las células iNKT humanas, y el análogo de urea 7 demostró ser el activador más débil a bajas concentraciones (Figura 2A).

Dado que los dos derivados de urea 7 y 10 mostraron la actividad más débil en experimentos in vitro, otros estudios se centraron únicamente en los derivados de tioamida y carbamato de ThrCer y a-GalCer. Estos análogos se investigaron a continuación in vivo, junto con los compuestos originales y la molécula de sesgo de Th2 OCH9 (12, más adelante), específicamente para evaluar su capacidad para efectuar la maduración de CC, así como su perfil de respuesta a citoquinas.

OCH9 (12)

Agonista de CD1d de sesgo TH2

Para este fin, se inyectó 1 |jg de lípido por vía intravenosa (i.v.) en ratones C57 BL/6 o C57 BL/6 CD1d -/­ (deficientes en células NKT) de tipo salvaje. Después de 2 h, los ratones se desangraron y se midieron los niveles de IL-4 en el suero mediante ELISA (Figura 3). A las 18 h, se sacrificaron los ratones y se midieron los niveles de IFNy en suero sanguíneo mediante ELISA (Figura 3), y se utilizaron células recogidas del bazo para determinar el grado de maduración de DC midiendo la expresión de la molécula coestimuladora, CD86 utilizando análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura 4).

La activación in vivo de células iNKT con los análogos de a-GalCer y ThrCer se determinó analizando el perfil de citoquinas en suero sanguíneo a las 2 h y 18 h. Por lo tanto, los análogos 6 y 8 de a-GalCer mostraron una marcada disminución en la capacidad de estimular a las células iNKT para producir ⁱL-4 a las 2 h después de la inyección en comparación con a-GalCer, pero ambos compuestos pudieron mantener la producción de IFNy a las 18 h, consistente con el de a-GalCer (Figura 3A). Las diferencias en la producción de citoquinas fueron aún más pronunciadas con los agonistas de ThrCer más débiles 9 y 11, los cuales no estimularon a las células iNKT para producir IL-4 cuando se analizaron a las 2 h, pero aún podían producir IFNy a las 18 h (Figura 3B). No se detectó producción de citoquinas en ratones CDld -/- inyectados con los análogos a-GalCer y ThrCer. Dado que la presentación del complejo CD1d-lípido por parte de DC a las células iNKT da como resultado la activación y la maduración posterior de DC, también determinamos si había alguna diferencia en la capacidad de DC para regular al alza la molécula coestimuladora, CD86, después de i.v. suministro de análogos de a- GalCer y ThrCer.

Agradablemente, ambos conjuntos de análogos indujeron la maduración de DC en un grado similar al de los compuestos a-GalCer y ThrCer originales en ratones de tipo salvaje pero no en ratones CD1d -/- (Figura 4).

Se examinaron las cinéticas de unión de estos compuestos análogos de ThrCer y a-GalCer. Con este fin, las moléculas de hCDld y p-2-microglobulina (p 2 M) expresadas en bacterias se replegaron con la tioamida y los análogos de carbamato de a-GalCer y ThrCer mediante cromatografía de replegamiento oxidativo, y luego se biotinilaron. Los análogos de urea de a-GalCer y ThrCer no pudieron replegarse y, por lo tanto, no hay datos disponibles de resonancia de plasmón superficial (SPR) para estas moléculas. Se preparó iNKT TCR humano soluble. Los experimentos SPR se usaron para medir la afinidad y la cinética de los TCR de células iNKT humanas para hCDld cargado con a-GalCer, ThrCer y sus análogos de tioamida y carbamato (Figura 5). Con este fin, se inyectaron concentraciones crecientes de ^t C^r durante 5 segundos sobre el complejo indicado inmovilizado en el chip BIAcore hasta que la unión específica alcanzó su meseta. Kd y Bmax se calcularon ajustando los datos utilizando el modelo de cinética de unión de regresión no lineal (Figura 5). Las mediciones cinéticas para el kdesactivado se calcularon utilizando el kit de software BIAevaluation; Los valores de kactivado se calcularon a partir del kdesactivao experimental y Kd.

Tabla

Los mecanismos por los cuales los agonistas de CD1d de glicolípidos pueden modular la respuesta de citoquinas en la activación de células iNKT son complejos. La estabilidad del complejo glicolípido-CDId y su afinidad por TCR se han invocado en conjunto para que sean importantes; sin embargo, más recientemente también se ha propuesto que la estabilidad metabólica del glicolípido, junto con la ubicación celular de la carga, desempeñen un papel importante. También deben considerarse los efectos indirectos resultantes de la activación de células iNKT; por ejemplo, se ha demostrado que la molécula de polarización de Th2, OCH9 12, reduce el nivel de expresión de CD40L por las células iNKT activadas, lo que a su vez reduce la producción de IL-12 y de allí la producción de IFN^y aguas abajo de las células NK.

Los experimentos in vivo para los análogos de a-GalCer muestran que los derivados de tioamida y carbamato, 6 y 8, respectivamente, ambos muestran un sesgo de citoquina hacia IFNy en comparación con a-GalCer, como resultado de una reducción en la producción de IL-4 relativa para el padre a-GalCer 1, en lugar de un aumento en la producción de IFNy, que en ambos casos fue similar al generado por a-GalCer 1. Los resultados para los derivados de ThrCer fueron más significativos porque mostraron una tendencia similar pero más pronunciada. En comparación con a-GalCer 1, ThrCer 2 es un activador más débil de las células iNKT, aunque muestra un perfil de citoquina similar. ThrCer-tioamida 9 y ThrCer-carbamato 11 no mostraron producción de IL-4, cuando se analizaron a las 2 h; sin embargo, mostraron niveles de producción de IFNy a las ¹⁸ h, que fueron más altos que los mostrados para ThrCer 2 y solo cuatro veces más bajos que los mostrados por a-GalCer 1.

Tanto los análogos de a-GalCer y ThrCer indujeron la maduración de DC en un grado similar a los compuestos de a-GalCer y ThrCer originales en ratones de tipo salvaje pero no en ratones CD1d -/-. En términos de afinidad de unión del TCR por hCD1d cargado con glicolípidos, los valores de Kd para los complejos hCD1d-carbamato-TCR en ambas series fueron comparables a los medidos para los compuestos originales. El TCR de células iNKT exhibió una afinidad de unión ligeramente menor por hCD1d cargado con a-GalCer-tioamida 6 en comparación con hCD1d/a-GalCer, mientras que la afinidad de unión por hCDld cargado con ThrCer-tioamida 9 fue interesantemente un orden de magnitud menor que el de hCD1d/ThrCer 2. El experimento de cinética de unión mostró que estas afinidades de unión más bajas son una consecuencia de una velocidad de desactivación más rápida y una velocidad de activación más lenta del complejo hCD1d-tioamida-TCR en comparación con los complejos CD1d con las moléculas parentales. Esta observación es comparable a la cinética mostrada por el análogo a-GalCer de polarización Th2, OCH9 cuya unión débil (Kd de 123 ± 9.08 j M) se atribuyó a ambos, una disminución en el kactivado (2.3 * 104 ± 1 * 103 M-1 ^s-1), así como un aumento de kdesactivado (2.67 ±0.12 s-1). Estos datos de afinidad de unión a TCR de células iNKT para los complejos CD1d-glicolípidos no muestran una correlación clara con la respuesta de citoquina observada.

Un estudio reciente realizó una comparación directa entre el glicolípido 12 OCH9 de polarización Th2 y el análogo de glucosilo C de polarización Th1 de a-GalCer 13. Se mostró que tanto OCH912 como el análogo de glucosilo C de a-GalCer 13 mostró interacciones más débiles que a-GalCer con los TCR de células iNKT. Las diferencias en los perfiles de respuesta a citoquinas se atribuyeron a otros factores, incluidas sus diferentes propiedades farmacocinéticas, y su capacidad para transactivar otros linfocitos T que liberan citoquinas, como las células NK. Cuando dicha transactivación requiere una vida prolongada después de la inyección inicial, los análogos de glucolípidos metabólicamente más estables deberían funcionar mejor. Se realizó una observación similar con el neoglicolípido a-carba-GalCer, que induce un perfil de respuesta de citoquina sesgada por Th1 tras la activación de células iNKT. Habiendo reemplazado el residuo de amida con una funcionalidad metabólicamente más estable, se esperaba que los tres análogos estructurales, y en particular los derivados de treitol no glucosídicos 9, 10 y 11, que tampoco son susceptibles a la hidrólisis mediada por glucosidasa, exhiban vidas in vivo prolongadas, y por esta razón, se postuló que esto podría conducir a una mayor producción de IFN^y. Esta hipótesis parece haberse confirmado, al menos en parte, en la serie ThrCer con los análogos de tioamida y carbamato. Tanto en la serie a-GalCer como en la serie ThrCer, los análogos de urea mostraron poca actividad y los datos de unión y cinética para estos dos sustratos fueron inalcanzables, lo que puede sugerir que la funcionalidad adicional de NH incorporada en la cadena de acilo interrumpe la unión de glucolípidos y la presentación posterior.

Desde que se demostró que a-GalCer 1 funciona como un potente agonista de CDld, numerosas modificaciones estructurales han probado las relaciones estructura-actividad y condujeron al descubrimiento de agonistas de CD1d que son capaces de polarizar la producción de citoquinas. La variación estructural alrededor del enlace amida en 1 ha recibido hasta la fecha poca atención. Con este fin, se prepararon análogos de tioamida, carbamato y urea de a-GalCer y su análogo no glucosídico, ThrCer, y se realizó una investigación de su actividad biológica. Mientras que los análogos de carbamato y tioamida de a-GalCer tienen un comportamiento similar al de la molécula original, los mismos cambios en ThrCer condujeron a dos sustratos que muestran un perfil de respuesta de citoquina notablemente diferente tras la activación de la célula iNKT. Este estudio muestra por primera vez que los isósteros de amida de los agonistas de CD1d pueden usarse para provocar cambios significativos en la respuesta de las citoquinas. Aunque los factores que rigen el perfil de citoquinas son probablemente multifactoriales, se postula que proporcionar el glicolípido se une en una conformación viable para su presentación a los TCR de células iNKT, el aumento de la estabilidad metabólica es importante para la activación prolongada de las células iNKT. Por este razonamiento, el análogo de tioamida del derivado C-glicosil a-GalCer es digno de investigación.

Biología - Análogos cíclicos

Se evaluó la afinidad de unión de iNKT TCR a diversos compuestos, como se indica a continuación.

Las células C1R-hCD1d se pulsaron con cada ligando anotado anteriormente y la afinidad del tetrámero iNKT TCR se determinó por citometría de flujo medida por la intensidad fluorescente media (MFI). Los resultados se muestran en la Figura 6. El sobrenadante se probó por IFNy por ELISA, y los resultados se muestran en la Figura 7. Los ratones (n=3) se inmunizaron con 0.1 jg de cada compuesto en el día -28. Los esplenocitos se cultivaron durante 60 horas en presencia de a-GalCer y los sobrenadantes se probaron para determinar IFNy por ELISA, los resultados se muestran en la Figura 8.

Después de la inmunización con 800 jg de OVA y 1 jg de lípidos i.v. en el día -7, se cultivaron esplenocitos in vitro en presencia de péptidos MHC I (A) y MHCII (B) específicos de OVA. La liberación de IFNy se determinó a las 18 horas por ELISpot y se expresó como el número de manchas por millón de esplenocitos. Los resultados se muestran en la Figura 9.

Se evaluó la actividad adyuvante de ThrCer 6 y ThrCer 7. Después de la inmunización con 800 |jg de OVA y 1 |jg de lípidos i.v. en el día 7, se sangraron los ratones y se ensayó el suero mediante ELISA para detectar la presencia de IgG específicas de OVA. Los resultados se muestran en la Figura 10.

Estudios biológicos de IMM47, IMM60, IMM70 e IMM80

Ratones y reactivos: Se usaron ratones C57BL/6 de tipo salvaje y CD1d -/-(deficientes en NKT). Los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la autoridad de una U.K. Home Office Project License. Los compuestos lipídicos a-GalCer, IMM47 (treitolceramida), IMM60 (anillo de 6 miembros ThrCer), IMM70 (anillo de 7 miembros ThrCer) e IMM80 (anillo de 8 miembros ThrCer), se solubilizaron en el vehículo (NaCl 150 mM y Tween 20 al 0.5%; Sigma, Reino Unido). Hiltonol® (Poly I:C; [Oncovir Inc, Estados Unidos.]) se diluyó en solución salina regulada con fosfato (PBS; Oxoid, Reino Unido) antes de la inyección.

Activación in vitro e in vivo de células iNKT: para la reestimulación in vitro de células iNKT, se cargaron 5x105 esplenocitos C57BL/6 con 100 ng/ml, 10 ng/ml o 1 ng/ml de a-GalCer o vehículo durante 48 horas y la presencia de IFN^y en el sobrenadante determinado por ELISA (eBioscience).

Para la activación in vivo de células iNKT, se inyectó por vía intravenosa a ratones C57BL/6 de tipo salvaje o CO1d -/-(deficientes en células NKT) con 1 jg de lípidos y suero sanguíneo a las 2 horas o 18 horas y la presencia de IL-4 e IFNy determinado por ELISA (eBioscience).

Expresión y purificación de proteínas: hCDld y p2m se replegaron con a-GalCer, IMM47, IMM60, IMM70 o IMM80 por cromatografía oxidativa. En resumen, CD1d y p2m se sobreexpresaron en E. coli BL21 utilizando un sistema de expresión procariota (Novagen, Reino Unido). Las proteínas individuales se purificaron de los cuerpos de inclusión, luego se replegaron con el lípido correspondiente. El complejo fue biotinilado y purificado.

Preparación de iNKT TCR humano: Se preparó TCR soluble de acuerdo con el protocolo descrito por McCarthy et al., J Exp Med, 204 (5), 1131-44 (2007), donde ambas cadenas Va24 y Vp11 se sobreexpresaron individualmente en E. coli y purificaron de los cuerpos de inclusión, luego se replegaron y purificaron para generar los heterodímeros de TCR.

Resonancia de plasmón superficial: Se realizaron experimentos SPR con un modelo 3000 BIAcore para medir la afinidad y la cinética de la unión de iNKT TCR a los complejos hCD1d-ligando. En resumen, aproximadamente 1000 RU de los complejos hCD1d-lípidos biotinilados se inmovilizaron en chips sensores CM5 recubiertos con estreptavidina (BIAcore). Las inyecciones de diluciones en serie de TCR purificadas se pasaron sobre el lípido hCD1d inmovilizado a una velocidad de flujo de 10 jl/min para los experimentos de unión en equilibrio, o 50 jl/min para los experimentos cinéticos. Los valores de Kd se calcularon ajustando los datos del experimento de enlace de equilibrio a un modelo de enlace de saturación de regresión no lineal (GraphPad Prism 5.0), mientras que los datos de kdesactivado se estimaron a partir de los experimentos de cinética ajustando los datos al enlace de Langmuir 1:1 modelo utilizando el software BIAevaal 3.1 (BIAcore).

Análisis comparativo de alpha-GalCer, ThrCer, IMM60 e IMM70 sobre la regresión tumoral

Se inyectó a los ratones 1 x 106 células EG7 (células EL4 transfectadas con ovoalbúmina de longitud completa). Cuatro días después (cuando el tumor era palpable) los ratones se inmunizaron con 800 jg de ovoalbúmina (OVA) sola o varios lípidos: (alfa-GalCer, ThrCer, IMM60 e IMM70. El tamaño medio del tumor se evaluó varios días después del desafío resumido en la Figura 19, IMM60 fue el único compuesto de los analizados que indujo la regresión del tumor establecido.

Anergia In vivo de células iNKT

El siguiente experimento fue diseñado para evaluar la anergia in vivo de las células iNKT tal como se define por su capacidad para mejorar las respuestas de células T y B específicas de antígeno. El diseño experimental se expone en la Figura 12. Los ratones se acondicionaron previamente en el día -28 con lípidos individuales mostrados en la Figura 12 (100 ng i.v. de alphaGalCer, IMM47, IMM60 o IMM70). Dieciocho horas más tarde, se sangraron los ratones para evaluar la activación de células iNKT, tal como se define por IFN-gamma (determinado por ELISA (eBioscience)), los resultados se muestran en la Figura 13. En el día cero (28 días después del preacondicionamiento de lípidos), se midió la expresión del marcador de activación PD1 en células iNKT esplénicas (Figura 14). Estos dos resultados muestran que IMM60 induce una activación celular iNKT más fuerte que IMM47, IMM70 o incluso alphaGalCer. (Esta observación es consistente con la capacidad de IMM60 de inducir respuestas más fuertes de células T y B después de la preparación de 7 días como se describe a continuación.) Sin embargo, IMM60 también causó una mayor lisis de CC y una mayor anergia como se describe a continuación.

Como se indica en la Figura 12, la inmunización se realizó el día cero con 800 jg de OVA y alphaGalCer (para todos los ratones). Dieciocho horas más tarde, la activación de células iNKT se analizó por expresión de IFNy por ELISA (Figura 15). En el día 7, las respuestas de las células T se analizaron (Figura 16).

Los resultados en la Figura 15 confirmaron hallazgos previos de que IMM47 causó la anergia celular de iNKT más débil (como se define por la mayor cantidad de IFNy). AlphaGalCer e IMM60 indujeron la mayor anergia de las células iNKT, mientras que los ratones IMM70 preacondicionados tenían células iNKT funcionales (como se muestra por la cantidad intermedia de IFNy). Los resultados que se muestran en la Figura 16 indican que los ratones IMM70 preacondicionados tuvieron la mayor respuesta de células T.

Lisis de células dendríticas pulsadas con IMM47, IMM60 e IMM70

Los siguientes experimentos se realizaron para analizar el grado en que IMM47, IMM60 e IMM70 causan la lisis de las células dendríticas humanas.

Se cultivaron células dendríticas derivadas de monocitos y células iNKT humanas con diversas concentraciones de cada lípido durante 40 horas y luego se tiñeron con PI para determinar el porcentaje de lisis de células dendríticas (y el porcentaje de supervivencia). Los resultados que se muestran en la Figura 17 muestran que IMM47 causó la muerte de células dendríticas más baja (al observar el porcentaje de células dendríticas vivas en la muestra) y que IMM60 causó la muerte de células dendríticas más alta. Curiosamente, a concentraciones inferiores a 5 ng/ml, el porcentaje de lisis DC obtenida con IMM70 es muy similar a los resultados obtenidos con IMM47, aunque IMM70 es el agonista más fuerte.

Cebado directo de células T y B por IMM47, IMM60 e IMM70

Se realizaron experimentos para analizar la capacidad de IMM47, IMM60 e IMM70 para inducir respuestas de células T y B. El diseño experimental se expone en la Figura 18. En resumen, se utilizó ovoalbúmina más 1 microgramo de uno de los lípidos para inmunizar ratones en el día cero, y se extrajeron sangre/células y se analizaron en los momentos indicados. Los datos proporcionados en la Figura 11 muestran que IMM60 indujo respuestas de células T y B más fuertes en comparación con IMM47 e IMM70, según lo medido por las células CD8+ Kb tetrámero y los niveles de OVA IgG en suero.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene una estructura:

en donde n es 1, 2 o 3;

o una sal del mismo.

2. Un compuesto o sal como se reivindica en la reivindicación 1, en donde n es 1.

3. Un compuesto o sal como se reivindica en la reivindicación 1, en donde n es 2 o 3.

4. Una composición que comprende un compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Una composición como se reivindica en la reivindicación 4, que comprende además una segunda terapéutica seleccionada del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente modificador de la respuesta biológica y un agente inmunoterapéutico.

6. Un compuesto o sal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso como medicamento.

7. Un método in vitro para activar una célula T asesina natural (NKT) que comprende poner en contacto la célula con el compuesto o la sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una cantidad efectiva para activar la célula NKT.

8. Un compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en el tratamiento del cáncer.

9. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en la reivindicación 8, en donde el cáncer es melanoma.

10. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el compuesto o sal se administra en combinación con un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente modificador de la respuesta biológica y un agente inmunoterapéutico.

11. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en la reivindicación 10, en donde el segundo agente terapéutico comprende un agente inmunoterapéutico que comprende una vacuna contra el cáncer.

12. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en la reivindicación 10, en donde el segundo agente terapéutico comprende una inmunoterapéutica que comprende un antígeno canceroso o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno canceroso.

13. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el segundo agente terapéutico comprende un agente inmunoterapéutico que comprende al menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo de receptor anti-Her2/neu, un anticuerpo anti-CD52, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo antirreceptor CD25 IL-2, un anticuerpo anti-CD40/CD40L, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1 (anti-CD279), un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-GITR y un anticuerpo anti-OX-40 (anti-CD134).

14. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en la reivindicación 13, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-PDL1, un anticuerpo anti OX40 y un anticuerpo anti-GITR.

15. Un compuesto o sal para uso en el tratamiento del cáncer como se reivindica en la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.

16. Un paquete que contiene un compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un segundo agente terapéutico como una preparación combinada para uso simultáneo por separado o secuencial en el tratamiento del cáncer.

17. Un kit que comprende (a) un compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y (b) un agente inmunoterapéutico, empaquetados juntos pero no mezclados.

18. Un kit como se reivindica en la reivindicación 17, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo.