ES2787234T3 - Purificación de proteínas potenciada a través de una elución de proteína A modificada - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende una región CH2/CH3, que comprende las etapas de: (a) unir el polipéptido a la proteína A; y (b) eluir el polipéptido con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos usando un tampón de elución, en el que el tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo y en el que el gradiente de pH se forma ajustando un porcentaje de cada tampón de pH en el tampón de elución, en el que el tampón de pH alto está en pH 5,0 y el tampón de pH bajo está en pH 2,7, en el que el gradiente de pH termina en 3,7, y en el que un agregado, una impureza de la célula huésped, un contaminante de colmatación de los filtros de virus, una partícula vírica y una partícula similivírica se eliminan del polipéptido deseado.

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de proteínas potenciada a través de una elución de proteína A modificada

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/238.867, presentada el 1 de septiembre de 2009, y la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/253.438 presentada el 20 de octubre de 2009.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la presente invención se refiere en general a procedimientos para purificar un polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3, que comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un gradiente de pH. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La purificación económica y a gran escala de proteínas es un problema cada vez más importante para la industria biotecnológica. En general, las proteínas se producen mediante cultivo celular, usando líneas celulares de mamífero o bien bacterianas genomanipuladas para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado que las líneas celulares usadas son organismos vivos, deben recibir alimento con un medio de crecimiento complejo, que contenga azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, normalmente suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos que las células reciben como alimento y de los subproductos de las propias células a una pureza suficiente para su uso como agente terapéutico humano plantea un desafío formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de restos celulares dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Se puede provocar que algunas proteínas se segreguen directamente desde la célula a los medios de crecimiento circundantes; otras se hacen intracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, que se puede realizar mediante una variedad de procedimientos, que incluyen cizallamiento mecánico, choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicha destrucción libera todo el contenido de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. En general, estos se eliminan por centrifugación diferencial o por filtración. El mismo problema surge, aunque en una escala más pequeña, con proteínas segregadas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de proteínas intracelulares de la célula huésped en el transcurso del ciclo de producción de proteínas.

Una vez que se ha obtenido una solución aclarada que contiene la proteína de interés, normalmente se intenta su separación de las otras proteínas producidas por la célula usando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. La cromatografía de afinidad, que aprovecha una interacción específica entre la proteína que se va a purificar y un agente de captura inmovilizado, se usa comúnmente para algunas proteínas (por ejemplo, proteínas para su uso como agente terapéutico humano). La proteína A es un adsorbente útil para la cromatografía de afinidad de proteínas, tales como anticuerpos, que contienen una región Fc. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kDa de Staphylococcus aureus que se une con una alta afinidad (aproximadamente 10'8 M a la IgG humana) a la región Fc de los anticuerpos. Sin embargo, dado que las proteínas tienden a agregarse o a plegarse incorrectamente, la proteína deseada (es decir, el monómero) a menudo se purifica conjuntamente con otras impurezas de estas columnas de afinidad, tales como agregados de proteínas, subproductos de las propias células (es decir, impurezas de la célula huésped) o contaminante de colmatación de los filtros de virus.

Se han desarrollado otras técnicas para separar aún más estas impurezas y mezclas de proteínas en función de su carga, grado de hidrofobia o tamaño, tal como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba o la cromatografía de exclusión por tamaño. Varias resinas o sorbentes cromatográficos diferentes están disponibles para cada una de estas técnicas, lo que permite la adaptación exacta del esquema de purificación a la proteína particular implicada. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación es que se puede provocar que las proteínas se muevan a diferentes velocidades al descender por una fase sólida larga (por ejemplo, una columna), logrando una separación física que se incrementa a medida que van descendiendo por la fase sólida, o que se adhieran selectivamente al medio de separación, eluyéndose entonces diferencialmente por diferentes disolventes. Sin embargo, cada uno de estos procedimientos requiere tampones, resinas o sorbentes adicionales y otros recursos para una mayor purificación, y esto a su vez da como resulto un tiempo de procesamiento más largo y un coste mayor. Por tanto, se necesitan procedimientos más eficaces y económicos para purificar monómeros de proteínas.

Los procedimientos de purificación de polipéptidos a partir de agregados, multímeros y proteínas modificadas usando una columna de proteína A y eluyendo con un sistema de elución en gradiente de pH se describieron en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 12/008.160. El documento WO2008/085988A1 describe procedimientos de purificación de proteínas. El documento WO2008/025747A1 describe un procedimiento para la purificación de proteínas de fusión a Fc.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para purificar un polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3 uniendo el polipéptido a la proteína A y eluyendo con un gradiente de pH que comienza en un pH bajo. Estos procedimientos de purificación proporcionan las ventajas de lograr una mejor separación secuencial de polipéptidos o no agregados de diversas impurezas, que incluyen impurezas de la célula huésped, contaminantes de colmatación de los filtros de virus, partículas víricas o similivíricas, variantes de polipéptidos básicas y agregados de polipéptidos, y también una mayor pureza de los monómeros del polipéptido deseables en la fracción/combinación purificada. Estos procedimientos se pueden lograr usando diversas resinas cromatográficas de proteína A y sorbentes cromatográficos. Estos procedimientos también se pueden usar a escala de fabricación y en procedimientos comerciales, y pueden facilitar la utilización de tecnologías alternativas de purificación posterior distintas a la cromatografía en columna.

En particular, la invención proporciona un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende una región C^h2/C^h3, que comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos.

Más en particular, la invención proporciona un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende una región C^h2/C^h3, que comprende las etapas de: (a) unir el polipéptido a la proteína A; y (b) eluir el polipéptido con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos usando un tampón de elución, en el que el tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo y en el que el gradiente de pH se forma ajustando un porcentaje de cada tampón de pH en el tampón de elución, en el que el tampón de pH alto está en pH 5,0 y el tampón de pH bajo está en pH 2,7, en el que el gradiente de pH termina en 3,7, y en el que un agregado, una impureza de la célula huésped, un contaminante de colmatación de los filtros de virus, una partícula vírica y una partícula similivírica se eliminan del polipéptido deseado.

En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente pH 4,2. En otros modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente pH 4,3. En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente 4,6. En algunos aspectos, el gradiente de pH termina en 3,0 o más. En algunos modos de realización, el gradiente de pH termina en aproximadamente 3,7.

En algunos modos de realización, el tampón de pH alto está en aproximadamente pH 5,0 y en el que el tampón de pH bajo está en aproximadamente pH 2,7.

En algunos modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo comienza en aproximadamente un 35 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 35 % comprende acetato aproximadamente 16,25 mM y formiato aproximadamente 8,75 mM. En otros modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo comienza en aproximadamente un 25 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 25 % comprende acetato aproximadamente 18,75 mM y formiato aproximadamente 6,25 mM. En algunos modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo comienza en aproximadamente un 40 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 40 % comprende acetato aproximadamente 15 mM y formiato aproximadamente 10 mM.

En algunos modos de realización, el polipéptido se carga con una densidad de carga que comienza en aproximadamente 14 g/l. En algunos modos de realización, el polipéptido se carga con una densidad de carga que varía de aproximadamente 14 g/l a aproximadamente 45 g/l.

En algunos modos de realización, la proteína A es una resina de cromatografía en columna de proteína A o un sorbente cromatográfico de proteína A. En algunos modos de realización, el sorbente cromatográfico de proteína A es una membrana o un monolito.

En algunos modos de realización, la proteína A es una resina de cromatografía en columna de proteína A y en la que el polipéptido tiene un caudal de elución que varía de aproximadamente 5 volúmenes de columna/hora a aproximadamente 25 volúmenes de columna/hora.

En algunos modos de realización, la proteína A es una resina de cromatografía en columna de proteína A y en la que una fracción purificada del polipéptido contiene aproximadamente o menos de aproximadamente 12 volúmenes de columna de proteína A.

En algunos modos de realización, una impureza de la célula huésped se separa del polipéptido. En algunos modos de realización, la impureza de la célula huésped es una proteína de ovario de hámster chino (CHOP).

En algunos modos de realización, un agregado se separa del polipéptido. En otros modos de realización, un contaminante de colmatación de los filtros de virus se separa del polipéptido.

En algunos modos de realización, una partícula vírica o una partícula similivírica se separa del polipéptido. En otros modos de realización, una variante de polipéptido básica se separa del polipéptido.

En algunos modos de realización, la región Ch2/Ch3 comprende una región Fc de una inmunoglobulina.

En algunos modos de realización, el polipéptido es un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo.

En otros modos de realización, el polipéptido es una inmunoadhesina.

En algunos modos de realización, el polipéptido tiene una pureza de al menos aproximadamente un 98 % de monómero. En otros modos de realización, el polipéptido tiene una pureza de al menos aproximadamente un 99 % de monómero.

En algunos modos de realización, la proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 75 % menor, aproximadamente un 80 % menor, aproximadamente un 85 % menor, aproximadamente un 90 % menor, aproximadamente un 95 % menor, aproximadamente un 96 % menor, aproximadamente un 97 % menor, aproximadamente 98 % menor o aproximadamente un 99 % menor que la proporción en un polipéptido no purificado.

En algunos modos de realización, una proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 20 % menor que la proporción en un polipéptido purificado por un procedimiento de elución por etapas, en el que el procedimiento de elución por etapas comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un pH que comienza en 3,6 o menos. En algunos modos de realización, una proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 60 % menor que la proporción en un polipéptido purificado por un procedimiento de elución por etapas, en el que el procedimiento de elución por etapas comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un pH que comienza en 3,6 o menos.

En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene un recuento de partículas víricas o de partículas similivíricas de menos de aproximadamente 15000 partículas/ml. En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene un recuento de partículas víricas o de partículas similivíricas de menos de aproximadamente 12500 partículas/ml, menos de aproximadamente 10000 partículas/ml, menos de aproximadamente 7500 partículas/ml, menos de aproximadamente 5000 partículas/ml, menos de aproximadamente 2500 partículas/ml, menos de aproximadamente 1500 partículas/ml, menos de aproximadamente 1000 partículas/ml, menos de aproximadamente 750 partículas/ml, menos de aproximadamente 500 partículas/ml, menos de aproximadamente 250 partículas/ml, menos de aproximadamente 100 partículas/ml o menos de aproximadamente 50 partículas/ml. En algunos modos de realización, la partícula similivírica es una partícula de tipo retrovirus.

En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica de al menos aproximadamente 4 LRV (reducción de log 10 de virus). En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica que varía de aproximadamente 4 LRV a aproximadamente 8 LRV. En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica que varía de aproximadamente 4 LRV a aproximadamente 7 LRV. En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica de aproximadamente 5 LRV, aproximadamente 6 LRV, aproximadamente 7 LRV o aproximadamente 8 LRV. En algunos modos de realización, la partícula similivírica es una partícula de tipo retrovirus.

En algunos modos de realización, el polipéptido purificado es un monómero del polipéptido.

En algunos modos de realización, la proteína A es un ligando de proteína A modificado o no modificado.

En algunos modos de realización, la purificación es un procedimiento a escala de fabricación.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el procedimiento de purificación comprende además someter el polipéptido a una etapa de filtración de virus o una etapa de cromatografía de intercambio iónico. En algunos modos de realización, la etapa de cromatografía de intercambio iónico se desarrolla después de la etapa de purificación.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el procedimiento de purificación no comprende una etapa de purificación adicional para eliminar un agregado.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el procedimiento de purificación no comprende una etapa de purificación adicional para eliminar un contaminante de colmatación de los filtros de virus.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el procedimiento de purificación no comprende una etapa de purificación adicional para eliminar una variante de polipéptido básica. En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el procedimiento de purificación no comprende una etapa de purificación adicional para eliminar una variante de polipéptido ácida.

También se describe un producto polipeptídico purificado por los procedimientos descritos en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra el cromatograma de gradiente escalonado de pH: el eje de abscisas está en ml desde el comienzo del ciclo de la proteína A, y el eje de ordenadas es la absorbancia (mUA). También se muestra la forma distintiva de la elución por gradiente escalonado en el trazado de UV 280: el pico grande se encuentra al comienzo de la elución y a continuación disminuye hasta una altura estable y se estrecha en los pH menores. La figura 2 muestra los resultados de SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) por fracción de anticuerpo anti-VEGF n.° 1. El eje de abscisas es el tiempo de retención en la columna de SEC (min), el eje de ordenadas es la absorbancia UV normalizada (mUA). A medida que se incrementa el número de fracciones (es decir, el pH disminuye a medida que avanza la elución en gradiente), los picos de HMWS (especies de alto peso molecular) y dímeros (tiempos de retención de alrededor de 12,5 minutos y 13,5 minutos, respectivamente) también se incrementan, mientras el pico de monómero disminuye (tiempo de retención de 16 minutos). Los resultados de estas curvas se cuantificaron mediante la integración de todos los picos (por ejemplo, HMWS, dímero y monómero), comparando las áreas relativas de los picos separadas como porcentajes (por ejemplo, el área total se estableció en un 100 %, el perfil de integración de la SEC de una muestra podía dar porcentajes, tales como "31 % HMWS, 36 % dímero y 33 % monómero").

La figura 3 muestra el gráfico de los resultados de la integración de la SEC para el anticuerpo anti-VEGF n.° 1. Este gráfico muestra que los niveles de monómero fueron altos para las primeras nueve fracciones de elución con cuatro fracciones al 100 %, y los niveles de dímero y HMWS alcanzaron su máximo más tarde en la elución. Estos resultados del ensayo demuestran que el gradiente escalonado de pH separa los agregados del monómero del anticuerpo anti-VEGF n.° 1.

La figura 4A muestra el perfil de integración de la SEC para múltiples moléculas de proteína (anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF n.° 2, anti-MUC16 y anticuerpo anti-CD4). El gradiente escalonado de pH separó con éxito los monómeros de los agregados en el anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF n.° 2, anti-MUC16 y anticuerpo anti-CD4.

La figura 4B muestra el perfil de integración de la SEC para un anticuerpo anti-Met aglucosilado de un solo brazo producido por una fermentación de células huésped bacterianas (E. coli). El gradiente escalonado de pH separó con éxito los monómeros de los agregados en el anticuerpo anti-Met aglucosilado de un solo brazo.

La figura 5 muestra una comparación en paralelo entre una elución por etapas estándar de anticuerpo anti-CD20 (control; con elución de proteínas a pH 3,6 o menos sin el gradiente de pH) y elución en gradiente escalonado de pH. El gráfico de elución del anticuerpo anti-CD20 y la CHOP en el panel izquierdo muestra los niveles de CHOP por fracción en ppm (partes por millón; unidad usada para normalizar la medición de impurezas con respecto a la cantidad de producto). El gráfico de elución del anticuerpo anti-CD20 y los agregados en el panel derecho muestra los valores de integración de los picos de la SEC por fracción a través de la elución en gradiente. Las líneas verticales en los paneles tanto izquierdo como derecho representan el agrupamiento simulado de las fracciones contenidas que generarían una combinación de elución en gradiente de pH con las características que se muestran en la tabla en la parte inferior de la diapositiva.

La figura 6 muestra la separación de CHOP para un anticuerpo anti-VEGF n.° 1. Los niveles de CHOP por fracción se expresan en ppm o ng/ml.

La figura 7 muestra la separación de CHOP para un anticuerpo anti-MUC16. Los niveles de CHOP por fracción se expresan en ppm o ng/ml.

La figura 8 es una superposición de cromatogramas con las resinas de proteína A MABSELECT™, MABSELECT SURE™, PROSEP® Va, PROSEP® Ultra Plus y POROS® MABCAPTURE™.

La figura 9 es un diagrama de Pareto que muestra que el % de B al comienzo (el pH inicial y la pendiente del gradiente de elución) es el parámetro más influyente para determinar la eficacia de separación de agregados, seguido de la densidad de carga y el tiempo de residencia.

La figura 10 es un perfil de interacción para los parámetros de % de B al comienzo, densidad de carga y % de B al comienzo, período total de elución y tiempo de residencia.

La figura 11 es un ciclo de fabricación ejemplar para la elución en gradiente escalonado de pH.

La figura 12 muestra los resultados del estudio de membranas de intercambio iónico posterior usando dos tamaños de membrana de intercambio catiónico y tres tamaños de membrana de intercambio aniónico. Las unidades Coin y Nano son ambas representativas de la fabricación en el número de capas de membrana, mientras que las unidades ACRODISC® tienen un número reducido de capas, pero son los modelos típicos a escala de mesa de laboratorio usados.

La figura 13 muestra la comparación de los resultados de integración de la SEC entre una columna de 4,1 l (escala piloto) y un ciclo de una columna a escala de mesa de laboratorio de 28 ml.

La figura 14 es un gráfico de disminución de la permeabilidad de VIRESOLVE® Pro del anticuerpo anti-VEGF n.° 1 que compara el gradiente escalonado de pH de la proteína A frente a la etapa estándar de la proteína A en términos de facilitar un mayor rendimiento de la masa con respecto al filtro de parvovirus VIRESOLVE® Pro. Había aproximadamente un incremento de seis veces en el rendimiento de la masa con respecto al VIRESOLVE® Pro usando el gradiente escalonado de pH de la proteína A.

La figura 15 es un cromatograma de elución en gradiente de pH completo de la proteína A que muestra los trazados reales del programa informático de cromatografía AKTA UNICORN™ para el gradiente de pH completo a una densidad de carga de 21 g/l. Falta el pico alto inicial de UV 250 al comienzo del gradiente, lo que indica que el pH al comienzo de la elución es más alto de lo que se requiere para eluir productos de la columna de proteína A.

La figura 16 es un cromatograma AKTA de un ensayo de gradiente de pH a pH 5,0-2,7 (0-100 %B), que indica que un anticuerpo anti-VEGF n.° 1 eluye como un pico diferenciado en el intervalo de pH 4,6-3,6.

La figura 17 es una integración de picos de un ensayo de una variante de intercambio iónico a través de fracciones de elución en gradiente escalonado de pH de la proteína A, que indica la separación de una variante de polipéptido básica en la parte de cola de la elución en gradiente escalonado.

La figura 18 es un recuento de partículas RVLP (partícula de tipo retrovirus) del análisis de QPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) por fracción representada gráficamente frente a la elución del producto de anticuerpo anti-VEGF n.° 1. La mayoría de las RVLP eluyeron tarde en el gradiente donde se produjo poca elución del producto.

La figura 19 es la LRV (reducción de log 10 de virus) para cada fracción en la elución en gradiente escalonado de pH de la proteína A del anticuerpo anti-VEGF n.° 1.

La figura 20 muestra las LRV acumulativas para las combinaciones simuladas de la fracción, que muestran que se pueden lograr LRV más altas en la combinación de proteína A si se omiten fracciones posteriores.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para purificar un polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3 uniendo el polipéptido a la proteína A y eluyendo con un gradiente de pH que comienza en un pH bajo. Los autores de la invención han hecho el sorprendente descubrimiento de que eluir polipéptidos que comprenden una región Ch2/Ch3 de la proteína A con un gradiente de pH a un pH bajo puede proporcionar una mejor separación secuencial de los polipéptidos de diversas impurezas, que incluyen impurezas de la célula huésped, contaminantes de colmatación de los filtros, partículas víricas o similivíricas, variantes de polipéptidos básicas y/o agregados de polipéptidos, y también lograr una mayor pureza o porcentaje de monómeros del polipéptido deseables en la fracción/combinación purificada. Por tanto, la invención tiene ventajas significativas. Los autores de la invención también han descubierto que estos procedimientos se pueden lograr usando diversas resinas cromatográficas de proteína A y sorbentes cromatográficos y que estos procedimientos se pueden usar a escala de fabricación y procedimiento comercial, y pueden facilitar la utilización de tecnologías alternativas de purificación posteriores distintas a la cromatografía en columna (por ejemplo, adsorbentes de membrana).

En particular, la invención proporciona un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende una región C^h2/C^h3, que comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos.

Más en particular, la invención proporciona un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3, que comprende las etapas de: (a) unir el polipéptido a la proteína A; y (b) eluir el polipéptido con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos usando un tampón de elución, en el que el tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo como se define en las reivindicaciones y en el que el gradiente de pH se forma ajustando un porcentaje de cada tampón de pH en el tampón de elución.

También se describe un polipéptido purificado por los procedimientos descritos en el presente documento.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Jane way y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones

Se entiende que el polipéptido de interés en el presente documento es uno que comprende una región C h2/Ch3 y, por lo tanto, es susceptible de purificación por la proteína A. El término "región C^h2/C^h3" cuando se usa en el presente documento se refiere a aquellos residuos aminoacídicos en la región Fc de una molécula de inmunoglobulina que interactúan con la proteína A. En algunos modos de realización, la región Ch2/Ch3 comprende una región C^h2 intacta seguida de una región C^h3 intacta, y comprende lo más preferentemente una región Fc de una inmunoglobulina. Los ejemplos de proteínas que contienen la región C^h2/C^h3 incluyen anticuerpos, inmunoadhesinas y proteínas de fusión que comprenden una proteína de interés fusionada o conjugada con una región C^h2/C^h3.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por moléculas distintas a aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido purificado" o "proteína purificada" es un producto eluido de la cromatografía de afinidad con proteína A usando los procedimientos de gradiente de pH como se describe en el presente documento. Los polipéptidos/proteínas purificados contienen preferentemente monómeros de los polipéptidos principalmente.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido no purificado", "proteína no purificada" o "carga de proteína" es un polipéptido o proteína en el material de carga o material de partida antes de la etapa de purificación por cromatografía de afinidad con proteína A.

Como se usa en el presente documento, el término "impureza" o "impurezas" es un material que es diferente del producto de monómero del polipéptido deseado. Las impurezas incluyen, pero no se limitan a, una variante de polipéptido (por ejemplo, variante de polipéptido ácida o básica), fragmento de polipéptido, agregado o derivado del monómero del polipéptido deseado, otro polipéptido, lípido, ácido nucleico, endotoxina, impureza de célula huésped o contaminante de colmatación de los filtros de virus.

Como se usa en el presente documento, el término "monómero(s)" se refiere a una sola unidad de un polipéptido que comprende una región C^h2/C^h3. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, un monómero consiste en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; en el caso de un anticuerpo de un solo brazo, un monómero consiste en una cadena pesada y una cadena ligera.

Como se usa en el presente documento, el término "variante de polipéptido básica" o "variante básica" se refiere a una variante de un polipéptido de interés que es más básica (por ejemplo, según se determina por cromatografía de intercambio catiónico) que el polipéptido de interés.

Como se usa en el presente documento, el término "variante de polipéptido ácida" o "variante ácida" se refiere a una variante de un polipéptido de interés que es más ácida (por ejemplo, según se determina por cromatografía de intercambio catiónico) que el polipéptido de interés.

Como se usa en el presente documento, el término "agregado(s)" se refiere a cualquier multímero de un polipéptido o un fragmento de polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3. Por ejemplo, un agregado puede ser un dímero, trímero, tetrámero o un multímero mayor que un tetrámero, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "impureza de la célula huésped" se refiere a cualquier contaminante proteínico o subproducto introducido por la línea de la célula huésped, líquido del cultivo celular o cultivo celular. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, proteína de ovario de hámster chino (CHOP), proteína de E. coli, proteína de levadura, proteína COS de simio o proteína de células de mieloma (por ejemplo, proteína NS0 (células de mieloma múltiple de ratón derivadas de un ratón BALB/c)).

Como se usa en el presente documento, el término "contaminante de colmatación de los filtros de virus" se refiere a cualquier partícula de gran peso molecular o especie de peso molecular alto (HMWS) con un diámetro hidrodinámico similar a o mayor que la distribución del tamaño de poro del filtro de parvovirus. Los contaminantes de colmatación de los filtros de virus incluyen, pero no se limitan a, agregados de polipéptidos solubles de peso molecular alto y agregados solubles y/o insolubles de impurezas de la célula huésped (por ejemplo, CHOP). Una "célula huésped" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de insertos polinucleotídicos para producir polipéptidos. Las células huésped incluyen la descendencia de una única célula huésped, y la descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico) a la célula original debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

La "fase sólida", como se usa en el presente documento, se refiere a una matriz no acuosa a la que se puede adherir la proteína A.

Un "tampón" es una solución tamponada que resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Diversos tampones que se pueden emplear dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampón se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

El "tampón de equilibrado" en el presente documento es el usado para preparar la fase sólida (con la proteína A inmovilizada) para cargar la proteína de interés.

El "tampón de lavado" se usa en el presente documento para referirse al tampón que se pasa sobre la fase sólida (con proteína A inmovilizada) después de la carga y antes de la elución de la proteína de interés.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que retengan o se modifiquen para que comprendan, una región Ch2/Ch3 como se define en el presente documento.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa, en general la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')² y Fv; moléculas de anticuerpos monocatenarios; diacuerpos; anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el fragmento de anticuerpo comprende una región C^h2/C^h3.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, al dirigirse contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de colecciones de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

El término "región hipervariable" cuando se usa en el presente documento se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoacídicos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Los residuos de la "región estructural" o "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable, como se define en el presente documento.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Se pueden realizar estas modificaciones para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para otros detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan el "dominio de unión" de una proteína "adhesina" heteróloga (por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de adhesina con la especificidad de unión deseada que es distinta al sitio de reconocimiento de y unión a antígeno (sitio de combinación con antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se deriva preferentemente de cadenas pesadas ^y1, ^y2 o ^y4 ya que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones se pueden purificar por cromatografía con proteína A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)).

El término "dominio de unión a ligando" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier receptor de superficie celular natural o cualquier región o derivado del mismo que retiene al menos una unión a ligando cualitativa de un receptor natural correspondiente. En un modo de realización específico, el receptor es de un polipéptido de la superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulinas. Otros receptores, que no son miembros de la familia de supergenes de inmunoglobulinas pero que, sin embargo, están específicamente cubiertos por esta definición, son receptores para citocinas, y en particular receptores con actividad tirosina cinasa (tirosina cinasas receptoras), miembros de las superfamilias de receptores de hematopoyetina y del factor de crecimiento nervioso, y moléculas de adhesión celular, por ejemplo, selectinas (E, L y P).

El término "dominio de unión al receptor" se usa para designar cualquier ligando natural para un receptor, incluyendo moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de dicho ligando natural que retiene al menos una capacidad de unión al receptor cualitativa de un ligando natural correspondiente. Esta definición, entre otras, incluye específicamente secuencias de unión de ligandos para los receptores mencionados anteriormente.

Una "quimera de anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula que combina al menos un dominio de unión de un anticuerpo (como se define en el presente documento) con al menos una inmunoadhesina (como se define en la presente solicitud). Las quimeras de anticuerpo-inmunoadhesina ejemplares son las quimeras biespecíficas de CD4-IgG descritas en Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) y Chamow et al., J. Immunol. 153:4268 (1994).

Para su uso en el presente documento, a menos que se indique claramente de otro modo, el uso de los términos "un/o", "una" y similares se refiere a uno o más.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que están dirigidos a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.

Se entiende que, siempre que se describan modos de realización en el presente documento con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan modos de realización análogos de otro modo descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Purificación de polipéptidos

El procedimiento en el presente documento implica purificar un polipéptido que contiene la región C h2/Ch3 de una o más impurezas mediante cromatografía de afinidad con proteína A que usa un gradiente de pH que comienza en un pH bajo. En un aspecto, el polipéptido que comprende una región C^h2/C^h3 se puede purificar mediante un procedimiento que comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos.

En otro aspecto, el polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3 también se puede purificar mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) unir el polipéptido a la proteína A; y (b) eluir el polipéptido con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos usando un tampón de elución, en el que el tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo y en el que el gradiente de pH se forma ajustando un porcentaje de cada tampón de pH en el tampón de elución.

La proteína A puede ser un ligando de proteína A modificado o no modificado. Como se usa en el presente documento, el "ligando de proteína A" engloba la proteína A natural, la proteína A producida sintéticamente (por ejemplo, por síntesis de péptidos o por técnicas recombinantes), y variantes de la misma que retienen la capacidad de unirse a proteínas que tienen una región C^h2/C^h3. Un ligando de proteína A modificado se puede manipular químicamente para que sea estable en soluciones de pH alto durante cortos períodos de tiempo (por ejemplo, MABSELECT SURE™ (GE Healthcare (Piscataway, NJ)), POROS® MABCAPTURE™ A (Applied Biosystems (Foster City, CA)). El término "ligando de proteína A no modificado", como se usa en el presente documento, engloba un ligando de proteína A que es similar a la proteína A recuperada de una fuente natural. El ligando de proteína A no modificado, por ejemplo, MABSELECT™, PROSEP™ Va, PROSEP™ Ultra Plus, se puede comprar comercialmente a GE Healthcare (Piscataway, NJ) o Millipore (Billerica, MA).

La proteína A se puede inmovilizar en una fase sólida. La fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase discontinua o partículas diferenciadas, una membrana o filtro. Los ejemplos de materiales para formar la fase sólida incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa) y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirenodivinil)benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualquiera de los anteriores.

La proteína A inmovilizada en una fase sólida se usa para purificar los polipéptidos que contienen la región C^h2/C^h3. En algunos modos de realización, la fase sólida es una resina de la columna de proteína A que comprende una resina a base de microesferas de vidrio, resina a base de sílice o resina a base de agarosa para inmovilizar la proteína A. Por ejemplo, la fase sólida es una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. A veces, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento por evitar una adherencia inespecífica a la columna. La columna PROSEP™ A es un ejemplo de una columna de vidrio de poro controlado con proteína A que está recubierta con glicerol. En otros modos de realización, la fase sólida es un sorbente cromatográfico de proteína A para inmovilizar la proteína A. Los sorbentes cromatográficos de proteína A incluyen, pero no se limitan a, membranas (por ejemplo, Sartorius (Goettingen, Alemania), membrana de proteína A SARTOBIND™) o monolitos (por ejemplo, BIA Separations (Villach, Austria), monolitos de HLD de proteína A CIM®).

La fase sólida para la cromatografía con proteína A se puede equilibrar con un tampón de equilibrado, y los polipéptidos no purificados que comprenden diversas impurezas (por ejemplo, líquido recuperado del cultivo celular) se pueden cargar a continuación sobre la fase sólida equilibrada. El polipéptido se puede cargar con un tampón de carga. Convenientemente, el tampón de equilibrado para equilibrar la fase sólida puede ser el mismo que el tampón de carga, pero esto no es necesario. A medida que los polipéptidos fluyen a través de la fase sólida, los polipéptidos y diversas impurezas se adsorben sobre la proteína A inmovilizada. Los tampones de lavado se pueden usar para eliminar algunas impurezas, tales como impurezas de la célula huésped, pero no los polipéptidos de interés.

El tampón de equilibrado es preferentemente isotónico y comúnmente tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. Por ejemplo, un tampón de equilibrado puede tener Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM y pH 7,1.

El "tampón de carga" se refiere a un tampón que se usa para cargar la mezcla de la proteína que contiene la región Ch2/Ch3 y contaminantes sobre la fase sólida en la que la proteína A está inmovilizada. A menudo, los tampones de equilibrado y carga son los mismos.

El tampón de lavado puede servir para eluir la impureza de la línea celular u otras diversas impurezas. La conductividad y/o el pH del tampón de lavado es/son tales que las impurezas se eluyen de la cromatografía con proteína A, pero no cantidades significativas del polipéptido de interés.

El polipéptido unido a la proteína A se puede eluir con un gradiente de pH usando un único tampón de elución o una combinación de tampones de elución.

El "tampón de elución" se usa para eluir el polipéptido que contiene la región C^h2/C^h3 de la proteína A inmovilizada. Como se usa en el presente documento, el tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo y, de este modo, forma un gradiente de pH ajustando un porcentaje del tampón de pH alto y el tampón de pH bajo en el tampón de elución. En algunos modos de realización, el tampón de elución tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Los valores de pH como se usan en el presente documento se miden sin la presencia de polipéptidos. Los ejemplos de tampones de pH que controlan el pH dentro de este intervalo incluyen, pero no se limitan a, tampones de fosfato, acetato, citrato, ácido fórmico y amonio, así como combinaciones de estos. Los tampones preferentes de este tipo son los tampones de acetato y ácido fórmico.

En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente 5,0. En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en menos de 5,0. En algún modo de realización, el gradiente de pH comienza en el intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 4,0. En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente 4,9, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,1 o aproximadamente 4,0. En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente 4,98, aproximadamente 4,96, aproximadamente 4,94, aproximadamente 4,92, aproximadamente 4,90, aproximadamente 4,88, aproximadamente 4,86, aproximadamente 4,84, aproximadamente 4,82, aproximadamente 4,80, aproximadamente 4,78, aproximadamente 4,76, aproximadamente 4,74, aproximadamente 4,72, aproximadamente 4,70, aproximadamente 4,68, aproximadamente 4,66, aproximadamente 4,64, aproximadamente 4,62, aproximadamente 4,60, aproximadamente 4,58, aproximadamente 4,56, aproximadamente 4,54, aproximadamente 4,52, aproximadamente 4,50, aproximadamente 4,48, aproximadamente 4,46, aproximadamente 4,44, aproximadamente 4,42, aproximadamente 4,40, aproximadamente 4,38, aproximadamente 4,36, aproximadamente 4,34, aproximadamente 4,32, aproximadamente 4,30, aproximadamente 4,28, aproximadamente 4,24, aproximadamente 4,22, aproximadamente 4,20, aproximadamente 4,18, aproximadamente 4,16, aproximadamente 4,14, aproximadamente 4,12, aproximadamente 4,10, aproximadamente 4,08, aproximadamente 4,06, aproximadamente 4,04 o aproximadamente 4,02.

En algunos modos de realización, el gradiente de pH termina en aproximadamente 3,0. En algunos modos de realización, el gradiente de pH termina en más de 3,0. En algunos modos de realización, el gradiente de pH termina en un intervalo de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0. En algunos modos de realización, el gradiente de pH termina en aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8 o aproximadamente 3,9. En algunos modos de realización, el gradiente de pH termina en aproximadamente 3,12, aproximadamente 3,14, aproximadamente 3,16, aproximadamente 3,18, aproximadamente 3,20, aproximadamente 3,22, aproximadamente 3,24, aproximadamente 3,26, aproximadamente 3,28, aproximadamente 3,30, aproximadamente 3,32, aproximadamente 3,34, aproximadamente 3,36, aproximadamente 3,38, aproximadamente 3,40, aproximadamente 3,42, aproximadamente 3,44, aproximadamente 3,46, aproximadamente 3,48, aproximadamente 3,50, aproximadamente 3,52, aproximadamente 3,54, aproximadamente 3,56, aproximadamente 3,58, aproximadamente 3,60, aproximadamente 3,61, aproximadamente 3,62, aproximadamente 3,63, aproximadamente 3,64, aproximadamente 3,65, aproximadamente 3,66, aproximadamente 3,67, aproximadamente 3,68, aproximadamente 3,69, aproximadamente 3,70, aproximadamente 3,71, aproximadamente 3,72, aproximadamente 3,73, aproximadamente 3,74, aproximadamente 3,75, aproximadamente 3,76, aproximadamente 3,77, aproximadamente 3,78, aproximadamente 3,79, aproximadamente 3,80, aproximadamente 3,82, aproximadamente 3,84, aproximadamente 3,86, aproximadamente 3,88, aproximadamente 3,9, aproximadamente 3,92, aproximadamente 3,94, aproximadamente 3,96 o aproximadamente 3,98.

En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente pH 4,2 y termina en aproximadamente pH 3,7. En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente pH 4,24 y termina en aproximadamente pH 3,69. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF, los anticuerpos anti-CD20, los anticuerpos anti-MUC16, los anticuerpos anti-CD4 y los anticuerpos anti-Met de un solo brazo se pueden purificar usando el gradiente de pH que comienza en aproximadamente pH 4,24 y termina en aproximadamente pH 3,69.

En otros modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente pH 4,3 y termina en aproximadamente pH 3,7. En algunos modos de realización, el gradiente de pH (es decir, gradiente escalonado de pH) comienza en aproximadamente pH 4,34 y termina a aproximadamente pH 3,69. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF, los anticuerpos anti-CD20, los anticuerpos anti-MUC16, los anticuerpos anti-CD4 y los anticuerpos anti-Met de un solo brazo se pueden purificar usando el gradiente de pH que comienza en aproximadamente pH 4,34 y termina en aproximadamente pH 3,69.

En algunos modos de realización, el gradiente de pH comienza en aproximadamente pH 4,6 y termina en aproximadamente pH 3,7. En algunos modos de realización, el gradiente de pH (es decir, gradiente completo de pH) comienza en aproximadamente pH 4,58 y termina en aproximadamente pH 3,69. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF, los anticuerpos anti-CD20, los anticuerpos anti-MUC16, los anticuerpos anti-CD4 y los anticuerpos anti-Met de un solo brazo se pueden purificar usando el gradiente de pH que comienza en aproximadamente pH 4,58 y termina en aproximadamente pH 3,69.

El tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo y el gradiente de pH se forma ajustando un porcentaje de cada tampón de pH en el tampón de elución. De acuerdo con la invención, el tampón de pH alto está en pH 5,0 y el tampón de pH bajo está en 2,7. Por ejemplo, el tampón de pH alto puede ser acetato 25 mM y pH 5,0, y el tampón de pH bajo puede ser ácido fórmico 25 mM y pH 2,7.

El ajuste del porcentaje inicial del tampón de pH bajo puede optimizar y maximizar la pureza del polipéptido purificado, y también la separación secuencial de las impurezas, incluyendo agregados, impurezas de la línea celular, variante del polipéptido básica, partícula vírica, partícula similivírica y contaminantes de colmatación de los filtros de virus, de los monómeros del polipéptido. El porcentaje de tampón de pH bajo en el tampón de elución puede comenzar en aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 % o aproximadamente un 45 %.

En algunos modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo en el tampón de elución puede comenzar en aproximadamente un 25 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 25 % comprende acetato aproximadamente 19 mM, formiato aproximadamente 6 mM, y una conductividad del tampón de aproximadamente 1140 a pH 4,5-4,6. Por ejemplo, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 25 % comprende acetato 18,75 mM, formiato 6,25 mM, conductividad del tampón de 1141 uS/cm, a pH 4,58.

En algunos modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo en el tampón de elución puede comenzar en aproximadamente un 35 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 35 % comprende acetato aproximadamente 16 mM, formiato aproximadamente 9 mM, y una conductividad del tampón de aproximadamente 1040 a pH 4,3-4,4. Por ejemplo, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 35 % comprende acetato 16,25 mM, formiato 8,75 mM, conductividad del tampón de 1039 uS/cm, a pH 4,34.

En algunos modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo en el tampón de elución puede comenzar en aproximadamente un 40 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 40 % comprende acetato aproximadamente 15 mM, formiato aproximadamente 10 mM, y una conductividad del tampón de aproximadamente 974 a pH 4,2-4,3. Por ejemplo, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 40 % comprende acetato 15 mM, formiato 10 mM, conductividad del tampón de 974 uS/cm, a pH 4,24.

En algunos modos de realización, el porcentaje de tampón de pH bajo en el tampón de elución puede terminar en aproximadamente un 60 %. En algunos modos de realización, el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo en aproximadamente un 60 % comprende acetato aproximadamente 10 mM, formiato aproximadamente 15 mM, y una conductividad del tampón de aproximadamente 763 a pH 3,6-3,7. Por ejemplo, el tampón de pH bajo al final del gradiente de pH puede ser acetato 10 mM, formiato 15 mM, conductividad del tampón 763 uS/cm, a pH 3,69.

En algunos modos de realización, el tampón de elución tiene una conductividad del tampón que varía de aproximadamente 1200 uS/cm a aproximadamente 500 uS/cm. En algunos modos de realización, el tampón de elución tiene una conductividad del tampón que varía de aproximadamente 1150 uS/cm a aproximadamente 700 uS/cm. En algunos modos de realización, el tampón de elución tiene una conductividad del tampón de aproximadamente 1145 uS/cm, aproximadamente 1141 uS/cm, aproximadamente 1130 uS/cm, aproximadamente 1120 uS/cm, aproximadamente 1110 uS/cm, aproximadamente 1000 uS/cm, aproximadamente 1039 uS/cm, aproximadamente 1000 uS/cm, aproximadamente 974 uS/cm, aproximadamente 900 uS/cm, aproximadamente 800 uS/cm, aproximadamente 763 uS/cm o aproximadamente 700 uS/cm.

En algunos modos de realización, la composición del tampón de elución es acetato aproximadamente 9-20 mM y formiato 5-15 mM. En algunos modos de realización, la composición de la elución es acetato aproximadamente 10-19 mM y formiato 6-16 mM.

El ajuste de la densidad de carga del polipéptido también puede optimizar y maximizar la pureza del polipéptido purificado y la separación de las impurezas, incluyendo agregados, impurezas de la línea celular, variante del polipéptido básica, partícula vírica, partícula similivírica y contaminantes de colmatación de los filtros de virus, de los monómeros del polipéptido.

El término "densidad de carga" es la densidad del polipéptido purificado (g) por litro de resina cromatográfica o la densidad del polipéptido purificado por litro de volumen de membrana/filtro (l). La densidad de carga se mide en g/l.

En algunos modos de realización, el polipéptido se carga con una densidad de carga que comienza en 14 g/l o más. En algunos modos de realización, el polipéptido se carga con una densidad de carga que varía de aproximadamente 14 g/l a aproximadamente 45 g/l o de aproximadamente 14 g/l a aproximadamente 70 g/l. En algunos modos de realización, el polipéptido se carga con una densidad de carga de aproximadamente 15 g/l, aproximadamente 17 g/l, aproximadamente 19 g/l, aproximadamente 21 g/l, aproximadamente 23 g/l, aproximadamente 25 g/l, aproximadamente 26 g/l, aproximadamente 27 g/l, aproximadamente 28 g/l, aproximadamente 29 g/l, aproximadamente 31 g/l, aproximadamente 33 g/l, aproximadamente 35 g/l, aproximadamente 37 g/l, aproximadamente 39 g/l, aproximadamente 41 g/l, aproximadamente 43 g/l, aproximadamente 45 g/l, aproximadamente 50 g/l, aproximadamente 55 g/l, aproximadamente 60 g/l, aproximadamente 65 g/l o aproximadamente 70 g/l.

El ajuste del tiempo de residencia de la elución del polipéptido (o caudal de elución) también puede optimizar y maximizar la pureza del polipéptido y la separación secuencial de impurezas de los monómeros del polipéptido. A una densidad de carga incrementada, el tiempo de residencia de la elución del polipéptido desempeña un papel mucho mayor en la capacidad del gradiente de pH de fraccionar agregados eficazmente. En algunos modos de realización, el polipéptido tiene un caudal de elución que varía de aproximadamente 5 volúmenes de columna/hora a aproximadamente 35 volúmenes de columna/hora. En algunos modos de realización, el polipéptido tiene un caudal de elución que varía de aproximadamente 5 volúmenes de columna/hora a aproximadamente 25 volúmenes de columna/hora. En algunos modos de realización, el polipéptido tiene un caudal de elución de aproximadamente 5 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 7,5 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 10 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 12,5 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 15 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 17,5 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 20 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 22,5 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 25 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 27,5 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 30 volúmenes de columna/hora, aproximadamente 32,5 volúmenes de columna/hora o aproximadamente 35 volúmenes de columna/hora.

Los polipéptidos purificados usando los procedimientos descritos en el presente documento tienen un rendimiento de al menos aproximadamente cualquiera de un 75 % de polipéptido no purificado, un 80 % de polipéptido no purificado, un 85 % de polipéptido no purificado, un 90 % de polipéptido no purificado, un 95 % de polipéptido no purificado, un 96 % de polipéptido no purificado, un 97 % de polipéptido no purificado, un 98 % de polipéptido no purificado o un 99 % de polipéptido no purificado.

El rendimiento es la cantidad total de polipéptido purificado recogido en comparación con el polipéptido no purificado antes de la purificación por cromatografía de afinidad con proteína A como se describe en el presente documento, normalmente expresado como un porcentaje del polipéptido no purificado.

En algunos modos de realización, la proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 75 % menor, aproximadamente un 80 % menor, aproximadamente un 85 % menor, aproximadamente un 90 % menor, aproximadamente un 95 % menor, aproximadamente un 96 % menor, aproximadamente un 97 % menor, aproximadamente 98 % menor o aproximadamente un 99 % menor que la proporción en un polipéptido no purificado.

En algunos modos de realización, la proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 20 % menor, aproximadamente un 30 % menor, aproximadamente un 40 % menor, aproximadamente un 50 % menor, aproximadamente un 60 % menor o aproximadamente un 70 % menor que la proporción en el polipéptido purificado usando una(s) etapa(s) de purificación por pH distinta(s) a las de la presente invención. Por ejemplo, en un procedimiento de elución de la proteína A por etapas convencional o típico, el polipéptido se purifica uniendo el polipéptido a la proteína A y eluyendo el polipéptido a pH 3,6 o menos sin el gradiente de pH. En consecuencia, en algunos modos de realización, la proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 20 % menor, aproximadamente un 30 % menor, aproximadamente un 40 % menor, aproximadamente un 50 % menor, aproximadamente un 60 % menor o aproximadamente un 70 % menor que la proporción en un polipéptido purificado por un procedimiento de elución por etapas, en el que el procedimiento de elución por etapas comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un pH que comienza en 3,6 o menos.

En algunos modos de realización, la proporción de contaminante de colmatación de los filtros de virus con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 75 % menor, al menos aproximadamente un 80 % menor, aproximadamente un 85 % menor, aproximadamente un 90 % menor, aproximadamente un 95 % menor, aproximadamente un 96 % menor, aproximadamente un 97 % menor, aproximadamente un 98 % menor, o aproximadamente un 99 % menor que la proporción en el polipéptido no purificado.

En algunos modos de realización, la proporción de contaminante de colmatación de los filtros de virus con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 20 % menor, aproximadamente un 30 % menor, aproximadamente un 40 % menor, aproximadamente un 50 % menor, aproximadamente un 60 % menor o aproximadamente un 70 % menor que la proporción en el polipéptido purificado usando una(s) etapa(s) de purificación por pH distinta(s) a las de la presente invención. Por ejemplo, en un procedimiento de elución de la proteína A por etapas convencional o típico, el polipéptido se purifica uniendo el polipéptido a la proteína A y eluyendo el polipéptido a pH 3,6 o menos sin el gradiente de pH. En consecuencia, en algunos modos de realización, la proporción de contaminante de colmatación de los filtros de virus con respecto al polipéptido purificado es al menos aproximadamente un 20 % menor, aproximadamente un 30 % menor, aproximadamente un 40 % menor, aproximadamente un 50 % menor, aproximadamente un 60 % menor o aproximadamente un 70 % menor que la proporción en un polipéptido purificado por un procedimiento de elución por etapas, en el que el procedimiento de elución por etapas comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un pH que comienza en 3,6 o menos.

En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene un recuento de partículas víricas o de partículas similivíricas de menos de aproximadamente 15000 partículas/ml. En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene un recuento de partículas víricas o de partículas similivíricas de menos de aproximadamente 12500 partículas/ml, menos de aproximadamente 10000 partículas/ml, menos de aproximadamente 7500 partículas/ml, menos de aproximadamente 5000 partículas/ml, menos de aproximadamente 2500 partículas/ml, menos de aproximadamente 1500 partículas/ml, menos de aproximadamente 1000 partículas/ml, menos de aproximadamente 750 partículas/ml, menos de aproximadamente 500 partículas/ml, menos de aproximadamente 250 partículas/ml, menos de aproximadamente 100 partículas/ml o menos de aproximadamente 50 partículas/ml. En algunos modos de realización, la partícula similivírica es una partícula de tipo retrovirus.

Como se usa en el presente documento, el término "partícula vírica" es un virión que consiste en un núcleo de ácido nucleico rodeado por una cubierta protectora de proteína (cápside). Las "partículas similivíricas" son virus no infecciosos que se asemejan en las propiedades morfológicas, bioquímicas u otras similares. Son defectuosos en al menos uno de los componentes necesarios para el ciclo vital del virus. Un ejemplo de partícula similivírica es una partícula de tipo retrovirus que no se puede replicar. Una partícula vírica o una partícula similivírica puede ser endógena o exógena (fortuita). Una partícula vírica o una partícula similivírica endógena se produce por una línea de células huésped, presente en las células y el líquido de cultivo celular, y se puede considerar una impureza de la célula huésped. Una partícula vírica o similivírica exógena o fortuita no se deriva de una línea de células huésped.

En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica de al menos aproximadamente 4 LRV (reducción de log 10 de virus). En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica que varía de aproximadamente 4 LRV a aproximadamente 8 LRV. En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica que varía de aproximadamente 4 LRV a aproximadamente 7 LRV. En algunos modos de realización, el polipéptido purificado tiene una depuración vírica de un virus o una partícula similivírica de aproximadamente 5 LRV, aproximadamente 6 LRV, aproximadamente 7 LRV o aproximadamente 8 LRV. En algunos modos de realización, la partícula similivírica es una partícula de tipo retrovirus.

Como se usa en el presente documento, la LRV es la diferencia de log 10 (virus total) en el polipéptido no purificado y en el polipéptido purificado.

En algunos modos de realización, el polipéptido purificado es un monómero del polipéptido.

En algunos modos de realización, una fracción purificada del polipéptido contiene aproximadamente o menos de aproximadamente 20 volúmenes de columna de proteína A. En algunos modos de realización, una fracción purificada del polipéptido contiene aproximadamente o menos de aproximadamente 15 volúmenes de columna de proteína A. En algunos modos de realización, una fracción purificada del polipéptido contiene aproximadamente o menos de aproximadamente 12 volúmenes de columna de proteína A. En algunos modos de realización, una fracción purificada del polipéptido contiene aproximadamente o menos de aproximadamente 11, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5,5 o aproximadamente 5,0 volúmenes de columna de proteína A.

En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento eliminan al menos dos de las impurezas descritas en el presente documento del producto de monómero del polipéptido deseado. Por ejemplo, los procedimientos eliminan tanto un agregado como una impureza de la línea de células huésped, tanto un agregado como un contaminante de colmatación de los filtros de virus, tanto un agregado como una partícula vírica, tanto un agregado como una partícula similivírica, tanto un agregado como una variante de polipéptido básica, o una impureza de la línea de células huésped y una partícula vírica, etc. En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento eliminan al menos tres de las impurezas descritas en el presente documento del producto de monómero del polipéptido deseado. Por ejemplo, los procedimientos eliminan un agregado, una impureza de la célula huésped y un contaminante de colmatación de los filtros de virus, o un agregado, una impureza de la célula huésped y una partícula vírica, y una variante de polipéptido básica, etc. En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento eliminan al menos cuatro de las impurezas descritas en el presente documento del producto de monómero del polipéptido deseado. Por ejemplo, los procedimientos eliminan un agregado, una impureza de la célula huésped, un contaminante de colmatación de los filtros de virus y una partícula vírica, o un agregado, una impureza de la célula huésped, un contaminante de colmatación de los filtros de virus y una partícula similivírica. En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento eliminan al menos cinco de las impurezas descritas en el presente documento del producto de monómero del polipéptido deseado. Por ejemplo, los procedimientos eliminan un agregado, una impureza de la célula huésped, un contaminante de colmatación de los filtros de virus, una partícula vírica y una partícula similivírica, etc. En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento eliminan todas las impurezas del producto polipeptídico deseado.

En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento no comprenden una etapa de purificación adicional para eliminar un agregado, y los polipéptidos purificados tienen una pureza de al menos aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % de monómero. La depuración de agregados que normalmente se realiza en una etapa de cromatografía de intercambio iónico separada no se requiere después de la cromatografía con proteína A que usa el gradiente de pH como se describe anteriormente.

En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento no comprenden una etapa de purificación adicional para eliminar un contaminante de colmatación de los filtros de virus, y los polipéptidos purificados tienen una pureza de al menos aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % de monómero.

En algunos modos de realización, el procedimiento de purificación no comprende una etapa de purificación adicional para eliminar una variante de polipéptido básica o ácida.

El polipéptido purificado usando los procedimientos descritos en el presente documento se puede someter a etapas de purificación adicionales antes, durante o después de la etapa de cromatografía con proteína A. Ejemplos de otras etapas de purificación incluyen, pero no se limitan a, cromatografía con hidroxiapatita; diálisis; cromatografía de afinidad que usa un anticuerpo para capturar la proteína; cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) (por ejemplo, fraccionamiento en una HIC); precipitación con sulfato de amonio; precipitación con polietilenglicol o derivado de polietilenglicol, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice; cromatoenfoque; SDS-PAGE, filtración de virus, filtración en gel y cromatografía de reparto débil.

En algunos modos de realización, los polipéptidos se someten además a una etapa de filtración de virus. Por ejemplo, se puede usar un filtro de parvovirus en la etapa de filtración de virus después de la etapa de cromatografía con proteína A que usa un gradiente de pH como se describe en el presente documento.

En algunos modos de realización, los polipéptidos se someten además a una etapa de cromatografía de intercambio iónico. En algunos modos de realización, la etapa de cromatografía de intercambio iónico comprende una etapa de cromatografía de intercambio catiónico. En algunos modos de realización, la etapa de cromatografía de intercambio iónico comprende una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. En algunos modos de realización, la etapa de cromatografía de intercambio iónico comprende una etapa de cromatografía de intercambio catiónico y una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

En algunos modos de realización, la etapa de cromatografía de intercambio iónico se desarrolla continuamente después de la etapa de cromatografía con proteína A como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pueden usar membranas de cromatografía de intercambio catiónico y aniónico en lugar de las columnas de cromatografía de intercambio catiónico y/o aniónico después del procedimiento de cromatografía con proteína A descrito en el presente documento para lograr polipéptidos purificados de pureza y rendimiento equivalentes producidos por el procedimiento de cromatografía con proteína A estándar sin el gradiente de pH seguido de etapas de cromatografía en columna de intercambio catiónico y aniónico estándar.

En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento son procedimientos a escala de fabricación o comerciales. Como se usa en el presente documento, los procedimientos a escala de fabricación o comerciales se refieren a una purificación a gran escala de proteína/polipéptido, por ejemplo, de aproximadamente 1 kl a aproximadamente 25 kl de producto de proteína/polipéptido a escala de fermentación por procedimiento de purificación.

Polipéptidos

El polipéptido o proteína que se va a purificar usando los procedimientos descritos en el presente documento incluye, pero no se limita a, anticuerpo, inmunoadhesina o un polipéptido fusionado o conjugado con una región Ch2/Ch3. Las técnicas para generar dichas moléculas se analizan a continuación.

Anticuerpos

Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a:

anticuerpos anti-CD20 tales como anti-CD20 quimérico "C2B8" como en la patente de EE. UU. n.° 5.736.137 (Rituxan®); anticuerpos anti-VEGF, incluyendo anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o madurados en afinidad tales como el anticuerpo anti-VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTIN® (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992) , publicación internacional n.° WO 96/30046 y WO 98/45331, publicado el 15 de octubre de 1998) y V3LA; anticuerpo anti-MUC16; anticuerpos anti-CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum.

39(1):52-56 (1996)) y el anticuerpo ibalizumab (TNX355); anticuerpos anti-MET tales como el anticuerpo anti-C-Met 5D5 de un solo brazo; anticuerpos anti-HER2 trastuzumab (H^e RCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992), patente de EE. UU. n.° 5.725.856) y 2C4 humanizado (documento WO01/00245, Adams et al.), una variante quimérica o humanizada del anticuerpo 2H7 como en la patente de EE. UU. n.° 5.721.108B1, o tositumomab (BEXXAR®); anticuerpos anti-IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993) , y publicación internacional n.° WO 95/23865); anticuerpos contra el antígeno prostático de células madre (PSCA) (documento WO01/40309); anticuerpos anti-CD40, incluyendo S2C6 y variantes humanizadas de los mismos (documento WO00/75348); anticuerpos anti-CD1 (patente de EE. UU. n.° 5.622.700, documento WO 98/23761, Steppe et al., Transplant IntI. 4:3-7 (1991), y Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-CD18 (patente de EE. UU. n.° 5.622.700, expedida el 22 de abril de 1997, o como en el documento WO 97/26912, publicado el 31 de julio de 1997); anticuerpos anti-IgE (incluyendo E25, E26 y E27; patente de EE. UU. n.° 5.714.338, expedida el 3 de febrero de 1998 o patente de EE. UU. n.° 5.091.313, expedida el 25 de febrero de 1992, documento WO 93/04173 publicado el 4 de marzo de 1993, o solicitud internacional n.° PCT/US98/13410 presentada el 30 de junio de 1998, patente de EE. UU. n.° 5.714.338, Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), y publicación internacional n.° WO 95/19181); anticuerpos contra el receptor de Apo-2 (documento WO 98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998); anticuerpos anti-TNF-a, incluyendo cA2 (REMICADE®), CDP571 y MAK-195 (véase la patente de EE. UU. n.° 5.672.347 expedida el 30 de septiembre de 1997, Lorenz et al. J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996), y Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)); anticuerpos contra el factor tisular (TF) (patente europea n.° 0420 937 B1 otorgada el 9 de noviembre de 1994); anticuerpos contra la integrina a4p7 humana (documento WO 98/06248 publicado el 19 de febrero de 1998); anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, anticuerpo 225 quimerizado o humanizado como en el documento WO 96/40210 publicado el 19 de diciembre de 1996); anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3 (patente de EE. UU. n.° 4.515.893 expedida el 7 de mayo de 1985); anticuerpos anti-CD25 o anti-Tac tales como CHI-621 (SIMULECT® y ZENAPa X® (véase la patente de EE. UU. n.° 5.693.762 otorgada el 2 de diciembre de 1997); anticuerpos anti-CD52 tales como CAMPATH-1H (Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)); anticuerpos contra el receptor de Fc tales como el anticuerpo M22 dirigido contra Fcy RI como en Graziano et al. J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); anticuerpos contra el antígeno carcinoembrionario (ACE) tales como hMN-1 4 (Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl): 5935s-5945s (1995); anticuerpos dirigidos contra células epiteliales de mama, incluyendo huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); y Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supl.): 5916s-5920s (1995)); anticuerpos que se unen a células de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al. Eur J Immunol. 26(1): 1­ 9 (1996)); anticuerpos anti-CD38, por ejemplo, AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); anticuerpos anti-CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Supl.):5908s-5910s (1995) y CmA-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoCide (Juweid et al. Cancer Res 55(23 Supl.):5899s-5907s (1995)); anticuerpos anti-EpCAM tales como 17-1A (PANOREX®); anticuerpos anti-GpIIb/IIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (R^e OPRO®); anticuerpos anti-RSV tales como como MEDI-493 (SYⁿA^g IS®); anticuerpos anti-CMV como PROTOVIR®; anticuerpos anti-VIH tales como PRO542; anticuerpos contra la hepatitis como el anticuerpo anti-Hep B OSTAVIR®; anticuerpos anti-CA 125, tales como OvaRex; anticuerpo comtra epítopo GD3 idiotípico BEC2; anticuerpos anti-avp3, incluyendo VITAXIN®; anticuerpo contra el carcinoma de células renales humano tal como ch-G250; ⁱN^g -1; anticuerpo anti-17-1A humana (3622W94); anticuerpo contra el tumor colorrectal humano (A33); anticuerpo contra el melanoma humano R24 dirigido contra el gangliósido GD3; anticuerpo contra el carcinoma de células escamosas humano (SF-25); y anticuerpos contra el antígeno leucocitario humano (HLA) tales como Smart ID10 y el anticuerpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1). Aparte de los anticuerpos específicamente identificados anteriormente, el experto puede generar anticuerpos dirigidos contra un antígeno de interés, por ejemplo, usando las técnicas descritas a continuación.

(i) Selección y preparación de antígenos

El anticuerpo en el presente documento está dirigido contra un antígeno de interés. Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, también se contemplan anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos glucolipídicos asociados a tumores; véase la patente de EE. UU. n.° 5.091.178). Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembranaria (por ejemplo, un receptor) o un ligando, tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ejemplares incluyen aquellas proteínas descritas en la sección (3) a continuación. Ejemplos de dianas moleculares para anticuerpos incluyen proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, ^c D20, CD22 y CD34; miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor EGFR, HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como L^fA-1, Mac1, pl 50, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina av/p3, incluyendo sus subunidades a o bien p (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11 a, anti-CD18 o anti-CD 11b); factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antígenos de los grupos sanguíneos; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C, o cualquiera de los otros antígenos mencionados en el presente documento.

Se pueden usar antígenos o fragmentos de los mismos solubles, opcionalmente conjugados con otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden usar fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. De forma alternativa, se pueden usar células que expresan la molécula transmembranaria como inmunógeno. Dichas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se obtienen preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno con una proteína que sea inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl² o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Se inmunizan animales contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados combinando, por ejemplo, 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se administra a los animales una dosis de refuerzo con 1/5 a {fracción (1/10)} de la cantidad original de antígeno o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para determinar el valor cuantitativo de anticuerpos. Se administra una dosis de refuerzo a los animales hasta alcanzar una meseta del valor cuantitativo. Preferentemente, se administra al animal una dosis de refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También se pueden preparar conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes de agregación, tales como el alumbre, se usan adecuadamente para potenciar la respuesta inmunitaria.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (patente de EE. UU. n.° 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un macaco, como se describe anteriormente en el presente documento, para obtener linfocitos que produzcan o puedan producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), evitando dichas sustancias el crecimiento de células carentes de HGPRT.

Las células de mieloma preferentes son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan la producción estable de anticuerpos en niveles altos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferentes son las líneas de mieloma murino, tal como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección Estadounidense de Cultivos Microbianos de Referencia, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se somete a ensayo para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

Después de que se identifiquen células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y cultivar mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Preferentemente, se usa el procedimiento de cromatografía de afinidad con proteína A que usa un gradiente de pH descrito en el presente documento.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se puedan unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 81: 6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina todo o parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto a inmunoglobulina.

Típicamente, dichos polipéptidos distintos a inmunoglobulina se sustituyen con los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen con los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación con antígeno que tenga especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígeno que tenga especificidad por un antígeno diferente.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de colecciones en fagos de anticuerpos generados usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante el intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

(iv) Anticuerpos humanizados y humanos

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en él desde una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos se denominan a menudo residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano por las CDR o secuencias de CDR de roedor. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE. UU. n.° 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como la FR humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)). Otro procedimiento utiliza una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región estructural se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferente, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales que usan modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada por el(los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia en la unión al antígeno.

De forma alternativa, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, después de su inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana a dichos ratones mutantes en la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Los anticuerpos humanos también se pueden derivar de colecciones de presentación en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).

(v) Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpo de las colecciones en fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. De forma alternativa, se pueden recuperar directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')² (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar directamente fragmentos F(ab')² del cultivo de células huésped recombinantes. También se puede aislar un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase el documento W^o 93/16185. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto en la técnica.

(vi) Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. Aunque dichas moléculas normalmente solo se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como los anticuerpos triespecíficos están englobados en esta expresión cuando se usan en el presente documento.

En la técnica son conocidos procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza normalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J , 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede genomanipular para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferente comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácido grandes con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales indeseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, se puede acoplar uno de los anticuerpos en el heteroconjugado a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmunitario a células indeseadas (patente de EE. UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por el VIH (documentos WO 91/00360, Wo 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

En la literatura también se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')². Estos fragmentos se reducen en presencia del agente arsenito de sodio que forma complejos con ditiol para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab')² de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se segregó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de este modo se pudo unir a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como pudo desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos. También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpo biespecífico del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V^l) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, se obliga a que los dominios VH y VL de un fragmento se emparejen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). De forma alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe en Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh-Ch1- Vh y Vl) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol 147: 60 (1991).

Inmunoadhesinas

El diseño de inmunoadhesina más simple y directo combina el(los) dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con las regiones de bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Normalmente, cuando se preparan las inmunoadhesinas, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión de la adhesina se fusionará en el extremo C con ácido nucleico que codifica el extremo N de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina; sin embargo, también son posibles fusiones N terminales.

Típicamente, en dichas fusiones, el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos los dominios funcionalmente activos de bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan con el extremo C de la parte Fc de un dominio constante, o inmediatamente N terminal al Ch1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crucial; los sitios particulares son bien conocidos y se pueden seleccionar para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de la inmunoadhesina.

En algunos modos de realización, la secuencia de adhesina se fusiona con el extremo N del dominio Fc de la inmunoglobulina G¹ (Ig G¹). Es posible fusionar toda la región constante de la cadena pesada con la secuencia de adhesina. Sin embargo, preferentemente, se usa una secuencia que comienza en la región de bisagra justo antes del sitio de escisión de la papaína que define químicamente el Fc de la IgG (es decir, el residuo 216, considerando que el primer residuo de la región constante de la cadena pesada es 114), o se usan sitios análogos de otras inmunoglobulinas en la fusión. En algunos modos de realización, la secuencia de aminoácidos de la adhesina se fusiona con (a) la región de bisagra y/o Ch2 y Ch3 o (b) los dominios Ch1, de bisagra, Ch2 y CH3, de una cadena pesada de la IgG.

Para las inmunoadhesinas biespecíficas, las inmunoadhesinas se ensamblan como multímeros, y en particular como heterodímeros o heterotetrámeros. En general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en que existen la IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de mayor peso molecular; la IgM existe, en general, como un pentámero de cuatro unidades básicas unidas por enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en forma multimérica en suero. En el caso del multímero, cada una de las cuatro unidades puede ser igual o diferente.

Diversas inmunoadhesinas ensambladas ejemplares dentro del alcance del presente documento se representan esquemáticamente en un diagrama a continuación:

(a) ACL-ACL;

(b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, o VlCl-ACh);

(c) ACl-ACh-(ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh, o VlCl-VhCh)

(d) ACl-VhCh -(ACh, o ACl-VhCh, o VlCl-ACh);

(e) VlCl- ACh -(ACL-VH Ch, o VlCl-ACh); y

(f) (A-Y^-(VlCl-VhCh)2,

en el que cada A representa secuencias de aminoácidos de adhesina idénticas o diferentes;

Vl es un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vh es un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;

CH es un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina;

n es un número entero mayor que 1;

Y designa el residuo de un agente de reticulación covalente.

Por motivos de brevedad, las estructuras anteriores solo muestran rasgos característicos clave; no indican unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran enlaces disulfuro. Sin embargo, cuando se requieran dichos dominios para la actividad de unión, se interpretará que están presentes en las localizaciones habituales que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.

De forma alternativa, las secuencias de adhesina se pueden insertar entre las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulina, de modo que se obtenga una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada quimérica. En este modo de realización, las secuencias de adhesina se fusionan con el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, entre la bisagra y el dominio C^h2, o bien entre los dominios C^h2 y C^h3. Se ha informado de construcciones similares por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol 28:1027-1037 (1991).

Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas, una cadena ligera de inmunoglobulina podría estar presente covalentemente asociada a un polipéptido de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina o directamente fusionada con la adhesina. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se coexpresa típicamente con el ADN que codifica la proteína de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina. Tras la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera se asociarán covalentemente para proporcionar una estructura de tipo inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos por disulfuro. Los procedimientos adecuados para la preparación de dichas estructuras se divulgan, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567, expedida el 28 de marzo de 1989.

Las inmunoadhesinas se construyen más convenientemente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la parte de adhesina sin cambio de pauta de lectura con una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, también se puede usar la fusión con fragmentos genómicos de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990); y Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)). Este último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Se pueden aislar ADNc que codifican regiones constantes de la cadena pesada de IgG en base a secuencias publicadas de colecciones de ADNc derivadas de bazo o linfocitos de sangre periférica, por hibridación o por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNc que codifican la "adhesina" y las partes de inmunoglobulina de la inmunoadhesina se insertan en tándem en un vector plasmídico que dirige la expresión eficaz en las células huésped elegidas.

Otros polipéptidos que contienen la región C^h2/C^h3

El polipéptido que se va a purificar es uno que está fusionado o conjugado con una región C^h2/C^h3. Dichos polipéptidos de fusión se pueden producir para incrementar la semivida sérica de la proteína y/o para facilitar la purificación de la proteína mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Los ejemplos de proteínas biológicamente importantes que se pueden conjugar de esta manera incluyen renina; una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; somatoliberina; paratirina; tirotropina; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; folitropina; calcitonina; lutropina; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de Von Willebrand; factores anticoagulantes tal como la proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como activador del plasminógeno de tipo urocinasa o urinario humano o tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada por activación, expresada y segregada normalmente por los linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una seroalbúmina tal como seroalbúmina humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como betalactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento similar a la insulina I y -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD1 9 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-a, -p y -^y; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerador de la descomposición; antígeno vírico tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del virus del SIDA; proteínas transportadoras; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD 18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumores tal como el receptor EGFR, HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente.

Expresión de polipéptidos

El polipéptido que se va a purificar usando el procedimiento descrito en el presente documento se produce, en general, usando técnicas recombinantes. El polipéptido también se puede producir mediante síntesis de péptidos (u otros medios sintéticos) o aislar de una fuente natural.

Para la producción recombinante del polipéptido, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el polipéptido se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, cuando el polipéptido es un anticuerpo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector, en general, incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.534.615).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Los procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como microorganismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, enterobacterias, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P divulgado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de cerveza, es el usado más habitualmente entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tal como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de un polipéptido glucosilado se derivan de organismos pluricelulares. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células huésped de insectos permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Están disponibles públicamente una variedad de cepas víricas para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 del VPN de Autographa californica y la cepa Bm-5 del VPN de Bombyx mori, y dichos virus se pueden usar como virus en el presente documento, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar como huésped cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el interés ha sido máximo en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen, pero no se limitan a, células CV1 de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/DHFR (C^h O, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón de cánido (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células M^rC 5; células FS4; y células de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de polipéptidos y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células huésped usadas para producir el polipéptido usado en los procedimientos de la presente invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham F10 (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), las patentes de EE. UU. n.os 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la patente de EE. UU. n.° ref. 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el polipéptido se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o segregar directamente al medio. Si el polipéptido se produce intracelularmente, como primera etapa, los desechos particulados, células huésped o bien células lisadas (por ejemplo, resultantes de la homogeneización), se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el polipéptido se segrega al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran, en general, en primer lugar, usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

Composiciones que incluyen formulaciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos

También se describen composiciones, tales como formulaciones farmacéuticas. Se puede preparar una formulación farmacéutica que comprenda el polipéptido purificado mediante los procedimientos de la presente invención, opcionalmente conjugado con una molécula heteróloga, mezclando el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 21.a edición (2005)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

El producto polipeptídico que comprende una región CH2/CH3 purificado mediante los procedimientos descritos en el presente documento puede tener el grado deseado de pureza de al menos aproximadamente un 98 % de monómero o al menos aproximadamente un 99 % de monómero.

Los vehículos, excipientes o estabilizantes "farmacéuticamente aceptables" no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.

Los ingredientes activos también pueden quedar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsula de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de liberación de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 21.a edición (2005).

La formulación que se va a usar para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la variante de polipéptido, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE. UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y-etil-L-glutamato, acetato de etilvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

El polipéptido purificado como se divulga en el presente documento o la composición que comprende el polipéptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable se usa a continuación para diversos usos de diagnóstico, terapéuticos u otros conocidos para dichos polipéptidos y composiciones. Por ejemplo, el polipéptido se puede usar para tratar un trastorno en un mamífero mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido al mamífero.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Cromatografía con proteína A con elución en gradiente de pH

Seis proteínas diferentes que contienen las regiones C^h2/C^h3, anticuerpo anti-VEGF n.° 1, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF n.° 2, anticuerpo anti-MUC16, anticuerpo anti-CD4 y un anticuerpo anti-Met de un brazo se purificaron usando un procedimiento de elución en gradiente escalonado de pH en una columna de cromatografía de proteína A. El procedimiento se describe en la tabla 1.

Tabla 1

Procedimientos experimentales

Se construyó un archivo de procedimiento Unicorn usando la carga de proteínas y la composición del tampón/parámetros de pH como se enumeran en la tabla 1. Este archivo se ejecutó en un sistema de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, cromatografía de líquidos de proteínas a alta velocidad) GE Healthcare AKTA (GE Healthcare) Explorer. El FPLC era un instrumento a escala de mesa de laboratorio fabricado con tuberías y bombas de plástico que simulaba un procedimiento de purificación para fabricación. El FPLC produjo una fase de "gradiente de pH" al mezclar dos tampones en una proporción cambiante programada usando un sistema de dos bombas (bomba A y bomba B) donde se mantuvo el caudal y se cambió el porcentaje de flujo que suministraba cada una de las bombas. En el programa Unicom se designó un "% de B" con respecto a otro sobre un volumen establecido (número de volúmenes de columna).

En la fase de equilibrado de la columna, la columna se tomó de la solución de almacenamiento como se enumera en la tabla 1 y se preparó para cargar los materiales proteínicos. En la fase de carga de proteínas, se prefiltró el HCCF (líquido recuperado del cultivo celular) usando un filtro de vacío de tamaño de poro de 0,2 micrómetros y se cargó en la columna de proteína A (MABSELECT™, MABSELECT SURE™, POROS® MABCAPTURE™ A, PROSEP® Va, o PROSEP® Ultra Plus). Se cargaron las proteínas a una densidad en el intervalo de 14-37 g/l. La mayoría de los ciclos se realizaron a 21 g/l. En la fase de lavado 1, el tampón de lavado 1 se usó para empujar cualquier carga que quedara en las líneas de AKTA hacia la columna. En la fase de lavado 2, el tampón de lavado 2 retiró impurezas tales como CHOP (proteína de ovario de hámster chino). En la fase de lavado 3, se usó el tampón de lavado 3 para retirar el tampón de lavado 2 y las impurezas asociadas de la columna para preparar la fase de elución. En la fase de elución en gradiente escalonado de pH, se usó un gradiente formado por la manipulación precisa de dos tampones de pH de diferentes pH por un sistema de dos bombas para pasar gradualmente de una mezcla de pH de los dos tampones a otra mezcla, establecida por porcentajes. El parámetro de elución de "35-60 % de B" se correlaciona con un intervalo de gradiente de pH de aproximadamente 4,3-3,7. Más específicamente, un 35 % de B corresponde a un pH del tampón de elución de 4,34, una composición del tampón de acetato 16,25 mM, formiato 8,75 mM, y una conductividad del tampón de 1039 uS/cm. Un 60 % de B corresponde a un pH del tampón de elución de 3,69, una composición del tampón de acetato 10 mM y formiato 15 mM, y una conductividad del tampón de 763 uS/cm. Durante esta fase de elución de la mayoría de los ciclos, se tomaron fracciones a lo largo de la elución y se sometieron a ensayo usando un ensayo de HPLC de exclusión por tamaño para determinar los comportamientos de elución de monómero frente a variante de tamaño (HMWS (especie de peso molecular alto), dímero o fragmento). Estas fracciones también se sometieron a un ensayo de determinación de CHOP para el ciclo seleccionado, y se midió la concentración de proteína en todas las fracciones usando un espectrofotómetro UV NanoDrop (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE). En la fase de regeneración, se usó tampón de regeneración para eliminar mediante lavado las impurezas fuertemente unidas o el producto sobrante para minimizar la contaminación por arrastre entre ciclos. En la fase de almacenamiento, la columna de proteína A se retiró del tampón de regeneración y se almacenó en una solución diseñada para mantener la integridad de la columna a lo largo del tiempo en desuso.

Las duraciones de las fases y los caudales se midieron en CV y centímetros por hora, respectivamente. El caudal se midió en centímetros por hora (se dividió el caudal en cm/h entre la altura del lecho de la columna en cm para llegar a los volúmenes de columna por hora, también una unidad estándar) debido a problemas de presión.

Los cromatogramas se recogieron y analizaron mediante el sistema de purificación por FPLC AKTA (GE Healthcare) y su paquete de programa informático Unicorn asociado. Después de que se realizara el ciclo de purificación de la columna A, se accedió a y se examinaron los trazados de la absorbancia UV, el pH y la conductividad (así como otros valores medidos o instrucciones de programa/libros de registro).

a. Ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Se realizó un ensayo analítico de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en un HPLC Agilent serie 1200 (Agilent Technologies, EE. UU., componente G1329A) y se usó para determinar los niveles relativos de especies de peso molecular alto (HMWS), dímero, monómero y fragmento para las muestras recogidas. Se usó una columna TSK G3000SWXL de 14,24 ml, 7,8 mm de profundidad x 300 mm de altura (Tosoh Bioscience, Tokio, Japón, componente 08541). Cada muestra se diluyó a aproximadamente 0,5 g/l de anticuerpo usando el tampón de migración de HPLC de fosfato de potasio/cloruro de potasio o bien se modificaron inyecciones de la muestra para normalizar la masa cargada en la columna de ensayo. Todas las muestras se prepararon en viales de vidrio Agilent de HPLC de 1,5 ml. Los ciclos fueron de 30 minutos con un caudal de 0,5 ml/min. Se ajustaron las inyecciones de la muestra de modo que se cargaran aproximadamente 25 ng de anticuerpo por muestra. Con cada conjunto de muestras se procesaron blancos que contenían los tampones de fondo respectivos de las muestras. Se analizaron las curvas de absorbancia Uv a 280 nm manualmente usando ChemStation (Agilent Technologies) o bien automáticamente usando el programa informático CHROMELEON® (DIONEX, Sunnyvale, CA) para integrar picos por separado para obtener valores porcentuales de especies para las muestras. Los valores porcentuales obtenidos de este ensayo se pueden multiplicar por la concentración (mg/ml) de la fracción para obtener concentraciones o masas reales para cada especie de variante de tamaño en la muestra (por ejemplo, resultado de la SEC: 4 % de HMWS, 3 % de dímero, 92 % de monómero, 1 % de fragmento; concentración de la muestra: 2 g/l; volumen de la muestra: 10 ml; 1,84 g/l de monómero, 18,4 mg de monómero total en la muestra).

b. Ensayo de determinación de CHOP

Se sometieron muestras de los ciclos seleccionados a un grupo de ensayos que realizó un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) estándar y validado para cuantificar los niveles de CHOP. Se inmovilizaron anticuerpos anti-CHOP de cabra purificados por afinidad en pocillos de una placa de microvaloración. Se incubaron en los pocillos diluciones de las muestras que contenían CHOP, patrones y controles, seguido de la incubación con anticuerpos de cabra anti-CHOP conjugados con peroxidasa de rábano picante. La actividad enzimática de la peroxidasa de rábano picante se detectó con diclorhidrato de o-fenilendiamina. La CHOP se cuantificó leyendo la absorbancia a 492 nm en un lector de placas de microvaloración. Se usó un programa informático de ajuste de curvas para generar la curva de calibración y calcular automáticamente la concentración de la muestra. El intervalo del ensayo para el ELISA fue típicamente de 5 ng/ml a 320 ng/ml. Los resultados se normalizaron a ppm para las comparaciones de combinaciones.

Resultados

La conformación de la elución de un gradiente escalonado se muestra en la figura 1. Todas las proteínas se habían eluido al final de la disminución del pH. Una parte mayor de las proteínas se eluyó de la columna más rápidamente, pero quedaron suficientes proteínas en la columna y se eluyeron durante el gradiente. A un pH menor, se produjo la separación entre el producto deseado (intervalo de elución de alrededor de pH 4,6 a 3,7 con una ligera variación de molécula a molécula) y el agregado indeseable (intervalo de elución de alrededor de pH 3,9 a 3,5).

En las seis moléculas de proteína sometidas a prueba (anticuerpo anti-VEGF n.° 1, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF n.° 2, anticuerpo anti-MUC16, anticuerpo anti-CD4 y anticuerpo anti-Met de un solo brazo), se observaron porcentajes altos (~100 %) de monómero en las fracciones de gradiente iniciales y la parte del extremo de la cola del gradiente contenía niveles mucho mayores de especies agregadas (>50 %). Estos resultados de la SEC se muestran en las figuras 2-4B. Dado que este conjunto de moléculas sometidas a prueba engloba clases más grandes de moléculas de proteínas (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, tiomAb (anticuerpos monoclonales recombinantes que tienen una mutación puntual reemplazando un residuo aminoacídico con cisteína), IgG4 y fragmentos de anticuerpo producidos por E. coli), este procedimiento de gradiente escalonado de pH sugiere una amplia aplicabilidad a todos los polipéptidos/proteínas que contienen regiones C^h2/C^h3 (por ejemplo, región Fc).

Ejemplo 2: Separación de CHOP para anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-VEGF n.° 1 y anticuerpo anti-MUC16 sobre una columna de cromatografía de proteína A usando una elución por etapas estándar y una elución en gradiente escalonado de pH

Usando el procedimiento de proteína de elución en gradiente escalonado de pH como se describe en el ejemplo 1, se midieron los niveles de anticuerpo anti-CD20 por fracción en mg/ml (de la absorbancia UV 280 fuera de línea en instrumento de sobremesa, que se monitorizó con las lecturas en línea con AKTA/Unicom a UV 280 para la fase de elución en gradiente escalonado como se observa en el cromatograma del anticuerpo anti-VEGF n.° 1 en la figura 1A) y los niveles de CHOP por fracción en ppm. Como se observa en el panel izquierdo de la figura 5 (elución del anticuerpo anti-CD20 y CHOP), las fracciones posteriores a pH menor de la elución en gradiente escalonado de pH contenían muy poco anticuerpo anti-CD20 en comparación con la cantidad de CHOP.

Los datos del ciclo de control realizado al mismo tiempo que la elución en gradiente escalonado de pH del anticuerpo anti-CD20 se muestran en la fila superior de la tabla en la figura 5. El ciclo de control estaba usando las mismas condiciones que se describen en la tabla 1, excepto que no se usó un gradiente escalonado de pH durante la fase de elución de la proteína, y la proteína se eluyó a pH 3,6 o menos. La fila inferior muestra una disminución pequeña, pero aceptable, del rendimiento del anticuerpo anti-CD20 usando el gradiente escalonado de pH. (nota: se prevé esta pérdida de rendimiento debido a la eliminación de agregados; el rendimiento se calcula usando el valor cuantitativo de HCCF que incluye los agregados en la cantidad total de producto cargado en la columna). Se observó aproximadamente un 5 % menos de agregados y la mitad de los niveles de CHOP en comparación con la combinación de control. Los resultados establecen un beneficio inesperado de una pureza incrementada usando la elución en gradiente escalonado de pH.

También se realizaron separaciones de CHOP tanto para el anticuerpo anti-VEGF n.° 1 como para el anticuerpo anti-MUC16 usando el procedimiento de gradiente escalonado de pH descrito en el ejemplo 1. Similar al patrón observado en el gráfico de CHOP para el anticuerpo anti-CD20, se eluyó más CHOP al final del gradiente de pH en proporción a la elución del anticuerpo anti-VEGF, lo que indica que la elución en gradiente escalonado de pH separó las impurezas de la célula huésped para esta molécula de proteína, así como el anticuerpo anti-CD20. Véase la figura 6. Para la separación de CHOP en el anticuerpo anti-MUC16, este anticuerpo tenía niveles de CHOP mucho mayores en comparación con el patrón de elución observado en el anticuerpo anti-VEGF n.° 1. Véase la figura 7. En consecuencia, se puede fraccionar una cantidad significativa de CHOP a partir del anticuerpo anti-MUC16 usando el procedimiento de gradiente escalonado de pH como se describe anteriormente.

Ejemplo 3: Depuración de partículas víricas usando cromatografía con proteína A con elución en gradiente de pH

Usando el procedimiento de cromatografía con proteína A con elución en gradiente escalonado de pH como se describe en el ejemplo 1, se midió la depuración de partículas víricas del anticuerpo anti-VEGF n.° 1.

Cromatografía con proteína A con elución en gradiente escalonado de pH

Todas las fases y tampones fueron los mismos que los usados en el ejemplo 1. Las fracciones se sometieron a prueba para determinar el recuento de partículas de tipo retrovirus usando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

a. Ensayo de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de partículas de tipo retrovirus (RVLP QPCR) El ensayo de partículas víricas endógenas RVLP es un ensayo de PCR cuantitativa ultrarrápida. Se extrajo ARN vírico de las muestras usando Qiagen EZ1 (Qiagen, Valencia, CA). Los tamaños de muestra fueron 0,4 ml (HCCF sin diluir y diluido 1:10, combinación de proteína A sin diluir). La eficacia de extracción se confirmó incluyendo una muestra del patrón de referencia de HCCF con un valor cuantitativo de partículas de retrovirus de CHO conocido. Se eliminó el ADN genómico mediante digestiones con DNasa tratando el eluido de la extracción con 0,2 unidades/ml de DNasa I a una temperatura elevada durante 30 minutos.

Se inactivo a continuación la DNasa por calor a 70 °C durante 15 min. La ausencia de ADN retrovírico se confirmó analizando las muestras sin retrotranscriptasa.

Los ensayos de PCR cuantitativa ultrarrápida para medir los genomas de retrovirus de CHO se realizaron como se describe en De Wit et al. (Biologicals, 28(3):137-48 (2000)), pero con el uso de una nueva sonda en la región cercana. Los reactivos y los procedimientos también se actualizaron y mejoraron. Se diseñaron cebadores y secuencias de sondas para amplificar un fragmento en la región pol altamente conservada del genoma de retrovirus de CHO de tipo C. Cada partícula de tipo retrovirus contiene dos moléculas de ARN genómico. Se realizaron pedidos de sondas oligonucleotídicas y cebadores a Applied Biosystems (Foster City, CA) e Invitrogen (Carlsbad, CA). La depuración vírica se expresó como un valor de reducción de log 10, o LRV, que es la diferencia de log 10 (virus total) en la carga de proteína (HCCF) y en la combinación de producto. El virus total se obtuvo de valores cuantitativos de virus (partículas/ml o nU/ml) en muestras y volumen de muestra (ml). La figura 18 muestra el recuento de partículas similivíricas endógenas para cada fracción tomada de la elución en gradiente escalonado de pH. Algunos virus eluyeron al comienzo del gradiente en el pico grande, pero una parte mayor del virus eluyó al final de la cola de la elución. En consecuencia, la separación de estas RVLP del producto puede beneficiar la eficacia general de la cromatografía con proteína A con elución en gradiente completo o gradiente escalonado de pH en términos de depuración vírica. La figura 19 muestra la LRV para cada fracción en comparación con la carga de HCCF. El gráfico se basó en un cálculo que usó los valores de la figura 18. Se observó una gran disminución en la LRV en las fracciones posteriores de elución ricas en agregados. La LRV fue alta (efecto deseable) en las fracciones de monómero de polipéptido más altas de elución en el medio. Ejemplo 4: Depuración de variantes de polipéptido básicas usando cromatografía con proteína A con elución en gradiente de pH

Usando el procedimiento de cromatografía con proteína A con elución en gradiente escalonado de pH como se describe en el ejemplo 1, se midió la depuración de variantes de polipéptido básicas (o variantes básicas) del anticuerpo anti-VEGF n.° 1.

Cromatografía con proteína A con elución en gradiente escalonado de pH

Todas las fases y tampones fueron los mismos que los usados en el ejemplo 1. Las fracciones se sometieron al ensayo de variantes de intercambio iónico.

a. Ensayo de variantes de intercambio iónico

Se desarrolló un ensayo analítico de cromatografía de intercambio iónico (IEC) en un HPLC Agilent serie 1200 (Agilent Technologies, EE. UU., componente G1329A) y se usó para determinar los niveles relativos del pico principal con respecto a variantes con carga ácida y básica para muestras recogidas del anticuerpo anti-VEGF n.° 1. Se usó una columna Dionex ProPac WCX-10, 4,6 x 250 mm (producto Dionex n.° 054993) con un gradiente de ACES [ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico] y NaCl en condiciones de temperatura elevada. La preparación de la muestra incluyó muestras de intercambio de tampón en fase móvil de IEC antes de una digestión calentada de 20 minutos con carboxipeptidasa (CpB). Se inyectaron aproximadamente 50 ug de anticuerpo anti-VEGF n.° 1 en la columna por muestra. Se obtuvieron trazados de ^uV a 280 nm y se integraron usando el programa informático ChemStation (Agilent Technologies). Se analizaron los porcentajes de integración para cada categoría de especies ácidas, básicas y principales para determinar las tendencias de composición de las variantes de intercambio iónico en todo el gradiente. La figura 17 muestra el resultado de la integración de picos del ensayo de variantes de intercambio iónico en 20 fracciones de elución en gradiente de pH de proteína A. El porcentaje de variantes básicas presentes en las fracciones se incrementa drásticamente en la parte de la cola de la elución con gradiente escalonado de pH de proteína A. Esta parte de la cola del gradiente de elución es la misma parte donde se observó la CHOP incrementada y la separación de agregados, como se describe en los ejemplos 1 y 2.

Ejemplo 5: Elución en gradiente escalonado de pH usando múltiples columnas de cromatografía de proteína A

Se sometieron a prueba tanto las resinas MABSELECT SURE™ como las resinas MABSELECT™ para el procedimiento de elución en gradiente escalonado de pH como se describe anteriormente. Estas dos resinas de proteína A, aunque tienen un nombre similar, tienen ligandos de afinidad diferentes unidos. La MABSELECT™ lleva el ligando natural de la proteína A, que se une a las partes Fc de los anticuerpos. La MABSELECT SURE™ lleva una forma modificada de proteína A que se ha alterado químicamente para que sea estable en soluciones de pH alto durante períodos cortos de tiempo. Los perfiles de elución de AKTA superpuestos muestran que los trazados de elución son extremadamente similares para las dos resinas de proteína A. Como se puede observar en el perfil de integración de la SEC para MabSelect en la figura 8, se logró una separación de agregados equivalente usando esta resina. Otras resinas sometidas a prueba con éxito para la separación de agregados fueron PROSEP® Va, PROSEP® Ultra Plus, y POROS® M^a B^cAPTURE™ A. En consecuencia, se pueden usar diversas resinas de afinidad (por ejemplo, MABSELECT™, MABSELECT SUERE™, PROSEP® Va, PROSEP® Ultra Plus y POROS® MABCAPTURE™) en el procedimiento de elución en gradiente escalonado de pH para fraccionar impurezas.

Ejemplo 6: Diseño de experimentos (DOE) usando diversos parámetros para el procedimiento de elución en gradiente de pH

Se exploraron diversos parámetros que son importantes en la mayoría de los procedimientos de cromatografía para el anticuerpo anti-VEGF n.° 1 usando un estudio diseñado estadísticamente de 35 ciclos dentro de los intervalos mostrados en la tabla 2. El parámetro "% de B al comienzo de la elución" afecta al pH inicial de la fase de elución (que desempeña un papel importante en la determinación de la conformación de la curva de elución. Cuanto mayor sea el % de B inicial, menor será el pH de la elución inicial, mayor cantidad de proteína eluida de la columna en las primeras fracciones), así como la pendiente del gradiente general. Se variaron parámetros simultáneamente en un estudio factorial fraccionario diseñado para dilucidar los efectos principales, así como las interacciones. Todos los ciclos se fraccionaron durante la elución, y el agregado y la concentración se sometieron a ensayo para todas las fracciones. Se usó un cálculo interpolativo para determinar los niveles de monómero de la combinación simulada para combinaciones que darían como resultado exactamente un rendimiento del 85 % (el límite inferior del objetivo de rendimiento escalonado) y estos valores se usaron para comparar la eficacia de cada conjunto de parámetros del ciclo en la separación eficaz del monómero del agregado.

Tabla 2 Intervalos de los parámetros del DOE

* Todas las eluciones terminaron en un 60 % de B (pH 3,7)

Procedimientos experimentales

Todos los cambios de parámetros, aparte de la altura del lecho de la columna (que requiere el relleno de múltiples columnas) se examinaron usando el programa informático Unicon. Se tomaron fracciones de CV en todas las eluciones, se sometieron a ensayo usando la HPLC SEC (como se describe anteriormente) y se midió la concentración de proteína (absorbancia UV 280 medida en un espectrofotómetro UV NanoDrop). Para normalizar mejor los resultados para la comparación, se compilaron datos de diversos conjuntos de fracciones y se usó un cálculo para interpolar el rendimiento general y el perfil mediante SEC de una combinación de cada uno de los ciclos.

El paquete de programa informático JMP® (SAS, Cary, NC) se empleó para generar un plan de ciclos de exploración de parámetros factoriales fraccionarios. Se seleccionó uno de los ciclos como el "ciclo de fabricación ejemplar" del conjunto debido a su alto rendimiento, alto nivel de monómero y bajo tamaño de combinación (figura 11).

Resultados

El diagrama de Pareto de los resultados del DOE muestra que el "% de B al comienzo" es el parámetro más influyente para determinar la separación de agregados, seguido de la densidad de carga (menor es mejor) y el tiempo de residencia (el tiempo de residencia se calculó dividiendo los parámetros controlados de la altura del lecho (cm/CV) entre el caudal (cm/h) para h/CV. En consecuencia, cuanto menor es el % de B al comienzo, mayor es el pH al comienzo de la elución y más eficaz es la separación de agregados; cuanto menor es la densidad de carga, más eficaz es la separación de agregados; y cuanto mayor es el tiempo de residencia, más eficaz es la separación de agregados. Véase la figura 9. Además, los perfiles de interacción de este estudio muestran que había una interacción entre los parámetros de densidad de carga y % de B al comienzo, así como una interacción entre el tiempo de residencia y la densidad de carga. A densidades de carga incrementadas, el % de B al comienzo tenía un mayor efecto sobre los niveles de monómero de las combinaciones simuladas de rendimiento del 85 % que si el ciclo se realizaba a densidades de carga menores. Además, a una densidad de carga incrementada, el tiempo de residencia desempeñaba un papel mucho más importante en la capacidad del gradiente para fraccionar agregados más eficazmente. Se debe usar una velocidad menor durante la elución para lograr un alto rendimiento del producto con el procedimiento de gradiente escalonado de pH. Véase la figura 10. La figura 11 muestra que la combinación de este ciclo estaba por debajo de 10 CV (por ejemplo, 5,4 CV o 6 CV) al tiempo que proporcionaba menos de un 1 % de agregados con un rendimiento mayor de un 85 %. Además de los efectos principales (diagrama de Pareto en la figura 9), interacciones (figura 10) y ciclo de fabricación ejemplar (figura 11), se observó que el período total de elución no tuvo ningún efecto en la separación de los agregados, pero se podía manipular para disminuir el tamaño de la combinación para dar como resultado una combinación que todavía tiene una alta pureza y un alto rendimiento, pero en un volumen menor (que es preferente para la escala de fabricación). Además, el uso del gradiente escalonado de pH dio como resultado volúmenes de combinación menores con una pureza casi equivalente a la dada por el gradiente completo (véase el ejemplo 8). También se descubrió que el gradiente escalonado de pH es robusto en varios cambios del procedimiento, incluyendo cambios más pequeños en la densidad de carga y el caudal, además de no verse afectado en absoluto por la altura del lecho.

Ejemplo 7: Purificación de proteínas usando cromatografía de membrana de intercambio iónico después de la cromatografía con proteína A con gradiente escalonado de pH

Para determinar si las cromatografías en columna posteriores se podían eliminar del procedimiento de purificación o se podían sustituir con membranas, se cargaron ciclos a escala de mesa de laboratorio del gradiente escalonado de pH de proteína A en el anticuerpo anti-VEGF n.° 1 (con una combinación de menos de un 1 % de agregados y un alto rendimiento) en membranas cargadas posteriormente. Las membranas MUSTANG® S (Corporación Pall) y MUSTANG® Q (Corporación Pall) representan una membrana de intercambio catiónico y una membrana de intercambio aniónico, respectivamente. El éxito se midió por la capacidad de las membranas de lograr las mismas purezas y rendimientos generales en comparación con el procedimiento típico de la columna posterior.

Procedimientos experimentales

Los parámetros usados para determinar el acondicionamiento óptimo de la carga para CHOP y la depuración de agregados sobre las membranas S y/o Q se tomaron de estudios previos sobre acondicionamiento óptimo de la carga para la depuración de CHOP sobre membranas S y/o Q usando una combinación de elución por etapas estándar de proteína A en las tablas 3A y 3B. En estos estudios previos, se mostraron resultados prometedores cuando se usó una combinación de elución por etapas estándar de proteína A (grupo de control, sin gradiente de pH y eluyendo la proteína a pH 3,6 o menos); sin embargo, este procedimiento tuvo niveles de CHOP ligeramente mayores de lo deseado y no depuró ningún agregado del procedimiento. En estos estudios previos, las membranas se habían cargado a 5 kg/l de membrana y se habían encontrado condiciones de carga óptimas para la eliminación de impurezas. Estas mismas condiciones se usaron para la combinación de elución en gradiente escalonado de proteína A para comparar el rendimiento de las diferentes combinaciones de proteína A en estas membranas con las impurezas principales seleccionadas como CHOP y agregados.

Tabla 3A: Parámetros previos para la determinación del acondicionamiento óptimo de la carga para la depuración de CHOP sobre membranas S o Q

Tabla 3B: Parámetros previos para determinar si la depuración ortogonal de impurezas se puede lograr procesando membranas S y Q en serie.

En los estudios iniciales, se acondicionaron combinaciones de elución por etapas estándar de proteína A a pH y conductividades específicos y pasaron a través de unidades de membrana de intercambio catiónico (MUSTANG® S) y aniónico (MUSTANG® Q) a escala de laboratorio que estaban conectadas al sistema de purificación AKTA™ FPLC. Se mantuvieron los caudales y se examinaron los trazados de presión para detectar pruebas de deterioro por colmatación/permeabilidad. Se tomaron fracciones a diversas densidades de carga y se sometieron a ensayo las concentraciones de CHOP (ELISA) y de anticuerpos (absorbancia UV 280 en el espectrofotómetro UV NanoDrop). Los resultados de estos ensayos se compararon a diversas densidades de carga para encontrar las condiciones de carga óptimas para la depuración final de CHOP. En los estudios posteriores, la combinación de elución en gradiente escalonado de pH de proteína A se acondicionó a los niveles óptimos encontrados en los estudios iniciales. A partir de esto, el comportamiento de la combinación de elución en gradiente escalonado se comparó con el de la elución por etapas de proteína A estándar en la capacidad de las membranas posteriores para depurar CHOP y otras impurezas mientras se mantiene un alto rendimiento y bajos niveles de agregados. También se usaron dos tamaños de membrana de intercambio catiónico y tres tamaños de membrana de intercambio aniónico para someter a prueba la reproducibilidad y la escalabilidad de los resultados.

Resultados

Cuando se usó la combinación de elución por etapas de proteína A como carga para una serie de purificación por membrana de intercambio catiónico a aniónico, los menores niveles de CHOP obtenidos fueron 15-20 ppm para membranas cargadas a 5 kg/l de membrana. Dado que las membranas no depuraron los agregados, los niveles de esta impureza eran inaceptablemente altos en las combinaciones finales. Por el contrario, cuando la combinación de elución en gradiente escalonado de pH de proteína A se cargó en estas mismas membranas, los niveles de CHOP fueron de 0 a 15 ppm y los niveles de agregados todavía fueron bajos en las combinaciones finales, lo que muestra un beneficio para el procedimiento general.

Además, las combinaciones finales de cada una de las tres combinaciones de membranas de intercambio iónico sometidas a prueba dieron como resultado combinaciones finales de alto rendimiento y alta pureza. En todos los casos, los niveles de agregados se mantuvieron bajos a través del ajuste del pH y el procesamiento de la membrana, y los niveles de CHOP también fueron menores de lo que se observó en los estudios de control previos, mostrando un beneficio inesperado de reducción de CHOP al usar una combinación de proteína A con menos agregados como aporte. Véase la figura 12. En consecuencia, el uso de membranas de cromatografía de intercambio iónico en lugar de las columnas de cromatografía de intercambio iónico habituales elimina la necesidad de muchos tampones de cromatografía en columna típicos y otros inconvenientes que consumen tiempo/espacio de fabricación. Más importante aún, dado que estas membranas cargadas se usaron en modo de sobrecarga (es decir, la carga se pasa a través de la membrana a una alta densidad de carga sin las etapas de lavado o elución necesarias para generar una combinación altamente purificada), las membranas permiten un procedimiento de purificación continuo posterior de la etapa de cromatografía con proteína A con gradiente de pH.

También se demuestra que los perfiles de integración de la SEC entre la escala piloto (4,1 l) y la escala de mesa de laboratorio de 28 ml son extremadamente similares, lo que indica que el gradiente escalonado de pH de la proteína A se puede aumentar con éxito y que cualquier resultado a pequeña escala se puede considerar indicativo de rendimiento a mayor escala. Véase la figura 13. Estos resultados indican un beneficio inesperado de la reproducibilidad y escalabilidad de la cromatografía con proteína A con elución en gradiente escalonado de pH.

Ejemplo 8: Ciclos de filtro de parvovirus VIRESOLVE® Pro

A. Comparación de disminución de la permeabilidad de VIRESOLVE® Pro

El gradiente escalonado de pH de la proteína A se comparó con la elución por etapas estándar de la proteína A (grupo de control, sin gradiente de pH y eluyendo la proteína a pH 3,6 o menos) en términos de facilitar un mayor rendimiento de la masa sobre un filtro de parvovirus (VIRESOLVE® Pro, Millipore, Inc.). Se usó un aporte de HCCF común para desarrollar tanto el gradiente escalonado de pH de la proteína A como el control por etapas estándar de la proteína A sobre la QSFF (Q Sepharose Fast Flow (columna de intercambio aniónico; GE Healthcare) en un modo de flujo continuo estándar antes de procesar el filtro de parvovirus VIRESOLVE® Pro. Se sometieron a prueba varias condiciones de procesamiento de VIRESOLVE® Pro: 1) combinación de elución por etapas estándar de proteína A con el prefiltro estéril SHC en línea, 2) elución por etapas estándar de proteína A con un adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX) como prefiltro en línea, 3) la combinación con gradiente escalonado de pH de la proteína A con el prefiltro SHC (un filtro de grado estéril sin carga de 0,2 micrómetros) y 4) la combinación con gradiente escalonado de pH de la proteína A con un adsorbente de membrana de CEX como prefiltro en línea. Algunas combinaciones se procesaron con repetición. El VIRESOLVE® Pro se procesó en una configuración de filtración que utiliza un conjunto de bombas peristálticas, balanzas y sensores de presión para suministrar datos en una hoja de cálculo.

La combinación con gradiente escalonado de pH con el filtro estéril SHC en línea se comportó de forma similar a la combinación de elución por etapas con la membrana de intercambio catiónico, mostrando ambas un incremento de alrededor de seis veces en el posible rendimiento de la masa con respecto al VIRESOLVE® Pro. Véase la figura 14. En consecuencia, este resultado indica el beneficio inesperado del gradiente escalonado de pH de la proteína A para eliminar contaminantes de colmatación del filtro VIRESOLVE® Pro sin la ayuda de un prefiltro de membrana de CEX. Además, el comportamiento de VIRESOLVE® Pro se benefició de la combinación del adsorbente de membrana de CEX con la combinación con gradiente escalonado de pH de la proteína A, lo que dio lugar a una mejora inesperada aproximada de 18 veces en el rendimiento potencial de la masa en comparación con el desarrollo de la combinación de elución por etapas estándar de la proteína A con el SHC en el VIRESOLVE® Pro.

B. Experimentos con VIRESOLVE® Pro de CHOP y SEC

Se tomaron muestras en diferentes puntos durante las secuencias de desarrollo de VIRESOLVE® Pro y se sometieron a ensayo para CHOP y SEC. La secuencia con elución por etapas estándar de proteína A con el SHC en línea tenía niveles de CHOP bastante bajos, pero todavía contenía agregados. Los niveles de agregados permanecieron bajos en los experimentos con gradiente escalonado de pH de proteína A a través de diferentes etapas del procedimiento y dieron como resultado una combinación final con menos de un 1 % de agregados. Este resultado fue una mejora significativa con respecto a la combinación proporcionada por la combinación de elución por etapas estándar. Además, los niveles de CHOP para las combinaciones con SHC- Viresolve® Pro con gradiente escalonado de pH eran equivalentes a los niveles en el ciclo previo de elución por etapas estándar con la membrana de intercambio catiónico. Los niveles fueron ligeramente menores que los de la elución por etapas estándar con el SHC. Véanse las tablas 4A y 4B. Estos resultados muestran que el procedimiento de gradiente escalonado de pH no solo produjo un mayor rendimiento de la masa en comparación con la combinación de elución por etapas estándar, sino que también produjo una pureza equivalente o mejor.

Tabla 4A

Tabla 4B

Ejemplo 9: Elución en gradiente de pH completo de proteína A en proteína A

También se sometió a prueba la elución con gradiente completo de pH de proteína A. Todas las fases y tampones fueron los mismos que los usados en el procedimiento de gradiente escalonado de pH como se describe en el ejemplo 1, excepto que el 35-60 % de B como se usa en el gradiente escalonado de pH se redujo a un 25-60 % al comienzo del gradiente, lo que dio como resultado un mayor gradiente inicial de pH (comenzando en aproximadamente pH 4,6 y terminando en aproximadamente pH 3,7). Un 25 % de B corresponde a un pH del tampón de elución de 4,58, una composición del tampón de acetato 18,75 mM y formiato 6,25 mM, y una conductividad del tampón de 1141 uS/cm. Un 60 % de B corresponde a un pH del tampón de elución de 3,69, una composición del tampón de acetato 10 mM y formiato 15 mM, y una conductividad del tampón de 763 uS/cm. Véase la tabla 5.

Tabla 5

La conformación de la elución en un gradiente completo se muestra en la figura 15. Todos los productos se habían eluido al final de la disminución del pH. El cromatograma para el gradiente de pH completo es el mismo en todas las fases que el gradiente escalonado de pH, excepto que la elución del anticuerpo comienza a un pH mayor. La falta del pico alto inicial de UV 280 al comienzo del gradiente dio como resultado fracciones de concentración menor al comienzo del gradiente, con más proteína distribuida a través del resto de la fase de elución. Esto permitió una mayor separación de especies que eluyen preferentemente a pH mayores que el monómero. Por tanto, esta técnica puede ser igualmente eficaz para depurar impurezas que se separan del producto deseado a pH menores (es decir, los agregados y las CHOP separados usando el gradiente escalonado), con la única desventaja del volumen final de la combinación en comparación con el gradiente escalonado de pH (las concentraciones menores de las fracciones al comienzo del gradiente se traducen en la necesidad de combinar más fracciones para lograr una combinación simulada de un rendimiento deseado). Los trazados e integraciones de SEC para este gradiente completo también demuestran la separación del agregado del monómero a los pH menores, lo que sugiere que los beneficios y la aplicabilidad del gradiente escalonado de pH también se pueden ampliar a un gradiente completo.

Ejemplo 10: Formación de agregados en el estudio de la proteína A

Para garantizar que no se formara un agregado durante el pH bajo o el final de la cola de la elución en gradiente escalonado de pH y que la técnica del gradiente escalonado de pH de la proteína A separaba eficazmente un monómero de un agregado, en lugar de provocar la formación de un agregado, se usaron materiales purificados para mostrar que los niveles de agregados del aporte no se incrementaron mediante el procesamiento sobre la proteína A, con o sin componentes de HCCF. Véase la tabla 6.

Tabla 6

* Ensayo de determinación de monómero por SEC no usado en HCCF

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende una región Ch2/Ch3, que comprende las etapas de:

(a) unir el polipéptido a la proteína A; y

(b) eluir el polipéptido con un gradiente de pH que comienza en 5,0 o menos usando un tampón de elución, en el que el tampón de elución contiene un tampón de pH alto y un tampón de pH bajo y en el que el gradiente de pH se forma ajustando un porcentaje de cada tampón de pH en el tampón de elución,

en el que el tampón de pH alto está en pH 5,0 y el tampón de pH bajo está en pH 2,7, en el que el gradiente de pH termina en 3,7, y en el que un agregado, una impureza de la célula huésped, un contaminante de colmatación de los filtros de virus, una partícula vírica y una partícula similivírica se eliminan del polipéptido deseado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el porcentaje de tampón de pH bajo comienza en un 35 %.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo al 35 % comprende acetato 16,25 mM y formiato 8,75 mM.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el porcentaje de tampón de pH bajo comienza en un 25 %.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo al 25 % comprende acetato 18,75 mM y formiato 6,25 mM.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el porcentaje de tampón de pH bajo comienza en un 40 %.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el tampón de elución que contiene el tampón de pH bajo al 40 % comprende acetato 15 mM y formiato 10 mM.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gradiente de pH comienza en pH 4,6.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la impureza de la célula huésped es la proteína de ovario de hámster chino (CHOP).

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que una variante de polipéptido básica se separa del polipéptido.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el polipéptido es un anticuerpo.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el polipéptido es una inmunoadhesina.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polipéptido tiene una pureza de al menos aproximadamente un 98 % de monómero.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que una proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos un 20 % menor que la proporción en un polipéptido purificado mediante un procedimiento de elución por etapas, en el que el procedimiento de elución por etapas comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un pH que comienza en 3,6 o menos.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que una proporción de una impureza de la célula huésped con respecto al polipéptido purificado es al menos un 60 % menor que la proporción en un polipéptido purificado mediante un procedimiento de elución por etapas, en el que el procedimiento de elución por etapas comprende unir el polipéptido a la proteína A y eluir con un pH que comienza en 3,6 o menos.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en el que el polipéptido purificado es un monómero de polipéptido.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la purificación es un procedimiento a escala de fabricación.