ES2807591T3

ES2807591T3 - Receptores de antígeno quimérico dirigidos a antígeno de maduración de células B

Info

Publication number: ES2807591T3
Application number: ES16714020T
Authority: ES
Inventors: Tracy Chia-Chien Kuo; Riggers Javier Fernando Chaparro; Barbra Johnson Sasu; Roman Galetto; Bijan Andre Boldajipour; Cesar Adolfo Sommer; Blarcom Thomas John Van; Thomas Charles Pertel; Arvind Rajpal; Philippe Duchateau; Alexandre Juillerat; Julien Valton
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2036-03-30
Also published as: KR102349475B1; AU2023219928A1; AU2020256365A1; CO2017010502A2; EP3283520B1; IL254276B2; JP6921001B2; US11912776B2; WO2016166630A1; SG10201912666PA; KR20170135931A; US20190241669A1; ZA201706384B; JP7301915B2; MX2020012573A; PE20171653A1; CN107980046B; RU2017133952A; HK1254248A1; KR102208443B1

Abstract

Un receptor de antígeno quimérico específico de antígeno de maduración de células B (BCMA) (CAR) que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un fragmento Fv de cadena única (scFv) que comprende: (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región de determinación complementaria de VH 1 (VH CDR1), una región de determinación complementaria de VH 2 (VH CDR2) y una región de determinación complementaria de VH 3 (VH CDR3), en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 o 154; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y una región variable de cadena liviana (VL) que comprende una región determinante complementaria VL 1 (VL CDR1), una región determinante complementaria VL 2 (VL CDR2), y una región determinante complementaria VL 3 (VL CDR3), en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y la VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; (b) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 o 188; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 249; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225; (c) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 o 166; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227; (d) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151,156, o 157; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 o 162; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la 30 secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 251; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 252; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 253; (e) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151,156, o 157; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190 o 191; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 262; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 252; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 263; (f) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 o 169; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 272; (g) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, 130 o 131; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 o 140; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; o (h) una región VH que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151,156, o 157; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158 o 159; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y una región VL que comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quimérico dirigidos a antígeno de maduración de células B

Campo

La invención se refiere a receptores de antígeno quimérico (CAR). Los CAR pueden redirigir la especificidad y la reactividad de las células inmunes hacia una diana seleccionada explotando las propiedades del dominio de unión al ligando. La invención se refiere a CAR que se unen específicamente al antígeno de maduración de células B (CAR específicos de BCMA). La invención se refiere además a polinucleótidos que codifican CAR específico de BCMA y células aisladas que expresan CAR específicos de BCMA en su superficie. La invención se refiere además a métodos in vitro para diseñar células inmunes que expresan CAR específicos de BCMA en su superficie. La invención es particularmente útil para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia. La invención se refiere además a células inmunes que comprenden los CAR específicos de BCMA (células CAR-T específicas de BCMA), composiciones que comprenden las células CAR-T específicas de BCMA y las células CAR-T específicas de BCMA para su uso en el tratamiento de afecciones asociadas con células malignas que expresan BCMA (por ejemplo, cáncer).

Antecedentes

El mieloma múltiple es una neoplasia maligna caracterizada por una acumulación de células plasmáticas clonales (véase, por ejemplo, Lonial et al., Clinical Cancer Res., 77(6): 1264-1277 (2011)). Las terapias actuales para MM a menudo causan remisiones, pero casi todos los pacientes eventualmente recaen y mueren (véase, por ejemplo, Rajkumar, Nature Rev. Clinical Oncol, 5(8): 479-491 (2011)).

La transferencia adoptiva de células T genéticamente modificadas para reconocer antígenos asociados a malignidad es prometedora como una nueva metodología para tratar el cáncer (véase, por ejemplo, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Las células T pueden modificarse genéticamente para expresar receptores de antígeno quimérico (CAR), que son proteínas de fusión que comprenden una unidad estructural de reconocimiento de antígeno y dominios de activación de células T (véase, por ejemplo, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), y Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)).

El antígeno de maduración de células B (BCMA, CD269 o TNFRSF17) es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR). BCMA se identificó en un linfoma maligno de células T humanas que contiene una translocación t(4; 16). El gen se expresa selectivamente en el linaje de células B con la mayor expresión en plasmablastos y células plasmáticas, células secretoras de anticuerpos. BCMA une dos ligandos, el factor de activación de células B (BAFF) (también llamado estimulador de linfocitos B (BLyS) y ligando expresado de leucocitos relacionado con APOL (TALL-1)) y un ligando inductor de proliferación (APRIL) con afinidad de 1 uM y 16 nM, respectivamente. La unión de APRIL o BAFF a BCMA promueve una cascada de señalización que involucra NF-kappa B, Elk-1, c-Jun quinasa N-terminal y la proteína quinasa activada por mitógeno p38, que produce señales para la supervivencia y proliferación celular. El BCMA también se expresa en las células B malignas y en varios tipos de cáncer que involucran linfocitos B, incluidos el mieloma múltiple, el plasmacitoma, el linfoma de Hodgkin y la leucemia linfocítica crónica. En las enfermedades autoinmunes en las que intervienen plasmablastos, como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide, las células productoras de anticuerpos que expresan BCMA secretan autoanticuerpos que se atacan a sí mismos.

En el caso del mieloma múltiple, cada año se diagnostican aproximadamente 24.000 casos nuevos en los Estados Unidos, y este número representa aproximadamente el 15 % de los cánceres hematológicos recién diagnosticados en los Estados Unidos. Un promedio de 11.000 muertes resultan del mieloma múltiple cada año, y la tasa promedio de supervivencia a 5 años es de aproximadamente 44 %, con una supervivencia media de 50-55 meses. El tratamiento actual para el mieloma múltiple se centra en la apoptosis de las células plasmáticas y/o en la disminución de la actividad de los osteoclastos (por ejemplo, quimioterapia, talidomida, lenalidomida, bisfosfonatos y/o inhibidores del proteasoma, como bortezomib (VELCADE®) o carfilzomib). Sin embargo, el mieloma múltiple sigue siendo una enfermedad incurable, y casi todos los pacientes han desarrollado resistencia a estos agentes y finalmente recaen. En consecuencia, un tratamiento alternativo para el mieloma múltiple, como el uso de un antagonista anti-BCMA que incluye CAR específicos de BCMA y células CAR-T específicas de BCMA, sería un agente terapéutico superior.

El documento WO 2013/154760 informa una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica un CAR dirigido contra BCMA, así como células huésped y métodos para destruir células de mieloma múltiple.

Resumen

Se proporcionan receptores de antígeno quimérico (CAR) que se unen a BCMA. Está demostrado que ciertos CAR específicos de BCMA son efectivos cuando se expresan en células T para activar las células T al entrar en contacto con BCMA. Ventajosamente, los CAR específicos de BCMA proporcionados en el presente documento se unen a BCMA de mono humano y cynomolgous. También ventajosamente, las células CAR-T específicas de BCMA proporcionadas en el presente documento exhiben actividad de desgranulación, aumento de la producción de interferón gamma y/o actividad citotóxica al entrar en contacto con células que expresan BCMA.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un CAR específico de BCMA según la reivindicación 1.

En el presente documento se describe un CAR específico de BCMA que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio del dominio de unión a ligando extracelular comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia SYX1MX2, en donde X1 es A o P; y X2 es T, N o S (SEQ ID NO: 301), GFTFX1SY, en donde X1 es G o S (SEQ ID NO: 302), o GFTFX1SYX2MX3, en donde X1 es G o S, X2 es A o P; y X3 es T, N o S (SEQ ID NO: 303); (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG, en donde X1 es I, V, T, H, L, A o C; X2 es S, D, G, T, I, L, F, M o V; X3 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X4 es S, Q, T, A, F o W; X5 es G o T, X6 es N, S, P, Y, W o F; X7 es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C; X8 es F, Y, P, W, H o G; X9 es V, R o L; y X10 es G o T (SEQ ID NO: 305), o X1X2X3X4X5X6, en donde X1 es S, V, I, D, G, T, L, F o M; X2 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X3 es S, G, F o W; X4 es G o S; X5 es G o T; y X6 es N, S, P, Y o W (SEQ ID NO: 306); y iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia VSPIX1X2X3X4, en donde X1 es A o Y; X2 es A o S; y X3 es G, Q, L, P o E (SEQ ID NO: 307), o YWPMX1X2, en donde X1 es D, S, T o A; y X2 es I, S, L, P o D (SEQ ID NO: 308); y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12, en donde X1 es R, G, W, A o C; X2 es A, P, G, L, C o S; X3 es S, G o R; X4 es Q, C, E, V o I; X5 es S, L, P, G, A, R o D; X6 es V, G o I; X7 es S, E, D o P; X8 es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y; X9 es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H o R; X10 es Y o F; X11 es L, W o P; y X12 es A, S o G (SEQ ID NO: 309); (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia X1ASX2RAX3, en donde X1 es G o D; X2 es S o I; y X3 es T o P (SEQ ID NO: 310); y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia QQYX1X2X3PX4T, en donde X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R o Y; X2 es S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K o C; X3 es W, F o S; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 311), o QQYX1X2X3PX4, en donde X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K o Y; X2 es S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F o Y; X3 es W, S o F; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 312).

En el presente documento se describe un CAR específico de BCMA que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende una variable de cadena pesada (VH) región que comprende tres CDR de la región VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33, 72, 39, 76, 83, 92, 25 u 8; y una región variable de cadena liviana (VL) que comprende tres CDR de la región VL mostrada en SEQ ID NO: 34, 73, 40, 77, 84, 93, 18 u 80. En algunos ejemplos, la región VH puede comprender la secuencia se muestra en SEQ ID NO: 33, 72, 39, 76, 83, 92, 25 u 8, o una variante del mismo con una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos en residuos que no están dentro de una CDR y/o la región VL puede comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, 73, 40, 77, 84, 93, 18 u 80, o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos en aminoácidos que no están dentro de una CDR.

En algunos ejemplos, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150, 151, 152, 156, 157, 129, 130 o 131; (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 153, 154, 187, 188, 165, 166, 162, 159, 190, 191, 169, 154, 139, 140, 132 o 133; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 155, 161, 134 o 137; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 209, 249, 226, 251,262, 271,217 o 377; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221,252 o 210; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 222, 225, 227, 253, 263, 272, 216 o 214.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150, 151 o 152; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 153 o 154; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 209; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221, y (iii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 222.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150, 151 o 152; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 187 o 188; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 249; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 225.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150, 151 o 152; (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 165 o 166; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 226; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 227.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 156, 151 o 157; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 162 o 159; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 161; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 251; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 252, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 253.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 156, 151 o 157; (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 190 o 191; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 161; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 262; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 252, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 263.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150, 151 o 152; (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 169 o 154; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 271; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 272.

En algunas realizaciones, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 129, 130 o 131; (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 139 o 140; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 134; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 217; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 210, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 216.

En algunos ejemplos, el dominio del dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico de BCMA proporcionado en este documento comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 129, 130 o 131; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 132 o 133; y (iii) un VH CD3 que comprende la secuencia mostrada en 137; y/o (b) una región variable de cadena liviana (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 377; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 210, y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 214.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender además otro dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular adicional puede comprender un dominio de 4-1BB.

En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un dominio de tallo entre el dominio de unión a ligando extracelular y el primer dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el dominio de tallo se puede seleccionar del grupo que consiste en: una bisagra CD8a humana, una bisagra IgG1 y una bisagra FcYRIIIa.

En algunas realizaciones, el primer dominio transmembrana puede comprender un dominio transmembrana de cadena CD8a.

En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un epítopo CD20.

En algunas realizaciones, el CAR puede comprender otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico para BCMA.

En algunas realizaciones, el CAR específico de BCMA puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 396.

En algunas realizaciones de un CAR, el (los) dominio(s) de unión a ligando extracelular, el primer dominio transmembrana y el (los) dominio(s) de señalización intracelular están en un único polipéptido.

En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un segundo dominio transmembrana, en donde el primer dominio transmembrana y el dominio o dominios de unión al ligando extracelular están en un primer polipéptido, y en donde el segundo dominio transmembrana y el dominio(s) de señalización intracelular(s) ) están en un segundo polipéptido, en donde el primer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de la cadena a del receptor de IgE de alta afinidad (FcsRI) y el segundo dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de la cadena y o p de FcsRI. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un tercer polipéptido que comprende un tercer dominio transmembrana fusionado a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora, en donde el tercer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de la cadena y o p de FcsRI.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un CAR específico de BCMA del primer aspecto de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un CAR específico de BCMA del primer aspecto de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona células inmunes diseñadas que expresan en su membrana de la superficie celular un CAR específico de BCMA del primer aspecto de la invención. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria manipulada puede comprender otro CAR que no es específico para BCMA. En algunas realizaciones, la célula inmune modificada puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido suicida. En algunas realizaciones, el polipéptido suicida es RQR8.

En algunas realizaciones, la célula inmune puede derivarse de un linfocito T inflamatorio, un linfocito T citotóxico, un linfocito T regulador o un linfocito T auxiliar.

En algunas realizaciones, la célula inmune manipulada puede comprender una disrupción de uno o más genes endógenos, en donde el gen endógeno codifica TCRa, TCRp, CD52, receptor de glucocorticoides (GR), desoxicitidina quinasa (DCK), o una proteína de punto de control inmune tal como por ejemplo la muerte programada-1 (PD-1).

En algunas realizaciones, las células inmunes se obtienen de un donante sano. En algunas realizaciones, la célula inmune se obtiene de un paciente.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula inmune manipulada que expresa en su membrana de la superficie celular un CAR específico de BCMA del primer aspecto de la invención, para usar como medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento se usa para el tratamiento de un cáncer relacionado con células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin predominante de linfocitos nodulares, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico precursor B, leucemia mieloide, macroglobuliemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico primario (tímico) de células B grandes, linfoma linfoplasmático, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), linfoma difuso positivo de EBV de células B grandes en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma ALK positivo de células B grandes, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre las células B grandes difusas linfoma y linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con células B.

En otro aspecto, la invención proporciona un método in vitro de manipulación de una célula inmune que comprende: proporcionar una célula inmune; y expresar en la superficie de la célula al menos un CAR específico de BCMA del primer aspecto de la invención.

En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula inmune; introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica dicho CAR específico de BCMA; y expresar dicho polinucleótido en la célula.

En algunas realizaciones, el método comprende proporcionar una célula inmune; introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica dicho CAR específico de BCMA; e introducir al menos otro CAR que no sea específico para BCMA.

Se proporciona en este documento un método para tratar a un sujeto que padece una afección asociada con células malignas, el método comprende: proporcionar una célula inmunitaria que expresa en la superficie un CAR específico de BCMA como se describe en este documento; y administrar dichas células inmunes a dicho paciente.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria manipulada por manipulación genética de la invención.

Se proporciona en el presente documento un método para tratar una afección asociada con células malignas que expresan BCMA en un sujeto que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica como se describe en el presente documento, que comprende una célula inmunitaria manipulada como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, la condición es un cáncer. En algunos ejemplos, el cáncer es un cáncer relacionado con células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico precursor B, leucemia mieloide, macroglobuliemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa, linfoma de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico primario (tímico) de células B grandes, linfoma linfoplasmático, macroglobulemia de Waldenstrom, linfoma nodal de la zona marginal de células B, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV de ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes ALK-positivo, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma clásico de Hodgkin y otros linfomas relacionados con células B.

Se proporciona en el presente documento un método para inhibir el crecimiento o la progresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria manipulada como se describe en el presente documento.

Se proporciona en el presente documento un método para inhibir la metástasis de células malignas que expresan BCMA en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria manipulada como se describe en el presente documento.

Se proporciona en el presente documento un método para inducir la regresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de una composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria manipulada como se describe en el presente documento.

En algunos ejemplos, cualquiera de los métodos anteriores comprende además administrar una o más terapias adicionales, tales como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal y/o un quimioterapéutico. En algunos ejemplos, el anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un inhibidor de punto de control como, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos ejemplos, cualquiera de los métodos anteriores comprende además administrar una terapia de análogos de nucleósidos, como por ejemplo fludarabina o clofarabina, al sujeto.

Breve descripción de los dibujos

LA Figura 1 representa un gráfico que resume los resultados del tratamiento con CAR-T específico de BCMA en el modelo tumoral MM1.S.

La Figura 2 representa un gráfico que resume los resultados del tratamiento con CAR-T específico de BCMA en el modelo de tumor Molp8.

Descripción detallada

La invención descrita en el presente documento proporciona receptores de antígeno quimérico (CAR) y células inmunes que comprenden CAR (células CAR-T) que se unen específicamente a BCMA (por ejemplo, BCMA humana). La invención también proporciona polinucleótidos que codifican estos CAR, composiciones que comprenden estas células CAR-T y métodos para fabricar y usar estos CAR y células CAR-T. La divulgación también proporciona métodos para tratar una afección asociada con la expresión maligna de BCMA en un sujeto, como el cáncer.

Técnicas generales

La práctica de la invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican por completo en la literatura, como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones

El término "dominio de unión a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se refiere a un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio será capaz de interactuar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión al ligando extracelular se puede elegir para reconocer un ligando que actúa como un marcador de la superficie celular en las células diana asociadas con un estado de enfermedad particular.

El término "dominio de tallo" o "dominio de bisagra" se usa indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier oligo o polipéptido que funcione para unir el dominio transmembrana al dominio de unión al ligando extracelular. En particular, los dominios de tallo se usan para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular.

El término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función de señal efectora y dirige a la célula a realizar una función especializada.

Una "molécula coestimuladora", como se usa en el presente documento, se refiere al asociado de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitación a la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll. Ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocítica-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares.

Un "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula de señalización coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, para por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, media una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulatorio inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina p, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que une el receptor del ligando Toll y un ligando que específicamente se une con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitación, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocítica-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena única (scFv) y anticuerpos de dominio (incluidos, por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélido), y proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgG, IgA o IgM (o una subclase del mismo), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "fragmento de unión a antígeno" o "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno dado (por ejemplo, BCMA). Las funciones de unión a antígeno de un anticuerpo pueden realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen Fab; Fab'; F(ab')2; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), y una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

Un anticuerpo, un conjugado de anticuerpos o un polipéptido que "se une preferencialmente" o "se une específicamente" (usado indistintamente aquí) a una diana (por ejemplo, proteína BCMA) es un término bien entendido en la técnica, y los métodos para determinar dicha unión específica o preferencial también es bien conocida en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferencial" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferencialmente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferencialmente a un epítopo de BCMA es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otros epítopos de BCMA o epítopos que no son de BCMA. También se entiende que al leer esta definición, por ejemplo, un anticuerpo (o unidad estructural o epítopo) que se une específica o preferencialmente a una primera diana puede o no unirse específica o preferencialmente a una segunda diana. Como tal, el "enlace específico" o el "enlace preferencial" no requieren necesariamente (aunque puede incluir) un enlace exclusivo. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa unión preferencial.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena liviana del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, sola o en combinación. Como se conoce en la técnica, las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) una metodología basada en la variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) una metodología basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273: 927 948). Como se usa en el presente documento, un CDR puede referirse a CDR definidos por cualquier metodología o por una combinación de ambas metodologías.

Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácidos dentro de la región variable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación de Kabat and Chothia, AbM, contacto y/o definiciones conformacionales o cualquier método de determinación de CDR bien conocido en la técnica. Las CDR de anticuerpos pueden identificarse como las regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat et al. Véase, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Las posiciones de las CDR también pueden identificarse como las estructuras de bucle estructural descritas originalmente por Chothia et al. Véase, por ejemplo, Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989. Otras metodologías para la identificación de CDR incluyen la "definición AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se deriva utilizando el software de modelación de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®), o la "definición de contacto" de CDR basada en contactos de antígeno observados, establecida en MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745, 1996. En otra metodología, denominada en el presente documento la "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166, 2008. Aún otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente una de las metodologías anteriores, pero sin embargo se superpondrán con al menos una parte de los CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los resultados experimentales de que residuos particulares o grupos de residuos o incluso CDR completos no tienen un impacto significativo en la unión al antígeno. Como se usa en el presente documento, un CDR puede referirse a CDR definidos por cualquier metodología conocida en la técnica, incluidas combinaciones de metodologías. Los métodos utilizados en este documento pueden utilizar CDR definidos de acuerdo con cualesquiera de estas metodologías. Para cualquier realización dada que contenga más de una CDR, las CDR pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendida, AbM, contacto y/o conformacional.

Como se usa en este documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la divulgación pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler and Milstein, Nature 256: 495, 1975, o pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.

4,816,567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990, por ejemplo.

Como se usa en este documento, el anticuerpo "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo teniendo la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias marco o CDR importadas, sino que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son los de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente el de una inmunoglobulina humana. Se prefieren los anticuerpos que tienen regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 o CDR H3) que se alteran con respecto al anticuerpo original, que también se denomina una o más CDR derivadas de "una o más CDR del anticuerpo original.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha realizado usando cualquiera de las técnicas para dar a conocer anticuerpos humanos a los expertos en la técnica o divulgada aquí. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena liviana humana. Un ejemplo de este tipo es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena liviana murina y de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En un ejemplo, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 95: 6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581, 1991). Los anticuerpos humanos también pueden fabricarse mediante inmunización de animales en donde se han introducido transgénicamente loci de inmunoglobulina humana en lugar de los loci endógenos, por ejemplo, ratones en donde los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Esta metodología se describe en la Patente de los Estados Unidos Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (dichos linfocitos B pueden recuperarse de una clonación individual o de células individuales del ADNc, o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, por ejemplo, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95, 1991; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,750,373.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos en donde las secuencias de región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en donde las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferiblemente, relativamente cortas (por ejemplo, 10 100 aminoácidos). La cadena puede ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede estar interrumpida por no aminoácidos. Los términos también abarcan una cadena de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden aparecer como cadenas individuales o cadenas asociadas.

Un "anticuerpo monovalente" comprende un sitio de unión a antígeno por molécula (por ejemplo, IgG o Fab). En algunos casos, un anticuerpo monovalente puede tener más de un sitio de unión al antígeno, pero los sitios de unión son de antígenos diferentes.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno por molécula (por ejemplo, IgG). En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos.

Un anticuerpo "biespecífico", "doblemente específico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Los dos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico se unen a dos epítopos diferentes, que pueden residir en las mismas o diferentes dianas proteicas.

Los anticuerpos de la divulgación pueden producirse usando técnicas bien conocidas en el arte, por ejemplo, tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas o combinaciones de tales tecnologías u otras tecnologías fácilmente conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 and Fellouse, FA, et al., J. Mol. Biol., 373 (4): 924-40, 2007).

Como se conoce en la técnica, "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a una cadena por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, se puede impartir modificación a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "tapas", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen unidades estructurales pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, alfa anomérico ácidos nucleicos, etc.), así como formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse a soportes sólidos. El OH terminal 5' y 3' puede fosforilarse o sustituirse con aminas o grupos orgánicos de grupos protectores de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que generalmente se conocen en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa o beta-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un éter (-O-) un enlace, arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluidos ARN y ADN.

Como se conoce en la técnica, una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena liviana del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, sola o en combinación.

Como se usa en este documento, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos 50 % puro (es decir, libre de contaminantes), más preferiblemente, al menos 90 % puro, más preferiblemente, al menos 95 % puro, aún más preferiblemente, al menos 98 % puro, y lo más preferiblemente, al menos 99 % puro.

Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico) a la célula madre original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido(s) de esta invención.

Como se usa en el presente documento, "célula inmune" se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en el inicio y/o ejecución de la respuesta inmune innata y/o adaptativa.

Como se conoce en la técnica, el término "región Fc" se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana generalmente se define para extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el terminal carboxilo del mismo. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice de la UE como en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1991. La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos regiones constantes, CH2 y C H 3.

Como se usa en la técnica, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases F ^cyRI, F^cyRII y F^cyRIII, incluidas variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen F cyRIIA (un "receptor activador") y F cyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos. Los FcR se revisan en Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9: 457- 92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4 : 25-34, 1994; y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41, 1995. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587, 1976 y Kim et al., J. Immunol., 24: 249, 1994).

El término "competir", como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o un fragmento (o porción) de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de una manera suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de modo que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín se reduce de manera detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, donde la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también se reduce de manera detectable en presencia del primer anticuerpo, puede, pero no es necesario que sea el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de manera detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en el mismo grado, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos "compiten entre sí" por la unión de su epítopo respectivo(s) La divulgación abarca tanto los anticuerpos competidores como los competidores cruzados. Independientemente del mecanismo por el cual se produce dicha competencia o competencia cruzada (por ejemplo, Impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común, o parte del mismo), el experto en la técnica apreciaría, según las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que dicha competencia y/o los anticuerpos de competencia cruzada están abarcados y pueden ser útiles para los métodos descritos aquí.

Como se usa en el presente documento, "autólogo" significa que las células, una línea celular o población de células usadas para tratar pacientes son originarias de dicho paciente o de un donante compatible con el Antígeno de Leucocitos Humanos (HLA).

Como se usa en el presente documento "alogénico" significa que las células o población de células usadas para tratar pacientes no se originan de dicho paciente sino de un donante.

Como se usa en este documento, "tratamiento" es una metodología para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) células neoplásicas o cancerosas, inhibir la metástasis de las células neoplásicas, reducir o disminuir el tamaño de tumor que expresa BCMA, remisión de una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer), disminución de los síntomas resultantes de una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer), aumento de la calidad de vida de las personas que padecen una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer), disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer), retrasar la progresión de una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer), curar una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer), y/o prolongar la supervivencia de los pacientes que tienen una enfermedad asociada a BCMA (por ejemplo, cáncer).

"Atenuar" significa una disminución o mejora de uno o más síntomas en comparación con no administrar un anticuerpo BCMA o un conjugado de anticuerpo BCMA. "Atenuar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.

Como se usa en este documento, una "dosis efectiva" o "cantidad efectiva" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar uno o más resultados beneficiosos o deseados. Para el uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos como la reducción de la incidencia o la mejora de uno o más síntomas de diversas enfermedades o afecciones asociadas a BCMA (como, por ejemplo, el mieloma múltiple), disminuyendo la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, potenciando el efecto de otro medicamento y/o retrasando la progresión de la enfermedad asociada a BCMA de los pacientes. Se puede administrar una dosis efectiva en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una dosis efectiva de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, se puede considerar una "dosis efectiva" en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y se puede considerar que un único agente se administra en una cantidad efectiva si, junto con uno o más agentes adicionales, se puede lograr o se logra un resultado deseable .

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferiblemente, un ser humano. Los mamíferos también incluyen, entre otros, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.

Como se usa en el presente documento, "vector" significa un constructo, que es capaz de administrar y, preferiblemente, expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertos células eucariotas, como las células productoras.

Como se usa en este documento, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de expresión está operativamente unida a la secuencia de ácidos nucleicos que se va a transcribir.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente retenga actividad biológica y no sea reactivo con el sistema inmune del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar tales como una solución salina regulada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para la administración parenteral o en aerosol son solución salina regulada con fosfato (PBS) o solución salina normal (0.9 %). Las composiciones que comprenden dichos portadores se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Farmacia 21a Ed. Mack Publishing, 2005).

El término "kact.", como se usa en este documento, se refiere a la constante de tasa para la asociación de un anticuerpo a un antígeno.

El término "kinact", como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de tasa para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

El término "K^d", como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "acerca de X" incluye la descripción de "X". Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango.

Se entiende que siempre que se describan realizaciones en el presente documento con el término "que comprende", también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Cuando los ejemplos se describen en términos de un grupo Markush u otro grupo de alternativas, la divulgación abarca no solo todo el grupo enumerado como un todo, sino también cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, sino también el grupo principal ausente uno o más de los miembros del grupo. La divulgación también prevé la exclusión explícita de uno o más de los miembros del grupo.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. A lo largo de esta especificación y reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. A menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

Se describen métodos y materiales de ejemplo en el presente documento, aunque también se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos.

CAR específicos de BCMA y métodos de fabricación de los mismos

La invención proporciona CAR que se unen a BCMA (por ejemplo, BCMA humana (por ejemplo, SEQ ID NO: 354 o número de acceso: Q02223-2). Los CAR específicos de BCMA proporcionados en el presente documento incluyen CAR de cadena sencilla y CAR de múltiples cadenas. Los CAR tienen la capacidad de redirigir la especificidad y la reactividad de las células T hacia BCMA de una manera no restringida por el MHC, explotando las propiedades de unión al antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígeno no restringido por el MHC proporciona a las células T que expresan CAR la capacidad de reconocer un antígeno independiente del procesamiento de antígenos, evitando así un mecanismo principal de escape tumoral.

En algunas realizaciones, los CAR proporcionados en el presente documento comprenden un dominio de unión a ligando extracelular (por ejemplo, un fragmento variable de cadena única (scFv)), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando extracelular, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular están en un polipéptido, es decir, en una sola cadena. Los CAR y polipéptidos multicadena también se proporcionan en el presente documento. En algunas realizaciones, los CAR muliticadena comprenden: un primer polipéptido que comprende un dominio transmembrana y al menos un dominio de unión a ligando extracelular, y un segundo polipéptido que comprende un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular, en donde los polipéptidos se ensamblan para formar un CAR multicadena.

En algunas realizaciones, un CAR multicadena específico de BCMA se basa en el receptor de alta afinidad para IgE (FcsRI). El FcsRI expresado en mastocitos y basófilos desencadena reacciones alérgicas. FcsRI es un complejo tetramérico compuesto por una sola subunidad a, una única subunidad p y dos subunidades y unidas por disulfuro. La subunidad a contiene el dominio de unión a IgE. Las subunidades p y y contienen ITAM que median la transducción de señales. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de la cadena FcRa se elimina y se reemplaza por un dominio de unión a ligando extracelular específico de BCMA. En algunas realizaciones, el CAR específico de BCMA de múltiples cadenas comprende un scFv que se une específicamente a BCMA, la bisagra CD8a y el ITAM de la cadena FCRp. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender o no la cadena FcRy.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular comprende un scFv que comprende la región variable de cadena liviana (VL) y la región variable de cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal específico de antígeno diana unido por un conector flexible. Los fragmentos de región variable de cadena única se hacen uniendo regiones variables de cadena liviana y/o pesada usando un péptido de enlace corto (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988). Un ejemplo de un péptido de enlace es el conector GS que tiene la secuencia de aminoácidos (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 333), que une aproximadamente 3.5 nm entre el terminal carboxilo de una región variable y el término amino de la otra región variable. Los enlazadores de otras secuencias se han diseñado y utilizado (Bird et al., 1988, supra). En general, los enlazadores pueden ser polipéptidos cortos y flexibles y preferiblemente comprender aproximadamente 20 o menos residuos de aminoácidos. Los enlazadores a su vez pueden modificarse para funciones adicionales, como la fijación de medicamentos o la fijación a soportes sólidos. Las variantes de cadena única se pueden producir de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el scFv en una célula huésped adecuada, ya sea eucariota, como células de levadura, plantas, insectos o mamíferos, o procariota, como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden hacerse mediante manipulaciones rutinarias tales como la ligadura de polinucleótidos. El scFv resultante se puede aislar usando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.

En algunos ejemplos, el dominio de unión a ligando extracelular comprende (a) una región VH que comprende (i) una región determinante de complementariedad VH uno (CDR1) que comprende la secuencia SYX1MX2, en donde X1 es A o P; y X2 es T, N o S (SEQ ID NO: 301), GFTFX1SY, en donde X1 es G o S (SEQ ID NO: 302), o GFTFX1SYX2MX3, en donde X1 es G o S, X2 es A o P; y X3 es T, N o S (SEQ ID NO: 303); (ii) un VH CDR2 que comprende la secuencia AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG, en donde X1 es I, V, T, H, L, A o C; X2 es S, D, G, T, I, L, F, M o V; X3 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X4 es S, Q, T, A, F o W; X5 es G o T, X6 es N, S, P, Y, W o F; X7 es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C; Xa es F, Y, P, W, H o G; X9 es V, R o L; y X10 es G o T (SEQ ID NO: 305), o X1X2X3X4X5X6, en donde X1 es S, V, I, D, G, T, L, F o M; X2 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X3 es S, G, F o W; X4 es G o S; X5 es G o T; y X6 es N, S, P, Y o W (SEQ ID NO: 306); y iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia VSPIX1X2X3X4, en donde X1 es A o Y; X2 es A o S; y X3 es G, Q, L, P o E (SEQ ID NO: 307), o YWPMX1X2, en donde X1 es D, S, T o A; y X2 es I, S, L, P o D (SEQ ID NO: 308); y una región VL que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12, en donde X1 es R, G, W, A o C; X2 es A, P, G, L, C o S; X3 es S, G o R; X4 es Q, C, E, V o I; X5 es S, L, P, G, A, R o D; X6 es V, G o I; X7 es S, E, D o P; Xs es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y; X9 es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H o R; X10 es Y o F; X11 es L, W o P; y X12 es A, S o G (SEQ ID NO: 309); (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia X1ASX2RAX3, en donde X1 es G o D; X2 es S o I; y X3 es T o P (SEQ ID NO: 310); y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia QQYX1X2X3PX4T, en donde X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R o Y; X2 es S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K o C; X3 es W, F o S; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 311), o QQYX1X2X3PX4, en donde X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K o Y; X2 es S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F o Y; X3 es W, S o F; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 312). En algunas realizaciones, el VH y el VL están unidos entre sí por un enlazador flexible. En algunas realizaciones, un enlazador flexible comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 333.

En otro aspecto, se proporciona CAR, que se une específicamente a BCMA, en donde CAR comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende: una región VH que comprende un VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en SEQ ID NO: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 78, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 76, 118, 120, 122, 112, 125, 127, 313 o 314; y/o una región VL que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315 o 316. En algunas realizaciones, el VH y el VL están unidos entre sí por un conector flexible. En algunas realizaciones, un enlazador flexible comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 333.

En algún ejemplo, un CAR de la divulgación comprende un dominio de unión a ligando extracelular que tiene una secuencia de cadena liviana parcial como se enumera en la Tabla 1 y/o una secuencia de cadena pesada parcial como se enumera en la Tabla 1. En la Tabla 1, las secuencias subrayadas son secuencias CDR de acuerdo con Kabat y en negrita de acuerdo con Chothia, excepto por las secuencias de CDR2 de cadena pesada, la secuencia Chothia CDR está subrayada y la secuencia Kabat CDR está en negrita.

En el presente documento también se proporcionan porciones CDR de dominios de unión a ligando extracelular de CAR a BCMA (que incluyen regiones de contacto Chothia, Kabat CDR y CDR). La determinación de las regiones CDR está dentro de la habilidad de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR Kabat and Chothia (también denominadas "CR combinadas" o "CDR extendidas"). En algunas realizaciones, las CDR son las CDR de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras palabras, en realizaciones con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de Kabat, Chothia, combinación de CDR o combinaciones de las mismas. La Tabla 2 proporciona ejemplos de secuencias de CDR proporcionadas en este documento.

La divulgación abarca modificaciones a los CAR y polipéptidos de las variantes mostradas en la Tabla 1, incluyendo CAR funcionalmente equivalentes que tienen modificaciones que no afectan significativamente sus propiedades y variantes que tienen actividad o afinidad mejorada o disminuida. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede mutarse para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión deseada a BCMA. La modificación de polipéptidos es una práctica habitual en la técnica y no necesita describirse en detalle en el presente documento. Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más eliminaciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente la actividad funcional de manera perjudicial, o que maduran (aumentan) la afinidad del polipéptido por su ligando, o el uso de análogos químicos.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de terminal amino y/o carboxilo que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en la circulación sanguínea.

Las variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 2.1 bajo el título de "sustituciones conservadoras". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la Tabla 2.1, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y se pueden seleccionar los productos.

Tabla 2.1: Sustituciones de aminoácidos

En algunos ejemplos, la divulgación proporciona un CAR que comprende un dominio de unión a ligando extracelular que se une a BCMA y compite por unirse a BCMA con un CAR descrito aquí, que incluye P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW /P6E01; L1.LGF/L3.N Y/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW /H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW /H3.AL, L1.GDF/L3.KW /H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY /L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY /L1. PS/H2. DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3. P Y /L 1. PS/H2. HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3. P Y /L 1. PS/H3.AQ, L3. P Y /L 1. PS/H3.TAQ, L3. PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3. P Y /L 1. PH/H2. HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA, L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT, L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3. PY/L3. KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ, L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02 Rd4 0.6nM C09 A02 Rd4 6nM C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26, A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6n M_C 03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26, A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VH VL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01 Rd4 6nM C20, C01 Rd4 6nM C 12 , C01 Rd4 0.6nM C16, C01_Rd4_0.6nM_C09, C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09 COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14 COMBO Rd4 6nM C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO Rd4 6nM C22, COMBO Rd4 0.6nM C 11 , o COMBO Rd4 0.6nM C29.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un CAR, que se une específicamente a BCMA, en donde el CAR comprende una región VH que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33; y/o una región VL que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 34. En algunos ejemplos, la divulgación proporciona un CAR, que se une específicamente a BCMA, en donde el CAR comprende una región VH que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33 , 72, 39, 76, 83, 92, 25 u 8; y/o una región VL que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 34, 73, 40, 77, 84, 93, 18 u 80. En algunos ejemplos, la divulgación también proporciona CAR que comprenden porciones CDR de anticuerpos contra anticuerpos BCMA basados en regiones de contacto CDR. Las regiones de contacto de CDR son regiones de un anticuerpo que imponen especificidad al anticuerpo para un antígeno. En general, las regiones de contacto de CDR incluyen las posiciones de residuos en las zonas de CDR y Vernier que están restringidas para mantener la estructura de bucle adecuada para que el anticuerpo se una a un antígeno específico. Véase, por ejemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283: 1156 -1166 , 2007. La determinación de las regiones de contacto CDR está dentro de la capacidad de la técnica.

La afinidad de unión (KD) del CAR específico de BCMA como se describe en este documento a BCMA (tal como BCMA humana (por ejemplo, SEQ ID NO: 354)) puede ser de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 6500 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es aproximadamente cualquiera de 6500 nm, 6000 nm, 5986 nm, 5567 nm, 5500 nm, 4500 nm, 4000 nm, 3500 nm, 3000 nm, 2500 nm, 2134 nm, 2000 nm, 1500 nm, 1000 nm, 750 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nM, 193 nM, 100 nM, 90 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nm, 18 nm, 17 nm, 16 nm, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5.5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.01 nM o 0.002 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que aproximadamente cualquiera de 6500 nm, 6000 nm, 5500 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM o 0.5 nM.

El dominio de señalización intracelular de un CAR según la invención es responsable de la señalización intracelular después de la unión del dominio de unión al ligando extracelular a la diana que da como resultado la activación de la célula inmune y la respuesta inmune. El dominio de señalización intracelular tiene la capacidad de activar al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en donde se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o una actividad auxiliar que incluye la secreción de citoquinas.

En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular para uso en un CAR puede ser las secuencias citoplasmáticas de, por ejemplo, sin limitación, el receptor y los correceptores de células T que actúan en concierto para iniciar la transducción de señal después de la activación del receptor de antígeno, como así como cualquier derivada o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. Los dominios de señalización intracelular comprenden dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias pueden comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación de ITAM basados en inmunorreceptores. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmática de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para las tirosina quinasas de la clase syk/zap70. Ejemplos de ITAM utilizados en la invención pueden incluir como ejemplos no limitantes los derivados de TCRZ, F ^cR^y, FcRp, FcRs, CD 3^y, CD 3^ó, CD 3^s, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3Z que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 70 % , preferiblemente al menos 80 % , más preferiblemente al menos 90 % , 95 % , 97 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 324. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR de la invención comprende un dominio de una molécula coestimuladora.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular de un CAR de la invención comprende una parte de la molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en el fragmento de 41BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 70 % , preferiblemente al menos 80 % , más preferiblemente al menos 90 % , 95 % , 97 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID NO: 323 y SEQ ID NO: 327.

Los CAR se expresan en la membrana superficial de la célula. Por lo tanto, el CAR puede comprender un dominio transmembrana. Los dominios transmembrana adecuados para un CAR descrito en este documento tienen la capacidad de (a) expresarse en la superficie de una célula, preferiblemente una célula inmune tal como, por ejemplo, sin limitación, células de linfocitos o células asesinas naturales (NK) y (b) interactuar con el dominio de unión al ligando y el dominio de señalización intracelular para dirigir la respuesta celular de la célula inmune contra una célula diana predefinida. El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o sintética. El dominio transmembrana puede derivarse de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitantes, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de células T como a, p, y o ó, polipéptido que constituye el complejo CD3, receptor de IL-2 p55 (una cadena), p75 (cadena p) o ^ycadena, cadena de subunidades de los receptores Fc, en particular el receptor III de F ^cyo las proteínas CD. Alternativamente, el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina. En algunas realizaciones, dicho dominio transmembrana se deriva de la cadena CD8a humana (por ejemplo, NP_001139345.1). El dominio transmembrana puede comprender además un dominio de tallo entre el dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. Un dominio de tallo puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente 10 a 100 aminoácidos y lo más preferiblemente 25 a 50 aminoácidos. La región del tallo puede derivarse de la totalidad o parte de moléculas que se producen naturalmente, como de toda o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de la totalidad o parte de una región constante de anticuerpo. Alternativamente, el dominio de tallo puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia de tallo natural, o puede ser una secuencia de tallo completamente sintética. En algunas realizaciones, dicho dominio de tallo es parte de la cadena CD8a humana (por ejemplo, NP_001139345.1). En otra realización particular, dichos dominios transmembrana y de bisagra comprenden una parte de la cadena CD8a humana, preferiblemente que comprende al menos 70 % , preferiblemente al menos 80 % , más preferiblemente al menos 90 % , 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 318. En algunas realizaciones, los CAR descritos en este documento pueden comprender un dominio de unión a ligando extracelular que une específicamente dominios de bisagra humana y transmembrana BCMA, CD8a, el dominio de señalización CD3Z y dominio de señalización de 4 -1 BB.

La Tabla 3 proporciona secuencias de ejemplo de dominios que pueden usarse en los CAR descritos aquí.

Tabla 3: Secuencias de ejemplo de componentes CAR

La regulación negativa o la mutación de los antígenos diana se observa comúnmente en las células cancerosas, creando variantes de escape de pérdida de antígeno. Por lo tanto, para compensar el escape tumoral y hacer que las células inmunes sean más específicas para la diana, el CAR específico de BCMA puede comprender uno o más dominios adicionales de unión a ligandos extracelulares, para unir simultáneamente diferentes elementos en la diana, aumentando así la activación y función de las células inmunes. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelular pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana, y opcionalmente pueden separarse mediante un conector. En algunas realizaciones, dichos dominios de unión a ligando extracelular diferentes pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR. En algunas realizaciones, la invención se refiere a una población de CAR, cada CAR comprende un dominio de unión a ligando extracelular diferente. En particular, la invención se refiere a un método de manipulación de células inmunes que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de la célula una población de CAR, cada CAR comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelular. En otra realización particular, la invención se refiere a un método de manipulación de una célula inmune que comprende proporcionar una célula inmune e introducir en la célula polinucleótidos que codifican polipéptidos que componen una población de CAR, cada uno de los cuales comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelular. Por población de CAR, se entiende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR, cada uno de los cuales comprende diferentes dominios de unión a ligandos extracelulares. Los diferentes dominios de unión a ligando extracelular de acuerdo con la invención pueden unirse simultáneamente a diferentes elementos en la diana, aumentando así la activación y función de las células inmunes. La invención también se refiere a una célula inmune aislada que comprende una población de CAR, cada una de las cuales comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelular.

La divulgación proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los CAR y polipéptidos descritos en este documento. Los polinucleótidos pueden prepararse y expresarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de las células de la invención. En algunas realizaciones, la composición comprende una célula que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los CAR descritos aquí. En otras realizaciones más, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 367 y SEQ ID NO: 368 a continuación:

Región variable de cadena pesada P5A

GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCACCCTGCCGGCTCTCTGAG

ACT GTCTT G T GCC GC C AGCG GCTT C ACCTTC AG C AG CT ACGC C AT G AAC T GG GTGC G

CCAGGCCCCT GGC AAAGGCC T GG AATG GGTGT CCGCC AT C AG CG ATAGC GGCG GCA

GC ACCTACTAC G CC G AT AGC GT G AA GGGCCG GTT C ACC AT C AGCCGGG AC AAC AG C A

AG AAC ACCCT G TACCTGC AG AT G AAC AGCCT GCGGG CCG AGG ACACCGCCGT GTACT

ACT GT GCC A N ATACT G GC C C AT GGAC AT CT GGGGCC AGG G A ACCTT G GTC ACCGTCT

CCTCA (SEQ ID NO: 367)

Región variable de cadena liviana P5A

GAG ATCGTGCT G ACAC AGAGCCCT GGC ACCCT G AGCCTGT CTCCAGG CG AAAG AG C

C ACCCT GTCCT G GAAAG CC AGCC AG AGCGT GTCGAG C AG CTACCT GGC CT GG TATC A

GC AA AAGCCCG GCC AG GCT C C CCGGCTGCT G AT GTACG ATGC C AGC ATC AG AG C C A

CCGGC ATCCC CGAC AG ATTTT CCGGCT CT GGC AGCGGC ACCG ACTT C AC CCT G ACC A

TC AGC AG ACT GG AACC CG AGG ACTTCGC CGT GTACT AC TG CC AGC AGTACG GC AGC T

GG CCCCTG AC ATTTGG CC AG GGC AC AAAGGT GG AG AT C AAA (SEQ ID NO: 366)

En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 369 y SEQ ID NO: 370 a continuación:

Región variable de cadena pesada P5AC1

GAGGTGC AGCT GCT GG AATCTGG CGG AG G ACTGGTGC AGCCT GGCGGCT CT CT GAG ACT GTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTT CAGC AGCTACGCC ATGAACTGGGT GCG CCAGGCC CCT GGTAAAGGTTTGG AAT GGGTTT CT GCT ATT CTGTCGTCT GGT GGTT C T ACTTACT AT GCCG ATT CTGTT AAGGGT AG ATT CACC ATTT CTAG AG AC AAC TCT AAG AA C ACC TT GTAC TT GC AAATG AACTCCTT GAG AG CT G AAGATACTG CT GTTT ATT AC TGTG CT AG AT ACTGGCC AATGG ATATTT GGGGT C AAGGTACTCTGGT CACCGTCT CCTCA

(SEQ ID NO: 369)

Región variable de cadena liviana P5AC1

GAGAT CGT GCT G AC ACAG AGCCCTGGC ACCCT G AGCCTGTCT CCT GGT G AAAGAGCT ACT TTGTCTT GT AG AGGGGGT C AAT CCGTTTCCTCTT C TT ATTTGGCTTGGT ATC AAC A AAAAC C AGGT C AAGCT CC AAG ATTATTG ATGTAC G AT GCTT CT ATTAG AGCC AC CGGT ATT CC AG AT AG ATTTT CTGGTT C TGGTT CCGGTACT G ATTT C ACTTT G ACTATCTCTAG A TTGG AAC CAG AAG ATTT CG CT GTTT ACTACTGT C AAC AATAT C AGT CTT GGCC ATTG AC TTTTGGTCAAGGTACAAAGGTTGAAATCAAA (SEQ ID NO: 370)

En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 371 y SEQ ID NO: 372 a continuación:

Región variable de cadena pesada PC1

GAGGTGCAGCTGCT GG AATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG

ACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACCCTATGAGCTGGGTGCG

CCAGGCC CCTGGC AAAGG ACT GGAATGGGTGTCCGCCATCGGAGGCTCTGGCGGCA

G C ACCTACT ACG CCG ATAGCGTG AAG GGCCGGTTCACCATCAG CCGGG ACAAC AGC A

AGAACACCCTGTACCTG C AAAT G AAC AGCCT GCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACT

ACTGTGCCAGATACTGGCCCATGGACAGCTGGGGCCAGGG AACTTT GGTCACCGTCT

CCTCA (SEQ ID NO: 371)

Región variable de cadena liviana PC1

GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCAG GCG AAAG AGC

C AC CCTGTCCTGC AAAGC C AGCC AG AGCGTGT CC AGC AC ATACCT GGCCT GGTAT CA

GCAAAAGCCCGGCCAGGCTCCCCGGCTGCTGATCTACGATGCCTCTTCTAGAGCCCC

TGGCATCCCCGACAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT

CAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACAGCACCAG CCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 372),

En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 373 y SEQ ID NO: 374 a continuación:

Región variable de cadena pesada PC1C12

GAGGT GC AGCT GCT GGAAT CT GGCGG AGG ACT GGTGC AGCCT GGCGGCT CT CT G AG ACTGTC TTGT GCCGCC AGCGGCTT C ACCTT C AGC AGCTAC CCT AT G AGCT G GGTGCG CCAGGCCCCTGGT AAAGGTTT GGAATGGGTTTCT GCT ATT GGTGGTT C AGGTG GTT G GAGTTATT ATGCCG ATTCT GTTAAGGGTAGATT CACCATTTCT AG AG ACAACT CTAAG A AC ACCTTGTACTT GC AAATG AACT CCTT G AG AGCTGAAGATACT GCT GTTTATTACTGT GCTAGATACTGGCCAAT GG ATTCTTGGG GTC AAGGTACTCTGGT C ACCGTCTCCTC A

(SEQ ID NO: 373)

Región variable de cadena liviana PC1C12

G AG ATCGTGCT G AC AC AG AGCCCTGGC ACCCT GAGCCTGTCTCCT GGTGAAAG AGCT ACTTTGTCTTGTTGGTTGTCTCAATCTGTTTCCTCTACTTACTTGGCTTGGTATCAACAA AAACC AGGT C AAGCTCC AAG ATT ATTG ATCTACG AT G CTT CTT C TAG AGC ACC AGGTAT T CC AG AT AG ATTTTCT GGTTCTGGTTCCGGTACT G ATTT C ACTTTG ACT ATCTCTAG ATT G G AACC AG AAG ATTT C GCT GTTT ACTACT GCC AACAAT ACTCTG AGT GGCC ATT G ACT TTTGGTCAAGGTACAAAGGTTGAAATCAAA (SEQ ID NO: 374).

En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 375 y SEQ ID NO: 376 a continuación:

Región variable de cadena pesada COM22

G AGGTGC AGCTGCTGG AATCTG GCGG AGG ACTGGTGC AG CCTGGCGG CTCTCTG AG AC TGTC TTGTGC C GCC AGCG GCTTC AGCTTC AG C AGCT ACGC C AT G AACTG GGTGCG CC AGGCC C CTGGT AAAGGTTTG GAATG GGTTTCTGCTATTTCT G ATTCTGGTG GTTCT AGGTGGTATGCCGATTCTGTT AAGGGT AGATTCACCATTTCTAGAGACAACTCTAAGA ACACCTTGTACTTGCAAATGAACTCCTTGAGAGCTGAAGATACTGCTGTTTATTACTGT ACGCGGTACTGGCCAATGGATATTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO: 375)

Región variable de cadena liviana COM22

GAGATCGTGCTGACACAG AGCCCT GGCACCCT G AGC CTGTCTCCTGGTGAAAGAGCT ACTTTGTCTTGTTGGTTGTCTCAATCTGTTTCCTCTACTTACTTGGCTTGGTATCAACAA AAACCAGGTCAAGCTCCAAGATTATTGATCTACGATGCTTCTTCTAGAGCACCAGGTAT

TCCAGATAGATTTTCTGGTTCTGGTTCCGGTACTGATTTCACTTTGACTATCTCTAGATT GGAACCAGAAGATTTCGCTGTTTACTACTGCCAACAATACTCT GAGT GGCCATTGACT TTTGGTCAAGGTACAAAGGTTGAAATCAAA (SEQ ID NO: 376),

Los vectores de expresión y la administración de composiciones de polinucleótidos se describen adicionalmente en el presente documento.

La divulgación proporciona un método para preparar cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento.

Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de tales secuencias también están abarcados por la invención. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificadores o antisentido) o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNHn, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de manera individual, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no necesariamente, estar presentes dentro de un polinucleótido de la invención, y un polinucleótido puede, pero no necesariamente, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones de manera que la inmunorreactividad del polipéptido codificado no disminuye, en relación con una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado generalmente se puede evaluar como se describe en el presente documento. Las variantes exhiben preferiblemente al menos aproximadamente 70 % de identidad, más preferiblemente, al menos aproximadamente 80 % de identidad, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 90 % de identidad, y lo más preferiblemente, al menos aproximadamente 95 % de identidad con una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo nativo o una porción de los mismos.

Se dice que dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para una correspondencia máxima como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente comparando las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, generalmente de 30 a aproximadamente 75, o de 40 a aproximadamente 50, en donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de contiguas posiciones después de las dos secuencias están alineadas de manera óptima.

La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo usando el programa Megalign en el conjunto de software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parámetros predeterminados. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrixes for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5: 151-153 ; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4: 11 -17 ; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 726-730.

Preferencialmente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, brechas) del 20 por ciento o menos, generalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se producen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Las variantes también pueden, o alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o una porción o complemento del mismo. Dichas variantes de polinucleótidos son capaces de hibridarse en condiciones moderadamente restrictivas con una secuencia de ADN natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).

Las "condiciones moderadamente restrictivas" adecuadas incluyen prelavado en una solución de 5 X SSC, SD S al 0.5 % , EDTA 1.0 mM (pH 8.0); hibridación a 50°C-65°C, 5 X SSC , durante la noche; seguido de lavar dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de los S S C 2X, 0.5X y 0.2X que contienen SD S al 0.1 % .

Como se usa en el presente documento, "condiciones altamente restrictivas" o "condiciones de alta restricción" son aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/ dodecil sulfato de sodio al 0.1 % a 50°C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1 %/Ficoll al 0.1 %/polivinilpirrolidona al 0.1 %/regulador fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con 750 cloruro de sodio mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50 % , 5 x S S C (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1 % , 5 soluciones de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SD S al 0.1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x S S C (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50 % a 55°C, seguido de un lavado de alta restricción que consiste en 0.1 x S S C que contiene EDTA a 55°C. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

Los expertos en la materia apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la invención contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionados en el presente documento están dentro del alcance de la invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, como eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse utilizando técnicas estándar (como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias en bases de datos).

Los polinucleótidos de esta invención pueden obtenerse usando síntesis química, métodos recombinantes o PCR. Los métodos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no necesitan describirse en detalle aquí. Un experto en la materia puede usar las secuencias proporcionadas aquí y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.

Para preparar polinucleótidos usando métodos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada se puede insertar en un vector adecuado, y el vector a su vez se puede introducir en una célula huésped adecuada para la replicación y amplificación, como se describe más adelante en este documento. Los polinucleótidos pueden insertarse en las células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman mediante la introducción de un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, acoplamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno se puede mantener dentro de la célula como un vector no integrado (como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.

Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología de PCR es bien conocida en la técnica y se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 y 4,683,202, así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

Se puede obtener ARN usando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN puede aislarse usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, como se establece en Sambrook et al., 1989, supra, por ejemplo.

Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de una gran cantidad de vectores de clonación disponibles en la técnica. Mientras que el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped destinada a ser utilizada, los vectores de clonación útiles generalmente tendrán la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una sola diana para una endonucleasa de restricción particular y/o pueden portar genes para un marcador que puede usarse para seleccionar clones que contienen el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, PUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADN de fagos y vectores lanzadera como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.

Los vectores de expresión generalmente son constructos polinucleotídicos replicables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Se da a entender que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped como episomas o como parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, que incluyen adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos y vector(es) de expresión descritos en la publicación PCT No. WO 87/04462. Los componentes del vector generalmente pueden incluir, entre otros, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control de la transcripción adecuados (tales como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), generalmente también se requieren uno o más elementos de control de la traducción, como sitios de unión a ribosomas, sitios de inicio de traducción y codones de parada.

Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de varios medios apropiados, que incluyen electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos a menudo dependerá de las características de la célula huésped.

Un polinucleótido que codifica un CAR específico de BCMA descrito aquí puede existir en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido para introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector de baculovirus para la transfección de una célula huésped de insecto, o un plásmido o vector viral tal como un lentivirus para la transfección de una célula huésped de mamífero). En algunas realizaciones, un polinucleótido o vector puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica secuencias de salto ribosómicas tales como, por ejemplo, sin limitación, una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de picornavirus Aphthovirus, provocan un "salto" ribosómico de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al.2007; Doronina, Wu et al.2008)). Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena de sentido de una molécula de ADN) que se traducen por un ribosoma en un residuo de aminoácido. Por lo tanto, se pueden sintetizar dos polipéptidos a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNmi cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptido 2A que está en el marco. Tales mecanismos de omisión ribosómica son bien conocidos en la técnica y se sabe que son utilizados por varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un solo ARN mensajero.

Para dirigir los polipéptidos transmembrana hacia la ruta secretora de una célula huésped, en algunas realizaciones, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia guía, preprosecuencia o presecuencia) en una secuencia de polinucleótidos o secuencia de vectores. La secuencia de señal secretora está operativamente unida a la secuencia de ácidos nucleicos transmembrana, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se colocan para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la vía secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en 5' respecto a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras se pueden colocar en otra parte de la secuencia de ácidos nucleicos de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., Patente de los Estados Unidos No.

5,037,743; Holland et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,143,830). En algunas realizaciones, el péptido de señalización comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 318 o 329. Los expertos en la materia reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. En algunas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico de la invención están optimizadas con codón para la expresión en células de mamífero, preferiblemente para la expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que generalmente son raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que generalmente son frecuentes en genes altamente expresados de tales especies, codificando tales codones los aminoácidos como los codones que están siendo intercambiados

En algunas realizaciones, un polinucleótido de acuerdo con la invención comprende la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1397. La invención se refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 70 % , preferiblemente al menos 80 % , más preferiblemente al menos 90 % , 95 % , 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1397.

Métodos de manipulación de una célula inmune.

En el presente documento se proporcionan métodos in vitro para preparar células inmunes para su uso en inmunoterapia. En algunas realizaciones, los métodos comprenden introducir un CAR según la invención en células inmunes y expandir las células. En algunas realizaciones, la invención se refiere a un método de manipulación de una célula inmune que comprende: proporcionar una célula y expresar en la superficie de la célula al menos un CAR como se describe anteriormente. Los métodos para diseñar células inmunes se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente PCT Nos. WO/2014/039523, W O/2014/184741, W O /2014/191128, WO/2014/184744 y W O/2014/184143. En algunas realizaciones, el método comprende: transfectar la célula con al menos un polinucleótido que codifica CAR como se describe anteriormente, y expresar los polinucleótidos en la célula.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos están presentes en vectores lentivirales para la expresión estable en las células.

En algunas realizaciones, el método puede comprender además una etapa de modificación genética de una célula al inactivar al menos un gen que expresa, por ejemplo, sin limitación, un componente del TCR, una diana para un agente inmunosupresor, un gen HLA y/o una proteína de punto de control inmune como, por ejemplo, PDCD1 o CTLA-4. Al inactivar un gen se pretende que el gen de interés no se exprese en una forma de proteína funcional. En algunas realizaciones, el gen por inactivar se selecciona del grupo que consiste, por ejemplo, sin limitación, TCRa, TCRp, CD52, GR, PD-1 y CTLA-4. En algunas realizaciones, el método comprende inactivar uno o más genes mediante la introducción en las células de una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente un gen mediante escisión selectiva de ADN. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser, por ejemplo, una nucleasa efectora activadora de la transcripción (nucleasa TALE) o endonucleasa Cas9.

En algunas realizaciones, se usa un dominio catalítico adicional con una endonucleasa de corte raro para mejorar su capacidad para inactivar genes dirigidos. Por ejemplo, un dominio catalítico adicional puede ser una enzima de procesamiento final de ADN. Ejemplos no limitantes de enzimas de procesamiento final de ADN incluyen 5-3' exonucleasas, 3-5' exonucleasas, 5-3' alcalinas exonucleasas, endonucleasas 5' de aleta, helicasas, hosfatasa, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de la plantilla. Ejemplos no limitantes de dicho dominio catalítico comprenden un dominio de proteína o derivado catalíticamente activo del dominio de proteína seleccionado del grupo que consiste en hExol (EXO1_HUMAN), Yeast Exol (EXO 1_YEAST), E. coli Exol, Human TREX2, Mouse TR EX 1, Human T R E X 1, TR EX 1 bovino, TR EX 1 de rata, TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) DNA2 humano, DNA2 de levadura (DNA2_YEAST). En algunas realizaciones, un dominio catalítico adicional puede tener una actividad 3'-5'-exonucleasa, y en algunas realizaciones, dicho dominio catalítico adicional es TREX, más preferiblemente dominio catalítico TR EX 2 (WO2012/058458). En algunas realizaciones, dicho dominio catalítico está codificado por un polipéptido TR EX de cadena sencilla. El dominio catalítico adicional puede fusionarse con una proteína de fusión de nucleasa o proteína quimérica. En algunas realizaciones, el dominio catalítico adicional se fusiona usando, por ejemplo, un conector peptídico.

En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de introducir en las células un ácido nucleico exógeno que comprende al menos una secuencia homóloga a una porción de la secuencia de ácidos nucleicos diana, de modo que se produce una recombinación homóloga entre la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico exógeno. En algunas realizaciones, dicho ácido nucleico exógeno comprende porciones primera y segunda que son homólogas a la región 5' y 3' de la secuencia de ácidos nucleicos diana, respectivamente. El ácido nucleico exógeno también puede comprender una tercera porción situada entre la primera y la segunda porción que no comprende homología con las regiones 5 'y 3' de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Después de la escisión de la secuencia de ácidos nucleicos diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico exógeno. En algunas realizaciones, pueden usarse secuencias homólogas de al menos aproximadamente 50 pb, mayores de aproximadamente 100 pb, o mayores de aproximadamente 200 pb dentro de la matriz donante. El ácido nucleico exógeno puede ser, por ejemplo, sin limitación, de aproximadamente 200 pb a aproximadamente 6000 pb, más preferiblemente de aproximadamente 1000 pb a aproximadamente 2000 pb. Las homologías de ácido nucleico compartidas se encuentran en regiones que flanquean corriente arriba y corriente abajo del sitio de la ruptura, y la secuencia de ácidos nucleicos por introducir se encuentra entre los dos brazos.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico comprende sucesivamente una primera región de homología con secuencias corriente arriba de dicha escisión; una secuencia para inactivar un gen dirigido seleccionado del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, receptor de glucocorticoides (GR), desoxicitidina quinasa (DCK), y una proteína de punto de control inmune tal como, por ejemplo, muerte programada-1 (P D -1); y una segunda región de homología con secuencias corriente abajo de la escisión. El paso de introducción de polinucleótidos puede ser simultáneo, antes o después de la introducción o expresión de la endonucleasa de corte raro. Dependiendo de la ubicación de la secuencia de ácidos nucleicos diana en donde se ha producido el evento de ruptura, dicho ácido nucleico exógeno puede usarse para eliminar un gen, por ejemplo, cuando el ácido nucleico exógeno se encuentra dentro del marco de lectura abierto del gen, o para introducir nuevas secuencias o genes de interés. Las inserciones de secuencia mediante el uso de dicho ácido nucleico exógeno se pueden usar para modificar un gen existente dirigido, mediante la corrección o el reemplazo del gen (intercambio de alelos como un ejemplo no limitante), o para aumentar o disminuir la expresión del gen diana (cambio de promotor como ejemplo no limitativo), la corrección o reemplazo de genes específicos. En algunas realizaciones, la inactivación de un gen seleccionado del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteínas de punto de control inmunitario, se puede realizar en una ubicación genómica precisa dirigida por una nucleasa TALE específica, en donde dicha nucleasa TALE específica cataliza una escisión y en donde el ácido nucleico exógeno comprende sucesivamente al menos una región de homología y una secuencia para inactivar un gen dirigido seleccionado del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK, proteínas de punto de control inmunitario que están integradas por homólogos recombinación. En algunas realizaciones, varios genes pueden ser, sucesivamente o al mismo tiempo, inactivados usando varias nucleasas TALE respectivamente y dirigidas específicamente a un gen definido y varios polinucleótidos específicos para la inactivación genética específica.

En algunas realizaciones, el método comprende la inactivación de uno o más genes adicionales seleccionados del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteínas de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la inactivación de un gen se puede lograr mediante la introducción en las células de al menos una endonucleasa de corte raro de manera que la endonucleasa de corte raro catalice específicamente la escisión en una secuencia dirigida del genoma celular; y opcionalmente, introducir en las células un ácido nucleico exógeno que comprende sucesivamente una primera región de homología con secuencias corriente arriba de la escisión, una secuencia que se insertará en el genoma de la célula y una segunda región de homología con secuencias corriente abajo de la escisión; en donde el ácido nucleico exógeno introducido inactiva un gen e integra al menos una secuencia de polinucleótidos exógenos que codifica al menos una proteína recombinante de interés. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos exógenos se integra dentro de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteína de punto de control inmune.

En otro aspecto, una etapa de modificación genética de células puede comprender: modificación de células T inactivando al menos un gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, y; expandiendo las células, opcionalmente en presencia del agente inmunosupresor. Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la función inmune por uno de varios mecanismos de acción. Un agente inmunosupresor puede disminuir el alcance y/o la voracidad de una respuesta inmune. Ejemplos no limitantes de agentes inmunosupresores incluyen inhibidores de la calcineurina, dianas de la rapamicina, bloqueadores de la cadena a de la interleucina-2, inhibidores de la deshidrogenasa monofosfato de inosina, inhibidores de la reductasa del ácido dihidrofólico, corticosteroides y antimetabolitos inmunosupresores. Algunos inmunosupresores citotóxicos actúan inhibiendo la síntesis de ADN. Otros pueden actuar a través de la activación de las células T o al inhibir la activación de las células auxiliares. Los métodos según la invención permiten conferir resistencia inmunosupresora a las células T para inmunoterapia al inactivar la diana del agente inmunosupresor en las células T. Como ejemplos no limitantes, las dianas para el agente inmunosupresor pueden ser un receptor para un agente inmunosupresor tal como, por ejemplo, sin limitación CD52, receptor de glucocorticoides (GR), miembros del gen de la familia FKBP y miembros del gen de la familia ciclofilina.

En algunas realizaciones, la modificación genética del método implica la expresión, en células proporcionadas para diseñar, de una endonucleasa de corte raro de tal manera que la endonucleasa de corte raro cataliza específicamente la escisión en un gen diana, inactivando así el gen diana. En algunas realizaciones, un método de manipulación de células comprende al menos uno de los siguientes pasos: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; seleccionar un gen en la célula T que expresa una diana para un agente inmunosupresor; introduciendo en la célula T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivarse selectivamente por escisión de ADN, preferiblemente por ruptura de doble cadena del gen que codifica una diana para el agente inmunosupresor, y expandiendo las células, opcionalmente en presencia del agente inmunosupresor.

En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; seleccionar un gen en la célula T en donde el gen expresa una diana para un agente inmunosupresor; transfectar la célula T con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de inactivarse selectivamente por escisión de ADN, preferiblemente por ruptura de doble cadena del gen que codifica una diana para el agente inmunosupresor, y expresar las endonucleasas de corte raro en las células T; y expandiendo las células, opcionalmente en presencia del agente inmunosupresor.

En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro se dirige específicamente a CD52 o GR. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación codifica CD52, y el tratamiento inmunosupresor comprende un anticuerpo humanizado dirigido al antígeno CD52. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación codifica GR, y el tratamiento inmunosupresor comprende un corticosteroide tal como dexametasona. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación es un miembro del gen de la familia FKBP o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor comprende FK506, también conocido como Tacrolimus o fujimicina. En algunas realizaciones, el miembro del gen de la familia FKBP es FK B P 12 o una variante del mismo. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación es un miembro del gen de la familia de la ciclofilina o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor comprende ciclosporina.

En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser, por ejemplo, una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc o una nucleasa TALE (TALEN). En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.

También se proporcionan en el presente documento métodos de manipulación de células T, adecuados para inmunoterapia, en donde los métodos comprenden: modificar las células T genéticamente mediante la inactivación de al menos la proteína de punto de control inmune. En algunas realizaciones, la proteína de punto de control inmune es, por ejemplo, PD-1 y/o CTLA-4. En algunas realizaciones, los métodos para modificar genéticamente una célula comprenden: modificar las células T inactivando al menos una proteína de punto de control inmune; y expandiendo las células. Las proteínas del punto de control inmunitario incluyen, entre otras, la muerte programada 1 (P D -1, también conocida como PDCD1 o CD279, número de acceso: NM_005018), antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, también conocido como CD 152, número de acceso de GenBank AF414120.1), LAG3 (también conocido como CD223, número de acceso: NM_002286.5), Tim3 (también conocido como HAVCR2, número de acceso de GenBank: JX049979.1), BTLA (también conocido como CD272, número de acceso: NM_181780.3) , BY55 (también conocido como CD160, número de acceso de GenBank: CR541888.1), TIGIT (también conocido como VSTM3, número de acceso: NM_173799), B7H5 (también conocido como C10orf54, homólogo del gen de vista de ratón, número de acceso: NM_022153.1), LAIR1 (también conocido como CD305, número de acceso de GenBank: CR542051.1), S IG L EC 10 (número de acceso de GeneBank: AY358337.1), 2B4 (también conocido como CD244, número de acceso: NM_001166664.1), que inhibe directamente las células inmunes. Por ejemplo, CTLA-4 es una proteína de la superficie celular expresada en ciertas células T CD4 y CD8; cuando sus ligandos (B7-1 y B7-2) se unen a las células presentadoras de antígeno, se inhibe la activación de las células T y la función efectora.

En algunas realizaciones, dicho método para diseñar células comprende al menos uno de los siguientes pasos: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; introducir en la célula T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivarse selectivamente mediante la escisión del ADN, preferiblemente mediante la ruptura de doble cadena de un gen que codifica una proteína de punto de control inmune; y expandiendo las células. En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; transfectar dicha célula T con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de inactivarse selectivamente por escisión de ADN, preferiblemente por ruptura de doble cadena de un gen que codifica una proteína de punto de control inmune; expresar las endonucleasas de corte raro en las células T; expandiendo las células. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro se dirige específicamente a un gen seleccionado del grupo que consiste en: PD -1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIG LEC10, 2B4, T C R a y TCRp. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc o una nucleasa TALE. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.

En algunas realizaciones, la presente invención puede ser particularmente adecuada para inmunoterapia alogénica. En tales realizaciones, las células pueden modificarse mediante un método que comprende: inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR) en células T; y expandiendo las células T. En algunas realizaciones, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para diseñar, de una endonucleasa de corte raro de tal manera que la endonucleasa de corte raro cataliza específicamente la escisión en un gen diana inactivando así el gen diana. En algunas realizaciones, dicho método para diseñar células comprende al menos uno de los siguientes pasos: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; introducir en la célula T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivarse selectivamente por escisión de ADN, preferiblemente por ruptura de doble cadena al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR), y expandir las células.

En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; transfectar dicha célula T con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de inactivarse selectivamente por escisión de ADN, preferiblemente por ruptura de doble cadena al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR); expresar las endonucleasas de corte raro en las células T; ordenar las células T transformadas, que no expresan TCR en su superficie celular, y expandir las células.

En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc o una nucleasa TALE. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE. En algunas realizaciones, las nucleasas de TALE reconocen y escinden una secuencia que codifica TC R a o TCRp. En algunas realizaciones, una nucleasa TALE comprende una secuencia de polipéptidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 o 341.

Secuencias del polipéptido TALE-nucleasa:

Repetición TRAC TQ1-L LTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQA LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIA SHDGG KQALETVQ RL LPVLCQAH GLTPEQWAI AS NIGG KQ AL ETVQALL PVLCQ AHGLT PEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPV LCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALE TVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASN IG GKQALETVQALLP VLC QAH G LTPOQ W AI AS N GGGKQ AL ÉTVQ RLLPVLCQAHGLTPE QWAIASHDGGKQALETVQRILPVLCGAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 334)

Repetición TRAC T01-R LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQA LETVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPV LCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQALE TVQALLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASN IGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQ QWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 335)

Bspetición TRBCTQ1-L LTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQWAIASMNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQ ALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAI ASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHG LTPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVGRLLP VLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLIPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASN GGGKGALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE QWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 336)

Repetición TRBC T01-R

NPQRSTVWYLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGK QALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPGQVVA IASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCGAHG LTPEQWAIASHDGGKQALETVGRLLPVLCGAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQ ALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAI ASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGL TPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLP

VLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKGALETVGRLLPVLCQAHGLTPGQWAIASNGGGRPAL

E (SEQ ID NO: 337)

LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLL PVLCGAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCGAHGLTPEGVVAIASNIGGKQA LETVOALLPVLCQAHGLTPEGWAIASHDGGKGALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQANGLT PQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPV LCQAHGLTPGQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALE TVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVGRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPGQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE QWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 338)

Repetición TRBC T02-R LTPGOWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCGAHGLTPOQWAIASNNGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQA LETVGALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKGALETVQRLLPVLCGAHGLTPEGVVAIA SNIGGKGALETVQALLPVLCGAHGLTPQGVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPV LCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALE TVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTP QQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCGAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE

(SEQ ID NO: 339)

Repetición CD52 T02-L LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQGWAIASNGGGKQA LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PEQWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEGWAIASHDGGKQALETVQRLLPV

LCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALE

TVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQWAIASH

DGGKQALETVQRLLPVLCOAHGLTPEGWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE

QWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO:

340)

Repetición CD52_T02-R

LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLL

PVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQA

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SNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGL

TPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPV

LCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALE

TVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASN

GGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPE

QWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE

(SEQ ID NO: 341)

En otro aspecto, otro paso de la modificación genética de la célula puede ser un método para expandir las células T deficientes en TCR a que comprende introducir pTa en las células T (también conocido como preTCRa) o una variante funcional de las mismas y expandir las células, opcionalmente mediante estimulación del complejo CD 3. En algunas realizaciones, el método comprende: a) transfectar las células con ácido nucleico que codifica al menos un fragmento de pTa para soportar la expresión superficial de CD3; b) expresar dicho pTa en las células; y c) expandir las células, opcionalmente a través de la estimulación del complejo CD 3.

También se proporcionan métodos para preparar células T para inmunoterapia que comprenden etapas del método de expansión para células T. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos pTa se puede introducir aleatoriamente o por recombinación homóloga. En algunas realizaciones, la inserción puede estar asociada con la inactivación del gen TCRa. Se pueden usar diferentes variantes funcionales de pTa. Una "variante funcional" del péptido se refiere a una molécula sustancialmente similar al péptido completo o a un fragmento del mismo. Un "fragmento" de la pTa o variante funcional del mismo se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, es decir, un péptido más corto que la pTa de longitud completa. En algunas realizaciones, pTa o variantes funcionales pueden ser, por ejemplo, pTa de longitud completa o una versión pTa truncada C-terminal. La pTa truncada C-terminal carece en el extremo C-terminal de uno o más residuos. Como ejemplos no limitantes, la versión de pTa truncada C-terminal carece de 18, 48, 62, 78, 92, 110 o 114 residuos del extremo C-terminal de la proteína. Las variantes de secuencia de aminoácidos del péptido pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN que codifica el péptido. Dichas variantes funcionales incluyen, por ejemplo, eliminaciones o inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. También se puede hacer cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea la actividad deseada, en particular la restauración de un complejo CD3 funcional. En una realización preferida, se introduce al menos una mutación en las diferentes versiones de pTa como se describió anteriormente para afectar la dimerización. Como ejemplo no limitante, el residuo mutado puede ser al menos W46R, D22A, K24A, R102A o R 117 A de la proteína pTa humana o posiciones alineadas usando el método CLUSTALW en la familia pTa o miembro homólogo. Preferiblemente, pTa o una variante del mismo como se describe anteriormente comprende el residuo mutado W46R o los residuos mutados D22A, K24A, R102A y R 117A . En algunas realizaciones, dicho pTa o variantes también se fusionan a un dominio de transducción de señal tal como CD28, OX40, ICOS, CD27, C D 137 (4-1BB) y CD8 como ejemplos no limitantes. El dominio extracelular de pTa o las variantes descritas anteriormente pueden fusionarse con un fragmento de la proteína TCRa, particularmente el dominio transmembrana e intracelular de TCRa. Las variantes de pTa también pueden fusionarse con el dominio intracelular de TCRa.

En algunas realizaciones, las versiones de pTa pueden fusionarse a un dominio de unión a ligando extracelular. En algunas realizaciones, pTa o variante funcional del mismo se fusiona a un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende el fragmento variable ligero y pesado de un anticuerpo monoclonal específico de antígeno diana unido por un conector flexible.

El término "célula T deficiente en TCRa" se refiere a una célula T aislada que carece de la expresión de una cadena TC R a funcional. Esto puede lograrse por diferentes medios, como ejemplos no limitantes, diseñando una célula T de manera que no exprese ningún TC R a funcional en su superficie celular o diseñando una célula T de manera que produzca muy poca cadena TC R a funcional en su superficie o diseñando una célula T para expresar la forma mutada o truncada de la cadena TCRa. Las células deficientes en TC R a ya no pueden expandirse a través del complejo CD3. Por lo tanto, para superar este problema y permitir la proliferación de células deficientes en TCRa, se introduce pTa o una variante funcional de las mismas en las células, restaurando así un complejo CD3 funcional. En algunas realizaciones, el método comprende además introducir en dichas células T endonucleasas de corte raro capaces de inactivar selectivamente mediante escisión de ADN un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR). En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.

En otro aspecto, las células T manipuladas obtenidas por los métodos descritos en el presente documento pueden ponerse en contacto con anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, las células T pueden ponerse en contacto con anticuerpos biespecíficos ex vivo antes de la administración a un paciente, o in vivo después de la administración a un paciente. Los anticuerpos biespecíficos comprenden dos regiones variables con propiedades antigénicas distintas que facilitan acercar las células modificadas a un antígeno diana. Como ejemplo no limitante, un anticuerpo biespecífico puede dirigirse contra un marcador tumoral y un antígeno linfocitario, como por ejemplo, sin limitación CD3, y tiene el potencial de redirigir y activar cualquier célula T circulante contra los tumores.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden ser ARNm que se introduce directamente en las células, por ejemplo por electroporación. En algunas realizaciones, la tecnología cytoPulse puede usarse para permeabilizar transitoriamente células vivas para el suministro de material a las células. Los parámetros se pueden modificar para determinar las condiciones para una alta eficiencia de transfección con una mortalidad mínima.

También se proporcionan en el presente documento métodos para transfectar células T. En algunas realizaciones, el método comprende: poner en contacto una célula T con ARN y aplicar a la célula T una secuencia de pulso ágil que consiste en: (a) un pulso eléctrico con un rango de voltaje de aproximadamente 2250 a 3000 V por centímetro; (b) un ancho de pulso de 0.1 ms; (c) un intervalo de pulso de aproximadamente 0.2 a 10 ms entre los pulsos eléctricos del paso (a) y (b); (d) un pulso eléctrico con un rango de voltaje de aproximadamente 2250 a 3000 V con un ancho de pulso de aproximadamente 100 ms y un intervalo de pulso de aproximadamente 100 ms entre el pulso eléctrico del paso (b) y el primer pulso eléctrico del paso (c ); y (e) cuatro pulsos eléctricos con un voltaje de aproximadamente 325 V con un ancho de pulso de aproximadamente 0.2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos eléctricos. En algunas realizaciones, un método para transfectar células T que comprende poner en contacto dichas células T con ARN y aplicar a las células T una secuencia de pulso ágil que comprende: (a) un pulso eléctrico con un voltaje de aproximadamente 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 ,2550 , 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000V por centímetro; (b) un ancho de pulso de 0.1 ms; (c) y un intervalo de pulso de aproximadamente 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ms entre los pulsos eléctricos de los pasos (a) y (b); (d) un impulso eléctrico con un rango de voltaje de aproximadamente 2250, de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000V con un ancho de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso eléctrico del paso (b) y el primer pulso eléctrico del paso (c); y (e) 4 pulsos eléctricos con un voltaje de aproximadamente 325 V con un ancho de pulso de aproximadamente 0.2 ms y un intervalo de pulso de aproximadamente 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos eléctricos. Cualquier valor incluido en el rango de valores descrito anteriormente se describe en la presente solicitud. El medio de electroporación puede ser cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el medio de electroporación tiene conductividad en un intervalo que abarca aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1.0 miliSiemens.

En algunas realizaciones, como ejemplos no limitantes, un ARN codifica una endonuclasa de corte raro, un monómero de la endonucleasa de corte raro tal como la nucleasa media TALE, un CAR, al menos un componente del quimérico multicadena receptor de antígeno, un pTa o variante funcional del mismo, un ácido nucleico exógeno y/o un dominio catalítico adicional.

Células inmunes inmunes modificadas genéticamente

La divulgación también proporciona células inmunes modificadas genéticamente que comprenden cualquiera de los polinucleótidos CAR descritos en este documento. En algunas realizaciones, se puede introducir un CAR en una célula inmune como un transgén a través de un vector plasmídico. En algunas realizaciones, el vector plasmídico también puede contener, por ejemplo, un marcador de selección que proporciona identificación y/o selección de células que recibieron el vector.

Los polipéptidos CAR pueden sintetizarse in situ en la célula después de la introducción de polinucleótidos que codifican los polipéptidos CAR en la célula. Alternativamente, los polipéptidos CAR pueden producirse fuera de las células y luego introducirse en las células. Los métodos para introducir un constructo polinucleotídica en las células son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se pueden usar métodos de transformación estables para integrar el constructo polinucleotídica en el genoma de la célula. En otras realizaciones, los métodos de transformación transitoria pueden usarse para expresar transitoriamente el constructo polinucleotídico, y el constructo polinucleotídico no integrado en el genoma de la célula. En otras realizaciones, se pueden usar métodos mediados por virus. Los polinucleótidos pueden introducirse en una célula por cualquier medio adecuado tal como, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, sin limitación, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Los polinucleótidos pueden incluirse en vectores, como por ejemplo vectores plasmídicos o vectores virales.

También se proporcionan en el presente documento células aisladas y líneas celulares obtenidas por los métodos descritos anteriormente de manipulación de células proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula aislada comprende al menos un CAR como se describe anteriormente. En algunas realizaciones, una célula aislada comprende una población de CAR, cada CAR comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelular.

También se proporcionan en el presente documento células inmunes aisladas obtenidas de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Cualquier célula inmune capaz de expresar ADN heterólogo puede usarse con el fin de expresar el CAR de interés. En algunas realizaciones, la célula inmune es una célula T. En algunas realizaciones, una célula inmune puede derivarse, por ejemplo, sin limitación, de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34+. La célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica asesina, un mastocito, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores. linfocitos o linfocitos T auxiliares. En algunas realizaciones, la célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+.

Antes de la expansión y modificación genética, se puede obtener una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos no limitantes. Las células se pueden obtener de varias fuentes no limitantes, incluidas las células mononucleares de sangre periférica, la médula ósea, el tejido de los ganglios linfáticos, la sangre del cordón umbilical, el tejido del timo, el tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En algunas realizaciones, se puede usar cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las células pueden derivarse de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En algunas realizaciones, las células pueden ser parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas.

También se proporcionan en el presente documento líneas celulares obtenidas de una célula T transformada de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente. También se proporcionan en el presente documento células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor. En algunas realizaciones, una célula aislada según la invención comprende un polinucleótido que codifica un CAR de la invención.

Las células inmunes de la invención pueden activarse y expandirse, antes o después de la modificación genética de las células T, usando métodos como se describe generalmente, por ejemplo, sin limitación, en las Patentes Estadounidenses 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro o in vivo. Generalmente, las células T de la invención pueden expandirse, por ejemplo, por contacto con un agente que estimula un complejo CD3 TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T. Por ejemplo, se pueden usar productos químicos como el ionóforo de calcio A23187, el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) o las lectinas mitogénicas como la fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T.

En algunas realizaciones, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro por contacto con, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Minimal Essential Media o RPMI Media 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluido el suero (por ejemplo, fetal bovino o humano suero), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-^y, IL-4, IL-7, GM -CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp y TNF, o cualquier otro aditivos para el crecimiento de células conocidas por el artesano experto. Otros aditivos para el crecimiento de las células incluyen, pero no se limitan a, surfactante, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanoi. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12 , X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, sin suero o suplementado con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se infunden en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura apropiada (por ejemplo, 37°C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5 % de CO ²). Las células T que han sido expuestas a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes.

En algunas realizaciones, las células de la invención pueden expandirse cocultivando con tejido o células. Las células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo en la sangre del sujeto después de administrar la célula al sujeto.

En algunas realizaciones, una célula aislada según la presente invención comprende un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, P D -1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LA IR 1, SIG LEC 10 , 2B4, HLA, TC R a y TCRp y/o expresa un CAR, un CAR multicadena y/o un transgén pTa. En algunas realizaciones, una célula aislada comprende polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden un CAR multicadena. En algunas realizaciones, la célula aislada según la presente invención comprende dos genes inactivados seleccionados del grupo que consiste en: CD52 y GR, CD52 y TCRa, CD R52 y TCRp, GR y TCRa, GR y TCRp, TC R a y TCRp, PD-1 y TCRa, PD-1 y TCRp, CTLA-4 y TCRa, CTLA-4 y TCRp, LAG3 y TCRa, LAG3 y TCRp, Tim3 y TCRa, Tim3 y TCRp, BTLA y TCRa, BTLA y TCRp, BY55 y TCRa, BY55 y TCRp, TIGIT y TCRa, TIGIT y TCRp, B7H5 y TCRa, B7H5 y TCRp, LAIR1 y TCRa, LAIR1 y TCRp, S IG L EC 10 y TCRa, S IG L E C 10 y TCRp, 2B4 y TCRa, 2B4 y TCRp y/o expresa un CAR, o CAR multicadena y un transgén pTa.

En algunas realizaciones, el TC R se vuelve no funcional en las células de acuerdo con la invención al inactivar el gen TC R a y/o el gen o los genes TCRp. En algunas realizaciones, se proporciona un método para obtener células modificadas derivadas de un individuo, en donde las células pueden proliferar independientemente de la ruta de señalización del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Las células modificadas, que pueden proliferar independientemente de la ruta de señalización de MHC, susceptibles de ser obtenidas por este método están incluidas en el alcance de la presente invención. Las células modificadas descritas en el presente documento pueden usarse para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo del huésped contra el injerto (HvG) y la enfermedad del injerto contra el huésped (GvHD). Por lo tanto, se describe en el presente documento un método para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo del huésped contra el injerto (HvG) y la enfermedad del injerto contra el huésped (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente mediante la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de células modificadas que comprenden TC R a inactivado y/o Genes TCRp.

En algunas realizaciones, las células inmunes están diseñadas para ser resistentes a uno o más fármacos de quimioterapia. El fármaco de quimioterapia puede ser, por ejemplo, un análogo de nucleótido de purina (PNA), lo que hace que la célula inmune sea adecuada para el tratamiento del cáncer que combina inmunoterapia adoptiva y quimioterapia. Los PNA de ejemplo incluyen, por ejemplo, clofarabina, fludarabina y citarabina, solos o en combinación. Los PNA se metabolizan por la desoxicitidina quinasa (dCK) en PNA mono, di y trifosfato. Sus formas de trifosfato compiten con el ATP por la síntesis de ADN, actúan como agentes proapoptóticos y son potentes inhibidores de la ribonucleótido reductasa (RNR), que participa en la producción de trinucleótidos. En el presente documento se proporcionan células CA R -T específicas de BCMA que comprenden un gen dCK inactivado. En algunas realizaciones, las células inactivadas con dCK se preparan mediante transfección de células T usando polinucleótidos que codifican TAL-nulceasa específica dirigida contra genes dCK mediante, por ejemplo, electroporación de ARNm. Las células CA R -T específicas de BCMA con dCK inactivadas son resistentes a los PNA, incluyendo por ejemplo clorofarabina y/o fludarabina, y mantienen la actividad citotóxica de las células T hacia las células que expresan BCMA.

En algunas realizaciones, las células aisladas o las líneas celulares de la invención pueden comprender un pTa o una variante funcional del mismo. En algunas realizaciones, una célula o línea celular aislada puede modificarse genéticamente adicionalmente inactivando el gen TCRa.

En algunas realizaciones, la célula CA R -T comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido suicida, como por ejemplo RQR8. Véase, por ejemplo, W O2013153391A. En las células CA R-T que comprenden el polinucleótido, el polipéptido suicida se expresa en la superficie de una célula CAR-T. En algunas realizaciones, el polipéptido suicida comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 342.

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP

APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS

LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPW (SEQ ID NO: 342)

El polipéptido suicida también puede comprender un péptido de señalización en el extremo amino. En algunas realizaciones, el polipéptido suicida comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 400.

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTT

ACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI

WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPW (SEQ ID NO: 400)

Cuando el polipéptido suicida se expresa en la superficie de una célula CAR-T, la unión de rituximab a los epítopos R del polipéptido provoca la lisis de la célula. Más de una molécula de rituximab puede unirse por polipéptido expresado en la superficie celular. Cada epítopo R del polipéptido puede unirse a una molécula separada de rituximab. La eliminación de células CA R -T específicas de BCMA puede ocurrir in vivo, por ejemplo, administrando rituximab a un paciente. La decisión de eliminar las células transferidas puede surgir de los efectos indeseables que se detectan en el paciente que son atribuibles a las células transferidas, como por ejemplo, cuando se detectan niveles inaceptables de toxicidad.

En algunas realizaciones, la célula CA R-T comprende un epítopo seleccionado dentro del scFv que tiene una especificidad para ser reconocida por un anticuerpo específico. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT "SISTEMAS QUIMÉRICOS R E C EP TO R E S DE ANTIGENO IMPULSADOS POR mAb PARA CLASIFICAR/AGOTAR CÉLULAS INMUNITARIAS MANIPULADAS", WO 2016/120216 A1, presentada el 25 de enero de 2016. Tal epítopo facilita la clasificación y/o el agotamiento de las células CAR-T. El epítopo se puede seleccionar de cualquier número de epítopos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el epítopo puede ser una diana de un anticuerpo monoclonal aprobado para uso médico, tal como, por ejemplo, sin limitación, el epítopo CD20 reconocido por rituximab. En algunas realizaciones, el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 397.

C P Y SN P SLC (SEQ ID NO: 397)

En algunas realizaciones, el epítopo está ubicado dentro del CAR. Por ejemplo, sin limitación, el epítopo puede ubicarse entre el scFv y la bisagra de un CAR. En algunas realizaciones, se pueden usar dos instancias del mismo epítopo, separadas por enlazadores, en el CAR. Por ejemplo, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 398 puede usarse dentro de un CAR, ubicado entre la región variable de la cadena liviana y la bisagra.

G S G G G G S C P Y S N P S L C S G G G G S C P Y S N P S L C S G G G G S (SEQ ID NO: 398)

En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de epítopo puede conjugarse con un fármaco citotóxico. También es posible promover la citotoxicidad de los CD C mediante el uso de anticuerpos modificados genéticamente en donde son componentes injertados del sistema del complemento. En algunas realizaciones, la activación de las células CAR-T se puede modular agotando las células usando un anticuerpo que reconoce el epítopo.

Aplicaciones terapéuticas

Las células aisladas obtenidas por los métodos descritos anteriormente, o las líneas celulares derivadas de tales células aisladas, pueden usarse como medicamento. En algunas realizaciones, dicho medicamento puede usarse para tratar el cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es neoplasia de células plasmáticas malignas de mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, , leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico precursor B, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico primario (tímico) de células B grandes, linfoma linfoplasmatico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), VEB linfoma difuso positivo de células B grandes en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma ALK positivo de células B grandes, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en e1HHV8 asociado enfermedad de Castleman multicéntrica, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, u otro linfoma relacionado con células B .

Una célula aislada de acuerdo con la invención, o una línea celular derivada de las células aisladas, puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesite.

También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar pacientes. En algunos ejemplos, el método comprende proporcionar una célula inmune de la invención a un paciente que la necesite. En algunos ejemplos, el método comprende una etapa de administrar células inmunes transformadas de la invención a un paciente que lo necesite.

En algunos ejemplos, las células T de la invención pueden experimentar una sólida expansión de células T in vivo y pueden persistir durante un período prolongado de tiempo.

Los métodos de tratamiento de la presente descripción pueden ser mejoradores, curativos o profilácticos. El método puede ser parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Las células inmunes de la invención son particularmente adecuadas para inmunoterapia alogénica. Las células T de los donantes pueden transformarse en células no alorreactivas utilizando protocolos estándar y reproducirse según sea necesario, produciendo células CA R-T que pueden administrarse a uno o varios pacientes. Dicha terapia con células CAR-T puede estar disponible como un producto terapéutico "listo para usar".

Las células que pueden usarse con los métodos descritos se describen en la sección anterior. El tratamiento se puede usar para tratar pacientes diagnosticados con, por ejemplo, cáncer. Los cánceres que pueden tratarse incluyen, por ejemplo, sin limitación, cánceres que involucran linfocitos B, incluido cualquiera de los cánceres mencionados anteriormente. Los tipos de cánceres a tratar con los CAR y las células CA R -T de la invención incluyen, pero no se limitan a, ciertas leucemias o tumores malignos linfoides. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos. En algunos ejemplos, el tratamiento puede combinarse con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citoquinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

En algunos ejemplos, el tratamiento puede administrarse a pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la invención se basa preferiblemente en células o población de células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de las células T de acuerdo con la invención dentro del paciente. La administración de las células o la población de células de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa o intralifática, o intraperitonealmente. En un ejemplo, las composiciones celulares de la invención se administran preferiblemente mediante inyección intravenosa.

En algunos ejemplos, la administración de las células o la población de células puede comprender la administración de, por ejemplo, aproximadamente 104 a aproximadamente 109 células por kg de peso corporal incluyendo todos los valores enteros de números de células dentro de esos intervalos. En algunos ejemplos, la administración de las células o la población de células puede comprender la administración de aproximadamente 105 a 106 células por kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o la población de células pueden administrarse en una o más dosis. En algunos ejemplos, dicha cantidad efectiva de células puede administrarse como una dosis única. En algunos ejemplos, dicha cantidad efectiva de células puede administrarse como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración depende del médico responsable y depende del estado clínico del paciente. Las células o la población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, como un banco de sangre o un donante. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los rangos óptimos de cantidades efectivas de un tipo celular dado para una enfermedad o afecciones particulares dentro de la habilidad de la técnica. Una cantidad efectiva significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. En algunos ejemplos, una cantidad efectiva de células o composición que comprende esas células se administran parenteralmente. En algunos ejemplos, la administración puede ser una administración intravenosa. En algunos ejemplos, la administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En algunos ejemplos, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen pero no se limitan al tratamiento con agentes tales como terapia de anticuerpos monoclonales, antagonista de C C R 2 (por ejemplo , INC-8761), terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, tratamiento con citarabina (también conocido como ARA-C) o nataliziimab para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En algunos ejemplos, se administran células CA R -T específicas de BCMA a un paciente junto con uno o más de los siguientes: un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab o PF-06801591), un anticuerpo anti-PD-L1 (por ejemplo, avelumab, atezolizumab o durvalumab), un anticuerpo anti-OX40 (por ejemplo, PF-04518600), un anticuerpo anti-4-1 BB (por ejemplo, PF-05082566), un anticuerpo anti-MCSF (por ejemplo, PD-0360324), un anticuerpo anti-GITR y/o un anticuerpo anti-TIGIT. En algunos ejemplos, un CAR específico de BCMA que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 396 se administra a un paciente junto con el anticuerpo anti-PD-L1 avelumab. En otros ejemplos, las células T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citoquinas y/o irradiación. Estos medicamentos inhiben la calcineurina fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). En un ejemplo adicional, las composiciones celulares de la invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) trasplante de médula ósea, terapia de ablación de células T usando agentes quimioterapéuticos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En algunos ejemplos, las composiciones celulares de la invención se administran después de una terapia ablativa de células B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con dosis altas de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertos ejemplos, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la invención. En algunos ejemplos, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

Kits

La invención también proporciona kits para su uso en los métodos instantáneos. Los kits de la invención incluyen uno o más recipientes que comprenden un polinucleótido que codifica un CAR específico de BCMA, o una célula inmune modificada que comprende un polinucleótido que codifica un CAR específico de BCMA de la invención, y las instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descritos aquí. Generalmente, estas instrucciones comprenden una descripción de la administración de la célula inmune modificada para los tratamientos terapéuticos descritos anteriormente.

Las instrucciones relacionadas con el uso de las células inmunes modificadas genéticamente tal como se describe en el presente documento generalmente incluyen información sobre la dosificación, el programa de dosificación y la vía de administración para el tratamiento pretendido. Los envases pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención son típicamente instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero las instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones llevadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico) también son aceptable.

Los kits de esta invención están en un embalaje adecuado. El embalaje adecuado incluye, entre otros, viales, botellas, frascos, embalaje flexible (por ejemplo, Mylar sellado o bolsas de plástico) y similares. También se contemplan paquetes para usar en combinación con un dispositivo específico, como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo BCMA. El recipiente puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo.

Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como memorias intermedias e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un contenedor y una etiqueta o inserto(s) del paquete o asociado con el contenedor.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos. De hecho, diversas modificaciones además de las mostradas y descritas en el presente documento resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior.

Los materiales representativos de la presente invención se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC) el 9 de febrero de 2016. El depósito biológico que tiene el número de acceso A T C C PTA-122834 es un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR específico de BCMA. El depósito se realizó de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento y las reglamentaciones de patentes en virtud del mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. A TCC pondrá a disposición el depósito de conformidad con los términos del Tratado de Budapest y estará sujeto a un acuerdo entre Pfizer, Inc. y A TCC, que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente pertinente de los Estados Unidos o al abrir al público cualquier solicitud de patente de los Estados Unidos o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a una determinada por el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para tener derecho a la misma de acuerdo con 35 U.S.C. Sección 122 y las reglas del Comisionado de conformidad con la misma (incluyendo 37 C.F.R. Sección 1.14 con referencia particular a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito murieran o se perdieran o fueran destruidos cuando se cultivan bajo condiciones adecuadas, los materiales serán reemplazados de inmediato tras la notificación con otros de los mismos. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Determinación de la cinética y afinidad de las interacciones BCMA/IgG humana a 25 °C y/o 37°C

Este ejemplo determina la cinética y la afinidad de diversos anticuerpos anti-BCMA a 25 °C y 37°C.

Todos los experimentos se realizaron en un biosensor de resonancia de plasma de superficie Bio-Rad Proteon XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA). Se preparó una matriz de anticuerpos anti-BCMA usando un método de acoplamiento de amina en un chip sensor Bio-Rad G LC similar al descrito en Abdiche, et al., Anal. Biochem. 411, 139 -151 (2011). La temperatura de análisis para la inmovilización fue de 25 °C y el regulador de ejecución fue HBS-T+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0.05 % , pH 7.4). Los canales se activaron en la dirección del analito (horizontal) inyectando una mezcla de ECD 1 mM y NHS 0.25 mM durante 3 minutos a una tasa de flujo de 30 pL/min. Las IgG se inmovilizaron en los puntos activados inyectándolas en la dirección del ligando (vertical) a 20 pg/ml en 10 mM de acetato de pH 4.5 regulador durante 1.5 minutos a 30 pg/ml. Las superficies activadas se bloquearon inyectando etanolamina 1M, pH 8.5 en la dirección del analito durante 3 minutos a 30 pl/min.

La temperatura de análisis para el análisis de unión a BCMA fue de 37 °C o 25 °C en un regulador de HBS-T+, suplementado con 1 mg/ml de BSA. Se empleó un método de titulación cinética para el análisis de interacción como se describe en Abdiche, et al. El analito BCMA humano (huBCMA) o el mono cynomolgus BCMA (cyBCMA) se inyectó en la dirección del analito usando una serie de inyecciones de baja a alta concentración. Las concentraciones utilizadas fueron 0.08 nM, 0.4 nM, 2 nM, 10 nM y 50 nM (una serie de 5 miembros, con un factor de dilución de 5 veces y una concentración máxima de 50 nM). El tiempo de asociación para una dilución de analito dada fue de dos minutos. Inmediatamente después de la inyección de BCMA 50 nM, se monitorizó la disociación durante 2 horas. Antes de las inyecciones de analito de BCMA, se inyectó regulador 5 veces usando los mismos tiempos de asociación y disociación en los ciclos de analito de BCMA para preparar un sensorgrama en blanco de regulador para fines de doble referencia (doble referencia como se describe en Myszka, J. Mol. Recognit. 12 279-284 (1999).

Los sensorgramas se referenciaron dos veces y se ajustaron a un Langmuir 1:1 con modelo de titulación cinética de transporte de masa en BIAevaluation Software versión 4.1.1 (GE Lifesciences, Piscataway, NJ). La cinética y los parámetros de afinidad para diversos anticuerpos anti-BCMA de la divulgación se muestran en las Tablas 4A-4C. Los anticuerpos que se muestran en las Tablas 4A-4C comparten las mismas regiones VH y VL que los CAR que se muestran en la Tabla 1 que tienen el mismo nombre.

Tabla 4A

Tabla 4B

Tabla 4C

Ejemplo 2: Células CAR-T específicas de BCMA

Este ejemplo demuestra la actividad funcional de células CA R -T específicas de BCMA contra células tumorales positivas para BCMA (BCMA+).

Entre todas las moléculas CAR específicas de BCMA generadas, ocho se seleccionaron para pruebas de actividad adicionales basadas en la afinidad por BCMA, reactividad cruzada con BCMA humano y BCMA de Cyno, y epítopo. Las moléculas CAR probadas incluyeron: P5A, P5AC1, P5AC16, P C 1, PC1 C 12 , COM22, P6DY y P6AP. Se diseñaron tres arquitecturas diferentes: la versión 1 (v1) comprende una bisagra FcYRIIIa, la versión 2 (v2) comprende una bisagra CD8a y la versión 3 (v3) comprende una bisagra IgG 1. Se prepararon y usaron los receptores de antígeno quimérico (CAR) que se muestran en la Tabla 5 y se evaluó su actividad de desgranulación hacia las células BCMA+. La actividad de desgranulación se determinó tras la expresión transitoria de cada CAR en células T humanas.

Tabla 5: CAR de ejemplo de BCMA específicos

Para los ensayos de actividad, se obtuvieron células T de trece donantes sanos (Donantes 1-13). En resumen, las células T se purificaron a partir de muestras de recubrimiento leucocitario y se activaron usando perlas CD3/CD28. Las células se transfectaron transitoriamente con ARNm que codifican las diferentes moléculas CAR en D 11/12 después de la activación. La actividad de CAR se evaluó midiendo su capacidad de desgranulación, la liberación de interferón-y (IFN^y) y la actividad citotóxica cuando se cultivan conjuntamente con (a) células que expresan BCMA (MM1S, KMS12BM y L363), o (b) células que no expresan la proteína BCMA (K562). También se incluyeron para cada ensayo células T transfectadas simuladas (células T en el regulador) para determinar la actividad basal de las células T que no expresan un CAR.10*52

La detección de CAR se realizó usando una proteína de fusión en donde el dominio extracelular de la proteína BCMA humana se fusionó con un fragmento Fc derivado de IgG1 de ratón. La unión del CAR en la superficie celular con la porción BCMA de la proteína de fusión se detectó con anticuerpo conjugado con anti-Fc PE y se analizó por citometría de flujo.

Materiales y métodos

Cultivos primarios de células T

Las células T se purificaron a partir de muestras de capa de Buffy proporcionadas por EFS (Etablissement Frangais du Sang, París, Francia) usando medio de densidad de gradiente Ficoll (Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences). La capa de PBMC se recuperó y las células T se purificaron usando un kit de enriquecimiento de células T disponible comercialmente (Stem Cell Technologies). Las células T purificadas se activaron en medio X -V ivo ™ -15 (Lonza) suplementado con 20 ng/ml de IL-2 humana (Miltenyi Biotech), suero humano al 5 % (Sera Laboratories) y el activador Dynabeads Human T CD3/CD28 en una relación perla:célula 1:1 (Life Technologies). Después de la activación, las células se cultivaron y mantuvieron en medio X -V ivo ™ -15 (Lonza) complementado con 20 ng/ml de IL-2 humana (Miltenyi Biotec) y suero humano al 5 % (Sera Laboratories).

Transfección de ARNm de CAR

Las transfecciones se realizaron el día 4/5 o el día 11 /12 después de la purificación y activación de las células T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 pg de ARNm que codifica los diferentes constructos CAR. Los ARNm de CAR fueron producidos usando el kit m M ESSAGE mMACHINE T7 (Life Technologies) y se purificaron usando RNeasy Mini Spin Columns (Qiagen). Las transfecciones se realizaron utilizando la tecnología de citopulso PulseAgile™, aplicando dos pulsos de 0.1 mS a 3000V/cm, seguidos de cuatro pulsos de 0.2 mS a 325V/cm en cubetas de espacio libre de 0.4 cm en un volumen final de 200 pl de "Regulador de citoporación T" (BTX Harvard Apparatus) Las células se diluyeron inmediatamente en medio X -V ivo ™ -15 (Lonza) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO ². Se añadió IL-2 (de Miltenyi Biotec 2 h después de la electroporación a 20 ng/ml).

Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)

Las células T se incubaron en placas de 96 pozos (50.000 células/pozo), junto con una cantidad igual de células que expresan o no la proteína BCMA. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X -V ivo ™ -15 (Lonza) durante 6 horas a 37 °C con 5 % de CO ². La tinción de CD 107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo anti-CD107a fluorescente (conjugado con APC, de Miltenyi Biotec) al comienzo del cocultivo, junto con 1 pg/ml de anti-CD49d (BD Pharmingen), 1 pg/ml de anti-CD28 (Miltenyi Biotec) y 1x solución de monensina (eBioscience). Después del período de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad reparable (eFluor 780, de eBioscience) y anti-CD8 conjugado con fluorocromo (Miltenyi Biotec conjugado con PE) y se analizaron por citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (MFI) para la tinción de CD 107a entre las células CD8+. Los ensayos de desgranulación se llevaron a cabo 24 h después de la transfección de ARNm. Los resultados se resumen en las Tablas 6A-9H y 9A-9C a continuación. En las tablas, la segunda columna (etiquetada como "célula CAR-T") indica que el CAR específico de BCMA se expresa en las células T transfectadas.

La expresión de CD 107a en las células es un marcador de activación específica de antígeno. El porcentaje y la MFI de CD 107a en las células T CD8 que expresan CAR específicos de BCMA aumentan cuando se incuban con células que expresan BCMA alto (H929), medio (MM1S) y bajo (KMS12BM, L363) pero no células negativas BCMA (K562 y Daudi) (Tablas 6A-9H y 9A-9C). Los niveles de expresión de CD 107a no aumentaron en células T transfectadas simuladas en contacto con BCMA. Por lo tanto, las células CA R -T específicas de BCMA se activan en presencia de células que expresan BCMA pero no en presencia de células que no expresan BCMA.

Estos resultados demuestran que las células T que expresan CAR específicos de BCMA se activan cuando se incuban con células que expresan BCMA, y que la activación es específica de antígeno.

Ensayo de liberación de IFNy

Las células T se incubaron en placas de 96 pozos (50.000 células/pozo), junto con (a) células que expresan BCMA (MM1S, KMS12BM y L363) o (b) células que no expresan la proteína BCMA (K562). Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X -V ivo ™ -15 (Lonza) durante 24 horas a 37 °C con 5 % de CO ². Después de este período de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes se recuperaron en una nueva placa. La detección de IFN^yen los sobrenadantes del cultivo celular se realizó mediante un ensayo ELISA (kit de IFN^yQuantikine ELISA humano, de R&D Systems). Los ensayos de liberación de IFN^yse llevaron a cabo iniciando los cocultivos celulares 24 h después de la transfección de ARNm. Los resultados se resumen en las Tablas 8A-8D y 10 más adelante.

Como se muestra en las Tablas 8A-8D y 10, las células T CD8 que expresan CAR específicos de BCMA producen IFN^ycuando se incuban con células que expresan BCMA medio (MM1S) o células con baja expresión de BCMA (KMS12BM, L363). Por el contrario, las células T CD8 que expresan CAR específicos de BCMA producen IFNy insignificante cuando se incuban con células negativas de BCMA (K562).

- Ensayo de citotoxicidad

Las células T se incubaron en placas de 96 pozos (100.000 células/pozo), junto con 10.000 células diana (que expresan BCMA) y 10.000 células de control (BCMAneg) en el mismo pozo. Las células diana y de control se marcaron con colorantes intracelulares fluorescentes (CFS E o Cell Trace Violet, de Life Technologies) antes de cocultivarlos con células T CAR+. Los cocultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C con 5 % de CO ². Después de este período de incubación, las células se marcaron con un colorante de viabilidad reparable (eFluor 780, de eBioscience) y se analizaron por citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control BCMAneg) y se calculó el % de lisis celular específica. Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo 48 h después de la transfección de ARNm. Los resultados se resumen en las Tablas 7A-7H a continuación. En las tablas, los datos de citotoxicidad se muestran como porcentaje de células viables, luego se calculan como una proporción de células positivas de BCMA vivo/células negativas de BCMA vivo. La lisis celular se calcula como 100 células T transfectadas simuladas.

Como se muestra en las Tablas 7A-7H, las células T que expresan CAR específicos de BCMA exhiben actividad destructora cuando se incuban con células que expresan BCMA medio (MM1S) o células con baja expresión de BCMA (L363). En contraste, las células T CD8 que expresan CAR específicos de BCMA no exhiben actividad de destrucción cuando se incuban con células negativas de BCMA (K562).

En resumen, las células T que expresan los CAR específicos de BCMA seleccionados que se muestran en la Tabla 5 se activan selectivamente tras el contacto con células que expresan BCMA. Si bien todas las versiones de los CAR específicos de BCMA exhibieron una actividad específica de BCMA, los CAR específicos de BCMA que comprenden una bisagra CD8a (v2) exhibieron niveles de activación aumentados en comparación con los CAR específicos de BCMA que comprenden una bisagra FcYRIIIa (v1) o una bisagra IgG1 (v3).

Tabla 6A: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 1

Tabla 6B: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 2

Tabla 6C: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 3

Tabla 6D: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 4

Tabla 6E: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 5

Tabla 6F: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 6

Tabla 6G: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 7

Tabla 6H: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 8

Tabla 7A: Datos de citotoxicidad, Donante 6

Tabla 7B: Datos de citotoxicidad, Donante 6

Tabla 7C: Datos de citotoxicidad, Donante 7

Tabla 7D: Datos de citotoxicidad, Donante 7

Tabla 7E: Datos de citotoxicidad, Donante 8

Tabla 7F: Datos de citotoxicidad, Donante 8

Tabla 7G: Datos de citotoxicidad, Donante 9

Tabla 7H: Datos de citotoxicidad, Donante 9

Tabla 8A: Producción de IFNy (pg/mL), Donante 6

Tabla 8B: Producción de iFMy (pg/mL), Donante 7

Tabla 8D: Producción deilFNy (pg/mL), Donante 9

Tabla 9A: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 10

Tabla 9B: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 11

Tabla 9C: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 12

Tabla 10: Resultados del ensayo de liberación de IFN gamma, Donante 10

Ejemplo 3: Las células CA R -T específicas de BCMA inducen regresión tumoral en el modelo tumoral MM1.S

Este ejemplo ilustra el tratamiento de tumores con células CA R -T específicas de BCMA usando el modelo de tumor MM1.S.

El estudio de eficacia in vivo de células CA R -T específicas de BCMA se realizó con MM1.S, que expresa luciferasa y GFP, modelo ortotópico. Se inyectaron cinco millones de células MM1.S Luc2AGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra Nod/Scid/IL2Rg-/-(NSG) de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 pL por animal a 15 mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de todo el cuerpo (BLI) permiten controlar la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes con un IVIS Spectrum C T (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) con Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA).

Se usaron tres células CA R-T específicas de BCMA diferentes en este estudio: las células T que expresan los constructos CAR específicos de BCMA P5A C1-V2, P C 1C 12 -V 2 o COM 22-V2 (véase la Tabla 5 anterior). Las células T de control no transducidas se usaron como control negativo. Todas las células T fueron diseñadas para ser deficientes en TCRa.

Cuando el flujo total alcanzó un promedio de 45E6 para todos los animales (día 20 después del implante tumoral), los animales se aleatorizaron en cuatro grupos. Se administró una dosis única de células CA R-T específicas de BCMA humanas o células T de control no transducidas mediante inyección en vena de la cola en bolo. Los animales fueron sacrificados cuando exhibían parálisis de las extremidades posteriores o una pérdida de peso corporal del 20 % , un punto final para los modelos ortotópicos MM1.S

Los resultados de este estudio se resumen en la Figura 1. En la Figura 1, el flujo total [p/s] representa la progresión del tumor. El tratamiento con células CA R-T específicas de BCMA (triángulos, diamantes, cuadrados) dio como resultado un flujo total más bajo en comparación con el control negativo (círculos). Por lo tanto, el tratamiento con células CA R -T específicas de BCMA inhibió la progresión tumoral en comparación con el control negativo.

Estos resultados demuestran que las células CA R -T específicas de BCMA son eficaces para inducir la regresión tumoral.

Ejemplo 4: Tratamiento del mieloma múltiple con células CAR-T específicas de BCMA

Este ejemplo ilustra el tratamiento del mieloma múltiple con células CA R -T específicas de BCMA usando el modelo ortotópico Molp8.

El estudio de eficacia in vivo de células CA R -T específicas de BCMA se realizó con Molp8, que expresa luciferasa y GFP, modelo ortotópico. Se inyectaron dos millones de células Molp8 Luc2AGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra NSG de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 pL por animal a 15 mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de todo el cuerpo (BLI) permiten controlar la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes con un IVIS Spectrum C T (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) con Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA).

Cuando el flujo total alcanzó un promedio de 30E6 para todos los animales (día 8 después del implante tumoral), los animales se aleatorizaron en tres grupos. A cada grupo se le administró una de las siguientes células: 1) células T no transducidas TCR KO ("TCR KO") utilizado como control, 2) células CA R -T específicas de BCMA que expresan P 5A C 1-V 2.1 ("P5AC1 V2 R2 TC R KO"), o 3) células CA R-T específicas de BCMA que expresan P5 A C 1-V 2 y el polipéptido suicida RQR8 ("P5AC1 V2 RQR8 TCR KO"). Todas las células 1-3 son deficientes en TCRa. Las células CA R -T específicas de BCMA se prepararon como se describe en el ejemplo anterior. Los constructos CAR específicos de BCMA P 5A C 1-V 2.1 y P5 A C 1-V 2 se muestran en la Tabla 5 anterior. Se administró una dosis única de 3 millones de células control (TCR KO) o específicas de BCMA CA R -T (P5AC1 V2 R2 TC R KO o P5AC1 V2 RQR8 TC R KO) mediante inyección de bolo en la vena de la cola del bolo. Los animales fueron sacrificados cuando perdieron más del 15 % del peso corporal total, un punto final para los modelos ortotópicos Molp8.

Los resultados del estudio se resumen en la Figura 2. Una dosis única de 3 millones de células CA R -T específicas de P5AC1 R2 TCRKO BCMA (cuadrados) o células P5AC1 RQR8 TCRKO CA R -T (triángulos) de células CA R-T específicas de BCMA resultó en flujo total más bajo de los días 10-35 después del implante tumoral en comparación con el control negativo (círculos) (Figura 2). Por lo tanto, el tratamiento con células CA R -T específicas de BCMA inhibió la progresión tumoral en comparación con el control negativo.

Estos resultados demuestran que las células CA R -T específicas de BCMA son eficaces para inhibir la progresión tumoral.

Ejemplo 5: Tratamiento del mieloma múltiple con células CAR-T específicas de BCMA

Este ejemplo ilustra la actividad terapéutica de células CA R -T específicas de BCMA en modelos ortotópicos de ratón de mieloma múltiple.

Se usaron dos modelos de ratones humanizados para evaluar la eficacia de las células CA R-T específicas de BCMA contra las líneas celulares de mieloma humano que expresan BCMA. Se adquirieron ratones hembra Nod/Scid IL2rg-/-(NSG) de seis (6) a ocho (8) semanas de Jackson Laboratories. Todos los animales fueron alojados en una instalación de vivero libre de patógenos en Rinat y los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos de acuerdo con las directrices del Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Las líneas celulares MM1.S y Molp-8 se compraron de la American Type Culture Collection (ATCC.org) y la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ.de). Las líneas celulares se diseñaron para expresar una proteína de fusión Luc-GFP usando partículas lentivirales (amsbio). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 con L-glutamina suplementada con suero de ternera fetal al 10 % para MM1.S o con F C S al 20 % para células Molp-8 a 37°C en dióxido de carbono (CO ²) al 5 % . Las células que crecen en una fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se usaron para la inoculación de tumores.

Se produjeron células CA R -T específicas de BCMA terapéuticas como se describe. Las células donantes sanas, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o las células pan-T purificadas, se activan y transducen con partículas lentivirales que codifican un CAR y RQR8 específico de BCMA impulsado por el promotor EF-1a. Se utilizaron tres CAR específicos de BCMA diferentes en este estudio: P5A C1-V2, P C 1C 12 -V 2 y COM 22-V2 (véase la Tabla 5 anterior). Las células T fueron editadas genéticamente para la eliminación del gen TCRa. Las células se cultivaron durante 14 a 17 días y luego se crioconservaron en 90 % de FC S /10 % de DMSO. Para la inyección de células T, las células T se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 que contenía Hepes 25 mM. Se inyectaron células en 0.2 ml de RPMI 1640 con Hepes 25 mM en la vena de la cola de animales con tumor.

Los ratones NSG se irradiaron con irradiación corporal total de 1 Gy (RAD Source Technologies) un día antes de la inoculación de células tumorales. Se inyectaron 5x106 células M M 1.S/Luc2-EGFP o 2x106 células Molp-8/Luc2-EGFP en la vena de la cola en 0.1 ml de solución salina regulada con fosfato (PBS). La carga tumoral se midió dos veces por semana utilizando imágenes de bioluminiscencia. Los ratones fueron inyectados con 3 ug de D-Luciferina disuelta en 0.2 ml de PBS y anestesiados con isofluorano. 7 minutos después de la inyección, se tomaron imágenes de los animales usando un sistema de cámara Perkin Elmer IVIS Spectrum. Se midió la luminiscencia corporal total con la excepción de la cola del ratón y la carga tumoral se informa como flujo total (fotones por segundo). Se permitió que los tumores se establecieran hasta que se produjo un crecimiento exponencial. Los animales fueron aleatorizados en grupos de tratamiento basados en el flujo total y tratados con células CA R -T específicas de BCMA o células T de control no transducidas del mismo donante. El efecto del tratamiento con CA R -T se evaluó dos veces por semana utilizando imágenes de bioluminiscencia y mediciones de peso corporal. El punto final del estudio se alcanzó cuando el primer animal exhibió una enfermedad terminal como lo indica la pérdida de peso corporal (>20 % del peso corporal inicial), parálisis posterior u otros signos de angustia animal. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 6. Se utilizaron medidas repetidas ANOVA unidireccional con corrección de Tukey para comparar la eficacia antitumoral entre todos los grupos. P<0.05 se consideró significativo.

Los resultados se resumen en la Tabla 11 (MM1.S) y la Tabla 12 (Molp-8) a continuación (valores log¹⁰del flujo total en fotones por segundo /- SEM). Se usó una dosis subóptima de células CA R -T para comparar las células CA R -T específicas de BCMA que tienen diferentes scFv. Los grupos de células CA R -T específicas de BCMA son P5A C1-V2, P C 1C 12 -V 2 y COM 22-V2 (véase la Tabla 5 anterior). En el modelo MM1.S, se inyectaron 3.5x106 células T que expresan CAR el día 17 después de la implantación del tumor. En el modelo Molp8, se inyectaron 4x106 células T que expresan CAR el día 7 después de la implantación del tumor. Las eficiencias de transducción variaron del 19 % al 29 % para las células CA R -T específicas de BCMA dosificadas en el modelo de ratón MM1.S y del 31 % al 36 % para las células CA R -T específicas de BCMA dosificadas en el modelo de ratón Molp8. Se usó una dosis total equivalente de células T no transducidas para el grupo de control. El grupo tratado con células T control mostró un crecimiento tumoral progresivo hasta que se alcanzó el punto final del estudio en el día 35 para MM1.S y el día 23 para Molp8. El análisis estadístico de la carga tumoral mediante la prueba RM-ANOVA con corrección de Dunnets mostró que en los tres grupos tratados con CA R -T específicos de BCMA, la carga tumoral fue significativamente menor en comparación con la carga tumoral en el grupo control (p<0.01) (Tablas 11 y 12). Por ejemplo, en el modelo de tumor MM1.S, el flujo total medio en animales tratados con células CA R -T específicas de BCMA P 5A C 1-V 2 fue de 6.44 log 10 fotones/s en el día 25, en comparación con 9.22 log 10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 11). En el día 35 después de la implantación del tumor, el flujo total medio en animales tratados con células CA R -T específicas de BCMA P 5A C 1-V 2 fue de 6.82 log 10 fotones/s, en comparación con 10.18 log 10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 11). En el modelo de tumor Molp8, el flujo total medio en animales tratados con células CA R-T específicas de BCMA P 5A C 1-V 2 fue de 7.88 log 10 fotones/s en el día 14, en comparación con 9.39 log 10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 12). En el día 23 después de la implantación del tumor, el flujo total medio en animales tratados con células CA R -T específicas de BCMA P 5A C 1-V 2 fue de 9.29 log 10 fotones/s, en comparación con 10.37 log 10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 12).

Estos resultados demuestran que los tratamientos con células CA R -T específicas de BCMA son eficaces para inducir la regresión tumoral.

Tabla 11 : Mediciones de bioluminiscencia tumoral del modelo de tumor MM1.S ortotópico

SEM N

Días después de la implantación del tumor Flujo total medio (log 10 fotones/s) SEM N 35

10.18

0

upo 2: Células CA R -T específicas de BCMA P 5A C 1-V 2

Días después de la

p

Días después de la implantación del tumor Flujo total medio (log 10) SEM N

Tabla 12: Mediciones de bioluminiscencia tumoral del modelo de tumor ortotópico Molp-8

Ejemplo 6: Tratamiento de mieloma múltiple con células CA R -T específicas de BCMA ACa/dCK anuladas

Se usó un modelo de ratón humanizado para evaluar la eficacia de las células BCMA CA R -T frente a las líneas celulares de mieloma humano que expresan BCMA. Se adquirieron ratones hembra Nod/Scid IL2rg-/- (NSG) de 6 a 8 semanas de edad en Jackson Laboratories. Todos los animales fueron alojados en una instalación de vivero libre de patógenos en Rinat y los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).10

Las líneas celulares MM1.S se compraron de la American Type Culture Collection (ATCC.org). La línea celular fue diseñada para expresar una proteína de fusión Luc-GFP usando partículas lentivirales (amsbio) y el gen editado usando nucleasas TALEN para desactivar el gen de desoxicitidina (dCK). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 con L-glutamina suplementada con suero de ternera fetal al 10 % a 37 °C en dióxido de carbono (CO²) al 5 % .

Las células que crecen en una fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se usaron para la inoculación de tumores.

Se produjeron células terapéuticas CA R -T como se describe. Las células donantes sanas, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o las células pan-T purificadas, se activan y transducen con partículas lentivirales que codifican BCMA scFV, bisagra CD8, transmembrana CD8, 41BB y CD3Z con genes RQR8 bajo el control de E F -1a promotor. Las células CA R -T específicas de BCMA se editaron gen para eliminar el gen TC R a y/o dCK usando una combinación de TC R a y dCK TALEN, o TC R a TALEN solo. La eficiencia de transducción para todas las células T fue del 70 % . Las células T inactivadas con TC R a se purificaron usando kits de selección magnética para células CD3 positivas (Miltenyi); las células T inactivadas con dCK se purificaron por expansión en presencia de clofarabina 0.5 pM. Las células se cultivaron durante 14 a 17 días y luego se crioconservaron en 90 % de F C S /10 % de DMSO. Para la inyección de células T, las células T se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 que contenía Hepes 25 mM. Para el tratamiento, se inyectaron células T en 0.2 ml de RPMI 1640 con Hepes 25 mM en la vena de la cola de animales con tumor.

Para el modelo de tumor de ratón, se inyectó a los animales células tumorales MM1.S/dCK KO. Los ratones fueron tratados con 2.5x106 células CA R -T específicas de BCMA el día 18 después de la implantación de las células tumorales. Se usó como control una dosis equivalente de células T no transducidas que recibieron TC R a y dCK TALEN. Los animales fueron tratados con clofarabina o vehículo durante cinco días después de la inyección de células T.

Resultados: el grupo tratado con células T control mostró un crecimiento tumoral progresivo hasta que se alcanzó el punto final del estudio en el día 35 (Tabla 13, Grupo 1). En comparación con el control, los grupos tratados con células TC R a extraídas de BCMA específicas del vehículo y vehículo mostraron una disminución significativa en la carga tumoral (p<0.05) que disminuyó con la administración conjunta de clofarabina (p<0.05) (Tabla 13, Grupos 2 y 3). La carga tumoral se redujo significativamente en los animales tratados con las células CA R -T de doble desactivación TCRa/dCK, independientemente de si los animales recibieron vehículo o clofarabina (p<0.05) (Tabla 13, Grupos 4 y 5). La reducción de la carga tumoral en los grupos que recibieron células T de doble desactivación de TCRa/dCK no difirió del grupo que recibió las células T de desactivación única de TC R a y el vehículo (p>01) (Tabla 13, Grupos 2, 4 y 5).

Estos resultados demuestran que los tratamientos con células BCMA CA R -T de doble desactivación TCRa/dCK son eficaces para inducir la regresión tumoral en presencia de terapias análogas a nucleósidos tales como fludarabina y clofarabina.

Tabla 13: Mediciones de bioluminiscencia tumoral del modelo de tumor ortotópico MM1.S resistente a la terapia de análogos de nucleósidos.

Grupo 1: Células T de control TCR a/dCK KO clofarabina

Días después de la administración de células T Flujo total medio (log 10 fotones/s) SEM N

Grupo 3: Células CA R -T específicas de TC R a KO BCMA clofarabina

Días después de la ad

Grupo 4: Células CA R -T específicas de TCRa/dCK KO BCMA vehículo

Días después de la ad

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico específico de antígeno de maduración de células B (BCMA) (CAR) que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un fragmento Fv de cadena única (scFv) que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región de determinación complementaria de VH 1 (VH CDR1), una región de determinación complementaria de VH 2 (VH CDR2) y una región de determinación complementaria de VH 3 (VH CDR3), en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 o 154; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y

una región variable de cadena liviana (VL) que comprende una región determinante complementaria VL 1 (VL C D R 1), una región determinante complementaria VL 2 (VL CDR2), y una región determinante complementaria VL 3 (VL CDR3), en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; la VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y la VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222;

(b) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 o 188; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 249; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225;

(c) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 o 166; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227;

(d) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151,156 , o 157; la VH CD R2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 o 162; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 251; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 252; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 253;

(e) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151,156 , o 157; la VH CD R2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190 o 191; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 262; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 252; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 263;

(f) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 o 169; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 272;

(g) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, 130 o 131; la VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 o 140; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; o

(h) una región VH que comprende una VH CD R 1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en donde la VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151,156 , o 157; la VH CD R2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158 o 159; y el VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; y

una región VL que comprende una VL CD R 1, una VL CDR2 y una VL CDR3, en donde la VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; la VL CD R 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y el VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225.

2. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 1, en donde la región VH comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 150, 151 o 152; una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 153 o 154; y una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 155; y una región variable de cadena liviana (VL) que comprende las siguientes CDR: una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 209; una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 221; y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 222.

3. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 1, en donde la región VH comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 151, 156 o 157; una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 158 o 159; y una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 155; y una región variable de cadena liviana (VL) que comprende las siguientes CDR: una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 209; una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 221; y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 225.

4. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 1, en donde la región VH comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 112 y la región VL comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 38.

5. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 1, en donde la región VH comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33 y la región VL comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34.

6. El CAR específico de BCMA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde:

(a) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización CD3Z y/o un dominio 4-1BB; y/o

(b) el primer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de cadena CD8a; y/o

(c) el (los) dominio(s) de unión al ligando extracelular, el primer dominio transmembrana y el (los) dominio(s) de señalización intracelular están en un único polipéptido.

7. El CAR específico de BCMA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además:

(a) un segundo dominio de señalización intracelular; opcionalmente, el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB; y/o

(b) un dominio de tallo entre el dominio de unión a ligando extracelular y el primer dominio transmembrana; opcionalmente, el dominio de tallo se selecciona del grupo que consiste en: una bisagra humana CD8a, una bisagra IgG1 y una bisagra FcYRIIIa; y/o

(c) un epítopo CD20; opcionalmente, el epítopo CD20 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 397 o SEQ ID NO: 398; y opcionalmente el CAR específico de BCMA comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 396; y/o

(d) otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico para BCMA.

8. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el CAR específico de BCMA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

10. Una célula inmunitaria manipulada que expresa en su membrana de la superficie celular un CAR específico de BCMA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 10,

(a) que comprende además otro CAR que no es específico para BCMA; y/o

(b) que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido suicida; y/o

(c) que comprende además una alteración de uno o más genes endógenos, en donde el gen endógeno codifica TCRa, TCRp, CD52, receptor de glucocorticoides (GR), desoxicitidina quinasa (dCK), o una proteína de punto de control inmune tal como, por ejemplo, muerte programada-1 (PD-1); y/o

(d) en donde la célula inmune se obtiene de un donante sano.

12. La célula inmunitaria manipulada por manipulación genética de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 para su uso como medicamento.

13. La célula inmunitaria manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el medicamento es para usar en el tratamiento de un cáncer relacionado con células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin predominante de linfocitos nodulares, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma precursor de linfoblastos B, leucemia mieloide, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de Burkitt, linfoma primario de células B mediastínico primario (tímico), linfoma linfoplasmático, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de la zona marginal de células B, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma primario difuso cutáneo primario de células grandes B ), Linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma ALK positivo de células B grandes, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, el linfoma de células B sin clasificar con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con las células B.

14. Una composición farmacéutica que comprende la célula inmune modificada por manipulación genética de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11.

15. La célula inmunitaria manipulada genéticamente de las reivindicaciones 10 a 11 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para usar en la inhibición del crecimiento o progresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA, inhibiendo la metástasis de células malignas que expresan BCMA en un sujeto, o induciendo regresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA; opcionalmente en donde dicho uso comprende además administrar una terapia de análogos de nucleósidos, fludarabina o clofarabina al sujeto.

16. Un método in vitro de manipulación de una célula inmune que expresa un CAR específico de BCMA, que comprende:

a. proporcionar una célula inmune;

b. introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica el CAR específico de BCMA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

c. opcionalmente, introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica un CAR que no es específico para BCMA.1789

17. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 1, en donde el CAR específico de BCMA comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 344.

18. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 17, que comprende además un epítopo CD20.

19. El CAR específico de BCMA de la reivindicación 18, en donde el epítopo CD20 comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 397 o SEQ ID NO: 398.