ES3039918T3 - Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen - Google Patents

Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen

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ES3039918T3
ES3039918T3 ES20172811T ES20172811T ES3039918T3 ES 3039918 T3 ES3039918 T3 ES 3039918T3 ES 20172811 T ES20172811 T ES 20172811T ES 20172811 T ES20172811 T ES 20172811T ES 3039918 T3 ES3039918 T3 ES 3039918T3
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Barbra Johnson Sasu
Roman Galetto
Bijan Andre Boldajipour
Cesar Adolfo Sommer
Blarcom Thomas John Van
Thomas Charles Pertel
Arvind Rajpal
Philippe Duchateau
Alexandre Juillerat
Julien Valton
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PFIZER
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Abstract

La invención proporciona receptores de antígenos quiméricos (CAR) que se unen específicamente al BCMA (antígeno de maduración de linfocitos B). La invención también se refiere a células inmunitarias modificadas que comprenden dichos CAR, ácidos nucleicos que los codifican y métodos para producir dichos CAR, células inmunitarias modificadas y ácidos nucleicos. La invención también se refiere a métodos terapéuticos para el uso de estos CAR y células inmunitarias modificadas en el tratamiento de una afección asociada con células malignas que expresan BCMA (p. ej., cáncer). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígenos quiméricos que fijan como objetivo el antígeno de maduración de células B
La invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CARs son capaces de redirigir la especificidad y reactividad de las células inmunitarias hacia una diana seleccionada aprovechando las propiedades del dominio de unión al ligando. En particular, la invención se refiere a CARs que se unen específicamente al antígeno de maduración de células B (CARs específicos para BCMA). La invención se refiere, además, a polinucleótidos que codifican CAR específicos para BCMA y a células aisladas que expresan CARs específicos para BCMA en su superficie. La invención se refiere, además, a métodos para la modificación por ingeniería genética de células inmunitarias que expresan CARs específicos para BCMA en su superficie. La invención es particularmente útil para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia. La invención se refiere, además, a células inmunitarias que comprenden los CARs específicos para BCMA (células CAR-T específicas para BCMA), composiciones que comprenden las células CAR-T específicas para BCMA y métodos de utilizar las células CAR-T específicas para BCMA para el tratamiento de afecciones asociadas con células malignas que expresan BCMA (p. ej., cáncer).
ANTECEDENTES
El mieloma múltiple es una neoplasia maligna caracterizada por la acumulación de células plasmáticas clonales (véase, p. ej., Lonial et al., Clinical Cancer Res., 77(6): 1264-1277 (2011)). Las terapias actuales para el MM provocan a menudo remisiones, pero casi todos los pacientes finalmente recaen y fallecen (véase, p. ej., Rajkumar, Nature Rev. Clinical Oncol, 5(8): 479-491 (2011)).
La transferencia adoptiva de células T genéticamente modificadas para reconocer antígenos asociados con la neoplasia maligna es prometedora como un nuevo enfoque para tratar el cáncer (véase, p. ej., Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Las células T pueden modificarse genéticamente para expresar receptores de antígenos quiméricos (CARs), que son proteínas de fusión compuestas por un resto de reconocimiento de antígenos y dominios de activación de células T (véase, p. ej., Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), y Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)).
El antígeno de maduración de células B (BCMA, CD269 o TNFRSF17) es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR). El BCMA se identificó en un linfoma maligno de células T humanas que contiene una translocación t(4;16). El gen se expresa selectivamente en el linaje de células B, con la máxima expresión en plasmoblastos y células plasmáticas, células secretoras de anticuerpos. El BCMA se une a dos ligandos: el factor de activación de células B (BAFF) (también llamado estimulador de células B [BLyS] y ligando expresado en leucocitos relacionados con APOL [TALL-1]) y un ligando inductor de proliferación (APRlL), con afinidad de 1 pM y 16 nM, respectivamente. La unión de APRIL o BAFF a BCMA fomenta una cascada de señalización que implica a NF-kappa B, Elk-1, la quinasa N-terminal c-Jun y la proteína quinasa activada por mitógeno p38, las cuales producen señales para la supervivencia y proliferación celular. BCMA también se expresa en células B malignas y en varios cánceres que implican linfocitos B, incluyendo el mieloma múltiple, el plasmocitoma, el linfoma de Hodgkin y la leucemia linfocítica crónica. En enfermedades autoinmunes en el que están implicados plasmoblastos, tal como el lupus eritematoso sistémico (SLE) y la artritis reumatoide, las células productoras de anticuerpos que expresan BCMA secretan autoanticuerpos que se atacan a sí mismas.
En el caso del mieloma múltiple, aproximadamente 24.000 casos nuevos diagnosticados recientemente en los Estados Unidos cada año, y este número representa aproximadamente el 15 % de los cánceres hematológicos recién diagnosticados en los Estados Unidos. El mieloma múltiple causa un promedio de 11000 muertes cada año, y la tasa de supervivencia promedio a 5 años es de aproximadamente el 44 %, con una supervivencia mediana de 50-55 meses. El tratamiento actual para el mieloma múltiple se centra en la apoptosis de las células plasmáticas y/o la disminución de la actividad osteoclástica (p. ej., quimioterapia, talidomida, lenalidomida, bifosfonatos y/o inhibidores del proteasoma tales como bortezomib (VELCADe®) o carfilzomib). Sin embargo, el mieloma múltiple sigue siendo una enfermedad incurable, y casi todos los pacientes han desarrollado resistencia a estos agentes y, finalmente, han recaído. Por consiguiente, un tratamiento alternativo para el mieloma múltiple, tal como el uso de un antagonista anti-BCMA que incluya CARs específicos para BCMA y células CAR-T específicas para BCMA, sería un agente terapéutico superior.
El documento WO 2013/154760 informa sobre un ácido nucleico aislado y purificado que codifica un CAR dirigido contra BCMA, así como células huésped y métodos para destruir células de mieloma múltiple.
Sumario
La materia objeto de la invención queda definido por las reivindicaciones adjuntas.
Se proporcionan receptores de antígenos quiméricos (CARs) que se unen al BCMA. Se demuestra que determinados CARs específicos para BCMA son eficaces, al expresarse en células T, para activar las células T al entrar en contacto con el BCMA. Ventajosamente, los CARs específicos para BCMA proporcionados en esta memoria se unen a BCMA de humanos y monos cinomolgos. También ventajosamente, las células CAR-T específicas para BCMA que se proporcionan en esta memoria presentan actividad de desgranulación, producción incrementada de interferón gamma y/o actividad citotóxica al entrar en contacto con células que expresan BCMA.
En un aspecto, un CAR específico para BCMA comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio de unión a ligando extracelular comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de la complementariedad (CDR1) de VH que comprende la secuencia SYX<1>MX<2>, en donde X<1>es A o P; y X<2>es T, N o S (SEQ ID NO: 301), GFTFX<1>SY, en donde X<1>es G o S (SEQ ID NO: 302), o GFTFX<1>SYX<2>MX<3>, en donde X<1>es G o S, X<2>es A o P; y X<3>es T, N o S (SEQ ID NO: 303); (ii) una<c>D<r>2 de VH que comprende la secuencia AX<1>X<2>X<3>X<4>GX<5>X<6>X<7>X<8>YADX<9>X<10>KG, en donde X<1>es I, V, T, H, L, A C; X<2>es S, D, G, T, I, L, F, M o V; X<3>es G, Y, L, H, D, A, S o M; X<4>es S, Q, T, A, F o W; X<5>es G o T; X6 es N, S, P, Y, W o F; X<7>es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C; X8 es F, Y, P, W, H o G; X<9>es V, R o L; y X<10>es G o T (SEQ ID NO: 305), o X<1>X<2>X<3>X<4>X<5>X<6>, en donde X<1>es S, V, I, D, G, T, L, F o M; X<2>es G, Y, L, H, D, A, S o M; X<3>es S, G, F o W; X<4>es G o S; X<5>es G o T; y X6 es N, S, P, Y o W (SEQ ID NO: 306); y iii) una CDR3 de VH que comprende la secuencia VSPIX<1>X<2>X<3>X<4>, en donde X<1>es A o Y; X<2>es A o S; y X<3>es G, Q, L, P o E (SEQ ID NO: 307), o YWPMX<1>X<2>, en donde X<1>es D, S, T o A; y X<2>es I, S, L, P o D (SEQ ID NO: 308); y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia X<1>X<2>X<3>X<4>X<5>X<6>X<7>X<8>X<9>X<10>X<11>X<12>, en donde X<1>es R, G, W, A o C; X<2>es A, P, G, L, C o S; X<3>es S, G o R; X<4>es Q, C, E, V o I; X<5>es S, L, P, G, A, R o D; X6 es V, G o I; X<7>es S, E, D o P; X<3>es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y; X<9>es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H o R; X<10>es Y o F; X<11>es L, W o P; y X<12>es A, S o G (SEQ ID NO: 309); (ii) una CDR<2>de VL que comprende la secuencia X<1>ASX<2>RAX<3>, en donde X<1>es G o D; X<2>es S o I; y X<3>es T o P (S<e>Q ID NO: 310); y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia QQYX<1>X<2>X<3>PX<4>T, en donde X<1>es G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R o Y; X<2>es S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K o C; X<3>es W, F o S; y X<4>es L o I (SEQ ID NO: 311), o QQYX<1>X<2>X<3>PX<4>, en donde X<1>es G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K o Y; X<2>es S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F o Y; X<3>es W, S o F; y X<4>es L o I (SEQ ID NO: 312).
En otro aspecto, un CAR específico para BCMA comprende un dominio de unión de ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende tres CDRs de la región VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33, 72, 39, 76, 83, 92, 25 u<8>; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDRs de la región VL mostrada en SEQ ID NO: 34, 73, 40, 77, 84, 93, 18 u 80. En algunas realizaciones, la región VH puede comprender la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33, 72, 39, 76, 83, 92, 25 u<8>, o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos conservativas en residuos que no están dentro de una CDR y/o la región VL puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, 73, 40, 77, 84, 93, 18 u 80, o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos en aminoácidos que no están dentro de una CDR.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad de VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150, 151, 152, 156, 157, 129, 130 o 131; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 153, 154, 187, 188, 165, 166, 162, 159, 190, 191,<1 6 9>, 154, 139, 140, 132 o 133; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 155, 161, 134 o 137; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 209, 249, 226, 251,<2 6 2>, 271,217 o 377; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 221,252 o 210; y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 222, 225, 227, 253, 263, 272, 216 o 214.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ I<d>NO: 150, 151 o 152; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 153 o 154; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 209; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 221, y (iii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO: 222.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ I<d>NO: 150, 151 o 152; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en 187 o 188; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 249; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 221, y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 225.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ Id NO: 150, 151 o 152; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 165 o 166; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 226; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 221, y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 227.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ Id NO: 156, 151 o 157; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 162 o 159; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 161; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 251; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 252, y (iii) una CDR3 de VL que comprende lasecuenciamostrada en SEQ ID NO: 253.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ Id NO: 156, 151 o 157; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 190 o 191; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 161; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 262; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 252, y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO: 263.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ Id NO: 150, 151 o 152; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 169 o 154; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 155; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 271; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 221, y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO: 272.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ Id NO: 129, 130 o 131; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 139 o 140; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 134; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 217; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 210, y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en SeQ ID NO: 216.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular de un CAR específico para BCMA proporcionado en esta memoria comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia mostrada en SEQ Id NO: 129, 130 o 131; (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia mostrada en 132 o 133; y (iii) una CD3 de VH que comprende la secuencia mostrada en 137; y/o (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 377; (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 210, y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia mostrada en SeQ ID NO: 214.
En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización CD3Z En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1BB. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender, además, otro dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular adicional puede comprender un dominio 4-1 BB.
En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un dominio de tallo entre el dominio de unión al ligando extracelular y el primer dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el dominio de tallo puede seleccionarse del grupo que consiste en: una bisagra CD8a humana, una bisagra IgG1 y una bisagra FcyRIiia.
En algunas realizaciones, el primer dominio transmembrana puede comprender un dominio transmembrana de cadena CD8a.
En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un epítopo CD20.
En algunas realizaciones, el CAR puede comprender otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico para BCMA.
En algunas realizaciones, el CAR específico para BCMA puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 396.
En algunas realizaciones de un CAR, los dominios de unión a ligando extracelular, el primer dominio transmembrana y los dominios de señalización intracelular están en un solo polipéptido.
En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un segundo dominio transmembrana, en donde el primer dominio transmembrana y el/los dominio(s) de unión a ligando extracelular se encuentran en un primer polipéptido, y en donde el segundo dominio transmembrana y el/los dominio(s) de señalización intracelular se encuentran en un segundo polipéptido, en donde el primer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de la cadena a del receptor de IgE de alta afinidad (FcsRI) y el segundo dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de la cadena<y>o p de FcsRI. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender un tercer polipéptido que comprende un tercer dominio transmembrana condensado a un dominio de señalización intracelular de una molécula co estimuladora, en donde el tercer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de la cadena y o p de FcsRI.
En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR específico para BCMA de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR específico para BCMA de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula inmunitaria modificada que expresa en su membrana celular un CAR específico para BCMA de la invención. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria modificada por ingeniería genética puede comprender otro CAR que no es específico para BCMA. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria modificada por ingeniería genética puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido suicida. En algunas realizaciones, el polipéptido suicida es RQR8.
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria puede derivarse de un linfocito T inflamatorio, un linfocito T citotóxico, un linfocito T regulador o un linfocito T auxiliar.
En algunas realizaciones, la célula inmune modificada por ingeniería genética puede comprender una interrupción de uno o más genes endógenos, en donde el gen endógeno codifica TCRa, TCRp, CD52, receptor de glucocorticoides (GR), desoxicitidina quinasa (DCK) o una proteína de punto de control inmune tal como, por ejemplo, muerte programada-1 (PD-1).
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria se obtiene de un donante sano. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria se obtiene de un paciente.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa en su membrana de superficie celular un CAR específico para BCMA para su uso como un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para uso en el tratamiento de un cáncer relacionado con células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B, leucemia mieloide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de la zona marginal, linfoma de tejido linfático asociado a mucosas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma primario mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma linfoplasmacéutico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de células B de la zona marginal, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con células B.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria que comprende: proporcionar una célula inmunitaria; y expresar en la superficie de la célula al menos un CAR específico para BCMA de la invención.
En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula inmunitaria; introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica dicho CAR específico para BCMA; y expresar dicho polinucleótido en la célula.
En algunas realizaciones, el método comprende proporcionar una célula inmunitaria; introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica dicho CAR específico para BCMA; e introducir al menos otro CAR que no es específico para BCMA.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar a un sujeto que padece una afección asociada con células malignas, comprendiendo el método: proporcionar una célula inmunitaria que expresa en la superficie un CAR específico para BCMA como se describe en esta memoria; y administrar dichas células inmunitarias a dicho paciente.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una afección asociada con células malignas que expresan BCMA en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la reivindicación que comprende una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética, como se describe en esta memoria. En algunas realizaciones, la afección es un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer relacionado con células B seleccionado del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B, leucemia mieloide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de la zona marginal, linfoma asociado a mucosas. linfoma de tejido linfático, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes del mediastino primario (tímico), linfoma linfoplasmacéutico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de células B de la zona marginal, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma ALK-positivo, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV<8>, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con células B.
En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir el crecimiento o la progresión de un tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA, que comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria diseñada como se describe en esta memoria.
En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la metástasis de células malignas que expresan BCMA en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se describe en esta memoria.
En otro aspecto, se proporciona un método para inducir la regresión de un tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA, que comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de una composición farmacéutica que comprende una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se describe en esta memoria.
En algunas realizaciones, cualquiera de los métodos anteriores comprende, además, administrar una o más terapias adicionales tales como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal y/o un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un inhibidor de puntos de control tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-LI. En algunas realizaciones, cualquiera de los métodos anteriores comprende, además, administrar al sujeto una terapia con análogos de nucleósidos tales como, por ejemplo, fludarabina o clofarabina.
Breve Descripción de los Dibujos
La FIG. 1 muestra un gráfico que resume los resultados del tratamiento con CAR-T específicas para BCMA en el modelo de tumor MM1.S.
La FIG. 2 muestra un gráfico que resume los resultados del tratamiento con CAR-T específicas para BCMA en el modelo de tumor Molp<8>.
Descripción Detallada
La invención descrita en esta memoria proporciona receptores de antígenos quiméricos (CARs) y células inmunitarias que comprenden CARs (células CAR-T) que se unen específicamente al BCMA (p. ej., BCMA humano). La invención también proporciona polinucleótidos que codifican estos CARs, composiciones que comprenden estas células CAR-T y métodos para producir y utilizar estos CARs y células CAR-T. La divulgación también proporciona métodos para tratar una afección asociada con la expresión maligna de BCMA en un sujeto tal como el cáncer.
Técnicas Generales
La práctica de la invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Técnicas de este tipo se explican enteramente en la bibliografía tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989), Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998), Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998), Plenum Press. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a
practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y
C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Definiciones
La expresión "dominio extracelular de unión a ligando", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un oligopéptido o polipéptido capaz de unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio será capaz de interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio extracelular de unión a ligando puede seleccionarse para reconocer un ligando que actúa como un marcador de la superficie celular en células diana asociadas con una enfermedad específica.
Las expresiones "dominio de tallo" y "dominio bisagra" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a cualquier oligopéptido o polipéptido que funciona para enlazar el dominio transmembrana con el dominio extracelular de unión al ligando. En particular, los dominios de tallo se utilizan para proporcionar mayor flexibilidad y accesibilidad al dominio extracelular de unión al ligando.
La expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada.
Una "molécula coestimulante", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere al participante en la unión cognada en una célula T que se une específicamente a un ligando co-estimulante, mediando con ello una respuesta co-estimulante de la célula tal como, pero no limitado a la proliferación. Moléculas co-estimulantes incluyen, pero no se limitan a una molécula MHC de clase I, BTLA y el receptor de ligando Toll. Moléculas co-estimulantes ejemplares incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocitaria 1 (LFA-1), CD2, CD7, L<i>GHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente a CD83, y similares.
Un "ligando co-estimulante" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula señal co-estimulante cognada en una célula T, proporcionando con ello una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media en una respuesta de célula T, incluyendo, pero no limitado a activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando co-estimulante puede incluir, pero no se limita a CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando co-estimulante inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (iCAM,<c>D30L,<c>D40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina p, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando co-estimulante también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula co-estimulante presente en una célula T, tal como, pero no limitada a CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocitaria 1 (LFA-1), CD2, CD7, LTg Ht , NkG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.
Un “anticuerpo” es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un carbohidrato, un polinucleótido, un lípido, un polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígenos, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se utiliza en esta memoria, el término abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv), anticuerpos de cadena sencilla (scFv) y de dominio (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélido), proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígenos. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o subclase de las mismas), y no es necesario que el anticuerpo pertenezca a cualquier clase específica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden subdividirse en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
La expresión “fragmento de unión al antígeno" o “porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno dado (p. ej., BCMA). Las funciones de unión al antígeno de un anticuerpo pueden ser desempeñadas por fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión que se engloban dentro de la expresión "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen Fab; Fab'; F(ab')<2>; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.
Un anticuerpo, un conjugado de anticuerpo o un polipéptido que “preferentemente se une” o “específicamente se une” (utilizados indistintamente en esta memoria) a una diana (p. ej., la proteína BCMA) es una expresión bien conocida en la técnica, y métodos para determinar una unión específica o preferencial de este tipo también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferencial" si reacciona o se asocia con mayor frecuencia, mayor rapidez, mayor duración y/o mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con otras células o sustancias. Un anticuerpo se "une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que si se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferencialmente a un epítopo BCMA es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otros epítopos BCMA o no BCMA. Al leer esta definición se entiende también que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específica o preferencialmente a una primera diana puede o no unirse específica o preferencialmente a una segunda diana. Como tal, la “unión específica” o la “unión preferencial” no requieren necesariamente (aunque pueden incluir) una unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión se refiere a una unión preferencial.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Como se sabe en la técnica, las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDRs de cada una de las cadenas se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FRs y, junto con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDRs: (1) un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol.
273:927-948). Tal como se utiliza en esta memoria, una CDR puede referirse a CDRs definidas mediante cualquiera de los dos enfoques o mediante una combinación de ambos.
Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácidos dentro de la región variable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación tanto de Kabat como de Chothia, AbM, contacto y/o definiciones conformacionales, o cualquier método de determinación de la CDR conocido en la técnica. Las CDRs de anticuerpos pueden identificarse como las regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat et al. Véase, p. ej., Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington D. C. Las posiciones de las CDRs también pueden identificarse como las estructuras de bucle estructural descritas originalmente por Chothia y otros. Véase, p. ej., Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989. Otros enfoques para la identificación de la CDR incluyen la "definición AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se deriva utilizando el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®), o la "definición de contacto" de CDRs basada en los contactos de antígeno observados, recogidos en MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. En otro enfoque, al que se alude en esta memoria como "definición conformacional" de CDRs, las posiciones de las CDRs pueden identificarse como los residuos que realizan contribuciones entálpicas a la unión del antígeno. Véase, p. ej., Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008. Aún otras definiciones de límite de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los enfoques anteriores, pero, no obstante, se superpondrán con al menos una parte de las CDRs de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los hallazgos experimentales de que residuos particulares o grupos de residuos o incluso CDRs completas no afectan significativamente la unión al antígeno. Tal como se utiliza en esta memoria, una CDR puede referirse a CDRs definidas mediante cualquier enfoque conocido en la técnica, incluyendo combinaciones de enfoques. Los métodos utilizados en esta memoria pueden utilizar CDRs definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para cualquier realización dada que contenga más de una CDR, las CDRs pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendidas, AbM, de contacto y/o conformacionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos, salvo por posibles mutaciones que se produzcan de forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada uno de los anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica que el anticuerpo se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no implica que se requiera la producción del anticuerpo mediante un método específico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la invención pueden obtenerse mediante el método del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler y Milstein (Nature 256:495, 1975), o pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante, como los descritos en la patente de EE.UU. N° 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de fagotecas generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990, por ejemplo.
Tal como se utiliza en esta memoria, anticuerpo “humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab<' )2>u otras subsecuencias de unión a antígenos de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede contener residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá prácticamente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR corresponden a las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Óptimamente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región o dominio constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente el de una inmunoglobulina humana. Se prefieren los anticuerpos con regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 o CDR H3) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, también denominadas una o más CDR "derivadas de" una o más CDRs del anticuerpo original.
Tal como se utiliza en esta memoria, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo, cuya secuencia de aminoácidos corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha obtenido mediante cualquiera de las técnicas de obtención de anticuerpos humanos conocidas por los expertos en la materia o descritas en esta memoria. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Un ejemplo de ello es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una fagoteca, en donde esa fagoteca expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581,1991). Los anticuerpos humanos también pueden producirse por inmunización de animales en los que se han introducido transgénicamente loci de inmunoglobulina humana en lugar de los loci endógenos, p. ej., ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Este enfoque se describe en las patentes de EE.UU. N°s 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (linfocitos B de este tipo pueden recuperarse de un individuo o de la clonación de una sola célula del ADNc, o pueden haber sido inmunizadosin vitro).Véase, p. ej., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991; y la patente de EE.UU. N<2>5.750.373.
La expresión "anticuerpo quimérico" pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.
Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferiblemente relativamente cortas (p. ej.,<10 - 100>aminoácidos). La cadena puede ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede estar interrumpida por no aminoácidos. Los términos también abarcan una cadena de aminoácidos que ha sido modificada de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación tal como la conjugación con un componente marcador. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas.
Un “anticuerpo monovalente” comprende un antígeno por molécula (p. ej., IgG o Fab). En algunos casos, un anticuerpo monovalente puede tener más de un sitio de unión a antígeno, pero los sitios de unión son de diferentes antígenos.
Un “anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno por molécula (p. ej., IgG). En algunos casos, los dos sitios de unión tienen la misma especificidad antigénica. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos.
Un anticuerpo “biespecífico”, “específico dual” o “bifuncional” es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Los dos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico se unen a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma o en diferentes dianas proteicas.
Anticuerpos de la invención se pueden producir utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, p. ej., tecnologías recombinantes, tecnologías de expresión en fagos, tecnologías sintéticas o combinaciones de tecnologías de este tipo u otras tecnologías fácilmente conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 y Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40, 2007).
Como se conoce en la técnica, "polinucleótido" o "ácido nucleico", utilizados indistintamente en esta memoria, se refieren a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a una cadena mediante la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si están presentes, la modificación de la estructura del nucleótido puede realizarse antes o después del ensamblaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización tal como mediante la conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (p. ej., metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen restos colgantes tales como, por ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), las que tienen intercaladores (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), las que contienen quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), las que contienen alquilantes, las que tienen enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), así como formas no modificadas del o de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con grupos protectores estándares o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o puede conjugarse con soportes sólidos. Los grupos OH 5' y 3' terminales pueden fosforilarse o sustituirse con aminas o grupos orgánicos de recubrimiento de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándares. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa, generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa- o beta-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosas, azúcares de furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como el metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a realizaciones en las que el fosfato se sustituye con P(O)S("tioato"), P(S)S("ditioato"), (O)NR<2>, ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2("formacetal"), en que cada uno de los R o R' es independientemente H o alquilo (C1-20) sustituido o no sustituido, que opcionalmente contiene un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleótido tienen que ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se alude en esta memoria, incluyendo ARN y ADN.
Como se conoce en la técnica, una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación.
Tal como se utiliza en esta memoria, "sustancialmente puro" se refiere a un material que es al menos 50 % puro (es decir, está libre de contaminantes), más preferiblemente, al menos 90 % puro, más preferiblemente, al menos 95 % puro, aún más preferiblemente, al menos 98 % puro, y lo más preferiblemente, al menos 99 % puro.
Una "célula huésped" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido receptor de uno o más vectores para la incorporación de inserciones de polinucleótidos. Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico) a la célula progenitora original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con uno o más polinucleótidos de esta invención.
Tal como se utiliza en esta memoria, "célula inmunitaria" se refiere a una célula de origen hematopoyético funcionalmente implicada en el inicio y/o la ejecución de la respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa.
Tal como se conoce en la técnica, la expresión "región Fc" se utiliza para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Si bien los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define habitualmente como una región que se extiende desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta su extremo carboxilo. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU, como se indica en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos regiones constantes: CH2 y CH3.
Tal como se utiliza en la técnica, la expresión "receptor Fc" y el término "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases F<cy>RI, FcyRIl y FcyRII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores F<cy>RII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Los FcRs se analizan en Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976, y Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).
El término “competir”, tal como se utiliza en esta memoria con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o un fragmento (o porción) de unión al antígeno del mismo, se une a un epítopo de forma suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, de modo que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo cognado disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo, en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede ser, aunque no necesariamente, el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que el segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, en los casos en los que cada uno de los anticuerpos inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando cognado, ya sea en igual, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos “compiten de forma cruzada” entre sí por la unión de su(s) respectivo(s) epítopo(s). La invención abarca tanto los anticuerpos competidores como los que compiten de forma cruzada. Independientemente del mecanismo por el cual se produzca una competencia o competencia cruzada de este tipo (p. ej., impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común o porción del mismo), el experto en la materia apreciará, basándose en las enseñanzas proporcionadas en esta memoria, que anticuerpos competidores y/o que compiten de forma cruzada de este tipo están abarcados y pueden ser útiles para los métodos descritos en esta memoria.
Tal como se utiliza en esta memoria, "autólogo" significa que las células, una línea celular o una población de células utilizadas para tratar pacientes se originan de dicho paciente o de un donante compatible con el antígeno leucocitario humano (HLA).
Tal como se utiliza en esta memoria, "alogénico" significa que las células o la población de células utilizadas para tratar a los pacientes no provienen de dicho paciente, sino de un donante.
Tal como se utiliza en esta memoria, “tratamiento” se refiere a un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. A los efectos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: reducir la proliferación (o destrucción) de células neoplásicas o cancerosas, inhibir la metástasis de células neoplásicas, contraer o disminuir el tamaño de un tumor que expresa BCMA, remitir una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer), disminuir los síntomas de una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer), aumentar la calidad de vida de quienes padecen una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer), disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer), retrasar la progresión de una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer), curar una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer) y/o prolongar la supervivencia de pacientes con una enfermedad asociada a BCMA (p. ej., cáncer).
"Aliviar" significa disminuir o mejorar uno o más síntomas en comparación con la ausencia de la administración de un anticuerpo BCMA o un conjugado de anticuerpo BCMA. "Aliviar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.
Tal como se utiliza en esta memoria, una "dosis eficaz" o "cantidad eficaz" de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr uno o más resultados beneficiosos o deseados. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen la eliminación o reducción del riesgo, la disminución de la gravedad o el retraso de la aparición de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como la reducción de la incidencia o la mejoría de uno o más síntomas de diversas enfermedades o afecciones asociadas a BCMA (tales como, por ejemplo, el mieloma múltiple), la disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, la potenciación del efecto de otro medicamento y/o el retraso de la progresión de la enfermedad asociada a BCMA en los pacientes. Una dosis eficaz puede administrarse en una o más administraciones. A los efectos de esta invención, una dosis eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en combinación con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "dosis eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y un solo agente puede considerarse administrado en una cantidad eficaz si, en combinación con uno o más agentes adicionales, se puede o se logra un resultado deseable.
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, preferiblemente un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a animales de granja, animales de caza, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "vector" significa una construcción que es capaz de administrar, y preferiblemente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores plasmídicos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y determinadas células eucariotas tales como las células productoras.
Tal como se utiliza en esta memoria, "secuencia de control de la expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión está operativamente enlazada a la secuencia de ácido nucleico a transcribir.
Tal como se utiliza en esta memoria, "soporte farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, al combinarse con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve su actividad biológica y no reaccione con el sistema inmunitario del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a cualquiera de los soportes farmacéuticos estándares, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como la emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Diluyentes preferidos para la administración en aerosol o parenteral son la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución salina normal (al 0,9 %). Composiciones que contienen soportes de este tipo se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed., Mack Publishing, 2005).
El término "kon", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo a un antígeno.
El término "koff", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.
El término "K<d>", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno.
La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en esta memoria incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo , la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
Se entiende que siempre que en esta memoria se describan realizaciones con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
En los casos en los que aspectos o realizaciones de la invención se describen en términos de un grupo de Markush u otra agrupación de alternativas, la invención abarca no solo el grupo completo enumerado como un todo, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal, e incluso el grupo principal sin uno o más de los miembros del grupo. La invención también contempla la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reivindicada.
Salvo definición contraria, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que comúnmente entiende un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones, el término “comprenden”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Salvo que el contexto lo requiera, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.
En esta memoria se describen métodos y materiales ejemplares, aunque también se pueden utilizar en la práctica o las pruebas de la invención métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria. Los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no limitativos.
CARs específicos para BCMA y Métodos para su Producción
La invención proporciona CARs que se unen a BCMA (p. ej., BCMA humano (p. ej., SEQ ID NO: 354 o número de acceso: Q02223-2). CARs específicos para BCMA proporcionados en esta memoria incluyen CARs de cadena simple y CARs de múltiples cadenas. Los CARs tienen la capacidad de redirigir la especificidad y reactividad de las células T hacia BCMA de una manera no restringida por MHC, explotando las propiedades de unión al antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento del antígeno no restringido por MHC ofrece a las células T que expresan CARs la capacidad de reconocer un antígeno independientemente del procesamiento del antígeno, evitando así un mecanismo principal de escape del tumor.
En algunas realizaciones, los CARs descritos en esta memoria comprenden un dominio de unión a ligando extracelular (p. ej., un fragmento variable de cadena sencilla [scFv]), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular se encuentran en un solo polipéptido, es decir, en una cadena sencilla. También se proporcionan en esta memoria CARs de múltiples cadenas y polipéptidos. En algunas realizaciones, los CARs multicadenas comprenden: un primer polipéptido que comprende un dominio transmembrana y al menos un dominio de unión a ligando extracelular, y un segundo polipéptido que comprende un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular, en donde los polipéptidos se ensamblan juntos para formar un CAR de múltiples cadenas.
En algunas realizaciones, un CAR de múltiples cadenas específico para BCMA se basa en el receptor de alta afinidad para IgE (FcsRI). El FcsRI expresado en mastocitos y basófilos desencadena reacciones alérgicas. El FcsRI es un complejo tetramérico compuesto por una sola subunidad a, una sola subunidad p y dos subunidades y enlazadas por disulfuro. La subunidad a contiene el dominio de unión a IgE. Las subunidades p y y contienen ITAMs que median en la transducción de señales. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de la cadena FcRa se elimina y se reemplaza por un dominio de unión a ligando extracelular específico para BCMA. En algunas realizaciones, el CAR de múltiples cadenas específico para BCMA comprende un scFv que se une específicamente a BCMA, la bisagra CD8a y el ITAM de la cadena FcRp. En algunas realizaciones, el CAR puede o no comprender la cadena F<c>R<y>.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular comprende un scFv que comprende la región variable de la cadena ligera (VL) y la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal específico para el antígeno diana, unidas mediante un enlazador flexible. Fragmentos de la región variable de cadena sencilla se generan mediante el enlace de las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada utilizando un péptido de enlace corto (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Un ejemplo de un péptido de enlace es el enlazador GS que tiene la secuencia de aminoácidos (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 333), que puentea aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi de una región variable y el extremo amino de la otra región variable. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird et al., 1988, supra). En general, los enlazadores pueden ser polipéptidos cortos y flexibles, preferiblemente compuestos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos o menos. Los enlazadores pueden, a su vez, modificarse para funciones adicionales tales como la unión de fármacos o la unión a soportes sólidos. Las variantes de cadena sencilla pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir un plásmido adecuado que contenga el polinucleótido que codifica el scFv en una célula huésped adecuada, ya sea eucariota, tal como células de levadura, vegetales, insectos o mamíferos, o procariota tal como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden obtenerse mediante manipulaciones rutinarias tal como la ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse mediante técnicas estándares de purificación de proteínas conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular comprende (a) una región VH que comprende (i) una región determinante de la complementariedad uno (CDR1) de VH que comprende la secuencia SYX1MX2, en donde X1 es A o P; y X2 es T, N o S (SEQ ID NO: 301), GFTFX1SY, en donde X1 es G o S (SEQ ID NO: 302), o GFTFX1SYX2MX3, en donde X1 es G o S, X2 es A o P; y X3 es T, N o S (SEQ ID NO: 303); (ii) una CDR2 de VH que comprende la secuencia AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG, en donde X1 es I, V, T, H, L, A o C; X2 es S, D, G, T, I, L, F, M o V; X3 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X4 es S, Q, T, A, F o W; X5 es G o T; X<6>es N, S, P, Y, W o F; X7 es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C; X<8>es F, Y, P, W, H o G; X9 es V, R o L; y X10 es G o T (SEQ ID NO: 305), o X1X2X3X4X5X6, en donde X1 es S, V, I, D, G, T, L, F o M; X2 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X3 es S, G, F o W; X4 es G o S; X 5 es G o T; y X<6>es N, S, P, Y o W (SEQ ID n O: 306); y iii) una CDR<3>de v H que comprende la secuencia VSPIX1X2X3X4, en donde X1 es A o Y; X2 es A o S; y X3 es G, Q, L, P o E (SEQ ID NO: 307), o YWPMX1X2, en donde X1 es D, S, T o A; y X2 es I, S, L, P o D (SEQ ID NO: 308); y una región VL que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12, en donde X1 es R, G, W, A o C; X2 es A, P, G, L, C o S; X3 es S, G o R; X4 es Q, C, E, V o I; X5 es S, L, P, G, A, R o D; X<6>es V, G o I; X7 es S, E, D o P; Xa es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y; X9 es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H o R; X10 es Y o F; X11 es L, W o P; y X12 es A, S o G (SEQ ID NO: 309); (ii) una CDR2 de VL que comprende la secuencia X1ASX2RAX3, en donde X1 es G o D; X2 es S o I; y X3 es T o P (SeQ ID NO: 310); y (iii) una CDR3 de VL que comprende la secuencia QQYX1X2X3PX4T, en donde Xi es G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R o Y; X2 es S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K o C; X3 es W, F o S; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 311), o QQYX1X2X3PX4, en donde X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K o Y; X2 es S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F o Y; X3 es W, S o F; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 312). En algunas realizaciones, la VH y la VL están enlazadas mediante un enlazador flexible. En algunas realizaciones, un enlazador flexible comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 333.
En otro aspecto, se proporciona un CAR que se une específicamente a BCMA, en donde el CAR comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende: una región VH que comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH de la secuencia VH mostrada en SEQ ID NO: 2, 3, 7,<8>, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64,<6 6>,<6 8>, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 78, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 76, 118, 120, 122, 112, 125, 127, 313 o 314; y/o una región VL que comprende CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL de la secuencia VL mostrada en SEQ ID NO: 1,4, 5,<6>, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41,43, 45, 47, 49, 51,53, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 317, 81,82, 84, 85,<8 6>,<8 8>, 89, 90, 91,93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315 o 316. En algunas realizaciones, la VH y la VL están enlazadas mediante un enlazador flexible. En algunas realizaciones, un enlazador flexible comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 333.
En algunas realizaciones, un CAR comprende un dominio de unión a ligando extracelular que tiene una cualquiera de las secuencias de cadena ligera parciales que se enumeran en la Tabla 1 y/o cualquiera de las secuencias de cadena pesada parciales que se enumeran en la Tabla 1. En la Tabla 1, las secuencias subrayadas son secuencias CDR de acuerdo con Kabat y en negrita según Chothia, excepto las secuencias CDR2 de cadena pesada, la secuencia CDR de Chothia está subrayada y la secuencia CDR de Kabat está en negrita.
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En esta memoria se proporcionan también porciones de CDR de dominios de unión a ligando extracelular de CARs a BCMA (incluyendo CDRs de Chothia, Kabat y regiones contacto de CDR). La determinación de regiones de CDR que están dentro de la experiencia de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDRs pueden ser una combinación de la CDR de Kabat y de Chothia (también denominadas “ CDRs combinadas” o “CDRs extendidas”). En algunas realizaciones con más de una CDR, las CDRs pueden ser cualquier CDR de Kabat, de Chothia y de combinación, o una combinación de las mismas. La Tabla 2 proporciona ejemplos de secuencias de CDR proporcionadas en esta memoria.
Tabla 2
(continúa)
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También se contemplan modificaciones a los CARs y polipéptidos mostrados en la Tabla 1, incluyendo CARs funcionalmente equivalentes que tienen modificaciones que no afectan significativamente a sus propiedades y variantes que tienen actividad y/o afinidad potenciada o disminuida. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede mutarse para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión deseada a BCMA. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en esta memoria. Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de residuos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran perjudicialmente de forma significativa la actividad funcional, o que maduran (potencian) la afinidad del polipéptido por su ligando, o el uso de análogos químicos.
Inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varía de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de las secuencias de un solo o de múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo condensado a una etiqueta epitópica. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de una enzima o un polipéptido en el extremo N o C del anticuerpo, lo que aumenta la semivida del anticuerpo en la circulación sanguínea.
Variantes de sustituciones tiene al menos un residuo de aminoácido eliminado en la molécula de anticuerpo y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de la FR. Sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 2.1, bajo el encabezado "sustituciones conservativas". Si sustituciones de este tipo resultan en un cambio en la actividad biológica, se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 2.1, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y analizar los productos.
Tabla 2.1 Sustituciones de Aminoácidos
En algunas realizaciones, se proporciona un CAR que comprende un dominio de ligando extracelular que se une a BCMA y compite por la unión a BCMA con un CAR descrito en esta memoria, incluyendo P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01 L1.GDF/L3.NY/P6E01 L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4 6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26 A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09 C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04 COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11 o COMBO_Rd4_0.6nM_C29.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un CAR que se une específicamente a BCMA, en donde el CAR comprende una región VH que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33; y/o una región VL que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, se proporciona un CAR que se une específicamente a BCMA, en donde el CAR comprende una región VH con una secuencia mostrada en s Eq ID NO: 33, 72, 39, 76, 83, 92, 25 u 8; y/o una región VL con una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 34, 73, 40, 77, 84, 93, 18 u 80. En algunas realizaciones, también se proporcionan CARs que comprenden porciones CDR de anticuerpos contra BCMA basadas en regiones de contacto de CDR. Las regiones de contacto de CDR son regiones de un anticuerpo que le confieren especificidad por un antígeno. En general, las regiones de contacto de CDR incluyen las posiciones de los residuos en las CDRs y las zonas de Vernier, que están restringidas con el fin de mantener una estructura de bucle adecuada que permita al anticuerpo unirse a un antígeno específico. Véase, p. ej., Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007. La determinación de las regiones de contacto de CDR está dentro de la experiencia de la técnica.
La afinidad de unión (K<d>) del CAR específico para BCMA como se describe en esta memoria a BCMA (tal como BCMA humano (p. ej., (SEQ ID NO: 354) puede ser de aproximadamente 0,002 a aproximadamente 6500 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es de aproximadamente cualquiera de 6500 nm, 6000 nm, 5986 nm, 5567 nm, 5500 nm, 4500 nm, 4000 nm, 3500 nm, 3000 nm, 2500 nm, 2134 nm, 2000 nm, 1500 nm, 1000 nm, 750 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nM, 193 nM, 100 nM, 90 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nm, 18 nm, 17 nm, 16 nm, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5,5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,3 nM, 0,1 nM, 0,01 nM o 0,002 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente cualquiera de 6500 nm, 6000 nm, 5500 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM o 0,5 nM.
El dominio de señalización intracelular de un CAR de acuerdo con la invención es el responsable de la señalización intracelular tras la unión del dominio de unión a ligando extracelular a la diana, dando como resultado la activación de la célula inmunitaria y la respuesta inmunitaria. El dominio de señalización intracelular tiene la capacidad de activar al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o auxiliar, incluyendo la secreción de citocinas.
En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular para uso en un CAR puede ser las secuencias citoplasmáticas de, por ejemplo, sin limitación, el receptor de células T y co-receptores que actúan conjuntamente para iniciar la transducción de señales tras la unión al receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. Los dominios de señalización intracelular comprenden dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno y las que actúan de forma independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o co-estimulante. Secuencias de señalización citoplasmática primaria pueden comprender motivos de señalización conocidos como motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor de los ITAMs. Los ITAMs son motivos de señalización bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmática de una diversidad de receptores y que sirven como sitios de unión para las tirosina quinasas de la clase syk /zap70. Ejemplos de ITAM utilizados en la invención incluyen, a título no limitativo, los derivados de TCRZ , FcRy , FcRp, FcRe , CD3y, CD35, CD3<e>, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3Z, cuya secuencia de aminoácidos presenta al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, lo más preferiblemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 324. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR de la invención comprende un dominio de una molécula co-estimulante.
En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular de un CAR de la invención comprende una parte de una molécula co-estimulante seleccionada del grupo que consiste en el fragmento de 41BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ. ID NO: 323 y SEQ. ID NO: 327.
Los CAR se expresan en la membrana de la superficie de la célula. Por lo tanto, el CAR puede comprender un dominio transmembrana. Dominios transmembrana adecuados para un CAR descrito en esta memoria tienen la capacidad de (a) expresarse en la superficie de una célula, preferiblemente una célula inmunitaria tal como, por ejemplo, sin limitación, linfocitos o células asesinas naturales (NK), y (b) interactuar con el dominio de unión al ligando y el dominio de señalización intracelular para dirigir la respuesta celular de la célula inmunitaria contra una célula diana predefinida. El dominio transmembrana puede derivar de una fuente natural o sintética. El dominio transmembrana puede derivar de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitativos, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de células T tal como a, p,<y>o 5, un polipéptido que constituye el complejo CD3, p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena<y>del receptor de IL-2, o una cadena subunidad de los receptores Fc, en particular el receptor Fcy III o las proteínas CD. Alternativamente, el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender residuos predominantemente hidrófobos, tales como leucina y valina. En algunas realizaciones, dicho dominio transmembrana deriva de la cadena CD8a humana (p. ej., NP_001139345.1). El dominio transmembrana puede comprender, además, un dominio del tallo entre el dominio de unión al ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. Un dominio del tallo puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y, lo más preferiblemente, de 25 a 50 aminoácidos. La región del tallo puede derivar de moléculas naturales, ya sea en su totalidad o en parte, como la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de la región constante de un anticuerpo. Alternativamente, el dominio del tallo puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia del tallo natural, o puede ser una secuencia del tallo completamente sintética. En algunas realizaciones, dicho dominio del tallo es una parte de la cadena CD8a humana (p. ej., NP_001139345.1). En otra realización particular, dichos dominios transmembrana y bisagra comprenden una parte de la cadena CD8a humana, preferiblemente con al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 318. En algunas realizaciones, los CARs descritos en esta memoria pueden comprender un dominio de unión a ligando extracelular que se une específicamente a BCMA, los dominios bisagra y transmembrana humanos de CD8a, el dominio de señalización CD3Z y el dominio de señalización 4-1BB.
La Tabla 3 proporciona secuencias ejemplares de dominios que pueden utilizarse en los CARs descritos en esta memoria.
Tabla 3: Secuencias ejemplares de Componentes CAR
(continúa)
La regulación a la baja o mutación de antígenos diana se observa comúnmente en células cancerosas, creando variantes de escape por pérdida de de antígeno. Por lo tanto, para contrarrestar el escape tumoral y aumentar la especificidad de la célula inmunitaria hacia la diana, el CAR específico para BCMA puede comprender uno o más dominios de unión a ligando extracelulares adicionales para unirse simultáneamente a diferentes elementos de la diana, aumentando así la activación y la función de la célula inmunitaria. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana y, opcionalmente, pueden separarse mediante un enlazador. En algunas realizaciones, dichos diferentes dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR. En algunas realizaciones, la invención se refiere a una población de CARs, comprendiendo cada uno de los cuales un dominio de unión a ligando extracelular diferente. En particular, la invención se refiere a un método in vitro de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de la célula una población de CARs, cada uno de los cuales comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En otra realización particular, la invención se refiere a un método in vitro para la modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria, que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir en ella polinucleótidos que codifican polipéptidos que componen una población de CAR, comprendiendo cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulare. Por población de CARs se entiende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CARs, comprendiendo cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. Los diferentes dominios de unión a ligando extracelulares de acuerdo con la invención pueden unirse preferiblemente de forma simultánea a diferentes elementos de la diana, aumentando así la activación y la función de la célula inmunitaria. La invención también se refiere a una célula inmunitaria aislada que comprende una población de CARs, cada uno con diferentes dominios de unión a ligando extracelulares.
En otro aspecto, la divulgación proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los CARs y polipéptidos descritos en esta memoria. Los polinucleótidos pueden prepararse y expresarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de las células de la invención. En algunas realizaciones, la composición comprende una célula que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los CARs descritos en esta memoria. En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 367 y SEQ ID NO: 368 que figuran a continuación:
Región variable de la cadena pesada P5A
GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG ACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGATAGCGGCGGCA GCACCTACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACT ACTGTGCCANATACTGGCCCATGGACATCTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCT CCTCA (SEQ ID NO: 367)
Región variable de la cadena ligera P5A
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCAGGCGAAAGAGC CACCCTGTCCTGCAAAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCAGCTACCTGGCCTGGTATCA GCAAAAGCCCGGCCAGGCTCCCCGGCTGCTGATGTACGATGCCAGCATCAGAGCCA CCGGCATCCCCGACAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCA TCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCT GGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 368)
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 369 y SEQ ID NO: 370 que figuran a continuación:
Región variable de la cadena pesada P5AC1
GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG ACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGTAAAGGTTTGGAATGGGTTTCTGCTATTCTGTCGTCTGGTGGTTCT ACTTACTATGCCGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACCATTTCTAGAGACAACTCTAAGAA CACCTTGTACTTGCAAATGAACTCCTTGAGAGCTGAAGATACTGCTGTTTATTACTGTG CTAGATACTGGCCAATGGATATTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO: 369)
Región variable de la cadena ligera P5AC1
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCTGGTGAAAGAGCT ACTTTGTCTTGTAGAGGGGGTCAATCCGTTTCCTCTTCTTATTTGGCTTGGTATCAACA AAAACCAGGTCAAGCTCCAAGATTATTGATGTACGATGCTTCTATTAGAGCCACCGGT ATTCCAGATAGATTTTCTGGTTCTGGTTCCGGTACTGATTTCACTTTGACTATCTCTAGA TTGGAACCAGAAGATTTCGCTGTTTACTACTGTCAACAATATCAGTCTTGGCCATTGAC TTTTGGTCAAGGTACAAAGGTTGAAATCAAA (SEQ ID NO: 370)
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 371 y SEQ ID NO: 372 que figuran a continuación:
Región variable de la cadena pesadaPC1
GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG ACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACCCTATGAGCTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCGGAGGCTCTGGCGGCA GCACCTACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACT ACTGTGCCAGATACTGGCCCATGGACAGCTGGGGCCAGGGAACTTTGGTCACCGTCT CCTCA (SEQ ID NO: 371)
Región variable de la cadena ligeraPC1
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCAGGCGAAAGAGC CACCCTGTCCTGCAAAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCACATACCTGGCCTGGTATCA GCAAAAGCCCGGCCAGGCTCCCCGGCTGCTGATCTACGATGCCTCTTCTAGAGCCCC TGGCATCCCCGACAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACAGCACCAG CCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 372).
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 373 y SEQ ID NO: 374 que figuran a continuación:
Región variable de la cadena pesadaPC1C12
GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG ACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACCCTATGAGCTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGTAAAGGTTTGGAATGGGTTTCTGCTATTGGTGGTTCAGGTGGTTG GAGTTATTATGCCGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACCATTTCTAGAGACAACTCTAAGA ACACCTTGTACTTGCAAATGAACTCCTTGAGAGCTGAAGATACTGCTGTTTATTACTGT GCTAGATACTGGCCAATGGATTCTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO: 373)
Región variable de la cadena ligeraPC1C12 GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCTGGTGAAAGAGCT ACTTTGTCTTGTTGGTTGTCTCAATCTGTTTCCTCTACTTACTTGGCTTGGTATCAACAA AAACCAGGTCAAGCTCCAAGATTATTGATCTACGATGCTTCTTCTAGAGCACCAGGTAT
TCCAGATAGATTTTCTGGTTCTGGTTCCGGTACTGATTTCACTTTGACTATCTCTAGATT GGAACCAGAAGATTTCGCTGTTTACTACTGCCAACAATACTCTGAGTGGCCATTGACT TTTGGTCAAGGTACAAAGGTTGAAATCAAA (SEQ ID NO: 374).
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 375 y SEQ ID NO: 376 que figuran a continuación:
Región variable de la cadena pesadaCOM22
GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG ACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGTAAAGGTTTGGAATGGGTTTCTGCTATTTCTGATTCTGGTGGTTCT AGGTGGTATGCCGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACCATTTCTAGAGACAACTCTAAGA ACACCTTGTACTTGCAAATGAACTCCTTGAGAGCTGAAGATACTGCTGTTTATTACTGT ACGCGGTACTGGCCAATGGATATTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO: 375)
Región variable de la cadena ligeraCOM22
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCTGGTGAAAGAGCT ACTTTGTCTTGTTGGTTGTCTCAATCTGTTTCCTCTACTTACTTGGCTTGGTATCAACAA AAACCAGGTCAAGCTCCAAGATTATTGATCTACGATGCTTCTTCTAGAGCACCAGGTAT TCCAGATAGATTTTCTGGTTCTGGTTCCGGTACTGATTTCACTTTGACTATCTCTAGATT GG AACC AGAAG ATTTC GCTGTTTACTACTGC C AAC AATAC TCTGAGTGGC CATTGACT TTTGGTCAAGGTACAAAGGTTGAAATCAAA (SEQ ID NO: 376).
En esta memoria se describen con además vectores de expresión y la administración de composiciones de polinucleótidos.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para preparar cualquiera de los polinucleótidos descritos en esta memoria.
Polinucleótidos complementarios a cualquiera de secuencias de este tipo también quedan abarcados por la invención. Los polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla (codificante o antisentido) o de doble cadena y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNHn que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de una manera uno-a-uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no necesitan estar presentes dentro de un polinucleótido de la invención, y un polinucleótido puede estar enlazado a otras moléculas y/o materiales de soporte, aunque no es necesario.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una porción del mismo) o una variante de una secuencia de este tipo. Variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, deleciones o inserciones, de modo que la inmunorreactividad del polipéptido codificado no se vea disminuida en comparación con una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en esta memoria. Variantes exhiben preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 70 %, más preferiblemente de al menos aproximadamente el 80 %, aún más preferiblemente de al menos aproximadamente el 90 % y, lo más preferiblemente, de al menos aproximadamente el 95 % con una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo.
Se dice que dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en ambas secuencias es la misma al alinearse para lograr la máxima correspondencia, como se describe más adelante. Comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente mediante la comparación de las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente de 30 a aproximadamente 75, o de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que ambas secuencias estén óptimamente alineadas.
El alineamiento opcional de secuencias para comparación se puede realizar utilizando el programa Megalign en la suite de Lasergene del software Bioinformatics (DNASTAR, Inc. Madison, WI) utilizando parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol.
183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol.
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Preferiblemente, el “porcentaje de identidad de secuencia” se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en las ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, habitualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni deleciones) para lograr un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se encuentran bases de ácidos nucleicos o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Las variantes pueden también, o alternativamente, ser sustancialmente homologas aun gen nativo o a una porción o complemento del mismo. Polinucleótidos de este tipo son capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN que se produce de forma natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).
"Condiciones moderadamente rigurosas" adecuadas incluyen el prelavado en una solución de 5 X SSC, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50 °C-65 °C, 5 X s Sc , durante la noche; seguido de lavado dos veces a 65 °C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contenga SDS al 0,1 %.
Tal como se utiliza en esta memoria, "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" son aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50 % (v/v) de formamida con albúmina de suero bovino al 0,1 %/Ficoll al 0,1 % / polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50 % a 55 °C, seguido de un lavado de alta rigurosidad consistente en 0,1 x SSC con EDTA a 55 °C. El experto en la materia sabrá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para tener en cuenta factores tales como la longitud de la sonda, etc.
Por parte de un experto ordinario en la técnica se apreciará que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en esta memoria. Algunos de estos polinucleótidos portan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la invención contempla específicamente los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones. Además, se contemplan alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en esta memoria. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, aunque no necesariamente, tienen una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse mediante técnicas estándares (tales como hibridación, amplificación o comparación de secuencias en bases de datos).
Los polinucleótidos de esta invención se pueden obtener utilizando síntesis químicas, métodos recombinantes o la PCR. Métodos de la síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos en detalle en esta memoria. Un experto en la técnica puede utilizar las secuencias proporcionadas en esta memoria y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.
Para preparar polinucleótidos utilizando métodos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada se puede insertar en un vector adecuado, y el vector, a su vez, se puede introducir en una célula huésped adecuada para la replicación y amplificación como se describe adicionalmente en esta memoria. Los polinucleótidos se pueden insertar en células huésped mediante cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno mediante captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento por F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno se puede mantener dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrarse en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado se puede aislar de la célula huésped mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., 1989.
Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es bien conocida en la técnica y se describe en las patentes de EE.UU. N°s 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202, así como en PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
El ARN puede obtenerse utilizando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, éste puede aislarse utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, como se describe en Sambrook et al., 1989, supra, por ejemplo.
Vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándares o seleccionarse de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Si bien el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, podrán poseer una única diana para una endonucleasa de restricción específica y/o podrán portar genes para un marcador que pueda utilizarse en la selección de clones que contengan el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, p. ej., pUC18, pUC19, Bluescript (p. ej., pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, Ad N de fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales tales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
Los vectores de expresión son generalmente construcciones polinucleotídicas replicables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Se supone que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico. Vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a plásmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, cósmidos y los vectores de expresión descritos en la publicación PCT N° WO 87/04462. Generalmente, los componentes del vector pueden incluir, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control de la transcripción adecuados (tales como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), también se requieren habitualmente uno o más elementos de control de la traducción, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de inicio de la traducción y codones de terminación.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de un cierto número de medios apropiados, incluyendo la electroporación, la transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; el bombardeo con microproyectiles; la lipofección; y la infección (p. ej., en los casos en los que el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de los vectores o polinucleótidos para la introducción dependerá a menudo de las características de la célula huésped.
Un polinucleótido que codifica un CAR específico para BCMA descrito en esta memoria puede existir en un casete de expresión o vector de expresión (p. ej., un plásmido para su introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector de baculovirus, para la transfección de una célula huésped de insecto, o un plásmido o vector viral, como un lentivirus, para la transfección de una célula huésped de mamífero). En algunas realizaciones, un polinucleótido o vector puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica secuencias de omisión ribosomal tales como, por ejemplo, sin limitación, una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, identificados en el subgrupo Aphthovirus de picornavirus, provocan una “omisión” ribosomal de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase (Donnelly y Elliott, 2001; Atkins, Wills et al., 2007; Doronina, Wu et al., 2008)). Por "codón" se entienden tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena sentido de una molécula de ADN) que son traducidos por un ribosoma a un residuo de aminoácido. Por lo tanto, se pueden sintetizar dos polipéptidos a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNim cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptidos 2A que está en marco. Mecanismos de omisión ribosomal de este tipo son bien conocidos en la técnica y se sabe que son utilizados por varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un único ARN mensajero.
Para dirigir polipéptidos de transmembrana a la vía secretora de una célula huésped, en algunas realizaciones, ser proporciona una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia conductora, secuencia prepro o secuencia pre) en una secuencia de polinucleótidos o secuencia de vectores. La secuencia señal secretora está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico transmembrana; es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se posicionan para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la vía secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras están situadas comúnmente en el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal secretoras pueden estar situadas en otra parte de la secuencia de ácido nucleico de interés (véanse, p. ej., Welch et al., patente de EE.UU. N° 5.037.743; Holland et al., patente de EE.UU. N° 5.143.830). En algunas realizaciones, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 318 o 329. Los expertos en la técnica reconocerán que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible una variación considerable de la secuencia entre estas moléculas de polinucleótidos. En algunas realizaciones, las secuencias de ácidos nucleicos de la invención están optimizadas por codones para su expresión en células de mamífero, preferiblemente para su expresión en células humanas. La optimización por codones se refiere al intercambio, en una secuencia de interés, de codones que generalmente son raros en genes altamente expresados de una especie dada que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de especies de este tipo, codificando este tipo de codones los aminoácidos que se intercambian.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de acuerdo con la invención comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1397. La invención se refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1397.
Métodos de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria
En esta memoria se proporcionan métodos de preparar células inmunitarias para uso en inmunoterapia. En algunas realizaciones, los métodos comprenden introducir un CAR de acuerdo con la invención en células inmunitarias y expandir las células. En algunas realizaciones, la invención se refiere a un método in vitro de modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria, que comprende proporcionar una célula y expresar en la superficie de la célula al menos un CAR, como se describe arriba. Métodos para la modificación por ingeniería genética de células inmunitarias se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente PCT N°s WO/2014/039523, WO/2014/184741, WO/2014/191128, WO/2014/184744 y WO/2014/184143. En algunas realizaciones, el método comprende: transfectar la célula con al menos un polinucleótido que codifica el CAR, como se describe arriba, y expresar los polinucleótidos en la célula.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos están presentes en vectores lentivirales para una expresión estable en las células.
En algunas realizaciones, el método puede comprender, además, una etapa de modificar genéticamente una célula mediante la inactivación de al menos un gen que expresa, por ejemplo, sin limitación, un componente del TCR, una diana para un agente inmunosupresor, un gen HLA y/o una proteína de punto de control inmunitario tal como, por ejemplo, PDCD1 o CTLA-4. Al inactivar un gen, se pretende que el gen de interés no se exprese en una forma proteica funcional. En algunas realizaciones, el gen a inactivar se selecciona del grupo que consiste, por ejemplo, sin limitación, en TCRa, TCRp, CD52, GR, PD-1 y CTLA-4. En algunas realizaciones, el método comprende inactivar uno o más genes mediante la introducción en las células de una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente un gen mediante la escisión selectiva del ADN. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser, por ejemplo, una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (nucleasa TALE) o una endonucleasa Cas9.
En algunas realizaciones, se utiliza un dominio catalítico adicional con una endonucleasa de corte raro para potenciar su capacidad de inactivar genes fijados como objetivo. Por ejemplo, un dominio catalítico adicional puede ser una enzima procesadora de extremos de ADN. Ejemplos no limitativos de enzimas procesadoras de extremos de ADN incluyen exonucleasas 5-3', exonucleasas 3-5', exonucleasas alcalinas 5-3', endonucleasas de colgajo 5', helicasas, fosfatasas, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de molde. Ejemplos no limitativos de dominio catalítico de este tipo comprenden un dominio proteico o un derivado catalíticamente activo del dominio proteico seleccionado del grupo que consiste en hExol (EXO1_HUMAN), Exol de Levadura (EXO1_YEAST), Exolde E. coli,TREX2 Humano, TREX1 de Ratón, TREX1 Humano, TREX1 Bovino, TREX1 de Rata, TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal), ADN2 Humano, ADN2 de Levadura (DNA2_YEAST). En algunas realizaciones, un dominio catalítico adicional puede tener una actividad exonucleasa 3'-5', y en algunas realizaciones, dicho dominio catalítico adicional es TREX, más preferiblemente el dominio catalítico TREX2 (documento WO2012/058458). En algunas realizaciones, dicho dominio catalítico es codificado por un polipéptido TREX de cadena sencilla. El dominio catalítico adicional puede estar condensado a una proteína de fusión de nucleasa o una proteína quimérica. En algunas realizaciones, el dominio catalítico adicional se condensa utilizando, por ejemplo, un enlazador peptídico.
En algunas realizaciones, el método comprende, además, una etapa de introducir en las células de un ácido nucleico exógeno que comprende al menos una secuencia homóloga a una porción de la secuencia del ácido nucleico diana, de modo que se produce una recombinación homóloga entre la secuencia del ácido nucleico diana y el ácido nucleico exógeno. En algunas realizaciones, dicho ácido nucleico exógeno comprende primera y segunda porciones que son homólogas a las regiones 5' y 3' de la secuencia del ácido nucleico diana, respectivamente. El ácido nucleico exógeno también puede comprender una tercera porción, situada entre la primera y la segunda porción, que no presenta homología con las regiones 5' y 3' de la secuencia del ácido nucleico diana. Tras la escisión de la secuencia del ácido nucleico diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre la secuencia del ácido nucleico diana y el ácido nucleico exógeno. En algunas realizaciones, se pueden utilizar secuencias homólogas de al menos aproximadamente 50 pb, más de aproximadamente 100 pb o más de aproximadamente 200 pb dentro de la matriz donante. El ácido nucleico exógeno puede ser, por ejemplo, sin limitación, de aproximadamente 200 pb a aproximadamente 6000 pb, más preferiblemente de aproximadamente 1000 pb A aproximadamente 2000 pb. Las homologías compartidas de ácidos nucleicos están situadas en regiones que flanquean aguas arriba y aguas abajo el sitio de la ruptura, y la secuencia de ácido nucleico que se ha de introducir se encuentra entre los dos brazos.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico comprende, sucesivamente, una primera región de homología con secuencias aguas arriba de dicha escisión, una secuencia para inactivar un gen fijado como objetivo, seleccionado del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, receptor de glucocorticoides (GR), desoxicitidina quinasa (DCK) y una proteína de punto de control inmunitario tal como, por ejemplo, la proteína de muerte programada 1 (PD-1); y una segunda región de homología con secuencias aguas abajo de la escisión. La introducción del polinucleótido puede ser simultánea, antes o después de la introducción o expresión de la endonucleasa de corte raro. Dependiendo de la ubicación de la secuencia de ácido nucleico diana donde se haya producido el evento de rotura, un ácido nucleico exógeno de este tipo puede utilizarse para inactivar un gen, p. ej., cuando el ácido nucleico exógeno se encuentra dentro del marco de lectura abierto del gen, o para introducir nuevas secuencias o genes de interés. Las inserciones de secuencias utilizando un ácido nucleico exógeno de este tipo pueden utilizarse para modificar un gen existente fijado como objetivo, mediante corrección o reemplazo del gen (intercambio de alelos como un ejemplo no limitante), o para regular positiva o negativamente la expresión del gen diana (intercambio de promotor, como un ejemplo no limitante), corrigiendo o reemplazando el gen fijado como objetivo. En algunas realizaciones, la inactivación de genes seleccionados del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteínas de punto de control inmunitario puede realizarse en una ubicación genómica precisa fijada como objetivo por una nucleasa TALE específica, en donde dicha nucleasa TALE específica cataliza una escisión y en donde el ácido nucleico exógeno comprende sucesivamente al menos una región de homología y una secuencia para inactivar un gen fijado como objetivo seleccionado del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteínas de punto de control inmunitario, que se integra mediante recombinación homóloga. En algunas realizaciones, varios genes pueden inactivarse, sucesivamente o al mismo tiempo, utilizando varias nucleasas TALE, respectivamente y fijando específicamente como objetivo un gen definido y varios polinucleótidos específicos para la inactivación de un gen específico.
En algunas realizaciones, el método comprende la inactivación de uno o más genes adicionales seleccionados del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteínas de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la inactivación de un gen puede lograrse introduciendo en las células al menos una endonucleasa de corte raro, de modo que ésta catalice específicamente la escisión en una secuencia fijada como objetivo del genoma de la célula y, opcionalmente, introduciendo en las células un ácido nucleico exógeno que comprende sucesivamente una primera región de homología con secuencias aguas arriba de la escisión, una secuencia a insertar en el genoma de la célula y una segunda región de homología con secuencias aguas abajo de la escisión; en donde el ácido nucleico exógeno introducido inactiva un gen e integra al menos una secuencia de polinucleótidos exógenos que codifica al menos una proteína recombinante de interés. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos exógenos está integrada dentro de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en TCRa, TCRp, CD52, GR, DCK y proteína de punto de control inmunitario.
En otro aspecto, una etapa de modificar genéticamente células puede comprender: modificar células T mediante inactivación de al menos un gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, y expandir las células, opcionalmente en presencia del agente inmunosupresor. Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la función inmunitaria mediante uno de varios mecanismos de acción. Un agente inmunosupresor puede disminuir la extensión y/o la voracidad de una respuesta inmunitaria. Ejemplos no limitativos de agentes inmunosupresores incluyen inhibidores de la calcineurina, dianas de la rapamicina, bloqueadores de la cadena a de la interleucina-2, inhibidores de la inosina monofosfato deshidrogenasa, inhibidores de la ácido dihidrofólico reductasa, corticosteroides y antimetabolitos inmunosupresores. Algunos inmunosupresores citotóxicos actúan inhibiendo la síntesis de ADN. Otros pueden actuar mediante la activación de células T o inhibiendo la activación de células auxiliares. Los métodos de acuerdo con la invención permiten conferir resistencia inmunosupresora a las células T para inmunoterapia mediante la inactivación de la diana del agente inmunosupresor en las células T. Como ejemplos no limitativos, las dianas para el agente inmunosupresor pueden ser un receptor para un agente inmunosupresor tal como, por ejemplo, sin limitación, CD52, el receptor de glucocorticoides (GR), miembros de los genes de la familia FKBP y miembros de los genes de la familia de la ciclofilina.
En algunas realizaciones, la modificación genética del método implica la expresión, en las células que se van a modificar por ingeniería genética, de una endonucleasa de corte raro, de modo que la endonucleasa de corte raro catalice específicamente la escisión en un gen fijado como objetivo, inactivándolo. En algunas realizaciones, un método de modificar por ingeniería genética células comprende al menos una de las siguientes etapas: proporcionar una célula T tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; seleccionar un gen en la célula T que exprese una diana para un agente inmunosupresor; introducir en la célula T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble cadena, el gen que codifica una diana para el agente inmunosupresor, y expandir las células, opcionalmente en presencia del agente inmunosupresor.
En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; seleccionar un gen en la célula T, en donde el gen expresa una diana para un agente inmunosupresor; transfectar la célula T con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble cadena, el gen que codifica una diana para el agente inmunosupresor, y expresar las endonucleasas de corte raro en las células T; y expandir las células, opcionalmente en presencia del agente inmunosupresor.
En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro fija específicamente como objetivo a CD52 o GR. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación codifica CD52, y el tratamiento inmunosupresor comprende un anticuerpo humanizado que fija como objetivo al antígeno CD52. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación codifica GR, y el tratamiento inmunosupresor comprende un corticosteroide tal como dexametasona. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación es un miembro del gen de la familia FKBP o una variante del mismo, y el tratamiento inmunosupresor comprende FK506, también conocido como tacrolimus o fujimicina. En algunas realizaciones, el miembro del gen de la familia FKBP es FKBP12 o una variante del mismo. En algunas realizaciones, el gen seleccionado para la inactivación es un miembro del gen de la familia ciclofilina o una variante del mismo, y el tratamiento inmunosupresor comprende ciclosporina.
En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser, por ejemplo, una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc o una nucleasa TALE (TALEN). En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.
También se proporcionan en esta memoria métodos de modificación por ingeniería genética de células T, adecuados para inmunoterapia, en donde los métodos comprenden: modificar genéticamente las células T mediante la inactivación de al menos una proteína de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la proteína de punto de control inmunitario es, por ejemplo, PD-1 y/o CTLA-4. En algunas realizaciones, los métodos de modificación genética de una célula comprenden: modificar las células T mediante la inactivación de al menos una proteína de punto de control inmunitario; y expandir las células. Las proteínas de punto de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a la muerte programada 1 (PD-1, también conocida como PDCD1 o CD279, número de acceso: NM_005018), el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, también conocido como CD152, número de acceso de GenBank AF414120.1), LAG3 (también conocido como CD223, número de acceso: NM_002286.5), Tim3 (también conocido como HAVCR2, número de acceso de GenBank: JX049979.1), BTLA (también conocido como<c>D272, número de acceso: NM_181780.3), BY55 (también conocido como CD160, número de acceso de GenBank: CR541888.1), TIGIT (también conocido como VSTM3, número de acceso: NM_173799), B7H5 (también conocido como C10orf54, homólogo del gen vista de ratón, número de acceso: NM_022153.1), LAIR1 (también conocido como CD305, número de acceso en GenBank: CR542051.1), SIGLEC10 (número de acceso en GenBank: AY358337.1), 2B4 (también conocido como CD244, número de acceso: NM_001166664.1), que inhiben directamente las células inmunitarias. Por ejemplo, CTLA-4 es una proteína de la superficie celular expresada en determinadas células T CD4+ y CD8+; al interactuar con sus ligandos (B7-1 y B7-2) en las células presentadoras de antígenos, se inhibe la activación de las células T y la función efectora.
En algunas realizaciones, dicho método para modificar por ingeniería genética células comprende al menos una de las siguientes etapas: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; introducir en la célula T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante la rotura de la doble cadena, un gen que codifica una proteína de punto de control inmunitario; y expandir las células. En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; transfectar dicha célula T con un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante la rotura de la doble cadena, un gen que codifica una proteína de punto de control inmunitario; expresar las endonucleasas de corte raro en las células T ; expandir las células. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro fija específicamente como objetivo un gen seleccionado del grupo que consiste en: PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCRa y TCRp. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc o una nucleasa TALE. En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.
En algunas realizaciones, la presente invención puede ser particularmente adecuada para la inmunoterapia alogénica. En realizaciones de este tipo, las células pueden modificarse mediante un método que comprende: inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR) en las células T; y expandir las células T. En algunas realizaciones, la modificación genética del método se basa en la expresión, en las células proporcionadas para modificar por ingeniería genética, de una endonucleasa de corte raro, de modo que la endonucleasa de corte raro catalice específicamente la escisión en un gen fijado como objetivo, inactivando el gen fijado como objetivo. En algunas realizaciones, dicho método para para modificar por ingeniería genética células comprende al menos una de las siguientes etapas: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; introducir en la célula T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble cadena, al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR), y expandir las células.
En algunas realizaciones, el método comprende: proporcionar una célula T, tal como de un cultivo celular o de una muestra de sangre; transfectar dicha célula T con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble cadena, al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR); expresar las endonucleasas de corte raro en las células T ; clasificar las células T transformadas, que no expresan TCR en su superficie celular; y expandir las células.
En algunas realizaciones, las endonucleasas de corte raro pueden ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc o una nucleasa TALE. En algunas realizaciones, las endonucleasas de corte raro es una nucleasa TALE. En algunas realizaciones, las endonucleasas TALE reconocen y escinden una secuencia que codifica TCRa o TCRp. En algunas realizaciones, una nucleasa TALE comprende una secuencia polipeptídica seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 o 341.
Secuencias polipeptídicas de la nucleasa TALE:
Repetición TRAC T01-L
LTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQA LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQWAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLT PEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCGAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPV LCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALE TVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASN IGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE QVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 334)
Repetición TRAC T01-R
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Repetición TRBC T01 -L LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQ ALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAI ASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHG LTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLLP VLCQAHGLTPEQWAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQAL ETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASN GGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE QWAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 336)
Repetición TRBC T01 -R
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E (SEQ ID NO: 337)
Repetición TRBC T02-L
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Repetición TRBC T02-R LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNNGGKQALETVQRLL PVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQA LETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIA SNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPV LCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALE TVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTP QQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQWAIASNGGGRPALE
(SEQ ID NO: 339)
Repetición CD52_T02-L
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340)
Repetición CD52_T02-R
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En otro aspecto, otra etapa de modificar genéticamente una célula puede ser un método de expandir células T deficientes en TCRa, que comprende introducir en la célula T pTa (también conocido como preTCRa) o una variante funcional del mismo, y expandir las células, opcionalmente mediante la estimulación del complejo CD3. En algunas realizaciones, el método comprende: a) transfectar las células con un ácido nucleico que codifica al menos un fragmento de pTa para favorecer la expresión en superficie de CD3; b) expresar dicho pTa en las células; y c) expandir las células, opcionalmente mediante la estimulación del complejo CD3.
También se proporcionan métodos de preparar células T para la inmunoterapia, que comprenden etapas del método de expansión para células T. En algunas realizaciones, la secuencia del polinucleótido pTa puede introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homóloga. En algunas realizaciones, la inserción puede asociarse con la inactivación del gen TCRa. Se pueden utilizar diferentes variantes funcionales de pTa. Una "variante funcional" del péptido se refiere a una molécula sustancialmente similar al péptido completo o a un fragmento del mismo. Un "fragmento" del pTa o de variante funcional del mismo se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, es decir, un péptido más corto que el pTa de longitud completa. En algunas realizaciones, el pTa o variantes funcionales pueden ser, por ejemplo, el pTa de longitud completa o una versión truncada del pTa en el extremo C. El pTa truncado en el extremo C carece de uno o más residuos. Como ejemplos no limitativos, la versión truncada de pTa en el extremo C carece de 18, 48, 62, 78, 92, 110 o 114 residuos del extremo C de la proteína. Variantes de la secuencia de aminoácidos del péptido pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN que codifica el péptido. Variantes funcionales de este tipo incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. También se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para obtener la construcción final, siempre que la construcción final posea la actividad deseada, en particular la restauración de un complejo CD3 funcional. En una realización preferida, se introduce al menos una mutación en las diferentes versiones de pTa, como se describe arriba, para afectar a la dimerización. A modo de ejemplo no limitativo, el residuo mutado puede ser al menos W46R, D22A, K24A, R102A o R117A de la proteína pTa humana, o posiciones alineadas utilizando el método CLUSTALW en la familia pTa o en un miembro homólogo. Preferiblemente, pTa o variantes del mismo, como se describe arriba, comprenden el residuo mutado W46R o los residuos mutados D22A, K24A, R102A y R117A. En algunas realizaciones, dicho pTa o variantes también se condensan a un dominio de transducción de señales, tales como CD28, OX40, ICOS, c D27, CD137 (4-1BB) y CD8, como ejemplos no limitativos. El dominio extracelular de pTa o variantes, como se describe arriba, puede condensarse a un fragmento de la proteína TCRa, en particular a los dominios transmembrana e intracelular de TCRa. Variantes de pTa también pueden condensarse al dominio intracelular de TCRa.
En algunas realizaciones, versiones de de pTa se pueden condensar a un dominio de unión a ligando extracelular. En algunas realizaciones, pTa o una variante funcional del mismo se condensa a un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende los fragmentos variables ligero y pesado de un anticuerpo monoclonal específico para el antígeno diana, unidos mediante un enlazador flexible.
La expresión “célula T deficiente en TCRa" se refiere a una célula T aislada que carece de la expresión de una cadena TCRa funcional. Esto puede lograrse por diferentes medios, como ejemplos no limitativos, modificando por ingeniería genética una célula T para que no exprese TCRa funcional alguna en su superficie celular o modificando por ingeniería genética una célula T para que produzca muy poca cadena TCRa funcional en su superficie o modificando por ingeniería genética una célula T para que exprese una forma mutada o truncada de la cadena TCRa. Las células deficientes en TCRa ya no pueden expandirse a través del complejo CD3. Por lo tanto, para superar este problema y permitir la proliferación de células deficientes en TCRa, se introduce pTa o una variante funcional de la misma en las células, restaurando así un complejo CD3 funcional. En algunas realizaciones, el método comprende, además, la introducción en dichas células T de endonucleasas de corte raro capaces de inactivar selectivamente, mediante escisión del ADN, un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR). En algunas realizaciones, la endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.
En otro aspecto, las células T modificadas por ingeniería genética, obtenidas mediante el método descrito en esta memoria, pueden ponerse en contacto con anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, las células T pueden ponerse en contacto con anticuerpos biespecíficos ex vivo antes de su administración a un paciente, o in vivo después de la administración a un paciente. Anticuerpos biespecíficos comprenden dos regiones variables con propiedades antigénicas distintas que facilitan la proximidad de las células modificadas por ingeniería genética a un antígeno diana. Como un ejemplo no limitativo, un anticuerpo biespecífico puede dirigirse contra un marcador tumoral y un antígeno linfocitario tal como, por ejemplo, sin limitación CD3, y tiene el potencial de redirigir y activar cualquier célula T circulante contra tumores.
En algunas realizaciones, polinucleótidos que codifican polipéptidos de acuerdo con la presente invención, pueden ser ARNm que se introduce directamente en las células, por ejemplo mediante electroporación. En algunas realizaciones, se puede utilizar la tecnología CytoPulse para permeabilizar transitoriamente las células vivas y administrar el material a las células. Los parámetros se pueden modificar con el fin de determinar las condiciones para una alta eficiencia de transfección con mínima mortalidad.
También se describen en esta memoria métodos para la transfección de células T. En algunas realizaciones, el método comprende: poner en contacto una célula T con ARN y aplicar a la célula T una secuencia de pulsos ágiles que consiste en: (a) un pulso eléctrico con una gama de tensiones de aproximadamente 2250 a 3000 V por centímetro; (b) una anchura de pulso de 0,1 ms; (c) un intervalo de pulso de aproximadamente 0,2 a 10 ms entre los pulsos eléctricos de las etapas (a) y (b); (d) un pulso eléctrico con una gama de tensiones de aproximadamente 2250 a 3000 V con una anchura de pulso de aproximadamente 100 ms y un intervalo de pulso de aproximadamente 100 ms entre el pulso eléctrico de la etapa (b) y el primer pulso eléctrico de la etapa (c); y (e) cuatro pulsos eléctricos con una tensión de aproximadamente 325 V con una anchura de pulso de aproximadamente 0,2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos eléctricos. En algunas realizaciones, un método para transfectar células T que comprende poner en contacto dichas células T con ARN y aplicar a las células T una secuencia de pulsos ágiles que comprende: (a) un pulso eléctrico con una tensión de aproximadamente 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 V por centímetro; (b) una anchura de pulso de 0,1 ms; (c) y un intervalo de pulso de aproximadamente 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ms entre los pulsos eléctricos de las etapas (a) y (b); (d) un pulso eléctrico con una gama de tensiones de aproximadamente 2250, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 V, con una anchura de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso eléctrico de la etapa (b) y el primer pulso eléctrico de la etapa (c); y (e) 4 pulsos eléctricos con una tensión de aproximadamente 325 V, con una anchura de pulso de aproximadamente 0,2 ms y un intervalo de pulso de aproximadamente 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos eléctricos. Cualquier valor incluido en el intervalo de valores arriba descrito se describe en la presente solicitud. El medio de electroporación puede ser cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el medio de electroporación tiene conductividad en un intervalo que abarca desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1,0 miliSiemens.
En algunas realizaciones, como ejemplos no limitativos, un ARN codifica una endonucleasa de corte raro, un monómero de la endonucleasa de corte raro tal como media nucleasa TALE, un CAR, al menos un componente del receptor de antígeno quimérico multi-cadenas, un pTa o variante funcional del mismo, un ácido nucleico exógeno y/o un dominio catalítico adicional.
Células inmunitarias modificadas por ingeniería genética
La invención también proporciona células inmunitarias modificadas por ingeniería genética que comprenden cualquiera de los polinucleótidos CAR de la invención.
En algunas realizaciones, un CAR se puede introducir en una célula inmunitaria como un transgén a través de un vector plasmídico. En algunas realizaciones, el vector plasmídico también puede contener, por ejemplo, un marcador de selección que proporciona la identificación y/o selección de células que recibieron el vector.
Polipéptidos CAR se pueden sintetizar in situ en la célula después de la introducción de polinucleótidos que codifican los polipéptidos CAR en la célula. Alternativamente, los polipéptidos CAR se pueden producir fuera de las células y luego introducir en las células. Métodos para introducir una construcción de polinucleótidos en células son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se pueden utilizar métodos de transformación estable para integrar la construcción de polinucleótidos en el genoma de la célula. En otras realizaciones, se pueden utilizar métodos de transformación transitoria para expresar transitoriamente la construcción de polinucleótidos, y la construcción de polinucleótidos no integrada en el genoma de la célula. En otras realizaciones, se pueden utilizar métodos mediados por virus. Los polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante cualquier medio adecuado tal como, por ejemplo, vectores virales recombinantes (p. ej., retrovirus, adenovirus), liposomas, y similares. Métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, sin limitación, la microinyección, la electroporación o el bombardeo de partículas. Los polinucleótidos pueden incluirse en vectores tales como, por ejemplo, vectores plasmídicos o vectores virales.
También se proporcionan en esta memoria células aisladas y líneas celulares obtenidas mediante los métodos de modificación por ingeniería genética de células arriba descritos. En algunas realizaciones, una célula aislada comprende al menos un CAR, como se describe arriba. En algunas realizaciones, una célula aislada comprende una población de CARs, comprendiendo cada uno de los CARs diferentes dominios de unión a ligando extracelulares..
También se proporcionan en esta memoria células inmunitarias aisladas, obtenidas de acuerdo con uno cualquiera de los métodos arriba descritos. Se puede utilizar cualquier célula inmunitaria capaz de expresar ADNs heterólogos con el fin de expresar el CAR de interés. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula T. En algunas realizaciones, una célula inmunitaria se puede derivar, por ejemplo, sin limitación, de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre de cordón umbilical, células progenitoras, células madre de la médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Células humanas representativas son las células CD34+. La célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica asesina, un mastocito, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En algunas realizaciones, la célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+.
Antes de la expansión y de la modificación genética, una fuente de células se puede obtener de un sujeto a través de una diversidad de métodos no limitativos. Células se pueden obtener de un cierto número de fuentes no limitativas, incluyendo células mononucleares de la sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un foco infeccioso, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En algunas realizaciones, se puede utilizar cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las células se pueden derivar de un donante sano, de un paciente con diagnóstico de cáncer o de un paciente con diagnóstico de infección. En algunas realizaciones, las células pueden formar parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas.
También se proporcionan en esta memoria líneas celulares obtenidas a partir de una célula T transformada de acuerdo con cualquiera de los métodos arriba descritos. También se proporcionan en esta memoria células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor. En algunas realizaciones, una célula aislada de acuerdo con la invención comprende un polinucleótido que codifica un CAR.
Las células inmunitarias de la invención se pueden activar y expandir, ya sea antes después de la modificación genética de las células T, utilizando métodos como se describen generalmente, por ejemplo, sin limitación en las patentes de EE.UU. 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro o in vivo. Generalmente, las células T de la invención pueden expandirse, por ejemplo, mediante el contacto con un agente que estimula un complejo CD3 TCR y una molécula co estimulante en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T. Por ejemplo, se pueden utilizar compuestos químicos como el ionóforo de calcio A23187, 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) o lectinas mitogénicas tales como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T.
En algunas realizaciones, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro mediante el contacto, por ejemplo, con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o con un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante el contacto con un activador de la proteína quinasa C (p. ej., briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la co-estimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones adecuadas para estimular la proliferación de las células T. Condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (p. ej., medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o X-vivo 5 (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (p. ej., suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp y<t>N<f>, o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a tensioactivo, plasmanato y agentes reductores, tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanoi. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos, piruvato sódico y vitaminas añadidos, ya sea sin suero o complementado con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Los antibióticos, tales como la penicilina y la estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para su crecimiento, por ejemplo, una temperatura (p. ej., 37 °C) y una atmósfera (p. ej., aire más 5 % de CO<2>) adecuadas. Las células T expuestas a diferentes tiempos de estimulación pueden exhibir características diferentes.
En algunas realizaciones, las células de la invención se pueden expandir medinate el co-cultivo con tejido o células. Las células también se pueden expandir in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto tras la administración de la célula al sujeto.
En algunas realizaciones, una célula aislada de acuerdo con la presente invención, comprende un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, Bt La , bY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRa y TCRp, y/o expresa un CAR, un CAR multi-cadenas y/o un transgén pTa. En algunas realizaciones, una célula aislada comprende polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden un CAR multicadenas. En algunas realizaciones, la célula aislada de acuerdo con la presente invención comprende dos genes inactivados seleccionados del grupo que consiste en: CD52 y GR, CD52 y TCRa, CDR52 y TCRp, GR y TCRa, GR y TCRp, TCRa y TCRp, PD-1 y TCRa, PD-1 y TCRp, CTLA-4 y TCRa, CTLA-4 y TCRp, LAG3 y TCRa, LAG3 y TCRp, Tim3 y TCRa, Tim3 y TCRp, BTLA y TCRa, BTLA y TCRp, BY55 y TCRa, BY55 y TCRp, TIGIT y TCRa, TIGIT y TCRp, B7H5 y TCRa, B7H5 y TCRp, LAIR1 y TCRa, LAIR1 y TCRp, SIGLEC10 y TCRa, SIGLEC10 y TCRp, 2B4 y TCRa, 2B4 y TCRp y/o expresa un CAR, un CAR multi-cadenas y un transgén pTa.
En algunas realizaciones, el TCR se vuelve no funcional en las células de acuerdo con la invención mediante la inactivación del gen TCRa y/o del o de los genes TCRp. En algunas realizaciones, se proporciona un método para obtener células modificadas derivadas de un individuo, en el que las células pueden proliferar independientemente de la vía de señalización del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las células modificadas, que pueden proliferar independientemente de la vía de señalización del MHC, susceptibles de obtenerse mediante este método, se incluyen en el alcance de la presente invención. Las células modificadas descritas en esta memoria pueden utilizarse para el tratamiento de pacientes que lo necesiten contra el rechazo del huésped contra el injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD); por lo tanto, en el alcance de la presente invención se incluye un método para el tratamiento de pacientes que lo necesiten contra el rechazo del huésped contra el injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), que comprende tratar a dicho paciente mediante la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de células modificadas que comprenden los genes TCRa y/o TCRp inactivados.
En algunas realizaciones, las células inmunitarias se modifican por ingeniería genética para ser resistentes a uno o más fármacos quimioterapéuticos. El fármaco quimioterapéutico puede ser, por ejemplo, un análogo de nucleótido de purina (PNA), lo que las hace adecuadas para el tratamiento del cáncer combinando inmunoterapia adoptiva y quimioterapia. PNAs ejemplares incluyen, por ejemplo, clofarabina, fludarabina y citarabina, solas o en combinación. Los PNAs son metabolizados por la desoxicitidina quinasa (dCK) en PNA monofosfato, difosfato y trifosfato. Sus formas trifosfato compiten con el ATP por la síntesis de ADN, actúan como agentes pro-apoptóticos y son potentes inhibidores de la ribonucleótido reductasa (RNR), que está implicada en la producción de trinucleótidos. En esta memoria se proporcionan células CAR-T específicas para BCMA que comprenden un gen dCK inactivado. En algunas realizaciones, las células dCK inactivadas se generan mediante la transfección de células T con polinucleótidos que codifican TAL-nucleasas específicas dirigidas contra genes dCK mediante, por ejemplo, electroporación de ARNm. Las células CAR-T específicas para BCMA dCK inactivadas son resistentes a los ANP, incluyendo, por ejemplo, la clorofarabina y/o la fludarabina, y mantienen la actividad citotóxica de las células T hacia las células que expresan BCMA.
En algunas realizaciones, células aisladas o líneas celulares de la invención pueden comprender un pTa o una variante funcional del mismo. En algunas realizaciones, una célula aislada o línea celular puede modificarse genéticamente de forma adicional mediante la inactivación del gen TCRa.
En algunas realizaciones, la célula CAR-T comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido suicida tal como, por ejemplo, RQR8. Véase, p. ej., el documento WO2013153391A. En las células CAR-T que comprenden el polinucleótido, el polipéptido suicida se expresa en la superficie de una célula CAR-T. En algunas realizaciones, el polipéptido suicida comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 342.
CPYSNPSLCSG G G G SELPTQ G TFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSG G G G SP APRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAG G AVHTRG LDFACDIYIW APLAG TCG VLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID NO: 342)
El polipéptido suicida también puede comprender un péptido señal en el extremo amino. En algunas realizaciones, el polipéptido suicida comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 400.
MGTSLLCW MALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTT ACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI W APLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID NO: 400)
Cuando el polipéptido suicida se expresa en la superficie de una célula CAR-T, la unión de rituximab a los epítopos R del polipéptido provoca la lisis de la célula. Más de una molécula de rituximab puede unirse por polipéptido expresado en la superficie celular. Cada uno de los epítopos R del polipéptido puede unirse a una molécula de rituximab independiente. La deleción de células CAR-T específicas para BCMA puede ocurrir in vivo, por ejemplo, al administrar rituximab a un paciente. La decisión de eliminar las células transferidas puede deberse a la detección de efectos indeseables en el paciente atribuibles a las células transferidas tales como, por ejemplo, la detección de niveles inaceptables de toxicidad.
En algunas realizaciones la célula CAR-T comprende un epítopo seleccionado dentro del scFv que tiene especificidad para ser reconocido por un anticuerpo específico. Véase, por ejemplo , la solicitud PCT “mAb DRIVEN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR SYSTEMS FOR SORTING/DEPLETING ENGINEERING IMMUNE CELLS”, presentada el 25 de enero de 2016. Un epítopo de este tipo facilita la clasificación y/o el agotamiento de las células CAR-T. El epítopo puede seleccionarse de cualquier número de epítopos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el epítopo puede ser una diana de un anticuerpo monoclonal aprobado para uso médico tal como, por ejemplo, sin limitación, el epítopo CD20 reconocido por rituximab. En algunas realizaciones, el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 397.
CPYSNPSLC (SEQ ID NO:: 397)
En algunas realizaciones, el epítopo está situado dentro del CAR. Por ejemplo, sin limitación, el epítopo puede estar situado entre el scFv y la bisagra de un CAR. En algunas realizaciones, dos casos del mismo epítopo, separadas por enlaces, se pueden utilizar en el CAR. Por ejemplo, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 398 se puede utilizar dentro de un CAR, situado entre la región variable de la cadena ligera y la bisagra.
GSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGS (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 398)
En algunas realizaciones, el anticuerpo específico para el epítopo puede conjugarse con un fármaco citotóxico. También es posible fomentar la citotoxicidad de CDC mediante utilizando anticuerpos modificados por ingeniería genética con componente(s) del sistema del complemento injertados. En algunas realizaciones, la activación de las células CAR-T puede modularse mediante el agotamiento de las células utilizando un anticuerpo que reconoce el epítopo.
Aplicaciones terapéuticas
Células aisladas obtenidas mediante los métodos arriba descritos,, o líneas celulares derivadas de células aisladas de este tipo, pueden utilizarse como un medicamento. En algunas realizaciones, un medicamento de este tipo puede utilizarse para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es neoplasia maligna de células plasmáticas de mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B, leucemia mieloide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de la zona marginal, linfoma de tejido linfático asociado a las mucosas, linfoma linfocítico de células pequeñas. linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma tímico (mediastínico) primario de células B grandes, linfoma linfoplasmatíico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de células B de la zona marginal, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en linfocitos T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y linfoma de Hodgkin clásico u otros linfomas relacionados con células B.
En algunas realizaciones, una célula aislada de acuerdo con la invención, o una línea celular derivada de las células aisladas, se puede utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita.
También se proporcionan en esta memoria métodos para el tratamiento de pacientes. En algunas realizaciones, el método comprende proporcionar una célula inmunitaria de la invención a un paciente que la necesite. En algunas realizaciones, el método comprende la etapa de administrar células inmunitarias transformadas de la invención a un paciente que la necesite.
En algunas realizaciones, las células T de la invención pueden experimentar una expansión robusta de células T in vivo y pueden persistir durante una cantidad prolongada de tiempo.
Métodos de tratamiento pueden ser aliviantes, curativos o profilácticos. El método puede formar parte de un tratamiento de inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. La invención es particularmente adecuada para la inmunoterapia alogénica. Células T de donantes pueden transformarse en células no alorreactivas utilizando protocolos estándares y pueden reproducirse según sea necesario, produciendo así células CAR-T que pueden administrarse a uno o varios pacientes. Una terapia con células CAR-T de este tipo puede estar disponible como un producto terapéutico “listo para usar”.
Células que se pueden utilizar con los métodos descritos se describen en la sección anterior. El tratamiento se puede utilizar para tratar pacientes a los que se ha diagnosticado, por ejemplo, cáncer. Cánceres que pueden tratarse incluyen, por ejemplo, sin limitación, cánceres que implican a los linfocitos B, incluyendo cualquiera de los cánceres arriba enumerados. Tipos de cáncer a tratar con los CAR y las células CAR-T de la invención incluyen, pero no se limitan a determinadas leucemias o neoplasias malignas linfoides. También se incluyen tumores/cánceres en adultos y pediátricos. En algunas realizaciones, el tratamiento puede combinarse con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con láser y radioterapia.
En algunas realizaciones, el tratamiento se puede administrar a pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la invención se basa preferiblemente en células o poblaciones de células que se han vuelto resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para un agente inmunosupresor de este tipo. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería facilitar la selección y expansión de las células T de la invención en el paciente. La administración de las células o poblaciones de células de la invención puede realizarse de cualquier manera conveniente, incluyendo inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en esta memoria pueden administrarse al paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa o intralinfática, o intraperitoneal. En una realización, las composiciones celulares de la invención se administran preferiblemente por inyección intravenosa.
En algunas realizaciones, la administración de las células o población de células puede comprender, por ejemplo, la administración de aproximadamente 104 a aproximadamente 10“ células por kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros del número de células dentro de esos intervalos. En algunas realizaciones, la administración de las células o población de células puede comprender la administración de aproximadamente 10“ a 10“ células por kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros del número de células dentro de dichos intervalos. Las células o población de células pueden administrarse en una o más dosis. En algunas realizaciones, dicha cantidad eficaz de células puede administrarse en una sola dosis. En algunas realizaciones, dicha cantidad eficaz de células puede administrarse en más de una dosis a lo largo de un período de tiempo. El momento de la administración queda a criterio del médico responsable y depende del estado clínico del paciente. Las células o población de células pueden obtenerse de cualquier fuente tal como un banco de sangre o un donante. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo de célula dado para una enfermedad o afección particular está dentro del ámbito de la técnica. Una cantidad eficaz se refiere a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente (si lo hay), la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. En algunas realizaciones, se administra una cantidad eficaz de células o una composición que comprende a esas células por vía parenteral. En algunas realizaciones, la administración puede ser intravenosa. En algunas realizaciones, la administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro del tumor.
En algunas realizaciones de la invención, las células se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan al tratamiento con agentes tales como terapia con anticuerpos monoclonales, antagonista de CCR2 (p. ej., INC-8761), terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con nataliziimab para pacientes con MS o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. En algunas realizaciones, se administran células CAR-T específicas para BCMA a un paciente junto con uno o más de los siguientes: un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., nivolumab, pembrolizumab o PF-06801591), un anticuerpo anti-PD-L1 (p. ej., avelumab, atezolizumab o durvalumab), un anticuerpo anti-OX40 (p. ej., PF-04518600), un anticuerpo anti-4-1 BB (p. ej., PF-05082566), un anticuerpo anti-MCSF (p. ej., p D-0360324), un anticuerpo anti-GITR y/o un anticuerpo anti-TIGIT. En algunas realizaciones, se administra a un paciente un CAR específico para BCMA que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 396 junto con el anticuerpo anti-PD-L1 avelumab. En otras realizaciones, las células T de la invención pueden utilizarse en combinación con quimioterapia, radioterapia, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas y/o radioterapia. Estos fármacos inhiben la calcineurina, una fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506), o la cinasa p70S6, que es importante para la señalización inducida por factores de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al., 1991; Liu, Albers et al., 1992; Bierer, Hollander et al., 1993). En una realización adicional, las composiciones celulares de la invención se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T utilizando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH.
En algunas realizaciones, las composiciones celulares de la invención se administran tras una terapia ablativa de células B, como agentes que reaccionan con CD20, p. ej., Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con quimioterapia de dosis alta seguida de un trasplante de células madre de la sangre periférica. En determinadas realizaciones, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la invención. En algunas realizaciones, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.
Kits
La invención también proporciona kits para uso en los presentes métodos. Los kits de la invención incluyen uno o más recipientes que contienen un polinucleótido que codifica un CAR específico para BCMA, o una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que comprende un polinucleótido que codifica un CAR específico para BCMA de la invención, e instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descritos en esta memoria. En general, estas instrucciones describen la administración de la célula inmunitaria modificada para los tratamientos terapéuticos arriba descritos.
Las instrucciones relativas al uso de las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética como se describen en esta memoria incluyen generalmente información en cuanto a la dosificación, al programa de dosificación y la vía de administración parta el tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (p .ej., envases multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención son típicamente instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (p. ej., una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables las instrucciones legibles por máquina (p. ej., las instrucciones contenidas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
Los kits de esta invención están en un envase adecuado. Envases adecuados incluyen, pero no se limitan a viales, botellas, frascos, envases flexibles (p. ej. bolsas selladas de Mylar o plástico), y similares. También se contemplan envases para uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (p. ej., un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo de la composición es un anticuerpo BCMA. El recipiente puede comprender, además, un segundo principio activo.
Los kits pueden proporcionar, opcionalmente, componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto adjunto o asociado al recipiente.
Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención de modo alguno. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en esta memoria, resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y se incluyen en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Materiales representativos de la presente invención se depositaron en American Type Culture Collection (ATCC) el 9 de febrero de 2016. El depósito biológico que tiene el N° de Acceso ATCC PTA-122834, es un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR específico para BCMA. El depósito se realizó conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento de Patentes y su Reglamento (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Pfizer, Inc. y la ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente de EE.UU. pertinente o al abrirse al público cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a alguien que el Comisionado de Patentes y Marcas de los EE.UU. determine que tiene derecho a ella de acuerdo con la Sección 122 del Título 35 del Código de los Estados Unidos y las Reglas del Comisionado de conformidad con ella (incluida la Sección 1.14 del Título 37 del Código de Reglamentos Federales, con especial referencia a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera cuando se cultiva en condiciones adecuadas, los materiales serán rápidamente reemplazados tras la notificación por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no constituye una licencia para poner en práctica la invención en contravención de los derechos otorgados por cualquier gobierno de conformidad con sus leyes de patentes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Determinación de la cinética y la afinidad de las interacciones BCMA/IgG humana a 25 °C y/o 37 °C
Este ejemplo determina la cinética y la afinidad de diversos anticuerpos anti-BCMA a 25 °C y 37 °C.
Todos los experimentos se realizaron en un biosensor de resonancia de plasmón de superficie Bio-Rad Proteon XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA). Se preparó una matriz de anticuerpos anti-BCMA utilizando un método de acoplamiento de aminas en un chip sensor GLC Bio-Rad, similar al descrito en Abdiche et al., Anal. Biochem. 411, 139-151 (2011). La temperatura de análisis para la inmovilización fue de 25 °C y el tampón de ejecución fue HBS-T+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05 %, pH 7,4). Los canales se activaron en la dirección del analito (horizontal) inyectando una mezcla de ECD 1 mM y NHS 0,25 mM durante 3 minutos a un caudal de 30 pL/min. Las IgG se inmovilizaron en las zonas activadas inyectándolas en dirección del ligando (vertical) a razón de 20 pg/mL en tampón acetato 10 mM, pH 4,5, durante 1,5 minutos a razón de 30 pg/mL. Las superficies activadas se bloquearon inyectando etanolamina 1 M, pH 8,5, en la dirección del analito durante 3 minutos a razón de 30 pL/min.
La temperatura de análisis para el análisis de unión a BCMA fue 37 °C o 25 °C en un tampón de ejecución de HBS-T+, complementado con 1 mg/mL de BSA. Se empleó un método de titulación cinética para el análisis de interacción, como se describe en Abdiche et al. El analito BCMA humano (huBCMA) o BCMA de mono cinomolgo (cyBCMA) se inyectó en la dirección del analito utilizando una serie de inyecciones de baja a alta concentración. Las concentraciones utilizadas fueron 0,08 nM, 0,4 nM, 2 nM, 10 nM y 50 nM (una serie de 5 miembros, con un factor de dilución de 5 veces y una concentración máxima de 50 nM). El tiempo de asociación para una dilución de analito dada fue de dos minutos. Inmediatamente después de la inyección de 50 nM de BCMA, se monitorizó la disociación durante 2 horas. Antes de las inyecciones de analito BCMA, se inyectó tampón 5 veces utilizando los mismos tiempos de asociación y disociación en los ciclos de analito BCMA para preparar un sensorgrama en blanco de tampón para fines de doble referencia (doble referencia como se describe en Myszka, J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999).
Los sensogramas se referenciaron por partida doble y se ajustaron a un modelo de titulación cinética deLangmuir con transporte de masa 1:1en el software BIAevaluation versión 4.1.1 (GE Lifesciences, Piscataway, NJ). Los parámetros cinéticos y de afinidad de diversos anticuerpos anti-BCMA de la invención se muestran en las Tablas 4A-4C. Los anticuerpos mostrados en las Tablas 4A-4C comparten las mismas regiones VH y VL que los CAR mostrados en la Tabla 1, que tienen el mismo nombre.
Tabla 4A
Tabla 4B
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Ejemplo 2: Células CAR-T específicas para BCMA
Este ejemplo demuestra la actividad funcional de células CAR-T específicas para BCMA contra células tumorales BCMA positivas (BCMA+).
Entre todas las moléculas CAR específicas para BCMA generadas, se seleccionaron ocho para realizar pruebas de actividad adicionales basadas en la afinidad con BCMA, la reactividad cruzada con BCMA humano y BCMA cino, y el epítopo. Las moléculas de CAR analizadas incluyeron: P5A, P5AC1, P5AC16, PC1, PC1C12, COM22, P6DY y P6A<p>. Se diseñaron tres arquitecturas diferentes: la versión 1 (v1) comprende una bisagra FcYRIIIa, la versión 2 (v2) comprende una bisagra CD8a y la versión 3 (v3) comprende una bisagra IgG1. Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) mostradas en la Tabla 5 se prepararon y utilizaron, y se evaluó su actividad de desgranulación hacia células BCMA+. La actividad de desgranulación se determinó mediante la expresión transitoria de cada CAR en células T humanas.
Tabla 5: CARs específicos para BCMA ejemplares
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Para los ensayos de actividad, se obtuvieron células T de trece donantes sanos (Donantes 1-13). Brevemente, las células T se purificaron a partir de muestras de capa leucocitaria y se activaron utilizando perlas de CD3/CD28. Las células se transfectaron transitoriamente con ARNm que codifican las diferentes moléculas CAR en los D11/12 después de la activación. La actividad de CAR se evaluó midiendo su capacidad de desgranulación, la liberación de interferón Y (IFNy) y la actividad citotóxica al co-cultivarse con (a) células que expresan BCMA (MM1S, KMS12BM y L363), o (b) células que no expresan la proteína BCMA (K562). También se incluyeron en cada uno de los ensayos células T transfectadas simuladas (células T en tampón) para determinar la actividad basal de las células T que no expresan un CAR.
La detección de CAR se realizó utilizando una proteína de fusión en la que el dominio extracelular de la proteína BCMA humana se condensó con un fragmento Fc derivado de IgG1 de ratón. La unión del CAR en la superficie celular con la porción BCMA de la proteína de fusión se detectó con un anticuerpo anti-Fc conjugado con PE y se analizó mediante citometría de flujo.
Materiales y métodos
Cultivos primarios de células T
Células T se purificaron a partir de muestras de capa leucocitaria proporcionadas por EFS (Etablissement Frangais du Sang, París, Francia) utilizando medio de densidad de gradiente Ficoll (Ficoll Paque PLUS / GE Healthcare Life Sciences). Se recuperó la capa de PBMC y se purificaron las células T utilizando un kit de enriquecimiento de células T disponible comercialmente (Stem Cell Technologies). Las células T purificadas se activaron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con 20 ng/mL de IL-2 humana (Miltenyi Biotech), suero humano al 5 % (Sera Laboratories) y activador de células T humanas Dynabeads CD3/CD28 en una relación perla:célula de 1:1 (Life Technologies). Tras la activación, las células se cultivaron y mantuvieron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con 20 ng/mL de IL-2 humana (Miltenyi Biotec) y suero humano al 5 % (Sera Laboratories).
Transfección de ARNm de CAR
Las transfecciones se realizaron el Día 4/5 o el Día 11/12 después de la purificación y activación de las células T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 pg de ARNm que codificaba las diferentes construcciones CAR. Los ARNm de CAR se produjeron utilizando el kit mMESSAGE. mMACHINE T7 (Life Technologies) y se purificaron utilizando columnas RNeasy Mini Spin (Qiagen). Las transfecciones se realizaron con tecnología Cytopulse PulseAgile™, aplicando dos pulsos de 0,1 mS a 3000 V/cm, seguidos de cuatro pulsos de 0,2 mS a 325 V/cm en cubetas con un hueco de 0,4 cm, con un volumen final de 200 pl de “Tampón de Citoporación T” (BTX Harvard Apparatus). Las células se diluyeron inmediatamente en medio X-Vivo™-15 (Lonza) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO<2>. Se añadió IL-2 (de Miltenyi Biotec) 2 h después de la electroporación a razón de 20 ng/ mL.
Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)
Células T se incubaron en placas de 96 pocillos (50.000 células/pocillo) junto con una cantidad igual de células que expresaban o no la proteína BCMA. Los co-cultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™15 (Lonza) durante 6 horas a 37 °C con 5 % de CO2. La tinción de CD107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo fluorescente anti-CD107a (conjugado con APC, de Miltenyi Biotec) al inicio del co-cultivo, junto con 1 pg/ml de anti-CD49d (BD Pharmingen), 1 pg/ml de anti-CD28 (Miltenyi Biotec) y una solución de monensina 1x (eBioscience). Tras un periodo de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable (eFluor 780, de eBioscience) y anti-CD8 conjugado con fluorocromo (conjugado con PE de Miltenyi Biotec) y se analizaron mediante citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el porcentaje de células CD8+/CD107a+ y mediante la determinación de la señal de intensidad de fluorescencia media (MFI) para la tinción de CD107a entre las células CD8+. Los ensayos de desgranulación se realizaron 24 h después de la transfección del ARNm. Los resultados se resumen en las Tablas 6A-9H y 9A-9C que figuran más adelante. En las tablas, la segunda columna (etiquetada como "célula CAR-T") indica el CAR específico para BCMA expresado en las células T transfectadas.
La expresión de CD107a en células es un marcador de activación específica para el antígeno. El porcentaje y la MFI de CD107a en células T CD8+ que expresan CAR específicas para BCMA aumentan al incubarse con células con expresión alta (H929), media (MM<1>S) y baja (KMS12BM, L363) de BCMA, pero no con células negativas para BCMA (K562 y Daudi) (Tablas 6A-9H y 9A-9C). Los niveles de expresión de CD107a no aumentaron en células T transfectadas simuladamente en contacto con BCMA. Por lo tanto, las células CAR-T específicas para BCMA se activan en presencia de células que expresan BCMA, pero no en presencia de células que no expresan BCMA.
Estos resultados demuestran que las células T que expresan CARs específicos para BCMA se activan cuando se incuban con células que expresan BCMA y que la activación es específica para el antígeno.
Ensayo de liberación de IFN v
Células T se incubaron en placas de 96 pocillos (50.000 células/pocillo) junto con (a) células que expresaban BCMA (MM1S, KMS12BM y L363) o (b) células que no expresaban la proteína BCMA (K562). Los co-cultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 24 horas a 37 °C con un 5 % de CO2. Tras este periodo de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes se recuperaron en una nueva placa. La detección de IFN<y>en los sobrenadantes del cultivo celular se realizó mediante un ensayo ELISA (kit ELISA Quantikine de IFN<y>humano, de R&D Systems). Los ensayos de liberación de IFN<y>se llevaron a cabo iniciando los co-cultivos celulares 24 h después de la transfección del ARNm. Los resultados se resumen en las Tablas 8A-8D y 10 que figuran más adelante.
Como se muestra en las Tablas 8A-8D y 10, células T CD8+ que expresan CARs específicos para BCMA producen IFNy al incubarse con células con expresión media de BCMA (MM1S) o con baja expresión de BCMA (KMS12BM, L363). Por el contrario, las células T CD8+ que expresan CARs específicos para BCMA producen una cantidad despreciable de IFNy al incubarse con células negativas para BCMA (K562).
Estos resultados demuestran que las células T que expresan CARs específicos para BCMA se activan cuando se incuban con células que expresan BCMA y que la activación es específica para el antígeno.
-Ensayo de citotoxicidad
Células T se incubaron en placas de 96 pocillos (100.000 células/pocillo) junto con 10.000 células diana (que expresaban BCMA) y 10.000 células de control (BCMAneg) en el mismo pocillo. Las células diana y de control se marcaron con colorantes intracelulares fluorescentes (CFSE o Cell Trace Violet, de Life Technologies) antes de co cultivarlas con células T CAR+. Los co-cultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C con 5 % de CO2. Después de este período de incubación, las células se marcaron con un colorante de viabilidad fijable (eFluor 780, de eBioscience) y se analizaron por citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada una de las poblaciones celulares (células diana o células de control BCMAneg) y se calculó el % de lisis celular específica. Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo 48 h después de la transfección del ARNm. Los resultados se resumen en las Tablas 7A-7H que figuran más adelante. En las tablas, los datos de citotoxicidad se muestran como porcentaje de células viables, y luego se calculan como la relación de células vivas positivas para BCMA/células vivas negativas para BCMA. La lisis celular se calcula como 100 células T transfectadas simuladamente.
Como se muestra en las Tablas 7A-7H, las células T que expresan CARs específicos para BCMA exhiben actividad destructora al incubarse con células con expresión media de BCMA (MM1S) o con baja expresión de BCMA (L363). Por el contrario, las células T CD8+ que expresan CARs específicos para BCMA no presentan actividad destructora al incubarse con células negativas para BCMA (K562).
En resumen, células T que expresan los CARs específicos para BCMA mostrados en la Tabla 5 se activan selectivamente al entrar en contacto con células que expresan BCMA. Si bien todas las versiones de los CARs específicos para BCMA exhibieron activación específica para BCMA, los CARs específicos para BCMA que comprenden una bisagra CD8a (v2) exhibieron niveles de activación mayores en comparación con los CARs específicos para BCMA con una bisagra FcYRIIIa (v1) o IgG1 (v3).
R esu ltados de l ensayo de desgranu lac ión , D onante 1
R esu ltados de l ensayo de desgranu lac ión , D onante 2
R esu ltados de l ensayo de desgranu lac ión , D onante 3
6D : R esu ltados de l ensayo de desgranu lac ión , D onante 4
ados de l ensayo de desgranu lac ión , D onante 5
(continúa)
Tabla 6F: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 6
(continúa)
Tabla 6G: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 7
(continúa)
(continúa)
Tabla 6H: Resultados del ensayo de desgranulación, Donante 8
(continúa)
Tabla 7A: Datos de Citotoxicidad, Donante 6
Tabla 7B: Datos de Citotoxicidad, Donante 6
(continúa)
Tabla 7C: Datos de Citotoxicidad, Donante 7
Tabla 7D: Datos de Citotoxicidad, Donante 7
T ab la 7E: Datos de C ito tox ic idad , Donante 8
Tabla 7F: Datos de Citotoxicidad, Donante 8
Tabla 7G: Datos de Citotoxicidad, Donante 9
Tabla 7H: Datos de Citotoxicidad, Donante 9
Tabla 8A: Producción de IFNv (oa/mL). Donante G
a b la 8B: P ro d u cc ió n de IFNy (pg /m L), D o na n te 7
Tabla 8C: Producción de IFNy (pg/mL), Donante 8
Tabla 8D: Producción de IFN-y (pg/ml_}_ Donante
R esu ltados Ensayos de D esgranu lac ión, D onante 10
T ab la 9B: R esu ltados Ensayos de D esgranu lac ión, D onante 11
Tabla 9C: Resultados Ensayos de Desgranulación, Donante 12
(continúa)
Tabla 10: Resultados ensayo liberación IFN gamma, Donante 10
(continúa)
Ejemplo 3: Células CAR-T específicas para BCMA inducen la regresión del tumor en el modelo de tumor MM1.S Este ejemplo ilustra el tratamiento de tumores con células CAR-T específicas para BCMA utilizando el modelo de tumor MM1.S.
Un estudio de eficaciain vivode células CAR-T específicas para BCMA se realizó con MM1.S, expresando luciferasa y GFP, modelo ortotópico. Cinco millones de células MM1.S Luc2AGFP se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales Nod/Scid/IL2Rg-/-(NSG) hembra de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 |<j>L por animal a razón de 15 mg/mL), seguida de anestesia con isoflurano y posterior formación de imágenes de bioluminiscencia corporal completa (BLI) permitió monitorizar la carga del tumor. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante formación de imágenes utilizando un aparato IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/s) utilizando un aparato Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, Ca ).
En este estudio se utilizaron tres células CAR-T específicas para BCMA: células T que expresan las construcciones CAR específicas para BCMA P5AC1-V2, PC1C12-V2 o COM22-V2 (véase la Tabla 5 anterior). Se utilizaron células T de control no transducidas como control negativo. Todas las células T se modificaron por ingeniería genética para ser deficientes en TCRa.
Cuando el flujo total alcanzó un promedio de 45E6 para todos los animales (día 20 después del implante del tumor), se aleatorizaron en cuatro grupos. Se administró una dosis única de células CAR-T humanas específicas para BCMA o de células T control no transducidas mediante inyección en bolo en la vena caudal. Los animales fueron sacrificados cuando exhibieron parálisis de las extremidades posteriores o una pérdida de peso corporal del 20 %, un criterio de valoración para los modelos ortotópicos MM1.S.
Los resultados de este estudio se resumen en la Figura 1. En la Figura 1, el flujo total [p/s] representa la progresión del tumor. El tratamiento con células CAR-T específicas para BCMA (triángulos, rombos, cuadrados) resultó en un flujo total menor en comparación con el control negativo (círculos). Por lo tanto, el tratamiento con células CAR-T específicas para BCMA inhibió la progresión del tumor en comparación con el control negativo.
Estos resultados demuestran que las células CAR-T específicas para BCMA son eficaces para inducir la regresión del tumor.
Ejemplo 4: Tratamiento del Mieloma Múltiple con células CAR-T específicas para BCMA
Este ejemplo ilustra el tratamiento del mieloma múltiple con células CAR-T específicas para BCMA utilizando el modelo ortotópico Molp8.
Se realizó un estudio de eficaciain vivode células CAR-T específicas para BCMA con Molp8, que expresa luciferasa y GFP, modelo ortotópico. Dos millones de células Molp8 Luc2AGFP se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena caudal en animales hembra NSG de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 pL por animal a razón de 15 mg/mL), seguida de anestesia con isoflurano y posterior formación de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo completo (BLI), permitió monitorizar la carga del tumor. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante formación de imágenes utilizando un aparato IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/s) utilizando un aparato Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA).
Cuando el flujo total alcanzó un promedio de 30E6 para todos los animales (día 8 después del implante del tumor), los animales fueron aleatorizados en tres grupos. A cada uno de los grupos se le administró una de las siguientes células: 1) células T no transducidas TCR KO ("TCR KO") utilizadas como control, 2) células CAR-T específicas para BCMA que expresan P5AC1-V2.1 ("P5AC1 V2 R2 TCR KO"), o 3) células Ca R-T específicas para BCMA que expresan P5AC1-V2 y el polipéptido suicida RQR8 ("P5AC1 V2<r>Q<r>8 TCR KO"). Todas las células 1 -3 son deficientes en TCRa. Las células CAR-T específicas para BCMA se prepararon como se describe en el ejemplo anterior. Las construcciones CAR específicas para BCMA P5AC1-V2.1 y P5AC1-V2 se muestran en la Tabla 5 anterior. Se administró una dosis única de 3 millones de células control (TCR KO) o células CAR-T específicas para BCMA (P5AC1 V2 R2 TCR KO o P5AC1 V2 RQR8 TCR KO) mediante inyección en bolo en la vena caudal. Los animales fueron sacrificados cuando perdieron más del 15 % de su peso corporal total, un criterio de valoración para los modelos ortotópicos Molp8.
Los resultados del estudio se resumen en la Figura 2. Una dosis única de 3 millones de células CAR-T específicas para BCMA PSAC1 R2 TCRKO (cuadrados) o células CAR-T específicas para BCMA PSAC1 RQR8 TCRKO (triángulos) resultó en un flujo total inferior desde los días 10-35 posteriores al implante del tumor, en comparación con el control negativo (círculos) (Figura 2). Por lo tanto, el tratamiento con células CAR-T específicas para BCMA inhibió la progresión del tumor en comparación con el control negativo.
Estos resultados demuestran que las células CAR-T específicas para BCMA son eficaces para inhibir la progresión del tumor.
Ejemplo 5: Tratamiento del mieloma múltiple con células CAR-T específicas para BCMA
Este ejemplo ilustra la actividad terapéutica de las células CAR-T específicas para BCMA en modelos de ratón ortotópicos de mieloma múltiple.
Se utilizaron dos modelos murinos humanizados para evaluar la eficacia de las células CAR-T específicas para BCMA contra líneas celulares de mieloma humano que expresan BCMA. Se adquirieron ratones hembra Nod/Scid IL2rg-/-(NSG) de seis (6) a ocho (8) semanas de edad de Jackson Laboratories. Todos los animales se alojaron en una instalación para vivarios libre de patógenos en Rinat y los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos establecidos por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Las líneas celulares MM1.S y Molp-8 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC.org) y de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ.de). Se modificaron por ingeniería genética líneas celulares para expresar una proteína de fusión Luc-GFP mediante partículas lentivirales (amsbio). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 con L-glutamina complementada con suero bovino fetal al 10 % para MM1.S o con FCS al 20 % para células Molp-8 a 37 °C en 5 % de dióxido de carbono (CO2). Las células que crecieron en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se utilizaron para la inoculación del tumor.
Células CAR-T terapéuticas específicas para BCMA se produjeron según lo descrito. Se activaron y transdujeron células sanas de donantes humanos, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células pan-T purificadas con partículas lentivirales que codifican un CAR específico para BCMA y RQR8, activado por el promotor EF-1a. En este estudio se utilizaron tres CARs específicos para BCMA: P5AC1-V2, PC1C12-V2 y COM22-V2 (véase la Tabla 5 anterior). Se realizó edición genética de las células T para la deleción del gen TCRa. Las células se cultivaron durante 14 a 17 días y posteriormente se crioconservaron en 90 % de FCS/10 % de DMSO. Para la inyección de células T, las células se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 con Hepes 25 mM. Las células se inyectaron en 0,2 ml de RPMI 1640 con Hepes 25 mM en la vena caudal de animales portadores de tumores.
Ratones NSG fueron irradiados con 1 Gy de irradiación corporal total (RAD Source Technologies) un día antes de la inoculación de las células tumorales. Se inyectaron 5 x 106 células MM1.S/Luc2-EGFP o 2 x 106 células Molp-8/Luc2-EGFP en la vena caudal en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La carga del tumor se midió dos veces por semana utilizando formación de imágenes de bioluminiscencia. Se inyectaron a los ratones 3 pg de D-luciferina disuelta en 0,2 ml de PBS y se anestesiaron con isoflurano .7 minutos después de la inyección, se obtuvieron imágenes de los animales utilizando un sistema de cámara Perkin Elmer IVIS Spectrum. Se midió la luminiscencia corporal total, con excepción de la cola del ratón, y la carga del tumor se reseña como flujo total (fotones por segundo). Se permitió que los tumores se establecieran hasta que se produjo un crecimiento exponencial. Los animales se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento en base al flujo total y se trataron con células CAR-T específicas para BCMA o células T control no transducidas del mismo donante. El efecto del tratamiento con CAR-T se evaluó dos veces por semana utilizando la formación de imágenes de bioluminiscencia y mediciones del peso corporal. El punto final del estudio se alcanzó cuando el primer animal exchibió enfermedad terminal, indicada por pérdida de peso corporal (> 20 % del peso corporal inicial), parálisis de las patas traseras u otros signos de sufrimiento del animal. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 6. Se utilizó un ANOVA de medidas repetidas de una vía con corrección de Tukey para comparar la eficacia antitumoral entre todos los grupos. Un valor de p < 0,05 se consideró significativo.
Los resultados se resumen en la Tabla 11 (MM1.S) y la Tabla 12 (Molp-8) que figuran más adelante (valores de log<10>del flujo total en fotones por segundo ± EMT). Se utilizó una dosis subóptima de células CAR-T para comparar células CAR-T específicas para BCMA con diferentes scFv. Los grupos de células CAR-T específicas para BCMA son P5AC1 -V2, PC1C12-V2 y COM22-V2 (véase la Tabla 5 anterior). En el modelo MM1.S, se inyectaron 3,5 x 106 células T que expresaban CAR el día 17 tras la implantación del tumor. En el modelo Molp8, se inyectaron 4 x 106 células T que expresaban CAR el día 7 tras la implantación del tumor. Las eficiencias de transducción variaron del 19 % al 29 % para las células CAR-T específicas para BCMA dosificadas en el modelo de ratón MM1.S y del 31 % al 36 % para las células CAR-T específicas para BCMA dosificadas en el modelo de ratón Molp8. Se utilizó una dosis total equivalente de células T no transducidas para el grupo de control. El grupo de control tratado con células T exhibió un crecimiento tumoral progresivo hasta que se alcanzó el punto final del estudio en el día 35 para MM1.S y el día 23 para Molp8. El análisis estadístico de la carga del tumor mediante la prueba RM-ANOVA con corrección de Dunnets mostró que en los tres grupos tratados con CAR-T específicas para BCMA, la carga del tumor fue significativamente menor en comparación con la carga del tumor en el grupo de control (p < 0,01) (Tablas 11 y 12). Por ejemplo, en el modelo de tumor MM1.S, el flujo total medio en animales tratados con células CAR-T específicas para BCMA P5AC1-V2 fue de 6,44 log10 fotones/s el día 25, en comparación con 9,22 log10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 11). El día 35 después de la implantación del tumor, el flujo total medio en animales tratados con células CAR-T específicas para BCMA P5AC1-V2 fue de 6,82 log 10 fotones/s, en comparación con 10,18 log10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 11). En el modelo de tumor Molp8, el flujo total medio en animales tratados con células CAR-T específicas para BCMA P5AC1-V2 fue de 7,88 log10 fotones/s el día 14, en comparación con 9,39 log10 fotones/s en animales que recibieron células T de control (Tabla 12). El día 23 después de la implantación del tumor, el flujo total medio en los animales tratados con células CAR-T específicas para BCMA P5AC1 -V2 fue de 9,29 log10 fotones/s, en comparación con 10,37 log 10 fotones/s en los animales que recibieron células T de control (Tabla 12).
Estos resultados demuestran que los tratamientos con células CAR-T específicas para BCMA son eficaces para inducir la regresión del tumor.
Tabla 11: Mediciones de bioluminiscencia tumoral del modelo de tumor ortotópico MM1.S
Tabla 12: Mediciones por bioluminiscencia del tumor de modelo de tumor Molp-8 ortotópico
Ejemplo 6: Tratamiento del mieloma múltiple con células CAR-T específicas de BCMA con eliminación de TCRa / dCK
Este ejemplo ilustra la actividad terapéutica de las células CAR-T específicas para BCMA en modelos de ratón ortotópicos de mieloma múltiple.
Se utilizó un modelo murino humanizado para evaluar la eficacia de las células CAR-T de BCMA contra líneas celulares de mieloma humano que expresan BCMA. Se adquirieron ratones hembra Nod/Scid IL2rg-/- (NSG) de 6 a 8 semanas de edad de Jackson Laboratories. Todos los animales se alojaron en una instalación para vivarios libre de patógenos en Rinat y los experimentos se realizaron según los protocolos establecidos por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
La línea celular MM1.S se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC.org). La línea celular se diseñó para expresar una proteína de fusión Luc-GFP mediante partículas lentivirales (amsbio) y se editó genéticamente utilizando nucleasas TALEN para inhibir el gende ladesoxicitidina (dCK). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 con L-glutamina complementada con suero bovino fetal al 10 % a 37 °C en 5 % de dióxido de carbono (CO2). Las células en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y se utilizaron para la inoculación del tumor.
Células CAR-T terapéuticas se produjeron como se describe. Células sanas de donantes humanos, células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) o células pan-T purificadas, se activan y transducen con partículas lentivirales que codifican BCM<a>scFV, CD8 bisagra, CD8 transmembrana, 41BB y CD3<z>con genes RQR8 bajo el control del promotor EF-1 a. Las células CAR-T específicas para BCMA se editaron genéticamente para eliminar el gen TCRa y/o dCK utilizando una combinación de TCRa y dCK TALEN, o TCRa TALEN solo. La eficiencia de la transducción para todas las células T fue del 70 %. Las células T inactivadas de TCRa se purificaron utilizando kits de selección magnética para células CD3-positivas (Miltenyi); las células T inactivadas de dCK se purificaron por expansión en presencia de clofarabina 0,5 pM . Las células se cultivaron durante 14 a 17 días y posteriormente se crioconservaron en 90 % de FCS/10 % de DMSO. Para la inyección de células T, las células T se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 que contenía Hepes 25 mM. Para el tratamiento, se inyectaron células T en 0,2 ml de RPMI 1640 con Hepes 25 mM en la vena caudal de los animales con tumores.
Para el modelo de tumor murino, se inyectó a los animales células tumorales MM1.S/ dCK KO. Posteriormente, se trató a los ratones con 2,5 x 101 células CAR-T específicas para BCMA el día 18 tras la implantación de las células tumorales. Se utilizó como control una dosis equivalente de células T no transducidas que recibieron TCRa y dCK TALEN. Los animales se trataron con clofarabina o vehículo durante cinco días tras la inyección de células T.
Resultados:El grupo control tratado con células T exhibió un crecimiento del tumor progresivo hasta alcanzar el punto final del estudio el día 35 (Tabla 13, Grupo 1). En comparación con el control, los grupos tratados con células CAR-T específicas para BCMA con TCRa inactivado y vehículo exhibieron una disminución significativa de la carga tumoral (p < 0,05), que disminuyó con la co-administración de clofarabina (p < 0,05) (Tabla 13, Grupos 2 y 3). La carga del tumor se redujo significativamente en los animales tratados con células CAR-T con doble TCRa/ dCK inactivado, independientemente de si recibieron vehículo o clofarabina (p < 0,05) (Tabla 13, Grupos 4 y 5). La reducción de la carga del tumor en los grupos que recibieron células T con doble TCRa/ dCK inactivado no difirió de la del grupo que recibió células T con TCRa inactivado simple y vehículo (p > 0,1) (Tabla 13, Grupos 2, 4 y 5).
Estos resultados demuestran que los tratamientos con células CAR-T BCMA con doble inactivación de TCRa/dCK son eficaces para inducir la regresión del tumor en presencia de terapias con análogos de nucleósidos tales como fludarabina y clofarabina .
Tabla 13: Mediciones de bioluminiscencia del tumor del modelo ortotópico MM1.S resistente a la terapia con análogos de nucleósidos
Aunque las enseñanzas divulgadas se han descrito con referencia a diversas aplicaciones, métodos, kits y composiciones, se entenderá que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse de las enseñanzas en esta memoria y de la invención reivindicada más adelante. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar mejor las enseñanzas divulgadas y no pretenden limitar el alcance de las enseñanzas presentadas en esta memoria. Aunque las presentes enseñanzas se han descrito en términos de estas realizaciones ejemplares, el experto en la técnica comprenderá fácilmente que son posibles numerosas variaciones y modificaciones de estas realizaciones ejemplares sin necesidad de una experimentación excesiva. Todas estas variaciones y modificaciones se encuentran dentro del alcance de las presentes enseñanzas. En caso de que una o más de la bibliografía citada y materiales similares difieran o contradigan esta solicitud, incluyendo, pero no limitados a términos definidos, el uso de términos, técnicas descritas o similares, la presente solicitud prevalecerá.
La descripción y los Ejemplos anteriores detallan determinadas realizaciones específicas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Sin embargo, se apreciará que, independientemente del grado de detalle que pueda aparecer en el texto, la invención puede implementarse de diversas maneras y debe interpretarse de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> PFIZER INC.
Kuo, Tracy Boldajipour, Bijan Andre Chaparro-Riggers, Javier Duchateau, Philippe Galetto, Roman Juillerat, Alexandre Pertel, Thomas Charles Rajpal, Arvind Sasu, Barbra J. Sommer, Cesar Adolfo Valton, Julien Van Blarcom, Thomas John
<120> RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS QUE FIJAN COMO OBJETIVO EL ANTÍGENO DE MADURACIÓN DE CÉLULAS B
<130> PC72207A
<150> 62/146,825
<151> 2015-04-13
<150> 62/286,473
<151> 2016-01-25
<150> 62/301,177
<151> 2016-02-29
<160> 401
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Ser Pro Ile Ala Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 4
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Phe 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Tyr Pro Pro 85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 6
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 7
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción Sintética
<400> 8
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ser Pro Ile Ala Ala Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
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<213> Secuencia artificial
<400> 9
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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<223> Construcción Sintética
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Phe 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Tyr Pro Pro 85 90 95
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción Sintética
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asp Phe 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Lys His Tyr Gly Trp Pro Pro 85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 12
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asp Phe 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Pro Tyr Pro Pro 85 90 95
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100 105
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 13
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100 105
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 14
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100 105
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 15
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<220>
<223> Construcción Sintética
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<220>
<223> Construcción Sintética
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<220>
<223> Construcción Sintética
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Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 109
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 19
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 109
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 20
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iConstrucción Sintética
<400> 21
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 22
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 23
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 24
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<211> 119
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 25
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<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 26
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 27
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Ala Arg Val Ser Pro Ile Ala Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Ala Arg Val Ser Pro Ile Ala Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 29
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115
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 30
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115
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 32
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 33
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Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 34
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
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100 105
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 35
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Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Leu 20 25 30
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 37
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 37
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
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Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
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Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Leu 20 25 30
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Thr Trp Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Leu 20 25 30
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 42
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115
<210> 43
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 43
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 44
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 45
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<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 46
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<220>
<223> Construcción Sintética
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<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 48
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<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 49
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<220>
<223> Construcción Sintética
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<220>
<223> Construcción Sintética
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<220>
<223> Construcción Sintética
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<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 53
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 54
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 55
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 56
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 57
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 58
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<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 59
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<210> 60
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 60
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<210> 61
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 61
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<210> 62
<211> 115
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 62
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Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 63
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100 105
<210> 64
<211> 115
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 64
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115
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 65
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<211> 115
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 66
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115
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 67
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<210> 68
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 68
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115
<210> 69
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 69
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100 105
<210> 70
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 70
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Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 71
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 72
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
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Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Gly Gly Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Leu Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 75
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Leu 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Ser Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
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Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 79
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Pro Glu 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Val Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Leu Gly Ser Phe Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Tyr Pro Pro Ser 85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Pro Leu 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Phe Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 83
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Leu Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 85
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu 20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Thr Val Gly Ser Gly Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 88
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ala Cys Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Cys Asp Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Arg Ser Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ala Val Pro Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Phe Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Cys Ser Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Phe Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Arg Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 93
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Val Arg Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
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Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 94
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ala 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Cys Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 95
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 96
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Cys Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 97
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 97
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala His Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 98
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly i 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 100
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 100
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Pro 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 101
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 102
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Listado de secuencias
<400> 102
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Pro Leu 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ala Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 103
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 103
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Glu Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 104
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 104
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Phe Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 105
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Gln 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ala Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 106
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 106
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Thr Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 107
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Lys Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 108
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 108
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Val 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Ala Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 109
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 109
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ile Ala Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Val Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 110
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 110
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Leu Phe Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 111
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Pro Arg Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Asp Trp Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 112
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 112
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 113
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Glu Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 114
<211> 114
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 114
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser
<210> 115
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 115
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 116
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 117
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 117
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Leu 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 118
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 118
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 119
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Gly Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 120
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Phe Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 121
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Phe Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 122
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 122
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 123
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 123
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 124
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Thr 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Tyr Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 125
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Cys Leu Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 126
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 126
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Gly Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 127
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 127
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 128
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 128
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Arg 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro 85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintétii
<400> 129
Ser Tyr Ala Met Thr
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintétii
<400> 130
Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
1 5
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintétii
<400> 131
Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr Ala Met Thr
1 5 10
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 132
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 133
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 133
Ser Gly Ser Gly Gly Asn
1 5
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 134
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 135
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 136
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 137
Val Ser Pro Ile Ala Ala Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 138
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Gln Arg Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 139
Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 140
Asp Tyr Ser Ser Gly Asn
1 5
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 141
Ala Ile Ser Tyr Gln Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 142
Ser Tyr Gln Gly Gly Asn
1 5
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 143
Ala Ile Ser Leu Thr Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 144
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 144
Ser Leu Thr Gly Gly Asn
1 5
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 145
Ala Ile Ser His Ala Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 146
Ser His Ala Gly Gly Asn
1 5
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 147
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Gln Leu Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 148
Val Ser Pro Ile Tyr Ala Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 149
Val Ser Pro Ile Ala Ala Glu Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 150
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<223> Construcción Sintética
<400> 150
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 151
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 152
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 153
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 154
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 154
Ser Asp Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 155
Tyr Trp Pro Met Asp Ile
1 5
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 156
Ser Tyr Pro Met Ser
1 5
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 157
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Pro Met Ser
1 5 10
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 158
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<223> Construcción Sintética
<400> 159
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 160
Ala Ile Leu Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 161
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 161
Tyr Trp Pro Met Asp Ser
1 5
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 162
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 163
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Ala Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 164
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 164
Tyr Trp Pro Met Ser Leu
1 5
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 165
Ala Ile Ser Asp Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 166
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 166
Ser Asp Phe Gly Gly Ser
1 5
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 167
Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 168
Thr Ala Ser Gly Gly Ser Leu Thr Ser
1 5
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 169
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Arg Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 170
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 170
Tyr Trp Pro Met Thr Pro
1 5
<210> 171
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 171
Ala Val Leu Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 172
Leu Asp Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 173
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 173
Tyr Trp Pro Met Ser Asp
1 5
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 174
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Lys Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 175
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Gly Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 176
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Cys Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 177
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 177
Ala Ile Phe Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 178
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 178
Phe Ala Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 179
Ser Gly Trp Gly Gly Ser
1 5
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 180
Ala Ile Met Ser Ser Gly Gly Pro Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 181
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 181
Met Ser Ser Gly Gly Pro
1 5
<210> 182
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 182
Tyr Trp Pro Met Ala Leu
1 5
<210> 183
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 183
Ala Ile Leu Met Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 184
Leu Met Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 185
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 186
Ser Asp Ser Gly Gly Tyr
1 5
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 187
Ala Ile Leu Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 188
Leu Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 189
Ala Tyr Trp Pro Met Ser Pro
1 5
<210> 190
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 190
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 191
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 191
Gly Gly Ser Gly Gly Trp
1 5
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 192
Ala Thr Val Gly Ser Gly Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly
<210> 193
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 193
Val Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 194
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ile His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 195
Ala His Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 196
Ile Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 197
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 197
Tyr Trp Pro Met Asp Pro
1 5
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 198
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 199
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 199
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Thr Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 200
Gly Gly Ser Gly Thr Trp
1 5
<210> 201
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 201
Ala Leu Phe Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 202
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 202
Phe Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 203
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 203
Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 204
Leu Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 205
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 205
Tyr Trp Pro Met Ala Asp
1 5
<210> 206
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 206
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Phe Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 207
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 207
Ser Asp Ser Gly Gly Phe
1 5
<210> 208
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 208
Ala Cys Leu Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 209
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 209
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 210
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 211
Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 212
Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 213
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 213
Lys His Tyr Gly Trp Pro Pro Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 214
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 214
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 215
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asp Phe Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 216
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 216
Gln His Tyr Pro Tyr Pro Pro Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 217
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 217
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Pro Ser
1 5 10
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 218
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala His Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 219
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 219
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Phe Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 220
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 220
Lys Tyr Tyr Pro Tyr Pro Pro Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 221
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 221
Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 222
Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 223
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 223
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Leu Tyr Leu Ala
1 5 10 <210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 224
Gln Gln Tyr Gln Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 225
Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 226
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 226
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 227
Gln Gln Tyr Gln Thr Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 228
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 228
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 229
Gln Gln Tyr Gln Gly Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 230
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 230
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Tyr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 231
Gln Gln Tyr Glu Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 232
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 233
Gln Gln Tyr Gln Val Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 234
Gln Gln Tyr Leu Asp Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 235
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 235
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SEQ ID NO.: 237
<400> 236
Gln Gln Tyr Leu Ala Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 237
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 237
Gln Gln Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 238
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 238
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Pro Tyr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 239
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 239
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Glu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 240
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 240
Gln Gln Tyr Ala Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 241
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 241
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Glu Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 242
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 242
Gln Gln Tyr Phe Gly Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 243
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<400> 243
Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Met Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 244
Gln Gln Tyr Ala His Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 245
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 245
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Gln Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 246
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 246
Gly Pro Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 247
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 247
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Trp Ala
1 5 10 <210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 248
<210> 249
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 249
Arg Gly Gly Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 250
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<400> 250
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 251
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 251
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 252
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro
1 5
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 253
Gln Gln Tyr Ser Thr Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 254
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 254
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Pro Glu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 255
Gln Gln Tyr Ser Val Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 256
Gln Gln Tyr Ser Ala Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 257
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 257
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Val Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 258
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 258
Gln Gln Tyr Ser Thr Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 259
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 259
Gln Gln Tyr Ser Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 260
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 260
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Pro Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 261
Gln Gln Tyr Ser Ala Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 262
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 262
Trp Leu Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 263
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 263
Gln Gln Tyr Ser Glu Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 264
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 264
Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 265
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 265
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 266
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 266
Ala Cys Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1 5 10 <210> 267
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 267
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 268
<210> 269
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 269
Arg Ala Ser Glu Ala Val Pro Ser Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 270
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 270
<210> 271
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 271
Arg Ala Ser Val Arg Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 272
Gln Gln Tyr Met Lys Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 273
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 273
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ala Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 274
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 274
Gln Gln Tyr Met Cys Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 275
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 275
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 276
Gln Gln Tyr Gln Cys Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 277
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 277
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Pro Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 278
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 278
Gln Gln Tyr Lys Ala Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 279
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 279
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 280
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 280
Gln Gln Tyr Met Glu Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 281
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 281
Gln Gln Tyr Gln Ala Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 282
Gln Gln Tyr Gln Lys Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 283
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 283
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Val Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 284
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 284
Gln Gln Tyr Arg Ala Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 285
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 285
Arg Ala Ser Ile Ala Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 286
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 286
Gln Gln Tyr Met Val Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 287
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 287
Arg Pro Arg Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 288
Gln Gln Tyr Gln Asp Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 289
Gln Gln Tyr Gln Glu Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 290
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 290
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ser Tyr Leu Ala
1 5 10 <210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 291
Gln Gln Tyr Met Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 292
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 292
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 293
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 293
Gln Gln Tyr Lys Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 294
Gln Gln Tyr Tyr Gly Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 295
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 295
Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 296
Gln Gln Tyr Glu Phe Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 297
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 297
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 298
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 298
Gln Gln Tyr Ala Tyr Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 299
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 299
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 300
Gln Gln Tyr Gly Ser Trp Pro Ile Thr
1 5
<210> 301
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3) ..(3)
<223> en donde X es A o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5) ..(5)
<223> en donde X es T, N o S
<400> 301
Ser Tyr Xaa Met Xaa
1 5
<210> 302
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5) ..(5)
<223> en donde X es G o S
<400> 302
Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr
1 5
<210> 303
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5) ..(5)
<223> en donde X es G o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8) ..(8)
<223> en donde X es A o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (10)..(10)
<223> en donde X es T, N o S
<400> 303
Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr Xaa Met Xaa
1 5 10
<210> 304
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 304
Ala Ile Ser Gly Trp Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 305
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) ..(2)
<223> en donde X es I, V, T, H, L, A o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)..(3)
<223> en donde X es S, D, G, T, I, L, F, M o V
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4) ..(4)
<223> en donde X es G, Y, L, H, D, A, S o M
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)..(5)
<223> en donde X es S, Q, T, A, F o W
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7) ..(7)
<223> en donde X es G o T
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8) ..(8)
<223> en donde X es N, S, P, Y, W o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9).. (9)
<223> en donde X es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C <220>
<221> VARIANTE
<222> (10)..(10)
<223> en donde X es F, Y, P, W, H o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (14).. (14)
<223> en donde X es V, R o L
<220>
<221> VARIANTE
<222> (15)..(15)
<223> en donde X es G o T
<400> 305
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Xaa Xaa Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> en donde X es S, V, I, D, G, T, L, F o M
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) ..(2)
<223> en donde X es G, Y, L, H, D, A, S o M
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)..(3)
<223> en donde X es S, G, F o W
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4) ..(4)
<223> en donde X es G o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)..(5)
<223> en donde X es G o T
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6) ..(6)
<223> en donde X es N, S, P, Y o W
<400> 306
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 307
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)..(5)
<223> en donde X es A o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6) ..(6)
<223> en donde X es A o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7) ..(7)
<223> en donde X es G, Q, L, P o E
<400> 307
Val Ser Pro Ile Xaa Xaa Xaa Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5) ..(5)
<223> en donde X es D, S, T o A
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6) ..(6)
<223> en donde X es I, S, L, P o D
<400> 308
Tyr Trp Pro Met Xaa Xaa
1 5
<210> 309
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> en donde X es R, G, W, A o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> en donde X es A, P, G, L, C o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)..(3)
<223> en donde X es S, G o R
<220>
<221> VARIANTE
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7) .. (7)
<223> en donde X es S, E, D, P o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8) ..(8)
<223> en donde X es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)..(9)
<223> en donde X es T, I, V, E, S, F, A, M, Q, Y, H o R <220>
<221> VARIANTE
<222> (10)..(10)
<223> en donde X es Y o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (11)..(11)
<223> en donde X es L, W o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (12).. (12)
<223> en donde X es A, S o G
<400> 309
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 310
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1) ..(1)
<223> en donde X es G o D
<220>
<221> VARIANTE
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7) ..(7)
<223> en donde X es T o P
<400> 310
Xaa Ala Ser Xaa Arg Ala Xaa
1 5
<210> 311
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1) ..(1)
<223> en donde X es Q o K
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) ..(2)
<223> en donde X es H o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4) ..(4)
<223> en donde X es G, N o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)..(5)
<223> en donde X es S, W o Y
<400> 311
Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Pro Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4) ..(4)
<223> en donde X es G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R o Y <220>
<221> VARIANTE
<222> (5)..(5)
<223> en donde X es S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K o C <220>
<221> VARIANTE
<222> (6) ..(6)
<223> en donde X es W, F o S
<220>
<221> VARIANTE
<400> 312
Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 313
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (30)..(30)
<223> en donde X es G o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (33)..(33)
<223> en donde X es A o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (35) ..(35)
<223> en donde X es T, N o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (51).. (51)
<223> en donde X es I, V, T, H, L, A o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (52).. (52)
<223> en donde X es S, D, G, T, I, L, F, M o V
<220>
<221> VARIANTE
<222> (53)..(53)
<223> en donde X es G, Y, L, H, D, A, S o M
<220>
<221> VARIANTE
<222> (54).. (54)
<223> en donde X es S, Q, T, A, F o W
<220>
<221> VARIANTE
<222> (56) ..(56)
<223> en donde X es G o T
<220>
<221> VARIANTE
<222> (57)..(57)
<223> en donde X es N, S, P, Y, W o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (58)..(58)
<223> en donde X es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C <220>
<221> VARIANTE
<222> (59) ..(59)
<223> en donde X es F, Y, P, W, H o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (63).. (63)
<223> en donde X es V, R o L
<220>
<221> VARIANTE
<222> (64) ..(64)
<223> en donde X es G o T
<220>
<221> VARIANTE
<222> (103)..(103)
<223> en donde X es A o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (104)..(104)
<223> en donde X es A o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (105)..(105)
<223> en donde X es G, Q, L, P o E
<400> 313
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly i 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr 20 25 30
Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Xaa Xaa 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Ser Pro Ile Xaa Xaa Xaa Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 314
<211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (30)..(30)
<223> en donde X es G o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (33)..(33)
<223> en donde X es A o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (35)..(35)
<223> en donde X es T, N o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (51)..(51)
<223> en donde X es I, V, T, H, L, A o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (52)..(52)
<223> en donde X es S, D, G, T, I, L, F, M o V
<220>
<221> VARIANTE
<222> (53) ..(53)
<223> en donde X es G, Y, L, H, D, A, S o M
<220>
<221> VARIANTE
<222> (54).. (54)
<223> en donde X es S, Q, T, A, F o W
<220>
<221> VARIANTE
<222> (56) ..(56)
<223> en donde X es G o T
<220>
<221> VARIANTE
<222> (57).. (57)
<223> en donde X es N, S, P, Y, W o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (58)..(58)
<223> en donde X es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (59) ..(59)
<223> en donde X es F, Y, P, W, H o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (63)..(63)
<223> en donde X es V, R o L
<220>
<221> VARIANTE
<222> (64) ..(64)
<223> en donde X13 es G o T
<220>
<221> VARIANTE
<222> (103)..(103)
<223> en donde X es D, S, T o A
<220>
<221> VARIANTE
<222> (104)..(104)
<223> en donde X es I, S, L, P o D
<400> 314
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr 20 25 30
Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Xaa Xaa 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 315
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24) ..(24)
<223> en donde X es R, G, W, A o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (25) ..(25)
<223> en donde X es A, P, G, L, C o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (26) ..(26)
<223> en donde X es S, G o R
<220>
<221> VARIANTE
<220>
<221> VARIANTE
<222> (30)..(30)
<223> en donde X es S, E, D, P o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (31) ..(31)
<223> en donde X es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (32)..(32)
<223> en donde X es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, R o F <220>
<221> VARIANTE
<222> (33) ..(33)
<223> en donde X es Y o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (34).. (34)
<223> en donde X es L, W o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (35)..(35)
<223> en donde X es A, S o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (51)..(51)
<223> en donde X es G o D
<220>
<221> VARIANTE
<222> (54)..(54)
<223> en donde X es S o I
<220>
<221> VARIANTE
<222> (57).. (57)
<223> en donde X es T o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (90).. (90)
<223> en donde X es Q o K
<220>
<221> VARIANTE
<222> (91)..(91)
<223> en donde X es H o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (93).. (93)
<223> en donde X es G, N o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (94)..(94)
<223> en donde X es S, W o Y
<400> 315
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Xaa Ala Ser Xaa Arg Ala Xaa Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Pro 85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 316
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24) ..(24)
<223> en donde X es R, G, W, A o C
<220>
<221> VARIANTE
<222> (25) ..(25)
<223> en donde X es A, P, G, L, C o S
<220>
<221> VARIANTE
<222> (26) ..(26)
<223> en donde X es S, G o R
<220>
<221> VARIANTE
<220>
<221> VARIANTE
<222> (30)..(30)
<223> en donde X es S, E, D .o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (31) ..(31)
<223> en donde X es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y
<220>
<221> VARIANTE
<222> (32)..(32)
<223> en donde X es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H o R
<220>
<221> VARIANTE
<222> (33) ..(33)
<223> en donde X es Y o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (34).. (34)
<223> en donde X es L, W o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (35)..(35)
<223> en donde X es A, S o G
<220>
<221> VARIANTE
<222> (51)..(51)
<223> en donde X es G o D
<220>
<221> VARIANTE
<222> (54)..(54)
<223> en donde X es S o I
<220>
<221> VARIANTE
<222> (57).. (57)
<223> en donde X es T o P
<220>
<221> VARIANTE
<222> (93).. (93)
<223> en donde X es G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K o Y <220>
<221> VARIANTE
<222> (94)..(94)
<223> en donde X es S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F o Y <220>
<221> VARIANTE
<222> (95)..(95)
<223> en donde X es W, S o F
<220>
<221> VARIANTE
<222> (97)..(97)
<223> en donde X es L o I
<400> 316
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Met Tyr Xaa Ala Ser Xaa Arg Ala Xaa Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Pro 85 90 95
Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 317
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 317
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Leu 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Trp Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 318
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 318
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 319
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 319
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15
<210> 320
<211> 45
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 320
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 321
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 321
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 322
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 322
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 323
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 323
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 324
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 324
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110
<210> 325
<211> 52
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 325
Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 1 5 10 15
Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn 35 40 45
Pro Lys Asn Asn
50
<210> 326
<211> 215
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 326
Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu 1 5 10 15 Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu 20 25 30
Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His 35 40 45
Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr 50 55 60
Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys 65 70 75 80
Ser Val Leu Asp Ile Ser His Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe 85 90 95
Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly 100 105 110
Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg 115 120 125
Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly 130 135 140
Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His 145 150 155 160
Ile His Ser Cys Gln Lys Phe Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser 165 170 175
Phe Ser Thr Glu Ile Val Val Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly 180 185 190
Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu 195 200 205
Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu
210 215
<210> 327
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 327
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 328
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 328
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 329
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 329
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala 1 5 10 15
Ala Ala
<210> 330
<211> 43
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 330
Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu 1 5 10 15
Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val 20 25 30
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser
35 40
<210> 331
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 331
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 332
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 332
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 333
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 333
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
<210> 334
<211> 530
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 334
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 65 70 75 80
Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 85 90 95 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 100 105 110
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 130 135 140
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 195 200 205
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<223> Construcción Sintética
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 341
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Arg
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Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Tyr Pro Pro Ser Phe Thr Phe Gly Gln 245 250 255
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 366
<211> 672
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 366
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45
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Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Phe 65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ser Pro Ile Ala Ala Pro Met Asp 115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 165 170 175
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln 180 185 190
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 195 200 205
Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Tyr Pro Pro Ser Phe Thr Phe Gly Gln 245 250 255
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His 260 265 270
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro 290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 385 390 395 400
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr 485 490 495
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Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 515 520 525
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 530 535 540
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 545 550 555 560
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 565 570 575
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 580 585 590
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 595 600 605
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 645 650 655
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 660 665 670
<210> 367
<211> 345
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<220>
<221> característica_misc
<222> (293)..(293)
<223> n es a, c, g o t
<400> 367
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atcagcgata gcggcggcag cacctactac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc canatactgg 300 cccatggaca tctggggcca gggaaccttg gtcaccgtct cctca 345
<210> 368
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 368
gagatcgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgagcctgt ctccaggcga aagagccacc 60 ctgtcctgca aagccagcca gagcgtgtcc agcagctacc tggcctggta tcagcaaaag 120 cccggccagg ctccccggct gctgatgtac gatgccagca tcagagccac cggcatcccc 180 gacagatttt ccggctctgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagactggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacggca gctggcccct gacatttggc 300 cagggcacaa aggtggagat caaa 324
<210> 369
<211> 345
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 369
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120 cctggtaaag gtttggaatg ggtttctgct attctgtcgt ctggtggttc tacttactat 180 gccgattctg ttaagggtag attcaccatt tctagagaca actctaagaa caccttgtac 240 ttgcaaatga actccttgag agctgaagat actgctgttt attactgtgc tagatactgg 300 ccaatggata tttggggtca aggtactctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 370
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 370
gagatcgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgagcctgt ctcctggtga aagagctact 60 ttgtcttgta gagggggtca atccgtttcc tcttcttatt tggcttggta tcaacaaaaa 120 ccaggtcaag ctccaagatt attgatgtac gatgcttcta ttagagccac cggtattcca 180 gatagatttt ctggttctgg ttccggtact gatttcactt tgactatctc tagattggaa 240 ccagaagatt tcgctgttta ctactgtcaa caatatcagt cttggccatt gacttttggt 300 caaggtacaa aggttgaaat caaa 324
<210> 371
<211> 345
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 371
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacccta tgagctgggt gcgccaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtccgcc atcggaggct ctggcggcag cacctactac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatactgg 300 cccatggaca gctggggcca gggaactttg gtcaccgtct cctca 345
<210> 372
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 372
gagatcgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgagcctgt ctccaggcga aagagccacc 60 ctgtcctgca aagccagcca gagcgtgtcc agcacatacc tggcctggta tcagcaaaag 120 cccggccagg ctccccggct gctgatctac gatgcctctt ctagagcccc tggcatcccc 180 gacagattca gcggctctgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagactggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacagca ccagccccct gacctttggc 300 cagggcacaa aggtggagat caaa 324 <210> 373
<211> 345
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 373
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacccta tgagctgggt gcgccaggcc 120 cctggtaaag gtttggaatg ggtttctgct attggtggtt caggtggttg gagttattat 180 gccgattctg ttaagggtag attcaccatt tctagagaca actctaagaa caccttgtac 240 ttgcaaatga actccttgag agctgaagat actgctgttt attactgtgc tagatactgg 300 ccaatggatt cttggggtca aggtactctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 374
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 374
gagatcgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgagcctgt ctcctggtga aagagctact 60 ttgtcttgtt ggttgtctca atctgtttcc tctacttact tggcttggta tcaacaaaaa 120 ccaggtcaag ctccaagatt attgatctac gatgcttctt ctagagcacc aggtattcca 180 gatagatttt ctggttctgg ttccggtact gatttcactt tgactatctc tagattggaa 240 ccagaagatt tcgctgttta ctactgccaa caatactctg agtggccatt gacttttggt 300 caaggtacaa aggttgaaat caaa 324
<210> 375
<211> 345
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 375
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120 cctggtaaag gtttggaatg ggtttctgct atttctgatt ctggtggttc taggtggtat 180 gccgattctg ttaagggtag attcaccatt tctagagaca actctaagaa caccttgtac 240 ttgcaaatga actccttgag agctgaagat actgctgttt attactgtac gcggtactgg 300 ccaatggata tttggggtca aggtactctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 376
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 376
gagatcgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgagcctgt ctcctggtga aagagctact 60 ttgtcttgtt ggttgtctca atctgtttcc tctacttact tggcttggta tcaacaaaaa 120 ccaggtcaag ctccaagatt attgatctac gatgcttctt ctagagcacc aggtattcca 180 gatagatttt ctggttctgg ttccggtact gatttcactt tgactatctc tagattggaa 240 ccagaagatt tcgctgttta ctactgccaa caatactctg agtggccatt gacttttggt 300 caaggtacaa aggttgaaat caaa 324
<210> 377
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 377
Arg Ala Ser Gln Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 378
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 378
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Trp Ser Gly Ala Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 379
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 379
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro 85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 380
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Val Gly Thr Ser Gly Ala Phe Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 381
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 381
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 382
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 382
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 383
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 383
Ser Ala Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 384
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 384
Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 385
Leu Ser Trp Ser Gly Ala Phe Asp Asn
1 5
<210> 386
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 386
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 387
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 387
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
1 5
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 388
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 389
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 389
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 390
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 390
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 391
Val Gly Thr Ser Gly Ala Phe Gly Ile
1 5
<210> 392
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 392
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Tyr
1 5
<210> 393
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 393
Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 394
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 394
Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 395
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 395
Gly Ala Ser Tyr Arg Ala Thr
1 5
<210> 396
<211> 519
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción CAR P5AC1-A2 BCMA con epítopo R2
<400> 396
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Leu Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln 115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly 145 150 155 160
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Gly 165 170 175
Gly Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 180 185 190
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr 195 200 205
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 210 215 220
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240
Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 245 250 255
Glu Ile Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro 260 265 270
Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser 275 280 285
Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 290 295 300
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 305 310 315 320
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 325 330 335 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 340 345 350
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 355 360 365
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 370 375 380
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 385 390 395 400
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 405 410 415
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 420 425 430
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 435 440 445
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 450 455 460
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 465 470 475 480
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 485 490 495
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 500 505 510
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 397
Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 398
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> epítopo R2
<400> 398
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 399
<211> 1497
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de ácido nucleico que codifica P5AC1--V2.1
<400> 399
atggcactgc ctgtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgccgcccgg 60 ccagaggtgc agctgctgga gagcggagga ggactggtgc agccaggagg aagcctgaga 120 ctgtcctgcg ccgcctctgg cttcaccttc agctcctacg ccatgaactg ggtgaggcag 180 gcaccaggca agggactgga gtgggtgtct gccatcctgt ctagcggcgg cagcacctac 240 tatgccgatt ccgtgaaggg ccgcttcaca atcagccggg acaactccaa gaataccctg 300 tacctgcaga tgaacagcct gagagccgag gatacagccg tgtactattg cgccaggtat 360 tggcccatgg acatctgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgtcctctgg aggaggagga 420 tccggcggag gaggctctgg cggcggcggc agcgagatcg tgctgacaca gagcccaggc 480 accctgagcc tgtcccctgg agagagagcc accctgtctt gtaggggcgg ccagagcgtg 540 agctcctctt acctggcctg gtatcagcag aagccaggcc aggcccccag actgctgatg 600 tacgacgcct ccatcagggc aacaggcatc cccgatcggt tctctggaag cggatccgga 660 accgacttta cactgaccat ctccaggctg gagcctgagg atttcgccgt gtactattgc 720 cagcagtacc agtcttggcc actgacattt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaggga 780 tccggaggag gaggatcttg cccttattcc aacccatctc tgtgcaccac aacccctgca 840 ccaaggccac ctacaccagc acctaccatc gcctctcagc cactgagcct gagacccgag 900 gcctgtaggc ctgcagcagg aggagcagtg cacacacggg gactggactt tgcctgcgat 960 atctacatct gggcacctct ggcaggaaca tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 1020 accctgtact gcaagagagg caggaagaag ctgctgtata tcttcaagca gccctttatg 1080 cgccctgtgc agacaaccca ggaggaggat ggctgctcct gtaggttccc agaagaggag 1140 gagggaggat gtgagctgcg cgtgaagttt tctcggagcg ccgacgcacc tgcataccag 1200 cagggacaga atcagctgta taacgagctg aatctgggcc ggagagagga gtatgacgtg 1260 ctggataaga ggaggggaag ggacccagag atgggaggca agccacggag aaagaacccc 1320 caggagggcc tgtacaatga gctgcagaag gataagatgg ccgaggccta tagcgagatc 1380 ggcatgaagg gagagaggcg ccggggcaag ggacacgacg gactgtacca gggactgtcc 1440 acagccacca aggacaccta tgatgccctg cacatgcagg ccctgccacc aaggtga 1497
<210> 400
<211> 157
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética RQR8 con secuencia señal
<400> 400
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser
35 40 45
Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro
65 70 75 80
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
85 90 95
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
100 105 110
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
115 120 125
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
130 135 140
Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
145 150 155
<210> 401
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción Sintética
<400> 401
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro 85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para el antígeno de maduración de células B (BCMA) que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un primer dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende: (a) una región VH que comprende una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, 151 o 152; una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 o 154; y una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, en donde
i) la región VH comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33, o
ii) la región VH comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33 con una a varias sustituciones de aminoácidos conservadoras en aminoácidos que no están dentro de las CDR, y
una región VL que comprende una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; y una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222, en donde
i) la región VL comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, o
ii) la región VL comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34 con una a varias sustituciones de aminoácidos conservativas en aminoácidos que no están dentro de las CDRs; o
(b) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 112, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 38.
2. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, en donde
el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización CD3Z y un dominio 4-1BB, el primer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de cadena CD8a, y
el CAR específico para BCMA comprende, además, una bisagra CD8a humana entre el dominio de unión a ligando extracelular y el primer dominio transmembrana .
3. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, en donde:
(a) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización CD3Z y/o un dominio 4-1 BB; y/o (b) el primer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de cadena CD8a; y/o
(c) el o los dominios de unión a ligando extracelular, el primer dominio transmembrana y el o los dominios de señalización intracelular están en un solo polipéptido.
4. El CAR específico para BCMA de las reivindicaciones 1 o 3, que comprende, además, un dominio de tallo entre el dominio de unión a ligando extracelular y el primer dominio transmembrana; opcionalmente en donde el dominio de tallo se selecciona del grupo que consiste en: una bisagra CD8a humana, una bisagra IgG1 y una bisagra FcyRII Ia.
5. El CAR específico para BCMA de cualquier reivindicación precedente, que comprende, además:
(a) un segundo dominio de señalización intracelular; opcionalmente el segundo dominio de señalización intracelular comprende un dominio 4-1 BB; y/o
(b) un epítopo CD20; opcionalmente, el epítopo CD20 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 397 o SEQ ID NO: 398; y/o
(c) otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico para BCMA.
6. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, en donde el primer dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana CD8a que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 322.
7. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, en donde el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular 4-1 BB que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 323.
8. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, en donde el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular CD3Z que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 324.
9. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, que comprende, además, un péptido señal CD8a que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 318.
10. El CAR específico para BCMA de la reivindicación 1, que comprende, además, un enlazador GS, que enlaza el VH y el VL, que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 333.
11. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR específico para BCMA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 11.
13. Una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa en su membrana de la superficie celular un CAR específico para BCMA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
14. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética de la reivindicación 13,
(a) que comprende, además, otro CAR que no es específico para BCMA; y/o
(b) que comprende, además, un polinucleótido que codifica un polipéptido suicida; y/o
(c) que comprende, además, una alteración de uno o más genes endógenos, en donde el gen endógeno codifica TCRa, TCRp, CD52, receptor de glucocorticoides (GR), desoxicitidina quinasa (dCK), o una proteína de punto de control inmunitario tal como, por ejemplo, muerte programada-1 (PD-1); y/o
(d) en donde la célula inmunitaria se obtiene de un donante sano.
15. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde la célula inmunitaria modificada por ingeniería genética es una célula NK o una célula T.
16. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para uso como un medicamento.
17. Célula inmunitaria modificada por ingeniería para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el medicamento es para uso en el tratamiento de un cáncer relacionado con células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma folicular, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B, leucemia mieloide, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de tejido linfático asociado a mucosas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de Burkitt, linfoma primario mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma linfoplasmacéutico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de células B de la zona marginal, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV en ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con inflamación, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con células B.
18. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el medicamento es para uso en el tratamiento del mieloma múltiple.
19. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética de las reivindicaciones 13-15, para uso en un método para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto con células malignas que expresan BCMA, inhibir la metástasis de células malignas que expresan BCMA en un sujeto o inducir la regresión del tumor en un sujeto con células malignas que expresan BCMA; en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la célula inmunitaria modificada por ingeniería genética, opcionalmente en donde dicho método comprende, además, administrar al sujeto una terapia con análogos de nucleósidos, fludarabina o clofarabina .
20. Un métodoin vitropara modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria que expresa un CAR específico para BCMA, que comprende:
a. proporcionar una célula inmunitaria;
b. introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica un CAR específico para BCMA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y
c. opcionalmente, introducir en la célula al menos un polinucleótido que codifica un CAR que no es específico para BCMA.
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