ES2829560T3

ES2829560T3 - Procedimientos y sistemas para el replegamiento de proteínas

Info

Publication number: ES2829560T3
Application number: ES12854533T
Authority: ES
Inventors: Matthew Seefeldt; Eliana Gomez
Original assignee: Pressure Biosciences Inc
Current assignee: Pressure Biosciences Inc
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2012-12-03
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2032-12-03
Also published as: US20200354400A1; BR112014013369A2; CA2857307A1; JP6377527B2; EP2785196A4; CN104080357A; EP2785196A1; US20190218247A1; EP2785196B1; JP2015504848A; US20140302589A1; WO2013082599A1

Abstract

Un procedimiento para la producción de proteínas a partir de cuerpos de inclusión, que comprende: a) proporcionar una preparación de proteínas que comprende partículas de cuerpos de inclusión, b) preparar una dispersión de cuerpos de inclusión mediante cizallamiento mecánico de modo que las partículas de los cuerpos de inclusión tienen un tamaño inferior a 10 μm, y c) exponer la dispersión de cuerpos de inclusión a alta presión en un recipiente a presión, desagregando y replegando de este modo la proteína del cuerpo de inclusión.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y sistemas para el replegamiento de proteínas

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a la desagregación a alta presión y al replegamiento de proteínas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión, preparadas como preparaciones o dispersiones de cuerpos de inclusión de proteínas estabilizadas, para la fabricación de proteínas a gran escala.

Antecedentes

Si bien la producción comercial de proteínas recombinantes en E. coli tiene muchas ventajas, algunas proteínas se pliegan incorrectamente en este sistema formando cuerpos de inclusión (CI) que requieren solubilización y replegamiento a la conformación nativa. Este procedimiento de replegamiento a menudo representa un cuello de botella, con un rendimiento promedio de la proteína en el intervalo del 15-25 %. Véase Zhang y col., del replegamiento de proteínas a partir de cuerpos de inclusión, Acta Biochim. Biophys Sin 1044-1052 (2009). Se desean procedimientos para aumentar el rendimiento de proteína replegada a partir de cuerpos de inclusión.

El documento US 2009/208453 desvela un procedimiento para replegar cuerpos de inclusión usando un tratamiento de alta presión en un recipiente a presión de 10 l de volumen.

Sumario de la invención

Tradicionalmente se han usado desnaturalizantes químicos, incluyendo caótropos como urea o cloruro de guanidio e incluyendo tensioactivos desnaturalizantes como dodecilsulfato de sodio ("SDS"), para solubilizar y replegar proteínas de cuerpos de inclusión, donde altas concentraciones de estos agentes (por ejemplo, hasta guanidina HCl 6M, urea 8M, SDS al 0,1 %) desnaturalizan termodinámicamente las proteínas. El replegamiento se logra eliminando el caótropo o detergente después de la disociación del cuerpo de inclusión y / o agregado, habitualmente mediante dilución, diálisis o diafiltración. Las propiedades y el tamaño del cuerpo de inclusión tienen un impacto insignificante en el rendimiento del replegamiento en estos sistemas, ya que se disuelven y desnaturalizan a gran escala en tanques de mezcla antes del replegamiento.

La presión hidrostática alta también es una herramienta de replegamiento de proteínas potencialmente eficaz y se describe en las patentes de Estados Unidos N.° 7.064.192 y 6.489.450. En contraste con el replegamiento tradicional basado en caótropos, las técnicas de alta presión pueden disociar agregados de proteínas en condiciones que favorecen la conformación nativa de la proteína y pueden realizarse en ausencia de caótropos o detergentes de unión fuerte, facilitando la purificación aguas abajo. Sin embargo, la presión hidrostática está menos demostrada a gran escala comercial, lo que puede dar como resultado un rendimiento reducido o inaceptable en la proteína replegada de los cuerpos de inclusión, especialmente cuando no se prefiere el uso de caótropos y detergentes desnaturalizantes.

La presente invención proporciona procedimientos y sistemas para la producción de proteína recombinante y, en particular, para la producción de proteína recombinante a partir de cuerpos de inclusión. La invención es aplicable a gran escala, para apoyar la producción comercial de proteínas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, en un aspecto, el procedimiento comprende proporcionar una preparación de proteína que comprende cuerpos de inclusión, preparar una preparación o dispersión de cuerpos de inclusión estables y exponer la dispersión de cuerpos de inclusión a alta presión en un recipiente a presión, para así disgregar y replegar la proteína recombinante a la conformación nativa (por ejemplo, activa).

La presente invención emplea cizallamiento mecánico y selección de la química de la solución para crear la preparación o dispersión de cuerpos de inclusión estables. La dispersión de cuerpos de inclusión comprende cuerpos de inclusión de un tamaño pequeño sustancialmente homogéneo de menos de 10 pm, de modo que la velocidad de sedimentación sea inferior a aproximadamente 5 cm por hora, o, en algunas realizaciones, sea inferior a aproximadamente 1 cm por hora o la velocidad de sedimentación sea despreciable debido al movimiento browniano (es decir, como resultado de que las partículas sean inferiores a aproximadamente 2,2 pm). De esta manera, los cuerpos de inclusión que se cargan en la reacción de replegamiento a alta presión y se tratan a presión tendrán tiempo suficiente para desagregarse y solubilizarse antes de depositarse en el fondo del recipiente a presión. En diversas realizaciones, la preparación o dispersión de cuerpos de inclusión no es desnaturalizante, esto es, no contiene una cantidad desnaturalizante de detergentes (por ejemplo, SDS) o agentes caotrópicos (por ejemplo, urea o cloruro de guanidinio), o está completamente libre de tales agentes. La dispersión se crea sin solubilizar ni precipitar la proteína de los cuerpos de inclusión antes del tratamiento a alta presión. En algunas realizaciones, la dispersión es estable durante al menos 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas o al menos aproximadamente 1 mes, sin sedimentación sustancial ni necesidad de procedimientos de redispersión antes del tratamiento a alta presión. La preparación o dispersión es estable tanto con como sin una o más etapas de congelación / descongelación. Por lo tanto, la invención puede proporcionar eficiencias del procedimiento sin pérdida, o con una mejora significativa, del rendimiento de replegamiento. La dispersión del cuerpo de inclusión permite un mejor rendimiento durante el replegamiento a alta presión, incluido el plegado a gran escala, entre otras cosas, evitar la sedimentación de los cuerpos de inclusión y / o reducir la propensión a la agregación de las partículas del cuerpo de inclusión durante el tratamiento a alta presión.

En algunos aspectos y realizaciones, el tamaño de las partículas de cuerpo de inclusión, su velocidad de sedimentación y / o propensión a la agregación se ajustan modificando el pH de la solución o alterando la constante dieléctrica de la solución, mediante la adición de un detergente no desnaturalizante, aditivo de replegamiento y / o agente que aumenta la viscosidad.

En aún otros aspectos y realizaciones, el eje horizontal del recipiente a presión es al menos dos veces el eje vertical. Un recipiente a presión con una gran superficie horizontal permite un mayor rendimiento mediante el plegamiento a alta presión. Los recipientes de alta presión de carga vertical se han utilizado generalmente para realizar experimentos de alta presión y pasteurización de alimentos.

Otros aspectos y realizaciones de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las distribuciones de tamaño de partículas de cuatro preparaciones de cuerpos de inclusión. Todas las muestras exhiben una sedimentación rápida según lo observado por inspección visual y según lo predicho por el flujo de Stokes.

La Figura 2 muestra las distribuciones del tamaño de partícula de los cuerpos de inclusión de rhG-CSF usando imágenes FlowCAM. Los resultados se correlacionan con el análisis del contador Coulter, específicamente, hay grandes cantidades de partículas en el intervalo de tamaño de 5 a 50 pm.

La Figura 3 muestra la distancia de sedimentación de los cuerpos de inclusión en función del tamaño de partícula y determinada por el flujo de Stokes. Las partículas de más de 5 pm de diámetro sedimentan lo suficiente para dar como resultado un gradiente de concentración de proteínas en un replegamiento a alta presión no mezclado después de treinta minutos.

La Figura 4 muestra las distribuciones del tamaño de partícula de cuatro preparaciones de cuerpos de inclusión después de la homogeneización a alta presión. Las muestras se dispersaron y no sedimentaron según lo observado por inspección visual y según lo predicho por el flujo de Stokes y la Ecuación 3.

La Figura 5 muestra que la dispersión de los cuerpos de inclusión antes del replegamiento aumenta significativamente los rendimientos del replegamiento de una manera que es independiente de la escala.

La Figura 6 muestra que la homogeneización a alta presión de cuerpos de inclusión de cuerpos de inclusión de rhG-CSF aumenta los rendimientos de replegamiento y minimiza los impactos de la escala.

La Figura 7 muestra que la adición de glicerol al 20 % durante la congelación / descongelación de Fab 1664 a 20 °C evita la floculación.

La Figura 8 muestra el efecto de las técnicas de homogeneización, en intentos de crear dispersiones, sobre el tamaño de partícula de Fab 1664.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona procedimientos y sistemas para la producción de proteína recombinante y, en particular, para la producción de proteína recombinante a partir de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, en un aspecto, el procedimiento comprende proporcionar una preparación de proteína que comprende cuerpos de inclusión, preparar una preparación o dispersión de cuerpos de inclusión estables y exponer la dispersión de cuerpos de inclusión a alta presión en un recipiente a presión, para desagregar y replegar la proteína del cuerpo de inclusión. Al preparar la dispersión de cuerpos de inclusión estables antes del tratamiento a alta presión, la invención evita la pérdida de rendimiento de replegamiento causada por gradientes de concentración de proteínas grandes y límites en la solubilidad de proteínas, especialmente durante el replegamiento a gran escala.

La concentración de proteína dentro de una reacción de replegamiento afecta al rendimiento de replegamiento de al menos dos formas. En primer lugar, las reacciones de reagregación perjudiciales son más frecuentes si la reacción de replegamiento se realiza a una alta concentración de proteínas, dado que se ha informado que el orden de reacción de agregación es de aproximadamente 2,6, mientras que la reacción de replegamiento es de primer orden. En segundo lugar, la concentración máxima de proteína que se puede obtener en una solución se rige por la solubilidad de la proteína. La solubilidad de una proteína es función de las características de la molécula de proteína dada y de la termodinámica de la solución (por ejemplo, pH, fuerza iónica, dieléctrica). Si se intenta una reacción de replegamiento a una concentración de proteína que está por encima del límite de solubilidad, el rendimiento se verá afectado negativamente por la precipitación de proteína a la concentración de saturación.

El efecto fundamental de la concentración de proteínas en las reacciones de agregación se ha observado empíricamente durante los replegamientos a alta presión. Por ejemplo, los rendimientos de rhGH monomérica soluble (hormona del crecimiento humana recombinante) de los agregados después de una incubación de 24 horas a 200 MPa eran esencialmente independientes de la concentración de proteína en el intervalo de 0,87 a 8,7 mg / ml (St. John, Carpenter y col. 1999). Sin embargo, otras proteínas tienen una mayor sensibilidad a la concentración de proteínas durante el replegamiento a alta presión. La bikunina placentaria humana recombinante exhibió rendimientos de replegamiento del 96 % a concentraciones de proteína de 0,0625 mg / ml, disminuyendo el rendimiento al 44 % a una concentración de 2 mg / ml (Seefeldt, Ouyang y col. 2004). La lisozima, replegada utilizando alta presión hidrostática, tuvo rendimientos del 80 % y 65 % a una concentración de proteína de 0,25 y 2 mg / ml respectivamente (St. John, Carpenter y col. 1999). Por tanto, la concentración de proteínas puede ser una variable importante para modular los rendimientos de replegamiento a alta presión.

Las cámaras de replegamiento de alta presión se realizan por lotes sin la capacidad de agitar, que afecta a la forma en que la tecnología se puede aplicar al material insoluble, tal como los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se forman durante la expresión recombinante en E. coli y se caracterizan como estructuras densas de polipéptidos expresados mal plegados que surgen de la incapacidad de la maquinaria celular para procesar y replegar el polipéptido correctamente. Se ha medido que los cuerpos de inclusión están en el intervalo de tamaño de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 pm y se pueden recolectar de células bacterianas usando sonicación o un homogeneizador de alta presión. Durante el procesamiento, la centrifugación y el almacenamiento, la mayoría de las preparaciones de cuerpos de inclusión floculan y se aglomeran aumentando su tamaño significativamente. El grado de floculación depende de la cantidad de desechos celulares (por ejemplo, ADN residual), el pH y las condiciones de la solución de recolección. En un ejemplo, se observó que el potencial zeta para una preparación de cuerpos de inclusión era de aproximadamente -9,8 mV (véase el documento US 2011/0268773). Generalmente se cree que los valores entre -10 mV y 10 mV caracterizan una solución inestable con una alta propensión a flocular. Una vez floculados, los cuerpos de inclusión se sedimentarán en el fondo de la solución acuosa de replegamiento, potencialmente causando un impacto significativo en el rendimiento del replegamiento, especialmente para reacciones de replegamiento a gran escala. Este problema de sedimentación da como resultado un gradiente de concentración de proteína y una gran concentración de proteína aparente en las regiones del recipiente a presión. De manera más específica, la concentración aparente de proteína durante el replegamiento es mucho más alta que la concentración real de la muestra, debido a la sedimentación del cuerpo de inclusión. Si hubiera un empaquetamiento infinito de los cuerpos de inclusión, la concentración de proteína en el fondo del recipiente sería ~ 1260 mg / ml (según la densidad de proteína en los cuerpos de inclusión). Las ineficiencias de empaquetamiento dan como resultado una concentración de proteína de las suspensiones de cuerpos de inclusión que típicamente se encuentra en el intervalo de 20-100 mg / ml. El tiempo requerido para la formación de este régimen de alta concentración de proteínas está gobernado por el flujo de Stokes (Ecn. 1) de las partículas del cuerpo de inclusión, por ejemplo, para partículas de más de 2,2 pm que no se rigen por el movimiento browniano,

P ^ P p a r t e P f l u i d o ' ) )

Ecn.1 V=± -------- -- - ₁ - ₈ -- _\ - _i --- --------

donde V es la velocidad, D es el diámetro de la partícula, g es la constante de gravitación, p es la viscosidad de la solución y p es la densidad de partículas y fluidos respectivamente (de Nevers 1970).

La energía cinética promedio por molécula se puede cuantificar mediante (Ecn. 2):

Ecn.2 Ek = 1,5 * kb * T

donde Ek es la energía cinética promedio por molécula, kb es la constante de Boltzman y T es la temperatura (K)) (Laidler y Meiser 1995).

Si se resuelve el balance de energía en una partícula de las fuerzas gravitacionales (ecuación 1) y las fuerzas cinéticas debido al movimiento browniano (Ecn. 2), se puede desarrollar la siguiente relación (Ecn. 3).

Ecn D4g{Pparte - Pfiuido)) Fuerzas gravitacionales

. 16KbT Movimiento browniano

donde los valores superiores a 1 demuestran que las fuerzas de gravitación dominan y la sedimentación de partículas se puede caracterizar generalmente por el flujo de Stokes y con valores menores a 1 que describen la dispersión donde la sedimentación ya no se produce debido a fuerzas de superación asociadas con el movimiento cinético de las moléculas (Duffy y Hill 2011). Resolver la ecuación 3 para cuerpos de inclusión aproximadamente esféricos con una densidad de aproximadamente 1,25 g / ml da como resultado la aproximación general de que las partículas de más de aproximadamente 2,2 pm de diámetro se sedimentan según lo descrito por el flujo de Stokes y las partículas de menos de aproximadamente 2,2 pm de diámetro forman coloides cuando no se produce sedimentación, porque la solución se rige por el movimiento browniano. Hay factores de forma asociados con la naturaleza no esférica de algunos cuerpos de inclusión, lo que da como resultado una distribución de las propiedades fluidodinámicas alrededor de los parámetros identificados anteriormente.

Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se prepara una dispersión estable de los cuerpos de inclusión. Tras un tratamiento de alta presión, los cuerpos de inclusión no sedimentan, lo que proporciona mejores rendimientos de replegamiento y / o eficiencias del procedimiento, ya que la solubilización con caótropos se hace innecesaria. La dispersión de los cuerpos de inclusión se puede preparar mediante, por ejemplo, homogeneización a alta presión u otra técnica que implique un alto esfuerzo cortante.

Tal como se usa en el presente documento, el término "dispersión" o "preparación de proteína estable" se usan indistintamente y se refieren a un sistema sustancialmente acuoso en el que las partículas sólidas finas se dispersan uniformemente. La preparación o dispersión es, por tanto, un sistema líquido de dos fases en el que una fase consiste en partículas finamente divididas de cuerpos de inclusión insolubles distribuidos a lo largo de la segunda fase, que es sustancialmente agua. Los cuerpos de inclusión insolubles pueden estar compuestos por al menos dos grupos de partículas. En primer lugar, la dispersión puede tener partículas de menos de aproximadamente 2,2 pm de tamaño, definidas como coloides, donde la sedimentación no ocurre sustancialmente debido al movimiento browniano. En segundo lugar, la dispersión puede tener partículas de más de aproximadamente 2,2 pm de tamaño, pero menos de aproximadamente l0 pm o menos de aproximadamente 5 pm en ciertas realizaciones, donde se produce sedimentación debido al flujo de Stokes, pero la velocidad es lo suficientemente lenta como para mejorar el replegamiento a alta presión a gran escala. Las partículas finas tienen un tamaño sustancialmente uniforme, teniendo la mayoría de las partículas de cuerpos de inclusión en masa un tamaño de menos de aproximadamente 5 pm y que no varían sustancialmente. Por ejemplo, al menos el 75 % o al menos el 85 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % de las partículas del cuerpo de inclusión tienen una ventana de tamaño de 5 pm. En algunas realizaciones, al menos el 75 % o al menos el 85 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % de las partículas del cuerpo de inclusión están dentro de una ventana de tamaño de 2 pm. El tamaño pequeño y la distribución de tamaños de las partículas finas del cuerpo de inclusión hace que la dispersión sea más estable frente a la sedimentación durante el tratamiento a alta presión. Además, en algunas realizaciones, las partículas de cuerpos de inclusión en la dispersión muestran una menor propensión a la agregación, lo que hace que el procedimiento general sea más eficiente, práctico y consistente de un lote a otro. En algunas realizaciones, la dispersión se estabiliza aún más mediante el uso del pH, la fuerza iónica, compuestos de exclusión preferente, detergentes y polímeros que aumentan la estabilidad de la dispersión alterando el potencial zeta. Por lo tanto, la dispersión de cuerpos de inclusión está diseñada para consistir esencialmente en partículas que tienen un tamaño inferior a aproximadamente 10 pm o inferior a aproximadamente 5 pm para evitar la sedimentación o que son lo suficientemente pequeñas como para minimizar las velocidades de sedimentación como describe el flujo de Stokes. En diversas realizaciones, estas partículas tienen un potencial zeta que está fuera del intervalo de ± 10, ± 20 o ± 30 para evitar la propensión a la agregación.

Tal como se desvela en el presente documento, el diámetro de las partículas del cuerpo de inclusión y su distribución, suficiente para guiar el rendimiento del replegamiento, puede cuantificarse mediante el uso de al menos uno de los contadores Coulter, formación de imágenes, difracción láser y dispersión dinámica de luz, o una técnica similar. El comportamiento real (por ejemplo, la tasa de sedimentación) de las preparaciones de cuerpos de inclusión en un sistema acuoso a alta presión no se ha caracterizado previamente y no se conocía la relevancia para los efectos de escala y la pérdida de rendimiento. Por ejemplo, las contribuciones del tamaño del cuerpo de inclusión y el estado de floculación hacen que el tamaño aparente bajo alta presión sea ambiguo, ya que el tratamiento a alta presión podría acelerar potencialmente la floculación de los cuerpos de inclusión o, alternativamente, podría romper rápidamente los floculantes de modo que tengan poco potencial para impulsar la sedimentación. La floculación, que implica tanto interacciones proteína-proteína recombinantes como interacciones con restos celulares, puede variar dependiendo de la proteína, el procedimiento y las condiciones para la alteración celular, las condiciones de tamponamiento y las etapas de procesamiento. Además, el estado de floculación de los cuerpos de inclusión tradicionalmente no se ha caracterizado porque es en gran parte irrelevante cuando los cuerpos de inclusión se solubilizan con agentes caotrópicos o detergentes desnaturalizantes. Cuando se tiene en cuenta la floculación, los cuerpos de inclusión pueden tener una enorme variabilidad de tamaño en el intervalo de aproximadamente 1 pm a más de 50 pm. Dependiendo del comportamiento del floculante a alta presión, el estado floculante particular de los cuerpos de inclusión y la variabilidad de la floculación de un lote a otro, existe la posibilidad de una gran pérdida de rendimiento y pérdida de consistencia de replegamiento a alta presión, especialmente en grandes volúmenes.

El tamaño relevante y / o las propiedades físicas de los cuerpos de inclusión pueden ser difíciles de caracterizar, en parte debido a la tendencia a flocular. Por ejemplo, el tamaño de los cuerpos de inclusión se ha caracterizado en alrededor de 1 pm [Peternel y Komel, Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microbial Cell Factories 20109:66; Balduino y col., Refolding by High Pressure of a Toxin Containing Seven Disulfide Bonds: Bothropstoxin-1 from Bothrops jararacussu Mol. Biotechnol. 48:228-234 (2011)], lo que sugeriría una tasa de sedimentación en condiciones no desnaturalizantes que sería adecuada para el replegamiento a alta presión. El impacto de la floculación, que puede ser responsable de tamaños de partículas mucho más grandes de hasta 50 pm, sobre la velocidad de sedimentación durante el replegamiento a alta presión no se ha caracterizado. Sin embargo, como se muestra en el presente documento, el tamaño de los cuerpos de inclusión es suficiente para afectar sustancialmente al rendimiento del replegamiento a presión y que una dispersión estable de las preparaciones de cuerpos de inclusión tiene un efecto positivo significativo en el rendimiento del replegamiento, especialmente a volúmenes de replegamiento más altos, e incluso en condiciones no desnaturalizantes.

Dado que los informes anteriores de replegamiento a alta presión se realizaron a pequeña escala, la concentración aparente de proteína no fue crítica para los rendimientos de replegamiento, en relación con escalas más grandes. Hay informes donde los cuerpos de inclusión se replegaron con alta presión, cada vez sin caracterización del tamaño de partícula o sin intentos de controlar el tamaño de partícula, y sin referencia a la floculación o sus efectos en el procedimiento. Un estudio intentó prevenir la sedimentación durante la espectroscopia UV de alta presión mediante el uso de hidroxi-etil-almidón, lo que dio como resultado menores rendimientos de replegamiento debido a la exclusión preferente (St. John, Carpenter y col. 2001; Seefeldt, Crouch y col. 2007). Cuando se intentó el replegamiento a gran escala de cuerpos de inclusión INF-beta-lb, la sedimentación de los cuerpos de inclusión fue tan significativa que el procedimiento de replegamiento de los cuerpos de inclusión fue ineficaz, con rendimientos inferiores al 5 %. El problema se resolvió adoptando técnicas de solubilización basadas en productos químicos antes del tratamiento a presión. Véase la patente de Estados Unidos 8.273.561. Los presentes inventores intentaron otras formas de evitar la sedimentación del cuerpo de inclusión durante el tratamiento a alta presión, incluyendo el desarrollo de equipos para agitar o mezclar bajo presión, pero estos esfuerzos resultaron ser difíciles de escalar. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 7.767.795 y el documento US 2009/0215998.

La presente invención prepara una dispersión estable de cuerpos de inclusión para evitar la sedimentación de partículas de cuerpos de inclusión durante el tratamiento a alta presión. Los cuerpos de inclusión a menudo floculan fácilmente (incluso bajo alta presión en algunos casos) con potenciales zeta de menos de -10 mV y generalmente se comportan de manera diferente a otros tipos de agregados de proteínas tales como agregados inducidos por procedimientos o precipitantes de proteínas. Por ejemplo, mientras que las partículas subvisibles a menudo se encuentran en el intervalo de 0,2-10 pm, estas partículas no exigen etapas de procedimiento de control de tamaño debido, por ejemplo, a su prevalencia extremadamente baja (típicamente <2 %), que es demasiado baja para crear un gradiente significativo de concentración de proteínas. Aún más, los agregados de proteínas sin cuerpos de inclusión son generalmente un material más limpio, están unidos más libremente, tienen un potencial floculante más bajo y pueden romperse con fuerzas de cizallamiento bajas, de tal manera que no hay necesidad de procedimientos duros que tienen el potencial de crear agregación inducida por procedimientos.

En determinadas realizaciones, la invención implica la creación de una dispersión estable de una preparación de cuerpos de inclusión que tiene una floculación sustancial. Por ejemplo, antes de la dispersión, la preparación de cuerpos de inclusión puede tener una amplia gama de tamaños de partículas desde menos de aproximadamente 1 pm hasta más de aproximadamente 20 pm o más de aproximadamente 30 pm, 40 pm, 50 pm o 100 pm. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 10 %, más de aproximadamente el 25 % o más de aproximadamente el 50 % de las partículas son mayores de aproximadamente 10 pm o más de aproximadamente 5 pm y, por tanto, pueden afectar significativamente al rendimiento de replegamiento a alta presión.

Se pueden usar dispositivos tales como un contador Coulter, generador de imágenes, difracción láser y dispersión dinámica de la luz para caracterizar el tamaño de partícula de las dispersiones de cuerpos de inclusión, para asegurar que los tamaños de partícula estén en el intervalo de tamaño apropiado y mantener la consistencia de un lote a otro. Un dispositivo de contador Coulter, por ejemplo, proporciona una medida precisa del tamaño del cuerpo de inclusión para el replegamiento a alta presión. Un contador Coulter mide el diámetro y la distribución de las partículas midiendo las perturbaciones en la conductividad eléctrica cuando las partículas se mueven a través de una sección transversal fija. La fuerza gravitacional es una constante bien definida. La viscosidad de la solución y la densidad de la partícula y el fluido (agua) es función de la composición del soluto. Después de realizar estos cálculos, se puede obtener una comprensión de las velocidades de sedimentación de todas las partículas en el tampón de replegamiento apropiado.

La presente invención en algunas realizaciones incorpora una etapa de cizallamiento mecánico de cuerpos de inclusión para preparar la dispersión de cuerpos de inclusión, por ejemplo mediante el uso de un homogeneizador de alta presión. El tamaño y / o diámetro del cuerpo de inclusión y el estado de floculación después de la dispersión es tal que la velocidad de sedimentación es inferior a aproximadamente 1 cm por hora. De esta manera, los cuerpos de inclusión que se cargan en el replegamiento a alta presión y se tratan a presión tendrán tiempo suficiente para solubilizarse antes de sedimentarse en el fondo del recipiente a presión. Como se muestra en el presente documento, la homogeneización a alta presión es una herramienta eficaz para mejorar el rendimiento del replegamiento a alta presión, incluso a escalas mayores. Si bien se ha demostrado que el procesamiento a alta presión en ausencia de condiciones de solución de replegamiento forma agregados inducidos por presión, que se ha demostrado además que son estructuras densas no propensas al replegamiento a alta presión (Seefeldt, Crouch y col. 2007), la presente divulgación muestra que los cuerpos de inclusión tratados mediante homogeneización a alta presión generalmente no exhiben tales propiedades.

Sorprendentemente, creando una dispersión de cuerpos de inclusión antes del replegamiento a alta presión, se pueden obtener rendimientos sustancialmente mejorados. En diversas realizaciones, se pueden obtener rendimientos de replegamiento superiores a aproximadamente el 30 %, superiores a aproximadamente el 40 %, superiores a aproximadamente el 50 %, superiores a aproximadamente el 60 %, superiores a aproximadamente el 70 %, superiores a aproximadamente el 80 %, superiores a aproximadamente el 90 % o cercanos al 100 %. Estos rendimientos pueden obtenerse incluso en condiciones no desnaturalizantes e incluso a gran escala. Este resultado no era posible anteriormente. En algunas realizaciones, el volumen del recipiente a presión utilizado para el replegamiento a alta presión es de aproximadamente 5 litros o más. En algunas realizaciones, el volumen del recipiente a presión utilizado para el replegamiento a alta presión es de aproximadamente 10 l o más. En algunas realizaciones, el volumen del recipiente a presión utilizado para el replegamiento a alta presión es de aproximadamente 15 l o más, o al menos 25 l o más, o al menos 50 l o más, o al menos 100 l o más, o al menos 125 l o más, o al menos 150 l o más o al menos 200 l o más.

Por lo tanto, en diversas realizaciones, la dispersión de cuerpos de inclusión no es desnaturalizante, esto es, la dispersión no contiene una cantidad desnaturalizante de detergentes (por ejemplo, SDS) o agentes caotrópicos (por ejemplo, urea o HCl de guanidinio). En algunas realizaciones, los agentes desnaturalizantes no están presentes en la dispersión, haciendo que su eliminación aguas abajo sea innecesaria. En algunas realizaciones, pueden emplearse niveles no desnaturalizantes de un detergente u otro agente que desnaturalice a concentraciones más altas. Por ejemplo, los detergentes u otro agente en el sistema tampón de replegamiento no es suficiente para solubilizar los cuerpos de inclusión.

La presente invención en algunas realizaciones, incorpora la selección de condiciones de solución que incluyen al menos una de pH, fuerza iónica, detergentes, compuestos de exclusión preferente y polímeros que pueden limitar la floculación y proporcionar una dispersión estable durante el almacenamiento del cuerpo de inclusión antes del replegamiento. En algunas realizaciones, las condiciones de solución seleccionadas también son efectivas para replegar la proteína a alta presión hidrostática. En algunas realizaciones, las condiciones de la solución se pueden seleccionar durante la recolección de cuerpos de inclusión evitando la necesidad de técnicas de rehomogeneización. Aunque sin querer limitarse a la teoría, las condiciones de la solución se seleccionan para aumentar el potencial zeta de las partículas del cuerpo de inclusión para que estén fuera del intervalo de aproximadamente ± 10 mV, aproximadamente ± 20 mV, aproximadamente ± 30 mV o aproximadamente ± 40 mV, para facilitar una dispersión coloidal estable (Duffy y Hill 2011).

La proteína producida a través de cuerpos de inclusión puede ser cualquier proteína, por ejemplo, cualquier proteína que se produzca a escala de fabricación. En diversas realizaciones, la proteína es una enzima industrial o una proteína terapéutica. La proteína terapéutica es una proteína para terapia humana o veterinaria. En algunas realizaciones, la proteína tiene un límite de solubilidad de menos de aproximadamente 100 mg / ml (por ejemplo, en una solución acuosa a un pH o aproximadamente 7), o menos de aproximadamente 50 mg / ml, o menos de aproximadamente 20 mg / ml, o menos de aproximadamente 10 mg / ml, o menos de aproximadamente 5 mg / ml. En estas u otras realizaciones, la proteína tiene uno o más enlaces disulfuro.

La proteína puede ser una proteína recombinante terapéutica, tal como una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que puede ser quimérica o humanizada), un dominio de unión a antígeno o un anticuerpo de cadena sencilla, una proteína que contiene dominio Fc (por ejemplo, ENBREL) u otra proteína terapéutica. Cuando la proteína comprende un anticuerpo o dominio de anticuerpo, el anticuerpo o dominio puede ser de cualquier isotipo humano, tal como un isotipo IgG. Las proteínas terapéuticas de ejemplo incluyen una interleucina o interferón (por ejemplo, un interferón-alfa, interferón-beta o interferón-gamma), proteína o hormona peptídica o factor de crecimiento (por ejemplo, insulina, GLP, eritropoyetina, GM-CSF u hormona del crecimiento humano), factor de coagulación (por ejemplo, factor VII, factor VIII) o enzima para terapia de reemplazo (por ejemplo, uricasa, MYOZYME, fenilalanina hidroxilasa, fenilalanina amoniaco liasa). La proteína terapéutica puede comprender proteínas de longitud completa o porciones funcionales de las mismas y puede contener modificaciones conocidas en la técnica para mejorar la actividad y / o la estabilidad de la molécula.

La proteína terapéutica recombinante puede ser una proteína grande de una o más de una subunidad. Por ejemplo, la proteína puede tener un tamaño superior a aproximadamente 500 kDa, 400 kDa, 200 kDa, 100 kDa, 75 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 10 kDa, 5 kDa, 2 kDa o 0,25 kDa. En determinadas realizaciones, la proteína recombinante comprende una pluralidad de cadenas polipeptídicas, que opcionalmente pueden estar conectados por uno o más enlaces disulfuro.

Las proteínas terapéuticas de ejemplo incluyen interferón-alfa; interferón-alfa 2a (Roferon-A; Pegasys); interferón-beta Ib (Betaseron); interferón-beta Ia (Avonex); insulina (por ejemplo, Humulin-R, Humalog); ADNasa (Pulmozyme); Neupogen; Epogen; Procrit (epoteína alfa); Aranesp (Procrit de segunda generación); Intrón A (interferón alfa 2b); Rituxan (Rituximab anti-CD20); IL-2 (proleucina); IL-I ra (Kineret); BMP-7 (osteogenina); TNF-alfa 1a (Beromun); HUMIRA (MAB anti-TNF-alfa); tPA (Tenecteplase); PDGF (Regranex); interferón-gamma Ib (Actimmune); uPA; GMCSF; factor VII, Factor VIII; Remicade (infliximab); Enbrel (Etanercapt); Betaferon (interferón beta-Ia); Saizen (somatotropina); Erbitux (cetuximab); Norditropin (somatropina); Nutropina (somatropina); Genotropina (somatropina); Humatrope (somatropina); Rebif (interferón beta Ia); Herceptin (trastuzumab); abatacept (Orencia) y Humira (adalimumab); Xolair (omalizumab); Avastin (bevacizumab); Neulasta (pegfilgrastin); Cerezyme (imiglucerasa); y motavizumab. La secuencia de aminoácidos y / o la estructura de tales proteínas terapéuticas son conocidas en la técnica.

La preparación de proteínas se recupera de las células hospedadoras en forma insoluble (por ejemplo, cuerpos de inclusión) y, en algunas realizaciones, a escala de fabricación. La expresión de proteínas en cuerpos de inclusión es bien conocida. Las células hospedadoras son células microbianas que expresan proteínas recombinantes como cuerpos de inclusión, tales como E. coli. Los homogeneizadores de alta presión se comercializan para llevar a cabo lisis celular para recuperar cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la célula hospedadora puede romperse por medios mecánicos, tales como un homogeneizador Manton-Gaulin o una prensa francesa. Se prefiere que el procedimiento de rotura se lleve a cabo de manera que los desechos celulares del organismo huésped se rompan de tal manera que no sedimenten de la solución homogeneizada bajo una centrifugación a baja velocidad suficiente para sedimentar los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se pueden resuspender, lavar y centrifugar nuevamente. El sobrenadante se descarta produciendo una preparación sustancialmente pura de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, cuando se utiliza un homogeneizador de alta presión para la lisis celular, las células enteras se pueden suspender en, por ejemplo, un tampón Tris 20 mM, EDTA 2 mM antes del procesamiento. En otras realizaciones, se utilizan procedimientos químicos y / o sonicación para romper las células y recuperar los cuerpos de inclusión. Las condiciones de rotura celular pueden afectar a las propiedades de los cuerpos de inclusión [véase Van Hee y col., Relation between cell disruption conditions, cell debris particle size, and inclusion body release, Biotechnol. Bioeng. 5;88(1): 100-10 (204)], y, por lo tanto, la rotura celular es un factor a optimizar con respecto a la proteína particular de interés que se replegará de acuerdo con la invención. El tamaño de partícula de los cuerpos de inclusión no ha sido tradicionalmente un problema de procedimiento para la producción de proteínas recombinantes, porque los procedimientos siempre incluyen etapas de solubilización de cuerpos de inclusión.

La dispersión de cuerpos de inclusión se puede preparar mediante cualquier técnica adecuada, según se ajuste para la proteína particular, y según sea necesario para producir las propiedades requeridas como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, la técnica de dispersión opera produciendo cizallamiento mecánico, tal como una licuadora de alta velocidad, homogeneizador de alta presión, prensa francesa, molino coloide, dispersor de alta cizalladura u homogeneizador de membranas. Podrían requerirse múltiples pasadas a través del equipo para obtener la dispersión adecuada. La dispersión de cuerpos de inclusión no es auxiliada sustancialmente por desnaturalizantes o compuestos solubilizantes, y los cuerpos de inclusión no necesitan solubilizarse y precipitarse antes del tratamiento a alta presión.

Las condiciones del procedimiento para cualquier técnica o equipo de homogeneización particular deben establecerse evaluando el tamaño de partícula como se desvela en el presente documento. En diversas realizaciones, se predice que las partículas del cuerpo de inclusión en la dispersión tendrán una tasa de sedimentación de 10 cm por hora o menos (basado en el tamaño promedio de las partículas, que se puede determinar como se describe en el presente documento), reduciendo el impacto de la sedimentación en el rendimiento del replegamiento por tratamiento de alta presión. En algunas realizaciones, las partículas del cuerpo de inclusión tienen una tasa de sedimentación de 5 cm por hora o menos, o una tasa de sedimentación de 1 cm por hora o menos. Por lo tanto, la mayoría de las partículas de cuerpos de inclusión en masa tienen un tamaño de 10 pm o menos, o, en otras realizaciones, la mayoría de las partículas de cuerpos de inclusión en masa tienen un tamaño de 5 pm o menos, o, en otras realizaciones, la mayoría de las partículas de cuerpos de inclusión en masa tienen un tamaño de 3 pm o menos, o un tamaño de 2 pm o menos. En algunas realizaciones, las partículas de la dispersión consisten esencialmente en partículas de menos de aproximadamente 2,2 pm de tamaño, que soportan las propiedades coloidales de la dispersión, así como partículas en el intervalo de aproximadamente 2,2 pm a aproximadamente 5 pm de tamaño, que no se sedimentarán sustancialmente durante una reacción de replegamiento a alta presión. En algunas realizaciones, la mayoría de las partículas tienen menos de aproximadamente 2,2 pm. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % de las partículas están por debajo del tamaño de aproximadamente 2,2 pm. Generalmente, el tamaño de las partículas de cuerpos de inclusión es sustancialmente homogéneo y no varía sustancialmente (por ejemplo, con solo aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 % o aproximadamente un 20 % de valores atípicos) en más de aproximadamente 5 pm, aproximadamente 4 pm, aproximadamente 3 pm o aproximadamente 2 pm.

La dispersión de cuerpos de inclusión se puede estabilizar después de la cosecha o después de la dispersión de una preparación de cuerpos de inclusión floculados y su tasa de sedimentación se puede ajustar mediante la adición de productos químicos que modifican el potencial zeta, tal como pH, fuerza iónica, detergentes no desnaturalizantes o agentes que aumentan la viscosidad. Muchos reactivos que aumentan la viscosidad son también compuestos de exclusión preferente que estabilizan las estructuras de los agregados y modulan los volúmenes de proteínas, impidiendo la solubilización y el replegamiento de los cuerpos de inclusión (Arakawa y Timasheff 1982; Timasheff 1992; Timasheff 1993; Qoronfleh, Hesterberg y col. 2007; Seefeldt, Crouch y col. 2007). Sin embargo, la invención, en algunos aspectos y realizaciones, implica lograr el equilibrio entre estabilizar la dispersión (por ejemplo, evitar la sedimentación y / o la floculación) sin estabilizar sustancialmente las partículas del cuerpo de inclusión para que no se desagreguen y replieguen a alta presión. Los agentes que aumentan la viscosidad incluyen, por ejemplo, glicerol, sacarosa, trehalosa, polietilenglicol, que también alteran la estructura del agua. En algunas realizaciones, tales agentes se añaden en particular cuando se incluye una etapa de congelación-descongelación antes del tratamiento a alta presión, para prevenir la floculación. Los productos químicos que modifican el potencial zeta son bien conocidos en la técnica y funcionan sobre la base de aumentar la repulsión carga-carga. Potenciales zeta de aproximadamente ± 20, aproximadamente ± 30, o aproximadamente ± 40 son suficientes para estabilizar las dispersiones coloidales en diversas realizaciones y pueden modificarse por pH, fuerza iónica y agentes de replegamiento cargados. El potencial zeta se puede cuantificar mediante técnicas de dispersión de luz.

En algunas realizaciones, la dispersión es estable durante un período de al menos una semana, al menos dos semanas, al menos un mes o al menos dos meses, sin más redispersión antes del replegamiento a alta presión.

Debido a que las partículas del cuerpo de inclusión en la dispersión no se sedimentarán sustancialmente, la concentración aparente de proteína se mantiene por debajo del límite de solubilidad de la proteína durante el tratamiento a alta presión. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la concentración aparente de proteína en todo el recipiente de alta presión es menos de aproximadamente 50 mg / ml durante el tratamiento de alta presión. En otras realizaciones, la concentración aparente de proteína en todo el recipiente a presión es menos de aproximadamente 30 mg / ml o es menos de aproximadamente 10 mg / ml o menos o es menos de aproximadamente 5 mg / ml o menos.

En algunas realizaciones, la dispersión de los cuerpos de inclusión se somete a alta presión desde aproximadamente 100 MPa hasta aproximadamente 500 MPa. En algunas realizaciones, el tratamiento a alta presión de la dispersión de los cuerpos de inclusión tiene lugar sin solubilización y / o precipitación de los cuerpos de inclusión.

Generalmente, el replegamiento tiene lugar en una ventana de presión. En algunas realizaciones, la ventana de presión es de aproximadamente 100 MPa a aproximadamente 250 MPa o de aproximadamente 100 MPa a aproximadamente 200 MPa. En otras realizaciones, la ventana puede ser de aproximadamente 125 MPa a aproximadamente 225 MPa o de aproximadamente 150 MPa a aproximadamente 200 MPa. Generalmente, la preparación se expone a alta presión dentro de una ventana de presión que da como resultado la desagregación y replegamiento. La alta presión está generalmente por debajo de la que desnaturalizaría irreversiblemente la proteína. Las condiciones de alta presión se seleccionan para no inducir agregación, cuando las condiciones incluyen magnitud de alta presión, duración del tratamiento de alta presión, concentración de proteína, temperatura, pH, fuerza iónica, concentración de caótropos (si se usan), concentración de tensioactivo, concentración de tampón, concentración de compuestos de exclusión preferente u otros parámetros de solución como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el tratamiento de "alta presión" significa una presión de al menos aproximadamente 25 MPa. El tratamiento de alta presión de acuerdo con las realizaciones de la invención puede ser de al menos aproximadamente 25 MPa de presión, al menos aproximadamente 40 MPa de presión, al menos aproximadamente 50 MPa de presión, al menos aproximadamente 100 MPa de presión, al menos aproximadamente 200 MPa de presión, al menos aproximadamente 300 MPa de presión, al menos aproximadamente 500 MPa de presión o al menos aproximadamente 1.000 MPa de presión. Presión "atmosférica", "ambiente" o "estándar" se define como aproximadamente 15 libras por pulgada cuadrada (psi) o aproximadamente 1 bar o aproximadamente 100.000 Pascales. La selección de condiciones para alta presión puede guiarse con técnicas adecuadas para evaluar el rendimiento de replegamiento y la proteína activa, incluyendo ensayos de actividad, ELISA, SDS-PAGE, cromatografía de fase inversa (RP), otros ensayos basados en HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de fase inversa (RP), otros ensayos basados en HPLC, dispersión / oscurecimiento de la luz, entre otras técnicas.

Los recipientes de alta presión están disponibles comercialmente (por ejemplo, High Pressure Equipment Co., Erie, Pensilvania). Las técnicas de alta presión se describen en las patentes de Estados Unidos números 6.489.450 y 7.064.192, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2004/0038333 y la solicitud de patente internacional WO 02/062827. También se han desarrollado ciertos dispositivos que son particularmente adecuados para el replegamiento de proteínas a alta presión; véase la Publicación de Solicitud de Patente Internacional n.° WO 2007/062174. Los parámetros de condición que se deben ajustar para un tratamiento favorable a alta presión se describen a continuación. Los recipientes horizontales pueden estar disponibles de National Calibration Inc. (Phoenix, AZ).

En algunos aspectos y realizaciones de la invención, el eje horizontal del recipiente a presión es al menos dos veces el eje vertical. Un recipiente a presión con una gran superficie horizontal, como se muestra en el presente documento, admite un mayor rendimiento mediante el plegamiento a alta presión. Los recipientes de alta presión de carga vertical se han utilizado generalmente para realizar experimentos de alta presión y pasteurización de alimentos. Estos recipientes convencionales se llenan fácilmente con muestras de procesamiento y fluido transmisor de presión. El fluido puede mantenerse en el sistema mientras se llena mediante la aplicación de válvulas simples. También existe el fenómeno de que la tensión del aro y, en consecuencia, la resistencia de un recipiente a presión, se rige por la relación entre el diámetro exterior e interior del recipiente y da como resultado que el volumen de muchos recipientes se controle más fácilmente alterando la altura del recipiente, no el diámetro del recipiente. La combinación de estas propiedades da como resultado el desarrollo natural de recipientes a presión verticales que son "estrechos" en dimensión, maximizando la altura mientras minimiza el diámetro para un volumen dado.

A medida que se escalan los replegamientos a alta presión, los recipientes a presión de carga vertical se vuelven cada vez más problemáticos a medida que aumenta la concentración de proteína aparente con el aumento de la altura del recipiente a presión. El problema es exclusivo del replegamiento a alta presión, ya que los procedimientos de pasteurización a alta presión son independientes de la ubicación de los alimentos dentro del recipiente. Muchas otras reacciones de alta presión ocurren en soluciones con densidad constante. La invención en algunos aspectos propone implementar recipientes de carga horizontal para replegamiento a gran escala, disminuir la altura de los recipientes a presión, aumentar el área de la superficie en el fondo del recipiente y, por tanto, disminuir la concentración de proteína aparente en relación con los recipientes cargados verticalmente. En este punto, solo hay disponibles recipientes a presión que son de configuración vertical. La llegada de los recipientes a presión de carga horizontal a gran escala es particularmente adecuada para el replegamiento a alta presión, no debido al aumento de las tasas de carga, la aplicación típica, sino más bien la capacidad de disminuir la concentración aparente en el sistema de replegamiento.

La concentración de proteína de la dispersión de cuerpos de inclusión que se somete a un tratamiento a alta presión puede estar generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg / ml a aproximadamente 50 mg / ml, tal como al menos aproximadamente 1,0 mg / ml, al menos aproximadamente 5,0 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml o al menos aproximadamente 20 mg/ml, pero dependerá del límite de solubilidad de la proteína.

La duración del tratamiento a alta presión puede seleccionarse basándose en el rendimiento del replegamiento. Generalmente, el tratamiento a alta presión se puede realizar durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 50 horas, o posiblemente más. En algunas realizaciones, la duración del tratamiento de alta presión es de hasta aproximadamente 1 semana, aproximadamente 5 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 3 días, etc.). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la duración suficiente para el replegamiento es de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 horas, de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 2 a aproximadamente 18 horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas.

Los componentes de la solución pueden ser uno o más agentes seleccionados entre uno o más agentes estabilizantes, uno o más agentes tampón, uno o más tensioactivos, uno o más pares de agentes de mezcla de disulfuro, una o más sales, o combinaciones de dos o más de los anteriores. Cuando dicho(s) componente(es) no son farmacéuticamente aceptables, el o los componentes añadidos deben poder eliminarse de la preparación de proteínas antes de la administración como producto farmacéutico. Dichos componentes pueden eliminarse mediante diálisis o cromatografía. En algunas realizaciones, la dispersión de cuerpos de inclusión no contiene caótropos ni detergente desnaturalizante. Los agentes de ejemplo incluyen, pero sin limitación, tampones (los ejemplos incluyen, pero sin limitación, tampón fosfato, tampón borato, tampón carbonato, tampón citrato, HEPES, MEPS), sales (los ejemplos incluyen, pero sin limitación, las sales de cloruro, sulfato y carbonato de sodio, cinc, calcio, amonio y potasio), caótropos (cuando se emplean, los ejemplos incluyen, urea, hidrocloruro de guanidina, sulfato de guanidina y sarcosina) y agentes estabilizantes (por ejemplo, compuestos de exclusión preferente, etc.). Los componentes de la solución también pueden seleccionarse para facilitar el replegamiento y estabilizar la dispersión del cuerpo de inclusión.

Se pueden usar aminoácidos para prevenir la reagregación y facilitar la disociación de los enlaces de hidrógeno. Los aminoácidos típicos que se pueden utilizar, sin limitación, son arginina, lisina, prolina, glicina, histidina y glutamina o combinaciones de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, el o los aminoácidos libres están presentes en una concentración de aproximadamente 0,1 mM hasta aproximadamente el límite de solubilidad del aminoácido y, en algunas variaciones, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2 M. La concentración óptima es una función de la proteína deseada y debe favorecer la conformación nativa. Los aminoácidos tienen carga asociada en función de la solución y el pKa de los grupos salientes y afectarán al potencial zeta y, por lo tanto, la estabilidad de la dispersión, ajustando la fuerza iónica y el dieléctrico de la solución.

Se pueden usar compuestos de exclusión preferente para estabilizar la conformación nativa de la proteína de interés. Los posibles compuestos de exclusión preferente incluyen, pero sin limitación, sacarosa, hexilenglicol, azúcares (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, dextrosa, manosa) y glicerol. El intervalo de concentraciones que se puede utilizar va desde 0,1 mM hasta la concentración máxima en el límite de solubilidad del compuesto específico. Las concentraciones de ejemplo incluyen aquellas que son consistentes con la osmolalidad fisiológica. La concentración de exclusión preferente óptima es función de la proteína de interés. Muchos reactivos que aumentan la viscosidad son también compuestos de exclusión preferente que estabilizan las estructuras de los agregados y modulan los volúmenes de proteínas, impidiendo la solubilización y el replegamiento de los cuerpos de inclusión (Arakawa y Timasheff 1982; Timasheff 1992; Timasheff 1993; Qoronfleh, Hesterberg y col. 2007; Seefeldt, Crouch y col. 2007). Sin embargo, en algunas realizaciones, la invención implica lograr el equilibrio entre prevenir la floculación y la sedimentación aplicando una concentración de uno o más compuestos de exclusión preferente, pero evitando concentraciones de compuestos de exclusión preferente que de otro modo podrían estabilizar las partículas del cuerpo de inclusión haciéndolas más resistentes al tratamiento a alta presión.

Pueden estar presentes agentes tampón para mantener un valor de pH o un intervalo de pH deseados. Los expertos en la técnica conocen numerosos agentes tampón adecuados y deben seleccionarse basándose en el pH que favorece (o al menos no desfavorece) la conformación nativa (monomérica) de la proteína de interés. Se pueden utilizar agentes tampón inorgánicos u orgánicos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se utiliza al menos un agente tampón inorgánico (por ejemplo, fosfato, carbonato, etc.). En determinadas realizaciones, se utiliza al menos un agente tampón orgánico (por ejemplo, citrato, acetato, Tris, MOPS, MES, HEPES, etc.). Los agentes tampón orgánicos e inorgánicos adicionales son bien conocidos en la técnica. Los componentes tampón ajustan el pH de la solución y controlan la carga neta y la distribución de la carga en las partículas del cuerpo de inclusión. Como también se cargan los componentes del tampón, también modifican la fuerza iónica de la solución. Ambos factores influyen en el potencial zeta y deben probarse para evaluar su impacto en la estabilidad de la dispersión.

También se puede incluir un tensioactivo, un compuesto de superficie activa para reducir la tensión superficial del agua. Los tensioactivos también pueden mejorar la solubilidad de la proteína de interés. Los tensioactivos se pueden utilizar a concentraciones superiores o inferiores a su concentración micelar crítica (CMC), por ejemplo, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente 20 % por encima o por debajo de la CMC. Sin embargo, estos valores variarán dependiendo del tensioactivo elegido, por ejemplo, tensioactivos, tales como, beta-octilglucopiranósido, pueden ser eficaces a concentraciones más bajas que, por ejemplo, tensioactivos, tales como TWEEN-20 (polisorbato 20). La concentración óptima es función de cada tensioactivo, que tiene su propia CMC. En algunas realizaciones, no se emplean tensioactivos. Cuando se usan, los tensioactivos potenciales incluyen no iónicos (incluyendo, pero sin limitación, t-octilfenoxi-polietoxi-etanol y polioxietilensorbitán), agentes aniónicos (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio) y catiónicos (por ejemplo, cloruro de cetilpiridinio) y anfóteros. Los tensioactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, desoxicolato, octilsulfato de sodio, tetradecilsulfato de sodio, éteres de polioxietileno, colato de sodio, octiltioglucopiranósido, n-octilglucopiranósido, bromuros de alquiltrimetilamonio, cloruros de alquiltrimetilamonio, sulfobetaínas no detergentes y bis(2-etilhexil)sulfosuccinato de sodio. En algunas realizaciones, el tensioactivo puede ser polisorbato 80, polisorbato 20, sarcosilo, Triton X-100, p-octil-glucopiranósido o Brij 35. También se ha demostrado que los tensioactivos impactan fuertemente sobre el potencial zeta, pero deben probarse de forma independiente ya que modifican tanto la hidrofobicidad como la carga de la proteína. El potencial zeta también se ve afectado por la cantidad de tensioactivo aniónico en la solución. Véase Malhotra y Coupland, The effect of surfactants on the solubility, zeta potential, and viscosity of soy protein isolates, Food Hydrocolloids 18 (2004) 101-108.

Cuando la proteína deseada contiene enlaces disulfuro en la conformación nativa, generalmente es ventajoso incluir al menos un par de agentes de mezcla disulfuro en la mezcla. Las concentraciones de compuestos reactivos con tiol son suficientemente bajas como para no alterar significativamente el potencial zeta.

Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en un intervalo de valores de temperatura, dependiendo de la proteína particular de interés. Por ejemplo, la proteína se puede replegar (por ejemplo, desagregar) a varias temperaturas, incluso aproximadamente a temperatura ambiente, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 100 °C, o aproximadamente 125 °C. Generalmente, la temperatura variará de aproximadamente 0 a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 10 a aproximadamente 37 °C, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 °C.

En algunas realizaciones, la temperatura puede oscilar entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 100 °C sin afectar negativamente a la proteína de interés, siempre que antes de volver a la temperatura ambiente, la mezcla se lleve a una temperatura a la que no se congelará.

Aunque a menudo se utilizan temperaturas elevadas para provocar la agregación de proteínas, cuando se combina con un aumento de la presión hidrostática, el aumento de las temperaturas puede mejorar la recuperación del replegamiento efectuada por el tratamiento a alta presión, siempre que las temperaturas no sean tan altas como para provocar una desnaturalización irreversible. Generalmente, el aumento de temperatura para el replegamiento debe ser aproximadamente 20 °C más bajo que las temperaturas a las que se produce una pérdida irreversible de actividad. Se pueden usar temperaturas relativamente altas (por ejemplo, de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 125 °C, mientras la solución está bajo presión, siempre que la temperatura se reduzca a una temperatura adecuadamente baja antes de despresurizar. Una temperatura tan adecuadamente baja se define como aquella por debajo de la cual se produce la desnaturalización o agregación inducida térmicamente en condiciones atmosféricas. Los aumentos de temperatura aumentan el impacto del movimiento browniano de la solución y podrían aumentar la estabilidad de algunas dispersiones.

Cuando la reducción de presión se realiza de forma continua, la tasa de reducción de la presión puede ser constante o puede aumentarse o disminuirse durante el período en el que se reduce la presión. En algunas variaciones, la tasa de reducción de la presión es de aproximadamente 500 a 200 MPa / 1 segundo a aproximadamente 500 a 200 MPa/ 4 días (o aproximadamente 3 días, aproximadamente 2 días, aproximadamente 1 día). En algunas realizaciones, la reducción de presión puede ser aproximadamente instantánea, como cuando se libera presión simplemente abriendo el dispositivo en el que está contenida la muestra y liberando inmediatamente la presión.

Cuando la reducción de presión se realiza de manera escalonada, el procedimiento comprende bajar la presión desde la presión más alta utilizada hasta al menos un nivel secundario que sea intermedio entre el nivel más alto y la presión atmosférica. El objetivo es proporcionar un período de incubación o retención en o alrededor de esta zona de presión intermedia que permita que una proteína adopte una conformación deseada.

En algunas realizaciones, cuando hay al menos dos reducciones de presión escalonadas, puede haber un período de retención a una presión constante entre las etapas intermedias. El período de retención puede ser de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 50 horas (o más, dependiendo de la naturaleza de la proteína de interés). En algunas realizaciones, el período de retención puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 2 a aproximadamente 18 horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas.

En realizaciones particulares, la presión constante después de la reducción escalonada es de aproximadamente cuatro quintos de la presión inmediatamente antes de la reducción escalonada de presión hasta aproximadamente una décima parte de antes de la reducción escalonada de presión. Por ejemplo, la presión constante está a una presión de aproximadamente cuatro quintos a aproximadamente un quinto, de aproximadamente dos tercios a aproximadamente un décimo, de aproximadamente dos tercios a aproximadamente un quinte de la presión inmediatamente antes de la reducción escalonada de la presión. Cuando hay más de una etapa de reducción de presión escalonada, la presión a la que se hace referencia es la presión inmediatamente anterior a la última reducción de presión (por ejemplo, cuando 200 MPa se reduce a 100 MPa se reduce a 50 MPa, la presión de 50 MPa es la mitad de la presión inmediatamente anterior a la reducción anterior (100 MPa).

Cuando la presión se reduce de manera escalonada, la tasa de reducción de presión (por ejemplo, el período de reducción de presión antes y después del período de retención) puede estar en el mismo intervalo que la tasa de reducción de presión descrita para la reducción continua (por ejemplo, de una manera no escalonada). En esencia, la reducción de presión escalonada es la reducción de presión de manera continua a una presión constante intermedia, seguido de un período de retención y luego una reducción adicional de la presión de manera continua. Los períodos de reducción de presión continua antes y después de cada período de retención pueden ser la misma tasa continua para cada período de reducción de presión continua o cada período puede tener una tasa de reducción diferente. En algunas realizaciones, hay dos períodos de reducción continua de la presión y un período de retención.

En determinadas realizaciones, cada período continuo de reducción de presión tiene la misma tasa de reducción de presión. En otras realizaciones, cada período tiene una tasa diferente de reducción de presión. En realizaciones particulares, el período de retención es de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones, el período de retención es de aproximadamente 12 a aproximadamente 18 horas.

El rendimiento de replegamiento de acuerdo con las diversas realizaciones de la invención puede ser superior al 50 %, superior al 60 %, superior al 75 %, superior al 80 % o superior al 90 %, o cercana al 100 % en algunas realizaciones. Los rendimientos de replegamiento pueden determinarse mediante diversas técnicas, incluyendo la caracterización de agregados en solución. Las técnicas incluyen ensayos de actividad, ELISA, SDS-PAGE, cromatografía de fase inversa (RP), otros ensayos basados en HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de fase inversa (RP), otros ensayos basados en HPLC, dispersión / oscurecimiento de la luz, entre otras técnicas.

La preparación de proteínas puede evaluarse mediante cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de permeación en gel, que puede estimar pesos moleculares y números de agregación de proteínas. Dichas técnicas también separan varios agregados de proteínas. Véase Wu, C-S. (editor), Handbook of Size Exclusion Chromatography and Related Techniques, Segunda edición (Chromatographic Science), Marcel Dekker: Nueva York, 2004 (particularmente el capítulo 15 en las páginas 439-462 de Baker y col., "Size Exclusion Chromatography of Proteins") y Wu, C-S. (editor), Column Handbook for Size Exclusion Chromatography, San Diego: Academic Press, 1999 (particularmente los Capítulos 2 y 18).

También se puede usar el oscurecimiento de la luz para medir la agregación de proteínas de la preparación; véase Seefeldt y col., Protein Sci. 14:2258 (2005); Kim y col., J. Biol. Chem. 276: 1626 (2001); y Kim y col., J. Biol. Chem.

277: 27240 (2002).

Se pueden emplear muchos procedimientos de electroforesis en gel (por ejemplo, PAGE desnaturalizante o no desnaturalizante) para analizar proteínas y agregación de proteínas. La PAGE nativa (PAGE no desnaturalizante) se puede usar para estudiar agregados enlazados no covalentemente. Véase, por ejemplo, Hermeling y col. J. Phar. Sci.

95:1084-1096 (2006); Kilic y col., Protein Sci. 12:1663 (2003); Westermeier, R., Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations 4a edición, Nueva York: John Wiley & Sons, 2005; y Hames, B.D. (Ed.), Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, 3a edición, Nueva York: Oxford University Press, EE.UU., 1998.

En algunas realizaciones, la invención se emplea junto con la escisión por proteasa de proteínas de fusión recombinantes en cuerpos de inclusión, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 7.829.681. En algunas realizaciones, la invención se usa junto con la tecnología de autoproteasa Npro (Boehringer Ingelheim). Por ejemplo, la proteína del cuerpo de inclusión puede expresarse como una proteína de fusión que tiene un sitio de escisión por proteasa, y la proteína del cuerpo de inclusión puede ser sometida a alta presión junto con una proteasa suficiente para que la escisión por proteasa libere la proteína de interés. La proteína de fusión puede comprender la proteína de interés (por ejemplo, la proteína terapéutica o enzima industrial) y la proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa es proteasa de pestivirus.

En estas u otras realizaciones, la proteína de fusión puede contener o más de un marcador de HIS, proteína de unión a maltosa, tiorredoxina, glutatión-s-transferasa, DsbA, gphD, FLAG, proteína de unión a calmodulina, streptag II, proteasa de pestivirus, marcador-HA, Softag1, Softag 3, c-myc, marcador-T7, marcador-S, NusA, dominio de unión a quitina, xilanasa 10A, virus del grabado del tabaco y ubiquitina.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de cuerpo de inclusión

Se produjeron inicialmente cuatro muestras de cuerpos de inclusión (CI) utilizando técnicas conocidas como base para comparar el efecto sobre el tamaño de partícula, la velocidad de sedimentación y el rendimiento tras el replegamiento posterior a alta presión usando (1) preparaciones de proteína CI sin tratar como control negativo; y (2) preparaciones de proteína CI tratadas como preparaciones o dispersiones de proteínas estables de acuerdo con la presente invención usando etapas adicionales de procesamiento mecánico de alto cizallamiento, en este caso, como un ejemplo no limitante, usando homogeneización adicional de alto cizallamiento usando un tratamiento NIRO Panda, como se presenta a continuación. Inesperadamente, el tratamiento adicional de las preparaciones de proteína CI utilizando un procesamiento mecánico adicional de alto cizallamiento dio como resultado un tamaño de partícula menor o disminuido, tasa de sedimentación y / o concentración aparente de proteína durante el replegamiento a alta presión, que proporcionó un aumento significativo en los rendimientos de proteína replegada.

En estos experimentos, las cuatro preparaciones de proteínas CI incluyeron: (i) factor de estimulación de colonias de granulocitos (rhG-CSF), (ii) Fab 1664 (una construcción patentada de Fab), (iii) Cuerpo de inclusión A, y (iii) Cuerpo de inclusión B. La expresión de los cuerpos de inclusión para cada preparación de proteína CI en el citoplasma de E. coli se realizó utilizando procedimientos estándar de laboratorio. La preparación de la proteína CI para Fab 1664 y rhG-CSF se realizó usando homogeneización. Después de la homogeneización, los cuerpos de inclusión se purificaron mediante centrifugación a 10.000 x g mediante lavado y resuspensión en tampón de lavado que contenía Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM 3 veces y los cuerpos de inclusión se almacenaron a -20 °C antes de su uso. Los protocolos de lavado para la producción de Fab 1664 y rhG-CSF también fueron consistentes con los procedimientos conocidos. La pasta de células congeladas para cada proteína se resuspendió en tampón de lisis (tampón Tris 50 mM, a pH 8,0, EDTA 1 mM y PMSF 1 mM) en una proporción de sedimento: tampón de 1:10 (p / v). Los cuerpos de inclusión que contenían rhG-CSF o rhG-CSF se recuperaron de las células usando un Microfluidizer M-110P a una presión de 96,5 Mpa. Antes de la centrifugación, se realizó una dilución 1:2 del lisado para reducir la viscosidad y obtener un mejor rendimiento de cuerpos de inclusión. La solución de lisado resultante se centrifugó a 48.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para sedimentar los cuerpos de inclusión usando una centrífuga Thermo Sorvall RC6 . Se descartó el sobrenadante y la fracción que contenía los cuerpos de inclusión se sometió a un procedimiento de lavado de tres etapas para eliminar las endotoxinas, las proteínas y el ADN de las células hospedadoras. En todas las etapas, el sedimento se suspendió en una serie de tampones de lavado a una relación 1:40 (p / v) a temperatura ambiente, se agitó durante 30 minutos y se volvió a sedimentar por centrifugación. El primer tampón estaba compuesto por: Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM y Triton x-100 al 2 %. La composición del segundo tampón fue Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM, desoxicolato de sodio al 1 %. En la tercera etapa de lavado, el tampón de lavado contenía tampón Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM y NaCl 1 M. Tras la centrifugación, los cuerpos de inclusión se almacenaron a 4 °C hasta la resuspensión en agua a una concentración de 15 mg / ml. También se generaron preparaciones de proteínas de cuerpos de inclusión A y B en procedimientos consistentes con los protocolos descritos en el presente documento y / o procedimientos conocidos para generar CI.

Ejemplo 2: Caracterización del tamaño del cuerpo de inclusión

El tamaño de partícula del cuerpo de inclusión para cada una de las cuatro preparaciones de proteína CI se midió usando el contador de partículas LS230 Coulter fabricado por Beckman. El instrumento se lavó con agua filtrada de 0,22 |jm y se restó el fondo. Las suspensiones de cuerpos de inclusión se agitaron con vórtex y las partículas se transfirieron al detector usando una pipeta de transferencia hasta que los recuentos de partículas estuvieron entre 35 60 % PID a una velocidad de bombeo que varía entre 50-70 % para evitar la sedimentación. Para el análisis no se realizó ninguna sonicación en la cámara de muestras. El modelo utilizado para calcular las distribuciones de los tamaños de partícula utilizó un índice de refracción de la solución de 1,33 (para agua) y un índice de refracción de muestra de 1,5 (para proteínas). Para cada carrera, se tomaron tres distribuciones del tamaño de partícula promediadas de noventa segundos para cada una de las cuatro preparaciones de proteína CI para cuantificar la distribución de partículas entre 0,4-2.000 jm con la media obtenida en las tres muestras y presentada como un intervalo de confianza del 95 %. La distribución del tamaño se presentó como un porcentaje de volumen. Suponiendo una densidad constante, el porcentaje en volumen también se puede interpretar como un porcentaje en masa. La distribución del tamaño de las cuatro preparaciones de cuerpos de inclusión se muestra en la Figura 1. Los tamaños medios de partícula (basados en el porcentaje en masa) para las preparaciones de cuerpos de inclusión fueron 133 /- 14, 13,4 /- 2,4, 108 /- 3 y 171 /- 9 jm para las preparaciones de cuerpos de inclusión Fab 1664, rhG-CSF, cuerpo de inclusión A y cuerpo de inclusión B respectivamente.

La figura 1 muestra las distribuciones del tamaño de partícula de cuatro preparaciones de cuerpos de inclusión. Todas las muestras exhiben una sedimentación rápida según lo observado por inspección visual y según lo predicho por el flujo de Stokes.

Para confirmar los resultados del contador Coulter, el recuento y dimensionamiento de las partículas se realizó en cuerpos de inclusión de rhG-CSF utilizando un instrumento FlowCAM (Fluid Imaging Technologies). El instrumento hace fluir la suspensión del cuerpo de inclusión y toma fotografías microscópicas de la solución, determinando el tamaño de partícula mediante medición óptica. El análisis se realizó analizando 200 j l de solución diluida que fluyó a través de una celda de flujo de 300 micrómetros a 0,15 ml / min. El ajuste oscuro de FlowCAM fue de 15 y el ajuste claro fue de 17. El tamaño mínimo de partícula detectado fue de 2 micrómetros y el máximo detectado fue de 10.000 micrómetros. La distribución del tamaño resultante se muestra en la figura 2. El análisis FlowCAM demuestra que los tamaños de partícula oscilan entre 5 y 50 jm para la inclusión de rhG-CSF, coincidiendo con los resultados del contador Coulter.

Ejemplo 3: Tasas de sedimentación de las preparaciones de cuerpos de inclusión

El asentamiento de una partícula de Stokes en un fluido inmóvil se caracteriza completamente por la ecuación de Stokes (de Nevers 1970): donde V es la velocidad de la partícula, D es el diámetro de la partícula, g la constante de gravitación, pparte la densidad de la partícula y pfluido la densidad del fluido. Los estudios de Middleburg demostraron que la densidad de un cuerpo de inclusión es de 1,26 g / ml (Thomas, Middelberg y col., 1990). Usando 1 g / ml como la densidad del agua y asumiendo un tiempo de sedimentación de treinta minutos, la distancia recorrida por una partícula en función de su diámetro se muestra en la Figura 3. La ecuación de Stokes demuestra que las partículas de 5 jm de diámetro se asientan 0,6 cm durante un período de treinta minutos, una distancia suficiente para generar un gradiente de concentración de proteínas durante una reacción de replegamiento. Se determinó que las distancias de sedimentación para las preparaciones de proteínas de muestra Fab 1664, rhG-CSF, cuerpo de inclusión A y cuerpo de inclusión B sin tratamiento adicional según la presente invención eran 429, 4,5, 307 y 734 cm, respectivamente, suficiente para dar como resultado cuerpos de inclusión para formar una capa límite en la parte inferior de una reacción de replegamiento a alta presión no mezclada después de 30 minutos, lo que daría lugar a un rendimiento reducido de la proteína replegada. Se observó que todas las muestras sedimentaban rápidamente mediante inspección visual.

Ejemplo 4: Preparación de preparaciones de proteínas estables o dispersiones de preparaciones de cuerpos de inclusión de acuerdo con la presente invención

Las preparaciones de proteínas de cuerpos de inclusión mostradas en el Ejemplo 2 (Fab 1664, rhG-CSF, cuerpo de inclusión B y cuerpo de inclusión A) se reprocesaron de acuerdo con la presente invención mediante un procesamiento mecánico de alto cizallamiento adicional como homogeneización de alto cizallamiento, como ejemplo no limitante, utilizando un procesador NIRO Panda (solo 1a etapa) a una contrapresión de 100 MPa. Cada muestra de preparación de proteína CI que se había tratado de acuerdo con la presente invención para proporcionar preparaciones o dispersiones de proteína estables se recogió y luego se almacenó a 25 °C durante no más de cinco horas y se volvió a analizar (para mostrar una distribución de tamaño inesperada y / o mejorada sobre no preparaciones de CI tratadas) utilizando el procedimiento idéntico al descrito en el Ejemplo 3. La distribución de tamaño después del procesamiento mecánico de alto cizallamiento según la invención se muestra en la Figura 4. Inesperadamente y en marcado contraste con las preparaciones de CI no tratadas, todas las partículas de cuerpos de inclusión de las preparaciones de proteínas estables o las dispersiones de las cuatro proteínas según la presente invención tienen un tamaño inferior a 2 pm, con la mayoría de las partículas de tamaño inferior a 1 pm. Según la ecuación de Stokes y la Ecn. 3, estas partículas tendrían tasas de sedimentación de menos de 1 pm después de treinta minutos, lo que impide la formación de una capa límite de proteína o un gradiente de concentración durante el curso de una reacción de replegamiento a alta presión no mezclada típica y también se encontró que aumentaba los rendimientos de proteínas después del replegamiento. Todas las preparaciones permanecieron homogéneas después de la dispersión mediante inspección visual.

Ejemplo 5: Efecto de la distribución del tamaño de partículas sobre el replegamiento a alta presión de Fab 1664 según la presente invención

Los cuerpos de inclusión Fab 1664 (antes (no tratados designados como "no homogeneizados") y después (tratados según la invención designados como "homogeneizados") del procesamiento mecánico de alto cizallamiento de la invención) se cuantificaron para la concentración de proteínas mediante densitometría usando SDS-PAGE con Fab 1664 purificado como patrón de referencia. Se realizó cuantificación para asegurar que el procedimiento de dispersión no alteraba la concentración de proteínas. Se prepararon suspensiones de replegamiento de cadena pesada y ligera de Fab 1664 (relación en masa aproximada 1: 1) a una concentración de proteínas constante de 1,6 g / en tampón que contenía CHES 50 mM (pH 9,0), cisteína 4 mM, arginina 350 mM y se trataron a presión a 300 MPa durante treinta minutos para facilitar la disociación agregada, se despresurizaron a 150 MPa durante cuatro horas para facilitar el ensamblaje de la cadena y se incubó durante la noche a presión atmosférica para facilitar la formación de disulfuro. Se eligieron volúmenes de replegamiento de 0,5 y 1 ml para los cuerpos de inclusión aglomerados y tratados mecánicamente procesados ("homogeneizados") en recipientes de muestra con un diámetro interior de 1,45 mm para demostrar la dependencia de la escala en el rendimiento de replegamiento. El replegamiento de 0,5 ml tenía una altura de 2,8 cm mientras que el replegamiento de 1 ml tenía una altura de 5,6 cm y las cuatro muestras se trataron a presión en posición vertical. Para muestras aglomeradas, el replegamiento de 0,5 ml y 1 ml dio como resultado que 0,8 y 1,6 mg de proteína formaran una capa delgada en el fondo del recipiente de muestra, respectivamente. Después de replegar a alta presión, los rendimientos de replegamiento de Fab 1664 se determinaron usando cromatografía de intercambio catiónico (CEX). La CEX se realizó en un HPLC Agilent 1100 con detección de 280 nm. La separación se realizó usando una columna Dionex ProPac WCX-10 4X250 mm con un gradiente que aumenta en 1 % de B / min cuando el tampón A contiene MES 50 mM (pH 6,3) y el tampón B contiene MES 50 mM (pH 6,3) y NaCl 250 mM. Los rendimientos de replegamiento en función del tamaño de partícula del cuerpo de inclusión de Fab 1664 y el volumen de replegamiento se muestran en la Figura 5. Se encuentra inesperadamente que la preparación o dispersión de proteína estable antes del replegamiento de acuerdo con la invención aumenta significativamente los rendimientos de replegamiento de una manera que es independiente de la escala.

En particular, inesperadamente se ha descubierto que el tratamiento de preparaciones de proteína CI de acuerdo con la presente invención usando procesamiento mecánico de alto cizallamiento para proporcionar preparaciones o dispersiones de proteína estables ("no homogeneizadas"), antes del replegamiento a alta presión, mejora el rendimiento de replegamiento a alta presión de Fab 1664 del 5 % al 25 %, independientemente de la escala en algunas realizaciones. En cambio, las preparaciones de CI no tratadas ("no homogeneizadas") de inclusiones de Fab 1664 se sedimentan inesperadamente demasiado rápido, de modo que la concentración aparente de proteína disminuye hasta que está muy por encima de 1,6 g / y da como resultado rendimientos de replegamiento de aproximadamente 5 %. Cuando el volumen de replegamiento aumenta a 1 ml, aumenta la altura del recipiente de replegamiento a 5,6 cm y da como resultado 1,6 mg de proteína en la capa límite, el rendimiento de replegamiento disminuye aún más.

Ejemplo 6 - Efecto de la distribución del tamaño de partícula sobre el replegamiento a alta presión de rhG-CSF según la presente invención

Se cuantificó la concentración de proteína de rhG-CSF (antes y después de la homogeneización a alta presión) mediante densitometría usando SDS-PAGE con rhG-CSF purificado como patrón de referencia. La cuantificación se realizó para asegurar que el procesamiento mecánico de alto cizallamiento de la preparación de CI según la presente invención no alteraba la concentración de proteína. Las suspensiones de replegamiento se realizaron a una concentración de proteína constante de 0,45 mg / ml en condiciones de replegamiento de alta presión no optimizadas de CHES 50 mM (pH 10,0), urea 1M, Triton X-100 al 0,01 % y cisteína 4 mM. Las preparaciones o dispersiones de proteína estable de rhG-CSF tratadas ("homogeneizadas") de acuerdo con la invención permanecieron suspendidas después de la preparación de la muestra mientras que las preparaciones de control no tratadas ("no homogeneizadas") se sedimentaron en el fondo del recipiente. Las muestras se trataron a presión a 250 MPa durante dieciséis horas en volúmenes de 200 pl, 600 pl, 1.000 pl y 10 ml.

Después del replegamiento, el rendimiento se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC), cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) y densitometría mediante SDS-PAGE, con rhG-CSF como patrón de referencia. De media, el replegamiento a alta presión de las preparaciones o dispersiones de proteínas estables tratadas ("homogeneizadas") de la invención dio como resultado rendimientos del 22 % y el uso de las preparaciones de CI no tratadas ("no homogeneizadas") de control redujo los rendimientos al 7 % mediante SDS-PAGe . El análisis SEC se realizó utilizando fosfato 20 mM (pH 6,8), NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,01 % como fase móvil con una columna Tosohaas 3000 SWXL con rhG-CSF como patrón de referencia. En la Figura 6 se muestran los rendimientos de replegamiento normalizados en función de la preparación o dispersión de proteína estable y el volumen de replegamiento. La preparación o dispersión de proteínas estable de cuerpos de inclusión de rhG-CSF aumenta los rendimientos de replegamiento y minimiza los impactos a escala.

Se espera que los rendimientos de replegamiento más bajos observados en el volumen de 200 pl sean el resultado de burbujas de aire solubilizadas durante el tratamiento a alta presión y alterando la química redox. Para muestras con volúmenes de replegamiento entre 600 y 10.000 pl, se pueden sacar dos conclusiones. En primer lugar, la dispersión de los cuerpos de inclusión de rhG-CSF aumenta el rendimiento de replegamiento para todos los volúmenes. En segundo lugar, el rendimiento de replegamiento se mantiene de 600 a 10.000 pl para las muestras tratadas ("homogeneizadas") preparadas según la invención, mientras que hay una disminución en el rendimiento a medida que aumenta el volumen en el caso de las preparaciones de cuerpos de inclusión de control no tratadas ("no homogeneizadas"). Se cree que la disminución del rendimiento es el resultado de la formación de una capa límite de proteína y un aumento en la concentración aparente de proteína.

Ejemplo 7: Uso de glicerol para prevenir la floculación durante la congelación / descongelación

Los estudios de Middelberg y otros demuestran que el homogeneizado celular, que incluye cuerpos de inclusión, contiene partículas en el intervalo de tamaño de 0,2-0,6 pm (Thomas, Middelberg y col. 1990; Bowden, Paredes y col.

1991). Durante el procesamiento, incluida la centrifugación, el lavado y la congelación-descongelación, los cuerpos de inclusión pueden flocular, dando como resultado grandes distribuciones del tamaño de partícula (Figura 1).

Ahora se ha descubierto que la floculación de una preparación de proteína CI, por ejemplo, Fab 1664, puede prevenirse si la preparación de proteína CI se congela en un 15-30 %, por ejemplo, Solución de glicerol al 20 % antes de replegar (Figura 7). En cambio, Los cuerpos de inclusión Fab 1664 congelados en agua floculaban significativamente. Como alternativa a la redispersión después de la floculación, se pueden añadir aditivos y química de la solución no limitados al menos a uno de pH, fuerza iónica, detergentes y modificadores dieléctricos y de la viscosidad para evitar la floculación durante el procesamiento. El glicerol podría tener el beneficio adicional de que altera la estructura del agua durante los ciclos de congelación / descongelación.

Referencias

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Ejemplo 8: Efecto de diferentes procedimientos de preparación o dispersión de proteínas estables sobre las distribuciones del tamaño de las partículas y los rendimientos aumentados después del replegamiento de las proteínas de acuerdo con la presente invención

Los cuerpos de inclusión de Fab 1664 aglomerados se procesaron usando un sonicador de sonda (escala de 1 ml) y un Niro Panda a 5,5 MPa (escala de 50 ml) para proporcionar preparaciones de proteína CI. Después del procesamiento, se evaluó el tamaño de partícula de los cuerpos de inclusión como se muestra en la Figura 8. El enfoque de procesamiento utilizado alteró la distribución de tamaño, con sonicación, que da como resultado una dispersión incompleta y un mayor porcentaje de partículas presentes en el intervalo de tamaño de 2-4 pm. La mayor proporción de partículas de 2-4 pm de tamaño es significativa en un replegamiento de 500ul, como la altura total de replegamiento es de solo 2,8 cm y las partículas de 2 y 4 pm sedimentan a una distancia de 0,1 y 0,4 cm respectivamente, lo que da como resultado un aumento en la concentración aparente de proteína durante la etapa de replegamiento. Los rendimientos de replegamiento para rendimientos de repligamiento de Fab 1664 aglomerados, sonicados y homogeneizados Niro tratados a presión con condiciones idénticas a las descritas en el Ejemplo 5 dieron como resultado rendimientos del 5,9% /- 0,7%, 13,8% /- 0,2% y 25,2% /- 0,5%. La dispersión incompleta después de la sonicación dio como resultado una mayor proporción de tamaños de partículas y rendimientos disminuidos en relación con una muestra más monodispersa. En consecuencia, se ha descubierto inesperadamente que la sonicación puede reducir los rendimientos de replegamiento de proteínas y, por tanto, proporcionar un procedimiento de acuerdo con la presente invención que proporcione altos rendimientos sin sonicación es, preferentemente, procedimientos que incluyen sonicación.

Ejemplo 9: Diseño experimental para maximizar la estabilidad de la solución de dispersión

Se puede aplicar química de la solución para prevenir la floculación de los cuerpos de inclusión durante la recolección de células, el procesamiento o almacenamiento, o después de que se hayan empleado técnicas de dispersión para suspender los cuerpos de inclusión. Las preparaciones o dispersiones de proteínas se pueden estabilizar aumentando el potencial zeta absoluto para evitar la floculación, o aumentando la viscosidad de la solución para ralentizar las colisiones entre partículas. El potencial zeta está controlado por el volumen excluido, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals, fuerzas entrópicas y fuerzas estéricas, y los valores superiores a /- 30 mV suelen impartir estabilidad a la solución. Como cada proteína tiene su pl independiente, la repulsión de cargas de cada proteína debe optimizarse en función del pH. El ajuste del pH de la solución lejos del pl de la proteína aumenta la repulsión de cargas y la estabilidad coloidal. Deben probarse los pH de 4 a 10, con cuidado de que el almacenamiento a largo plazo no produzca modificaciones químicas o desamidación. La fuerza iónica de la solución debe analizarse a baja concentración de tampón (10 mM) y con la adición de 0,5 y 1 M de NaCl. El uso de tensioactivos cargados aumentará drásticamente el potencial zeta, pero a menudo son desnaturalizantes (por ejemplo, SDS). Los tensioactivos no iónicos pueden proporcionar cambios modestos en el potencial zeta y deben probarse de manera escalonada por encima y por debajo de la CMC. El uso de compuestos de exclusión preferente y glicoles ajustará la constante dieléctrica de la solución y, por lo tanto, el potencial zeta y debe probarse en el intervalo de 0-1 M en incrementos de 0,25 M. La experimentación se puede realizar en un formato escalonado o mediante el uso de un cribado de alto rendimiento, factorial fraccional y otro diseño estadístico. Después de que los cuerpos de inclusión se hayan dispersado en las diversas condiciones de solución, el potencial zeta se puede medir mediante dispersión dinámica de la luz para determinar cuándo se maximiza el potencial mediante una carga positiva o negativa. Para cada condición de solución probada, debe probarse el potencial zeta, la distribución de partículas medida y las muestras almacenadas durante una, dos y cuatro semanas a 25 °C, 4 °C, y mediante ciclos de congelación-descongelación, y luego se volvió a probar para determinar la distribución de partículas utilizando un contador Coulter u otros procedimientos.

Los agentes modificadores de la viscosidad también se pueden utilizar para estabilizar floculantes al retardar las colisiones proteína-proteína, sin embargo, se debe tener cuidado para asegurarse de que no modifiquen la reacción de replegamiento, ya que normalmente son compuestos de exclusión preferente. Los agentes modificadores de la viscosidad podrían usarse eficazmente si se diluyen al mezclar los cuerpos de inclusión en el tampón de replegamiento. Una lista no exclusiva de modificadores de viscosidad que se analizarán incluye guar, goma xantana, hidroxietilalmidón, PEG y agar.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la producción de proteínas a partir de cuerpos de inclusión, que comprende:

a) proporcionar una preparación de proteínas que comprende partículas de cuerpos de inclusión,

b) preparar una dispersión de cuerpos de inclusión mediante cizallamiento mecánico de modo que las partículas de los cuerpos de inclusión tienen un tamaño inferior a 10 |jm, y

c) exponer la dispersión de cuerpos de inclusión a alta presión en un recipiente a presión, desagregando y replegando de este modo la proteína del cuerpo de inclusión.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además seleccionar una química de la solución de replegamiento basada en uno o más de pH, fuerza iónica y constante dieléctrica; en el que, opcionalmente, el eje horizontal del recipiente a presión es al menos dos veces el eje vertical.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la dispersión de cuerpos de inclusión no es desnaturalizante, y en el que, opcionalmente, la dispersión de cuerpos de inclusión no contiene caótropos y / o detergente suficiente para solubilizar los cuerpos de inclusión en ausencia de alta presión.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el volumen del recipiente a presión es de aproximadamente 5 l o más, aproximadamente 10 l o más o aproximadamente 50 l o más.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína es una proteína terapéutica que comprende una región de unión a antígeno o una región Fc de anticuerpo.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la mayoría de las partículas de cuerpos de inclusión en la dispersión tienen una velocidad de sedimentación de aproximadamente 1 cm por hora o menos.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la mayoría de las partículas de cuerpo de inclusión en masa tienen un tamaño de 3 jm o menos, o aproximadamente 2,2 jm o menos.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cizallamiento mecánico se genera por homogeneización a alta presión, procesadores microfluidizadores o procesadores de orificio fijo o presión constante.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la química de la dispersión se ajusta mediante la adición de uno o más de detergentes no desnaturalizantes, agentes tampón, sal, co-agente de replegamiento, agente de aumento de la viscosidad o compuesto de exclusión preferente.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el potencial zeta de las partículas se ajusta para que esté fuera del intervalo de ± 10 mV o ± 20 mV o ± 30 mV.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que se añade un compuesto de exclusión preferente a una concentración que evita la floculación.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la dispersión de cuerpos de inclusión se somete a congelación / descongelación y no flocula.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la proteína del cuerpo de inclusión es una proteína de fusión que tiene un sitio de escisión por proteasa y se somete a alta presión junto con una proteasa suficiente para la escisión por proteasa.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la proteasa es proteasa de pestivirus.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las partículas del cuerpo de inclusión son de tamaño sustancialmente homogéneo y no varían en más de 5 jm .

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la dispersión se crea sin solubilizar ni precipitar la proteína de los cuerpos de inclusión.