ES2831315T3

ES2831315T3 - Generación efectiva de células T dirigidas al tumor derivadas de células madre pluripotentes

Info

Publication number: ES2831315T3
Application number: ES14722926T
Authority: ES
Inventors: Maria Themeli; Michel Sadelain; Christopher C Kloss
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2034-04-03
Also published as: AU2021201731A1; EP2981607B1; WO2014165707A3; WO2014165707A2; AU2014248119A1; CA2908668A1; US10370452B2; AU2019229342A1; US20240400713A1; DK2981607T3; AU2014248119B2; EP3789487A1; PT2981607T; CA3185368A1; US20160009813A1; CA2908668C; AU2024205819A1; EP2981607A2; US20190375850A1; AU2019229342B2

Abstract

Una celula madre pluripotente que comprende un locus reordenado del receptor de las celulas T (TCR) y comprende un acido nucleico que codifica un receptor de antigeno quimerico (CAR), en donde la celula madre pluripotente se deriva de una celula T.

Description

DESCRIPCIÓN

Generación efectiva de células T dirigidas al tumor derivadas de células madre pluripotentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia adoptiva. La invención proporciona los métodos para generar células T fenotípicamente definidas, funcionales y/o expandibles a partir de las células madre pluripotentes (células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas) manipuladas mediante modificaciones genéticas seguras. Las células manipuladas pueden proporcionar uno o más de: 1) dirigirse a un antígeno predeterminado específico expresado en la superficie celular de una célula diana de una manera independiente de1 HLA, 2) supervivencia y potencial funcional mejorados 3) células T "listas para usar" para la administración a múltiples receptores, eventualmente a través de barreras inmunogénicas y/o 4) potencial citotóxico y actividad antitumoral.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos T son componentes esenciales del sistema inmunitario cuyo mal funcionamiento o ausencia son fundamentales para múltiples patologías, incluidas las inmunodeficiencias congénitas y adquiridas, la autoinmunidad y el cáncer. Por lo tanto, un suministro clínicamente relevante de las células T funcionales específicas por el antígeno es útil para el tratamiento de una serie de trastornos, especialmente en el contexto de la inmunoterapia adoptiva del cáncer.

Las características esenciales de los linfocitos T transferidos adoptivamente (como en la inmunoterapia adoptiva) requeridas para la erradicación exitosa de los tumores establecidos incluyen su especificidad por el tumor, su capacidad estimuladora, el número de las células T específicas por el antígeno tumoral y su persistencia in vivo. Las terapias actuales con células T adoptivas están limitadas por la falta de células T del paciente y específicas por el tumor, incluida su rareza en el cuerpo, su incapacidad para superar una serie de mecanismos de inmunoescape tumoral y su corta vida útil, especialmente cuando se utilizan células T efectoras terminalmente diferenciadas o "agotadas", es decir, células T que no proliferan incluso cuando se exponen a un antígeno específico.

La leucocitaféresis de los pacientes o donantes alogénicos son las fuentes actuales de los linfocitos T usados para la terapia celular adoptiva. Sin embargo, es difícil aislar y expandir los números normalmente bajo de las células T reactivas a un antígeno deseado, es decir, generar clones funcionales de las células T específicos por el antígeno. Además, en algunos casos no se dispone de los linfocitos de sangre periférica, por ejemplo, de los pacientes inmunodeficientes.

Por lo tanto, existe una necesidad de las células T específicas por el antígeno funcionales y terapéuticamente suficientes para su uso eficaz en la inmunoterapia.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia adoptiva. Se divulgan los métodos para la generación de las células T fenotípicamente definidas, funcionales y/o expandibles a partir de las células madre pluripotentes (células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) manipuladas mediante modificaciones genéticas seguras. Las células manipuladas pueden proporcionar uno o más de: 1) dirigirse a un antígeno predeterminado específico expresado en la superficie celular de una célula diana de una manera independiente del HLA, 2) supervivencia y potencial funcional mejorados y/o 3) potencial citotóxico y actividad antitumoral. En algunos ejemplos, las células manipuladas pueden usarse como células T "listas para usar" para la administración a múltiples receptores, eventualmente a través de barreras inmunogénicas.

Como se muestra en este documento, manipular una iPSC o ESC para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), que se une a un antígeno predeterminado para estimular la proliferación y la función, aumenta drásticamente el rendimiento de las células T y proporciona (por ejemplo, después de la diferenciación a una célula efectora mediante sistemas de cultivo celular descritos en las presentes invenciones) células T con propiedades terapéuticas mejoradas. Tales células T expandidas y manipuladas, que pueden o no expresar CD4 o CD8 y pueden compartir características fenotípicas con las células T ap o y5, son capaces de la estimulación específica por el antígeno por las células diana de una manera independiente del HLA para proporcionar la actividad funcional de las células T que incluyen la producción de citocinas, citotoxicidad e inhibición citostática del crecimiento tumoral, por ejemplo, como la actividad que reduce la cantidad de la carga tumoral, junto con la proliferación continua durante numerosas generaciones de división celular. La función mejorada de las células T se puede entregar a las células manipuladas a través de una gama de señales coestimuladoras (por ejemplo, CD28) proporcionadas por el CAR. La modificación genética segura de la T-iPSC es posible al direccionarse a un sitio genómico seguro en el genoma humano. Específicamente, se divulgan las composiciones y los métodos para generar las células T derivadas de T-iPSC modificadas con un CAR (o células T derivadas de iPSC que expresan el CAR) para su uso en la inmunoterapia adoptiva, tal como la inmunoterapia adoptiva del cáncer. En algunos ejemplos, las células T derivadas de T-iPSC modificadas con un CAR se manipulan para su uso en entornos alogénicos mediante la manipulación genética de la expresión en la superficie celular del HlA.

Se divulga además una célula T que se genera a partir de una célula madre pluripotente que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). En determinadas modalidades, dichos linfocitos T se dirigen específicamente a un antígeno y la especificidad por el antígeno de dicho linfocito T es independiente de1HLA. En un ejemplo, dichas células T expresan el CAR. En un ejemplo, dicho CAR está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia heteróloga. En un ejemplo, dicha secuencia heteróloga se integra en el genoma de dicha célula T en un sitio genómico seguro. En algunos ejemplos, el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno de un patógeno. En determinados ejemplos, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en la anhidrasa carbónica IX (CAlX), el antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44 , CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, un antígeno de una célula infectada por el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular), glucoproteína 2 epitelial (EGP 2), glucoproteína 40 epitelial (EGP-40), molécula de adhesión a células epiteliales (Ep-CAM), proteínas receptoras tirosina cinasas erb-B2,3,4, proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor a de folato, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (GD3), Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (HER-2), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), subunidad alfa 2 del receptor de la Interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor del dominio de inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión de las células L1 (L1CAM), familia A de antígenos de melanoma, 1 (MAGE-AI), Mucina l6 (Muc-16), Mucina 1 (Muc-1), Mesotelina (MSLN), ligandos de NKG2D, antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glucoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2) y proteína del tumor de Wilms (WT-1). En un ejemplo, dichas células T comprenden un gen silenciado seleccionado del grupo que consiste en un factor de transcripción de los genes del HLA y una microglobulina beta-2 para un gen de1HLA. En algún ejemplo, dicho CAR comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. En algún ejemplo, dicho dominio extracelular comprende una porción de unión al antígeno. En determinado ejemplo, dicha porción de unión al antígeno comprende fragmentos variables de cadena sencilla (scFv). En algún ejemplo, dicho dominio transmembrana comprende un polipéptido de CD3Z, un polipéptido de CD4, un polipéptido de CD8, un polipéptido de CD28, un polipéptido de 4-1BB, un polipéptido de OX40, un polipéptido de iCo S, un polipéptido de CTLA-4, un polipéptido de PD-1, un polipéptido de lAG-3, un polipéptido de 2B4 y un polipéptido de bTlA. En algunos ejemplos, dicho dominio intracelular comprende un polipéptido de CD3Z. En determinados ejemplos, dicho dominio intracelular comprende además al menos una región de señalización coestimuladora. Dicha región de señalización coestimuladora puede comprender un polipéptido de CD28, un polipéptido de 4-1BB, un polipéptido de OX40, un polipéptido de ICOS, un polipéptido de PD-1, un polipéptido de LAG-3, un polipéptido de 2B4, un polipéptido de BTLA o un polipéptido de Ct La -4. En un ejemplo, dicho CAR es 1928z. En determinados ejemplos, dichas células T pueden seleccionarse del grupo que consiste en células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria, células T reguladoras, células T asesinas naturales, células T invariantes asociadas a la mucosa, células T y5 y una combinación de las mismas. En determinados ejemplos, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En un ejemplo, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida.

Se divulga una población celular que comprende a la célula T descrita anteriormente.

Se divulgan los métodos para usar la célula T descrita anteriormente para el tratamiento de neoplasias, enfermedades infecciosas y otras patologías.

Se divulga un método para reducir la carga tumoral en un sujeto. En un ejemplo no limitante, dicho método comprende administrar una célula T generada a partir de una célula madre pluripotente que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) a un sujeto que tiene un tumor, de este modo inducir la muerte de la célula tumoral en dicho sujeto. En determinados ejemplos, dicha célula T expresa el CAR. En algunos ejemplos, la especificidad antigénica de dicha célula T es independiente del HLA. En determinados ejemplos, dicha célula T es citotóxica para dicho tumor y no induce la enfermedad del injerto contra el huésped en dicho sujeto. En un ejemplo, dicha célula tumoral expresa un antígeno tumoral y dicha célula T se dirige específicamente a dicho antígeno tumoral. En un ejemplo, dicho antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en la anhidrasa carbónica IX (CAlX), el antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44 , CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, un antígeno de una célula infectada por el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular), glucoproteína 2 epitelial (EGP 2), glucoproteína 40 epitelial (EGP-40), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), proteínas receptoras tirosina cinasas erb-B2,3,4, proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor a de folato, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (GD3) ), Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (HER-2), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), subunidad alfa 2 del receptor de la Interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor del dominio de inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), familia A de antígenos de melanoma, 1 (MAGE-Al), Mucina 16 (Muc-16), Mucina 1 (Muc-1), Mesotelina (MSLN), ligandos de NKG2D, antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glucoproteína 72 asociada a tumor (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2) y proteína del tumor de Wilms (WT-1). En determinados ejemplos, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En un ejemplo, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida. En un ejemplo, dicho método reduce el número de las células tumorales. En un ejemplo, dicho método reduce el tamaño del tumor. En un ejemplo, dicho método erradica el tumor en el sujeto. En determinados ejemplos, dicha célula T se selecciona del grupo que consiste en células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria, células T reguladoras, células T asesinas naturales, células T invariantes asociadas a mucosas, células T y5 y una combinación de las mismas. En un ejemplo, dicha célula T tiene un gen silenciado seleccionado del grupo que consiste en un factor de transcripción de los genes de1HLA, transactivador de clase II (CIITA), un gen RAG y una microglobulina beta 2 para un gen del HLA. En determinadas modalidades, el sujeto es un humano. En algunos ejemplos, en donde dicha célula T expresa Foxp3. En determinados ejemplos, dicha célula madre pluripotente se deriva de una célula T. En un ejemplo, dicha célula madre pluripotente expresa un ligando para el receptor inmunorregulador de las células T, en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en PD-L1, CD48 y TNFRSF14. En otra modalidad, dicha célula madre pluripotente expresa HLA-G. En determinados ejemplos, dicha célula madre pluripotente se deriva de una célula T específica por el virus. La célula T específica por el virus puede ser una célula T específica por el EBV o una célula T específica por el CMV. En determinados ejemplos, dicha célula madre pluripotente se deriva de una célula T que no expresa un receptor reordenado de las células T (TCR).

Se divulga un método para aumentar la supervivencia de un sujeto que tiene una neoplasia. En un ejemplo, dicho método comprende administrar una célula T generada a partir de una célula madre pluripotente que expresa un receptor de antígeno quimérico a dicho sujeto diagnosticado con una neoplasia, de este modo tratar o prevenir así una neoplasia en dicho sujeto. En determinados ejemplos, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En un ejemplo, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida. En determinados ejemplos, dicha célula T es citotóxica para dicha neoplasia. En determinados ejemplos, dicha célula T expresa el CAR. En determinados ejemplos, dicha célula de la neoplasia expresa un antígeno tumoral y dicha célula T se dirige específicamente a dicho antígeno tumoral. En determinados ejemplos, la especificidad por el antígeno de dicha célula T es independiente del HLA. En determinados ejemplos, dicha neoplasia se selecciona del grupo que consiste en cáncer de la sangre, leucemia de las células B, mieloma múltiple, leucemia linfoblástica (LLA), leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama y sarcoma, leucemia mieloide aguda (AML). En determinadas modalidades, dicha célula T se selecciona del grupo que consiste en células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria, células T reguladoras, células T asesinas naturales, células T invariantes asociadas a mucosas, células T y5 y una combinación de las mismas. En un ejemplo, dicha célula T tiene un gen silenciado seleccionado del grupo que consiste en un factor de transcripción de los genes del HLA, transactivador de clase II (CIITA), un gen RAG y una microglobulina beta 2 para un gen del HLA. En determinados ejemplos, dicho sujeto es un humano. En algunos ejemplos, en donde dicha célula T expresa Foxp3. En determinados ejemplos, dicha célula madre pluripotente se deriva de una célula T. En un ejemplo, dicha célula madre pluripotente expresa un ligando para el receptor inmunorregulador de las células T, en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en PD-L1, CD48 y TNFRSF14. En otro ejemplo, dicha célula madre pluripotente expresa HLA-G. En determinados ejemplos, dicha célula madre pluripotente se deriva de una célula T específica por el virus. La célula T específica por el virus puede ser una célula T específica por el EBV o una célula T específica por el CMV. En determinados ejemplos, dicha célula madre pluripotente se deriva de una célula T que no expresa un receptor reordenado de las células T (TCR).

La presente invención proporciona un método para producir una célula madre pluripotente (PSC) que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende: a) proporcionar, i) un célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del TCR (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3 Z y b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca una T-PSC que comprende al CAR (CAR-T-PSC). En determinadas modalidades, dicho vector de expresión del CAR comprende un gen heterólogo que codifica al menos una región de señalización coestimuladora o un ligando coestimulador. Al menos un ligando coestimulador dicho puede seleccionarse del grupo que consiste en CD80, CD86, CD70, OX40L, 4-1BBL, CD48, TNFRSF14 y PD-L1. Dicha región de señalización coestimuladora puede comprender un polipéptido de CD28, un polipéptido de 4-1BB, un polipéptido de OX40, un polipéptido de ICOS o un polipéptido de PD-1, un polipéptido de LAG-3, un polipéptido de 2B4, un polipéptido de BTLA o un polipéptido de Ct La -4. En determinadas modalidades, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En una modalidad, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida.

La presente invención proporciona un método para producir una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende, a) proporcionar, i) una célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z, b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca una T-PSC que comprende el CAR (CAR-T-PSC); c) cultivar dicha CAR-T-PSC en condiciones tales que se produzca una célula T derivada de T-PSC que expresa el CAR (célula T derivada de la CAR-T-PSC). En determinadas modalidades, dicho c) cultivar dicha CAR-T-PSC en condiciones tales que se produzca una célula T derivada de CAR-T-PSC comprende: (a) proporcionar, i) dicha CAR-T-PSC, ii) un primer medio de cultivo celular para la inducción del mesodermo, iii) un segundo medio de cultivo celular para la especificación hematopoyética y expansión, iii) un tercer medio de cultivo celular para la diferenciación linfoide T y iv) una línea celular alimentadora que induce el compromiso linfoide T en las células hematopoyéticas y (b) incubar dicha CAR-T-PSC con dicho primer medio de cultivo celular durante hasta aproximadamente 4 días en condiciones tales que se produzca una célula del mesodermo, (c) incubar dicha célula del mesodermo con dicho segundo medio de cultivo celular durante aproximadamente 6 días en condiciones tales que se produzca y expanda una célula hematopoyética, (d) incubar dicha célula hematopoyética expandida y dicha línea celular alimentadora con dicho tercer medio de cultivo celular durante aproximadamente al menos 5 días para inducir el compromiso linfoide T en dicha célula hematopoyética expandida para producir un célula T derivada de CAR-TP-PSC. En determinadas modalidades, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En una modalidad, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida. En determinadas modalidades, dicha célula T expresa el CAR. En algunas modalidades, dicha célula T se dirige específicamente a un antígeno y la especificidad por el antígeno de dicha célula T es independiente de1HLA. En una modalidad, el primer medio de cultivo celular comprende a la proteína 4 morfogenética ósea (BMP-4) y al factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). En una modalidad, el segundo medio de cultivo celular comprende al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), bFGF, factor de las células madre (SCF), ligando de la tirosina cinasa 3 similar a FMS (Flt3L) y al menos una citocina Th1, que se puede seleccionar entre el grupo que consiste en la Interleucina-3 (IL-3), IL-15, IL-7, IL-12 e IL-21. En una modalidad, el tercer medio de cultivo celular comprende al SCF, Flt3L y al menos una citocina Th1, que puede seleccionarse del grupo que consiste en IL-15, IL-7, IL-12 e IL-21. En determinadas modalidades, dicho método comprende además d) exponer dicha célula T derivada de CAR-T-PSC a una célula presentadora de antígeno en condiciones para estimular una actividad de dicha célula T derivada de CAR-T-PSC. En una modalidad, dicha actividad se selecciona del grupo que consiste en secreción de citocinas, división celular, citotoxicidad, inhibición citostática e inhibición del crecimiento celular. En una modalidad, dicha citocina es una citocina Th1 seleccionada del grupo que consiste en IFN-y, IL-2 y TNF-a. En una modalidad, dicha citotoxicidad se determina al matar una célula diana que expresa un antígeno que se une a dicho CAR y medir la muerte de la célula diana. En una modalidad, dicha inhibición del crecimiento celular comprende la inhibición del crecimiento de una célula tumoral. En una modalidad, dicha inhibición del crecimiento celular comprende la reducción del tamaño del tumor. Dicho CAR puede comprender un dominio de unión al antígeno. En una modalidad, dicho dominio de unión al antígeno de dicho es específico por un antígeno. Dicho antígeno puede ser un antígeno tumoral o un antígeno de un patógeno. En determinadas modalidades, dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en la anhidrasa carbónica IX (CAlX), el antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CDl33, CD138, un antígeno de una célula infectada por el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular), glicoproteína 2 epitelial (EGP 2), glicoproteína 40 epitelial (EGP-40), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), proteínas receptoras tirosina cinasas erb-B2,3,4, proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor a de folato, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (GD3), Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (HER-2), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), subunidad alfa 2 del receptor de Interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor del dominio de inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión de celular L1 (L1CAM), familia A de antígenos de melanoma, 1 (Ma Ge -AI), Mucina 16 (Muc-16), Mucina 1 (Muc-1), Mesotelina (MSLN), ligandos de NKG2D, antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glucoproteína 72 asociada a los tumores (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2) y proteína del tumor de Wilms (WT-1). En una modalidad, dicho vector de expresión del CAR comprende una secuencia de ácido nucleico que está integrada en dicho genoma de CAR-T-PSC en un sitio genómico seguro. En una modalidad, dicho vector de expresión del CAR codifica además una proteína fluorescente para expresarse en dicha CAR-T-PSC. En una modalidad, dicha proteína fluorescente es mCherry. En una modalidad, dicho método comprende además e) inducir la fluorescencia en dicha CAR-T-PSC para rastrear dicha CAR-T-PSC. En una modalidad, dicho método comprende además f) rastrear dicha CAR-T-PSC in vitro. En una modalidad, dicho método comprende además g) rastrear dicha CAR-T-PSC in vivo.

La presente invención proporciona un método para producir una célula madre pluripotente (PSC) que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende: a) proporcionar, i) un célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del TCR (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z y b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca una T-p Sc que comprende el CAR (CAR-T-PSC). En una modalidad no limitante, dicho método comprende a) proporcionar, i) una célula seleccionada del grupo que consiste en un linfocito de sangre periférica aislado (PBL) y una célula T de sangre periférica aislada y una combinación de los mismos y ii) al menos un vector retroviral que codifica al menos un factor de reprogramación seleccionado del grupo que consiste en el factor 4 de transcripción de unión al octámero (OCT4), factor 4 similar a Kruppel (KLF4), homólogo del oncogén viral de mielocitomatosis (c-MYC) y factor de transcripción SOX- 2 y b) transducir dicha célula con al menos un vector retroviral dicho en las condiciones para producir una célula madre pluripotente. En determinadas modalidades, dicha célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En una modalidad, dicha célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida. En una modalidad, dicho vector retrovírico codifica en la dirección 5' a 3' a OCT4 y KLF4. En otra modalidad, dicho vector retrovírico codifica en la dirección 5' a 3' a c-MYC y SOX-2. En algunas modalidades, dicho vector retrovírico es escindible. En algunas modalidades, dicho vector retrovírico comprende un sitio loxP ubicado en la repetición terminal larga 3' (LTR) para su uso por la recombinasa Cre para escindir al menos un factor de reprogramación dicho. En determinadas modalidades, dicho vector retrovírico codifica además un marcador fluorescente e. En una modalidad, dicho marcador fluorescente es una proteína verde fluorescente. En otra modalidad, el marcador fluorescente es Citrine. En la presente invención también se proporcionan una célula madre pluripotente y una población celular que la comprende producida mediante el método descrito anteriormente.

Se divulga un vector retroviral escindible que codifica en la dirección 5' a 3', al menos un factor de reprogramación seleccionado del grupo que consiste en el factor 4 de transcripción de unión al octámero (OCT4), el factor 4 similar a Kruppel (KLF4), homólogo del oncogén viral de mielocitomatosis (c-MYC) y el factor de transcripción SOX-2. En determinadas modalidades, el vector retrovírico codifica dos factores de reprogramación. En algunas modalidades, el vector retrovírico codifica en la dirección 5' a 3' a OCT4 y KLF4. En algunas modalidades, el vector retroviral codifica en la dirección 5' a 3' a cMYC y SOX2. En determinadas modalidades, dicho vector retrovírico codifica además un marcador fluorescente. En una modalidad, el marcador fluorescente es Citrine. En una modalidad, el marcador fluorescente es GFP. En determinadas modalidades, el vector retroviral comprende un sitio loxP en la repetición terminal larga 3' (LTR) para su uso por la recombinasa Cre para escindir al menos un factor de reprogramación dicho. En algunas modalidades, dicho vector retrovírico comprende además un promotor en combinación operable con una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un factor de reprogramación dicho.

La presente invención proporciona una célula madre pluripotente que comprende un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T. En determinadas modalidades, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria con la condición de que la preparación de la célula madre embrionaria no implique la destrucción de un embrión humano o una célula madre pluripotente inducida. En una modalidad, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida. También se divulga una población celular que comprende la célula madre pluripotente descrita anteriormente.

Se divulga además una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de una población celular de las células T descritas en este documento en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de una neoplasia que contiene una cantidad eficaz de las células T específicas por el antígeno tumoral de cualquier aspecto de la invención delineado en este documento en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se divulga además un kit para el tratamiento de una neoplasia, infección por patógenos, un trastorno autoinmune o un trasplante alogénico, el kit comprende una población celular que comprende a las células T que se generan a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), en donde dichas células T se dirigen específicamente a un antígeno y el reconocimiento del antígeno por dichas células T es independiente de1HLA. En determinados ejemplos, el kit comprende además las instrucciones escritas para usar la célula para el tratamiento de un sujeto que tiene una neoplasia, una infección por patógenos, un trastorno autoinmune o un trasplante alogénico.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente invención, debajo se definen una serie de términos.

Como se usa en este documento, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más".

Como se usa en este documento, el término "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular según lo determine un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 3 o más de 3 desviaciones estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferentemente hasta el 10 %, más preferentemente hasta el 5 % y más preferentemente aún hasta el 1 % de un valor dado. Alternativamente, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y más preferentemente dentro de 2 veces, de un valor.

Como se usa en este documento, el término "población celular " se refiere a un grupo de al menos dos células que expresan fenotipos similares o diferentes. En ejemplos no limitantes, una población celular puede incluir al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000 células que expresan fenotipos similares o diferentes.

Como se usa en este documento, el término "clon" en referencia a un clon celular se refiere a una célula que es genéticamente idéntica a otra célula, por ejemplo, los clones de las células T son células hijas genéticamente idénticas a la célula parental.

Como se usa en este documento, el término "linfocito(s) de sangre periférica" o "PBL(s)" se refiere a los glóbulo(s) blancos que comprenden a las células T y células B de un intervalo de etapas funcionales y de diferenciación, células plasmáticas, monocitos, macrófagos, células asesinas naturales, basocitos, eosinófilos, etc.

Como se usa en este documento, el término "aislado" en referencia a una población se refiere a la eliminación de una población celular deseada más pequeña de una población inicial más grande. Como un ejemplo, los linfocitos de sangre periférica aislados pueden referirse a una capa específica de glóbulos blancos ubicada en un gradiente de Ficol. Como otro ejemplo, "células T de sangre periférica aisladas" puede referirse a una población celular CD3+ aisladas a partir de una población de glóbulos blancos más grande, como un ejemplo, las células CD3+ pueden aislarse con el uso de anticuerpos antiCD3+, tal como mediante la separación por citometría de flujo o separación por perlas magnéticas, etc. Como un ejemplo, una población celular T CD3+ puede aislarse a partir de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) u otra población de las células mediante separación magnética con el uso de un anticuerpo CD3 unido directa o indirectamente a partículas magnéticas.

Como se usa en este documento, el término "pluripotente" se refiere a una línea celular capaz de diferenciarse en múltiples tipos de las células diferenciadas.

Como se usa en este documento, el término "célula madre pluripotente (PSC)" o "células madre pluripotentes (PSC)" se refiere a la(s) célula(s) madre(s) que tiene(n) el potencial de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital) o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso). En ejemplos no limitantes, una PSC puede ser una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida.

Como se usa en este documento, el término "multipotente" se refiere a una línea celular capaz de diferenciarse en al menos dos tipos de células diferenciadas.

Como se usa en este documento, solo como referencia, el término "célula madre embrionaria (ESC)" o "células madre embrionarias (ESC)" se refiere a una célula madre pluripotente derivada de la masa celular interna de un blastocisto.

Como se usa en este documento, el término "célula madre adulta" o "células madre adultas" se refiere a la(s) célula(s) madre derivada(s) de un organismo después del nacimiento.

Como se usa en este documento, el término "linfocito T" o "célula T" se refiere a una célula que expresa CD3 (CD3+) y un receptor de las células T (TCR+).

Como se usa en este documento, el término "TCR" o "receptor de las células T" se refiere a una proteína heteróloga dimérica de señalización de la superficie celular que forma un receptor alfa-beta o gamma-delta normalmente involucrado en el reconocimiento de un antígeno presentado por una molécula del MHC (es decir, reconocimiento del antígeno en el contexto de una molécula del MHC).

Como se usa en este documento, el término "complejo de CD3" se refiere a un ensamblaje de moléculas de la superficie celular que comprende numerosas proteínas para la señalización transmembranal de la activación del TCR.

Como se usa en este documento, los términos "región" o "porción" cuando se usan en referencia a una molécula de ácido nucleico se refieren a un conjunto de nucleótidos enlazados que es menor que la longitud total de la molécula, tal como una región de señalización CD3Z descrita en este documento.

Como se usa en este documento, el término "sistema de cultivo celular" se refiere a las composiciones y los métodos de cultivo de las células para producir un tipo celular homogéneo más específico. Un sistema de cultivo celular puede comprender determinados factores de cultivo celular en un medio de crecimiento celular y los métodos de incubación durante un período de tiempo para cultivar las células en los factores de cultivo específicos para producir células específicas. En un ejemplo no limitante, un sistema de cultivo celular puede proporcionar las composiciones y los métodos para producir las células de un tipo de célula no predeterminado, tal como producir las células T más diferenciadas con un reconocimiento de antígeno específico. En otro ejemplo no limitante, se puede usar un sistema de cultivo celular para desdiferenciar a las células T para producir las células T pluripotentes inducidas.

Como se usa en este documento, el término "célula T precursora" en referencia a una célula producida por las composiciones y los métodos de las presentes invenciones se refiere a una célula que expresa CD34 (CD34+) y CD7 (CD7+).

Como se usa en este documento, el término "célula(s) madre pluripotente(s) inducida(s)" o "iPSC(s)" se refiere a la(s) célula(s) madre pluripotente(s) derivada(s) artificialmente in vitro de una célula somática a través de la expresión forzada (transformada o inducida) de los factores de transcripción de reprogramación específicos (como el OCT-4, KLF-4, SOX-2, c-Myc). Las iPSC son similares a las células madre embrionarias en morfología, patrón de expresión de genes de las células madre, patrón de metilación de la cromatina y pluripotencia (formación de teratomas, formación de cuerpos embrioides, etc.).

Como se usa en este documento, el término "T-PSC" o "T-PSC" se refiere a la(s) célula(s) madre pluripotente(s) que lleva(n) un locus reordenado del TCR, de manera que una célula T se reprograma o desdiferencia a una célula madre pluripotente (PSC). Una célula T-PSC puede derivar de cualquier célula T madura desarrollada endógenamente aislada.

Como se usa en este documento, el término "T-iPSC" o "T-iPSC" se refiere a la(s) célula(s) madre pluripotente(s) inducida(s) que llevan un locus reordenado del TCR, de manera que una célula T se reprograma o desdiferencia a una iPSC. Una célula T-iPSC puede derivar de cualquier célula T madura desarrollada endógenamente aislada.

Como se usa en este documento, el término "CAR-T-PSC" o "CAR-T-PSC" se refiere a la(s) célula(s) madre pluripotente(s) que llevan un locus preordenado del TCR y que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) (CAR+). La CAR-T-PSC no expresa un TCR en la superficie celular. Normalmente hay una expresión del TCR después de la rediferenciación con el uso de un método de cultivo celular para producir las células T comprometidas y las células T efectoras. La CAR-T-PSC se puede producir al transducir la T-PSC con un vector CAR.

Como se usa en este documento, el término "CAR-T-iPSC" o "CAR-T-iPSC" se refiere a la(s) célula(s) madre pluripotente(s) inducida(s) que llevan un locus preordenado del TCR y que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) (CAR+). La CAR-T-iPSC no expresa un TCR en la superficie celular. Normalmente hay una expresión del TCR después de la rediferenciación con el uso de un método de cultivo celular para producir las células T comprometidas y las células T efectoras. Las CAR-T-iPSC se pueden producir al transducir la T-iPSC con un vector CAR.

Como se usa en este documento, el término "célula(s) T derivada(s) de CAR-T-PSC" se refiere a la(s) célula(s) T producida(s) o derivada(s) a partir de la CAR-T-PSC como se describió anteriormente. Por ejemplo, la célula T derivada de CAR-T-PSC puede derivarse a partir de la CAR-T-PSC después de la inducción de la diferenciación con el uso de un sistema de cultivo celular de la presente invención. La célula T derivada de CAR-T-PSC puede reconocer un antígeno, para el cual el CAR es específico o que puede ser reconocido por el CAR.

Como se usa en este documento, el término "la(s) célula(s) T derivada(s) de CAR-T-iPSC" se refiere a la(s) célula(s) T producida(s) o derivada(s) a partir de CAR-T-iPSC como se describió anteriormente. Por ejemplo, las células T derivadas de CAR-T-iPSC pueden derivarse a partir de las CAR-T-iPSC después de la inducción de la diferenciación con el uso de un sistema de cultivo celular de la presente invención. Las células T derivadas de CAR-T-iPSC pueden reconocer un antígeno, para el cual el CAR es específico o que puede ser reconocido por el CAR.

Como se usa en este documento, el término "la(s) célula(s) T efectora(s) CAR-T-PSC" se refiere a la(s) célula(s) T efectora(s) producida(s) a partir de CAR-T-PSC como se describió anteriormente, por ejemplo, las células T derivadas de CAR-T-PSC. Las células T efectoras CAR-T-PSC pueden poseer al menos una de las siguientes actividades: secreción de citocinas (incluidas, pero no se limitan a, IL-2, IFN-y, TNF-a), proliferación cuando se expone a un antígeno que se puede reconocer por el CAR, citotoxicidad e inhibición citostática.

Como se usa en este documento, el término "la(s) célula(s) T efectora(s) CAR-T-iPSC" se refiere a la(s) célula(s) T efectora(s) producida(s) a partir de CAR-T-iPSC, por ejemplo, las células T derivadas de CAR-T-iPSC. Las células T efectoras CAR-T-iPSC pueden poseer al menos una de las siguientes actividades: secreción de citocinas (incluidas, pero no se limitan a, IL-2, IFN-y, TNF-a), proliferación cuando se expone a un antígeno que se puede reconocer por el CAR, citotoxicidad e inhibición citostática.

Como se usa en este documento, el término "citotóxico" o "citostático" o "inhibición citostática" se refiere a una o más de una inhibición del crecimiento tumoral y una reducción en la carga tumoral, es decir, la cantidad de las células tumorales en un sujeto, tal como se mide por los medios de diagnóstico.

Como se usa en este documento, el término "contactar" o "exponer" en referencia a un antígeno y su región de unión en un CAR se refiere a la interacción entre la región de unión al antígeno expresada por un CAR y su antígeno que estimula una respuesta en una célula CAR+.

Como se usa en este documento, el término "fragmento variable de cadena sencilla" o "scFv" es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (V^h) y ligera (V^l) de una inmunoglobulina (por ejemplo, de ratón o humana) ligada de forma covalente para formar un heterodímero V^h:: VL. Las cadenas pesada (V^h) y ligera (V^l) están unidas directamente o unidas por un enlazador que codifica péptidos (por ejemplo, 10, 15, 20, 25 aminoácidos), que conecta el extremo N-terminal de la V^hcon el extremo C-terminal de la V^lo el extremo C-terminal de la V^hcon el extremo N-terminal de la V^l. El enlazador suele ser rico en glicina para la flexibilidad, así como serina o treonina para la solubilidad. A pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción de un enlazador, las proteínas scFv conservan la especificidad de la inmunoglobulina original. Los anticuerpos de polipéptido Fv de cadena sencilla se pueden expresar a partir de un ácido nucleico que incluye las secuencias que codifican la V^hy la V^l, como describen Huston, y otros (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988). Véanse también las patentes de los EE. UU. No.

5,091,513, 5,132,405 y 4,956,778 y las publicaciones de patente de los EE. UU. No. 20050196754 y 20050196754. Se han descrito scFv antagonistas que tienen actividad inhibidora (véase, por ejemplo, Zhao y otros, Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27 (6):455-51; Peter y otros, J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 12 de agosto; Shieh y otros, J Imunol2009 183(4):2277-85; Giomarelli y otros, Thromb Haemost 2007 97(6):955-63; Fife y otros, J Clin Invst 2006 116(8):2252-61; Brocks y otros, Immunotechnology 19973(3):173-84; Moosmayer y otros, Ther Immunol 19952(10: 31-40). Se han descrito scFv agonistas que tienen actividad estimulante (véase, por ejemplo, Peter y otros, J Bioi Chern 200325278 (38):36740-7; Xie y otros, Nat Biotech 199715(8):768-71; Ledbetter y otros, Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55; Ho y otros, BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66).

Como se usa en este documento, "F(ab)" se refiere a un fragmento de una estructura de anticuerpo que se une a un antígeno pero es monovalente y no tiene una porción Fc, por ejemplo, un anticuerpo digerido por la enzima papaína produce dos fragmentos F(ab) y un fragmento Fc (por ejemplo, una región constante de la cadena pesada (H); región Fc que no se une a un antígeno).

Como se usa en este documento, "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo generado por la digestión con pepsina de los anticuerpos IgG completos, en donde este fragmento tiene dos regiones de unión al antígeno (ab') (bivalentes), en donde cada región (ab') comprende dos cadenas de aminoácidos separadas, una parte de una cadena H y una cadena ligera (L) ligadas por un enlace S-S para unir un antígeno y donde las porciones restantes de la cadena H están ligadas entre sí. Un fragmento "F(ab')2" se puede dividir en dos fragmentos Fab' individuales.

Como se usa en este documento, el término "grupo de diferenciación" o "CD" se refiere a un marcador de superficie celular, por ejemplo, un leucocito. El CD se puede usar para distinguir los linajes celulares, etapas de desarrollo y subconjuntos funcionales. El CAR de la presente invención puede dirigirse a un CD, que incluye, pero no se limita a, CD10, CD19, etc.

Como se usa en este documento, el término "marcador seleccionable" se refiere al uso de un gen que codifica una proteína que proporciona una actividad distinguible a la célula, como la capacidad de crecer en un medio que contiene un antibiótico que de otro modo mataría una célula (por ejemplo, un gen de neomicina fosforiltransferasa (Neo) en las células transformadas o transducidas) o la capacidad de emitir luz fluorescente. Por ejemplo, un marcador seleccionable puede conferir resistencia a un antibiótico o fármaco sobre la célula, tal como cuando se expresa un marcador seleccionable, como un gen de neomicina fosforiltransferasa (Neo). Otro tipo de marcador es un marcador fluorescente, tales como GFP mejorado (eGFP), mCherry, etc., que puede detectarse mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. Los marcadores fluorescentes incluyen a la proteína fluorescente verde, la proteína fluorescente azul, la proteína fluorescente cian y la proteína fluorescente amarilla. Las proteínas fluorescentes azules incluyen a EBFP, EBFP2, Azurite y mKalamal. Las proteínas fluorescentes cian incluyen a ECFP, Cerulean y CyPet. Las proteínas fluorescentes amarillas incluyen a YFP, Citrine, Venus e YPet.

Como se usa en este documento, el término "diferenciación", como se usa con respecto a las células en un sistema celular de diferenciación se refiere a un proceso por el cual las células se diferencian de un tipo celular (por ejemplo, una célula diferenciable multipotente, totipotente o pluripotente) a otro tipo celular tal como una célula diana diferenciada (por ejemplo, una célula T). Como tal, la diferenciación puede ser mediante un tipo de célula predeterminada o no predeterminada. In vitro, un tipo de célula predeterminada es el tipo de célula mayoritaria en una población celular cuando no se expone a un determinado factor de diferenciación o grupo de factores en contraste con un tipo de célula no predeterminada o un tipo de célula diferente en la mayoría de las células cuando se expone a determinados factor(s) de diferenciación.

Como se usa en este documento, "inducir diferenciación hematopoyética" en referencia a un sistema de cultivo celular se refiere a las composiciones y los métodos de las presentes invenciones como se describe en este documento, para producir las células precursoras hematopoyéticas CD34+ a partir de T-iPSC, véase el Ejemplo I para una descripción ejemplar.

Como se usa en este documento, "reprogramación" en referencia a un sistema de cultivo celular se refiere a las composiciones y los métodos para producir las células T-PSC a partir de linfocitos T maduros de sangre periférica de las presentes invenciones como se describe en este documento, en donde dichas células reprogramadas expresan inicialmente los factores de transcripción de reprogramación (que consisten en Oct-4, KLF-4, Sox-2 y c-Myc), véase el Ejemplo I para una descripción ejemplar.

Como se usa en este documento, "rediferenciar" o "diferenciación linfoide T" o "compromiso linfoide T" en referencia a un sistema de cultivo celular se refiere a las composiciones y los métodos descritos en este documento, para producir las células con marcadores específicos de linfoides T que se expresaron, pero luego se silenciaron durante la reprogramación (CD7, CD5, CD3, TCR) a partir de las células CD34+ derivadas de T-PSC. En particular, las células T de las presentes invenciones se produjeron mediante las composiciones y los métodos de un sistema de rediferenciación o cultivo celular como se describe en el Ejemplo I.

Como se usa en este documento, el término "cultivo celular" se refiere a cualquier cultivo de las células in vitro. Dentro de este término se incluyen líneas celulares continuas (por ejemplo, con un fenotipo inmortal), cultivos de las células primarias, líneas celulares finitas (por ejemplo, células no transformadas) y cualquier otra población celular mantenida in vitro, incluidas las células madre, las células sanguíneas del cordón embrionario, las células transducidas, etc.

Como se usa en este documento, "cuerpo embrioide" o "EB" se refiere a agregados tridimensionales de las células madre pluripotentes que se forman durante determinados sistemas de cultivo celular.

Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a cualquier elemento genético, tales como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias de genes a las células. Por lo tanto, el término incluye los vehículos de clonación y expresión, así como los vectores virales y los vectores plasmídicos.

El término "vector de expresión" como se usa en este documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico recombinante, es decir, una molécula de ADN recombinante, que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante ligada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas normalmente incluyen un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación.

Como se usa en este documento, el término "lentivirus" se refiere a un virus que puede transducir tanto a las células que proliferan activamente como a las células que no se dividen.

Como se usa en este documento, el término "vectores SFG" se refiere a los vectores gamma retrovirales que también encuentran uso en la presente invención, tales vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney, incluidos los vectores y la construcción de los vectores descritos, por ejemplo, por Riviere, PNAS, 1995, Gallardo, Blood, 1997.

Como se usa en este documento, el término "escindible" en referencia a un vector se refiere a un vector que se puede eliminar de un genoma después de la integración (transducción), en donde dicho vector tiene un sitio loxP en la LTR 3' para uso de la recombinasa Cre para la escisión de las secuencias de los vectores.

Como se usa en este documento, el término "lentiviral" o "lentivirus" en referencia a un vector se refiere a los vectores virales derivados de la familia Lentiviridae que son capaces de integrarse en las células que se dividen y que no se dividen, incluidos, pero no se limitan a, los vectores pLM, (por ejemplos, véanse, por ejemplo, Papapetrou & Sadelain, Nature Protocols, 6 (9): 1274-1289 (2011); patentes de los e E. UU. No. 5,994,136 y 6,013,516). Se conocen en la técnica una variedad de vectores lentivirales y líneas celulares de empaquetamiento y encuentran uso en la presente invención (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. No. 5,994,136 y 6,013,516), sin embargo, no se pretende limitar el tipo de vector siempre que sea capaz de integrar de forma estable un CAR en el genoma de una célula.

El término "transducción", como se usa en este documento, se refiere al proceso en donde se introducen las secuencias de ácido nucleico heterólogas en otra célula con el uso de un vector viral.

El término "transfección" como se usa en este documento se refiere al proceso de introducir ácidos nucleicos en las células mediante métodos no virales. La transfección se puede lograr mediante una variedad de medios conocidos en la técnica que incluyen coprecipitación del ADN con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, lipofección, fusión de protoplastos y biolística.

El término "transducción estable" o "transducido de manera estable" se refiere a una célula que ha integrado de manera estable el ADN extraño en el genoma después de la infección con un vector viral.

El término "silenciado" en referencia a un gen o proteína se refiere a la regulación a la baja o ausencia de la expresión génica y/o expresión de la proteína. El término "silenciado" en referencia a una célula que tiene un gen silenciado se refiere a una célula que tiene al menos un gen regulado a la baja o ausente en comparación con una célula equivalente que no tiene el gen silenciado.

Como se usa en este documento, "terapia de transferencia celular adoptiva" o "ACT" se refiere a la administración de linfocitos T autólogos reactivos a tumores activados ex vivo y expandidos.

Como se usa en este documento, "autólogo" se refiere a las células genéticamente idénticas derivadas del mismo donante.

Como se usa en este documento, "alogénico" se refiere a las células derivadas de un donante genéticamente no idéntico. Las células alogénicas normalmente causan la enfermedad del injerto contra el huésped cuando se usan para el trasplante de células u órganos.

Como se usa en este documento, "MHC" o "complejo principal de histocompatibilidad" se refiere a las moléculas de la superficie celular codificadas por un gran número de genes en los mamíferos. Las moléculas del MHC incluyen la Clase I y la Clase II. Las moléculas de Clase I se denominan alternativamente en humanos como "HLA" o "antígeno leucocitario humano". En parte debido a la complejidad de la expresión de las moléculas de1HLA, e1HLA también puede denominarse sistema HLA. Los humanos expresan las moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C que normalmente están implicadas en la presentación del antígeno procesado a las células CD8, es decir, restringido a1HLA. Las moléculas de Clase II, tales como DR, DQ, DP, etc., están normalmente implicadas en la presentación de péptidos derivados del exterior a las células CD4+, es decir, restringido a las moléculas de Clase II del MHC. La restricción al MHC en general abarca tanto a la Clase I como la Clase II como en la compatibilidad del trasplante (médula ósea).

Como se usa en este documento, "restringido al HLA" o "restringido al MHC" se refiere al reconocimiento del antígeno que requiere tanto la molécula del MHC como su péptido. A diferencia del reconocimiento del antígenos que "no está restringido al HLA" o "independiente del HLA" o "no está restringido al MHC".

Como se usa en este documento, el término "in vitro" se refiere a un ambiente artificial y a procesos o reacciones que ocurren dentro de un ambiente artificial. Los entornos in vitro pueden consistir en, pero no están limitados a, tubos de ensayo y cultivo celular. Alternativamente, el término "in vivo" se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a los procesos o reacciones que ocurren dentro de un entorno natural.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluidos, pero no se limitan a, humanos, primates no humanos, roedores y similares (por ejemplo, que va a ser el receptor de un tratamiento particular o de quien se recolectan las células).

Como se usa en este documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para tener un efecto terapéutico. En una modalidad, una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para detener, mejorar o inhibir la proliferación, el crecimiento o la metástasis continuos (por ejemplo, la invasión o la migración) de una neoplasia. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosis y no se pretende que se limite a una formulación o vía de administración particular.

Como se usa en este documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para reducir al menos aproximadamente el 15 por ciento, preferentemente al menos el 50 por ciento, más preferentemente al menos el 90 por ciento y lo más preferentemente previene un efecto dañino clínicamente significativo o actividad o respuesta de las células que causan la enfermedad en un paciente huésped, tal como una reducción de la carga tumoral o cáncer o al menos ralentizar o detener el desarrollo de un crecimiento tumoral adicional o la diseminación del cáncer. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para provocar una mejora en una enfermedad clínicamente significativa en un paciente huésped, es decir, como cuando se administra una célula CAR+ de la presente invención a un paciente que tiene cáncer y se destruyen las células cancerosas.

Como se usa en este documento, el término "tratamiento" o "tratar" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso de la enfermedad del individuo o de la célula que se está tratando y se puede realizar para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos terapéuticos del tratamiento incluyen, sin limitación, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención de las metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado patológico y la remisión o el pronóstico mejorado. Al prevenir la progresión de una enfermedad o trastorno, un tratamiento puede prevenir el deterioro debido a un trastorno en un sujeto afectado o diagnosticado o en un sujeto sospechoso de tener el trastorno, pero también un tratamiento puede prevenir la aparición del trastorno o un síntoma del trastorno en un sujeto en riesgo de padecer el trastorno o sospechoso de tener el trastorno.

Como se usa en este documento, el término "sujeto diagnosticado con un cáncer" se refiere a un sujeto que ha sido probado y se ha encontrado que tiene células cancerosas. El cáncer se puede diagnosticar con el uso de cualquier método adecuado, que incluye, pero no se limitan a, biopsia, rayos X, análisis de sangre y los métodos de diagnóstico de la presente invención. Un "diagnóstico preliminar" es aquel que se basa únicamente en las pruebas visuales (por ejemplo, tomografía computarizada o la presencia de un bulto) y pruebas de antígenos. El sujeto puede necesitar la inmunoterapia adoptiva contra el cáncer que comprenda las células T de la presente invención.

Como se usa en este documento, el término "administrado" o "administrar" se refiere a cualquier método para proporcionar una composición (es decir, por ejemplo, una célula biológica) a un paciente de manera que la composición tenga el efecto pretendido en el paciente. Por ejemplo, un método de administración es mediante un mecanismo indirecto con el uso de un dispositivo médico, tales como, pero no limitados a, un catéter, pistola aplicadora, jeringa, etc. Un segundo método ejemplar de administración es mediante un mecanismo directo, tales como la administración local de tejido (es decir, por ejemplo, colocación extravascular), ingestión oral, parche transdérmico, tópico, inhalación, supositorio, etc., sin embargo, no se pretende limitar el tipo de administración de una célula producida por los métodos de las presentes invenciones a un paciente.

Como se usa en este documento, el término "células cancerosas" se refiere a las células individuales de un cáncer. Dichas células pueden incluir, por ejemplo, células tumorigénicas (por ejemplo, capaces de generar un tumor), células leucemogénicas (por ejemplo, capaces de generar leucemia), células madre cancerosas (por ejemplo, capaces de formar nuevos tumores o transferir la enfermedad tras el trasplante a un huésped inmunodeprimido), así como las células que no son tumorigénicas, leucemogénicas o que son capaces de formar nuevos tumores o transferir la enfermedad tras el trasplante (por ejemplo, células mesenquimales y endoteliales) que incluyen pero no se limitan a cáncer de próstata, cáncer de mama, etc.

Como se usa en este documento, el término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula que contiene ácido nucleico, que incluye, pero no se limitan a, ADN o ARN. El término abarca las secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos del ADN y ARN.

Como se usa en este documento, los términos "molécula de ácido nucleico que codifica", "secuencia de ADN que codifica" y "codificación de ADN" se refieren al orden o secuencia de los desoxirribonucleótidos a lo largo de una hebra de un ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena del polipéptido (proteína). Por lo tanto, la secuencia de ADN codifica la secuencia de aminoácidos.

Como se usa en este documento, el término "gen heterólogo" se refiere a un gen que no se encuentra en su entorno natural. Por ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen de una especie introducido en otra especie. Un gen heterólogo también incluye un gen nativo de un organismo que ha sido alterado de alguna manera (por ejemplo, mutado, agregado en múltiples copias, ligado a secuencias reguladoras no nativas, etc.). Como otro ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen expresado en un linaje celular anterior o futuro o en un estado de diferenciación de una célula. Los genes heterólogos se distinguen de los genes endógenos en que las secuencias de los genes heterólogos se unen normalmente a las secuencias de ADN que no se encuentran asociadas naturalmente con las secuencias de genes en el cromosoma o están asociadas con las porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en un locus donde el gen no se expresa normalmente).

Como se usa en este documento, el término "transgén" se refiere a un gen heterólogo que se integra en el genoma de un organismo (por ejemplo, un animal no humano) y que se transmite a la progenie del organismo durante la reproducción sexual.

Como se usa en este documento, "secuencia de aminoácidos" y los términos, tales como "polipéptido" o "proteína" no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa y completa asociada con la molécula de proteína mencionada.

Como se usa en este documento, el término "sustancialmente idéntico" se refiere a un polipéptido o molécula de ácido nucleico que exhibe al menos 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en este documento) o secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento). Preferentemente, tal secuencia es al menos 60 %, más preferentemente 80 % o 85 % y más preferentemente 90 %, 95 % o incluso 99 % idéntica a nivel de aminoácidos o ácido nucleico a la secuencia usada para la comparación.

La identidad de la secuencia se mide normalmente con el uso de software de análisis de secuencia (por ejemplo, los programas Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BlAs t , BEs Tf IT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX). Dicho software empareja las secuencias idénticas o similares mediante la asignación de los grados de homología a diversas sustituciones, deleciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras normalmente incluyen las sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina y fenilalanina, tirosina. En un enfoque ejemplar para determinar el grado de identidad, puede usarse un programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e-3 y e-100 lo que indica una secuencia estrechamente relacionada.

Como se usa en este documento, el término "ligando" se refiere a una molécula que se une a un receptor. En particular, el ligando se une a un receptor en otra célula, lo que permite el reconocimiento y/o la interacción de célula a célula.

Como se usa en este documento, el término "neoplasia" significa una enfermedad caracterizada por la proliferación patológica de una célula o tejido y su posterior migración o invasión de otros tejidos u órganos. El crecimiento de la neoplasia es normalmente incontrolado y progresivo y se produce en condiciones que no desencadenarían o provocarían el cese o la multiplicación de las células normales. Las neoplasias pueden afectar una variedad de tipos de las células, tejidos u órganos, que incluyen, pero no se limitan a, un órgano seleccionado del grupo que consiste en vejiga, hueso, cerebro, mama, cartílago, glía, esófago, trompas de Falopio, vesícula biliar, corazón, intestinos, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, tejido nervioso, ovarios, páncreas, próstata, músculo esquelético, piel, médula espinal, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, tráquea, tracto urogenital, uréter, uretra, útero y vagina o un tejido o tipo celular del mismo. Las neoplasias incluyen cánceres, tales como sarcomas, carcinomas o plasmacitomas (tumor maligno de las células plasmáticas).

Como se usa en este documento, el término "patógeno" significa un virus, bacteria, hongo, parásito o protozoo capaz de causar una enfermedad.

Los virus ejemplares incluyen, pero no están limitados a, Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1 (también denominados HDTV-III, LAVE o HTLV-III/LAV o VIH-III y otros aislados, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humano, rinovirus, echovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de encefalitis equina, virus de rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio); Ortomixoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus Naira); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbiviurses y rotavirus); Birnaviridae; H epadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvovirida (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxviridae (virus de la variola, virus de la vacuna, virus de la viruela) e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la peste porcina africana) y virus no clasificados (por ejemplo, el agente de la hepatitis delta (se cree que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A, no B (clase 1 = transmisión interna; clase 2 transmitida por vía parenteral (es decir, Hepatitis C); virus de Norwalk y afines y astrovirus).

Las bacterias ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Pasteurella, Staphylococci, Streptococcus, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de las bacterias infecciosas incluyen, pero no están limitadas a, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (sps. anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patógena, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, and Actinomyces israelli.

Como se usa en este documento, el término "receptor" se refiere a un polipéptido o una porción del mismo, presente en una membrana celular que se une selectivamente a uno o más ligandos.

Como se usa en este documento, el término "reducir" pretende alterar negativamente en al menos un 5 %. Una alteración puede ser del 5 %, 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 75 % o incluso del 100 %.

Como se usa en este documento, el término "reconocer" se refiere a que se une selectivamente a una diana. Una célula T que reconoce un virus normalmente expresa un receptor que se une a un antígeno expresado por el virus.

Como se usa en este documento, el término "antígeno tumoral" se refiere a un antígeno (por ejemplo, un polipéptido) que se expresa única o diferencialmente en una célula tumoral en comparación con una célula normal o célula neoplásica normal o no IS. Con referencia a la invención, un antígeno tumoral incluye cualquier polipéptido expresado por un tumor que es capaz de activar o inducir una respuesta inmune a través de un receptor de reconocimiento de antígeno (por ejemplo, CD19, MUCI) o capaz de suprimir una respuesta inmune mediante la unión del ligando al receptor (por ejemplo, CD47, PD-L1/L2, B7.1/2).

Como se usa en este documento, el término "antígeno de virus" se refiere a un polipéptido expresado por un virus que es capaz de inducir una respuesta inmune.

Como se usa en este documento, "tratamiento" se refiere a una intervención clínica en un intento de alterar el curso de la enfermedad del individuo o la célula que se está tratando y puede realizarse para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos terapéuticos del tratamiento incluyen, sin limitación, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención de las metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado patológico y la remisión o el pronóstico mejorado. Al prevenir la progresión de una enfermedad o trastorno, un tratamiento puede prevenir el deterioro debido a un trastorno en un sujeto afectado o diagnosticado o en un sujeto sospechoso de tener el trastorno, pero también un tratamiento puede prevenir la aparición del trastorno o un síntoma del trastorno en un sujeto en riesgo de padecer el trastorno o sospechoso de tener el trastorno.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente Descripción Detallada, dada a modo de ejemplo, puede entenderse junto con los dibujos adjuntos.

Las Figuras 1A-1F muestran la diferenciación de las T-iPSC manipuladas con el CAR de 1928z en los linfocitos T funcionales específicos por el CD19. (A) El concepto de estudio. Los linfocitos de sangre periférica se reprograman a pluripotencia mediante transducción con retrovirus que codifican c-MYC, SOX2, KLF4 y OCT-4 (7). Las T-iPSC resultantes se manipulan genéticamente para expresar un CAR y luego se diferencian en células T que expresan tanto el CAR como un TCR endógeno. (B) Protocolo de diferenciación de linfoides T in vitro. Las T-iPSC se transdujeron de manera estable con un vector lentiviral bicistrónico que codifica el CAR 19-28z y el marcador fluorescente mCherry. Las T-iPSC mCherry+ CAR+ se diferencian en tres etapas: (i) formación del mesodermo (días 1-4), (ii) especificación y expansión hematopoyética (días 5-10) y (iii) compromiso linfoide T (días 10-30). Las imágenes de microscopía de fluorescencia (abajo) muestran que la expresión de mCherry se mantuvo durante todo el proceso de diferenciación. Barras de escala, 100 pM. (C) Análisis por citometría de flujo de las células derivadas de l928z-T-iPSC al día 30 de la diferenciación. Las gráficas representativas tienen al menos cinco diferenciaciones independientes. (D) Se sembraron las células 1928z-T-iPSC-T en cultivos de las células 3T3 o de las células 3T3 que expresan CD19 (3T3-CD19). Se muestran los cocultivos 24 h después de la siembra de las células T; son visibles la formación de los grupos de las células T y la eliminación de la monocapa 3T3-CD19. Barras de escala, 100 mM. (E) Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD25 y CD69 en la superficie de las células 1928z-T-iPSC-T 48 h después de la exposición a las células 3T3 o 3T3-CD19. (F) Análisis de citocinas multiplex Luminex del sobrenadante del cultivo 24 h después de la siembra de las células 1928z-T-iPSC-T en las células 3T3 o 3T3-CD19. Los datos se presentan como la media de dos experimentos independientes ± d.e.

Las Figuras 2A-2G muestran el perfil fenotípico de las células 1928z-T-iPSC-T antes y después de la expansión inducida por CD19. (A) Agrupación jerárquica no supervisada de 35 transcriptomas totales, generados por una micromatriz de expresión génica de ARNm, a partir de las células 1928z-TiPCS-T en los días 30-35 de la diferenciación (1928z-T-iPSC-T) y otros subconjuntos de las células linfoides humanas aisladas para este estudio [células CD3+TCRy5+ (y5-T), células CD3+CD56+, células CD8+ y células CD4+] o descargado de la base de datos GEO del repositorio del NCBI (células B vírgenes, células T y5 TCRVy9 antes de la activación (y5-T GEO) y después de la activación con BrHPP/IL-2 (pirofosfato de bromohidrina/interleucina-2) durante 6 h (y5-T 6h activ) o 7 días (y5-T 7d activ) y células NK en reposo). (B) Mapa de calor que compara la expresión de los transcritos de ARNm indicados expresados en las células linfoides y/o NK. Los transcritos se clasifican de acuerdo con los patrones de función y expresión conocidos. (C) Expresión intracelular del factor de transcripción PLZF (histograma rojo), en comparación con el control de isotipo (histograma negro) y expresión de superficie de CD161 y CD3 en las células 1928z-T-iPSC-T, según lo evaluado por citometría de flujo. (D) Expansión de las células 1928z-T-iPSC-T después de las estimulaciones semanales con las células 3T3-CD19 en presencia de IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml) durante 4 semanas. Se muestran los números absolutos de las células. Las flechas indican reestimulaciones con las AAPC 3T3-CD19 recién irradiadas. (E) Análisis por citometría de flujo de las moléculas de superficie celular y de los receptores citotóxicos en las células 1928z-T-iPSC-T seleccionadas como CD3+ antes y 7 días después de la expansión en las AAPC 3T3-CD19. (F y G) Análisis qRT-PCR de la expresión de los transcritos de ARNm indicados en las células 1928z-T-iPSC-T antes y 7 d después de la expansión en las AAPC 3T3-CD19. Los datos se normalizaron a los valores de GAPDH endógeno y los niveles de expresión de preexpansión se utilizaron como referencia. Los gráficos representan el promedio de los triplicados técnicos intraensayo. Barras de error, media ± d.e.

Las Figuras 3A-3E muestran las células 1928z-T-iPSC-T que lisan las células tumorales positivas para CD19 in vitro e in vivo. (A) Ensayo de liberación de Cr51 in vitro de las células 1928z-T-iPSC-T expandidas durante 7 d (efectores) y la línea celular de linfoma murino EL-4 que expresa ovoalbúmina (EL4-OVA) o CD19 humano (EL4-CD19) (dianas). E/T, relación efector/diana. Representativo de dos experimentos independientes. (B) Análisis por citometría de flujo de las células 1928z-T-iPSC-T y de las células T y5 singénicas transducidas con 1928z (1928z-y5) y ap (1928z-aP) antes de su inyección en ratones portadores de tumores. Abajo: histograma negro, células no transducidas; histograma rojo, células transducidas. Gráficas representativas de dos experimentos independientes. (C) Se inocularon ratones NOD-SCID IL2RYcnulos intraperitonealmente con la línea celular de linfoma de Burkitt humano Raji CD19+ que expresa una proteína de fusión de proteína fluorescente verde-luciferasa de luciérnaga (GFP/Luc). Cuatro días después, las células T (4 x 105) descritas en B se inyectaron por vía intraperitoneal. Ningún tratamiento indica los ratones que fueron inyectados con las células tumorales, pero no con las células T. La carga tumoral se midió cada dos semanas mediante imágenes bioluminiscentes. Se muestran las imágenes de puntos en el tiempo representativos. Las imágenes de tres ratones de cada grupo se seleccionaron intencionalmente para mostrar la recaída de los ratones después del tratamiento. La desaparición de un ratón de la secuencia de imágenes indica la muerte de ese ratón. (D) Curva de Kaplan-Meier que representa el porcentaje de supervivencia de los grupos experimentales descritos en B (1928z-T-iPSC-T: n = 4, 1928z-y5: n = 5, 1928z-ap: n = 7, sin tratamiento: n = 6). Las flechas codificadas por colores representan los eventos de muerte no relacionados con el crecimiento del tumor en los grupos correspondientes. El análisis estadístico entre el grupo experimental tratado y el grupo de control no tratado, que se muestra aquí, se realizó con el uso de la prueba de rango logarítmico y P <0,05 se consideró significativo. (E) muestra las células CAR-T-iPSC-T ejemplares que retrasaron el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto murino de linfoma de Burkit Raji CD19+ en comparación con un control no tratado. Las células TCRap y TCRyS de sangre periférica transducidas con el CAR 1928z sirvieron como controles positivos. Los ratones NOD scid gamma (NSG) se inocularon por vía intraperitoneal con 105 células Raji que expresan GFP y luciferasa de luciérnaga, de modo que la carga tumoral podría monitorearse mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo (IVIS 100 Imaging System). Cuatro días más tarde también se inyectaron intraperitonealmente 105 células T de los grupos respectivos junto con IL-2 (50000 U/ratón) e IL-15 (0,25 pg/ratón). La administración de la IL-2 se continuó a diario e IL-15 cada 2 días.

Las Figuras 4A-4G muestran la generación de T-iPSC. (A) Representación esquemática de los dos vectores retrovirales tricistrónicos utilizados para reprogramar a los linfocitos T de sangre periférica (PBL). Cada uno de los vectores codifica 2 de los factores de reprogramación de Yamanaka y un marcador fluorescente (vexGFP o mCitrine) ligado con péptidos 2A. LTR: repetición terminal larga, wpre: elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota. (B) Número de copias de los vectores de reprogramación en las diferentes líneas T-iPSC evaluadas por qPCR. (C) Silenciamiento de los vectores de reprogramación en T-iPSC evaluados por qRT-PCR. Expresión de los transcritos vexGFP-P2A-Oct4-E2A-KLF4 y mCitrine-P2A-cMyc-T2A-SOX2 codificados por los vectores en PBL antes de la transducción (PBL d0), 3 días después de la transducción (PBL d3) y en 3 clones diferentes de T-iPSC. (D) Expresión de los marcadores de las células pluripotentes Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-3 y SSEA-4 en el clon T-iPSC-1.10 evaluado por citometría de flujo. La población con marcador de pluripotencia negativo/HLA-ABC negativo corresponde a MEF. (E) Expresión de los genes endógenos asociados a pluripotencia en el clon TiPSC-1.10 (enumerados debajo del eje X) evaluados mediante qRT-PCR. Los datos se normalizaron a los valores de GAPDH endógena y se muestran como la expresión relativa frente a los niveles de expresión de PBL d0. hES: línea de las células madre embrionarias humanas de referencia HI. (F) Análisis cariotípico del clon TiPSC-1.10. (G) Tinción representativa con hematoxilina y eosina de las secciones histológicas de un teratoma derivado del clon T-iPSC-1.10 que comprende los tejidos de las tres capas germinales. Las flechas negras muestran el ectodermo: rosetas neuronales, mesodermo: cartílago y mesodermo: epitelio similar a una glándula.

Las Figuras 5A y 5B muestran los reordenamientos de las cadenas p y y del receptor de las células T (TCR). (A) Análisis del reordenamiento del TCRp y TCRy de la línea parental T-iPSC-1.10 y linfocitos 1928z-T-iPSC-T con el uso de los cebadores de PCR multiplexados dirigidos a las regiones conservadas dentro de la región VJ de los loci p y y del TCR y análisis de fragmentos de PCR. (B) Análisis del reordenamiento del TCRp de las líneas T-iPSC-1.3 y T-iPSC-1.4. Eje X: tamaño del fragmento (pb), eje Y: intensidad de fluorescencia (RFU). Los corchetes rojos representan el intervalo de tamaño del fragmento de p Cr válido en el electroferograma.

Las Figuras 6A-6C muestran la generación de las T-iPSC que expresan el 1928z CAR. (A) Representación esquemática del vector lentiviral que codifica el CAR 1928z y el marcador fluorescente mCherry ligado con un péptido P2A. LTR: repetición terminal larga, Ubi-c: promotor de ubiquitina-C, wpre: elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota. (B) Línea T-iPSC-1.10 transducida con el vector lentiviral mCherry-p2A-1928z (1928z-T-iPSC) como se ve bajo un microscopio fluorescente. Imagen superior: campo brillante, imagen inferior: epifluorescencia. Barra de escala, 100 pM. (C) Expresión de mCherry y el CAR en 1928z-T-iPSC evaluados por citometría de flujo. La expresión superficial del CAR se determinó después de la tinción con un anticuerpo F(ab')2 de IgG antirratón de cabra que se une al dominio extracelular derivado de murino del CAR.

Las Figuras 7A y 7B muestran la generación de los progenitores hematopoyéticos con potencial linfoide. a) Expresión de Notch1 y g At A-3 en las células CD34+ aisladas al día 10 y día 12 de la diferenciación del clon T-iPSC-1.10, evaluado por qRT-PCR con el uso de Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems). Los datos se normalizaron a los valores de GAPDH endógena y se muestran como la expresión relativa frente a los niveles de expresión del clon T-iPSC-1.10. b) Análisis por citometría de flujo de la expresión de Notch1 y CD127 (IL-7Ra) en los progenitores hematopoyéticos CD34+CD43- y en las células CD34-CD43 al día 10 de la diferenciación del clon T-iPSC-1.10. Gráficas representativas de al menos 5 diferenciaciones independientes.

Las Figuras 8A-8C muestran la expresión de los marcadores de superficie y receptores en las células T 1928z. (A) Expresión de TCRyS y CD3 por citometría de flujo. (B) La expresión de los receptores y marcadores de superficie específicos de las células NK se evaluó mediante citometría de flujo en las células 1928z-T-iPSC-T antes (preexpansión) y 7 días después (posexpansión) de la estimulación con las células 3T3-CD19 irradiadas. (C) Expresión de CD27 y CD28 en las células 1928z-T-iPSC-T antes y 7 días después de la estimulación con las células 3T3-CD19 irradiadas.

Las Figuras 9A y 9B muestran la comparación de la expresión del gen de ARNm entre las células 1928z-T-CC-T y los subconjuntos linfoides de sangre periférica de control. (A) Gráficos que demuestran la similitud de la expresión génica, calculada como coeficientes de correlación de Pearson, entre las células 1928z-T-iPSCT y los otros subconjuntos linfoides como se muestra. Conjunto de datos 1: muestras recolectadas para este estudio, Conjunto de datos 2: muestras descargadas de la base de datos GEO (Gene Expression Omnibus) del repositorio del NCBI. (B) Expresión de los principales factores de transcripción, moléculas citolíticas y moléculas de superficie, que son características de los linajes T, NK y y5-T en las células NK, células T CD4, CD8 y y5 y células 1928z-T-iPSC-T antes y después de 1 semana de expansión en 3T3-CD19, según lo evaluado mediante qRT-PCR. Los datos se normalizaron a los valores de GAPDH endógena y se muestran como la expresión relativa en comparación con la expresión en las células T y5. Los gráficos representan el promedio de triplicados técnicos intraensayo (barras de error = DE).

La Figura 10 muestra que las células 1928z-T-iPSC-T retrasan significativamente la progresión del tumor positivo a CD19 in vivo. Se inocularon ratones NSG intraperitonealmente con la línea celular de linfoma de Burkitt humano Raji CD19+ que expresa una proteína de fusión de proteína fluorescente verde-luciferasa de luciérnaga (GFP/Luc). Cuatro días más tarde se les inyectó i.p. las células T singénicas 1928z-T-iPSC-T, 1928z-y5 o 1928z-ap. Ningún tratamiento indica los ratones portadores de tumores no inyectados con las células T. La carga tumoral total al día 22 después de la inyección del tumor se midió mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) y se representa el flujo total (fotones/s). Se grafica la mediana ± el intervalo. Las variaciones difirieron entre el grupo 1928z-T-iPSC-T y el grupo sin tratamiento (prueba F, p = 0,0016) pero no difirieron entre el grupo 1928z-T-iPSC-T y 1928z-y5 (prueba F, p = 0,408). La significancia estadística se determinó con el uso de la prueba de Mann-Whitney de dos colas para comparar los intervalos entre los grupos 1928z-T-iPSC-T, sin tratamiento y 1928z-y5. Cada punto representa un ratón receptor. p < 0,05 se consideró significativo.

La Figura 11 muestra la expresión temprana del TCR en la diferenciación linfoide T de diferentes clones de T-iPSC. Análisis por citometría de flujo de las células derivadas de los clones independientes T-iPSC-1.3 y T-iPSC-1.4 al día 25 de la diferenciación (día 15 en cocultivo de OP9-DL1).

La Figura 12 muestra el inmunofenotipo de los linfocitos T derivados a partir de las T-iPSC no manipuladas con CAR. Análisis por citometría de flujo de los linfocitos T derivados a partir del clon T-iPSC-1.10 al día 30 de la diferenciación (día 20 en cocultivo de OP9-DL1). La figura muestra los gráficos representativos de al menos 5 diferenciaciones independientes. Histograma negro: control de isotipos.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia adoptiva. Se divulgan las células T fenotípicamente definidas, funcionales y/o expandibles que poseen al menos una de las siguientes características inmunoterapéuticas: 1) dirigirse a un antígeno predeterminado específico expresado en la superficie celular de una célula diana de una manera independiente del HLA, 2) supervivencia y potencial funcional mejorados y 3) células T disponibles "listas para usar" para la administración a múltiples receptores, eventualmente a través de las barreras inmunogénicas y 4) potencial citotóxico y actividad antitumoral.

En resumen, aunque existen numerosos ejemplos de publicaciones que describen la generación de las células T específicas por el antígeno o células NK a partir de ESC e iPSC humanas, ninguno de estos ejemplos de publicaciones describe la producción y uso de una iPSC o ESC que exprese un CAR (incluida una región de reconocimiento del antígeno (dominio), una cadena CD3z y, opcionalmente, al menos una señal coestimuladora proporcionada en la ^{proteína CAR o como una proteína ligando coestimuladora coexpresada con una proteína}CaR, ^{es decir, para}proporcionar al menos dos proteínas con sitios de unión extracelular, la proteína CAR y la proteína ligando coestimuladora) como una especificidad por el antígeno determinada in vitro que se diferencia más y luego se expande mediante el uso de la estimulación CAR para uso como se describe en este documento. Se divulga la manipulación de la especificidad por el antígeno a través del uso de los vectores que comprenden los CAR transducidos en las T-iPSC o células NK producidas mediante las composiciones y los métodos divulgados en este documento.

También se divulgan los métodos para generar las células T fenotípicamente definidas, funcionales y/o expandibles a partir de las T-iPSC humanas manipuladas a través de modificaciones genéticas seguras, por ejemplo, las iPSC que se modifican para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) (CAR-T-iPSC). Un aspecto de la presente invención proporciona un método para producir una célula madre pluripotente (PSC) que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende, a) proporcionar, i) una célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del TCR (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva a partir de una célula T y ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z y b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca un T-PSC que comprende el CAR (CAR-T-PSC). Las CAR-T-iPSC además se pueden diferenciar y expandir en números de células con el uso de un antígeno de unión al CAR para la estimulación (en lugar de a través de la activación del TCR o activación no específica) de la célula CAR+ para producir las células T derivadas de CAR-T-iPSC (células CAR-T-iPSC-T) que tienen actividad efectora (función) en números contemplados para la terapia celular adoptiva terapéuticamente eficaz, por ejemplo, las células T efectoras derivadas de CAR-T-iPSC. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende, a) proporcionar, i) una célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z, b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca un T-PSC que expresa el CAR (CAR-T-PSC); c) cultivar dicha CAR-T-PSC en condiciones tales que se produzca una célula T derivada de T-PSC que comprende el CAR (célula T derivada de CAR-T-PSC).

También se divulgan los linfocitos T específicos por el antígeno para inmunoterapia, incluidos, pero no se limitan a, los linfocitos T específicos por el antígeno capaces de eliminar a las células tumorales establecidas in vivo. Los linfocitos T específicos por el antígeno pueden reducir el crecimiento de las células cancerosas. En algunos ejemplos, los linfocitos T específicos por el antígeno pueden destruir las células infectadas por virus, incluidas, pero no se limitan a, las células infectadas por el VIH in vivo.

Actualmente, el uso de las células T que expresan un TCR específico por el antígeno endógeno (u otra molécula presentadora de antígeno) en la inmunoterapia adoptiva se basa en el autorreconocimiento dependiente del MHC y el antígeno (es decir, en el contexto del antígeno) para la estimulación. Este requisito de compatibilidad del MHC junto con la unión específica por el antígeno resultada en limitaciones de la función efectora cuando una célula tumoral (cancerosa) escapa a la inmunorregulación cuando la expresión de sus moléculas del MHC que contienen al antígeno está reducida o ausente, es decir, un ejemplo de un mecanismo de escape tumoral. Por lo tanto, el uso de las células CAR+ de las divulgadas en este documento puede superar tal escape tumoral porque el reconocimiento del antígeno basado en CAR no depende del reconocimiento del MHC, simplemente de la capacidad de un antígeno expresado extracelularmente para unirse al CAR.

Además, el uso de las células T y de otras células efectoras que expresan las moléculas del MHC endógenas en la inmunoterapia adoptiva limita dichas células para la inmunoterapia al uso autólogo, es decir, sujeto a las limitaciones de la compatibilidad de los haplotipos del MHC como ocurre con el trasplante de tejido. En determinadas modalidades, las células CAR+ de la presente invención tienen una expresión reducida o indetectable en la superficie celular de las moléculas del MHC. En determinadas modalidades, las células CAR+ de la presente invención tienen una expresión reducida o indetectable en la superficie celular de las moléculas del HLA. En algunas modalidades, las células CAR+ de la presente invención tienen una expresión reducida o indetectable en la superficie celular de las moléculas de clase I del HLA.

Los linfocitos T específicos de antígeno descritos en este documento expresan el CAR y se dirigen específicamente a un antígeno a través de la interacción entre CAR y el antígeno. El CAR descrito en este documento puede proporcionar estimulación específica por el antígeno a los linfocitos T que expresan el CAR, lo que da como resultado la proliferación celular y/o una función efectora. Las células T que expresan el CAR descritas en este documento pueden superar las limitaciones de las células T que tienen un TCR específico por el antígeno endógeno, que tienen una capacidad proliferativa y funcional limitada in vivo incluso si una célula T específica por el antígeno está presente in vivo y luego está presente en las PBMC aisladas. Las células T que expresan el CAR divulgadas en este documento tienen tasas de supervivencia a largo plazo (capacidad proliferativa incrementada) tanto in vitro como in vivo para proporcionar cantidades terapéuticamente relevantes de las células específicas por el antígeno para las terapias con células adoptivas tanto a corto como a largo plazo. Esto es diferente al plazo más corto (menos ciclos de proliferación) cuando se utilizan células efectoras de una fuente maduras (aisladas endógenamente) para los métodos de expansión in vitro. Las células que tienen tasas de supervivencia a plazo más corto resultan en un "agotamiento" del antígeno cuando tienen una proliferación reducida o inexistente in vitro. Se divulgan los métodos para producir cantidades terapéuticamente relevantes (eficaces) de las células T específicas por el antígeno a partir de pequeñas cantidades de las células sanguíneas aisladas de una muestra de las células sanguíneas extraídas de un sujeto. En algunos ejemplos, la cantidad de la muestra de sangre extraída de un paciente es de al menos aproximadamente 0,5 ml, al menos aproximadamente 1 ml, al menos aproximadamente 5 ml o hasta aproximadamente 10 ml de sangre, en contraste con la recolección de múltiples tubos de sangre del sujeto. En algunas modalidades, los métodos para producir las células T CAR+ específicas por el antígeno de la presente invención comprenden producir hasta aproximadamente 108, hasta aproximadamente 109, hasta aproximadamente 1010, hasta aproximadamente 1011, hasta aproximadamente 1012, o más de 1012 células T CAR+ específicas por el antígeno a partir de un sujeto. Se divulga la desdiferenciación (reprogramación) de las células T de sangre periférica a T-PSC (ESC o iPSC) para su uso con las construcciones de vectores manipulados que comprenden un c A r de regiones quiméricas específicas por el antígeno para producir las T-PSC que expresan el CAR. La presente invención proporciona una célula madre pluripotente que comprende un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T. Además, la presente invención proporciona los métodos para producir las células T que expresan el CAR a partir de las PSC que expresan el CAR o modificadas con el CAR (por ejemplo, ESC o iPSC). La presente invención proporciona un método para producir una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende, a) proporcionar, i) una célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z, b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca una T-PSC que comprende el CAR (CAR-T-PSC); c) cultivar dicha CAR-T-PSC en condiciones tales que se produzca una célula T derivada de T-PSC que expresa el CAR (célula T derivada de la CAR-T-PSC). Las células efectoras T derivadas de CAR-PSC-T producidas pueden usarse en tratamientos de inmunoterapia.

En determinados ejemplos divulgados en este documento, se incluye proporcionar modificaciones genéticas a las células T. Las células T genéticamente modificadas (manipuladas) pueden usarse en la terapia clínica, ya que se consideran "seguras" para uso in vivo. La modificación genética incluye la inserción de uno o más genes heterólogos en uno o más sitios genómicos seguros. Como se usa en este documento, un "sitio genómico seguro" se refiere a una ubicación en el genoma humano donde se puede agregar material genético extraño donde la expresión del transgén se mantiene (es decir, no se silencia) y no perturba la expresión de los genes endógenos. Véase Sadelain, Nat Rev Cancer, 2012.

Además, se divulgan los métodos para producir las PSC (por ejemplo, las ESC, las iPSC, las T-iPSC) que pueden usarse para producir las células T vírgenes, por ejemplo, las células T fenotípicamente definidas, funcionales y/o expandibles que poseen al menos uno de las siguientes características inmunoterapéuticas: 1) dirigirse a un antígeno predeterminado específico expresado en la superficie celular de una célula diana de una manera independiente del HLA, 2) supervivencia y potencial funcional mejorados y 3) células T disponibles "listas para usar" para su administración a múltiples receptores, eventualmente a través de las barreras inmunogénicas y 4) potencial citotóxico y actividad antitumoral.

Diferenciación de linfocitos T que tienen especificidad por el antígeno a partir de los reordenamientos endógenos del gen del TCR.

Las células T obtienen la especificidad por el antígeno a través de los reordenamientos funcionales de las regiones de reconocimiento del antígeno en sus receptores de las células T (TCR). El receptor de las células T o TCR es una molécula que se encuentra en la superficie de los linfocitos T (o células T) que es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El TCR puede estar compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes (por ejemplo, un heterodímero). En la mayoría (por ejemplo, 95 %) de las células T, esta consta de una cadena alfa (a) y beta (P), mientras que en algunas (por ejemplo, 5 %) de las células T, se compone de las cadenas gamma (y) y delta (y/5). Tales células T que tienen especificidad por el antígeno en las moléculas de TCR de la superficie celular se diferencian in vivo en diferentes subconjuntos fenotípicos, que incluyen, pero no se limitan a, CD3+ TCR alfa-beta CD4+, CD3+ TCR alfa-beta CD8+, células T gamma-delta, células T asesinas naturales clásicas, etc. Además, las poblaciones de las células T tienen numerosos tipos de estados de activación, que incluyen, pero no se limitan a, virgen, memoria central, memoria efectora, efector terminal, etc., cada uno con distintas propiedades funcionales y capacidades proliferativas en respuesta a las interacciones específicas con el antígeno, es decir, estimulación. Las células T tienen interacciones (reacciones) específicas con el antígeno que pueden desencadenarse cuando una región de reconocimiento del antígeno específico en el TCR (incluida la región variable de cada cadena que gobierna la especificidad por el antígeno) interactúa con una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) capaz de desencadenar la activación del TCR con o sin el reconocimiento del TCR con las regiones en las moléculas del MHC. La interacción entre el TCR y una molécula del MHC debe ser la correcta para determinados tipos de activación funcional. El tipo de activación desencadenada por el TCR está controlado por muchos factores, que incluyen, pero no se limitan a, la fuerza del antígeno a la región de unión/reconocimiento del antígeno, por ejemplo, la unión del TCR a un péptido antigénico dentro del contexto de una molécula de MHC, la ubicación o fuerza de unión del péptido antigénico dentro de la molécula del MHC, el grado, si lo hay, de compatibilidad del HLA o MHC con el TCR en el contexto del péptido antigénico, unión de la molécula coestimuladora (por ejemplo, CD28), el fenotipo de la célula T cuando se activa y las citocinas presentes en el medio ambiente. Algunos de estos factores de activación pueden ser controlados al menos en parte por una célula diana, por ejemplo, un tumor o una célula cancerosa, que a menudo limita las actividades citotóxicas de las células T (por ejemplo, al dañar o matar a la célula diana). En un ejemplo no limitante, la activación de las células T por una célula diana puede resultar alternativamente en la actividad supresora de las células T, donde la célula T se activa, pero esta activación puede no resultar en dañar o matar a la célula diana. De hecho, en determinadas condiciones de estimulación, la unión y la señalización del TCR puede desencadenar el suicidio de la célula T activada (por ejemplo, la muerte celular). Por lo tanto, existe un delicado equilibrio entre el reconocimiento del antígeno por las células T, la señalización del TCR y la acción de la molécula coestimuladora, junto con las contribuciones de los cofactores para producir las células T efectoras funcionales específicas por el antígeno. Además, las consideraciones similares relacionadas con la producción de las células T de memoria efectoras específicas por el antígeno para el control a largo plazo de las células tumorales o virus.

Cuando el TCR se acopla con un péptido antigénico y una molécula del MHC, el linfocito T puede activarse a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados. Además, la activación de una célula T puede inducir la proliferación celular, por ejemplo, mitosis celular para producir células hijas (por ejemplo, clones). Dependiendo de la etapa de diferenciación de una célula T y los tipos de factores de activación presentes, la activación puede resultar en cualquiera de los subconjuntos fenotípicos mencionados anteriormente.

De forma similar al trasplante, la inmunoterapia adoptiva (por ejemplo, la terapia de las células T adoptivas) a menudo está restringida por la compatibilidad del HLA/MHC. Por lo tanto, a menudo existe un requisito para las células T compatibles con el HLA/MHC en la inmunoterapia adoptiva. Pueden usarse las células T tanto autólogas como no autólogas (por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas) en la terapia de las células T adoptivas (por ejemplo, los métodos para tratar a los cánceres) descrita en este documento. En determinados ejemplos, al menos un gen del antígeno leucocitario humano (HLA) está silenciado, desactivado o ausente en las células T que expresan el CAR descritas en este documento.

Los métodos conocidos para generar las células T autólogas funcionales específicas por el antígeno incluyen la activación de los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos por el antígeno (incluido un antígeno tumoral y un antígeno de un patógeno) aislados de un sujeto ex vivo para aumentar el número de las células y proporcionar las células T asesinas funcionalmente activas para estimular esa función inmunológica del sujeto. Estos Ct L activados específicos por el antígeno pueden caracterizarse fenotípicamente como células CD3+ CD4- CD8+ (CD8 positivo simple: CD8SP) (Sensi y Anichini, 2006). Aunque los CTL activados pueden matar o dañar a las células tumorales in vitro, a menudo no son lo suficientemente sustanciales para detener el crecimiento de las células tumorales o detener el desarrollo del tumor en el sujeto. Un factor limitante importante en este tipo de enfoque es la corta vida útil de los CTL activados, que con frecuencia se inactivan con bastante rapidez por la muerte celular inducida por el antígeno (Mescher y otros, 2007; Willimsky y Blankenstein, 2005). Por ejemplo, las células T CD8+ aisladas al menos del subconjunto virgen reactivas a un antígeno específico son de uso limitado en la inmunoterapia adoptiva ya que tienen una expansión in vitro y persistencia in vivo limitadas. Además, el uso de estas CTL activadas ex vivo en la terapia celular está limitado principalmente debido a la dificultad de encontrar una célula T CD8+ que pueda dirigirse específicamente a un antígeno específico. Las células T específicas por el antígeno pueden obtenerse mediante el aislamiento a partir de un sujeto y la estimulación no específica con CD3 y CD28 u otros factores estimulantes. Estas células T activadas pueden dividirse en presencia del antígeno para producir las células T específicas por el antígeno generadas endógenamente. Sin embargo, estas células T específicas por el antígeno no siempre continúan expandiéndose en cantidades suficientes cuando se estimulan más, por ejemplo, no siempre se dividen en cultivo celular para producir más células T específicas por el antígeno para su uso en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, las células T específicas por el antígeno pueden exponerse a los factores que impiden la expansión in vitro y/o in vivo debido al efecto prolongado de los factores de las células tumorales presentes cuando las células T se exponen a al menos uno de los antígenos tumorales. Alternativamente, estas células T pueden diferenciarse terminalmente de manera que no puedan experimentar una proliferación adicional. Además, los números endógenos de las células T específicas por el antígeno puede ser limitado. Otras limitaciones incluyen, pero no se limitan a, la capacidad del antígeno diana (por ejemplo, un antígeno tumoral) para seguir evadiendo o escapando de la citotoxicidad de las células T funcionales inyectadas a partir de la expansión y activación in vitro incluso cuando están presentes en mayor número en el sujeto.

El aislamiento de los linfocitos T de sangre periférica (PBL) a través de la leucoféresis puede proporcionar una fuente de los linfocitos T (células) para su uso en la producción de las células T específicas por el antígeno que son adecuadas para la terapia adoptiva de las células T. Sin embargo, en muchos casos, por ejemplo, en el caso de los sujetos inmunodeficientes, el aislamiento y la expansión de las células T autólogas es problemático o imposible. Además, en casos de los subtipos raros del HLA/MHC, es difícil obtener donantes autólogos compatibles con e1HLA/MHC.

Las células T específicas por el antígeno generadas a partir de las T-iPSC que expresan el CAR pueden eludir los mecanismos de tolerancia (escape) utilizados por los antígenos tumorales. Las células T CAR+ diferenciadas de la presente invención pueden dirigirse específicamente a un antígeno específico, incluyendo, pero no se limitan a, un antígeno tumoral y un antígeno de un patógeno. Además, la especificidad por el antígeno de las células T de la presente invención no está restringida al HLA o es independiente del HLA. Los CAR utilizados para producir las células T de la presente invención no requieren el reconocimiento del antígeno unido al MHC/HLA, por ejemplo, el CAR no requiere que el antígeno sea presentado por una molécula específica del MHC/HLA para activar o estimular a las células T debido a la estimulación o la activación específica por el antígeno es a través del CAR. Las células T CAR+ experimentan diferenciación y compromiso con un linaje de las células T y no se requiere ni es necesaria la estimulación del antígeno antes de al menos aproximadamente 20 días o al menos aproximadamente 30 días después de la diferenciación linfoide T. Por lo tanto, las células T CAR+ pueden usarse en la inmunoterapia adoptiva, incluido el tratamiento de los cánceres y el tratamiento de las infecciones virales, etc.

II. Las PSC que expresan el CAR y los métodos para producir las mismas

Se divulgan las composiciones y los métodos para producir (proporcionar) las células T precursoras, por ejemplo, las células T desdiferenciadas (reprogramadas) para producir las T-PSC (por ejemplo, ESC o iPSC) que pueden ser modificadas por un CAR y las composiciones y los métodos para proporcionar un sistema de diferenciación que incluye la diferenciación, la expansión y el compromiso de las células T a partir de las T-PSC y las CAR-T-PSC desdiferenciadas (por ejemplo, ESC o iPSC). Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, los sistemas de cultivo celular y los vectores de expresión. Los sistemas de cultivo celular divulgados en este documento incluyen, pero no se limitan a, un sistema de cultivo celular para reprogramar el estado de diferenciación de una célula (por ejemplo, dirigir una célula somática comprometida para que exprese marcadores de las células pluripotentes), sistema de cultivo celular para la inducción del mesodermo (por ejemplo, iniciar la formación del cuerpo embrioide para la inducción del mesodermo), sistemas de cultivo celular para la especificación y expansión hematopoyética y sistemas de cultivo celular para la diferenciación de linfoides T (inducir el compromiso con un linaje de las células T, incluida la inducción de la función efectora en una célula T rediferenciada). Las composiciones descritas en este documento incluyen un vector de expresión (por ejemplo, un vector CAR) para transducir las T-PSC con un CAR.

Las células madre embrionarias humanas (ESC) y las células madre pluripotentes humanas inducidas (iPSC) pueden producirse mediante varios métodos conocidos en la técnica. Las PSC (ESC o iPSC) se pueden utilizar para producir o generar las T-PSC que pueden ser modificadas por un CAR mediante, por ejemplo, la transducción de las T-PSC con un CAR.

Las PSC incluyen las ESC y las iPSC. Las iPSC se pueden generar directamente a partir de las células adultas (por ejemplo, las células somáticas). Las PSC se pueden utilizar ampliamente en la medicina regenerativa. Dado que las PSC pueden propagarse indefinidamente, así como dar lugar a todos los demás tipos de las células del cuerpo (tales como las neuronas, las células cardíacas, pancreáticas y hepáticas), representan una fuente única de las células que podrían usarse para reemplazar las que se pierden debido al daño o enfermedad. Las iPSC se pueden derivar o generar mediante la introducción de un conjunto específico de genes asociados a la pluripotencia o "factores de reprogramación", en un tipo de célula dado. Los factores de reprogramación incluyen, pero no se limitan a, OCT4 (también conocido como "POU5FL"), SOX2, cMYC y KLF4, que también se conocen como los factores de Yamanaka. Véase Takahashi, K; Yamanaka, S (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors ". Cell 126 (4): 663-76. Cada uno de los factores de reprogramación pueden ser reemplazado funcionalmente por los factores de transcripción relacionados, los miARN, moléculas pequeñas o incluso genes no relacionados, tales como los especificadores de linaje. Tras la introducción de los factores de reprogramación, las células comienzan a formar colonias que se asemejan a las PSC, que pueden aislarse en función de su morfología, las condiciones que seleccionan para su crecimiento o mediante la expresión de los marcadores de superficie o genes indicadores. En determinadas modalidades, las PSC utilizadas en los métodos de la presente invención son específicas del sujeto.

Existen tecnologías conocidas para producir las PSC a partir de varios tipos de las células somáticas mediante la reprogramación con el uso de los factores de Yamanaka (OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC). Por ejemplo, la reprogramación de los linfocitos maduros en las iPSC se logró para las células B murinas (Hanna y otros, 2008; Wada y otros, 2011), para las células T murinas y las células T NK maduras (Watarai y otros, 2010a) y para las células T humanas (Loh y otros, 2010; Seki y otros, 2010). Las iPSC se pueden producir a partir de las células T humanas mediante el uso de las células mononucleares periféricas completas (PBMC) o células CD3+ como una fuente de población celular (Loh y otros, 2010; Seki y otros, 2010, Staerk y otros, 2010, Brown y otros, 2010). La población celular T inicial de la tecnología conocida a menudo incluye alrededor de un millón de las células. Por el contrario, las T-PSC de la presente invención (antes de la expansión del número de las células) se pueden obtener a partir de aproximadamente 0,5 millones de PBMC o menos, que pueden ser de menos de aproximadamente 1 ml de sangre completa extraída de un sujeto.

Las T-PSC que expresan el CAR de la presente invención pueden generarse al transducir los linfocitos de sangre periférica recogidos de un sujeto con al menos un vector retroviral. En algunas modalidades, el vector retrovírico es escindible. El vector retrovírico puede codificar al menos uno de los factores de reprogramación como se describió anteriormente, por ejemplo, los seleccionados del grupo que consiste en OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC. El vector retroviral puede codificar un marcador fluorescente. Dicho marcador fluorescente puede seleccionarse del grupo que consiste en la proteína fluorescente verde, la proteína fluorescente azul, la proteína fluorescente cian, la proteína fluorescente amarilla y una combinación de las mismas. La proteína azul fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste en EBFP, EBFP2, Azurite y mKalama1. Dicha proteína cian fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste en ECFP, Cerulean y CyPet. Dicha proteína fluorescente amarilla se puede seleccionar del grupo que consiste en YFP, Citrine, Venus e YPet. En una modalidad, dicho marcador fluorescente es una proteína verde fluorescente. En otra modalidad, el marcador fluorescente es Citrine.

El uso de las T-PSC que expresan el CAR para producir las células T puede evitar la restricción de1HLA. De acuerdo con la presente invención, las T-PSC que expresan el CAR pueden manipularse para usos clínicos específicos. En algunas modalidades, las T-PSC que expresan el CAR pueden manipularse para regular a la baja o anular la expresión del HLA y regular a la baja o anular la expresión del gen Rag, con el fin de generar las células T que expresan el CAR que se pueden usar en múltiples huéspedes sin rechazo o síntomas de la enfermedad del injerto contra el huésped o para su uso como fármacos inmunosupresores (por ejemplo, para la inmunoterapia de las células alogénicas). En algunas modalidades, las T-PSC que expresan el CAR pueden manipularse para que no expresen el transactivador CIITA, que es necesario para la transcripción de los genes de clase II de1HLA (por ejemplo, CIITA puede desactivarse). En algunas modalidades, las T-PSC que expresan el CAR pueden manipularse para que no expresen la microglobulina beta 2, que es necesaria para la expresión en la superficie de las moléculas de clase I de1HLA (por ejemplo, la microglobulina beta 2 puede desactivarse). Las T-PSC manipuladas que expresan el CAR pueden usarse para generar las células T adecuadas para muchos sujetos independientemente de sus haplotipos de1HLA y pueden usarse para dirigirse a las células tumorales que tienen la expresión del HLA regulada a la baja. Además, las PSC que expresan el CAR se pueden manipular para expresar las moléculas de la superficie celular para efectuar el tipo de activación, por ejemplo, mediante la transducción de las células para expresar los ligandos supresores o tolerogénicos con el uso de los métodos conocidos.

III. Células T derivadas de las PSC que expresan el CAR

El uso de las células T derivadas de las ESC y/o las iPSC mediante tecnologías conocidas es limitado. La caracterización funcional de las células T derivadas de las ESC y las iPSC se complica al no conocer su especificidad por el antígeno (es decir, especificidad por el antígeno del TCR) y/o restricción a1HLA. Por ejemplo, las células T generadas in vitro a partir de las ESC o de las iPSC tienen un repertorio impredecible del TCR porque los reordenamientos del gen del TCR son aleatorios y las células se seleccionan positivamente mediante mecanismos poco claros durante su diferenciación in vitro (Timmermans, 2009). Por ejemplo, es difícil encontrar una célula T CD8+ que se dirija específicamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno tumoral o un antígeno de un patógeno) en la superficie celular. Una o más de las limitaciones se pueden eludir mediante el uso de las iPSC que lleven un TCR endógeno reordenado de especificidad antigénica conocida (Vizcardo, 2013; y Nishimura, 2013). Sin embargo, este enfoque requiere clonación laboriosa de las células T específicas por el antígeno y se limita a los antígenos para los que se pueden detectar las células T específicas de paciente.

Además, el procedimiento para aislar un clon de las células T suele tardar entre 4 y 6 meses. Además, aunque se han realizado numerosos intentos para expandir las células T específicas por el antígeno ex vivo con el fin de aumentar los niveles de las células T sensibles al antígeno que son suficientes para inducir una respuesta a un virus o célula cancerosa, las células T específicas por el antígeno expandidas no han resultado ser eficaces principalmente debido a la rápida pérdida de función y al bajo número de las células (June, C.H.J. Clin. Invest. 117, 1466-1476 (2007)). Por ejemplo, Brown informó sobre el tratamiento de los pacientes con melanoma avanzado con la inmunoterapia adoptiva de las células T CD8+, la erradicación de los tumores correlacionada con una mayor presencia de las células T CD8+ similares a las células madre (Brown, M.E. y otros. PLoS ONE 5, e11373; publicado en línea el 29 de junio del 2010). Otras limitaciones del uso de las células T derivadas de las ESC o de las iPSC incluyen 1) no poder encontrar clones de las células T endógenos para cada antígeno deseado, 2) incluso cuando se obtiene un clon de las células T para un antígeno específico, lleva meses expandir y establecer la línea celular para uso en la caracterización y/o terapia, 3) el reconocimiento del antígeno todavía está sujeto a restricción al HLA o todavía depende de1HLA. Por lo tanto, estas células T derivadas de las ESC o de las iPSC solo reconocen al antígeno en los sistemas autólogos o compatibles con el MHC/HLA y estas células T derivadas de las ESC o de las iPSC no superan el escape tumoral de la regulación a la baja del MHC/HLA. Además, como los TCR reconocen los antígenos presentados por las moléculas específicas del HLA, el uso clínico de las células T que reconocen el antígeno a través de un TCR endógeno está limitado por la necesidad de hacer compatibilizar su especificidad con el HLA del receptor.

Además, aunque se han realizado numerosos intentos para producir las células T derivadas de las iPSC con especificidad endógena por el antígeno para su uso en la inmunoterapia adoptiva, estas células no pueden diferenciarse en células T efectoras comprometidas (Brown, y otros PLoS ONE 5, e11373 2010; Loh, Cell Stem Cell 7, 15-19 (2010); Seki, Cell Stem Cell 7, 11-14 (2010) y Staerk, y otros Cell Stem Cell 7, 20-24 (2010)). Nishimura (2013) y Vizcardo (2013) informan del uso de las células T CD8+ específicas por el antígeno maduras aisladas de pacientes que luego se reprograman en las iPSC. Como se informa en Nishimura (2013) y Vizcardo (2013), estas células T derivadas de las iPSC específicas por el antígeno se rediferenciaron en células T proliferativas "rejuvenecidas". Nishimura (2013) utilizó las células T CD8+ maduras específicas por el p27 (nef) de VIH obtenidas de un paciente infectado con el VIH-1 para producir las iPSC. Vizcardo (2013) utilizó una línea de las células T derivadas de un paciente con melanoma que expresa el epítopo melan-A del melanoma (MLANA; MARTI) para producir las iPSC. A continuación, estas iPSC se diferenciaron en células T CD8+ maduras mediante la exposición a citocinas junto con el cocultivo con las células alimentadoras de ratón. Debido a que estas células fueron expuestas a las células alimentadoras murinas antes de su uso en los ratones, estas células pueden no ser aceptables para su uso en terapia clínica humana. Se demostró que la especificidad por el antígeno codificada en el a Dn genómico de las células T maduras parentales se conservaba en las iPSC reprogramadas y luego en las células CD8+ maduras diferenciadas.

Además, el uso de los sistemas conocidos se basa en encontrar y cultivar los clones de las células T específicos por el antígeno a partir de un sujeto para cada antígeno deseado. Esto requiere esfuerzos meticulosos de cultivo durante largos períodos de tiempo. Este proceso puede incluir múltiples extracciones de sangre de un sujeto, especialmente cuando la especificidad por el antígeno se encuentra en una población de las células T poco común. El éxito de este tipo de método depende de la presencia de las células T específicas por el antígeno y del número de estas células T específicas por el antígeno que circulan en la sangre del sujeto. Se divulgan las células T que se derivan de las T-PSC (ESC o iPSC) modificadas por un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, las T-PSC que expresan el CAR. Estas células T se dirigen específicamente a un antígeno y la especificidad por el antígeno de estas células T es independiente del HLA. Una ventaja de los métodos de la presente invención para producir las células T que expresan el CAR mediante el uso de las T-PSC que expresan el CAR es que no son necesarios los clones de las células T específicos por el antígeno en la población celular de partida porque la especificidad por el antígeno se logra mediante la interacción del antígeno y del dominio de unión al antígeno del CAR. En algunas modalidades, las células T que expresan el CAR se producen a partir de una extracción de sangre, no de múltiples extracciones de sangre de un sujeto. Por lo tanto, son necesarias o requeridas pocas células T de sangre periférica en la población celular de partida. De acuerdo con la presente invención, la población celular de partida puede tener números de las células que varían de aproximadamente 2 x 105 a aproximadamente 5 x 105 células T de sangre periférica de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml de sangre periférica de un sujeto.

Además, una ventaja de los métodos de la presente invención para producir las células T que expresan el CAR mediante el uso de las T-PSC que expresan el CAR (ESC o iPSC) es la expansión de las células T efectoras específicas por el antígeno. A diferencia de los métodos conocidos para producir las células T a partir de las ESC o de las iPSC, donde no hay expansión de las células T efectoras específicas por el antígeno (por ejemplo, con el uso de las T-PSC no específicas por el antígeno o cocultivo de las T-PSC con las aloPBMC para estimular la división celular para expandir las poblaciones de las células T), las señales específicas por el antígeno inducidas por el CAR pueden estimular la división celular que resulta en una expansión significativa de las células T efectoras.

Los métodos de la presente invención incluyen manipular o modificar las T-PSC con un CAR, que incluye una región de unión o reconocimiento del antígeno que se une a un antígeno específico. Por lo tanto, otra ventaja de los métodos de la presente invención es que el direccionamiento de las células T no depende del repertorio de las células T endógenas del sujeto o de la frecuencia de las células T específicas por el antígeno.

Se informó de un obstáculo del reordenamiento adicional de la cadena TCRa debido a la expresión del gen Rag durante la diferenciación. Este tipo de evento conduce normalmente a una especificidad alterada de una región de reconocimiento del antígeno del TCR. El reconocimiento alterado del antígeno durante la proliferación celular puede superarse en los métodos de la presente invención que incluyen el uso de las T-PSC que expresan el CAR mediante, por ejemplo, la expresión constante (estable) del CAR.

En algunos ejemplos, el uso de las células sanguíneas de un sujeto (por ejemplo, los linfocitos de sangre periférica) como fuente para reprogramar la célula T específica por el antígeno (por ejemplo, las células T efectoras) cumple con las mismas reglas de compatibilidad del HLA que existen para la BMT. El reconocimiento/especificidad por el antígeno de las células T que expresan el CAR no depende de la presentación en el HLA. Cuando se usan las células de un solo clon con el mismo TCR, luego el antígeno normalmente debe ser presentado por un determinado tipo de HLA compatible para ser reconocido por la célula T, es decir, estimulación. En esta situación, las células tumorales que frecuentemente regulan a la baja su expresión del HLA luego escapan al reconocimiento de las células T. Sin embargo, dado que la estimulación basada en el CAR no se basa en la presentación en e1HLA, los métodos de la presente invención pueden superar la regulación a la baja del HLA por las células tumorales.

Además, la caracterización fenotípica y funcional de las células T producidas por las tecnologías conocidas es limitada. Esta limitación se puede superar mediante el uso de las T-PSC que expresan el CAR de la presente invención, ya que las T-PSC que expresan el CAR se pueden expandir en cantidades sustanciales utilizadas para la caracterización funcional in vitro e in vivo, fenotipado y para uso futuro en la clínica.

Existen tecnologías conocidas para generar los linfocitos T a partir de las ESC y/o las iPSC humanas: Galic, y otros, Stem Cells, 2009; Timmermans, y otros, Journal of Immunology, 2009; Kennedy, y otros, Cell Reports, 2012, Nishimura y otros Cell Stem Cell 2013, Vizcardo y otros, Cell Stem Cell 2013 y Wakao y otros, Cell Stem Cell 2013. Sin embargo, como no se conoce la especificidad por el antígeno de estas células T, su utilidad terapéutica no se conoce o está limitada. Además, ninguna de las tecnologías conocidas utiliza las ESC o las iPSC que expresan el CAR. Dado que el rendimiento de las células T maduras en las tecnologías conocidas es a menudo extremadamente bajo, el potencial para una investigación funcional adicional es limitado y la posibilidad de aplicación terapéutica in vivo en los modelos animales o para uso en la generación de las células para la inmunoterapia humana es extremadamente baja.

Galic y otros, Stem Cells. 27(1): 100-107 (2009) describe el uso de las células madre embrionarias humanas (hESC) como fuente a través de la formación de cuerpos embrioides (EB) para producir las células progenitoras de las células T. Galic y otros informaron sobre la diferenciación de las células T a partir de las ESC humanas a través de los progenitores de las células T derivados de los EB que dieron lugar a las células fenotípica y funcionalmente normales del linaje T cuando se transfirieron al tejido tímico humano implantado en ratones inmunodeprimidos. Además, Galic y otros mostró que después de la introducción mediada por lentivirales de un vector que expresa proteína fluorescente verde mejorada en hESC, la expresión transgénica estable se mantuvo durante toda la diferenciación. Sin embargo, a diferencia de los sistemas de cultivo celular de la presente invención, Galic y otros, añadieron BMP-4 al medio de cultivo celular al día 4 en lugar de al comienzo de la diferenciación. Además, la diferenciación de las células T en Galic y otros utilizó un portador murino que hace que las células T producidas sean incompatibles para la aplicación clínica.

Timmermans y otros (2009). Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology, 182, 6879 - 6888 informó de las células T derivadas de hESC que proliferaron en respuesta a la estimulación con PHA, lo que sugiere que las hESC pueden dar lugar a células T funcionales. Sin embargo, Timmermans, y otros usó un cultivo alimentador de OP9 para inducir la diferenciación hematopoyética en lugar del cóctel de citocinas definido usado en la presente invención.

Nishimura (2013), Vizcardo (2013) y Wakao (2013) informaron la generación de las células T a partir de las T-iPSC que llevan TCR específicos. Sin embargo, la caracterización funcional de esas células T es limitada. Nishimura (2013) y Vizcardo (2013) simplemente mostraron la funcionalidad in vitro como la producción de IFN-y y la actividad citotóxica contra las líneas de células B transformadas con EBV pulsadas con péptidos. Las células T generadas en Wakao (2013) mostraron una función in vivo, sin embargo, se dirigieron a la infección por la micobacteria de una manera no específica por el antígeno. Por el contrario, las células T que expresan el CAR de la presente invención poseen no solo la actividad de secreción de citocinas (por ejemplo, secreción de citocinas de tipo 1, incluidas IL-2, TNF-a e IFN-Y), sino también actividad citotóxica in vitro e in vivo contra las células tumorales en ratón y en humanos.

Sin embargo, quedan cuestiones importantes por resolver antes de que las células T generadas a partir de las ESC y las iPSC de las tecnologías conocidas puedan aplicarse a la medicina regenerativa humana. Además, las células T generadas a partir de ESC muestran un patrón de TCR policlonal a medida que tienen lugar reordenamientos aleatorios de TCR durante la diferenciación. Por lo tanto, sin conocer la especificidad del TCR, ensayar la capacidad citotóxica mediada por la especificidad por el antígeno de las células T generadas se convierte en una ocurrencia aleatoria si el antígeno compatible está presente en el ensayo. Se vuelve inútil cuando no está presente una célula específica por el antígeno deseada. El reconocimiento por el antígeno es un componente importante de la evaluación funcional de las células T. Además, no puede tener lugar una selección positiva eficaz en un sistema de diferenciación in vitro de este tipo debido a la falta de presentación de los antígenos peptídicos compatibles en e1HLA.

De acuerdo con la presente invención, las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR pueden ser cualquier tipo de células T, incluidas, pero que no se limitan a, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria (incluidas las células T de memoria central, las células T de memoria similares a las células madre (o las células T de memoria similares a las células madre) y dos tipos de células T de memoria efectoras: por ejemplo, células T^emy células T^emra), células T reguladoras (también conocidas como las células T supresoras), células T asesinas naturales, ^{células T invariantes asociadas a la mucosa y células T}y5. ^{En algunas modalidades, las CAR-T-PSC expresan Foxp3}para lograr y mantener un fenotipo T regulador. Las células T reguladoras que expresan Foxp3 prometen reemplazar y/o complementar la inmunosupresión indiscriminada por las CAR-T-PSC.

IV. Células asesinas naturales (NK) derivadas de las PSC que expresan el CAR.

Las células asesinas naturales (NK) derivadas de las células madre embrionarias (ESC) y las células asesinas naturales (NK) derivadas de las iPSC son otra fuente de linfocitos antitumorales para su uso como células CAR+ inmunoterapéuticas. En algunos ejemplos, las células NK derivadas de ESC o derivadas de iPSC se utilizan como fuente para inducir con un CAR

Las células NK pueden derivarse a partir de las ESC y/o las iPSC, como se describe en Woll, y otros, Journal of Immunology 175: 5095-103 (2005); Ni, y otros, Journal of Virology 85:43-50 (2011) y Knorr, y otros, Translational Research 156:147-154 (2010). Las células NK derivadas de las hESC y de las iPSC pueden tener la capacidad de destruir diversas células tumorales tanto in vitro como in vivo (véanse Woll (2005); Ni (2011); Woll, y otros, Blood 113:6094-6101 (2009)). Las células NK derivadas de ESC pueden mediar la eliminación completa del tumor en los ratones injertados con las células de leucemia humana (véase Woll (2009).

1. Producción de las células NK a partir de las líneas ESC y iPSC.

Las ESC (por ejemplo, la línea H9) se pueden mantener en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) a baja densidad (90000 células/pocillo de una placa de 6 pocillos). La generación de las células progenitoras hematopoyéticas a partir de las ESC puede lograrse mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, el método descrito en Ng, y otros (2008). A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal productfree medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols 3:768-776. Como se describe en Ng (2008), los EB centrifugados susceptibles de generar agregación se pueden generar para las líneas ESC y iPSC mediante el paso en TrypLE Select (Invitrogen) en fibroblastos embrionarios de ratón a baja densidad (MEF, 90000 células/pocillo). Las ESC adaptados a TrypLE con una confluencia de alrededor del 60 70 % se pueden disociar y filtrar a través de un filtro estéril de 70 micrones. Las células se pueden contar y colocar a una concentración de 3000 células por pocillo (volumen de 100 |_il) de una placa de 96 pocillos de fondo redondo en medio BPEL que contiene factor de célula madre (SCF, 40 ng/ml), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 20 ng/ml) y la proteína 4 morfogénica ósea (BMP4, 20 ng/ml). Los pocillos exteriores de la placa se pueden llenar con agua estéril para evitar cualquier evaporación del medio. Las placas se pueden agregar por centrifugación a 1500 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente y colocarse sin tocar en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.

2. Diferenciación de las células NK a partir de las EB centrifugadas.

Como se describe en Woll, y otros (2009). Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood 113: 6094-6101, al día 11 de la diferenciación, 6 pocillos de una placa de 96 pocillos se pueden transferir directamente a un pocillo de una placa de 24 pocillos en citocinas iniciadoras de las células NK (IL-3, IL-7, IL-15, factor de célula madre (SCF), ligando del receptor 3 de tirosina cinasa similar a fms (FLT3L). Los cultivos de las células NK se pueden renovar con 0,5 ml de medio que contiene citocinas cada 4-5 días. Las células NK maduras se pueden medir a los 28-35 días de cultivo. Después de 4 semanas de cultivo de las células NK, las células se pueden expandir adicionalmente con el uso de las células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) (véase Denman, y otros (2012). Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of ^{human natural killer cells. PLoS}OnE ^7:e30264).

V. Sistemas de cultivo celular

Existen sistemas de cultivo celular conocidos para la diferenciación de las células T. Véase, por ejemplo, Salvagiotto, y otros, describe un Defined, Feeder-Free, Serum-Free System to Generate In Vitro Hematopoietic Progenitors and Differentiated Blood Cells from hESCs and hiPSCs. PLoS One 2011. y Brown y otros Derivation of induced pluripotent stem cells from human peripheral blood T lymphocytes. PLoS One 5: e11373 (2010).

Los sistemas de cultivo celular para generar las células T que expresan el CAR usados en este documento pueden estar libres de suero, libres de alimentadores y/o incluir células alimentadores que son compatibles para el cocultivo de las células para la terapia clínica humana. En determinados ejemplos, el sistema de cultivo celular para generar los precursores hematopoyéticos a partir de las células humanas está libres de suero y de alimentadores. Este sistema libre de suero y de alimentadores se basa en la formación de los cuerpos embrioides (EB) en los cultivos de las poblaciones celulares de partida. Las poblaciones celulares de partida incluyen las células madre pluripotentes humanas, por ejemplo, las ESC humanas y las iPSC humanas. El sistema de cultivo celular divulgado en este documento puede superar las limitaciones de los sistemas de cultivo celular conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, escasez de las células del donante, contaminación viral de las células, tal como cuando un paciente tiene las células infectadas in vivo.

En determinados ejemplos, el sistema de cultivo celular de la presente invención usa la formación de cuerpos eritroides (EB) en condiciones definidas libres suero y/o libres de alimentadores para generar los precursores hematopoyéticos a partir de las T-PSC (por ejemplo, las T-PSC que expresan el CAR). Dicho sistema de cultivo celular puede resultar al menos aproximadamente un 70 % o al menos aproximadamente un 80 % de células CD3+TCR+ en aproximadamente 30 días de diferenciación. Por ejemplo, en algunos ejemplos, tan temprano como al día 25 de diferenciación, se pueden detectar células CD3+TCR+. Aproximadamente al día 30 de diferenciación, aproximadamente el 80 % de las células CD3+TCR+ expresan todas un CAR. Por lo tanto, las T-PSC que expresan el CAR se pueden generar en aproximadamente 20 días a aproximadamente 30 días, que es mucho más corto que el período de tiempo (varios meses o más) requerido para establecer un clon de las células T reactivo a un antígeno específico, si se encuentra uno, por las tecnologías conocidas. Las T-PSC se pueden expandir durante aproximadamente 10 días, aproximadamente 20 días o hasta aproximadamente un mes. Las T-PSC expandidas se pueden cultivar durante aproximadamente 10 días, aproximadamente 20 días o hasta aproximadamente un mes. Posteriormente, durante aproximadamente 10 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 30 días o hasta aproximadamente 35 días, estas T-PSC (por ejemplo, las T-PSC que expresan el CAR) se pueden diferenciar en células T funcionales (por ejemplo, las células T efectoras derivadas de T-iPSC que expresan el CAR). Por lo tanto, las células T funcionales que expresan el CAR (por ejemplo, células T efectoras derivadas de PSC que expresan el CAR) pueden producirse en aproximadamente 4 meses o aproximadamente 5 meses o hasta 6 meses después de la extracción de una muestra de sangre de un sujeto.

La diferenciación de las células T puede incluir cuatro etapas: 1) inducción del mesodermo (aproximadamente a los días 1-4), 2) especificación hematopoyética (aproximadamente a los días 4-8) y 3) compromiso y expansión hematopoyética (aproximadamente a los días 8-10) y 4) diferenciación linfoide T. El sistema de cultivo celular divulgado en este documento usa las PSC indiferenciadas que expresan el CAR (iPSC o ESC) como población celular de partida para la diferenciación del mesodermo. Estas iPSC que expresan el CAR se diferencian adicionalmente en células del mesodermo. Las células del mesodermo se diferencian además en células hematopoyéticas que se expanden en números celulares seguido de la inducción de estas células derivadas de T-PSC que expresan el CAR en células T derivadas de T-PSC que expresan el CAR comprometidas para producir las células T efectoras capaces de sobrevivir a largo plazo en cultivo. Los sistemas de cultivo celular divulgados en este documento incluyen, pero no se limitan a, un primer medio de cultivo celular para la inducción del mesodermo, un segundo medio de cultivo celular para la especificación y expansión hematopoyéticas y un tercer medio de cultivo celular para la diferenciación linfoide T. El primer medio de cultivo celular puede incluir BMP-4 (por ejemplo, BMP-4 humana) y bFGF (por ejemplo, bFGF humano). Se pueden usar las T-iPSC indiferenciadas o las ESC indiferenciadas como la población celular de partida. Las T-iPSC o las ESC indiferenciadas se pueden transferir a placas de baja adherencia para permitir la formación de los cuerpos embrioides (EB). La formación de los EB durante la primera etapa puede facilitarse mediante una incubación durante la noche en presencia de hBMP-4. A continuación, los EB se pueden cultivar con BMP-4 y bFGF hasta el día 4 para permitir la inducción del mesodermo. La inducción satisfactoria del mesodermo puede ensayarse, por ejemplo, al medir el porcentaje de las células KDR+PDGFR-.

El segundo medio de cultivo celular puede incluir VEGF (por ejemplo, hVEGF) y un cóctel de citocinas hematopoyéticas. El cóctel de citocinas hematopoyéticas puede incluir SCF (por ejemplo, hSCF), Flt3L (por ejemplo, hFlt3L), al menos una citocina y bFGF para la especificación hematopoyética. La citocina puede ser una citocina Th1, que incluye, pero no se limita a, IL-3, IL-15, IL-7, IL-12 e IL-21. Los EB se pueden cultivar en el segundo medio de cultivo celular para la especificación hematopoyética hasta aproximadamente el día 10. Los EB pueden analizarse inmunofenotípicamente por FACS para la expresión de CD34, CD31, CD43, CD45, CD41a, ckit, Notch1, IL7Ra. En algunos ejemplos, las células CD34+ de aproximadamente el día 10, los EB expresan los niveles más altos de los factores de transcripción claves para la diferenciación linfoide, por ejemplo, CD127 (IL7Ra) y Notch1. El sistema de cultivo celular divulgado en este documento puede producir un rendimiento sorprendentemente alto de progenitores hematopoyéticos a partir de la diferenciación dirigida in vitro de las iPSC o las ESC.

El tercer medio de cultivo celular puede incluir una célula alimentadora y SCF, Flt3L y al menos una citocina. La citocina puede ser una citocina Th1, que incluye, pero no se limita a, IL-3, IL-15, IL-7, IL-12 e IL-21. En algunos divulgados en este documento, la citocina puede añadir modificación(es) genética(s) a las CAR-T-PSC con el fin de mejorar la supervivencia y el potencial funcional de las células CAR-T-PSC-T. En algunos ejemplos, aproximadamente al día 10, los EB se disocian y los precursores hematopoyéticos se transfieren a una célula alimentadora para inducir la diferenciación linfoide T en un sistema de cocultivo establecido en presencia de SCF, Flt3L y de la(s) citocina(s) Th1 (por ejemplo, IL-7). En algunos ejemplos, la célula alimentadora es compatible para el cocultivo de las células para la terapia clínica humana y expresa una proteína recombinante, que incluye, pero no se limitan a, una proteína (DL)-1 similar a Delta o una proteína 4 (DL-4) similar a delta (DL). En un ejemplo, la célula alimentación es una célula alimentadora OP9 (IP9-DL1) que expresa DL-1.

VI. Receptor de antígeno quimérico (CAR).

Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son receptores manipulados, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria. Los CAR se pueden utilizar para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en una célula T; con transferencia de su secuencia codificante facilitada por los vectores retrovirales.

En la presente invención se puede utilizar cualquier CAR que sea adecuado para manipular las células efectoras (por ejemplo, las células T o las células NK) para su uso en la terapia de inmunoterapia adoptiva. Los CAR que se pueden usar en la presente invención para manipular o modificar las PSC (iPSC o ESC) incluyen los descritos en Sadelain, y otros, "The Basic Principles of Chimeric Antigen Receptor Design". Cancer Discovery, OF1-11, (2013), Chicaybam, y otros, (2011), Brentjens y otros Nature Medicine 9: 279286 (2003) y la patente de los EE. u U. No. 7,446,190, los ejemplos no limitantes de los CDR adecuados incluyen, pero no se limitan a, los CAR dirigidos a CD19 (véase la patente de los EE. UU. No. 7,446,190; la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. No. 2013/0071414), los CAR dirigidos a HER2 (véase Ahmed, y otros, Clin Cancer Res., 2010), los CAR dirigidos a MUC16 (véase Chekmasova, y otros, 2011), los CAR dirigidos al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) (por ejemplo, Zhong, y otros, Molecular Therapy, 18(2):413-420 (2010).

Los CAR pueden incluir un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. El dominio extracelular puede incluir una región/dominio de unión/reconocimiento del antígeno. El dominio de unión al antígeno del CAR puede unirse a un antígeno específico, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno de un patógeno (por ejemplo, un antígeno viral), un antígeno CD. El dominio extracelular también puede incluir un péptido señal que dirige la proteína naciente hacia el retículo endoplásmico. El péptido señal puede ser esencial si el CAR está glicosilado y anclado en la membrana celular. El dominio transmembrana es una hélice alfa hidrófoba que atraviesa la membrana. Los diferentes dominios transmembrana dan como resultado una estabilidad del receptor diferente. Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. El componente intracelular más comúnmente utilizado es el CD3Z que contiene 3 ITAM. Esto transmite una señal de activación a la célula T después de que se une el antígeno. Los CAR también pueden incluir una región espaciadora que liga el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembrana. La región espaciadora debe ser lo suficientemente flexible para permitir que el dominio de unión al antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento del antígeno. El espaciador puede ser la región bisagra de IgGl o la región CH2CH3 de una inmunoglobulina y porciones de CD3.

Cuando se utilizan para reprogramar la especificidad de las células T, los CAR permiten el reconocimiento del antígeno nativo en lugar de procesado independiente del MHC y/o independiente del HLA (Eshhar, y otros, Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 (1993); Altenschmidt, y otros, Specific cytotoxic T lymphocytes in gene therapy. J. Mol. Med. 75, 259-266 (1997); Paillard, F. Immunotherapy with T cells bearing chimeric antitumor receptors. Hum. Gene Ther. 10, 151-153 (1999)).

Después del reconocimiento del antígeno, el dominio intracelular de los CAR suministra o transmite un estímulo o señal de activación a las células T (Eshhar, (1993); Altenschmidt (1999)). En determinadas modalidades, se incluyen uno o más receptores coestimuladores en el dominio intracelular distintos de la cadena CD3Z para proporcionar una activación óptima de los linfocitos. En algunos ejemplos, la falta de una señalización coestimuladora puede resultar en una respuesta proliferativa deficiente de las células T o en la inducción de anergia o apoptosis (Hardin, y otros, CD28-mediated signaling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T cell clones. Nature 356, 607-609 (1992); Lenschow, y otros, CD28/B7 system of T cell co-stimulation. Annu. Rev. Immunol. 14, 233-258 (1996). Ward, SG CD28: a signaling perspective. Biochem. J. 318, 361-377 (1996); Greenfield, y otros, CD28/B7 costimulation: a review. Crit. Rev. Immunol. 18, 389-418 (1998)). Por lo tanto, puede ser valioso manipular las células T humanas para que reciban una señal coestimuladora de una manera dependiente del antígeno. Un desarrollo importante en este sentido ha sido el diseño exitoso de los receptores de fusión ScFv-CD28 que transducen una señal coestimuladora funcional dependiente del antígeno en las células T primarias humanas, lo que permite la proliferación sostenida de las células T cuando tanto el TCR endógeno como el receptor CD28 quimérico están conectados. (Krause, y otros Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. J. Exp. Med. 188, 619-626 (1998). Publicación de patente de los EE. UU. No.

2002/0018783.

Hay tres generaciones de los CAR. Los CAR de "primera generación" se componen normalmente de un dominio de reconocimiento de antígeno derivado de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv)) fusionado a un dominio transmembrana, fusionado al dominio de señalización citoplásmico de la cadena del receptor de las células T. Los CAR de "primera generación" tienen normalmente el dominio intracelular de la cadena ^del CD3, que es el transmisor principal de las señales de los TCR endógenos. Los CAR de "primera generación" pueden proporcionar reconocimiento de novo del antígeno y provocar la activación tanto de las células T CD4+ y como de las células T CD8+ a través de su dominio de señalización de la cadena CD3Z en una única molécula de fusión, independiente de la presentación del antígeno mediada por el HLA. En un ejemplo no limitante, los linfocitos T pueden manipularse genéticamente para expresar los TCR artificiales que dirigen la citotoxicidad hacia las células tumorales (véase Eshhar, y otros, Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 (1993); Altenschmidt, y otros, Specific cytotoxic T lymphocytes in gene therapy. J. Mol. Med. 75, 259-266 (1997)).

Los CAR de "segunda generación" añaden dominios de señalización intracelular de varios receptores proteicos coestimuladores (por ejemplo, CD28, 41BB, ICOS, OX40) a la cola citoplásmica del CAR para proporcionar señales adicionales a la célula T. Maher, Nat Biotechnol, 2002; Brentjens y otros, Clin Cáncer Res. (2007) y Stephan y otros, Nat Med., 13(12): 1440-9 (2007). Los CAR de "segunda generación" pueden. Los estudios preclínicos han indicado que los CAR de "segunda generación" mejoran la actividad antitumoral de las células T. Por ejemplo, se demostró en ensayos clínicos la eficacia sólida de las células T modificadas con CAR de "segunda generación" dirigidos a la molécula CD19 en los pacientes con leucemia linfoblástica crónica (CLL) y leucemia linfoblástica aguda (ALL).

La estimulación del receptor CAR específico por el antígeno no induce "agotamiento" como se demuestra con la estimulación por el antígeno basada en TCR o la estimulación no específica basada en anticuerpo antiCD3 o estimulación aloPBMC. Por lo tanto, el reconocimiento del antígeno CAR no se limita al reconocimiento del antígeno basado en TCR endógeno, sino que depende de la especificidad del antígeno elegida para la manipulación en las células CAR+ específicas por el antígeno.

De acuerdo con la presente invención, el CAR puede incluir un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. El dominio extracelular del CAR puede incluir una región de unión al antígeno que se une a un antígeno, que puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos de los antígenos tumorales adecuados incluyen, pero no se limitan a, anhidrasa carbónica IX (CAlX), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, un antígeno de una célula infectada por el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de superficie celular), glicoproteína 2 epitelial (EGP 2), glicoproteína 40 epitelial (EGP-40), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), proteínas receptoras tirosina cinasas erb-B2,3,4, proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor a de folato, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (GD3), Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (HER-2), telomerasa transcriptasa inversa humana ^{(hTERT), subunidad alfa 2 del receptor de Interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera}k, ^{receptor del dominio de}inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), familia A de antígenos de melanoma, 1 (MAGE-AI), Mucina 16 (Muc-16), Mucina 1 (Muc-1), Mesotelina (MSLN), ligandos de NKG2D, antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glucoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), factor R2 de crecimiento endotelial vascular (VEGF- R2) y proteína del tumor de Wilms (WT-1). En determinadas modalidades, la región de unión al antígeno del CAR incluye un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). El scFv puede derivarse de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo que se une al antígeno deseado. Alternativamente, los ScFv pueden derivarse de un Fab (por ejemplo, de bibliotecas Fab). En algunas modalidades, el CAR se selecciona para que tenga alta afinidad o avidez por el antígeno.

El dominio transmembrana del CAR puede incluir un polipéptido de CD3Z, un polipéptido de CD4, un polipéptido de CD8, un polipéptido de CD28, un polipéptido de 4-1BB, un polipéptido de OX40, un polipéptido de ICOS, un polipéptido de CTLA-4, un polipéptido de PD-1, un polipéptido de LAG-3, un polipéptido de 2B4 y un polipéptido de BTLA.

El polipéptido de CD3Z puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % homóloga a la SEQ ID NO. 1 o la secuencia que tiene un número de referencia NCBI: NP_932170 o los fragmentos de las mismas, que tiene actividad activadora o estimulante.

La SEQ ID NO: 1 se proporciona debajo:

1 mkwkalftaa ilqaqlpite aqsfglldpk lcylldgilf íygviltalf lrvkfsrsad

61 apayqqgqnq lynelnlgrr eeydvldkrr grdpemggkp qrrknpqegl ynelqkdkma

121 eayseigmkg errrgkghdg lyqglstatk dtydalhmqa Ippr

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico CD3Z" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD3Z.

El polipéptido de CD8 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % homóloga a la SEQ ID NO: 2 como se indica debajo:

MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTS

GCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSD

FRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQP

LSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNH

RNRRRVCKC PRPWKS GDKPSLSARYV

En algunas modalidades, el dominio transmembrana del CAR incluye un polipéptido de CD8 que tiene una secuencia ácida de los aminoácidos 137 al 209 de la SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico CD8" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD8.

El dominio intracelular del CAR puede incluir un polipéptido de CD3Z que puede activar o estimular una célula (por ejemplo, una célula del linaje linfoide, por ejemplo, una célula T). En determinadas modalidades, el dominio intracelular del CAR puede incluir además al menos una región de señalización coestimuladora que comprende al menos una molécula coestimuladora. Como se usa en este documento, "moléculas coestimuladoras" se refiere a las moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígeno o sus ligandos que se requieren para una respuesta eficaz de los linfocitos al antígeno. La región de señalización coestimuladora puede incluir un polipéptido de CD28, un polipéptido de 4-1BB, un polipéptido de OX40, un polipéptido de ICOS, un polipéptido de DAP-10, un polipéptido de ^{PD-1, un polipéptido de LAG-3, un polipéptido de 2B4, un polipéptido de BTLA o un polipéptido de}cTlA-4. ^Porejemplo, los CAR que contienen el dominio intracelular de 4-1BB, ICOS o DAP-10 se divulgan en la patente de los EE.UU. 7,446,190 (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica el 4-1BB se indica en la SEQ ID No: 15, la secuencia de nucleótidos que codifica el ICOS se indica en SEQ ID No: 16 y la secuencia de nucleótidos que codifica el DAP-10 se indica en la SEQ ID No: 17 en la Patente de los EE. UU. 7,446,190). En algunas modalidades, el dominio intracelular del CAR incluye dos regiones de señalización coestimuladora que comprenden el CD28 y el 4-1BB (Sadelain, y otros, Cancer Discovery, OF1-11, (2013)) y CD28-OX40. La molécula coestimuladora puede unirse a un ligando coestimulador, que es una proteína expresada en la superficie celular que al unirse a su receptor produce una respuesta coestimuladora, es decir, una respuesta intracelular que efectúa la estimulación proporcionada cuando un antígeno se une a su molécula CAR de la presente invención. Los ligandos coestimuladores incluyen, pero no se ^{limitan a, CD80, CD86, CD70, OX40L,}4-1bBl, ^{CD48, TNFRSF14 y PD-L1. Como ejemplo, un ligando de 4-1BB (es}decir, 4-1BBL) puede unirse a 4-1BB (también conocido como "CD137") para proporcionar una señal intracelular que en combinación con una señal CAR induce una función celular efectora de la célula T CAR+.

Un polipéptido de CD28 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % homóloga a la secuencia que tiene un No. de Referencia NCBI: o P10747 o NP_006130 (SEQ ID No. 3) o NP_001230006 (SEQ ID NO: 4) o los fragmentos de los mismos, que tiene actividad estimulante.

La SEQ ID NO: 3 se proporciona debajo:

1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD

61 SAVEVCWYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP

121 PYLDNEKSNG TI1HVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVWG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR

181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS

La SEQ ID NO: 4 se proporciona debajo:

1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSW KHLCPSPLFP GPSKPFWVLV

61 WGGVLACYS LLVTVAFIIF WVRSKRSRLL HSDYMNMTPR RPGPTRKHYQ PYAPPRDFAA

121 YRS

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico CD28" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD28.

Un polipéptido de OX40 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % homóloga a la secuencia que tiene un No. de Referencia NCBI: P43489 o NP_003318 (SEQ ID No: 5) o los fragmentos de los mismos, que tiene actividad estimulante.

La SEQ ID NO: 5 se proporciona debajo:

1 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ

61 NTVCRPCGPG FYNDWSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK

121 PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ

181 GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL

241 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico OX40" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de OX40.

Un polipéptido 4-1BB puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % homóloga a la secuencia que tiene un No. de Referencia NCBI: P41273 o NP_001552 o los fragmentos del mismo (SEQ ID NO: 6), que actúa como ligando del factor de necrosis tumoral (TNF) y tiene actividad estimulante.

La SEQ ID NO: 6 se proporciona debajo:

1 MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPPNSFSSAGGQR

61 TCDICRQCKGVFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQELTKKGCKDC

121 CFGTFNDQKRGICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDWCGP SPADLSPGASSVTPPAPARE

181 PGHSPQIISFFLALTSTALL FLLFFLTLRF SWKRGRKKL LYIFKQPFMRPVQTTQEEDG

241 CSCRFPEEEE GGCEL

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico 4-1BB" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de 4-1BB.

Un polipéptido de ICOS puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % homóloga a la secuencia que tiene un No. de Referencia NCBI: NP_036224 (SEQ ID NO: 7) o los fragmentos de los mismos, que tiene actividad estimulante.

La SEQ ID NO: 7 se proporciona debajo:

1 MKSGLWYFFL FCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQI LCKYPDIVQQFKMQLLKGGQ

61 ILCDLTKTKG SGNTVSIKSLKFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCNLSIFDPPPFK

121 VTLTGGYLHI YESQLCCQLKFWLPIGCAAFVWCILGCIL ICWLTKKKYSSSVHDPNGEY

181 MFMRAVNTAK KSRLTDVTL

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico ICOS" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de ICOS.

CTLA-4 es un receptor inhibidor expresado por las células T activadas, que cuando se acoplan a sus ligandos correspondientes (CD80 y CD86; B7-1 y B7-2, respectivamente), media la inhibición o anergia de las células T activadas. Tanto en los estudios preclínicos como en los clínicos, el bloqueo de CTLA-4 por la infusión sistémica de un anticuerpo, mejoró la respuesta antitumoral endógena, aunque, en el contexto clínico, con importantes efectos tóxicos imprevistos.

CTLA-4 contiene un dominio V extracelular, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. Se han caracterizado variantes de empalme alternativas que codifican diferentes isoformas. La isoforma unida a la membrana funciona como un homodímero interconectado por un enlace disulfuro, mientras que la isoforma soluble funciona como un monómero. El dominio intracelular es similar al de CD28, en que no tiene actividad catalítica intrínseca y contiene un motivo YVKM capaz de unir PI3K, PP2A y SHP-2 y un motivo rico en prolina capaz de unir proteínas que contienen SH3. Una función de CTLA-4 en la inhibición de las respuestas de las células T parece ser directamente a través de la desfosforilación por SHP-2 y PP2A de las proteínas de señalización proximales al TCR, tales como CD3 y LAT. CTLA-4 también puede afectar la señalización indirectamente al competir con CD28 por la unión a CD80/86. También se ha demostrado que CTLA-4 se une y/o interactúa con PI3K, CD80, AP2M1 y PPP2R5A.

Un polipéptido de CTLA-4 puede tener una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 8.

1 MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLPFLLF JPVFCKAMHV AQPAWLASS RGIASFVCEY

61 ASPGKATEVRVTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD SICTGTSSGN QVNLTIQGLR

121 AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL

181 LTAVSLSKML KKRSPLTTGV YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido de CTLA-4 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % homóloga a la SEQ ID NO: 8 (la homología en este documento puede determinarse con el uso de software estándar como BLAST o FASTA). En modalidades no limitantes, un polipéptido de CTLA-4 puede tener una secuencia de aminoácidos que es una porción consecutiva de la SEQ ID NO: 8 que es al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 y hasta 222 aminoácidos de longitud. Alternativa o adicionalmente, en diversas modalidades no limitantes, el polipéptido de CTLA-4 tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 al 223, 1 al 50, 50 al 100, 100 al 140, 141 al 161, 162 al 182, 183 al 223, 141 al 223, 162 al 223 o 183 al 223 de la SEQ ID NO: 8. En una modalidad, el polipéptido de CTLA-4 tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 183 al 223 de la SEQ ID NO: 8. En determinadas modalidades, el dominio de señalización intracelular del CAR incluye un polipéptido de CTLA-4 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 183 al 223 de la SEQ ID NO: 8. En determinadas modalidades, el dominio transmembrana del CAR incluye un polipéptido de CTLA-4 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 162 al 182 de la s Eq ID NO: 8.

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico de CTLA-4" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CTLA-4.

PD-1 es un regulador negativo inmune de las células T activadas tras el acoplamiento con sus correspondientes ligandos PD-L1 y PD-L2 expresados en los macrófagos endógenos y en las células dendríticas. PD-1 es una proteína de membrana de tipo I de 268 aminoácidos. PD-1 tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2, que son miembros de la familia B7. La estructura de la proteína incluye un dominio IgV extracelular seguido de una región transmembrana y una cola intracelular. La cola intracelular contiene dos sitios de fosforilación ubicados en un motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina y un motivo de interruptor inmunorreceptor basado en tirosina, que PD-1 regula negativamente las señales del TCR. Las fosfatasas SHP-I y SHP-2 se unen a la cola citoplásmica de PD-1 tras la unión del ligando. La regulación al alza de PD-L1 es un mecanismo por el que las células tumorales pueden evadir el sistema inmunitario del huésped. En los ensayos preclínicos y clínicos, el bloqueo de PD-1 por los anticuerpos antagonistas indujo respuestas antitumorales mediadas a través del sistema inmunitario endógeno del huésped.

Un polipéptido de PD-1 puede tener una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 9.

1 mqipqapwpv vwavlqlgwr pgwfldspdr pwnpptfspa llwtegdna tftcsfsnts 61 esfvlnwyrm spsnqtdkla afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsv vrarrndsgt 121 ylcgaislap kaqikeslra elrvterrae vptahpspsp rpagqfqtlv vgwggllgs 181 lvllvwvlav icsraargti garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqw rektpeppvp 241 cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadg prsaqplrpe dghcswpl

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido de PD-1 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % homóloga a la SEQ ID NO: 9. En modalidades no limitantes, un polipéptido de PD-1 puede tener una secuencia de aminoácidos que es una porción consecutiva de la SEQ ID NO: 9 que es al menos 20, o al menos 30 o al menos 40 o al menos 50 y hasta 287 aminoácidos de longitud. Alternativa o adicionalmente, en diversas modalidades no limitantes, un polipéptido de PD-1 tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 al 288, 1 al 50, 50 al 100, 100 al 144, 145 al 170, 171 al 191, 192 al 288, 145 al 288, 171 al 288 o 192 al 288 de la SEQ ID NO: 9. En una modalidad, el polipéptido de PD-1 tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 192 al 288 de la SEQ ID NO: 9. En determinadas modalidades, el dominio de señalización intracelular del CAR incluye un polipéptido de PD-1 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 192 al 288 de la SEQ ID NO: 9. En determinadas modalidades, el dominio transmembrana del CAR incluye un polipéptido de PD-1 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 171 al 191 de la SEQ ID NO: 9.

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico PD-1" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de PD-1.

La proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3) es un regulador inmunitario negativo de las células inmunitarias. LAG-3 pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (lg) y contiene 4 dominios extracelulares similares a Ig. El gen LAG3 contiene 8 exones. Los datos de la secuencia, la organización exón/intrón y la localización cromosómica indican una estrecha relación de LAG3 con CD4. LAG3 también ha sido designado como CD223 (grupo de diferenciación 223).

Un polipéptido LAG-3 puede tener una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 10.

1 mweaqflgll fIqplwvapv kplqpgaevp wwaqegapa qlpcsptípl qdlsllrrag 61 vtwqhqpdsg ppaaapghpl apgphpaaps swgprprryt vlsvgpgglr sgrlplqprv 121 qldergrqrg dfslwlrpar radageyraa vhlrdralsc rlrlrlgqas mtasppgslr 181 asdwvilncs fsrpdrpasv hwfrnrgqgr vpvresphhh laesfIflpq vspmdsgpwg 241 ciltyrdgfn vsimynltvi glepptpltv yagagsrvgl pcrlpagvgt rs fItakwtp 301 pgggpdllvt gdngdftlrl edvsqaqagt ytchihlqeq qlnatvtlai itvtpks fgs 361 pgslgkllce vtpvsgqerf vwssldtpsq rsfsgpwlea qeaqllsqpw qcqlyqgerl 421 lgaavyftel sspgaqrsgr apgalpaghl llflilgvls llllvtgafg fhlwrrqwrp 481 rrfsaleqgi hppqaqskie eleqepepep epepepepep epeql

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido de LAG-3 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % homóloga a la SEQ ID NO: 10. En modalidades no limitantes, un polipéptido de LAG-3 puede tener una secuencia de aminoácidos que es una porción consecutiva de la SEQ ID NO: 10 que es al menos 20 o al menos 30 o al menos 40 o al menos 50 y hasta 524 aminoácidos de longitud. Alternativa o adicionalmente, en varias modalidades no limitantes, un polipéptido de LAG-3 tiene una secuencia de aminoácidos de 1 al 525, 1 al 50, 50 al 100, 100 al 150, 150 al 200, 200 al 250, 250 al 300300 al 350, 350 al 400, 400 al 420, 421 al 450, 451 al 471,472 al 525, 421 al 525, 451 al 525 o 472 al 525 de la SEQ ID NO: 10. En una modalidad, el polipéptido de LAG-3 tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 472 al 525 de la SEQ ID NO: 10. En determinadas modalidades, el dominio de señalización intracelular del CAR incluye un polipéptido de LAG-3 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 472 al 525 de la SEQ ID NO: 10. En determinadas modalidades, el dominio transmembrana del CAR incluye un polipéptido de LAG-3 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 451 al 471 de la SEQ ID NO: 10.

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico LAG-3" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de LAG-3.

El Receptor 2B4 de las Células Asesinas Naturales (2B4) media la muerte de las células no restringidas por el MHC en las células NK y subconjuntos de las células T. Hasta la fecha, la función de 2B4 todavía está bajo investigación, se cree que la isoforma 2B4-S es un receptor activador y se cree que la isoforma 2B4-L es un regulador inmunitario negativo de las células inmunitarias. 2B4 se compromete al unirse a su ligando de alta afinidad, CD48. 2B4 contiene un motivo de interruptor basado en tirosina, un interruptor molecular que permite que la proteína se asocie con varias fosfatasas. 2B4 también se ha designado como CD244 (grupo de diferenciación 244).

Un polipéptido de 2B4 puede tener una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 11.

1 mlgqwtlil 111lkvyqgk gcqgsadhw sisgvplqlq pnsiqtkvds iawkkllpsq 61 ngfhhilkwe ngslpsntsn drfsfivknl sllikaaqqq dsglyclevt sisgkvqtat 121 fqvfvfesll pdkvekprlq gqgkildrgr cqvalsclvs rdgnvsyawy rgskliqtag 181 nltyldeevd ingthtytcn vsnpvswesh tlnltqdcqn ahqefrfwpf Iviivilsal 241 flgtlacfcv wrrkrkekqs etspkeflti yedvkdlktr rnheqeqtfp gggstíysmí 301 qsqssaptsq epaytlysli qpsrksgsrk rnhspsfnst iyevigkaqp kaqnparlsr 361 kelenfdvys

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido de 2B4 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % homóloga a la SEQ ID NO: 11. En modalidades no limitantes, un polipéptido de 2B4 puede tener una secuencia de aminoácidos que es una porción consecutiva de la SEQ ID NO: 11 que es al menos 20 o al menos 30 o al menos 40 o al menos 50 y hasta 369 aminoácidos de longitud. Alternativa o adicionalmente, en diversas modalidades no limitantes, un polipéptido de 2B4 tiene una secuencia de aminoácidos de 1 al 370, 1 al 50, 50 al 100, 100 al 150, 150 al 215, 216 al 229, 230 al 250, 251 al 370, 216 al 370, 230 al 370 o 251 al 370 de la SEQ ID NO: 11. En una modalidad, el polipéptido de 2B4 tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 251 al 370 de la SEQ ID NO: 11. En determinadas modalidades, el dominio de señalización intracelular del CAR incluye un polipéptido de 2B4 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 251 a 370 de la SEQ ID NO: 11. En determinadas modalidades, el dominio transmembrana del CAR incluye un polipéptido de 2B4 que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 230 al 250 de la SEQ ID NO: 11.

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico 2B4" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de 2B4.

La expresión del atenuador de linfocitos B y T (BTLA) se induce durante la activación de las células T y BTLA permanece expresada en las células Th1, pero no en las células Th2. Al igual que PD1 y CTLA4, BTLA interactúa con un homólogo de B7, B7H4. Sin embargo, a diferencia de PD-1 y CTLA-4, BTLA muestra inhibición de las células T a través de la interacción con los receptores de la familia de necrosis tumoral (TNF-R), no solo con la familia B7 de los receptores de la superficie celular. BTLA es un ligando de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (receptor), miembro 14 (TNFRSF14), también conocido como mediador de entrada del virus del herpes (HVEM). Los complejos BTLA-HVEM regulan negativamente las respuestas inmunitarias de las células T. Se ha demostrado que la activación de BTLA inhibe la función de las células T CD8+ humanas específicas por el cáncer. BTLA también se ha designado como CD272 (grupo de diferenciación 272).

Un polipéptido BTLA puede tener una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 12.

1 MKTLPAMLGTGKLFWVFFLIPYLDIWN1HG KESCDVQLYIKRQSEHSILA GDPFELECPV

61 KYCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWK BEKNISFFILHFBPVLPNDN GSYRCSANFQ

121 SNLIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMAS RPWLLYRLLPLGGLPLL1TT CFCLFCCLRR

181 HQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEA STRQNSQVLLSETGIYDWDP DLCFRMQEGS

241 EVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSR LARNVKEAPTEYASICVRS

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido BTLA puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % homóloga a la SEQ ID NO:12. En modalidades no limitantes, un polipéptido de BTLA puede tener una secuencia de aminoácidos que es una porción consecutiva de la SEQ ID NO: 12 que es al menos 20 o al menos 30 o al menos 40 o al menos 50 y hasta 288 aminoácidos de longitud. Alternativa o adicionalmente, en diversas modalidades no limitantes, un polipéptido de BTLA tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 al 289, 1 al 50, 50 al 100, 100 al 134, 135 al 157, 158 al 178, 179 al 289, 135 al 289, 158 al 289 o 179 al 289 de la SEQ ID NO:12. En una modalidad, el polipéptido de BTLA tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 179 al 289 de la SEQ ID NO: 12. En determinadas modalidades, el dominio de señalización intracelular del CAR incluye un polipéptido de BTLA que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 179 al 289 de la SEQ ID NO:12. En determinadas modalidades, el dominio transmembrana del CAR incluye un polipéptido de BTLA que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 158 al 178 de la SEQ ID NO:12.

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico de BTLA" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de BTLA.

Un polipéptido de OX40L puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % homóloga a la secuencia que tiene un No de Referencia NCBI: BAB 18304 o NP_003317 (SEQ ID NO: 13) o los fragmentos de los mismos que es un ligando del factor de necrosis tumoral (TNF).

La SEQ ID NO: 13 se proporciona debajo:

1 mervqpleen vgnaarprfe rnklllvasv iqglglllcf tyiclhfsal qvshrypriq 61 sikvqfteyk kekgfiltsq kedeimkvqn nsviincdgf ylislkgyfs qevnislhyq

121 kdeeplfqlk kvrsvnslmv asltykdkvy lnvttdntsl ddfhvnggel ilihqnpgef 181 cvl

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico OX40L" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de OX40L.

Un polipéptido de 4-1BB puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % homóloga a la secuencia que tiene un No. de Referencia NCBI: P41273 o NP_001552.2 (SEQ ID NO: 14) o un fragmento del mismo que actúa como ligando del factor de necrosis tumoral (TNF).

La SEQ ID NO: 14 se proporciona a continuación:

l mgnscyniva tlllvlnfer trslqdpcsn epagtfcdnn rnqicspcpp nsfssaggqr 61 tcdicrqckg vfrtrke ess tsnaecdctp gfhelgages mceqdckqgq eltkkgckdc

121 cfgtfndqkr gicrpwtncs ldgksvlvng tkerdvvcgp spadlspgas svtppapare

181 pghspqiisf flaltstall fllffltlrf svvkrgrkkl lyifkqpfmr pvqttqeedg 241 cscrfpeeee ggcel

De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico 4-1BB" se refiere a un polinudeótido que codifica un polipéptido de 4-1BB.

En una modalidad, el CAR es 1928z, que comprende una región de unión al antígeno que se une a un antígeno CD19 del linaje de las células B y un dominio de señalización coestimulador que comprende un polipéptido de CD28. "1928z" se refiere a una proteína que tiene al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % homóloga a la SEQ ID NO: 15, que incluye una secuencia líder de CDS en los aminoácidos 1-18 y es capaz de unirse a CD19.

La SEQ ID NO: 15 se proporciona a continuación:

MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNW

VKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSED

SAVYFCARKTISSWDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQS

PKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDR

FTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVM

YPPPYLDNEKSNGTI1HVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVWGGVLACYSLLVT

VAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFS

RSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY

NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRX

Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica un polipéptido de 1928z, que incluye una secuencia líder de CDS, se proporciona en la SEQ ID NO: 16, que se proporciona debajo.

ccatggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatg cagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcag tgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaact gggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctg gagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactg cagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgagg actctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttct actttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtg gatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagt ctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaagg ccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaat ctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatc gcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgc agtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtaca cgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagtta tgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatg tgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccct tttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaa cagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcaca gtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattacc agccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttca gcaggagcgcagagccccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacg agctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggcc gggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgt acaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatga aaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagta cagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcg En algunas modalidades, el CAR puede comprender además un promotor inducible, para expresar las secuencias de ácido nucleico en las células humanas. Los promotores para usar en la expresión de los genes CAR pueden ser promotores constitutivos, como el promotor de ubiquitina C (UbiC).

En algunas modalidades, el dominio extracelular del CAR puede incluir además un péptido señal que dirige la proteína naciente al retículo endoplásmico. El CAR también puede incluir una región espaciadora que une el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembrana. La región espaciadora debe ser lo suficientemente flexible para permitir que el dominio de unión al antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento del antígeno. El espaciador puede ser la región bisagra de IgG1 o la región CH2CH3 de inmunoglobulina y porciones de CD3 Los PSC (iPSC o ESC) se pueden transducir con el CAR para generar las PSC que expresan el CAR. La generación de las PSC que expresan el CAR puede evaluarse en ensayos de estimulación con las células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) que expresan el antígeno al que la región de unión al antígeno CAR puede unirse y reconocer. Las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR tienen una fuerte señal proliferativa y de supervivencia similar a la del TCR a través de la cadena CD3Z y además a través de la coestimulación proporcionada por CD28.

El uso de un CAR para el reconocimiento del antígeno puede evitar la posibilidad de un reordenamiento futuro del gen TCR. Además, al reprogramar una célula T en una T-PSC que tiene un mayor potencial de proliferación y diferenciación que una célula T, estas T-PSC (por ejemplo, las T-PSC que expresan el CAR) pueden usarse para las manipulaciones genéticas. Las T-PSC pueden ser transducidas por una molécula, que incluye, pero no se limitan a, un CAR, un TCR específico, un ligando coestimulador, un gen suicida (por ejemplo, hsvtk, caspasa inducible), una citocina inducible y un gen de formación de imágenes. En una modalidad, las T-PSC se transducen con un CAR. Estas moléculas pueden insertarse en un sitio genómico seguro, tal como el identificado en Papapetrou, Nat Biotech (2011). EL direccionamiento hacia un sitio genómico seguro específico se puede lograr mediante la recombinación homóloga con el uso de una nucleasa (por ejemplo, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN)). Además, la expresión del MHC/HLA puede manipularse como se describe en este documento y mediante la anulación o silenciamiento de los genes Rag con el fin de proporcionar a la célula T CAR+ un potencial de aplicación universal, es decir, uso alogénico. Por lo tanto, la función efectora celular de las células T CAR+ se puede modificar para su manipulación y mejora de una manera clínicamente segura. Además, el proceso de manipulación (construcción del vector) brinda una oportunidad de manipular el vector para que se integre en un sitio de integración cromosómico seleccionado para el CAR al direccionar a sitios específicos de "sitio genómico seguro" (véase, Papapetrou y otros Nat Biotech 2011). En algunas modalidades, los vectores comprenden secuencias de direccionamiento para la integración en un sitio genómico seguro.

En una modalidad, las T-PSC se producen a partir de las células T de sangre periférica, que se transducen de forma estable con un vector que codifica un CAR y un marcador fluorescente. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, un vector lentiviral, un vector retroviral. También pueden usarse otros enfoques que pueden dirigir los ADN a un "sitio genómico seguro" seleccionado, por ejemplo, Thal5.10 (Papapetrou, 2011 o 2012) y AAVS1, para producir las T-PSC a partir de las células T. En algunos ejemplos, el marcador fluorescente es mCherry. Se proporciona una secuencia ejemplar que codifica a mCherry en la SEQ ID NO: 17:

Atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtg

cacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccc

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El marcador fluorescente se puede usar para clasificar las T-PSC que expresan el CAR mediante la clasificación para la expresión alta del marcador fluorescente, identificación, seguimiento, in vitro e in vivo. Las T-PSC que expresan el CAR se pueden volver a diferenciar en los precursores hematopoyéticos, que pueden diferenciarse además en el linaje linfoide T. Las células T derivadas o producidas a partir de las T-PSC que expresan el CAR de la presente invención expresan el CAR en su superficie y pueden responder, dirigirse o reconocer el antígeno específico al que se dirige la región de unión al antígeno del CAR. Por ejemplo, las células T producidas o derivadas a partir de las T-PSC que expresan 1928ZCAR pueden dirigirse o reconocer CD19, por ejemplo, el CD19 expresado en la superficie celular de las células NIH-3T3 (AAPC) (Latouche y otros Nat Biotech 2000). Después del reconocimiento del antígeno, el dominio intracelular del CAR (por ejemplo, CD3Z solo o CD3Z combinado con uno o más péptidos de señalización coestimuladores (por ejemplo, CD28, 4-1BB, ICOS y/o OX40) transmite una señal de activación a las células T. Las células T que expresan el Ca r de la presente invención pueden secretar citocinas, por ejemplo, las citocinas Th1 que incluyen, pero no se limitan a, IFN-y, IL-2 y TNF-a. Además, las células T que expresan el CAR de la presente invención pueden expandirse de 10 a 50 veces después de una estimulación (por ejemplo, diferenciación al día 30) y hasta aproximadamente 1000 veces después de tres rondas de estimulaciones. Las actividades adicionales que poseen las células T que expresan el CAR de la presente invención incluyen la citotoxicidad y la inhibición citostática del crecimiento celular. La inhibición citostática del crecimiento celular puede resultar en la muerte de las células que expresan el antígeno reconocido por el CAR. Debido a la inhibición citostática de la actividad del crecimiento celular, las células T que expresan el CAR de la presente invención pueden usarse para tratar los tumores o los cánceres. Además, el reconocimiento del antígeno de los CAR no requiere la presentación en la molécula de clase I de1HLA y, por lo tanto, las células T que expresan el CAR derivadas de las T-PSC que expresan el CAR pueden reconocer los tumores a través de las barreras del MHC. Para al menos lo anterior, las células T que expresan el CAR de la presente invención pueden usarse en la inmunoterapia adoptiva (terapia de las células T adoptivas).

Mediante el uso de los sistemas de cultivo celular descritos en este documento para la diferenciación y desdiferenciación de las células fuente, que incluyen, pero no se limitan a, PSC, iPSC, ESC, las células de la sangre del cordón umbilical, las células de sangre periférica, las células T de sangre periférica, etc., se superó el obstáculo del rendimiento de la diferenciación a células T in vitro de las PSC para una reactividad antigénica específica. Por lo tanto, las células T que expresan el CAR de la presente invención pueden usarse para la evaluación funcional in vivo en los modelos de ratón y para uso clínico.

VII. Vectores

La modificación genética de las células (por ejemplo, las células T, las células NK e iPSC y ESC) se puede lograr al transducir una composición celular sustancialmente homogénea con una construcción de ADN o ARN recombinante. Preferentemente, se emplea un vector retroviral (ya sea gamma retroviral o lentiviral) para la introducción de la construcción de ADN o ARN en el genoma de la célula huésped. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un receptor que se une a un antígeno (por ejemplo, un antígeno tumoral o una variante o un fragmento del mismo), se puede clonar en un vector retroviral y la expresión se puede impulsar desde su promotor endógeno, desde la repetición terminal larga retroviral o de un promotor interno alternativo. También se pueden usar vectores o ARN no virales. Se puede usar la integración cromosómica aleatoria o la integración dirigida (por ejemplo, con el uso de una nucleasa, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y/o repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) o expresión transgénica (por ejemplo, con el uso de un ARN natural o químicamente modificado).

Para la modificación genética inicial de las células para proporcionar las células tumorales o virales específicas por el antígeno, generalmente se emplea un vector retroviral para la transducción, sin embargo, se puede usar cualquier otro vector viral o sistema de administración no viral adecuado. Para la posterior modificación genética de las células para proporcionar las células que comprenden un complejo presentador de antígeno que comprende al menos dos ligandos coestimuladores, la transferencia de genes retrovirales (transducción) también resulta eficaz. También son adecuadas las combinaciones de vector retrovírico y una línea de empaquetamiento apropiada, donde las proteínas de la cápside serán funcionales para infectar las células humanas. Se conocen varias líneas celulares productoras de virus anfotrópicas, que incluyen, pero no se limitan a, PA12 (Miller, y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902) y CRIP (Danos y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464). Las partículas no anfotrópicas también son adecuadas, por ejemplo, las partículas pseudotipadas con envoltura de VSVG, RD114 o GALV y cualquier otra conocida en la técnica.

Los posibles métodos de transducción también incluyen el cocultivo directo de las células con las células productoras, por ejemplo, mediante el método de Bregni, y otros (1992) Blood 80: 1418-1422 o el cultivo con sobrenadante viral solo o reservas de vector concentradas con o sin los factores de crecimiento y policationes apropiados, por ejemplo, mediante el método de Xu, y otros (1994) Exp. Hemat. 22:223-230 y Hughes, y otros (1992) J. Clin. Invest. 89:1817.

Los vectores virales transductores se pueden usar para expresar un ligando coestimulador en una célula inmunosensible. Preferentemente, el vector elegido exhibe una alta eficiencia de infección e integración y expresión estables (véanse, por ejemplo, Cayouette y otros, Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido y otros, Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer y otros, Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini y otros, Science 272:263 267, 1996 y Miyoshi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10319, 1997). Otros vectores virales que pueden usarse incluyen, por ejemplo, los vectores virales adenovirales, lentivirales y adenoasociados, virus vaccinia, un virus del papiloma bovino o un virus del herpes, tales como el virus de Epstein-Barr (ver también, por ejemplo, los vectores de Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis y otros, BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev y otros, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277 1278, 1991; Cornetta y otros, Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226: 401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller y otros, Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle y otros, Science 259:988-990, 1993 y Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995). Los vectores retrovirales están particularmente bien desarrollados y se han utilizado en entornos clínicos (Rosenberg y otros, N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson y otros, patente de los EE. UU. No. 5,399,346).

También se pueden emplear enfoques no virales para la expresión de una proteína en la célula. Por ejemplo, se puede introducir una molécula de ácido nucleico en una célula mediante la administración del ácido nucleico en la presencia de lipofección (Feigner y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono y otros, Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham y otros, Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989; Staubinger y otros, Methods in Enzymology 101:512, 1983), conjugación asialoorosomucoide-polilisina (Wu y otros, Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu y otros, Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989) o mediante microinyección en condiciones quirúrgicas (Wolff y otros, Science 247:1465, 1990). Otros medios no virales para la transferencia de genes incluyen la transfección in vitro con el uso de fosfato de calcio, DEAE dextrano, electroporación y fusión de protoplastos. Los liposomas también pueden ser potencialmente beneficiosos para el suministro del ADN a una célula. El trasplante de genes normales en los tejidos afectados de un sujeto también se puede lograr mediante la transferencia de un ácido nucleico normal a un tipo celular cultivable ex vivo (por ejemplo, una célula primaria autóloga o heteróloga o la progenie de la misma), después de lo cual la célula (o sus descendientes) se inyectan en un tejido diana o se inyectan sistémicamente. Los receptores recombinantes también se pueden derivar u obtener con el uso de las transposasas o nucleasas dirigidas (por ejemplo, nucleasas de dedos de Zinc, meganucleasas o nucleasas TALE). La expresión transitoria se puede obtener mediante electroporación del ARN.

La expresión del ADNc para su uso en los métodos de la terapia con polinucleótidos se puede dirigir a partir de cualquier promotor adecuado (por ejemplo, el citomegalovirus humano (CMV), el virus de simio 40 (SV40) o los promotores de metalotioneína) y regulada por cualquier elemento o intrón regulador de mamífero apropiado (por ejemplo, el factor de alargamiento 1 a potenciador/promotor/estructura intrónica). Por ejemplo, si se desea, pueden usarse los potenciadores que se sabe que dirigen preferentemente la expresión génica en tipos celulares específicos para dirigir la expresión de un ácido nucleico. Los potenciadores usados pueden incluir, sin limitación, aquellos que se caracterizan como potenciadores específicos de tejido o célula. Alternativamente, si se usa un clon genómico como construcción terapéutica, la regulación puede estar mediada por las secuencias reguladoras afines o, si se desea, por las secuencias reguladoras derivadas de una fuente heteróloga, que incluyen cualquiera de los promotores o elementos reguladores descritos anteriormente.

Las células resultantes se pueden cultivar en condiciones similares a las de las células no modificadas, por lo que las células modificadas se pueden expandir y usar para una variedad de propósitos.

VIII. Administración

Las poblaciones celulares que comprenden las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR y las composiciones que comprenden lo divulgado en este documento pueden proporcionarse para una administración sistémica o directa a un sujeto para el tratamiento de una neoplasia, infección por patógenos o enfermedad infecciosa. Las células T de la presente invención pueden inyectarse directamente en un órgano de interés (por ejemplo, un órgano afectado por una neoplasia). Alternativamente, las células T y las composiciones que comprenden las mismas de la presente invención se proporcionan para la administración indirecta al órgano de interés, por ejemplo, mediante la administración en el sistema circulatorio (por ejemplo, la vasculatura del tumor). Pueden proporcionarse los agentes de expansión y diferenciación antes, durante o después de la administración de las células y las composiciones para aumentar la producción de las células T in vitro o in vivo.

Las células T y las composiciones que comprenden lo divulgado en este documento pueden administrarse en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable, normalmente por vía intravascular, aunque también pueden introducirse en el hueso u otro sitio conveniente donde las células pueden encontrar un sitio apropiado para la regeneración y diferenciación (por ejemplo, el timo). Normalmente, se administrarán al menos 1 x 105 células, llegando finalmente a 1 x 1010 o más. Una población celular que comprende las células T puede comprender una población purificada de las células. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el porcentaje de las células T en una población con el uso de varios métodos bien conocidos, tal como la clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS). Los intervalos preferibles de pureza en las poblaciones que comprenden las células inmunosensibles modificadas genéticamente son de aproximadamente 50 a aproximadamente 55 %, aproximadamente 55 a aproximadamente 60 % y aproximadamente 65 a aproximadamente 70 %. Más preferentemente, la pureza es de aproximadamente 70 a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 a aproximadamente 85 % y aún más preferentemente, la pureza es de aproximadamente 85 a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 a aproximadamente 95 % y de aproximadamente 95 a aproximadamente 100 %. Los expertos en la técnica pueden ajustar fácilmente las dosis (por ejemplo, una disminución de la pureza puede requerir un aumento de la dosis). Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similar. Si se desea, también se pueden incluir los factores que incluyen, pero no se limitan a, interleucinas, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL 6, IL-11, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, así como las otras interleucinas, los factores estimulantes de colonias, tales como G-, M- y GM-CSF, interferones, por ejemplo, interferón gamma y eritropoyetina.

Las composiciones divulgadas en este documento incluyen las composiciones farmacéuticas que comprenden las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración puede ser autóloga o no autóloga. Por ejemplo, las células T y las composiciones que comprenden las mismas pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células T derivadas de sangre periférica de la presente invención o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluida la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica de la presente invención (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende las células T derivadas de T-PSC que expresan el CAR), generalmente se formulará en forma de dosis unitaria inyectable (solución, suspensión, emulsión).

IX. Formulaciones

Las poblaciones celulares que comprenden las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR y las composiciones que comprenden a las mismas divulgadas en este documento se pueden proporcionar convenientemente como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que se pueden tamponar a una pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, que otras composiciones viscosas y que las composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más convenientes de administrar, especialmente mediante inyección. Las composiciones viscosas, por otra parte, se pueden formular dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más largos con los tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender vehículos, que pueden ser un disolvente o medio dispersante que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismo.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de las composiciones que comprenden a las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR de la presente invención en la cantidad requerida del disolvente apropiado con diversas cantidades de los otros ingredientes, según se desee. Tales composiciones pueden estar mezcladas con un vehículo, diluyente o excipiente adecuado, tales como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponantes del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Se pueden consultar los textos estándar, como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edición, 1985, para preparar las preparaciones adecuadas, sin experimentación indebida.

Se pueden añadir varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluidos los conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Sin embargo, cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado tendría que ser compatible con las células T derivadas de las T-iPSC que expresan el CAR de la presente invención.

Las composiciones pueden ser isotónicas, es decir, pueden tener la misma presión osmótica que la sangre y el líquido lagrimal. La isotonicidad deseada de las composiciones divulgadas en este documento puede lograrse con el uso de cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables, tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio, propilenglicol u otros solutos inorgánicos u orgánicos. El cloruro de sodio se prefiere particularmente para los tampones que contienen iones de sodio.

La viscosidad de las composiciones, si se desea, puede mantenerse al nivel seleccionado con el uso de un agente espesante farmacéuticamente aceptable. Se prefiere la metilcelulosa porque está disponible fácil y económicamente y es fácil de trabajar. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbómero y similares. La concentración preferida del espesante dependerá del agente seleccionado. El punto importante es usar una cantidad que logre la viscosidad seleccionada. Obviamente, la elección de los vehículos adecuados y otros aditivos dependerá de la ruta exacta de administración y la naturaleza de la forma de dosificación particular, por ejemplo, forma de dosificación líquida (por ejemplo, si la composición se va a formular en una solución, suspensión, gel u otra forma líquida, tales como una forma de liberación en el tiempo o una forma llena de líquido).

Los expertos en la técnica reconocerán que los componentes de las composiciones deben seleccionarse para que sean químicamente inertes y no afectarán la viabilidad o eficacia de las células T como se describe en este documento. Esto no presentará ningún problema para los expertos en los principios químicos y farmacéuticos o pueden evitarse fácilmente los problemas mediante la referencia a los textos estándar o mediante experimentos simples (que no implican experimentación indebida), a partir de esta descripción y los documentos citados en este documento.

Una consideración relativa al uso terapéutico de las células T de la presente invención es la cantidad de las células necesaria para lograr un efecto óptimo. La cantidad de las células a administrar variará para el sujeto que se esté tratando. En una modalidad, se administran a un sujeto humano entre 104 y 1010 entre 105 y 109 o entre 106 y 108 células T de la presente invención. Se pueden administrar células más eficaces en cantidades incluso menores. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108 y 5 x 108 células T de la presente invención se administran a un sujeto humano. La determinación precisa de lo que se consideraría una dosis eficaz puede basarse en los factores individuales de cada sujeto, que incluyen su tamaño, edad, sexo, peso y condición del sujeto en particular. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica.

El experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad de las células y aditivos, vehículos y/o portadores opcionales en las composiciones y que se administrarán en los métodos de la invención. Normalmente, cualquier aditivo (además de la(s) célula(s) activa(s) y/o agente(s)) está presente en una cantidad de 0,001 a 50 % (en peso) en la solución salina tamponada con fosfato y el ingrediente activo está presente en el orden de microgramos a miligramos, tales como aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 5 % en peso, preferentemente aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 % en peso, aún más preferentemente aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,05 % en peso o aproximadamente 0,001 a aproximadamente 20 % en peso, preferentemente aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 % en peso y aún más preferentemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 % en peso. Por supuesto, para cualquier composición que se va a administrar a un animal o ser humano y para cualquier método de administración particular, se prefiere determinar por lo tanto: la toxicidad, tal como mediante la determinación de la dosis letal (LD) y lD50 en un modelo animal adecuado, por ejemplo, roedor, tal como el ratón y, la dosis de la(s) composición(es), la concentración de los componentes en la misma y el momento de administración de la(s) composición(es), que provocan una respuesta adecuada. Tales determinaciones no requieren experimentación indebida a partir del conocimiento del experto en la técnica, esta divulgación y los documentos citados en este documento. Y el tiempo para las administraciones secuenciales se puede determinar sin la experimentación indebida.

X. Métodos de tratamiento

Se divulgan los métodos para tratar neoplasias en un sujeto. También se divulgan los métodos para tratar una infección patógena u otra enfermedad infecciosa en un sujeto, tal como un sujeto humano inmunodeprimido. Los métodos comprenden administrar las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR de la presente invención en una cantidad eficaz para lograr el efecto deseado, ya sea paliación de una afección existente o prevención de la recurrencia. Para el tratamiento, la cantidad administrada es una cantidad eficaz para producir el efecto deseado. Puede proporcionarse una cantidad eficaz en una o una serie de administraciones. Se puede proporcionar una cantidad eficaz en un bolo o mediante una perfusión continua.

Una "cantidad eficaz" (o "cantidad terapéuticamente eficaz") es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado tras el tratamiento. Se puede administrar una cantidad eficaz a un sujeto en una o más dosis. En términos de tratamiento, una cantidad eficaz es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir o ralentizar la progresión de la enfermedad o reducir de otro modo las consecuencias patológicas de la enfermedad. La cantidad eficaz se determina generalmente por el médico sobre la base de caso por caso y está dentro del conocimiento de un experto en la materia. Normalmente, se tienen en cuenta varios factores al determinar una dosis adecuada para lograr una cantidad eficaz. Estos factores incluyen la edad, el sexo y el peso del sujeto, la afección que se está tratando, la gravedad de la afección y la forma y concentración eficaz del fragmento de unión al antígeno administrado.

Para la inmunoterapia adoptiva que usa las células T específicas por el antígeno, normalmente se infunden dosis de las células en el intervalo de 106 - 1010 (por ejemplo, 109). Tras la administración de las células T al sujeto y la posterior diferenciación, se inducen las células T que se dirigen específicamente contra un antígeno específico. La "inducción" de las células T puede incluir la inactivación de las células T específicas por el antígeno, tales como por deleción o anergia. La inactivación es particularmente útil para establecer o restablecer la tolerancia, como en los trastornos autoinmunitarios. Las células T de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier de los métodos conocidos en la técnica, que incluye, pero no se limitan a, la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intranodal, la administración intratumoral, la administración intratecal, la administración intrapleural, la administración intraperitoneal y la administración directa al timo.

Se divulgan los métodos para aumentar una respuesta inmune en un sujeto que lo necesite. En un ejemplo, los métodos son para tratar o prevenir una neoplasia en un sujeto. Se divulgan las terapias que son particularmente útiles para el tratamiento de los sujetos que tienen cánceres de la sangre (por ejemplo, leucemias, linfomas y mielomas) o cáncer de ovario, que no son susceptibles a las intervenciones terapéuticas convencionales. Los sujetos humanos adecuados para la terapia comprenden normalmente dos grupos de tratamiento que pueden distinguirse por los criterios clínicos. Los sujetos con "enfermedad avanzada" o "alta carga tumoral" son aquellos que portan un tumor clínicamente medible. Un tumor clínicamente medible es aquel que puede detectarse sobre la base de la masa tumoral (por ejemplo, mediante palpación, tomografía computarizada, ecografía, mamografía o radiografía; los marcadores bioquímicos o histopatológicos positivos por sí solos son insuficientes para identificar esta población). Una composición farmacéutica realizada, divulgada en este documento es para la administración a estos sujetos para provocar una respuesta antitumoral, con el objetivo de paliar su condición. Idealmente, como resultado se produce una reducción de la masa tumoral, pero cualquier mejoría clínica constituye un beneficio. La mejoría clínica incluye la disminución del riesgo o la tasa de progresión o la reducción de las consecuencias patológicas del tumor.

Un segundo grupo de sujetos adecuados se conoce en la técnica como el "grupo adyuvante". Estos son individuos que han tenido antecedentes de neoplasia, pero que han respondido a otro modo de terapia. La terapia anterior puede haber incluido, pero no se limitan a, extirpación quirúrgica, radioterapia y quimioterapia tradicional. Como resultado, estos individuos no tienen un tumor clínicamente medible. Sin embargo, se sospecha que están en riesgo de progresión de la enfermedad, ya sea cerca del sitio del tumor original o por metástasis. Este grupo se puede subdividir además en personas de alto y bajo riesgo. La subdivisión se realiza sobre la base de las características observadas antes o después del tratamiento inicial. Estas características se conocen en la técnica clínica y se definen adecuadamente para cada neoplasia diferente. Las características típicas de los subgrupos de alto riesgo son aquellas en las que el tumor ha invadido los tejidos vecinos o que muestran afectación de los ganglios linfáticos.

Otro grupo tiene una predisposición genética a la neoplasia, pero aún no ha evidenciado los signos clínicos de la neoplasia. Por ejemplo, las mujeres que dan positivo por una mutación genética asociada con el cáncer de mama, pero aún en edad fértil, pueden desear recibir uno o más de los fragmentos de unión al antígeno descritos en este documento en el tratamiento de manera profiláctica para prevenir la aparición de la neoplasia hasta que sea adecuado realizar la cirugía preventiva.

Los sujetos con neoplasia humana que tienen cualquiera de las siguientes neoplasias: glioblastoma, melanoma, neuroblastoma a, adenocarcinoma, glioma, sarcoma de tejido blando y varios carcinomas (que incluyen el cáncer de próstata y de pulmón de células pequeñas) son sujetos especialmente apropiados. Los carcinomas adecuados incluyen además todos los conocidos en el campo de la oncología, que incluyen, pero no se limitan a, astrocitoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, oligodendroglioma, ependimoma, meduloblastoma, tumor ectodérmico neural primitivo (PNET), condrosarcoma, sarcoma osteogénico, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinomas de pulmón de las células pequeñas y grandes, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, carcinoma de las células escamosas, carcinoma broncoalveolar, adenocarcinoma epitelial y metástasis hepáticas de los mismos, linfangiosarcoma, sarcoma de linfangioendotelio, hepatoma, colangiocarcinoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, rabdomiosarcoma, carcinoma de colón, carcinoma de las células basales, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma papilar, carcinoma de glándulas sebáceas, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de las células renales, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de la cadena pesada, tumores de mama, tales como adenocarcinoma ductal y lobular, escamoso y adenocarcinomas del útero y cérvix, carcinomas epiteliales de ovario y útero, adenocarcinomas prostáticos, carcinoma de las células escamosas transicionales de la vejiga, linfomas de las células B y T (nodular y difuso) plasmocitoma, leucemias agudas y crónicas, melanoma maligno, sarcomas de tejidos blandos y leiomiosarcomas.

Los sujetos pueden tener una forma avanzada de la enfermedad, en cuyo caso el objetivo del tratamiento puede incluir la mitigación o la reversión de la progresión de la enfermedad y/o la mejora de los efectos secundarios. Los sujetos pueden tener antecedentes de la afección, por los cuales ya han sido tratados, en cuyo caso el objetivo terapéutico normalmente incluirá una disminución o retraso en el riesgo de recurrencia. En algunos ejemplos, los sujetos son pacientes inmunodeficientes, tales como los pacientes infectados por VIH o altamente inmunosuprimidos con neoplasias, donde el aislamiento y la expansión de las células T autólogas es problemático o imposible. En algunos ejemplos, los sujetos han fracasado en el aislamiento de los linfocitos T autólogos infiltrantes del tumor. En algunos ejemplos, los pacientes tienen leucemia aguda y han recaído después de un trasplante de las células hematopoyéticas alogénicas, para quienes el uso de las infusiones de linfocitos de donantes alogénicos (DLI) es problemático. Por lo tanto, los métodos pueden proporcionar una opción adicional para los pacientes que no responden a la DLI o para quienes no está indicado el uso de DLI debido al alto riesgo de la enfermedad de injerto contra huésped.

Por consiguiente, se divulga un método para tratar o prevenir una neoplasia en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de las células T derivadas de las T-iPSC que expresan el CAR de la presente invención. Los ejemplos de las neoplasias que pueden tratarse o prevenirse mediante la administración de las células T de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los cánceres de la sangre (por ejemplo, leucemias, linfomas y mielomas), cáncer de ovario, sarcoma y leucemia mieloide aguda (AML), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de la piel, cáncer de estómago, glioblastoma y cáncer de garganta. En otra modalidad, el antígeno tumoral es uno o más de anhidrasa carbónica IX (CA1X), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, un antígeno de una célula infectada por el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular), glicoproteína 2 epitelial (EGP 2), glicoproteína 40 epitelial (EGP-40), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), receptor cinasa de tirosina erb-B2,3,4, proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor a de folato, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (GD3), Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (HER-2), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), subunidad alfa 2 del receptor de Interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor del dominio de inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), familia A de antígenos de melanoma, 1 (MAGE-AI), Mucina 16 (Muc-16), Mucina 1 (Muc-1), Mesotelina (Ms Ln ), ligandos de NKG2D, antígeno de cáncer de testículo n Y-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de célula madre de la próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glucoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), factor R2 de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R2) o proteína del tumor de Wilms (WT-1).

En otros ejemplos, se divulgan los métodos para tratar a los sujetos con una infección por patógenos (por ejemplo, infección viral, infección bacteriana, infección por hongos, infección por parásitos o infección por protozoos). El método es particularmente útil para potenciar una respuesta inmune en un sujeto inmunodeprimido. Las infecciones virales ejemplares susceptibles al tratamiento con el uso de un método de la invención incluyen, pero no se limitan a, las infecciones con el Citomegalovirus (CMV), Virus de Epstein Barr (EBV), Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) e virus de la influenza. Por consiguiente, se divulga un método para tratar o prevenir una infección por patógenos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de las células T que expresan el CAR de la presente invención.

Se pueden tomar varias etapas para evitar o minimizar los riesgos de las complicaciones inmunológicas en el contexto de una terapia alogénica CAR-T-PSC-T "lista para usar". La generación de las células T "listas para usar" para la administración a múltiples receptores puede lograrse mediante la prevención del alorrechazo de las células T CAR-T-PSC transferidas adoptivamente. Por ejemplo, la alorreactividad de las células T derivadas de T-PSC, que expresan un TCR endógeno (Figura 1A), se puede minimizar o evitar mediante la generación de las PSC a partir de haplotipos comunes del HLA para asegurar su histocompatibilidad con receptores no emparentados compatibles) o haplotipos homocigotos del HLA (Turner y otros Cell Stem Cell 2013 y Stacey y otros Cell Stem Cell 2013) y/o mediante la represión de la expresión del HLA en las células T derivadas de CAR-T-PSC, por ejemplo, al anular el factor de transcripción del HLA y/o la microglobulina b2, por ejemplo, con el uso de nucleasas con dedos de zinc, meganucleasas, TALEN o CRISPR. El rechazo de las células T derivadas de CAR-T-PSC por los linfocitos T del receptor se puede prevenir mediante la modificación genética de las T-PSC para expresar los ligandos para los receptores inmunorreguladores de las células T, incluidos, pero no se limitan a, PD-L1, CD48, TNFRSF14. Además, el rechazo de las células T derivadas de CAR-T-PSC por las células NK del receptor se puede prevenir mediante la modificación genética de las T-PSC para expresar la clase I no clásica, por ejemplo, HLA-G. Adicional o alternativamente, la generación de las células T "listas para usar" para su administración a múltiples receptores se puede lograr mediante la prevención de la enfermedad del injerto contra el huésped (GvHD). Por ejemplo, la prevención de GvHD se puede lograr mediante la selección de un TCR endógeno deseable, por ejemplo, mediante la generación de las T-PSC a partir de las células T específicas por el virus, que, debido a su reconocimiento de un antígeno derivado de un patógeno, es menos probable que causen GvHD. El TCR ya reordenado ya está dirigido contra los antígenos virales con los que se ha infectado una gran población (por ejemplo, EBV, CMV) y, por lo tanto, existe poco o ningún riesgo de reacción de GvHD después de la administración del producto. Ya existen bancos bien caracterizados de las células T específicas por el EBV y CMV, que pueden usarse para la generación de tales PSC. Además, la prevención de GvHD se puede lograr mediante la eliminación de la expresión del TCR endógeno mediante la alteración del gen TRAC, por ejemplo, con el uso de nucleasas con dedos de zinc, meganucleasas, TALEN o CRISPR. Además, la prevención de GvHD se puede lograr mediante la prevención de la expresión superficial del TCR, por ejemplo, mediante la anulación (por ejemplo, mediante nucleasas con dedos de zinc, meganucleasas, TALEN o CRISPR) o desactivando (por ejemplo, con ARNhc) de la expresión del gen CD3. El riesgo de oncogénesis de inserción secundaria a la transferencia de los genes puede reducirse mediante la integración del ADNc del CAR y otros genes, tales como los genes suicidas y los reporteros de imágenes no invasivos en los sitios genómicos seguros. Los genes suicidas adecuados incluyen, pero no se limitan a, timidina cinasa del virus de1Herpes simple (hsv-tk) y gen inducible de suicidio de Caspasa 9 (iCasp-9).

XI. Kits

Se divulgan además los kits para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, infección por un patógeno, trastorno inmunitario o trasplante alogénico. En un ejemplo, el kit incluye una composición terapéutica o profiláctica que contiene una cantidad eficaz de las células T derivadas de las T-PSC que expresan el CAR en forma de dosificación unitaria. En algunos ejemplos, el kit comprende un recipiente estéril que contiene una vacuna terapéutica o profiláctica; tales recipientes pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, cartucheras, blísteres u otras formas de recipientes adecuadas conocidas en la técnica. Dichos recipientes pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, láminas metálicas u otros materiales adecuados para contener medicamentos.

Si se desea, las células T se proporcionan junto con las instrucciones para administrar las células T a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una neoplasia, infección por un patógeno, trastorno inmunitario o trasplante alogénico. Las instrucciones generalmente incluyen información sobre el uso de la composición para el tratamiento o prevención de la neoplasia, infección por un patógeno, trastornos inmunitarios o trasplantes alogénicos. En otras modalidades, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del agente terapéutico; programa de dosificación y administración para el tratamiento o prevención de una neoplasia, infección por un patógeno, trastorno inmunitario o trasplante alogénico o síntomas de los mismos; precauciones; advertencias; indicaciones; contraindicaciones; información de sobredosis; reacciones adversas; farmacología animal; estudios clínicos y/o referencias. Las instrucciones pueden imprimirse directamente en el contenedor (cuando esté presente) o como una etiqueta aplicada al contenedor o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta separada que se suministra en o con el contenedor.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar determinadas modalidades y aspectos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma. En las divulgaciones experimentales que siguen, se aplican las siguientes abreviaturas: N (normal); M (molar); mM (milimolar); pM (micromolar); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); ng (nanogramos); pg (picogramos); L y l (litros); ml (mililitros); pl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); pm (micrómetros); nm (nanómetros); U (unidades); min (minuto); s y seg (segundo); grad (grado); pen (penicilina), estrep (estreptomicina) y °C (grados Centígrados/Celsius).

Ejemplo 1 -- Generación de los linfocitos T humanos dirigidos al tumor a partir de las células madre pluripotentes inducidas para la terapia del cáncer

1. Resumen

Este Ejemplo proporciona los métodos de cultivo celular ejemplares para su uso en la producción de las células ejemplares de la presente invención. Estos sistemas de cultivo celular resultan en una diferenciación cuando se usan las células ES o iPS como las poblaciones de partida. Cuando se usan las células T de sangre periférica como una población de partida, este sistema de cultivo celular adicionalmente desdiferencia las células T en células similares a iPS que luego se diferencian en las células similares a T para su uso con los CAR de la presente invenciones.

El progreso en la terapia adoptiva de células T para el cáncer y las enfermedades infecciosas (1,2) se ve obstaculizado por la falta de linfocitos T humanos específicos por el antígeno y fácilmente disponibles. Las células madre pluripotentes podrían proporcionar una fuente ilimitada de linfocitos T, pero el potencial terapéutico de las células linfoides derivadas de las células madre pluripotentes humanas generadas hasta la fecha sigue siendo incierto (3-6). Como se muestra en este Ejemplo, la célula madre pluripotente inducida (iPSC) se combinó con las tecnologías del receptor de antígeno quimérico (CAR) para generar las células T humanas dirigidas a CD19, un antígeno expresado por las células B malignas, en cultivo de tejido (7, 8). Estas células T derivadas de iPSC que expresan el CAR muestran un fenotipo que se asemeja al de las células T y5 innatas. De forma similar a las células T y5 de sangre periférica transducidas con el CAR, las células T derivadas de iPSC inhiben de forma potente el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto. Este enfoque de generar las células T humanas terapéuticas "en la placa" puede ser útil para la inmunoterapia del cáncer y otras aplicaciones médicas.

2. Introducción

Los enfoques actuales para la terapia adoptiva de células T requieren la generación laboriosa de las líneas de las células T a partir de donantes cuidadosamente seleccionados o la manipulación genética de las células T autólogas de cada paciente individual, lo que dificulta el uso fácil y amplio de las células T con especificidad por el antígeno predeterminada. Tener acceso rápido a un número ilimitado de linfocitos T específicos por el antígeno con características terapéuticas optimizadas haría avanzar enormemente el alcance y la administración de terapias con las células T. Estudios previos apoyan la viabilidad de generar linfocitos T a partir de las células madre embrionarias humanas (ESC) y de las iPSC in vitro, aunque el rendimiento de las células linfoides ha sido bajo y su naturaleza solo está parcialmente definida (3, 4). Más específicamente, la caracterización funcional de las células T derivadas a partir de las ESC y de las iPSC se complica al no conocer su especificidad antigénica y la restricción de1HLA. Por ejemplo, las células T generadas in vitro a partir de las ESC o de las iPSC tienen un repertorio de receptores de las células T (TCR) impredecible porque los reordenamientos del gen del TCR son aleatorios y las células se seleccionan positivamente mediante mecanismos poco claros durante su diferenciación in vitro (3). Esta limitación se puede eludir con el uso de las iPSC que lleven un TCR endógeno reordenado de especificidad antigénica conocida (5, 6). Desafortunadamente, este enfoque requiere una clonación laboriosa de las células T específicas por el antígeno y se limita a los antígenos para los que se pueden detectar las células T específicas del paciente. Además, como los TCR reconocen los antígenos presentados por moléculas específicas del HLA, el uso clínico de las células T que reconocen el antígeno a través de un TCR endógeno está limitado por la necesidad de compatibilizar su especificidad con e1HLA del paciente receptor.

La manipulación genética de los linfocitos T para expresar el CAR ha surgido recientemente como un enfoque prometedor para generar rápidamente las células T dirigidas a los tumores dotadas de propiedades antitumorales mejoradas (8). Por ejemplo, los CAR redirigen la especificidad de las células T de manera independiente de1HLA, al eliminar de este modo la necesidad de considerar la restricción del HLA y al superar algunos mecanismos de escape de tumores (8). Anteriormente se demostró que las células T humanas que expresan un CAR dirigido al antígeno CD19, que se expresa en la gran mayoría de las leucemias y los linfomas, pueden erradicar las neoplasias malignas de las células B en los ratones (9). Es importante destacar que los CAR de segunda generación, que combinan tanto los dominios de señalización de activación como de coestimulación, mejoran la expansión de las células T y la persistencia in vivo (8, 10). Se ha demostrado en ensayos clínicos que las células T modificadas con CAR de segunda generación específicas por el CD19 inducen eficazmente remisiones completas en los pacientes con las leucemias linfoblásticas agudas o crónicas (11-14).

Se planteó la hipótesis de que la manipulación genética de las iPSC con los CAR de segunda generación sería una estrategia eficiente para aprovechar concomitantemente la disponibilidad ilimitada de las iPSC y generar las células T expandibles, funcionales y fenotípicamente definidas que están dirigidas genéticamente a un antígeno tumoral de interés (Figura 1A) (8).

3. Métodos y materiales

3.1. Generación de la 1928z-T-iPSC

Se recogieron linfocitos de sangre periférica (PBL) de un donante voluntario después de obtener el consentimiento informado. Los PBL se activaron con fitohemaglutinina (PHA, 2 |jg/ml) y se transdujeron con dos vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (Sf G) tricistrónicos escindibles, cada uno de los cuales codificaba los factores de reprogramación y un marcador fluorescente diferente (f-Citrine-P2A-cMYC-E2A-SOX2 y fvexGFP-P2A-OCT4-T2A-KLF4) (Figura 4A). La secuencia de Citrine-P2A-cMYC-E2A-SOX2 y vexGFP-P2A-OCT4-T2A-KLF4 se construyeron superponiendo los fragmentos de PCR y se introdujeron en los sitios Ncol y BamHI de un vector retroviral SFG (véase Riviere y otros PNAS 1995 para las composiciones y los métodos de construcción de un vector SFG). Se introdujo un elemento wpre después de los transgenes y antes del 3'LTR. Se introdujo un sitio loxP en el 3'LTR, de modo que el vector pueda escindirse mediante la expresión transitoria de la recombinasa Cre a través de un vector lentiviral deficiente en integrasa (IDLV) (43). Se introdujo un sitio loxP en el 3'LTR, de modo que el vector se escindió mediante la expresión transitoria de la recombinasa Cre a través de un vector lentiviral deficiente en integrasa (IDLV).

Una secuencia de ácido nucleico ejemplar para codificar los factores de reprogramación MYC y SOX-2, en donde un marcador ejemplar es Citrine: SFG-fcMS (f-Citrine-P2A-cMYC-E2A-SOX2) que incluye:

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccac aagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggca agctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatga agcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaac tacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaag gaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcaga agaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagc agaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaaga ccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgt acaagGGATCTGGAGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGT GGAGGAGAATCCCGGCCCTatgcccctcaacgttagcttcaccaacaggaactatgacctcgactac gactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccagcagcagcagcagagcgagctgcag cccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgctgcccaccccgcccctgtcccctagccgccgct ccgggctctgctcgccctcctacgttgcggtcacacccttctcccttcggggagacaacgacggcggtggcgggagc ttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgctgggaggagacatggtgaaccagagtttcatctgcg acccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatccaggactgtatgtggagcggcttctcggccgccgccaa gctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgcgcgcaaagacagcggcagcccgaaccccgcccgcggcca cagcgtctgctccacctccagcttgtacctgcaggatctgagcgccgccgcctcagagtgcatcgacccctcggtgg tcttcccctaccctctcaacgacagcagctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagactccagcgccttctctccgtcctc ggattctctgctctcctcgacggagtcctccccgcagggcagccccgagcccctggtgctccatgaggagacaccgc ccaccaccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgaggaagaaatcgatgttgtttctgtggaaaagagg caggctcctggcaaaaggtcagagtctggatcaccttctgctggaggccacagcaaacctcctcacagcccactgg tcctcaagaggtgccacgtctccacacatcagcacaactacgcagcgcctccctccactcggaaggactatcctgct gccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagcaacaaccgaaaatgcaccagccccag gtcctcggacaccgaggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttggagcgccagaggaggaacgagcta aaacggagcttttttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatgaaaaggcccccaaggtagttatcct taaaaaagccacagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgttgcgg aaacgacgagaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtgcgGGATCTGGACAATG

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Esta secuencia anotada del vector muestra una secuencia de ácido nucleico ejemplar de: subrayado = marcador fluorescente; letras mayúsculas = péptidos 2A; negrita = primer gen reprogramador; cursiva = segundo gen reprogramador.

Una secuencia de ácido nucleico ejemplar para codificar los factores de reprogramación OCT4 y OCT, en donde un marcador ejemplar es vexGFP: Sf G-GOK (f-vexGFP-P2A-OCT4-T2A-KLF4):

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccac aagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggca agctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcagctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatg aagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcagcttcaaggacgacggca actacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaa ggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcacggccgacaagca gaagaacggcatcaaggcgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactacca gcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgttcatccagtccgccctgagcaaa gaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactcacggcatggacgag ctgtacaagGGATCTGGAGC A AC AAACTTCTC ACT ACTC AA AC AAGC AGGTGA CGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTatggcgggacacctggcttcggatttcgccttctcgccccctcc aggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaagg ccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccg ccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttgg agacctctcagcctgagggTgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgc accgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaa agctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggc cgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgca gcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaat cttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagt gagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagca gcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcga ctatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagg gccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaa gcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaacGGATCTGGAGAGGGCAGA GGAAGTCTTCT AAC AT GCGGT GACGT GGAGGAGAATCCCGGCCCCaíggeíg? cagcgacgcgctgctcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaagacactgcgtcaagcag gtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccggccgcccctatg acctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcggcggagccggtgcggcttgcggcggtagcaacctgg cgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctggacctggactttattctctccaattcgctgacccat cctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccctgc cagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggcgtggcgccgggcggcacg ggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccgacggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtg agcccctcgggcggcttcgtggccgagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcagccgca gccgccaggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgagtacggcagc ccgtcggtcatcagcgtcagcaaaggcagccctgacggcagccacccggtggtggtggcgccctacaacggcgggc cgccgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagca atggccaccggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtctt gaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatccccacccggggcccaatt acccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctg catgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtg attacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtgagaa accttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaactgaccaggcactaccgtaaaca cacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaa gaggcatttttaa. [SEQ ID NO: 19]

Las células transducidas se sembraron en las células alimentadoras MEF y se cultivaron en medio de las células T (RPMI-1640 suplementado con FBS al 10 %, 1-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ng/ml). El medio se cambió a medio ESC humano (DMEM/F12 con 20 % de reemplazo de suero eliminado, 1-glutamina 1 mM, aminoácidos no esenciales al 1 %, 2-mercaptoetanol 10 mM y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)) 8 ng/ml al día 5 después de la transducción y luego se refrescó diariamente. Las colonias de T-iPSC aparecieron ~ 22 25 días después de la transducción. El clon T-iPSC-1.10 se transdujo de manera estable con un vector lentiviral que codifica 19-28z, un CAR de segunda generación y un marcador fluorescente (mCherry) ligado mediante un péptido 2A (Figura 6A). La línea 1928z-T-iPSC se estableció después de clasificar por la alta expresión del marcador mCherry. Todas las líneas T-iPSC se mantuvieron en cultivo en las células alimentadoras MEF con medio ESC humano y se pasaron cada 3 a 4 días. Las líneas T-iPSC se ensayaron para determinar la contaminación por micoplasmas cada 2 meses.

3.2. Caracterización y evaluación de la pluripotencia de las T-iPSC.

Para determinar el número de copias de los vectores de reprogramación (VCN), se aisló el ADN genómico aislado de las líneas T-iPSC y se realizó PCR cuantitativo múltiple (qPCR) con el uso de los conjuntos de cebadores y sondas específicos por el vector SFG y para el gen de la albúmina humana (Tabla 1). Para determinar el VCN absoluto, se generó una curva estándar con el uso de diluciones en serie de un plásmido que contenía tanto el vector SFG como los amplicones del gen de la albúmina. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado en un sistema de detección ABI 7500 (Applied Biosystems).

Tabla 1 - Lista de los oligonucleótidos usados para la qPCR del número de copias del vector

Para evaluar la expresión de los genes de pluripotencia endógenos, se aisló el ARNm total de T-iPSC con Trizol (Invitrogen). La transcripción inversa se realizó con Superscript III (Invitrogen) y la qRT-PCR se realizó con los cebadores previamente descritos con el uso de SYBR Green (38). Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado en un ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). La expresión se calculó mediante cuantificación relativa con el uso del método DDCt con GAPDH como control endógeno.

Para el análisis por citometría de flujo, las T-iPSC se tiñeron con los siguientes anticuerpos conjugados con fluoróforo: SSEA-3-AlexaFluor647 (MC-631) comprado en Biolegend, SSEA-4-AlexaFluor647 (MC813-70), Tra-1-81-AlexaFluor647 (TRA-1-81), Tra-1-60-AlexaFluor647 (TRA-1-60) y HLA-ABC-PE (Cat#555553) comprado en BD Biosciences. Todo el análisis por citometría de flujo se realizó en un citómetro LSRII (BD Biosciences) y se analizó con el uso del software FlowJo, Ver. 9.5.2 (TreeStar).

Para los ensayos de formación de teratoma, se suspendieron las T-iPSC indiferenciadas en medio ESC humano que contenía 10 mM del inhibidor Y-27632 de la cinasa asociada a Rho (Rock) (Tocris). Se inyectaron aproximadamente 2 x 106 células por vía subcutánea en ratones NOD-SCID IL2RYcnulos hembra de 6 a 12 semanas de edad, obtenidos a partir de la instalación MSKCC Mouse Genetics Core. Cinco a seis semanas después, los teratomas se extirparon quirúrgicamente y se fijaron en formaldehído al 4 %. Las muestras incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina para el análisis histológico.

Para el cariotipo, se realizó un análisis estándar de bandas G en la instalación central de citogenética molecular de MSKCC. El análisis de cromosomas se realizó en un mínimo de 12 metafases con bandas de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Para la evaluación del silenciamiento de los vectores de reprogramación, se realizó la qRT-PCR con el uso de los cebadores y sondas que detectan los transcritos del derivado de GFP (vexGFP y mCitrine) como se describió anteriormente (38). Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado en un ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). La expresión se calculó mediante cuantificación relativa con el uso del método DDCt con GAPDH como control endógeno.

3.3. Reordenamiento de las cadenas p y y del TCR

El ADN genómico se aisló de las células T-iPSC y 1928z-T-iPSC-T con el uso del kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). La PCR se realizó con el uso de los kits de cebadores multiplex (Invivoscribe Technologies, San Diego, CA) específicos para la mayoría de los reordenamientos clonales de las cadenas y y P del TCR. La electroforesis capilar y el análisis de los fragmentos del producto de PCR se realizaron en las instalaciones centrales de MSKCC Genomic con el uso de un analizador de ADN ABI 3730. Los datos se analizaron con el uso del software Peak Scanner (ABI, Foster City, CA).

3.4. Diferenciación de las células T a partir de las 1928z-T-iPSC y expansión de las células 1928z-T-iPSC-T

Para la diferenciación de las 1928z-T-iPSC a precursores hematopoyéticos, se usó un protocolo de diferenciación in vitro optimizado libre de suero y de alimentadores. Brevemente, las colonias de T-iPSC indiferenciadas se trataron con dispasa (Worthington) durante 6 min y se transfirieron a las placas de baja adherencia para permitir la formación de los cuerpos embrioides (EB) en medio de diferenciación de cuerpos embrioides (StemPro-34, Invitrogen, con 1-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1 %, 2-mercaptoetanol 10 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ng/ml y ácido ascórbico 50 mg/ml). La formación de los cuerpos embrioides se facilitó mediante una incubación durante la noche en presencia de 30 ng/ml de hBMP-4. Los cuerpos embrioides se cultivaron luego con BMP-4 y hbFGF (5 ng/ml) hasta el día 4 para permitir la inducción del mesodermo. A continuación, se logró la especificación y expansión hematopoyéticas en presencia de hVEGF (20 ng/ml) y de un cóctel de citocinas hematopoyéticas (hSCF 100 ng/ml, hFlt3L 20 ng/ml, hIL-3 20 ng/ml y bFGF 5 ng/ml) como se indica. Los cuerpos embrioides al día 10 que contenían las células progenitoras hematopoyéticas se disociaron mediante el tratamiento con Accutase durante 20 min y luego se sembraron las células individuales en monocapas de OP9-DL1 para permitir su diferenciación linfoide T en medio OP9 (a-MEM con FBS al 20 %, 1-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1 %, 2-mercaptoetanol 10 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ng/ml y ácido ascórbico 50 mg/ml) suplementado con SCF 10 ng/ml, IL-7 5 ng/ml y Flt3L 10 ng/ml (39). Para la estimulación y expansión de las células 1928z-T-iPSC-T, usamos las células 3T3 que expresan CD19 previamente descritas como las células presentadoras de antígenos artificiales (3T3-CD19) (9, 40). Las células 1928z-T-iPSC-T generadas se sembraron en una monocapa de 3T3-CD19 irradiada en una relación E/T 3:1 en medio de las células T con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml). Todos los factores recombinantes se compraron en R&D Systems (Minneapolis).

3.5. Análisis por citometría de flujo

Se usaron los siguientes anticuerpos conjugados para el fenotipado y análisis por citometría de flujo: CD34-PECy.7 (8G12), CD43-FITC (1G10), CD7-V450 (MT701), CD8P-PE (2ST8.5H7), CD69-PECy.7 (FN50), CD161-FITC (DX12), CD16-PerCPCy5.5 (3G8), TCRy5-FITC (11F2), CD122-FITC (TU27), CD94-PE (HP-3D9) comprados en BD Biosciences, CD3-PE/FITC/ Pacific Blue (UCTH1), CD5-PE (5D7), CD4-PECy.7 (S3.5), CD8a-PE/FITC (3B5), CD25-APC (3G10), CD62L-PE (Dreg-56), CD27-APC (0323), CD28-PE (10F3), cabra antiratón-AlexaFluor647 comprados en Invitrogen, TCRap-APC (IP26), CD56-PECy.7 (CMSSB) y CD45RA-PerCPCy5.5 (HI100) comprados en eBioscience, NKp44-PE (P44-8), NKp46-PE (9E2), NKG2DAPC (1D11), CD158a/h-PE (HP-MA4), CD158b-PE (OX27) comprados en BioLegend, PLZF-APC (20102) y CCR7-FITC (150503) comprados en R&D. Todos los anticuerpos se usaron en una dilución 1:20. Las células muertas se excluyeron del análisis en todos los experimentos mediante la tinción con DAPI. Todo el análisis por citometría de flujo se realizó en un citómetro LSRII (BD Biosciences) y se analizó en el software FlowJo, Ver. 9.5.2 (TreeStar).

3.6. Ensayos de citotoxicidad y liberación de citocinas

Para medir la producción de citocinas 6 x 104 células 1928z-T-iPSC-T fueron sembradas en las células CD19- o 3T3-CD19 irradiadas en una relación de 3:1 (relación E/T) por pocillo de una placa de 96 pocillos en medio de las células T con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml). Los sobrenadantes del cultivo se recogieron después de 24 horas y la concentración de las citocinas de tipo I y/o tipo II se cuantificó con un kit de ensayo Luminex (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El potencial citotóxico de las células 1928z-Ti-T se evaluó en ensayos estándar de liberación de Cr51. Las células diana se marcaron con Cr51 y se cocultivaron con las células 1928z-T-iPSC-T a relaciones decrecientes de efector/diana (E/T). Después de 4 h de cultivo, se eliminó el sobrenadante y se midió la radiactividad liberada del cromo. La lisis específica se determinó restando la radiactividad de fondo de las células diana no cultivadas con las células T y dividiendo por la radiactividad medida de las células diana completamente lisadas por el tratamiento con Triton X-100 al 0,2 %. Se usó como diana la línea celular de linfoma murino EL4, manipulada para expresar la ovoalbúmina (EL4-OVA) o el CD19 humano (EL4-CD19) (41).

3.7. Procedimiento de micromatriz y análisis de la expresión génica

Los PBL completos se aislaron de dos donantes sanos mediante centrifugación por densidad Ficoll después de obtener el consentimiento informado. Las siguientes subpoblaciones: CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+ CD56+, CD3'CD56+ (NK) y CD3+TCRy6+ (células T y5) se purificaron (98 %) a partir de PBL mediante clasificación celular. El ARNm total se extrajo de las células 1928z-T-iPSC-T a los días 30-35 de la diferenciación y a partir de las subpoblaciones de PBL clasificadas con el uso del reactivo TRIzolTM (Invitrogen Life Technologies, Paisley, Reino Unido). Se realizaron los análisis de micromatrices en la instalación central de MSKCC Genomics con el uso de 75 ng de ARN total como material de partida, amplificado y etiquetado siguiendo el protocolo estándar de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.). A continuación, el ARN complementario marcado se fragmentó y se hibridó con Affymetrix GeneChip arrays HG-U133 plus 2.0.

Para el análisis de la expresión génica se usaron los datos crudos (archivos Affymetrix CEL) producidos con el uso de la plataforma HG U133-Plus 2.0. Para fines de comparación, se descargaron los archivos de los datos crudos adicionales obtenidos en la misma plataforma de la base de datos GEO del repositorio del NCBI: cinco muestras de las células B vírgenes (GSE12195), cinco muestras de las células ap CD4+ (GSE15659), una muestra de las células ap CD8+ en reposo (GSE8059), una muestra de las células NK en reposo (GSE8059), 12 muestras de las células T TCRVy9y5 (GSE27291), antes de la activación y después de la activación con BrHPP/IL-2 (pirofosfato de bromohidrina e IL-2) durante 6 h o 7 d. Se aplicó un procedimiento robusto de promedio de matriz múltiple (RMA) a todos los archivos CEL y se realizaron las comparaciones de diferentes muestras tras la normalización de las puntuaciones z. Los valores de expresión centrados en el gen se obtuvieron con el uso de un archivo CDF basado en la reasignación de las sondas al genoma humano. Los niveles de expresión genética se compararon tanto entre las muestras individuales como al agrupar las muestras del mismo tipo de forma no sesgada. La similitud entre las muestras se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Pearson calculado entre una lista seleccionada de sondas: se seleccionaron 1163 sondas en función de su variabilidad entre las muestras (d.e. > 0,75) y consistencia entre las células 1928z-T-iPSC-T (d.e. < 1). Las correlaciones entre los grupos se calcularon después de promediar los niveles de expresión de la sonda de las muestras individuales del mismo tipo. Con el uso del conjunto de correlaciones calculado, se realizó la agrupación jerárquica de las muestras individuales. La agrupación se realizó con el uso del paquete R hclust con la configuración predeterminada (distancia Euclidiana). En segundo lugar, se realizó una comparación entre las muestras analizadas en un panel seleccionado de genes.

3.8. PCR cuantitativa en tiempo real

El ARNm total se extrajo con el uso del reactivo TRIzolTM (Invitrogen Life Technologies, Paisley, Reino Unido). La transcripción inversa se realizó con el uso de la supermezcla Superscript III First-Strand Synthesis para la qRT-PCR (Invitrogen). La PCR cuantitativa para los genes específicos se realizó con el uso de los respectivos ensayos basados en las sondas TaqMan Gene Expression (Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado en un ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). La expresión se calculó mediante cuantificación relativa con el uso del método DDCt con GAPDH como control endógeno.

3.9. Aislamiento y transducción retroviral de las células T y5 y ap

Se aislaron los PBL del mismo donante que la T-iPSC. Se aislaron células T TCRyS con clasificación magnética de las células (selección negativa) con el uso del kit de aislamiento de las células T TCRy5+ (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se estimularon las células T TCRyS con el ácido zoledrónico 5 mM (Zometa, Novartis) y 1000 UI/ml de IL-2 durante 48 h. La fracción de TCRap de los PBL (obtenida como la fracción positiva después de la selección negativa de las células T TCRyS) se activó con PHA 2 mg/ml durante 48 h. Se ha descrito la síntesis del vector 1928z-IRES-LNGFR que codifica 1928z-CAR (41). Se prepararon los productores retrovirales a partir de los sobrenadantes de las células H29 transfectadas con el plásmido como se describió previamente (41). Se transdujeron las células T y5 y ap activadas con los sobrenadantes retrovirales durante dos días consecutivos mediante infección por centrifugación en placas unidas al vector oncoretroviral recubiertas con retronectina (Takara). Las células se alimentaron cada 3 días con medio de las células T suplementado con 1000 UI/ml o 20 UI/ml de IL-2 para las células T y5 y ap, respectivamente.

3.10. Modelo de tumor in vivo

Ratones macho NOD-SCID IL2RYcnulos de 6 a 12 semanas de edad, obtenido a partir de la instalación MSKCC Mouse Genetics Core, se inocularon i.p. con 105 células de linfoma de Burkitt CD19+ Raji humana que expresan una proteína de fusión de proteína verde fluorescente-luciferasa de luciérnaga (GFP/Luc) como se describió previamente (9,40). Cuatro días después 4 x 105 células 1928z-T-iPSC-T expandidas (estimulación por 1 semana en 3T3-CD19 irradiada) o células T ap o y5 singénicas transducidas con el CAR se inyectaron i.p. junto con IL-2 (50000 U/ratón) e IL-15 (0,25 mg/ratón). Solo se usaron los ratones que tenían la misma carga tumoral (2 x 106 ± 0,5 x 106 fotones/s) antes de la inyección de las células T. Los ratones con menor o mayor carga tumoral fueron excluidos del estudio. Los ratones portadores de los tumores retenidos en el estudio se asignaron al azar a los diferentes grupos de tratamiento (al menos cuatro ratones por grupo). No se usó ningún método de cegamiento. La dosis de las células T se basó en el porcentaje de las células CAR+ medido mediante el análisis citométrico de flujo previo a la inyección. La administración de la IL-2 continuó diariamente y de la IL-15 cada 2 días durante 2 semanas. La carga tumoral se siguió dos veces por semana mediante las imágenes de bioluminiscencia in vivo (IVIS 100 Imaging System). Se usó el software Living Image versión 4.3.1 para adquirir y cuantificar los conjuntos de datos de las imágenes de bioluminiscencia. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de los Animales (IACUC) de MSKCC y siguiendo los lineamientos de los Institutos Nacionales de Salud para el bienestar animal.

3.11. Métodos de estadística

No se usó un tamaño del efecto preespecificado para determinar los tamaños de las muestras. El uso de pruebas estadísticas se eligió de acuerdo con la naturaleza de los datos. Se usó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (prueba U de Mann-Whitney) para comparar la carga tumoral en varios grupos. Se eligió esta prueba por su solidez a la distribución subyacente de las observaciones. La comparación de las curvas de supervivencia se realizó con el uso de la prueba de rango logarítmico. La prueba de razón de verosimilitud parcial de un modelo de regresión de Cox también se usó para comparar la supervivencia entre 1928z-T-iPSCT y los grupos sin tratamiento después de asegurarse de que los datos fueran consistentes con el supuesto de riesgos proporcionales (P = 0,15 con el uso de la prueba de residuos ponderados) (42). Como no pudo ajustar un modelo de Cox para los grupos de tratamiento restantes debido a la escasez de los eventos, los valores de P informados son los proporcionados por la prueba de rango logarítmico. La significación estadística se definió como P < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron en el software Prism (GraphPad) (comparación de la carga tumoral y rango logarítmico) o R (análisis de micromatrices y regresión de riesgos proporcionales de Cox).

4. Resultados

Los clones de iPSC (T-iPSC) se generaron mediante la transducción de los linfocitos T de sangre periférica (PBL) de un voluntario sano con dos vectores retrovirales, cada uno de los cuales codificaba dos de los factores de reprogramación KLF4, SOX2, OCT-4 y C-MYC (Figura 4A) (7). Se analizaron múltiples clones de T-iPSC seleccionados al azar y se confirmó su pluripotencia (Figuras 4B a 4G) y el origen de las células T (Figuras 5A y 5B). El clon T-iPSC-1.10 se transdujo de forma estable con un vector lentiviral bicistrónico que codifica 19-28z (1928z-T-iPSC), un CAR de segunda generación específico por el CD19 y el marcador fluorescente mCherry (Figuras 6A a 6C) (14). Para dirigir la diferenciación de la 1928z-T-iPSC al linaje linfoide T, primero se optimizó un protocolo de diferenciación in vitro libre de suero y de alimentadores para la generación de los precursores hematopoyéticos a través de la formación del cuerpo embrioide (Figura 1B).

Al igual que en informes anteriores (3, 4, 15), se encontró que las células CD34+ de los cuerpos embrioides al día 10 expresaban los niveles más altos de los factores de transcripción claves para la diferenciación linfoide (Figura 7A), que muestran específicamente una mayor expresión de Notch 1 y CD127 (IL7Ra) en el subconjunto CD34+CD43- en comparación con las células CD34'CD43' (Figura 7B). Los cuerpos embrioides al día 10 se disociaron y los precursores hematopoyéticos se transfirieron a las células alimentadoras OP9 (OP9-DL1) que expresan 1 similar a Delta para inducir la diferenciación linfoide T en un sistema de cocultivo establecido en la presencia del factor de las células madre de citocinas (SCF), Flt3L e interleucina (IL)-7 (Figura 1B). La expresión de mCherry se determinó a lo largo del proceso de diferenciación y no se detectó un silenciamiento sustancial de la expresión de mCherry (Figura 1B). Tan temprano como al día 25 de diferenciación, se detectaron las células CD7+CD3+TCRap+ (Tabla 2). Como se muestra en la Tabla 2, la expresión de cada marcador de superficie en las células seleccionadas como se indica se midió mediante citometría de flujo a los días 25 y 30 de la diferenciación y 7 días después de la expansión en las células 3T3-CD19 (expandidas). Estas células albergaron los mismos reordenamientos de las cadenas p y y del TCR que la línea parental T-iPSC-1.10 (Figura 5C). Para el día 30, las células CD3+TCRap+ representaban normalmente ~ 80 % de los cultivos (Fig. 1c y Tabla 1 complementaria) y todas expresaban el CAR específico por el CD19 en su superficie; las células del día 30 se denominan en lo sucesivo como las células 1928z-T-iPSC-T (Figura 1C). Una fracción sustancial expresó CD8a (10,4 ± 3,5 %) y CD56 (20,7 ± 9,5 %), mientras que muy pocas células expresaron cantidades bajas de CD4 y casi ninguna célula expresó CD8p detectable (Figura 1C y Tabla 2). El fenotipado de superficie adicional mostró que la mayoría de las células eran CD5bajas y negativas para CD122 y TCRyS (Figura 1C, Figuras 8A y 8B y Tabla 2).

Tabla 2 - Resumen del análisis de datos por citometría de flujo

continuación

na: no disponible

Aprovechando el CAR específico por el CD19, se evaluó la respuesta funcional de las células 1928z-T-iPSC-T al CD19 unido a células. Las células 1928z-T-iPSC-T recolectadas a los días 30-35 de la diferenciación se cultivaron en las células artificiales presentadoras de antígeno (AAPC) basadas en NIH-3T3 que expresan el antígeno CD19 (3T3-CD19) donde se indica (9). Las células 1928z-T-iPSC-T se unieron rápidamente a las células 3T3-CD19, que forman grupos y que eliminan la monocapa 3T3-CD19 (Figura 1D). No se observó tal adhesión cuando se colocaron las células 1928z-T-iPSC-T en las células 3T3 negativas para CD19 (Figura 1D). La exposición a las células 3T3-CD19 también provocó la expresión en la superficie de las células 1928z-T-iPSC-T de los marcadores de activación de las células T CD25 y CD69 (Figura IE) y la secreción de citocinas de tipo 1, tales como IL-2, factor de necrosis tumoral (TNF)-a e interferón (IFN)-y (Figura IF). Estos resultados muestran que las células 1928z-T-iPSC-T mostraban características canónicas de la función de los linfocitos T y la especificidad por el antígeno CD19.

Para dilucidar mejor el fenotipo de las células 1928z-T-iPSC-T, se llevó a cabo una micromatriz de expresión génica y se comparó el perfil de expresión del ARNm de los días 30-35 de las células 1928z-T-iPSC-T con el de las células B vírgenes, células T CD4, células T CD8, células T CD3+CD56+ y células asesinas naturales (NK) aisladas de sangre periférica. El perfil también se comparó con las células T y5 de sangre periférica recientemente aisladas o activadas in vitro. Agrupación jerárquica con el uso del conjunto de genes con la expresión de ARNm más variable (d.e. > 0,75) mostró que las células 1928z-T-iPSC-T eran distintas de las células B y estaban más estrechamente relacionadas con los otros subconjuntos linfoides T y células NK (Figura 2A). A continuación, se compararon las células 1928z-T-iPSC-T con los subconjuntos de las células linfoides particulares mediante la correlación de los niveles de expresión del ARNm de los genes más variables en el conjunto de datos. Este análisis de correlación por pares indicó que las células 1928z-T-iPSC-T eran más similares a las células T y5 frescas o activadas (durante 7 d) (Figura 9A). Esta correlación se confirmó además al examinar la expresión de los genes clave de la diferenciación linfoide. Las células 1928z-T-iPSC-T expresaron los genes característicos del linaje linfoide T (por ejemplo, GATA3, CD35, CD3e, LEF1, LCK y BCL11B) a niveles comparables a los de las células T y5 de sangre periférica; sin embargo, las células 1928z-T-iPSC-T no expresaron muchos genes característicos del linaje de las células NK (por ejemplo, CD94, CD16 y receptores de tipo inmunoglobulina de las células asesinas) (Figuras 2B, 8 y 9B). Además, se detectó una expresión pronunciada de FASLG, TYROBP, CCL20, TNFSF11 (RAn KL), CXCR6 y RORC, genes que están altamente expresados en células T y5 frente a las células T ap y/o células NK, en las células 1928z-T-iPSC-T (Figuras 2B y 9B) (16). La propiedad de las células inmunes innatas de las células 1928z-T-iPSC-T fue apoyada además por su expresión del factor de transcripción PLZF y el marcador de superficie CD161 (Figura 2C). Curiosamente, las células 1928z-T-iPSC-T también mostraron un alto potencial citotóxico como lo indica la alta expresión de TNFSF10 (TRAIL), GNLY, GZMB, FASL, LTA y una baja expresión de los marcadores coinhibidores o de agotamiento PD1, CTLA-4 y LAG3 (Figura 2B). La mayoría de las células CD3+ tenían un fenotipo de memoria efectora CD45RA+CD62L'CCR7' (TEMRA), aunque un pequeño porcentaje (~ 6 %) tenía un fenotipo CD45RA+CD62L+ más virgen (Figura 2D). No se detectó expresión de los receptores Cd 27 o CD28 en la superficie de las células 1928z-T-iPSC-T (Figura 8C).

Las células T derivadas de iPSC serán terapéuticamente relevantes solo si pueden expandirse mientras conservan las propiedades funcionales. Por lo tanto, las células 1928z-T-iPSC-T se expandieron con el uso de las células 3T3-Cd 19 y se caracterizaron las células T expandidas. A partir de 3 x 1061928z-T-iPSC, ~ 1-2 x 105 células 1928z-T-iPSC-T se obtuvieron al día 30 de la diferenciación. Esas células 1928z-T-iPSC-T se expandieron de 10 a 50 veces (media = 20, d.e. = 15, n = 6) después de una estimulación y hasta ~ 1000 veces después de tres estimulaciones semanales (Figura 2E). Por lo tanto, aunque la eficiencia de diferenciación al día 30 es de alrededor de 0,05, se incrementó a 0,5-1,0 en la semana 1 y hasta 50,0 después de 3 semanas de expansión. Las células expandidas mantuvieron su fenotipo de memoria efectora y regularon a la alta la expresión de los receptores de citotoxicidad natural, tales como NKp44, NKp46 y NKG2D (Figura 2E). Curiosamente, las células expandidas regularon a la alta la expresión de los genes específicos del linaje linfoide T (ZAP70, GATA3, CD35, CD3e, TRGC2) y regularon a la baja la expresión de RORC, lo que indica un cambio hacia un fenotipo de tipo 1 (que expresa Tbet/IFN-Y) (Figuras 2F y 2G). La expresión de la superficie de CD161 también se redujo después de la expansión (Figuras 2D y 2E). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la proliferación mediada por c Ar polarizó las células 1928z-T-iPSC-T hacia una respuesta de tipo 1. Se ha demostrado un cambio de fenotipo similar para las células T y5 T17 que expresan RORC, las células linfoides innatas fetales productoras de IL-17 y las células Th17 transgénicas al TCR murinas, que se polarizan a las células de tipo 1 después de la estimulación con los antígenos o con las citocinas (17-19).

El potencial citotóxico de las células 1928z-T-iPSCT expandidas se evaluó primero con el uso de un ensayo de liberación de Cr51 in vitro con las células de linfoma murino EL4 que expresan CD19 u ovoalbúmina (control negativo inespecífico) como dianas (9). Las células 1928z-T-iPSC-T expandidas mostraron una alta actividad citotóxica específica por el antígeno, incluso a bajas relaciones de efector a diana (E/T) (Figura 3A). Para investigar la actividad antitumoral de las células 1928z-T-iPSC-T in vivo, se estableció un modelo de tumor xenogénico. Se inocularon ratones no obesos NOD-SCID IL2RYcnulos inmunodeficientes combinados con diabetes severa con la línea celular de linfoma de Burkitt humano Raji CD19+ que expresa una proteína de fusión de luciferasa fluorescente. Para la comparación con las células 1928z-T-iPSC-T, se transdujeron los linfocitos de sangre periférica TCR-ap y TCR-y5 a partir del mismo donante que la línea T-iPSC que expresa el CAR 1928z específico por el CD19.

Estas tres poblaciones de las células T mostraron algunas similitudes fenotípicas y algunas diferencias. Cuando las células 1928z-T-iPSC-T se expandieron durante una semana, mostraron un fenotipo TEMRA (CD45RACD27+CD28-CCR7-), similar a las células T 1928z-y5 expandidas. En contraste, una fracción considerable (33 %) de las células T 1928z-ap mostraron un fenotipo CD45RACD27+CD28+CCR7+ indicativo de las células de memoria central (Figura 3B). La expresión del CAR fue mucho menor en las células 1928z-T-iPSC-T (intensidad de fluorescencia media (MFI) = 395) que en las células 1928z-y5 (MFI = 1212) o 1928z-ap (MFI = 2010) (Figura 3B), que puede influir en la actividad terapéutica (20).

Como lo muestran las imágenes bioluminiscentes, la infusión de las células 1928z-T-iPSC-T retrasó la progresión del tumor en un grado similar al inducido por las células 1928z-y5 de sangre periférica (Figuras 3C y 10) y resultó en una ventaja de supervivencia significativa en comparación con los ratones portadores de tumores que no fueron tratados con las células T (rango logarítmico P = 0,042, regresión de riesgos proporcionales de Cox P = 0,036; Figura 3D y 3E). Las imágenes de bioluminiscencia revelaron además que las células T 1928z-T-iPSC-T y 1928z-y5 iniciaron la regresión tumoral más rápidamente que las células 1928z-ap (Figura 3C). Sin embargo, aunque inicialmente fueron más lentos para inducir la regresión del tumor, las células T 1928z-ap finalmente indujeron la regresión completa del tumor (Figura 3C). Estos hallazgos demuestran que las células CAR+ T-iPSC-T pueden lisar a las células tumorales in vitro, provocar fuertes respuestas antitumorales in vivo y proporcionar un beneficio de supervivencia en animales portadores de tumores, en el mismo grado que sus contrapartes naturales más cercanas.

5. Discusión

Las tecnologías iPSC y CAR, combinadas como se muestra aquí, proporcionan potencialmente una fuente ilimitada de linfocitos T dirigidos a un antígeno elegido, independientemente de la restricción de1HLA. En las presentes condiciones, a partir de las T-iPSC que codifican un TCR ap endógeno reordenado, se determinó que las células T generadas tienen las propiedades de las células T y5, aunque expresan su TCR ap endógeno en su superficie (17, 21). Se ha observado una desviación del linaje similar en los ratones que expresan transgenes del TCRa y p, en donde las células T distintas de las células NK de tipo salvaje, las células T NK o las células T a p CD4+ o CD8+ muestran características de las células T y5, incluida la expresión de CD8a y baja expresión de CD5, CD122 y NK1.1 (22-24). Las células T diferenciadas in vitro a partir de los progenitores hematopoyéticos CD34+ humanos manipulados genéticamente para expresar un TCR específico por el antígeno muestran un fenotipo similar a las células NK (25). Juntas, estas observaciones sugieren un posible efecto de expresión prematura del TCRap, que puede sesgar el desarrollo hacia linajes innatos de tipo linfoide. Aunque se ha informado que las células T expandidas derivadas de T-iPSC tienen un fenotipo CD3+CD7+CD5bajoTCRap+CD56+ asociado con la expresión de CD8a, pero no CD8p, no se identificaron como células T similares a y5 (6). Curiosamente, la expresión del TCRap endógeno preordenado se observó al día 15 de diferenciación en las células OP9-DL1 (Tabla 2), antes que en algunos otros informes que describen la diferenciación de las células T a partir de las células T derivadas de ESC o iPSC humanas (3, 4). Es importante destacar que se observó la misma cinética de desarrollo de las células T como en T-iPSC-1.10 en otras dos líneas independientes de T-iPSC que llevan diferentes reordenamientos del TCR (Figuras 5B y 11), pero no en las iPSC derivadas de sangre de cordón umbilical o en las ESC (datos no mostrados). En conjunto, estas observaciones sugieren que la expresión temprana de un TCRap transgénico o endógeno influye en el proceso de la diferenciación de las células T (22-25). Además, algunas características sutiles de nuestras células 1928z-T-iPSC-T, tales como su fenotipo CD8a+CD8p-, expresión de CD161 y baja expresión de CD5, se comparten entre las células T adultas y5 y las células T de tipo innato generadas en el desarrollo fetal (17, 18, 21, 26). Junto con los informes anteriores, estas observaciones sugieren que estas células linfoides pueden originarse a partir de una célula madre hematopoyética intermedia similar a una célula fetal comprometida con una linfopoyesis de tipo innato y que la diferenciación in vitro de las células madre pluripotentes puede estar intrínsecamente sesgada hacia las características embrionarias (4, 27, 28). En particular, el CAR, que apoyó eficazmente la expansión de las células T, no pareció influir en la adquisición del fenotipo y5, ya que las células T-iPSC-1.10 no transducidas con el CAR también produjeron células T similares a y5 que expresan el TCRap (Figura 12). Una comprensión completa de la maduración de los linfocitos T derivados de T-iPSC puede optimizar además su desarrollo y diferenciación, generar diferentes linajes de las células T y dar forma a sus atributos funcionales.

La especificidad tumoral es una de las características esenciales de los linfocitos T usados en la terapia adoptiva de células T. Con el uso del protocolo descrito en este Ejemplo, cualquier especificidad por el antígeno independiente del HLA puede impartirse a cualquier iPSC a través de un CAR apropiado, sin requerir el establecimiento de un clon de las células T específico del paciente (8). Los inventores no estaban al tanto de ningún estudio publicado anteriormente que informara que la modificación genética de las células madre pluripotentes humanas con un receptor para el antígeno es un enfoque eficaz para generar células T con potencial terapéutico. Las células 1928z-T-iPSC-T retrasaron la progresión del tumor in vivo en un grado similar al de las células 1928z-y5-T derivadas de sangre periférica a partir del mismo donante. Las células T y5 tienen algunas propiedades ventajosas, tales como una baja reactividad del injerto contra el huésped y la capacidad de infiltrar a los tumores sólidos (29, 30). Su actividad antitumoral se ha demostrado en varios entornos clínicos, principalmente contra las neoplasias hematológicas (30).

Las células T derivadas de T-iPSC modificadas con el CAR pueden ser especialmente valiosas en las situaciones donde las células T autólogas o alogénicas no están disponibles. Este es, por ejemplo, el caso de los pacientes inmunodeficientes, tales como los pacientes infectados por el VIH o altamente inmunosuprimidos con las neoplasias; en estos escenarios, el aislamiento y la expansión de las células T autólogas es problemático o imposible. Las células CAR-T-iPSC-T también pueden ser útiles en los pacientes en los que el aislamiento de linfocitos T autólogos infiltrantes de tumores ha fallado, al tiempo que proporciona el beneficio adicional de dirigirse a antígenos alternativos reconocidos por los CAR (8, 31). Otros pacientes que podrían beneficiarse de las células CAR-T-iPSC-T incluyen aquellos con leucemia aguda que recaen después de un trasplante de células hematopoyéticas alogénicas y para quienes el uso de las infusiones alogénicas de linfocitos de donantes (DLI) es problemático. La eficacia de DLI en esos pacientes es mínima, pero está cargada de riesgo de la enfermedad del injerto contra el huésped (32). Por lo tanto, las células CAR-T-iPSC-T podrían representar una opción adicional para los pacientes que no responden a la DLI o para quienes no está indicado el uso de DLI debido al alto riesgo de enfermedad de injerto contra huésped.

Se pueden tomar varias medidas para evitar los riesgos de las complicaciones inmunológicas en el contexto de una terapia alogénica CAR-T-iPSC-T lista para usar. La alorreactividad de las células T derivadas de T-iPSC, que expresan un TCR endógeno (Figura 1A), se puede eliminar ya sea al interrumpir el TCR, con el uso de nucleasas específicas del sitio diana después de la diferenciación de las células T o mediante la generación de las T-iPSC a partir células T específicas por el virus, que debido a su reconocimiento de un antígeno derivado de un patógeno, tienen menos probabilidades de causar la enfermedad del injerto contra el huésped (33, 34). El rechazo de las células CAR-iPSC-T (que expresan las moléculas del HLA) se puede minimizar mediante la generación de las iPSC a partir de haplotipos comunes del HLA (para asegurar su histocompatibilidad con receptores no emparentados compatibles) o mediante la represión de la expresión del HLA a través de modificaciones genéticas adicionales (35, 36). Por último, el riesgo de oncogénesis de inserción secundaria a la transferencia de genes puede reducirse mediante la integración del ADNc del CAR y otros genes, tales como los genes suicidas y los reporteros de imágenes no invasivas, en sitios genómicos seguros (37, 38).

En resumen, la combinación de las tecnologías iPSC y CAR como se divulga en la presente invención ofrece una nueva fuente potencial de las células T listas para usar de especificidad antigénica predeterminada. Teniendo en cuenta la versatilidad de las células madre pluripotentes y la manipulación del CAR, este sistema puede facilitar la producción de diferentes subpoblaciones de las células T con modificaciones genéticas adicionales y especificidades adecuadas para una variedad de indicaciones terapéuticas.

Ejemplo 2

Este ejemplo proporciona las composiciones y los métodos ejemplares para manipular y proporcionar los receptores de las células T quiméricos (CAR).

Se proporcionan receptores de antígenos quiméricos (CAR) que combinan, en una única especie quimérica, el dominio intracelular de la cadena CD3.zeta., una región de señalización de una proteína coestimuladora, tal como CD28 y un elemento de unión que interactúa específicamente con un antígeno diana seleccionado. La construcción manipulada puede comprender además las secuencias de ácido nucleico que codifican un marcador fluorescente. Tales como mCherry, eGFP, etc.

Para este ejemplo, se proporcionó un receptor de las células T quimérico que comprende las secuencias de ácido nucleico para codificar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína para el reconocimiento del antígeno CD19 del receptor de superficie celular del linaje de las células B, una molécula coestimuladora de CD28 y mCherry. Dichas secuencias para CD19 y CD28 se proporcionan en la patente de los EE. UU. 7,446,190, los vectores virales y los métodos de uso de los vectores virales para transducir las células y ensayar la función y los fenotipos de las células resultantes.

Específicamente, para construir un CAR específico por el CD19, ScFv, las regiones variables de la cadena pesada (VH) y ligera (VL) se clonaron a partir del ADNc derivado de la línea celular de hibridoma SJ25C1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el uso de los cebadores degenerados descritos por Orlandi (43) y se fusionaron estas regiones codificantes con un fragmento de ADN que codifica una región espaciadora (Gly3Ser) (4). Se ligó un elemento de señalización coestimulador del CD28 humano, que incluye las porciones transmembrana y extracelular (Patente de los EE. UU. 7,446,190: SEQ ID NO: 6) al extremo 3' del ScFv resultante y al dominio citoplásmico del zeta humano. (Patente de los EE. UU. 7,446,190: Se Q ID NO: 3) al extremo 3' de la porción CD28 para formar el gen de fusión 19-28z (también denominado 1928z).

La secuencia de mCherry se ligó con un péptido P2A corriente arriba del gen de fusión 1928z y luego la construcción se ligó en los sitios de restricción AgeI/SalI de un vector lentiviral pLM (Papapetrou y otros PNAS 2009) impulsado por un promotor constitutivo de ubiquitina C (UbC).

La producción del vector lentiviral se realizó mediante cotransfección triple de las células productoras 293T colocadas en placas de cultivo de tejidos de 100 mm recubiertas con poli-L-lisina. Cuando las células tenían una confluencia de ~ 80 %, el medio (DMEM con FBS al 10 % y L-Glut 1 mM) se reemplazó suavemente con 7 ml de medio precalentado y se incubó durante una hora. Se preparó una mezcla de plásmido/CaCl2 añadiendo 10 pg del plásmido del vector lentiviral, 7,5 pg de pCMVVR8.91,2,5 pg de pUCMDG, 50 pl de CaCl22,5 M y WFI hasta un volumen total de 500 pl. Para transfectar, se transfirieron 0,5 ml de la mezcla de plásmido/CaCl2 a un tubo cónico de 50 ml. Mientras se agita en el vórtex a baja velocidad, se añadieron 0,5 ml del tampón HBS 2x gota a gota con el uso de una pipeta P1000. Luego, se añadió 1 ml de la nueva mezcla a la placa de 100 mm de 293T con el uso de una pipeta P1000 gota a gota, esparciendo las gotas uniformemente por toda la superficie de la placa. Las células 293T se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 16 h. Después de 16 h, se aspiró el medio y se reemplazó suavemente con 10 ml de medio precalentado por placa. Las células se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 h. Al día siguiente, se recoge el sobrenadante que contiene el vector y se desechan las placas. El sobrenadante se centrifugó a 1000 g a 4 °C durante 5 min para sedimentar los restos celulares. A continuación, el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 pm, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C.

Ejemplo 3.

Este ejemplo describe las composiciones y los métodos proféticos para proporcionar una célula CAR+ "universal" que se "edita" de modo que no induzca los síntomas del injerto contra el huésped en un sistema o huésped alogénico.

Por lo tanto, en una modalidad, se proporcionan las composiciones y los métodos para anular la expresión de la superficie celular del HLA (clase I) en una célula antes o después de la expresión de un CAR. En modalidades adicionales, se proporcionan las composiciones y los métodos para anular la expresión de la superficie celular de1HLA (clase II) en una célula antes o después de la expresión de un CAR.

en una modalidad, un TCR se silencia o se desactiva. En una modalidad, un ligando coestimulador se silencia o se anula. en una modalidad, se desactiva un gen suicida. en una modalidad, una secuencia para una citocina inducible se transduce en las células CAR+. en una modalidad, una secuencia para un gen de imágenes se transduce en las células CAR+. En algunas modalidades, se coloca un gen heterólogo dentro de un sitio genómico seguro del genoma de una célula. En algunas modalidades, dentro del genoma de una célula CAR+ (Papapetrou, y otros, Nat Biotech (2011)). Dirigirse a este puerto genómico seguro específico se logró mediante la recombinación homóloga con el uso de una nucleasa (por ejemplo, TALEN). La manipulación adicional de la CAR-T-PSC incluye silenciar o anular los genes Rag para evitar el reordenamiento de la cadena TCRa durante la rediferenciación y el riesgo de que aparezcan nuevos pares de TCRap. De esta manera, las células T derivadas de CAR-T-iPSC producidas expresarán un TCR endógeno único, que minimiza por lo tanto el riesgo de alorreactividad. Mediante estas manipulaciones, la presente invención tiene como objetivo proporcionar las células CAR-T-PSC-T con un potencial de aplicación universal para incluir el trasplante alogénico.

Por lo tanto, las composiciones y los métodos como se describen en este documento se usaron para producir las células manipuladas específicas por el antígeno capaces de estimular las funciones efectoras por estimulación con el antígeno. Además, estas células manipuladas superan un obstáculo de rendimiento de otros tipos de diferenciación de las células T in vitro de las células iPS en células efectoras específicas por el antígeno.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula madre pluripotente que comprende un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T.

2. La célula de la reivindicación 1, en donde la célula madre pluripotente se transduce con el ácido nucleico que codifica el CAR.

3. La célula de la reivindicación 1, en donde dicha célula madre pluripotente no expresa un TCR en la superficie celular.

4. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho CAR se une a un antígeno tumoral.

5. La célula de la reivindicación 4, en donde dicho antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en anhidrasa carbónica IX (CA1X), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, un antígeno de una célula infectada por el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de superficie celular), glicoproteína 2 epitelial (EGP 2), glicoproteína 40 epitelial (e Gp -40), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), proteínas receptoras tirosina cinasas erb-B2,3,4, proteína que se une a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor a de folato, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (g D3), Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (HER-2), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), subunidad alfa 2 del receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor del dominio de inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), familia A de antígenos de melanoma, 1 (MAGE-AI), Mucina 16 (Muc-16), Mucina 1 (Muc-1), Mesotelina (m Sl N), ligandos de NKG2D, antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de célula madre de la próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), factor R2 de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R2) y proteína del tumor de Wilms (WT-1).

6. La célula de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el antígeno tumoral es CD19.

7. Un método para producir una célula madre pluripotente (PSC) que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) y que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende,

a) proporcionar,

i) una célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del TCR (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y

ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z y

b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca una T-PSC que comprende el CAR (CAR-T-PSC).

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho vector de expresión del CAR comprende un gen heterólogo que codifica al menos una región de señalización coestimuladora o un ligando coestimulador.

9. El método de la reivindicación 8, en donde

dicha al menos una región de señalización coestimuladora comprende un polipéptido de CD28, un polipéptido de 4-1BB, un polipéptido de OX40 o un polipéptido de ICOS, un polipéptido de PD-1, un polipéptido de CTLA-4, un polipéptido de LAG-3, un polipéptido de 2B4 o un polipéptido de BTLA y dicho ligando coestimulador se selecciona del grupo que consiste en CD80, CD86, CD70, OX40L, 4-1BBL, CD48, TNFRSF14 y PD-L1.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde dicha célula madre pluripotente no expresa el TCR en la superficie celular.

11. El método de la reivindicaciones 7-9, además comprende interrumpir el locus del TCR de la célula madre pluripotente.

12. Un método para producir una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende, a) proporcionar,

i) una célula madre pluripotente que lleva un locus reordenado del receptor de las células T (TCR) (T-PSC), en donde la célula madre pluripotente se deriva de una célula T y

ii) un vector de expresión del CAR que codifica un dominio de unión al antígeno y un polipéptido de CD3Z,

b) transducir dicha T-PSC con dicho vector de expresión del CAR en condiciones tales que se produzca una T-PSC que comprende el CAR (CAR-T-PSC);

c) cultivar dicha CAR-T-PSC en condiciones tales que se produzca una célula T derivada de T-PSC que expresa el CAR (célula T derivada de CAR-T-PSC).

13. El método de la reivindicación 12, en donde dicho c) cultivar dicha CAR-T-PSC en condiciones tales que se produzca una célula T derivada de CAR-T-PSC comprende:

(a) proporcionar,

i) dicha CAR-T-PSC,

ii) un primer medio de cultivo celular para la inducción del mesodermo,

iii) un segundo medio de cultivo celular para la especificación y expansión hematopoyéticas, iii) un tercer medio de cultivo celular para la diferenciación linfoide T y

iv) una línea de células alimentadoras que induce el compromiso linfoide T en las células hematopoyéticas,

(b) incubar dicha CAR-T-PSC con dicho primer medio de cultivo celular durante hasta aproximadamente 4 días en condiciones tales que se produzca una célula del mesodermo,

(c) incubar dicha célula del mesodermo con dicho segundo medio de cultivo celular durante hasta aproximadamente 6 días en condiciones tales que se produzca y expanda una célula hematopoyética, e (d) incubar dicha célula hematopoyética expandida y dicha línea de células alimentadoras con dicho tercer medio de cultivo celular durante al menos aproximadamente 5 días para inducir el compromiso linfoide T en dicha célula hematopoyética expandida para producir una célula T derivada de T-PSC que expresa el CAR.

14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde dicha célula T se dirige específicamente a un antígeno específico y la especificidad por el antígeno de dicha célula T es independiente de1HLA.

15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende la proteína 4 morfogenética ósea (BMP-4) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), dicho segundo medio de cultivo celular comprende el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), bFGF, el factor de las células madre (SCF), el Ligando de Tirosina Cinasa 3 Similar a FMS (Flt3L) y al menos una citocina Th1 y dicho tercer medio de cultivo celular comprende el SCF, al menos una citocina Th1 y Flt3L.

16. El método de la reivindicación 15, en donde dicha al menos una citocina Th1 se selecciona del grupo que consiste en Interleucina-3 (IL-3), IL-15, IL-7, IL-12 e IL-21.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12-16, que comprende además d) exponer dicha célula T derivada de CAR-T-PSC a una célula presentadora de antígenos en condiciones para estimular una actividad de dicha célula T derivada de CAR-T-PSC, en donde dicha actividad se selecciona del grupo que consiste en secreción de citocinas, división celular, citotoxicidad e inhibición citostática del crecimiento celular.

18. El método de la reivindicación 17, en donde

dicha citocina es una citocina Th1 seleccionada del grupo que consiste en IFN-y, IL-2 y TNF-a y dicha citotoxicidad se determina al matar una célula diana que expresa un antígeno que se une a dicho CAR y medir la muerte de las células diana.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en donde dicho vector de expresión del CAR comprende una secuencia de ácido nucleico que está integrada en dicho genoma de la CAR-T-PSC en un sitio genómico seguro.