ES2836258T3 - Construcciones de vectores virales adenoasociados de GLUT1 recombinante y métodos relacionados para restaurar la expresión de GLUT1 - Google Patents

Abstract

Un vector adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de acido nucleico que comprende un transgen que codifica Glut1 operativamente unido a un promotor de la beta-actina de pollo y en donde el rAAV es capaz de cruzar la barrera hematoencefalica (BBB) y en donde el AAV es AAV8 o AAV9.

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de vectores virales adenoasociados de GLUT1 recombinante y métodos relacionados para restaurar la expresión de GLUT 1

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los EE. UU. Ser. No.

62/130,899 presentada el 10 de marzo del 2015.

Listado de las secuencias

La solicitud instantánea contiene un listado de las secuencias que se ha presentado electrónicamente en el formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 4 de marzo del 2016, se denomina 01001-003887-WO0_SL.txt y tiene un tamaño de 189953 bytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las construcciones de los vectores virales adenoasociados (AAV) de Glut1 recombinante y los usos relacionados para restaurar la expresión de Glut1 en los mamíferos deficientes en Glut1. Antecedentes

La glucosa es la fuente principal de energía del cerebro de los mamíferos. El transportador 1 de glucosa (Glut1), también conocido como familia 2 de transportadores de solutos, es el transportador de glucosa predominante expresado en la barrera hematoencefálica (BBB), es responsable de la entrada de la glucosa al cerebro y es el primer miembro identificado de la familia de transportadores de glucosa facilitado (SLC2A). El gen humano SLC2A1 que codifica la proteína Glut1 se ha localizado en el brazo corto del cromosoma 1 (1p34.2) y tiene 35 kb de longitud y contiene 10 exones que codifican una proteína de 492 aminoácidos (SEQ ID NO: 79). La proteína está altamente conservada entre diferentes especies, incluidas las de humanos, ratas, ratones y cerdos. El gen Slc2a1 de ratón que codifica la proteína mGlut1 está localizado en el cromosoma 4 y tiene una estructura génica muy similar al SLC2A1 humano (Mouse Genome Informatics) (la secuencia mGlut1 de 492 aminoácidos es la SEQ ID NO: 78). El ADNc de Slc2a1 de ratón (NM 011400) es > 97 % idéntico al del ADNc de SLC2A1c humano. (Ver: Mueckler M y otros, 1985; Veggiotti, P y otros, 2013; Seidner y otros, 1998).

El síndrome de deficiencia de Glut1 (SD de Glut1, OMIM 606777) es un trastorno neurológico infantil poco común pero debilitante causado por una haploinsuficiencia del gen SLC2A1. El síndrome de deficiencia de Glut1 es un trastorno autosómico dominante. El fenotipo más prominente del paciente incluye convulsiones infantiles, microcefalia adquirida, retraso en el desarrollo e hipoglucorraquia (De Vivo D.C. y otros 1991).

Los tratamientos actuales para la enfermedad incluyen el uso de las dietas cetogénicas, ya que los cuerpos cetónicos forman una fuente alternativa de energía para las neuronas del cerebro. Sin embargo, la dieta implica la ingestión de grandes cantidades de aceites y se informa que solo tiene efectos modestos sobre los síntomas neuroconductuales. Existe una necesidad continua de mejores tratamientos, especialmente para la terapia génica para restaurar la expresión de Glut1 en los pacientes.

El documento US 2012/0232130 A1 está dirigido a los métodos para inhibir la inanición de una célula al mejorar la generación y/o absorción intracelular de la glucosa, piruvato, lactato y/o NADPH. Una estrategia sugerida para suministrar más glucosa a las células del cono es proporcionarles un gen que codifique un transportador de glucosa, tal como glut1. El gen que codifica glut1 se administra con el uso de un vector AAV2/5 o AAV2/8.

Resumen de la invención

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a un vector adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende un transgén que codifica Glut1. En determinadas modalidades, Glut1 comprende la SEC ID NO: 78 o 79. El rAAV comprende además un promotor de la beta-actina de pollo, en donde el rAAV es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB). En determinadas modalidades, el transgén puede expresarse en las células endoteliales que recubren la microvasculatura cerebral. En determinadas modalidades, el promotor de la beta-actina de pollo se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 31, 38, 45, 54, 62 y 70. El rAAV es AAV8 o AAV9. En determinadas modalidades, el rAAV comprende además los elementos de miARN seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 48, 56, 59, 64 y 73. En determinadas modalidades, el rAAV comprende además las repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean los elementos de miARN.

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a una composición que comprende cualquiera de los AAV recombinantes descritos en el presente documento. En determinadas modalidades, la composición comprende además un vehículo farmacéutico.

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a un kit que comprende una carcasa de recipiente que comprende la composición descrita en el presente documento. En determinadas modalidades, el recipiente es una jeringa.

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los vectores AAV recombinantes descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento del síndrome de deficiencia de Glut1 en un sujeto que lo necesite, en donde el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de los vectores AAV recombinantes descritos en el presente documento que es capaz de cruzar la BBB y también es capaz de expresarse en las células endoteliales que revisten la microvasculatura del cerebro.

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los vectores AAV recombinantes descritos en el presente documento para su uso en el alivio de un sujeto de al menos uno de los síntomas asociados con el síndrome de deficiencia de Glut1 seleccionado del grupo que consiste en hipoglucorraquia, microcefalia adquirida, disfunción motora atáxica y distónica, en donde el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de los vectores ^a A^v recombinantes descritos en el presente documento que es capaz de cruzar la BBB y también que es capaz de expresarse en las células endoteliales que recubren la microvasculatura cerebral. En determinados aspectos, las modalidades de la invención se refieren a un uso en el tratamiento de SD de Glut1 en un sujeto caracterizado por el defecto o la haploinsuficiencia de un gen SLC2A1. El uso puede incluir administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante que lleva una secuencia de ácido nucleico (es decir, un transgén) que codifica la proteína Glut1 normal/tipo silvestre, bajo el control de una secuencia promotora que expresa el producto Glut1 en las células deseadas. En determinadas modalidades, la secuencia promotora proporciona la expresión del producto Glut1 en las células BBB. En determinadas modalidades, la expresión se encuentra en las células endoteliales que recubren la microvasculatura del cerebro. En determinadas modalidades, la expresión del gen transgénico proporciona a las células el producto necesario para restaurar o mantener los niveles de Glut1 deseados en el sujeto. En otra modalidad más, la invención proporciona una composición para el tratamiento del SD de Glut1. Tales composiciones pueden formularse con un vehículo y componentes adicionales adecuados para la inyección.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen con más detalle en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-D son mapas de los plásmidos de (diez) construcciones que codifican Glut1. La Figura 1 A muestra dos construcciones de EGFP-2A-Glut1 que llevan los genes indicadores de Glut1 y EGFP, junto con la secuencia codificante de 2A. La Figura 1B muestra dos construcciones de Glut1-2A-EGFP. La Figura 1C muestra dos construcciones de Glut1 nativas. La Figura 1D muestra cuatro construcciones que llevan un sitio de unión de miARN-122 (Mir-122BS) que sirve para desactivar selectivamente la expresión de Glut1 en el tejido hepático. Las Figuras 2A-C son transferencias y gráficos que muestran la expresión de la construcción AAV9-hGlut1-eGFP (SEQ ID NO: 80) y la función Glut1 en un ensayo con las células CHO in vitro. La Figura 2A muestra una transferencia de Western que demuestra la expresión de la construcción AAV9-hGlut1-eGFP. La Figura 2B es un gráfico que muestra una absorción mejorada de la glucosa en las células CHO transfectadas con la construcción AAV9-hGlut1-eGFP; que demuestra su capacidad para desempeñarse en un ensayo funcional. La Figura 2C muestra la fluorescencia de GFP de la construcción después de la transfección en las células CHO.

Las Figuras 3A-B son gráficos que muestran un desempeño motor mejorado después de la reintroducción del gen slc2a1 murino en ratones con el SD de Glut1. La Figura 3A es un gráfico que muestra el desempeño mejorado de la varilla giratoria en los ratones mutantes tratados con AAV9-mGlut1 (SEQ ID NO: 35). La Figura 3B es un gráfico que muestra una escalada mejorada de un poste vertical después de la restauración de mGlut1 en los ratones mutantes tratados.

Las Figuras 4A-B son gráficos que muestran una expresión aumentada de Glut1 específica del tejido en los ratones tratados con AAV9-mGlut1 (SEQ ID NO: 35). La Figura 4A es un gráfico que muestra la expresión relativa del gen slc2a1 en los mutantes tratados y los controles relevantes. La Figura 4B es un gráfico que muestra la expresión de Glut1 como porcentaje de la expresión en los ratones Glut1 /+ de tipo silvestre.

Las Figuras 5A-D son transferencias y gráficos que muestran los niveles aumentados de la proteína Glut1 y glucosa en el LCR en los ratones mutantes tratados con AAV9-mGlut1; que demuestra que la restauración de Glut1 mitiga la hipoglucorraquia en los ratones de modelo con el SD de Glut1. La Figura 5A es una transferencia Western de la proteína Glutl en el tejido cerebral de los ratones mutantes con el SD de Glutl tratados y controles relevantes. La Figura 5B es un gráfico que muestra la cuantificación de los niveles de proteína en los ratones mutantes con el SD de Glut1 tratados y controles. La Figura 5C es un gráfico que muestra las concentraciones de glucosa en sangre y LCR en los ratones tratados con AAV9-mGlut1 (SEQ ID NO: 35) y controles. La Figura 5D es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de glucosa LCR:sangre en los diversos ratones. Nota: N.S. - no significativo. *, P < 0,05, **, P < 0,01, ***, P < 0,001, ANOVA unidireccional, N >8.

Descripción detallada

Las mutaciones en el gen SLC2A1 (también denominado Glutl) dan como resultado el síndrome de deficiencia de Glutl (SD de Glutl), un trastorno del neurodesarrollo poco común pero devastador (De Vivo D.C. et al. 1991). La proteína Glut1 de tipo silvestre se expresa ampliamente. Sin embargo, su sitio de acción celular predominante parecen ser las células endoteliales de los microvasos cerebrales, donde actúa en el transporte facilitado de glucosa a través de la barrera hematoencefálica. Los niveles reducidos o la pérdida de la proteína dan como resultado un fenotipo complejo cuyas características distintivas incluyen la hipoglucorraquia, retraso en el desarrollo y microcefalia adquirida. Los pacientes también presentan un fenotipo motor que es tanto atáxico como distónico. Los ratones haploinsuficientes para el gen slc2a1 presentan muchas de las características de la enfermedad humana. Una desactivación génica homocigótica del gen slc2a1 murino es letal para el embrión. Los modelos animales haploinsuficientes presentan muchos aspectos de la enfermedad humana. La presente invención se refiere al uso de las construcciones AAV9-Glutl para restaurar la expresión de la proteína Glut1 en el cerebro. Se espera que tales métodos y construcciones de AAV9-Glut1 puedan ser tratamientos efectivos para la enfermedad humana. Para facilitar la referencia, las construcciones de los vectores descritas en el presente documento se denominan diversas construcciones de AAV9-Glut1, que indican construcciones de AAV9 que comprenden las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína Glut1 de ratón o humana, entre otros elementos. Como se usa en el presente documento, SLC2A1 se refiere al gen humano, mientras que slc2a1 se refiere al gen de ratón que codifica la proteína Glut1 respectiva.

Definiciones

Para que la invención pueda entenderse más fácilmente, debajo se definen específicamente determinados términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte de en el presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Como se usa en el presente documento, incluidas las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de las palabras, tales como "un", "una" y "el" incluyen sus correspondientes referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

La "activación", "estimulación" y "tratamiento", según se aplique a las células o a los receptores, pueden tener el mismo significado, por ejemplo, activación, estimulación o tratamiento de una célula o receptor con un ligando, a menos que el contexto o explícitamente indique lo contrario. El "ligando" incluye a los ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y compuestos de unión derivados de los anticuerpos. El "ligando" también incluye a las moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos de péptidos de citocinas y miméticos de péptidos de los anticuerpos. La "activación" puede referirse a la activación celular regulada por los mecanismos internos, así como por los factores externos o ambientales. La "respuesta", por ejemplo, de una célula, tejido, órgano u organismo, incluye un cambio en el comportamiento bioquímico o fisiológico, por ejemplo, concentración, densidad, adhesión o migración dentro de un compartimento biológico, tasa de expresión génica o estado de diferenciación, donde el cambio se correlaciona con la activación, estimulación o tratamiento o con los mecanismos internos, tal como la programación genética.

La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula a un ligando o a un receptor, a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración celular; a la actividad antigénica, a la modulación de las actividades de otras moléculas y similares. La "actividad" de una molécula también puede referirse a la actividad para modular o mantener las interacciones de célula a célula, por ejemplo, adhesión o actividad para mantener una estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. La "actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica] /[mg de proteína] o [actividad inmunitaria]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico o similares. La "actividad" puede referirse a la modulación de los componentes del sistema inmunitario innato o adaptativo.

La "administración" y el "tratamiento", como se aplica a un animal, humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refiere al contacto de un agente de diagnóstico, terapéutico, farmacéutico o composición exógena al animal, el ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. La "administración" y el "tratamiento" pueden referirse, por ejemplo, a los métodos terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula incluye el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un fluido, donde el fluido está en contacto con la célula. La "administración" y "tratamiento" también significa los tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por un reactivo, diagnóstico, compuesto de unión o por otra célula. El término "sujeto" incluye cualquier organismo, preferentemente un animal, más preferentemente un mamífero (por ejemplo, rata, ratón, perro, gato, conejo) y más preferentemente un ser humano, incluido un paciente humano.

"Tratar" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de las construcciones de rAAV de la presente invención, interna o externamente a un sujeto o paciente que tiene uno o más síntomas de la enfermedad o se sospecha que tiene una enfermedad o tener un riesgo elevado de adquirir una enfermedad, para la cual el agente tiene actividad terapéutica. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de la enfermedad en el sujeto o la población tratados, ya sea al inducir la regresión o al inhibir la progresión de dicho(s) síntoma(s) en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de la enfermedad en particular (también denominada "la cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar de acuerdo con los factores, tales como el estado de la enfermedad, la edad y el peso del paciente y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el sujeto si el síntoma de la enfermedad se ha aliviado se puede evaluar mediante cualquier medición clínica que use normalmente por los médicos u otros proveedores expertos de atención médica para evaluar la gravedad o el estado de progresión de ese síntoma. Si bien una modalidad de la presente invención (por ejemplo, un método de tratamiento o un artículo de fabricación) puede no ser eficaz para aliviar lo(s) síntoma(s) de la enfermedad diana en todos los sujetos, debería aliviar lo(s) síntoma(s) de la enfermedad diana en un número estadísticamente significativo de sujetos según lo determinado por cualquier prueba estadística conocida en la técnica, como la prueba t de Student, la prueba chi2, la prueba U de acuerdo con Mann y Whitney, la prueba Kruskal-Wallis (prueba H), prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

El "tratamiento", como se aplica a un ser humano, veterinario o sujeto de investigación, se refiere al tratamiento terapéutico, a las medidas profilácticas o preventivas, a las aplicaciones de investigación y diagnóstico. El "tratamiento", como se aplica a un ser humano, veterinario o sujeto de investigación o célula, tejido u órgano, incluye la transfección de cualquiera de las construcciones de rAAV o los métodos relacionados de la presente invención como se aplican a un sujeto humano o animal, una célula, tejido, compartimento o fluido fisiológicos.

La "molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido en donde el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. Para los fines de esta divulgación, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no incluye a los cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que "comprenden" las secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, a las secuencias codificantes de hasta diez o incluso hasta veinte o más de otras proteínas o porciones o fragmentos de las mismas o pueden incluir a las secuencias reguladoras unidas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico enumeradas y/o puede incluir a las secuencias de los vectores.

La frase "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria sujeto y los cultivos derivados de ella sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que no toda la progenie tendrá un contenido de ADN exactamente idéntico, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la seleccionada en la célula transformada originalmente. Donde se pretendan designaciones distintas, quedará claro por el contexto.

AAV recombinantes

En algunos aspectos, la invención proporciona AAV aislados. Como se usa en el presente documento con respecto a los AAV, el término "aislado" se refiere a un AAV que ha sido aislado de su entorno natural (por ejemplo, de una célula huésped, tejido o sujeto) o producido artificialmente. Los AAV aislados pueden producirse con el uso de los métodos recombinantes. Tales AAV se denominan en el presente documento como "a Av recombinantes". Los AAV recombinantes (rAAV) tienen preferentemente capacidades de direccionamiento específicas de tejido, de manera que un transgén del rAAV se administrará específicamente a uno o más tejidos predeterminados. La cápside de AAV es un elemento importante para determinar estas capacidades de direccionamiento específicas del tejido. Por lo tanto, se puede seleccionar un rAAV que tenga una cápside apropiada para el tejido al que se dirige. En algunas modalidades, el rAAV comprende las secuencias (tales como la SEQ ID NO: 96) que codifican la cápside AAV9 que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica como la SEQ ID NO: 97 o una proteína que tiene una homología sustancial con la misma.

Para dirigirse al tejido deseado en el contexto del tratamiento del SD de Glut1, un rAAV preferido es una combinación de la cápside de AAV9 y la estructura principal de AAV2, lo que da como resultado los diversos rAAV descritos en el presente documento (ver la Tabla 1 y el listado de las secuencias).

Se han descrito los métodos para obtener los AAV recombinantes que tienen una proteína de la cápside deseada (ver, por ejemplo, el documento US 2003/0138772). Se han descrito varias proteínas diferentes de la cápside de AAV, por ejemplo, las divulgadas en G. Gao, y otros, J. Virol, 78(12): 6381-6388 (junio del 2004); G. Gao y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (13 de mayo de 2003); US 2003-0138772, US 2007/0036760, US 2009/0197338. Para el empaquetado deseado de las construcciones y los métodos actualmente descritos, se prefieren el vector y la cápside de AAV9. Sin embargo, se observa que otros AAV adecuados, tales como rAAVrh.8 y rAAVrh.10 u otros vectores similares pueden adaptarse para su uso en la presente invención como se define en las reivindicaciones. Normalmente, los métodos implican cultivar una célula huésped que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV o un fragmento de la misma; un gen rep funcional; un vector AAV recombinante compuesto de las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén y suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del vector de AAV recombinante en las proteínas de la cápside de AAV.

Los componentes por cultivar en la célula huésped para empaquetar un vector rAAV en una cápside de AAV pueden proporcionarse a la célula huésped en trans. Alternativamente, uno o más de los componentes requeridos (por ejemplo, vector AAV recombinante, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden ser proporcionados por una célula huésped estable que ha sido manipulada para contener uno o más de los componentes requeridos con el uso de los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Más adecuadamente, tal célula huésped estable contendrá el componente o los componentes requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el o los componente(s) necesario(s) puede(n) estar bajo el control de un promotor constitutivo. En otra alternativa más, una célula huésped estable seleccionada puede contener el o los componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula huésped estable que se deriva de las células 293 (que contienen las funciones auxiliares de E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contienen las proteínas rep y/o cap bajo el control de los promotores inducibles.

El vector AAV recombinante, las secuencias rep, las secuencias cap y las funciones auxiliares para producir el rAAV pueden administrarse a la célula huésped de empaquetamiento con el uso de cualquier elemento genético apropiado (vector). El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluidos los descritos en el presente documento. Ver, por ejemplo, K. Fisher y otros, J. Virol., 70:520-532 (1993) y la patente de los EE. UU. No. 5,478,745.

En algunas modalidades, los AAV recombinantes pueden producirse con el uso del método de triple transfección (por ejemplo, como se describe en detalle en la Patente de los EE. UU. No. 6,001,650). Normalmente, los AAV recombinantes se producen mediante la transfección de una célula huésped con un vector AAV recombinante (que comprende un transgén) para empaquetarlo en las partículas de AAV, un vector de función auxiliar de AAV y un vector de función accesoria. Un vector de función auxiliar de AAV codifica las secuencias de la "función auxiliar de AAV" (es decir, rep y cap), que funcionan en trans para la replicación y encapsidación productiva de AAV. Preferentemente, el vector de función auxiliar de AAV soporta la producción eficiente del vector AAV sin generar ningún virión de AAV de tipo silvestre detectable (es decir, viriones de AAV que contienen los genes rep y cap funcionales). Los ejemplos no limitantes de los vectores adecuados para su uso con la presente invención incluyen pHLP19, descrito en la patente de los EE. UU. No. 6,001,650 y el vector pRep6cap6, descrito en la patente de los EE. UU. No. 6,156,303. El vector de función accesoria codifica las secuencias de nucleótidos para las funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las que AAV depende para la replicación (es decir, "funciones accesorias"). Las funciones accesorias incluyen aquellas funciones requeridas para la replicación de AAV, que incluyen, sin limitación, los restos implicados en la activación de la transcripción del gen de AAV, corte y empalme del ARNm de AAV de etapa específica, replicación del ADN de AAV, síntesis de los productos de la expresión cap y ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones accesorias de base viral se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos, tales como adenovirus, herpesvirus (distintos del virus del herpes simple tipo 1) y virus vaccinia.

Con respecto a las células huésped transfectadas, el término "transfección" se usa para referirse a la captación del ADN extraño por una célula y una célula ha sido "transfectada" cuando se ha introducido un ADN exógeno dentro de la membrana celular. En general, se conocen en la técnica varias técnicas de transfección. Ver, por ejemplo, Graham y otros (1973) Virology, 52:456, Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis y otros (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier y Chu y otros (1981) Gene 13:197. Dichas técnicas pueden usarse para introducir uno o más ácidos nucleicos exógenos, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácido nucleico, en las células huésped adecuadas.

Una "célula huésped" se refiere a cualquier célula que alberga o es capaz de albergar, una sustancia de interés. A menudo, una célula huésped es una célula de mamífero. Puede usarse una célula huésped como receptora de una construcción auxiliar de AAV, un plásmido con minigén de AAV, un vector de función accesoria u otro ADN de transferencia asociado con la producción de los AAV recombinantes. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por lo tanto, una "célula huésped", como se usa en el presente documento, puede referirse a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total como el parental original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

Con respecto a las células, el término "aislado" se refiere a una célula que ha sido aislada de su entorno natural (por ejemplo, de un tejido o sujeto). El término "línea celular" se refiere a una población de células capaces de tener un crecimiento y división continuos o prolongados in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una única célula progenitora. Se sabe además en la técnica que pueden producirse cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de tales poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular mencionada pueden no ser exactamente idénticas a las células o cultivos ancestrales y la línea celular mencionada incluye tales variantes. Como se usa en el presente documento, el término "célula recombinante" se refiere a una célula en donde se ha introducido un segmento de ADN exógeno, tal como un segmento de ADN que conduce a la transcripción de un polipéptido biológicamente activo o la producción de un ácido nucleico biológicamente activo, tal como un ARN.

El término "vector" incluye cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, cromosoma artificial, virus, virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir las secuencias de los genes entre las células. Por lo tanto, el término incluye los vehículos de clonación y expresión, así como los vectores virales. En algunas modalidades, se contempla que los vectores útiles sean aquellos vectores en los que el segmento de ácido nucleico que se va a transcribir se coloca bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen. Las frases "posicionado operativamente", "unido operativamente", "bajo control" o "bajo control transcripcional" significan que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gen. El término "vector de expresión o construcción" significa cualquier tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico en donde parte o toda la secuencia que codifica el ácido nucleico es capaz de transcribirse. En algunas modalidades, la expresión incluye la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, para generar un producto polipeptídico biológicamente activo o a Rn inhibidor (por ejemplo, ARNhp, miARN) a partir de un gen transcrito.

Vectores AAV recombinantes

Los "vectores AAV recombinantes (rAAV)" descritos en el presente documento se componen normalmente de, como mínimo, un transgén (por ejemplo, que codifica Glut1) y sus secuencias reguladoras y las repeticiones terminales invertidas (ITR) 5' y 3' de AAV. Es este vector AAV recombinante el que se empaqueta en una proteína de la cápside y se administra a una célula diana seleccionada. En algunas modalidades, el transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga a las secuencias del vector, que codifica un polipéptido, proteína, molécula de ARN funcional (por ejemplo, miARN, inhibidor de miARN) u otro producto génico de interés (por ejemplo, Glut1). La secuencia codificante de ácido nucleico está unida operativamente a los componentes reguladores de una manera que permite la transcripción, traducción y/o expresión de un transgén en una célula de un tejido diana.

Las secuencias AAV del vector pueden comprender las secuencias repetidas terminales invertidas 5' y 3' que actúan en cis (ver, por ejemplo, B. J. Carter, en "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, págs. 155 168 (1990)). Las secuencias de ITR tienen normalmente una longitud de aproximadamente 145 pb. Preferentemente, sustancialmente todas las secuencias que codifican las ITR se usan en la molécula, aunque es permisible cierto grado de modificación menor de estas secuencias. (Ver, por ejemplo, los textos, tales como Sambrook y otros, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989) y K. Fisher y otros, J. Virol., 70:520532 (1996)). Un ejemplo de una molécula de este tipo es un plásmido "que actúa en cis" que contiene el transgén, en donde la secuencia del transgén seleccionada y los elementos reguladores asociados están flanqueados por las secuencias de ITR 5' y 3' de AAV. Las secuencias ITR de AAV pueden obtenerse de cualquier AAV conocido, incluidos los tipos de AAV de mamíferos identificados actualmente.

Además de los elementos identificados anteriormente para los vectores AAV recombinantes, el vector también puede incluir los elementos de control convencionales que están unidos operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector plasmídico o infectada con el virus producido por la invención. Como se usa en el presente documento, las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. Las secuencias de control de la expresión incluyen las secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; las señales eficientes de procesamiento del ARN, tales como las señales de corte y empalme y poliadenilación (poliA); las secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; las secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); las secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas y cuando se desee, las secuencias que potencian la secreción del producto codificado. En la técnica se conocen y pueden utilizarse un gran número de las secuencias de control de la expresión, que incluyen los promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos del tejido.

Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia codificante) y las secuencias reguladoras están unidas operativamente cuando están unidas covalentemente de tal manera que colocan la expresión o transcripción de la secuencia de ácido nucleico bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias de ácido nucleico se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de a Dn están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5' da como resultado en la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN (1) no da como resultado la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o (3) interfiere con la capacidad del correspondiente transcrito de ARN para traducirlo en una proteína. Por lo tanto, una región promotora estaría unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de manera que la transcripción resultante pudiera traducirse en la proteína o polipéptido deseado. De forma similar, dos o más regiones codificantes están unidas operativamente cuando están unidas de tal manera que su transcripción a partir de un promotor común da como resultado en la expresión de dos o más proteínas que se han traducido en marco. En algunas modalidades, las secuencias codificantes unidas operativamente producen una proteína de fusión. En algunas modalidades, las secuencias codificantes unidas operativamente producen un ARN funcional (por ejemplo, ARNhp, miARN).

Para los ácidos nucleicos que codifican proteínas, generalmente se inserta una secuencia de poliadenilación después de las secuencias transgénicas y antes de la secuencia ITR 3' de AAV. Una construcción de rAAV útil en la presente invención también puede contener un intrón, ubicado deseablemente entre la secuencia promotora/potenciadora y el transgén. Una posible secuencia de intrón se deriva de SV-40 y se denomina la secuencia de intrón T de SV-40. Otro elemento del vector que puede usarse es un sitio de entrada interno de ribosoma (IRES). Se usa una secuencia IRES para producir más de un polipéptido a partir de una transcripción de un solo gen. Se usaría una secuencia IRES para producir una proteína que contenga más de una cadena polipeptídica. La selección de estos y otros elementos vectoriales comunes son convencionales y muchas de estas secuencias están disponibles [ver, por ejemplo, Sambrook y otros y las referencias citadas en el mismo en, por ejemplo, las páginas 3.183.26 y 16.1716.27 y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989]. En algunas circunstancias, una secuencia 2A del virus de la fiebre aftosa puede incluirse en una poliproteína; este es un péptido pequeño (de aproximadamente 18 aminoácidos de longitud) que se ha demostrado que media en la escisión de las poliproteínas (Ryan, M D y otros, EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M y otros, J Virology, noviembre de 1996; pág. 8124-8127; Furler, S y otros, Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; y Halpin, C y otros, The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). La actividad de escisión de la secuencia 2A se ha demostrado previamente en los sistemas artificiales que incluyen los plásmidos y los vectores de terapia génica (AAV y retrovirus) (Ryan, M D y otros, EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M y otros, J Virology, noviembre de 1996; pág. 8124-8127; Furler, S y otros, Gene Therapy, 2001; 8: 864-873 y Halpin, C y otros, The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P y otros, Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P y otros, Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931 y Klump, H y otros, Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).

La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica en las células huésped puede variar entre las especies, tejidos o tipos de células, pero en general incluirán, según sea necesario, las secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, una secuencia de capucha, una secuencia CAAT, elementos potenciadores y similares. Especialmente, tales secuencias reguladoras no transcritas en 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido operativamente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir las secuencias potenciadoras o las secuencias activadoras corriente arriba, según se desee. Los vectores pueden incluir opcionalmente secuencias líder o señal en 5'.

Los ejemplos de los promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retroviral (opcionalmente con el potenciador del RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador del CMV) [ver, por ejemplo, Boshart y otros, Cell, 41: 521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de la dihidrofolato reductasa, el promotor de la 13-actina, el promotor de la fosfoglicerol cinasa (PGK) y el promotor de EFla [Invitrogen].

Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y pueden regularse mediante compuestos suministrados exógenamente, factores ambientales, tal como la temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o solo en las células en replicación. Los promotores y los sistemas inducibles están disponibles en una variedad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Los ejemplos de los promotores inducibles regulados por los promotores suministrados exógenamente incluyen el promotor de la metalotioneína de oveja (MT) inducible por zinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa T7 (documento WO 98/10088); el promotor de insectos ecdisona (No y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), el sistema inducible por tetraciclina (Gossen y otros, Science, 268:1766-1769 (1995), ver también Harvey y otros, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), el sistema inducible por RU486 (Wang y otros, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) y Wang y otros, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) y el sistema inducible por rapamicina (Magari y otros, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Otros tipos más de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o sólo en las células en replicación.

En otra divulgación, se usará el promotor nativo o un fragmento del mismo para el transgén. El promotor nativo puede ser preferido cuando se desea que la expresión del transgén imite la expresión nativa. El promotor nativo puede usarse cuando la expresión del transgén debe regularse temporalmente o durante el desarrollo o de una manera específica de tejido o en respuesta a los estímulos transcripcionales específicos. En una modalidad adicional, también se pueden usar otros elementos nativos de control de la expresión, tales como los elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak para imitar la expresión nativa.

En algunas divulgaciones, las secuencias reguladoras imparten capacidades de expresión génica específicas del tejido. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas del tejido se unen a los factores de transcripción específicos del tejido que inducen la transcripción de una manera específica del tejido. Tales secuencias reguladoras específicas del tejido (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) son bien conocidas en la técnica. Las secuencias reguladoras específicas del tejido ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los siguientes promotores específicos del tejido: promotor neuronal, tal como la enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen y otros, Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), promotor del gen de la cadena ligera del neurofilamento (Piccioli y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. IDSA, 88:5611-5 (1991)) y el promotor del gen vgf específico de la neurona (Piccioli y otros, Neuron, 15:373-84 (1995)). En algunas divulgaciones, el promotor específico del tejido es un promotor de un gen seleccionado de: núcleos neuronales (NeuN), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), poliposis coli adenomatosa (APC) y molécula 1 adaptadora de unión a calcio ionizado (Iba-1). De acuerdo con la invención, el promotor es un promotor de la beta-actina de pollo.

En algunas modalidades, se incorporan uno o más sitios de unión para uno o más de los miARN en un transgén de un vector rAAV, para inhibir la expresión del transgén en uno o más tejidos de un sujeto que alberga los transgenes, por ejemplo, los tejidos que no son del SNC. El experto en la materia apreciará que se pueden seleccionar los sitios de unión para controlar la expresión de un transgén de una manera específica del tejido. Por ejemplo, la expresión de un transgén en el hígado puede inhibirse mediante la incorporación de un sitio de unión para miR-122 de manera que el ARNm expresado a partir del transgén se una y sea inhibido por miR-122 en el hígado. La expresión de un transgén en el corazón se puede inhibir mediante la incorporación de un sitio de unión para miR-133a o miR-1, de modo que el ARNm expresado a partir del transgén se una y sea inhibido por miR-133a o miR-1 en el corazón. Los sitios diana del miARN en el ARNm pueden estar en la UTR 5', la UTR 3' o en la región codificante. Normalmente, el sitio diana está en la UTR 3' del ARNm. Además, el transgén puede diseñarse de manera que múltiples miARN regulen el ARNm mediante el reconocimiento del mismo o múltiples sitios. La presencia de múltiples sitios de unión del miARN puede resultar en la acción cooperativa de múltiples RISC y proporcionar una inhibición de la expresión altamente eficiente. La secuencia del sitio diana puede comprender un total de 5-100, 10-60 o más nucleótidos. La secuencia del sitio diana puede comprender al menos 5 nucleótidos de la secuencia de un sitio de unión al gen diana.

Secuencias que codifican al transgén

La composición de la secuencia transgénica de un vector rAAV dependerá del uso que se le dé al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia transgénica incluye una secuencia indicadora, que tras la expresión produce una señal detectable. De acuerdo con la invención, el transgén codifica una proteína Glut1 terapéutica o un ARN funcional terapéutico. En otro ejemplo, el transgén codifica una proteína o un ARN funcional que se pretende usar con fines de investigación, por ejemplo, para crear un modelo animal transgénico somático que alberga el transgén, por ejemplo, para estudiar la función del producto transgénico. En otro ejemplo, el transgén codifica una proteína o un ^a Rⁿ funcional que está destinado a ser utilizado para crear un modelo animal de la enfermedad. Las secuencias codificantes apropiadas del transgén serán evidentes para el experto en la técnica.

En algunos aspectos, la invención proporciona los vectores rAAV para su uso en los métodos de prevención o tratamiento de un defecto del gen SLC2A1 (por ejemplo, los defectos hereditarios del gen, las alteraciones somáticas del gen) en un mamífero, tal como por ejemplo, un defecto del gen que da como resultado en una deficiencia del polipéptido Glut1 en un sujeto y particularmente para tratar o reducir la gravedad o extensión de la deficiencia en un sujeto que manifiesta una deficiencia de Glut1. En algunas modalidades, los métodos implican la administración de un vector rAAV que codifica uno o más péptidos terapéuticos, polipéptidos, ARNhp, microARN, nucleótidos antisentido, etc. en un vehículo farmacéuticamente aceptable para el sujeto en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para tratar el trastorno de Glut1 en el sujeto que tiene o se sospecha que tiene dicho trastorno.

Administración del AAV recombinante

Los rAAVS se administran en las cantidades suficientes para transfectar las células de un tejido deseado y para proporcionar los niveles suficientes de la transferencia y expresión génica sin los efectos adversos indebidos. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, la administración directa al tejido seleccionado (por ejemplo, administración intracerebral, administración intratecal), intravenosa, oral, inhalación (incluida la administración intranasal e intratraqueal), intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intratumoral y otras vías parentales de administración. Las rutas de administración se pueden combinar, si se desea.

La administración de determinados rAAV a un sujeto puede ser, por ejemplo, mediante la administración en el torrente sanguíneo del sujeto. La administración en el torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria o cualquier otro conducto vascular. Además, en determinados casos, puede ser deseable administrar los rAAV al tejido cerebral, meninges, células neuronales, células gliales, astrocitos, oligodendrocitos, líquido cefalorraquídeo (LCR), espacios intersticiales y similares. En algunas modalidades, los AAV recombinantes pueden administrarse directamente a la médula espinal o al cerebro mediante la inyección en la región ventricular, así como en el cuerpo estriado (por ejemplo, el núcleo caudado o putamen del cuerpo estriado) y la unión neuromuscular o lóbulo cerebeloso, con una aguja, catéter o dispositivo relacionado, con el uso de las técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la técnica, tal como por inyección estereotáctica (ver, por ejemplo, Stein y otros, J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson y otros, PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson y otros, Nat. Genet. 3:219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000). En determinadas circunstancias, será deseable administrar las construcciones terapéuticas basadas en rAAV en las composiciones farmacéuticas adecuadamente formuladas divulgadas en el presente documento ya sea por vía subcutánea, intrapancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intracerebral, intratecal, intracerebral, oral, intraperitoneal o por inhalación. En algunas modalidades, las modalidades de administración descritas en la patente de los EE. UU. No. 5,543,158; 5,641,515 y 5,399,363 pueden usarse para administrar los rAAV.

Composiciones de AAV recombinantes

Los rAAV se pueden administrar a un sujeto en las composiciones de acuerdo con cualquier método apropiado conocido en la técnica. El rAAV, preferentemente suspendido en un vehículo fisiológicamente compatible (por ejemplo, en una composición), puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un ser humano, ratón, rata, gato, perro, oveja, conejo, caballo, vaca, cabra, cerdo, conejillo de indias, hámster, pollo, pavo o un primate no humano (por ejemplo, macaco). En determinadas modalidades, las composiciones pueden comprender un rAAV solo o en combinación con uno o más virus diferentes (por ejemplo, un segundo rAAV que codifica uno o más transgenes diferentes).

Un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente los vehículos adecuados en vista de la indicación a la que se dirige el rAAV. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye una solución salina, que puede formularse con una variedad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros vehículos ejemplares incluyen una solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del vehículo no es una limitación de la presente invención.

Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del rAAV y el o (los) vehículo(s), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizadores químicos. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen el clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen la gelatina y albúmina.

La dosis de los viriones de rAAV requerida para lograr un efecto deseado o "efecto terapéutico", por ejemplo, las unidades de dosis en los genomas del vector/por kilogramo de peso corporal (vg/kg), variará en base a varios factores que incluyen, pero no se limitan a: la vía de administración del rAAV, el nivel de expresión del gen o ARN requerido para lograr un efecto terapéutico, la enfermedad o trastorno específico que se está tratando y la estabilidad del gen o producto de ARN. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un intervalo de dosis del virión de rAAV para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno particular en base a los factores mencionados anteriormente, así como en otros factores que son bien conocidos en la técnica. Una cantidad eficaz del rAAV está generalmente en el intervalo de aproximadamente 10 |_il a aproximadamente 100 ml de una solución que contiene de aproximadamente 109 a 1016 copias del genoma por sujeto. Pueden utilizarse otros volúmenes de la solución. El volumen usado dependerá normalmente, entre otras cosas, del tamaño del sujeto, la dosis del rAAV y la vía de administración. Por ejemplo, para la administración intratecal o intracerebral se puede usar un volumen en el intervalo de 1 |_il a 10 |_il o de 10 |_il a 100 |_il. Para la administración intravenosa, se puede usar un volumen en el intervalo de 10 |_il a 100 |_il, 100 |_il a 1 ml, 1 ml a 10 ml o más. En algunos casos, es apropiada una dosis entre aproximadamente 1010 y 1012 copias del genoma de rAAV por sujeto. En determinadas modalidades, 1012 copias del genoma de rAAV por sujeto son eficaces para dirigirse a los tejidos del SNC. En algunas modalidades, el rAAV se administra a una dosis de 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 o 1015 copias del genoma por sujeto. En algunas modalidades, el rAAV se administra a una dosis de 1010, 1011, 1012, 1013 o 1014 copias del genoma por kg.

En algunas modalidades, las composiciones de rAAV se formulan para reducir la agregación de las partículas de AAV en la composición, particularmente cuando están presentes altas concentraciones de rAAV (por ejemplo, aproximadamente 1013 GC/ml o más). Los métodos para reducir la agregación de los rAAV son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la adición de tensioactivos, ajuste del pll, ajuste de la concentración de sal, etc. (Ver, por ejemplo, Wright F R, y otros, Molecular Therapy (2005) 12, 171-178.)

Los expertos en la técnica conocen bien la formulación de los excipientes y soluciones del vehículo farmacéuticamente aceptables, al igual que el desarrollo de los regímenes de tratamiento y dosificación adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de regímenes de tratamiento. Normalmente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente 0,1 % del ingrediente activo o más, aunque el porcentaje del o los ingrediente(s) activo(s) puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 1 o 2 % y aproximadamente 70 % o 80 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de ingrediente activo en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtenga una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Los factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, vida media biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán contempladas por un experto en la técnica para preparar tales formulaciones farmacéuticas y, como tal, pueden ser deseables una variedad de dosis y regímenes de tratamiento.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables estériles. También se pueden preparar las dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En las condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de los microorganismos. En muchos casos, la forma es estéril y fluida en la medida en que se puede inyectar fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de los microorganismos, tales como las bacterias y los hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante el uso en las composiciones de los agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración de una solución acuosa inyectable, por ejemplo, la solución puede tamponarse adecuadamente, si es necesario y el diluyente líquido primero se puede volver isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán un medio acuoso estéril que pueda emplearse. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y agregarse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar de infusión propuesto (ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosis que dependen de la condición del huésped. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el huésped individual.

Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación del rAAV activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.

Las composiciones de rAAV divulgadas en el presente documento también se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con los ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar a partir de las bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones de vehículos, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. También se pueden incorporar a las composiciones los ingredientes activos complementarios. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades y a las composiciones moleculares que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un huésped.

Se pueden usar los vehículos de administración, tales como liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en las células huésped adecuadas. En particular, los transgenes administrados por el vector rAAV pueden formularse para su administración encapsulados en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similares.

Tales formulaciones pueden ser preferidas para la introducción de las formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos o las construcciones de rAAV divulgadas en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen generalmente la formación y el uso de los liposomas. Recientemente, se desarrollaron los liposomas con estabilidad en el suero y semividas de circulación mejoradas (patente de los EE. UU. No. 5,741,516). Además, se han descrito diversos métodos de liposomas y preparaciones de tipo liposoma como posibles vehículos de fármacos (patentes de los EE UU. No. 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 y 5,795,587).

Los liposomas se han utilizado con éxito con varios tipos de células que normalmente son resistentes a la transfección mediante otros procedimientos. Además, los liposomas están libres de las limitaciones de la longitud del ADN que son típicas de los sistemas de administración basados en los virus. Los liposomas se han utilizado de forma eficaz para introducir genes, fármacos, agentes radioterapéuticos, virus, factores de transcripción y efectores alostéricos en una variedad de líneas de células cultivadas y animales. Además, se han completado varios ensayos clínicos exitosos que examinan la eficacia de la administración de los fármacos mediada por los liposomas.

Los liposomas se forman a partir de los fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 |_im, la sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo.

Alternativamente, pueden usarse las formulaciones de nanocápsulas del rAAV. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar sustancias de forma estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 |_im) deberían diseñarse con el uso de los polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contempla el uso de las nanopartículas de polialquilcianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos.

Además de los métodos de administración descritos anteriormente, las siguientes técnicas también se contemplan como métodos alternativos para administrar las composiciones de rAAV a un huésped. La sonoforesis (es decir, ultrasonido) se ha utilizado y descrito en la patente de los EE. UU. No. 5,656,016 como un dispositivo para mejorar la velocidad y la eficacia de la penetración del fármaco en y a través del sistema circulatorio. Otras alternativas de administración de los fármacos contempladas son la inyección intraósea (patente de los EE UU. No. 5,779,708), dispositivos de microchip (patente de los EE. UU. No. 5,797,898), formulaciones oftálmicas (Bourlais y otros, 1998), matrices transdérmicas (patentes de los EE. UU. No. 5,770,219 y 5,783,208) y entrega controlada por retroalimentación (patente de los EE. UU. No. 5,697,899).

Métodos generales relacionados con la administración de las composiciones de rAAV

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas estables que comprenden viriones de rAAV. Las composiciones permanecen estables y activas incluso cuando se someten a los ciclos de congelación/descongelación y cuando se almacenan en recipientes hechos de diversos materiales, incluido el vidrio.

Los viriones de AAV recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se pueden utilizar para la administración de los genes, tales como en las aplicaciones de terapia génica, para la producción de los animales transgénicos, en la vacunación con ácido nucleico, ribozima y terapia antisentido, así como para la administración de los genes en vitro, a una variedad de tipos celulares.

Generalmente, los viriones de rAAV se introducen en las células de un sujeto con el uso de las técnicas de transducción in vivo o in vitro. Si se transduce in vitro, la célula receptora deseada se eliminará del sujeto, se transducirá con los viriones de rAAV y se reintroducirá en el sujeto. Alternativamente, se pueden usar células singénicas o xenogénicas cuando esas células no generarán una respuesta inmune inapropiada en el sujeto.

Se han descrito los métodos adecuados para la administración e introducción de las células transducidas en un sujeto. Por ejemplo, las células se pueden transducir in vitro mediante la combinación de los viriones de AAV recombinantes con las células, por ejemplo, en un medio apropiado y mediante el cribado de aquellas células que albergan el ADN de interés con el uso de las técnicas convencionales, tales como las transferencias Southern y/o PCR o con el uso de los marcadores seleccionables. A continuación, las células transducidas pueden formularse en las composiciones farmacéuticas, que se describen con más detalle debajo y la composición puede introducirse en el sujeto por diversas vías, tales como por inyección intramuscular, intravenosa, intraarterial, subcutánea e intraperitoneal o por inyección en el músculo liso, con el uso de, por ejemplo, un catéter o directamente en un órgano. Para la administración in vivo, los viriones de rAAV se formularán en una composición farmacéutica y generalmente se administrarán por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección intramuscular directamente en el músculo esquelético, intraarticular, intravenosa o directamente en un órgano.

Las dosis apropiadas dependerán del sujeto que se esté tratando (por ejemplo, primate humano o no humano u otro mamífero), la edad y la condición general del sujeto que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el modo de administración de los viriones de rAAV, entre otros factores. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz apropiada.

Por lo tanto, una "cantidad terapéuticamente eficaz" caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante los ensayos clínicos. Por ejemplo, para la inyección in vivo, es decir, la inyección directamente al sujeto, una dosis terapéuticamente eficaz será del orden de aproximadamente 105 a 1016 de los viriones de rAAV, más preferentemente 108 a 1014 viriones de rAAV. Para la transducción in vitro, una cantidad eficaz de viriones de rAAV para administrarse a las células será del orden de 105 a 1013, preferentemente 108 a 1013 de los viriones de rAAV. Si la composición comprende a las células transducidas para administrarse de regreso al sujeto, la cantidad de las células transducidas en las composiciones farmacéuticas será de aproximadamente 104 a 1010 células, más preferentemente 105 a 108 células. La dosis, por supuesto, depende de la eficiencia de la transducción, la fuerza del promotor, la estabilidad del mensajero y la proteína codificada por él, etc. Las dosis efectivas pueden ser establecidas fácilmente por un experto en la técnica a través de los ensayos de rutina que establecen las curvas de respuesta a la dosis.

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple para administrar finalmente la cantidad especificada anteriormente. Además, al sujeto se le pueden administrar tantas dosis como sea apropiado. Por lo tanto, al sujeto se le pueden administrar, por ejemplo, 105 a 1056 viriones de rAAV en una sola dosis o dos, cuatro, cinco, seis o más dosis que dan como resultado colectivamente la liberación de, por ejemplo, 105 a 1016 viriones de rAAV. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un número apropiado de dosis para administrar.

Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas comprenderán suficiente material genético para producir una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de interés, es decir, una cantidad suficiente para reducir o mejorar los síntomas de la enfermedad en cuestión o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Por lo tanto, los viriones de rAAV estarán presentes en las composiciones del sujeto en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto terapéutico cuando se administren en una o más dosis. Los viriones de rAAV pueden proporcionarse como preparaciones liofilizadas y diluirse en las composiciones estabilizadoras de viriones para su uso inmediato o futuro. Alternativamente, los viriones de rAAV pueden proporcionarse inmediatamente después de la producción y almacenarse para uso futuro.

Las composiciones farmacéuticas también contendrán un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y que pueda administrarse sin una toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, líquidos, tales como el agua, solución salina, glicerol y etanol. Pueden incluirse las sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares y las sales de los ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, en tales vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Una discusión detallada de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J., 1991).

Como se usa en el presente documento, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en donde se amplifican las secuencias de ácido nucleico específicas, ARN y/o ADN, como se describe en, por ejemplo, la patente de los EE. UU. No. 4,683,195. Generalmente, la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá se usa para diseñar los cebadores oligonucleotídicos. Estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede usar para amplificar las secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas de ADN genómico total y ADNc transcrito del ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Ver de manera general Mullis y otros (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY) Como se usa en el presente documento, se considera que la PCR es un, pero no el único, ejemplo de un método de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una pieza específica de ácido nucleico.

Ácidos nucleicos

La invención también comprende determinadas construcciones y ácidos nucleicos que codifican la proteína Glut1 descrita en el presente documento. Determinadas construcciones y secuencias, incluidas las secuencias seleccionadas enumeradas en la Tabla 1, incluidas las SEQ ID NO: 28-75 y 80-97 y en determinados aspectos una o más de las SEQ ID NO: 2-5, 7-9, 11-14, 16-18, 20-23, 25-27 y 80-95 pueden ser útiles en las modalidades de la presente invención. Inesperadamente, como se describe en el presente documento, se ha encontrado que la inclusión de las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido 2A no expresa los niveles deseados de Glut1. Por lo tanto, las construcciones de rAAV preferidas carecerán de los ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 6, 15 y/o 24, que corresponden todas a las secuencias que codifican 2A.

Preferentemente, los ácidos nucleicos se hibridan en condiciones de rigurosidad baja, moderada o alta y codifican una proteína Glut1 que mantiene la función biológica. Una primera molécula de ácido nucleico se puede "hibridar" con una segunda molécula de ácido nucleico cuando una forma monocatenaria de la primera molécula de ácido nucleico se puede hibridar con la segunda molécula de ácido nucleico en las condiciones adecuadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (ver Sambrook, y otros, supra). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones típicas de hibridación de baja rigurosidad incluyen 55 °C, SSC a 5X, SDS al 0,1 % y sin formamida o formamida al 30 %, SSC a 5X, S^dS al 0,5 % a 42 °C. Las condiciones típicas de hibridación de rigurosidad moderada son formamida al 40 %, con SSC a 5X o 6X y SDS al 0,1 % a 42 °C. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad son formamida al 50 %, SSC a 5X o 6X a 42 °C u, opcionalmente, a una temperatura más alta (por ejemplo, 57 °C, 59 °C, 60 °C, 62 °C, 63 °C, 65 °C o 68 °C). En general, la SSC es NaCl a 0,15 M y citrato de Na a 0,015 M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque, dependiendo del rigor de la hibridación, son posibles las faltas de complementariedad entre las bases. La rigurosidad adecuada para hibridar los ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre las dos secuencias de nucleótidos, mayor será el rigor bajo el cual los ácidos nucleicos pueden hibridar. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular la temperatura de fusión (ver Sambrook, y otros, supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de las faltas de complementariedad se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (ver Sambrook, y otros, supra, 11.7-11.8).

Los polipéptidos Glut1 que comprenden las secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % idénticas, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % idénticas, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % idénticas y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % idénticas (por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %) a las secuencias de aminoácidos de mGlut1 o hGlut1 proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 79) se contemplan con respecto a la restauración de la función Glut1, cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor complementariedad entre las secuencias respectivas en toda la longitud de las secuencias de referencia respectivas. También se incluyen en las construcciones y los métodos de la presente invención los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente 70 % similares, preferentemente al menos aproximadamente 80 % similares, más preferentemente al menos aproximadamente 90 % similares y lo más preferentemente al menos aproximadamente 95 % similares (por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %) a cualquiera de las secuencias de aminoácidos Glut1 de referencia cuando la comparación se realiza con un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor complementariedad entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia.

La identidad de la secuencia se refiere al grado en el que los aminoácidos de los dos polipéptidos son iguales en las posiciones equivalentes cuando las dos secuencias están alineadas de manera óptima. La similitud de la secuencia incluye los residuos idénticos y los aminoácidos bioquímicamente relacionados no idénticos. Anteriormente se describen los aminoácidos bioquímicamente relacionados que comparten propiedades similares y pueden ser intercambiables.

La "homología" se refiere a la similitud de la secuencia entre dos secuencias polinucleotídicas o entre dos secuencias polipeptídicas cuando están alineadas de manera óptima. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma subunidad de monómero base o aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología es el número de posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número total de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, entonces las dos secuencias son 60 % homólogas. Generalmente, la comparación se realiza cuando las dos secuencias están alineadas para dar el máximo porcentaje de homología.

Las siguientes referencias se refieren a los algoritmos BLAST utilizados a menudo para el análisis de secuencias: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., y otros, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., y otros, (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. y otros, (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. y otros, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., y otros, (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C. y otros, (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. y otros, (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., y otros, "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5. suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., y otros, "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., y otros, (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., y otros, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., y otros, (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., y otros, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S. y otros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A. y otros, (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039 y Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.

Esta invención también proporciona vectores de expresión que comprenden diversos ácidos nucleicos, en los que el ácido nucleico está unido operativamente a las secuencias de control que son reconocidas por una célula huésped cuando la célula huésped se transfecta con el vector. También se proporcionan los viriones que comprenden las secuencias de AAV 9 y determinadas AAV2 recombinantes, así como las secuencias de ácido nucleico para expresar Glut-1 bajo la dirección del promotor de la p-actina de pollo y un potenciador de CMV. Dentro de estas construcciones, las secuencias de rAAV2 corresponden a las secuencias de iTr 5' y 3', por ejemplo, las SEQ ID NO: 2, 9, 29, 34, 36, 41 y otras como se describe en la Tabla 1). Estas secuencias se empaquetaron con la cápside de AAV9 para formar los viriones que son terapéuticos para la deficiencia de Glut-1 en la presente invención.

Composiciones farmacéuticas y administración

Para preparar las composiciones farmacéuticas o estériles de las composiciones de la presente invención, los vectores AAV9 o las composiciones relacionadas se pueden mezclar con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Las formulaciones de los agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mediante la mezcla con los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables en la forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, pastas, soluciones o suspensiones acuosas (ver, por ejemplo, Hardman, y otros (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, New York, NY; Avis, y otros (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y otros (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y otros (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones terapéuticas, administrado solo o en combinación con otro agente, se puede determinar mediante los procedimientos farmacéuticos estándar en los cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (LD⁵⁰/ED⁵⁰). En aspectos particulares, son deseables las composiciones terapéuticas que presenten índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y de los estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosis para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos cae preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰ con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo que depende de la forma de dosificación empleada y la vía de administración.

En una modalidad de la invención, se administra una composición de la invención a un sujeto de acuerdo con Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57a edición (1 de noviembre de 2002)).

El modo de administración puede variar. Las vías de administración adecuadas incluyen la oral, rectal, transmucosal, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutáneo, intradérmico, intramedular, intratecal, intraventricular directo, intravenoso, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópico, cutáneo, transdérmico o intraarterial.

En modalidades particulares, la composición o terapéutico se puede administrar por una vía invasiva, tal como por inyección (ver arriba). En modalidades adicionales de la invención, la composición, composición terapéutica o farmacéutica de la misma, se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intraarticular (por ejemplo, en las articulaciones con artritis), intratumoralmente o por inhalación, administración de aerosol. La administración por vías no invasivas (por ejemplo, por vía oral; por ejemplo, en una píldora, cápsula o tableta) también está dentro del alcance de la presente invención.

Las composiciones se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede administrarse mediante inyección con una aguja hipodérmica, que incluye, por ejemplo, una jeringa precargada o un autoinyector.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja; tales como los dispositivos divulgados en las patentes de los EE. UU. No. 6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 o 4,596,556.

Alternativamente, se puede administrar el vector AAV9 o el compuesto relacionado de manera local en lugar de manera sistémica, por ejemplo, mediante la inyección directamente en el sitio diana deseado, a menudo en una formulación de liberación prolongada o de depósito. Además, se puede administrar la composición en un sistema de administración de fármacos dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico del tejido, dirigido, por ejemplo, al cerebro. Los liposomas se dirigirán y absorberán selectivamente por el tejido deseado. El régimen de administración depende de varios factores, que incluyen la tasa de renovación del suero o tejido de la composición terapéutica, el nivel de los síntomas y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, el régimen de administración proporciona una composición terapéutica suficiente para lograr una mejora en el estado de la enfermedad diana, mientras que simultáneamente minimiza los efectos secundarios no deseados. Por consiguiente, la cantidad del producto biológico administrado depende en parte de la composición terapéutica particular y la gravedad de la afección que se está tratando.

El médico determina la dosis apropiada, por ejemplo, con el uso de los parámetros o los factores conocidos o sospechados en la técnica que afectan el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y se incrementa en pequeños incrementos a partir de entonces hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de los síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de las citocinas inflamatorias producidas. En general, es deseable que un producto biológico que se usará se derive de la misma especie que el animal diana para el tratamiento, minimizando así cualquier respuesta inmune al reactivo.

Como se usa en el presente documento, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados con un trastorno y/o una reducción en la gravedad de los síntomas de dicho trastorno. Los términos incluyen además mejorar los síntomas existentes no controlados o no deseados, prevenir los síntomas adicionales y mejorar o prevenir las causas subyacentes de tales síntomas. Por lo tanto, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto vertebrado con un trastorno, enfermedad o síntoma o con el potencial de desarrollar tal trastorno, enfermedad o síntoma.

Como se usa en el presente documento, los términos "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de un compuesto basado en rAAV9-Glutl de la invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto es eficaz para provocar una mejora medible en uno o más síntomas de una enfermedad o afección o la progresión de dicha enfermedad o afección. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a la cantidad del compuesto suficiente para producir al menos una mejora parcial de los síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o mejora de la afección médica relevante o un aumento en la tasa del tratamiento, curación, prevención o mejora de tales afecciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea que se administren en combinación, en serie o simultáneamente. Una cantidad eficaz de un agente terapéutico dará como resultado una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico en al menos un 10 %; normalmente en al menos un 20 %; preferentemente al menos alrededor del 30 %; más preferentemente al menos el 40 % y lo más preferentemente al menos el 50 %. Una cantidad eficaz también puede resultar en una mejora en una medida subjetiva en los casos donde se utilizan las medidas subjetivas para evaluar la gravedad de la enfermedad.

Kits

La presente invención también proporciona los kits que comprenden los componentes de las combinaciones de la invención en forma de kit. Un kit de la presente invención incluye uno o más componentes que incluyen, pero no se limitan a, un compuesto basado en rAAV9-Glut1, como se describe en el presente documento, en asociación con uno o más componentes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un agente quimioterapéutico, como se describe en el presente documento. El compuesto o composición basado en rAAV9-Glut1 y/o el agente terapéutico se pueden formular como una composición pura o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica.

En una modalidad, un kit incluye un compuesto/composición basado en rAAV9-Glut1 de la invención o una composición farmacéutica del mismo en un recipiente (por ejemplo, en un frasco de vidrio o plástico estéril) y una composición farmacéutica del mismo y/o un agente quimioterapéutico en otro recipiente (por ejemplo, en un frasco de plástico o vidrio estéril).

En otra modalidad de la invención, el kit comprende una combinación de la invención, que incluye un compuesto basado en rAAV9-Glutl, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en combinación con uno o más componentes del agente quimioterapéutico formulados juntos, opcionalmente, en una composición farmacéutica, en un solo recipiente común.

Si el kit incluye una composición farmacéutica para la administración parenteral a un sujeto, el kit puede incluir un dispositivo para realizar dicha administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección como se discutió anteriormente.

El kit puede incluir un prospecto que incluya la información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación del kit. Generalmente, dicha información ayuda a los pacientes y a los médicos a utilizar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación adjuntas de forma eficaz y segura. Por ejemplo, la siguiente información con respecto a una combinación de la invención se puede proporcionar en el prospecto: farmacocinética, farmacodinamia, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración adecuadas, cómo suministrarlo, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias, información del fabricante/distribuidor e información de la patente. Métodos generales

Se describen los métodos estándar en la biología molecular Sambrook, Fritsch y Maniatis (1982 y 19892a edición, 2001 3a edición) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Los métodos estándar también aparecen en Ausbel, y otros (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonación en las células bacterianas y la mutagénesis del ADN (Vol. 1), la clonación en las células de mamíferos y levadura (Vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3) y bioinformática (Vol.4).

Se describen los métodos para la purificación de las proteínas que incluyen la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización (Coligan, y otros (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se describen los análisis químicos, modificación química, modificación postraduccional, producción de las proteínas de fusión, glicosilación de las proteínas (ver, por ejemplo, Coligan, y otros (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, y otros (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., págs 384-391). Se describen la producción, purificación y fragmentación de los anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, y otros (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, supra). Están disponibles las técnicas estándar para caracterizar las interacciones ligando/receptor (ver, por ejemplo, Coligan, y otros (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York).

Abreviaturas

AAV: virus adenoasociado

rAAV virus adenoasociado recombinante o vector viral

BBB: barrera hematoencefálica

FMDV: virus de la fiebre aftosa

GFP: proteína verde fluorescente

G lutl: El transportador de glucosa 1, también conocido como familia 2 de transportadores de solutos, miembro 1 del transportador de glucosa facilitado (SLC2A1), es una proteína uniportadora que en los humanos está codificada por el gen SLC2A1. Glut1 facilita el transporte de la glucosa a través de las membranas plasmáticas de las células de mamíferos. Glut1 fue el primer transportador de glucosa en ser caracterizado. Glut1 1 está altamente conservada con la proteína Glut1 humana (hGlut1) (número de acceso: NP_006507.2; SEQ ID NO: 79) y la proteína Glut1 de ratón (mGlut1) (número de acceso: NP_035530.2; SEQ ID NO: 78) que comparten 98 % de homología. Glut1 presenta un 40% de homología con otros Glut.

SLC2A1: Gen que codifica el transportador 1 de glucosa humano (hGlut1). SLCZA1 humano (número de acceso: NG_008232.1; gen ID - 6513).

Slc2a1: Gen que codifica Glut1 de ratón (mGlut1) (No de acceso: Genomic #: NC_000070.6; ID del gen - 20525).

SD deSíndrome de deficiencia de Glut1

GLUT1:

PND: día posnatal

PND3: día posnatal 3

Ejemplos

Tabla 1-Plásmidos de Glut1 recombinantes

Continuación

Continuación

Desarrollo de la construcción de AAV recombinante

Se generaron cuatro construcciones de ADN que portaban el gen SLC2A1 murino o humano unido al casete de nucleótidos que codifica el indicador de la proteína verde fluorescente (GFP) como se muestra en las Figs. 1A-B. Estas cuatro construcciones también contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A de 16 aminoácidos de longitud del virus de la fiebre aftosa (FMDV) incorporado entre los marcos de lectura abiertos Glut1 y GFP. El péptido 2A se incluye en la construcción para evitar la posibilidad de que las proteínas de fusión Glutl-GFP puedan alterar la estructura o actividad de la proteína Glut1. El péptido 2A media la 'escisión' primaria en cis de la poliproteína del FMDV en una cascada de eventos de procesamiento que finalmente generan las proteínas maduras del FMDV (Donnelly, ML y otros (2001)). Se esperaba que esta estrategia creara construcciones en las que la proteína Glut1 se genere en su estado nativo. Sin embargo, como se describe debajo, ninguna de estas construcciones expresó Glut1 a niveles satisfactorios.

También se desarrollaron seis construcciones de ADN adicionales sin el ácido nucleico que codifica el péptido 2A (Fig. 1C-D), varias de las cuales incluyen los elementos que proporcionan que la expresión del gen S^l C2A1 se apague selectivamente en el hígado (Fig. 1D). Estas construcciones se desarrollaron para abordar la posibilidad de que el aumento sistémico del gen SLC2A1 en futuros experimentos de terapia génica podría dar como resultado niveles altos de la proteína que se expresa en el hígado, lo que podría aumentar el proceso de glucogénesis y, por lo tanto, inducir un estado hipoglucémico. Finalmente, también se han generado las construcciones que contienen exclusivamente el gen SLC2A1 humano o de ratón nativo con fines de control (Fig. 1C). En la validación de los experimentos se utilizarán pAAV9 CB6 PI hGlut1, pAAV9 CB6 PI hGlut1 out3xmiR122BS y pAAV9 CB6 PI hGlut1 in3xmiR122BS. Las secuencias y las características clave de estas construcciones se enumeran en la Tabla 1 y en la lista de las secuencias correspondiente SEQ ID NO: 1-97.

Análisis de la expresión inicial de los plásmidos de rAAV transfectados en las células CHO

Se utilizaron dos líneas celulares para evaluar los diversos plásmidos recombinantes en cultivo celular. Una línea celular es una línea de ovario de hámster chino (CHO), la otra es una línea de fibroblastos derivada de un paciente Glut1 (Yang y otros 2011). Los experimentos de cultivo celular y las transferencias Western posteriores indicaron que las construcciones de los plásmidos que contenían el péptido 2A no expresaban ni Glut1 ni GFP a niveles satisfactorios. Aunque es inesperado, es posible que en el contexto del gen SLC2A1/slc2A1, el péptido 2A afecte negativamente a la expresión de la proteína. Por el contrario, se encontró que las construcciones de control que contienen sólo los genes SLC2A1 de ratón o humano expresan niveles robustos de la proteína. Ninguna de las construcciones Glut1 que contienen 2A (Fig. 1A-B) se prosiguió más para restaurar la expresión de Glut1 en los sistemas de modelos mutantes.

Para sortear las dificultades de la expresión introducidas por la presencia del péptido 2A en las primeras cuatro construcciones (Fig. 1A-B), se probó una proteína de fusión hGlut1-eGFP (denominada phGlut1::eGFP). Los experimentos de cultivo celular indicaron que la proteína de fusión no solo se expresa, sino que también es funcional en el ensayo de absorción de glucosa. Esta construcción (phGlut1::eGFP), junto con las construcciones que contienen sólo el slc2a1 de ratón o los genes SLC2A1 de humanos se contemplan para su uso en los experimentos in vivo que implican la terapia génica de los ratones modelo Glut1.

Clonación del plásmido AAV9 y posterior empaquetamiento del vector viral

La construcción de la proteína de fusión hGlutl-eGFP (phGlut1::eGFP) se volvió a clonar en el plásmido AAV9 para su posterior empaquetamiento en el vector viral. Para asegurar que la construcción reclonada continuara con la expresión de la proteína, se transfectó transitoriamente en las células de ovario de hámster chino (CHO) y se examinaron los niveles de la proteína mediante el análisis de la transferencia Western (Figura 2A). El análisis de la expresión de la proteína en las células CHO mostró que en relación con las construcciones que expresan solo el ADNc que codifica hGlut1 o la fusión de hGlut-eGFP impulsada por un elemento promotor diferente, el plásmido AAV9-hGlut1-eGFP expresó niveles más bajos de Glut1 (Figura 2A). Sin embargo, la construcción de fusión modificada (AAV9-hGlut1-eGFP) continuó con la expresión de la proteína Glut1 en una cantidad eficaz y satisfactoria. Además, la proteína de fusión pareció ser significativamente más grande que la proteína hGlut1 nativa, como se esperaba debido a la etiqueta GFP en el extremo 3' del ADNc de Glut1 (Figura 2A). Estos resultados son consistentes con los ensayos de absorción de la glucosa en los que se encontró que la proteína hGlut-eGFP aumentaba la absorción de la glucosa en las células CHO (Figura 2B). La Fig. 2C muestra la fluorescencia de GFP de esta construcción después de la transfección en las células CHO. En paralelo, los genes SLC2A1 de humano y slc2a1 de ratón también se clonaron en el plásmido AAV9 y, tras la transfección en los fibroblastos de los pacientes, encontraron que conducen la expresión de Glut1 y el aumento de la absorción de la glucosa. Por consiguiente, cada uno se empaquetó en la cápside de AAV9 y se prepararon ~ 1013 copias del genoma para su administración en ratones modelo con el SD de Glut1. (De acuerdo con los métodos descritos en la patente de los EE. UU. No.

8,734,809 y en Grieger y Samulski 2005 y Grieger y Samulski 2012).

Condiciones/distribución de empaquetamiento

Para optimizar las condiciones para la administración de las construcciones que expresan Glut1 empaquetadas en los vectores AAV9, se analizó la distribución de un vector AAV9-GFP (Foust, KD y otros 2009) en los ratones de tipo silvestre. (De acuerdo con los métodos descritos en Gao, G.P. y Sena-Esteves, M. (2012), In Molecular Cloning, Vol 2: A Laboratory Manual (M.R. Green and J. Sambrook eds.)).

La distribución de la construcción AAV9-GFP se evaluó en diferentes tejidos en los ratones adultos o neonatales de tipo silvestre. Se encontró fluorescencia verde brillante en los tejidos probados de los ratones inyectados con AAV9-GFP, pero no en los ratones inyectados con PBS/control. Esencialmente, se administraron sistémicamente ~ 4 x 1012 copias del genoma del vector en un volumen de ~ 40 |_il a los ratones a través del seno retroorbital y en la vena temporal. Los resultados de estos experimentos indican que el virus AAV9 se distribuye en una variedad de tejido nervioso y no nervioso. En particular, se encontraron niveles altos que se dirigían al músculo esquelético, el corazón y el hígado. Sin embargo, se observó una fluorescencia sustancial de GFP en el tejido cerebral, incluidas las células endoteliales positivas para Glutl que recubren la microvasculatura cerebral. Es importante destacar que estas células son los sitios supuestos de una terapia dirigida para el SD de Glutl.

Construcciones AAV9-mGlut1 control

Tabla 2 -mGlutl = pAAV9 CB6 PI mGlutl (SEQ ID NO: 35-41).

Tabla 2 - Resumen de los ratones inyectados con Glutl o vehículo

Una de las construcciones que expresaba las cantidades deseadas de la proteína mGlut1 se empaquetó en el vector viral AAV9. Aunque esta construcción no tiene una etiqueta marcada (por ejemplo, GFP), la expresión de Glutl de esta construcción en los ratones modelo puede seguirse mediante la evaluación de la proteína mGlut1 total mediante los análisis de la transferencia Western y los experimentos de inmunohistoquímica.

La construcción pAAV9 CB6 PI mGlutl (SEQ ID NO: 35) se introdujo en las crías de ratón Glutl mutantes al día posnatal (PND) 2 a través del seno retroorbital. Los ratones inyectados con esta construcción sirven como controles para los mutantes inyectados con AAV9-hGlut1-eGFP (SEQ ID NO: 80; ver las características de la SEQ ID NO: 81­ 87). Se han inyectado nueve ratones mutantes con la construcción AAV9-mGlut1, pAAV9 CB6 PI mGlut1 (Tabla 2). Como controles adicionales, a siete mutantes se les ha inyectado el vehículo (PBS) solo. Estos ratones se probarán para determinar la mejora funcional del fenotipo de la enfermedad. Esto se llevará a cabo mediante la determinación de los niveles de absorción de la glucosa en el tejido cerebral, mediante tomografías por emisión de positrones (PET) y mediante la medición el rendimiento motor en las pruebas de varilla giratoria o del poste vertical de acuerdo con las técnicas estándar (ver Kariya y otros, 2012).

Una de las construcciones utilizadas en los experimentos de sustitución de genes con los ratones modelo con el SD de Glut1 es la construcción AAV9-hGlutl-eGFP (SEQ ID NO: 80). La proteína Glut1 etiquetada producida a partir de esta construcción permitirá seguir la distribución de la proteína en los diversos sistemas de órganos, incluidas las células endoteliales que expresan Glut1 de los cerebros de los ratones experimentales. Esto permitirá optimizar las condiciones para la detección de mGlut1 en el cerebro del ratón. La expresión robusta de la proteína mGlut1 en el cerebro es detectable con el uso de un anticuerpo específico.

Restaurar Glut1 a los ratones mutantes con el SD de Glut1 rescata el fenotipo de la enfermedad, como se ejemplifica al rescatar la disfunción de la marcha

La capacidad del virus adenoasociado recombinante 9 (rAAV9) para infectar múltiples tipos celulares se utilizó como una característica para reintroducir el gen Slc2a1 murino en un modelo de ratón de la enfermedad humana. En la ausencia de un alelo Slc2a1 de tipo silvestre, los ratones con el SD de Glut1 se desempeñan mal en el ensayo de la varilla giratoria, una medida del resultado que se cree que modela los defectos del comportamiento motor, es decir, fenotipos motores, observados en los pacientes humanos. Los ratones mutantes se inyectaron con ~ 4 x 1011 copias del genoma de AAV9-Glut1 proporcionadas por la construcción pAAV9 CB6 PI mGlut1 (SEQ ID NO: 35) o vehículo (PBS) al PND3. Valores de p calculados con el uso de un ANOVA de una vía. Restaurar el gen Slc2a1 en los ratones mutantes al PND3 dio como resultado una mejora significativa en el rendimiento de la varilla giratoria (realizada en condiciones estándar; ver Wang y otros 2006), ya a las 6 semanas de edad (Fig. 3A). El rendimiento mejorado persistió hasta las 20 semanas de edad, momento en donde se terminó el experimento.

Además del rendimiento mejorado en el ensayo de la varilla giratoria (Fig. 3A), los ratones tratados también sortearon un poste vertical con mayor agilidad que sus homólogos tratados con el vehículo (Fig. 3B). Los mutantes tratados se comportaron de manera indistinguible de los compañeros de camada de control de tipo silvestre cuando las cohortes se probaron entre las 6 y las 12 semanas de edad. Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que restaurar Glut1 en los ratones con el SD de Glut1 mitiga las características del fenotipo motor de la enfermedad humana, lo que indica que restaurar el gen Slc2a1 en los ratones modelo mutantes es indicativo del valor terapéutico.

La restauración de Glut1 a los ratones mutantes con el SD de Glut1 da como resultado una expresión mejorada del gen en múltiples tejidos.

Para explorar la base molecular del rendimiento mejorado de los animales tratados con AAV9-Glut1, se evaluó la expresión del gen Slc2a1 murino en el tejido cerebral y hepático de los animales. Los animales mutantes tratados con el pAAV9 CB6 PI mGlut1 (SEQ ID NO: 35) presionaron mayores niveles del gen Slc2a1 en el tejido cerebral y hepático (Figs. 4A-B). Se extrajo el tejido cerebral y hepático de los ratones tratados y de control, se preparó el ARN y luego se sometió a transcripción inversa antes de amplificar el transcripto de Slc2a1 en un ensayo Q-PCR. Se utilizó la p-actina para normalizar la expresión del gen Slc2a1. La Fig. 4^a muestra la expresión relativa del gen Slc2a1 en los mutantes tratados y en los controles relevantes. La Fig. 4B muestra la expresión de Slc2a1 como un porcentaje de la expresión en los ratones Glutl+/+ de tipo silvestre. Se utilizaron cebadores que incluyen el intrón 1 para amplificar el transcrito que codifica Glutl mediante PCR cuantitativa en los mutantes tratados (Glutl /-) y en los controles relevantes (Glutl+/+ y mutantes Glutl+/- tratados con PBS). Los ratones se sacrificaron y se extrajeron los tejidos después de la perfusión transcardial con PBS. El ARN se preparó utilizando el kit Qiagen RNAeasy según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). El ARN se sometió a transcripción inversa de acuerdo con los procedimientos estándar y se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar el transcripto que codifica Glutl: GlutIQPCR F1: 5' CTT GCT TGT AGA GTG ACG ATC 3' (SEQ ID NO: 76) y GlutIQPCR R1: 5' CAG TGA TCC GAG CAC TGC TC 3' (SEQ ID NO: 77). La banda de 212 pb esperada se cuantificó en un Eppendorf Realplex Cycler (Eppendorf, Alemania).

Inesperadamente, la expresión del gen en el hígado mutante tratado excedió los niveles en el mismo tejido de los controles Glut1+/+, consistente con los informes anteriores (Foust y otros, 2010) de que el virus AAV9-Glut1 tiene un tropismo particular por el hígado. En una pequeña cohorte de ratones WT a los que se les administró el virus, esto también condujo a hipoglucemia, probablemente una consecuencia de la regulación a la alta de Slc2a1 en este tejido y, por lo tanto, de la eliminación de la glucosa de la sangre. Por consiguiente, se contempla la supresión de la expresión de Slc2a1 con el uso de las construcciones que contienen los sitios de unión de miARN-122 (como se muestra en la Fig. 1D e incluida por las SEQ ID NO: 42-75). El miARN-122 se expresa específicamente en el hígado y suprime la expresión de los genes a cuyos transcriptos se une (Xie y otros, 2011). Las consecuencias fisiológicas de este hallazgo serán el objeto de una investigación adicional.

Proteína cerebral Glut1 mejorada y glucosa del LCR en los ratones mutantes tratados con AAV9-Glut1; Restaurar Glut1 mitiga la hipoglucorraquia en los ratones modelo con el SD de Glut1.

Una característica definitoria del SD de Glut1 es la hipoglucorraquia (glucosa baja en el líquido cefalorraquídeo). Los ratones modelo con el SD de Glut1 muestran este fenotipo. Para determinar si la restauración de Glut1 en los ratones modelo revirtió o mitigó la hipoglucorraquia, se extrajo la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR) de los animales y se midieron los niveles de la glucosa. Todos los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de realizar las mediciones. El LCR se aisló de la cisterna magna esencialmente como se describió anteriormente (Wang y otros, 2006; Fleming y otros, 1983). Brevemente, se hizo una incisión desde la parte superior del cráneo hasta el tórax dorsal y se extrajo la musculatura desde la base del cráneo hasta las primeras vértebras para exponer las meninges que cubren la cisterna magna. El tejido sobre la cisterna magna fue extirpado con cuidado de no perforar las meninges translúcidas. Una vez que se limpió el área circundante de sangre residual/fluido intersticial, se utilizó una micropipeta unida a una aguja 30G para perforar la membrana aracnoidea que cubre la cisterna magna y extraer 5-15 |_il del LCR. Todo el procedimiento se completó en 5 minutos y la glucosa en el LCR se midió con un medidor de glucosa Ascensia Elite XL (Bayer Corp.) Se determinó de manera similar la glucosa en sangre, antes de la extracción del LCR, mediante la extracción de ~ 10 |_il de sangre de una incisión en la cola. Se evaluaron dos lecturas de cada una de las concentraciones de glucosa en sangre y LCR para cada ratón. Se informará el valor medio.

Con respecto a los valores de glucosa en el LCR y las etapas de la enfermedad, los siguientes intervalos son típicos: más del 90 % de los pacientes con Glut1 tienen valores de glucosa en el LCR de < 40 mg/dl (2,2 mM) y los pacientes restantes se encuentran en el intervalo de 41-52 mg/dl. Por lo tanto, el intervalo normal para los niveles de glucosa en el LCR es > aproximadamente 53 mg/dl. Para los ratones modelo con el SD de Glut1, el nivel típico de glucosa en el LCR es de aproximadamente 23,3±7,17 mg/dl (dentro de un intervalo de < 25,0± 8,00 mg/dl); mientras que para los ratones de tipo silvestre el nivel es de aproximadamente 74,6 ±14,1 mg/dl (dentro de un intervalo de > aproximadamente de 70,0 ±15,0 mg/dl).

Además, el ensayo de la función de absorción de la glucosa en los glóbulos rojos se usa a menudo como un sustituto de la haploinsuficiencia de Glut1. En este ensayo, las muestras de los pacientes que presentan SD de Glut1 se agrupan alrededor del 50 % de absorción, con un intervalo de 36-73 %. Se estima que > 75 % de la actividad es consistente con un intervalo normal. Se observa que < 25 % es grave y se acerca a la letalidad embrionaria al 0 %.

Restaurar el gen SLC2A1 a los ratones mutantes con el SD de Glut1 por transfección con la construcción pAAV9 CB6 PI mGlut1 (SEQ ID NO: 35) da como resultado una expresión aumentada de la Glut1 (Fig. 5A). Además, los ratones mutantes con el SD de Glut1 tratados expresaron niveles aumentados de la proteína Glut1 en el tejido cerebral (Fig. 5B). En la Fig. 5C, las concentraciones de glucosa en el LCR en los mutantes tratados fueron significativamente mayores que las de los mutantes no tratados, pero no alcanzaron los niveles observados en los controles de tipo silvestre. Los ratones mutantes con slc2a1 restaurado presentaron niveles aumentados de la glucosa en LCR/sangre (Fig. 5D). Los tamaños de las muestras son n = 8 para los ratones mutantes no tratados y n = 9 para los ratones mutantes tratados. Además, la cohorte de tipo silvestre es n = 18. Estos datos muestran que la restauración de Glut1 en los ratones mutantes con el SD de Glut1 aumenta los niveles de glucosa en el LCR y mitiga la hipoglucorraquia de los animales afectados. En conjunto, estos resultados son una clara indicación de los beneficios terapéuticos de restaurar Glut1 en un sujeto deficiente en Glut1. Los resultados preliminares de estos experimentos indican que restaurar Glut1 a estos ratones adultos sintomáticos no logra rescatar el fenotipo de la enfermedad, lo que argumenta a favor de una ventana de oportunidad terapéutica limitada en los ratones y, probablemente, también en humanos.

Restauración de Glut1 a los ratones sintomáticos, momento de la administración de Glut1.

La restauración de la expresión de Glut1 en los ratones modelo al principio del curso de la enfermedad (ejemplificada por la inyección de PN3 de las construcciones AAV9-mGlut1) en los ratones con el SD de Glut1 tiene un valor terapéutico claro. Para determinar el período de tiempo de la restauración de Glut1 en los ratones sintomáticos, se han iniciado los experimentos que implican inyectar las construcciones pAAV CB6 PI mGlut1 (SEQ ID NO: 35) en los ratones mutantes a las 8 semanas de edad. Los ratones con el SD de Glut1 son claramente sintomáticos en este punto y se desempeñan peor que los compañeros de control de camada de tipo silvestre en la varilla giratoria. En consecuencia, a una cohorte de ratones con el SD de Glut1 se les inyectó sistémicamente el vehículo o 1 x 1012 copias del genoma de AAV9-mGlut1. Todos los ratones toleraron el procedimiento, lo que indica que la inyección del virus en los roedores adultos es segura. Se están evaluando los ensayos moleculares, celulares y de comportamiento similares a los descritos anteriormente para determinar los marcos de tiempo que permitirán tratar/aliviar los síntomas de la deficiencia de Glut1, así como cualquier límite de tiempo para revertir el curso del fenotipo de la enfermedad.

Refinación de la ventana de oportunidad terapéutica en un modelo del SD de Glutl

Los datos actuales demuestran que la repleción mediada por AAV9 de la proteína Glutl (murina) en los ratones con el SD de Glut1 neonatales (PND3) aumenta la expresión de Glut1, mitiga la hipoglucorraquia característicamente observada en la enfermedad, restaura el tamaño del cerebro y da como resultado una mejora notable en el rendimiento motor. En contraste, la repleción de G lutl a las 8 semanas de edad no logró rescatar el fenotipo de la enfermedad. Estos resultados sugieren que existe una ventana de oportunidad terapéutica limitada en los ratones modelo con el SD de Glut1, un hallazgo que probablemente refleje la condición humana. Los datos preliminares también indican niveles de glucosa en el LCR significativamente reducidos en los ratones mutantes ya a las 2 semanas de edad (mutantes: 23,25 ± 3,77 mg/dl; Ctrl: 53,33 ± 5,20 mg/dl, P < 0,01, prueba t). Sin embargo, no está claro si restaurar Glut1 en esta coyuntura, antes de un fenotipo evidente discernible, proporcionará un beneficio terapéutico.

Para determinar el resultado de la restauración de Glut1 en esta etapa temprana de la enfermedad, similar al tratamiento de los pacientes que han sido diagnosticados en la infancia pero que sin embargo han estado sujetos a los efectos causantes de la enfermedad de la deficiencia de Glut1 durante la infancia, los ratones mutantes se transducirán sistémicamente con el vector pAAV9 CB6 PI mGlut1 (SEQ ID NO: 35). Brevemente, se inyectarán ~ 1012 copias del genoma del vector terapéutico del vehículo en un volumen de ~ 50 |_il en la vena temporal de los ratones de 2 semanas de edad. Posteriormente, los animales serán evaluados con el uso de una batería completa de ensayos moleculares (análisis de la transferencia Western, ensayos de Q-PCR, niveles de glucosa en sangre y LCR), imágenes (escaneos PET) y de comportamiento (análisis de varilla giratoria, ensayos del poste vertical) para determinar el resultado de restaurar la proteína funcional en esta etapa "juvenil" en los ratones. Estos experimentos complementarán los resultados obtenidos tras el tratamiento en los neonatos (PND3) por un lado y en el modelo adulto (8 semanas) por el otro y refinarán la ventana de oportunidad terapéutica para el SD de Glutl.

Evaluación de los efectos combinados del tratamiento temprano con la dieta cetogénica y la repleción tardía de la proteína Glut1 en los ratones modelo con el SD de Glut1

Si bien está claro que la restauración de Glut1 en los ratones adultos (8 semanas) no mitigó el fenotipo del SD de Glutl, es posible que el tratamiento previo de estos ratones con una dieta alta en grasas haya producido un resultado más favorable. Los ratones con tales dietas representan con mayor precisión la cohorte de los pacientes mayores con el SD de Glut1 que pueden haber perdido la ventana terapéutica ideal de tratamiento, pero que, sin embargo, podrían beneficiarse de una restauración tardía de la proteína Glutl debido a los efectos protectores tempranos de una dieta cetogénica. Estas dietas suministran al cerebro los cuerpos cetónicos, una fuente de energía alternativa, aunque imperfecta, que atraviesa la barrera hematoencefálica a través de los transportadores monocarboxílicos. En consecuencia, además de nuestros experimentos en los ratones de dos semanas de edad, probaremos los efectos de restaurar Glutl en los mutantes adultos (6-8 semanas) que han recibido (que comienza al PND7) el triglicérido triheptanoína 7C. La triheptanoína, actualmente en los ensayos clínicos para el S^d de Glutl, no solo se metaboliza a acetil CoA por el ciclo de TCA, sino que también se cree que proporciona los sustratos anapleróticos esenciales para el ciclo a medida que los nutrientes se descomponen eventualmente para suplir las necesidades energéticas de la célula. En resumen, este experimento implicará el tratamiento de los mutantes con (82 mg/g) o sin triheptanoína hasta que se les administre la construcción AAV9-Glutl (pAAV9 CB6 PI mGlutl). A continuación, se evaluarán las diferentes cohortes de ratones como se describió anteriormente como un medio para predecir el resultado terapéutico de restaurar la expresión de Glut1 en los pacientes mayores con los tratamientos actualmente disponibles (dieta cetogénica).

Optimización de las construcciones Glutl para los ensayos clínicos

Aunque no se han observado hasta la fecha efectos adversos de la expresión slc2a1 en los ratones con el SD de Glutl, los estudios preliminares en una pequeña muestra de los ratones de tipo silvestre administrados con la construcción del vector pAAV9 CB6 PI mGlutl (SEQ ID NO: 35) indicó niveles inferiores de glucosa en el LCR y la sangre. Este evento inesperado podría resultar de un aumento de la expresión de slc2a1 en el hígado, un órgano diana preferido de AAV9 y, en consecuencia, un transporte mejorado de glucosa en este tejido. El resultado neto es una caída de la glucosa circulante que se refleja en un estado hipoglucémico. En previsión de tal evento, la construcción de hGlutl (pAAV CB6 PI hGlutl) se modificará para evitar su expresión a niveles altos en el hígado, un órgano para el cual AAV9 tiene un tropismo particularmente alto (Zincarelli y otros, 2008; Pacak y otros, 2006). Para ello, se introducirán en las construcciones los sitios de unión (BS) para el miARN - miR-122 (expresado específicamente en los hepatocitos). Esta estrategia se ha implementado con éxito anteriormente (^er Xie y otros, 2011) y aprovecha la escisión endonucleolítica mediada por miARN de los ARNm diana, que restringe, por lo tanto, la expresión del transcrito a los tejidos de interés. Dichas construcciones se muestran en la Fig.1 D y en la Tabla 1 (pAAV CB6 PI hGlut1-in3xmiR-122 BS, pAAV CB6 PI hGlut1-out3xmiR-122 BS, pAAV CB6 PI mGlut1-in3xmiR-122, pAAV CB6 PI mGlut1-out3xmiR-out3xmiR-122) se probarán en un subconjunto de ratones en paralelo con los vectores que expresan Glut1 originales (sin modificar), al examinar cada uno de ellos para determinar los niveles de expresión de Glut1 y la eficacia terapéutica. Una mayor tendencia de la construcción original a causar hipoglucemia indicará el beneficio de usar las nuevas construcciones de Glut1-miARN-BS en los experimentos y en los ensayos posteriores.

Para optimizar la expresión de las construcciones de prueba descritas en el presente documento no solo como un medio para reducir los títulos virales durante el proceso de fabricación, sino también para abordar los problemas de seguridad asociados con las grandes concentraciones del virus, los genes SLC2A1 y slc2a1 se evaluarán mediante un proceso de optimización de codones con el uso del software disponible gratuitamente (https://www.idtdna.com/CodonOpt). Además, las secuencias de consenso de Kozak se introducirán en las construcciones según sea necesario. Por lo tanto, cualquiera de las construcciones o elementos descritos en la Tabla 1 puede optimizarse en codones de esta manera. Cada una de las construcciones modificadas se probará en paralelo con las construcciones parentales en los ratones. Brevemente, las construcciones se administrarán sistémicamente a través de la vena temporal en las crías de ratones al PND3. A continuación, los animales se sacrificarán dos o tres semanas más tarde y se determinarán los niveles de proteína de cada una de las construcciones mediante Q-PCR y la transferencia Western. Las construcciones que proporcionan los niveles de expresión más rápidos y altos se considerarán para su uso eventual en los estudios de primates no humanos y, finalmente, en los ensayos clínicos para los pacientes humanos.

Estudios de primates no humanos

Para determinar la biodistribución, expresión y toxicidad de nuestra(s) construcción(es) seleccionada(s) en un modelo de mamífero grande, se administrarán los vectores virales a una cohorte de monos cynomolgus. Brevemente, a 6 animales cada uno al PND1, PND90 y 2 años de edad se les administrará sistémicamente el vector AAV9 a una dosis de 5 x 1013 copias del genoma/kg. Para determinar la toxicidad aguda de la(s) construcción(es), los animales se sangrarán 1 día, 3 días y 7 días después de la administración del vector. Además, se sangrarán a los animales 2, 3 y 4 semanas después de la inyección del vector. En todos los casos, se evaluarán los parámetros importantes de la química clínica y hematología. Los títulos de los anticuerpos neutralizantes contra AAV9 se seguirán en las muestras de suero mediante un ensayo cuantitativo de anticuerpos neutralizantes basado en la transducción (Rapti y otros, 2012) y determinarán la presencia de las células T específicas por el transgén o cápside en las PBMC con el uso del ELISPOT, técnicas de tinción de citocinas intracelulares y citometría de flujo (Walker y otros, 2001). Para complementar los estudios inmunológicos anteriores, tres animales de cada cohorte serán sacrificados en la semana 4 para la histopatología, estudios de biodistribución del vector y análisis de la expresión transgénica en todos los sistemas de órganos principales. Estos experimentos también permitirán el examen y la comparación de las respuestas inmunitarias de las células B y T a la cápside o el transgén en el suero, los linfocitos y las PBMC en un momento temprano frente a tardío después de la administración del virus. Con el fin de llevar a cabo un estudio de seguridad a largo plazo, los 3 animales restantes de cada grupo serán seguidos durante un período de 3 meses durante el cual serán sangrados cada mes para estudios de la química clínica y hematología como se describe anteriormente. Estos animales eventualmente serán sacrificados 3 meses después de las inyecciones y analizados como se describe en los estudios de toxicidad aguda. Es posible que la proteína Glut1 humana a pesar de compartir una homología de ~ 99 % con la Glut1 de cynomolgus provoque una respuesta inmunitaria agresiva. Para evitar esto, se introducirán dos sitios de unión de miARN para miR-142-3p y miR-155 en las construcciones de prueba. Los resultados preliminares de un estudio independiente indican que estos miARN se expresan en las células presentadoras de antígeno y, en consecuencia, suprimen la expresión de las proteínas cuyos transcriptos contienen los sitios de unión para los miARN. En conjunto, estos estudios facilitarán el uso eventual de las construcciones de Glut1 de prueba descritas en el presente documento en los ensayos clínicos en humanos.

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9. Yang H, Wang D, Engelstad K, Bagay L, Wei Y, Rotstein M, Aggarwal V, Levy B, Ma L, Chung WK, De Vivo DC (2011) Glut1 deficiency syndrome and erythrocyte glucose uptake assay. Ann Neurol 70, 996-1005.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un vector adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende un transgén que codifica Glut1 operativamente unido a un promotor de la beta-actina de pollo y en donde el rAAV es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y en donde el AAV es AAV8 o AAV9.

2. El AAV recombinante de la reivindicación 1, en donde el rAAV que comprende el transgén se dirige a las células endoteliales que recubren la microvasculatura cerebral, lo que permite, por lo tanto, que el transgén se exprese en las células endoteliales que recubren la microvasculatura cerebral.

3. El AAV recombinante de la reivindicación 1, en donde el promotor de la beta-actina de pollo se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 31,38, 45, 54, 62 y 70.

4. El AAV recombinante de la reivindicación 1, en donde la Glut1 comprende la SEQ ID NO: 78 o 79.

5. El AAV recombinante de la reivindicación 1, que comprende además los elementos de miARN seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 48, 56, 59, 64 y 73.

6. El AAV recombinante de la reivindicación 1, en donde el vector recombinante comprende además las repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean los elementos de miARN.

7. Una composición que comprende el AAV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y que además comprende un vehículo farmacéutico.

8. Un kit que comprende una carcasa de recipiente que comprende la composición de la reivindicación 7.

9. El kit de la reivindicación 8, en donde el recipiente es una jeringa.

10. El AAV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento del síndrome de deficiencia de Glut1 en un sujeto que lo necesite, en donde el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del vector AAV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de la reivindicación 7.

11. El AAV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de la reivindicación 7 para su uso para aliviar en un sujeto, al menos uno de los síntomas asociados con el síndrome de deficiencia de Glut1 seleccionado del grupo que consiste en hipoglucorraquia, microcefalia adquirida, disfunción motora atáxica y distónica, en donde el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del vector AAV recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de la reivindicación 7.