ES2841648T3

ES2841648T3 - Procedimiento para purificar eritropoyetina PEGilada

Info

Publication number: ES2841648T3
Application number: ES17745145T
Authority: ES
Inventors: Roberto Falkenstein; Bernhard Spensberger
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2021-07-08
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: JP7177035B2; SI3484911T1; IL264153B; AU2017295037B2; US11993630B2; JP7530413B2; MX2018016033A; US20210155655A1; KR102820834B1; IL264153A; US20250136639A1; SG11201811553UA; CA3027143A1; WO2018011381A1; KR20190026759A; EP3484911A1; EP3484911B1; JP2019524726A; CN109415427A; KR20220158870A

Abstract

Un procedimiento para purificar una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas: a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende un material de cromatografía que tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7, b) aplicar una segunda solución con un valor de pH incrementado con respecto a la primera solución, c) aplicar una solución con una conductividad incrementada o creciente a la columna y recuperar de este modo la proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol).

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para purificar eritropoyetina PEGilada

En el presente documento se informa de un procedimiento para purificar eritropoyetina PEGilada con un procedimiento de columna individual usando un material de cromatografía de intercambio catiónico.

Antecedentes de la invención

Las proteínas desempeñan un papel importante en la cartera médica actual. Para su aplicación en humanos, cada proteína terapéutica tiene que cumplir criterios distintos. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos en humanos, en especial se han de retirar los subproductos que se acumulan durante el procedimiento de producción. Para cumplir las especificaciones reglamentarias, una o más etapas de purificación han de seguir al procedimiento de fabricación. Entre otras, la pureza, producción y rendimiento desempeñan un papel importante en la determinación de un procedimiento de purificación apropiado.

Se ha informado de conjugados de proteínas terapéuticas, por ejemplo, para polietilenglicol (PEG) e interleucina-6 (documento EP 0442 724), para PEG y eritropoyetina (documento W o 01/02017), para moléculas quiméricas que comprenden endostatina e inmunoglobulinas (documento US 2005/008649), para proteínas de fusión basadas en anticuerpos secretados (documento US 2002/147311), para polipéptidos de fusión que comprenden albúmina (documento US 2005/0100991; seroalbúmina humana documento US 5.876.969), para polipéptidos PEGilados (documento US 2005/0114037) y para fusiones de eritropoyetina.

Necina, R., et al. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) informó de la captura de anticuerpos monoclonales humanos directamente de sobrenadantes de cultivo celular por medios de intercambio iónico que presentan una densidad de carga alta. En el documento WO 89/05157 se informa de un procedimiento para la purificación de inmunoglobulinas de producto sometiendo directamente el medio de cultivo celular a un tratamiento de intercambio catiónico. Se describe una purificación en una etapa de anticuerpos monoclonales IgG de ascitis de ratón por Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88. Se informa de un procedimiento para purificar un polipéptido por cromatografía de intercambio iónico en el documento WO 2004/024866 en el que se usa un lavado en gradiente para resolver un polipéptido de interés de uno o más contaminantes. En el documento EP 0530447 se informa de un procedimiento para purificar anticuerpos monoclonales IgG por una combinación de tres etapas cromatográficas. Se informa de una purificación simple del antagonista del receptor de interleucina-1 mono-PEGilada por Yu, G., et al., Process Biotechnol.

42 (2007) 971-977. Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218 informa de la purificación de hTFF3 expresado en E.coli por una cromatografía de intercambio catiónico en dos etapas. Yun Q., et al. (Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) informan de la purificación de rhG-CSF PEGilado por dos etapas de cromatografía de intercambio iónico consecutivas.

Se informa de un procedimiento para purificar eritropoyetina PEGilada en una columna SP Sephacryl S 500 HR en el documento WO 2012/035037.

El documento WO 1999/057134 informa de la purificación de proteínas por cromatografía de intercambio iónico.

Se informa de un procedimiento para la purificación de eritropoyetina mono-PEGilada que comprende dos etapas de cromatografía de intercambio catiónico en el que se usa el mismo tipo de material de intercambio catiónico en ambas etapas de cromatografía de intercambio catiónico en el documento WO 2009/010270.

Sumario de la invención

En el presente documento se informa de un procedimiento para la purificación de un conjugado de proteína que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol) de subproductos de reacción o material de partida sin reaccionar por un procedimiento de cromatografía de intercambio catiónico.

Se ha descubierto que empleando una etapa de lavado con una solución de lavado con un valor de pH incrementado, la proteína conjugada que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol) se puede obtener a partir de un material de cromatografía de intercambio catiónico, tal como por ejemplo Toyopearl® SP-650, en una etapa individual con alta pureza y rendimiento de forma mejorada y simplificada.

Se ha descubierto que cuando se compara con un procedimiento de purificación para un conjugado de proteína que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol) que emplea dos etapas de cromatografía de intercambio catiónico secuenciales, el rendimiento y la calidad son al menos comparables o mejores. El procedimiento de una columna permite obtener la misma calidad mientras que se incrementa la consistencia del procedimiento. También reduce los costes de fabricación y el tiempo de producción. Los rendimientos finales se pueden incrementar sin pérdida de calidad de la eritropoyetina mono-PEGilada.

Por tanto, en el presente documento se informa como un aspecto de un procedimiento para obtener/purificar/producir una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende Toyopearl® SP-650 como material de cromatografía, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 2,7,

b) aplicar una segunda solución con un valor de pH incrementado con respecto a la primera solución (con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7),

c) aplicar una solución con una conductividad incrementada o creciente a la columna y recuperar de este modo la proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol).

En el presente documento se informa como un aspecto de un procedimiento para obtener/purificar/producir una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas: a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende un material de cromatografía que tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

En un modo de realización, el procedimiento comprende además la etapa de volver a aplicar la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 después de la etapa b) y antes de la etapa c). Por tanto, en un modo de realización se informa de un procedimiento para obtener/purificar/producir una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende material de cromatografía Toyopearl® SP-650, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 2,7,

b) aplicar una segunda solución con un valor de pH incrementado con respecto a la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

b1) volver a aplicar la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,2, preferentemente con un pH de aproximadamente 2,7 a 3,0.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un valor de conductividad constante.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen aproximadamente el mismo valor de conductividad constante. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y/o la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen un valor de conductividad constante de aproximadamente 19 mS/cm, preferentemente con un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,2 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 19 mS/cm.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución tamponada con fosfato.

En un modo de realización, la solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilengMcol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina no se ajusta a un valor de conductividad de aproximadamente 19 mS/cm.

En un modo de realización, la solución con conductividad incrementada o creciente es una solución con concentración de cloruro de sodio incrementada o creciente. En un modo de realización, la solución con conductividad incrementada o creciente tiene un valor de pH de desde pH 2,3 a pH 3,5.

En un modo de realización, la solución con conductividad incrementada o creciente tiene una conductividad que se incrementa de manera gradual o lineal.

En un modo de realización, el procedimiento se usa en preparaciones de proteína a gran escala en las que la columna de cromatografía de la etapa a) tiene un diámetro de al menos 30 cm.

En un modo de realización, la eritropoyetina es eritropoyetina humana. En un modo de realización, la eritropoyetina humana tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 o SEQ ID NO: 02.

En un modo de realización, el único residuo de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de desde 20 kDa a 40 kDa.

En el presente documento se informa en un aspecto de un procedimiento para obtener una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende Toyopearl® SP-650M como material de cromatografía, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

a1) volver a aplicar la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

Descripción de la invención

En el presente documento se informa de un procedimiento para purificar una proteína, que comprende una molécula de eritropoyetina y un residuo de poli(etilenglicol), con un procedimiento de elución de gradiente en una columna de cromatografía de intercambio catiónico, tal como por ejemplo una columna que comprende Toyopearl® SP-650, con lo que la columna de cromatografía de intercambio catiónico/Toyopearl® SP-650 se ha lavado con dos soluciones de lavado antes de iniciar la recuperación/elución de la proteína, que comprende una molécula de eritropoyetina y un residuo de poli(etilenglicol). En el presente documento, la segunda solución de lavado tiene un valor de pH incrementado con respecto a la primera solución de lavado.

Los procedimientos cromatográficos generales y su uso son conocidos por el experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Heftmann, E., (ed.). Chromatography, 5.a edición, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York (1992); Deyl, Z., (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, Países Bajos (1998); Poole, C.F. y Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag (1982); Sambrook, J., et al., (eds.). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); o Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1987-1994).

El término "aplicar a" indica una etapa parcial de un procedimiento de purificación en la que una solución se pone en contacto con un material de cromatografía. Esto indica que a) la solución se añade a un dispositivo cromatográfico en el que está contenido el material de cromatografía, o bien b) que el material de cromatografía se añade a la solución. En el caso a) la solución pasa a través del dispositivo permitiendo una interacción entre el material de cromatografía y las sustancias contenidas en la solución. Dependiendo de las condiciones, tales como, por ejemplo, pH, conductividad, concentración de sal, temperatura y/o caudal, algunas sustancias de la solución se unen al material de cromatografía y, por tanto, se pueden recuperar del material de cromatografía en otra etapa. Las sustancias que permanecen en solución se pueden encontrar en el flujo continuo. El "flujo continuo" indica la solución obtenida después del paso del dispositivo, que puede ser la solución aplicada o una solución tamponada, que se usa para lavar la columna o para provocar la elución de sustancias unidas al material de cromatografía. En un modo de realización, el dispositivo es una columna o un casete. En el caso b), el material de cromatografía se puede añadir, por ejemplo, como un sólido, a la solución, por ejemplo, que contiene la sustancia de interés que se va a purificar, permitiendo una interacción entre el material de cromatografía y las sustancias en solución. Después de la interacción se retira el material de cromatografía, por ejemplo, por filtración, y la sustancia unida al material de cromatografía también se retira con él de la solución, mientras que las sustancias no unidas al material de cromatografía permanecen en solución.

El término "modo de unión y elución" indica un modo de funcionamiento de una etapa de cromatografía, en la que se aplica una solución que contiene una sustancia de interés que se va a purificar a un material de cromatografía, con lo que la sustancia de interés se une al material de cromatografía. Por tanto, la sustancia de interés se retiene en el material de cromatografía, mientras que las sustancias que no son de interés se retiran con el flujo continuo o el sobrenadante. La sustancia de interés se recupera después del material de cromatografía en una segunda etapa con una solución de elución. En un modo de realización, el procedimiento como se informa en el presente documento se realiza en modo de unión y elución.

Las soluciones empleadas en el procedimiento como se informa en el presente documento son soluciones brutas o tamponadas. El término "solución tamponada" indica una solución en la que los cambios de pH debidos a la adición o liberación de sustancias ácidas o alcalinas se equilibran por la sustancia tampón disuelta. Se puede usar cualquier sustancia tampón con dichas propiedades. En general, se usan sustancias tampón farmacéuticamente aceptables. En un modo de realización, la solución tamponada se selecciona de una solución tamponada con fosfato que consiste en ácido fosfórico y/o sales del mismo, o una solución tamponada con acetato que consiste en ácido acético y sales del mismo, o una solución tamponada con citrato que consiste en ácido cítrico y/o sales del mismo, o una solución tamponada con morfolina, o una solución tamponada con 2-(N-morfolino)etanosulfónico, o una solución tamponada con histidina, o una solución tamponada con glicina o una solución tamponada con tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). En un modo de realización, la solución tamponada se selecciona de una solución tamponada con fosfato, o una solución tamponada con acetato, o una solución tamponada con citrato o una solución tamponada con histidina. Opcionalmente, la solución tamponada puede comprender una sal adicional, tal como, por ejemplo, cloruro de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, citrato de sodio o citrato de potasio. Se entiende en la técnica que las soluciones tamponadas se preparan en condiciones comparables a aquellas en las que se usan posteriormente. Por ejemplo, el pH de una solución tamponada se ajusta a una temperatura que es comparable a una temperatura a la que la solución se usa posteriormente en el procedimiento previsto. Si, por ejemplo, se usa una solución tamponada en un procedimiento de cromatografía que se realiza a 4 °C, el pH se ajustará cuando la solución tamponada tenga una temperatura comparable y, por ejemplo, no a 30 °C. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución tamponada con fosfato.

Los términos "elución continua" y "procedimiento de elución continua", que se usan de manera intercambiable en la presente solicitud, indican un procedimiento en el que la conductividad de una solución que provoca elución, es decir, la recuperación de un compuesto unido de un material de cromatografía se cambia, es decir, se eleva o reduce continuamente, es decir, la concentración se cambia por una secuencia de pequeñas etapas, cada una no más grande que un cambio de un 2 % o de un 1 % de la concentración de la sustancia que provoca elución. En esta "elución continua", una o más condiciones, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, concentración de una sal y/o el flujo de una cromatografía, se pueden cambiar de forma lineal o exponencial o asintótica. En un modo de realización, el cambio es lineal.

Los términos "elución por etapas", "elución de manera gradual", "procedimiento de elución de manera gradual" y "procedimiento de elución por etapas", que se usan de manera intercambiable en la presente solicitud, indican un procedimiento en el que, por ejemplo, la concentración de una sustancia que provoca elución, es decir, la disolución de un compuesto unido de un material, se eleva o reduce de una vez, es decir, directamente de un valor/nivel al siguiente valor/nivel. En esta "elución por etapas", una o más condiciones, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, concentración de una sal y/o el flujo de una cromatografía, se cambian todas a la vez de un primer valor, por ejemplo, inicial, a un segundo valor, por ejemplo, final, es decir, las condiciones se cambian de forma incremental, es decir, gradual, al contrario que un cambio lineal. En el "procedimiento de elución por etapas" después de cada incremento en la fuerza iónica se recoge una nueva fracción. Esta fracción contiene los compuestos recuperados del material de intercambio iónico con el correspondiente incremento en la fuerza iónica. Después de cada incremento, se mantienen las condiciones hasta la siguiente etapa en el procedimiento de elución. En la "etapa de elución" una o más condiciones se cambian todas a la vez desde un primer valor, por ejemplo, inicial, a un segundo valor, por ejemplo, final. El cambio puede ser de un 10 % o más de la concentración de la sustancia que provoca elución. Es decir, en caso de que la concentración de la sustancia que provoca elución sea de un 100 % en la primera etapa, un 110 % o más en la segunda etapa y un 120 % o más en la tercera etapa. Además, el cambio puede ser de un 50 % o más de la concentración de la sustancia que provoca elución. Además, el cambio puede ser de un 120 % o más de la concentración de la sustancia que provoca elución. "Elución por etapas" indica que las condiciones se cambian incrementalmente, es decir, de manera gradual, al contrario que un cambio lineal.

El término "material de cromatografía intercambio iónico" indica una matriz de alto peso molecular inmóvil que porta sustituyentes cargados unidos covalentemente usadacomo fase estacionaria en la cromatografía de intercambio iónico. Para la neutralidad de carga global, los contraiones no unidos covalentemente se unen a la misma. El "material de cromatografía de intercambio iónico" tiene la capacidad de intercambiar sus contraiones no unidos covalentemente por iones cargados de manera similar de la solución circundante. Dependiendo de la carga de sus contraiones intercambiables, la "resina de intercambio iónico" se denomina resina de intercambio catiónico o resina de intercambio aniónico. Dependiendo de la naturaleza del grupo cargado (sustituyente), la "resina de intercambio iónico" se denomina, por ejemplo, en el caso de resinas de intercambio catiónico, resina de ácido sulfónico (S) o resina de sulfopropilo (SP) o resina de carboximetilo (CM). Dependiendo de la naturaleza química del grupo cargado/sustituyente, la "resina de intercambio iónico" se puede clasificar adicionalmente como resina de intercambio iónico fuerte o débil, dependiendo de la fuerza del sustituyente cargado unido covalentemente. Por ejemplo, las resinas de intercambio catiónico fuerte tienen un grupo ácido sulfónico, preferentemente un grupo sulfopropilo, como sustituyente cargado, las resinas de intercambio catiónico débil tienen un grupo carboxílico, preferentemente un grupo carboximetilo, como sustituyente cargado, y las resinas de intercambio aniónico débil tienen un grupo dietilaminoetilo como sustituyente cargado. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía de intercambio catiónico fuerte. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía Toyopearl® SP-650. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico es material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M.

Para un experto en la técnica son bien conocidos los procedimientos para convertir una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, de un polipéptido, en una correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica esta secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, un ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácido nucleico que consiste en nucleótidos individuales y asimismo por la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado de este modo.

El término "poli(etilenglicol)" o "residuo de poli(etilenglicol)" indica un residuo no proteínico que contiene poli(etilenglicol) como parte esencial. Un residuo de poli(etilenglicol) de este tipo puede contener otros grupos químicos, que son necesarios para las reacciones de unión, que resultan de la síntesis química de la molécula, o que son espaciadores para la distancia óptima de las partes de la molécula. Estos otros grupos químicos no se usan para el cálculo del peso molecular del residuo de poli(etilenglicol). Además, un residuo de poli(etilenglicol) de este tipo puede consistir en una o más cadenas de poli(etilenglicol) que se unen covalentemente entre sí. Los residuos de poli(etilenglicol) con más de una cadena de PEG se denominan residuos de poli(etilenglicol) ramificados o de múltiples ramas. Se pueden preparar residuos de poli(etilenglicol) ramificados, por ejemplo, por la adición de poli(óxido de etileno) a diversos polioles, incluyendo glicerol, pentaeritriol y sorbitol. Se informa de residuos de poli(etilenglicol) ramificados, por ejemplo, en los documentos EP 0473084, US 5.932.462. En un modo de realización, el residuo de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de 20 kDa a 35 kDa y es un residuo de poli(etilenglicol) lineal. En otro modo de realización, el residuo de poli(etilenglicol) es un residuo de poli(etilenglicol) ramificado con un peso molecular de 35 kDa a 40 kDa.

El término "fusión de eritropoyetina con un residuo de poli(etilenglicol)" indica un enlace introducido químicamente covalente de un residuo de poli(etilenglicol) en el extremo N o un residuo de lisina interna de eritropoyetina. La fusión da como resultado un conjugado de proteína, que comprende una molécula de eritropoyetina y uno o más residuos de poli(etilenglicol). El procedimiento de fusión también se denomina PEGilación y el producto del mismo como eritropoyetina PEGilada. La fusión/conjugación de polipéptidos con residuos de poli(etilenglicol) es ampliamente conocida en el estado de la técnica y se revisa, por ejemplo, por Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. El residuo de poli(etilenglicol) se puede unir usando diferentes grupos funcionales. Se pueden usar poli(etilenglicoles) con diferente peso molecular, diferente forma, así como diferentes grupos de enlace (véase también Francis, G.E., et al, Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304). La fusión de eritropoyetina y un residuo de poli(etilenglicol) se puede realizar en solución acuosa con reactivos de residuo de poli(etilenglicol) como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/44785. La fusión también se puede realizar en la fase sólida de acuerdo con Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. También se puede producir la fusión de forma N terminal no aleatoriamente de acuerdo con el documento WO 94/01451.

Los términos "fusión de eritropoyetina y poli(etilenglicol)" y "PEGilación" indican la formación de un enlace covalente entre un residuo de poli(etilenglicol) en el extremo N de la eritropoyetina y/o un residuo de lisina interna para obtener un conjugado de proteína, que comprende una molécula de eritropoyetina y un residuo de poli(etilenglicol). En un modo de realización, la PEGilación de eritropoyetina se realiza en solución acuosa usando moléculas de PEG lineales o ramificadas activadas con NHS de un peso molecular entre 5 kDa y 40 kDa.

El término "en condiciones adecuadas para la unión" y equivalentes gramaticales del mismo como se usa en la presente solicitud indica que una sustancia de interés, por ejemplo, una eritropoyetina PEGilada, se une a una fase estacionaria cuando se pone en contacto con ella, por ejemplo, un material de intercambio iónico. Esto no indica necesariamente que un 100 % de la sustancia de interés se una, sino que esencialmente un 100 % de la sustancia de interés se une, es decir, al menos un 50 % de la sustancia de interés se une, al menos un 75 % de la sustancia de interés se une, al menos un 85 % de la sustancia de interés se une, o más de un 95 % de la sustancia de interés se une a la fase estacionaria.

La fusión química o conjugación de eritropoyetina y poli(etilenglicol) en general da como resultado una mezcla de diferentes compuestos, tales como eritropoyetina poli-PEGilada (eritropoyetina oligo-PEGilada), eritropoyetina mono-PEGilada (con un único residuo de poli(etilenglicol)), eritropoyetina no PEGilada, productos de hidrólisis del éster de PEG activado, así como productos de hidrólisis de la propia eritropoyetina. Para obtener una eritropoyetina mono-PEGilada en una forma sustancialmente homogénea, estas sustancias se han de retirar/separar entre sí.

Por lo tanto, es un aspecto como se informa en el presente documento proporcionar un procedimiento para obtener una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende un material de cromatografía de intercambio catiónico, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

c) aplicar una solución con conductividad creciente a la columna y recuperar de este modo por separado la proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), y eritropoyetina, con lo que la proteína que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol) se recupera en primer lugar.

En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía de intercambio catiónico fuerte. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía Toyopearl® SP-650. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico es material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un valor de conductividad constante. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y/o la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen un valor de conductividad constante de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,2 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm. En un modo de realización preferente, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 2,9 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm o un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 18 mS/cm.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen aproximadamente el mismo valor de conductividad constante.

En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 65 pm.

Este procedimiento es en especial útil para la purificación de eritropoyetina recombinante PEGilada, que está glucosilada, es decir, que se ha producido por una célula de mamífero, en un modo de realización por una célula CHO, o una célula HEK293, o una célula BHK, o una célula Per.C6®, o una célula HeLa y después de esto se PEGila químicamente.

En la primera etapa del procedimiento la eritropoyetina se PEGila. Las moléculas de polímero poli(etilenglicol) (PEG) usadas en la reacción de PEGilación tienen un peso molecular de aproximadamente 20 kDa a 40 kDa (el término "peso molecular" como se usa en el presente documento se debe entender como el peso molecular medio del PEG porque el PEG como compuesto polimérico no se obtiene con un peso molecular definido sino que de hecho tiene una distribución de peso molecular; el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de PEG, algunas moléculas pesarán más y algunas menos que el peso molecular indicado, es decir, el término aproximadamente se refiere a una distribución de peso molecular en la que un 95 % de las moléculas de PEG tienen un peso molecular dentro de /- 10 % del peso molecular indicado. Por ejemplo, un peso molecular de 30 kDa indica un intervalo de desde 27 kDa a 33 kDa).

El término "eritropoyetina" y su abreviatura "EPO" se refieren a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, o una proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a la misma, con propiedades biológicas que se relacionan con la estimulación de la producción de glóbulos rojos y la estimulación de la división y diferenciación de progenitores eritroides sensibilizados en la médula ósea. Se puede preparar eritropoyetina recombinante por medio de la expresión en células eucariotas, por ejemplo en células CHO, o células BHK, o células HeLa por tecnología de ADN recombinante o por activación de genes endógenos, es decir, la glucoproteína eritropoyetina se expresa por activación de genes endógenos, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.733.761, US 5.641.670, US 5.733.746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955. En un modo de realización, la eritropoyetina es EPO humana. En un modo de realización, la eritropoyetina humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En un modo de realización, la eritropoyetina humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. El término "eritropoyetina" también indica variantes de la proteína de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, en la que uno o más residuos aminoacídicos se han cambiado, delecionado o insertado, y que tiene actividad biológica comparable a la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, la informada en los documentos EP 1064 951 o US 6.583.272. Una variante puede tener la secuencia de aminoácidos de eritropoyetina humana que tiene de 1 a 6 sitios adicionales para la glucosilación. La actividad específica de la eritropoyetina PEGilada se puede determinar por diversos ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de la eritropoyetina PEGilada purificada es tal que la administración de la proteína por inyección a pacientes humanos da como resultado células de médula ósea que incrementan la producción de reticulocitos y glóbulos rojos en comparación con grupos de sujetos no inyectados o de control. La actividad biológica de la eritropoyetina PEGilada obtenida y purificada de acuerdo con el procedimiento como se informa en el presente documento se puede someter a prueba por procedimientos de acuerdo con Bristow, A., Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals b Rp Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48.

Las variantes de secuencia de aminoácidos de eritropoyetina se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica la eritropoyetina, o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de la eritropoyetina. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea actividad biológica comparable con la eritropoyetina humana.

Se muestran sustituciones aminoacídicas conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en eritropoyetina humana y los productos cribar para determinar la retención de la actividad biológica de eritropoyetina humana.

TABLA 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

La PEGilación química de eritropoyetina en general da como resultado una preparación de proteína que comprende eritropoyetina que está PEGilada en uno o más grupos amino £ de residuos de lisina y/o en el grupo amino N terminal. Se puede realizar la PEGilación selectiva en el aminoácido N terminal de acuerdo con Felix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly(ethylene glycol)) (1997) 218-238. Se puede lograr la PEGilación N terminal selectiva durante la síntesis en fase sólida por acoplamiento de un derivado aminoacídico PEGilado en Na al aminoácido N-1 terminal de la cadena peptídica. Se puede realizar la PEGilación de la cadena lateral durante la síntesis en fase sólida por acoplamiento de derivados de lisina PEGilados en N£ a la cadena en crecimiento. La PEGilación combinada N terminal y de cadena lateral es factible como se describe anteriormente en la síntesis en fase sólida o bien por síntesis en fase de solución aplicando reactivos de PEG activado a un péptido con amino desprotegido.

Los derivados de PEG adecuados son moléculas de PEG activado con, como en un modo de realización, un peso molecular promedio de desde aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 40 kDa, en otro modo de realización de desde aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa, y en otro modo de realización de aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 35 kDa. Los derivados de PEG pueden ser PEG lineales o ramificados. Está disponible una amplia variedad de derivados de PEG adecuados para su uso en la preparación de conjugados PEG-proteína y PEG-péptido.

Los derivados de PEG activado son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, para PEG-vinilsulfona. Las especies de PEG de cadena lineal y de cadena ramificada son adecuadas para la preparación de los fragmentos PEGilados. Los ejemplos de reactivos de PEG reactivos son yodo-acetil-metoxi-PEG o metoxi-PEG-vinilsulfona (m es, en un modo de realización, un número entero de aproximadamente 450 a aproximadamente 900 y R es alquilo inferior, lineal o ramificado, que tiene de uno a seis átomos de carbono tal como metilo, etilo, isopropilo, etc., con lo que metilo es preferente):

El uso de estas sustancias activadas por yodo es conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, por Hermanson, G. T., en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) pp. 147-148.

En un modo de realización, la especie de PEG es un éster de PEG activado, por ejemplo, propionato de N-hidroxisuccinimidilo, o butanoato de N-hidroxisuccinimidilo, o N-hidroxisuccinimida tal como PEG-NHS (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). En un modo de realización, el PEG se activa por el éster de N-hidroxisuccinimida

usando alcoxi-PEG-N-hidroxisuccinimida, tal como metoxi-PEG-N-hidroxisuccinimida (MW 30000), en el que R y m son como se define anteriormente. En un modo de realización, la especie de PEG es el éster N-hidroxisuccinimidílico del ácido metoxi-poli(etilenglicol)-butírico. El término "alcoxi" se refiere a un grupo éter alquílico en el que el término "alquilo" quiere decir un grupo alquilo de cadena lineal o cadena ramificada que contiene un máximo de cuatro átomos de carbono, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi y similares, preferentemente metoxi.

El término "forma sustancialmente homogénea" indica que la fusión o conjugado de proteína eritropoyetina obtenido, contenido o usado es uno que tiene un número definido de residuos de PEG unidos. En un modo de realización, la eritropoyetina PEGilada es una eritropoyetina mono-PEGilada. La preparación puede contener eritropoyetina sin reaccionar (es decir, que carece de grupo PEG), eritropoyetina poli-PEGilada, así como fragmentos del polipéptido generado durante la reacción de PEGilación. El término "forma sustancialmente homogénea" indica que una preparación de una eritropoyetina mono-PEGilada contiene al menos un 50 % (p/p) de la eritropoyetina mono-PEGilada, o al menos un 75 % de la eritropoyetina mono-PEGilada, o al menos un 90 % de la eritropoyetina mono-PEGilada, o más de un 95 % de la eritropoyetina mono-PEGilada. Los valores en porcentaje se basan en el % de área del cromatograma correspondiente al procedimiento de cromatografía con el que se obtiene la eritropoyetina mono-PEGilada.

En el presente documento se informa de un procedimiento para la purificación de una eritropoyetina PEGilada para obtener una forma sustancialmente homogénea de una eritropoyetina mono-PEGilada. Se ha descubierto que el procedimiento de purificación se puede mejorar usando/empleando solo una única etapa de cromatografía dando como resultado un procedimiento que es simplificado y técnicamente más practicable.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener/producir/purificar eritropoyetina mono-PEGilada usando un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 en una única etapa de cromatografía introduciendo/aplicando una etapa de lavado además de la etapa de lavado normal, que emplea una solución que tiene un valor de pH que se incrementa con respecto al valor de pH en la primera etapa de lavado. Se ha descubierto que la retirada/reducción de impurezas de eritropoyetina oligo-PEGilada en la eritropoyetina mono-PEGilada se puede mejorar usando esta etapa de lavado adicional.

Por lo tanto, el procedimiento para obtener/producir/purificar una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), como se informa en el presente documento, comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende Toyopearl® SP-650 como material de cromatografía, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

c) aplicar una solución con una conductividad creciente a la columna y recuperar de este modo la proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol).

Se ha descubierto que la separación de eritropoyetina mono-PEGilada de/retirada de subproductos se mejora si después de aplicar la solución de lavado con el pH incrementado, se vuelve a aplicar la primera solución de lavado con el pH menor. Por tanto, el procedimiento comprende además la etapa de volver a aplicar la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 después de la etapa b) y antes de la etapa c).

Se ha descubierto que en la etapa de lavado adicional/segunda, la segunda solución debe tener un valor de pH incrementado, con lo que el incremento es de una determinada magnitud.

En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,1. En un modo de realización preferente, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0. En un modo de realización preferente, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 2,9. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un pH de aproximadamente 2,8 a aproximadamente 3,0.

En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa hasta en un 25 % en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa hasta en un 20% en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa hasta en un 15% en comparación con la primera solución.

En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa en 0,5 unidades de pH en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa en 0,4 unidades de pH en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa en 0,3 unidades de pH en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa en 0,2 unidades de pH en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa en 0,1 unidades de pH en comparación con la primera solución.

En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa de 0,1 a 0,5 unidades de pH en comparación con la primera solución. En un modo de realización, el pH de la segunda solución con un valor de pH incrementado se incrementa de 0,3 a 0,5 unidades de pH en comparación con la primera solución.

La solución con un valor de pH incrementado se debe aplicar como una solución con conductividad constante, es decir, a un valor de conductividad que varía como máximo /- 10 %, preferentemente como máximo /- 5 %.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un valor de conductividad constante. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y/o la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen un valor de conductividad constante de aproximadamente 17 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y/o la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen un valor de conductividad constante de aproximadamente 18 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y/o la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen un valor de conductividad constante de aproximadamente 19 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 18 mS/cm. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 2,9 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 19 mS/cm.

En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm. En un modo de realización preferente, la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 2,9 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm.

Se entiende en la técnica que el pH y la conductividad están relacionados entre sí. Por lo tanto, los valores de pH de las soluciones de lavado pueden ser diferentes a los descritos anteriormente, si también se cambia la conductividad. Por ejemplo, el pH se puede incrementar en mayor medida cuando la conductividad es menor, mientras se logran resultados de purificación comparables.

Se ha descubierto que cuando se aplica la solución con un valor de pH incrementado, la conductividad se debe mantener constante con respecto a la primera solución de lavado. En un modo de realización, la segunda solución con un valor de pH incrementado y la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen aproximadamente el mismo valor de conductividad constante.

Después de que se haya recuperado la eritropoyetina poli-PEGilada del material de cromatografía, se inicia la elución de la eritropoyetina mono-PEGilada por un incremento en la conductividad. La conductividad de la fase móvil que pasa por el material de cromatografía incrementa de manera lineal o gradual.

En un modo de realización, la solución con conductividad creciente tiene una conductividad que se incrementa de manera lineal o gradual.

En el gradiente de conductividad, en primer lugar se recupera eritropoyetina mono-PEGilada de la columna y después se recupera eritropoyetina no PEGilada sustancialmente homogénea.

El incremento en la conductividad es, en un modo de realización, aplicando una solución con una concentración de cloruro de sodio creciente. En un modo de realización, la solución aplicada para incrementar la conductividad tiene un valor de pH de 2,5 a 3,5.

En un modo de realización, la solución que comprende una mezcla de eritropoyetina libre y poli(etilenglicol) libre así como proteínas de fusión (es decir, conjugados de proteínas) de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina se aplica al material de cromatografía, de desde 1 mg/ml hasta 4 mg/ml de proteína se aplica a 1 ml de material de cromatografía.

Se ha descubierto que el procedimiento descrito en el presente documento (en especial cuando se usa Toyopearl® SP-650 como material de cromatografía) se puede usar para la purificación de proteína a gran escala.

El término "material de cromatografía Toyopearl® SP-650" indica un material de cromatografía de intercambio catiónico (disponible de Tosoh Corporation). El material de cromatografía Toyopearl® SP-650 tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional y es, por tanto, un material de cromatografía de intercambio catiónico fuerte. El material de cromatografía Toyopearl® SP-650M tiene un tamaño de partícula de 65 pm.

En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico tiene una matriz de metacrilato. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico tiene un sulfopropilo como grupo funcional. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional. En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 65 pm.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, de la que su verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 01 Secuencia de aminoácidos de eritropoyetina humana.

SEQ ID NO: 02 Secuencia de aminoácidos de eritropoyetina humana.

Descripción de las figuras

Figura 1 Cromatograma de elución de una purificación de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un procedimiento como se informa en el ejemplo 1 (lavado a pH 2,5; sin etapa de lavado adicional).

Figura 2 Cromatograma de elución de una purificación de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un procedimiento como se informa en el ejemplo 3 (lavado a pH 2,5; etapa de lavado adicional a pH 2,8).

Figura 3 Aumento del cromatograma de elución (fig. 2) de una purificación de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un procedimiento como se informa en el ejemplo 3 (lavado a pH 2,5; etapa de lavado adicional a pH 2,8).

Figura 4 Cromatograma de elución de una purificación de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un procedimiento como se informa en el ejemplo 2 (lavado a pH 3,0; sin etapa de lavado adicional).

Figura 5 Cromatograma de elución de una purificación de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un procedimiento como se informa en el ejemplo 4 (lavado a pH 2,5; etapa de lavado adicional a pH 3,0).

Ejemplo 1

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M sin una etapa de lavado adicional (pH 2,5)

La cromatografía de eritropoyetina PEGilada se realizó como se muestra a continuación.

Cromatografía de eritropoyetina PEGilada:

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19,6 ml

carga de muestra: 1.3 mg/ml de resina

caudal: 1.3 ml/min

soluciones: A: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,5, ajustado a LF = 19 mS/cm con 5 m cloruro de sodio

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

solución de aplicación: 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 100 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): ninguna

volumen de lavado (lavado 2): ninguna

solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 196 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda: 280 nm

El cromatograma de elución para este procedimiento se muestra en la figura 1.

Ejemplo 2

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M sin una etapa de lavado adicional (pH 3,0)

Cromatografía de eritropoyetina PEGilada:

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19,6 ml

carga de muestra: 1.3 mg/ml de resina

caudal: 1.3 ml/min

soluciones: A: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 3,0, con un valor de conductividad = 20,5 mS/cm

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

solución de aplicación: 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 100 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): ninguna

volumen de lavado (lavado 2): ninguna

solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 196 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda: 280 nm

El cromatograma de elución para este procedimiento se muestra en la figura 4.

Ejemplo 3

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M con una etapa de lavado adicional con una solución con un pH de 2,8 y una conductividad de aproximadamente 19 mS/cm

La cromatografía de eritropoyetina PEGilada se realizó como se muestra a continuación:

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19,6 ml

carga de muestra: 1.3 mg/ml de resina

caudal: 1.3 ml/min

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

Lavado adicional (lavado 2): fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,8, ajustado a LF = 19 mS/cm con agua

solución de aplicación: 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 100 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): 100 % lavado adicional (lavado 2)

volumen de lavado (lavado 2): 100 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 3): 100 % A

volumen de lavado (lavado 3): 60 ml (3 volúmenes de columna (VC))

solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 196 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda: 280 nm

El cromatograma de elución para este procedimiento se muestra en la figura 2 y un aumento se muestra en la figura 3.

Ejemplo 4

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M con una etapa de lavado adicional con una solución con un pH de 3,0 y una conductividad de aproximadamente 19 mS/cm

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19,6 ml

carga de muestra: 1.3 mg/ml de resina

caudal: 1.3 ml/min

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

Lavado adicional (lavado 2): fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 3,0, ajustado a LF = 19 mS/cm con agua

solución de aplicación; 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 100 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): 100 % lavado adicional (lavado 2)

volumen de lavado (lavado 2): 100 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 3): 100 % A

volumen de lavado (lavado 3): 60 ml (3 volúmenes de columna (VC))

solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 196 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda: 280 nm

El cromatograma de elución para este procedimiento se muestra en la figura 5.

Ejemplo 5

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M con una etapa de lavado adicional con una solución de diferentes valores de pH (pH 2,8, 2,9 o 3,0) y una conductividad de aproximadamente 17 mS/cm

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19.2 ml

carga de muestra: 0,7 mg/ml de resina

caudal: 150 cm/h

soluciones: A: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,5, ajustado a LF = 17 mS/cm con 5 m cloruro de sodio

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

Lavado adicional (lavado 2): fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,8, 2,9 o 3,0 ajustado a LF = 17 mS/cm con agua

solución de aplicación: 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 96.2 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): 100 % lavado adicional (lavado 2)

volumen de lavado (lavado 2): 96.2 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 3): 100 % A

volumen de lavado (lavado 3): 57,7 ml (3 volúmenes de columna (VC))

solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 192 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda: 280 nm

Los resultados se muestran a continuación:

Los rendimientos se calculan en base al contenido de EPO mono-PEGilada en el material de partida.

Ejemplo 6

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M con una etapa de lavado adicional con una solución de diferentes valores de pH (pH 2,8, 2,9 o 3,0) y una conductividad de aproximadamente 18 mS/cm

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19.2 ml

carga de muestra: 0,7 mg/ml de resina

caudal: 15,0 cm/h

soluciones: A: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,5, ajustado a LF = 18 mS/cm con 5 m cloruro de sodio

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

Lavado adicional (lavado 2): fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,8, 2,9 o 3,0 ajustado a LF = 18 mS/cm con agua

solución de aplicación: 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 96.2 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): 100 % lavado adicional (lavado 2)

volumen de lavado (lavado 2): 96.2 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 3): 100 % A

volumen de lavado (lavado 3): 57,7 ml (3 volúmenes de columna (VC))

solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 192 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda; 280 nm

Los resultados se muestran a continuación:

Ejemplo 7

Cromatografía de una preparación de eritropoyetina PEGilada con un material de cromatografía Toyopearl® SP-650 M con una etapa de lavado adicional con una solución de diferentes valores de pH (pH 2,8, 2,9 o 3,0) y una conductividad de aproximadamente 19 mS/cm

resina: SP Toyopearl 650 M

volumen de lecho: 19.2 ml

carga de muestra: 0,7 mg/ml de resina

caudal: 150 cm/h

B: fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 375 mM, ajustado a pH 2,5

Lavado adicional (lavado 2): fosfato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, ajustado a pH 2,8, 2,9 o 3,0 ajustado a LF = 19 mS/cm con agua

solución de aplicación: 100 % A

solución de lavado: 100 % A

volumen de lavado: 96.2 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 2): 100 % lavado adicional (lavado 2)

volumen de lavado (lavado 2): 96.2 ml (5 volúmenes de columna (VC))

solución de lavado (lavado 3): 100 % A

volumen de lavado (lavado 3): 57,7 ml (3 volúmenes de columna (VC)) solución de elución de gradiente lineal: 100 % B

gradiente lineal: dentro de 196 ml (10 volúmenes de columna) al 100 %

B

longitud de onda: 280 nm

Los resultados se muestran a continuación:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para purificar una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina a una columna, que comprende un material de cromatografía que tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional, a la que se ha aplicado una primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7,

b) aplicar una segunda solución con un valor de pH incrementado con respecto a la primera solución,

2. Un procedimiento para producir una proteína, que comprende eritropoyetina y un único residuo de poli(etilenglicol), que comprende las siguientes etapas:

3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el procedimiento comprende además la etapa de volver a aplicar la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 después de la etapa b) y antes de la etapa c).

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la segunda solución con un valor de pH incrementado es una solución con un valor de conductividad constante.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la segunda solución con un valor de pH incrementado y la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen aproximadamente el mismo valor de conductividad constante.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la segunda solución con un valor de pH incrementado y/o la primera solución con un pH de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,7 tienen un valor de conductividad constante de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la segunda solución con un valor de pH incrementado tiene un pH de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,0 y tiene un valor de conductividad de aproximadamente 17 mS/cm a aproximadamente 19 mS/cm.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la solución que comprende una mezcla de eritropoyetina y conjugados de eritropoyetina y poli(etilenglicol) con uno o más residuos de poli(etilenglicol) por molécula de eritropoyetina no se ajusta a un valor de conductividad de aproximadamente 19 mS/cm.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la solución con conductividad creciente es una solución con concentración de cloruro de sodio creciente.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la solución con conductividad creciente tiene una conductividad que se incrementa de manera lineal o gradual.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que el procedimiento se usa en preparaciones de proteína a gran escala en las que la columna de cromatografía de la etapa a) tiene un diámetro de al menos 30 cm.

13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que la eritropoyetina es eritropoyetina humana.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que la eritropoyetina humana tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 o SEQ ID NO: 02.

15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que el único residuo de poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de desde 20 kDa a 40 kDa.

16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por que el material de cromatografía que tiene una matriz de metacrilato con un sulfopropilo como grupo funcional es un material de cromatografía Toyopearl® SP-650.