ES2855728T3

ES2855728T3 - Sistema fúngico de producción de proteínas de alto nivel

Info

Publication number: ES2855728T3
Application number: ES17717532T
Authority: ES
Inventors: Jurian Alexander Bronkhof; Jean-Paul Meijnen; Carola Bianca Michielse; Der Burgt Ismail Atalay Van; Jacob Visser; Johannes Heinrich Visser
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: EP3419992A1; US10072267B2; CN109661402A; EP3419992B1; BR112018015626A2; WO2017147163A1; DK3419992T3; US20170240909A1; CN109661402B

Abstract

Célula fúngica filamentosa modificada que presenta una producción aumentada de una proteína de interés, donde dicha célula fúngica ha sido modificada mediante modificación genética del gen ubc9 para reducir la producción y/o actividad de la proteína Ubc9, de modo que da lugar a sumoilación alterada.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema fúngico de producción de proteínas de alto nivel

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se enmarca en el ámbito de los sistemas de producción de proteínas y, más en concreto, de los sistemas fúngicos de producción capaces de producir altos niveles de proteína. La invención se basa en el descubrimiento de que la modificación de la sumoilación da lugar a un aumento de la producción de proteínas. La presente invención hace que estos sistemas fúngicos mutantes sean adecuados para la producción de proteínas en la industria.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0002] El contenido del listado de secuencias presentado por vía electrónica en texto ASCII que se presenta con este documento (Número de documento: NB36013WOPCT_SEQLIST_ST25.txt; Tamaño: 143,201 bytes; y con fecha de creación 22 de febrero de 2017) forma parte de la presente memoria.

ANTECEDENTES

[0003] La producción de enzimas utilizadas en aplicaciones industriales constituye un mercado creciente impulsado por la necesidad de pasar de una economía basada en fuentes fósiles a una economía basada en la biomasa. La demanda creciente de estas enzimas hace que el coste de la producción de enzimas se convierta en un gasto importante. La reducción del coste de la producción de enzimas requiere la exploración de nuevas enzimas, así como de métodos fiables para obtener procesos de producción de alto rendimiento. Con el fin de establecer procesos de producción de enzimas rentables, la producción y secreción de proteínas de alto nivel son requisitos fundamentales.

[0004] Los hongos han sido utilizados como huéspedes para la producción de una variedad de enzimas. Las cepas que pertenecen a los siguientes géneros, pero sin limitarse a los mismos: Chrysosporium, Thielavia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus, Neurospora, Aureobasidium, Filivasidium, Piromyces, Corynascus, Cryptococcus, Acremonium, Tolypocaldium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola y Trichoderma, así como los anamorfos y teleomorfos de los mismos, han sido aplicadas en la producción industrial de una amplia variedad de enzimas. Se han desarrollado cepas que secretan hasta 100 g/L o más de proteína en el caldo de fermentación; véase, por ejemplo, Visser et al., (Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1, Industrial Biotechnology, 2011. 7(3): pp. 214-223) y la solicitud de patente europea n.° 2408910. La capacidad de secreción de proteínas de estos hongos las convierte en huéspedes atractivos para la producción dirigida de enzimas específicas o mezclas de enzimas.

[0005] El documento WO2008083271A2 hace referencia a métodos para mejorar los niveles de expresión y se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una SUMO alterada artificialmente, donde dicha SUMO alterada artificialmente es una proteína SUMO donde al menos un residuo de arginina en el dominio de interacción de proteasa SUMO ha sido modificado a un aminoácido no básico.

[0006] WANG Z ET AL, "Human SUMO fusion systems enhance protein expression and solubility", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, California, vol. 73, n.° 2, hace referencia al uso de SUMO1 y SUMO2 humanas en la tecnología de fusión de genes.

[0007] ZUO XUN ET AL, "Enhanced expression and purification of membrane proteins by SUMO fusion in Escherichia coli.", JOURNAL OF STRUCTURAL AND FUNCTIONAL GENOMICS 2005, (2005), vol. 6, n.° 2-3, ISSN 1345-711X, páginas 103 - 111, se refiere a la expresión de diferentes proteínas en Escherichia coli mediante la utilización de un sistema de expresión de fusión de genes basado en las propiedades chaperonas de la etiqueta SUMO.

[0008] El documento WO2014081700A1 hace referencia a los polipéptidos de degradación de biomasa de Myceliophthora thermophila y a los polipéptidos de Myceliophthora thermophila que aumentan la productividad de las proteínas, a los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos y a métodos de producción de los polipéptidos.

[0009] WONG K H ET AL, "Sumoylation in Aspergillus nidulans: sumO inactivation, overexpression and live-cell imaging", FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY, SAN DIEGO, California, EE. UU., vol. 45, n.° 5, ISSN 1087 1845, (20080501), páginas 728 - 737, hace referencia al gen codificante de SUMO, sumO, del hongo filamentoso Aspergillus nidulans.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0010] La invención de la presente memoria es como se define en las reivindicaciones.

[0011] En la presente memoria, se dan a conocer células modificadas que presentan un aumento de producción de proteínas. Se dan a conocer células modificadas que han sido modificadas para dar lugar a sumoilación alterada. El aumento en la producción de proteínas puede ser un aumento de la producción de proteínas global de al menos 1,1 en comparación con la producción de proteínas total de la célula parental que carece de la modificación de sumoilación. El aumento en la producción de proteínas puede ser un aumento de la producción de una proteína de interés de al menos 1,1 en comparación con la producción de dicha proteína por la célula parental que carece de la modificación de sumoilación.

[0012] En la presente memoria, se dan a conocer células modificadas en las que se ha modificado la sumoilación por modificación genética de al menos un gen que codifica una proteína endógena de la maquinaria de sumoilación. La modificación genética puede ser una mutación, inserción y/o deleción puntual. La modificación genética puede ser una modificación dirigida. La modificación genética puede ser una modificación de una secuencia reguladora de expresión o la secuencia codificante. En algunos modos de realización, la sumoilación se modifica mediante la reducción de la producción y/o la actividad de Ubc9. En algunos modos de realización, Ubc9 es modificada por una alteración genética situada en la secuencia codificante o en la secuencia promotora del gen ubc9. En algunos modos de realización, el gen ubc9 presenta un homólogo de tipo salvaje que presenta al menos un 50 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 1 [M. thermophila], En algunos modos de realización, el gen ubc 9 presenta un homólogo de tipo salvaje que codifica una proteína que comprende el dominio PFAM PF00179. En algunos modos de realización, el gen ubc 9 presenta un homólogo de tipo salvaje que codifica una proteína que comprende una secuencia que presenta al menos un 75 % de identidad con respecto a uno o varios de los motivos de secuencia de SEQ ID NO: 42 o 43.

[0013] Las células modificadas que se dan a conocer en la presente memoria pueden ser células fúngicas, tales como las células fúngicas filamentosas. Las células modificadas pueden ser células fúngicas del género seleccionado de entre el grupo que consiste en Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Corynascus, Cryptococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Trichoderma, Talaromyces y Rasamsonia. En algunos modos de realización, la célula es o se obtiene a partir de Myceliophthora thermophila. En algunos modos de realización, la célula es o se obtiene a partir de una cepa seleccionada de entre el grupo que consiste en C1 (depositada en el Depósito Internacional de la All Russian Collection of micro-organisms de la Academia de Ciencias de Rusia con el número de acceso VKM F-3500D), UV18-25 (depositada en VKM con el número de acceso VKM F-3631 D), UV18#100f (depositada en el CBS con el número de acceso CBS122188), W1L (depositada en el CBS con el número de acceso CBS122189) y W1L#100L (cepa depositada en el CBS con el número de acceso CBS122190). En algunos modos de realización, la célula es una célula de Myceliophthora thermophila. En algunos modos de realización, la célula no se obtiene a partir de C1, ni se obtiene a partir de UV18-25, ni se obtiene a partir de UV18#100f, ni se obtiene a partir de W1L, ni se obtiene a partir de W1L#100L. En algunos modos de realización, la célula no se obtiene a partir de W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5. En algunos modos de realización, la célula es o se obtiene a partir de Trichoderma y, en algunos modos de realización, la célula es o se obtiene a partir de Trichoderma reesei. En algunos modos de realización, la célula es o se obtiene a partir de Aspergillus y, en algunos modos de realización, la célula es o se obtiene a partir de Aspergillus niger.

[0014] Las células modificadas que se dan a conocer en la presente memoria pueden comprender, además, un constructo de expresión exógena que codifica al menos una proteína de interés. En algunos modos de realización, la proteína de interés es una proteína heteróloga. En algunos modos de realización, la proteína de interés es una acetilesterasa, aminopeptidasa, amilasa, arabinasa, arabinofuranosidasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasa, epimerasa, esterasa, a-galactosidasa, pgalactosidasa, a-glucanasa, glucanolisasa, endo-p-glucanasa, glucoamilasa, glucosaoxidasa, a-glucosidasa, pglucosidasa, glucuronidasa, hemicelulasa, hexosaoxidasa, hidrolasa, invertasa, isomerasa, lacasa, lipasa, liasa, manosidasa, oxidasa, óxidorreductasa, pectatoliasa, pectinacetilesterasa, pectin depolimerasa, pectinmetilesterasa, enzima pectolítica, peroxidasa, fenoloxidasa, fitasa, poligalacturonasa, proteasa, ramnogalacturonasa, ribonucleasa, taumatina, transferasa, proteína transportadora, transglutaminasa, xylanasa, hexosaoxidasa, un fragmento funcional de las mismas o una mezcla de una o varias de entre ellas. En algunos modos de realización, la proteína de interés es una hormona peptídica, un factor de crecimiento, un factor de coagulación, una quimiocina, una citocina, una linfocina, un anticuerpo, un receptor, una molécula de adhesión, un antígeno microbiano, un fragmento funcional de los mismos o una mezcla de uno o varios de los mismos. En algunos modos de realización, la proteína es una enzima para la degradación de material lignocelulósico o un fragmento activo de la misma. En consecuencia, en algunos modos de realización, la proteína de interés no es una enzima para la degradación de material lignocelulósico ni un fragmento activo de la misma. En algunos modos de realización, la proteína de interés es una celobiohidrolasa, xilanasa, endoglucanasa, p-glucosidasa, pxilosidasa, una enzima accesoria, glucoamilasa, alfa-amilasa, alfa-glucosidasa, fitasa, proteasa, aminopeptidasa, mananasa, lacasa, catalasa, glucosa o hexosaoxidasa, oligosacárido oxidasa, lipasa o una mezcla de una o varias de las mismas.

[0015] En la presente memoria, también se dan a conocer procesos para la producción de una célula modificada que presenta una mayor producción de proteínas en comparación con la célula parental que no ha sido modificada, que comprenden la introducción de al menos una modificación genética en un gen que codifica una proteína de sumoilación. En algunos modos de realización, la modificación genética es una mutación, inserción y/o deleción puntual. En algunos modos de realización, la modificación genética es específica. En algunos modos de realización, la modificación genética resultante es una modificación de una secuencia reguladora de expresión o la secuencia codificante. En algunos modos de realización, la secuencia reguladora de expresión es una secuencia promotora. En algunos modos de realización, la modificación genética da lugar a una producción y/o actividad menor de Ubc9. En algunos modos de realización, la modificación genética abarca una alteración genética situada en la secuencia promotora del gen ubc9. En algunos modos de realización, el gen ubc9 presenta un homólogo de tipo salvaje que presenta al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con respecto a la región promotora o la región codificante o ambas de SEQ ID NO: 1 [ubc9 de M. thermophila]. En algunos modos de realización, el gen ubc9 presenta un homólogo de tipo salvaje que comprende una secuencia con al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 47 o 48. En algunos modos de realización, el gen ubc 9 presenta un homólogo de tipo salvaje que comprende una secuencia con al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con respecto a la porción promotora o codificante de SEQ ID NO: 45.

[0016] En la presente memoria, también se dan a conocer procesos para la producción de un sistema de expresión que comprenden la etapa de transducir una célula modificada proporcionada en la presente memoria o una célula modificada obtenida mediante un proceso dado a conocer en la presente memoria. En algunos modos de realización, la célula se transduce con al menos un constructo de expresión exógena que codifica al menos una proteína de interés. En algunos modos de realización, la al menos una proteína de interés es heteróloga a la célula.

[0017] También se da a conocer un proceso para la producción de una proteína de interés, que comprende la etapa de cultivar una célula modificada proporcionada en la presente memoria o una célula modificada o un sistema de expresión proporcionados en la presente memoria u obtenidos mediante un proceso proporcionado en la presente memoria.

[0018] En la presente memoria, se da a conocer un caldo celular producido por una célula modificada dada a conocer en la presente memoria, así como una composición que comprende una célula modificada expuesta en la presente memoria o un caldo celular. Dicha composición puede comprender, además, opcionalmente un sustrato que comprende material lignocelulósico.

[0019] En la presente memoria, también se da a conocer el uso de una célula modificada expuesta en la presente memoria en un proceso para producir al menos una proteína de interés. En algunos modos de realización, la proteína de interés es codificada por un constructo de expresión heteróloga. En algunos modos de realización, la proteína de interés es heteróloga a la célula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0020]

Figura 1. Análisis SDS-PAGE del caldo del final de la fermentación de:

- W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[eg2/pyr5] (línea 1); y

- W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[eg2/pyr5]ubc9-(línea 2).

Misma carga de contenido de proteína (~ 1 g/L) por línea. La punta de flecha indica la proteína Eg2.

Figura 2. Análisis SDS-PAGE del caldo de placa microtituladora de:

- W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[Twbxl1/pyr5] (línea 1); y,

- W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[TwBxl1/pyr5]ubc9-(línea 2)

La proteína TwBxl1 es indicada por la punta de flecha.

Figura 3. Análisis SDS-PAGE de cultivos en matraces de agitación de:

- W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[AnPGN/pyr5]; y

- W1 L#100.lAalp1Achi1Apyr5[AnPGII/pyr5]ubc9-La punta de flecha indica la proteína AnPGII.

Figura 4. Concentración de proteína total de UV18-25 y UV18-25ubc9 durante la fermentación en tiempo (h).

Figura 5. Liberación de glucosa después de 68 h de incubación del caldo del final de la fermentación de UV18-25 y UV18-25ubc9 en sustrato N^rEL PCS con y sin la adición de Bgl1 a la mezcla enzimática.

Figura 6. Mediciones de actividad de fitasa que demuestran el efecto de la alteración del promotor del gen ubc9 en cepas C1

Figura 7. Diagrama de pLH937, descrito en el ejemplo 8.

Figura 8. Alineamiento múltiple de secuencias de secuencia de proteína Ubc9 de M. thermophila ("Mycthe"; SEQ ID NO: 2); N. crassa ("Neurcra"; SEQ ID NO: 9); A. nidulans ("Aspnid"; SEQ ID NO: 11); S. cerevisiae ("Saccer"; SEQ ID NO: 15); C. neoformans ("Cryneo"; SEQ ID NO: 13); y motivos conservados (motivo 1/consenso 1: SEQ ID NO: 42; motivo 2: SEQ ID NO: 43; consenso 2: SEQ ID NO: 44).

[0021] En la tabla 4, se proporciona un resumen de SEQ ID Nos 1-7.

DEPÓSITOS BIOLÓGICOS

[0022] Los materiales a los que se hace referencia a continuación en la presente memoria fueron depositados de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes en la autoridad depositaria indicada.

DESCRIPCION DETALLADA

[0023] Tal y como se utiliza en la presente memoria, salvo que se indique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una valoración de la homología que se lleva a cabo utilizando: 1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST mediante la utilización de blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros estándar por defecto, donde la secuencia de consulta se filtra para las regiones de baja complejidad por defecto (como se describe en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); 2) un alineamiento BLAST 2 (con los parámetros descritos a continuación); 3) PSI-BLAST con los parámetros estándar por defecto (Position-Specific Iterated BLAST; y/o 4) homología CAZy determinada mediante el uso de los parámetros estándar por defecto de la base de datos de enzimas activas en carbohidratos Carbohydrate-Active enZYmes Database (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12) y/o mediante la aplicación de una estrategia similar mediante el uso de bases de datos como la base de datos Foly (página web: foly. esil.univmrs.fr) y la PeroxiBase (página web: peroxibase.isb-sib.ch).

[0024] Se observa que, debido a algunas diferencias en los parámetros estándar entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, podría reconocerse que dos secuencias específicas presentan una homología significativa mediante la utilización del programa BLAST 2, mientras que una búsqueda llevada a cabo en BLAST 2.0 Basic BLAST mediante la utilización de una de las secuencias a modo de secuencia de consulta puede que no identifique la segunda secuencia en los emparejamientos principales. Asimismo, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada y fácil de usar de una búsqueda de "perfil", que representa una manera sensible de búsqueda de homólogos o variantes de secuencia. En primer lugar, el programa lleva a cabo una búsqueda de base de datos gapped BLAST. El programa PSI-BLAST utiliza la información de cualesquiera alineamientos significativos devueltos para construir una matriz de puntuación de posición específica, que sustituye la secuencia de consulta para la siguiente ronda de búsquedas en la base de datos. Por consiguiente, cabe comprender que el porcentaje de identidad puede determinarse mediante la utilización de cualquiera de estos programas.

[0025] Dos secuencias específicas pueden alinearse entre sí mediante la utilización de la secuencia BLAST 2, como se describe en Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. El alineamiento de secuencias BLAST 2 se lleva a cabo en blastp o blastn mediante la utilización del algoritmo BLAST 2.0 para llevar a cabo una búsqueda Gapped BLAST (BLAST 2.0) entre las dos secuencias que permita la introducción de huecos (gaps) [deleciones e inserciones] en el alineamiento resultante. Con fines de claridad, en la presente memoria, se lleva a cabo un alineamiento de secuencias BLAST 2 mediante la utilización de los parámetros estándar por defecto siguientes.

[0025] Para blastn, utilizando la matriz 0 BLOSUM62:

Recompensa por emparejamiento [reward for match] = 1

Penalización por incompatibilidad [penalty for mismatch] = -2

Penalizaciones [penalties] por hueco abierto [open gap] (5) y hueco de extensión [extension gap] (2) hueco [gap] x_disminución [x_dropoff] (50) esperar [expect] (10) tamaño de palabra [word size] (11) filtro (activado) [filter] [(on)]

Para blastp, utilizando la matriz 0 BLOSUM62:

Penalizaciones [penalties] por hueco abierto [open gap] (11) y hueco de extensión [extension gap] (1) hueco [gap] x_disminución [x_dropoff] (50) esperar [expect] (10) tamaño de palabra [word size] (3) filtro (activado) [filter] [(on)].

[0027] Salvo que se indique lo contrario en la presente memoria, la identidad con respecto a un SEQ ID NO se refiere a la identidad basándose en la longitud completa y contigua de dicha secuencia (es decir, a lo largo de toda su longitud o en su totalidad).

[0028] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "contiguo" o "consecutivo", con respecto a secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos descritas en la presente memoria, se refiere a estar conectado en una secuencia ininterrumpida. Por ejemplo, que una primera secuencia comprenda 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, se refiere a que la primera secuencia incluye una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácidos que es 100 % idéntica a una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácidos en la segunda secuencia. De manera similar, que una primera secuencia presente un "100 % de identidad" o que sea "100 % idéntica" a una segunda secuencia significa que la primera secuencia se empareja de manera precisa con la segunda secuencia sin huecos entre nucleótidos ni aminoácidos.

[0029] Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína como se da a conocer en la presente memoria, se refiere a la secuencia nucleotídica de la cadena de ácido nucleico que codifica la proteína. Cabe comprender que un ADN bicatenario que codifica una secuencia de aminoácidos determinada comprende un ADN monocatenario y su cadena complementaria, que presenta una secuencia que es un complemento del ADN monocatenario. Por definición, las moléculas de ácido nucleico pueden ser, bien bicatenarias o monocatenarias, e incluir dichas cadenas complementarias. Los expertos en la materia conocen métodos para deducir una secuencia complementaria. Cabe destacar que, puesto que las tecnologías de secuenciación de ácido nucleico no están totalmente libres de errores, las secuencias presentadas en la presente memoria, en el mejor de los casos, representan secuencias evidentes de las proteínas expuestas en la presente memoria.

[0030] Tal y como se utiliza en la presente memoria, las referencias a condiciones de hibridación se refieren a condiciones de hibridación estándar en las que las moléculas de ácido nucleico se utilizan para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Dichas condiciones estándar se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid., (véanse, en especial, las páginas 9.31-9.62). Además, se exponen fórmulas para calcular la hibridación y las condiciones de lavado adecuadas para alcanzar la hibridación permitiendo diversos grados de incompatibilidad de nucleótidos en, por ejemplo, Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., ibid.

[0031] Más en particular, las condiciones de lavado y de hibridación de rigurosidad moderada, tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de las moléculas de ácido nucleico que presentan al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia nucleotídica con la molécula de ácido nucleico que se está utilizando para investigar en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 30 % o una incompatibilidad menor de nucleótidos). Las condiciones de lavado y de hibridación de alta rigurosidad, tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de las moléculas de ácido nucleico que presentan al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia nucleotídica con la molécula de ácido nucleico que se está utilizando para investigar en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 20 % o una incompatibilidad menor de nucleótidos). Las condiciones de lavado y de hibridación de muy alta rigurosidad, tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de las moléculas de ácido nucleico que presentan al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia nucleotídica con la molécula de ácido nucleico que se está utilizando para investigar en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 10 % o una incompatibilidad menor de nucleótidos). Tal y como se ha indicado anteriormente, los expertos en la materia pueden utilizar las fórmulas expuestas en Meinkoth et al., ibid. para calcular las condiciones de hibridación y de lavado adecuadas para alcanzar dichos niveles particulares de incompatibilidad de nucleótidos. Dichas condiciones variarán en función de si se forman híbridos ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para los híbridos ADN:ADN son 10 °C inferiores que para los híbridos ADN:ARN. Preferiblemente, las condiciones de hibridación rigurosas para los híbridos ADN:ADN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0,9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 35 °C (rigurosidad más baja), más preferiblemente, entre aproximadamente 28 °C y aproximadamente 40 °C (más rigurosas) y, todavía más preferiblemente, entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 45 °C (todavía más rigurosas), con unas condiciones de lavado adecuadas. Preferiblemente, las condiciones de hibridación rigurosas para los híbridos ADN:ARN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0,9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 45 °C, más preferiblemente, entre aproximadamente 38 °C y aproximadamente 50 °C y, todavía más preferiblemente, entre aproximadamente 45 °C y aproximadamente 55 °C, con unas condiciones de lavado rigurosas similares. Estos valores de basan en cálculos de una temperatura de fusión (Tm) para moléculas más grandes que aproximadamente 100 nucleótidos, un 0 % de formamida y un contenido G C de aproximadamente un 40 %. Alternativamente, la Tm puede calcularse empíricamente como se expone en Sambrook et al., supra, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deberían ser lo más rigurosas posible y deberían ser adecuadas para las condiciones de hibridación elegidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de temperatura y sal que se encuentre aproximadamente entre 20 y 25 °C por debajo de la Tm calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado suelen incluir una combinación de condiciones de temperatura y sal que se encuentre aproximadamente entre 12 y 20 °C por debajo de la Tm calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para su uso con híbridos ADN:ADN incluye una hibridación de 2-24 horas en 6X SSC (50 % de formamida) a aproximadamente 42 °C, seguido de unas etapas de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguido de varios lavados adicionales a temperaturas superiores y una fuerza iónica inferior (p. ej., al menos un lavado a aproximadamente 37 °C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC, seguido de al menos un lavado a aproximadamente 68 °C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC).

[0032] La referencia a un gen incluye todas las secuencias nucleotídicas relacionadas con un gen natural (es decir, de tipo salvaje), tales como las regiones reguladoras que controlan la producción de la proteína codificada por ese gen (por ejemplo, pero sin carácter limitativo, las regiones de control de transcripción, traducción o postraducción), así como la propia región codificante. Los genes pueden incluir o excluir uno o más intrones o cualesquiera porciones de los mismos o cualquier otra secuencia no incluida en el ADNc de dicha proteína. Las frases "molécula de ácido nucleico" y "gen" pueden utilizarse de manera intercambiable cuando la molécula de ácido nucleico comprende un gen como se ha descrito anteriormente.

[0033] Los genes modificados incluyen genes naturales modificados porbc sustitución, inserción y/o deleción de secuencias nucleotídicas únicas o múltiples, que pueden producirse en la secuencia codificante, incluyendo exones de regiones que codifican un polipéptido, o en regiones flanqueadoras, tales como regiones reduladoras normalmente en dirección 5' (p. ej., promotores, intensificadores y secuencias relacionadas), en dirección 3' (p. ej., terminación transcripcional y señales poli[A]), o regiones internas (p. ej., intrones) que afectan a la trasncripción, la traducción y/o la activación de una molécula reguladora o polipéptido de interés. La activación de un polipéptido, por ejemplo, puede requerir la eliminación de una o más regiones polipeptídicas internas, N-terminales o C-terminales, y/o la modificación postraduccional de residuos de aminoácidos específicos, tal como mediante glicosilación, amidación, etc., que pueden alterar la actividad catalítica, de reconocimiento o de degradación de una enzima.

[0034] Una molécula de ácido nucleico tal y como se da a conocer en la presente memoria puede producirse mediante la utilización de tecnología de ^aDⁿrecombinante (p. ej., clonación o amplificación con reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) o mediante síntesis química. Una modificación de ácido nucleico puede producirse mediante la utilización de un número de métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al.). Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse mediante la utilización de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin carácter limitativo, las técnicas de mutagénesis y de ADN recombinante clásicas (p. ej., mutagénesis de sitio dirigido, tratamiento químico, escisión de enzima de restricción, ligación de fragmentos de ácido nucleico y/o amplificación con PCR), o la síntesis de mezclas oligonucleotídicas y la ligación de grupos de mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Otro método de modificación de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína es la redistribución genética (es decir, la reproducción molecular) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,605,793 a Stemmer; Minshull y Stemmer; 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290; Stemmer, 1994, P.N.A.S. USA 91:10747-10751). Esta técnica puede utilizarse para introducir de manera eficiente múltiples cambios simultáneos en la proteína.

[0035] Una molécula de ácido nucleico tal y como se da a conocer en la presente memoria puede ser una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente, que se une de manera operativa a al menos una secuencia de control de expresión. Más en particular, una molécula de ácido nucleico recombinante normalmente comprende un vector recombinante y una o varias de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria. Tal y como se utiliza en la presente memoria, un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico manipulada (es decir, producida de manera artificial) utilizado como herramienta para manipular una secuencia nucleotídica elegida y/o para introducir dicha secuencia nucleotídica en una célula huésped. Por lo tanto, el vector recombinante es adecuado para su uso en la clonación, secuenciación y/o cualquier otra manipulación de la secuencia nucleotídica elegida, así como mediante la expresión y/o distribución de la secuencia nucleotídica elegida a una célula huésped para formar una célula recombinante. Dicho vector normalmente contiene secuencias nucleotídicas que no se encuentran de manera natural al lado de la secuencia nucleotídica que se ha de clonar o distribuir, aunque el vector también puede contener secuencias nucleotídicas reguladoras (p. ej., promotores, regiones no traducidas) que se encuentran de manera natural al lado de las secuencias nucleotídicas dadas a conocer en la presente memoria o que son útiles para la expresión de las moléculas de ácido nucleico expuestas en la presente memoria (analizadas con detalle a continuación). El vector puede ser, bien ARN o ADN, bien procariota o eucariota y, normalmente, es un plásmido. El vector puede mantenerse como un elemento extracromosómico (p. ej., un plásmido) o puede integrarse en el cromosoma de una célula huésped recombinante, aunque se prefiere que el vector siga separado del genoma. El vector completo puede permanecer en su sitio en una célula huésped o, en determinadas condiciones, el ADN plásmido puede delecionarse, dejando atrás la molécula de ácido nucleico expuesta en la presente memoria. Una molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control de un promotor cromosómico, bajo el control de un promotor nativo o plásmido o bajo una combinación de diversos controles de promotores. Pueden integrarse copias únicas o múltiples de la molécula de ácido nucleico en el cromosoma. Un vector recombinante expuesto en la presente memoria puede contener al menos un marcador de selección.

[0036] Un vector recombinante utilizado en una molécula de ácido nucleico recombinante expuesta en la presente memoria puede ser un vector de expresión. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase "vector de expresión" se utiliza para referirse a un vector adecuado para la producción de un producto codificado (p. ej., una proteína de interés, tal como una enzima expuesta en la presente memoria). Una secuencia nucleotídica que codifica el producto que se va a producir puede insertarse en un vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia nucleotídica que codifica la proteína que se va a producir se inserta en el vector para que se una la secuencia nucleotídica de manera operativa a las secuencias reguladoras en el vector, lo que permite la transcripción y la traducción de la secuencia nucleotídica en la célula huésped recombinante. Normalmente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye al menos una molécula de ácido nucleico expuesta en la presente memoria unida de manera operativa a una o más secuencias de control de expresión (p. ej., secuencias de control transcripcional o secuencias de control traduccional). Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase "molécula recombinante" o "molécula de ácido nucleico recombinante" principalmente se refiere a una secuencia nucleotídica o una molécula de ácido nucleico unida de manera operativa a una secuencia de control transcripcional, pero puede utilizarse de manera intercambiable con la frase "molécula de ácido nucleico", cuando dicha molécula de ácido nucleico es una molécula recombinante como se ha analizado en la presente memoria. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase "unida de manera operativa" se refiere a la unión de una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de expresión para que la molécula pueda expresarse cuando se transfecta (es decir, se transforma, se transduce, se transfecta, se conjuga o se conduce) en una célula huésped. Las secuencias de control transcripcional son secuencias que controlan el inicio, la extensión o el fin de la transcripción. Las secuencias de control transcripcional particularmente importantes son las que controlan el inicio de la transcripción, tales como las secuencias promotoras, intensificadoras, de operador y de represor). Las secuencias de control transcripcional adecuadas incluyen cualquier secuencia de control transcripcional que puede funcionar en una célula huésped u organismo en el que se va a introducir la molécula de ácido nucleico recombinante. Las secuencias de control transcripcional también pueden incluir cualquier combinación de una o varias de cualquiera de las anteriores.

[0037] Las moléculas de ácido nucleico recombinante también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras traduccionales, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras compatibles con la célula recombinante. Una molécula recombinante, incluidas las que se integran en el cromosoma de la célula huésped, preferiblemente también contiene señales secretoras (es decir, secuencias nucleotídicas de segmento de señal) para permitir que una proteína expresada sea secretada de la célula que produce la proteína. Los segmentos de señal adecuados incluyen un segmento de señal que se asocia de manera natural a la proteína que se ha de expresar o cualquier segmento de señal heterólogo que pueda dirigir la secreción de la proteína de la manera que se expone en la presente memoria. Una molécula recombinante puede comprender una secuencia líder que permita que una proteína expresada pueda distribuirse e insertarse en la membrana de una célula huésped. Las secuencias líderes adecuadas incluyen una secuencia líder que se asocia de manera natural con la proteína, o cualquier secuencia líder heteróloga que pueda dirigir la distribución y la inserción de la proteína en la membrana de una célula.

[0038] El término "transfección" se utiliza, en general, para referirse a cualquier método mediante el que una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) pueda insertarse en una célula. El término "transformación" puede utilizarse de manera intercambiable con el término "transfección" cuando dicho término se utiliza para referirse a la introducción de moléculas de ácido nucleico en células microbianas o plantas y describe un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por parte del microorganismo, que es fundamentalmente sinónimo del término "transfección". Las técnicas de transfección incluyen, pero sin carácter limitativo, la transformación, el bombardeo de partículas, la electroporación, la microinyección, la lipofección, la adsorción, la infección y la fusión de protoplastos.

[0039] El término "cotransfección" se refiere a la transfección simultánea con dos moléculas de ácido nucleico diferentes. Por ejemplo, la cotransfección puede referirse a la transfección simultánea con una molécula de ácido nucleico que comprende un gen particular, y otra molécula de ácido nucleico que comprende un gen marcador particular.

[0040] Por transgén se entiende, en la presente memoria, un gen o un gen modificado que ha sido introducido en una célula, preferiblemente, por medio de tecnologías recombinantes conocidas por los expertos en la materia. El transgén puede ser, bien homólogo; es decir, presente de manera normal en la célula, bien heterólogo; es decir, no presente de manera normal en la célula. Preferiblemente, el transgén codifica una proteína de interés como parte de un constructo de expresión y se transduce o está a punto de ser transducido en una célula o célula huésped para la producción recombinante de dicha proteína de interés. Un transgén puede codificar una proteína heteróloga u homóloga. Cabe observar que un transgén que codifica una proteína homóloga como parte de un constructo de expresión que no está presente de manera normal en la célula (p. ej., que comprende un promotor diferente al que se asocia normalmente a la secuencia codificante de proteínas) es un transgén heterólogo.

[0041] Por transgén indicador o por gen marcador debe entenderse, en la presente memoria, un transgén que codifica una proteína indicadora, es decir, una proteína que debe detectarse como indicadora, por ejemplo, del nivel de expresión de proteínas.

[0042] Por secuencia heteróloga debe entenderse, en la presente memoria, una secuencia en una posición particular que no se encuentra presente, de manera natural, en dicha posición. Dicho de otro modo, una secuencia de ácido nucleico específica que comprende una secuencia heteróloga es una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra presente de manera normal en la naturaleza, pero que se introduce en la misma por medio de una modificación genética aleatoria o específica.

[0043] Por proteína heteróloga se entiende, en la presente memoria, una proteína que no es producida de manera natural por una célula particular para la que se indica que la proteína es heteróloga.

[0044] Por proteína homóloga se entiende, en la presente memoria, una proteína que es producida de manera natural por una célula particular para la que se indica que la proteína es homóloga. Una proteína homóloga puede ser, bien una proteína endógena de una célula o una proteína exógena, es decir, producidas de manera recombinante por una célula en caso de que la célula haya sido transducida con un vector de expresión que codifica la proteína homóloga.

[0045] Cabe observar que "manipulado/a/os/as" puede utilizarse en la presente memoria para referirse a células producidas de manera artificial (p. ej., células modificadas genéticamente) o a secuencias de ácido nucleico o proteicas.

[0046] La palabra "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se utiliza en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10, alrededor de 10), preferiblemente, significa que el valor puede ser el valor determinado de más o menos un 10 % del valor.

[0047] En este documento y en las reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitativo para querer decir que los artículos que siguen a la palabra están incluidos, pero los artículos que no se mencionan específicamente no están excluidos. Asimismo, la referencia a un elemento con el artículo indefinido "un/una" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, salvo que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un/una", por lo tanto, normalmente significa "al menos un/una".

[0048] Un sistema de producción microbiana capaz de producir y secretar altas cantidades de una enzima específica, particularmente sin la presencia de altos niveles de otras proteínas, incluyendo las proteínas que presentan un impacto negativo en la actividad de la proteína deseada, sería útil tanto para aplicaciones de investigación como industriales. Puede permitir el cribado simplificado de los huéspedes que expresan funcionalmente una enzima deseada. Asimismo, puede permitir la producción de una enzima relativamente pura. También puede permitir la purificación a gran escala simplificada de la enzima deseada. Estas ventajas contribuirían enormemente a, por ejemplo, la generación fácil de mezclas enzimáticas artificiales adaptadas para distintas aplicaciones, por ejemplo, pero sin carácter limitativo, la hidrólisis de biomasa vegetal (biocombustibles y productos químicos), el acabado de textiles, aplicaciones en la industria del papel y de la pasta de papel, así como en el sector de la alimentación y los piensos. Las enzimas relativamente puras, producidas mediante la utilización de los métodos descritos, también permiten el diseño de procesos eficientes para, pero sin limitarse a, la biocatálisis, la bioconversión y la biorremediación, ya sea en solución (p. ej., en disolventes acuosos o mezclados) o en formatos inmovilizados.

[0049] Se identificaron mutantes de una cepa fúngica con una capacidad de producción de proteínas inesperadamente alta, al tiempo que mantenían unas buenas características de crecimiento y susceptibilidad a la modificación genética. Estos mutantes son útiles como sistema de producción microbiana. En la presente memoria, se da a conocer que la modificación de una enzima en la maquinaria de sumoilación es responsable del aumento en la producción de proteínas. La sumoilación de proteínas o de enzimas es un mecanismo de modificación postraduccional que implica la unión covalente de un miembro de las proteínas SUMO (modificador pequeño similar a la ubiquitina) a los residuos de lisina de la proteína o enzima que se va a modificar (sumoilada) por medio de cascada enzimática análoga a, pero distinta de, la vía de ubiquitinación (Wilkinson y Henley, Biochem. J. 2010, 428(2): 133-145). Algunos ejemplos de proteínas SUMO son la Smt3, la S^uMO-1, la SUMO-2, la SUMO-3 y la SUMO-4. Se ha señalado que el efecto de la sumoilación de proteínas de la proteína de sustrato puede dar lugar a una alteración (mayor o menor) de la actividad, la funcionalidad y/o la interacción de proteína de la proteína de sustrato. La conjugación SUMO se realiza por medio de las enzimas E1, E2 y E3. Por medio de la enzima "de activación" E1, las proteínas SUMO se activan de manera dependiente de ATP. La proteína SUMO activada, a continuación, es transferida a la proteína de sustrato por medio de una enzima "de conjugación" E2, normalmente conjugada con una enzima "ligasa" E3. Las proteasas SUMO tienen una función tanto en la desumoilación de las proteínas de sustrato sumoiladas como en la activación de las proteínas SUMO precursoras. Se conocen múltiples enzimas de activación E1, ligasas E3 y proteasas SUMO. Sin embargo, la Ubc9 es la única enzima de conjugación E2 conocida y se conserva muy bien en los organismos (véase, por ejemplo, la figura 8). Las enzimas de activación E1 de levadura conocidas son Aos1 y Uba2. Las enzimas de activación E1 de mamífero conocidas son SAE1 y SAE2. Las ligasas E3 de levadura conocidas son Siz1, Siz2, Cst9 y Mms21. Las ligasas E3 de mamífero conocidas son PIAS1, PIAS3, PIAS4, PIASxa, PIASxp, PIASy, RanBP2, Pc2, Mms21, HDAC4, HDAC7, MUL1, Rhes, TOPORS, TLS, FUS, RSUME, ZMIZ1, NSE2 y TRAF7. Las proteasas SUMO de levadura son Ulp1 y Ulp2. Las proteasas SUMO de mamífero conocidas son SENP-1, SENP-2, SENP-3, SENP-4, SENP-5, SENP-6, SENP-7, DESI-1, DESI-2 y USPL1 (véase, por ejemplo, Chymokowitch et al., Bioessays. 2015, 37(10):1095-105; y Wilkinson y Henley, Biochem. J. 2010, 428(2): 133 145).

[0050] Por lo tanto, se da a conocer una célula modificada que presenta una producción de proteínas mayor, donde dicha célula ha sido modificada para dar lugar a una sumoilación alterada. La sumoilación puede alterarse mediante la modificación de una proteína de la maquinaria de sumoilación y/o su gen codificante, o mediante exposición, incubación o inserción de agentes de modificación de sumoilación, preferiblemente, dando lugar a una reducción de la sumoilación en la célula. Algunos ejemplos de agentes modificantes de sumoilación son el ácido ginkgólico, la kerriamicina B, la espectomicina B1, la catocromina A, la viomeleina y/o un derivado de los mismos. La espectomicina B1 y los productos naturales relacionados expuestos en el artículo de Hirohama et al., (ACS Chem, Biol. 2013, 8, 2635-2642) inhiben la sumoilación mediante la inhibición de Ubc9.

[0051] La modificación de la sumoilación en una célula puede confirmarse mediante la utilización de kits disponibles en el mercado (por ejemplo, de Abcam, Cambridge, Massachusetts) y/o de métodos conocidos en la técnica. Algunos métodos conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, el ensayo de intercambio de isótopos ATP:PPi, la determinación de índices de intercambio de ATP:AMP catalizado por E1 con cromatografía de capa fina o la determinación de conjugados E1-SUMO mediante ensayo basado en gel (Alontaga, et al., julio de 2012, Biochemical Analysis of Protein SUMOylation en Curr Protoc Mol Biol, capítulo 10: unidad 10.29).

[0052] En algunos modos de realización, la célula modificada muestra una producción de proteínas mayor en comparación con su célula parental, tal y como se detectó en condiciones sustancialmente iguales o comparables. El aumento en la producción de proteínas puede ser un aumento en la producción de proteínas total o global. En algunos modos de realización, la célula modificada muestra una producción de proteínas mayor de al menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o al menos 50 veces en comparación con la célula parental. La "célula parental" debe entenderse en la presente memoria como el ascendiente del que se obtiene directamente la célula modificada mediante la alteración de la sumoilación, tal y como se define en la presente memoria. Preferiblemente, la célula modificada se obtiene directamente de la célula parental (i) mediante modificación genética de al menos un gen que codifica una proteína endógena de la maquinaria de sumoilación, y/o (ii) mediante exposición, incubación o inserción de al menos un agente modificador de la sumoilación, preferiblemente, un inhibidor de al menos una proteína endógena de la maquinaria de sumoilación.

[0053] El aumento en la producción de proteínas puede medirse mediante cualquier técnica conocida en la materia. La producción de proteínas puede medirse mediante la detección del total o de un tipo de proteína particular producida y/o secretada por la célula durante un periodo particular del cultivo celular. La producción de proteínas total o global puede medirse mediante la utilización de ensayos disponibles en el mercado, tales como el método colorimétrico de Bradford y Lowry y el método que utiliza métodos colorimétricos disponibles en el mercado tales como el ensayo BCA (p. ej., Pierce; Biorad). El aumento en la producción de proteínas puede medirse mediante la detección de la cantidad de proteína extracelular codificada mediante la detección de la cantidad de proteína presente en el cultivo o el medio de fermentación de los cultivos después de un tiempo definido. El aumento en la producción de proteínas puede medirse mediante la detección de la cantidad o actividad de una proteína particular (celular o extracelular) por medio de métodos conocidos en la técnica.

[0054] Un experto en la materia también comprenderá que un aumento en la producción de proteínas puede permitir alteraciones deseables en los procesos de producción. Dichas mejoras pueden demostrarse mediante mejoras en los parámetros de producción medidos con métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, una producción de proteínas mayor puede dar lugar a un título mayor, una productividad volumétrica mayor, una productividad específica mayor y/o un rendimiento mayor. El título mayor puede medirse, por ejemplo, mediante la cantidad de proteína o de actividad enzimática por volumen de caldo de fermentación o de sobrenadante de fermentación (p. ej., gramo de proteína/litro o unidades de actividad/litro) en un momento determinado durante la fermentación. La productividad volumétrica mayor puede medirse, por ejemplo, por el índice de proteína o actividad enzimática por volumen de caldo de fermentación o de sobrenadante de fermentación (p. ej., gramo de proteína/litro/hora o unidades de actividad/litro/hora). La productividad específica mayor (incluyendo, por ejemplo, la productividad específica máxima) puede medirse, por ejemplo, por el índice de proteína o de actividad enzimática producida por masa celular (p. ej., gramo de proteína/gramo de peso de célula en seco/hora o unidades de actividad/gramo de peso de célula en seco/hora). El rendimiento mayor puede medirse, por ejemplo, mediante la cantidad de proteína o actividad enzimática producida por cantidad de carbono o fuente de carbono (p. ej., glucosa) consumida durante la fermentación (p. ej., gramo de proteína/gramo de glucosa o unidades de actividad/gramo de glucosa o gramo de carbono en proteína/gramo de carbono suministrado). En consecuencia, en la presente memoria se dan a conocer procesos de producción que comprenden la fermentación de las células modificadas en la presente memoria para producir un producto en el que al menos un parámetro de producción aumenta. Dicho incremento puede ser de al menos un 1 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 100 %.

[0055] El aumento en la producción de proteínas puede ser un aumento de la producción de una proteína de interés de al menos 1,1 en comparación con la producción de dicha proteína por la célula parental que carece de la modificación de sumoilación. Preferiblemente, la célula modificada muestra una producción de la proteína de interés mayor de al menos aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o al menos aproximadamente 50 veces en comparación con la célula parental. Dicha proteína de interés puede ser una proteína codificada por un transgén que actúa como indicador (denominada en la presente memoria proteína indicadora) que ha sido introducida en la célula modificada con el fin de detectar la capacidad de producción de proteínas de la célula modificada. Al establecer el aumento en la producción de proteínas provocado por la modificación de la sumoilación, tanto la célula parental como la célula modificada comprenden el gen indicador y la producción de la proteína codificada se compara entre estas células son guardadas en condiciones de cultivo sustancialmente iguales. La producción de gen indicador puede medirse mediante un método adecuado del estado de la técnica para identificar la cantidad de gen indicador producido; por ejemplo, puede medirse la fluorescencia en caso de que el gen indicador sea una proteína fluorescente o puede medirse la actividad enzimática en caso de que el gen indicador sea una enzima.

[0056] Un transgén indicador adecuado comprende una secuencia codificante de una proteína indicadora, unida de manera operativa a una secuencia promotora que permite la expresión de la secuencia codificante del transgén indicador en la célula parental y su célula parental. Por ejemplo, en caso de que la célula modificada sea una célula fúngica de las cepas Myceliophthora thermophila, la secuencia promotora puede ser una secuencia promotora como la que se expone en WO2010/107303 A2. La proteína indicadora puede ser una proteína secretada y los niveles de proteína pueden medirse mediante la detección de los niveles de proteína extracelular. El gen indicador puede unirse, por ejemplo, unirse físicamente a un gen que codifica un marcador de selección como, pero sin carácter limitativo, el marcador de selección amdS. Un gen indicador ejemplificado en la presente memoria y adecuado para su uso en una célula huésped fúngica, tal como una célula huésped fúngica de la cepa M. thermophila, se representa como SEQ ID NO: 4, que comprende una secuencia promotora de chil y una secuencia codificante de celulasa (Eg2). Otro gen indicador ejemplificado en la presente memoria y adecuado para su uso en una célula huésped fúngica, tal como una célula huésped fúngica de la cepa M. thermophila, es representado por SEQ ID NO: 5, que comprende una secuencia promotora de chil o una secuencia promotora de cbhl y una secuencia promotora de poligalacturonasa (^nPGII). Otro gen indicador ejemplificado en la presente memoria y adecuado para su uso en una célula huésped fúngica, tal como una célula huésped fúngica de la cepa M. thermophila, es representado por SEQ ID NO: 6, que comprende una secuencia promotora de chil y una secuencia codificante de p-xilosidasa (Bxl1). Otro gen indicador ejemplificado en la presente memoria y adecuado para su uso en una célula huésped fúngica, tal como una célula huésped fúngica de M. thermophila, comprende una secuencia promotora de chil o una secuencia promotora de cbhl y una secuencia que codifica una glucoamilasa, tal como una glucoamilasa de T. reesei. Otro gen indicador ejemplificado en la presente memoria y adecuado para su uso en una célula huésped fúngica, tal como una célula huésped fúngica de M. thermophila, comprende una secuencia promotora de chi1 o una secuencia promotora de cbhl y una secuencia que codifica la fitasa, por ejemplo, una variante de fitasa de Buttiauxella sp. (SEQ ID No 53 y 54, respectivamente). Un ejemplo de secuencia que codifica una fitasa adecuada para la expresión en una célula fúngica puede comprender la secuencia de nucleótidos 1905-3184 de SEQ ID NO: 40. En consecuencia, las proteínas de interés adecuadas incluyen, pero sin carácter limitativo, la glucoamilasa de Eg2, Bxl1, ^nPGII, T. reesei y la variante de fitasa de Buttiauxella sp.

[0057] Cabe observar que una proteína de interés también puede medirse mediante la utilización de un ensayo específico de la proteína. Dichos ensayos son conocidos por los expertos en la materia y pueden incluir, por ejemplo, ensayos de fijación, HPLC, ELISA, densitometría de gel o métodos útiles para la determinación de los niveles totales de proteínas. Asimismo, como se muestra en los ejemplos, el aumento en la producción de una proteína de interés enzimática puede medirse mediante la utilización de un ensayo de actividad adecuado para la proteína de interés. Los expertos en la materia serán fácilmente capaces de seleccionar un método de medición adecuado para la proteína deseada.

[0058] En un modo de realización, la sumoilación ha sido alterada en la célula modificada mediante modificación genética de al menos un gen de la vía de sumoilación, tal como un gen que codifica una enzima de sumoilación endógena o un gen que codifica una proteína SUMO endógena. En algunos modos de realización, la modificación genética puede ser una modificación genética específica de al menos un gen de la vía de sumoilación, tal como un gen que codifica una enzima de sumoilación endógena o un gen que codifica una proteína SUMO endógena. Algunos ejemplos de proteínas de la maquinaria de sumoilación son: Ubc9, Smt3, SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 y SUMO-4, Siz1, Siz2, Cst9, Mms21, PIAS1, PIAS3, PIAS4, PIASxa, PIASxp, PIASy, RanBP2, Pc2, Mms21, HDAC4, HDAC7, MUL1, Rhes, TOPORS, TLS, FUS, RSUME, ZMIZ1, NSE2, TRAF7, Ulp1, Ulp2, Aos1, Uba2, SENP-1, SENP-2, SENP-3, SENP-4, SENP-5, SENP-6, SENP-7, DESI-1, DESI-2 y USPL1. La modificación genética puede abarcar una o más mutaciones puntuales, una o más inserciones de una secuencia heteróloga y/o una o más deleciones de la secuencia endógena (o de parte de ella) del gen que codifica dicha enzima o proteína de sumoilación. La o las mutaciones, inserciones y/o deleciones puede(n) situarse en la secuencia codificante y/o en una secuencia reguladora. Algunos ejemplos de una secuencia reguladora de expresión son una secuencia promotora, una secuencia de terminación, una secuencia de activación de promotor y una secuencia que codifica factores de transcripción. La modificación puede dar lugar a la eliminación o alteración del gen completo o de parte del gen que codifica la enzima o proteína de sumoilación endógena, o a la sustitución del gen completo o de parte del gen, por ejemplo, por un gen que codifica un marcador de selección. Un ejemplo de un marcador de selección adecuado es el marcador de selección AmdS. La modificación puede abarcar la "expulsión" de la copia endógena del gen. La "expulsión" de un gen se refiere a una técnica biológica molecular por medio de la cual el gen en el organismo se queda sin efecto, de tal forma que la expresión del gen se reduce sustancialmente o se elimina. También quedan abarcadas las mutaciones puntuales que dan lugar a una reducción o eliminación de la producción y/o actividad de las enzimas o proteínas.

[0059] La modificación genética puede dar lugar a una alteración de la producción, de la actividad o a una alteración tanto de la producción como de la actividad de la enzima o proteína codificante de sumoilación. La modificación genética puede dar lugar a una reducción e incluso una supresión de la producción y/o actividad de la enzima o proteína de sumoilación codificada y puede dar lugar a la reducción o la supresión de la sumoilación.

[0060] Dicha modificación genética puede realizarse mediante la utilización de métodos conocidos por los expertos en la materia provistos de la secuencia de un gen que codifica una enzima o proteína de sumoilación. Los expertos en la materia identifican fácilmente las secuencias reguladoras de expresión. Los métodos adecuados para la modificación genética incluyen los conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero sin carácter limitativo, los que se dan como ejemplo en la presente memoria, la recombinación homóloga, interferencia por ARN y sistemas CRISPR/Cas (Timberlake, et al. 1989, Science 244(4910):1313-1317.; Moore, p. 36-66, en Biotecnology Vol III: Fundamentals in Biotechnol. Eds. Doelle, Robek, Berovic (2009); Singh, et al.

2017, Gene 599: 1-18). También se conocen reactivos y métodos adecuados en la técnica y/o se encuentran disponibles en el mercado (véase, por ejemplo, WO2016100568A1, WO2016100272A1 y WO2016100571A1). Por ejemplo, la proteína Cas9 purificada y los ARN guías, o kits para elaborar ARN guías pueden obtenerse en PNA BIO (www.pnabio.com; Newbury Park, California), NEB (www.neb.com; Ipswich, Massachusetts), ThermoFisher (www.thermofisher.com; Waltham, Massachusetts), e IDT (www.idtdna.com o www.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr/2nm; Coralville, Iowa).

[0061] La producción de enzimas o proteínas de sumoilación endógenas puede detectarse mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica. La modificación genética de la célula modificada puede dar lugar a una reducción de la cantidad total de transcripciones de la enzima o proteína de sumoilación modificada, que puede detectarse mediante un ensayo adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, por medio de RNA-seq, como se ejemplifica en la presente memoria (con referencia al ejemplo 1 de la presente exposición). La cantidad de dichas transcripciones en la célula modificada puede reducirse en al menos aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8. 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o al menos 100 veces en comparación con la cantidad de dichas transcripciones en la célula parental. En combinación con la reducción indicada que se define anteriormente, la modificación genética puede ser tal que la cantidad de dichas transcripciones no se reduce a cero, sino que la cantidad residual de dichas transcripciones es al menos de aproximadamente un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % de la cantidad de dichas transcripciones presentes en la célula parental.

[0062] La célula modificada genéticamente difiere estructuralmente de la célula parental por que comprende una modificación genética. La célula modificada puede haberse obtenido directamtente de la célula parental mediante la introducción de la modificación genética. El gen modificado puede ser cualquiera de los genes que codifican las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Ubc9, Smt3, SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 y SUMO-4, Siz1, Siz2, Cst9, Mms21, PIAS1, PIAS3, PIAS4, PIASxa, PIASxp, PIASy, RanBP2, Pc2, Mms21, HDAC4, HDAC7, MUL1, Rhes, TOPORS, TLS, FUS, RSUME, ZMIZ1, NSE2, TRAF7, Ulp1, Ulp2, SENP-1, SENP-2, SENP-3, SENP-4, SENP-5, SENP-6, SENP-7, DESI-1, DESI-2 y USPL1, así como los homólogos de cualquiera de estas proteínas o enzimas. Los homólogos pueden identificarse en una célula de interés particular mediante la utilización de métodos conocidos en la técnica; por ejemplo, alineamientos de secuencias, generación de árboles y análisis filogenéticos. La modificación genética puede abarcar la mutación, deleción o alteración aleatoria o específica, el silenciamiento de secuencias codificantes y/o secuencias reguladoras de expresión de genes que codifican una o más proteínas de sumoilación que dan lugar a un aumento en la producción de proteínas por la célula que comprende la modificación tal y como se define en la presente memoria, es decir, en comparación con la producción de proteínas por parte de su célula parental al analizarla en prácticamente las mismas condiciones.

[0063] La modificación genética puede comprender o consistir en una modificación del gen que codifica Ubc9. El gen ubc9 endógeno puede cualquier experto en la materia, por ejemplo, el gen ubc9 que codifica Ubc9 de Myceliophthora thermophila (SEQ ID NO: 2), Neurospora crassa (ácido nucleico SEQ ID NO: 8; proteína SEQ ID ⁿO: 9; n.° de acceso: NCU04302; XM_955999), Ubc9 de Aspergillus nidulans (ácido nucleico SEQ ID NO: 10; proteína SEQ ID NO: 11; n.° de acceso.: AN_4399), Cryptococcus neoformans (ácido nucleico SEQ ID NO: 12; proteína SEQ ID NO: 13; n.° de acceso: CNAG_04328;), Ubc9 de Saccharomyces cerevisae (ácido nucleico SEQ ID NO: 14; proteína SEQ ID NO: 15; n.° de acceso: YDL064W; Z74112.1), Ubc de Aspergillus niger (ácido nucleico SEQ ID NO: 45; proteína SEQ ID NO: 46), y Ubc9 de Trichoderma reesei (secuencia promotora SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48 codificante o SEQ ID NO: 49, proteína SEQ ID NO: 50). Puede encontrarse información de secuencias en, por ejemplo, bases de datos públicas, tal como en JGI MycoCosm (genome.jgi.doe.gov/programs/fungi/index.jsf); National Center for Biotechnology Information [Centro Nacional para la Información Biotecnológica] ("NCBI"; www.ncbi.nlm.nih.gov); Aspergillus Genome Database ("AsGD"; www.aspergillusgenome.org); o Saccharomyces Genome Database ("SGD"; www.yeastgenome.org). La modificación genética puede producirse en un gen que codifica una proteína que presenta comprende al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menso un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con, o comprendiendo, la secuencia de uno o más o ambos de los siguientes motivos de secuencia: RLQEERKQWRKDHPFGF (SEQ ID NO: 42) y KPPKCKFTPPLFHPNVYPSGTVCLSIL (SEQ ID NO: 43). La modificación genética puede ser una modificación de una región reguladora del gen ubc9, por ejemplo, en la secuencia promotora del gen ubc9, por ejemplo, mediante una inserción de casete de expresión en la región promotora de ubc9, en dirección 5' de la secuencia codificante de proteína. Un ejemplo de un casete de inserción para la alteración de la secuencia promotora de ubc9 en M. thermophila es representado por SEQ ID NO: 3. Algunos ejemplos de secuencias objeto para la alteración de la secuencia promotora de ubc9 en T. reesei son representadas por SEQ ID Nos: 30, 31 y 32. Un ejemplo de un casete de inserción para la alteración de la secuencia promotora de ubc9 en A. niger es representado por SEQ ID NO: 26. En la presente memoria, también se contemplan otras modificaciones genéticas que dan lugar a la modificación de la expresión de ubc9, la producción o actividad de Ubc9, tal como la inactivación de mutantes de Ubc9 o alteraciones genéticas en la secuencia codificante de ubc9, preferiblemente, dando lugar a la reducción o la supresión de la producción y/o actividad de Ubc9.

[0064] La célula modificada puede caracterizarse por que comprende un gen ubc9 (enzima conjugadora de ubiquitina o enzima E2) endógeno que ha sido modificado para aumentar la producción de proteínas. El gen ubc9 endógeno que comprende la modificación en la célula modificada puede presentar un homólogo de tipo salvaje (sin modificar) que presenta al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud, o que presenta al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 delimitado por los nucleótidos de las posiciones 1070 y 2195 (es decir, SEQ ID NO: 1 (1070-2195)) a lo largo de toda su longitud o que presenta al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1 delimitado por los nucleótidos de las posiciones 1302 y 1994 (es decir, SEQ ID NO: 1 (1302-1994) representando el marco de lectura abierto) a lo largo de toda su longitud. El gen ubc9 endógeno que comprende la modificación en la célula modificada puede presentar un homólogo de tipo salvaje que comprende una secuencia que presenta al menos la célula modificada puede presentar un homólogo de tipo salvaje (sin modificar) que presenta al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 47 o con SEQ ID NO: 48 a lo largo de toda su longitud. El gen ubc9 endógeno que comprende la modificación en la célula modificada puede presentar un homólogo de tipo salvaje que comprende una secuencia que presenta al menos la célula modificada puede presentar un homólogo de tipo salvaje (sin modificar) que presenta al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la porción promotora o codificante de SEQ ID NO: 45.

[0065] El gen ubc9 endógeno que comprende la modificación genética en la célula modificada puede codificar una proteína Ubc9 que presenta una secuencia que tiene al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 a lo largo de toda su longitud. El gen ubc9 endógeno que comprende la modificación genética en la célula modificada puede codificar una proteína Ubc9 que presenta una secuencia que tiene al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 50 a lo largo de toda su longitud. El gen ubc9 endógeno que comprende la modificación genética en la célula modificada puede codificar una proteína Ubc9 que presenta una secuencia que tiene al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 46 a lo largo de toda su longitud.

[0066] Con la presente exposición, un experto en la materia puede fácilmente identificar una secuencia de ubc9 en un organismo de interés. Por ejemplo, un alineamiento de más de 600 ortólogos de Ubc9 disponibles públicamente mostró dos elongaciones destacadas de conservación de secuencia extendida y fuerte, denominadas en la presente memoria motivo 1 (17aa; SEQ ID NO: 42) y motivo 2 (27aa; SEQ ID NO: 43) (véase la figura 8). Ambas elongaciones están situadas en el dominio de proteína de "enzima conjugadora de ubiquitina" (PF00179; pfam.xfam.org/) que caracteriza a las proteínas de ubc. Dichas elongaciones pueden utilizarse para identificar la ubc9 de otras proteínas que contienen el dominio PF00179.

[0067] La célula modificada puede presentar una inserción o alteración de una secuencia promotora de gen ubc9 endógeno. La secuencia promotora de ubc9 puede alterarse por la inserción de un casete de expresión; por ejemplo, la secuencia promotora de ubc9 se altera por la inserción de un casete de expresión en una posición análoga a los nucleótidos de la secuencia promotora del gen ubc9 de M. thermophila, que están representados por los nucleótidos en la posición 1257 y 1258 de SEQ ID NO: 1. Se descubrió que la alteración de la secuencia promotora en esta posición dio lugar a un aumento inesperado en la producción de proteínas global, más en particular, en la expresión de genes indicadores transducidos que codifican proteínas secretadas extracelularmente. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, es probable que la alteración de la secuencia promotora afecte a la expresión funcional de la proteína Ubc9 codificada, lo que, posiblemente a través de su papel fundamental en las vías de modificación postraduccional, dé lugar a un aumento en la producción de proteínas neta. Cabe observar que la modificación del gen ubc9 endódeno no se limita a la alteración de la secuencia promotora. En la presente memoria, se contemplan modificaciones del gen ubc9 que dan lugar a la alteración o la supresión de la expresión funcional de la proteína ubc9 codificada. Asimismo, en la presente memoria, se contemplan modificaciones de enzima, proteína o gen de sumoilación que dan lugar a un aumento global en la producción de proteínas.

[0068] En otro modo de realización o en una combinación con el modo de realización definido anteriormente, la célula modificada se expone a uno o más agentes biológicos o químicos que cambian la sumoilación, tal como los inhibidores o activadores de enzima de sumoilación. La célula modificada puede exponerse a al menos un inhibidor de una enzima de sumoilación en una concentración efecitva para inhibir la actividad de dicha enzima. El inhibidor puede ser cualquiera seleccionado del grupo que consiste en ácido ginkgólico, kerriamicina B, espectomicina B1, catocromina A, viomeleina y/o un derivado de los mismos. La espectomicina B1 y los productos naturales relacionados expuestos en el artículo de Hirohama et al., (ACS Chem, Biol. 2013, 8, 2635 2642) inhiben la sumoilación mediante la inhibición de Ubc9. Por lo tanto, la célula modificada puede exponerse a espectomicina B1 y/o a productos naturales relacionados expuestos en el artículo de Hirohama et al., (ACS Chem, Biol. 2013, 8, 2635-2642) en una concentración efectiva para inhibir la actividad de dicha enzima. La célula modificada puede exponerse a un agente que cambia la sumoilación en una concentración de dicho agente que da lugar a un aumento en la producción de proteínas como se define en la presente memoria, es decir, en comparación con su célula parental al analizarla en prácticamente las mismas condiciones. La célula modificada expuesta a uno o más inhibidores o activadores de enzima de sumoilación tal y como se define en la presente memoria puede ser estructuralmente similar a la célula parental y solo difiere de la misma en que está expuesta a dicho(s) inhibidor(es) o activador(es). La célula modificada puede exponerse a un inhibidor para dar lugar a una actividad enzimática reducida en al menos aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o al menos aproximadamente 100 veces en comparación con la actividad enzimática de la célula parental. En combinación con la reducción indicada que se define anteriormente, la actividad enzimática resultante puede ser tal que la cantidad de actividad enzimática no se reduce a cero, sino que la actividad enzimática residual es al menos de aproximadamente un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % de la actividad de la célula parental.

[0069] Puesto que las células modificadas que se dan a conocer en la presente memoria muestran una alta capacidad de producción de proteínas, las células modificadas que se dan a conocer en la presente memoria pueden utilizarse en la producción de proteínas industriales, tal como, pero sin carácter limitativo, la producción de proteínas farmacéuticas y/o de enzimas industriales (también denominadas en la presente memoria "proteínas de interés"). Una proteína de interés puede ser una proteína endógena o una proteína exógena, es decir, codificada por un transgén. El transgén puede codificar una proteína heteróloga u homóloga. La célula modificada que codifica y produce una proteína de interés (o una mezcla de proteína de interés) también se denomina en la presente memoria sistema de expresión.

[0070] En el modo de realización de la exposición en el que la proteína de interés es un transgén, la célula modificada comprende un constructo o vector de expresión exógena que codifica al menos una proteína de interés, codificada por un transgén comprendido en el constructo o vector de expresión. El constructo de expresión puede comprender porciones de un gen o un polinucleótido que codifican la proteína de interés y que no son parte de la región codificante de la proteína (p. ej., intrones o regiones reguladoras de un gen que codifica la proteína) y pueden ser bicatenarias, monocatenarias y pueden incluir ADN, ARN o derivados de ADN o ARN, incluyendo ADNc, sondas y cebadores, incluyendo secuencias de guía. Opcionalmente, el constructo de expresión codifica una o más enzimas industriales. El constructo de expresión puede ser un constructo o vector de expresión quimérico que codifica al menos dos proteínas de interés.

[0071] Los expertos en la materia observarán que el uso de tecnologías de ADN recombinante puede afectar al control de la expresión de los vectores de expresión transfectados (que codifican proteínas homólogas o heterólogas) mediante la manipulación, por ejemplo, del número de copias de secuencias que codifican la proteína de interés en la célula huésped, la eficiencia con la que dichas secuencias que codifican la proteína de interés se transcriben, la eficiencia con la que las transcripciones resultantes se traducen y la eficiencia de las modificaciones postraduccionales. El transgén puede comprender secuencias reguladoras y/o intensificadoras de traducción, tales como las secuencias promotoras adecuadas para expresarse en la célula huésped de interés. Dicha secuencia promotora puede ser una secuencia promotora para la expresión de proteínas en Myceliophthora thermophila, tal como Myceliophthora thermophila C1, se exponen en WO2010/107303 A2. Por ejemplo, dicha secuencia promotora puede comprender una secuencia promotora de Myceliophthora thermophila chil, tal como SEQ ID NO: 51, o una secuencia promotora de Myceliophthora thermophila cbh, tal como SEQ ID NO: 52, o una secuencia promotora que presente al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 51 o 52. Algunas secuencias promotoras adecuadas para la expresión de proteínas en Trichoderma pueden incluir, pero sin carácter limitativo, un promotor de cbhl, cbh2, egll, egl2, egl3, egl4, egl5, pkil, gpdl, xynl o xyn2 de T. reesei. Asimismo, la secuencia promotora puede manipularse genéticamente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Algunas técnicas recombinantes útiles para el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico incluyen, pero sin carácter limitativo, la integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas de célula huésped, la adición de secuencias de estabilidad de vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control transcripcional (p. ej., promotores, operadores, intensificadores), sustituciones o modificaciones de señales de control traduccional (p. ej., sitios de unión al ribosoma), modificación de moléculas de ácido nucleico para corresponderse con el uso del codón de la célula huésped, y deleción de secuencias que desestabilizan las transcripciones.

[0072] La proteína o las proteínas de interés puede(n) ser una mezcla enzimática o una composición multienzimática. Dicho de otro modo, la célula modificada puede modificarse adicionalmente para producir enzimas o mezclas enzimáticas o composiciones multienzimáticas que son ventajosas para aplicaciones industriales.

[0073] La proteína de interés puede ser, por ejemplo, una hemicelulasa, una peroxidasa, una proteasa, una celulasa, una xilanasa, una lipasa, una fosfolipasa, una esterasa, una cutinasa, una pectinasa, una queratinasa, una reductasa, una oxidasa, una fenol oxidasa, una lipoxigenasa, una ligninasa, una pululanasa, una tanasa, una pentosanasa, una mananasa, una beta-glucanasa, una arabinosidasa, una hialuronidasa, una condroitinasa, una lacasa, una amilasa, una glucoamilasa, una mezcla de las mismas, un fragmento funcional de los mismos o una mezcla de una o varias de las enzimas o fragmentos funcionales de las mismas. Algunos ejemplos no limitativos de proteínas pueden incluir también proteínas o enzimas implicadas en el metabolismo de los almidonres, proteínas o enzimas implicadas en el metabolismo de los glicógenos, acetilesterasas, aminopeptidasas, amilasas, arabinasas, arabinofuranosidasas, carboxipeptidasas, catalasas, celulasas, quitinasas, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasas, epimerasas, esterasas, a-galactosidasas, p-galactosidasas, a-glucanasas, glucanolisasas, endo-p-glucanasas, glucoamilasas, glucosaoxidasas, a-glucosidasas, p-glucosidasas, glucuronidasas, hemicelulasas, hexosaoxidasas, hidrolasas, invertasas, isomerasas, lacasas, lipasas, liasas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, pectatoliasas, pectina acetilesterasas, pectin metil esterasas, pectinmetil esterasas, enzimas pectinolíticas, peroxidasas, fenoloxidasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, ramno-galacturonasas, ribonucleasas, taumatina, transferasas, proteínas de transporte, transglutaminasas, xilanasas, hexosa oxidasa (D-hexosa: 02-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5), variantes de las mismas, fragmentos funcionales de las mismas o combinaciones de las mismas. La proteína de interés también puede ser una hormona peptídica, un factor de crecimiento, un factor de coagulación, una quimiocina, una citocina, una linfocina, un anticuerpo, un receptor, una molécula de adhesión, un antígeno microbiano (p. ej., antígeno de superficie del VHB, VPH E7 , etc.), o una variante, fragmento funcional, o una mezcla de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o seis o más de las sustancias anteriores. Algunas mezclas de enzimas pueden incluir, por ejemplo, combinaciones expuestas en las publicaciones de solicitud PCT n.° WO2008/153903, WO2012/125951 y/o WO2012/125937.

[0074] La célula modificada puede ser una célula que codifica (de forma endógena y/o transgénica) y produce una composición multienzimática adecuada para degradar un material lignocelulósico y/o hemicelulósico. Dicha composición multienzimática puede comprender al menos una celobiohidrolasa, al menos una xilanasa, al menos una endoglucanasa, al menos una p-glucosidasa, al menos una p-xilosidasa y al menos una enzima accesoria. En algunos modos de realización, la composición multienzimática puede carecer de enzimas que conducen a la formación decelobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico. Una xilanasa puede ser una endoxilanasa, una exoxilanasa o una p-xylosidasa. Una enzima accesoria puede tener la misma función o una función similar o una función diferente que una enzima o enzimas en un conjunto básico de enzimas. Algunas enzimas accesorias adecuadas se han descrito en otra parte de la presente memoria y, generalmente, pueden incluir celulasas, xilanasas, ligninasas, amilasas, lipidasas o glucuronidasas, por ejemplo. Algunas enzimas accesorias, por ejemplo, pueden incluir enzimas que cuando entran en contacto con biomasa en una reacción, permiten un aumento en la actividad de las enzimas (por ejemplo, hemicelulasas) en la composición multienzimática. Una enzima accesoria o una mezcla de enzimas puede estar compuesta por enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan enzimas; (3) caldo complejo (como el que se obtiene del crecimiento de una cepa microbiana en los medios, donde las cepas secretan proteínas y enzimas en los medios); (4) lisados celulares de cepas cultivadas como en (3); y, (5) material vegetal que expresa enzimas capaces de degradar la lignocelulosa. En algunos modos de realización, la enzima accesoria es una glucoamilasa, una pectinasa o una ligninasa. Algunas enzimas accesorias incluyen una enzima seleccionada del grupo que consiste en: celulasa, glucosidasa, monooxigenasa de polisacárido lítico (o GH61 o polipéptido que presenta actividad de mejora celulolítica), xilanasa, xilosidasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinasa, arabinogalactanasa, ferulipalactanasa pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, galactosidasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitosanasa, exo-p-D-glucosaminidasa, celobiosa deshidrogenasa y acetil xilano esterasa. En algunos modos de realización, las enzimas accesorias están presentes en una mezcla de enzimas en ausencia de enzimas que conducen a la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico. La composición multienzimática también puede comprender al menos una hemicelulasa. Se puede seleccionar una hemicelulasa del grupo que consiste en una xilanasa, una arabinofuranosidasa, una acetil xilano esterasa, una glucuronidasa, una endogalactanasa, una mananasa, una endoarabinasa, una exoarabinasa, una exogalactanasa, una esterasa de ácido ferúlico, una galactomananasa, una xiloglucanasa y mezclas de las mismas. Se puede seleccionar una xilanasa del grupo que consiste en endoxilanasas, exoxilanasas y p-xilosidasas. La composición multienzimática puede comprender además al menos una celulasa.

[0075] Las composiciones multienzimáticas contempladas en el presente documento se pueden obtener a partir de la célula modificada como un producto de fermentación bruto sometido opcionalmente a una etapa de purificación. La composición multienzimática también puede comprender una o más enzimas accesorias. Algunas enzimas accesorias pueden incluir al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en: celulasa, glucosidasa, monooxigenasa de polisacárido lítico (o GH61 o GH61 o polipéptido que presenta actividad de mejora celulolítica), xilanasa, xilosidasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinasa, arabinogaulicidasa, esterasa de ácido ferúlico, lipasa, pectinasa, glucomananasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, galactosidasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitosanasa, exo-p-D-glucosaminidasa, celobiosa deshidrogenasa, acetilxilano esterasa y acetilesterasa. En algunos modos de realización, la enzima accesoria es producida por el cultivo de la célula modificada en un sustrato para producir la enzima. La composición multienzimática también puede comprender al menos una proteína para degradar un material que contiene arabinoxilano o un fragmento del mismo que presenta actividad biológica. La composición multienzimática puede comprender además al menos una endoxilanasa, al menos una p-xilosidasa y al menos una arabinofuranosidasa. Una arabinofuranosidasa puede comprender una arabinofuranosidasa con especificidad hacia residuos de xilosa sustituidos de forma sencilla, una arabinofuranosidasa con especificidad hacia residuos de xilosa de sustitución doble o una combinación de las mismas.

[0076] Las composiciones multienzimáticas también pueden incluir celulasas, hemicelulasas (como xilanasas, incluidas las endoxilanasas, exoxilanasas y p-xilosidasas; mananasas, incluidas las endomanasas, exomananasas y p-manosidasas), ligninasas, amilasas, glucuronidasas, proteasas, esterasas (incluida la esterasa de ácido ferúlico), lipasas, glucosidasas (como p-glucosidasa) y xiloglucanasas.

[0077] También se contempla una célula modificada que produce mezclas que comprenden enzimas que son capaces de degradar paredes celulares y de liberar contenidos celulares. Dicha célula puede ser una célula bacteriana, o una célula de un alga, un hongo o una planta que produce las enzimas de forma natural o gracias a haber sido modificada genéticamente para expresar la enzima o las enzimas.

[0078] En un modo de realización, la composición multienzimática se emplea en un proceso para obtener productos fermentables, tales como azúcares, a partir de la degradación de biomasa y/o material lignocelulósico, tal como biomasa rica en hemicelulosa, como se define en la presente memoria. Dicho material lignocelulósico puede ser, por ejemplo, residuos agrícolas o un residuo producido por la agricultura y la silvicultura. El material lignocelulósico puede ser, por ejemplo, rastrojo de maíz, bagazo o paja de trigo. El material lignocelulósico puede ser material lignocelulósico pretratado. El material lignocelulósico pretratado se puede producir, por ejemplo, al someter un material de biomasa a una temperatura elevada y mediante la adición de ácido diluido, ácido concentrado o solución alcalina diluida. El material lignocelulósico pretratado se puede producir, por ejemplo, al someter un material de biomasa a una concentración baja de amoníaco en condiciones de altos sólidos. El material lignocelulósico puede degradarse parcial o completamente en azúcares fermentables. Se contemplan niveles económicos de degradación con costes comercialmente viables. Debido, en parte, a la gran cantidad de componentes que comprenden la biomasa y los materiales lignocelulósicos, se necesitan enzimas o una mezcla de enzimas capaces de degradar el xilano, la lignina, la proteína y los carbohidratos para conseguir la sacarificación. La una o más enzimas adicionales pueden incluir enzimas o composiciones de las mismas con, por ejemplo, oxidorreductasas, celobiohidrolasa, endoglucanasa, p-glucosidasa, xilanasa y otras actividades de hemicelulasa. Estas composiciones enzimáticas son adecuadas para degradar biomasa, tal como biomasa rica en hemicelulosa, tal como pulpa, como se define en la presente memoria.

[0079] La composición multienzimática debe disolver la pulpa para la producción de productos químicos como, entre otros, rayón, celofán y varios productos químicos como ésteres de celulosa (acetatos, nitratos, propionatos y butiratos) y éteres de celulosa (carboximetilcelulosa y metil y etilcelulosa) y etanol (por ejemplo, como biocombustible bioetanol). También se contempla una composición multienzimática para el blanqueado de papel y pulpa. La composición multienzimática puede utilizarse para mejorar la aptitud al blanqueo de la pulpa en el sector de la pulpa y el papel.

[0080] La célula modificada (por ejemplo, una célula huésped u organismo de producción) puede incluir cualquier microorganismo tal como un protista, un alga, un hongo u otro microbio eucariótico, una planta, un insecto o una célula animal y puede ser una levadura o un hongo filamentoso. La célula modificada puede ser cualquier célula fúngica (por ejemplo, hongos filamentosos o una levadura o setas), de alga, vegetal, de insecto o animal que pueda transfectarse. La célula modificada es puede ser una célula cultivada. Entre los géneros adecuados de levadura se incluyen, entre otros, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces y Phaffia. Entre las especies de levadura adecuadas, se incluyen, entre otras, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia canadensis, Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma.

[0081] Entre los géneros fúngicos adecuados, se incluyen, entre otros, Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Corynascus, Cryptococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola y Trichoderma, Talaromyces, Rasamsonia y anamorfos y teleomorfos de los mismos. Entre las especies fúngicas adecuadas, se incluyen, entre otras, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Absidia coerulea, Rhizopus oryzae, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris, Sporotrichum thermophile, Sporotrichum cellulophilum, Chaetomium globosum, Corynascus heterothallicus, Talaromyces emersonii, Rasamsonia emersonii y Talaromyces flavus.

[0082] La célula modificada puede ser una célula o un microorganismo modificados genéticamente (adicionalmente), es decir, que comprenden (adicionalmente) modificaciones genéticas además de la posible modificación del gen que codifica una enzima de sumoilación o una proteína SUMO y la introducción de transgenes que codifican una o más proteína de interés, tal y como se detalla en la presente memoria. La célula puede modificarse adicionalmente para producir cantidades reducidas o carecer de la producción de enzimas que interfieren/compiten con la expresión y/o secreción de la proteína de interés y/o con la producción o actividad enzimática de la proteína de interés. Por ejemplo, dicha célula puede modificarse para regular por disminución la actividad enzimática interferente. La regulación por disminución puede conseguirse, por ejemplo, mediante la introducción de inhibidores (químicos o biológicos) de la actividad enzimática, mediante la manipulación de la eficacia con la que se transcriben dichas moléculas de ácido nucleico, la eficacia con la que se traducen las transcripciones resultantes y la eficacia de las modificaciones postraduccionales, o mediante la mutación, alteración o deleción génica. Alternativamente, la actividad de la producción o actividad enzimáticas pueden regularse por incremento en caso de que la producción o actividad enzimáticas tengan un efecto positivo en la producción o actividad de la enzima de interés. Dichas enzimas pueden ser enzimas accesorias; por ejemplo, en caso de que la enzima de interés sea para degradar material lignocelulósico. En la presente memoria, también se contempla la regulación por disminución de la actividad de una o más enzimas al tiempo que se regula por incremento de manera simultánea la actividad de una o más enzimas para conseguir el resultado deseado.

[0083] La célula modificada puede ser una célula fúngica o incluso una célula fúngica filamentosa. La célula modificada puede ser una célula fúngica del género seleccionado del grupo que consiste en Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Corynascus, Cryptococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Myceliophtrella, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Trichoderma, Talaromyces y Rasamsonia. La célula modificada puede ser una célula de Myceliophthora thermophila, como la cepa CI (VKM F-3500 D) o una cepa mutante derivada de la misma (por ejemplo, UV13-6 (número de acceso ^vK^mF-3632 D); NG7C-19 (número de registro VKM F-3633 D); UV18-25 (VKM F-3631D), UV18#100f (CBS122188), W1L (CBS122189) o W1L#100L (CBS122190)). La cepa puede ser una cepa con expresión reducida de proteasa y (hemi)celulasa, e incluso puede estar exenta de expresión de proteasa y (hemi)celulasa. La cepa puede ser W1L#100.lApyr5Aalp1, también denominada cepa LC (Visser H, et al., Ind. Biotechnol. 7:214-222, 2011 y WO2010/107303. Tal y como se describe en la patente estadounidense n.° 6,015,707 o en la patente estadounidense n.° 6,573,086, una cepa denominada C1 (n.° de acceso VKM F-3500 D), fue aislada de las muestras de suelo alcalino de bosque de Sola Lake, Extremo Oriente de la Federación Rusa. Esta cepa fue depositada en la All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences (VKM) (www.vkm.ru; Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia, 113184; Prospekt Nauki n.° 5, Púshchino, región de Moscú, 142290, Rusia) de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes el 29 de agosto de 1996 (por A.P. Sinitsyn, O.N. Okunev, I.V. Solov'eva, V.M. Chernoglasov, M.A. Emalfarb, A. Ben-Bassat; "FermTech" LTD Acad. Kapitsky str. 32-2, Moscú, 117647, Rusia), como Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM F-3500 D. Se han producido diversas cepas mutantes de C1 y estas cepas también han sido depositadas en la All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences (VKM) (Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia, 113184; Prospekt Nauki n.° 5, Púshchino, región de Moscú, 142290, Rusia), de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes el 2 de septiembre de 1998 (por O.N. Okunev, A.P. Sinitsyn, V.M. Chernoglasov y M.A. Emalfarb; "FermTech" LTD, Acad. Kapitsy str., 32-2, Moscú, 117647, Rusia) o en el Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), (Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Países Bajos) a los fines del Procedimiento en materia de Patentes el 5 de diciembre de 2007 (por Dyadic Nederland B.V., Nieuwe Kanaal 7s, 6709 PA Wageningen, Nederland). Por ejemplo, la cepa C1 fue mutagenizada sometiéndola a luz ultravioleta para generar la cepa UV13-6 (n.° de acceso VKM F-3632 D; depositada en la VKM el 2 de septiembre de 1998). Esta cepa fue, a continuación, mutada adicionalmente con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina para generar la cepa NG7C-19 (n.° de acceso VKM F-3633 D; depositada en la VKM el 2 de septiembre de 1998). Esta última cepa, a su vez, fue sometida a mutación mediante luz ultravioleta, lo que dio lugar a la cepa UV18-25 (n.° de acceso VKM F-3631 D; depositada en la VKM el 2 de septiembre de 1998). UV18-25 ha sido mutada con luz ultravioleta y seleccionada para una actividad de proteasa baja, indicada en la presente memoria como UV18#100f (CBS122188; depositada en el CBS el 5 de diciembre de 2007). La cepa UV18-25 también ha sido mutada con luz ultravioleta y seleccionada para una actividad de celulasa baja, lo que da lugar a la cepa W1L (n.° de acceso CBS122189; depositada en el CBS el 5 de diciembre de 2007), que fue posteriormente sometida a mutación mediante luz ultravioleta y seleccionada para una actividad de proteasa baja, que dio lugar a la cepa W1L#100L (n.° de acceso CBS122190; depositada en el CBS el 5 de diciembre de 2007). La cepa C1 fue inicialmente clasificada como Chrysosporium lucknowense a partir de las características morfológicas y de crecimiento del microorganismo, como se analiza con detalle en la patente estadounidense n.° 6,015,707, en la patente estadounidense n.° 6,573,086 y en la patente PCT/NL2010/000045. La cepa C1 fue posteriormente reclasificada como Myceliophthora thermophila a partir de pruebas genéticas. C. lucknowense también ha aparecido en la literatura como Sporotrichum thermophile. En otro modo de realización, la célula modificada es una cepa que presenta altos niveles de producción celulósica (cepa HC), tales como, entre otros, C1, UV13-6, NG7C-19, UV18-25 o UV18#100f (n.° de acceso CBS122189), o derivados de los mismos. Una célula modificada derivada de UV18#100f y que presenta una maquinaria de SUMOilación modificada como se detalla adicionalmente en este documento, tal como una inserción de promotor en el gen ubc9 como se define en la presente memoria, es de particular interés en la producción de celulasa. La célula de la cepa HC como se detalla en la presente memoria que presenta una maquinaria de SUMOilación modificada puede modificarse además genéticamente para reducir la expresión de proteasa. La célula modificada puede, asimismo, modificarse genéticamente y dar como resultado una actividad reducida o eliminar la actividad de las enzimas que provocan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o de gluconolactona/ácido glucónico. Dicha célula o microorganismo modificado genéticamente de manera adicional puede ser una célula fúngica que carece de genes funcionales que codifican enzimas que provocan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o de gluconolactona/ácido glucónico; por ejemplo, puede generarse mediante deleción génica, alteración génica, silenciamiento o mutación génica; o mediante deleción, alteración o mutación de secuencias reguladoras de la expresión génica, tales como secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias activadoras de promotor y secuencias que codifican factores de transcripción; o mediante mutación aleatoria o dirigida de los genes que codifican las enzimas que provocan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o de gluconolactona/ácido glucónico. El hongo modificado adicionalmente puede ser un hongo modificado en el que uno o más genes que codifican las enzimas responsables de la producción de uno o más productos seleccionados entre celobionolactona, ácido celobiónico, gluconolactona y ácido glucónico codifican una celobiosa deshidrogenasa (CDH) se deleciona, se altera o se hace mutar. El uno o más genes pueden codificar una enzima que presenta una secuencia de aminoácidos de la celobiosa deshidrogenasa (CDH) seleccionada de un grupo de polipéptidos que presentan al menos un 90 %, 95 % o 99 % de identidad con cualquiera de los endógenos de CDH1, CDH2 y CDH3 de Myceliophthora thermophila C1, como se expone en WO2013/159005A2. El hongo modificado adicionalmente puede ser un hongo modificado adicionalmente, donde el gen que codifica la celobiosa deshidrogenasa (CDH) CDH1, CDH2 o CDH3 se deleciona, se altera o se hace mutar. El hongo modificado adicionalmente puede ser un hongo donde la actividad de CDH se reduce entre aproximadamente un 50 % y aproximadamente un 100 % o al menos un 75 %, 90 % o 95 %, medida con un ensayo de reducción de ferricianuro expuesto en WO2013/159005A2. El gen que codifica CDH1 o que codifica CDH2 en Myceliophthora thermophila CI puede ser expulsado. Los genes que codifican CDH1 y CDH2 en Myceliophthora thermophila C1 pueden ser expulsados (dobe expulsión), como se expone en WO2013/159005A2 y WO2012/061432A1.

[0084] En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de Trichoderma reesei modificada. La célula modificada puede comprender una deleción de uno o más o de la totalidad de los genes cbh1, cbh2, egl1 y egl2 (como se describe en US2015/0030717A1). La célula modificada puede comprender la deleción de un gen de endoglucosaminidasa. En algunos modos de realización, la deleción previene la desglicosilación de la proteínas secretadas.

[0085] Otras células adecuadas incluyen células de insectos (más particularmente, células de Drosophila melanogaster, células de Spodoptera frugiperda Sf9 y Sf21 y células de Trichoplusia High-Five), células de nematodo (particularmente, células de C. elegans), células de aves, células de anfibios (particularmente, células de Xenopus laevis), células de reptil y células de mamífero (más particularmente, células humanas, de simio, caninas, de roedor, bovinas u ovinas; por ejemplo, NIH3T3, CHO (célula de ovario de hámster chino), COS, VERO, BHK, HEK y otras células de roedor o humanas).

[0086] La presente exposición también contempla organismos modificados genéticamente, como las algas y las plantas con una maquinaria de sumoilación modificada, como se expone en la presente memoria. Las plantas se pueden utilizar para la producción de las enzimas y/o como el material de lignina, lignocelulósico, celulósico y/o hemicelulósico utilizado como sustrato para procesos de sacarificación. En el estado de la técnica, se conocen métodos para generar plantas recombinantes. Por ejemplo, se han desarrollado numerosos métodos para la transformación de plantas, incluidos protocolos de transformación biológica y física. Véase, por ejemplo, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. y Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88. Además, se dispone de vectores y métodos de cultivo in vitro para la transformación de células o tejidos vegetales y la regeneración de plantas. Véase, por ejemplo, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. y Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119.

[0087] El método más ampliamente utilizado para la introducción de un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985). Algunas descripciones de sistemas y métodos de vector de Agrobacterium para la transferencia genética mediada por Agrobacterium son proporcionadas por numerosas referencias, incluidas Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989) y las patentes estadounidenses n.° 4,940,838 y 5, 464, 763.

[0088] Otro método generalmente aplicable de transformación de plantas es la transformación mediada por microproyectiles; véase, por ejemplo, Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992). Otro método para la distribución física de ADN a plantas es la sonicación de células diana. Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991). Alternativamente, se ha utilizado la fusión de liposoma o de esferoplasto para introducir vectores de expresión en plantas. Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84:3962 (1987)). La absorción directa de ADN en protoplastos mediante la utilización de precipitación de CaCh, alcohol polivinílico o poli-L-ornitina también ha sido estudiada. Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) y Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). También se ha descrito la electroporación de protoplastos y células y tejidos enteros. Donn et al., en los resúmenes del VlIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC (VII Congreso Internacional sobre Células Vegetales y Cultivos Tisulares IAPTC), A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) y Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994).

[0089] También se da a conocer un proceso para producir una célula modificada tal y como se define en la presente memoria. Tal y como se indica en la presente memoria, la célula modificada se modifica para tener una maquinaria de sumoilación modificada, bien mediante modificación genética de al menos una enzima o proteína de la maquinaria de sumoilación o mediante la exposición de la célula a un modificador de enzima de sumoilación, para aumentar la producción de proteínas. Dicho proceso puede comprender la etapa de alteración de una secuencia reguladora de expresión o la secuencia codificante de una proteína de maquinaria de sumoilación; por ejemplo, la secuencia promotora de ubc9, mediante inserción, deleción o mutación puntual. Dicho proceso puede comprender al menos una etapa de modificación genética específica, donde dicha etapa puede ser una etapa en la inserción de un casete de expresión. Cabe observar que una modificación genética "dirigida" utiliza la información de secuencia del gen dirigido para crear la modificación. Por ejemplo, una modificación genética específica puede emplear la introducción de una secuencia de casete de inserción o una secuencia antisentido o una secuencia de guía que presenta un grado suficiente de complementariedad u homología (adecuado para la estrategia de modificación) con respecto a la secuencia genética dirigida para orientar la modificación al único gen de interés. Dicho proceso puede comprender la etapa de alteración de una secuencia reguladora de expresión o la secuencia codificante de una proteína de maquinaria de sumoilación; por ejemplo, la secuencia promotora de ubc9, mediante la inserción de un casete de expresión, donde la secuencia promotora de ubc9 se altera mediante la inserción de un casete de expresión en una posición que es homóloga a la posición en la secuencia promotora del gen ubc9 de M. thermophila representado por los nucleótidos en la posición 1257 y 1258 de ^sE^qID NO: 1. Por posición homóloga, cabe entender en la presente memoria una posición en una secuencia o elongación consecutiva de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 20 nucleótidos que comparte al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o al menos el 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, donde dicha posición puede ser una posición en medio o en el centro de la elongación consecutiva. Anteriormente, en la presente memoria, se han detallado células o células huésped para su uso como material de partida en el proceso descrito en la presente memoria, así como genes opcionales para su modificación en este proceso. El método de la exposición también puede comprender la etapa de incubar o exponer la célula a uno o más modificadores, tales como inhibidores, de al menos una enzima de sumoilación o una proteína SUMO, tal y como se ha detallado en la presente memoria anteriormente.

[0090] En la presente memoria, también se da a conocer una composición que comprende la célula modificada tal y como se ha definido anteriormente en la presente memoria. Dicha composición puede ser un caldo de fermentación que puede ser un caldo de fermentación bruto. El caldo de fermentación puede comprender también una proteína o mezcla de proteínas de interés endógena o exógena (homogénea o heterogénea). Dicha proteína o mezcla de proteínas puede(n) ser enzima(s) para la degradación de material lignocelulósico, tal y como se ha detallado anteriormente en la presente memoria.

[0091] También se proporciona un proceso para la producción de un sistema de expresión que comprende la etapa de transducción de una célula modificada, tal y como se ha definido en la presente memoria, o una célula obtenida mediante un proceso para la producción de dicha célula modificada, tal y como se ha definido en la presente memoria, que comprende al menos un constructo de expresión exógena que codifica al menos una proteína de interés. La proteína de interés puede ser una proteína secretada, es decir, una proteína que es secretada en el entorno extracelular tras la producción por parte de la célula. La célula transducida con múltiples constructos de expresión diferentes, cada uno de los cuales expresa diferentes proteínas de interés y/o la célula se transduce con un único constructo de expresión que codifica múltiples proteínas de interés diferentes. Opcionalmente, el proceso tiene como resultado una célula que comprende múltiples constructos de expresión exógena y/o comprende un constructo de expresión o varios constructos de expresión que codifican más de una proteína. Las proteínas codificadas pueden ser heterólogas u homólogas. Opcionalmente, el resultado del proceso es una célula capaz de producir una mezcla de proteínas de interés. Los expertos en la materia observarán que el uso de tecnologías de ADN recombinante puede mejorar el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico transfectadas mediante la manipulación, por ejemplo, del número de copias de las moléculas de ácido nucleico en la célula huésped, la eficacia con la que se transcriben dichas moléculas de ácido nucleico, la eficacia con la que se traducen las transcripciones resultantes y la eficacia de las modificaciones postraduccionales. Asimismo, la secuencia promotora podría modificarse artificialmente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Algunas técnicas recombinantes útiles para el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico incluyen, pero sin carácter limitativo, la integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas de célula huésped, la adición de secuencias de estabilidad de vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control transcripcional (p. ej., promotores, operadores, intensificadores), sustituciones o modificaciones de señales de control traduccional (p. ej., sitios de unión al ribosoma), modificación de moléculas de ácido nucleico para corresponderse con el uso del codón de la célula huésped, y deleción de secuencias que desestabilizan las transcripciones.

[0092] La presente exposición no se limita a hongos y también contempla organismos modificados genéticamente, tales como las algas y plantas transformados con una o más moléculas de ácido nucleico expuestas en la presente memoria. Las plantas pueden utilizarse para la producción de las enzimas y/o como el material lignocelulósico utilizado como sustrato en los métodos de la exposición. En el estado de la técnica, se conocen métodos para generar plantas recombinantes. Por ejemplo, se han desarrollado numerosos métodos para la transformación de plantas, incluidos protocolos de transformación biológica y física. Anteriormente, en la presente memoria, se han indicado referencias de los mismos.

[0093] La proteína o mezcla de proteínas de interés puede ser una proteína o una mezcla de proteínas aplicable industrialmente, tal y como se indica con más detalle anteriormente en la presente memoria.

[0094] También se da a conocer un proceso para la producción de una proteína o una mezcla de proteínas de interés, que comprende la etapa de cultivar una célula modificada tal y como se define en la presente memoria, o una célula modificada obtenida mediante un proceso para la producción de dicha célula modificada o un sistema de expresión tal y como se define en la presente memoria, en condiciones eficaces para la producción de la proteína. La proteína puede ser una proteína endógena o una mezcla de proteínas endógenas o una proteína o una mezcla de proteínas codificadas por un constructo de expresión exógena, tal y como se ha indicado anteriormente en la presente memoria con más detalle. Cuando la célula ha sido transducida con múltiples constructos de expresión diferentes, cada uno de los cuales expresa proteínas de interés diferentes y/o la célula ha sido transducida con un único constructo de expresión que codifica múltiples proteínas de interés diferentes, el proceso para la producción de una proteína o mezcla de proteínas de interés tal y como se define en la presente memoria daría como resultado la producción de mezclas de proteínas.

[0095] En algunos casos, la proteína puede recuperarse (es decir, aislarse y/o purificarse) y, en otros, la célula puede recolectarse por completo, y cualquiera de las dos puede utilizarse en una composición. La exposición también da a conocer una composición que comprende la célula modificada. En caso de que la célula sea un microorganismo, la célula puede cultivarse en el medio de fermentación adecuado, es decir, un medio de fermentación en el que el microorganismo sea capaz de producir las proteínas de interés. Los microorganismos pueden cultivarse mediante cualquier proceso de fermentación, incluidos, entre otros, la fermentación por lotes, por lotes alimentados, con células recicladas y continua. En general, las cepas fúngicas son cultivadas en fermentadoras, opcionalmente se centrifugan o se filtran para eliminar la biomasa y, opcionalmente, se concentran, se formulan y se secan para producir una proteína o una composición de múltiples proteínas que es un producto de fermentación bruto. En la patente estadounidense n.° 6,015,707 y en la patente estadounidense n.° 6,573,086, se describen condiciones adecuadas para el cultivo de hongos filamentosos.

[0096] La recuperación de proteínas se refiere al proceso de recopilar todo el medio de cultivo que contiene la proteína y no implica etapas adicionales de separación ni purificación. Las proteínas producidas pueden purificarse mediante la utilización de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, entre otras, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, la filtración, la electroforesis, la cromatografía hidrofóbica, cromatografía de filtración por gel, la cromatografía en fase inversa, la cromatografía de concanavalina A, el cromatoenfoque y la precipitación o solubilización diferencial. Las proteínas pueden recuperarse, obtenerse y/o utilizarse en una forma "sustancialmente pura". Tal y como se utiliza en la presente memoria, "sustancialmente puro/a" hace referencia a una pureza que permite el uso efectivo de la proteína en cualquier método de acuerdo con la presente exposición. Para que una proteína sea útil en más aplicaciones, puede estar sustancialmente exenta de contaminantes, otras proteínas y/o productos químicos que podrían interferir o que interferirían con su uso en otra aplicación. Una proteína "sustancialmente pura", tal y como se indica en la presente memoria, puede ser una proteína que puede producirse mediante cualquier método (es decir, mediante purificación directa a partir de una fuente natural, de manera recombinante o de manera sintética), y que ha sido purificada a partir de otros componentes de proteína de tal forma que la proteína comprende al menos aproximadamente un 80 % peso/peso de la proteína total en una composición determinada (p. ej., la proteína de interés representa aproximadamente un 80 % de la proteína en una solución/composición/tampón), al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 % peso/peso de la proteína total en una composición determinada.

[0097] Asimismo, se da a conocer el uso de una célula modificada tal y como se define en la presente memoria en un proceso para producir al menos una proteína de interés tal y como se define en la presente memoria.

[0098] La invención se explica con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven a modo de aclaración.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Producción de proteínas mejorada de cepas C1 de M. thermophila: alteración de la región promotora de ubc9

[0099] Los inventores descubrieron una cepa C1 de Myceliophthora thermophila que producía, inesperadamente, una alta cantidad de proteínas después de dos rondas de cotransformación subsiguiente empezando con W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5 (produciendo un transformante de segunda generación) mediante la utilización de un casete de expresión de celulasa específico (como se describe en la solicitud de patente Europea EP 2408910). El análisis genético del transformante reveló un evento de integración en la región promotora del gen anotado como enzima conjugadora de ubiquitina, E2 (ubc9) (número de acceso de NCBI XP_003662268.1, Interpro ID IPR000608, acceso Prosite PS50127, que contiene el dominio Pfam PF00179) representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 1, que probablemente altera la expresión funcional. Se demostró que Ubc9 desempeña una función en la sumoilación de las proteínas diana.

[0100] Con el fin de conocer más en profundidad el fenotipo de alta producción de proteínas del transformante de segunda generación, se llevó a cabo un análisis de expresión (RNA-seq) génica diferencial con el transformante de segunda generación y se comparó con W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5. Se realizaron cultivos por lote alimentado con limitación de carbono con ambas cepas mediante la utilización de glucosa como alimentación de carbono. A partir de estos cultivos, se tomaron muestras de micelio a las 4 horas, 90 horas y 162 horas de haber empezado la alimentación. A partir de estas muestras, se aisló el ARN total con el sistema SV Total RNA Isolation System (Promega Corporation, EE. UU.) mediante la utilización de micelio molido como material de partida. A continuación, se envió el ARN total aislado para su secuenciación mediante la utilización de la plataforma Illumina. Se analizaron y se visualizaron datos de secuenciación de ARN de extremos apareados mediante la utilización de una combinación de herramientas estándar (TopHat, Cuffdiff) y de scripts hechos a medida. La expresión, medida en FPKM (fragmentos por kilobase por millón) y obtenida a partir de extremos apareados de RNA-seq en Illumina de 126 nt de longitud (tamaño total de biblioteca 4,7-8,2 M extremos apareados, cada uno) se presenta en la tabla 1. Los resultados de los análisis de expresión génica diferenciales pusieron de manifiesto una regulación por disminución del gen ubc9, una enzima de conjugación SUMO implicada en la vía de conjugación SUMO. La reducción de la expresión de ubc9 se muestra de manera sistemática en todos los puntos temporales, con niveles de reducción de entre un 95,4 % y un 99 %, correspondientes a una reducción de al menos 4,3 veces (a t=4 h).

Tabla 1. Valores de FPKM obtenidos con análisis de expresión génica diferencial mediante la utilización de secuenciación de ARN.

Ejemplo 2: Alteración específica de la región promotora del gen ubc9 de cepas C1 de M. thermophila

[0101] Para analizar el efecto del evento de integración en la producción de proteínas, el marcador de selección amdS fue insertado en el mismo locus en una cepa C1 de Myceliophthora thermophila, es decir, insertado en la región promotora de ubc9 entre los nucleótidos en la posición 1257 y 1258 de SEQ ID NO: 1. Más en particular, la cepa utilizada se obtuvo a partir de W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5. W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5 se obtiene a partir de W1L#100.l (depositado con el n.° CBS122190) mediante la alteración del gen alpl y chil, tal y como se describe en WO2010/107303, (más en particular, en el ejemplo 5 de WO2010/107303.

[0102] Los transformantes fueron producidos mediante la cotransfección de W1L#100.l Aalp1Achi1Apyr5 con un casete de expresión que codifica Eg2 (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 4) y un marcador de selección de pyr5 (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 7). El transformante obtenido se denomina W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[eg2pyr5]. Posteriormente, el casete de inserción de Ubc9-amdS representado por SEQ ID NO: 3 fue dirigido al locus de ubc9 específico en W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[eg2/pyr5] análogo al procedimiento para realizar deleciones de genes, que fue descrito anteriormente por Visser et al. (2011). El casete de inserción de amdS fue construido con el gen marcador de selección de acetamidasa (amdS) [incluyendo su propia secuencia promotora y terminadora] de Aspergillus nidulans, flanqueado por las secuencias de 1257 y 1380 bp (flanco en dirección 5' y en dirección 3', respectivamente) del sitio de inserción de ubc9 (posición de nucleótidos 1257-1258 de ^sE^qID NO: 1). Los casetes de inserción también comprenden repeticiones de cbh que no son pertinentes para los presentes ejemplos, pero pueden utilizarse para la eliminación opcional de secuencias de marcador de selección en aplicaciones futuras. La inserción de amdS se produce tras la recombinación homóloga de las secuencias flanqueadoras que portan la misma secuencia que el sitio de inserción en el genoma. De esta manera, el marcador de selección de amdS fue insertado en el genoma W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[eg2/pyr5] en el locus especificado.

[0103] Los transformantes fueron cribados mediante la utilización de PCR de colonias, que se estableció para amplificar parte del gen amdS combinado con una parte del sitio de inserción. Solo cuando el gen amdS fue correctamente insertado en el locus correcto, la amplificación fue posible. De este modo, los transformantes que portaban una amdS correctamente insertado podrían distinguirse de los transformantes que presentan el marcador de selección integrado en otro lugar del genoma.

[0104] Las cepas transformantes confirmadas fueron cultivadas en placas microtituladoras y en matraces de agitación para analizar el efecto de la inserción de amdS en la producción de proteínas extracelulares. La producción y secreción de proteínas mejorada fue confirmada mediante observación visual con SDS-PAGE. Otros experimentos de fermentación posteriores (cultivos por lote alimentado con limitación de carbono con la utilización de glucosa como alimentación de carbono) confirmaron adicionalmente la producción de proteínas mejorada. Las mediciones de concentración de proteínas con el ensayo BCA (kit de ensayo de proteínas BCA Pierce [ThermoFisher Scientific]) sobre el contenido de proteínas extracelulares mostraron unos niveles de producción de proteínas superiores de la cepa transformante, con unos niveles de proteínas crecientes desde 15,6 hasta 35,5 g/L (figura 1). Asimismo, se determinó el Qp máx. para ambas cepas (tabla 2). El Qp es el índice de producción de proteínas específico (gramo de proteína / gramo de biomasa / hora), que se calculó mediante la división del índice de producción de proteínas total (en gramo / hora) por la cantidad de biomasa (peso seco de célula) presente en ese momento en el reactor. El índice de producción de proteínas total se calcula a partir de la inclinación de la proteína total producida con el tiempo. El Qp máx. aumentó desde 0,011 g/g/h en la cepa madre hasta 0,015 g/g/h en la cepa modificada de ubc9.

Tabla 2. Proteína total y Qp con y sin alteración en la región promotora de ubc9

Ejemplo 3: Producción de proteínas heterólogas mejorada con cepas C1 de M. thermophila: alteración de la región promotora de ubc9

[0105] Con el fin de demostrar que la modificación genética del promotor del promotor de ubc9 (Pubc9) da lugar a niveles de producción mejorados de proteínas a partir de microorganismos diferentes a M. thermophila C1, la mutación de Pubc9 - tal y como se describe en el ejemplo 1 - fue introducida en la cepa W1L#100.lAalpl Achi1Apyr5 que expresa la proteína heteróloga Bxl1 (p-xilosidasa) de Talaromyces wortmanii W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[Tw8xl1/pyr5] y PGII (poligalacturonasa) de Aspergillus niger (W1L#100.lAchi1Apyr5 [AnPGII/pyr5]).

[0106] Los transformantes fueron producidos mediante la cotransfección de un marcador de selección de pyr5 (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 7) con el casete de expresión que codifica TwBxl1 o AnPGII en W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5, de tal forma que se produce el transformante W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[TwBxl1/pyr5] o W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[AnPG///pyr5]. Este casete de expresión (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 6 y 5, respectivamente) también comprendía un promotor del gen chil y la secuencia terminadora de cbhl, que suelen utilizarse para obtener altos niveles de expresión de los genes correspondientes (Visser et al., 2011). Posteriormente, el casete de inserción de Ubc9-amdS representado por SEQ ID NO: 3 fue dirigido al promotor de ubc9 en las cepas W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[TwBxl1/pyr5] y W1L#100.lAalp1Achi1Apyr5[AnPG///pyr5], como se expone con más detalle en el ejemplo 2.

[0107] Los transformantes fueron cribados mediante la utilización de PCR de colonias, que se estableció para amplificar parte del gen amdS combinado con una parte del sitio de inserción. Solo cuando el gen amdS fue correctamente insertado en el locus correcto, la amplificación fue posible. De este modo, un transformante que portaba una amdS correctamente insertada podría distinguirse de los transformantes que presentan el marcador de selección integrado en otro lugar del genoma.

[0108] Las cepas de transformante confirmadas fueron cultivadas en placas microtituladoras y en matraces de agitación para analizar el efecto de la inserción de amdS en la producción de proteínas extracelulares. La producción y secreción de proteínas mejorada fue confirmada mediante observación visual con SDS-PAGE (figura 2 y 3).

Ejemplo 4: Producción de proteínas mejorada de cepas HC C1 de M. thermophila: alteración de la región promotora de ubc9

[0109] Con el fin de demostrar que la modificación genética de Pubc9 (la región promotora de ubc9) en otro linaje de M. thermophila también da lugar a niveles de producción mejorados, la mutación de Pubc9 - tal y como se ha descrito en el ejemplo 1 - fue introducida en la cepa HC UV18-25.

[0110] La introducción del marcador de selección de amdS representado por SEQ ID NO: 3 en la región promotora de ubc9 en la cepa UV18-25 se explica con más detalle en el ejemplo 2.

[0111] Los transformantes fueron cribados mediante la utilización de PCR de colonias, que se estableció para amplificar parte del gen amdS combinado con una parte del sitio de inserción. Solo cuando el gen amdS fue correctamente insertado en el locus correcto, la amplificación fue posible. De este modo, los transformantes que portaban una amdS correctamente insertada podrían distinguirse de los transformantes que presentan el marcador de selección integrado en otro lugar del genoma.

[0112] Una cepa de transformante confirmada fue cultivada en placas microtituladoras y en matraces de agitación para analizar el efecto de la inserción de amdS en la producción de proteínas extracelulares. La producción y secreción de proteínas mejorada fue confirmada mediante observación visual con SDS-PAGE.

[0113] La cepa transformante confirmada fue analizada en experimentos de fermentación (como se describe en el ejemplo 2) para confirmar la producción de proteínas mejorada. Las mediciones de concentración de proteínas con el ensayo BCA (como se ha descrito en el ejemplo 2) sobre el contenido de proteínas extracelulares mostraron unos niveles de producción de proteínas superiores de la cepa transformante, con unos niveles de proteínas crecientes desde 39,6 hasta 47,5 g/L. Asimismo, se determinó el índice de producción de proteínas específico (Qp máx.) para ambas cepas, como se ha descrito en el ejemplo 2 (tabla 3).

Tabla 3. Concentración de proteínas total (g/L) y Qp máx. (g/g/h) obtenido a partir de fermentaciones en Labfors

(2,5 L)

[0114] Se analizaron cócteles de enzimas a partir de las cepas UV18-25 y UV18-25 ubc9::amdS para observar la eficacia de sacarificación. El rastrojo de maíz pretratado del NREL (Schell et al., J Appl Biochem Biotechnol, 105:69-86, 2003) fue utilizado como sustrato. Las reacciones de sacarificación se llevaron a cabo en un volumen total de 10 mL en tubos Greiner de 50 mL mediante la utilización del sustrato con un contenido en materia seca de un 20 %. Las reacciones de sacarificación se llevaron a cabo con un pH 5 mediante la utilización de un tampón de acetato con una concentración final de 100 mM. Se añadió una cantidad predeterminada de hidróxido de sodio a cada reacción para conseguir un valor de pH 5. Se incluyó una reacción adicional (15 mg/g) para monitorizar el pH cada 24 horas. Cuando el pH de esta reacción adicional se desvió más de 0,1 unidades de pH, se añadió 2M NaOH para corregir el pH a su pH de partida inicial. El volumen necesario para ajustar el pH fue añadido posteriormente a los demás tubos de reacción y mezclado inmediatamente. La azida de sodio fue dosificada a un 0,02 % (p/p). Se analizaron mezclas enzimáticas con cargas de enzimas de 2,5-5-10 y 15 mg/g de DM (dosis-respuesta). Se añadió Bgl1 purificada de M. thermophila C1 (SEQ ID NO: 16) a cada reacción (10 % de la carga de punto de partida). Las cargas de enzimas fueron aplicadas mediante la utilización de valores determinados por BCA descritos anteriormente. Las reacciones se incubaron a 52 °C a 300 rpm. Después de 24 y 68 h, se tomaron muestras de 0,2 ml y se filtraron mediante la utilización de una microplaca (pvdf), seguido de un análisis de los sobrenadantes. Las concentraciones de glucosa se midieron mediante la utilización de un kit de ensayo GOPOD (Megazyme, Co. Wicklow, Irlanda). Todos los experimentos se realizaron por duplicado. En la figura 5, se muestra la eficacia de sacarificación de las mezclas de proteínas de UV18-25 ubc9::amdS.

Tabla 4 Resumen de secuencia de SEQ ID ONs 1-7

Ejemplo 5: Alteración de la región promotora del gen ubc9 de cepas C1 de M. thermophila que expresan glucoamilasa heteróloga

[0115] Los transformantes fueron producidos mediante la cotransfección de las cepas W1L#100.I Aalp1Achi1Apyr5 y la cepa UV18#100.fAalp1Apyr5 con un casete de expresión que codifica glucoamilasa de Trichoderma reesei (indicada como "DP1"), de los cuales se modificó la secuencia codificante de ADN para su expresión en cepas C1 (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente) y un marcador de selección de pyr5 (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 7). El casete de expresión utilizado para la cepa W1L#100.I Aalp1Achi1Apyr5 incluía una secuencia promotora de chil (SEQ ID NO: 51) y el casete de expresión utilizado para la cepa UV18#100.fAalp1Apyr5 incluía una secuencia promotora de cbhl (SEQ ID NO: 52). Los transformantes obtenidos fueron cribados para observar la actividad de glucoamilasa mediante la utilización del kit de ensayo de p-amilasa (Betamyl-3) de Megazyme (Co. Wiklow, Irlanda). Se seleccionaron los transformantes con la mayor actividad de glucoamilasa y fueron denominados W1L#100.IAalp1Achi1Apyr5[DP1/pyr5] y UV18#100.fAalp1Apyr5[DP1/pyr5], respectivamente. Posteriormente, se modificó la región promotora de ubc9 en estos transformantes para que fuera análoga a la que se ha descrito en el ejemplo 2.

[0116] Después de confirmar que la región promotora de ubc9 fue modificada por PCR de colonias (como se ha descrito en el ejemplo 2), las cepas modificadas y sus cepas madre de expresión de glucoamilasa fueron cultivadas en fermentadoras Minifors (1L) o Labfors (2,5 L) en cultivos por lote alimentado con limitación de carbono mediante la utilización de glucosa como fuente de carbono para analizar la producción de glucoamilasa extracelular. Se llevaron a cabo ensayos de actividad de glucoamilasa mediante la utilización de p-Nitrofenil a-D-glucopiranosida (pNPG; Sigma N-1377) como sustrato. Se calcularon los niveles de glucoamilasa producidos por M. thermophila C1 mediante la conversión de las unidades de glucoamilasa (GAU), medidas con el ensayo pNPG en gramo de glucoamilasa por litro (g/L). Con este fin, se determinó un factor de conversión mediante la realización del mismo ensayo pNPG en una muestra de glucoamilasa producida de T. reesei de la que se conocía la concentración de proteínas. Este factor de conversión se utilizó posteriormente para convertir las GAU medidas en cultivos de M. thermophila en concentraciones de glucoamilasa. Las cepas de M. thermophila modificadas por ubc9 mostraron niveles de producción de glucoamilasa superiores (tablas 5B y 6B).

[0117] Las concentraciones de proteína totales (medidas con el ensayo de BCA descrito en el ejemplo 2) eran superiores a las de la cepa modificada por ubc9 W1L#100.IAalp1Achi1Apyr5[DP1/pyr5] (tabla 5A). Los niveles de proteína totales de la cepa modificada por ubc9 UV18#l0o.fAalplApyr5[DP1/pyr5] no aumentaron en las fermentaciones en Minifors (1 L), pero sí que mostraron unos niveles de proteína mayores en las fermentaciones en Labford (2,5 L) (tabla 6A). Asimismo, se calcularon los Qp máx. (como se describe en el ejemplo 2), que se muestran en la tabla 7.

Tabla 5A: Concentraciones de proteína totales producidas con la cepa W1L#100.IAalp1Achi1Apyr5 de expresión de DP1 con y sin alteración del promotor gel gen ubc9.

Tabla 5B: Concentraciones de glucoamilasa producidas con la cepa W1L#100.IAa/p1Achi1Apyr5 de expresión de DPI con y sin alteración del promotor del gen ubc9

Tabla 6A Concentraciones de proteína totales producidas con la cepa UV18#100.f Aa/p1Apyr5 de expresión de DP1 con y sin alteración del promotor del gen ubc9

Tabla 6B. Concentraciones de glucoamilasa producidas con la cepa UV18#100.fAa/p1Apyr5 que expresa DPI con y sin alteración del promotor del gen ubc9

Tabla 7. Concentración de proteínas totales (g/L) y Qp máx. (g/g/h) a partir de fermentaciones en Labfors (2,5 L)

Ejemplo 6: Alteración dirigida de la región promotora del gen ubc9 de cepas C1 de M. thermophi/a que expresan fitasa heteróloga

[0118] Con el fin de demostrar que la modificación genética de Pubc9 (la región promotora de ubc9) también da lugar a niveles de producción mejorados de una fitasa heteróloga, se introdujo la mutación de Pubc9 - como se ha descrito en el ejemplo 2 - en las cepas C1 W1L#100.IAa/p1Achi1Apyr5 y UV18#100.fAa/p1Apyr5 que expresan una variante de fitasa de Buttiauxe//a sp (proteína SEQ ID NO: 21).

[0119] Los transformantes fueron producidos mediante la cotransfección de las cepas W1L#100.I Aa/p1Achi1Apyr5 y UV18#100.fAa/p1Apyr5 con un casete de expresión que codifica la fitasa (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, respectivamente) y un marcador de selección de pyr5 (representado en la presente memoria por SEQ ID NO: 7). El casete de expresión utilizado para la cepa W1L#100.I Aa/p1Achi1Apyr5 incluía una secuencia promotora de chil (SEQ ID NO: 51) y el casete de expresión utilizado para la cepa UV18#100.fAa/p1Apyr5 incluía una secuencia promotora de cbh1 (SEQ ID NO: 52). Los transformantes obtenidos, que presentaban una actividad de fitasa elevada superior a la de la madre sin trasnformar se denominan W1L#100.IAa/p1Achi1Apyr5[phytase/pyr5] y UV18#10o.fAa/p1Apyr5[phytase/pyr5], respectivamente. Posteriormente, se modificó la región promotora de ubc9 en estos transformantes para que fuera análoga a la que se ha descrito en el ejemplo 2.

[0120] Las cepas modificadas de ubc9 y sus cepas madre de expresión de fitasa fueron cultivadas en fermentadoras (se llevaron a cabo cultivos por lote alimentado con limitación de carbono con ambas cepas mediante la utilización de glucosa como alimentación de carbono) para analizar el efecto de la modificación del promotor de ubc9 en la producción de fitasa extracelular.

[0121] Las mediciones de la actividad de fitasa (US2015/0030717 ) mostraron unos niveles de actividad mayores de las cepas modificadas de ubc9, con niveles de actividad crecientes desde 2,1 a 5,9 kU/g para W1L#100.IAa/p1Achi1Apyr5[phytase/pyr5] y desde 11,3 a 16,1 kU/g paraUV18#100.fAa/p1Apyr5[phyfase/pyr5] (figura 6). Asimismo, los nivles de proteína totales eran superiores de las cepas modificadas de ubc9, con niveles de proteína extracelulares crecientes desde14 a 20 g/Kg para W1L#100.IAa/p1Ach/1Apyr5[phytase/pyr5] y desde 64 a 75 g/Kg para UV18#100.fAa/p1Apyr5[phytase/pyr5] (figura 6).

Ejemplo 7: Alteración dirigida de la región promotora del gen ubc9 de cepas de Asperaillus niger que sobreexpresan poligalacturonasa II heteróloga

[0122] El Aspergi/lus niger utilizado en este estudio se obtiene de N402 (Bos et a/., 1988). Las cepas de A.niger que expresan pGpdA-pgaIIC1 fueron obtenidas mediante cotransfección de la cepa AB4.1, un derivado de pyrG-de N402 (van Hartingsveldt et a/., 1987) with 5 |jg de pAB4.1 (van Hartingsveldt et a/., 1987) y 50 |jg de pGpdA-pgaIIC1. El vector de expresión pGpdA-pgaIIC1 (s Eq ID NO: 23) contiene la secuencia codificante para poligalacturonasa II de A. niger, que se optimizó por codón para su expresión en M. thermophi/a C1 (SEQ ID NO: 24; proteína SEQ ID NO: 25), y el promotor comúnmente utilizado GpdA para impulsar la expresión génica. La transfección de A.niger se llevó a cabo como se ha descrito (Arentshorst et a/., 2012). Los transformantes fueron purificados mediante dos rondas de purificación en medio mínimo selectivo (Bennet y Lasure, 1991). Tras la purificación, se cultivaron transformantes individuales en pocillo de placa microtituladora (200 j l de medio mínimo) y el medio fue analizado para observar la actividad de galacturonasa mediante la utilización del ensayo PAHBAH (véase más adelante). Las cepas que mostraban expresión de Pgall fueron cultivadas en medio completo (Arentshorst et a/., 2012) e incubadas durante 4-5 días antes del aislamiento de conidióspora. Se contaron las esporas mediante la utilización de un contador celular de Biorad y se almacenaron a 4 °C en 0,9 % de NaCl. Se utilizaron las suspensiones de espora para inocular cultivos en matraces de agitación (50 ml de medio mínimo en 300 ml de matraces de Erlenmeyer) con una densidad de 1,0 x 106 esporas/ml y fueron cultivadas durante 36 horas a 37 °C a 250 rpm.

[0123] Se obtuvieron cepas de inserción de promotor Ubc9 (identificador de gen An04g01350 en AspGD) mediante transfección con selección de amdS del casete de inserción de ubc9 (SEQ ID NO: 26) en las cepas de A. niger AN[PGAII]_HIGH y AN[PGAII]_LOW. El fragmento de inserción fue diseñado para que el marcador de selección de amdS fuera introducido 45 pares de bases en dirección 5' del ATG de inicio de ubc9, que es similar a la estrategia utilizada para insertar el marcador de selección de amdS en M. thermophi/a. El casete de inserción contiene el marcador de amdS flanqueado por 956 bp de la región en dirección 5' de ubc9 y 983 bp de la región codificante y en dirección 5' de ubc9. El fragmento de 5863 bp fue utilizado para la transfección de las cepas AN[PGAII]_HIGH y AN[PGAII]_LOW. Se seleccionaron cepas transformantes en medios para la selección de amdS, como se ha descrito en Arentshorst et a/., 2012. Los transformantes fueron purificados dos veces en placas de acetamida mínima selectivas, antes de cultivarse cepas seleccionadas en medio completo para obtener esporas para inocular cultivos líquidos.

[0124] El ADN genómico fue aislado tal y como se ha descrito anteriormente (Meyer et a/. 2010) y utilizado en una PCR diagnóstica mediante la utilización de los cebadores ubc9P1f y ubc9P4r. La PCR fue realizada con ADN polimerasa Phire Hot Start II o con ADN polimerasa Phusion (Thermo Scientific). ubc9P1f (GATAGTGCTTAGCGACACCCG; SEQ ID NO: 27) se reasocia con el marcador de amdS y ubc9P4r (TCGGCCACAAATCTCAGTGA; SEQ ID NO: 28) se reasocia con la región 3' de ubc9. Se espera que la integración con éxito del fragmento de inserción en el promotor de ubc9 dé lugar a un fragmento de PCR de 2222 bp, mientras que no se forma ningún producto cuando el fragmento se inserta ectópicamente.

[0125] Se llevó a cabo un análisis de transferencia de Southern de acuerdo con (Sambrook y Russell 2001). Se sintetizaron sondas marcadas con a-32P-dCTP mediante la utilización del kit Decalabel DNA labelling (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN genómico de las cepas de A.niger fue digerido con BamHI y marcado con una sonda nucleotídica 1000, que cubría la región codificante de ubc9. Las enzimas de restricción fueron obtenidas a partir de Thermo Scientific y utilizadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0126] Los cultivos en biorreactor fueron realizados como se ha descrito anteriormente (Jorgensen et a/., 2010; Nitsche et a/., 2012, utilizando un 0,75 % (p/v) de glucosa como fuente de carbono.

[0127] Se realizó el ensayo PAHBAH de azúcar no reductor para determinar la actividad relativa de poligalacturonasa mediante la utilización del ácido poligalacturónico como sustrato (como ha descrito M. Lever, 1972). La actividad enzimática de las muestras se define como la cantidad de ácido galacturónico por litro que se libera en 5 minutos dividida por el tiempo de incubación por litro de volumen de reacción (véase la fórmula). La actividad enzimática se muestra en unidades por gramo de proteína (U/g). La actividad enzimática se determina en muestras diluidas que se encontraban dentro del rango de la curva estándar ( 0 - 2 mM de ácido galacturónico).

X * V r * D e * 1000

Actividad enzimática = y e tí! T

X = mmol de ácido galacturónico por litro

Vr = volumen de reacción en litros

De = dilución de enzimas antes de añadirse a mezcla de reacción

Ve = volumen de enzimas añadido a mezcla de reacción en ml

Ec = concentración enzima/proteína en solución madre en mg/ml

T = tiempo de incubación

[0128] Se analizaron muestras de medio de transformantes de A.niger obtenidos después de la cotransfección de pAB4.1 con pGpdA-pgaIIC1 para observar la actividad de endopolifalacturonasa después de su cultivo en placas microtituladoras mediante la utilización del ensayo PAHBAH de azúcar no reductor y de PGA como sustrato. 12 transformantes con una actividad al menos 3 veces mayor en comparación con las cepas no transformadas fueron seleccionados y cultivados de nuevo en cultivos de matraz de agitación para obtener una medición cuantitativa fiable de la actividad. A partir de las mediciones de actividad, se seleccionaron dos cepas, An[Pgall]_high (110 ± 10 AU) y An[PgaII]_low (30 ± 3 AU), que mostraron una actividad en PGA muy por encima de la cepa madre N402 (4 ± 1 AU). Las cepas An[PgaII]_high y An[Pgall]_low fueron seleccionadas como cepas de A.niger de alta producción de poligalacturonasa y de baja producción de galacturonasa y fueron utilizadas para experimentos posteriores.

[0129] Las cepas An[Pgall]_high y An[PgaII]_low fueron transformadas con el constructo de inserción del promotor de ubc9::amdS y los transformantes que pudieron cultivarse en placas de acetamida fueron seleccionados y purificados. El ADN genómico de los transformantes fue aislado y analizado mediante PCR diagnóstica y transferencia de Southern para identificar a los transformantes en los que el fragmento de inserción del promotor de ubc9::amdS se integró en el sitio deseado. Se descubrió que dos transformantes en el contexto de An[PgaII]_high (An[PgaII]_high ubc9::amdS #8 y #17) y un transformante en el contexto de An[PgaII]_low (An[PgaII]_low ubc9::amdS #1) contenían el fragmento en el sitio esperado y no contenían insertos adicionales.

[0130] Las cepas seleccionadas An[Pgall]_high y An[PgaII]_low y los derivados An[Pgall]_high ubc9::amdS #8 y #17 y An[Pgall]_low ubc9::amdS #1, respectivamente, fueron cultivados en cultivos de matraz de agitación tal y como se ha descrito anteriormente y analizados para observar la actividad de engopoligalacturonasa mediante la utilización del ensayo PAHBAH. En la tabla 8, se proporciona la actividad relativa no reductora en PGA de las cinco cepas.

[0131] En la tabla 9, se muestra la producción de enzimas con cultivo de An[Pgall]_high y el derivado An[Pgall]_high ubc9::amdS #17 en biorreactores.

Tabla 8. Actividad relativa no reductora en PGA en muestras de medio de cultivo de transformantes seleccionados después de cultivo en matraz de agitación (48 h, 30 °C).

Tabla 9. Actividad relativa no reductora en PGA en muestras de medio de cultivo de transformantes seleccionados durante el cultivo en biorreactor (pH 3,0, 30 °C) células de crecimiento exponencial medio

Ejemplo 8. Alteración del promotor de ubc9 en Trichoderma reesei

[0132] Un plásmido, pLH937 (SEQ ID NO: 29), fue construido y comprendía los siguientes segmentos de ADN: 1. Un vector bacteriano que incluye el gen ccdB de E. coli, un gen resistente a la ampicilina y un origen de replicación para la selección y amplificación en E. coli.

2. Un marco de lectrua abierto de higromicina fosfotransferasa fusionado de manera operativa con el promotor cpcl de Neurospora crassa y el terminador trpC de A. nidulans.

[0133] Se seleccionaron tres sitios objetivo de Cas9 diferentes en el promotor de ubc9 de Trichoderma reesei. Estos se encontraban cerca del sitio de inserción que se utilizó en los ejemplos anteriores con Myceliophthora thermophila (C1).

Sitio objetivo 1: GCAGTTCGACGCTTACCCACCGG (SEQ ID NO: 30).

Sitio objetivo 2: CGACGCTTACCCACCGGGTGAGG (SEQ ID NO: 31).

Sitio objetivo 3: GCGCGACTACCATCACGTCTCGG (SEQ ID NO: 32).

[0134] En cada caso, los primeros 20 nucleótidos representan la región protoespaciadora reconocida por Cas9 y los tres últimos nucleótidos son el PAM (motivo adyacente de protoespaciador). Se generaron ARN guías para su ensamblaje con Cas9 a partir de estas secuencias objetivo.

[0135] Una cepa de Trichoderma reesei que secreta una variante modificada artificialmente (BP17) de una fitasa de Buttiauxella sp. (SEQ ID NO: 33) fue utilizada en estos experimentos. Esta cepa presentaba deleciones de los cuatro genes de celulasa secretados principales (cbh1, cbh2, egl1 y egl2), así como una deleción de un gen de endoglucosaminidasa para prevenir la desglicosilación de las proteínas secretadas. La construcción de cepas se describe en US 2015/0030717A1, ejemplos 1 y 2. Los protoplastos de esta cepa fueron preparados mediante la utilización de los métodos descritos en U^s2015/0030717.

Cotransformación del complejo Cas9.RNP y el plásmido pLH937 en protoplastos de Trichoderma reesei [0136] La proteína Cas9 fue mezclada individualmente con cada uno de los tres ARN guías diferentes e incubada en tampón para que se ensamblaran los complejos Cas9.RNP. La transformación mediada por polietilenglicol (PEG) de los protoplastos de T.reesei se realizó como se describe en WO2016100568A1 para permitir la absorción de Cas9.RNP y ADN plasmídico.

[0137] Se mezclaron 25 ul de Cas9.RNP, 3 ul de plásmido pLH937 (0,3 ug/uL), 1,2 ul de reactivo de transfección Lipofectamine® CRISPR-MAX (Thermo Fisher) y, a continuación, fueron añadidos a los protoplastos para su absorción. Tras el procedimiento de transformación, los protoplastos fueron sembrados en una capa de medio de agar Vogel (con 1,1 M de sorbitol, un 2 % de glucosa y 50 ug/mL de higromicina B) vertida sobre medio de agar Vogel solidificado (con 1,1 M de sorbitol y un 20 % de glucosa, pero sin higromicina).

[0138] Las colonias transformadas que surgieron en las placas de selección de higromicina fueron transferidas a agar Vogel no selectivo sin sorbitol o sin higromicina e incubadas durante 4 días a 30 °C. A continuación, las colonias fueron pasadas dos veces sobre agar Vogel selectivo con 50 ug/mL de higromicina. Se consideró que las colonias de transformantes que se cultivaron correctamente presentaban un fenotipo estable resistente a la higromicina. Se esperaba que la mayoría de estos transformantes estables presentaran pLH937 o algún fragmento o algunos fragmentos del mismo, integrados en el sitio objetivo de cas9 en el promotor del gen ubc9. Se aisló el ADN genómico de los transformantes. Se llevó a cabo una PCR mediante la utilización de los cebadores nik1 2kb F (5'-gccatgaacctcaccacacag; SEQ ID NO: 34) y nik1 2kb R(5'-cggcgtggccctgttctcgag; SEQ ID NO: 35) para amplificar una región de 2kb del locus de nik1 de T. reesei. La electroforesis en gel de agarosa confirmó que todas las muestras contenían ADNg de suficiente cantidad y calidad para servir como plantilla en la PCR.

[0139] Se llevó a cabo una PCR mediante la utilización de los cebadores 3078 (5'-aagagatctctgccctcccaggg; SEQ ID NO: 36) y 3079 (5'- gtgatggccggcttccagg; SEQ ID NO: 37) para amplificar la región promotora de ubc9 que abarca los sitios objetivo de cas9. La PCR se realizó con ADN polimerasa Stratagene PfuUltra II Fusion HS (Agilent, Santa Clara, California) de acuerdo con las instrucciones del fabricante a una temperatura de recocido de 50 °C y un tiempo de extensión de 1 minuto. Con estas condiciones, se esperaba que no se obtuviera ningún producto de PCR en caso de haber un inserto grande en el sitio objetivo de cas9 en el promotor de ubc9. Los transformantes que produjeron un producto de PCR del tamaño esperado para el locus de ubc9 de tipo salvaje fueron eliminados de otros análisis. La totalidad de los transformantes descritos a continuación no produjeron ningún producto de PCR, lo que sugiere que todos tienen el vector HygR insertado en el sitio objetivo. Se llevó a cabo una PCR mediante la utilización de los cebadores 3078 y 3145 (5'- ctttgccctcggacgagtgct; SEQ ID NO: 38) para amplificar entre la región flanqueadora del promotor de ubc9 y el extremo 5' del gen de higromicina fosfotransferasa (HygR). Se llevó a cabo una PCR a una temperatura de recocido de 50 °C y con un tiempo de extensión de 3 minutos. Solo se obtendría un producto de PCR si el vector HygR se insertara en el sitio objetivo en el promotor de ubc9. Mediante la utilización de ADN genómico como plantilla, los siguientes transformantes mostraron un producto de PCR obvio; 3140-12, 3140-34, 3141-11, 3141-25, 3141-34, 3142-15, 3142-34, 3140-2, 3140-5 y 3141-1.

[0140] Se llevó a cabo una PCR mediante la utilización de los cebadores 3078 y 3146 (5'-ctgaactcaccgcgacgtctgtc; SEQ ID NO: 39) para amplificar entre la región flanqueadora del promotor de ubc9 y el extremo 3' del gen de HygR. Se llevó a cabo una PCR a una temperatura de recocido de 50 °C y con un tiempo de extensión de 3 minutos. Solo se obtendría un producto de PCR si el vector HygR se insertara en el sitio objetivo en el promotor de ubc9. Mediante la utilización de ADN genómico como plantilla, los siguientes transformantes mostraron un producto de PCR obvio; 3140-31, 3141-15, 3141-35 y 3142-12.

[0141] Se llevó a cabo una PCR mediante la utilización de los cebadores 3078 y 3148 (5'-gtgtgcgacagtgcgcgtcc; SEQ ID NO: 41) para amplificar entre la región flanqueadora del promotor de ubc9 y el promotor de cpcl de N. crassa. Mediante la utilización de ADN genómico del transformante 3140-15 como plantilla, una temperatura de recocido de 50 °C y un tiempo de extensión de 2 minutos, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb. Solo se obtendría un producto de PCR si el vector HygR se insertara en el sitio objetivo en el promotor de ubc9. Dicho fragmento de ADN amplificado fue secuenciado en una dirección mediante la utilización del cebador 3078 como cebador de secuenciación. El análisis de secuencias confirmó que el ADN de pLH937 fue insertado en el sitio objetivo de Cas9 en el promotor de ubc9. En resumen, con el análisis mediante PCR se comprobó que 15 de los 25 transformantes que se muestran en la tabla 12 tenían ADN de pLH937 insertado en la región promotora de ubc9. Los demás transformantes supuestamente también tenían ADN de pLH937 insertado en la región promotora de ubc9 pero, puesto que el alcance o la disposición del ADN de pLH937 insertado era desconocido, esto no pudo comprobarse mediante PCR.

[0142] Los transformantes y la cepa madre fueron cultivados durante 4 días a 28 °C por triplicado en placas microtituladoras de liberación lenta de 24 pocillos con la incorporación de un 20 % de lactosa en la placa (WO2014047520A1) y que utilizan medio definido de Trichoderma con un 2,5 % de glucosa/soforosa (EP1545217B1) como medio líquido. La actividad de fitasa fue medida en los sobrenadantes mediante la utilización de pNPP como sustrato (US2015/0030717). El ensayo fue ejecutado como un ensayo de valoración y se leyó la absorbancia a 405 nm. La absorbancia media de los cultivos por triplicado de cada cepa se muestra en la tabla 10 con la desviación estándar asociada.

Tabla 10: Actividad de fitasa de los transformantes de Trichoderma reesei

Claims

REIVINDICACIONES

1. Célula fúngica filamentosa modificada que presenta una producción aumentada de una proteína de interés, donde dicha célula fúngica ha sido modificada mediante modificación genética del gen ubc9 para reducir la producción y/o actividad de la proteína Ubc9, de modo que da lugar a sumoilación alterada.

2. Célula fúngica modificada de acuerdo con la reivindicación 1, donde la producción aumentada de la proteína de interés es al menos de ^1,1en comparación con la producción de dicha proteína por la célula parental que carece de la reducción en la producción y/o actividad de la proteína Ubc9.

3. Célula fúngica modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, donde la modificación genética es una modificación de una secuencia reguladora de expresión o la secuencia codificante del gen ubc9.

4. Célula fúngica modificada de acuerdo con la reivindicación 3, donde la modificación genética reduce la producción de la proteína Ubc9.

5. Célula fúngica modificada de acuerdo con la reivindicación 4, donde la modificación genética altera la secuencia promotora del gen ubc9.

⁶. Célula fúngica modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el gen ubc9 presenta un homólogo de tipo salvaje que presenta al menos un 50 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.

7. Célula fúngica modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el gen ubc9 presenta un homólogo de tipo salvaje que codifica una proteína ubc9 que comprende una secuencia con al menos un 75 % de identidad de secuencia con uno o más de los siguientes motivos de secuencia:

RLQEERKQWRKDHPFGF (SEQ ID NO: 42) y

KPPKCKFTPPLFHPNVYPSGTVCLSIL (SEQ ID NO: 43).

⁸. Célula fúngica modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la célula es del género seleccionado de entre el grupo que consiste en Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Corynascus, Cryptococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Trichoderma, Talaromyces y Rasamsonia.

9. Célula fúngica modificada de acuerdo con la reivindicación ⁸, donde la célula es una célula de Myceliophthora thermophila.

10. Célula fúngica modificada de acuerdo con la reivindicación ⁸, donde la célula es una célula de Trichoderma reesei o Aspergillus niger.

11. Célula fúngica modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la célula también comprende un constructo de expresión exógena que codifica la proteína de interés.

12. Célula modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la proteína de interés es una acetilesterasa, aminopeptidasa, amilasa, arabinasa, arabinofuranosidasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, epimerasa, esterasa, a-galactosidasa, p-galactosidasa, a-glucanasa, glucano liasa, endo-p-glucanasa, glucoamilasa, glucosa oxidasa, a-glucosidasa, p-glucosidasa, glucuronidasa, hemicelulasa, hexosa oxidasa, hidrolasa, invertasa, isomerasa, lacasa, lipasa, liasa, mananasa, manosidasa, oxidasa, oxidorreductasa, pectato liasa, pectina acetilesterasa, pectina depolimerasa, pectina metilesterasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fenoloxidasa, fitasa, poligalacturonasa, proteasa, ramno-galacturonasa, ribonucleasa, taumatina, transferasa, proteína de transporte, transglutaminasa, xilanasa, p-xilosidasa hexosa oxidasa, hormona peptídica, factor de crecimiento, factor de coagulación, quimiocina, citocina, linfocina, anticuerpo, receptor, molécula de adhesión o antígeno microbiano.

13. Proceso para la producción de una proteína de interés, donde dicho proceso comprende la etapa de cultivar la célula fúngica modificada de cualquiera de las reivindicaciones ^1-12en condiciones efectivas para producir la proteína.