ES2856451T3

ES2856451T3 - Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2856451T3
Application number: ES16200832T
Authority: ES
Inventors: Roman Kischel; Tobias Raum; Bernd Schlereth; Doris Rau; Ronny Brünsch; Peter Kufer
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2005-10-11
Filing date: 2006-10-10
Publication date: 2021-09-27
Anticipated expiration: 2026-10-10
Also published as: AU2006301492A1; US8236308B2; JP5686953B2; EP3178850B1; US20250064927A1; EP3178850A1; US20090252683A1; WO2007042261A9; CA2625440A1; EP1940881A2; EP1940881B1; AU2006301492B2; ES2616316T3; JP2009511521A; DK1940881T3; WO2007042261A2; CA2625440C; EP3770174A1; US20190070290A1; US11925684B2

Abstract

Una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente humano, que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende (i) un primer dominio de unión que se une con un CD3 de primate distinto de chimpancé, y (ii) un segundo dominio de unión que se une con un antígeno de superficie celular humano y con el homólogo de primate distinto de chimpancé de dicho antígeno de la superficie celular, que es un antígeno tumoral, en el que dicho primer dominio de unión se une con CD3 épsilon humano y de primate cynomolgus, en el que el CD3 épsilon de cynomolgus comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NOs. 135 o 136 y el CD3 épsilon humano comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO. 134, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOs. 2 o 110, y en el que el primer dominio de unión comprende una región VL que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOs. 4, 148 o 168.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas

La presente invención se refiere a las realizaciones como se definen en las reivindicaciones.

Para comercializarse, cualquier nueva medicación candidata debe pasar por rigurosos ensayos. En general, dichos ensayos pueden subdividirse en fases preclínicas y clínicas: mientras que las últimas - subdivididas adicionalmente en las fases clínicas generalmente conocidas I, II y III - se realiza en pacientes humanos, la primera se realiza en animales. En general, el objetivo de los ensayos preclínicos es demostrar que el candidato farmacológico actúa y es eficaz y seguro. Específicamente, el fin de estos estudios con animales es demostrar que el fármaco no es carcinogénico, mutagénico o teratogénico, así como entender la farmacocinética del fármaco. Solamente cuando la seguridad en animales y la posible eficacia del candidato farmacológico se han establecido en los ensayos preclínicos, este candidato farmacológico se aprobará para ensayos clínicos en seres humanos.

El comportamiento de un candidato farmacológico de tipo molécula pequeña, por ejemplo un nuevo agente antineoplásico basado en antraciclina, en animales, será indicativo en muchos casos del comportamiento esperado de este candidato farmacológico tras su administración a seres humanos. Como resultado, los datos obtenidos de dichos ensayos preclínicos tendrán generalmente por lo tanto un alto valor predictivo para el caso humano. Sin embargo, no se espera dicha compatibilidad con todos los tipos de candidatos farmacológicos; se esperaría que ciertos formatos moleculares se comportaran de un modo en animales y de otro modo en seres humanos. En dichos casos, el potencial predictivo de ensayos preclínicos - y por lo tanto la probabilidad de aprobación del candidato farmacológico para ensayos clínicos - se reduce en gran medida.

Un formato de candidato farmacológico que con frecuencia actúa de forma diferente en animales que en seres humanos es un anticuerpo. En general, los anticuerpos actúan por medio de reconocimiento altamente específico de moléculas diana - habitualmente proteicas -. La mayoría de candidatos farmacológicos anticuerpos son anticuerpos monoclonales; reconocen solamente un único sitio, o epítopo, en su molécula diana. Sin embargo, aunque esta capacidad diferenciadora inherente de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos hace estos compuestos candidatos muy interesantes para el desarrollo de fármacos, también complica su ensayo preclínico. Esto se debe a variaciones dependientes de especies en la secuencia de la molécula diana con la que se unen dichos anticuerpos. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que reconoce específicamente y se une con, por ejemplo, la molécula Y mediante epítopo X en seres humanos, con frecuencia no conseguirá reconocer específicamente y unirse con la molécula correspondiente Y’ en una especie no humana, ya que el epítopo correspondiente X’ puede ser diferente de su homólogo humano X. De este modo, los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, contra antígenos humanos) por diseño tienden a tener reactividad muy limitada con especies filogenéticamente distantes tales como roedores, excepto en los casos muy poco habituales en los que el antígeno está altamente conservado. Incluso entre el grupo de anticuerpos monoclonales con reactividad para antígenos humanos y de primates, existen numerosos ejemplos de anticuerpos que reaccionan solamente con los homólogos de antígeno humanos y del chimpancé. Esto también se ha observado para anticuerpos monoclonales anti-CD3. Uno de los anticuerpos monoclonales más ampliamente usados y mejor caracterizados, específicos para el complejo de CD3, es OKT-3, que reacciona con CD3 de chimpancé, pero no con el homólogo de CD3 de otros primates, tales como macacos, o con CD3 de perro (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). El anticuerpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1 también es reactivo con CD3 de chimpancé pero no con CD3 de macacos (datos propios; véanse los siguientes Ejemplos). Por otro lado, también hay ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de macaco, pero no sus homólogos humanos. Un ejemplo de este grupo es el anticuerpo monoclonal FN-18 dirigido contra CD3 de macacos (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Resulta interesante que se ha descubierto que linfocitos periféricos de alrededor de 12% de monos cynomolgus carecen de reactividad con anticuerpo monoclonal anti-CD3 de mono Rhesus (FN-18) debido a un polimorfismo del antígeno CD3 en macacos. Uda et al. describieron una sustitución de dos aminoácidos en la secuencia de CD3 de monos cynomolgus que no son reactivos con anticuerpos FN-18, en comparación con CD3 derivado de animales que son reactivos con anticuerpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7).

El documento WO2004/106383 describe composiciones farmacéuticas que comprenden constructos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos, en los que un dominio se une al antígeno EpCAM y el segundo dominio se une al antígeno CD3, preferiblemente vía un anticuerpo del grupo II como se describe en Tunacliffe (1989), Int. Immuno. 1, 546-550.

Dificultades similares con alta especificidad de anticuerpos monoclonales en ensayos preclínicos con animales se observaron con anticuerpos biespecíficos, por ejemplo un anticuerpo monocatenario biespecífico recombinante del tipo general descrito en, por ejemplo, la patente US 5.260.203. Esta dificultad añadida se debe al hecho de que un anticuerpo biespecífico, por ejemplo un anticuerpo monocatenario biespecífico, comprende dos dominios de unión distintos, uno de los cuales - o ambos - puede no reconocer el homólogo no humano de su molécula diana humana. En la práctica, el riesgo de que, por ejemplo, un anticuerpo monocatenario biespecífico, no consiga reconocer sus moléculas diana respectivas pretendidas en un animal es dos veces mayor que con un anticuerpo monoespecífico o fragmento del mismo.

Existen varias estrategias conocidas para contrarrestar estos problemas.

Un enfoque conocido es realizar ensayos preclínicos del candidato farmacológico de anticuerpo (biespecífico) o un fragmento del mismo en un modelo de chimpancé. El chimpancé es el pariente genético más cercano al ser humano, idéntico a este último en más del 99% de su genoma, de modo que es muy probable que la variante de chimpancé de una molécula unida específicamente por un candidato farmacológico anticuerpo (biespecífico) o un fragmento del mismo sea idéntica a la variante humana de esta molécula. Por tanto, se minimiza el peligro de la ausencia de reconocimiento de esta molécula por el candidato farmacológico anticuerpo (biespecífico) o el fragmento del mismo en chimpancé. Sin embargo, los ensayos en chimpancé son muy caros y están cargados de problemas éticos. Además, los chimpancés son animales en peligro de extinción, de modo que el número de animales que pueden usarse en experimentación está muy limitado. Para la mayoría de los desarrolladores de sustancias terapéuticas de tipo anticuerpo (biespecífico), dichos ensayos preclínicos en chimpancés están por lo tanto excluidos.

El enfoque anterior se describe, por ejemplo, en Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). En este estudio, la actividad biológica de un candidato farmacológico clínico, anticuerpo monocatenario biespecífico CD19xCD3, se ha ensayado en chimpancé. El anticuerpo CD19xCD3, previamente descrito en el documento WO 99/54440 para administración terapéutica en seres humanos, es un anticuerpo monocatenario biespecífico que se une específicamente con el antígeno de linfocitos B humanos CD19 y el antígeno de linfocitos T humanos CD3. Los autores de este artículo descubrieron que este anticuerpo monocatenario biespecífico se unía a variantes tanto humana como de chimpancé de la molécula CD3 y CD19. Sin embargo, no se pudo encontrar ninguna reactividad de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico con linfocitos B y T de otra especie, es decir, ratón, perro Beagle y primates distintos de chimpancé (cynomolgus, Rhesus y babuino), confirmando de nuevo la extrema sensibilidad de los anticuerpos monoclonales por las especies.

Otro enfoque adapta la molécula usada en el ensayo preclínico al animal usado para este ensayo. De acuerdo con este enfoque, la información de seguridad requerida se obtiene en estudios preclínicos construyendo anticuerpos denominados “sustitutos” para administración a animales de ensayo. En general, dicho anticuerpo sustituto es un anticuerpo que se ha modificado para reconocer específicamente y unirse con el homólogo del animal de ensayo de una molécula diana con la que se une el anticuerpo no sustituto, es decir, el candidato farmacológico real en seres humanos. De este modo, en enfoques que usan dichos anticuerpos “sustitutos”, tienen que desarrollarse e investigarse por separado dos moléculas diferentes: el candidato farmacológico clínico y un candidato para ensayos preclínicos en una especie animal correspondiente a la especificidad diana del candidato clínico. El principal inconveniente de dichos enfoques de sustituto es que el anticuerpo sustituto para ensayos preclínicos se ha modificado con respecto al anticuerpo candidato farmacológico real. Por lo tanto, los datos obtenidos en ensayos preclínicos usando un anticuerpo sustituto no son con frecuencia directamente aplicables al caso humano. Como se ha explicado anteriormente, esta aplicabilidad reducida reduce en última instancia el potencial predictivo de cualquier estudio preclínico que use estos enfoques.

Aunque el enfoque anterior adapta el candidato farmacológico para coincidir con el animal usado para ensayo, otros enfoques conocidos hacen exactamente lo opuesto; de acuerdo con estos otros enfoques conocidos, el animal usado para ensayos se adapta al candidato farmacológico que se pretende administrar a seres humanos.

Un ejemplo de la adaptación del animal de ensayo al candidato farmacológico que se pretende administrar a seres humanos es la creación de un animal transgénico que expresa la molécula humana a la que se une específicamente el anticuerpo (biespecífico) o fragmento del mismo en lugar de la molécula no humana que es endógena de su propia especie. De esta manera, el anticuerpo (biespecífico) o fragmento del mismo administrado en ensayos preclínicos se encontrará y se unirá con el antígeno humano en el animal de ensayo transgénico. Por ejemplo, en un estudio diseñado por Bugelski et al. (Bugelski et al., Hum Exp Toxicol. 19 (2000), 230-243), se ha llevado a cabo la evaluación de seguridad preclínica del anticuerpo monoclonal Keliximab en un ratón transgénico para CD4 humano a fin de mantener el tratamiento crónico de artritis reumatoide en pacientes humanos. Keliximab es un anticuerpo monoclonal con especificidad por CD4 humano y de chimpancé. Los autores concluyen que el uso de ratones transgénicos que expresan proteínas humanas proporciona una alternativa útil a estudios en chimpancés con agentes biofarmacéuticos que tienen especificidad limitada para diferentes especies (Bugelski et al., Hum Exp Toxicol. 19 (2000), 230-243). Sin embargo, la creación de animales transgénicos para fines de ensayo es muy laboriosa y, por lo tanto, cara.

En el mismo sentido, un enfoque alternativo empleado con frecuencia es inyectar a un animal de ensayo no transgénico células humanas que expresan la molécula para unirla específicamente con el anticuerpo (biespecífico) o fragmento del mismo que se ensaye. Sin embargo, aunque evite los costes y el tiempo asociado con construcción de especies animales transgénicas, este enfoque presenta otros problemas. En primer lugar, en enfoques que usan, por ejemplo, ratones inmunocompetentes, el sistema inmunitario del animal de ensayo reconoce con frecuencia células ajenas introducidas en el animal, y éstas se eliminan sistemáticamente. Aunque los ratones inmunodeficientes permiten la inyección y el crecimiento de células no singénicas, por ejemplo en modelos de tumores de xenoinjerto, la aplicabilidad de los datos obtenidos para el candidato farmacológico en dichos estudios está limitada debido a la distancia filogenética entre roedores y seres humanos. Además, las múltiples extracciones sanguíneas son problemáticas en animales inferiores, por ejemplo un ratón. Sin embargo, dichas múltiples extracciones sanguíneas son esenciales para la determinación de parámetros farmacocinéticos y el ensayo continuo de parámetros sanguíneos para evaluar los efectos biológicos de un candidato farmacológico en ensayos preclínicos con animales.

En resumen, hay dos enfoques principales para obtener datos preclínicos sobre seguridad y toxicidad de un candidato farmacológico para administración en seres humanos. Un modo es la aplicación del candidato farmacológico clínico a modelos de animales transgénicos, principalmente modelos de ratón. Sin embargo, los datos preclínicos tienen potencia explicativa limitada debido al hecho de que los roedores están menos relacionados con seres humanos en comparación con los primates. Otro modo es ensayar moléculas sustitutas en una especie animal relevante. Estas moléculas sustitutas son específicas para los animales usados, y por tanto son diferentes del candidato farmacológico clínico desarrollado para administración en seres humanos. El problema es que el candidato farmacológico clínico no puede aplicarse directamente en un animal distinto de chimpancés que está estrechamente relacionado con seres humanos y tiene alto potencial predictivo cuando se usa en ensayos preclínicos. Los métodos existentes para obtener datos preclínicos significativos con respecto a un anticuerpo (biespecífico) o fragmento del mismo que se somete a ensayos como un candidato farmacológico ajustan este anticuerpo al animal de ensayo, en cuyo caso los datos obtenidos son con frecuencia solamente de aplicabilidad limitada para el candidato farmacológico, o, por el contrario, ajustan el animal de ensayo al anticuerpo, en cuyo caso surgen dificultades éticas y/o de coste y, en el peor de los casos, la aplicabilidad de los datos obtenidos para el candidato farmacológico aún puede ser limitada.

Es por lo tanto un objetivo de la invención proporcionar una solución a los problemas perfilados anteriormente.

La solución a estos problemas es la provisión de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos monocatenarios biespecíficos, como se define en la reivindicación 1, que exhiben especificidad entre especies, que se unen a moléculas diana humanas y de primates distintos de chimpancés y, por lo tanto, se pueden usar tanto para la evaluación preclínica de seguridad, actividad y/o perfil farmacocinético de dicho anticuerpo biespecífico en primates y - en la forma idéntica - como fármacos en seres humanos. Por consiguiente, un aspecto de la descripción se refiere al uso de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí, que comprende un primer dominio de unión que se une a un CD3 de primate distinto de chimpancé, y

un segundo dominio de unión que se une a un antígeno de la superficie celular, en el que dicho primer dominio de unión se une a CD3 humano y de primate distinto de chimpancé,

para evaluar la seguridad y/o actividad y/o perfil farmacocinético (in vivo) de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico en seres humanos, que comprende (i) administrar dicho anticuerpo monocatenario biespecífico a un primate distinto de chimpancé, (ii) medir dicha seguridad y/o actividad y/o perfil farmacocinético (in vivo) de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico en dicho primate distinto de chimpancé, y (iii) evaluar la seguridad y/o actividad y/o el perfil farmacocinético (in vivo) de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico en seres humanos.

Se describe aquí un método para evaluar la actividad biológica/seguridad/toxicidad de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se describe anteriormente, que comprende

(i) administrar dicho anticuerpo monocatenario biespecífico a un primate distinto de chimpancé,

(ii) medir la seguridad y/o actividad y/o perfil farmacocinético in vivo de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico en dicho primate distinto de chimpancé,

(iii) evaluar la seguridad y/o actividad y/o perfil farmacocinético in vivo de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico en el primate distinto de chimpancé, y

(iv) determinar una dosis eficaz y no toxica de dicho anticuerpo monocatenario biespecífico, y administrar dicha dosis a seres humanos.

En particular, es un objetivo de la invención proporcionar medios y métodos que mejoren el valor predictivo de datos obtenidos en ensayos preclínicos con animales para la administración del candidato farmacológico a seres humanos.

Como se usa aquí, un “anticuerpo monocatenario biespecífico” denota una única cadena polipeptídica que comprende dos dominios de unión. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (“región VH”), en la que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente con dicha primera molécula, es decir, la molécula de CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente con un antígeno de superficie celular, como se define con más detalle posteriormente. Los dos dominios de unión se unen opcionalmente entre sí por un espaciador polipeptídico corto que comprende en general alrededor de 5 aminoácidos. Cada dominio de unión puede comprender adicionalmente una región variable de una cadena ligera de anticuerpo (“región VL”), estando enlazadas entre sí la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo vía un enlazador polipeptídico, por ejemplo del tipo descrito y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso suficientemente largo para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se emparejen entre sí de modo que, juntas, sean capaces de unirse específicamente con las moléculas respectivas primera y segunda.

Como se usa aquí, la expresión “se une”, o expresiones relacionadas tales como “uniéndose” o “reactividad con/a”, etc., se refieren a capacidad de los dominios de unión primero y/o segundo del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí para discriminar entre la primera y/o segunda molécula respectiva en tal grado que, a partir de un grupo de una pluralidad de moléculas diferentes como parejas de unión potenciales, solamente se unan, o se unan significativamente, dichas primera y/o segunda moléculas respectivas. Dichas medidas de unión pueden realizarse rutinariamente, por ejemplo en un aparato Biacore.

Más específicamente, el primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí se une con CD3 humano y con CD3 de primate distinto de chimpancé. La expresión “primate distinto de chimpancé” se explica con más detalle posteriormente. Como resultará evidente para el experto en la técnica, no se excluye del alcance de la invención que el primer dominio de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies como se define aquí también pueda unirse, por ejemplo, con CD3 de chimpancé. Por otro lado, resulta evidente que los dominios de unión que solamente se unen con CD3 humano, pero no con CD3 de primate distinto de chimpancé, se excluyen del alcance de la invención. Esto se aplica cambiando lo que deba cambiarse a dominios de unión que solamente se unan con CD3 de primate distinto de chimpancé, pero no con CD3 humano, tales como, por ejemplo, los del anticuerpo monoclonal FN-18.

El segundo dominio de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define aquí se une con un antígeno de superficie celular, preferiblemente un antígeno tumoral, como se expone posteriormente. Preferiblemente, ambas moléculas de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define aquí se unen con sus moléculas diana humanas y de primate distinto de chimpancé respectivas. El segundo dominio de unión, de este modo, se une con un antígeno de superficie celular humano y con el homólogo correspondiente del antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé. La identificación y determinación de homólogos de antígenos de superficie celular humanos en primates distintos de chimpancé se conocen bien por los expertos en la técnica, y puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante alineamientos de secuencia.

La expresión “especificidad para diferentes especies” o “especificidad entre especies”, como se usa aquí, significa unión de al menos uno de los dos dominios de unión, preferiblemente de ambos dominios de unión, del anticuerpo monocatenario biespecífico descrito aquí con la misma molécula diana en seres humanos y primates distintos de chimpancé. De este modo, la “especificidad para diferentes especies” o “especificidad entre especies” debe entenderse como una reactividad entre especies a la misma molécula X, pero no a una molécula distinta de X. La especificidad para diferentes especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo CD3 humano, para un CD3 de primate distinto de chimpancé, por ejemplo CD3 de macaco, puede determinarse, por ejemplo, por análisis de FACS. El análisis de FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se ensaye con respecto a la unión con células humanas y de primates distintos de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos CD3 humanos y de primates distintos de chimpancé, respectivamente. En los siguientes ejemplos se muestra un ensayo apropiado. Para la generación del primer dominio de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define aquí, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales que se unen con CD3 tanto humano como distinto de chimpancé (por ejemplo, CD3 de macaco). De forma similar, para la generación del segundo dominio de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define aquí, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen con ambos de los antígenos de superficie celular humanos y de primates distintos de chimpancé respectivos. Los dominios de unión apropiados para los anticuerpos monoclonales biespecíficos como se define aquí pueden derivarse de anticuerpos monoclonales específicos para diferentes especies por métodos recombinantes descritos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal que se une con un antígeno de superficie celular humano y con el homólogo de dicho antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé puede evaluarse mediante ensayos de FACS como se ha expuesto anteriormente. Resulta evidente para los expertos en la técnica que también pueden generarse anticuerpos monoclonales específicos para diferentes especies por técnicas de hibridoma descritas en la bibliografía (Milstein y Kohler, Nature 256 (1975), 495-7). Por ejemplo, los ratones pueden inmunizarse alternativamente con CD3 humano y de primate distinto de chimpancé. De estos ratones, se aíslan células de hibridoma productoras de anticuerpos específicos para diferentes especies mediante tecnología de hibridoma, y se analizan mediante FACS como se ha expuesto anteriormente. En los siguientes ejemplos se muestra la generación y análisis de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies como se describe aquí. Las ventajas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies incluyen los puntos enumerados posteriormente.

Como se usa aquí, “ser humano” y “hombre” se refiere a la especie Homo sapiens. Una molécula “humana” es por lo tanto la variante de esa molécula como se expresa de forma natural en Homo sapiens. En lo que se refiere a los usos médicos de los constructos descritos aquí, los pacientes humanos deben tratarse con los mismos.

Como se usa aquí, un “primate distinto de chimpancé” o “primate no chimpancé”, o variantes gramaticales del mismo, se refiere a cualquier primate distinto de chimpancé, es decir, distinto de un animal que pertenece al género Pan, y que incluye las especies Pan paniscus y Pan troglodytes, también conocidos como Anthropopithecus troglodytes o Simia satyrus. Un “primate”, “especie de primate”, “primates”, o variantes gramaticales de los mismos, denotan un orden de mamíferos euterios divididos en los dos subórdenes de prosimios y antropoides, y que comprenden al hombre, simios, monos y lémures. Específicamente, “primates”, como se usa aquí, comprende el suborden Strepsirrhini (prosimios no tarseros), que incluye el infraorden Lemuriformes (que incluye por su parte las superfamilias Cheirogaleoidea y Lemuroidea), el infraorden Chiromyiformes (que incluye por su parte la familia Daubentoniidae), y el infraorden Lorisiformes (que incluye por su parte las familias Lorisidae y Galagidae). “Primates”, como se usa aquí, también comprende el suborden Haplorrhini, que incluye el infraorden Tarsiiformes (que incluye por su parte la familia Tarsiidae), el infraorden Simiiformes (que incluyen por su parte los Platyrrhini, o monos del Nuevo Mundo, y los Catarrhini, que incluye los Cercopithecidea, o Monos del Viejo Mundo).

Puede entenderse, dentro del significado de la invención, que la especie de primate distinto de chimpancé es un lémur, un tarsero, un gibón, un tití (que pertenece a los Monos del Nuevo Mundo de la familia Cebidae) o un Mono del Viejo Mundo (que pertenece a la superfamilia Cercopithecoidea).

Como se usa aquí, un “Mono del Viejo Mundo” comprende cualquier mono dentro de la superfamilia Cercopithecoidea, subdividida a su vez en las familias: Cercopithecinae, que son principalmente africanos, pero incluyen el género diverso de macacos que son asiáticos y norteafricanos; y Colobinae, que incluye la mayoría de los géneros asiáticos, pero también los monos colobos africanos.

Específicamente, dentro de la subfamilia Cercopithecinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser de la tribu Cercopithecini, dentro del género Allenopithecus (Mono de Allen, Allenopithecus nigroviridis) ; dentro del género Miopithecus (Talapoin Sureño, Miopithecus talapoin; Talapoin Norteño, Miopithecus ogouensis); dentro del género Erythrocebus (Mono Patas, Erythrocebus patas); dentro del género Chlorocebus (Mono Verde, Chlorocebus sabaceus; Cercopiteco Verde, Chlorocebus aethiops; Cercopiteco de las Montañas Bale, Chlorocebus djamdjamensis; Cercopiteco Tántalo, Chlorocebus tantalus; Cercopiteco Verde, Chlorocebus pygerythrus; Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); o dentro del género Cercopithecus (Mono Dryas o Ntolu, Cercopithecus dryas; Cercopiteco Diana, Cercopithecus diana; Cercopiteco de Roloway, Cercopithecus roloway; Cercopiteco de Nariz Blanca, Cercopithecus nictitans; Mono Azul, Cercopithecus mitis; Mono de Plata, Cercopithecus doggetti; Mono Dorado, Cercopithecus kandti; Cercopiteco de Cuello Blanco, Cercopithecus albogularis; Cercopiteco Mona, Cercopithecus mona; Mona de Campbell, Cercopithecus campbelli; Cercopiteco de Lowe, Cercopithecus lowei; Cercopiteco Coronado de Grey, Cercopithecus pogonias; Cercopiteco de Wolf, Cercopithecus wolfi; Cercopiteco de Dent, Cercopithecus denti; Cercopiteco Menor, Cercopithecus petaurista; Cercopiteco de Garganta Blanca, Cercopithecus erythrogaster; Cercopiteco de Sclater, Cercopithecus sclateri; Cercopiteco de Orejas Rojas, Cercopithecus erythrotis; Cercopiteco de Hocico Azul, Cercopithecus cephus; Cercopiteco de Cola Roja, Cercopithecus ascanius; Cercopiteco de L’Hoest, Cercopithecus lhoesti; Cercopiteco de Preuss, Cercopithecus preussi; Cercopiteco de Gabón, Cercopithecus solatus; Cercopiteco de Cara de Búho, Cercopithecus hamlyni; Cercopiteco de Brazza, Cercopithecus neglectus).

Como alternativa, un primate distinto de chimpancé ventajoso, también dentro de la subfamilia Cercopithecinae, pero dentro de la tribu Papionini, puede estar dentro del género Macaca (Macaco de Gibraltar, Macaca sylvanus; Macaco de Cola de León, Macaca silenus; Macaco Cola de Cerdo Sureño o Beruk, Macaca nemestrina; Macaco Cola de Cerdo Norteño, Macaca leonina; Macaco de Pagai o Bokkoi, Macaca pagensis; Macaco de Siberut, Macaca siberu; Macaco Moro, Macaca maura; Macaco Crestado de Célebes, Macaca ochreata; Macaco de Togian, Macaca tonkeana; Macaco de Heck, Macaca hecki; Macaco de Gorontalo, Macaca nigriscens; Macaco Negro Crestado, Macaca nigra; Mono Cynomolgus o Macaco Cangrejero o Kera, Macaca fascicularis; Macaco Rabón, Macaca arctoides; Macaco Rhesus, Macaca mulatta; Macaco de Formosa, Macaca cyclopis; Macaco Japonés, Macaca fuscata; Macaco de Sri Lanka, Macaca sinica; Macaco Coronado, Macaca radiata; Macaco de Gibraltar, Macaca sylvanus; Macaco de Assam, Macaca assamensis; Macaco Tibetano o Macaco de Milne-Edwards, Macaca thibetana; Macaco de Arunachal o Munzala, Macaca munzala); dentro del género Lophocebus (Mangabey de Mejillas Grises, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; Mangabey de Cresta Negra, Lophocebus aterrimus; Mangabey de Opdenbosch, Lophocebus opdenboschi; Kipunyi, Lophocebus kipunji); dentro del género Papio (Hamadríade, Papio hamadryas; Papión de Guinea, Papio papio; Papión Oliva, Papio anubis; Papión Amarillo, Papio cynocephalus; Papión Chacma, Papio ursinus); dentro del género Theropithecus (Gelada, Theropithecus gelada); dentro del género Cercocebus (Mangabey Gris, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; Mangabey Gris, Cercocebus torquatus; Mangabey Ágil, Cercocebus agilis; Mangabey de Vientre Dorado, Cercocebus chrysogaster; Mangabey del Río Tana, Cercocebus galeritus; Mangabey del Río Sanje, Cercocebus sanjei); o dentro del género Mandrillus (Mandril, Mandrillus sphinx; Drill, Mandrillus leucophaeus).

Son muy preferidos Macaca fascicularis (también conocido como mono cynomolgus y, por lo tanto, en los ejemplos denominado “Cynomolgus”) y Macaca mulatta (mono rhesus, denominado “rhesus”).

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser del grupo africano, dentro del género Colobus (Colobo Negro, Colobus satanas; Colobo Angoleño, Colobus angolensis; Colobo Rey, Colobus polykomos; Colobo Ursino, Colobus vellerosus; Guereza Abisinio, Colobus guereza); dentro del género Piliocolobus (Colobo Rojo Occidental, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; Colobo de Pennant, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; Colobo Rojo de Preuss, Piliocolobus preussi; Colobo Rojo de Thollon, Piliocolobus tholloni; Colobo Rojo Centroafricano, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; Colobo Rojo Ugandés, Piliocolobus tephrosceles; Colobo Rojo de Udzungwa, Piliocolobus gordonorum; Colobo Rojo de Zanzíbar, Piliocolobus kirkii; Colobo Rojo del Río Tana, Piliocolobus rufomitratus); o dentro del género Procolobus (Colobo Oliva, Procolobus verus).

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser como alternativa del grupo de Langur (mono de hoja), dentro del género Semnopithecus (Langur Gris de Nepal, Semnopithecus schistaceus; Langur Gris de Cachemira, Semnopithecus ajax; Langur Gris de Tarai, Semnopithecus hector; Langur Gris de las Planicies del Norte, Semnopithecus entellus; Langur Gris de Pies Negros, Semnopithecus hypoleucos; Langur Gris de las Planicies del Sur, Semnopithecus dussumieri; Langur Gris Moñudo, Semnopithecus priam); dentro del grupo de T.

vetuluso el género Trachypithecus (Langur de Cara Púrpura, Trachypithecus vetulus; Langur de Nilgiri, Trachypithecus johnii); dentro del grupo de T. cristatus del género Trachypithecus (Langur de Java, Trachypithecus auratus; Langur Plateado, Trachypithecus cristatus; Langur de Indochina, Trachypithecus germaini; Langur de Tenasserim, Trachypithecus barbei); dentro del grupo de T. obscurus del género Trachypithecus (Langur Oscuro o Langur de Anteojos, Trachypithecus obscurus; Langur de Phayre, Trachypithecus phayrei); dentro del grupo de T. pileatus del género Trachypithecus (Langur Cappuccino, Trachypithecus pileatus; Langur de Shortridge, Trachypithecus shortridgei; Langur Dorado, Trachypithecus geei); dentro del grupo de T. francoisidel género Trachypithecus (Langur de Francois, Trachypithecus francoisi; Langur de Hatinh, Trachypithecus hatinhensis; Langur de Cabeza Blanca, Trachypithecus poliocephalus; Langur Laosiano, Trachypithecus laotum; Langur de Delacour, Trachypithecus delacouri; Langur Negro de Indochina, Trachypithecus ebenus); o dentro del género Presbytis (Surili de Sumatra, Presbytis melalophos; Surili de Bandas, Presbytis femoralis; Surili de Sarawak, Presbytis chrysomelas; Surili de Muslos Blancos, Presbytis siamensis; Surili de Frente Blanca, Presbytis frontata; Surili de Java, Presbytis comata; Langur de Thomas, Presbytis thomasi; Langur de Hose, Presbytis hosei; Langur Marrón, Presbytis rubicunda; Langur Colilargo o Langur de Mentawai, Presbytis potenziani; Surili de la Isla Natuna, Presbytis natunae).

Dentro de la familia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser como alternativa del grupo de Nariz Rara dentro del género Pygathrix (Douc de Canillas Rojas, Pygathrix nemaeus; Douc de Canillas Negras, Pygathrixnigripes; Douc de Patas Grises, Pygathrixcinerea); dentro del género Rhinopithecus (Langur Chato Dorado, Rhinopithecus roxellana; Langur Negro de Nariz Chata, Rhinopithecus bieti; Langur Gris de Nariz Chata, Rhinopithecus brelichi; Langur de Nariz Chata de Tonkin, Rhinopithecus avunculus); dentro del género Nasalis (Mono Narigudo, Nasalis larvatus); o dentro del género Simias (Langur de Cola de Cerdo, Simias concolor).

Como se usa aquí, el término “tití” significa cualquier Mono del Nuevo Mundo del género Callithrix, por ejemplo que pertenezca a los titís del Atlántico del subgénero Callithrix (Tití Común, Callithrix (Callithrix) jacchus; Tití de Pincel Negro, Callithrix (Callithrix) penicillata; Tití de Orejas Negras, Callithrix (Callithrix) kuhlii; Tití de Cabeza Blanca, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; Tití de Cabeza Amarilla Callithrix (Callithrix) flaviceps; Tití de Orejas Blancas, Callithrix (Callithrix) aurita); que pertenecen a los titís amazónicos del subgénero Mico (Tití del Río Acari, Callithrix (Mico) acariensis; Tití de Manicoré, Callithrix (Mico) manicorensis; Tití Plateado, Callithrix (Mico) argentata; Tití Blanco, Callithrix (Mico) leucippe; Tití de Snethlage, Callithrix (Mico) emiliae; Tití de Cabeza Negra, Callithrix (Mico) nigriceps; Tití de Marca, Callithrix (Mico) marcai; Tití de Cola Negra, Callithrix (Mico) melanura; Tití Oreja de Santarem, Callithrix (Mico) humeralifera; Tití de Maues, Callithrix (Mico) mauesi; Tití Dorado y Blanco, Callithrix (Mico) chrysoleuca; Tití de Aripuana, Callithrix (Mico) intermedia; Tití de Sateré, Callithrix (Mico) saterei); Tití Enano de Roosmalens que pertenece al subgénero Callibella (Callithrix(Callibella) humilis); o el Tití Pigmeo que pertenece al subgénero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

Como se usa aquí, CD3 denota una molécula expresada como parte del receptor de linfocitos T, y tiene el significado que se le atribuye típicamente en la técnica anterior. En seres humanos, abarca en forma individual o combinada de forma independiente todas las subunidades de CD3 conocidas, por ejemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gamma, CD3 zeta, CD3 alfa y CD3 beta. Los antígenos CD3 de primates distintos de chimpancé como se indica aquí son, por ejemplo, CD3 de Macaca fascicularis y CD3 de Macaca mulatta. En Macaca fascicularis, abarca CD3 épsilon FN-18 negativo y CD3 épsilon FN-18 positivo, CD3 gamma y CD3 delta. En Macaca mulatta, abarca CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta. Preferiblemente, dicho CD3 como se usa aquí es CD3 épsilon.

El CD3 épsilon humano está indicado en el n° de acceso GenBank NM_000733, y comprende SEQ ID NO. 134. El CD3 gamma humano está indicado el n° de acceso GenBank NM_000073, y comprende SEQ ID NO. 142. El CD3 delta humano está indicado en el n° de acceso GenBank NM_000732, y comprende SEQ ID NO. 143.

El CD3 épsilon “FN-18 negativo” de Macaca fascicularis (es decir, CD3 épsilon no reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo como se ha expuesto anteriormente) está indicado en el n° de acceso GenBank AB073994, y comprende SEQ ID NO. 136.

El CD3 épsilon “FN-18 positivo” de Macaca fascicularis (es decir, CD3 épsilon reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18) está indicado en el n° de acceso GenBank AB073993, y comprende SEQ ID No . 135. El CD3 gamma de Macaca fascicularis está indicado en el n° de acceso GenBank AB073992, y comprende SEQ ID NO. 144. El CD3 delta de Macaca fascicularis está indicado en el n° de acceso GenBank AB073991, y comprende SEQ ID NO. 145.

Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta respectivos de Macaca mulatta pueden identificarse y aislarse por técnicas recombinantes descritas en la técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición 2001). Esto se aplica cambiando lo que deba cambiarse a los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta de otros primates distintos de chimpancé como se define aquí.

Como se ha indicado anteriormente y como se describe aquí, se pretende que el primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico comprendido en la composición farmacéutica de la invención conduzca a un epítopo de CD3 humano y de primate distinto de chimpancé que comprende la secuencia de aminoácidos “fenilalanina (F) - serina (S) - ácido glutámico (E)”. El experto en la técnica se encuentra fácilmente en una situación en la que puede deducir un epítopo detectado por un anticuerpo/molécula de unión dado y/o (como en la presente invención) un “dominio de unión” dado de un constructo monocatenario por métodos conocidos en la técnica; dichos métodos también se ilustran en los ejemplos adjuntos, y pueden comprender análisis de transferencia Western, cartografiado epitópico o análisis de pepspot, y similares.

El epítopo a detectar mediante dicho primer dominio de unión está preferiblemente en el intervalo de 15 aminoácidos /- 3 aminoácidos. Se prevén (pero sin limitación) 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 aminoácidos en dicho epítopo que comprende el epítopo de tramo “F-S-E”/nuclear “F-S-E”.

Como se muestra en los siguientes Ejemplos, el epítopo nuclear mínimo de CD3 humano y de primate distinto de chimpancé unido por el primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí es un epítopo que comprende los restos de aminoácidos “FSE”. Más específicamente, el epítopo mínimo comprende los restos de aminoácidos “FSEXE” (SEQ ID NOs. 202 y 204), en el que la sustitución de metionina por leucina es una sustitución de aminoácido conservada entre dos restos de aminoácidos neutros, no polares. El epítopo mínimo puede ser parte de un epítopo discontinuo. Como se usa aquí, la expresión “epítopo discontinuo” debe entenderse como al menos dos tramos de secuencias de aminoácidos no adyacentes dentro de una cadena polipeptídica dada, aquí, por ejemplo, CD3 (preferiblemente CD3 épsilon), que están simultáneamente unidos por un anticuerpo. Estos tramos de aminoácidos podrían ser de longitud diferente, y también pueden estar implicados en la interacción de anticuerpo y antígeno. En consecuencia, además del epítopo mínimo (central) como se ha definido anteriormente, el anticuerpo monocatenario biespecífico puede unirse simultáneamente con uno, dos o incluso más epítopos no adyacentes. Este epítopo o estos epítopos no adyacentes en combinación con el epítopo (central) mínimo podría representar el sitio de contacto entre antígeno y anticuerpo. De acuerdo con esta definición, dicha unión simultánea puede ser del polipéptido en forma lineal. Aquí, se puede imaginar que el polipéptido forma un bucle extendido, en una región de la cual las dos secuencias, por ejemplo, están más o menos en paralelo y próximas una a la otra. Los epítopos no adyacentes en la secuencia lineal podrían formar una estructura tridimensional que conduce a una proximidad estrecha de estos epítopos. En este estado se unen simultáneamente con el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí. De acuerdo con esta definición, la unión simultánea de los al menos dos tramos de secuencias del polipéptido indicado anteriormente (incluyendo el epítopo (central) mínimo) también puede tomar la forma de unión de anticuerpo con un epítopo conformacional. Aquí, el polipéptido maduro ya ha formado su conformación terciaria como existe normalmente in vivo. En esta conformación terciaria, la cadena polipeptídica se pliega de tal manera que ponga los al menos dos tramos de secuencias indicados anteriormente en proximidad espacial, por ejemplo en la superficie externa de una región particular de polipéptido maduro, plegado, en la que se reconocen después en virtud de su conformación tridimensional en el contexto de las secuencias polipeptídicas circundantes.

La expresión “antígeno de superficie celular”, como se usa aquí, denota una molécula que se presenta en la superficie de una célula. En la mayoría de los casos, esta molécula se localizará en o sobre la membrana plasmática de la célula de modo que al menos parte de esta molécula permanezca accesible desde fuera de la célula en forma terciaria. Un ejemplo no limitante de una molécula de superficie celular que se localiza en la membrana plasmática es una proteína transmembránica que comprende, en su conformación terciaria, regiones de hidrofilia e hidrofobia. Aquí, al menos una región hidrófoba permite que la molécula de superficie celular se incluya, o se inserte, en la membrana plasmática hidrófoba de la célula, mientras que las regiones hidrófilas se extienden a uno de los lados de la membrana plasmática en el citoplasma y espacio extracelular, respectivamente. Los ejemplos no limitantes de moléculas de superficie celular que se localizan en la membrana plasmática son proteínas que se han modificado en un resto de cisteína para portar un grupo de palmitoílo, proteínas modificadas en un resto de cisteína C terminal para portar un grupo farnesilo, o proteínas que se han modificado en el término C para portar un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (“GPI”). Estos grupos permiten la unión covalente de proteínas con la superficie externa de la membrana plasmática, en la que permanecen accesibles para reconocimiento por moléculas extracelulares tales como anticuerpos.

El “antígeno tumoral”, como se usa aquí, debe entenderse como los antígenos que se presentan en células tumorales. Estos antígenos pueden presentarse en la superficie celular con una parte extracelular que se combina con frecuencia con una parte transmembránica y citoplasmática de la molécula. Estos antígenos pueden en ocasiones presentarse solamente por células tumorales y nunca por las normales. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente en células tumorales, o podrían representar una mutación específica de tumor en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor. Más habituales son antígenos que se presentan por células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumor. Estos antígenos asociados a tumor pueden sobreexpresarse en comparación con células normales, o son accesibles para unión a anticuerpo en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral en comparación con tejido normal. Los ejemplos no limitantes de antígenos tumorales como se usa aquí son EpCAM (Naundorf, Int. J. Cancer 100/1 (2002), 101-110), EGFR (Liu, Br. J. Cancer 82/12 (2000), 1991 -1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78), EGFRvIII (Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78), o Carboanhidrasa IX (MN/CA IX) (Uemura, Br. J. Cancer 81/4 (1999), 741-746; Longcaster, Cancer Res. 61/17 (2001), 6394-6399; Chia, J. Clin. Oncol. 19/16 (2001), 3660-3668; Beasley, Cancer Res. 61/13 (2001), 5262-5267).

Las secuencias correspondientes de las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos humanas y de primate distinto de chimpancé pueden encontrarse, por ejemplo, en bases de datos de NCBI.

Un anticuerpo monoclonal específico para diferentes especies que se une con un antígeno de superficie celular humano (preferiblemente un antígeno tumoral) y con el homólogo de dicho antígeno de superficie celular (preferiblemente un antígeno tumoral) en un primate distinto de chimpancé puede generarse como se ha expuesto anteriormente. “Homólogos”, como se usa aquí, se refiere a genes (que codifican, por ejemplo, CD3, CD3 épsilon, antígenos de superficie celular, o antígenos tumorales) que codifican productos génicos con función biológica similar o idéntica en diferentes especies, y cuyos genes pueden atribuirse a un gen precursor común. La especificidad para diferentes especies de dicho anticuerpo monoclonal para el antígeno tumoral humano y de primate distinto de chimpancé puede evaluarse mediante ensayos de FACS como se ha expuesto anteriormente. Como alternativa, puede usarse inmunohistoquímica, radioinmunoensayo, o ensayos ELISA como conocen los expertos en la técnica. El segundo dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies como se describe aquí puede derivar, por ejemplo, de dichos anticuerpos monoclonales específicos para diferentes especies mediante técnicas recombinantes descritas en los siguientes ejemplos.

La expresión “evaluar la seguridad y/o actividad y/o perfil farmacocinético in vivo" del anticuerpo monocatenario biespecífico como se usa aquí puede entenderse como se expone posteriormente. Antes de poder comercializar un nuevo medicamento candidato, éste debe pasar por ensayos rigurosos, que pueden subdividirse aproximadamente en ensayos preclínicos en animales y fases clínicas en pacientes humanos. El objetivo del ensayo preclínico en animales es demostrar que el candidato farmacológico es seguro y eficaz (véase, por ejemplo, Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997).

El término “fármaco”, “candidato farmacológico” o “composición farmacéutica”, como se usa aquí, se refiere a anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos aquí.

La actividad biológica del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí puede determinarse, por ejemplo, mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440, o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). “Eficacia” o “eficacia in vivo”, como se usa aquí, se refiere a la respuesta a la terapia por el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí, usando, por ejemplo, criterios de respuesta de NCI normalizados. El éxito o eficacia in vivo de la terapia que usa un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí se refiere a la eficacia del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí para su fin pretendido, es decir, la capacidad del anticuerpo biespecífico para provocar su efecto deseado, es decir, agotamiento de células patológicas, por ejemplo células tumorales. La eficacia in vivo puede monitorizarse por métodos convencionales establecidos para las entidades de enfermedad respectivas incluyendo, pero sin limitación, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros químicos clínicos específicos de la enfermedad y otros métodos convencionales establecidos. Además, puede usarse tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo, para evaluación de respuesta basada en criterios del National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr; 17(4):1244]), exploración por tomografía de emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de medula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos, y diversos parámetros químicos clínicos específicos de linfomas (por ejemplo, lactato deshidrogenasa), y otros métodos convencionales establecidos.

Otro reto importante en el desarrollo de fármacos es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para este fin, se establece un perfil farmacocinético del candidato farmacológico, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular para tratar una afección dada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco para tratar una determinada entidad de enfermedad incluyen, pero sin limitación: vida media, volumen de distribución, metabolismo de primer paso hepático, y grado de unión en suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede estar influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.

“Vida media” significa el tiempo en el que el 50% de un fármaco administrado se elimina mediante procesos biológicos, por ejemplo metabolismo, excreción, etc.

Por “metabolismo de primer paso hepático” se entiende la propensión de un fármaco para metabolizarse tras su primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado.

“Volumen de distribución” significa el grado de retención de un fármaco a lo largo de los diversos compartimentos del cuerpo, como por ejemplo espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc., y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos.

“Grado de unión en suero sanguíneo” significa la propensión de un fármaco a interaccionar con y unirse con proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, que conducen a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retardo (Tlag), Tmax, velocidades de absorción, más comienzo y/o Cmax para una cantidad dada de fármaco administrado.

“Biodisponibilidad” significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo.

“Tiempo de retardo” significa el retardo temporal entre la administración del fármaco y su detección y capacidad de medición en sangre o plasma.

“Tmax” es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco, y “Cmax” es la concentración en la sangre obtenida de forma máxima con un fármaco dado. El tiempo hasta alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco que se requiere para su efecto biológico está influido por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies que pueden determinarse en ensayos preclínicos con animales en primates distintos de chimpancé como se ha perfilado anteriormente también se exponen, por ejemplo, en la publicación de Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12).

El término “toxicidad”, como se usa aquí, se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos secundarios podrían referirse a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos causados por el fármaco.

El término “seguridad”, “seguridad in vivo” o “tolerabilidad”, como se usa aquí, define la administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período más largo de aplicación del fármaco. La “seguridad”, “seguridad in vivo” o “tolerabilidad” puede evaluarse, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las medidas incluyen la evaluación clínica, por ejemplo manifestaciones orgánicas, y exploración de anomalías de laboratorio. Puede llevarse a cabo la evaluación clínica, y registrarse/codificarse la desviación con respecto a hallazgos normales según los patrones de NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación, y similares, como se expone, por ejemplo, en Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden ensayarse incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación, y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, líquido, y similares. De este modo, la seguridad puede evaluarse, por ejemplo, mediante examen físico, técnicas de formación de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos x, barridos mediante CT, formación de imágenes mediante resonancia magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros de laboratorio y registrando acontecimientos adversos. Por ejemplo, los acontecimientos adversos en primates distintos de chimpancé en los usos y métodos según la invención pueden examinarse por métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

La expresión “dosis eficaz y no tóxica”, como se usa aquí, se refiere a una dosis tolerable del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí, que es suficientemente alta para provocar el agotamiento de células patológicas, eliminación de tumores, encogimiento de tumores o estabilización de enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Dichas dosis eficaces y no tóxicas pueden determinarse, por ejemplo, por estudios de aumento de escala de la dosis descritos en la técnica, y deberían estar por debajo de la dosis que induzca acontecimientos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de la dosis, TLD).

También se hace referencia a las expresiones anteriores, por ejemplo en Preclinical safety evaluation of biotechnologyderived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

Se ha descubierto sorprendentemente que es posible generar productos terapéuticos basados en anticuerpos biespecíficos para seres humanos en los que la molécula idéntica también puede usarse en ensayos preclínicos con animales. Esto se debe a la identificación inesperada de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que, además de unirse con antígenos humanos (y debido a la similitud genética probable con homólogos de chimpancé), también se unen con los homólogos de dichos antígenos de primates distintos de chimpancé, tales como macacos. De este modo, desaparece la necesidad de construir un anticuerpo monocatenario biespecífico sustituto para ensayar en una especie filogenética distante (de los seres humanos). Como resultado, puede usarse el mismo anticuerpo monocatenario biespecífico en ensayos preclínicos con animales como se pretende administrar a seres humanos en ensayos clínicos así como tras la aprobación comercial. La capacidad de usar la misma molécula para ensayos preclínicos con animales así como en la administración posterior a seres humanos elimina prácticamente, o al menos reduce en gran medida, el peligro de que los datos obtenidos en ensayos preclínicos con animales no sean aplicables al caso humano. Brevemente, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se administrará realmente a seres humanos hace mucho para asegurar la aplicabilidad de los datos a un escenario relevante para seres humanos. Por el contrario, en enfoques convencionales que usan moléculas sustitutas, dichos anticuerpos sustitutos tienen que adaptarse molecularmente al sistema de ensayo animal usado para la evaluación de la seguridad preclínica. De este modo, el anticuerpo sustituto a usar en terapia humana difiere de hecho en secuencia y también probablemente en estructura del usado en ensayos preclínicos en parámetros farmacocinéticos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en ensayos preclínicos con animales tienen una aplicabilidad/transferibilidad limitada al caso humano. El uso de moléculas sustitutas requiere la construcción, producción, purificación y caracterización de un constructo de anticuerpo completamente nuevo. Esto conduce a costes y tiempo de desarrollo adicionales necesarios para obtener esa molécula. En resumen, tienen que desarrollarse sustitutos por separado además del fármaco real a usar en terapia humana, de modo que deben llevarse a cabo dos líneas de desarrollo para dos moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico. Por lo tanto, una ventaja importante de los constructos basados en anticuerpos biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies descritos aquí es que la molécula idéntica puede usarse para productos terapéuticos en seres humanos y en ensayos preclínicos con animales.

Por otro lado, tampoco es necesario ya adaptar el animal de ensayo al candidato farmacológico de anticuerpo biespecífico que se pretende usar para la administración a seres humanos, tal como, por ejemplo, la creación de animales transgénicos que producen las moléculas humanas a las que se une el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies según los usos y métodos de la invención pueden usarse directamente para ensayos preclínicos en primates distintos de chimpancé, sin ninguna manipulación genética de los animales. Como se conoce bien por los expertos en la técnica, los enfoques en los que el animal de ensayo se adapta al candidato farmacológico siempre conllevan el riesgo de que los resultados obtenidos en el ensayo de seguridad preclínica sean menos representativos y predictivos para seres humanos debido a la modificación del animal. Por ejemplo, en animales transgénicos, las proteínas codificadas por los transgenes están con frecuencia sobreexpresadas. De este modo, los datos obtenidos para la actividad biológica de un anticuerpo contra este antígeno proteico pueden tener valor predictivo limitado para seres humanos en los que la proteína se expresa a niveles mucho menores, más fisiológicos.

Una ventaja adicional de los usos del anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies de la invención está en evitar al chimpancé como una especie para ensayos con animales. Los chimpancés son los parientes más cercanos a los seres humanos, y se agruparon recientemente en la familia de los homínidos basándose en los datos de secuenciación genómica (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Por lo tanto, se considera en general que los datos obtenidos con un chimpancé son altamente predictivos para seres humanos. Sin embargo, debido a su estatus como especie en peligro de extinción, el número de chimpancés que pueden usarse para experimentos médicos está altamente restringido. Como se ha indicado anteriormente, el mantenimiento de chimpancés para ensayos con animales es por lo tanto costoso y éticamente problemático. Los usos del anticuerpo monocatenario biespecífico de la invención evitan tanto la carga financiera como la objeción ética durante los ensayos preclínicos sin perjudicar a la calidad, es decir, la aplicabilidad, de los datos de ensayos con animales obtenidos. A la luz de esto, los usos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies, y los métodos según la invención para ensayos preclínicos en primates distintos de chimpancé, posibilitan una alternativa razonable a los estudios en chimpancés.

Una ventaja adicional del anticuerpo monocatenario biespecífico de la invención es la capacidad de extraer múltiples muestras sanguíneas cuando se usa como parte de ensayos preclínicos con animales, por ejemplo en el transcurso de estudios farmacocinéticos con animales. Pueden obtenerse mucho más fácilmente múltiples extracciones sanguíneas con un primate distinto de chimpancé que con animales inferiores, por ejemplo un ratón. La extracción de múltiples muestras de sangre permite el ensayo continuo de parámetros sanguíneos para la determinación de los efectos biológicos inducidos por el anticuerpo monocatenario biespecífico de la invención. Además, la extracción de múltiples muestras sanguíneas permite al investigador evaluar el perfil farmacocinético del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí. Además, los potenciales efectos secundarios que pueden inducirse por dicho anticuerpo monocatenario biespecífico reflejados en parámetros sanguíneos pueden medirse en diferentes muestras de sangre extraídas durante el transcurso de la administración de dicho anticuerpo. Esto permite la determinación del perfil de toxicidad potencial del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí.

Las ventajas de las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies, usos de dichos anticuerpos biespecíficos, y métodos según la invención pueden resumirse brevemente de la siguiente manera:

En primer lugar, el anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies usado en ensayos preclínicos es el mismo que el usado en terapia humana. De este modo, ya no es necesario desarrollar dos moléculas independientes que pueden diferir en sus propiedades farmacocinéticas y actividad biológica. Esto es altamente ventajoso por cuanto, por ejemplo, los resultados farmacocinéticos son más directamente transferibles y aplicables a la situación humana que, por ejemplo, en enfoques de sustitutos convencionales.

En segundo lugar, los usos del anticuerpo biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies y métodos según la invención para la preparación de productos terapéuticos en ser humano son menos costosos y laboriosos que los enfoques de sustitutos.

En tercer lugar, se evita al chimpancé como especie para ensayos con animales.

En cuarto lugar, pueden extraerse múltiples muestras de sangre para estudios farmacocinéticos extensivos.

Se describe aquí un método para determinar la actividad biológica y/o eficacia de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define anteriormente, en el que dicho anticuerpo monocatenario biespecífico se administra a un primate distinto de chimpancé y se mide la actividad in vivo.

Preferiblemente, dicha actividad in vivo es la activación de linfocitos T, agotamiento de células diana tumorales, citotoxicidad, toxicidad, aparición de efectos secundarios adversos, y/o liberación de citocinas. En el documento WO 99/54440, por ejemplo, se exponen métodos para la determinación de dicha actividad in vivo.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente humano, que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en las reivindicaciones, que comprende

(i) un primer dominio de unión que se une con un CD3 de primate distinto de chimpancé, y

(ii) un segundo dominio de unión que se une con un antígeno de superficie celular,

en el que dicho primer dominio de unión se une con un CD3 humano y de primate distinto de chimpancé.

De acuerdo con la presente invención, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a una composición para administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizadores y/o excipientes. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal, o mediante inyección directa al tejido. En particular, se prevé que dicha composición se administre a un paciente mediante infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición de la presente invención puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien en la técnica ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados, e incluyen disoluciones salinas amortiguadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, liposomas, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse por ejemplo mediante estudios de cambio de escala de la dosis por administración de dosis crecientes del anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies descrito aquí a primates distintos de chimpancé, por ejemplo macacos. Como se ha expuesto anteriormente, el anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies descrito aquí puede usarse ventajosamente en forma idéntica en ensayos preclínicos en primates distintos de chimpancé y como fármaco en seres humanos. Estas composiciones también pueden administrarse en combinación con otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí, o por separado, antes o después de la administración de dicho anticuerpo biespecífico en intervalos y dosis definidos temporalmente. El régimen de dosificación se determinará por el médico a cargo y los factores clínicos. Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el momento y vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se administren simultáneamente. Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo disolución salina y medios amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen recuperadores de líquidos y nutrientes, recuperadores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares. Además, la composición de la presente invención podría comprender vehículos proteicos, como, por ejemplo, albúmina de suero o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano. Se prevé que la composición de la invención podría comprender, además del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Dichos agentes podrían ser fármacos que actúen en el sistema gastrointestinal, fármacos que actúen como citostáticos, fármacos que eviten la hiperuricemia, fármacos que inhiban inmunorreacciones (por ejemplo corticosteroides), fármacos que modulen la respuesta inflamatoria, fármacos que actúen en el sistema circulatorio, y/o agentes tales como citocinas conocidos en la técnica.

Según un aspecto preferido de la composición farmacéutica descrito aquí, el primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí se une con un epítopo de CD3 humano y de primate distinto de chimpancé que comprende la secuencia de aminoácidos “FSE”. El epítopo nuclear mínimo que comprende los restos de aminoácidos “FSE”, el epítopo mínimo que comprende la secuencia de aminoácidos “FSEXE” (SEQ ID NOs. 202 y 204; en la que “X” corresponde a una leucina (L) o a una metionina (M)) o epítopos no adyacentes como se define aquí tienen preferiblemente 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 restos de aminoácidos de longitud. Preferiblemente, dichos epítopos tienen 13 restos de aminoácidos de longitud. Aún más preferiblemente, el epítopo con el motivo “FSEXE” (SEQ ID NOs. 202 y 204, en la que “X” corresponde a una leucina (L) o a una metionina (M)) comprende la secuencia de aminoácidos “EfSELEQSGYYVC” (SEQ ID NO. 195) de CD3 épsilon humano. En Cd 3 épsilon de cynomolgus, el epítopo correspondiente tiene la secuencia “EFSEMEQSGYYVC” (SEQ ID NO. 201). La sustitución de metionina por leucina es una sustitución de aminoácidos conservada entre dos restos de aminoácidos neutros, no polares. La secuencia correspondiente del epítopo preferido “EFSEXEQSGYYVC”, en la que X representa L (leucina) o M (metionina), se representa en SEQ ID NO. 207. Como se muestra en los siguientes Ejemplos, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí no solamente se une con este epítopo, sino también con tramos de aminoácidos no adyacentes a dicho epítopo mínimo. Por ejemplo, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí, además del epítopo nuclear mínimo, puede unirse simultáneamente con un epítopo o epítopos de CD3 épsilon humano contenido en dicha cadena de CD3 épsilon. En consecuencia, dicho epítopo puede comprender adicionalmente la secuencia de aminoácidos “QYPGSEILWQHND” (SEQ ID NO. 203). También pueden detectarse epítopos adicionales (u otros) de CD3 épsilon de cynomolgus contenidos en dicha cadena por la molécula de unión o molécula que comprende los dominios de unión como se define en la misma. Estas secuencias adicionales u otras pueden comprender la secuencia de aminoácidos “QDGNEEMGSITQT” (SEQ ID NO. 199) y “YYVSYPRGSNPED” (SEQ ID NO. 200).

De este modo, el epítopo mínimo es más probablemente parte de un epítopo discontinuo o un epítopo conformacional. Como resulta evidente para un experto en la técnica, el alcance de la presente invención incluye anticuerpos monocatenarios biespecíficos que no solamente se unen con este epítopo (nuclear) mínimo, sino también con uno, dos o incluso más tramos de secuencias de aminoácidos no adyacentes dentro de CD3 (preferiblemente CD3 épsilon). Basándose en los resultados mostrados en los siguientes Ejemplos, se concluye que los anticuerpos específicos para diferentes especies anti-CD3 entran en contacto con CD3 épsilon en el área de los restos de aminoácidos 57-61 de CD3 épsilon tanto de cynomolgus como humano que comprende los tramos de aminoácidos FSEME (SEQ ID NO.

206) y FSELE (SEQ ID NO. 205) de CD3 épsilon de cynomolgus y humano, respectivamente, formando el motivo FSE el núcleo del epítopo. Este resultado - aunque es plausible debido a la accesibilidad del bucle E-F (aminoácidos 56 62) de CD3 épsilon humano (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80) que comprende los aminoácidos FSELE (SEQ ID NO. 205) o FSEME (SEQ ID NO. 206) - es sorprendente, ya que no hay ningún solapamiento de este epítopo de nueva definición con el epítopo conocido de la cadena de CD3 épsilon de anticuerpos anti-CD3 OKT-3 y UCHT-1 (Kjer-Nielsen et al., loc.cit; Arnett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73) que se han considerado hasta la fecha representativos de todos los anticuerpos anti-CD3 que se creía que formaban una única familia con el mismo epítopo o uno muy similar. En resumen, los epítopos “FSE” y “FSEXE” (SEQ ID NO. 204) son distintos de los epítopos reconocidos por UCHT-1 u OKT-3 (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80; Arnett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73), y son únicos para anticuerpos específicos para diferentes especies anti-CD3 que se unen con CD3 humano y de macaco. Preferiblemente, el epítopo mínimo comprende la secuencia de aminoácidos “FSEXE” (SEQ ID NO. 204), en la que X representa L (leucina) o M (metionina), y representa una sustitución de restos de aminoácidos neutros, no polares.

Se prevé que, en la composición farmacéutica de la invención, dicho primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico de la composición farmacéutica de la invención esté situado terminalmente en C con respecto al segundo dominio de unión. Sin embargo, también es parte de la presente invención un constructo biespecífico, en el que el “primer dominio de unión para un CD3 de primate distinto de chimpancé” está situado terminalmente en N con respecto al “segundo dominio de unión para un antígeno de superficie celular” definido aquí.

Como se muestra en los siguientes ejemplos, las ventajas como se han descrito anteriormente aquí son realizables no solamente cuando el primer dominio de unión (que se une a CD3) está situado terminalmente en C con respecto al segundo dominio de unión, es decir, más cerca del término C del anticuerpo monocatenario biespecífico que el segundo dominio de unión, sino también cuando el primer dominio de unión (que se une a CD3) está situado terminalmente en N con respecto al segundo dominio de unión, es decir más cerca del término N del anticuerpo monocatenario biespecífico que el segundo dominio de unión. La disposición de los dominios de unión en el anticuerpo monocatenario biespecífico definido aquí puede por lo tanto ser aquella en la que el primer dominio de unión está situado terminalmente en C con respecto al segundo dominio de unión. La disposición de las cadenas V puede ser VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular)-VL(CD3)-VH(CD3), VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular)-VH(CD3)-VL(CD3), VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular)-VL(CD3)-VH(CD3), o VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular)-VH(CD3)-VL(CD3). Para una disposición, en la que el primer dominio de unión está situado terminalmente en N con respecto al segundo dominio de unión, son posibles los siguientes órdenes: VH(CD3)-VL(CD3)-VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular), VL(CD3)-VH(CD3)-VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular), o VL(CD3)-VH(CD3)-VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular). Como se usa aquí, “terminalmente en N con respecto a” o “terminalmente en C con respecto a”, y sus variantes gramaticales, denotan la localización relativa dentro de la secuencia de aminoácidos primaria en lugar de la colocación en el término N o C absoluto del anticuerpo monocatenario biespecífico. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, un primer dominio de unión que se “sitúa terminalmente en C con respecto al segundo dominio de unión” denota simplemente que el primer dominio de unión se sitúa en el lado carboxilo del segundo dominio de unión dentro del anticuerpo monocatenario biespecífico, y no excluye la posibilidad de que una secuencia adicional, por ejemplo una etiqueta His, u otro compuesto proteico o no proteico tal como un radioisótopo, se sitúe en el término C final del anticuerpo monocatenario biespecífico.

En la composición farmacéutica, el segundo dominio de unión se une con un antígeno de superficie celular y con el homólogo de primate distinto de chimpancé de dicho antígeno de superficie celular.

De acuerdo con esta realización de la invención, tanto el primer como el segundo dominios de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico descrito aquí se unen específicamente con variantes tanto humana como de primate distinto de chimpancé de dichas moléculas primera y segunda, respectivamente. A la luz de las declaraciones anteriores, esto es particularmente ventajoso ya que existe suficiente especificidad (para diferentes especies) en ambos lados del anticuerpo monocatenario biespecífico, asegurando así la compatibilidad entre especies con respecto tanto a la primera como a la segunda molécula, y por lo tanto capacidad de extrapolación óptima de los datos obtenidos en estudios preclínicos con animales al caso de administración en seres humanos.

Preferiblemente, dicho antígeno de superficie celular es un antígeno tumoral. Aún más preferiblemente, dicho antígeno tumoral es EpCAM (Naundorf, Int. J. Cancer 100/1 (2002), 101-110), EGFR (Liu, Br. J. Cancer 82/12 (2000), 1991 1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol.

17/2 (2000), 71-78), EGFRvIII (Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78), o Carboanhidrasa IX (MN/CA IX) (Uemura, Br. J. Cancer 81/4 (1999), 741-746; Longcaster, Cancer Res. 61/17 (2001), 6394-6399; Chia, J. Clin. Oncol.

19/16 (2001), 3660-3668; Beasley, Cancer Res. 61/13 (2001), 5262-5267).

Se prefiere particularmente como antígeno de superficie celular y/o antígeno tumoral EpCAM. Como se muestra en los siguientes Ejemplos, la presente solicitud proporciona por primera vez las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos del dominio extracelular de EpCAM de cynomolgus mostradas en SEQ ID NO. 47 y 48, respectivamente. Dichas secuencias son herramientas esenciales para la generación y caracterización de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se definen aquí que muestran especificidad para diferentes especies para EpCAM humano y de cynomolgus.

En la composición farmacéutica de la invención, el primer dominio de unión comprende una región VH que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOs. 2 o 110.

En la composición farmacéutica, el primer dominio de unión comprende una región VL que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOs. 4, 148 o 168.

La región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 4; o la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 148; o la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 168. O la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 148. O la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110, y la región VL el primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No .

4. O la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 168.

Como se ha expuesto anteriormente, el orden de las regiones variables del primer dominio de unión puede ser VH-VL o VL-VH. Ambas disposiciones están dentro del alcance de la invención. Para un primer dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 2 y la VL de SEQ ID NO. 4, la disposición VH-VL se muestra en SEQ ID NOs. 9 y 10, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NOs. 11 y 12.

Para un primer dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 110 y la VL de SEQ ID NO. 148, la disposición VH-VL se muestra en SEQ ID NOs. 146 y 147. Para un primer dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO.

110 y la VL de SEQ ID NO. 168, la disposición VH-Vl se muestra en SEQ ID Nos. 169 y 170, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NOs. 193 y 194.

De forma similar, el orden de las regiones variables del segundo dominio de unión puede ser VH-VL o VL-VH. Ambas disposiciones están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la disposición VH-VL de un segundo dominio de unión que muestra especificidad para diferentes especies para EpCAM humana y de cynomolgus se muestra en SEQ ID NOs. 53 y 54, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NOs. 55 y 56.

En una realización particularmente preferida de la composición farmacéutica de la invención, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de SEQ ID NOs. 38, 40 o 124; y

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NOs. 37, 39 o 125.

Lo más preferible, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de SEQ ID NOs. 66, 68, 74, 76, 122, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, o 192;

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NOs. 65, 67, 73, 75, 123, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, o 191.

En esta realización anteriormente indicada, tanto el primer como el segundo dominio de unión muestran especificidad para diferentes especies.

El CD3 de primate distinto de chimpancé comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs. 135 o 136.

De acuerdo con una realización adicional de la composición farmacéutica de la invención, al menos uno de dichos primer o segundo dominios de unión es humano, humanizado, y/o con injertos de CDR.

Debe entenderse que la expresión anticuerpo “humano”, como se usa aquí, significa que el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí comprende una secuencia o secuencias de aminoácidos contenidas en el repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana. Para los fines de definición aquí, dicho anticuerpo monocatenario biespecífico puede considerarse por tanto humano si consiste en dicha o dichas secuencias de aminoácidos de línea germinal humana, es decir, si la secuencia o las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monocatenario biespecífico en cuestión son idénticas a una secuencia o secuencias de aminoácidos de línea germinal humana expresadas. Un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí también puede considerarse humano si consiste en una secuencia o secuencias que se desvían de su secuencia o sus secuencias de línea germinal humana más cercanas en no más de lo que se esperaría debido a la impronta de hipermutación somática. Adicionalmente, los anticuerpos de muchos mamíferos no humanos, por ejemplo roedores tales como ratones y ratas, comprenden secuencias de aminoácidos de VH CDR3 que podría esperarse que existieran también en el repertorio de anticuerpos humano expresado. Cualquiera de dichas secuencias de origen humano o no humano que puede esperarse que exista en el repertorio humano expresado también se consideraría “humana” para los fines de la presente invención.

Como se usa aquí, el término “humanizado”, “humanización”, “de tipo humano”, o variantes gramaticalmente relacionadas de los mismos, se usan indistintamente para hacer referencia a un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende en al menos uno de sus dominios de unión al menos una región determinante de la complementariedad (“CDR”) de un anticuerpo no humano o fragmento del mismo. Los enfoques de humanización se describen, por ejemplo, en los documentos WO 91/09968 y US 6.407.213. Como ejemplos no limitantes, el término abarca el caso en el que una región variable de al menos un dominio de unión comprende una única región CDR, por ejemplo la tercera región CDR de la VH, de otro animal no humano, por ejemplo un roedor, así como el caso en el que una o ambas regiones variables comprenden, en cada una de sus primera, segunda y tercera CDR respectivas, las CDR de dicho animal no humano. En el caso de que todas las CDR de un dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico se hayan reemplazado por sus equivalentes correspondientes de, por ejemplo, un roedor, típicamente se habla de “injertos de CDR”, y debe entenderse que esta expresión está abarcada por el término “humanizado” o variantes gramaticalmente relacionadas del mismo como se usa aquí. El término “humanizado”, o variantes gramaticalmente relacionadas del mismo, también abarca casos en los que, además del reemplazo de una o más regiones CDR dentro de una VH y/o VL del primer y/o segundo dominio de unión, se ha/han efectuado una mutación o mutaciones adicionales (por ejemplo, sustituciones) de al menos un resto o restos de aminoácidos individuales dentro de las regiones marco (“FR”) entre las CDR, de modo que los aminoácidos en esa o esas posiciones correspondan al aminoácido o los aminoácidos en esa o esas posiciones en el animal del que derivan las regiones CDR usadas para el reemplazo. Como se conoce en la técnica, dichas mutaciones individuales se realizan con frecuencia en las regiones marco después del injerto de CDR para restaurar la afinidad de unión original del anticuerpo no humano usado como un donante de CDR para su molécula diana. El término “humanizado” puede abarcar además una sustitución o sustituciones de aminoácidos en las regiones CDR de un animal no humano por el aminoácido o aminoácidos de una región CDR correspondiente de un anticuerpo humano, además de las sustituciones de aminoácidos en las regiones marco como se ha descrito anteriormente.

El término “desinmunizado”, “desinmunización”, o variantes gramaticalmente relacionadas de los mismos, denota modificación del primer y/o segundo dominio de unión frente a un constructo de tipo salvaje original haciendo dicho constructo de tipo salvaje no inmunogénico o menos inmunogénico en seres humanos. Los enfoques de desinmunización se muestran, por ejemplo, en los documentos WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 o WO 92/10755. El término “desinmunizado” también se refiere a constructos que muestran propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T. De acuerdo con esta invención, la expresión “propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T” se refiere a la retirada de epítopos de linfocitos T que conduce a activación de linfocitos T específica.

Además, “propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T” significa sustitución de aminoácidos que contribuyen a la formación de epítopos de linfocitos T, es decir, sustitución de aminoácidos que son esenciales para la formación de un epítopo de linfocitos T. En otras palabras, “propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T” se refiere a inmunogenicidad reducida o capacidad reducida para inducir proliferación de linfocitos T independiente de antígeno. La expresión “epítopo de linfocitos T” se refiere a secuencias peptídicas cortas que pueden liberarse durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de células, y posteriormente presentarse por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para desencadenar la activación de linfocitos T; véase, entre otros, el documento W o 02/066514. Para péptidos presentados por MHC de clase II, dicha activación de linfocitos T puede dar lugar entonces a una respuesta de anticuerpos por estimulación directa de linfocitos T para producir dichos anticuerpos. La “propensión reducida para generar epítopos de linfocitos T” y/o “desinmunización” pueden medirse por técnicas conocidas en la técnica. Preferiblemente, la desinmunización de proteínas puede ensayarse in vitro mediante ensayo de proliferación de linfocitos T. En este ensayo, las PBMC de donantes que representan > 80% de los alelos de HLA-DR en el mundo se criban para la proliferación en respuesta a péptidos de tipo salvaje o desinmunizados. Idealmente, la proliferación celular se detecta solamente tras la carga de las células presentadoras de antígenos con péptidos de tipo salvaje. Como alternativa, se puede ensayar la desinmunización expresando tetrámeros de HLA-DR que representan todos los haplotipos. Estos tetrámeros pueden ensayarse con respecto a unión a péptidos, o cargarse con péptidos que sustituyen células presentadoras de antígenos en ensayos de proliferación. Para ensayar si se presentan péptidos desinmunizados en haplotipos de HLA-DR, puede medirse la unión de, por ejemplo, péptidos marcados con fluorescencia en PBMC. Además, la desinmunización puede demostrarse determinando si se han formado anticuerpos contra las moléculas desinmunizadas después de la administración en pacientes. Preferiblemente, se desinmunizan moléculas derivadas de anticuerpos en las regiones marco, y la mayoría de las regiones CDR no se modifican a fin de generar propensión reducida para inducir epítopos de linfocitos T de modo que la afinidad de unión de las regiones CDR no se ve afectada. Incluso la eliminación de un epítopo de linfocitos T da como resultado inmunogenicidad reducida.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define aquí.

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, dicho vector comprende además una secuencia reguladora que está unida operativamente a dicha secuencia de ácido nucleico definida anteriormente. Más preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión.

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un hospedante transformado o transfectado con un vector definido anteriormente.

La invención se refiere a una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente aquí, que comprende además un compuesto proteico capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunitarias.

Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizadores y/o excipientes.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un hospedante como se ha definido anteriormente en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se ha definido anteriormente aquí, y recuperar el anticuerpo monocatenario biespecífico producido a partir del cultivo.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un anticuerpo monocatenario biespecífico como se ha definido anteriormente aquí o como se produce por el procedimiento como se ha definido anteriormente aquí, a una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente aquí, a un vector como se ha definido anteriormente aquí, o a un hospedante como se ha definido anteriormente aquí, para uso en un método para la prevención, el tratamiento o el alivio de una enfermedad proliferativa o enfermedad tumoral.

Aún más preferiblemente, dicha enfermedad tumoral es una enfermedad maligna, preferiblemente cáncer. Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies como se define aquí, con especificidad para EpCAM, EGFR o EGFRvIII, pueden usarse para la terapia de cánceres y tumores epiteliales. Para el tratamiento de tumores con regiones o áreas hipóxicas, pueden usarse constructos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies como se define aquí con especificidad para CAIX. Además, dichos constructos de CAIX pueden usarse para el tratamiento de carcinomas renales o del cuello uterino. En otra realización preferida de los usos o métodos de la invención, dicha composición farmacéutica como se ha definido anteriormente aquí es adecuada para administrarse en combinación con un fármaco adicional, es decir, como parte de una coterapia. En dicha coterapia, un agente activo puede incluirse opcionalmente en la misma composición farmacéutica que el anticuerpo monocatenario biespecífico, o puede incluirse en una composición farmacéutica separada. En este último caso, dicha composición farmacéutica separada es adecuada para administración antes de, simultáneamente con, o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monocatenario biespecífico. El fármaco adicional o la composición farmacéutica pueden ser un compuesto no proteico o un compuesto proteico. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteico, es ventajoso que el compuesto proteico sea capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunitarias.

Preferiblemente, dicho compuesto proteico o compuesto no proteico puede administrarse simultáneamente o no simultáneamente con un anticuerpo monocatenario biespecífico como se ha definido anteriormente aquí, con una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente aquí, con un vector como se ha definido anteriormente aquí, o con un hospedante como se ha definido anteriormente aquí. Preferiblemente, dicho sujeto a tratar es un ser humano.

Se describe aquí un kit que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico como se ha definido anteriormente aquí, una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente aquí, un vector como se ha definido anteriormente aquí, o un hospedante como se ha definido anteriormente aquí.

Estas y otras realizaciones se describen y están abarcadas por la descripción y Ejemplos de la presente invención. Las técnicas recombinantes y métodos en inmunología se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. La bibliografía adicional con respecto a uno cualquiera de los anticuerpos, métodos, usos y compuestos a emplear según la presente invención puede recuperarse de bibliotecas públicas y bases de datos, usando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos pública “Medline”, disponible en internet, por ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.qov/PubMed/medline.html. Los expertos en la técnica conocen bases de datos y direcciones adicionales, tales como http://www.ncbi.nim.nih.qov/, http://www.infobioaen.fr/, http://www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html, http://www.tiqr.orQ/, y también pueden obtenerse usando, por ejemplo, http ://www. lvcos.com.

Las Figuras muestran:

Figura 1: Identificación de anticuerpos específicos para diferentes especies contra CD3 de macaco: La especificidad para diferentes especies de un anticuerpo anti-CD3 mostrado en SEQ ID NO. 162 descrita en el documento WO 99/54440, OKT-3, una Ig que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8, una Ig que comprende SEQ ID NOs.

2 y 4, y UCHT-1 para CD3 de macaco (cynomolgus) se evaluó con citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 1. Una inmunoglobulina (Ig) que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8 y una Ig que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4 muestran especificidad para diferentes especies contra CD3 de macaco. Por el contrario, el anticuerpo anti-CD3 mostrado en SEQ ID NO. 162, OKT-3 y UCHT-1 no consiguen unirse con CD3 de macaco.

Figura 2: Ensayo de FACS para unión de una Ig que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4, una Ig que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8, y anticuerpo monoclonal (mAb) FN-18 con células HPB-ALL y PBMC de Macaca fascicularis (cynomolgus). Las células HPB-ALL expresan el complejo de CD3 humano. Las células teñidas con los anticuerpos respectivos se muestran en comparación con células no teñidas. Se detectó unión a antígeno fuerte en células humanas, así como de cynomolgus para la Ig que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4. Para la Ig que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8, se observó unión fuerte con células humanas pero unión más débil con células de cynomolgus. Para FN-18, se pudo observar unión fuerte con células de cynomolgus, mientras que no pudo detectarse unión con células humanas.

Figura 3: Ensayo de FACS para unión de 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, 5-10LHxSEQ ID NO.16 y 5-10LHxSEQ ID NO.14 con células Kato III humanas que expresan EpCAM o células CHO transfectadas con EpCAM humana y con células HPB-ALL. Se muestran células unidas por los constructos respectivos (representadas como curvas en blanco) en comparación con las células incubadas solamente con los anticuerpos de detección (representadas como curvas en negro). La unión a antígeno de todos los constructos biespecíficos fue claramente detectable para la especificidad anti EpCAM humana, así como para las especificidades anti CD3 en la línea celular HPB-ALL positiva para CD3 humano.

Figura 4: Ensayo de citotoxicidad para 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10 y 5-10LHxSEQ ID NO.14 con células Kato III humanas como células diana y PBMC humanas como células efectoras. Todos los constructos mostraron actividad citotóxica.

Figura 5: Ensayo de citotoxicidad para 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, y 5-10LHxSEQ ID NO.14 con células Kato III como células diana y PBMC de cynomolgus como células efectoras. 5-10LHxSEQ ID NO.14, 5-10LHxSEQ ID NO.12 y 5-10LHxSEQ ID NO.10 mostraron actividad citotóxica. Como control negativo se usó 5-10LHxdi-anti CD3 (anticuerpo anti-CD3 desinmunizado mostrado en SEQ ID NO. 163) que no consigue unirse con CD3 de cynomolgus.

Figura 6: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de la porción extracelular del antígeno EpCAM de cynomolgus (también mostrado en SEQ ID NO. 48) y el antígeno EpCAM humano.

Figura 7: Ensayo de FACS para la detección del antígeno EpCAM de cynomolgus en células CHO transfectadas. Se ensayaron sobrenadantes de tres hibridomas anti EpCAM humana diferentes (M79, 3B10, 2G8) con respecto a la unión. Los transfectantes (representados como curvas en blanco) en comparación con células no transfectadas (representadas como curvas en negro) mostraron unión solamente con el sobrenadante del hibridoma 2G8 que se reconoce por lo tanto como anticuerpo específico para diferentes especies para EpCAM humana y de cynomolgus.

Figura 8: Ensayo de FACS para unión de 2G8LHxSEQ ID NO.12, 2G8LHxSEQ ID NO.10, 2G8LHxSEQ ID NO.16, 2G8LHxSEQ ID NO.14, 2G8HLxSEQ ID NO.12, 2G8HLxSEQ ID NO.10, 2G8HLxSEQ ID NO.16 y 2G8HLxSEQ ID NO.14 en células Kato III (Fig. 8A) o células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus (Fig. 8B) y células HPB-ALL. La unión a antígeno fue claramente detectable para las especificidades anti EpCAM, así como para las especificidades anti CD3. Como control negativo para unión con EpCAM de cynomolgus, se incluyó el constructo 5-10LHxSEQ ID NO.10, que muestra unión con CD3 humano (en células HPB-ALL) pero no muestra unión con EpCAM de cynomolgus (células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus).

Figura 9: Ensayo de citotoxicidad para 2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 con células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus como células diana y PBMC humanas como células efectoras.

2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 mostraron actividad citotóxica. Como control negativo, se incluyó 5-10LHxdi-anti CD3 (anticuerpo anti-CD3 desinmunizado mostrado en SEQ ID NO. 163). 5-10LH no consigue unirse con EpCAM de cynomolgus.

Figura 10: Ensayo de citotoxicidad para 2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 con células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus como células diana y PBMC de cynomolgus como células efectoras.

2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 mostraron actividad citotóxica. Como control negativo, se incluyó 5-10LHxdi-anti CD3 (anticuerpo anti-CD3 desinmunizado mostrado en SEQ ID NO. 163). Este constructo no consigue unirse con CD3 de cynomolgus ni con EpCAM de cynomolgus.

Figura 11: Comparación de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 y segmento VH humano (hu)3-73.

Figura 12: Secuencias de aminoácidos y nucleotídicas de una región VH de tipo humano específica para diferentes especies (también mostrada en SEQ ID NOs. 110 y 111, respectivamente).

Figura 13: Análisis de FACS de un scFv que comprende la cadena VH de tipo humano mostrada en SEQ ID NO.

110 y la cadena VL mostrada en SEQ ID No .148. La secuencia de aminoácidos de scFv completa se muestra en SEQ ID NO. 146. El scFv de control de SEQ ID NO. 10 muestra un claro desplazamiento en células HPB-ALL positivas para CD3 humano, y de este modo se une con CD3 humano. El scFv representado en SEQ ID NO. 146 también muestra unión clara con dichas células humanas positivas para CD3.

Figura 14: Análisis de unión del scFv de SEQ ID NO. 146. El scFv de control de SEQ ID NO. 10 muestra un claro desplazamiento en linfocitos T positivos para CD3 de cynomolgus, y de este modo se une con células positivas para CD3 de cynomolgus. Además, el scFv de SEQ ID NO. 146 muestra una unión clara con células positivas para CD3 de cynomolgus.

Figura 15: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de CD3 épsilon humano y de cynomolgus.

Figura 16: Secuencias de aminoácidos de los péptidos 13meros derivados de CD3 épsilon de cynomolgus (43 puntos peptídicos).

Figura 17: Secuencias de aminoácidos de los péptidos 13meros derivados de CD3 épsilon humano (47 puntos peptídicos).

Figura 18: Pepspots desarrollados por quimioluminiscencia potenciada. (A) Pepspot de control con IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante. (B) Pepspot con anticuerpo I anti-CD3 específico para diferentes especies correspondiente a una inmunoglobulina (Ig) que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4.

Figura 19: Pepspot con anticuerpo II anti-CD3 específico para diferentes especies correspondiente a una inmunoglobulina (Ig) que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8.

Figura 20: Restos de contacto de OKT-3 y UCHT-1 y epítopo de bucle E-F de anticuerpos I y II anti-CD3 específicos para diferentes especies a los que se ha hecho referencia en las Fig. 18 y 19, respectivamente, en CD3 épsilon de cynomolgus y humano.

Figura 21: Comparación de secuencias de aminoácidos del VL murino mostrado en SEQ ID NO. 4 con el segmento lambda 7a de línea germinal humana.

Figura 22: Unión del scFv murino mostrado en SEQ ID NO. 10 y el scFv de tipo humano mostrado en SEQ ID NO.

170 con células HPB-ALL positivas para CD3 humano.

Figura 23: Panel superior: Unión igual del scFv murino mostrado en SEQ ID NO. 10 y el scFv de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 170 con linfocitos T humanos y de cynomolgus en las PBMC. Panel inferior: Cuando se preincuba con 10 mg/ml del anticuerpo IgG murino mAb I descrito en el Ejemplo 1 que tiene la misma especificidad de unión que los scFv (es decir, para CD3 épsilon), los desplazamientos de células teñidas con el scFv murino anteriormente mencionado o el scFv de tipo humano se reducen significativamente, subrayando la región de unión similar de los scFv y el anticuerpo murino original mAb I.

Figura 24: Pepspots desarrollados por el sistema de detección de fosfatasa alcalina. (A) Pepspot de control con IgG de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina. (B) Pepspot con anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies que comprende la VH de tipo humano mostrada en SEQ ID NO. 110 y la VL de tipo humano mostrada en SEQ ID NO. 168 como se describe en el Ejemplo 18.

Figura 25: Ensayo de Transferencia de Punto con el anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies que comprende la VH de tipo humano de SEQ ID NO. 110 y la VL de tipo humano de SEQ ID NO. 168 como se describe en el Ejemplo 19 en (A) y el anticuerpo IgG 1 murino anti-CD3 UCHT1 (B) que se une con los péptidos transferidos “biotina-enlazador-EFSELEQSGYYVC” (1) y “EFSELEQSGYYVC-biotina” (2) derivados de Cd 3 épsilon humano.

Figura 26: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies CAIX HL x SEQ ID NO. 194 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano) PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A549 (positivas para CAIX humano) y CYNOM-K1 (positivas CAIX de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 27: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies CAIX HL x SEQ ID NO. 170 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A549 (positivas para CAIX humano) y 4MBr-5 (positivas para CAIX de macaco), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 28: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies CAIX LH x SEQ ID NO. 170 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A549 (positivas para CAIX humano) y 4MBr-5 (positivas para CAIX de macaco), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 29: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies EGFR HL x SEQ ID NO. 170 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 30: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies EGFR LH x SEQ ID NO. 170 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 31: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies EGFR HL x SEQ ID NO. 194 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 32: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies EGFR LH x SEQ ID NO. 194 con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 33: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies SEQ ID NO. 170 x EGFR HL con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 34: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies SEQ ID NO. 170 x EGFR LH con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 35: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies SEQ ID NO. 194 x EGFR HL con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 36: Análisis de unión de FACS de constructo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies SEQ ID NO. 194 x EGFR LH con células HPB-ALL (positivas para CD3 humano), PBMC de cynomolgus (positivas para CD3 de cynomolgus), A431 (positivas para EGFR humano) y CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus (positivas para EGFR de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 mg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 37: Actividad citotóxica inducida por constructos de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies CAIX y CD3 redirigidos a líneas celulares diana indicadas. Se usaron como células efectoras, respectivamente, linfocitos T positivos para CD8 estimulados de origen humano y de cynomolgus. El ensayo se realizó como se describe en los Ejemplos 24 y 25. En el panel izquierdo de la Figura 37, se ha usado como control positivo un anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio variable reactivo con CAIX y un dominio variable específico de CD3 humano desinmunizado. En el panel derecho, se ha usado como control negativo el mismo constructo.

Figura 38: Actividad citotóxica inducida por el constructo de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies CAIX y CD3 CAIX HL x SEQ ID NO. 194 redirigido a la línea celular diana A549. Se usaron como células efectoras, respectivamente, linfocitos T positivos para CD8 estimulados de origen humano y de cynomolgus. El ensayo se realizó como se describe en los Ejemplos 24 y 25.

Figura 39: Actividad citotóxica inducida por constructos de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies EGFR y CD3 redirigidos a células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus como línea celular diana. Se usaron como células efectoras linfocitos T positivos para CD8 estimulados de origen de cynomolgus. Las medidas mostradas en esta figura se realizaron en un único ensayo. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 24. Como control negativo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio variable reactivo con EGFR y un dominio variable específico de CD3 humano desinmunizado (EGFR LH x di-anti CD3).

Figura 40: Actividad citotóxica inducida por constructos de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies EGFR y CD3 redirigidos a A431 humana como línea celular diana. Se usaron como células efectoras linfocitos T positivos para CD8 estimulados de origen humano. Las medidas mostradas en esta figura se realizaron en un único ensayo. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 24. Como control positivo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio variable reactivo con EGFR y un dominio variable específico de CD3 humano desinmunizado (EGFR LH x di-anti CD3). Como control negativo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico irrelevante.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención:

EJEMPLO 1: Análisis citométrico de flujo de anticuerpos específicos para diferentes especies

Se ensayó la especificidad para diferentes especies de anticuerpos anti-CD3 humano para CD3 de macaco (CD3 de Macaca fascicularis, en lo sucesivo también denominado “Cynomolgus”) por análisis citométrico de flujo. Los anticuerpos ensayados fueron un anticuerpo anti-CD3 como se describe en el documento WO 99/54440 (como se muestra en SEQ ID NO. 162 de la presente solicitud), anticuerpo monoclonal (mAb) OKT-3 (Jansen-Cilag), UCHT-1-PE (BD PharMingen, San Diego, California), una inmunoglobulina (Ig) que comprende las cadenas VH y VL mostradas en SEQ ID NOs. 2 y 4, respectivamente, y una Ig que comprende las cadenas VH y VL mostradas en SEQ ID NOs. 6 y 8, respectivamente. Se tiñeron 2x105 células (líneas de linfocitos T de macaco de Macaca fascicularis y Macaca mulatta, respectivamente, como se proporcionó amablemente por H. Fickenscher, Heidelberg, Alemania) por muestra durante 30 minutos a 4°C en 25 pl de PBS/FCS al 1 %/NaN3 al 0,05% que contenía diluciones de trabajo de anticuerpos monoclonales (como se determinó individualmente por titulación). Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 1 %/NaN3 al 0,05%, y se añadió un anticuerpo secundario cuando fue necesario. Después de la adición del anticuerpo secundario, las células se lavaron de nuevo dos veces en la misma disolución, y se adquirieron 10.000 células vivas. Para recoger y analizar los datos, se usaron un citómetro de flujo FACS Calibur y el software CellQuest de Becton Dickinson. Se excluyeron células no viables usando selección electrónica de dispersión frontal y lateral. Como control negativo, solamente se usaron anticuerpos de control de isotipo o secundarios. Como puede verse en la Fig. 1, solamente la Ig que comprende las cadenas VH y VL mostradas en SEQ ID NOs. 2 y 4, respectivamente, y la Ig que comprende las cadenas VH y VL mostradas en SEQ ID NOs. 6 y 8, respectivamente, mostraron especificidad para diferentes especies para un CD3 de primate distinto de chimpancé, es decir, CD3 de macaco.

EJEMPLO 2: Ensayo de FACS para unión de una Ig que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4, una Ig que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8, y mAb FN18, con células HPB-ALL y PBMC de cynomolgus

La unión de una Ig que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4, una Ig que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8, y mAb FN18 con el antígeno CD3 de cynomolgus en PBMC de cynomolgus y con el antígeno CD3 humano en células HPB-ALL (DSMZ No. ACC 483) se evaluó usando un ensayo de FACS. Para ese fin, se incubaron 2,5x105 células con la Ig conjugada con FITC que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8 y la Ig conjugada con FITC que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4 diluidas 1:25 en 50 pl de PBS con FCS al 2%, respectivamente. La incubación con el anticuerpo mAb FN18 conjugado con FITC (Biosource International) se realizó en 50 pl de anticuerpo no diluido. Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG). Los resultados para el ensayo se muestran en la Fig. 2. Se detectó fuerte unión a antígeno en células humanas así como en células de cynomolgus para la Ig que comprende SEQ ID NOs. 2 y 4. Para la Ig que comprende SEQ ID NOs. 6 y 8, se observó unión fuerte con células humanas, pero unión más débil con células de cynomolgus. Para FN18, se pudo observar unión fuerte con células de cynomolgus, mientras que no se pudo detectar unión con células humanas.

EJEMPLO 3: Determinación de secuencias de las regiones variables de dos anticuerpos anti-CD3 humano que muestran especificidad de especie para primates no humanos

Para la determinación de secuencia de las regiones variables de las Ig anti-CD3 específicas para diferentes especies de los Ejemplos 1 y 2, se usó PCR (desnaturalización a 93°C durante 5 min, hibridación a 58°C durante 1 min, elongación a 72°C durante 1 min para el primer ciclo; desnaturalización a 93°C durante 1 min, hibridación a 58°C durante 1 min, elongación a 72°C durante 1 min durante 30 ciclos; extensión terminal a 72°C durante 5 min) para amplificar las secuencias codificantes de las regiones variables de los anticuerpos. Como se desconoce la secuencia de la región 5’ de las regiones variables, en lugar de un único cebador se usó un conjunto de cebadores de 5’ en combinación con un cebador de 3’ constante, por lo que el cebador de 3’ se escogió según el isotipo del anticuerpo respectivo, y hubo dos conjuntos diferentes de cebadores para la región 5’, uno para la región variable de cadena ligera y el otro para la región variable de cadena pesada. Las combinaciones de cebadores usadas en las reacciones de PCR se proporcionan a continuación.

Región variable de cadena pesada:

cebador de 5’:

5’-SAGGTGCAGCTCGAGGAGTCAGGACCT-3’ (SEQ ID NO. 81)

5’-GAGGTCCAGCTCGAGCAGTCTGGACCT-3’ (SEQ ID NO. 82)

5'-CAGGTCCAACTCGAGCAGCCTGGGGCT-3' (SEQ ID NO. 83)

5'-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGGGCA-3' (SEQ ID NO. 84)

5'-GARGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGA-3' (SEQ ID NO. 85)

5'-GAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGT-3' (SEQ ID NO. 86)

5'-GAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA-3' (SEQ ID NO. 87)

5'-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT-3' (SEQ ID NO. 88)

5'-GGGCTCGAGCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3' (SEQ ID NO. 89)

5'-GGGCTCGAGCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (SEQ ID NO. 90)

5'-GGGCTCGAGCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3' (SEQ ID NO. 91)

cebador de 3':

5'-GAGGAATTCGAACTGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3' (SEQ ID NO. 92)

5'-CGGAATTCGAATGACATGGACATCTGGGTCATCC-3' (SEQ ID NO. 93)

Región variable de cadena ligera:

cebador de 5':

5'-CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT-3' (SEQ ID NO. 94)

5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC-3' (SEQ ID NO. 95)

5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO. 96)

5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO. 97)

5'-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3' (SEQ ID NO. 98)

5'-CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO. 99)

5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO. 100)

5'-GGGGAGCTCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3' (SEQ ID NO. 101)

5'-GGGGAGCTCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3' (SEQ ID NO. 102)

5'-GGGGAGCTCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3' (SEQ ID NO. 103)

5'-GGGGAGCTCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT-3' (SEQ ID NO. 104)

cebador de 3':

5'-GAGGAATTCGAACTGCTCACTGGATGGTGGG-3' (SEQ ID NO. 105)

5'-CGGAATTCGAACAAACTCTTCTCCACAGTGTGACC-3' (SEQ ID NO. 106)

Todos los productos de PCR con una longitud entre 350 y 700 pares de bases se aislaron, se purificaron y se secuenciaron con el cebador de 3' respectivo según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)(2001)).

Las secuencias obtenidas se examinaron con respecto a secuencias codificantes de región variable funcional, y para la cadena pesada y la cadena ligera de cada anticuerpo se obtuvo una secuencia que codifica la región variable. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies se describen en SEQ ID NOs. 1 a 8 en el listado de secuencias incluido en la descripción, respectivamente.

EJEMPLO 4: Clonación de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies anti EpCAM y CD3 humanos

Para generar anticuerpos monocatenarios biespecíficos que comprenden las especificidades para diferentes especies de CD3 anteriormente mencionadas, las regiones variables amplificadas tuvieron que ser modificadas mediante PCR para obtener los fragmentos de anticuerpo Fv monocatenario correspondientes. Para determinar disposiciones adecuadas de las regiones variables de cadena ligera y pesada en el anticuerpo Fv monocatenario, se generaron para cada anticuerpo dos anticuerpos Fv monocatenario diferentes. Para este fin, se usó una PCR de fusión en dos etapas para amplificar la secuencia que codifica las regiones variables. Se diseñó un conjunto de cebadores apropiados para realizar las etapas de clonación basadas en PCR, dando como resultado finalmente un anticuerpo monocatenario que conecta los dos dominios variables con un enlazador de 15 aminoácidos ([Gly4Ser]3) en el orden VH-enlazador-VL y VL-enlazador-VH. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes se describen en SEQ ID NOs. 9 a 12 y en SEQ ID NOs. 13 a 16 del listado de secuencias incluido en la descripción.

En resumen, se usaron las siguientes combinaciones de cebadores:

Para anticuerpo scFv VL-VH mostrado en SEQ ID NOs. 11 y 12: SEQ ID NOs. 17 a 20.

Para anticuerpo scFv VH-VL mostrado en SEQ ID NOs. 9 y 10: SEQ ID NOs. 21 a 24.

Para anticuerpo scFv VL-VH mostrado en SEQ ID NOs. 15 y 16: SEQ ID NOs. 25 a 28.

Para anticuerpo scFv VH-VL mostrado en SEQ ID NOs. 13 y 14: SEQ ID NOs. 29 a 32.

Para generar el anticuerpo monocatenario, se realizaron dos PCR con las combinaciones de cebadores respectivas. Durante esta PCR, se introdujeron secuencias complementarias solapantes en los productos de PCR que surgían de los cebadores de enlazadores respectivos que se combinaban para formar la secuencia codificante del enlazador de 15 aminoácidos durante la PCR de fusión posterior. Los dominios VH y VL amplificados se fusionaron en una siguiente PCR, en la que solamente se requerían los cebadores externos y ambos productos de PCR. El anticuerpo scFv resultante está flanqueado en el extremo 5’ con un enlazador Ser(Gly⁴)Ser pequeño precedido por el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BspEI, y en el extremo 3’ con una etiqueta de afinidad de 6 histidinas seguido de un codón de terminación y del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para SalI. El segundo anticuerpo Fv monocatenario fue una especificidad anti EpCAM humana designada “5-10” que se describe en SEQ ID NO. 33 y 34 del listado de secuencias incluido en la descripción. Para conseguir la fusión de los anticuerpos Fv monocatenario, y para permitir la expresión eucariota, la secuencia codificante de los anticuerpos Fv monocatenario se clonó después mediante BspEI (5’ con respecto al enlazador Ser(Gly⁴)Ser) y SalI en el vector de expresión pEFDHFR (pEFDHFR se describió en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) que contenía la secuencia codificante para el anticuerpo Fv monocatenario específico de EpCAM humana 5-10 y el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BspEI. La secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina murino se describe en SEQ ID NO. 35 y 36 del listado de secuencias incluido en la descripción, precedido de una secuencia consenso de inicio de la traducción de Kozak y el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para EcoRI. Se aislaron clones individuales de los constructos y se secuenciaron con cebadores complementarios de regiones flanqueantes en el vector según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (2001)). Para experimentos adicionales, se seleccionó un clon de cada constructo. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos se describen para 5-10LHxSEQ ID NO.12 en SEQ ID NOs. 37 y 38, para 5-10LHxSEQ ID NO.10 en SEQ ID NOs. 39 y 40, para 5-10LHxSEQ ID NO.16 en SEQ ID NOs. 41 y 42, y para 5-10LHxSEQ ID NOs.14 en SEQ ID NO. 43 y 44 del listado de secuencias incluido en la descripción.

EJEMPLO 5: Expresión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, 5-10LHxSEQ ID NO.16 y 5-10LHxSEQ ID NO.14 en células CHO

Los plásmidos con las secuencias que codifican los anticuerpos monocatenarios biespecíficos se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de MTX de hasta 500 nM. Las células transfectadas se expandieron entonces, y se produjo 1 litro de sobrenadante. El constructo se purificó finalmente del sobrenadante de cultivo como se describe en Kufer et al. Cancer immunity Vol. 1, p. 10 (2001).

EJEMPLO 6: Ensayo de FACS para unión de 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, 5-10LHxSEQ ID NO.16 y 5-10LHxsEq ID NO.14 con células Kato III o células CHO transfectadas con EpCAM humana y con células HPB-ALL

La unión de los constructos bifuncionales con el antígeno de EpCAM en células Kato III humanas que expresan EpCAM (ATCC No. HTB-103) o en células CHO transfectadas con EpCAM humana y con el antígeno CD3 humano en células HPB-ALL se evaluó usando un ensayo de FACS. Para ese fin, se incubaron 2,5x105 células con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular que contenía el constructo. La unión del constructo se detectó con un anticuerpo anti-His (Anticuerpo Penta-His, sin BSA, obtenido de Qiagen GmbH, Hilden, FRG) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa, se usó un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-Ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón, anticuerpo específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (obtenido de Dianova, Hamburgo, FRG). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG). La unión al antígeno fue claramente detectable para la especificidad anti EpCAM humana, así como para las especificidades anti CD3 en la línea celular positiva para CD3 humano (véase la Fig. 3).

EJEMPLO 7: Ensayo de citotoxicidad para 5-10LHxSEQ ID NO. 12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, y 5-10LHxSEQ ID NO.14 con células Kato III como células diana y PBMC humanas como células efectoras

La bioactividad de 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, y 5LH-10xSEQ ID NO.14 se analizó por ensayos de citotoxicidad in vitro basados en FACS usando las células Kato III positivas para EpCAM humana como células diana y PBMC humanas como células efectoras. Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las células diana marcadas se lavaron dos veces con RPMI/FCS al 10%, y se mezclaron con células efectoras recién aisladas a una relación E:T de 10:1. Se añadieron por pocillo 2x104 células diana y 2x105 células efectoras en un volumen de 50 pl de RPMI/FCS al 10% en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se prepararon diluciones en serie décuplas de constructos monocatenarios biespecíficos diferentes en RPMI/FCS al 10% para obtener una concentración de partida de 1.000 ng/ml en el volumen de reacción final. Se añadieron 50 pl de las disoluciones diferentes por triplicado a los pocillos correspondientes. Se incubaron mezclas de citotoxicidad individuales durante 24 a 48 horas a 37°C, 5% de CO².

Posteriormente, se realizó la medida de la actividad citotóxica. Para este fin, se añadió yoduro de propidio (PI) hasta una concentración final de 1 pg/ml por pocillo, y las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. El número de células diana positivas y negativas para PKH y PI se determinó por FACS. La citotoxicidad se midió como la relación de PKH positivas y PI negativas (células diana vivas) frente a la media de células diana vivas (PKH positivas y PI negativas) en el control que no contenía ningún constructo, según la fórmula: citotoxicidad (%) = [(células PI negativas/media de células PI negativas en el control) x 100]. Se analizaron curvas de muerte de respuesta frente a la dosis sigmoideas por software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, USA), y se calculó la concentración de BiTE que indujo la destrucción semi-máxima (valor de EC50). Los resultados de este ensayo se muestran posteriormente en la Fig 4. Todos los constructos mostraron actividad citotóxica. Los valores de EC50 resultantes para 5-10LHxSEQ ID NO.14, 5-10LHxSEQ ID NO.12 y 5-10LHxSEQ ID NO.10 fueron 1,3 pg/ml, 1,5 pg/ml, y 5,8 pg/ml, respectivamente.

EJEMPLO 8: Ensayo de citotoxicidad para 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, y 5-10LHxSEQ ID NO.14 con células Kato III como células diana y PBMC de cynomolgus como células efectoras

La bioactividad de 5-10LHxSEQ ID NO.12, 5-10LHxSEQ ID NO.10, y 5-10LHxSEQ ID NO.14 se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro basados en FACS usando las células Kato III positivas para EpCAM humana como células diana y PBMC de cynomolgus como células efectoras.

Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las células diana marcadas se lavaron dos veces con RPMI/FCS al 10%, y se mezclaron con células efectoras recién aisladas a una relación E:T de 10:1. Se añadieron por pocillo 2x104 células diana y 2x105 células efectoras en un volumen de 50 pl de RPMI/FCS al 10% en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se prepararon diluciones en serie décuplas de anticuerpos monocatenarios biespecíficos diferentes en RPMI/FCS al 10% para obtener una concentración de partida de 1000 ng/ml en el volumen de reacción final. Se añadieron 50 pl de las diferentes disoluciones por triplicado a los pocillos correspondientes. Se incubaron mezclas de citotoxicidad individuales durante 24 a 48 horas a 37°C, 5% de CO².

Posteriormente, se realiza la medida de la actividad citotóxica. Para este fin, se añadió yoduro de propidio (PI) hasta una concentración final de 1 pg/ml por pocillo, y las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. El número de células diana positivas y negativas para PKH y PI se determinó por FACS. La citotoxicidad se midió como la relación de PKH positivas y PI negativas (células diana vivas) con respecto a la media de células diana vivas (PKH positivas y PI negativas) en el control que no contenía constructo, según la fórmula: citotoxicidad (%) = [(células PI negativas/media de células PI negativas en control) x 100]. Se analizaron las curvas de muerte de respuesta frente a la dosis sigmoideas mediante software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, USA), y se calculó la concentración de anticuerpo monocatenario biespecífico que indujo la destrucción semi-máxima (valor de EC50). Los resultados de este ensayo se muestran posteriormente en la Fig 5. 5-10LHxSEQ ID NO.14, 5-10LHxSEQ ID NO.12 y 5-10LHxSEQ ID NO.10 mostraron actividad citotóxica. Los valores de EC50 resultantes para 5-10LHxSEQ ID NO.14, 5-10LHxSEQ ID NO.12 y 5-10LHxSEQ ID NO.10 fueron 87 pg/ml, 69 pg/ml, y 52 pg/ml, respectivamente. 5-10LHxdianti CD3 (anticuerpo anti-CD3 desinmunizado como se muestra en la SEQ ID NO. 163) no mostró ninguna actividad. Esto se debe al hecho de que el anticuerpo di-anti CD3 solamente se une con CD3 humano, pero no con CD3 de cynomolgus.

EJEMPLO 9: Determinación de secuencia del antígeno EpCAM de cynomolgus y generación de células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus

Para obtener el antígeno EpCAM de cynomolgus para ensayar la especificad para diferentes especies de anticuerpos anti-EpCAM humana, primero tuvo que determinarse la secuencia codificante del antígeno EpCAM de cynomolgus. Para este fin, se usaron en paralelo muestras de tejido de colon de 3 animales para el aislamiento de ARN total y la síntesis de ADNc por transcripción inversa con cebadores aleatorios, que se realizaron según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (2001)). Para amplificar la secuencia codificante del antígeno EpCAM, se usó una PCR (desnaturalización a 93°C durante 5 min, hibridación a 58°C durante 1 min, elongación a 72°C durante 1 min para el primer ciclo; desnaturalización a 93°C durante 1 min, hibridación a 582C durante 1 min, elongación a 72°C durante 1 min durante 35 ciclos; extensión terminal a 72°C durante 5 min). Como se desconocía la secuencia codificante del antígeno EpCAM de cynomolgus, se diseñaron cebadores apropiados (cebador de 5’ descrito en SEQ ID NO. 45, cebador de 3’ descrito en SEQ ID NO. 46) para la reacción de PCR según la secuencia codificante conocida del antígeno EpCAM humano (Szala S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (1990); p. 3542-6). También se diseñaron cebadores para permitir la expresión de la secuencia codificante del antígeno completo. Para las 3 muestras, se aislaron, purificaron y subclonaron PCR de 960 pares de bases mediante Xbal y Salí, en pEFDHFR. Se secuenciaron múltiples clones para cada muestra según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)(2001)) usando cebadores de secuenciación apropiados complementarios de secuencias flanqueantes en el vector.

Las nuevas secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del antígeno EpCAM de cynomolgus se describen en SEQ ID NOs. 47 y 48 en el listado de secuencias incluido en la descripción, respectivamente.

Las secuencias obtenidas se examinaron por comparación con la secuencia codificante del antígeno EpCAM humano. Como se muestra en la Figura 6, hay un alto grado de homología de secuencia entre la secuencia codificante del antígeno EpCAM humano y las secuencias obtenidas de las muestras de colon de los 3 monos cynomolgus.

Para generar una línea celular positiva para EpCAM de cynomolgus, un clon de la secuencia codificante anteriormente mencionada del antígeno EpCAM de cynomolgus subclonado en pEFDHFR con una secuencia nucleotídica verificada se transfectó en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). La amplificación génica del constructo se indujo mediante concentraciones crecientes de MTX hasta una concentración final de hasta 500 nM de MTX. Las células transfectadas se ensayaron después con respecto a la expresión de EpCAM de cynomolgus usando un ensayo de FACS. Para ese fin, se incubó un número de 2,5x105 células con 50 pl de sobrenadante de tres hibridomas anti EpCAM humana de ratón diferentes (M79 - Fogler et al., Cancer Res. 48 (1988); p. 6303-8; 3B10 - Passlick et al. Int. J. Cancer 87 (2000), p. 548-552; 2G8 - Balzar et al., J. Mol. Med. 77 (1999), p. 699-712). La unión de los anticuerpos se detectó con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-Ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón, anticuerpo específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (obtenido de Dianova, Hamburgo, FRG). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG). El anticuerpo anti EpCAM 2G8 se reconoció como específico para diferentes especies, y se confirmó la expresión de EpCAM de cynomolgus (véase la Fig. 7). Los transfectantes (representados como curvas en blanco) en comparación con células no transfectadas (representadas como curvas en negro) mostraron unión solamente con el sobrenadante del hibridoma 2G8, que por lo tanto se reconoció como anticuerpo específico para diferentes especies para EpCAM humana y de cynomolgus.

EJEMPLO 10: Determinación de secuencia de las regiones variables de un anticuerpo anti EpCAM humana específico para diferentes especies para primates no humanos

Para la determinación de secuencia de las regiones variables del anticuerpo anti-EpCAM 2G8, se usó la línea celular de hibridoma respectiva para el aislamiento de ARN total y la síntesis de ADNc por transcripción inversa con cebadores aleatorios, que se realizaron según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989) (2001)). Para amplificar las secuencias codificantes de las regiones variables del anticuerpo, se usó una PCR (desnaturalización a 93°C durante 5 min, hibridación a 58°C durante 1 min, elongación a 72°C durante 1 min para el primer ciclo; desnaturalización a 93°C durante 1 min, hibridación a 58°C durante 1 min, elongación a 72°C durante 1 min durante 30 ciclos; extensión terminal a 72°C durante 5 min). Como se desconoce la secuencia de la región 5’ de las regiones variables, se usó el conjunto anteriormente mencionado de cebadores de 5’ en combinación con un cebador de 3’ constante, por lo que el cebador de 3’ se escogió según el isotipo del anticuerpo.

Región variable de cadena pesada:

cebador de 3’: 5’-TATGCAACTAGTACAACCACAATCCCTGGG-3’ (SEQ ID NO. 107)

Región variable de cadena ligera:

cebador de 3’: 5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’ (SEQ ID NO. 108)

Todos los productos de PCR con una longitud entre 350 y 700 pares de bases se aislaron, se purificaron y se secuenciaron con el cebador de 3’ respectivo según protocolos convencionales (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)(2001)).

Las secuencias obtenidas se examinaron con respecto a secuencias codificantes de región variable funcional, y para la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se aisló una secuencia codificante de la región variable. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de las regiones variables se describen en SEQ ID NOs. 49 a 52 en el listado de secuencias incluido en la descripción, respectivamente.

EJEMPLO 11: Clonación de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de EpCAM y CD3

Para generar moléculas de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que comprenden la especificidad para diferentes especies de CD3 anteriormente mencionada y la especificidad para diferentes especies de EpCAM anteriormente mencionada, las regiones variables amplificadas del anticuerpo 2G8 tuvieron que modificarse por PCR para obtener los fragmentos de anticuerpo Fv monocatenario correspondientes. Se generaron dos anticuerpos Fv monocatenario con diferentes disposiciones de las regiones variables de cadena ligera y pesada. Para este fin, se usó una PCR de fusión de dos etapas para amplificar la secuencia que codifica las regiones variables. Se diseñó un conjunto de cebadores apropiados para realizar las etapas de clonación basadas en PCR, dando como resultado finalmente un anticuerpo monocatenario 2G8 que conecta los dos dominios variables con un enlazador de 15 aminoácidos ([Gly4Ser]3) en el orden VH-Enlazador-VL y VL-Enlazador-VH. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos se describen en SEQ ID NOs. 53 a 56 del listado de secuencias incluido en la descripción, respectivamente.

En resumen, se usaron las siguientes combinaciones de cebadores:

Para el anticuerpo scFv VL-VH 2G8 (designado en lo sucesivo aquí 2G8LH mostrado en SEQ ID NOs. 55 y 56): SEQ ID NOs. 57 a 60.

Para el anticuerpo scFv VH-VL 2G8 (designado en lo sucesivo aquí 2G8HL mostrado en SEQ ID NOs. 53 y 54): SEQ ID NOs. 61 a 64.

Para generar el anticuerpo monocatenario, se realizaron dos PCR con las combinaciones de cebadores respectivas. Durante esta PCR, se introdujeron secuencias complementarias solapantes en los productos de PCR (que surgen de los cebadores de enlazadores respectivos que se combinaron para formar la secuencia codificante del enlazador de 15 aminoácidos durante la PCR de fusión posterior). Los dominios VH y VL amplificados se fusionaron en esta PCR de fusión en la que solamente se requerían los cebadores externos y ambos productos de PCR. El anticuerpo scFv resultante está flanqueado en el extremo 5’ con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BsrGI y en el extremo 3’ con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BspEI. La secuencia codificante de los anticuerpos Fv monocatenario específicos de EpCAM se clonó entonces mediante BsrGI y BspEI en los vectores de expresión pEFDHFR descritos anteriormente que reemplazan el scFv 5-10LH. Se aislaron clones individuales de los constructos y se secuenciaron con cebadores complementarios con las regiones flanqueantes en el vector según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)(2001)). Para experimentos adicionales, se seleccionó un clon de cada constructo. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos se describen para 2G8LHxSEQ ID NO.12 en SEQ ID NOs.

65 y 66, para 2G8LHxSEQ ID NO.10 en SEQ ID NOs. 67 y 68, para 2G8LHxSEQ ID NO.16 en SEQ ID NOs. 69 y 70, para 2G8LHxSEQ ID NO.14 en SEQ ID NOs. 71 y 72, para 2G8HLxSEQ ID NO.12 en SEQ ID NOs. 73 y 74, para 2G8HLxSEQ ID NO.10 en SEQ ID NOs. 75 y 76, para 2G8HLxSEQ ID NO.16 en SEQ ID NOs. 77 y 78, y para 2G8HLxSEQ ID NO.14 en SEQ ID NOs. 79 y 80 del listado de secuencias incluido en la descripción.

EJEMPLO 12: Expresión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos 2G8LHxSEQ ID NO.12, 2G8LHxSEQ ID NO.10, 2G8LHxSEQ ID NO.16, 2G8LHxSEQ ID NO.14, 2G8HLxSEQ ID NO.12, 2G8HLxSEQ ID NO.10, 2G8HLxSEQ ID NO.16 y 2G8HLxSEQ ID NO.14 en células CHO

Los plásmidos con las secuencias que codifican los anticuerpos monocatenarios biespecíficos se transfectaron en células CHO deficientes en DFHR para la expresión eucariota del constructo como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). La amplificación génica del constructo se indujo mediante concentraciones crecientes de MTX hasta una concentración final de hasta 500 nM de MTX. Las células transfectadas se expandieron entonces, y se produjo 1 litro de sobrenadante. El constructo se purificó finalmente del sobrenadante de cultivo como se describe en Kufer et al. Cancer Immunity Vol. 1, p. 10 (2001).

EJEMPLO 13: Ensayo de FACS para la unión de 2G8LHxSEQ ID NO.12, 2G8LHxSEQ ID NO.10, 2G8LHxSEQ ID NO.16, 2G8LHxSEQ ID NO.14, 2G8HLxSEQ ID NO.12, 2G8HLxSEQ ID NO.10, 2G8HLxSEQ ID NO.16 y 2G8HLxSEQ ID NO.14 en células Kato III o células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus y células HPB-ALL

La unión de los constructos bifuncionales de sobrenadantes de cultivo celular, o la unión de constructos bifuncionales purificados, con el antígeno EpCAM humano en células Kato III o células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus y con el antígeno CD3 en células HPB-ALL se evaluó usando un ensayo de FACS. Para ese fin, se incubaron 2,5x105 células con 50 pl de sobrenadante o con 5 pg/ml de los constructos purificados en 50 pl de PBS con FCS al 2%. La unión de los constructos se detectó con un anticuerpo anti-His (Anticuerpo Penta-His, sin BSA, obtenido de Qiagen GmbH, Hilden, FRG) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como un reactivo de segunda etapa, se usó un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-Ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón, anticuerpo específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (obtenido de Dianova, Hamburgo, FRG). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG). La unión a antígeno fue claramente detectable para las especificidades anti EpCAM así como para las especificidades anti CD3 (véase la Fig. 8). Como un control negativo para la unión con EpCAM de cynomolgus, se incluyó el constructo 5-10LHxSEQ ID NO.10, que muestra la unión en CD3 humano (células HPB-ALL) pero no muestra la unión con EpCAM de cynomolgus (células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus). La parte 5-10LH solamente se une con EpCAM humana.

EJEMPLO 14: Ensayo de citotoxicidad para 2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 con células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus como células diana y P^bM^chumanas como células efectoras

La bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos seleccionados se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro basados en FACS usando las células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus como células diana y PBMC humanas como células efectoras.

Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las células diana marcadas se lavaron dos veces con RPMI/FCS al 10%, y se mezclaron con células efectoras recién aisladas a una relación E:T de 10:1. Se añadieron por pocillo 2x104 células diana y 2x105 células efectoras en un volumen de 50 pl de RPMI/FCS al 10% en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se prepararon diluciones en serie décuplas de diferentes anticuerpos monocatenarios biespecíficos en RPMI/FCS al 10% para obtener una concentración de partida de 5000 ng/ml en el volumen de reacción final. Se añadieron 50 pl de las diferentes disoluciones por triplicado a los pocillos correspondientes, y se incubaron durante 24 a 48 horas a 37°C, 5% de CO².

Posteriormente, se realizó la medida de la actividad citotóxica. Para este fin, se añadió yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/ml por pocillo, y las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. El número de células diana positivas para PKH y PI se determinó por FACS. La citotoxicidad se midió como la relación de células PI positivas (células muertas) frente al número total de células diana (PKH positivas) según la fórmula: citotoxicidad (%) = [(células PI positivas/células PKH positivas) x 100]. Se analizaron curvas de destrucción de respuesta frente a la dosis sigmoideas mediante Software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, USA), y se calculó la concentración de anticuerpo monocatenario biespecífico que indujo la destrucción semi-máxima (valor de EC50). Los resultados de este ensayo se muestran posteriormente en la Fig. 9. Los valores de EC50 resultantes para 2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 fueron 1103 pg/ml y 3638 pg/ml, respectivamente. Como control negativo, se incluyó 5-10LHxdi-anti CD3 (versión desinmunizada del anticuerpo anti-CD3 como se muestra en SEQ ID NO. 163 que se une con CD3 humano, pero no con CD3 de cynomolgus), y no mostró ninguna actividad. Esto se debe al hecho de que 5-10LH solamente se une con EpCAM humana pero carece de especificidad para diferentes especies para EpCAM de cynomolgus.

EJEMPLO 15: Ensayo de citotoxicidad para 2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 con células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus como células diana y PBMC de cynomolgus como células efectoras

La bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos seleccionados se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro basados en FACS usando las células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus como células diana y PBMC de cynomolgus como células efectoras.

Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las células diana marcadas se lavaron dos veces con RPMI/FCS al 10%, y se mezclaron con células efectoras recién aisladas a una relación E:T de 10:1. Se añadieron por pocillo 2x104 células diana y 2x105 células efectoras en un volumen de 50 pl de RPMI/FCS al 10% en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se prepararon diluciones en serie décuplas de diferentes anticuerpos monocatenarios biespecíficos en RPMI/FCS al 10% para obtener una concentración de partida de 5000 ng/ml en el volumen de reacción final. Se añadieron 50 pl de las diferentes disoluciones por triplicado a los pocillos correspondientes. Se incubaron mezclas de citotoxicidad individuales durante 24 a 48 horas a 37°C, 5% de CO².

Posteriormente, la medida de la actividad citotóxica se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los valores de EC50 resultantes para 2G8LHxSEQ ID NO.10 y 2G8HLxSEQ ID NO.12 fueron 39810 pg/ml y 60350 pg/ml, respectivamente. Como control negativo, se incluyó 5-10LHxdi-anti CD3 (versión desinmunizada del anticuerpo anti-CD3 como se muestra en SEQ ID NO. 163), y no mostró ninguna actividad. Di-anti CD3 se une solamente con CD3 humano, pero no consigue unirse con CD3 de macaco/cynomolgus. 5-10LH solamente se une con EpCAM humana pero carece de especificidad para diferentes especies para EpCAM de cynomolgus.

EJEMPLO 16: Generación de un fragmento de anticuerpo CD3 de tipo humano que se une con CD3 humano y de cynomolgus

1. Determinación de una VH humana equivalente

La secuencia de aminoácidos de la cadena VH murina mostrada en SEQ ID NO. 2 se alineó con el repertorio de secuencias de línea germinal de VH humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) usando el software de análisis de ADN Vector NTI. Basándose en este análisis, se escogió el segmento 3-73 de VH humana como una secuencia molde (véase la Fig. 11). Las definiciones de las CDR y de los marcos son según el esquema de numeración de Kabat.

Los restos de aminoácidos correspondientes que difieren entre la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y el segmento 3-73 de VH humana dentro de las regiones marco se mutaron en el nivel de ADN con respecto a los restos humanos.

Sin embargo, el constructo conservó restos marco potencialmente cruciales de la secuencia de VH murina original (según el esquema de numeración de Kabat): H-30, H-41, H49, H82b, H-93 (véase la Fig. 12). De esta manera, se diseñó una secuencia de aminoácidos que era idéntica a la cadena de VH murina mostrada en la secuencia SEQ ID NO. 2 dentro de sus CDR. La secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en SEQ ID NO. 110, mientras que la secuencia de ácido nucleico correspondiente se muestra en SEQ ID NO. 111; véase también la Fig. 12. La secuencia de VH N-terminal se cambió a “EVQLLE” para generar un sitio de clonación N-terminal adecuado (véase la Fig. 12).

2. Síntesis génica y clonación de la región VH de tipo humano

La región VH de tipo humano anteriormente mencionada se sintetizó por gen (Entelechon, Alemania) y se subclonó mediante los sitios de restricción XhoI y BstEII en un vector de expresión bacteriano adecuado. Este vector ya contenía la secuencia que codifica una cadena VL (secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 148; el término N en comparación con la VL original mostrada en SEQ ID NO. 4 cambió ligeramente por razones de clonación), que se empareja con la región VH de tipo humano, seguida de un Flag y una etiqueta His-6, y precedida por una secuencia líder que dirige el scFv funcional al periplasma de E. coli. La disposición de dominio funcional después de la clonación fue Secuencia líder-VH-(G4S)3-VL-Flag-His6.

3. Análisis funcional de constructos de scFv que tienen la VH murina original mostrada en SEQ ID NO. 2/VL mostrada en SEQ ID NO. 4 en comparación la VH de tipo humano mostrada en SEQ ID NO. 110/VL mostrada en SEQ ID NO.

148

El ADN plasmídico que codifica a) la VH (SEQ ID NO. 2) y VL (SEQ ID NO. 4) murinas originales y b) la VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) combinada con la VL (SEQ ID NO. 148) se transformó cada uno en TG1 de E. coli según protocolos convencionales. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del scFv VH-VL que comprende la VH (SEQ ID NO. 2) y VL (SEQ ID NO. 4) murinas originales se muestran en SEQ ID NOs. 9 y 10, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del scFv VH-VL que comprende la VH (SEQ ID NO. 110) y la VL (SEQ ID NO. 148) de tipo humano se muestran en SEQ ID NOs. 147 y 146, respectivamente.

La expresión de diferentes clones se realizó en TG-1 E. coli en un formato de 96 pocillos. Se inocularon 100 pl de LB/glucosa al 0,1% con 10 pl de un cultivo nocturno de clones individuales, y se dejaron crecer durante 4 h a 37°C. Después de la adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM, el cultivo se dejó crecer a 30°C durante otras 18-20 h. Por cada pocillo, se añadieron 40 pl de amortiguador BEL (ácido bórico 400 mM, NaCl 320 mM, EDTA 4 mM pH 8,0 lisozima 2,5 mg/ml), y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. El desecho celular se eliminó por centrifugación, y los sobrenadantes se ensayaron en experimentos de citometría de flujo.

La línea de linfocitos T humanos HPB-All y linfocitos T en células mononucleares de sangre periférica de cynomolgus (PBMC) se usaron como células positivas para CD3 humano y CD3 de cynomolgus, respectivamente.

Típicamente, se incubaron 100.000 células con 50 pl de los sobrenadantes bacterianos que contenían scFv, y se incubaron durante 30 min en hielo.

A continuación las células se lavaron tres veces con PBS, y posteriormente se resuspendieron en 50 pl de PBS que contenía anticuerpo anti-His (Pentahis, Roche) y se incubaron adicionalmente en hielo durante 30 min. Después, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo anti IgG de ratón marcado con PE durante 30 min más en hielo (en esta etapa se coincubaron PBMC de cynomolgus con FITC anti-CD2 para identificar los linfocitos T en la mezcla de PBMC). Después de lavar las células una vez, las células se resuspendieron en un amortiguador adecuado, y se determinó la positividad del constructo de anticuerpo unido a las células en un citómetro de flujo (FACScalibur), y se analizó.

El scFv de control de SEQ ID NO. 10 muestra un claro desplazamiento en células CD3 positivas humanas así como en células CD3 positivas de cynomolgus, indicativo de la unión con CD3 tanto humano como de cynomolgus. El scFv mostrado en SEQ ID NO. 146 que contiene la VH de tipo humano también muestra clara unión con células CD3 positivas humanas (véase la Fig. 13) y de cynomolgus (véase la Fig. 14).

4. Determinación de una VL humana equivalente

La secuencia de aminoácidos de la cadena de VH murina mostrada en SEQ ID NO. 2 se alineó con el repertorio de secuencias de línea germinal de VL humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) usando el software de análisis de ADN Vector NTI. Basándose en este análisis, se escogió el segmento 7a de Vlambda humano como una secuencia molde (véase la Fig. 21). Las definiciones de CDR y marcos son según el esquema de numeración de Kabat.

Los restos de aminoácidos correspondientes que difieren entre la cadena de VL murina mostrada en SEQ ID NO. 4 y el segmento 7a de Vlambda humano dentro de las regiones marco se mutaron en el nivel de ADN hacia los restos humanos. Sin embargo, el constructo conservó restos de marco potencialmente cruciales de la secuencia de Vlambda murina original (según el esquema de numeración de Kabat): L 36, L 46, L 49, L 57 (véase la Fig. 21). De esta manera, se diseñó una secuencia de aminoácidos que era idéntica a la cadena de VL murina mostrada en la secuencia SEQ ID NO. 4 dentro de sus CDR. La secuencia de aminoácidos correspondiente de la VL de tipo humano generada se muestra en SEQ ID NO. 168, mientras que la secuencia de ácido nucleico correspondiente se muestra en SEQ ID NO.

167. La secuencia de VL N-terminal se cambió a “EL” para generar un sitio de clonación N-terminal adecuado.

5. Síntesis génica y clonación de la región VL de tipo humano

La región VL de tipo humano anteriormente mencionada se sintetizó por gen (Entelechon, Alemania) y se subclonó mediante los sitios de restricción SacI y BsiWI en un vector de expresión bacteriano adecuado. Este vector ya contenía la secuencia que codifica la cadena de VH de tipo humano anteriormente mencionada (secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110), que se empareja con la región VL de tipo humano (secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 168), seguida de un Flag y una etiqueta de His-6 y precedida por una secuencia líder que dirige el scFv funcional a periplasma de E. coli. La disposición de dominio funcional después de la clonación fue Secuencia líder-VH-enlazador (G4S)3-VL-etiqueta Flag-etiqueta His6.

6. Análisis funcional de constructos de scFv que tienen la VH de tipo humano mostrada en SEQ ID NO. 110 combinada con la VL de tipo humano mostrada en SEQ ID NO. 168

El ADN plasmídico que codifica a) la VH (SEQ ID NO. 2) y la VL (SEQ ID NO. 4) murinas originales y b) la VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) combinada con la VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) se transformó cada uno en TG1 de E. coli según protocolos convencionales. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del scFv VH-VL que comprende la VH (SEQ ID NO. 2) y la VL (SEQ ID NO. 4) murinas originales se muestran en SEQ ID NOs. 9 y 10, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del scFv VH-VL que comprende la VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) y la VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) se muestran en SeQ ID NOs. 169 y 170, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del scFv VL-VH que comprende la VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) y la VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) se muestran en SeQ ID NOs. 193 y 194, respectivamente. Debido a diferentes estrategias de clonación, la secuencia de aminoácidos del scFv VL-VH de SEQ ID NO. 194 muestra tres intercambios de aminoácidos en comparación con la del scFv VH-VL de SEQ ID NO. 170, sin embargo, sin afectar a la capacidad de unión y especificidad de dicho scFv.

La expresión de diferentes clones se realizó en TG-1 de E. coli en formato de 96 pocillos. Se inocularon 100 pl de LB/glucosa al 0,1% con 10 pl de un cultivo de una noche de clones individuales, y se cultivó durante 4 h a 37°C. Después de la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM, el cultivo se dejó crecer a 30°C durante otras 18 20 h. Por cada pocillo, se añadieron 40 pl de amortiguador BEL (ácido bórico 400 mM, NaCl 320 mM, EDTA 4 mM pH 8,0 lisozima 2,5 mg/ml), y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. El desecho celular se eliminó por centrifugación, y los sobrenadantes se ensayaron en experimentos de citometría de flujo.

La línea de linfocitos T humanos HPB-ALL y linfocitos T humanos y de cynomolgus en células mononucleares de sangre periférica (PMBC) se usaron como células positivas para CD3 humano y CD3 de cynomolgus, respectivamente.

a) Las células HPB-ALL se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron posteriormente en 50 pl de PBS que contenía anticuerpo anti-His (Pentahis, Roche) y se incubaron adicionalmente en hielo durante 30 min. Después, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo anti IgG de ratón marcado con PE durante 30 min más en hielo. Después de lavar las células una vez, las células se resuspendieron en un amortiguador adecuado, y se determinó la positividad del constructo de anticuerpo unido a las células en un citómetro de flujo (FACScalibur), y se analizó.

b) PBMC humanas y de cynomolgus (que contenían linfocitos T) se lavaron tres veces con PBS y posteriormente se resuspendieron en 50 pl de PBS que contenía anticuerpo anti-His biotinilado (Pentahis biotinilado, Roche) y se incubaron adicionalmente en hielo durante 30 min. Después, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con estreptavidina marcada con PE durante 30 min más en hielo. En esta etapa, se coincubaron PBMC con FITC anti-CD2 para identificar los linfocitos T en la mezcla de PBMC.

Después de lavar las células de a) o b) una vez, las células se resuspendieron en un amortiguador adecuado, y se determinó la positividad del constructo de anticuerpo unido a las células en un citómetro de flujo (FACScalibur) y se analizó.

El scFv de control de SEQ ID NO. 10 (VH murina de SEQ ID NO. 4 - VL murina de SEQ ID NO. 2) muestra un claro desplazamiento en células CD3 positivas humanas como se representa en la Figura 22. El desplazamiento en linfocitos T humanos y de cynomolgus es menos pronunciado, más probablemente debido al sistema de detección menos sensible (Fig. 23).

El scFv de tipo humano de SEQ ID NO. 170 (VH de tipo humano de SEQ ID NO. 110 - VL de tipo humano de SEQ ID NO. 168) muestra un desplazamiento positivo en células HPB-ALL (Fig. 22) y claros desplazamientos en linfocitos T humanos así como de cynomolgus (Fig. 23, panel superior).

Cuando se preincuba con 10 mg/ml del anticuerpo IgG murino mAb I descrito en el Ejemplo 1 que tiene la misma especificidad que los scFv (es decir, para CD3 épsilon), los desplazamientos de células teñidas con el scFv murino anteriormente mencionado o el scFv de tipo humano se reducen significativamente, subrayando la región de unión similar de los scFv y el anticuerpo murino original; véase la Fig. 23 panel inferior.

Ejemplo 17: Determinación de un epítopo para anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies que se unen a CD3 épsilon tanto humano como de cynomolgus

Para determinar el epítopo de CD3 épsilon humano y de cynomolgus que se une con anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies, se llevó a cabo el cartografiado de epítopos con anticuerpo I (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4) y el anticuerpo II (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8), que se unen ambos con CD3 épsilon humano y de cynomolgus; véase también la Figura 1. Para el análisis de aplicación puntual de péptidos (“pepspot”), se unieron covalentemente péptidos de 13meros solapantes derivados de las secuencias de aminoácidos de CD3 épsilon humano y de cynomolgus (véase la Figura 15) a una membrana de celulosa-p-alanina Whatman 50 mediante el término C, mientras que el término N acetilado permanecía libre. En los péptidos, el aminoácido cisteína - siempre que aparezca en la secuencia de CD3 épsilon correspondiente - se intercambió por el aminoácido serina. Los péptidos 13meros individuales generados (mediante JPT Peptide Technologies GmbH) se muestran en las Figuras 16 y 17. Para CD3 épsilon de cynomolgus, se han ensayado 43 puntos, mientras que para el CD3 épsilon humano se han ensayado 47 puntos. Se ha establecido que la longitud de la secuencia solapante de dos péptidos adyacentes es de 11 aminoácidos.

Los experimentos de pepspot se realizaron de la siguiente manera. De acuerdo con el protocolo del fabricante, la membrana se aclaró con metanol durante 1 min, se lavó con TBS 1x, y se bloqueó con TBS 1x/reactivo de bloqueo al 1% (p/v) (BM Chemiluminescence Blotting Sustrate (POD) de Roche Diagnostics GmbH) durante 3 h. Todas las etapas de incubación y lavado se realizaron en un agitador orbital a temperatura ambiente, excepto por la incubación durante una noche del anticuerpo primario. Directamente después de descartar la disolución de bloqueo, las membranas se incubaron durante una noche con 5 o 3 mg/ml de anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies como se ha expuesto anteriormente en TBS 1 x/reactivo de bloqueo al 0,5% (p/v) a 4°C en un agitador orbital. Después de lavar 4 veces con TBS 1x/Tween al 0,05% durante 15 min, la detección del anticuerpo anti-CD3 unido se logró mediante incubación durante 2 h con un anticuerpo anti-IgG (específico de F(ab)²) conjugado con peroxidasa de rábano picante comercialmente disponible o un anticuerpo anti-IgG marcado con fosfatasa alcalina (diluido según la recomendación del fabricante en TBS 1x/reactivo de bloqueo al 0,5%, respectivamente). Posteriormente, las membranas se lavaron 6 veces con TBS 1x/Tween al 0,05% durante 15 minutos. La peroxidasa de rábano picante se visualizó mediante quimioluminiscencia potenciada (disolución de sustrato de luminiscencia A y disolución de partida B mezcladas 100:1; Bm Chemiluminescence Blotting Substrate (POD) de Roche Diagnostics GmbH) y una película BioMax (Kodak). Se visualizó fosfatasa alcalina usando el sistema de sustrato líquido de fosfato de 5-bromo-4-cloro-indolilo/nitroazul de tetrazolio (Sigma).

Para excluir la unión no específica de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, la membrana se incubó solamente con anticuerpo secundario. Todas las otras etapas se realizaron como en el experimento anterior.

El ensayo de pepspot de control (véase la Figura 18(A)) mostró señales en los puntos 33 y 42 de CD3 épsilon de cynomolgus, y en los puntos 37, 39 y 46 de CD3 épsilon humano. Estas señales se consideran inespecíficas, y no se mencionarán adicionalmente.

1. Anticuerpo anti-CD3 I (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4)

(i) Unión con CD3 épsilon de cynomolgus

Se detectaron fuertes señales de unión de anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies I (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4) con péptidos derivados de CD3 épsilon de cynomolgus en el punto 1, así como en el tramo de puntos peptídicos 24-29 (Figura 18(B)). Este último corresponde a los restos de aminoácidos 47-69 de CD3 épsilon de cynomolgus (véase la Figura 15). Todos los péptidos 13meros que abarcan esta región contienen un motivo de aminoácidos mínimo 56-59 (EFSE). El punto 1 corresponde a los restos de aminoácidos 1-13 (QDGNEEMGSITQT) de CD3 épsilon de cynomolgus.

(ii) Unión con CD3 épsilon humano

El anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies I se unió con los puntos peptídicos 15, 28, 32, 33 y 40 derivados de CD3 épsilon humano (véase la Figura 18(B)). El tramo de puntos peptídicos 28 a 33 corresponde a los restos de aminoácidos 47-69 de CD3 épsilon humano, y comprende el motivo de aminoácidos mínimo 57-59 (FSE). Los puntos 15 y 40 corresponden a los restos de aminoácidos 30-42 (QYPGSEILWQHND) y 71-83 (RGSKPEDANFYLY), respectivamente.

2. Anticuerpo anti-CD3 II (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8)

(i) Unión con CD3 épsilon de cynomolgus

El análisis de pepspot con anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies II (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8) mostró fuertes señales para CD3 épsilon de cynomolgus en el tramo de puntos peptídicos 27-29 así como en el punto 33 (véase la Figura 19). El tramo que abarca los puntos 27 y 29 corresponde a los restos de aminoácidos 53-69 de CD3 épsilon de cynomolgus (véase la Figura 15), en el que los péptidos 13meros tienen el tramo mínimo de aminoácidos 57-61 (FSEME) en común. El punto 33 se correlaciona con los restos de aminoácidos 65-77 (YYVSYPRGSNPED).

(ii) Unión con CD3 épsilon humano

El anticuerpo anti-CD3 con reacción cruzada II se unió con los puntos peptídicos 15, 19, 32 and 33, 37, 39 y 40 de CD3 épsilon humano (véase la Figura 19). El punto 19 corresponde a los restos de aminoácidos 38-46d (WQHNDKNIGGDED) de CD3 épsilon humano (véase la Figura 15). El tramo pequeño de puntos 32 a 33 corresponde a los restos de aminoácidos 55-69 que contienen el péptido mínimo FSELE (aminoácidos 57-61). Los puntos 37 y 39 coinciden con los restos de aminoácidos 65-77 (YYVSYPRGSKPED) y 69-81 (YPRGSKPEDa NfY) de CD3 épsilon humano, respectivamente. Las correlaciones de los puntos 15 y 40 ya se han mencionado anteriormente.

En resumen, ambos anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies reconocen epítopos discontinuos en CD3 épsilon humano y de cynomolgus. Con respecto a CD3 épsilon de cynomolgus, ambos anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies reconocieron un claro tramo solapante de puntos peptídicos 27-29 (véase la Figura 16). Todos los péptidos 13meros que abarcan esta región contienen un péptido mínimo FSEME (restos de aminoácidos 57-61 de CD3 épsilon de cynomolgus). La intersección peptídica en CD3 épsilon humano unido por ambos anticuerpos puede determinarse para los puntos 32 y 33 (véase la Figura 17). Esta sección contiene el péptido mínimo FSELE correspondiente a los restos 57-61 de CD3 épsilon humano.

Basándose en estos resultados, se concluye que fragmentos de anticuerpo de CD3 específicos para diferentes especies entra en contacto con CD3 épsilon en el área de los restos de aminoácidos 57-61 de CD3 épsilon tanto de cynomolgus como humano que comprende los tramos de aminoácidos FSEME y FSELE de CD3 épsilon de cynomolgus y humano, respectivamente, formando el motivo FSE el núcleo epitópico. Este resultado - aunque es plausible debido a la accesibilidad del bucle E-F (aminoácidos 56-62; véase la Figura 15) de CD3 épsilon humano (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80) que comprende los aminoácidos FSELE o FSEME - es no obstante sorprendente ya que no hay ningún solapamiento de este epítopo recién definido con el epítopo conocido en la cadena de CD3 épsilon de anticuerpos anti-CD3 OKT3 y UCHT1 (véase la Figura 17; Kjer-Nielsen et al., loc.cit; Amett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73) que se han considerado hasta la fecha representativos de todos los anticuerpos anti-CD3 que se cree que forman una única familia con el mismo epítopo o uno muy similar.

Ejemplo 18: Determinación del epítopo para el anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano que se une con CD3 épsilon tanto humano como de cynomolgus

El cartografiado epitópico del fragmento de anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano descrito en el Ejemplo 16 (SEQ ID NO. 170) se llevó a cabo por análisis de puntos peptídicos (“pepspot”) como se describe en el Ejemplo 17. Para este fin, se convirtió dicho fragmento Fv monocatenario mostrado en SEQ ID NO. 170 en un anticuerpo IgG completo con una cadena pesada gamma1 murina que comprendía la región VH como se muestra en SEQ ID NO. 110 y una cadena ligera kappa que comprendía la región VL como se muestra en SEQ ID NO. 168. El procedimiento del experimento pepspot fue idéntico al protocolo usado en el Ejemplo 17.

La membrana de pepspot se incubó con 4 mg/ml del anticuerpo IgG1 mencionado, y un anticuerpo de cabra anti IgG de ratón marcado con fosfatasa alcalina que detecta anticuerpo de CD3 unido. Se incubó una segunda membrana con anticuerpo de cabra anti IgG de ratón marcado con fosfatasa alcalina solo para revelar la unión inespecífica del anticuerpo de detección.

Las siguientes señales detectadas en el ensayo de pepspot de control (véase la Figura 24(A)) se han considerado inespecíficas, y no se mencionarán adicionalmente: los tramos de puntos teñidos 10-13, 15-19, 30-32, 35-41 de CD3 épsilon de cynomolgus y 2-6, 14-19, 26, 34-39 y 46 de CD3 épsilon humano.

(i) Unión con CD3 épsilon de cynomolgus

El anticuerpo anti CD3 específico para diferentes especies (IgG1 murino que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 110 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 168) se unió con los puntos peptídicos 1 y 33, así como con el tramo de aminoácidos de los puntos peptídicos 24-29 (Figura 24(B)) derivados de CD3 épsilon de cynomolgus. El tramo que abarca los puntos 24 y 29 corresponde a los restos de aminoácidos 47-69 de CD3 épsilon de cynomolgus (véanse las Figuras 15 y 16), en el que los péptidos 13meros tienen el tramo mínimo de aminoácidos 56-59 (EFSE) en común. El punto 1 y el punto 33 corresponden a restos de aminoácidos 1-13 (“QDGNEEMGSITQT”; SEQ ID NO.

199) y 65-77 (“YYVSYPRGSNPED”; SEQ ID NO. 200) de CD3 épsilon de cynomolgus, respectivamente.

(ii) Unión con CD3 épsilon humano

Se descubrieron señales de unión del anticuerpo IgG1 anti-CD3 específico para diferentes especies mencionado con péptidos derivados de CD3 épsilon humano (véase la Figura 24(B)) en los puntos 28 y 33, que corresponden a los restos de aminoácidos 47-59 y 57-69 de CD3 épsilon humano (véase la Figura 17), respectivamente. Los dos puntos teñidos comprenden el motivo de aminoácidos mínimo 57-59 (FSE).

El anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano reconoce los mismos epítopos discontinuos en CD3 épsilon humano y de cynomolgus que el anticuerpo I y II descritos en los Ejemplos 1 y 17. Las señales de unión de dicho anticuerpo de tipo humano en la membrana peptídica revelan las intersecciones peptídicas correspondientes a la secuencia de aminoácidos “FSEME” (restos de aminoácidos 57-61) de CD3 épsilon de cynomolgus y las correspondientes a la secuencia de aminoácidos “FSELE” (restos de aminoácidos 57-61) de CD3 épsilon humano como región nuclear. Esto está en línea con el epítopo determinado para los anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies I y II en CD3 épsilon tanto de cynomolgus como humano (véase el Ejemplo 17).

Ejemplo 19: Verificación del epítopo identificado en CD3 épsilon humano para el anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano

Para verificar el epítopo del fragmento de anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano descrito en el Ejemplo 16 en CD3 épsilon humano, la región de unión identificada como se ha determinado en el Experimento 18 se analizó adicionalmente por un ensayo de transferencia puntual usando un péptido 13mero que abarcaba el área de unión definida de los restos de aminoácidos “FSELE” en CD3 épsilon humano. Este péptido comprende la secuencia de aminoácidos “EFSELEQSGYYVC” (SEQ ID NO. 195) de CD3 épsilon humano. El péptido existe en dos formas, y está biotinilado en el término N o C. En caso de marcaje N terminal, un enlazador corto conecta el péptido con la biotina. Como se ha descrito en el Ejemplo 18, el fragmento de anticuerpo se convirtió a un formato de IgG murino con una cadena pesada gamma1 murina que comprende la región VH como se muestra en SEQ ID NO. 110 y una cadena ligera kappa que comprende la región VL como se muestra en SEQ ID NO. 168. La transferencia puntual se realizó de la siguiente manera. Se usó Minifold I Spot Blot System de Schleicher & Schuell para inmovilizar los péptidos en una membrana de nitrocelulosa Protran BA 85, 0,45 mm). Se filtraron 75 mg de cada péptido en 100 ml de TBS a través de la membrana usando vacío. Después de la etapa de filtración, la membrana se bloqueó con TBS 1x/reactivo de bloqueo al 1% (p/v) (BM Chemiluminescence Blotting Substrate (POD) de Roche Diagnostics GmbH) durante 2 h. Todas las etapas de incubación y lavado se realizaron en un agitador orbital a temperatura ambiente, excepto por la incubación durante una noche del anticuerpo primario. Directamente después de descartar la disolución de bloqueo, la membrana se incubó una noche con 3 mg/ml del anticuerpo anti-CD3 anteriormente mencionado en TBS 1x/reactivo de bloqueo al 0,5% (p/v) a 4°C en un agitador orbital. Como control, se aplicó el anticuerpo IgG1 murino anti-CD3 UCHT1 (BD Biosciences) que se unía con CD3 épsilon humano a una segunda membrana transferida con las mismas cantidades de los dos péptidos. Después de lavar tres veces con TBS 1x/Tween al 0,05% durante 10 min, se consiguió la detección del anticuerpo anti-CD3 unido por incubación durante 2 horas con un anticuerpo anti IgG conjugado con fosfatasa alcalina comercialmente disponible (diluido según las recomendaciones del fabricante en TBS 1x/reactivo de bloqueo al 0,5%). Posteriormente, las membranas se lavaron tres veces con TBS 1x/Tween al 0,05% durante 10 min. La fosfatasa alcalina se visualizó usando sistema de sustrato líquido de fosfato de 5-bromo-4-cloro-indolilo/nitroazul de tetrazolio (Sigma).

El anticuerpo específico de CD3 mencionado que comprende la región VH mostrada en SEQ ID NO. 110 y la región VL mostrada en SEQ ID NO. 168 se unió con ambas formas del péptido “EFSELEQSGYYVC” (SEQ ID NO. 195) transferido a la membrana (véase la Figura 25 (A)(1) y (2)), mientras que no pudo obtenerse unión para el anticuerpo IgG murino anti-CD3 UCHT 1 (véase la Figura 25 (B) (1) y (2)). El epítopo reconocido por el anticuerpo anti-CD3 UCHT 1 se describe, por ejemplo, en Kjer-Nielsen et al., loc.cit; Arnett et al., PNAS (2204), p. 16268-73.

Estos resultados apoyan la identificación del epítopo recién definido del anticuerpo anti-CD3 descrito aquí (con la región VH mostrada en SEQ ID NO. 110 y la región VL mostrada en SEQ ID NO. 168). Dicho epítopo corresponde a los restos de aminoácidos “EFSELEQSGYYVC” (SEQ ID NO. 195) en la cadena CD3 épsilon humana, y comprende el tramo de aminoácidos “FSELE”.

Ejemplo 20: Generación de células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus

Se usó un trozo congelado instantáneamente de colon de cynomolgus positivo para EGFR para obtener el ARN total, que se aisló según las instrucciones del manual del kit (Qiagen, RNeasy Mini Kit). El ARN obtenido se usó para síntesis de ADNc por transcripción inversa con cebadores aleatorios. Para clonación de la secuencia de longitud completa del antígeno de EGFR, se usaron los siguientes oligonucleótidos:

5' EGFR AG XbaI 5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3' (SEQ ID NO. 197)

3' EGFR AG Sail 5'-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3' (SEQ ID NO. 198).

Se usó una PCR (desnaturalización a 93°C durante 5 min, hibridación a 58°C durante 1 min., elongación a 72°C durante 2 min para el primer ciclo, desnaturalización a 93°C durante 1 min, hibridación a 58°C durante 1 min., elongación a 72°C durante 2 min durante 30 ciclos; extensión terminal a 72°C durante 5 min) para amplificar la secuencia codificante. El producto de PCR se digirió posteriormente con Xbal y SalI, se ligó en el vector de expresión digerido de forma apropiada pEF-DHFR, y se transformó en E. coli. Los procedimientos anteriormente mencionados se llevaron a cabo según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica verificada por secuencia en las células CHO deficientes en DHFR para expresión eucariota del constructo. La expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de MTX hasta una concentración final de hasta 20 nM de MTX.

Ejemplo 21: Generación de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de EGFR y CD3

En general, se diseñaron moléculas de anticuerpos monocatenarios biespecíficos, que comprendían cada una un dominio con una especificidad de unión por el antígeno CD3 humano y de cynomolgus así como un dominio con una especificidad de unión por el antígeno EGFR humano y de cynomolgus, como se expone en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico

para diferentes especies anti-CD3 y anti-EGFR

Los constructos anteriormente mencionados que contienen los dominios de cadena ligera variable (L) y cadena pesada variable (H) que reaccionan con el EGFR humano y de cynomolgus derivado de hibridomas murinos se obtuvieron por síntesis génica y posterior clonación en un vector de expresión que comprendía las combinaciones de VH y VL específicas de CD3 reactivas con el CD3 humano y de cynomolgus. Aquí, SEQ ID NO. 170 corresponde a la secuencia de aminoácidos del scFv VH-VL anti-CD3 que comprende la VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) y la VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168). SEQ ID NO. 194 corresponde a la secuencia de aminoácidos del scFv VL-VH anti-CD3 que comprende la VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) y la VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110). Los constructos se transfectaron después en células CHO deficientes en DHFR mediante electroporación.

Ejemplo 22: Expresión y purificación de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de ^eGF^ry CD3

Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica de los constructos se indujo mediante concentraciones crecientes de MTX hasta una concentración final de hasta 20 nM de MTX. Después de dos pasadas de cultivo estacionario, las células se dejaron crecer en frascos rotatorios con medio MEM modificado para CHO durante 7 días antes de la recogida. Las células se retiraron por centrifugación, y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20°C.

Para la cromatografía, se usaron el sistema Ákta® FPLC (Pharmacia) y el software Unicorn®. Todos los productos químicos fueron de uso en investigación, y se obtuvieron de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt). Se realizó cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (“IMAC”) usando una columna Fractogel® (Merck) que se cargó con ZnCl²según el protocolo proporcionado por el fabricante. La columna se equilibró con amortiguador A2 (amortiguador de fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,4 M), y el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) se aplicó a la columna (10 ml) a un caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con amortiguador A2 para eliminar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente de dos etapas de amortiguador B2 (amortiguador de fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,4 M, imidazol 0,5 M) según lo siguiente:

Etapa 1: amortiguador B2 al 20% en 6 volúmenes de columna;

Etapa 2: amortiguador B2 al 100% en 6 volúmenes de columna.

Las fracciones proteicas eluidas de la etapa 2 se reunieron para la purificación posterior.

La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna HiPrep Sephadex S200 (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco). Las muestras de proteínas eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE convencional y transferencia Western para detección. Antes de la purificación, la columna se calibró para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando colorante de ensayo de proteínas (MicroBCA Pierce) e IgG (Biorad) como proteína patrón.

Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos se aislaron en un procedimiento de purificación de dos etapas de IMAC y filtración en gel. El producto principal tuvo un peso molecular de alrededor de 52 kDa en condiciones nativas como se determinó por filtración en gel en PBS. Este peso molecular corresponde al anticuerpo monocatenario biespecífico. Todos los constructos se purificaron según este método.

La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizadas con geles Bis Tris 4-12% premoldeados (Invitrogen). La preparación y aplicación de las muestras se realizó según el protocolo proporcionado por el fabricante. El peso molecular se determinó con un patrón de proteína MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95% como se determinó por SDS-PAGE.

La transferencia Western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de Invitrogen según el protocolo proporcionado por el fabricante. Los anticuerpos usados se dirigieron contra la etiqueta His (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma), y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. El anticuerpo monocatenario biespecífico se pudo detectar específicamente por transferencia Western. Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente a la molécula biespecífica purificada.

Ejemplo 23: Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos para diferentes especies de EGFR y CD3

Para evaluar la funcionalidad de los constructos de anticuerpos biespecíficos específicos para diferentes especies con respecto a la capacidad de unión con EGFR y CD3 humanos y de cynomolgus, respectivamente, se realizó un análisis de FACS. Para este fin, se usaron las células de carcinoma epidermoide positivas para EGFR A431 (ATCC CRL-1555) y la línea celular de leucemia de linfocitos T humanos positiva para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para comprobar la unión con antígenos humanos. La reactividad de unión con antígenos de cynomolgus se evaluó usando los transfectantes de EGFR de cynomolgus generados descritos en el Ejemplo 20 y PBMC de cynomolgus que se obtuvieron por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Se incubaron 200.000 células de la población celular respectiva durante 30 min en hielo con 50 pl de la proteína purificada de los constructos de anticuerpos biespecíficos específicos para diferentes especies (1 pg/ml). Las células se lavaron dos veces en PBS, y la unión del constructo se detectó con un anticuerpo Penta His murino no marcado (diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%; Qiagen; n° de pedido 34660). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti His unidos con un anticuerpo específico para Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Se usó medio de cultivo reciente como control negativo.

Las células se analizaron por citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se llevaron a cabo como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002).

La capacidad de unión de varias disposiciones de dominio fue claramente detectable como se muestra en las Figuras 29 a 36. En el análisis de FACS, todos los constructos con diferente disposición de los dominios VH y VL específicos para EGFR y CD3 mostraron unión con CD3 y EGFR en comparación con el control negativo usando medio de cultivo y anticuerpo de detección 1 y 2. En resumen, la especificidad para diferentes especies del anticuerpo biespecífico para antígenos CD3 y EGFR humanos y de cynomolgus pudo demostrarse claramente.

Ejemplo 24: Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de EGFR y CD3

Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante liberación de cromo 51 en ensayos de citotoxicidad in vitro usando las líneas celulares positivas para EGFR descritas en el Ejemplo 23; véanse también las Figuras 39 y 40. Como células efectoras, se usaron linfocitos T positivos para CD8 humanos estimulados o PBMC de cynomolgus estimuladas, respectivamente.

La generación de los linfocitos T CD8+ estimulados se realizó de la siguiente manera:

Se recubrió previamente una placa de Petri (85 mm de diámetro, Nunc) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Las PBMC recientes se aislaron de sangre periférica (30-50 ml de sangre humana, o 10 ml de sangre de cynomolgus) mediante centrifugación en gradiente de Ficoll según protocolos convencionales. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 50 ml de RPMI 1640/FCS al 10%/IL-220 U/ml (Proleukin, Chiron), y se estimularon durante 2 días. Al tercer día, las células se recogieron, y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivó de nuevo durante un día. Los CTL CD8+ se aislaron mediante agotamiento de linfocitos T CD4+ y células Nk CD56+.

Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 45 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI, y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 pl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una relación E:T de 10:1 correspondiente a 1000 células diana y 10000 células efectoras por pocillo. Se aplicó 1 pg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies y 20 diluciones triples de las mismas. El tiempo de ensayo fue 18 horas, y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron por cuadruplicado. La medida de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3 (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA). Las curvas de respuesta a la dosis sigmoideas tuvieron típicamente valores de R2 > 0,90 como se determinó por el software. Para comparación de la bioactividad, se usaron valores de EC⁵⁰calculados por el programa de análisis.

Como se muestra en las Figuras 39 y 40, todos los constructos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies generados revelaron actividad citotóxica contra células diana positivas para EGFR humano inducida por células CD8+ humanas y células diana positivas para EGFR de cynomolgus inducida por células CD8+ de cynomolgus. En la Figura 39, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio variable reactivo con EGFR y un dominio variable de CD3 humano desinmunizado (EGFR LH x di-anti CD3) como un control negativo. En la Figura 40, se ha usado el mismo constructo (EGFR LH x di-anti CD3) como un control positivo. Como control negativo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico irrelevante.

Ejemplo 25: Generación y caracterización de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de carboanhidrasa IX (CAIX) y CD3

Tabla 2: Formatos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de CAIX y CD3

En analogía a los Ejemplos anteriormente mencionados, se crearon anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de carboanhidrasa IX (CAIX/MN) y CD3 que contenían los dominios de cadena ligera variable (L) y de cadena pesada variable (H) reactivos con el antígeno CAIX humano y de cynomolgus, y posteriormente se clonaron en un vector de expresión que comprendía las combinaciones de VH y VL específicas de CD3 reactivas con el CD3 humano y de cynomolgus. Los experimentos se llevaron a cabo en esencia como se ha descrito en los Ejemplos 20 a 24, con las siguientes excepciones:

Los experimentos de unión de FACS se realizaron con la línea celular de carcinoma de pulmón humano positiva para CAIX A549 (ATCC, CCL-185) para evaluar la capacidad de unión con el antígeno CAIX humano. La especificidad para diferentes especies para tejido de cynomolgus se evaluó desplegando la línea celular de piel de cynomolgus CYNOM-K1 (National Institute for Cancer Research (IST) de Génova, Italia, ECACC 90071809) o la línea celular epitelial de mono Rhesus 4MBr-5 (ATCC, CCL-208). Los mismos cambios en líneas celulares se aplican a los ensayos de citotoxicidad realizados con los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies CAIX y CD3.

Como se representa en las Figuras 26 a 28, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de CAIX y CD3 generados demostraron unión con los antígenos tanto humanos como de cynomolgus, y demostraron ser completamente específicos para diferentes especies. La bioactividad citolítica de los constructos analizados se muestra en las Figuras 37 y 38. En el panel izquierdo de la Figura 37, se ha usado como control positivo un anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio variable reactivo con CAIX y un dominio variable específico de CD3 humano desinmunizado. En el panel derecho, se ha usado el mismo constructo como control negativo.

Apéndice

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente humano, que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende

(ii) un segundo dominio de unión que se une con un antígeno de superficie celular humano y con el homólogo de primate distinto de chimpancé de dicho antígeno de la superficie celular, que es un antígeno tumoral, en el que dicho primer dominio de unión se une con CD3 épsilon humano y de primate cynomolgus, en el que el CD3 épsilon de cynomolgus comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NOs. 135 o 136 y el CD3 épsilon humano comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO. 134,

en el que el primer dominio de unión comprende una región VH que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOs. 2 o 110, y

en el que el primer dominio de unión comprende una región VL que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOs. 4, 148 o 168.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 4.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en la que la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en s Eq ID NO. 110, y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 148 o SEQ ID NO: 168.

4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 10, 12, 146, 170 o 194.

5. La composición farmacéutica de cualquier reivindicación anterior, en la que al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo es humano, humanizado y/o injertado con CDR.

6. Una composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, o una célula hospedante transformada o transfectada con dicho vector.

7. Un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula hospedante definida en la reivindicación 6 en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y recuperar del cultivo el anticuerpo monocatenario biespecífico producido.

8. Una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o como se produce según el procedimiento de la reivindicación 7, para uso en un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa o una enfermedad tumoral.

9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en la que dicha enfermedad tumoral es una enfermedad maligna, preferiblemente cáncer.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8 o 9, en la que dicha composición farmacéutica se administra en combinación con un fármaco adicional.