ES2857513T3 - Oligonucleótidos y su uso - Google Patents

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ES2857513T3 ES16739091T ES16739091T ES2857513T3 ES 2857513 T3 ES2857513 T3 ES 2857513T3 ES 16739091 T ES16739091 T ES 16739091T ES 16739091 T ES16739091 T ES 16739091T ES 2857513 T3 ES2857513 T3 ES 2857513T3
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Abstract

Oligonucleótidos (i) con la secuencia SEQ ID NO 3 o (ii) con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 3 o (iii) con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 3 con respecto a la dirección de lectura 5' → 3': cgaacccc*w ccwyc SEQ ID NO 3, en donde w representa a o t, y representa c o t; y * representa una inserción "c".

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos y su uso
La presente invención se refiere a oligonucleótidos y se refiere al uso de los oligonucleótidos para el diagnóstico médico. En particular, la invención se refiere a oligonucleótidos que pueden encontrar uso para una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas.
La enfermedad de Chagas pertenece a las infecciones parasitarias y es provocada por el protozoo Trypanosoma cruzi (T. cruzi). El germen es transmitido principalmente por diferentes redúvidos chupadores de sangre. También están documentadas transmisiones congénitas, transmisión mediante transfusiones de sangre y trasplantes de órganos, transmisiones por alimentos contaminados y transmisiones por accidentes de laboratorio.
Más de 150 animales domésticos y salvajes sirven como reservorio, pero también seres humanos infectados de forma asintomática colaboran en su difusión. 100 millones de personas viven con el riesgo de ser infectados, alrededor de 18 millones ya están infectaos. Con ello, Chagas se encuentra en el 6° puesto de las “Enfermedades de Carga Mundial” y representa un gran problema para Sudamérica y Centroamérica. Mediante la migración incrementada de personas infectadas a los EE.UU. y a España y Portugal aumentan también allí los casos de la enfermedad de Chagas.
Diferentes especies de redúvidos (familia Reduviidae, subfamilia Triatomae) sirven como vectores. Ingieren a los gérmenes patógenos al chupar la sangre. Los gérmenes patógenos se multiplican en el insecto y luego, cuando el redúvido chupa sangre de un nuevo huésped, por ejemplo de un ser humano, son secretados con las heces del redúvido durante el acto de chupar.
La picadura del redúvido es la mayoría de las veces indolora, pero deja una lesión en la piel y un prurito. Si la persona picada combate el prurito (a menudo instintivamente) mediante restriego, los gérmenes patógenos son incorporados mediante restriego con las heces del redúvido en la herida.
También es posible una infección a través de las mucosas de los ojos (conjuntiva), de la nariz o de la boca. En el tejido, los gérmenes patógenos penetran en la célula huésped y se multiplican mediante bipartición, formando los denominados pseudoquistes. Finalmente, los pseudoquistes revientan y liberan a los parásitos que luego son transportados a través del torrente sanguíneo a nuevas células huésped y, de esta forma, inician otros ciclos de multiplicación. Durante la siguiente ingesta de sangre se infectan otros redúvidos, para lo cual son suficientes incluso bajas parasitemias. Los redúvidos son animales nocturnos. Pueden alcanzar hasta 2 años de edad y se multiplican mediante puesta de huevos. Su radio asciende a varios cientos de metros. Todos los estadios (adultos y larvas) y ambos sexos chupan sangre. Una vez infectados, permanecen siendo infecciosos durante toda su vida.
En el caso del hombre, la enfermedad de Chagas discurre en diferentes estadios. En la fase aguda puede producirse una reacción inflamatoria local (chagoma) con hinchazón vecina de los ganglios linfáticos. Si ésta se produce en el ojo, se produce el característico signo de Romaña, una conjuntivitis con edema del párpado e inflamación pre-auricular de los ganglios linfáticos. No obstante, el signo de Romaña aparece solo raras veces (< 5%). Los síntomas inespecíficos de la enfermedad se asemejan a una infección gripal. Los síntomas desaparecen de nuevo, por lo general, de forma espontánea, a menudo en el espacio de 2 a 4 semanas. En unos pocos casos, en este estadio se produce una meningoencefalitis o miocarditis con un resultado letal.
Después sigue una fase de latencia. También aquí tiene lugar un test serológico positivo y, de vez en cuando, también una ligera parasitemia; a esta fase se la denomina también forma indeterminante o forma crónicamente indeterminante. Normalmente, esta fase discurre sin molestias, pero exámenes han demostrado aquí ya en algunos casos trastornos discretos del sistema nervioso.
El 30 a 40% de los afectados pasan entonces a un estadio crónico, el cual va acompañado de alteraciones graves en el corazón (cardiomiopatía, muerte cardíaca repentina, etc.) o en el tracto gastrointestinal (megacolon, megaesófago, etc.).
Ciertamente, la enfermedad de Chagas podría ser diagnosticada en la fase aguda, dado que la densidad de parásitos es elevada (frotis, procedimiento de concentración, procedimiento de la capa leucocitaria, etc.), pero esto no sucede, sin embargo, la mayoría de las veces, ya sea porque no se consulta al médico o no se consideran los síntomas relacionados con Chagas. Por lo tanto, la mayoría de las veces se diagnostica posteriormente de forma serológica.
Como agentes terapéuticos se dispone actualmente de dos principios activos: Benznidazol (medicamentos: Ragonil ®, Radanil ®) y Nifurtimox (medicamento: Lampit ®). Debido al perfil de efectos secundarios algo más favorable, Benznidazol es la primera elección. Sin embargo, ambos principios activos son tóxicos y deberían ser administrados al comienzo de forma estacionaria. Destruyen a los parásitos en la sangre y, por lo tanto, son particularmente exitosos en la fase aguda. Los tratamientos son de larga duración (60-90 días para Benznidazol, 90-120 días para Nifurtimox). Las ventajas y desventajas deben ser bien sopesadas por el médico tratante. Durante el embarazo no deben emplearse.
Con el fin de interrumpir el círculo de las infecciones, junto a medidas de control y prevención (mejora de las condiciones de vida, fumigaciones, exploración, etc.) deben estar disponibles también buenos kits y métodos de diagnóstico, con el fin de reconocer de manera prematura a Chagas, tratarla e impedir la propagación mediante reservorios (ser humano y animal). Los donantes de sangre y órganos deberían ser rastreados en cuanto a la enfermedad de Chagas, descubrir y tratar infecciones congénitas y reactivaciones en el caso de la inmunosupresión. Para ello, se requieren nuevos kits y métodos de diagnóstico que presenten una mejor sensibilidad y especificidad que los medios y procedimientos ya conocidos.
Además, en todos los enfoques diagnósticos es importante diferenciar T. cruzi de otros tripanosomas emparentados y, en parte, apatógenos (tales como, p. ej., T. rangeli): en virtud de la toxicidad, un tratamiento que sigue a un diagnóstico “positivo” con los principios activos arriba mencionados no es justificable en virtud de la toxicidad cuando el diagnóstico positivo se remonte erróneamente al reconocimiento de un germen apatógeno.
Hasta la fecha falta una regla de oro para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. En el estadio crónico se aplican la mayoría de las veces procedimientos serológicos. Debido a las pequeñas cantidades de gérmenes patógenos, tal como son frecuentes en el caso de una forma crónica o crónicamente indeterminada de la enfermedad de Chagas, en el estado de la técnica se describió ya la PCR para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas junto a otros métodos de diagnóstico.
En un gran estudio multicentros (A G Schijman et al (2011), International Study to Evaluate PCR Methods for Detection of Tripanosoma cruzi ADN in Blood Samples from Chagas Disease Patients, PLoS Negl Trop Dis 5 (1): e931) se testaron de manera confrontada 48 PCRs. En este caso, los autores llegaron a la conclusión de que 4 PCRs fueron declaradas las mejores. Una de ellas era la Gel-PCR(LbQ IDNA) convencional. Las otras tres eran las Sat-DNa-PCR’s LbD2-Sat-DNA-PCR, LbD3-Sat-DNA-PCR y LbF1-Sat-DNA-PCR. La mencionada en último lugar (LbF1-Sat-DNA-PCR) se denomina en lo que sigue “TCZ-PCR”.
El enfoque reseñado por Schijmann et al. fue recogido por “Y Qvarnstrom et al., (2012), Sensitive and Specific Detection of Tripanosoma cruzi DNA in Clinical Specimens using a multi-Target Real-Time PCR Approach, PLoS Negl Trop Dis 6(7): e1689): compararon un colectivo de Chagas positivo ya conocido con los resultados de los minisatélites TCZ-PCR, de la PCR de cinetoplastos guía (kADN-PCR) y una PCR de 18s-ARNr, la cual se considera como particularmente específica. A partir de los datos pueden calcularse las siguientes sensibilidades o bien especificidades:
78 % o bien 40 % para kADN-PCR;
63 % o bien 100 % para TCZ-PCR;
6 % o bien 100 % para 18s-ARNr-PCR
Los autores llegaron a la conclusión de que solo en aquellos pacientes para los que en todas las tres PCRs se producían resultados del ensayo positivos, podría establecerse un diagnóstico seguro de Chagas. Cada una de las muestras que solo proporcionó un resultado positivo en kADN-PCR y/o TCZ-PCR, se requería una exploración adicional. Sin embargo, ésta sigue siendo teoría in situ: por motivos de coste y/o como consecuencia de la ausencia de un equipo adecuado ya no se llevan a cabo etapas de diagnóstico adicionales. Con ello, en la práctica queda poco claro el diagnóstico y, por lo tanto, no se lleva a cabo una terapia.
No obstante, a partir de las investigaciones que fueron reseñadas en los documentos antes mencionados resulta que a la PCR de tiempo real (RT-PCR) se le asigna una elevada importancia.
En el documento CA 2736087 A1 se describe una sonda para la detección de Trypanosoma cruzi en muestras biológicas.
Además, siguen siendo insuficientes los procedimientos aplicados para establecer infecciones agudas o enfermedades congénitas, para el control con éxito después de una terapia, en el caso de la reactivación bajo inmunosupresión o para la detección del reservorio de gérmenes patógenos y controles de medidas, así como para el rastreo antes de trasplantes de órganos.
En el marco de la invención se examinó un colectivo de muestras que se diferencia por un número elevado de voluntarios (1009 frente a 119 - Qvarnstrom, loc. cit.), la presencia de todos los grupos de edades, la presencia de personas sanas, así como diferentes estadios de la enfermedad de Chagas (aguda, crónica, crónica-indeterminante, negativa) del colectivo de Qvarnstrom.
En el marco de experimentos propios se detectó, en particular, que la kADN-PCR conduce a numerosos resultados falsos positivos. Estos se basan predominantemente en reacciones cruzadas con Trypanosoma rangeli. En resumen, se puede decir que las PCR’s actualmente más eficientes (RT-PCR’s) son de ayuda, pero solo pueden ser empleadas como ayuda en el diagnóstico.
El motivo podría estribar - sin desear limitarse a esta interpretación - en que las (RT-) PCR’s actuales fijan como objetivo estructuras de la célula que o bien están altamente conservadas (18s-ARNr-PCR) y, con ello, son muy específicas, o se presentan en muchas copias en diferentes genomas de parásitos distintos (p. ej., también Leishmanias) (cinetoplastos-kADN-PCR) y, con ello, muestran erróneamente una elevada sensibilidad.
Otro problema son las pequeñas cantidades de gérmenes tal como son frecuentes en el caso de una forma crónica o crónicamente-indeterminada de la enfermedad de Chagas. Dificultades las ofrecen también la gran variabilidad genética de los gérmenes. También estos factores explican las dificultades para las sensibilidades y especificidades.
En el marco de la presente invención se examinaron muestras de un sector de elevada endemia en Colombia mediante un ensayo rápido o ELISA, inmunofluorescencia, así como con las PCR’s en tiempo real (RT-PCR’s) kADN-PCR, TCZ-PCR y 18s-ARNr-PCR, las cuales - como se informó arriba: Schijmann et al. Qvarnstrom et al. -pertenecen actualmente a las PCR’s más eficientes.
Para la evaluación adicional se clonaron y secuenciaron aprox. 87 productos de amplificación por kADN-PCR.
Partiendo de los resultados de secuenciación se realizó, a través de BLAST en el NCBI una asignación de los materiales aislados a los gérmenes.
Los clones para Trypanosoma cruzi se compararon entre sí y frente a los clones de Trypanosoma rangeli, así como frente a las secuencias depositadas en el Banco de Datos.
En este caso, pudo encontrarse una región en la que las secuencias de todos los Trypanosoma cruzi examinados se diferencian claramente de las secuencias de Trypanosoma rangeli.
En la Figura 1 se muestra la comparación de las secuencias de gérmenes.
La invención se refiere, por lo tanto, a oligonucleótidos (i) con la secuencia SEQ ID NO 3 o (ii) a oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 3 o (iii) a oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 3 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
cgaacccc*w ccwyc 15 SEQ ID NO 3,
en donde w representa a o t,
y representa c o t; y
* representa una inserción “c”.
Formas de realización preferidas de esta parte de la invención se reivindican en las reivindicaciones 2 a 7 dependientes y se describen en lo que sigue a modo de ejemplo.
La invención se refiere, además, a oligonucleótidos de las secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 y/o SEQ ID NO 16 de acuerdo con la siguiente descripción detallada, para uso en la amplificación de secuencias de nucleótidos de gérmenes patógenos, preferiblemente para la amplificación exclusiva de secuencias de ADN de Trypanosoma cruzi, en una mezcla de ADN de diferente procedencia, de manera particularmente preferida mediante PCR, lo más preferiblemente mediante PCR en tiempo real.
La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos de las secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 y/o SEQ ID NO 16 de acuerdo con la siguiente descripción detallada para la determinación de la presencia o ausencia de ADN de Trypanosoma cruzi en el cuerpo de un animal o ser humano, preferiblemente en el cuerpo de un insecto, de un ave de corral, de un mamífero o de un ser humano, más preferiblemente en una muestra de un tejido corporal o de un fluido corporal de un ave de corral, un mamífero o un ser humano, lo más preferiblemente en una muestra de tejido o en una muestra de sangre o en una muestra de plasma o en una muestra de suero de un ser humano.
La invención se refiere también, además, al uso de los oligonucleótidos de las secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ iD NO 15 y/o s Eq ID NO 16 de acuerdo con la siguiente descripción detallada para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en el cuerpo de un animal o ser humano, preferiblemente en el cuerpo de un insecto, de un ave de corral, de un mamífero o de un ser humano, más preferiblemente en una muestra de un tejido corporal o de un fluido corporal de un ave de corral, un mamífero o un ser humano, lo más preferiblemente en una muestra de tejido o en una muestra de sangre o en una muestra de plasma o en una muestra de suero de un ser humano.
Además, aquí se dan a conocer los siguientes oligonucleótidos: (i) oligonucleótidos de la secuencia SEQ ID NO 1 u oligonucleótidos con secuencias de nucleótidos homólogas a la anterior, o (ii) oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 1 u oligonucleótidos con secuencias de nucleótidos homólogas a la secuencia de nucleótidos complementaria; o (iii) oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 1 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
ccccwccwcc vnd 13 SEQ ID NO 1,
en donde w representa a o t;
v representa a o c o g,
d representa a o g o t; y
n representa c o g o t.
La invención se refiere también a oligonucleótidos de SEQ ID NO 2
ccccacctcc ccg 13 SEQ ID NO 2
y oligonucleótidos relacionados con los mismos, tal como se reivindica en la reivindicación 11 y se describe a modo de ejemplo en lo que sigue.
En el marco de la invención se creó, por lo tanto, una secuencia de nucleótidos específica para la región diferenciadora en el ADN de Trypanosoma cruzi de una sonda que es adecuada para un uso en la PCR en tiempo real, así como cebadores directos y cebadores inversos combinables con la misma.
Particularidades del enfoque llevado a cabo resultan de los datos experimentales y se explican allí.
En el marco de la presente invención se reivindican y se describen en el marco de formas de realización preferidas en la memoria descriptiva, oligonucleótidos que se caracterizan por las SEQ ID NOs 1 a 16 indicadas en particular de acuerdo con la lista de secuencias perteneciente a la memoria descriptiva.
Por “oligonucleótidos” se entienden en el marco de las reivindicaciones y de la presente memoria descriptiva secuencias lineales a base de hasta 40 nucleótidos unidos entre sí de forma covalente a través de puentes diéster de ácido fosfórico desde el átomo de C 3’ de un nucleótido al átomo de C 5’ del siguiente nucleótido. Habitualmente, estos se abrevian (también así en las presentes reivindicaciones y en la memoria descriptiva) con las letras en minúscula a (para adenina), c (para citosina), g para guanina y t para timina. Secuencias lineales son representadas por la yuxtaposición covalente de los distintos nucleótidos. En este caso, la secuencia de nucleótidos indicada se lee siempre en la dirección 5’ ^ 3’.
En el marco de la presente invención, los oligonucleótidos de acuerdo con la invención se entienden siempre (i) como oligonucleótidos con la secuencia SEQ ID NO indicada, o
ii) como oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO indicada; o
iii) como oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO indicada con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’.
Para los casos de secuencias de nucleótidos que son homólogas a una secuencia de nucleótidos indicada se utilizan - asimismo como es habitual - letras concretas para distintos nucleótidos homólogos que resultan en concreto particularmente de las reivindicaciones y de la siguiente memoria descriptiva. Inserciones que se manifiestan en casos individuales se caracterizan con símbolos definidos de manera particular (*, **, §, #).
La invención se describe en lo que sigue haciendo referencia a formas de realización preferidas de secuencias de nucleótidos reproducidas asimismo en la lista de secuencias. Sin embargo, la invención no se limita a las formas de realización preferidas descritas. Éstas posibilitan, en primer término, una mejor comprensión de la invención y deben servir para la ilustración a modo de ejemplo de la invención.
Oligonucleótidos de acuerdo con la invención tienen, en una forma de realización de la invención, la secuencia de nucleótidos indicada bajo SEQ ID NO 3:
cgaacccc*w ccwyc 15 SEQ ID NO 3,
en donde w representa a o t,
y representa c o t; y
* representa una inserción “c”.
Esta forma de realización de la invención comprende oligonucleótidos con la secuencia SEQ ID NO 3 indicada u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 3 indicada u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 3 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’.
En una forma de realización preferida, dado que proporciona resultados ventajosos en relación con el uso, la cual no limita sin embargo la invención, la invención se refiere a oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 14 (similar a la secuencia con la SEQ ID NO 3) u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 14 indicada u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 14 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
cgaaccccwc cwyc 14 SEQ ID NO 14,
en donde w representa a o t; e
y representa c o t.
En otra forma de realización preferida, dado que proporciona resultados ventajosos en relación con el uso, la cual no limita sin embargo la invención, la invención se refiere a oligonucleótidos que comprenden o incluso se componen de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 4 (similar a la secuencia con la SEQ ID NO 3 y la secuencia con la SEQ ID NO 14) u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 4 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 4 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’.
cgaacccc*a cctcc 15 SEQ ID NO 4,
en donde * representa una inserción “c”.
Todavía más preferida es una forma de realización de la invención con oligonucleótidos que comprenden o incluso se componen de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 10 (similar a la secuencias con la SEQ ID NO 3 y la SEQ ID NO 14 y la SEQ ID NO 4) u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 10 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 10 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
cgaaccccac ctcc 14 SEQ ID NO 10
En formas de realización alternativas, la invención se refiere a oligonucleótidos, los cuales - como se puede observar en lo que sigue - contienen secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOs 3 o 4 o 10 o 14 precedentes, pero que en su extremo 5’ y/o extremo 3’ presentan unidas otras secuencias de nucleótidos, o se refieren a oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos indicada u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos indicada con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’.
Estos oligonucleótidos comprenden las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO 5:
caaccccaat cgaacccc*w ccwyc vnd**d §nm#hwhy 38 SEQ ID NO 5,
en donde w representa a o t;
m representa a o c;
y representa c o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t;
h representa a o c o t;
n representa a o c o g o t;
* representa la inserción c;
** representa la inserción t,
§ representa la inserción g, y
# representa la inserción c.
Oligonucleótidos preferidos del grupo antes mencionado comprenden oligonucleótidos de la SEQ ID NO 15 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 15 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 15 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaacccc*a cctccccg**a §aa#attc 38 SEQ ID NO 15,
en donde * representa la inserción c;
** representa la inserción t,
§ representa la inserción g, y
# representa la inserción c.
Asimismo oligonucleótidos preferidos del grupo antes mencionado comprenden oligonucleótidos de la SEQ ID NO 11 o comprenden oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 11 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 11 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaaccccwc cwycvnddnm hwhy 34 SEQ ID NO 11
en donde w representa a o t;
m representa a o c;
y representa c o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t;
h representa a o c o t; y
n representa a o c o g o t.
Asimismo oligonucleótidos preferidos del grupo antes mencionado comprenden oligonucleótidos de la SEQ ID NO 16 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 16 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 16 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaaccccac ctccccgaaa attc 34 SEQ ID NO 16.
El grupo de oligonucleótidos de la SEQ ID NO 16 mencionado en último lugar es particularmente preferido en virtud del reconocimiento preestablecido de secuencias de gérmenes de Trypanosoma cruzi.
En formas de realización de la invención preferidas adicionales, que pueden ponerse en práctica por sí solas o con otras características de la invención y que no han de limitar la invención, la invención se refiere a oligonucleótidos de la SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 11 o SEQ ID NO 14 o SEQ ID NO 15 o SEQ ID NO 16 definidas precedentemente que presentan una o varias marcas en uno o en los dos de sus extremos 5’ y/o extremos 3’. Marcas de este tipo, las cuales pueden servir para fines determinados en el caso del posterior uso de los oligonucleótidos, son generalmente conocidas por el experto en la materia y, por lo tanto, pueden elegirse de manera correspondiente a las particularidades de marcas conocidas del estado de la técnica. En formas de realización preferidas adicionales, la una o las varias marcas son marcadores y, todavía más preferiblemente, son marcadores o extintores de la fluorescencia. A modo de ejemplo, en este punto se pueden utilizar marcadores o bien extintores de la fluorescencia conocidos, tales como FAM o BHQ1.
Oligonucleótidos de las SEQ ID NOs 3, 4, 5, 10, 11, 14, 15 y/o 16 de acuerdo con la descripción precedente pueden utilizarse, por ejemplo (sin limitación) como sondas para la PCR y sirven, de acuerdo con la invención, de manera particularmente preferida como sondas para la PCR en tiempo real, sin limitar a este uso el uso de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención.
En formas de realización de la invención preferidas adicionales, las cuales se pueden poner en práctica por sí solas o con otras características de la invención y que no han de limitar la invención, los oligonucleótidos de la SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 11 o SEQ ID NO 14 o SEQ ID NO 15 o SEQ ID NO 16 precedentemente descritos se encuentran, de acuerdo con la descripción a modo de ejemplo arriba detallada, en combinación con uno o varios de otros oligonucleótidos del grupo cebador directo y cebador inverso.
Más preferiblemente, por ejemplo oligonucleótidos de la SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 11 o SEQ ID NO 14 o SEQ ID NO 15 o SEQ ID NO 16 pueden combinarse con un cebador (1), por ejemplo en forma de oligonucleótidos de la secuencia de oligonucleótidos de la SEQ ID NO 6, o de oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 6 o de oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 6 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
gcactatatt acaccaaccc c 21 SEQ ID NO 6
y/o con un cebador (2), por ejemplo en forma de una secuencia de oligonucleótidos de la SEQ ID NO 7, o de oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 7 o de oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 7 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
catgcawctc mcccgtm 17 SEQ ID NO 7;
en donde w representa a o t; y
m representa a o c.
En una forma de realización preferida, dado que representa una buena base de reconocimiento, de combinaciones con oligonucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 7, que se puede realizar por si sola o con otras características de la invención y que no ha de limitar la invención o de oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 7 o de oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 7 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’, la secuencia de nucleótidos es una de la SEQ ID NO 12:
catgcatctc ccccgta 17 SEQ ID NO 12.
Preferiblemente, el cebador (1) es un cebador directo y/o el cebador (2) es un cebador inverso. En otra forma de realización de la invención, el cebador (2) es un cebador directo y/o el cebador (1) es un cebador inverso.
Como cebador (1) y/o cebador (2) pueden utilizarse también oligonucleótidos que contienen en su extremo 5’ y/o en su extremo 3’ unidas otras secuencias de nucleótidos, pero en cualquier caso una secuencia de oligonucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NOs 6 y/o 7 precedentes (o al menos un homólogo de las mismas):
Con ello, la invención se refiere también a combinaciones a base de oligonucleótidos de las SEQ ID NOs 4, 5, 6, 7, 10, 11 y 12 precedentemente definidas que comprenden: como cebador (1) secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO 8 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 8 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 8 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
taaccaactg gcactatatt acaccaaccc caat 34 SEQ ID NO 8
y/o que comprenden como cebador (2) secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO 9 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 9 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 9 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
vbsbnrdwwk catgcawctc mcccgtmcat tatyt*bn 38 SEQ ID NO 9
en donde s representa c o g;
w representa a o t;
r representa a o g;
y representa c o t;
k representa g o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t;
b representa c o g o t,
n representa a o c o g o t, y
* representa la inserción “s”.
En una forma de realización preferida, dado que representa una buena base de reconocimiento, de combinaciones con oligonucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 9, que se puede realizar por si sola o con otras características de la invención y que no ha de limitar la invención o de oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 9 o de oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 9 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’, la secuencia de nucleótidos es una de la SEQ ID NO 13:
ggccagaatt catgcatctc ccccgtacat tattt*ta 38 SEQ ID NO 13,
en donde * representa la inserción „s“.
Más preferiblemente, también en este caso el cebador (1) es un cebador directo y/o el cebador (2) es un cebador inverso, o el cebador (2) es un cebador directo y/o el cebador (1) es un cebador inverso.
Además, la invención, de acuerdo con otro aspecto, se refiere a oligonucleótidos de la secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 y SEQ ID NO 16, tal como se describen en detalle precedentemente, son para uso en la amplificación de secuencias de nucleótidos de gérmenes patógenos. En particular se han acreditado los oligonucleótidos de acuerdo con las SEQ ID NOs 3 a 16 precedentemente indicadas, en la amplificación exclusiva de secuencias de ADN de Trypanosoma cruzi, en una mezcla de ADN de distinta procedencia, de manera particularmente preferida mediante PRC, de acuerdo con la invención lo más preferiblemente mediante PCR en tiempo real.
Los resultados de la realización de una PCR en tiempo real con las combinaciones de acuerdo con la invención a base de cebadores (cebadores directos y cebadores inversos) con una sonda de oligonucleótidos de acuerdo con la invención (eventualmente con marcadores) de acuerdo con la descripción precedente apuntan - sin desear comprometerse a estas interpretaciones - , a que la región identificada del ADN de Trypanosoma cruzi es una característica diferencial significativa con respecto al ADN de Trypanosoma rangeli. No se observan reacciones cruzadas con respecto a Trypanosoma rangeli.
Cepas de Trypanosoma cruzi sometidas a ensayo en el marco de la invención son las cepas Trypanosoma cruzi CL Brenner (Hg 39), Trypanosoma cruzi tipo Y (Vero) y Trypanosoma cruzi Brasil (HG 39). Estas fueron detectadas en las nuevas PCR’s en tiempo real utilizando los oligonucleótidos de acuerdo con la invención. Por otra parte, no se dan reacciones cruzadas con Malaria tertiana y Malaria tropica y Leishmania brasiliensis.
Por lo tanto, la invención se refiere también al uso de los oligonucleótidos de las SEQ ID NOs 3 a 11 y 13 a 16 definidas para la determinación de la presencia o ausencia de ADN de Trypanosoma cruzi en el cuerpo de un animal o ser humano, preferiblemente en el cuerpo de un insecto, un ave de corral, un mamífero o un ser humano, más preferiblemente en una muestra de un tejido corporal o de un fluido corporal de un ave de corral, un mamífero o un ser humano, lo más preferiblemente en una muestra de tejido o una muestra de sangre o una muestra de plasma o una muestra de suero de un ser humano.
La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos de las SEQ ID NOs 3 a 11 y 13 a 16 definidas para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en el cuerpo de un animal o ser humano, preferiblemente en el cuerpo de un insecto, un ave de corral, un mamífero o un ser humano, más preferiblemente en una muestra de un tejido corporal o de un fluido corporal de un ave de corral, un mamífero o un ser humano, lo más preferiblemente en una muestra de tejido o una muestra de sangre o una muestra de plasma o una muestra de suero de un ser humano. Como se ha descrito arriba, también se dan a conocer aquí los siguientes oligonucleótidos:
(i) oligonucleótidos con la secuencia SEQ ID NO 1 u oligonucleótidos con secuencias de nucleótidos homólogas a la misma, o
ii) oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 1 u oligonucleótidos con secuencias de nucleótidos homólogas a la secuencia de nucleótidos complementaria; o
iii) oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 1 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’ u oligonucleótidos con secuencias de nucleótidos homólogas a la secuencia de nucleótidos opuesta:
ccccwccwcc vnd 13 SEQ ID NO 1,
en donde w representa a o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t; y
n representa a o c o g o t,
los cuales se adecuan para la diferenciación de la secuencia de gérmenes de Trypanosoma cruzi de secuencias de otros Trypanosoma, por ejemplo Trypanosoma rangeli.
En una forma de realización preferida, dado que representa una buena base de reconocimiento, la invención se refiere a oligonucleótidos que comprenden o que se componen de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 2, u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 2 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 2 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
ccccacctcc ccg 13 SEQ ID NO 2,
con la cual se consigue una diferenciación particularmente fiable de la secuencia de gérmenes de Trypanosoma cruzi de Trypanosoma rangeli, a diferencia de las PCR’s del estado de la técnica descritas al comienzo.
Parte experimental: Parte 1:
En el progreso de la PCR reproducido en la siguiente combinación de Tablas se sometieron a ensayo diferentes muestras de ADN de diferentes voluntarios. Todas las muestras fueron examinadas mediante serología (test rápido [Chagas Ab Rapid de Standard Diagnostics] o ELISA [Elisa doméstico del Laboratorio de Salud], inmunofluorescencia [inmunofluorescencia doméstica, Bernhard-Nocht Institut für Tropenmedizin]), kADN-PCR, TCZ-PCR, 18s-ARNr-PCR.
Las muestras designadas en la Tabla con “Cruzi”, “Rangeli” y “Homo s” se secuenciaron adicionalmente.
“Muestra Neg.” 1 - 4 son muestras de voluntarios que eran negativas en todos los exámenes serológicos y métodos de PCR.
“Tulahuen” designa dos controles positivos con dos concentraciones diferentes.
Para la PCR se utilizaron los siguientes cebadores preferidos:
Cebador 1 (Directo): (SEQ ID NO 6) gcactatatt acaccaaccc c (21 Nucleótidos)
Cebador 2 (Inverso): (SEQ ID NO 12) catgcatctc ccccgta (17 Nucleótidos)
Sonda: (SEQ ID NO 10) cgaaccccac ctcc (14 Nucleótidos)
Para la PCR se utilizó la siguiente tanda de reacción desarrollada como óptima:
10 gl de 2 x Master Mix (HotStar Taq Mastermix, razón social Qiagen)
1 gl de cebador directo 8 pmol (SeQ ID NO 6)
1 gl de cebador inverso 8 pmol (SEQ ID NO 12)
1 gl de sonda 2 pmol (SeQ ID NO 10)
2 gl de MgCl225 mmol
3 gl de agua dest.
Los 18 gl de Mix descritos se combinaron en cada caso con 2 gl del ADN extraído de la muestra a examinar.
Como control positivo se utilizó ADN de Trypanosoma tulahuen en la misma concentración.
El programa Cycler del aparato (Rotorgene, razón social Qiagen) se programó de la siguiente manera:
15 min a 95 °C; a continuación
45 ciclos durante 15 s a 95 °C y durante 60 s a 60 °C; a continuación
30 s a 402C.
Los resultados se pueden tomar de las siguientes Tablas
Tabla 1
Información del Experimento
Figure imgf000010_0001
Tabla 2
Información de Cuantificación
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
Resultados: Tabla 3
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Los valores determinados están confrontados entre sí en la Figura 2 en una gráfica.
Tal como muestran los datos precedentes, junto con la gráfica de la Figura 2, en todos los casos en los que se confirmaron ya mediante la secuenciación, secuencias de gérmenes de Trypanosoma cruzi, estos se mostraron en el intervalo CT esperado y, con ello, se detectaron de manera inequívoca. A diferencia de ello, todas las secuencias de gérmenes (relacionadas) de Trypanosoma rangelifueron negativas en el ensayo.
Parte experimental: Parte 2:
Sensibilidad, especificidad
El diagnóstico técnico de laboratorio de la enfermedad de Chagas es un reto, en la medida en que no existe regla de oro alguna. Además de ello, el diagnóstico depende del estadio de la enfermedad. Así, se pueden establecer bien formas crónicas ya con ayuda de procedimientos serológicos (test rápido, ELISA, inmunofluorescencia, etc.), pero no formas agudas, indeterminantes o congénitas, así como recidivas o el control de una terapia que ha tenido lugar. A diferencia de los procedimientos de detección serológicos indirectos, aquí se aconsejan las detecciones directas del germen, p. ej., mediante RT-PCR.
A este respecto, se han intentado y evaluado muchos enfoques (véanse las publicaciones de Schijman et al, Qvarnstrom et al y otras). A modo de ejemplo, para muchas PCRs Qvarnstrom et al representaron para tres de las PCRs líderes, sensibilidades y especificidades:
Figure imgf000015_0001
(modificado según Qvarnstrom et al, 2012)
A este respecto, es destacable el colectivo de estudio examinado (119) que se componía predominantemente de adultos con una enfermedad de Chagas conocida, la cual había sido reactivada mediante inmunosupresión (después de un trasplante de órganos, SIDA), o había sido adquirida de forma congénita o por accidentes de laboratorio. En el caso de muchas personas de este colectivo eran de esperar parasitemias elevadas. A pesar de ello, los autores llegan a la conclusión de que con estas PCRs tiene lugar ciertamente una base diagnóstica, pero no puede establecerse diagnóstico fiable alguno, a no ser que la muestra se manifestara positiva en las tres PCRs.
En el marco de un estudio en Colombia los autores de la invención estuvieron atentos al problema de la enfermedad de Chagas. Examinaron en total 1009 muestras de una zona de alta endemia en cuanto a Chagas.
De este colectivo, consistente en todas las clases de edad, personas sanas, personas enfermas de Chagas agudas, crónicas o crónicas-indeterminantes se secuenciaron aprox. 100 muestras PCR-positivas. Dado que todas las muestras TCZ y 18s-ARNr PCR positivas también eran kADN PCR positivas, se clonó y secuenció aquí el material amplificado de la kADN PCR. En 87 casos se consiguió la clonación y la secuenciación. Se encontraron 65 determinaciones secuencialmente aseguradas para Trypanosoma cruzi, 14 para Trypanosoma rangeli y 8 para Homo sapiens.
También se secuenciaron los materiales amplificados por PCR de seis muestras de las PCR nuevas desarrolladas. Todas ellas mostraron una detección positiva para T. cruzi. Una de estas muestras secuenciadas positivas era positiva solo en la nueva PCR y no fue detectada por ninguna de las otras tres PCRs.
Partiendo de estos resultados, los autores de la invención han calculado las sensibilidades y especificidades para el colectivo secuenciado para todas las PCRs en las mismas condiciones y se enumeran en la siguiente Tabla:
Figure imgf000015_0002
También se confirmaron aquí las buenas especificidades de las 18S ARNr y TCZ PCR - tal como se describió previamente por Qvarnstrom et al -. No obstante, las sensibilidades se manifestaron más bajas (muchos resultados falsos negativos). El motivo de ello podrían ser los diferentes colectivos. En el caso de reactivaciones, p. ej., las parasitemias son la mayoría de las veces elevadas, en el caso de una población media con transcursos predominantemente crónicos/crónico-indeterminantes, el número de los parásitos es sin embargo más bien bajo.
La kADN-PCR muestra una buena sensibilidad, pero se encuentra muy baja en la especificidad. Un motivo de ello son muchos resultados falsos positivos que se han de atribuir la mayoría de las veces a una reacción cruzada con T. rangeli. T. rangeli se considera como el pariente más próximo de T. cruzi, pero a diferencia de T. cruzi se considera apatógeno. La nueva PCR desarrollada muestra como únicas tanto buenas sensibilidades como especificidades. En este grupo no se clasificó como falso positivo muestra alguna y todas las negativas fueron reconocidas como correctamente negativas.
Datos de inter- e intra-ensayo
Para el inter-ensayo se utilizó el control positivo Tulahuen en una dilución de 1 : 100 y se testó en tres días diferentes en 10 muestras por cada progreso (22-24.6.15). El valor del coeficiente de variación ascendió a 1,86%.
Para el intra-ensayo se diluyeron 20 muestras del control positivo Tulahuen, en cada caso en una relación 1 : 100 y 1 : 10.000 y se evaluaron en un progreso. El valor del coeficiente de variación ascendió a 1,7% para la dilución de 1 : 100 y a 2,4% para la dilución de 1 : 10.000
Progreso de cebador-dímero
En un progreso de cebador-dímero (también denominado progreso de agua) se emplearon únicamente cebador, sonda, cloruro de magnesio, tampón y agua con el fin de reconocer interacciones de los distintos componentes del kit. Estos no se manifestaron en ninguna de las 30 muestras sometidas a ensayo.
Plásmido definido para la cuantificación
Con ayuda de un plásmido definido se estableció una curva patrón para la determinación de la cantidad de la parasitemia. Para ello, se amplificó, clonó y secuenció una muestra positiva ya conocida, al mismo tiempo se midió la concentración de plásmidos. Después de la confirmación renovada de la secuencia como T. cruzi y un resultado de medición de 1011 plásmidos / pl en la muestra pudo determinarse, a través de una serie de dilución en un enfoque triple, la curva patrón. La medición de la serie de dilución, así como el establecimiento de la curva patrón tuvieron lugar tanto para la kADN-PCR (modificada por Qvarnstrom et al) como para la nueva PCR.
A continuación, se sometieron a ensayo dos muestras positivas conocidas en etapas de dilución logarítmicas en las dos PCRs arriba mencionadas.
Como límite de detección se describieron en la publicación de Schijman et al (2011) 5 x 10-3 parásitos/ml. En los exámenes realizados por los autores de la invención, para la kADN-PCR (modificada por Qvarnstrom et al) se comprobó un límite de detección de 3 x 10-2 parásitos/ml.
La nueva PCR desarrollada tiene un límite de detección de 3 x 10-4 gérmenes/ml.
Con ello, la nueva PCR desarrollada puede detectar incluso pequeñas parasitemias, con lo cual existe la posibilidad de mejorar el diagnóstico en el caso de infecciones agudas, congénitas, crónica-indeterminantes, así como controles de éxito de la terapia, reactivaciones bajo supresión inmune, rastreo antes de trasplantes de órganos o donaciones de sangre y medidas para combatir (p. ej., control del vector/reservorio, etc.).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Oligonucleótidos
(i) con la secuencia SEQ ID NO 3 o
(ii) con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 3 o
(iii) con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 3 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
cgaacccc*w ccwyc 15 SEQ ID NO 3,
en donde w representa a o t,
y representa c o t; y
* representa una inserción “c”.
2. Oligonucleótidos según la reivindicación 1, que comprenden o se componen de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 14 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 14 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 14 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
cgaaccccwc cwyc 14 SEQ ID NO 14,
en donde w representa a o t,
y representa c o t; o
que comprenden o se componen de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 4 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 4 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 4 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’.
cgaacccc*a cctcc 15 SEQ ID NO 4,
en donde * representa una inserción “c”; preferiblemente
que comprenden o se componen de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 10 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 10 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 10 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
cgaaccccac ctcc 14 SEQ ID NO 10.
3. Oligonucleótidos según la reivindicación 1 o 2, que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 5, u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 5 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 5 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaacccc*w ccwyc vnd**d §nm#hwhy 38 SEQ ID NO 5,
en donde w representa a o t;
m representa a o c;
y representa c o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t;
h representa a o c o t;
n representa a o c o g o t;
* representa la inserción “c”;
** representa la inserción “t”,
§ representa la inserción “g”, y
* representa la inserción “c”; preferiblemente
que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 11 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 11 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 11 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaaccccwc cwycvnddnm hwhy 34 SEQ ID NO 11
en donde w representa a o t;
m representa a o c;
y representa c o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t;
h representa a o c o t;
n representa a o c o g o t; o
que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 15 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 15 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 15 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaacccc*a cctccccg**a §aa#attc 38 SEQ ID NO 15,
en donde * representa la inserción “c”;
** representa la inserción “t”,
§ representa la inserción “g”, y
# representa la inserción “c”; preferiblemente
que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 16 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 16 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 16 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
caaccccaat cgaaccccac ctccccgaaa attc 34 SEQ ID NO 16.
4. Oligonucleótidos de la SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 11 según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, que presentan una o varias marcas en uno o en los dos de sus extremos 5’ y/o extremos 3’, preferiblemente en donde la una o las varias marcas es o son marcadores, más preferiblemente, la una o las varias marcas es o son marcadores o extintores de la fluorescencia.
5. Oligonucleótidos de la SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 11 o SEQ ID NO 14 o SEQ ID NO 15 o SEQ ID NO 16 según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en combinación con uno o varios de otros oligonucleótidos del grupo cebador directo y cebador inverso.
6. Oligonucleótidos de la SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 11 o SEQ ID NO 14 o SEQ ID NO 15 o SEQ ID NO 16 según la reivindicación 5, en donde un cebador (1) comprende: una secuencia de oligonucleótidos de la SEQ ID NO 6 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 6 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 6 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’: gcactatatt acaccaaccc c 21 SEQ ID NO 6
y/o en donde un cebador (2) comprende: una secuencia de oligonucleótidos de la SEQ ID NO 7 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 7 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 7 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
catgcawctc mcccgtm 17 SEQ ID NO 7;
en donde w representa a o t; y
m representa a o c; y
comprende preferiblemente: oligonucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 12 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 12 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 12 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
catgcatctc ccccgta 17 SEQ ID NO 12;
más preferiblemente, en donde el cebador (1) es un cebador directo y/o en donde el cebador (2) es un cebador inverso; o en donde el cebador (2) es un cebador directo y/o en donde el cebador (1) es un cebador inverso.
7. Oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 5 o 6, que comprenden como cebador (1) secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO 8 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 8 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 8 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
taaccaactg gcactatatt acaccaaccc caat 34 SEQ ID NO 8
y/o que comprenden como cebador (2) secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO 9 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 9 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 9 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
vbsbnrdwwk catgcawctc mcccgtmcat tatyt*bn 38 SEQ ID NO 9
en donde s representa c o g;
w representa a o t;
r representa a o g;
y representa c o t;
k representa g o t;
v representa a o c o g;
d representa a o g o t;
b representa c o g o t;
n representa a o c o g o t; y
* representa la inserción “s”; y
que comprenden preferiblemente: oligonucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 13 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 13 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 13 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
ggccagaatt catgcatctc ccccgtacat tattt*ta 38 SEQ ID NO 13,
en donde * representa la inserción „s“;
más preferiblemente, en donde el cebador (1) es un cebador directo y/o en donde el cebador (2) es un cebador inverso, o en donde el cebador (2) es un cebador directo y/o en donde el cebador (1) es un cebador inverso.
8. Oligonucleótidos de la secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 y/o SEQ ID NO 16, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en la amplificación de secuencias de nucleótidos de gérmenes patógenos, preferiblemente para la amplificación exclusiva de secuencias de ADN de Trypanosoma cruzi, en una mezcla de ADN de distinta procedencia, de manera particularmente preferida mediante PRC, lo más preferiblemente mediante PCR en tiempo real.
9. Uso de los oligonucleótidos de las secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 y/o SEQ ID NO 16 según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, para la determinación de la presencia o ausencia de ADN de Trypanosoma cruzi en una muestra de un tejido corporal o de un fluido corporal de un ave de corral, un mamífero o un ser humano, lo más preferiblemente en una muestra de tejido o en una muestra de sangre o en una muestra de plasma o en una muestra de suero de un ser humano.
10. Uso de los oligonucleótidos de las secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 y/o SEQ ID NO 16 según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en una muestra de un tejido corporal o de un fluido corporal de un ave de corral, un mamífero o un ser humano, lo más preferiblemente en una muestra de tejido o en una muestra de sangre o en una muestra de plasma o en una muestra de suero de un ser humano.
11. Oligonucleótidos, consistentes en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 2 u oligonucleótidos con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 2 u oligonucleótidos con una secuencia de nucleótidos opuesta a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 2 con respecto a la dirección de lectura 5’ ^ 3’:
ccccacctcc ccg 13 SEQ ID NO 2.
12. Uso de un oligonucleótido según la reivindicación 11, para la diferenciación de la secuencia de gérmenes de Trypanosoma cruzi de secuencias de otros Trypanosoma, preferiblemente para la diferenciación de la secuencia de gérmenes de Trypanosoma cruzi de la secuencia de Trypanosoma rangeli.
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