ES2857702T3 - Oligonucleótidos para la reducción de la expresión de PD-L1 - Google Patents

Oligonucleótidos para la reducción de la expresión de PD-L1 Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido antisentido de fórmula CCtatttaacatcAGAC, en el que las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5- metilcitosina y todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos para la reducción de la expresión de PD-L1
Campo de la invención
La presente invención se refiere a oligonucleótidos (oligómeros) que son complementarios al ligando 1 de muerte programada (PD-L1), que dan lugar a la reducción de la expresión de PD-L1 el hígado. La presente invención también se refiere a un procedimiento para aliviar el agotamiento de los linfocitos T provocado por una infección del hígado o cáncer de hígado. Las infecciones pertinentes son las infecciones crónicas por el VHB, VHC y VHD y parasitosis como la malaria y la toxoplasmosis (por ejemplo, provocadas por protozoos de Plasmodium, en particular de las especies P. vivax, P. malariae y P. falciparum).
Antecedentes
La vía coestimuladora que consiste en el receptor de muerte programada 1 (PD-1) y su ligando, PD-L1 (o B7-H1 o CD274) es conocida por contribuir directamente al agotamiento de los linfocitos T, dando como resultado una falta de control vírico durante las infecciones crónicas del hígado. La vía PD-1 también desempeña un papel en la autoinmunidad, ya que los ratones con esta vía afectada desarrollan enfermedades autoinmunitarias.
Se ha demostrado que los anticuerpos que bloquean la interacción entre PD-1 y PD-L1 potencian las respuestas de los linfocitos T, en particular la respuesta de los linfocitos T citotóxicos CD8+ (véase Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682 y Maier et al 2007 J. Immunol Vol. 178, pág. 2714).
El documento WO2006/042237 describe un procedimiento para diagnosticar cáncer mediante la evaluación de la expresión de PD-L1 (B7-H1) en tumores y sugiere administrar un agente, que interfiera en la interacción PD-1/PD-L1, a un paciente. Los agentes interferentes pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ARNip u oligonucleótidos antisentido. No hay ejemplos específicos de dichos agentes interferentes ni hay mención alguna de infecciones crónicas del hígado.
La inhibición de PD-L1 mediada por la interferencia de ARN que usa moléculas de ARN bicatenario (ARNb, ARNi o ARNip) también se ha descrito, por ejemplo, en los documentos WO2005/007855, WO2007/084865 y US8.507.663. Ninguno de estos describe la administración dirigida al hígado.
Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 describen la administración in vivo de moléculas de ARNip dirigidas a PD-L1 a células de Kupffer, que potencian de este modo la eliminación de linfocitos T NK y CD8+ en ratones infectados por el CMVM. Este artículo llega a la conclusión de que las moléculas de ARNip dirigidas a PD-L1 que se administran a los hepatocitos no son eficaces en relación con la potenciación de la función efectora de los linfocitos T CD8+.
El enfoque de ARNip es significativamente diferente del enfoque de oligonucleótidos antisentido monocatenarios ya que la biodistribución y el modo de acción son muy diferentes. Como se describe en Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res.Comm. Vol 306, páginas 712-717, los oligonucleótidos antisentido y los ARNip tienen diferentes preferencias por los sitios diana en el ARNm.
El documento WO2016/138278 describe la inhibición de puntos de control inmunitarios, incluido el PD-L1, usando dos o más oligonucleótidos antisentido monocatenarios que están unidos en sus extremos 5'. La aplicación no menciona el VHB ni la administración dirigida al hígado.
Objetivo de la invención
La presente invención identifica novedosos oligonucleótidos y conjugados de oligonucleótidos que reducen el ARNm del PD-L1 de manera muy eficaz en las células del hígado, tanto en células parenquimatosas (por ejemplo, hepatocitos) como en células no parenquimatosas tales como las células de Kupffer y las células endoteliales sinusoidales hepáticas (CESH). Al reducir o silenciar el PD-L1, los oligonucleótidos y conjugados de oligonucleótidos disminuyen la inhibición mediada por PD-1 y, de este modo, promueven la inmunoestimulación de los linfocitos T agotados. El alivio del agotamiento de los linfocitos T en una infección patógena crónica del hígado dará como resultado la recuperación del control inmunitario y la reducción de los niveles de antígenos víricos en la sangre durante una infección patógena crónica del hígado. Los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los linfocitos T citolóticos naturales (NKT) también se pueden activar por los oligonucleótidos y conjugados de oligonucleótidos de la presente invención.
Los conjugados de oligonucleótidos aseguran la reducción local de PD-L1 en las células del hígado y, por lo tanto, reducen el riesgo de efectos secundarios autoinmunitarios, tales como neumonitis, hepatitis no vírica y colitis asociada con la disminución sistémica del PD-L1.
Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención es un oligonucleótido antisentido de fórmula CCtatttaacatcAGAC, en el que las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metilcitosina y todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
En otro aspecto, la presente invención es un conjugado de oligonucleótidos antisentido que comprende el oligonucleótido de la presente invención y un resto de conjugado unido covalentemente a dicho oligonucleótido.
En otro aspecto, la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de la presente invención o el conjugado de oligonucleótidos antisentido de la presente invención y un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención es un procedimiento in vitro para modular la expresión de PD-L1 en una célula diana que está expresando el PD-L1, comprendiendo dicho procedimiento administrar el oligonucleótido antisentido de la presente invención, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de la presente invención o la composición farmacéutica de una cualquiera de la presente invención en una cantidad eficaz a dicha célula.
En otro aspecto, la presente invención es el oligonucleótido antisentido de la presente invención, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el restablecimiento de la respuesta inmunitaria contra un virus.
En otro aspecto, la presente invención es el oligonucleótido antisentido de la presente invención, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el restablecimiento de la respuesta inmunitaria contra un parásito.
En otro aspecto, la presente invención es el oligonucleótido antisentido de la presente invención, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso como medicamento.
En otro aspecto, la presente invención es el oligonucleótido antisentido de la presente invención, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el tratamiento de la infección por el VHB.
La presente invención se refiere a oligonucleótidos o conjugados de los mismos dirigidos a un ácido nucleico capaz de modular la expresión de PD-L1 y de tratar o prevenir enfermedades relacionadas con el funcionamiento del PD-L1. Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos se pueden usar, en particular, para tratar enfermedades en las que se ha agotado la respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso.
En consecuencia, en el presente documento se describen oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de complementariedad con un ácido nucleico diana de PD-L1. El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido antisentido, preferentemente con un diseño de gapmero. Preferentemente, el oligonucleótido es capaz de inhibir la expresión de PD-L1 mediante escisión de un ácido nucleico diana. La escisión se logra preferentemente mediante el reclutamiento de nucleasas.
En otro aspecto, el oligonucleótido de la presente invención se conjuga con al menos un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína, tal como un resto de conjugado que comprende al menos un resto de N-acetilgalactosamina (GalNAc). El resto de conjugación y el oligonucleótido se pueden unir mediante un conector, en particular un conector bioescindible.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la invención y diluyentes, vehículos, sales y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
En el presente documento se describen procedimientos para un procedimiento in vivo o in vitro para la reducción de la expresión de PD-L1 en una célula diana que esté expresando PD-L1, mediante la administración de un oligonucleótido o una composición de la invención en una cantidad eficaz a dicha célula.
En otro aspecto, la invención proporciona oligonucleótidos, conjugados de oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso en el restablecimiento de la inmunidad contra un virus o un parásito.
En otro aspecto, la invención proporciona oligonucleótidos, conjugados de oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso como un medicamento.
En el presente documento se describen procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o disfunción mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del oligonucleótido de la invención a un sujeto que padece o es susceptible a la enfermedad, trastorno o disfunción, en particular enfermedades seleccionadas de infecciones hepáticas víricas o parasitosis.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido, los conjugados de oligonucleótidos o la composición farmacéutica de la invención se usa en el tratamiento o prevención de infecciones hepáticas víricas como las causadas por el VHB, el VHC y el VHD, o de las parasitosis como la malaria, la toxoplasmosis, la leishmaniosis y la tripanosomiasis, o del cáncer de hígado o las metástasis en el hígado.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Ilustra conjugados de oligonucleótidos antisentido ejemplares, en los que el oligonucleótido se representa como una línea ondulada (A-D) o bien como "oligonucleótido" (E-H) o como T2 (I) y los restos de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína son restos trivalentes de N-acetilgalactosamina. Los compuestos A a D comprenden una molécula ramificadora de di-lisina, un espaciador de PEG3 y tres restos de carbohidrato de GalNAc terminal. En el compuesto A y B, el oligonucleótido se une directamente al resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína sin un conector. En el compuesto C y D, el oligonucleótido se une directamente al resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína por medio de un conector C6. Los compuestos E-1 comprenden una molécula ramificadora triple y espaciadores de longitud y estructura variables y tres restos de carbohidrato de GalNAc terminal.
Figura 2: Gráfico que muestra la atenuación de CE50 (A) y PD-L1 como % de solución salina (B) para los compuestos sometidos a prueba en el ejemplo 2, en relación con su posición en el ácido nucleico diana. Las líneas celulares en la que se sometió a prueba el compuesto son THP1 (•) y Karpas (-*-).
Figura 3: Fórmula estructural del clúster de GalNAc trivalente (GN2). GN2 es útil como resto de conjugación en la presente invención. La línea ondulada ilustra el sitio de conjugación del clúster con, por ejemplo, un conector amino C6 o directamente con el oligonucleótido.
Figura 4: Fórmula estructural de CMP ID NO766_2.
Figura 5: Fórmula estructural de CMP ID NO767_2.
Figura 6: Fórmula estructural de CMP ID NO768_2.
Figura 7: Fórmula estructural de CMP ID NO769_2.
Figura 8: Fórmula estructural de CMP ID NO770_2.
Figura 9: Inmunoelectrotransferencia que detecta la expresión de la proteína PD-L1 en el hígado de animales inducidos con poli(IC) después del tratamiento con solución salina y los CMP ID NO indicados. Cada transferencia muestra un oligonucleótido no conjugado frente a una versión conjugada con GalNAc del mismo oligonucleótido, transferencia A) CMP ID NO 744_1 y 755_2, B) CMP ID NO 747_1 y 758_2, C) CMP ID NO 748_1 y 759_2, D) CMP ID NO 752_1 y 763_2 y E) CMP ID NO 753_1 y 764_2. La banda superior es el control de carga de vinculina, la banda inferior es la proteína PD-L1. El primer carril en cada transferencia muestra ratones tratados con solución salina sin inducción con poli(IC). Estos ratones expresan muy poca proteína PD-L.
Figura 10: Población de células mononucleares en el hígado después del tratamiento con • vehículo (grupo 10 y 1), ♦ vacuna de ADN (grupo 11 y 2), o anticuerpo anti-PD-LI (grupo 12), ▲ vacuna de PD-L1 ASO no conjugado ADN (grupo 7) o vacuna de PD-L1 ASO conjugado con A GalNAc ADN (grupo 8), para cada grupo se representan los animales individuales y el promedio está indicado por la línea vertical para cada grupo (véase la tabla 18). Se ha evaluado la significación estadística entre el grupo de la vacuna de ADN y los tres grupos de tratamiento y, si está presente, se indica con * entre los grupos (* = p <0,05,*** = p <0,001 y**** = p <0,0001). A) Representa el número de linfocitos T en el hígado después del tratamiento. B) Representa la fracción de linfocitos T c D4+ y C) representa la fracción de linfocitos T CD8+.
Figura 11: Modulación de las células positivas para PD-L1 en el hígado después del tratamiento con • vehículo (grupo 10 y 1), ♦ vacuna de ADN (grupo 11 y 2), o anticuerpo anti-PD-L1 (grupo 12), ▲ vacuna de PD-L1 ASO no conjugado ADN (grupo 7) o vacuna de PD-L1 ASO conjugado con A GalNAc ADN (grupo 8), para cada grupo se representan los animales individuales y el promedio está indicado por la línea vertical para cada grupo (véase la tabla 19). Se ha evaluado la significación estadística entre el grupo de la vacuna de ADN y los tres grupos de tratamiento y, si está presente, se indica con * entre los grupos (* = p <0,05 y **** = p <0,0001). A) Representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ que expresan PD-L1 en el hígado después del tratamiento. B) Representa el porcentaje de linfocitos T CD4+ que expresan PD-L1 en el hígado después del tratamiento y C) representa el porcentaje de linfocitos B que expresan PD-L1 en el hígado después del tratamiento.
Figura 12: Células secretoras de citocinas CD8+ específicas del antígeno del VHB en el hígado después del tratamiento con • vehículo (grupo 10 y 1), ♦ vacuna de ADN (grupo 11 y 2), o anticuerpo anti-PD-LI (grupo 12), ▲ vacuna de PD-L1 ASO no conjugado ADN (grupo 7) o vacuna de PD-L1 ASO conjugado con A GalNAc ADN (grupo 8), para cada grupo se representan los animales individuales y el promedio está indicado por la línea vertical para cada grupo (véase la tabla 20). Se ha evaluado la significación estadística entre el grupo de la vacuna de ADN y los tres grupos de tratamiento y, si está presente, se indica con * entre los grupos (* = p <0,05). A) Representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ secretores de IFN-y en el hígado que son específicos del antígeno PreS2+S del VHB después del tratamiento. B) Representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ secretores de IFN-y en el hígado que son específicos del antígeno central del VHB después del tratamiento y C) representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ secretores de IFN-y y TNF-a en el hígado que son específicos del antígeno PreS2+S del VHB después del tratamiento.
Figura 13: ADN del VHB, HBsAg y HBeAg en ratones VAA/VHB después del tratamiento con el antisentido de PD-L1 conjugado con GalNAc CMP NO: 759_2 (▼) en comparación con el vehículo (■). La línea vertical indica el final del tratamiento.
Definiciones
Oligonucleótido
El término "oligonucleótido", como se usa en el presente documento, se define como lo entiende en general el experto en la técnica, como una molécula que comprende dos o más nucleósidos unidos covalentemente. Dichos nucleósidos unidos covalentemente también se pueden denominar moléculas de ácido nucleico u oligómeros. Los oligonucleótidos se preparan normalmente en el laboratorio mediante síntesis química en fase sólida seguida de purificación. Cuando se hace referencia a una secuencia del oligonucleótido, se hace referencia a la secuencia u orden de los restos de nucleobases, o modificaciones de los mismos, de los nucleótidos o nucleósidos unidos covalentemente. El oligonucleótido de la invención es artificial, y se sintetiza químicamente, y típicamente se purifica o se aísla. El oligonucleótido de la invención puede comprender uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados.
Oligonucleótidos antisentido
El término "oligonucleótido antisentido" como se usa en el presente documento se define como oligonucleótidos capaces de modular la expresión de un gen diana hibridando con un ácido nucleico diana, en particular con una secuencia contigua en un ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos antisentido no son esencialmente bicatenarios y, por lo tanto, no son ARNip. Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son monocatenarios.
Secuencia de nucleótidos contigua
El término "secuencia de nucleótidos contigua" se refiere a la región del oligonucleótido que es complementaria al ácido nucleico diana. El término se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "secuencia de nucleobases contigua" y el término "secuencia de motivos oligonucleotídicos". En algunos modos de realización, todos los nucleótidos del oligonucleótido constituyen la secuencia de nucleótidos contigua. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende la secuencia de nucleótidos contigua y puede comprender opcionalmente otro(s) nucleótido(s), por ejemplo, una región conectora de nucleótidos que se puede usar para unir un grupo funcional a la secuencia de nucleótidos contigua. La región conectora de nucleótidos puede ser o no complementaria al ácido nucleico diana.
Nucleótidos
Los nucleótidos son los componentes básicos de los oligonucleótidos y polinucleótidos y, para los fines de la presente invención, se incluyen nucleótidos tanto naturales como no naturales. En la naturaleza, los nucleótidos, tales como los nucleótidos de ADN y ARN, comprenden un resto glucídico de ribosa, un resto de nucleobase y uno o más grupos fosfato (que están ausentes en los nucleósidos). Los nucleósidos y nucleótidos también se pueden denominar de manera intercambiable "unidades" o "monómeros".
Nucleósido modificado
El término "nucleósido modificado" o "modificación de nucleósido" como se usa en el presente documento se refiere a nucleósidos modificados en comparación con el nucleósido de ADN o ARN equivalente mediante la introducción de una o más modificaciones del resto glucícido o el resto de (nucleo)base. El nucleósido modificado comprende un resto glucídico modificado. El término nucleósido modificado también se puede usar en el presente documento de manera intercambiable con el término "análogo nucleosídico" o "unidades" modificadas o "monómeros" modificados.
Enlaces internucleosídicos modificados
El término "enlace internucleosídico modificado" se define como lo entiende en general el experto en la técnica como enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster (PO), que acopla covalentemente dos nucleósidos conjuntamente. Los nucleótidos con enlace internucleosídico modificado también se denominan "nucleótidos modificados". En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico modificado aumenta la resistencia a nucleasa del oligonucleótido en comparación con un enlace fosfodiéster. Para los oligonucleótidos naturales, el enlace internucleosídico incluye grupos fosfato que crean un enlace fosfodiéster entre nucleósidos contiguos. Los enlaces internucleosídicos modificados son útiles en particular en la estabilización de los oligonucleótidos para su uso in vivo, y pueden servir para proteger contra la escisión de nucleasas en regiones de nucleósidos de ADN o ARN en el oligonucleótido de la invención, por ejemplo dentro de la región gap de un oligonucleótido gapmero, así como en regiones de nucleósidos modificados.
En un modo de realización, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados del fosfodiéster natural a un enlace que es, por ejemplo, más resistente al ataque de nucleasas. La resistencia a nucleasas se puede determinar incubando el oligonucleótido en suero sanguíneo o usando un ensayo de resistencia a nucleasas (por ejemplo, fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD)), ambos son bien conocidos en la técnica. Los enlaces internucleosídicos que son capaces de potenciar la resistencia a nucleasas de un oligonucleótido se denominan enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasas. En algunos modos de realización, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, se modifican, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, se modifican. En algunos modos de realización, se modifican todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo. Se reconocerá que, en algunos modos de realización, los nucleósidos que unen el oligonucleótido de la invención a un grupo funcional no nucleotídico, tal como un conjugado, pueden ser fosfodiéster. En algunos modos de realización, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasas.
Los enlaces internucleosídicos modificados se pueden seleccionar del grupo que comprende fosforotioato, difosforotioato y boranofosfato. En algunos modos de realización, los enlaces internucleosídicos modificados son compatibles con el reclutamiento de la RNasaH del oligonucleótido de la invención, por ejemplo fosforotioato, difosforotioato o boranofosfato.
En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico comprende azufre (S), tal como un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Un enlace internucleosídico de fosforotioato es útil en particular debido a la resistencia a las nucleasas, la farmacocinética beneficiosa y la facilidad de fabricación. En algunos modos de realización, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son fosforotioato, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son fosforotioato. En algunos modos de realización, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son fosforotioato.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos neutros, en particular un enlace internucleosídico seleccionado de fosfotriéster, metilfosfonato, MMI, amida-3, formacetal o tioformacetal.
En el documento WO2009/124238 se divulgan otros enlaces internucleosídicos. En un modo de realización, el enlace internucleosídico se selecciona de los conectores divulgados en el documento WO2007/031091. En particular, el enlace intemudeosídico se puede seleccionar de -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(0,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O -PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -N R h-P(O)2-O-, - n r h-c o -o -, - n r h-c o -NRH-, y/o el conector internucleosídico se puede seleccionar del grupo que consiste en: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -N R h-CO-CH2-, -O-CH 2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRh-CH2-, -CH 2-NRhCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-0 -, -S-CH 2-CH2-S-, -CH 2-SO2-CH2-, -CH 2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH 2-NCH3-O-CH2-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4.
Los enlaces resistentes a nucleasas, tales como los enlaces de fosfotioato, son útiles en particular en las regiones de oligonucleótidos capaces de reclutar nucleasas cuando forman un dúplex con el ácido nucleico diana, tal como la región G para gapmeros, o la región de nucleósidos no modificada de los oligómeros de cabeza (headmers) y los oligómeros de cola (tailmers). Sin embargo, los enlaces de fosforotioato también pueden ser útiles en regiones que no reclutan nucleasas y/o regiones potenciadoras de la afinidad tales como las regiones F y F' para gapmeros, o la región de nucleósidos modificada de oligómeros de cabeza y oligómeros de cola.
Sin embargo, cada una de las regiones de diseño puede comprender enlaces internucleosídicos distintos de fosforotioato, tales como enlaces fosfodiéster, en particular en regiones donde los nucleósidos modificados, tales como LNA, protegen el enlace contra la degradación por nucleasas. La inclusión de enlaces fosfodiéster, tales como uno o dos enlaces, en particular entre o adyacentes a unidades de nucleósidos modificados (típicamente en las regiones que no reclutan nucleasas) puede modificar la biodisponibilidad y/o biodistribución de un oligonucleótido - véase el documento WO2008/113832.
Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Preferentemente, todos los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces fosforotioato.
Nucleobase
El término nucleobase incluye el resto purina (por ejemplo, adenina y guanina) y pirimidina (por ejemplo, uracilo, timina y citosina) presentes en nucleósidos y nucleótidos que forman enlaces de hidrógeno en la hibridación de ácidos nucleicos. En el contexto de la presente invención, el término nucleobase también engloba nucleobases modificadas que pueden diferir de las nucleobases naturales, pero que son funcionales durante la hibridación de ácidos nucleicos. En este contexto, "nucleobase" se refiere tanto a nucleobases naturales tales como adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo, xantina e hipoxantina, como a variantes no naturales. Dichas variantes se describen, por ejemplo, en Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 página 2055 y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1.
En algunos modos de realización, el resto de nucleobase se modifica cambiando la purina o pirimidina a una purina o pirimidina modificada, tal como purina sustituida o pirimidina sustituida, tal como un nucleobasado seleccionado de isocitosina, pseudoisocitosina, 5-metil citosina, 5-tiozolo-citosina., 5-propinil-citosina, 5-propinil-uracilo, 5-bromouracilo 5-tiazolo-uracilo, 2-tio-uracilo, 2'tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
Los restos de nucleobase se pueden indicar mediante el código de letra para cada nucleobase correspondiente, por ejemplo, A, T, G, C o U, en el que cada letra puede incluir opcionalmente nucleobases modificadas de función equivalente. Por ejemplo, en los oligonucleótidos ejemplificados, los restos de nucleobase se seleccionan de A, T, G, C y 5-metil citosina. Opcionalmente, para los gapmeros de LNA, se pueden usar nucleósidos de LNA de 5-metilcitosina.
Oligonucleótido modificado
El término oligonucleótido modificado describe un oligonucleótido que comprende uno o más nucleósidos modificados con glúcidos y/o enlaces internucleosídicos modificados. El término "oligonucleótido quimérico" es un término que se ha usado en la literatura para describir oligonucleótidos con nucleósidos modificados.
Complementariedad
El término "complementariedad" describe la capacidad de emparejamiento de bases de Watson-Crick de nucleósidos/nucleótidos. Los pares de bases de Watson-Crick son guanina (G)-citosina (C) y adenina (A) - timina (T)/uracilo (U). Se entenderá que los oligonucleótidos pueden comprender nucleósidos con nucleobases modificadas, por ejemplo, la 5-metil citosina se usa a menudo en lugar de citosina y, como tal, el término complementariedad engloba el emparejamiento de bases de Watson Crick entre nucleobases no modificadas y modificadas (véase, por ejemplo, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 página 2055 y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1).
El término "% complementario", como se usa en el presente documento, se refiere al número de nucleótidos en porcentaje de una secuencia de nucleótidos contigua en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) que, en una posición dada, son complementarios a (es decir, forman pares de bases de Watson Crick con) una secuencia de nucleótidos contigua, en una posición dada de una molécula de ácido nucleico separada (por ejemplo, el ácido nucleico diana). El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que forman pares entre las dos secuencias (cuando se alinean con la secuencia diana 5'-3' y la secuencia de oligonucleótidos de 3'-5'), dividiendo entre el número total de nucleótidos en el oligonucleótido y multiplicando por 100. En dicha comparación, una nucleobase/nucleótido que no se alinea (forma un par de bases) se denomina emparejamiento erróneo.
El término "completamente complementario" se refiere a una complementariedad de un 100 %.
El siguiente es un ejemplo de un oligonucleótido (SEQ ID NO: 5) que es completamente complementario al ácido nucleico diana (SEQ ID NO: 772).
5'gcagtagagccaatta3' (SEQIDNO:772)
3'cgtcatctcggttaat5' (SEQIDNO:5)
Identidad
El término "identidad", como se usa en el presente documento, se refiere al número de nucleótidos en porcentaje de una secuencia de nucleótidos contigua en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) que, en una posición dada, son idénticos a (es decir, en su capacidad para formar pares de bases de Watson Crick con el nucleósido complementario) una secuencia de nucleótidos contigua, en una posición dada de una molécula de ácido nucleico separada (por ejemplo, el ácido nucleico diana). El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que son idénticas entre las dos secuencias, incluyendo los huecos, dividiendo entre el número total de nucleótidos en el oligonucleótido y multiplicando por 100. Porcentaje de identidad = (coincidencias x 100)/Longitud de la región alineada (con huecos).
Hibridación
El término "hibridar" o "hibrida" como se usa en el presente documento se debe entender como dos cadenas de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido y un ácido nucleico diana) que forman enlaces de hidrógeno entre pares de bases en cadenas opuestas formando de este modo un dúplex. La afinidad de la unión entre dos cadenas de ácido nucleico es la fuerza de la hibridación. A menudo se describe en términos de la temperatura de fusión (Tm) definida como la temperatura a la que la mitad de los oligonucleótidos forman un dúplex con el ácido nucleico diana. En condiciones fisiológicas, la Tm no es estrictamente proporcional a la afinidad (Mergny y Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). La energía libre de Gibbs en estado estándar AG° es una representación más precisa de la afinidad de unión y está relacionada con la constante de disociación (Kd) de la reacción por AG°=-RTIn(Kd), donde R es la constante de gas y T es la temperatura absoluta. Por lo tanto, una AG° muy baja de la reacción entre un oligonucleótido y el ácido nucleico diana refleja una fuerte hibridación entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. La AG° es la energía asociada con una reacción donde las concentraciones acuosas son 1 M, el pH es 7 y la temperatura es 37 °C. La hibridación de oligonucleótidos con un ácido nucleico diana es una reacción espontánea y para reacciones espontáneas AG° es menor que cero. La AG° se puede medir experimentalmente, por ejemplo, mediante el uso del procedimiento de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) como se describe en Hansen et al., 1965, Chem. Comm.
36-38 y Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. El experto en la técnica sabrá que hay equipo comercial disponible para mediciones de la AG°. La AG° también se puede estimar numéricamente usando el modelo de vecino más cercano como lo describe SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sei USA. 95: 1460-1465 usando parámetros termodinámicos derivados apropiadamente descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 y McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Para tener la posibilidad de modular su ácido nucleico diana pretendido por hibridación, los oligonucleótidos de la presente invención hibridan con un ácido nucleico diana con valores estimados de AG° por debajo de -10 kcal para oligonucleótidos que tienen una longitud de 10-30 nucleótidos. En algunos modos de realización, el grado o la fuerza de hibridación se mide mediante la energía libre de Gibbs en estado estándar AG°. Los oligonucleótidos pueden hibridar con un ácido nucleico diana con valores estimados de AG° por debajo del intervalo de -10 kcal, tal como por debajo de -15 kcal, tal como por debajo de -20 kcal y tal como por debajo de -25 kcal para oligonucleótidos que tienen una longitud de 8-30 nucleótidos. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos hibridan con un ácido nucleico diana con un valor estimado de AG° de -10 a -60 kcal, tal como de -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal o de -16 a -27 kcal, tal como de -18 a -25 kcal.
Ácido nucleico diana
De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico que codifica PD-L1 de mamífero y puede ser, por ejemplo, un gen, un ARN, un ARNm y un preARNm, un ARNm maduro o una secuencia de ADNc. Por lo tanto, la diana se puede denominar ácido nucleico diana de PD-L1. El oligonucleótido como se describe en el presente documento se puede, por ejemplo, dirigir a regiones de exones de un PD-L1 de mamífero, o se puede, por ejemplo, dirigir a una región de intrones en el pre-ARNm de PD-L1 (véase la tabla 1).
Tabla 1: Exones e intrones de PD-L1 humano
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De forma adecuada, el ácido nucleico diana codifica una proteína PD-L1, en particular PD-L1 de mamífero, tal como PD-L1 humana (véase, por ejemplo, las tablas 2 y 3, que proporcionan referencia a las secuencias de ARNm y preARNm para PD-L1 de humano, mono y ratón). En el contexto de la presente invención, el preARNm también se considera un ácido nucleico que codifica una proteína.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y 3 o variantes naturales del mismo (por ejemplo, secuencias que codifican una proteína PD-L1 de mamífero).
Si se emplea el oligonucleótido de la invención en investigación o diagnóstico, el ácido nucleico diana puede ser un ADNc o un ácido nucleico sintético derivado de ADN o ARN.
Para la aplicación in vivo o in vitro, el oligonucleótido de la invención es típicamente capaz de inhibir la expresión del ácido nucleico diana de PD-L1 en una célula que expresa el ácido nucleico diana de PD-L1. La secuencia contigua de nucleobases del oligonucleótido de la invención es típicamente complementaria al ácido nucleico diana de PD-L1, como se mide a lo largo de la longitud del oligonucleótido, opcionalmente con la excepción de uno o dos emparejamientos erróneos, y opcionalmente excluyendo las regiones conectoras basadas en nucleótidos que pueden unir el oligonucleótido con un grupo funcional opcional tal como un conjugado, u otros nucleótidos terminales no complementarios (por ejemplo, región D' o D”). El ácido nucleico diana, en algunos modos de reali zación, puede ser un ARN o ADN, tal como un ARN mensajero, tal como un ARNm maduro o un preARNm. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un ARN o ADN que codifica la proteína PD-L1 de mamífero, como PD-L1 humana, por ejemplo, la secuencia de preARNm de PD-L1 humana, tal como la divulgada como SEQ ID NO 1 o la secuencia de ARNm humano con el número de referencia de NCBI NM 014143. En las tablas 2 y 3 se proporciona más información sobre ácidos nucleicos diana ejemplares.
Tabla 2: Información sobre genoma y ensamblaje para PD-L1 en diversas especies.
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Fwd = hebra directa. Las coordenadas del genoma proporcionan la secuencia de pre-ARNm (secuencia genómica). La referencia de NCBI proporciona la secuencia de ARNm (secuencia de ADNc).
*La base de datos de secuencias de referencia del Centro Nacional de Información Biotecnológica es un conjunto exhaustivo, integrado, no redundante y bien anotado de secuencias de referencia que incluyen genómica, transcrito y proteína. Está alojado en www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.
Tabla 3: Detalles de la secuencia de PD-L1 en las diversas especies.
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Secuencia diana
El término "secuencia diana" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos presente en el ácido nucleico diana que comprende la secuencia de nucleobases que es complementaria al oligonucleótido de la invención. En algunos modos de realización, la secuencia diana consiste en una región del ácido nucleico diana que es complementaria a la secuencia de nucleótidos contigua del oligonucleótido de la invención. En algunos modos de realización, la secuencia diana es más larga que la secuencia complementaria a un único oligonucleótido y puede, por ejemplo, representar una región preferente del ácido nucleico diana al que se pueden dirigir varios oligonucleótidos de la invención.
La secuencia diana puede ser una subsecuencia del ácido nucleico diana.
En algunos modos de realización, la subsecuencia es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en a1-a149 (véase las tablas 4). En algunos modos de realización, la subsecuencia es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en un exón de ARNm de PD-L1 humano, tal como un exón de ARNm humano de PD-L1 seleccionado del grupo que consiste en e1, e2, e3, e4, e5, e6 y e7 (véase la tabla 1 anterior).
En algunos modos de realización, la subsecuencia es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en un intrón de ARNm de PD-L1 humano, tal como un intrón de ARNm humano de PD-L1 seleccionado del grupo que consiste en i1, i2, i3, i4, i5 e i6 (véase la tabla 1 anterior).
El oligonucleótido como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria a o se hibrida con el ácido nucleico diana, tal como una subsecuencia del ácido nucleico diana, tal como una secuencia diana descrita en el presente documento.
El oligonucleótido como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos contigua de al menos 8 nucleótidos que es complementaria a o se hibrida con una secuencia diana presente en la molécula de ácido nucleico diana. La secuencia de nucleótidos contigua (y, por lo tanto, la secuencia diana) comprende al menos 8 nucleótidos contiguos, tal como 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23., 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos contiguos, tal como de 12-25, tal como de 14-18 nucleótidos contiguos.
Célula diana
El término "célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a una célula que está expresando el ácido nucleico diana. Como se describe en el presente documento, la célula diana puede ser in vivo o in vitro. En algunos modos de realización, la célula diana es una célula de mamífero, tal como una célula de roedor, tal como una célula de ratón o una célula de rata, o una célula de primate, tal como una célula de mono o una célula de humano.
En modos de realización preferentes, la célula diana expresa ARNm de PD-L1, tal como preARNm de PD-L1 o ARNm maduro de PD-L1. La cola de poli(A) del ARNm de PD-L1 se descarta típicamente para dirigirse a oligonucleótidos antisentido.
Variante natural
El término "variante natural" se refiere a variantes o transcritos del gen PD-L1 que se originan en los mismos locus genéticos que el ácido nucleico diana, pero que pueden diferir, por ejemplo, en virtud de la degeneración del código genético, lo que provoca una multiplicidad de codones que codifican el mismo aminoácido, o debido a un corte y empalme alternativo del preARNm, o la presencia de polimorfismos, tales como polimorfismos de nucleótido único y variantes alélicas. En base a la presencia de la secuencia complementaria suficiente al oligonucleótido, el oligonucleótido de la invención se puede dirigir, por lo tanto, al ácido nucleico diana y las variantes naturales del mismo.
En algunos modos de realización, las variantes naturales tienen al menos un 95 %, tal como al menos un 98 % o al menos un 99 %, de homología con un ácido nucleico diana de PD-L1 de mamífero, tal como un ácido nucleico diana seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO 1, 2 y 3.
Son conocidos numerosos polimorfismos de nucleótido único en el gen PD-L1, por ejemplo, los divulgados en la siguiente tabla (la secuencia de inicio/referencia de preARNm humano es SEQ ID No 2)
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Modulación de la expresión
El término "modulación de la expresión" como se usa en el presente documento se debe entender como un término general para la capacidad de un oligonucleótido para alterar la cantidad de PD-L1 en comparación con la cantidad de PD-L1 antes de la administración del oligonucleótido. De forma alternativa, la modulación de la expresión se puede determinar por referencia a un experimento de control. Se entiende, en general, que el control es un individuo o una célula diana tratada con una composición salina o un individuo o una célula diana tratada con un oligonucleótido no dirigido (simulado). Sin embargo, también puede ser un individuo tratado con el tratamiento de referencia.
Un tipo de modulación es la capacidad de un oligonucleótido para inhibir, regular por disminución, reducir, suprimir, eliminar, detener, bloquear, evitar, disminuir, bajar, impedir o terminar la expresión de PD-L1, por ejemplo, mediante degradación de ARNm o bloqueo de la transcripción. Otro tipo de modulación es la capacidad de un oligonucleótido para restablecer, aumentar o potenciar la expresión de PD-L1, por ejemplo, mediante la reparación de sitios de empalme o la prevención del empalme o la eliminación o bloqueo de mecanismos inhibidores tal como la represión de microARN.
Nucleósidos modificados de alta afinidad
Un nucleósido modificado de alta afinidad es un nucleótido modificado que, cuando se incorpora en el oligonucleótido, potencia la afinidad del oligonucleótido por su diana complementaria, por ejemplo como se mide por la temperatura de fusión (Tm). Un nucleósido modificado de alta afinidad de la presente invención preferentemente da como resultado un aumento en la temperatura de fusión entre 0,5 y 12 °C, más preferentemente entre 1,5 y 10 °C y lo más preferentemente entre 3 y 8 °C por nucleósido modificado. Son conocidos en la técnica numerosos nucleósidos modificados de alta afinidad e incluyen, por ejemplo, muchos nucleósidos sustituidos en 2' así como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (véase, por ejemplo, Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Modificaciones de glúcidos
El oligómero de la invención puede comprender uno o más nucleósidos que tienen un resto glucídico modificado, es decir, una modificación del resto glucídico en comparación con el resto glucídico de ribosa que se encuentra en el ADN y el ARN.
Se han elaborado numerosos nucleósidos con modificación del resto glucídico de ribosa, principalmente con el objetivo de mejorar determinadas propiedades de los oligonucleótidos, tales como la afinidad y/o la resistencia a las nucleasas.
Dichas modificaciones incluyen aquellas donde se modifica la estructura del anillo de ribosa, por ejemplo, por reemplazo con un anillo de hexosa (HNA) o un anillo bicíclico, que típicamente tienen un puente birradical entre los carbonos C2 y C4 en el anillo de ribosa (LNA), o un anillo de ribosa no enlazado que típicamente carece de un enlace entre los carbonos C2 y C3 (por ejemplo, UNA). Otros nucleósidos modificados en el glúcido incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de biciclohexosa (documento WO2011/017521) o ácidos nucleicos tricíclicos (documento WO2013/154798). Los nucleósidos modificados también incluyen nucleósidos donde el resto glucídico se reemplaza con un resto no glucídico, por ejemplo, en el caso de ácidos peptidonucleicos (APN), o ácidos morfolinonucleicos.
Las modificaciones de glúcidos también incluyen modificaciones realizadas por medio de la alteración de los grupos sustituyentes en el anillo de ribosa a grupos distintos de hidrógeno, o el grupo 2'-OH que se encuentra naturalmente en los nucleósidos de ADN y ARN. Los sustituyentes se pueden introducir, por ejemplo, en las posiciones 2', 3', 4' o 5'. Los nucleósidos con restos glucídicos modificados también incluyen nucleósidos modificados en 2', tales como nucleósidos sustituidos en 2'. De hecho, se ha prestado mucha atención al desarrollo de nucleósidos sustituidos en 2' y se ha descubierto que numerosos nucleósidos sustituidos en 2' tienen propiedades beneficiosas cuando se incorporan en oligonucleótidos, tales como una resistencia potenciada de los nucleósidos y una afinidad potenciada.
Nucleósidos modificados en 2’.
Un nucleósido modificado en el glúcido en 2' es un nucleósido que tiene un sustituyente distinto de H o -OH en la posición 2' (nucleósido sustituido en 2') o comprende un birradical enlazado en 2', e incluye nucleósidos sustituidos en 2' y nucleósidos de LNA (puente birradical en 2' - 4'). Por ejemplo, el glúcido modificado en 2' puede proporcionar una afinidad de unión potenciada y/o una resistencia incrementada de las nucleasas al oligonucleótido. Ejemplos de nucleósidos modificados sustituidos en 2' son 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino- ADN, 2'-fluoro-ARN y nucleósido 2'-F-ANA. Para otros ejemplos, véase, por ejemplo, Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, y Deleavey y Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. A continuación se presentan ilustraciones de algunos nucleósidos modificados sustituidos en 2'.
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Nucleósidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
Los nucleósidos de LNA son nucleósidos modificados que comprenden un grupo conector (denominado birradical o puente) entre C2' y C4' del anillo glucídico de ribosa de un nucleótido. Estos nucleósidos también se denominan ácido nucleico con puente o ácido nucleico bicíclico (BNA) en la literatura.
Como se describe en el presente documento, el nucleósido modificado o los nucleósidos de LNA del oligómero de la invención tienen una estructura general de fórmula I o II:
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en la que W se selecciona de -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-, tal como, en algunos modos de realización -O-;
B designa una nucleobase o un resto de nucleobase modificado;
Z designa un enlace internucleosídico a un nucleósido contiguo, o un grupo terminal 5';
Z* designa un enlace internucleosídico a un nucleósido contiguo, o un grupo terminal 3';
X designa un grupo seleccionado de la lista que consiste en -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -S i(Ra)2-, -S -, -SO 2-, -N(Ra)- y >C=Z
En algunos modos de realización, X se selecciona del grupo que consiste en: -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH 2-, CRaRb, -C(=CH2 )- y -C(=CRaRb)-En algunos modos de realización, X es -O -Y designa un grupo seleccionado del grupo que consiste en -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -S i(Ra)2-, -S -, -SO 2-, -N(Ra)- y >C=Z
En algunos modos de realización, Y se selecciona del grupo que consiste en: -C H 2-, -C(RaRb)-, -CH 2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH 2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- y -C(Ra)=N-En algunos modos de realización, Y se selecciona del grupo que consiste en: -CH 2-, -CHRa-, -CHCH3-, CRaRbo -X-Y- conjuntamente designan un grupo conector bivalente (también denominado radical) conjuntamente designan un grupo conector bivalente que consiste en 1, 2, 3 o 4 grupos/átomos seleccionados del grupo que consiste en -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -S i(Ra)2-, -S-, -SO 2-, -N(Ra)- y >C=Z,
En algunos modos de realización, -X-Y- designa un birradical seleccionado del grupo que consiste en: -X-CH 2-, -X -CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH 2-O-CH2 , -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2 )-CH2-, -NR a-CH2-, N-O-CH2 , -S-CRaRb- y -S -CHRa-.
En algunos modos de realización -O-CH 2- o -O-CH(CH3 )-.
en la que Z se selecciona -O-, -S - y -N(Ra)-,
y Ra y, cuando está presente Rb, cada uno se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-6 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, alcoxialquilo C2-6, alqueniloxi C2-6, carboxi, alcoxicarbonilo C1-6, alquilcarbonilo C1-6, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C1-6)amino, carbamoilo, mono- y di(alquilo C1-6)-aminocarbonilo, amino-alquilo C1-6-aminocarbonilo, mono- y di(alquilo C1-6) amino-alquilo C1-6-aminocarbonilo, alquilo C1-6-aminocarbonilo, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, donde arilo y heteroarilo puede estar opcionalmente sustituidos y donde dos sustituyentes geminales Ra y Rb conjuntamente pueden designar metileno opcionalmente sustituido (=CH2 ), en el que para todos los centros quirales, se pueden encontrar grupos asimétrticos en orientación R o S.
en la que R1, R2, R3, R5 y R5* se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-6 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi Ci-6, alcoxialquilo C2-6, alqueniloxi C2-6, carboxi, alcoxicarbonilo C1-6, alquilcarbonilo C1-6, formilo, arilo, ariloxicarbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C1-6)amino, carbamoilo, mono- y di(alquilo C1-6)-aminocarbonilo, amino-alquilo C1-6-aminocarbonilo, mono- y di(alquilo C1-6) amino-alquilo C1-6-aminocarbonilo, alquilo C1-6-aminocarbonilo, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, donde arilo y heteroarilo puede estar opcionalmente sustituidos y donde dos sustituyentes geminales conjuntamente pueden designar oxo, tioxo, imino o metileno opcionalmente sustituido.
En algunos modos de realización, R1, R2, R3, R5 y R5* se seleccionan independientemente de alquilo C1-6, tal como metilo, e hidrógeno.
En algunos modos de realización, R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno.
En algunos modos de realización, R1, R2, R3 son todos hidrógeno, y R5 y R5* también es hidrógeno y el otro de R5 y R5* es distinto de hidrógeno, tal como alquilo C1-6 tal como metilo.
En algunos modos de realización, Ra es hidrógeno o bien metilo. En algunos modos de realización, cuando está presente, Rb es hidrógeno o bien metilo.
En algunos modos de realización, uno o ambos de Ra y Rb es hidrógeno
En algunos modos de realización, uno de Ra y Rb es hidrógeno y el otro es distinto de hidrógeno
En algunos modos de realización, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno
En algunos modos de realización, tanto Ra como Rb son metilo.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA se divulgan en los documentos WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 y WO2004/046160 e incluyen lo que se conoce comúnmente como nucleósidos de beta-D-oxi LNA y alfa-L-oxi LNA.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -S-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de tio LNA se divulgan en los documentos WO99/014226 y WO2004/046160.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -IMH-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de amino LNA se divulgan en los documentos WO99/014226 y WO2004/046160.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CH2-CH2- o -O-CH 2-CH2-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA se divulgan en el documento WO00/047599 y en Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1273-76 e incluyen lo que se conoce comúnmente como ácidos nucleicos con puente de 2'-O-4'C-etileno (ENA).
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CH 2-, W es O, y todos de R1, R2, R3 y uno de R5 y R5* son hidrógeno, y el otro de R5 y R5* es distinto de hidrógeno, tal como alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA sustituidos en 5' se divulgan en el documento WO2007/134181.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CRaRb-, en el que uno o ambos de Ra y Rb son distintos de hidrógeno, tal como metilo, W es O, y todos de R1, R2, R3, y uno de R5 y R5* son hidrógeno, y el otro de R5 y R5* es distinto de hidrógeno, tal como alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA bis modificados se divulgan en el documento WO2010/077578.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- designa el grupo conector bivalente -O-CH(CH2OCH3)-(ácido nucleico bicíclico 2'O-metoxietil - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) págs. 1569-81). En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- designa el grupo conector bivalente -O-CH(CH2OCH3) -(ácido nucleico bicíclico 2'O-etil - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) págs. 1569-81). En algunos modos de realización, el birradical -X-Y-es -O-CHRa-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA sustituidos en 6' se divulgan en los documentos WO10036698 y WO07090071.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CH(CH2OCH3)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como MOE cíclicos en la técnica (cMOE) y se divulgan en el documento WO07090071.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- designa el grupo conector bivalente -O-CH(CH3)-. - en la configuración R- o bien S-. En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- conjuntamente designan el grupo conector bivalente -O-CH 2-O-CH2-(Seth et al., 2010, J. Org. Chem). En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CH(CH3)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA de 6' metilo también son conocidos como nucleósidos de cET en la técnica y pueden ser estereoisómeros (S)cET o bien (R)cET, como se divulga en los documentos WO07090071 (beta-D) y WO2010/036698 (alfa-L).
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -O-CRaRb-, en el que en ni Ra ni Rb es hidrógeno, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización, Ra y Rb son ambos metilo. Dichos nucleósidos de LNA disustituidos en 6' se divulgan en el documento WO2009006478.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -S-CHRa-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA tiosustituidos en 6' se divulgan en el documento WO11156202. En algunos modos de realización de LNA tiosustituido en 6', Ra es metilo.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -C(=CH2)-C(RaRb)-, tal como -C(=CH2 )-CH2-, o - C(=CH2)-CH(CH3)-W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA de vinilo carbono se divulgan en los documentos WO08154401 y WO09067647.
En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -N(-ORa)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6 tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como LNA N sustituidos y se divulgan en el documento WO2008/150729. En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- conjuntamente designa el grupo conector bivalente -O-NRa-CH3- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem). En algunos modos de realización, el birradical -X-Y- es -N(Ra)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6 tal como metilo.
En algunos modos de realización, uno o ambos de R5 y R5* es hidrógeno y, cuando está sustituido, el otro de R5 y R5* es alquilo C1-6 tal como metilo. En dicho modo de realización, R1, R2, R3 pueden ser todos hidrógeno, y el birradical -X-Y- se puede seleccionar de -O-CH2- o -OC(HCRa)-, tal como -O-C(HCH3)-.
En algunos modos de realización, el birradical es -C R aRb-O-CRaRb-, tal como CH2-O-CH2-, W es O y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6 tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como nucleótidos conformacionalmente restringidos (CRN) y se divulgan en el documento WO2013036868. En algunos modos de realización, el birradical es -O-CRaRb-O-CRaRb-, tal como O-CH2-O-CH2-, W es O y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6 tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como nucleótidos COC y se divulgan en Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 200937(4), 1225-1238.
En el esquema 1 se presentan algunos ejemplos de nucleósidos de LNA.
Esquema 1
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Como se ilustra en los ejemplos, en algunos modos de realización de la invención los nucleósidos de LNA en los oligonucleótidos son nucleósidos de beta-D-oxi-LNA.
Degradación mediada por nucleasas
La degradación mediada por nucleasas se refiere a un oligonucleótido capaz de mediar la degradación de una secuencia de nucleótidos complementaria cuando forma un dúplex con dicha secuencia.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido puede funcionar por medio de la degradación mediada por nucleasas del ácido nucleico diana, donde los oligonucleótidos de la invención son capaces de reclutar una nucleasa, en particular y endonucleasa, preferentemente endorribonucleasa (RNasa), como RNasa H. Ejemplos de diseños de oligonucleótidos que operan por medio de mecanismos mediados por nucleasas son oligonucleótidos que típicamente comprenden una región de al menos 5 o 6 nucleósidos de ADN y están flanqueados en un lateral o en ambos laterales por nucleósidos potenciadores de la afinidad, por ejemplo gapmeros, oligómeros de cabeza y oligómeros de cola. Actividad y reclutamiento de RNase H
La actividad de RNasa H de un oligonucleótido antisentido se refiere a su capacidad para reclutar RNasa H cuando está en un dúplex con una molécula de ARN complementario. El documento WO01/23613 proporciona procedimientos in vitro para determinar la actividad de RNasaH, que se pueden usar para determinar la capacidad para reclutar RNasaH. Típicamente, se considera que un oligonucleótido es capaz de reclutar RNasa H si, cuando se le proporciona una secuencia de ácido nucleico diana complementario, tiene una tasa inicial, medida en pmol/l/min, de al menos un 5 %, tal como al menos un 10 % o más que un 20 % de la tasa inicial determinada cuando se usa un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de bases que el oligonucleótido modificado que se está sometiendo a prueba, pero que contiene solo monómeros de ADN con enlaces de fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleótido, y usando la metodología proporcionada por el ejemplo 91-95 del documento WO01/23613.
Gapmero
El término gapmero como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido antisentido que comprende una región de oligonucleótidos que reclutan RNasa H (hueco) que está flanqueada en 5' y 3' por regione s que comprenden uno o más nucleósidos modificados que potencian la afinidad (flancos o alas). En el presente documento se describen diversos diseños de gapmeros y se caracterizan por su capacidad para reclutar RNasa H. Los oligómeros de cabeza y los oligómeros de cola son oligonucleótidos capaces de reclutar RNasa H donde falta uno de los flancos, es decir, solo uno de los extremos del oligonucleótido comprende nucleósidos modificados que potencian la afinidad. Para los oligómeros de cabeza falta el flanco en 3' (es decir, el flanco en 5' comprende nucleósidos modificados que potencian la afinidad) y para los oligómeros de cola falta el flanco en 5' (es decir, el flanco en 3' comprende nucleósidos modificados que potencian la afinidad).
Gapmero de LNA
El término gapmero de LNA es un oligonucleótido gapmero en el que al menos uno de los nucleósidos modificados que potencian la afinidad es un nucleósido de LNA.
Gapmero con alas mixtas
El término gapmero con alas mixta o gapmero con flancos mixtos se refiere a un gapmero de LNA en el que al menos una de las regiones del flanco comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido modificado distinto de LNA, tal como al menos un nucleósido modificado sustituido en 2', tal como, por ejemplo, nucleósido(s) de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-Fluoro-ARN y 2-F-ANA. Como se describe en el presente documento, el gapmero con alas mixta tiene un flanco que comprende solo nucleósidos de LNA (por ejemplo, 5' o 3') y el otro flanco (3' o 5', respectivamente) comprende nucleósidos modificados sustituidos en 2' y opcionalmente nucleósidos de LNA.
Interruptor de huecos
El término "oligonucleótido interruptor de huecos" se usa en relación con un gapmero capaz de mantener el reclutamiento de RNasa H aunque la región de hueco se interrumpa por un nucleósido que no reclute RNasa H (un nucleósido interruptor de huecos, E) de modo que la región de hueco comprenda menos de 5 nucleósidos de ADN consecutivos. Los nucleósidos que no reclutan RNasa H son, por ejemplo, nucleósidos en la conformación endo 3', tal como los LNA, donde el puente entre C2' y C4' del anillo glucídico de ribosa de un nucleósido está en la conformación beta, tal como beta-D-oxi LNA o nucleósido ScET. La capacidad del oligonucleótido interruptor de huecos para reclutar RNasa H es típicamente específica de secuencia o incluso de compuesto específico - véase Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 págs. 8476-8487, que divulga oligonucleótidos "interruptores de huecos" que reclutan RNasaH que en algunos casos proporcionan una escisión más específica del ARN diana.
El oligonucleótido de la invención descrito en el presente documento puede ser un oligonucleótido interruptor de huecos. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido interruptor de huecos puede comprender un flanco en 5' (F), un hueco (G) y un flanco en 3' (F'), en el que el hueco se interrumpe por un nucleósido que no recluta RNasaH (un nucleósido interruptor de huecos, E) de modo que el hueco contenga al menos 3 o 4 nucleósidos de ADN consecutivos. Como se describe en el presente documento, el nucleósido interruptor de huecos (E) puede ser un nucleósido de LNA donde el puente entre C2' y C4' del anillo glucídico de ribosa de un nucleósido está en la conformación beta y se coloca dentro de la región de hueco de modo que el nucleósido de LNA interruptor de huecos esté flanqueado en 5' y 3' por al menos 3 (5') y 3 (3') o al menos 3 (5') y 4 (3') o al menos 4 (5') y 3 (3') nucleósidos de ADN, y en el que el oligonucleótido es capaz de reclutar RNasaH.
El oligonucleótido interruptor de huecos se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
F-G-E-G-F'; en particular F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
D'-F-G-F', en particular D'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
F-G-F'-D”, en particular F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D”1-3
D'-F-G-F'-D”, en particular D'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D”1-3
Donde la región D' y D" son como se describe en la sección "Diseño de gapmeros".
Como se describe en el presente documento, el nucleósido interruptor de huecos (E) es un beta-D-oxi LNA o ScET u otros nucleósidos beta-LNA mostrados en el esquema 1).
Conjugado
El término conjugado como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido que está unido covalentemente a un resto no nucleotídico (resto de conjugado o región C o tercera región), también denominado conjugado de oligonucleótidos.
La conjugación de los oligonucleótidos de la invención con uno o más restos no nucleotídicos puede mejorar la farmacología del oligonucleótido, por ejemplo, afectando a la actividad, distribución celular, captación celular o estabilidad del oligonucleótido. En algunos modos de realización, el resto de conjugado dirige el oligonucleótido al hígado. Al mismo tiempo, el conjugado sirve para reducir la actividad del oligonucleótido en tipos de células, tejidos u órganos no diana, por ejemplo, actividad colateral o actividad en tipos de células, tejidos u órganos no diana. En un modo de realización de la invención, el conjugado de oligonucleótidos de la invención muestra una inhibición mejorada de PD-L1 en la célula diana en comparación con un oligonucleótido no conjugado. En otro modo de realización, el conjugado de oligonucleótidos de la invención tiene una distribución celular mejorada entre el hígado y otros órganos, tales como el bazo o el riñón (es decir, más oligonucleótidos conjugados van al hígado que al bazo o al riñón) en comparación con un oligonucleótido no conjugado. En otro modo de realización, el conjugado de oligonucleótidos de la invención muestra una captación celular mejorada en el hígado del oligonucleótido del conjugado en comparación con un oligonucleótido no conjugado.
Los documentos WO93/07883 y WO2013/033230 proporcionan restos de conjugados adecuados. Otros restos de conjugados adecuados son aquellos capaces de unirse al receptor para la asialoglicoproteína (ASGPr). En particular, los restos de conjugados de N-acetilgalactosamina trivalentes son adecuados para su unión al ASGPr; véase, por ejemplo, los documentos WO2014/076196, WO2014/207232 y WO2014/179620. El resto de conjugado es esencialmente la parte de los conjugados de oligonucleótidos antisentido que no está compuesta de ácidos nucleicos.
Los conjugados de oligonucleótidos y su síntesis también se han informado en revisiones exhaustivas de Manoharan en Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Cap. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 y Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
En un modo de realización, el resto no nucleotídico (resto de conjugado) se selecciona del grupo que consiste en carbohidratos, ligandos de receptores de superficie celular, sustancias farmacéuticas, hormonas, sustancias lipófilas, polímeros, proteínas, péptidos, toxinas (por ejemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas víricas (por ejemplo, cápsides) o combinaciones de los mismos.
Conectores
Un enlace o conector es una conexión entre dos átomos que enlaza un grupo químico o segmento de interés con otro grupo químico o segmento de interés por medio de uno o más enlaces covalentes. Se pueden unir restos de conjugados al oligonucleótido directamente o a través un resto enlazador (por ejemplo, conector o amarre). Los conectores sirven para conectar covalentemente una tercera región, por ejemplo, un resto de conjugado (Región C), a una primera región, por ejemplo, un oligonucleótido o secuencia de nucleótidos contigua complementaria al ácido nucleico diana (región A).
En algunos modos de realización de la invención, el conjugado o conjugado de oligonucleótidos de la invención puede comprender, opcionalmente, una región conectora (segunda región o región B y/o región Y) que se sitúa entre el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua complementaria al ácido nucleico diana (región A o primera región) y el resto de conjugado (región C o tercera región).
La región B se refiere a conectores bioescindibles que comprenden o consisten en un enlace fisiológicamente lábil que se puede escindir en las condiciones normalmente encontradas o análogas a las encontradas dentro del cuerpo de un mamífero. Las condiciones en las cuales los conectores fisiológicamente lábiles experimentan una transformación química (por ejemplo, escisión) incluyen condiciones químicas tales como pH, temperatura, condiciones o agentes oxidantes o reductores, y concentración de sal encontrada o análoga a las encontradas en células de mamífero. Las afecciones intracelulares de mamíferos también incluyen la presencia de la actividad enzimática normalmente presente en una célula de mamífero tal como de enzimas proteolíticas o enzimas hidrolíticas o nucleasas. En un modo de realización, el conector bioescindible es susceptible de escisión por la nucleasa S1. En un modo de realización preferente, el conector susceptible a nucleasas comprende entre 1 y 10 nucleósidos, tales como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleósidos, más preferentemente entre 2 y 6 nucleósidos y lo más preferentemente entre 2 y 4 nucleósidos enlazados que comprenden al menos dos enlaces fosfodiéster consecutivos, tales como al menos 3 o 4 o 5 enlaces fosfodiéster consecutivos. Preferentemente, los nucleósidos son ADN o ARN. Los conectores bioescindibles que contienen fosfodiéster se describen con más detalle en el documento WO2014/076195.
La región Y se refiere a conectores que no son necesariamente bioescindibles sino que sirven principalmente para conectar covalentemente un resto de conjugado (región C o tercera región), a un oligonucleótido o secuencia de nucleótidos contigua complementaria al ácido nucleico diana (región A o primera región). Los conectores de la región Y pueden comprender una estructura de cadena o un oligómero de unidades repetidas tales como etilenglicol, unidades de aminoácidos o grupos aminoalquilo. Los conjugados de oligonucleótidos de la presente invención se pueden construir con los siguientes elementos regionales A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C o A-Y-C. En algunos modos de realización, el conector (región Y) es un amino alquilo, tal como un grupo amino alquilo C2-C36, que incluye, por ejemplo, grupos amino alquilo C6 a C12. En un modo de realización preferente, el conector (región Y) es un grupo amino alquilo C6.
Tratamiento
El término "tratamiento" como se usa en el presente documento se refiere tanto al tratamiento de una enfermedad existente (por ejemplo, una enfermedad o trastorno como al que se hace referencia en el presente documento), como a la prevención de una enfermedad, es decir, profilaxis. Por lo tanto, se reconocerá que el tratamiento como al que se hace referencia en el presente documento puede, en algunos modos de realización, ser profiláctico.
Restablecimiento de la respuesta inmunitaria frente a patógenos.
La respuesta inmunitaria se divide en respuesta inmunitaria innata y adaptativa. El sistema inmunitario innato proporciona una respuesta inmediata, pero no específica. La respuesta inmunitaria adaptativa es activada por una respuesta inmunitaria innata y es altamente específica para un patógeno en particular. Tras la presentación de un antígeno derivado de un patógeno en la superficie de las células presentadoras de antígeno, las células inmunitarias de la respuesta inmunitaria adaptativa (es decir, los linfocitos T y B) se activan a través de sus receptores específicos de antígenos, lo que da lugar a una respuesta inmunitaria patógena específica y al desarrollo de una memoria inmunológica. Las infecciones víricas crónicas, tales como las causadas por el v Hb y el VHC, se asocian con el agotamiento de los linfocitos T caracterizado por la falta de respuesta de los linfocitos T específicos del virus. El agotamiento de los linfocitos T está bien estudiado; para una revisión, véase, por ejemplo, Yi et al 2010 lmmunology129, 474-481. Las infecciones víricas crónicas también se asocian con una función reducida de los linfocitos NK que son células inmunitarias innatas. Potenciar la respuesta inmunitaria vírica es importante para la eliminación de la infección crónica. El restablecimiento de la respuesta inmunitaria frente a patógenos, mediada por linfocitos T y linfocitos NK, se puede evaluar mediante la medición de la proliferación, la secreción de citocinas y la función citolítica (Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 y ejemplo 6 en el presente documento).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al uso de oligonucleótidos antisentido y conjugados de los mismos y composiciones farmacéuticas que los comprenden para restablecer la respuesta inmunitaria frente a patógenos que han infectado a un animal, en particular a un ser humano. Los conjugados de oligonucleótidos antisentido de la presente invención son útiles en particular contra patógenos que han infectado el hígado, en particular infecciones hepáticas crónicas como la causada por el VHB. Los conjugados permiten la distribución dirigida de los oligonucleótidos y evitan la atenuación sistémica del ácido nucleico diana.
Los oligonucleótidos de la invención
La invención se refiere a oligonucleótidos capaces de modular la expresión de PD-L1. La modulación se puede lograr mediante hibridación con un ácido nucleico diana que codifica PD-L1 o que está implicado en la regulación de PD-L1. El ácido nucleico diana puede ser una secuencia de PD-L1 de mamífero, tal como una secuencia seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3. El ácido nucleico diana puede ser un preARNm, un ARNm o cualquier secuencia de ARN expresada a partir de una célula de mamífero que soporta la expresión o regulación de PD-L1.
El oligonucleótido de la invención es un oligonucleótido antisentido que se dirige a PD-L1.
En un aspecto de la invención, el oligonucleótido de la invención se conjuga con un resto de conjugado, en particular un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido antisentido de la invención es capaz de modular la expresión de la diana inhibiéndola o regulándola por disminución. Preferentemente, dicha modulación produce una inhibición de la expresión de al menos un 20 % en comparación con el nivel de expresión normal de la diana, más preferentemente al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de inhibición en comparación con el nivel de expresión normal de la diana. Preferentemente, dicha modulación produce una inhibición de la expresión de al menos un 20 % en comparación con el nivel de expresión cuando la célula u organismo es objeto de provocación por un agente infeccioso, o se trata con un agente que simula la provocación por un agente infeccioso (por ejemplo, poli I:C o LPS), más preferentemente al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de inhibición en comparación con el nivel de expresión cuando la célula u organismo es objeto de provocación por un agente infeccioso o se trata con un agente que simula la provocación por un agente infeccioso (por ejemplo, poli I:C o LPS). En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención puede ser capaz de inhibir los niveles de expresión de ARNm de PD-L1 en al menos un 60 % o un 70 % in vitro usando células kA r PAS-299 o THP1. En algunos modos de realización, los compuestos de la invención pueden ser capaces de inhibir los niveles de expresión de la proteína PD-L1 en al menos un 50 % in vitro usando células KARPAS-299 o THP1. De forma adecuada, los ejemplos proporcionan ensayos que se pueden usar para medir el ARN de PD-L1 (por ejemplo, ejemplo 1). La modulación de la diana se desencadena por la hibridación entre una secuencia de nucleótidos contigua del oligonucleótido y el ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención comprende emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. A pesar de los emparejamientos erróneos, la hibridación con el ácido nucleico diana todavía puede ser suficiente para mostrar una modulación deseada de la expresión de PD-L1. La afinidad de unión reducida resultante de los emparejamientos erróneos se puede compensar de forma ventajosa mediante un número incrementado de nucleótidos en el oligonucleótido y/o un número incrementado de nucleósidos modificados capaces de incrementar la afinidad de unión a la diana, tales como los nucleósidos modificados en 2', incluido el LNA, presentes dentro de la secuencia de oligonucleótidos.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido antisentido de la invención es capaz de restablecer linfocitos T específicos de patógenos. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención es capaz de incrementa los linfocitos T específicos de patógenos en al menos un 40 %, 50 %, 60 % o 70 % en comparación con los controles no tratados o los controles tratados con el tratamiento de referencia. En un modo de realización, el oligonucleótido antisentido o conjugado de la invención es capaz de incrementar los linfocitos T específicas del VHB cuando se compara con controles no tratados o controles tratados con el tratamiento de referencia. De forma adecuada, los ejemplos proporcionan ensayos que se pueden usar para medir los linfocitos T específicos del VHB (por ejemplo, proliferación de linfocitos T, secreción de citocinas y actividad citolítica). En otro modo de realización, el oligonucleótido antisentido o conjugado de la invención es capaz de incrementar los linfocitos T específicas del VHC cuando se compara con controles no tratados o controles tratados con el tratamiento de referencia. En otro modo de realización, el oligonucleótido antisentido o conjugado de la invención es capaz de incrementar los linfocitos T específicas del VHD cuando se compara con controles no tratados o controles tratados con el tratamiento de referencia.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido antisentido de la invención es capaz de reducir los niveles de HBsAg en un animal o un ser humano. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención es capaz de reducir los niveles de HBsAg en al menos un 40 %, 50 %, 60 % o 70 %, más preferentemente en al menos un 80 %, 90 % o 95 % en comparación con el nivel anterior al tratamiento. Lo más preferentemente, los oligonucleótidos de la invención son capaces de lograr la seroconversión del HBsAg en un animal o un humano infectado por el VHB.
En el presente documento se describe un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de complementariedad con un ácido nucleico diana de PD-L1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia contigua que es al menos un 90 % complementaria, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, o un 100 % complementaria con una región del ácido nucleico diana.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, es completamente complementario (100 % complementario) a una región del ácido nucleico diana, o en algunos modos de realización puede comprender uno o dos emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de complementariedad, tal como completamente (o un 100 %) complementaria, con una región de ácido nucleico diana de la región presente en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Como se describe en el presente documento, la secuencia de oligonucleótidos es un 100 % complementaria a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Como se describe en el presente documento, la secuencia de oligonucleótidos es un 100 % complementaria a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de complementariedad, tal como un 100 % de complementariedad, con una región de ácido nucleico diana correspondiente en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana seleccionado del grupo que consiste en la posición 371-3068, 5467-12107 y 15317-19511 en la SEQ ID NO: 1. Como se describe en el presente documento, la subsecuencia del ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la posición 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881-19494 y 1881-19494 en la SEQ ID NO: 1. Como se describe en el presente documento, la subsecuencia del ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la posición 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 y 15690-15735 en la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de complementariedad, tal como un 100 % de complementariedad, con una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, en la que la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la región a1 a a449 en la tabla 4.
Tabla 4: Regiones de la SEQ ID NO 1 contra las que es posible dirigirse usando oligonucleótidos como se describe en el presente documento
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Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región del ácido nucleico diana, en el que la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 y a438.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región del ácido nucleico diana, en el que la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en a160, a180, a221, a269 y a360.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención comprende o consiste en 8 a 35 nucleótidos de longitud, tales como de 9 a 30, tales como de 10 a 22, tales como de 11 a 20, tales como de 12 a 18, tales como de 13 a 17 o de 14 a 16 nucleótidos contiguos de longitud. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende o consiste en 16 a 20 nucleótidos de longitud. Se debe entender que cualquier intervalo dado en el presente documento incluye los puntos finales del intervalo. En consecuencia, si se dice que un oligonucleótido incluye de 10 a 30 nucleótidos, se incluyen tanto 10 como 30 nucleótidos.
Como se describe en el presente documento, la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende o consiste en 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la tabla 5.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 a 743 (véase las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 5).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 a 743 y 771.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601.619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 y 735.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 287.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 342.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 640.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 466.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 566.
Como se describe en el presente documento, donde el oligonucleótido es más largo que la secuencia de nucleótidos contigua (que es complementaria al ácido nucleico diana), las secuencias de motivos en la tabla 5 forman la parte de la secuencia de nucleótidos contigua de los oligonucleótidos antisentido de la invención. Como se describe en el presente documento, la secuencia del oligonucleótido es equivalente a la secuencia de nucleótidos contigua (por ejemplo, si no se añaden conectores bioescindibles).
Se entiende que las secuencias de nucleobases contiguas (secuencia de motivos) se pueden modificar para, por ejemplo, incrementar la resistencia a las nucleasas y/o la afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Las modificaciones se describen en las definiciones y en la sección "Diseño de oligonucleótidos". La tabla 5 enumera los diseños preferentes de cada secuencia de motivos.
Diseño de oligonucleótidos
El diseño de oligonucleótidos se refiere al patrón de modificaciones con glúcidos de los nucleósidos en la secuencia de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos como se describen en el presente documento comprenden nucleósidos modificados con glúcidos y también pueden comprender nucleósidos de ADN o ARN. En algunos modos de realización, el oligonucleótido descrito en el presente documento comprende nucleósidos modificados con glúcidos y nucleósidos de ADN. La incorporación de nucleósidos modificados en el oligonucleótido descrito en el presente documento puede potenciar la afinidad del oligonucleótido por el ácido nucleico diana. En ese caso, los nucleósidos modificados se pueden denominar nucleótidos modificados potenciadores de la afinidad, los nucleósidos modificados también se pueden denominar unidades.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende al menos 1 nucleósido modificado, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende de 1 a 10 nucleósidos modificados, tales como de 2 a 8 nucleósidos modificados, tales como de 3 a 7 nucleósidos modificados, tales como de 4 a 6 nucleósidos modificados, tales como 3, 4, 5, 6 o 7 nucleósidos modificados.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados con glúcidos, tales como nucleósidos modificados con glúcidos en 2'. Preferentemente, el oligonucleótido descrito en el presente documento comprende uno o más nucleósidos modificados con glúcidos en 2' seleccionados independientemente del grupo que consiste en nucleósidos de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabinonucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y LNA. Incluso más preferentemente, el uno o más nucleósidos modificados es un ácido nucleico bloqueado (LNA).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado. Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos dentro de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleósidos fosforotioato o boranofosfato. En algunos modos de realización, todos los enlaces internucleotídicos en la secuencia contigua del oligonucleótido son enlaces fosforotioato.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención comprende al menos un nucleósido de LNA, tales como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleósidos de LNA, tales como de 2 a 6 nucleósidos de LNA, tales como de 3 a 7 nucleósidos LNA, de 4 a 6 nucleósidos de LNA o 3, 4, 5, 6 o 7 nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, al menos un 75 % de los nucleósidos modificados en el oligonucleótido son nucleósidos de LNA, tal como un 80 %, tal como un 85 %, tal como un 90 % de los nucleósidos modificados son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en el oligonucleótido son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA como uno o más de los siguientes nucleósidos de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA y/o ENA en las configuraciones beta-D o bien alfa-L o combinaciones de las mismas. En otro modo de realización, todas las unidades de citosina del LNA son 5-metil-citosina. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua tiene al menos 1 nucleósido de LNA en el extremo 5' y al menos 2 nucleósidos de LNA en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención comprende al menos un nucleósido modificado que es un nucleósido de 2'-MOE-ARN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleósidos de 2'-MOE-ARN. Como se describe en el presente documento, al menos uno de dichos nucleósidos modificados es 2' -fluoro ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleósidos de 2'-fluoro-ADN.
El oligonucleótido como se describe en el presente documento comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido modificado sustituido en 2'.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende tanto nucleósidos modificados con glúcidos en 2' como unidades de ADN. Preferentemente, el oligonucleótido comprende nucleósidos (unidades) tanto de LNA como de ADN. Preferentemente, el total combinado de unidades de ADN y LNA es 8-30, tal como 10-25, preferentemente 12-22, tal como 12-18, incluso más preferentemente 11-16. Como se describe en el presente documento, la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido, tal como la secuencia de nucleótidos contigua, consiste en al menos uno o dos nucleósidos de LNA y los nucleósidos restantes son unidades de ADN. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende solo nucleósidos de LNA y nucleósidos naturales (tales como ARN o ADN, más preferentemente nucleósidos de ADN), opcionalmente con enlaces internucleosídicos modificados tales como fosforotioato.
En un modo de realización de la invención, el oligonucleótido de la invención es capaz de reclutar RNasa H.
El diseño estructural del oligonucleótido como se describe en el presente documento se puede seleccionar de gapmeros, interruptores de huecos, oligómeros de cabeza y oligómeros de cola.
Diseño de gapmeros
En un modo de realización preferente, el oligonucleótido de la invención tiene un diseño o estructura de gapmero también denominado en el presente documento simplemente "gapmero". En una estructura de gapmero, el oligonucleótido comprende al menos tres regiones estructurales distintas: un flanco en 5', un hueco y un flanco en 3', F-G-F' en orientación '5 -> 3'. En este diseño, las regiones flanqueantes F y F' (también denominadas regiones de alas) comprenden un tramo contiguo de nucleósidos modificados, que son complementarios al ácido nucleico diana de PD-L1, mientras que la región de hueco, G, comprende un tramo contiguo de nucleótidos que son capaces de reclutar una nucleasa, preferentemente una endonucleasa tal como RNasa, por ejemplo RNasa H, cuando el oligonucleótido está en dúplex con el ácido nucleico diana. Los nucleósidos que son capaces de reclutar una nucleasa, en particular RNasa H, se pueden seleccionar del grupo que consiste en a Dn , alfa-L-oxi-LNA, 2'-Flouro-ANA y UNA. Las regiones F y F', que flanquean los extremos 5' y 3' de la región G, comprenden preferentemente nucleósidos que no reclutan nucleasas (nucleósidos con una estructura endo en 3'), más preferentemente uno o más nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad. Como se describe en el presente documento, el flanco en 3' comprende al menos un nucleósido de LNA, preferentemente al menos 2 nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, el flanco en 5' comprende al menos un nucleósido de LNA. Como se describe en el presente documento, las regiones flanqueantes tanto 5' como 3' comprenden un nucleósido de LNA. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos en las regiones flanqueantes son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, las regiones flanqueantes pueden comprender tanto nucleósidos de LNA como otros nucleósidos (flancos mixtos), tales como nucleósidos de a Dn y/o nucleósidos no modificados con LNA, tales como nucleósidos sustituidos en 2'. En este caso, el hueco se define como una secuencia contigua de al menos 5 nucleósidos que reclutan RNasa H (nucleósidos con una estructura endo en 2', preferentemente ADN) flanqueada en el extremo 5' y 3' por un nucleósido modificado potenciador de la afinidad, preferentemente LNA, tal como beta-D-oxi-LNA. En consecuencia, los nucleósidos de la región flanqueante en 5' y la región flanqueante en 3' que son contiguas a la región del hueco son nucleósidos modificados, preferentemente nucleósidos que no reclutan nucleasas.
Región F
La región F (flanco en 5' o ala en 5') unida al extremo '5 de la región G comprende, contiene o consiste en al menos un nucleósido modificado tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos al menos 6, al menos 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, la región F comprende o consiste en de 1 a 7 nucleósidos modificados, tales como de 2 a 6 nucleósidos modificados, tales como de 2 a 5 nucleósidos modificados, tales como de 2 a 4 nucleósidos modificados, tales como de 1 a 3 nucleósidos modificados nucleósidos, tales como 1, 2, 3 o 4 nucleósidos modificados. La región F se define por tener al menos un nucleósido modificado en el extremo 5' y en el extremo 3' de la región.
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F tienen una estructura endo en 3'.
Como se describe en el presente documento, uno o más de los nucleósidos modificados en la región F son nucleósidos modificados en 2'. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos de la región F son nucleósidos modificados en 2'.
Como se describe en el presente documento, la región F comprende ADN y/o ARN además de los nucleósidos modificados en 2'. Los flancos que comprenden ADN y/o ARN se caracterizan por tener un nucleósido modificado en 2' en el extremo 5' y el extremo 3' (contiguo a la región G) de la región F. Como se describe en el presente documento, la región F comprende nucleósidos de ADN, tales como de 1 a 3 nucleósidos de ADN contiguos, tales como de 1 a 3 o de 1 a 2 nucleósidos de ADN contiguos. Los nucleósidos de ADN en los flancos preferentemente no deberían poder reclutar RNasa H. Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en 2' y los nucleósidos de ADN y/o ARN en la región F se alternan con 1 a 3 nucleósidos modificados en 2' y 1 a 3 nucleósidos de ADN y/o de ARN. Dichos flancos también se pueden denominar flancos alternos. La longitud del flanco en 5' (región F) en oligonucleótidos con flancos alternos puede ser de 4 a 10 nucleósidos, tal como de 4 a 8, tal como de 4 a 6 nucleósidos, tal como 4, 5, 6 o 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, solo se alterna el flanco en 5' del oligonucleótido. Ejemplos específicos de la región F con nucleósidos alternos son
2'1-3-N'1-4-2'1-3
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
Donde 2' indica un nucleósido modificado y N' es un ARN o ADN. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en los flancos alternos son LNA y N' es ADN. En otro modo de realización, uno o más de los nucleósidos modificados en 2' en la región F se seleccionan de unidades de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro-ADN, 2'-alcoxi-ARN, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabinonucleico (ANA) y unidades de 2'-fluoro-ANA.
Como se describe en el presente documento, la región F comprende tanto LNA como un nucleósido modificado sustituido en 2'. Estos a menudo se denominan oligonucleótidos de ala mixta o de flanco mixto.
Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en la región F son nucleósidos de LNA. En otro modo de realización, todos los nucleósidos en la Región F son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, los nucleósidos de LNA en la región F se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET y/o ENA, en las configuraciones beta-D o bien alfa-L o combinaciones de las mismas. Como se describe en el presente documento, la región F comprende al menos 1 unidad de beta-D-oxi LNA, en el extremo 5' de la secuencia contigua.
Región G
La región G (región de hueco) preferentemente comprende, contiene o consiste en al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos consecutivos capaces de reclutar la nucleasa mencionada anteriormente, en particular RNasa H. Como se describe en el presente documento, la región G comprende, contiene o consiste en de 5 a 12, o de 6 a 10 o de 7 a 9, tales como 8 unidades de nucleótidos consecutivas capaces de reclutar la nucleasa mencionada anteriormente.
Las unidades de nucleósidos en la región G, que son capaces de reclutar nucleasa, son como se describe en el presente documento, seleccionadas del grupo que consiste en ADN, alfa-L-LNA, ADN alquilado en C4' (como se describe en PCT/EP2009/050349 y Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300), nucleósidos derivados de arabinosa como ANA y 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (ácido nucleico desbloqueado) (como se describe en Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039). UNA es un ácido nucleico desbloqueado, típicamente donde se ha eliminado el enlace entre C2 y C3 de la ribosa, formando un residuo "glucídico" desbloqueado.
Como se describe en el presente documento, al menos una unidad de nucleósido en la región G es una unidad de nucleósido de ADN, tal como de 1 a 18 unidades de ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16 o 17 unidades de ADN, preferentemente de 2 a 17 unidades de ADN, tal como de 3 a 16 unidades de ADN, tal como de 4 a 15 unidades de ADN, tal como de 5 a 14 unidades de ADN, tal como de 6 a 13 unidades de ADN, como de 7 a 12 unidades de ADN, tal como de 8 a 11 unidades de ADN, más preferentemente de 8 a 17 unidades de ADN, o de 9 a 16 unidades de ADN, de 10 a 15 unidades de ADN o de 11 a 13 unidades de ADN, tal como 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 154, 16, 17 unidades de ADN. En algunos modos de realización, la región G consiste en un 100 % de unidades de ADN.
Como se describe en el presente documento, la región G puede consistir en una mezcla de ADN y otros nucleósidos capaces de mediar en la escisión de la RNasa H. La región G puede consistir en al menos un 50 % de ADN, más preferentemente un 60 %, 70 % u 80 % de ADN, e incluso más preferentemente un 90 % o 95 % de ADN.
Como se describe en el presente documento, al menos una unidad de nucleósido en la región G es una unidad de nucleósido alfa-L-LNA, tal como al menos un alfa-L-LNA, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 alfa -L-LNA. Como se describe en el presente documento, la región G comprende al menos un alfa-L-LNA es alfa-L-oxi-LNA. Como se describe en el presente documento, la región G comprende una combinación de unidades de nucleósidos de ADN y alfa-L-LNA.
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos en la región G tienen una estructura endo en 2'.
Como se describe en el presente documento, la región G puede comprender un nucleósido interruptor de huecos, que da lugar a un oligonucleótido interruptor de huecos, que es capaz de reclutar Rnasa H.
Región F’
La región F' (flanco en 3' o ala en 3') unida al extremo '3 de la región G comprende, contiene o consiste en al menos un nucleósido modificado tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos al menos 6, al menos 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, F' comprende o consiste en de 1 a 7 nucleósidos modificados, tales como de 2 a 6 nucleósidos modificados, tales como de 2 a 4 nucleósidos modificados, tales como de 1 a 3 nucleósidos modificados, tales como 1, 2, 3 o 4 nucleósidos modificados. La región F' se define por tener al menos un nucleósido modificado en el extremo 5' y en el extremo 3' de la región.
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F' tienen una estructura endo en 3'.
Como se describe en el presente documento, uno o más de los nucleósidos modificados en la región F' son nucleósidos modificados en 2'. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos de la región F' son nucleósidos modificados en 2'.
Como se describe en el presente documento, uno o más de los nucleósidos modificados en la región F' son nucleósidos modificados en 2'.
Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos de la región F' son nucleósidos modificados en 2'. Como se describe en el presente documento, la región F' comprende ADN o ARN además de los nucleósidos modificados en 2'. Los flancos que comprenden ADN o ARN se caracterizan por tener un nucleósido modificado en 2' en el extremo 5' (contiguo a la región G) y el extremo 3' de la región F'. Como se describe en el presente documento, la región F' comprende nucleósidos de ADN, tales como de 1 a 4 nucleósidos de ADN contiguos, tales como de 1 a 3 o de 1 a 2 nucleósidos de ADN contiguos. Los nucleósidos de ADN en los flancos preferentemente no deberían poder reclutar RNasa H. En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados en 2' y los nucleósidos de ADN y/o ARN en la región F' se alternan con 1 a 3 nucleósidos modificados en 2' y 1 a 3 nucleósidos de ADN y/o de a Rn , dichos flancos también se pueden denominar flancos alternos. La longitud del flanco en 3' (región F') en oligonucleótidos con flancos alternos puede ser de 4 a 10 nucleósidos, tal como de 4 a 8, tal como de 4 a 6 nucleósidos, tal como 4, 5, 6 o 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, solo se alterna el flanco en 3' del oligonucleótido. Ejemplos específicos de la región F' con nucleósidos alternos son
2'1-2-N'1-4-2'1-4
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
Donde 2' indica un nucleósido modificado y N' es un ARN o ADN. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en los flancos alternos son LNA y N' es ADN. Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F se seleccionan de unidades de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro-ADN, 2'-alcoxi-ARN, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabinonucleico (ANA) y unidades de 2'-fluoro-ANA.
Como se describe en el presente documento la región F' comprende tanto LNA como un nucleósido modificado sustituido en 2'. Estos a menudo se denominan oligonucleótidos de ala mixta o de flanco mixto.
Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en la región F' son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos de la región F' son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, los nucleósidos de LNA en la región F' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET y/o ENA, en las configuraciones beta-D o bien alfa-L o combinaciones de las mismas. Como se describe en el presente documento, la región F' tiene al menos 2 unidades de beta-D-oxi LNA, en el extremo 3' de la secuencia contigua.
Región D’ y D”
Las regiones D' y D” se pueden unir al extremo 5' de la región F o al extremo 3' de la región F', respectivamente. Las regiones D' o D” son opcionales.
La región D' o D” puede comprender independientemente de 0 a 5, tal como de 1 a 5, tal como de 2 a 4, tal como 0, 1,2, 3, 4 o 5 nucleótidos adicionales, que pueden ser complementarios o no complementarios al ácido nucleico diana. A este respecto, el oligonucleótido de la invención, en algunos modos de realización, puede comprender una secuencia de nucleótidos contigua capaz de modular la diana que está flanqueada en el extremo 5' y/o 3' por nucleótidos adicionales. Dichos nucleótidos adicionales pueden servir como un conector bioescindible susceptible a las nucleasa (véase la definición de conectores). En algunos modos de realización, los nucleósidos en los extremos 5' y/o 3' adicionales están enlazados con enlaces fosfodiéster, y pueden ser ADN o ARN. En otro modo de realización, los nucleósidos en los extremos 5' y/o 3' adicionales son nucleósidos modificados que se pueden incluir, por ejemplo, para potenciar la estabilidad de las nucleasas o para facilitar la síntesis. En un modo de realización, el oligonucleótido de la invención comprende una región D' y/o D” en el extremo 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos contigua. En otro modo de realización, la región D' y/o D” está compuesta por de 1 a 5 nucleósidos de ADN o ARN enlazados por fosfodiéster que no son complementarios al ácido nucleico diana.
El oligonucleótido gapmero de la presente invención se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5'-F-G-F'-3'; en particular F1-7-G4-12-FV7
5'-D'-F-G-F'-3', en particular DV3-F1-7-G4-12-FV7
5'-F-G-F'-D”-3', en particular F1-7-G4-12-F'1-7-D”1-3
5'-D'-F-G-F'-D'-3”, en particular D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D”1-3
El número y los tipos preferentes de nucleósidos en las regiones F, G y F', D' y D” se han descrito anteriormente. Los conjugados de oligonucleótidos de la presente invención tienen una región C unida covalentemente al extremo 5' o 3' del oligonucleótido, en particular los oligonucleótidos gapmeros presentados anteriormente.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos de la invención comprende un oligonucleótido con la fórmula 5'-D'-F-G-F'-3' o 5'-F-G-F'-D”-3', donde la región F y F' independientemente comprenden 1 - 7 nucleósidos modificados, G es una región entre 6 y 16 nucleósidos que son capaces de reclutar RNasaH y la región D' o D” comprende 1 - 5 nucleósidos enlazados por fosfodiéster. Preferentemente, la región D' o D” está presente en el extremo del oligonucleótido donde se contempla la conjugación con un resto de conjugado.
Los ejemplos de oligonucleótidos con flancos alternos se pueden representar mediante las siguientes fórmulas:
2'1-3-N' 1-4-2'1-3-G6-12-2'1 -2-N' 1 -4-2'1 -4
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2-G6-12-2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
F-G6-12-2'1-2-N'1-4-2'1-4
F-G6-12-2'1 -2-N' 1-2-2'1-2-N' 1-2-2'1-2
2'1-3-N'1-4-2'1-3-G6-12-F'
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N1-2-2'1-2-G6-12-F'
Cuando un flanco está indicado por F o F', solo contiene nucleósidos modificados en 2', tal como nucleósidos de LNA. El número y los tipos preferentes de nucleósidos en las regiones alternas y la región F, G y F', D' y D” se han descrito anteriormente.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gapmero que consiste en 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 nucleótidos de longitud, en el que cada una de las regiones F y F' consis te independientemente de 1, 2, 3 o 4 unidades de nucleósidos modificadas complementarias al ácido nucleico diana de PD-L1 y la región G consiste en 8, 9, 10, 11,12,13,14,15,16,17 unidades de nucleósidos, capaces de reclutar nucleasa cuando están en dúplex con el ácido nucleico diana de PD-L1 y la región D' consiste en 2 ADN enlazados por fosfodiéster.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gapmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 3, 4, 5 o 6 unidades de nucleósidos modificadas, tales como unidades de nucleósidos que contienen un glúcido de 2'-O-metoxietil-ribosa (2'-MOE) o unidades de nucleósidos que contienen un glúcido de 2'-fluoro-desoxirribosa y/o unidades de LNA, y la región G consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 unidades de nucleósidos, tales como unidades de ADN u otros nucleósidos que reclutan nucleasas tales como alfa-L-LNA o una mezcla de nucleósidos de ADN y que reclutan nucleasas.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gapmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste en dos unidades de LNA cada una, y la región G consiste en 12, 13, 14 unidades de nucleósidos, preferentemente unidades de ADN. Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen 2-12-2, 2-13-2 y 2-14-2.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gapmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en tres unidades de LNA, y la región G consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 unidades de nucleósidos, preferentemente unidades de ADN. Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen 3-8-3, 3-9-33-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 y 3-14-3.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gapmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste en cuatro unidades de LNA cada una, y la región G consiste en 8 o 9, 10, 11 o 12 unidades de nucleósidos, preferentemente unidades de ADN. Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen 4-8-4, 4-9-4, 410-4, 4-11-4 y 4-12-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 6 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas, incluyendo gapmeros 1-6-1, 1-6-2, 2-6- 1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-22-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 y 4­ 6-3.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 7 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas, incluyendo gapmeros 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1,2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7­ 3 y 4-7-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 8 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas, incluyendo gapmeros 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1,2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, , 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8­ 3 y 4-8-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 9 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas, incluyendo gapmeros 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1,2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9­ 3 y 4-9-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 10 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10­ 1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 y 4-10-4 .
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 11 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11 -1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 y 4-11-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 12 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12­ 1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 y 4-12-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 13 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13­ 1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 y 4-13-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 14 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-14-1,2-14-1, , 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14­ 1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 y 4-14-4.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 15 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15­ 1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 y 3-15-3.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 16 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16­ 1,2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 y 3-16-3.
Los diseños específicos de gapmeros de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 17 nucleósidos, incluyendo gapmeros 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17­ 1, 2-17-2, 2-17-3 y 3-17-2.
En todos los casos, el diseño de F-G-F' puede incluir además la región D' y/o D”, que puede tener 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tales como unidades de ADN, tales como 2 unidades de ADN enlazadas con fosfodiéster. Preferentemente, los nucleósidos en la región F y F' son nucleósidos modificados, mientras que los nucleótidos en la región G son preferentemente nucleósidos no modificados.
En cada diseño, el nucleósido modificado preferente es LNA.
Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en el hueco en un gapmero son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleósidos en los flancos (región F y F') en un gapmero son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en la región D' y D” en un gapmero son enlaces fosfodiéster.
Para los gapmeros específicos como se divulgan en el presente documento, cuando los residuos de citosina (C) se anotan como 5-metil-citosina, como se describe en el presente documento, uno o más de los C presentes en el oligonucleótido pueden ser residuos de C no modificados.
Como se describe en el presente documento, el gapmero es lo que se denomina un oligómero con huecos cortos (shortmer) como se describe en el documento WO2008/113832.
En los documentos WO2004/046160, WO2007/146511 se divulgan otros diseños de gapmeros.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 5_1 a 743_1 y 771_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO 6_1, 8_1, 9_1, 13_1,41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 1711, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318__ 1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 4151, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1,529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1 578_1, 582_1, 601_1,619_1,620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1,651_1,652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 y 735_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es CMP-ID-NO: 287_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es CMP-ID-NO: 342_1.
En otro modo de realización preferente de la invención, el oligonucleótido es CMP-ID-NO: 640_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es CMP-ID-NO: 466_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es CMP-ID-NO: 566_1.
En otro modo de realización de la invención, la secuencia de nucleótidos contigua de los motivos oligonucleotídicos y los compuestos oligonucleotídicos de la invención comprenden de dos a cuatro nucleósidos adicionales enlazados por fosfodiéster en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos contigua (por ejemplo, región D'). En un modo de realización, los nucleósidos sirven como conector bioescindible (véase la sección sobre conectores bioescindibles). En un modo de realización preferente, un dinucleótido de ca (citidina-adenosina) se une al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos contigua (es decir, una cualquiera de las secuencias de motivos o compuestos oligonucleotídicos enumerados en la tabla 5) por medio de un enlace fosfodiéster. En un modo de realización preferente, el dinucleótido ca no es complementario a la secuencia diana en la posición donde el recordatorio del nucleótido contigioso es complementario.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de motivos nucleotídicos con SEQ ID NO: 766, 767, 768, 769 y 770.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en los compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO766_1, 767_1, 768_1, 769_1 y 770_1.
Restos de conjugado de carbohidrato
Los restos de conjugado de carbohidrato incluyen galactosa, lactosa, n-acetilgalactosamina, manosa y manosa-6-fosfato. Se pueden usar conjugados de carbohidratos para potenciar la administración o la actividad en una gama de tejidos, tales como hígado y/o músculo. Véase, por ejemplo, el documento EP1495769, el documento WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20 (2): 213-21. Zatsepin y Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17. En algunos modos de realización, el resto de conjugado de carbohidrato es multivalente, tal como, por ejemplo, 2, 3 o 4 restos de carbohidrato idénticos o no idénticos se pueden unir covalentemente al oligonucleótido, opcionalmente por medio de un conector o conectores. En algunos modos de realización, la invención proporciona un conjugado que comprende el oligonucleótido de la invención y un resto de conjugado de carbohidrato.
En algunos modos de realización, el resto de conjugado es o puede comprender manosa o manosa-6-fosfato. Esto es útil en particular para dirigirse a células musculares, véase, por ejemplo, el documento US2012/122801.
Los restos de conjugado que se pueden unir al receptor para la asialoglicoproteína (ASGPr) son útiles en particular para dirigirse a los hepatocitos en el hígado. En algunos modos de realización, la invención proporciona un conjugado de oligonucleótidos que comprende el oligonucleótido de la invención y un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína. El resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína comprende uno o más restos de carbohidrato que se pueden unir al receptor para la asialoglicoproteína (restos de carbohidrato de unión a ASPGr) con una afinidad igual o mayor que la de la galactosa. Se han estudiado las afinidades de numerosos derivados de la galactosa por el receptor para la asialoglicoproteína (véase, por ejemplo: Jobst, S.T. Y Drickamer, K. JB.C. 1996, 271.6686) o se determinan fácilmente usando procedimientos típicos en la técnica.
En el presente documento se describe un conjugado de oligonucleótidos antisentido que comprende a) un oligonucleótido (región A) que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de complementariedad con un ácido nucleico diana de PD-L1; y b) al menos un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína (región C) unido covalentemente al oligonucleótido en a). El oligonucleótido o una secuencia de nucleótidos contigua puede ser como se describe en cualquiera de las secciones "oligonucleótidos de la invención", "diseño de oligonucleótidos y "diseño de gapmeros".
En algunos modos de realización, el resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína comprende al menos un resto de carbohidrato de unión a ASPGr seleccionado del grupo que consiste en galactosa, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-acetilgalactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoil-galactosamina y N-isobutanoilgalactosamina. En algunos modos de realización, el resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína es monovalente, divalente, trivalente o tetravalente (es decir, que contiene restos de carbohidrato 1,2, 3 o 4 terminal que se pueden unir al receptor para la asialoglicoproteína). Preferentemente, el resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína es divalente, incluso más preferente es trivalente. En un modo de realización preferente, el resto de conjugado dirigido al receptor para asialoglicoproteína comprende de 1 a 3 restos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) (también denominado conjugado de GalNAc). En algunos modos de realización, el conjugado de oligonucleótidos comprende un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína que es un resto de N-acetilgalactosamina trivalente (GalNAc). Se han usado conjugados de GalNAc con fosfodiéster, metilfosfonato y oligonucleótidos antisentido de PNA (por ejemplo, documento US5.994517 y Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec; 6(6):695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792 y Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29) y ARNip (por ejemplo, documentos WO2009/126933, WO2012/089352 y WO2012/083046) y con nucleósidos de LNA y modificados en 2'-MOE documentos WO2014/076196 WO2014/207232 y WO2014/179620.
Para generar el resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína, los restos de carbohidrato de unión a ASPGr (preferentemente GalNAc) se unen a una molécula ramificadora a través de los carbonos C-l de los sacáridos. Los restos de carbohidrato de unión a ASPGr se unen preferentemente a la molécula ramificadora por medio de espaciadores. Un espaciador preferente es un espaciador hidrófilo flexible (patente de EE. UU. 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Un espaciador hidrófilo flexible preferente es un espaciador de PEG. Un espaciador de PEG preferente es un espaciador de PEG3 (tres unidades de etileno). La molécula ramificadora puede ser cualquier molécula pequeña que permita la unión de dos o tres restos de carbohidrato de unión a ASPGr terminales y además permita la unión del punto de ramificación al oligonucleótido. Una molécula ramificadora ejemplar es una di-lisina. Una molécula de di-lisina contiene tres grupos amina a través de los cuales se pueden unir tres restos de carbohidrato de unión a ASPGr y un grupo reactivo con carboxilo a través del cual la di-lisina se puede unir al oligonucleótido. Las moléculas ramificadoras alternativas pueden ser un doblador o un triplicador como las suministradas por Glen Research. En algunos modos de realización, el ramificador se puede seleccionar del grupo que consiste en 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoxitritiloxi)pentilamido]propil-2-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]fosforamidita (número de catálogo de Glen Research: 10-1920-xx), tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propiloximetil]etil-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita (número de catálogo de Glen Research: 10-1922-xx), tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propiloximetil]metilenoxipropil-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita y 1-[5-(4,4'-dimetoxitritiloxi)pentilamido]-3-[5-fluorenometoxicarbonil-oxi-pentilamido]-propil-2-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita (número de catálogo de Glen Research: 10-1925-xx). El documento WO2014/179620 y la solicitud PCT n.° PCT/EP2015/073331 describen la generación de diversos restos de conjugado de GalNAc. Se pueden insertar uno o más conectores entre la molécula ramificadora y el oligonucleótido. En un modo de realización preferente, el conector es un conector bioescindible. El conector se puede seleccionar de los conectores descritos en la sección "Conectores" y sus subsecciones.
El resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína, en particular el resto de conjugado de GalNAc, se puede unir al extremo 3' o 5' del oligonudeótido usando procedimientos conocidos en la técnica. En modos de realización preferentes, el resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína se une al extremo 5' del oligonucleótido.
Los moduladores farmacocinéticos en relación con la administración de ARNip se han descrito en el documento WO2012/083046. En algunos modos de realización, el resto de conjugado de carbohidrato comprende un modulador farmacocinético seleccionado del grupo que consiste en un grupo hidrófobo que tiene 16 o más átomos de carbono, un grupo hidrófobo que tiene 16-20 átomos de carbono, palmitoilo, hexadec-8-enoilo, oleilo, (9E, 12E)-octadeca-9,12dienoílo, dioctanoílo y acilo C16-C20, y colesterol. En un modo de realización preferente, el modulador farmacocinético que contiene el resto de conjugado de carbohidrato es un conjugado de GalNAc.
Los restos de conjugado de carbohidrato preferentes comprenden de uno a tres restos de carbohidrato de unión a ASPGr terminales, preferentemente resto(s) de N-acetilgalactosamina. En algunos modos de realización, el resto de conjugado de carbohidrato comprende tres restos de carbohidrato de unión a ASPGr, preferentemente restos de N-acetilgalactosamina, unidos por medio de un espaciador a una molécula ramificadora. La molécula espaciadora puede tener entre 8 y 30 átomos de longitud. Un resto de conjugado de carbohidrato preferente comprende tres restos de GalNAc terminales unidos por medio de un espaciador de PEG a una molécula ramificadora de di-lisina. Preferentemente, el espaciador de PEG es un espaciador de 3PEG. Se muestran en la figura 1 restos de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína adecuados. Se muestra en la figura 3 un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína preferente.
Otros restos de conjugado de GalNAc pueden incluir, por ejemplo, pequeños péptidos con restos de GalNAc unidos tales como Tyr-Glu-Glu- (aminohexil GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; un glicotripeptido que se une al receptor para la asialoglicoproteína en los hepatocitos, véase, por ejemplo, Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); clústers de galactosa basados en lisina (por ejemplo, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); y clústers de galactosa basados en colano (por ejemplo, motivo de reconocimiento de carbohidratos para el receptor para la asialoglicoproteína).
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos antisentido se selecciona del grupo que consiste en los siguientes CPM ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 y 770_2.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos antisentido corresponde al compuesto representado en la figura 4.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos antisentido corresponde al compuesto representado en la figura 5.
En otro modo de realización preferente, el conjugado de oligonucleótidos antisentido corresponde al compuesto representado en la figura 6.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos antisentido corresponde al compuesto representado en la figura 7.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos antisentido corresponde al compuesto representado en la figura 8.
Conectores
Conectores bioescindibles (región B)
El uso de un conjugado a menudo se asocia con propiedades dinámicas farmacocinéticas o farmacodinámicas potenciadas. Sin embargo, la presencia de un resto de conjugado puede interferir en la actividad del oligonucleótido contra su diana pretendida, por ejemplo a través de un impedimento estérico que evita la hibridación o el reclutamiento de nucleasas (por ejemplo, RNasaH). El uso de un enlace fisiológicamente lábil (conector bioescindible) entre el oligonucleótido (región A o primera región) y el resto de conjugado (región C o tercera región) permite mejorar las propiedades debido a la presencia del resto de conjugado, al tiempo que garantiza que, una vez en el tejido diana, el grupo del conjugado no evita la actividad eficaz del oligonucleótido.
La escisión del enlace fisiológicamente lábil se produce espontáneamente cuando una molécula que contiene el enlace lábil alcanza un entorno intra y/o extracelular apropiado. Por ejemplo, un enlace lábil al pH se puede escindir cuando la molécula entra en un endosoma acidificado. Por tanto, un enlace lábil al pH se puede considerar un enlace escindible endosómico. Los enlaces escindibles por enzimas se pueden escindir cuando se exponen a enzimas tales como las presentes en un endosoma o lisosoma o en el citoplasma. Un enlace disulfuro se puede escindir cuando la molécula entra en el entorno más reductor del citoplasma celular. Por tanto, se puede considerar que un disulfuro es un enlace escindible citoplásmico. Como se usa en el presente documento, un enlace lábil al pH es un enlace lábil que se rompe selectivamente en condiciones ácidas (pH <7). Dichos enlaces también se pueden denominar enlaces endosómicamente lábiles, ya que los endosomas y lisosomas celulares tienen un pH inferior a 7.
Para conectores bioescindibles asociados con un resto de conjugado para administración dirigida, es preferente que la tasa de escisión observada en el tejido diana (por ejemplo, músculo, hígado, riñón o un tumor) sea mayor que la encontrada en el suero sanguíneo. Los métodos adecuados para determinar el nivel (%) de escisión en el tejido diana frente al suero o de escisión por la nucleasa S1 se describen en la sección "Materiales y procedimientos". En algunos modos de realización, el conector bioescindible (también denominado conector fisiológicamente lábil, o conector susceptible a nucleasas o región B), en un conjugado de la invención, se escinde al menos aproximadamente un 20 %, tal como al menos aproximadamente un 30 %, tal como al menos aproximadamente un 40 %, tal como al menos aproximadamente un 50 %, tal como al menos aproximadamente un 60 %, tal como al menos aproximadamente un 70 %, tal como al menos aproximadamente un 75 % en comparación con un estándar.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos comprende tres regiones: i) una primera región (región A), que comprende 10-25 nucleótidos contiguos complementarios al ácido nucleico diana; ii) una segunda región (región B) que comprende un conector bioescindible y iii) una tercera región (región C) que comprende un resto de conjugado, tal como un resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína, en el que la tercera región se une covalentemente a la segunda región que se une covalentemente a la primera región.
Como se describe en el presente documento, el conjugado de oligonucleótidos comprende un conector bioescindible (región B) entre la secuencia de nucleótidos contigua (región A) y el resto de conjugado dirigido al receptor para la asialoglicoproteína (región C).
En algunos modos de realización, el conector bioescindible puede estar situado en el extremo 5' y/o bien en el extremo 3' de los nucleótidos contiguos complementarios al ácido nucleico diana (región A). En un modo de realización preferente, el conector bioescindible está en el extremo 5'.
En algunos modos de realización, el conector escindible es susceptible a nucleasa(s) que, por ejemplo, se pueden expresar en la célula diana. En algunos modos de realización, el conector bioescindible se compone de 2 a 5 enlaces fosfodiéster consecutivos. El conector puede ser una región corta (por ejemplo, 1-10 como se detalla en la definición de conectores) nucleósidos enlazados por fosfodiéster. En algunos modos de realización, los nucleósidos en la región B del conector bioescindible se seleccionan (opcionalmente independientemente) del grupo que consiste en ADN y ARN o modificaciones de los mismos que no interfieren en la escisión por nucleasas. Las modificaciones de nucleósidos de ADN y ARN que no interfieren en la escisión por nucleasas pueden ser nucleobases no naturales. Determinados nucleósidos modificados con glúcidos también pueden permitir la escisión por nucleasas, tal como un alfa-L-oxi-LNA. En algunos modos de realización, todos los nucleósidos de la región B comprenden (opcionalmente independientemente) un glúcido 2'-OH ribosa (ARN) o un glúcido 2'-H, es decir, ARN o ADN. En un modo de realización preferente, al menos dos nucleósidos consecutivos de la región B son nucleósidos de ADN o ARN (tales como al menos 3 o 4 o 5 nucleósidos de ADN o ARN consecutivos). En un modo de realización aún más preferente, los nucleósidos de la región B son nucleósidos de ADN. Preferentemente, la región B consiste en entre 1 a 5, o 1 a 4, tales como 2, 3, 4 nucleósidos de ADN consecutivos enlazados por fosfodiéster. En modos de realización preferentes, la región B es tan corta que no recluta RNasa H. En algunos modos de realización, la región B comprende no más de 3 o no más de 4 nucleósidos consecutivos de ADN y/o ARN enlazados por fospodiéster (tales como nucleósidos de ADN).
Cuando la región B está compuesta por nucleósidos enlazados por fosfodiéster, la región A y B pueden formar conjuntamente el oligonucleótido que se une a la región C. En este contexto, la región A se puede diferenciar de la región B en que la región A comienza con al menos uno, preferentemente al menos dos, nucleósidos modificados con una afinidad de unión incrementada al ácido nucleico diana (por ejemplo, LNA o nucleósidos con un resto glucídico sustituido en 2') y la región A por sí sola es capaz de modular la expresión del ácido nucleico diana en una línea celular pertinente. Además, si la región A comprende nucleósidos de ADN o ARN, estos se enlazan con un enlace internucleosídico resistente a nucleasas, como fosforotioato o boranofosfato. La región B, por otra parte, comprende enlaces fosfodiéster entre nucleósidos de ADN o ARN. En algunos modos de realización, la región B no es complementaria al ni comprende al menos un 50 % de emparejamientos erróneos con el ácido nucleico diana.
En algunos modos de realización, la región B no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana ni a los nucleótidos contiguos complementarios al ácido nucleico diana en la región A.
En algunos modos de realización, la región B es complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana. A este respecto, las regiones A y B conjuntamente pueden formar una única secuencia contigua que es complementaria a la secuencia diana.
En algunos aspectos de la invención, el enlace internucleosídico entre la primera (región A) y la segunda región (región B) se puede considerar parte de la segunda región.
En algunos modos de realización, la secuencia de bases en la región B se selecciona para proporcionar un sitio de escisión por las endonucleasas óptimo, basado en las enzimas predominantes de escisión por endonucleasas presentes en el tejido o célula diana o compartimento subcelular. A este respecto, aislando extractos celulares de tejidos diana y tejidos no diana, las secuencias de escisión por endonucleasas para su uso en la región B se pueden seleccionar en base a una actividad de escisión preferencial en la célula diana deseada (por ejemplo, hígado/hepatocitos) en comparación con una célula no diana (por ejemplo, riñón). A este respecto, la potencia del compuesto para la regulación por disminución de la diana se puede optimizar para el tejido/célula deseado.
En algunos modos de realización, la región B comprende un dinucleótido de secuencia AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC o GG, en la que C puede ser 5-metilcitosina, y/o T se puede reemplazar con U. Preferentemente, el enlace internucleosídico es un enlace fosfodiéster. En algunos modos de realización, la región B comprende un trinucleótido de secuencia AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC y GGG en la que C puede ser 5-metilcitosina y/o T se puede reemplazar con U. Preferentemente, los enlaces internucleósidos son enlaces fosfodiéster. En algunos modos de realización, la región B comprende un trinucleótido de secuencia AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX y GGGX, en la que X se puede seleccionar del grupo que consiste en A, T, U, G, C y análogos de los mismos, en la que C puede ser 5-metilcitosina y/o T se puede reemplazar con U. Preferentemente, los enlaces internucleosídicos son enlaces fosfodiéster. Se reconocerá que, cuando se hace referencia a las nucleobases (naturales) A, T, U, G, C, estas se pueden sustituir con análogos de nucleobases que funcionan como la nucleobase natural equivalente (por ejemplo, par de bases con el nucleósido complementario).
Otros conectores (región Y)
El conector puede tener al menos dos funcionalidades, una para unirse al oligonucleótido y la otra para unirse al resto de conjugado. Las funcionalidades del conector de ejemplo pueden ser electrófilas para reaccionar con grupos nucleófilos en el oligonucleótido o resto de conjugado, o nucleófilas para reaccionar con grupos electrófilos. En algunos modos de realización, las funcionalidades del conector incluyen amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, fosforamidato, fosforotioato, fosfato, fosfito, insaturaciones (por ejemplo, enlaces dobles o triples). Algunos conectores de ejemplo (región Y) incluyen ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA), 6 aminohexiloxi, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-aminociclohexilcarboxílico, 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxi-(6-amido-caproato) de succinimidilo (LCSMCC), m-maleimido-benzoilato de succinimidilo (MBS), N-e-maleimido-caproilato de succinimidilo (EMCS), 6-(beta-maleimido-propionamido)hexanoato de succinimidilo (SMPH), N-(a-maleimido acetato) de succinimidilo (AMAS), 4-(p-maleimidofenil) butirato de succinimidilo (SMPB), beta-alanina (beta-ALA), fenilglicina (PHG), ácido 4-aminociclohexanoico (ACHC), beta-(ciclopropil)alanina (beta-CYPR), ácido aminododecanoico (ADC), alilen dioles, polietilenglicoles, aminoácidos. En algunos modos de realización, el conector (región Y) es un alquilamino, tal como un grupo amino alquilo C2-C36, que incluye, por ejemplo, grupos amino alquilo C6 a C12. En un modo de realización preferente, el conector (región Y) es un grupo amino alquilo C6. El grupo amino alquilo se puede añadir al oligonucleótido (región A o región A-B) como parte de la síntesis de oligonucleótidos estándar, por ejemplo usando una amino alquil fosforamidita (por ejemplo, protegida). El grupo de enlace entre el amino alquilo y el oligonucleótido puede ser, por ejemplo, un fosforotioato o un fosfodiéster, o uno de los otros grupos de enlace de nucleósidos a los que se hace referencia en el presente documento. El grupo amino alquilo se une covalentemente al extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Los conectores amino alquilo disponibles comercialmente son, por ejemplo, el reactivo 3'-Amino-Modifier para el enlace en el extremo 3' del oligonucleótido y, para el enlace en el extremo 5', de un oligonucleótido está disponible 5'-Amino-Modifier C6. Estos reactivos están disponibles en Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Estos compuestos u otros similares fueron utilizados por Krieg et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 para unir la fluoresceína al extremo 5' de un oligonucleótido. Son conocidos en la técnica una amplia variedad de otros grupos conectores y pueden ser útiles en la unión de restos de conjugado a oligonucleótidos. Se puede encontrar una revisión de muchos de los grupos conectores útiles en, por ejemplo, Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350. Otros compuestos tales como acridina se han unido al grupo fosfato terminal 3' de un oligonucleótido por medio de un enlace de polimetileno (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81,3297). Cualquiera de los grupos anteriores se puede usar como un solo conector (región Y) o en combinación con uno o más conectores adicionales (región Y-Y' o región Y-B o B-Y).
Los conectores y su uso en la preparación de conjugados de oligonucleótidos se proporcionan a lo largo de la técnica tal como en los documentos WO96/11205 y WO98/52614 y las patentes de Ee . UU. n.os 4.948.882; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.580.731; 5.486.603; 5.608.046; 4.587.044; 4.667.025; 5.254.469; 5.245.022; 5.112.963; 5.391.723; 5.510475; 5.512.667; 5.574.142; 5.684.142; 5.770.716; 6.096.875; 6.335.432; y 6.335.437, el documento WO2012/083046.
Procedimiento de fabricación
En el presente documento se describen procedimientos para fabricar los oligonucleótidos de la invención que comprenden hacer reaccionar unidades de nucleótidos y de ese modo formar unidades de nucleótidos contiguas unidas covalentemente comprendidas en el oligonucleótido. Preferentemente, el procedimiento usa la química de la fosforamidita (véase, por ejemplo, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, páginas 287-313). Como se describe en el presente documento, el procedimiento comprende además hacer reaccionar la secuencia de nucleótidos contigua con un resto de conjugación (ligando). En el presente documento se describe un procedimiento se proporciona para fabricar la composición de la invención, que comprende mezclar el oligonucleótido o el oligonucleótido conjugado de la invención con un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables.
Composición farmacéutica
Como se describe en el presente documento, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los oligonucleótidos y/o conjugados de oligonucleótidos mencionados anteriormente y un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de sodio y potasio. En algunos modos de realización, el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato estéril. En algunos modos de realización, el oligonucleótido se usa en el diluyente farmacéuticamente aceptable a una concentración de solución 50-300 pM.
Las formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17.a ed., 1985. Para una breve revisión de los procedimientos para la administración de fármacos, véase, por ejemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). El documento WO2007/031091 proporciona otros ejemplos adecuados y preferentes de diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En el documento WO2007/031091 también se proporcionan dosis, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas farmacéuticas, combinaciones con otros agentes terapéuticos y formulaciones de profármacos adecuadas.
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la invención se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, que incluyen la vía de administración, el alcance de la enfermedad o la dosis que se va a administrar.
Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales o se pueden esterilizar por filtración. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso tal cual, o liofilizar, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración.
El pH de las preparaciones estará típicamente entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y lo más preferentemente entre 7 y 8, tal como 7 a 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida se pueden envasar en múltiples unidades de dosis única, cada una de las cuales contiene una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente, tal como en un envase sellado de comprimidos o cápsulas. La composición en forma sólida también se puede envasar en un recipiente para una cantidad flexible, tal como en un tubo comprimible diseñado para una crema o pomada de aplicación tópica.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido de la invención es un profármaco. En particular, con respecto a los conjugados de oligonucleótidos, el resto de conjugado se escinde del oligonucleótido una vez que el profármaco se administra al sitio de acción, por ejemplo, la célula diana.
Aplicaciones
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la presente invención se pueden utilizar como reactivos de investigación para, por ejemplo, diagnóstico, tratamientos y profilaxis.
En investigación, dichos oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos se pueden usar para modular específicamente la síntesis de la proteína PD-L1 en células (por ejemplo, cultivos in vitro) y animales de laboratorio, facilitando de este modo el análisis funcional de la diana o una valoración de su utilidad como diana para intervención terapéutica. Típicamente, la modulación de la diana se logra degradando o inhibiendo el ARNm que produce la proteína, evitando de ese modo la formación de proteínas o degradando o inhibiendo un modulador del gen o ARNm que produce la proteína.
Si se emplea el oligonucleótido de la invención en investigación o diagnóstico, el ácido nucleico diana puede ser un ADNc o un ácido nucleico sintético derivado de ADN o ARN.
En el presente documento se describe un procedimiento in vivo o in vitro para modular la expresión de PD-L1 en una célula diana que expresa PD-L1, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la invención en una cantidad eficaz a dicha célula.
Como se describe en el presente documento, la célula diana es una célula de mamífero, en particular una célula humana. La célula diana puede ser un cultivo celular in vitro o una célula in vivo que forma parte de un tejido en un mamífero. Como se describe en el presente documento, la célula diana está presente en el hígado. La célula diana del hígado se puede seleccionar de células parenquimatosas (por ejemplo, hepatocitos) y células no parenquimatosas tales como células de Kupffer, LSEC, células estrelladas (o células Ito), colangiocitos y leucocitos asociados al hígado (incluyendo linfocitos T y linfocitos NK). Como se describe en el presente documento, la célula diana es una célula presentadora de antígeno. Las células presentadoras de antígenos presentan xenoantígenos que forman complejos con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I o clase II en sus superficies. En algunos modos de realización, la célula presentadora de antígeno expresa MHC de clase II (es decir, células presentadoras de antígenos profesionales tales como células dendríticas, macrófagos y linfocitos B).
En el diagnóstico, los oligonucleótidos se pueden usar para detectar y cuantificar la expresión de PD-L1 en células y tejidos mediante transferencia de tipo Northern, hibridación in situ o técnicas similares.
Para tratamientos, los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la presente invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden administrar a un animal o un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno, que se puede aliviar o tratar mediante la reducción de la expresión de PD-L1, en particular por reducción de la expresión de PD-L1 en las células diana del hígado.
En el presente documento se describen procedimientos para tratar o evitar una enfermedad, que comprenden administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un oligonucleótido, un conjugado de oligonucleótidos o una composición farmacéutica de la invención a un sujeto que padece o es susceptible a la enfermedad.
La invención también se refiere a un oligonucleótido, conjugado de oligonucleótidos o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.
El oligonucleótido, el conjugado de oligonucleótidos o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra típicamente en una cantidad eficaz.
En el presente documento se describe el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos o composición farmacéutica de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno como se hace referencia en el presente documento. Como se describe en el presente documento, la enfermedad se selecciona de a) infecciones víricas del hígado tales como infecciones por el VHB, el VHC y el VHD; b) parasitosis tales como malaria, toxoplasmosis, leishmaniosis y tripanosomiasis y c) cáncer de hígado o metástasis en el hígado.
En el presente documento se describen oligonucleótidos, conjugados de oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos seleccionados de infecciones víricas o parasitosis. Como se describe en el presente documento, la enfermedad se selecciona de a) infecciones víricas del hígado tales como infecciones por el VHB, el VHC y el VHD; b) parasitosis tales como malaria, toxoplasmosis, leishmaniosis y tripanosomiasis y c) cáncer de hígado o metástasis en el hígado.
La enfermedad o trastorno, como se hace referencia en el presente documento, se asocia con agotamiento inmunitario. En particular, la enfermedad o trastorno se asocia con el agotamiento de las respuestas de los linfocitos T específicos del virus. Como se describe en el presente documento, la enfermedad o trastorno se puede aliviar o tratar mediante la reducción de la expresión de PD-L1.
Los procedimientos de la invención se emplean preferentemente para el tratamiento o la profilaxis frente a enfermedades asociadas a agotamiento inmunitario.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido, el conjugado de oligonucleótidos o las composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el restablecimiento de la respuesta inmunitaria contra un cáncer de hígado 0 metástasis en el hígado.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido, el conjugado de oligonucleótidos o las composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el restablecimiento de la respuesta inmunitaria contra un patógeno. Como se describe en el presente documento, el patógeno se puede encontrar en el hígado. Los patógenos pueden ser un virus o un parásito, en particular los descritos en el presente documento. En un modo de realización preferente, la enfermedad es el VHB.
En el presente documento se describe el uso de un oligonucleótido, un conjugado de oligonucleótidos o una composición farmacéutica como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el restablecimiento de la inmunidad contra una infección vírica o una parasitosis como se menciona en el presente documento.
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de infecciones víricas, en particular infecciones víricas en el hígado donde la vía de PD-1 se ve afectada (véase, por ejemplo, Kapoor y Kottilil 2014 Future Virol Vol. 9 págs. 565-585 y Salem y El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol.7 págs. 2449-2458). Las infecciones víricas del hígado se pueden seleccionar del grupo que consiste en las infecciones por los virus de la hepatitis, en particular el VHB, el VHC y el VHD, en particular formas crónicas de estas infecciones. En un modo de realización, los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usan para tratar la infección por el VHB, en particular la infección crónica por el VHB. Los indicadores de infecciones crónicas por el VHB son niveles altos de carga vírica (ADN del VHB) e incluso niveles mayores de partículas vacías de HBsAg (>100 veces más de viriones) en la circulación.
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la presente invención también se pueden usar para tratar infecciones víricas del hígado que se producen como coinfecciones con el VIH. Otras infecciones víricas que se pueden tratar con oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas de la presente invención son las infecciones por el VCML (virus de la coriomeningitis linfocítica) y por el VIH como monoinfección, la infección por el HSV-1 y -2 y otros herpesvirus. Estos virus no son hepatotróficos; sin embargo, pueden ser sensibles a la regulación por disminución de PDL1.
En algunos modos de realización, el restablecimiento de la inmunidad o la respuesta inmunitaria implica la mejora de la respuesta de los linfocitos T y/o linfocitos NK y/o el alivio del agotamiento de los linfocitos T, en particular la respuesta de los linfocitos T específicos del VHB, la respuesta de los linfocitos T específicos del VHC o la respuesta de los linfocitos T específicos del VHD. Una mejora de la respuesta de los linfocitos T se puede evaluar, por ejemplo, como un incremento de los linfocitos T en el hígado, en particular un incremento de los linfocitos T CD8+ y/o CD4+ en comparación con un control (por ejemplo, el nivel antes del tratamiento o el nivel en un sujeto tratado con vehículo) En otro modo de realización, son los linfocitos T CD8+ específicos del virus los que se restablecen o incrementan en comparación con el control), en particular los linfocitos T CD8+ específicas del v Hb o los linfocitos T CD8+ específicos del VHC o los linfocitos T CD8+ específicos del VHD se restablecen o incrementan en comparación con el control. En un modo de realización preferente, los linfocitos T CD8+ específicos para el antígeno s del VHB (HBsAg) y/o los linfocitos T CD8+específicos para el antígeno e del VHB (HBeAg) y/o los linfocitos T CD8+específicos para el antígeno central del VHB (HBcAg) se incrementan en sujetos tratados con un oligonucleótido, conjugado de oligonucleótidos o composición farmacéutica de la presente invención en comparación con el control. Preferentemente, los linfocitos T CD8+ específicos para el antígeno del VHB producen una o más citocinas, tales como interferón-gamma (IFN-y) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). El incremento de los linfocitos T CD8+ descrito anteriormente se observa en particular en el hígado. El incremento descrito en el presente documento debería ser estadísticamente significativo en comparación con un control. Preferentemente, el incremento es de al menos un 20 %, tal como un 25 %, tal como un 50 %, tal como un 75 % en comparación con el control. En otro modo de realización, los linfocitos citolíticos naturales (NK) y/o los linfocitos T citolóticos naturales (NKT) también se activan por los oligonucleótidos y conjugados de oligonucleótidos de la presente invención.
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de parasitosis, en particular parasitosis en las que la vía de PD-1 se ve afectada (véase, por ejemplo, Bhadra et al. 2012 J Infect Dis vol 206 págs. 125-134; Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci USA Vol.108 págs. 9196-9201; Esch et al. J Immunol vol 191 págs. 5542-5550; Freeman y Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 págs.
113-115; Gutierrez et al. 2011 Infect Immun Vol 79 págs. 1873-1881; Joshi et al. 2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431; Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 págs. 58-64; Wykes et al.2014 Front Microbiol Vol 5 págs. 249). Las parasitosis se pueden seleccionar del grupo que consiste en malaria, toxoplasmosis, leishmaniosis y tripanosomiasis. La malaria está provocada por protozoos del género Plasmodium, en particular de las especies P. vivax, P. malariae y P. falciparum. La toxoplasmosis es una enfermedad parasitaria provocada por Toxoplasma gondii. La leishmaniosis es una enfermedad provocada por parásitos protozoarios del género Leishmania. La tripanosomiasis está provocada por el protozoo del género Trypanosoma. La enfermedad de Chagas, que es la forma tropical provocada por la especie Trypanosoma cruzi, y la enfermedad del sueño está provocada por la especie Trypanosoma brucei.
En algunos modos de realización, el restablecimiento de la inmunidad implica el restablecimiento de una respuesta de los linfocitos T y los linfocitos NK específicos del parásito, en particular una respuesta de los linfocitos T específicos de Plasmodium, una respuesta de los linfocitos T y los linfocitos NK específicos de Toxoplasma gondii, una respuesta de los linfocitos T y los linfocitos NK específicos de Leishmania, una respuesta de los linfocitos T y los linfocitos NK específicos de Trypanosoma cruzi o una respuesta de los linfocitos T y los linfocitos NK específicos de Trypanosoma brucei. En otro modo de realización, lo que se restablece es la respuesta de los linfocitos T CD8+ y los linfocitos NK específicos del parásito.
Administración
Los oligonucleótidos o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía tópica (tal como en la piel, por inhalación, oftálmica u ótica) o enteral (tal como por vía oral o a través del tubo gastrointestinal) o parenteral (tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular o intratecal).
En un modo de realización preferente, el oligonucleótido o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran por vía parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intrarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, administración intratecal o intracraneal, por ejemplo intracerebral o intraventricular, intravítrea. En un modo de realización, el oligonucleótido o el conjugado de oligonucleótidos activo se administra por vía intravenosa. En otro modo de realización, el oligonucleótido o el conjugado de oligonucleótidos activo se administra por vía subcutánea.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido, el conjugado de oligonucleótidos o la composición farmacéutica de la invención se administra a una dosis de 0,1 - 15 mg/kg, tal como de 0,1 - 10 mg/kg, tal como de 0,2-10 mg/kg, tal como de 0,25 - 10 mg/kg, tal como de 0,1 - 5 mg/kg, tal como de 0,2 - 5 mg/kg, tal como de 0,25 - 5 mg/kg. La administración puede ser una vez a la semana, cada 2.a semana, cada tercera semana o incluso una vez al mes.
Politerapias
En algunos modos de realización, el oligonucleótido, el conjugado de oligonucleótidos o la composición farmacéutica de la invención es para su uso en un tratamiento de combinación con otro agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, el tratamiento de referencia contra las enfermedades o trastornos descritos anteriormente.
Para el tratamiento de infecciones crónicas por el VHB, se recomienda una combinación de fármacos antivíricos y moduladores del sistema inmunitario como tratamiento de referencia. Los fármacos antivíricos eficaces contra el VHB son, por ejemplo, análogos nucleos(t)ídicos. Hay cinco análogos nucleos(t)ídicos autorizados para el tratamiento de la infección por el VHB, a saber, lamivudina (Epivir), adefovir (Hepsera), tenofovir (Viread), telbivudina (Tyzeka), entecavir (Baraclude), que son eficaces para inhibir la replicación vírica (ADN del VHB) pero no tienen ningún efecto sobre los niveles de HBsAg. Otros fármacos antivíricos incluyen ribavirina y un tratamiento con anticuerpos contra el VHB (monoclonales o policlonales). Los moduladores del sistema inmunitario pueden ser, por ejemplo, interferón alfa-2a e interferón PEGilado alfa-2a (Pegasys) o agonistas de TLR7 (por ejemplo, GS-9620) o vacunas terapéuticas. El tratamiento con IFN-a muestra solo un efecto muy modesto en la reducción de la carga vírica, pero da como resultado cierta disminución del HBsAg, aunque muy ineficazmente (<10 % después de 48 semanas de tratamiento).
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la presente invención también se pueden combinar con otros fármacos antivirales eficaces contra el VHB, tales como los oligonucleótidos antisentido descritos en los documentos WO2012/145697 y WO2014/179629 o las moléculas de ARNip descritas en los documentos WO2005/014806, WO2012/024170., WO2012/2055362, WO2013/003520 y WO2013/159109.
Cuando los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la presente invención se administran en politerapias con otros agentes, se pueden administrar de forma secuencial o concurrente a un individuo. De forma alternativa, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden estar compuestas por una combinación de un oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la presente invención en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, como se describe en el presente documento, y otro agente terapéutico o profiláctico conocido en la técnica.
EJEMPLOS
Materiales y procedimientos
Secuencias de motivos y compuestos oligonucleotídicos
Tabla 5: lista de secuencias de motivos de oligonucleótidos (indicadas por SEQ ID NO) dirigidos al transcrito del PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1), diseños de estos, así como compuestos de oligonucleótidos antisentido específicos (indicados por CMP ID NO) diseñados en base a la secuencia de motivos.
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Las secuencias de motivos representan la secuencia contigua de nucleobases presentes en el oligonucleótido.
Los diseños se refieren al diseño de gapmeros, F-G-F', donde cada número representa el número de nucleósidos modificados consecutivos, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (primer número = flanco en 5'), seguido del número de nucleósidos de ADN (segundo número = región de hueco), seguido del número de nucleósidos modificados, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (tercer número = flanco en 3'), opcionalmente precedidos o seguidos de otras regiones repetidas de ADN y LNA, que no son necesariamente parte de la secuencia contigua que es complementaria al ácido nucleico diana.
Los compuestos de oligonucleótidos representan diseños específicos de una secuencia de motivos. Las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metilcitosina, todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
Tabla 6: Oligonucleótidos dirigidos a de transcritos de PD-L1 de ratón (SEQ ID NO: 4), diseños de estos, así como compuestos de oligonucleótidos específicos (indicados por CMP ID NO) diseñados en base a la secuencia de motivos.
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Las secuencias de motivos representan la secuencia contigua de nucleobases presentes en el oligonucleótido.
Los diseños se refieren al diseño de gapmeros, F-G-F', donde cada número representa el número de nucleósidos modificados consecutivos, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (primer número = flanco en 5'), seguido del número de nucleósidos de ADN (segundo número = región de hueco), seguido del número de nucleósidos modificados, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (tercer número = flanco en 3'), opcionalmente precedidos o seguidos de otras regiones repetidas de ADN y LNA, que no son necesariamente parte de la secuencia contigua que es complementaria al ácido nucleico diana.
Los compuestos de oligonucleótidos representan diseños específicos de una secuencia de motivos. Las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metilcitosina, todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
Tabla 7: Secuencias de motivos de oligonucleótidos y compuestos antisentido con conector bioescindible de ca en 5'.
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Las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metilcitosina, el subíndice o representa un enlace internucleosídico fosfodiéster y, a menos que se indique de otro modo, otros enlaces internucleosídicos son enlaces internucleósidos de fosforotioato.
Tabla 8: Compuestos de oligonucleótidos antisentido conjugados con GalNAc.
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GN2 representa el clúster de GalNAc trivalente que se muestra en la figura 3, C6 representa un grupo amino alquilo con 6 carbonos, las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metilcitosina, el subíndice o representa un enlace nucleosídico de fosfodiéster y, a menos que se indique de otro modo, los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato. Se muestran en las figuras 4 a 8 dibujos químicos que representan algunas de las moléculas.
Modelos de ratón VAA/VHB
Modelo de Pasteur:
Se crearon y se criaron ratones genomanipulados por desactivación de H-2 clase I/clase II, transgénicos para HLA-A2.1-/HLA-DR1 (a los que se hace referencia aquí como HLA-A2/DR1), en el Institut Pasteur. Estos ratones representan un modelo experimental in vivo para estudios de la función inmune humana sin ninguna interferencia con la respuesta del MHC del ratón (Pajot et al 2004 Eur J Immunol. 34 (11 ):3060-9.
En estos estudios se usó un vector vírico adenoasociado (VAA), serotipo 2/8 de VAA que porta un genoma de ADN del VHB competente para replicación. El vector VAA-VHB (lote GVPN n.° 6163) se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril para alcanzar un título de 5 x 1011 gv/ml. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa (i.v.) 100 pl de esta solución diluida (dosis/ratón: 5 x 1010 gv) en una vena de la cola. Se detectaron partículas víricas completas que contenían ADN del VHB en la sangre de ratones portadores del VHB. E1HBcAg se detectó durante hasta un año en el hígado conjuntamente con las proteínas circulantes del VHB HBeAg y HBsAg en la sangre. En todos los ratones transducidos con VAA2/8-VHB, el ADN del HBsAg, HBeAg y VHB persistió en el suero durante al menos un año (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).
Modelo de Shanghai:
En este modelo, los ratones infectados por un virus adenoasociado (VAA) recombinante que porta el genoma del VHB (VAA/VHB) mantienen una viremia y antigenemia estables durante más de 30 semanas (Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11,71-78).
Se compraron ratones macho C57BL/6 (4-6 semanas de edad), libres de patógenos específicos, de SLAC (Centro de Animales de Laboratorio de Shanghai de la Academia China de Ciencias) y se alojaron en una instalación de cuidado de animales en jaulas ventiladas individualmente. Se siguieron las pautas para el cuidado y uso de animales según lo indicado por WuXi IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, número de protocolo WUXI IACUC R20131126-Mouse). Se permitió que los ratones se aclimataran al nuevo entorno durante 3 días y se agruparon de acuerdo con el diseño experimental.
El VAA-VHB recombinante se diluyó en PBS, 200 pl por inyección. Este virus recombinante porta 1,3 copias del genoma del VHB (genotipo D, serotipo ayw).
El día 0, se inyectó a todos los ratones a través de la vena de la cola 200 pl de VAA-VHB. Los días 6, 13 y 20 después de la inyección del VAA, se extrajo sangre por vía submandibular a todos los ratones (0,1 ml de sangre/ratón) para la recogida de suero. El día 22 después de la inyección, los ratones con viremia estable estaban listos para el tratamiento con oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden estar conjugados con GalNAc o no conjugados.
Vacuna de ADN
El ADN plasmídico estaba libre de endotoxinas y fue fabricado por Plasmid-Factory (Alemania). pCMV-S2.S ayw codifica los dominios preS2 y S del HBsAg (genotipo D), y su expresión está controlada por el promotor génico temprano inmediato del citomegalovirus (Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci USA92:5307-5311). pCMV-HBc codifica la cápside del VHB que porta el Ag del núcleo de la hepatitis (HBc) (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).
El tratamiento con la vacuna de ADN se realizó como se describe aquí. Cinco días antes de la vacunación, se inyectó cardiotoxina (CaTx, Latoxan refL81-02, 50 pl/músculo) en el músculo de los ratones. CaTx despolariza las fibras musculares para inducir la degeneración celular, 5 días después de la inyección, aparecerán nuevas fibras musculares y recibirán la vacuna de ADN para una mejor eficacia de la transfección. El pCMV-S2.S ayw y pCMVCore a 1 mg/ml cada uno se mezclaron en igual cantidad y cada ratón recibió un total de 100 g por inyección intramuscular bilateral en los músculos tibiales anteriores tratados con cardiotoxina como se describe previamente en Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci USA92:5307-5311, bajo anestesia (100 pl de 12,5 mg/ml de ketamina, 1,25 mg/ml de xilacina).
Anticuerpo anti-PD-LI
Este es un clon 6E11 de anticuerpo IgG1 anti-PD-L1 de ratón, producido internamente en Genetech. Es un anticuerpo sustituto que bloquea de forma cruzada el atezolizumab y tiene una actividad de bloqueo in vitro similar al atezolizumab producido internamente en Roche. El anticuerpo se administró mediante inyección intraperitoneal (i.p.) a una dosis de 12,5 pg/g.
Síntesis de oligonucleótidos
La síntesis de oligonucleótidos es, en general, conocida en la técnica. A continuación se muestra un protocolo que se puede aplicar. Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden haber producido mediante procedimientos ligeramente variables en términos de aparato, soporte y concentraciones usados.
Los oligonucleótidos se sintetizan en soportes universales de uridina usando el enfoque de fosforamidita en un Oligomaker 48 a escala de 1 pmol. Al final de la síntesis, los oligonucleótidos se escinden del soporte sólido usando amoníaco acuoso durante 5-16 horas a 60 °C. Los oligonucleótidos se purifican mediante HPLC en fase inversa (RP-HPLC) o mediante extracciones en fase sólida y se caracterizan por UPLC, y la masa molecular se confirma además mediante ESI-MS.
Alargamiento del oligonucleótido:
El acoplamiento de p-cianoetil-fosforamiditas (ADN-A(Bz), ADN-G(ibu), ADN-C(Bz), ADN-T, LNA-5-metil-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) o LNA-T) se realiza usando una solución de 0,1 M de la amidita protegida con 5'-O-DMT en acetonitrilo y DCI (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M) como activador. Para el ciclo final, se puede usar una fosforamidita con las modificaciones deseadas, por ejemplo, un conector C6 para unir un grupo de conjugado o un grupo de conjugado como tal. La tiolación para la introducción de enlaces fosfortioato se lleva a cabo usando hidruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo/piridina 9:1). Se pueden introducir enlaces fosfordiéster usando yodo 0,02 M en THF/piridina/agua 7:2:1. El resto de los reactivos son los que se usan típicamente para la síntesis de oligonucleótidos.
Para la conjugación posterior a la síntesis en fase sólida, se puede usar una fosforamidita como conector amino C6 comercialmente disponible en el último ciclo de la síntesis en fase sólida y después de la desprotección y escisión del soporte sólido se aísla el oligonucleótido desprotegido con enlace amino. Los conjugados se introducen por medio de la activación del grupo funcional usando procedimientos de síntesis estándar.
De forma alternativa, el resto de conjugado se puede añadir al oligonucleótido mientras todavía se encuentra en el soporte sólido usando una fosforamidita del clúser con GalNAc o GalNAc como se describe en PCT/EP2015/073331 o en la solicitud de EP n.° 15194811.4.
Purificación por RP-HPLC:
Los compuestos brutos se purifican mediante RP-HPLC preparativa en una columna Phenomenex Jupiter C18 10 p 150x10 mm. Se usa acetato de amonio 0,1 M pH8 y acetonitrilo como tampones a un caudal de 5 ml/min. Las fracciones recogidas se liofilizan para dar el compuesto purificado típicamente como un sólido blanco.
Abreviaturas:
DCI: 4,5-dicianoimidazol
DCM: Diclorometano
DMF: Dimetilformamida
DMT: 4,4'-Dimetoxitritilo
THF: Tetrahidrofurano
Bz: Benzoílo
Ibu: Isobutirilo
RP-HPLC: Cromatografía de líquidos de alta rendimiento en fase inversa
Ensayo de T m
Se diluyen dúplex de oligonucleótidos y ARN diana (unidos a fosfato, PO) a 3 mM en 500 ml de agua sin RNasa y se mezclan con 500 ml de tampón de Tm 2x (NaCl 200 mM, EDTA 0,2 mM, nafosfato 20 mM, pH7,0). Se calienta la solución a 95 °C durante 3 min y a continuación se deja enfriar a temperatura ambiente durante 30 min. Las temperaturas de fusión (Tm) de los dúplex se midieron en un espectrofotómetro UV/VIS Lambda 40 equipado con un programador de temperatura Peltier PTP6 usando el programa informático PE TempLAB (Perkin Elmer). La temperatura se aumenta de 20 °C a 95 °C y a continuación baja a 25 °C, registrando la absorción a 260 nm. Se usan la primera derivada y los máximos locales tanto de la fusión como del enfriamiento para evaluar la Tm de los dúplex.
Ensayo in vitro de escisión del conector específico de tejido
Los oligonucleótidos marcados con FAM con el conector bioescindible que se va a someter a prueba (por ejemplo, un conector de fosfodiéster de ADN (conector PO)) se someten a escisión in vitro usando homogeneizados de los tejidos pertinentes (por ejemplo, hígado o riñón) y suero.
Se recogen las muestras de tejido y suero de un animal adecuado (por ejemplo, ratones, mono, cerdo o rata) y se homogeneizan en un tampón de homogeneización (Igepal CA-630 al 0,5 %, Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, pH8,0 (ajustado con NaOH 1 N). Se enriquecen los homogeneizados de tejido y el suero con oligonucleótido a concentraciones de 200 pg/g de tejido. Se incuban las muestras durante 24 horas a 37 °C y, después de esto, se extraen las muestras con fenol-cloroformo. Se someten las soluciones a análisis por AIE HPLC en un Dionex Ultimate 3000 usando una columna Dionex DNApac p-100 y un gradiente que varía de perclorato de sodio 10 mM a 1 M a pH7,5. Se determina el contenido de oligonucleótidos escindidos y no escindidos frente a un estándar usando tanto un detector de fluorescencia a 615 nm como un detector uv a 260 nm.
Ensayo de escisión por la nucleasa S1
Se someten oligonucleótidos marcados con FAM con conectores sensibles a la nucleasa S1 (por ejemplo, un conector de fosfodiéster de ADN (conector PO)) a escisión in vitro en extracto de nucleasa S1 o suero.
100 pM de los oligonucleótidos se someten a escisión in vitro por la nucleasa S1 en tampón de nucleasa (60 U pr.
100 pl) durante 20 y 120 minutos. Se detiene la actividad enzimática añadiendo EDTA a la solución tampón. Se someten las soluciones a análisis por AIE HPLC en un Dionex Ultimate 3000 usando una columna Dionex DNApac p-100 y un gradiente que varía de perclorato de sodio 10 mM a 1 M a pH7,5. Se determina el contenido de oligonucleótidos escindidos y no escindidos frente a un estándar usando tanto un detector de fluorescencia a 615 nm como un detector uv a 260 nm.
Preparación de células mononucleares de hígado
Se prepararon células de hígado de ratones VAA/VHB como se describe a continuación y de acuerdo con un procedimiento descrito por Tupin et al 2006 Methods Enzymol 417:185-201 con modificaciones menores. Después de sacrificar al ratón, se perfundió el hígado con 10 ml de PBS estéril a través de la vena porta hepática usando una jeringa con aguja G25. Cuando el órgano está pálido, se recogió el órgano en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (GIBCO® HBSS, 24020) suero de ternero fetal descomplementado (FCS) al 5 %. Se presionó suavemente el hígado recogido a través de un filtro celular de 100 pM (BD Falcon, 352360) y se suspendieron las células en 30 ml de HBSS FCS al 5 %. Se centrifugó la suspensión celular a 50 g durante 5 min. A continuación, se centrifugaron los sobrenadantes a 289 g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, se descartaron los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos en 15 ml a temperatura ambiente en una solución de Percoll isotónica al 35 % (GE Healthcare Percoll n.° 17-0891-01 diluido en r Pm I 1640 (GIBCO, 31870)) y se transfirieron a un tubo de 15 ml. Se centrifugaron además las células a 1360 g durante 25 min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante por aspiración y el sedimento que contenía células mononucleares se lavó dos veces con HBSS FCS al 5 %.
Se cultivaron las células en medio completo (medio esencial mínimo a (Gibco, 22571) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, n.° SH30066, lote APG21570), 100 U/ml de penicilina 100 pg/ml de estreptomicina 0,3 mg/ml de L-glutamina (Gibco, 10378), 1X aminoácidos no esenciales (Gibco, 11140), Hepes 10 mM (Gibco, 15630), piruvato de sodio 1 mM (Gibco, 11360) y p-mercaptoetanol 50 pM (LKB, 1830)).
Marcado de células en la superficie
Se sembraron las células en placas de 96 pocillos con fondo en U y se lavaron con PBS FACS (PBS que contenía seroalbúmina bovina al 1 % y azida sódica al 0,01 %). Se incubaron las células con 5 |jl de PBS FACS que contenía un anticuerpo de rata anti-CD16/CD32 de ratón y un marcador de viabilidad LD amarillo fijable, Thermofisher, L34959 durante 10 min en la oscuridad a 4 °C. A continuación, se tiñeron las células durante 20 min en la oscuridad a 4 °C con 25 pl de PBS FACS que contenía anticuerpos monoclonales (Mab) contra NK P46 BV421 (Mab de rata anti-NK P46 de ratón, Biolegend, 137612) y F4/80 (Mab de rata anti-F4/80 FITC de ratón, BD Biolegend, 123108) y dos marcadores de superficie suplementarios: también se añadieron PD1 (Mab de rata anti-PD1 PE de ratón, BD Biosciences, 551892) y PDL1 (Mab de rata anti-PDL1 BV711 de ratón, Biolegend, 124319).
Ensayo de tinción de citocinas intracelulares (ICS)
Se realizaron ensayos de ICS tanto en esplenocitos como en células mononucleares del hígado. Se sembraron las células en placas de 96 pocillos con fondo en U. Se incubaron Las placas con células durante la noche a 37 °C en medio completo solo como control negativo o con los péptidos descritos en la Tabla 9 a una concentración de 2 jg/ml. Se añadió brefeldina A a 2 pg/ml (Sigma, B6542) después de una hora de incubación.
Después del cultivo durante la noche, se lavaron las células con PBS FACS y se incubaron con 5 j l de PBS FACS que contenía anticuerpo de rata anti-CD16/CD32 de ratón y un marcador de viabilidad LD amarillo fijable, Thermofisher, L34959 durante 10 min en la oscuridad a 4 °C. A continuación, se tiñeron las células durante 20 min en la oscuridad a 4 °C con 25 j l de PBS FACS que contenía Mab. La mezcla estaba compuesta por anticuerpos monoclonales contra CD3 (Mab de hámster anti-CD3-PerCP de ratón, BD Biosciences, 553067), c D8 (Mab de rata anti-CD8-APC-H7 de ratón, BD Biosciences, 560182), CD4 (Mab de rat anti-CD4-PE-Cy7 de ratón, BD Biosciences, 552775) y linfocitos NK (Mab de rata anti-NK P46 Bv 421 de ratón, Biolegend, 137612). Se fijaron las células después de varios lavados y se permeabilizaron durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente con Cytofix/Cytoperm, se lavaron con solución Perm/Wash (BD Biosciences, 554714) a 4 °C.
Se realizó la tinción de citocinas intracelulares con anticuerpos contra IFNy (Mab de rata anti-IFNY-APC de ratón, clon XMG1.2, BD Biosciences, 554413) y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) (Mab de rata anti-TNFa-FITC de ratón, clon MP6-XT22; 1/250 (BD Biosciences 554418) durante 30 min en la oscuridad a 4 °C. Antes del análisis por citometría de flujo usando el analizador MACSOuant, se lavaron las células con Perm/Wash y se resuspendieron en PBS FACS que contenía formaldehído al 1 %.
Se seleccionaron CD3+CD8+CD4- y células CD3+CD8-CD4+ vivas y se presentaron en una curva de puntos. Se definieron dos regiones para seleccionar células positivas para cada citocina. El número de eventos encontrados en estas ventanas se dividió entre el número total de eventos en la población parental para proporcionar los porcentajes de linfocitos T que respondieron. Para cada ratón, el porcentaje obtenido en medio solo se consideró el fondo y se restó del porcentaje obtenido con estimulaciones peptídicas.
Se definió el umbral de positividad de acuerdo con los antecedentes del experimento, es decir, el porcentaje medio de células teñidas obtenido para cada grupo en condición de medio solo más dos desviaciones estándar. Solo el porcentaje de citocinas que representó al menos 5 eventos se consideró positivo.
Tabla 9: Epítopos restringidos a HLA-A2/DR1 contenidos en la proteína del núcleo del VHB y los dominios de la envoltura del HBsAg (S2+S).
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Ejemplo 1 Prueba de eficacia in vitro
Se realizó un recorrido génico a través del transcrito de PD-L1 humano principalmente usando gapmeros de 16 a 20 nucleótidos. La prueba de eficacia se realizó en un experimento in vitro en la línea celular de leucemia monocítica humana THP1 y en la línea celular de linfoma K no hodgkiniano humano (KARPAS-299).
Líneas celulares:
La línea celular THP1 y Karpas-299 se compraron originalmente de la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (ECACC) y se mantuvieron según lo recomendado por el proveedor en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO2.
Eficacia de los oligonucleótidos
Se añadieron células THP-1 (3.104 en RPMI-GLutamax, FBS al 10 %, Pen-Strep al 1 % (Thermo Fisher Scientific) a los oligonucleótidos (4-5 ul) en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se cultivaron durante 6 días en un volumen final de 100 pl/pocillo. Se cribaron los oligonucleótidos a una concentración única (20 pM) y en concentraciones en el intervalo de dosis de 25 pM a 0,004 pM (dilución 1:3 en agua). Se extrajo el ARNm total usando el kit de gran volumen de ARN celular MagNA Pure 96 en el sistema MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el análisis de expresión génica, se realizó RT-qPCR usando el kit TaqMan RNA-to-ct 1-Step (Thermo Fisher Scientific) en la máquina QuantStudio (Applied Biosystems) con cebadores Taqman prediseñados dirigidos a PDL1 y ACTB humanos usados como control endógeno (Thermo Fisher Scientific). Se calculó el nivel relativo de expresión de ARNm de PD-L1 usando el procedimiento 2(-Delta C(T)) y el porcentaje de inhibición como el % en comparación con la muestra de control (células no tratadas).
Se cultivaron células Karpas-299 en RPMI1640, glutamina 2 mM y FBS al 20 % (Sigma). Se sembraron las células a 10000 células/pocillo en placas de 96 pocillos incubadas durante 24 horas antes de la adición de oligonucleótidos disueltos en PBS. La concentración final de oligonucleótidos fue en una dosis única de 5 pM, en un volumen de cultivo final fue de 100 pl/pocillo o se añadió en un intervalo de respuesta a la dosis de 50 pM, 15,8 pM, 5,0 pM, 1,58 pM, 0,5 pM, 0,158 pM, 0,05 pM, a 0,0158 pM en 100 pl de volumen de cultivo. Se recogieron las células 3 días después de la adición de compuestos de oligonucleótidos y se extrajo el ARN usando el kit PureLink Pro 96 RNA Purification (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó el ADNc usando retrotranscriptasa M-MLT, decámeros aleatorios RETROscript, inhibidor de RNasa (Ambion) y un conjunto de dNTP 100 mM (Invitrogen, grado para PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de expresiones génicas, se realizó la qPCR usando TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)(Ambion) en una configuración en dúplex con ensayos con cebadores TaqMan para PD-L1 (Applied Biosystems; Hs01125299_m1) y TBP (Applied Biosystems; 4325803). El nivel relativo de expresión de ARNm de PD-L1 se muestra en la tabla 10 como % de la muestra de control (células tratadas con PBS).
Tabla 10: eficacia in vitro de compuestos anti-PD-L1 en líneas celulares THP1 y KARPAS-299 (promedio de n=3 experimentos). Los niveles de ARNm de PD-L1 se normalizan a TBP en células KARPAS-299 o ACTB en células THP1 y se muestran como % de control (células tratadas con PBS).
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Ejemplo 2 - Prueba de la eficacia in vitro en una curva de respuesta a la dosis
Se sometió a prueba una selección de oligonucleótidos de la tabla 10 en células KARPAS-299 usando diluciones seriadas semilogarítmicas en PBS (50 pM, 15,8 pM, 5,0 pM, 1,58 pM, 0,5 pM, 0,158 pM, 0,05 pM, a 0,0158 pM de oligonucleótidos) en el ensayo de eficacia in vitro descrito en el ejemplo 1. Se evaluó la CI50 y la inhibición máxima (% de expresión de PD-L1 residual) para los oligonucleótidos.
Los cálculos de la CE50 se realizaron en GraphPad Prism6. La CI50 y el nivel máximo de atenuación de PD-L1 se muestran en la tabla 11 como % de células tratadas (PBS) de control.
Tabla 11: Inhibición máxima como % de solución salina y CE50 en la línea celular KARPAS-299.
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Se sometió a prueba una selección de oligonucleótidos de la tabla 6 en células THP-1 usando una dilución seriada 1:3 en agua de 25 pM a 0,004 pM en el ensayo de eficacia in vitro descrito en el ejemplo 1. Se evaluó la CI50 y la inhibición máxima (porcentaje de expresión de PD-L1 residual) para los oligonucleótidos.
Los cálculos de la CE50 se realizaron en GraphPad Prism6. La CI50 y el nivel máximo de atenuación de PD-L1 se muestran en la tabla 12 como % de células tratadas (PBS) de control.
Tabla 12: Inhibición máxima como % de solución salina y CE50 en la línea celular THP1.
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Los resultados de la tabla 7 y 8 también se muestran en la figura 2 en relación con su posición cuando se dirigen al preARNm de PD-L1 de SEQ ID NO: 1.
A partir de esto, se puede observar que casi todos los compuestos tienen valores de CE50 por debajo de 1 pM y una atenuación del objetivo por debajo de un 25 % del nivel de expresión de PD-L1 en las células de control (tratadas con solución salina).
E je m p lo 3 - P o ten c ia y e fic a c ia in vitro y re d u cc ió n d e PD -L1 in vivo en ra to n es in d u c id o s con p o li(I:C ) u san d o o lig o n u c le ó tid o s a n tis e n tid o d e PD -L1 no c o n ju g a d o s y c o n ju g a d o s co n G a lN A c
La prueba de eficacia y potencia se realizó en un experimento in vitro en estudios de respuesta a la dosis en células MCP-11 usando los oligonucleótidos de la tabla 6. Los mismos oligonucleótidos, así como las versiones conjugadas con GalNAc (tabla 8 CMP ID NO755_2-765_2) se sometieron a prueba in vivo en ratones hembra C57BL/6J inducidos con poli(I:C) para determinar su capacidad para reducir el ARNm de PD-L1 y la expresión de la proteína.
Ensayo in vitro
Se añadieron células MCP-11 (adquiridas originalmente de ATCC) suspendidas en DMEM (n.° de cat. de Sigma D0819) complementado con suero de caballo al 10 %, L-glutamina 2 mM, 0,025 mg/ml de gentamicina y piruvato de sodio 1 mM a una densidad de 8000 células/pocillo a los oligonucleótidos (10 pl) en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se cultivaron durante 3 días en un volumen final de 200 pl/pocillo en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO2. Se seleccionaron oligonucleótidos en concentraciones dentro de un intervalo de dosis (50 pM, 15,8 pM, 5,0 pM, 1,58 pM, 0,5 pM, 0,158 pM, 0,05 pM y 0,0158 pM).
Se extrajo el ARNm total usando el kit PureLink Pro 96 RNA Purification (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó el ADNc usando retrotranscriptasa M-MLT, decámeros aleatorios RETROscript, inhibidor de RNasa (Ambion) y un conjunto de dNTP 100 mM (Invitrogen, grado para PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de expresiones génicas, se realizó una qPCR usando TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)(Ambion) en una configuración en dúplex con ensayos con cebadores TaqMan para el PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-Mg B Mm00452054-m1) y Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm01197698-m1). El nivel relativo de expresión de ARNm de PD-L1 se muestra en la tabla 9 como % de expresión de PD-L1 residual en % de muestras de control con PBS (células tratadas con PBS). Los cálculos de la CE50 se realizaron en GraphPad Prism6. La CE50 y el nivel máximo de atenuación de PD-L1 se muestran en la tabla 13 como % de células de control (PBS).
Ensayo in vivo
Se inyectaron por vía s.c. a ratones hembra C57BL/6J (20-23 g; 5 ratones por grupo) 5 mg/kg de oligonucleótidos no conjugados a PD-L1 de ratón o 2,8 mg/kg de oligonucleótidos conjugados con GalNAc a PD-L1 de ratón. Tres días más tarde, se inyectó a los ratones por vía i.v. 10 mg/kg de poli(I:C) (LWM, Invivogen). Se sacrificaron los ratones 5 h después de la inyección de poli(I:C) y se colocaron las muestras de hígado en RNAIater (Thermo Fisher Scientific) para la extracción de ARN o se congelaron en nieve carbónica para la extracción de la proteína.
Se extrajo el ARNm total de muestras de hígado homogeneizadas usando el kit PureLink Pro 96 RNA Purification (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó el ADNc usando retrotranscriptasa M-MLT, decámeros aleatorios RETROscript, inhibidor de RNasa (Ambion) y un conjunto de dNTP 100 mM (Invitrogen, grado para PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de expresiones génicas, se realizó una qPCR usando TaqMan® Fast Advanced Master Mix TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)(Ambion) en una configuración en dúplex con ensayos con cebadores TaqMan para el PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) y TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-p L Mm00446971_m1). El nivel relativo de expresión de ARNm de PD-L1 se muestra en la tabla 13 como % de muestras de control de ratones a los que se inyectó solución salina y poli (I:C).
Se prepararon homogeneizados de hígado homogeneizando muestras de hígado en 2 ml por 100 mg de T-PER® Tissue Protein Extraction Reagent para tejido (Thermo Fisher Scientific) mezclado con 1x Halt Protease Inhibitor Cocktail, sin EDTA (Thermo Fisher Scientific). Se midieron las concentraciones de proteína en los homogeneizados de hígado usando el reactivo de ensayo Coomassie Plus (Bradford) (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se separaron los homogeneizados de hígado (40 pg de proteína) en geles de poliacrilamida Bis-Tris Plus al 4-12 % (Thermo Fisher Scientific) en tampón de migración MOPS 1xy se transfirieron a membranas de nitrocelulosa usando el sistema de transferencia iBLOT Dry (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cortó cada mancha en dos partes horizontalmente en la banda de 64 kDa. Después del bloqueo en TBS que contenía leche desnatada al 5 % y Tween 20 al 0,05 %, se incubaron las membranas durante la noche a 4 °C con anticuerpo monoclonal de conejo anti-vinculina (n.° de cat. de Abcam ab129002) diluido 1:10000 (membranas superiores) o anticuerpo policlonal de cabra anti-mPD-L1 (n.° de cat. de R&D Systems AF1019) diluido 1:1000 (membranas inferiores) en TBS que contenía leche desnatada al 5 % y Tween 20 al 0,05 %. Se lavaron las membranas en TBS que contenía Tween 20 al 0,05 % y se expusieron durante 1 h a temperatura ambiente a anticuerpo de cerdo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (DAKO) diluido 1:3000 (membranas superiores) o anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra conjugado con HRP (DAKO) diluido 1:2000 en TBS que contenía leche desnatada al 5 % y Tween 20 al 0,05 %. Después del lavado de las membranas, se detectó la reactividad usando ECL select (Amersham GE Healthcare). Para cada grupo de ratones tratados con oligonucleótidos, se evaluó la intensidad de las bandas de PD-L1 en relación con las bandas de vinculina por comparación con las intensidades de las bandas de PD-L1/vinculina de los ratones a los que se inyectó solución salina y poli(I:C)(control). Los resultados se muestran en la tabla 13, y las transferencias de Western con pares de oligonucleótidos no conjugados y conjugados se muestran en la figura 9 A e .
Tabla 13: Eficacia in vitro e in vivo de oligonucleótidos en PD-L1 de ratón
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+++: similar a la intensidad de control de las bandas de PD-LI/vinculina; +: más débil que la intensidad de control de la banda de vinculina/PD-L1; : mucho más débil que la intensidad de control de la banda de vinculina/PD-L1; nd = no determinado.
A partir de los datos de la tabla 13 se puede observar que la conjugación de los oligonucleótidos con GalNAc mejora claramente la reducción de PD-L1 in vivo. La reducción de ARNm se correlaciona, en general, con una reducción de la proteína PD-L1. Excepto para CMP ID NO: 754_1, un valor de CE50 in vitro bajo refleja, en general, una buena reducción del ARNm de PD-L1 in vivo una vez que el oligonucleótido se conjuga con GalNAc.
E je m p lo 4 - F C /F D in vivo en h e p a to c ito s c la s ific a d o s y c é lu la s no p a re n q u im a to s a s d e ra to n es in d u c id o s con p o li(I:C )
Se investigó la distribución de oligonucleótidos conjugados y conjugados con GalNAc, así como la reducción del ARNm de PD-L1 en hepatocitos y células no parenquimatosas aislados de ratones inducidos con poli (I:C).
Se inyectaron por vía s.c. a ratones hembra C57BL/6J (n=3 por grupo) 5 mg/kg de oligonucleótido no conjugado (748_1) o 7 mg/kg de oligonucleótidos conjugados con GalNAc (759_2) dirigidos al ARNm de PD-L1 de ratón. Dos días más tarde, se inyectó a los ratones por vía i.p. 15 mg/kg de poli(I:C) (LWM, Invivogen). Se anestesió a los ratones 18-20 h después de la inyección de poli(I:C) y se perfundió el hígado a un caudal de 7 ml por minuto a través de la vena cava usando una solución salina equilibrada de Hank que contenía Hepes 15 mM y EGTA 0,38 mM durante 5 min seguido de solución de colagenasa (solución salina equilibrada de Hank que contiene 0,17 mg/ml de colagenasa de tipo 2 (Worthington 4176), BSA al 0,03 %, CaCl2 3,2 mM y 1,6 g/l de NaHCO3) durante 12 min. Después de la perfusión, se extrajo el hígado y se abrió la cápsula hepática, se filtró la suspensión de hígado a través de un filtro de células de 70 pm usando medio de William E y se extrajo una alícuota de la suspensión de células (= células hepáticas mixtas) para su análisis posterior. Se centrifugó el resto de la suspensión celular durante 3 min a 50xg. Se recogió el sobrenadante para la purificación posterior de las células no parenquimatosas. Se resuspendió el sedimento en 25 ml de medio de William E (n.° de cat. de Sigma W1878 complementado con 1x Pen/Strep, L-glutamina 2 mM y FBS al 10 % (ATCC n.° 30-2030)), se mezcló con 25 ml de medio de William E que contenía Percoll al 90 % y se precipitaron los hepatocitos por centrifugación a 50xg durante 10 min. Después de lavado 2x en medio de William E, se resuspendieron los hepatocitos precipitados en medio de Williams E. Se centrifugó el sobrenadante que contenía células no parenquimatosas a 500xg durante 7 min y se resuspendieron las células en 4 ml de medio RPMI y se centrifugaron a través de dos capas de percoll (percoll al 25 % y 50 %) a 1800xg durante 30 min. Tras la recogida de las células no parenquimatosas entre las dos capas de percoll, se lavaron las células y se resuspendieron en medio RPMI.
Se extrajo el ARNm total de los hepatocitos purificados, células no parenquimatosas y suspensión hepática total (células hepáticas no fraccionadas) usando el kit PureLink Pro 96 RNA Purification (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó el ADNc usando retrotranscriptasa M-MLT, decámeros aleatorios RETROscript, inhibidor de RNasa (Ambion) y un conjunto de dNTP 100 mM (Invitrogen, grado para PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de expresiones génicas, se realizó una qPCR usando TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)(Ambion) en una configuración en dúplex con ensayos con cebadores TaqMan para el PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) y TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). El nivel relativo de expresión de ARNm de PD-L1 se muestra en la tabla 10 como % de muestras de control de ratones a los que se inyectó solución salina y poli (I:C).
Se realizó el análisis del contenido de oligonucleótidos usando ELISA que empleó una sonda de captura biotinilada con la secuencia 5’-TACCGT-s-Bio-3’ y una sonda de detección conjugada con digoxigenina con la secuencia 5’-DIG-C12-S1-CCTGTG-3’. Las sondas consistieron únicamente en LNA con una cadena principal de fosfodiéster. Se homogeneizaron muestras de hígado (aproximadamente 50 mg) en 1,4 ml de tampón de lisis MagNa puré (n.° de cat. de Roche 03604721001) en un tubo Eppendorf de 2 ml que contenía una microesfera de acero inoxidable de 5 mm. Se homogeneizaron las muestras en un homogeneizador Retsch MM400 (Merck Eurolab) hasta que se obtuvo un lisado uniforme. Se incubaron las muestras durante 30 min a temperatura ambiente. Se generaron estándares añadiendo el compuesto de oligonucleótido antisentido no conjugado (CMP ID NO 748_1) en concentraciones definidas en una muestra de hígado no tratada y procesándolas como muestras. Se eligen concentraciones enriquecidas para que coincidan con el contenido previsto de oligonucleótidos de la muestra (dentro de ~ 10 veces).
Se diluyeron las muestras homogeneizadas un mínimo de 10 veces en 5 x tampón SSCT (NaCl 750 mM y citrato de sodio 75 mM, que contenía Tween-20 al 0,05 % (v/v), pH7,0) y una serie de diluciones de 6 veces Se hicieron diluciones 2 veces usando una solución de captura-detección (sonda de captura 35 nM y sonda de detección 35 nM en tampón SSCT 5x) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirieron las muestras a una placa recubierta con estreptavidina de 96 pocillos (n.° de cat. de Nunc 436014) con 100 pl en cada pocillo. Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Lavar tres veces con tampón SSCT 2 x y se añadió 100 pl de fragmento Fab anti-DIG-AP (Roche Applied Science, n.° de cat. 11 093274 910) diluido 1:4000 en PBST (solución salina tamponada con fosfato, que contiene Tween-20 al 0,05 % (v/v), pH 7,2, recién preparada) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Lavar tres veces con tampón SSCT 2 x y añadir 100 pl de solución de sustrato de fosfatasa alcalina (AP) (sustrato Blue Phos, código de producto KPL50-88-00, recién preparado). Se midió la intensidad del color espectrofotométricamente a 615 nm después de 30 minutos de incubación con agitación suave. Se exportaron los datos brutos de los lectores (programa informático Gen52.0) al formato de Excel y se analizaron adicionalmente en Excel. Se generaron curvas de calibración usando el programa informático GraphPad Prism 6 y un modelo de regresión logística 4PL.
Tabla 14: Expresión de PD-L1 y contenido de oligonucleótidos en suspensión total de hígado, hepatocitos y células no parenquimatosas de ratones con poli (I:C) tratados con oligonucleótidos no conjugados y conjugados con GalNAc, n=3.
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Los resultados muestran que el oligonucleótido no conjugado (CMP ID NO: 748_1) y el conjugado (CMP ID NO: 759_2) reducen el ARNm de PD-L1 igualmente bien en las células hepáticas totales. En hepatocitos aislados, el efecto del oligonucleótido conjugado es casi 5 veces más fuerte que el efecto del oligonucleótido no conjugado, mientras que los oligonucleótidos no conjugados mostraron un efecto dos veces más fuerte que los oligonucleótidos conjugados con GalNAc en células no parenquimatosas. En hepatocitos y células no parenquimatosas, la reducción de la expresión de ARNm de PD-L1 se correlaciona en cierta medida con el contenido de oligonucleótidos en estos tipos de células.
Ejemplo 5 - Atenuación de PD-L1 in vivo en ratones VAA/VHB usando oligonucleótidos antisentido de PD-L1 no conjugados y conjugados con GalNAc
En el presente estudio, se trataron ratones VAA/VHB con oligonucleótidos antisentido de PD-L1 no conjugados o conjugados con GalNAc, y se evaluó la expresión de ARNm de PD-L1 y la expresión génica del VHB en el hígado.
Se pretrataron ratones hembra HLA-A2/DR1 de 5-8 semanas de edad (5 animales por grupo) en la semana -1 con vehículo (solución salina), oligonucleótidos antisentido de PD-L1 no conjugados (CMP ID NO752_1 a 5 mg/kg s.c.) y oligonucleótidos antisentido de PD-L1 conjugados con GalNAc (CMP ID NO763_2 a 7 mg/kg s.c.), estas dosis corresponden a concentraciones equimolares de los oligonucleótidos. Se transdujo a los ratones 5 x 1010 gv de VAA-VHB en la semana 0 (para otros detalles véase la descripción del modelo de ratón de VAA/VHB en la sección Materiales y procedimientos). Desde la S1 después de la transducción de VAA-VHB a la S4, los ratones recibieron 4 inyecciones s.c. adicionales de oligonucleótidos de PD-L1 o vehículo (solución salina), administradas con una semana de diferencia.
Se tomaron muestras de sangre una semana antes de la transducción y una semana después de cada inyección.
Se sacrificó a los ratones dos semanas después de las últimas inyecciones y se extrajo el hígado después de la perfusión de PBS. Se cortó el hígado en trozos más pequeños y se congeló directamente.
Para medir la expresión génica del VHB, se extrajo ADN del suero con Qiagen Biorobot usando el kit QIAamp One para todos los ácidos nucleicos, n.° de cat. 965672, se diluyó el suero en una dilución 1:20 en PBS y se lisó un total de 100 |jl en 200 |jl de tampón AL. Se eluyó del kit el ADN en 100 jl.
Para la qPCR ultrarrápida, se usó TaqMan Gene Expression Master Mix (n.° de cat. 4369016, Applied Biosystems) conjuntamente con una mezcla de cebadores preparada añadiendo 1:1:0,5 de los siguientes cebadores F3_core, R3_core, P3_core (Integrated DNA Technologies, todos reconstituidos a 100 jM cada uno)
Directo (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG C T T T (SEQ ID NO: 784)
Inverso (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)
Sonda (P3_core): 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G -3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)
Se preparó una curva de calibración usando un plásmido del VHB (genotipo D, GTD) usando diluciones 1:10 comenzando con 1 x109 copias/l y bajando hasta 1 copia/l y se usó en 5 j l por reacción.
Para cada reacción, se añadieron 10 j l de Gene Expression Master Mix, 4,5 j l de agua, 0,5 j l de mezcla de cebadores y 5 j l de muestra o estándar y se ejecutó la qPCR.
Para el análisis, se calculó el número de copias/ml/pocillo usando la curva de calibración. Los resultados se muestran en la tabla 15.
Se midió la expresión de ARNm de PD-L1 usando la qPCR.
Se extrajo ARNm de trozos de hígado congelados que se añadieron a tubos de 2 ml que contenían microesferas de cerámica (tubos Lysing Matrix D, 116913500, mpbio) y 1 ml de Trizol.
Se homogeneizó la parte de hígado usando el Precellys Tissue Disruptor. Se añadió 200 j l de cloroformo al homogeneizado, se agitó en vórtex y se centrifugó a 4 °C durante 20 min a 10000 rpm. Se transfirió el ARN que contenía la fase transparente (alrededor de 500 ul) a un tubo nuevo y se añadió el mismo volumen de EtOH al 70 %. Después de mezclar bien, se transfirió la solución a una columna de centrifugación RNeasy y se extrajo el ARN de nuevo siguiendo el manual del kit RNeasy Mini Kit, n.° de cat. 74104, Qiagen (incluyendo el RNase-free DNase Set para digestión de ARN, n.° de cat. 79254). Elución en 50 j l de H2O. Se midió La concentración final de ARN y se ajustó a 100 ng/ul para todas las muestras.
Se realizó la qPCR en 7,5 j l de ARN usando el kit Taqman RNA-to-ct 1-step Kit, n.° de cat. 4392938, Thermo Fisher de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cebador directo mezclado usado contenía PD-L11-3 (número de cebador Mm00452054_m1, Mm03048247_m1 y Mm03048248_m1) y controles endógenos (ATCB Mm00607939_s1, CANX Mm00500330_m1, YWHAZ Mm03950126B_s1 y GUSB Mm01197698_m1)
Los datos se analizaron mediante el procedimiento 2A-ddct. Se usó la media de los cuatro controles endógenos para calcular los valores de dct. La expresión de PD-L1 con respecto a la media de los controles endógenos y en % de solución salina
Tabla 15: Expresión de ARNm de PD-L1 y ADN del VHB en ratones VAA/VHB tratados con oligonucleótidos no conjugados y conjugados con GalNAc, n=5.
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A partir de estos resultados, se puede observar que los oligonucleótidos tanto no conjugados como conjugados con GalNAc son capaces de reducir la expresión de ARNm de PD-L1 en el hígado de un ratón VAA/VHB, siendo algo mejor el oligonucleótido conjugado con GalNAc. Ambos oligonucleótidos también dieron como resultado cierta reducción en el ADN del VHB en el suero.
E je m p lo 6 - E fec to in vivo s o b re la re s p u e s ta d e los lin fo c ito s T en ra to n es V A A /V H B
En el presente estudio, se trataron ratones VAA/VHB de Pasteur con un anticuerpo u oligonucleótidos antisentido dirigidos a PD-L1. Los oligonucleótidos antisentido fueron no conjugados o bien conjugados con GalNAc. Durante el tratamiento, se inmunizó a los animales con una vacuna de ADN contra los antígenos HBs y HBc (véase la sección Materiales y procedimientos) para garantizar un cebado eficaz de los linfocitos T por las células presentadoras de antígenos. Se evaluó cómo el tratamiento afectaba a la población de células en el hígado y el bazo, así como la expresión de PD-L1 en estas poblaciones y si se podía identificar una respuesta de los linfocitos T específicos del VHB.
Protocolo de tratamiento:
Se trataron ratones hembra HLA-A2/DR1 de acuerdo con los protocolos siguientes. El estudio se realizó en dos subestudios separados, con ligeras diferencias en los regímenes de administración como se indica en la tabla 16 y 17 a continuación.
Se administraron La vacuna de ADN y el anticuerpo anti-PD-L1 como se describe en la sección de materiales y procedimientos. Los oligonucleótidos antisentido usados fueron CMP ID NO 748_1 (no conjugado) a 5 mg/kg y CMP ID NO: 759_2 (conjugado con GalNAc) a 7 mg/kg, ambos administrados como inyecciones subcutáneas (s.c.).
Tabla 16: Protocolo de tratamiento de ratones VAA/VHB con vacuna de ADN y vacuna de ADN anticuerpo anti-PD-L1, 6 ratones en cada grupo
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lsotipo = Ab de control de IgG de ratón, CaTx = cardiotoxina, ADN = vacuna de ADN, Ab = Ab anti-PD-L1 y * = recogida de suero
Tabla 17: Protocolo de tratamiento de ratón VAA/VHB con vacuna de ADN y vacuna de ADN oligonucleótido de PD-L1 (ASO) no conjugado o conjugado, 7 ratones en cada grupo
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ADN = vacuna de ADN, CaTx = cardiotoxina, Ab = Ab anti-PD-LI, ASO = oligonucleótido PDL-1 no conjugado, GN-ASO = oligonucleótido GalNAc-PDL-1 y * = recogida de suero
En el momento del sacrificio, se recogieron células mononucleares de sangre, bazo e hígado de cada ratón de cada grupo y se redujeron los glóbulos rojos (Lysing Buffer, BD biosciences, 555899). Las células mononucleares de hígado requirieron una preparación específica como se describe en la sección de materiales y procedimientos.
Poblaciones celulares:
En el hígado, la población de células se analizó marcando la superficie de las células mononucleares del hígado (véase materiales y procedimientos) usando citometría.
No se observaron cambios significativos en las frecuencias de linfocitos NK en el bazo y el hígado de los ratones tratados en comparación con los grupos de control (es decir, grupos inmunizados con vehículo y con ADN). La tabla 18 muestra que, en el hígado, los grupos tratados con oligonucleótido de PD-L1 no conjugado (CMP ID NO748_1) y oligonucleótido de PD-L1 conjugado con GalNAc (CMP ID NO: 759_2) tuvieron un incremento significativo en el número de linfocitos T en comparación con los grupos de control (es decir, grupos inmunizados con vehículo y con ADN) también presentados en la figura 10 A. Este incremento se debió a un incremento en las poblaciones de linfocitos T tanto CD4+ como CD8+(tabla 18 y figura 10B y 10C, respectivamente).
Tabla 18: Linfocitos T en el hígado después del tratamiento en millones de células.
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Expresión de PD-L1:
La expresión de la proteína PD-L1 se evaluó en macrófagos, linfocitos B y T del bazo e hígado en el momento del sacrificio. La presencia de anticuerpo anti-PD-L1 en la mezcla de anticuerpos de marcado de superficie (véase materiales y procedimientos) permitió la cuantificación de células que expresan PD-L1 por citometría.
En el bazo, no se observó una diferencia significativa entre los tratamientos en el % de macrófagos, linfocitos B y linfocitos T CD4+ que expresan PD-L1. El % de linfocitos T CD8+ que expresan PD-L1 fue menor en los ratones tratados con oligonucleótido de PD-L1 no conjugado (CMP ID NO 748_1) y oligonucleótido de PD-L1 conjugado con GalNAc (CMP ID NO: 759_2) en comparación con los otros tratamientos (datos no mostrado).
En el hígado, PD-L1 se expresó principalmente en linfocitos T CD8+ con una frecuencia media de un 32 % y 41 % en los grupos de control (los dos grupos de vacunación con vehículo y ADN combinados, respectivamente, figura 11 A). El tratamiento con oligonucleótido de PD-L1 no conjugado u oligonucleótido de PD-L1 conjugado con GalNAc dio como resultado una disminución de la frecuencia de linfocitos T CD8+ que expresan PD-L1 (véase la tabla 19, figura 11 A). También se observaron diferencias significativas en el % de células que expresaban PD-L1 para los linfocitos B y los linfocitos T CD4+después del tratamiento con ASO, aunque estos tipos de células expresan significativamente menos PD-L1 que los linfocitos T CD8+ (véase la tabla 19 y la figura 11B y C). El tratamiento con Ab anti-PD-L1 también dio como resultado una disminución aparente de la expresión de PD-L1 en todos los tipos de células. Sin embargo, es posible que esta disminución se deba a un bloqueo parcial del epítopo de PD-L1 por el anticuerpo anti-PD-L1 usado para el tratamiento, de modo que se evita que el anticuerpo de detección de PD-L1 en la mezcla de anticuerpos de marcado de superficie se una a PD-L1. Por lo tanto, lo que parece ser una regulación por disminución de PD-L1 por el anticuerpo anti-PD-L1 usado para el tratamiento puede ser el resultado de la competencia de epítopos entre el anticuerpo de tratamiento y el anticuerpo de detección.
Tabla 19: % de la población de células hepáticas con expresión de PD-L1
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Respuesta de los linfocitos T específicos del VHB:
Los linfocitos NK y los linfocitos T CD4+ y CD8+que producen citocinas proinflamatorias se detectaron usando ensayos de tinción de citocinas intracelulares (véase la sección Materiales y procedimientos) que detectan la producción de IFNy y TNFa.
En el bazo no se detectaron linfocitos NK y pocos linfocitos T CD4+ que secretaran IFNy- y TNFa (frecuencia <0,1 %) en el momento del sacrificio. Se detectaron linfocitos T CD8+ productores de IFNy dirigidos a los dos antígenos del VHB en ratones tratados con oligonucleótido de PD-L1 no conjugado u oligonucleótido de PD-L1 conjugado con GalNAc, así como en ratones de este estudio que recibieron solo la vacuna de ADN (datos no mostrados).
En los hígados de ratones portadores del VHB inmunizados con ADN, no se detectaron linfocitos NK productores de IFNy en el sacrificio, mientras que se detectaron linfocitos T CD4+ secretores de IFNy específicos para el antígeno del núcleo o para S2+S en el hígado de unos cuantos ratones inmunizados con ADN a una frecuencia baja (<0,4 %, datos no mostrados). Se detectaron linfocitos T CD8+ específicos del VHB S2+S que producen IFNy en la mayoría de los ratones inmunizados con ADN. La frecuencia de linfocitos T CD8+ que secretan IFNy se incrementó en los ratones tratados con una combinación de vacuna de ADN y oligonucleótido de PD-L1 no conjugado u oligonucleótido de PD-L1 conjugado con GalNAc, mientras que el tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 no añadió ningún efecto adicional aparente a la vacunación con ADN (figura 12). Se detectaron linfocitos T CD8+ que producen IFNy dirigidos a los antígenos de la envoltura y del núcleo en la mayoría de los grupos inmunizados con ADN (excepto el anticuerpo anti-PD-L1) (figura 12B). La mayoría de los linfocitos T específicos de S2-S produjeron tanto IFNy como TNFa (figura 12C). Los resultados se muestran también en la tabla 20.
Tabla 20: % de linfocitos T CD8+ específicos de los antígenos del VHB (S2-S o núcleo) a partir de la población total de células que producen IFNy o IFNy TNFa
Figure imgf000098_0001
E je m p lo 7 - E fec to in vivo s o b re el an tíg e n o d e l V H B y el A D N d el V H B en el s u e ro d e ra to n es V A A /V H B
En el presente estudio, se trataron ratones VAA/VHB de Shanghai (véase la sección Materiales y procedimientos) con el oligonucleótido antisentido de PD-L1 conjugado con GalNAc CMP ID NO 759_2.
Se evaluó cómo afectó el tratamiento a los antígenos HBe y HBs ya los niveles de ADN del VHB en el suero en comparación con los animales tratados con vehículo.
Protocolo de tratamiento:
En este estudio se usaron ratones macho C57BL/6 infectados por el virus adenoasociado (VAA) recombinante que portan el genoma del VHB (VAA/VHB) como se describe en el modelo de Shanghai en la sección de materiales y procedimientos. Se inyectó a los ratones (6 ratones por grupo) una vez a la semana durante 8 semanas el oligonucleótido antisentido CMP ID NO: 759_2 a 5 mg/kg o vehículo (solución salina), ambos administrados como inyecciones subcutáneas (s.c.). Se recogieron muestras de sangre cada semana durante el tratamiento, así como 6 semanas después del tratamiento. Se midieron los niveles de ADN del VHB, HBsAg y HBeAg en las muestras de suero como se describe a continuación. Los resultados de las primeras 10 semanas se muestran en la tabla 21 y en la figura 13. El estudio todavía estaba en curso en el momento de presentar la solicitud, por lo que no se han obtenido los datos de las 4 semanas restantes.
Detección de HBsAg y HBeAg:
Se determinaron los niveles séricos de HBsAg y HBeAg en el suero de ratones VAA/VHB infectados usando el inmunoanálisis de quimioluminiscencia para HBsAg (CLIA) y el kit HBeAg CLIA (Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou, China, n.° de cat. CL0310-2 y CL0312-2 respectivamente), según el protocolo del fabricante. En resumen, se transfirió 50 pl de suero a la placa de microvaloración recubierta con el anticuerpo respectivo y se añadió 50 pl de reactivo de conjugado enzimático. Se incubó la placa durante 60 minutos en un agitador a temperatura ambiente antes de lavar todos los pocillos seis veces con tampón de lavado usando una lavadora automática. Se añadieron a cada pocillo 25 pl de sustrato A y, a continuación, 25 pl de sustrato B. Se incubó la placa durante 10 min a TA antes de medir la luminiscencia usando un lector de luminiscencia Envision. El HBsAg se administra en la unidad UI/ml; donde 1 ng de HBsAg = 1,14 UI. El HBeAg se administra en la unidad NCU/ml de suero.
Extracción de ADN del VHB y qPCR:
Inicialmente, se diluyó el suero de los ratones en un factor de 10 (1:10) con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se extrajo el ADN usando el robot MagNA Pure 96 (Roche). Se mezclaron 50 pl del suero diluido en un cartucho de procesamiento con 200 pl de tampón de lisis externo MagNA Pure 96 (Roche, n.° de cat. 06374913001) y se incubó durante 10 minutos. A continuación, se extrajo el ADN usando el “MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Small Volume Kit” (Roche, n.° de cat. 06543588001) y el protocolo “Viral NA Plasma SV external lysis 2.0”. El volumen de elución de ADN fue de 50 pl.
Se realizó La cuantificación del ADN del VHB extraído usando una máquina qPCR Taqman (ViiA7, life technologies). Cada muestra de ADN se analizó por duplicado en la PCR. Se añadió 5 pl de muestra de ADN a 15 pl de mezcla maestra de PCR que contenía 10 pl de TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems, n.° de cat.
4369016), 0,5 |jl de cebador/sonda para qPCR PrimeTime XL (IDT) y 4,5 j l de agua destilada en una placa de 384 pocilios y se realizó la PCR usando los siguientes ajustes: incubación con UDG (2 min, 50 °C), activación enzimática (10 min, 95 °C) y PCR (40 ciclos con 15 s, 95° para desnaturalización y 1 min, 60 °C para hibridación y extensión). Se calcularon los números de copias de ADN a partir de los valores Ct basados en una curva de calibración de ADN plasmídico del VHB por el programa informático VIIA7.
Secuencias para cebadores y sondas TaqMan (IDT):
Cebador directo para antígeno del núcleo (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)
Cebador inverso (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)
Sonda Taqman (P3_core): 56-FAM/ AGC TCC AAA /ZEN/ TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G /3IABkFQ (SEQ ID NO: 786).
Tabla 21: Niveles de ADN del VHB, HBsAg y HBeAg en suero de ratones VAA/VHB después del tratamiento con oligonucleótido antisentido de PD-L1 conjugado con GalNAc.
Figure imgf000099_0001
A partir de este estudio se puede observar que el oligonucleótido antisentido de PD-L1 conjugado con GalNAc CMP NO759_2 tiene un efecto significativo sobre la reducción de los niveles de ADN del VHB, HBsAg y HBeAg en suero después de 6 semanas de tratamiento, y el efecto se mantiene durante al menos 2 semanas después de finalizado el tratamiento.
E je m p lo 8 - A te n u a c ió n d e PD -L1 in vitro en h e p a to c ito s p rim ario s h u m an o s u san d o o lig o n u c le ó tid o s d e P D -L1 c o n ju g a d o s con G a lN A c
Se investigó usando la genómica la capacidad de los compuestos de oligonucleotídicos antisentido de PD-L1 conjugados con GalNAc para reducir el transcrito de PD-L1 en hepatocitos humanos primarios.
Cultivo celular
Se suspendieron hepatocitos humanos crioconservados en WME complementado con suero de ternero fetal al 10 %, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml) y L-glutamina (0,292 mg/ml) a una densidad de aprox. 5x106 células/ml y se sembraron en placas de 24 pocillos recubiertas de colágeno (Becton Dickinson AG, Allschwil, Suiza) a una densidad de 2 x 105 células/pocillo. Se cultivaron previamente las células durante 4 h permitiendo la unión a placas de cultivo celular antes de comenzar el tratamiento con oligonucleótidos a una concentración final de 100 jM . Los oligonucleótidos usados se muestran en la tabla 21 y la tabla 8, el vehículo fue PBS. Se reemplazó el medio de siembra por 315 j l de WME libre de suero (complementado con penicilina (100 U/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), L-glutamina (0,292 mg/ml)) y se añadieron 35 j l de soluciones madre de oligonucleótidos 1 mM en PBS al cultivo celular y se dejó en las células durante 24 horas o 66 horas.
Preparación de la colección
El perfil de expresión de la transcripción se realizó usando la química de ARNm de Illumina Stranded en la plataforma de secuenciación de Illumina con una estrategia de secuenciación de 2 lecturas finales emparejadas de 51 pb y una profundidad de lectura mínima de 30 M por muestra (Q al cuadrado EA). Se lisaron Las células en los pozos añadiendo 350 j l de tampón Qiagen RLT y se incorporaron en un esquema de aleatorización.
Se purificó el ARNm usando el Qiagen RNeasy Mini Kit. Se cuantificó el ARNm y se evaluó la integridad usando un bioanalizador Agilent. Tras la evaluación de la calidad inicial del ARN aislado, se observó que todas las muestras cumplían la métrica de calidad de entrada de 100 ng con puntuaciones RIN >7,0.
Se generaron colecciones de secuenciación para todas las muestras usando la preparación de colecciones de ARNm Illumina TruSeq Stranded, comenzando con 100 ng de ARN total. Se analizaron las colecciones de ADCc finales para determinar la distribución de tamaño y, usando un Agilent Bioanalyzer (kit DNA1000), se cuantificaron mediante qPCR (KAPA Library Quant Kit) y se normalizaron a 2 nM en preparación para la secuenciación. Se usó el Standard Cluster Generation Kit v5 para unir las colecciones de ADNc a la superficie de la cubeta de lectura y el cBot de forma isotérmica para amplificar las construcciones de ADNc unidas hasta clústers clonales de ~ 1000 copias cada uno. La secuencia de ADN se determinó mediante tecnología de secuenciación por síntesis usando el kit TruSeq SBS.
Procesamiento de datos
Se asignaron lecturas de secuenciación de extremo emparejado de Illumina de 2x51 pb de longitud en el genoma de referencia humano hg 19 usando el programa de alineación de lectura corta GSNAP. Se convirtieron las alineaciones en formato SAM en archivos de alineación ordenados en formato BAM usando el programa SAMTOOLS. Se estimaron los recuentos de lectura de genes para PD-L1 en base a la anotación de exones de NCBI RefSeq, especificada por el archivo GTF correspondiente para hg 19. Se aplicó un paso de normalización que considera el tamaño diferente en la colección de cada muestra usando el paquete DESeq2 R.
La reducción en el transcrito de PD-L1 después de la incubación con compuestos de oligonucleótidos antisentido de PD-L1 conjugados con GalNAc se muestra en la tabla 22.
Tabla 22: Reducción del transcrito de PD-L1 en hepatocitos primarios humanos después del tratamiento con oligonucleótidos conjugados con GalNAc, n=4
Figure imgf000100_0001
Los cinco compuestos antisentido conjugados con GalNAc mostraron una reducción significativa del transcrito de PD L1 después de 24 y 66 horas de incubación en comparación con las muestras tratadas con vehículo. E je m p lo 9 - C E 50 d e o lig o n u c le ó tid o s a n tis e n tid o d e PD -L1 no c o n ju g a d o s y c o n ju g a d o s en c é lu la s A S G P R -H e p a R G in fe c ta d a s p o r el V H B
Se comparó la potencia de dos oligonucleótidos antisentido de PD-L1, no conjugado y el equivalente conjugado con GalNAc, en células ASGPR-HepaRG infectadas por el VHB.
Línea celular
Se cultivaron células HepaRG (Biopredic International, Saint-Gregoire, Francia) en medio de Williams E (complementado con un suplemento de crecimiento de HepaRG al 10 % (Biopredic). A partir de esta línea celular, se generó una línea celular HepaRG que sobreexpresa de manera estable ASGPR1 y ASGPR2 humanos usando un procedimiento lentiviral. Se transdujeron células HepaRG en proliferación en MOI 300 con un lentivirus producido a demanda por Sirion biotech (CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro) que codifica ASGPR1 y 2 humanas bajo el control de un promotor de CMV y un gen de resistencia a la puromicina. Se seleccionaron células transducidas durante 11 días con 1 pg/ml de puromicina y, a continuación, se mantuvieron en la misma concentración de antibiótico para garantizar la expresión estable de los transgenes. Se confirmó la sobreexpresión de ASGPR1/2 tanto a nivel de ARNm mediante RT-qPCR (ASGPR1: 8560 veces frente a no transducido, ASGPR2: 2389 veces frente a no transducido), como a nivel de proteína mediante análisis por citometría de flujo.
Se diferenciaron las células usando DMSO al 1,8 % durante al menos 2 semanas antes de la infección. El genotipo D del VHB se derivó del sobrenadante del cultivo celular HepG2/2/15 y se concentró usando precipitación con PEG. Para evaluar la actividad de los compuestos de prueba frente al VHB, se infectaron células ASGPR-HepaRG diferenciadas en placas de 96 pocillos por el VHB a una MOI de 20 a 30 durante 20 h, antes se lavaron las células 4 veces con PBS para extraer el inóculo del VHB.
Potencia de los oligonucleótidos
L i i n li n l i
Figure imgf000101_0001
se añadieron a las células ASGPR-HepaRG infectadas por el VHB el día 7 y el día 10 después de la infección usando diluciones seriadas de 25 pM a 0,4 nM (diluciones 1:4 en PBS). Se recolectaron las células el día 13 después de la infección.
Se extrajo el ARNm total usando el kit de gran volumen de ARN celular MagNA Pure 96 en el sistema MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de la expresión génica, se realizó una RT-qPCR como se describe en el ejemplo 5.
Los datos se analizaron mediante el procedimiento 2A-ddct. Se usó actinaB como control endógeno para calcular los valores de dct. La expresión de PD-L1 es con respecto a los controles endógenos y al vehículo de solución salina. Los cálculos de la EC50 se realizaron en GraphPad Prism6 y se muestran en la tabla 23.
Tabla 23: CE50 en células ASGPR-HepaRG infectadas por el VHB, n=4.
Figure imgf000101_0002
Estos datos muestran claramente que la conjugación con GalNAc de los oligonucleótidos antisentido de PD-L1 mejora significativamente los valores de CE50.
E je m p lo 10 - Fun c ió n d e e s tim u la c ió n d e los lin fo c ito s T en P B M C d e riv a d a s d e p a c ie n te s co n in fecc ió n c ró n ic a p o r el V H B
Se investigó si los compuestos antisentido de PD-L1 no conjugados podrían incrementar la función de los linfocitos T de pacientes con infección crónica por el VHB (HBC) después de la estimulación ex vivo de los antígenos del VHB de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
Se descongelaron y sembraron PBMC congeladas de tres pacientes con infección crónica por el VHB a una densidad de 200000 células/pocillo en 100 pl de medio (RPMI1640 GlutaMax suero humano al 8 % Hepes 25 mM PenStrep al 1 %). Al día siguiente, se estimularon las células con PepMix HBV Large Envelope Protein 1 pM o PepMix HBV Core Protein 1 pM (véase la tabla 9) con o sin 5 pM de CMP ID NO: 466_1 o CMP ID NO: 640_1 en 100 pl de medio que contenía 100 pg/ml de IL-12 y 5 ng/ml de IL-7 (la estimulación con concanavalina solo se aplicó el día 8). Cuatro días después, se renovó el tratamiento con oligonucleótidos antisentido de PD-L1 con medio que contenía 50 UI de IL-2. El día 8 después de la primera estimulación, se volvieron a estimular las células con PepMix o 5 pg/ml de Concanavalina A más oligonucleótido antisentido de PD-L1 durante 24 h. Durante las últimas 5 h de la estimulación, se añadieron 0,1 pl de Brefeldina A, 0,1 pl de Monensina y 3 pl de anti-CD-107 humano (APC).
Después de 24 h, se lavaron las células con tampón de tinción (PBS BSA al 1 % azida sódica al 0,09 % EDTA) y se aplicó tinción superficial durante 30 min a 4 °C [anti-CD3 humano (BV605), anti-CD4 humano (FITC), anti-CD8 humano (BV711), anti-PDL1 humano (BV421), anti-PD1 humano (PerCP-Cy5.5) y tinción viva y muerta (BV510) (BD Biosciences)]. Se fijaron las células en tampón de fijación BD durante 15 min a 4 °C. A la mañana siguiente, se permeabilizaron las células con BD Perm/Wash Buffer durante 15 min a 4 °C y se realizó una tinción intracelular durante 30 min a 4 °C [anti-INFY humano (PE)]. Después de lavar en tampón de lavado/permeabilización, se disolvieron las células en 250 pl de tampón de tinción.
La medición por FACS se realizó en un BD Fortessa (BD Biosciences). Para el análisis, la población celular completa se seleccionó primero en células vivas (tinción Live and Death, BV510) y a continuación en células CD3+ (BV605). A continuación, las células CD3+ se representaron gráficamente como CD107a+ (APC) frente a IFNy+ (PE).
Los resultados se muestran en la tabla 24.
Tabla 24: Efecto del tratamiento con PD-L1 ASO en linfocitos T CD3+ de PBMC aislados de tres pacientes con infección crónica por el VHB.
Figure imgf000102_0001
A partir de estos datos, se puede observar que la estimulación del antígeno por sí misma es capaz de inducir la activación de los linfocitos T (% de incremento de las células CD3+ que expresan INFy y/o CD107a) en las PBMC de pacientes con HBC (n=3). La adición del oligonucleótido antisentido de PD-L1 CMP466_1 o 640_1 dio como resultado un incremento adicional de la respuesta de los linfocitos T CD3+. Este incremento se observó principalmente en el grupo con estimulación de la envoltura del VHB.

Claims (20)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un oligonucleótido antisentido de fórmula CCtatttaacatcAGAC i en el que las letras mayúsculas representan nucleósidos de beta-D-oxi LNA, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metilcitosina y todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
2. Un conjugado de oligonucleótidos antisentido que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 1 y un resto de conjugado unido covalentemente a dicho oligonucleótido.
3. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 2, en el que está presente un conector entre el oligonucleótido y el resto de conjugado.
4. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el resto de conjugado es un resto dirigido al receptor para la asialoglicoproteína.
5. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 4, en el que el resto dirigido al receptor para la asialoglicoproteína es un resto de N-acetilgalactosamina trivalente (GalNAc).
6. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el conector es un conector fisiológicamente lábil.
7. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 6, en el que el conector fisiológicamente lábil es un conector susceptible a las nucleasas.
8. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el conector fisiológicamente lábil comprende un dinucleótido de citidina-adenosina.
9. El conjugado de oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 2, en el que está presente un conector entre el oligonucleótido y el resto de conjugado; en el que además el resto de conjugado comprende un resto dirigido al receptor para la asialoglicoproteína que es un resto de N-acetilgalactosamina trivalente (GalNAc); en el que el conector es un conector fisiológicamente lábil; en el que además el conector fisiológicamente lábil comprende un dinucleótido de citidina-adenosina.
10. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 o el conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 y un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato estéril.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en la que la sal farmacéuticamente aceptable es sodio.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en la que la sal farmacéuticamente aceptable es potasio.
14. Un procedimiento in vitro para modular la expresión de PD-L1 en una célula diana que está expresando el PD-L1, comprendiendo dicho procedimiento administrar el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en una cantidad eficaz a dicha célula.
15. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en el restablecimiento de la respuesta inmunitaria contra un virus.
16. El oligonucleótido antisentido, el conjugado de oligonucleótidos antisentido o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el virus es el VHB.
17. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en el restablecimiento de la respuesta inmunitaria contra un parásito.
18. El oligonucleótido antisentido, el conjugado de oligonucleótidos antisentido o la composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en el que el restablecimiento de la respuesta inmunitaria es un incremento en el hígado de los linfocitos T CD8+ específicos para uno o más antígenos del VHB en comparación con un control.
19. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso como medicamento.
20. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, el conjugado de oligonucleótidos antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 o la composición farmacéutica de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en el tratamiento de la infección por el VHB.
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