RS61528B1 - Oligonukleotidi za smanjenje ekspresije pd-l1 - Google Patents

Oligonukleotidi za smanjenje ekspresije pd-l1

Info

Publication number
RS61528B1
RS61528B1 RS20210240A RSP20210240A RS61528B1 RS 61528 B1 RS61528 B1 RS 61528B1 RS 20210240 A RS20210240 A RS 20210240A RS P20210240 A RSP20210240 A RS P20210240A RS 61528 B1 RS61528 B1 RS 61528B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleosides
antisense oligonucleotide
region
cells
Prior art date
Application number
RS20210240A
Other languages
English (en)
Inventor
Lykke Pedersen
Hassan Javanbakht
Malene Jackerott
Søren Ottosen
Souphalone Luangsay
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS61528B1 publication Critical patent/RS61528B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

OPIS
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na oligonukleotide (oligomere) koji su komplementarni ligandu programirane smrti (PD-L1), što dovodi do smanjenja ekspresije PD-L1 u jetri. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak ublažavanja iscrpljenosti T ćelija koju uzrokuje infekcija jetre ili rak jetre. Radi se o infekcijama kao što je hronični HBV, HCV i HDV, te infekcija parazitima poput malarije i toksoplazmoze (koje izazivaju npr. protozoa Plasmodium, posebno vrsta P. vivax, P. malariae i P. falciparum).
Osnova
Poznato je da kostimulacijski put koji se sastoji od receptora programirane smrti-1 (PD-1) i njegovog liganda PD-L1 (ili B7-H1 ili CD274) direktno doprinosi iscrpljenosti T ćelija zbog čega dolazi do izostanka kontrole virusa tokom hroničnih infekcija jetre. Put PD-1 takođe igra ulogu u autoimunitetu jer miševi koji imaju poremećen ovaj put razvijaju autoimune bolesti.
Pokazalo se da antitela koja blokiraju interakciju između PD-1 i PD-L1 pojačavaju odgovor T ćelija, posebno odgovor CD8+ citotoksičnih T ćelija (videti Barber et al. 2006 Nature Vol.439 str 682 i Maier et al.2007. J. Immunol. Vol 178 str 2714).
WO2006/042237 opisuje postupak za dijagnozu raka pomoću procene ekspresije PD-L1 (B7-H1) u tumorima i predlaže primenu kod pacijenta agensa koji ometa interakciju PD-1/PD-L1. Agensi za ometanje mogu biti antitela, fragmenti antitela, siRNK ili antisense oligonukleotidi. Nema konkretnih primera takvih agensa za ometanje, niti se pominju hronične infekcije jetre.
Inhibicija PD-L1 posredstvom ometanja RNK-om koja koristi dvolančane molekule RNK (dsRNK, RNKi ili siRNK) takođe je objavljena, na primer u WO2005/007855, WO2007/084865 i US8,507,663. Tu se nigde ne opisuje ciljana isporuka u jetru.
Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 opisuje in vivo isporuku molekula siRNK koje ciljaju PD-L1, u Kupfferove ćelije, čime se poboljšava klirens NK i CD8+ T ćelija kod miševa zaraženih MCMV-om. U ovom radu se dolazi do zaključka da molekuli siRNA koji ciljaju PD-L1, kad su isporučeni u hepatocite nisu efikasni po pitanju pojačavanja efektorske funkcije CD8+ T ćelija.
Pristup siRNK značajno se razlikuje od pristupa u kojem se koristi jednolančani antisense oligonukleotid, jer su biodistribucija i način delovanja sasvim različiti. Kao što je opisano u Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res .Comm. Vol. 306, str. 712-717, antisense oligonukleotidi i siRNK imaju različite preferencije za ciljna mesta u mRNK. WO2016/138278 opisuje inhibiciju imunoloških kontrolnih tačaka, uključujući PD-L1, pri čemu se koriste dva ili više jednolančanih antisense oligonukleotida koji su povezani na njihovim 5' krajevima. Ova primena ne spominje HBV ili ciljanu isporuku u jetru.
Cilj pronalaska
Predmetni pronalazak identifikuje nove oligonukleotide i oligonukleotidne konjugate koji vrlo efikasno smanjuju PD-L1 mRNK u ćelijama jetre, kako u ćelijama parenhima (npr. hepatocitima), tako i u neparenhimskim ćelijama kao što su Kupfferove ćelije i sinusoidne endotelne ćelije jetre (LSEC). Smanjujući ili utišavajući PD-L1, oligonukleotidi i oligonukleotidni konjugati smanjuju inhibiciju posredovanu PD-1-om i time podstiču imunostimulaciju iscrpljenih T ćelija. Ublažavanje iscrpljenosti T ćelija kod hronične patogene infekcije jetre ima za rezultat vraćanje imunološke kontrole i smanjenje nivoa virusnih antigena u krvi tokom hronične patogene infekcije jetre. Oligonukleotidi i oligonukleotidni konjugati iz predmetnog pronalaska mogu takođe da aktiviraju ćelije prirodne ubice (NK) i T ćelije prirodne ubice (NKT).
Konjugati oligonukleotida omogućavaju lokalno smanjenje PD-L1 u ćelijama jetre i stoga smanjuju rizik od autoimunih nuspojava, poput pneumonitisa, nevirusnog hepatitisa i kolitisa, povezanih sa sistemskim smanjenjem PD-L1.
Rezime pronalaska
U jednom aspektu, predmetni pronalazak je antisense oligonukleotid formule CCtatttaacatcAGAC, pri čemu velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNA nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, svi LNA C su 5-metil citozin, a sve internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je konjugat antisense oligonukleotida koji sadrži oligonukleotid iz predmetnog pronalaska i konjugovani ostatak kovalentno vezan za navedeni oligonukleotid.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak je farmaceutski preparat koji sadrži antisense oligonukleotid iz predmetnog pronalaska ili konjugat antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, rastvarač, nosač, so i/ili adjuvans.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je in vitro postupak za modulaciju ekspresije PD-L1 u ciljnoj ćeliji koja eksprimira PD-L1, pri čemu se spomenuti postupak sastoji od primeni na navedenu ćeliju antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska, konjugat antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska ili farmaceutskog preparata iz bilo kog od predmetnih pronalazaka, u delotvornoj količini.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je antisense oligonukleotid iz predmetnog pronalaska, konjugat antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska ili farmaceutski preparat iz predmetnog pronalaska, za primenu u obnavljanju imunološkog odgovora na virus.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je antisense oligonukleotid iz predmetnog pronalaska, konjugat antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska ili farmaceutski preparat iz ovog pronalaska, za primenu u obnavljanju imunološkog odgovora na parazita.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je antisense oligonukleotid iz predmetnog pronalaska, konjugat antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska ili farmaceutski preparat iz predmetnog pronalaska, za primenu u vidu leka.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je antisense oligonukleotid iz predmetnog pronalaska, konjugat antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska ili farmaceutski preparat iz predmetnog pronalaska, za primenu u lečenju HBV infekcije.
Predmetni pronalazak se odnosi na oligonukleotide ili njihove konjugate koji ciljaju nukleinsku kiselinu koja može da modulira ekspresiju PD-L1, te na lečenje i prevenciju bolesti povezane sa funkcionisanjem PD-L1. Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati mogu konkretno da se koriste za lečenje bolesti kod kojih je iscrpljen imunološki odgovor na zarazne agense.
Shodno tome, ovde su opisani oligonukleotidi koji sadrže preklapajuću nukleotidnu sekvencu dužine 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom liganda PD-L1. Oligonukleotid može da bude antisense oligonukleotid, po mogućnosti sa gepmer dizajnom. Poželjno, oligonukleotidmože da inhibira ekspresiju PD-L1 cepanjem ciljne nukleinske kiseline. Poželjno, cepanje se postiže regrutacijom nukleaze.
U još jednom aspektu, oligonukleotid iz predmetnog pronalaska je konjugovan sa najmanje jednim asijaloglikoproteinskim receptorom koji cilja konjugovani ostatak, kao što je konjugovani ostatak koji sadrži najmanje jedan N-acetilgalaktozaminski (GalNAc) ostatak. Konjugovani ostatak i oligonukleotid mogu biti vezani linkerom, posebno biocepljlivim linkerom.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže oligonukleotide ili oligonukleotidne konjugate iz predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljive razblaživače, nosače, soli i/ili adjuvanse.
Ovde se opisuju in vivo ili in vitro postupci za smanjenje ekspresije PD-L1 u ciljnoj ćeliji koja eksprimira PD-L1, primenom na navedenu ćeliju oligonukleotida ili preparata iz predmetnog pronalaska u delotvornoj količini.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje oligonukleotide, oligonukleotidne konjugate ili farmaceutske preparate iz predmetnog pronalaska za upotrebu u obnavljanju imuniteta protiv virusa ili parazita.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje oligonukleotide, oligonukleotidne konjugate ili farmaceutske preparate iz predmetnog pronalaska koji se koriste kao lek.
Ovde se opisuju postupci lečenja ili prevencije bolesti, poremećaja ili disfunkcije putem primene terapeutski ili profilaktički delotvorne količine oligonukleotida iz ovog pronalaska na pojedincu koji ima ili je sklon takvoj bolesti, poremećaju ili disfunkciji, posebno bolestima koje se odnose na virusne ili parazitske infekcije jetre.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid, oligonukleotidni konjugati ili farmaceutski preparat iz pronalaska, koriste se u lečenju ili prevenciji virusnih infekcija jetre kao što su HBV, HCV i HDV ili parazitskih infekcija kao što je malarija, toksoplazmoza, lajšmanijaza i tripanosomijaza, ili rak jetre ili metastaze na jetri.
Kratak opis slika
Slika 1: Prikazuje primere antisense oligonukleotidnih konjugata, gde je oligonukleotid predstavljen ili kao valovita linija (A-D) ili kao "oligonukleotid" (E-H) ili kao T2(I), a asijaloglikoproteinski receptori koji ciljaju konjugovane delove su trovalentni N-acetilgalaktosamin delovi. Jedinjenja A do D sadrže molekul grananja di-lizina, PEG3 spejser i tri krajnja GalNAc ugljenohidratna dela. U jedinjenjima A i B, oligonukleotid je vezan direktno za asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak bez linkera. U jedinjenjima C i D oligonukleotid je vezan direktno za asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak preko C6 linkera. Jedinjenja E-l sadrže "trebler" molekul grananja i spejsere različite dužine i strukture i tri krajnja GalNAc ugljenohidratna dela.
Slika 2: Grafikon prikazuje EC50 (A) i PD-L1 nokdaun kao % fiziološke otopine (B) za jedinjenja testirana u primeru 2, u odnosu na njihov položaj na ciljnoj nukleinskoj kiselini. Ćelijska linije u kojoj je jedinjenje testirano su THP1 (●) i Karpas (�).
Slika 3: Strukturna formula trovalentnog klastera GalNAc (GN2). GN2 je koristan kao konjugovani ostatak u predmetnom pronalasku. Valovita linija pokazuje mesto konjugacije klastera, na primer, sa C6 amino linkerom ili direktno sa oligonukleotidom.
Slika 4: Strukturna formula CMP ID NO 766_2.
Slika 5: Strukturna formula CMP ID NO 767_2.
Slika 6: Strukturna formula CMP ID NO 768_2.
Slika 7: Strukturna formula CMP ID NO 769_2.
Slika 8: Strukturna formula CMP ID NO 770_2.
Slika 9: Western blot otkriva ekspresiju PD-L1 proteina u jetri životinja indukovanih kiselinom poly(IC) nakon tretmana fiziološkim rastvorom i naznačenim CMP ID NO. Svaki blot prikazuje goli oligonukleotid naspram GalNAc konjugovane verzije istog oligonukleotida, blot A) CMP ID NO744_1 i 755_2, B) CMP ID NO747_1 i 758_2, C) CMP ID NO748_1 i 759_2, D) CMP ID NO752_1 i 763_2 i E) CMP ID NO753_1 i 764_2. Gornja traka je kontrola punjenja vinkulina, donja traka je protein PD-L1. Prva traka u svakom blotu prikazuje miševe tretirane fiziološkim rastvorom bez indukcije poly(IC). Ovi miševi eksprimiraju vrlo malo PD-L proteina.
Slika 10: Populacija mononuklearnih ćelija u jetri nakon tretmana ● placebom (grupa 10 i 1), ♦ DNK vakcinom (grupa 11 i 2), ○ anti-PD-L1 antitelom (grupa 12), ▲ golim PD-L1 ASO DNK vakcinom (grupa 7) ili ∆ GalNAc konjugovanim PD-L1 ASO DNK vakcinom (grupa 8), za svaku grupu su predstavljene pojedinačne životinje, a prosek je označen okomitom linijom za svaku grupu (videti tabelu 18). Procenjena je statistička važnost između grupe DNK vakcine i tri tretirane grupe, i ako ona postoji, to je označeno sa * (* = P <0,05,*** = P <0,001 i **** = P <0,0001). A) predstavlja broj T ćelija u jetri nakon tretmana. B) predstavlja frakciju CD4+ T ćelija i C) predstavlja frakciju CD8+ T ćelija.
Slika 11: Modulacija PD-L1 pozitivnih ćelija u jetri nakon tretmana ● placebom (grupa 10 i 1), ♦ DNK vakcinom (grupa 11 i 2), ○ anti-PD-L1 antitelom (grupa 12), ▲ golim PD-L1 ASO DNK vakcinom (grupa 7) ili ∆ GalNAc konjugovanim PD-L1 ASO DNK vakcinom (grupa 8), za svaku grupu su predstavljene pojedinačne životinje, a prosek je označen okomitom linijom za svaku grupu (videti tabelu 19). Procenjena je statistička važnost između grupe DNK vakcine i tri tretirane grupe, i ako postoji, to je označeno sa * (* = P <0,05 i **** = P <0,0001). A) predstavlja procenat CD8+ T ćelija koje eksprimiraju PD-L1 u jetri nakon tretmana. B) predstavlja procenat CD4+ T ćelija koje eksprimiraju PD-L1 u jetri nakon tretmana i C) predstavlja procenat B ćelija koje eksprimiraju PD-L1 u jetri nakon tretmana.
Slika 12: HBV antigen specifične CD8+ ćelije koje luče citokine u jetri nakon tretmana ● placebom (grupa 10 i 1), ♦ DNK vakcinom (grupa 11 i 2), ○ antitelom na PD-L1 (grupa 12), ▲ golim PD-L1 ASO DNK vakcinom (grupa 7) ili ∆ GalNAc konjugovanim PD-L1 ASO DNK vakcinom (grupa 8), za svaku grupu su predstavljene pojedinačne životinje, a prosek je označen okomitom linijom za svaku grupu (videti tabelu 20). Procenjena je statistička važnost između grupe DNK vakcine i tri tretirane grupe, i ako ona postoji, to je označeno sa * (* = P <0,05). A) predstavlja procenat CD8+ T ćelija koje luče IFN-γ u jetri, koje su specifične za HBV PreS2+S antigen nakon tretmana. B) predstavlja procenat CD8+ T ćelija koje luče IFN-γ u jetri, koje su specifične za HBV jedreni antigen, nakon tretmana, i C) predstavlja procenat CD8+ T ćelija koje luče IFN-γ i TNF-α u jetri, koje su specifične za HBV PreS2+S antigen, nakon tretmana.
Slika 13: HBV-DNK, HBsAg i HBeAg kod AAV/HBV miševa nakon tretmana GalNAc konjugovanim PD-L1 antisense CMP NO: 759_2 (▼) u odnosu na placebo (■). Okomita linija označava kraj tretmana.
Definicije
Oligonukleotid
Izraz "oligonukleotid", kako se ovde koristi, definiše se onako kako ga stručno lice po pravilu razume tj. kao molekul koji sadrži dva ili više kovalentno vezanih nukleozida. Takvi kovalentno vezani nukleozidi nazivaju se i molekuli nukleinske kiseline ili oligomeri. Oligonukleotidi se najčešće proizvode u laboratoriji hemijskom sintezom u čvrstoj fazi, nakon čega se vrši pročišćavanje. Kada se govori o sekvenci oligonukleotida, misli se na sekvencu ili redosled nukleobaznih komponenti, ili njihovih modifikacija, kovalentno vezanih nukleotida ili nukleozida. Oligonukleotid iz ovog pronalaska je veštački napravljen, hemijski je sintetizovan i po pravilu je pročišćen ili izolovan. Oligonukleotid iz ovog pronalaska može da sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida.
Antisense oligonukleotidi
Izraz "antisense oligonukleotid" kako se ovde koristi, definiše se kao oligonukleotid koji je sposoban da modulira ekspresiju ciljnog gena hibridizacijom na ciljnu nukleinsku kiselinu, posebno na preklapajuću sekvencu na ciljnoj nukleinskoj kiselini. Antisense oligonukleotidi u osnovi nisu dvolančani i stoga nisu siRNK. Poželjno, antisense oligonukleotid iz predmetnog pronalaska je jednolančani.
Preklapajuća nukleotidna sekvenca
Izraz "preklapajuća nukleotidna sekvenca" se odnosi na region oligonukleotida koji je komplementaran ciljnoj nukleinskoj kiselini. Izraz se ovde koristi naizmenično sa izrazom "preklapajuća nukleobazna sekvenca" i izrazom "sekvenca oligonukleotidnog motiva". U nekim realizacijama svi nukleotidi oligonukleotida su prisutni u preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci. U nekim realizacijama, oligonukleotid sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu i može opciono da sadrži i dodatne nukleotide, na primer region nukleotidnog linkera koji se može koristiti za vezanje funkcionalne grupe na preklapajuću nukleotidnu sekvencu. Region nukleotidnog linkera može ili ne mora biti komplementaran sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
Nukleotidi
Nukleotidi su gradivni blokovi oligonukleotida i polinukleotida i u svrhe predmetnog pronalaska podrazumevaju nukleotide koji se javljaju u prirodi i one koji se ne javljaju u prirodi. U prirodi, nukleotidi poput DNK i RNK nukleotida, sadrže šećerni deo riboze, nukleobazni deo i jednu ili više fosfatnih grupa (kojih nema u nukleozidima). Nukleozidi i nukleotidi se takođe mogu nazivati naizmenično i terminima "jedinice" ili "monomeri".
Modifikovani nukleozid
Izraz "modifikovani nukleozid" ili "modifikacija nukleozida", kako se ovde koristi, odnosi se na nukleozide modifikovane u odnosu na ekvivalentni DNK ili RNK nukleozid uvođenjem jedne ili više modifikacija šećernog dela ili (nukleo)baznog dela. Modifikovani nukleozid sadrži modifikovani šećerni deo. Izraz modifikovani nukleozid ovde se takođe može koristiti naizmenično sa terminom "nukleozidni analog" ili modifikovane "jedinice" ili modifikovani "monomeri".
Modifikovana internukleozidna veza
Izraz "modifikovana internukleozidna veza" se definiše kao što ga obično shvata stručno lice, kao veza koje nije fosfodiesterska veza (PO), koja kovalentno spaja dva nukleozida. Nukleotidi sa modifikovanom internukleozidnom vezom nazivaju se i "modifikovani nukleotidi". U nekim realizacijama, modifikovana internukleozidna veza povećava otpornost oligonukleotida na nukleaze u poređenju sa fosfodiesterskom vezom. Kod prirodnih oligonukleotida, internukleozidna veza obuhvata fosfatne grupe koje stvaraju fosfodiestersku vezu između susednih nukleozida. Modifikovane internukleozidne veze posebno su korisne za stabilizaciju oligonukleotida za in vivo upotrebu i mogu poslužiti za zaštitu od cepanja nukleaza na delovima DNK ili RNK nukleozida u oligonukleotidu iz ovog pronalaska, na primer unutar regiona razmaka "gepmer" oligonukleotida, kao i u regionima modifikovanih nukleozida.
U jednoj realizaciji, oligonukleotid sadrži jednu ili više internukleozidnih veza modifikovanih iz prirodnog fosfodiestera u vezu koja je, na primer, otpornija na napad nukleaze. Otpornost na nukleazu može da se odredi inkubacijom oligonukleotida u krvnom serumu ili upotrebom testa na rezistenciju na nukleazu (npr. fosfodiesteraza zmijskog otrova (SVPD)), što je dobro poznato u struci. Internukleozidne veze koje su sposobne pojačati nukleaznu rezistenciju oligonukleotida nazivaju se internukleozidne veze rezistentne na nukleazu. U nekim realizacijama, najmanje 50 % internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci, su modifikovane, na primer najmanje 60 %, na primer najmanje 70 %, na primer najmanje 80 % ili na primer najmanje 90 % internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci su modifikovane. U nekim realizacijama, modifikovane su sve internukleozidne veze oligonukleotida ili njegove preklapajuće nukleotidne sekvence. Biće prepoznatljivo da u nekim realizacijama nukleozidi koji povezuju oligonukleotid iz pronalaska sa nenukleotidnom funkcionalnom grupom, kao što je konjugat, mogu biti fosfodiester. U nekim realizacijama, sve internukleozidne veze oligonukleotida ili njegova preklapajuća nukleotidna sekvenca su internukleozidne veze otporne na nukleazu.
Modifikovane internukleozidne veze mogu da se odaberu iz grupe u kojoj su fosforotioat, difosforotioat i boranofosfat. U nekim realizacijama, modifikovane internukleozidne veze su kompatibilne sa regrutacijom RNaseH oligonukleotida iz ovog pronalaska, na primer fosforotioatne, difosforotioatne ili boranofosfatne.
U nekim realizacijama, internukleozidna veza sadrži sumpor (S), poput fosforotioatne internukleozidne veze.
Fosforotioatna internukleozidna veza je posebno korisna zahvaljujući rezistenciji na nukleazu, korisnoj farmakokinetici i jednostavnosti izrade. U nekim realizacijama, najmanje 50 % internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci su fosforotioatne, kao na primer najmanje 60 %, najmanje 70 %, najmanje 80 % ili najmanje 90 % internukleozidnih veza u oligonukleotidu, ili njegovoj preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci, su fosforotioatne. U nekim realizacijama, sve internukleozidne veze oligonukleotida ili njegove preklapajuće nukleotidne sekvence su fosforotioatne.
U nekim realizacijama, oligonukleotid sadrži jednu ili više neutralnih internukleozidnih veza, posebno internukleozidnu vezu odabranu iz grupe koja se sastoji od fosfotriestra, metilfosfonata, MMI, amida-3, formacetala ili tioformacetala.
Druge internukleozidne veze su objavljene u WO2009/124238. U jednoj realizaciji, internukleozidna veza se odabire iz grupe linkera objavljenih u WO2007/031091. Konkretno, internukleozidna veza može da se odabere od −O-P(O)2-O-, −O-P(O,S)-O-, −O-P(S)2-O-, −S-P(O)2-O-, −S-P(O,S)-O-, −S-P(S)2-O-, −O-P(O)2-S-, −O-P(O,S)-S-, −S-P(O)2-S-, −O-PO(R<H>)-O-, O-PO(OCH3)-O-, −O-PO(NR<H>)-O-, −O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, −O-PO(BH3)-O-, −O-PO(NHR<H>)-O-, −O-P(O)2-NR<H>-, −NR<H>-P(O)2-O-, −NR<H>-CO-O-, −NR<H>-CO-NR<H>- i/ili internukleozidni linker može da se odabere iz grupe koju čine: −O-CO-O-, −O-CO-NR<H>-, −NR<H>-CO-CH2-, −O-CH2-CO-NR<H>-, −O-CH2-CH2-NR<H>-, −CO-NR<H>-CH2-, −CH2-NR<H>CO-, −O-CH2-CH2-S-, −S-CH2-CH2-O-, −S-CH2-CH2-S-, −CH2-SO2-CH2-, −CH2-CO-NR<H>-, −O-CH2-CH2-NR<H>-CO-, −CH2-NCH3-O-CH2-, gde je R<H>odabran između vodonika i C1-4-alkila.
Veze otporne na nukleazu, kao što su fosfotioatne veze, posebno su korisne u oligunukleoidnim regionima koji mogu regrutovati nukleaze u toku formiranja dupleksa sa ciljnom nukleinskom kiselinom, kao što je region G za gepmere, ili nemodifikovani nukleozidni regioni glave i repa. Fosforotioatne veze mogu, međutim, da budu korisne i u regionima za regrutaciju nenukleaza i/ili u regionima za povećanje afiniteta, kao što su regioni F i F' za gepmere, ili modifikovani nukleozidni regioni glave i repa.
Svaki od dizajnerskih regiona, međutim, može da sadrži internukleozidne veze koje nisu fosforotioatne, kao što su fosfodiesterske veze, posebno u regionima gde modifikovani nukleozidi, kao što je LNA, štite vezu od razgradnje nukleazama. Uključivanjem fosfodiesterskih veza, kao što su jedna ili dve veze, posebno između ili u blizini modifikovanih nukleozidnih jedinica (tipično u regionima za regrutovanje ne-nukleaza) može da se modifikuje bioraspoloživost i/ili biorasprostranjenost oligonukleotida - videti WO2008/113832.
Kako se ovde opisuje, sve internukleozidne veze u oligonukleotidu su fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. Poželjno je da su sve internukleozidne veze u oligonukleotidu fosforotioatne veze.
Nukleobaza
Termin nukleobaza označava purinski (npr. adenin i gvanin) i pirimidinski (npr. uracil, timin i citozin) deo prisutan u nukleozidima i nukleotidima koji stvaraju vodonične veze u procesu hibridizacije na nukleinsku kiselinu. U kontekstu ovog pronalaska, pojam nukleobaza takođe obuhvata modifikovane nukleobaze koje se mogu razlikovati od nukleobaza koje se prirodno javljaju, ali su funkcionalne tokom hibridizacije na nukleinsku kiselinu. U ovom kontekstu, termin "nukleobaza" se odnosi na nukleobazu koja se prirodno javlja, kao što su adenin, gvanin, citozin, timidin, uracil, ksantin i hipoksantin, kao i na varijante koje se ne pojavljuju u prirodi. Takve varijante su, na primer, opisane u Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45 str. 2055 i Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1.
U nekim realizacijama, nukleobazni deo se modifikuje promenom purina ili pirimidina u modifikovani purin ili pirimidin, kao što je supstituisani purin ili supstituisani pirimidin, kao što su nukleobaze odabrane od izocitozina, pseudoizocitozina, 5-metil citozina, 5-tiozolo-citozina, 5-propinil-citozina, 5-propinil-uracila, 5-bromouracil 5-tiazolo-uracila, 2-tio-uracila, 2'tio-timina, inozina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina i 2-kloro-6-aminopurina.
Nukleobazni delovi mogu biti označeni slovnim kodom za svaku odgovarajuću
1
nukleobazu, npr. A, T, G, C ili U, pri čemu svako slovo može opciono da sadrži modifikovane nukleobaze ekvivalentne funkcije. Na primer, u pomenutim oligonukleotidima, nukleobazni delovi se odabiru iz grupe koja sadrži A, T, G, C i 5-metil citozin Opciono, za LNA gepmere, mogu da se koristei 5-metil citozin LNA nukleozidi.
Modifikovani oligonukleotid
Izraz modifikovani oligonukleotid se odnosi na oligonukleotid koji sadrži jedan ili više šećerima modifikovanih nukleozida i/ili modifikovanih internukleozidnih veza. Izraz "himerni oligonukleotid" je termin koji se koristi u literaturi za opis oligonukleotida sa modifikovanim nukleozidima.
Komplementarnost
Termin komplementarnost se odnosi na sposobnost Watson-Crickovog sparivanja baza nukleozida/nukleotida. Parovi baza Watson-Crick su gvanin (G)-citozin (C) i adenin (A)-timin (T)/uracil (U). Podrazumeva se da oligonukleotidi mogu da sadrže nukleozide sa modifikovanim nukleobazama, na primer, 5-metil citozin se često koristi umesto citozina, i kao takav pojam komplementarnosti obuhvaća bazno sparivanje Watson Crick između nemodifikovanih i modifikovanih nukleobaza (videti npr. Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45, str. 2055 i Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
Izraz " % komplementarni", kako se ovde koristi, odnosi se na broj nukleotida, u procentima, preklapajuće nukleotidne sekvence u molekuli nukleinske kiseline (npr. oligonukleotidu), koji su na datom položaju komplementarni sa preklapajućom nukleotidnom sekvencom (tj. sa njom formiraju parove baza Watson Crick), na određenom položaju zasebnog molekula nukleinske kiseline (npr. ciljne nukleinske kiseline). Ovaj procenat se izračunava brojanjem poravnatih baza koje čine parove između dve sekvence (kada se poravnaju sa ciljnom sekvencom 5'-3' i oligonukleotidnom sekvencom od 3'-5'), taj zbir se deli sa ukupnim brojem nukleotida u oligonukleotidu i rezultat množi sa 100. Kod ovakvog poređenja, za nukleobazu/nukleotid koji se ne poravna (ne načini bazni par) kaže se da je neusklađen.
Izraz "potpuno komplementaran" se odnosi na komplementarnost od 100 %.
U nastavku se daje primer oligonukleotida (SEQ ID NO: 5) koji je u potpunosti komplementaran ciljnoj nukleinskoj kiselini (SEQ ID NO: 772.).
Termin "identitet", kako se ovde koristi, odnosi se na broj nukleotida, izražen u procentima, preklapajuće nukleotidne sekvence u molekulu nukleinske kiseline (npr. oligonukleotida) koji su, u datom položaju, identični (tj. po svojoj sposobnosti da formiraju Watson Crick bazne parove sa komplementarnim nukleozidom) preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci, na datom položaju odvojenog molekula nukleinske kiseline (npr. ciljne nukleinske kiseline). Procenat se izračunava brojanjem poravnatih baza koje su identične između dve sekvence, uključujući razmake, taj zbir se deli sa ukupnim brojem nukleotida u oligonukleotidu i rezultat se množi sa 100. Procenat identiteta = (podudarni x 100)/dužina poravnatog regiona (sa razmacima).
Hibridizacija
Termin "hibridizovati" ili "hibridizuje", kako se ovde koristi, odnosi se na dve niti nukleinske kiseline (npr. oligonukleotid i ciljna nukleinska kiselina) koje tvore vodonične veze između baznih parova na suprotnim nitima, stvarajući tako dupleks. Afinitet vezivanja između dve niti nukleinske kiseline predstavlja snagu hibridizacije. To se često opisuje kao temperatura topljenja (Tm) koja se definiše kao temperatura na kojoj polovina oligonukleotida formira duplekse sa ciljnom nukleinskom kiselinom. U fiziološkim uslovima, Tmnije striktno proporcionalan afinitetu (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Standardno stanje Gibbsove slobodne energije ΔG° je tačniji prikaz afiniteta vezivanja i vezano je za konstantu disocijacije (Kd) reakcije pomoću ΔG° = -RTIn (Kd), gde je R gasna konstanta, a T je apsolutna temperatura. Stoga, vrlo niska ΔG° reakcije između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline odražava snažnu hibridizaciju između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. ΔG° je energija povezana sa reakcijom u kojoj su koncentracije u vodi 1M, pH je 7 i temperatura je 37 °C. Hibridizacija oligonukleotida sa ciljnom nukleinskom kiselinom je spontana reakcija, a za spontane reakcije ΔG° je manja od nule. ΔG° se može izmeriti eksperimentalno, na primer, primenom postupka izotermalne titracione kalorimetrije (ITC), kako je opisano u Hansen et al., 1965, Chem. Comm.36-38 i u Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Stručno lice će znati da postoji komercijalna oprema za merenje ΔG°. ΔG° se takođe može numerički proceniti korištenjem modela najbližeg suseda kako je opisano u SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465 uz korištenje na odgovarajući način izvedene termodinamičke parametre opisane u Sugimoto i et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 i McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Da bi se imala mogućnost modulacije njihovih ciljnih nukleinskih kiselina hibridizacijom, oligonukleotidi iz ovog pronalaska hibridizuju se sa ciljnom nukleinskom kiselinom pri procenjenim vrednostima za ΔG° ispod -10 kcal za oligonukleotide dužine 1030 nukleotida. U nekim realizacijama, stepen ili snaga hibridizacije meri se standardnim stanjem Gibbsove slobodne energije ΔG°. Oligonukleotidi se mogu hibridizovati sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa procenjenim vrednostima ΔG° ispod opsega -10 kcal, na primer ispod -15 kcal, ispod -20 kcal i ispod -25 kcal za oligonukleotide dužine od 8-30 nukleotida. U nekim realizacijama, oligonukleotidi se hibridizuju sa ciljnom nukleinskom kiselinom uz procenjenu vrednost ΔG° od -10 do -60 kcal, na primer od -12 do -40, od -15 do -30 kcal, od -16 do -27 kcal ili od -18 do -25 kcal.
Ciljna nukleinska kiselina
Prema ovom pronalasku, ciljna nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja kodira PD-L1 sisara i može, na primer, da bude sekvenca gena, RNK, mRNK, i pre-mRNK, zrela mRNK ili cDNK. Cilj se stoga može označiti kao PD-L1 ciljna nukleinska kiselina. Oligonukleotid, kako je ovde opisan, može, na primer, ciljati egzonske regione PD-L1 sisara, ili može na primer ciljati intronski region u PD-L1 pre-mRNK (videti Tabelu 1).
Tabela 1: humani PD-L1 egzoni i introni
Pogodno, ciljna nukleinska kiselina kodira PD-L1 protein, posebno PD-L1 sisara, kao što je humani PD-L1 (videti na primer tabele 2 i 3, koje daju sekvence mRNK i pre-mRNK za PD-L1 čoveka, majmuna i miša). U kontekstu predmetnog pronalaska pre-mRNK se takođe smatra nukleinskom kiselinom koja kodira protein.
U nekim realizacijama, ciljna nukleinska kiselina se bira iz grupe koja se sastoji od
1
SEQ ID NO: 1, 2 i 3 ili njihovih prirodnih varijanti (npr. sekvenci koje kodiraju protein PD-L1 sisara).
Ako se oligonukleotid iz pronalaska koristi u istraživanju ili dijagnostici, ciljna nukleinska kiselina može da bude cDNK ili sintetička nukleinska kiselina izvedena iz DNK ili RNK.
Za primenu in vivo ili in vitro, oligonukleotid iz predmetnog pronalaska je po pravilu sposoban da inhibira ekspresiju PD-L1 ciljne nukleinske kiseline u ćeliji koja eksprimira PD-L1 ciljnu nukleinsku kiselinu. Preklapajuća sekvenca nukleobaza oligonukleotida iz predmetnog pronalaska po pravilu je komplementarna sa PD-L1 ciljnom nukleinskom kiselinom, mereno dužinom oligonukleotida, opciono uz izuzetak jednog ili dva neusklađena nukleotida, i opciono uz izuzetak regiona nukleotidnih linkera koji mogu povezati ogligonukleotid za jednu opcionu funkcionalnu grupu kao što je konjugat, ili drugi nekomplementarne terminalne nukleotide (npr. region D' ili D''). Ciljna nukleinska kiselina može, u nekim realizacijama, biti RNK ili DNK, kao što je informaciona RNK, na primer zrela mRNK ili pre-mRNK. U nekim realizacijama ciljna nukleinska kiselina je RNK ili DNK koja kodira PD-L1 protein sisara, kao što je humani PD-L1, npr. humana PD-L1 premRNK sekvenca, kao na primer ona koja je objavljena kao SEQ ID NO1 ili humana mRNK sekvenca sa NCBI referentnim brojem NM014143. Dalje informacije o primerima ciljnih nukleinskih kiselina nalaze se u tabelama 2 i 3.
Tabela 2: Informacije o genomu i sklopu za PD-L1 prema vrstama.
Fwd = prednja nit. Koordinate genoma daju pre-mRNK sekvencu (genomska sekvenca). NCBI referenca daje mRNK sekvencu (cDNK sekvencu).
*Baza podataka referentnih sekvenci Nacionalnog centra za biotehnološke informacije predstavlja sveobuhvatan, integrisan, neredundantan, dobro označen skup referentnih sekvenci, uključujući genomske sekvence, sekvence transkripta i proteinske sekvence. Hostiran je na www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.
Tabela 3: Detalji sekvenci za PD-L1 prema vrstama.
Ciljna sekvenca
Izraz "ciljna sekvenca", kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu nukleotida prisutnoj u ciljnoj nukleinskoj kiselini koja sadrži nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa oligonukleotidom iz ovog pronalaska. U nekim realizacijama, ciljna sekvenca se sastoji od regiona na ciljnoj nukleinskoj kiselini koji je komplementaran sa preklapajućom nukleotidnomj sekvencom oligonukleotida iz ovog pronalaska. U nekim realizacijama, ciljna sekvenca je duža od komplementarne sekvence pojedinačnog oligonukleotida i može, na primer, predstavljati poželjan region ciljne nukleinske kiseline kojeg nekoliko oligonukleotida iz ovog pronalaska mogu ciljati.
Ciljna sekvenca može biti podsekvenca ciljne nukleinske kiseline.
U nekim realizacijama, podsekvenca je sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od a1-a149 (videti tabele 4). U nekim realizacijama, podsekvenca je sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od humanog PD-L1 mRNK egzona, kao što je PD-L1 humani mRNK egzon odabran iz grupe koja se sastoji od e1, e2, e3, e4, e5, e6 i e7 (videti tabelu 1 iznad).
U nekim realizacijama, podsekvenca je sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od humanog PD-L1 mRNK introna, kao što je PD-L1 humani mRNK intron odabran iz grupe koja se sastoji od i1, i2, i3, i4, i5 i i6 (videti tabelu 1 iznad).
Oligonukleotid, kako je ovde opisan, sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ili se hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom, kao što je podsekvenca ciljne nukleinske kiseline, na primer ciljna sekvenca, kako je ovde opisana.
Oligonukleotid, kako je ovde opisan, sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu od
1
najmanje 8 nukleotida koja je komplementarna ili se hibridizira sa ciljnom sekvencom prisutnom u molekuli ciljne nukleinske kiseline. Preklapajuća nukleotidna sekvenca (i shodno tome ciljna sekvenca) sastoji se od najmanje 8 preklapajućih nukleotida, na primer 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 preklapajućih nukleotida, na primer od 12-25, od 14-18 preklapajućih nukleotida.
Ciljna ćelija
Termin ciljna ćelija, kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju koja eksprimira ciljnu nukleinsku kiselinu. Kako se ovde opisuje, ciljna ćelija može biti in vivo ili in vitro. U nekim realizacijama, ciljna ćelija je ćelija sisara poput ćelije glodara, na primer ćelije miša ili ćelije pacova, ili ćelije primata, na primer ćelije majmuna ili ćelije čoveka.
U poželjnim realizacijama, ciljna ćelija eksprimira PD-L1 mRNK, kao što je PD-L1 pre-mRNK ili PD-L1 zrela mRNK. Poli A rep od PD-L1 mRNK tipično se zanemaruje zbog antisense ciljanja oligonukleotida.
Prirodna varijanta
Izraz "varijanta koja se javlja u prirodi" se odnosi na varijante gena PD-L1 ili transkripte koji potiču iz istih genetskih lokusa kao i ciljna nukleinska kiselina, ali se mogu razlikovati, na primer, po razgradnji genetskog koda koja uzrokuje mnoštvo kodona koji kodiraju iste aminokiseline, ili zbog alternativnog splajsovanja pre-mRNK, ili prisustva polimorfizama, kao što su polimorfizmi pojedinačnih nukleotida i alelne varijante. Na osnovu prisustva dovoljne komplementarne sekvence oligonukleotida, oligonukleotid iz predmetnog pronalaska može stoga ciljati ciljnu nukleinsku kiselinu i njene prirodne varijante.
U nekim realizacijama, varijante koje se javljaju u prirodi su najmanje 95 %, na primer najmanje 98 % ili najmanje 99 % homologne sa PD-L1 ciljnom nukleinskom kiselinom sisara, kao što je ciljna nukleinska kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 1, 2 i 3.
Poznati su brojni pojedinačni nukleotidni polimorfizmi u genu PD-L1, na primer oni koji se prikazuju u sledećoj tabeli (humana početna/referentna sekvenca premRNK je SEQ ID NO 2)
1
1
1
Modulacija ekspresije
Termin "modulacija ekspresije", kako se ovde koristi, treba shvatiti kao opšti pojam koji označava sposobnost oligonukleotida da promeni količinu PD-L1 u odnosu na količinu PD-L1 pre primene oligonukleotida. Alternativno, modulacija ekspresije može se odrediti pomoću kontrolnog eksperimenta. Obično se podrazumeva da je kontrola pojedinačna ili ciljna ćelija tretirana fiziološkim rastvorom, ili pojedinačna ili ciljna ćelija tretirana neciljajućim oligonukleotidom (lažnim). Međutim, to može biti i pojedinac koji se leči standardnom terapijom.
Jedna vrsta modulacije je sposobnost oligonukleotida da inhibira, vrši nishodnu regulaciju, smanjuje, suzbija, uklanja, zaustavlja, blokira, sprečava, umanjuje, snižava, izbegava ili ukida ekspresiju PD-L1, npr. razgradnjom mRNK ili blokadom transkripcije. Druga vrsta modulacije je sposobnost oligonukleotida da obnavlja, povećava ili pojačava ekspresiju PD-L1, npr. popravljanjem mesta splajsovanja, ili sprečavanjem splajsovanja, ili uklanjanjem ili blokiranjem inhibitornih mehanizama kao što je represija mikroRNK.
Modifikovani nukleozidi sa visokim afinitetom
Modifikovani nukleozid sa visokim afinitetom je modifikovani nukleotid koji, kada se ugradi u oligonukleotid, pojačava afinitet oligonukleotida za njegov komplementarni cilj, na primer mereno temperaturom topljenja (T<m>). Modifikovani nukleozid sa visokim afinitetom iz ovog pronalaska poželjno proizvodi povećanje temperature topljenja između 0,5 do 12 °C, još poželjnije između 1,5 do 10 °C i najpoželjnije između 3 do 8 °C po modifikovanom nukleozidu. Brojni modifikovani nukleozidi sa visokim afinitetom poznati su u struci i obuhvataju, na primer, mnoge 2' supstituisane nukleozide kao i blokirane nukleinske kiseline (LNA) (videti npr. Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 i Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Modifikacije šećera
1
Oligomer iz predmetnog pronalaska može da sadrži jedan ili više nukleozida koji imaju modifikovani šećerni deo, tj. modifikaciju šećernog dela u odnosu na ribozni šećerni deo koji se nalazi u DNK i RNK.
Proizvedeni su brojni nukleozidi sa modifikacijom riboznog šećernog dela, prvenstveno u cilju poboljšanja određenih svojstava oligonukleotida, kao što je afinitet i/ili rezistencija na nukleaze.
Takve modifikacije obuhvataju one kod kojih je struktura riboznog prstena modifikovana, npr. zamenom heksoznim prstenom (HNA) ili bicikličkim prstenom, koji po pravilu ima biradikularni most između ugljenika C2 i C4 na riboznom prstenu (LNA), ili nepovezanim riboznim prstenom koji po pravilu nema vezu između ugljenika C2 i C3 (npr. UNA). Ostali nukleozidi sa modifikovanim šećerom obuhvataju, na primer, nukleinske kiseline bicikloheksoze (WO2011/017521) ili tricikličke nukleinske kiseline (WO2013/154798). U modifikovane nukleozide takođe spadaju nukleozidi kod kojih je šećerni deo zamenjen nešećernim delom, na primer u slučaju peptidnih nukleinskih kiselina (PNA) ili morfolino nukleinskih kiselina.
U modifikacije šećera takođe spadaju modifikacije izvršene promenom supstituentnih grupa na riboznom prstenu u grupe koje nisu vodonične, ili 2'-OH grupe koja se prirodno nalaze u nukleozidima DNK i RNK. Supstituenti se mogu, na primer, uvesti na položajima 2', 3', 4' ili 5'. Nukleozidi sa modifikovanim šećernim delovima takođe obuhvataju 2' modifikovane nukleozide, poput 2' supstituisanih nukleozida. Zapravo, mnogo se pažnje posvetilo razvoju 2' supstituisanih nukleozida, a utvrđeno je da brojni 2' supstituisani nukleozidi imaju korisna svojstva kada se ugrade u oligonukleotide, kao što je povećanje rezistencije na nukleozide i pojačan afinitet.
2' modifikovani nukleozidi.
2' šećerni modifikovani nukleozid je nukleozid koji ima supstituenta koji nije H ili -OH na položaju 2' (2' supstituisani nukleozid) ili sadrži 2' povezani biradikular, a obuhvata 2' supstituisane nukleozide i LNA nukleozide (2' - 4' nukleozidi premošteni biradikularom). Na primer, 2' modifikovani šećer može porizvesti na oligonukleotidu povećan afinitet vezivanja i/ili povećanu rezistenciju na nukleazu. Primeri 2' supstituisanih modifikovanih nukleozida su 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK (MOE), 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-RNK i 2'-fluoro-ANA. Dodatne primere pogledati npr. u Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 i Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, i Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. U nastavku se daju ilustracije nekih 2' supstituisanih modifikovanih nukleozida.
2
Nukleozidi sa zaključanom nukleinskom kiselinom (LNA).
LNA nukleozidi su modifikovani nukleozidi koji sadrže linker grupu (koja se naziva biradikular ili most) između C2' i C4' riboznog šećernog prstena nukleotida. Ovi nukleozidi se u literaturi nazivaju i premošćenim nukleinskim kiselinama ili bicikličnim nukleinskim kiselinmaa (BNA).
Kako se ovde opisuje, modifikovani nukleozidi ili LNA nukleozidi oligomera iz predmetnog pronalaska imaju opštu strukturu kao u formuli I ili II:
u kojoj se W bira iz grupe gde se nalaze −O-, −S-, −N(R<a>)-, −C(R<a>R<b>)-, na primer u nekim realizacijama -O-;
B označava nukleobazu ili modifikovani deo nukleobaze;
Z označava internukleozidnu vezu sa susednim nukleozidom ili 5'-terminalnom grupom;
Z* označava internukleozidnu vezu sa susednim nukleozidom ili 3'-terminalnom grupom;
X označava grupu koja se bira sa liste na kojoj su −C(R<a>R<b>)-, −C(R<a>)=C(R<b>)-, −C(R<a>)=N-, −O-, −Si(R<a>)2-, −S-, −SO2-, −N(R<a>)- i >C=Z
U nekim realizacijama, antagonist vezivanja PD-L1 se bira iz grupe koja se sastoji od: −O-, −S-, NH-, NR<a>R<b>, −CH2-, CR<a>R<b>, −C(=CH2)- i −C(=CR<a>R<b>)-U nekim realizacijama, X je -O-Y označava grupu odabranu iz grupe koja se sastoji od −C(R<a>R<b>)-, −C(R<a>)=C(R<b>)-, −C(R<a>)=N-, −O-, −Si(R<a>)2-, −S-, −SO2-, −N(R<a>)-, i >C=Z
U nekim realizacijama, Y se bira iz grupe koja se sastoji od: −CH2-, −C(R<a>R<b>)-, −CH2CH2-, −C(R<a>R<b>)-C(R<a>R<b>)-, −CH2CH2CH2-, −C(R<a>R<b>)C(R<a>R<b>)C(R<a>R<b>)-, −C(R<a>)=C(R<b>)-i −C(R<a>)=N-U nekim realizacijama, Y se bira iz grupe koja se sastoji od: −CH2-, −CHR<a>-, −CHCH3-, CR<a>R<b>-ili -X-Y- zajedno označavaju bivalentnu vezujuću grupu (koja se naziva i radikulum) koja se sastoji od 1,2, 3 ili 4 grupe/atoma odabrana iz grupe u kojoj se nalaze −C(R<a>R<b>)-, −C(R<a>)=C(R<b>)-, −C(R<a>)=N-, −O-, −Si(R<a>)2-, −S-, −SO2-, −N(R<a>)-, i >C=Z,
U nekim realizacijama, -X-Y- označava biradikulum odabran iz grupa koje se sastoje od: −X-CH2-, −X-CR<a>R<b>-, −X-CHR<a>-, −X-C(HCH3)-, −O-Y-, −O-CH2-, −S-CH2-, −NH-CH2-, −O-CHCH3-, −CH2-O-CH2, −O-CH(CH3CH3)-, −O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,−O-CH2OCH2-, −O-NCH2-, −C(=CH2)-CH2-, −NR<a>-CH2-, N-O-CH2, −S-CR<a>R<b>- i −S-CHR<a>-.
U nekim realizacijama, -X-Y- označava −O-CH2- or −O-CH(CH3)-.
pri čemu se Z odabire od −O-, −S-, and −N(R<a>)-,
a R<a>i, kada je prisutan R<b>, svaki od njih je nezavisno odabran od vodonika, opciono supstituisanog C1-6-alkila, supstituisanog C2-6-alkenila, supstituisanog C2-6-alkinila, hidroksi, supstituisanog C1-6-alkoksi, C2-6-alkoksialkila, C2-6-alkeniloksi, karboksi, C1-6-alkoksikarbonila, C1-6-alkilkarbonila, formila, arila, ariloksi-karbonila, ariloksi, arilkarbonila, heteroarila, heteroariloksi-karbonila, heteroariloksi, heteroarilkarbonila, amino, mono- i di(C1-6-alkil)amino, karbamoila, mono- i di(C1-6-alkil)-amino-karbonila, amino-C1-6-alkilaminokarbonila, mono- i di(C1-6-alkil)amino-C1-6-alkil-aminokarbonila, C1-6-alkilkarbonilamino, karbamido, C1-6-alkanoiloksi, sulfono, C1-6-alkilsulfoniloksi, nitro, azido, sulfanila, C1-6-alkiltio, halogena, gde aril i heteroaril mogu opciono biti supstituisani i gde dva geminalna supstituenta R<a>i R<b>zajedno mogu da odrede opciono supstituisani metilen (=CH2), pri čemu za sve hiralne centre, asimetrične grupe mogu da se nađu u R ili S orijentaciji.
pri čemu su R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>nezavisno odabrani iz grupe koja sadrži: vodonik, supstituisani C1-6-alkil, supstituisani C2-6-alkenil, supstituisani C2-6-alkinil, hidroksi, C1-6-alkoksi, C2-6-alkoksialkil, C2-6-alkeniloksi, karboksi, C1-6-alkoksikarbonil, C1-6-alkilkarbonil, formil, aril, ariloksi-karbonil, ariloksi, arilcarbonil, heteroaril, heteroariloksi-karbonil, heteroariloksiy, heteroarilkarbonil, amino, mono- i di(C1-6-alkil) amino, karbamoil, mono- i di(C1-6-alkil)-amino-karbonil, amino-C1-6-alkil-aminokarbonil, mono- i di(C1-6-alkil)amino-C1-6-alkil-aminokarbonil, C1-6-alkil-karbonilamino, karbamido, C1-6-alkanoiloksi, sulfono, C1-
6-akilsulfoniloksi, nitro, azido, sulfanil, C1-6-alkiltio, halogen, gde aril i heteroaril mogu biti supstituisani, i gde dva geminalna supstituenta zajedno mogu da odrede okso, tiokso, imino, ili opciono supstituisani metilen.
U nekim realizacijama R<1>, R<2>, R<3>, R<5>and R<5*>su nezavisno odabrani od C1−6alkila, kao što je metil, i vodonika.
U nekim realizacijama R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik.
U nekim realizacijama, R<1>, R<2>, R<3>su vodonik, a jedan od R<5>ili R<5*>je takođe vodonik, a drugi od R5 i R5* nije vodonik nego nešto drugo, na primer C1-6alkil, kao što je metil.
U nekim realizacijama, R<a>je ili vodonik ili metil. U nekim realizacijama, kada je prisutan, R<b>je vodonik ili metil.
U nekim realizacijama, jedan ili oba R<a>i R<b>su vodonik
U nekim realizacijama, jedan od R<a>i R<b>je vodonik, a drugi nije vodonik nego nešto drugo
U nekim realizacijama, jedan od R<a>i R<b>je metil, a drugi je vodonik
U nekim realizacijama, i R<a>i R<b>su metil.
U nekim realizacijama, biradikulum -−O-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi LNA nukleozidi su objavljeni u WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 i WO2004/046160 i sadrže nukleozide koji su obično poznati kao beta-D-oksi LNA i alfa-L-oksi LNA nukleozidi.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −S-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi tio LNA nukleozidi su objavljeni u WO99/014226 i WO2004/046160.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −NH-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi amino LNA nukleozidi su objavljeni u WO99/014226 i WO2004/046160.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −O-CH2-CH2- ili −O-CH2-CH2-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi LNA nukleozidi su objavljeni u WO00/047599 i u Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76, i obuhvataju nukleinske kiseline obično poznate kao 2'-O-4'C-etilen premoštene nukleinske kiseline
2
(ENA).
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je -O-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>i jedan od R<5>i R<5*>su vodonik, a drugi od R<5>i R<5*>nije vodonik nego nešto drugo, na primer C1-6alkil, kao što je metil. Takvi 5' supstituisani LNA nukleozidi su objavljeni u WO2007/134181.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −O-CR<a>R<b>-, pri čemu je jedan ili ni jedan od R<a>i R<b>nisu vodonik nego nešto drugo, na primer metil, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>i jedan od R<5>i R<5*>su vodonik, a drugi R<5>i R<5*>nije vodonik nego nešto drugo, na primer C1-6alkil, kao što je metil. Takvi bis modifikovani LNA nukleozidi su objavljeni u WO2010/077578.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- određuje bivalentnu linker grupu −O-CH(CH2OCH3)-(2’ O-metoksietil biciklična nukleinska kiselina - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) str. 1569-81). U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- određuje bivalentnu linker grupu −O-CH(CH2CH3)-(2’O-etil biciklična nukleinska kiselina - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) str. 1569-81). U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je -O-CHR<a>-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi 6' supstituisani LNA nukleozidi su opisani u WO10036698 i WO07090071.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −O-CH(CH2OCH3)-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi LNA nukleozidi su poznati i kao ciklični MOE (cMOE) i objavljeni su u WO07090071.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- određuje bivalentnu linker grupu −O-CH(CH3)-. - bilo u R- ili S- konfiguraciji. U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- zajedno određuje bivalentnu linker grupu −O-CH2-O-CH2- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem). U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −O-CH(CH3)-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi 6' metil LNA nukleozidi su poznati i kao cET nukleozidi, a mogu biti ili (S)cET ili (R)cET stereoizomeri, kako je objavljeno u WO07090071 (beta-D) i WO2010/036698 (alfa-L).
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −O-CR<a>R<b>-, pri čemu ni R<a>ni R<b>nije vodonik, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. U nekim realizacijama, R<a>i R<b>su oba metil. Takvi 6' di-supstituisani LNA nukleozidi su opisani u WO2009006478.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je -S-CHR<a>-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi 6' supstituisani tio LNA nukleozidi su opisani u WO11156202. U nekim 6' supstituisanim tio LNA realizacijama, R<a>je metil.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je -C(=CH2)-C(R<a>R<b>)-, na primer -C(=CH2)-CH2- ili - C(=CH2)-CH(CH3)-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. Takvi vinil karbo LNA nukleotidi su objavljeni u WO08154401 i WO09067647.
U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −N(-OR<a>)-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>and R<5*>su svi vodonik. U nekim realizacijama R<a>je C1-6alkil, kao što je metil. Takvi LNA nukleozidi su takođe poznati kao N supstituisane LNA i objavljeni su u WO2008/150729. U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- zajedno određuje bivalentnu linker grupu −O-NR<a>-CH3- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). U nekim realizacijama, biradikular -X-Y- je −N(R<a>)-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>and R<5*>su svi vodonik. U nekim realizacijama R<a>je Ci-e alkil, kao što je metil.
U nekim realizacijama, jedan ili oba R<5>i R<5*>su vodonik, a supstituisani drugi od R<5>i R<5*>je C1-6alkil, kao što je metil. U takvoj jednoj realizaciji, R<1>, R<2>, R<3>mogu svi biti vodonik, a biradikular -X-Y- može biti odabran od -O-CH2- ili -OC(HCR<a>)-, kao što je -OC(HCH3)-.
U nekim realizacijama, biradikular je -CR<a>R<b>-O-CR<a>R<b>-, kao što je CH2-O-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5>su svi vodonik. U nekim realizacijama R<a>je C1-6alkil, kao što je metil. Takvi LNA nukleozidi su poznati i kao konformaciono ograničeni nukleotidi (CRN) i objavljeni su u WO2013036868. U nekim realizacijama, biradikular je −O-CR<a>R<b>-O-CR<a>R<b>-, kao što je O-CH2-O-CH2-, W je O, a R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik. U nekim realizacijama R<a>je C1-6alkil, kao što je metil. Takvi LNA nukleozidi su poznati i kao COC nukleotidi i objavljeni su u Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 200937 (4), 1225-1238.
Određeni primeri LNA nukleozida predstavljeni su u šemi 1.
2
Kao što je prikazano u primerima, u nekim realizacijama ovog pronalaska LNA nukleozidi u oligonukleotidima su beta-D-oksi-LNA nukleozidi.
Razgradnja posredstvom nukleaze
Razgradnja posredstvom nukleaze se odnosi na oligonukleotid sposoban da posreduje u razgradnji komplementarne nukleotidne sekvence kada formira dupleks sa takvom sekvencom.
U nekim realizacijama, oligonukleotid može da funkcioniše putem nukleazom posredovane razgradnje ciljne nukleinske kiseline, pri čemu su oligonukleotidi iz ovog pronalaska sposobni regrutovati nukleazu, posebno endonukleazu, po mogućnosti endoribonukleazu (RNase), kao što je RNase H. Primeri dizajna oligonukleotida koji deluju putem mehanizama posredovanih nukleazom su oligonukleotidi koji tipično sadrže region od
2
najmanje 5 ili 6 DNK nukleozida, a sa jedne ili sa obe strane bočno su povezani nukleozidima koji pojačavaju afinitet, kao što su na primer gepmeri, nukleozidi glave i repa.
Aktivnost i regrutovanje RNase H
Aktivnost RNaze H antisense oligonukleotida se odnosi na njegovu sposobnost da regrutuje RNazu H kada je u dupleksu sa komplementarnim RNK molekulom. WO01/23613 daje in vitro postupke za određivanje aktivnosti RNaseH, koji se mogu koristiti za određivanje sposobnosti regrutacije RNaseH. Po pravilu se smatra da je oligonukleotid sposoban da regrutuje RNazu H ako, kada mu je data komplementarna ciljna sekvenca nukleinske kiseline, ima početnu brzinu, izmerenu u pmol/l/min, od najmanje 10 % ili više od 20 % od početne brzine utvrđene kada se koristi oligonukleotid koji ima istu baznu sekvencu kao i modifikovani oligonukleotid koji se ispituje, ali koji sadrži samo DNK monomere, sa fosforotioatnim vezama između svih monomera u oligonukleotidu, i primenom metodologije iz primera 91-95 iz WO01/23613.
Gepmer
Termin gepmer, kako se ovde koristi, odnosi se na antisense oligonukleotid koji obuhvaća oligonukleotide koji regrutuju region RNaze H (razmak) koji bočno ima na 5' i 3' jedan ili više modifikovanih nukleozida koji pojačavaju afinitet (bokovi ili krila). Ovde se opisuju različiti dizajni gepmera i daju se njihove karakteristike u odnosu na sposobnost regrutovanja RNaseH. Glava i rep su oligonukleotidi koji mogu regrutovati RNazu H tamo gde nedostaje jedan od bokova, tj. gde samo jedan od krajeva oligonukleotida sadrži modifikovane nukleozide koji povećavaju afinitet. Kod glave nedostaje bočni ogranak 3' (tj. bočni ogranak 5' sadrži modifikovane nukleozide koji povećavaju afinitet), a kod repa nedostaje bočni ogranak 5' (tj. bočni ogranak 3' sadrži modifikovane nukleozide koji povećavaju afinitet).
LNA gepmer
Termin LNA gepmer se odnosi na gepmer oligonukleotid u kojem je najmanje jedan od modifikovanih nukleozida koji povećavaju afinitet LNA nukleozid.
Mešani krilni gepmer
Izraz mešani krilni gepmer se odnosi na LNA gepmer u kojem najmanje jedan od bočnih regiona sadrži najmanje jedan LNA-nukleozid i najmanje jedan ne-LNA modifikovani nukleozid, na primer najmanje jedan 2' supstituisani modifikovani nukleozid, kao što su 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK (MOE), 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-RNK i 2'-F-ANA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, mešani krilni gepmer ima jedan bočni ogranak koji sadrži LNA nukleozide (npr. 5' ili 3'), a drugi bočni ogranak (3' odnosno
2
5') sadrži 2' supstituisani(/e) modifikovani(/e) nukleozid(/e) i opciono LNA nukleozide.
Gapbreaker
Izraz "gapbreaker" oligonukleotid odnosi se na gepmer koji može da održava regrutovanje RNKseH čak i kada je region razmaka prekinut nukleozidima koji regrutuju ne-RNaseH ("gapbreaker" nukleozid, E), tako da region razmaka sadrži manje od 5 uzastopnih DNK nukleozida. Nukleozidi koji regrutuju ne-RNaseH su, na primer, nukleozidi u 3' endo konformaciji, poput LNA nukleozida, gde se most između C2' i C4' riboznog šećernog prstena nukleozida nalazi u beta konformaciji, kao kod beta-D-oksi LNA ili ScET nukleozida. Sposobnost "gapbreaker" oligonukleotida da regrutuje RNaseH najčešće je specifično u odnosu na sekvencu ili čak i jedinjenje - videti Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 str. 8476-8487, koji otkriva "gapbreaker" oligonukleotide koji regrutuju RNaseH koji u nekim slučajevima pružaju specifičnije cepanje ciljne RNK.
Oligonukleotid iz ovde opisanog pronalaska može biti "gapbreaker" oligonukleotid. Kako se ovde opisuje, "gapbreaker" oligonukleotid može da sadrži 5'-bok (F), razmak (G) i 3'-bok (F'), pri čemu se razmak prekida nukleozidom koji regrutuje ne-RNaseH ("gapbreaker" nukleozid, E), tako da razmak sadrži najmanje 3 ili 4 uzastopna DNK nukleozida. Kako se ovde opisuje, "gabreaker" nukleozid (E) može biti LNA nukleozid kod kojeg se most između C2' i C4' riboznog šećernog prstena nukleozida nalazi u beta konformaciji i smešten je u region razmaka tako da je "gapbreaker" LNA nukleozid bočno spojen na 5' i 3' sa najmanje 3 (5') i 3 (3'), ili najmanje 3 (5') i 4 (3'), ili najmanje 4 (5') i 3 (3') DNK nukleozida, a pri čemu je oligonukleotid sposoban da regrutuje RNaseH.
"Gapbreaker" oligonukleotid može da se predstavi sledećim formulama:
F-G-E-G-F’; konkretno F1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7
D’-F-G-F’, konkretno D’1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7
F-G-F’-D”, konkretno F1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7-D”1-3
D’-F-G-F’-D”, konkretno D’1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7-D”1-3
Gde su region D' i D'' kao što je opisano u odeljku "Dizajn gepmera".
Kako se ovde opisuje, "gapbreaker" nukleozid (E) je beta-D-oksi LNA, ili ScET, ili drugi beta-LNA nukleozidi prikazani na šemi 1).
Konjugat
Termin konjugat, kako se ovde koristi, odnosi se na oligonukleotid koji je kovalentno vezan za nenukleotidni deo (konjugovani ostatak ili region C ili treći region), koji se naziva i oligonukleotidni konjugat.
Konjugacija oligonukleotida iz predmetnog pronalaska sa jednim ili više
2
nenukleotidnih delova može da poboljša farmakologiju oligonukleotida, npr. utičući na aktivnost, ćelijsku distribuciju, ćelijski unos ili stabilnost oligonukleotida. U nekim realizacijama, konjugovani ostatak usmerava oligonukleotid na jetru. Istovremeno, konjugat služi za smanjenje aktivnosti oligonukleotida u neciljanim ćelijskim tipovima, tkivima ili organima, npr. za neciljanu aktivnost ili aktivnost u neciljanim tipovima ćelija, tkiva ili organa. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, oligonukleotidni konjugat iz ovog pronalaska pokazuje poboljšanu inhibiciju PD-L1 u ciljnoj ćeliji u odnosu na nekonjugovani oligonukleotid. U drugoj realizaciji, oligonukleotidni konjugat iz ovog pronalaska je poboljšao ćelijsku distribuciju između jetre i drugih organa, na primer slezine ili bubrega (tj. više konjugovanih oligonukleotida odlazi u jetru nego u slezinu ili bubrege) u odnosu na nekonjugovani oligonukleotid. U još jednoj realizaciji, oligonukleotidni konjugat iz ovog pronalaska pokazuje poboljšan ćelijski unos u jetru konjugovanog oligonukleotida u odnosu na nekonjugovani oligonukleotid.
WO93/07883 i WO2013/033230 daju pogodne konjugovane delove. Drugi odgovarajući konjugovani delovi su oni koji mogu da se vežu za asijaloglikoproteinski receptor (ASGPr). Konkretno, trivalentni N-acetilgalaktozamin konjugovani delovi pogodni su za vezivanje na ASGPr, videti na primer WO2014/076196, WO2014/207232 i WO2014/179620. Konjugovani ostatak je u osnovi fragment konjugata antisense oligonukleotida koji ne sadrži nukleinske kiseline.
Oligonukleotidni konjugati i njihova sinteza su opisani i u opsežnim pregledima Manoharana u Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 i Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
U jednoj realizaciji, ne-nukleotidni deo (konjugovani ostatak) odabran je iz grupe koju čine ugljikohidrati, ligandi površinskih ćelijskih receptora, supstance lekova, hormoni, lipofilne supstance, polimeri, proteini, peptidi, toksini (npr. bakterijski toksini), vitamini, virusni proteini (npr. kapsidi) ili njihove kombinacije.
Linkeri
Veza ili linker je veza između dva atoma koja povezuje jednu hemijsku grupu ili segment od interesa sa drugom hemijskom grupom ili segmentom od interesa putem jedne ili više kovalentnih veza. Konjugovani delovi mogu se vezati za oligonukleotid direktno ili preko veznog dela (npr. linker ili vezica). Linkeri služe za kovalentno povezivanje trećeg regiona, npr. konjugovanog dela (regiona C), sa prvim regionom, npr. oligonukleotidom (region A) ili preklapajućom nukleotidnom sekvencom komplementarnom sa ciljnom
2
nukleinskom kiselinom (region A).
U nekim realizacijama ovog pronalaska konjugat ili oligonukleotidni konjugat iz pronalaska može opciono sadržavati region linkera (drugi region ili region B i/ili region Y) koji je pozicioniran između oligonukleotida ili preklapajuće nukleotidne sekvence komplementarne sa ciljnom nukleinskom kiselinom (regiona A ili prvog regiona) i konjugovanog dela (regiona C ili trećeg regiona).
Region B se odnosi na biološki cepljive linkere koji sadrže ili se sastoje od fiziološki labilne veze koja se cepa u uslovima koji se inače susreću ili su analogni onima koji se mogu naći u telu sisara. Uslovi pod kojima fiziološki labilni linkeri doživljavaju hemijsku transformaciju (npr. cepanje) obuhvataju hemijska stanja kao što su pH, temperatura, oksidativni ili reduktivni uslovi ili agensi i koncentracija soli koja se nalazi u ili je analogna onima u ćelijama sisara. Unutarćelijski uslovi kod sisara takođe obuhvataju prisustvo enzimske aktivnosti koja je normalno prisutna u ćeliji sisara, poput proteolitičkih enzima ili hidrolitičkih enzima ili nukleaza. U jednoj realizaciji, biološki cepljivi linker je osetljiv na cepanje S1 nukleazom. U jednoj poželjnoj realizaciji, nukleazno osetljivi linker sadrži između 1 i 10 nukleozida, na primer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleozida, poželjnije između 2 i 6 nukleozida i najpoželjnije između 2 i 4 vezana nukleozida koji sadrže najmanje dve uzastopne fosfodiesterske veze, na primer najmanje 3 ili 4 ili 5 uzastopnih fosfodiesterskih veza. Poželjno je da su nukleozidi DNK ili RNK. Fosfodiester koji sadrži biocepljive linkere detaljnije je opisan u WO2014/076195.
Region Y se odnosi na linkere koji nisu nužno biocepljivi već prvenstveno služe za kovalentno povezivanje konjugovanog dela (regiona C ili trećeg regiona) sa oligonukleotidom ili preklapajućom nukleotidnomo sekvencom komplementarnom sa ciljnom nukleinskom kiselinom (regionom A ili prvim regionom). Linkeri regiona Y mogu sadržavati strukturu lanca ili oligomera ponavljajućih jedinica kao što su etilen glikol, aminokiselinske jedinice ili amino alkilne grupe. Oligonukleotidni konjugati iz predmetnog pronalaska mogu da se konstruišu od sledećih regionalnih elemenata A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C ili A-Y-C. U nekim realizacijama, linker (region Y) je aminoalkil, kao što je aminoalkil grupa C2-C36, uključujući, na primer, amino alkil grupe C6 do C12. U jednoj poželjnoj realizaciji, linker (region Y) je C6 aminoalkilna grupa.
Lečenje
Termin "lečenje", kako se ovde koristi, odnosi se kako na lečenje postojeće bolesti (npr. bolesti ili poremećaja kako se ovde pominju), tako i na prevenciju bolestitj. profilaksu. Stoga će se lako shvatiti da termin lečenje, kako se ovde koristi, može da u nekim realizacijama podrazumeva profilaksu.
Obnavljanje imunološkog odgovora na patogene
Imunološki odgovor deli se na urođeni i adaptivni imunološki odgovor. Urođeni imunološki sistem pruža trenutni, ali nespecifični odgovor. Adaptivni imunološki odgovor aktivira se urođenim imunološkim odgovorom i vrlo je specifičan za određeni patogen. Nakon prezentacije antigena izvedenog iz patogena na površini antigen prezentujućih ćelija, imune ćelije adaptivnog imunološkog odgovora (tj. T i B limfociti) aktiviraju se putem svojih antigen-specifičnih receptora što dovodi do patogeno specifičnog imunološkog odgovora i razvoja imunološke memorije. Hronične virusne infekcije, kao što su HBV i HCV, povezane su sa iscrpljenošću T ćelija, čija je karakteristika izostanak odgovora virusno specifičnih T ćelija. Iscrpljenost T ćelija je dosta proučavana, pregledni rad može se naći, na primer, u Yi et al 2010 lmmunology129, 474-481. Hronične virusne infekcije su takođe povezane sa smanjenom funkcijom NK ćelija koje su urođene imunološke ćelije. Pojačavanje virusnog imunološkog odgovora važno je za lečenje hronične infekcije. Obnavljanje imunološkog odgovora na patogene posredstvom T ćelija i NK ćelija, može se proceniti merenjem proliferacije, sekrecije citokina i citolitičke funkcije (Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 i primer 6 u ovom radu).
Detaljan opis pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu antisense oligonukleotida i njihovih konjugata, te farmaceutskih preparata koji ih sadrže, za obnavljanje imunološkog odgovora na patogene koji zaraze životinju, posebno čoveka. Konjugati antisense oligonukleotida iz predmetnog pronalaska su posebno korisni protiv patogena koji zaraze jetru, posebno kod hroničnih infekcija jetre kao što je HBV. Konjugati omogućavaju ciljanu raspodelu oligonukleotida i sprečavaju sistemski nokdaun ciljne nukleinske kiseline.
Oligonukleotidi iz predmetnog pronalaska
Ovaj pronalazak se odnosi na oligonukleotide koji mogu modulirati ekspresiju PD-L1. Modulacija se može postići hibridizacijom sa ciljnom nukleinskom kiselinom koja kodira PD-L1 ili koja je uključena u regulaciju PD-L1. Ciljna nukleinska kiselina može biti PD-L1 sekvenca sisara, poput sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i/ili SEQ ID NO: 3. Ciljna nukleinska kiselina može biti pre-mRNK, mRNK ili bilo koja RNK sekvenca eksprimirana iz ćelije sisara koja podržava ekspresiju ili regulaciju PD-L1.
Oligonukleotid iz predmetnog pronalaska je antisense oligonukleotid koji cilja PD-L1. U jednom aspektu pronalaska, oligonukleotid z ovog pronalaska je konjugovan sa
1
konjugovanim delom, posebno asijaloglikoproteinskim receptorom koji cilja konjugovani ostatak.
U nekim realizacijama, antisense oligonukleotid iz ovog pronalaska može da modulira ekspresiju cilja njegovim inhibiranjem ili nishodnom regulacijom. Poželjno je da takva modulacija proizvodi inhibiciju ekspresije od najmanje 20 % u odnosu na normalni nivo ekspresije cilja, poželjnije najmanje 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ili 90 % inhibicije u odnosu na normalni nivo ekspresije cilja. Poželjno je da takva modulacija proizvodi inhibiciju ekspresije od najmanje 20 % u odnosu na nivo ekspresije kada na ćeliju ili organizam deluje zarazni agens ili kad se ćelija ili organizam tretiraju agensom koji imitira delovanje zaraznog agensa (npr. pPoli I:C ili LPS), poželjnije najmanje 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ili 90 % inhibicije u odnosu na nivo ekspresije kada na ćeliju ili organizam deluje zarazni agens ili kad se ćelija ili organizam tretiraju agensom koji imitira delovanje zaraznog agensa (npr. poli I: C ili LPS). U nekim realizacijama, oligonukleotid iz ovog pronalaska može da inhibira nivoe ekspresije PD-L1 mRNK za najmanje 60 % ili 70 % in vitro, pri korištenju KARPAS-299 ili THP1 ćelija. U nekim realizacijama, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da inhibiraju nivoe ekspresije proteina PD-L1 za najmanje 50 % in vitro, pri korištenju KARPAS-299 ili THP1 ćelija. Na prikladan način, u primerima se daju testovi koji se mogu koristiti za merenje PD-L1 RNK (npr. primer 1). Ciljana modulacija pokreće se hibridizacijom između preklapajuće nukleotidne sekvence oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, oligonukleotid iz pronalaska sadrži neusklađene nukleotide između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. I pored neusklađenih nukleotida, hibridizacija sa ciljnom nukleinskom kiselinom i dalje može biti dovoljna da pokaže željenu modulaciju ekspresije PD-L1. Smanjeni afinitet vezivanja koji nastaje zbog neusklađenih nukleotida, može se povoljno nadoknaditi povećanjem broja nukleotida u oligonukleotidu i/ili povećanjem broja modifikovanih nukleozida koji mogu povećati afinitet vezivanja za cilj, kao što su 2' modifikovani nukleozidi, uključujući LNA, prisutni u oligonukleotidnoj sekvenci.
U nekim realizacijama, antisense oligonukleotid iz ovog pronalaska može da obnovi T ćelije specifične za patogen. U nekim realizacijama, oligonukleotid iz ovog pronalaska može da poveća T-ćelije specifične za patogen za najmanje 40 %, 50 %, 60 % ili 70 % u odnosu na nelečene kontrole ili kontrole lečene standardnom terapijom. U jednoj realizaciji, antisense oligonukleotid ili konjugat iz ovog pronalaska mogu povećati HBV-specifične T ćelije u odnosu sa nelečene kontrole ili kontrole lečene standardnom terapijom. Na prikladan način, u primerima se daju testovi koji se mogu koristiti za merenje HBV-specifičnih T ćelija (npr.
2
proliferacija T ćelija, sekrecija citokina i citolitička aktivnost). U jednoj drugoj realizaciji, antisense oligonukleotid ili konjugat iz ovog pronalaska može da poveća HCV-specifične T ćelije u odnosu na nelečene kontrole ili kontrole lečene standardnom terapijom. U jednoj drugoj realizaciji, antisense oligonukleotid ili konjugat iz ovog pronalaska može da poveća HDV-specifične T ćelije u odnosu na nelečene kontrole ili kontrole lečene standardnom terapijom.
U nekim realizacijama, antisense oligonukleotid iz ovog pronalaska može da smanji nivo HBsAg kod životinje ili čoveka. U nekim realizacijama, oligonukleotid iz ovog pronalaska može da smanji nivo HBsAg za najmanje 40 %, 50 %, 60 % ili 70 %, još poželjnije za najmanje 80 %, 90 % ili 95 % u odnosu na nivo pre lečenja. Najpoželjnije, oligonukleotidi iz ovog pronalaska mogu da postignu serokonverziju HBsAg kod životinje ili čoveka koji su zaraženi HBV-om.
Ovde se opisuje antisense oligonukleotid koji sadrži prekalapajuću nukleotidnu sekvencu dužine 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom PD-L1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži preklapajuću sekvencu koja je najmanje 90 % komplementarna, npr. najmanje 91 %, npr. najmanje 92 %, npr. najmanje 93 %, npr. najmanje 94 %, npr. najmanje 95 %, npr. najmanje 96 %, npr. najmanje 97 %, npr. najmanje 98 %, ili 100 % komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid iz ovog pronalaska ili njegova preklapajuća nukleotidna sekvenca u potpunosti je komplementaran (100 % komplementaran) sa regionom ciljne nukleinske kiseline, ili u nekim realizacijama može sadržavati jedan ili dva neusklađena nukleotida između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % komplementarnosti, na primer potpunom (ili 100 %) komplementarnosti, sa regionom ciljne nukleinske kiseline prisutne u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. Kako se ovde opisuje, oligonukleotidna sekvenca je 100 % komplementarna sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline prisutnim u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Kako se ovde opisuje, oligonukleotidna sekvenca je 100 % komplementarna sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline prisutnim u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 3.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % komplementarnosti, na primer 100 % komplementarnosti, sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline u kojoj je preklapajuća nukleotidna sekvenca komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline odabranom iz grupe koja se sastoji od položaja 371-3068, 5467-12107 i 15317-19511 na SEQ ID NO: 1. Kako se ovde opisuje, podsekvenca ciljne nukleinske kiseline odabrana je iz grupe koja se sastoji od položaja 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881- 19494 i 1881-19494 na SEQ ID NO: 1. Kako se ovde opisuje, podsekvenca ciljne nukleinske kiseline odabrana je iz grupe koja se sastoji od položaja 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 i 15690-15735 na SEQ ID NO: 1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % komplementarnosti, na primer 100 % komplementarnosti, sa odgovarajućim ciljanim regionom nukleinske kiseline prisutnim u SEQ ID NO: 1, pri čemu je region ciljne nukleinske kiseline odabran iz grupe koja se sastoji od regiona a1 do a449 u tabeli 4.
Tabela 4: Regioni SEQ ID NO 1 koji se mogu ciljati upotrebom oligonukleotida kako je ovde opisano
4
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca, komplementaran je regionu ciljne nukleinske kiseline, pri čemu je region ciljne nukleinske kiseline odabran iz grupe koju čine a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 i a438.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid, ili preklapajuća nukleotidna sekvenca, komplementaran je regionu ciljne nukleinske kiseline, pri čemu je ciljni region nukleinske kiseline odabran iz grupe koja se sastoji od a160, a180, a221, a269 i a360.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid iz ovog pronalaska ima dužinu ili se sastoji od 8 do 35 nukleotida, na primer od 9 do 30, na primer od 10 do 22, na primerod 11 do 20, na primer od 12 do 18, na primer od 13 do 17 ili 14 do 16 preklapajućih nukleotida. Kako se ovde opisuje, oligonukleotid ima dužinu ili se sastoji od 16 do 20 nukleotida. Podrazumeva se da bilo koji od ovde datih raspona sadrži i krajnje tačke raspona. Shodno tome, ako se kaže da oligonukleotid sadrži od 10 do 30 nukleotida, obuhvaćen je i broj od 10 i broj od 30 nukleotida.
Kako se ovde opisuje, preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 preklapajućih nukleotida. Kako se ovde opisuje, oligonukleotid ima dužinu ili se sastoji od 16, 17, 18, 19 ili 20 nukleotida.
4
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe u kojoj se nalaze sekvence navedene u tabeli 5.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa sekvencom odabranom iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 5 do 743 (vidi sekvence motiva navedene u tabeli 5).
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa sekvencom odabranom iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 5 do 743 i 771.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa sekvencom odabranom iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601,619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734, i 735.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa SEQ ID NO: 287.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa SEQ ID NO: 342.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa SEQ ID NO: 640.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa SEQ ID NO: 466.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca ima dužinu ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % identiteta, po mogućnosti 100 % identiteta, sa SEQ ID NO: 566.
Kako se ovde opisuje, kada je oligonukleotid duži od preklapajuće nukleotidne sekvence (koja je komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom), sekvence motiva u tabeli 5 čine deo preklapajuće nukleotidne sekvence antisense oligonukleotida iz ovog pronalaska. Kako se ovde opisuje, sekvenca oligonukleotida je ekvivalentna preklapajućoj nukleotidnoj sekvenci (npr. ako nisu dodani biološki razcepljivi linkeri).
Podrazumijeva se da preklapajuće nukkleobazne sekvence (sekvence motiva) mogu biti modifikovane kako bi se, na primer, povećala rezistencija na nukleazu i/ili afinitet za vezivanje na ciljnu nukleinsku kiselinu. Modifikacije su opisane u definicijama i u odeljku "Dizajn oligonukleotida". U tabeli 5 navedeni su poželjni dizajni svake sekvence motiva.
Dizajn oligonukleotida
Dizajn oligonukleotida se odnosi na obrazac modifikacija nukleozidnog šećera u oligonukleotidnoj sekvenci . Ovde opisani oligonukleotidi sadrže nukleozide sa modifikovanim šećerom, a mogu sadržavati i DNK ili RNK nukleozide. U nekim realizacijama, oligonukleotid sadrži nukleozide sa modifikovanim šećerom i nukleozide DNK. Uključivanje modifikovanih nukleozida u oligonukleotid iz ovog pronalaska može da poveća afinitet oligonukleotida za ciljnu nukleinsku kiselinu.
U tom slučaju, modifikovani nukleozidi mogu se nazivati modifikovanim nukleotidima koji povećavaju afinitet, modifikovani nukleozidi mogu se nazivati i jedinicama.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži najmanje 1 modifikovani nukleozid, na primer najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15 ili najmanje 16 modifikovanih nukleozida. Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži od 1 do 10 modifikovanih nukleozida, na primer od 2 do 8 modifikovanih nukleozida, na primer od 3 do 7 modifikovanih nukleozida, na primer od 4 do 6 modifikovanih nukleozida, na primer 3, 4, 5, 6 ili 7 modifikovanih nukleozida.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži jedan ili više nukleozida sa modifikovanim šećerom, poput nukleozida sa 2' modifikovanim šećerom. Poželjno je da ovde opisani oligonukleotid sadrži jedan ili više nukleozida sa 2' modifikovanim šećerom, nezavisno odabranih iz grupe koju čine 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'- O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinska kiselina (ANA), 2'-fluoro-ANA i LNA nukleozidi. Još poželjnije, jedan ili više modifikovanih nukleozida je zaključana nukleinska kiselina (LNA).
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu. Kako se ovde opisuje, sve internukleozidne veze unutar preklapajuće nukleotidne sekvence su fosforotioatne ili boranofosfatne internukleozidne veze. U nekim realizacijama, sve internukleotidne veze u preklapajućoj sekvenci oligonukleotida su fosforotioatne veze.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid iz ovog pronalaska sadrži najmanje jedan LNA nukleozid, na primer 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 LNA nukleozida, na primer od 2 do 6 LNA nukleozida, na primer od 3 do 7 LNA nukleozida, od 4 do 6 LNA nukleozida ili 3, 4, 5, 6 ili 7 LNA nukleozida. Kako se ovde opisuje, najmanje 75 % modifikovanih nukleozida u oligonukleotidu su LNA nukleozidi, na primer 80 %, na primer 85 %, na primer 90 % modifikovanih nukleozida su LNA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, svi modifikovani nukleozidi u oligonukleotidu su LNA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, oligonukleotid može sadržavati i beta-D-oksi-LNA i jedan ili više sledećih LNA nukleozida: tio-LNA, amino-LNA, oksi-LNA i/ili ENA ili u beta-D ili u alfa-L konfiguracijama, ili njihove kombinacije. U još jednoj realizaciji, sve jedinice LNA citozina su 5-metil-citozin. Kako se ovde opisuje, oligonukleotid, ili preklapajuća nukleotidna sekvenca, ima najmanje 1 LNA nukleozid na 5' kraju i najmanje 2 LNA nukleozida na 3' kraju nukleotidne sekvence.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid iz ovog pronalaska sadrži najmanje jedan modifikovani nukleozid koji je 2'-MOE-RNK nukleozid, na primer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 2'-MOE- RNK nukleozida. Kako se ovde opisuje, najmanje jedan od navedenih modifikovanih nukleozida je 2'-fluoro DNK, na primer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 2'-fluoro-DNK nukleozida.
Oligonukleotid, kako je ovde opisan, sadrži najmanje jedan LNA nukleozid i najmanje jedan 2' supstituisani modifikovani nukleozid.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži i nukleozide sa 2' modifikovanim šećerom i DNK jedinice. Poželjno je da oligonukleotid sadrži i LNA i DNK nukleozide (jedinice). Poželjno je da ukupni broj LNA i DNK jedinica iznosi 8-30, na primer 10-25, po mogućnosti 12-22, na primer 12-18, još poželjnije 11-16. Kako se ovde opisuje, nukleotidna sekvenca oligonukleotida, kao što je preklapajuća nukleotidna sekvenca, sastoji se od najmanje jednog ili dva LNA nukleozida, a preostali nukleozidi su DNK jedinice. Kako se ovde opisuje, oligonukleotid sadrži samo LNA nukleozide i nukleozide koji se javljaju u prirodi (kao što su RNK ili DNK, najpoželjnije DNK nukleozide), opciono sa modifikovanim internukleozidnim vezama, kao što je fosforotioat.
U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, oligonukleotid iz ovog pronalaska može regrutovati RNazu H.
Strukturni dizajn oligonukleotida, kako je ovde opisan, može se odabrati između
4
gepmera, "gapbreaker" oligonukleotida, i nukleozida glave i repa.
Gepmer dizajn
U poželjnoj realizaciji, oligonukleotid iz ovog pronalaska ima gepmer dizajn ili strukturu koja se ovde označava i samo kao "gepmer". U strukturi gepmera oligonukleotid sadrži najmanje tri različita strukturna regiona 5'-bok, razmak i 3'-bok, FG-F' u orijentaciji '5 -> 3'. U ovom dizajnu, bočni regioni F i F' (koja se nazivaju i krilo) sastoje se od preklapajući segment modifikovanih nukleozida, koji su komplementarni sa ciljnom nukleinskomkiselinom PD-L1, dok region razmaka G sadrži preklapajući segment nukleotida koji mogu regrutovati nukleazu, po mogućnosti endonukleazu kao što je RNaza, na primer RNaza H, kada je oligonukleotid u dupleksu sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Nukleozidi koji mogu regrutovati nukleazu, posebno RNazu H, mogu se birati iz grupe koja se sastoji od DNK, alfa-L-oksi-LNA, 2'-Flouro-ANA i UNA. Regioni F i F', uz bok 5' i 3' krajeva regiona G, poželjno sadrže nukleozide koji regrutuju nenukleazu (nukleozidi sa 3' endo strukturom), poželjnije jedan ili više modifikovanih nukleozida koji povećavaju afinitet. Kako se ovde opisuje, bok 3' sadrži najmanje jedan LNA nukleozid, po mogućnosti najmanje 2 LNA nukleozida. Kako se ovde opisuje, bok 5' sadrži barem jedan LNA nukleozid. Kako se ovde opisuje, i 5' i 3' bočni regioni sadrže LNA nukleozid. Kako se ovde opisuje, svi nukleozidi u bočnim regionima su LNA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, bočni regioni mogu sadržavati i LNA nukleozide i druge nukleozide (mešoviti bokovi), kao što su DNK nukleozidi i/ili ne-LNA modifikovani nukleozidi, poput 2' supstituisanih nukleozida. U ovom slučaju razmak se definiše kao preklapajuća sekvenca od najmanje 5 nukleozida koji regrutuju RNazu H (nukleozidi s 2' endo strukturom, po mogućnosti DNK) sa modifikovanim nukleozidom koji poboljšava afinitet bočno na 5' i 3' kraju, po mogućnosti LNA, kao što je beta-D-oksi-LNA. Shodno tome, nukleozidi 5' bočnog regiona i 3' bočnog regiona, koji su uz region razmaka, su modifikovani nukleozidi, po mogućnosti nukleozidi koji regrutuju nenukleazu.
Region F
Region F (5' bok ili 5' krilo) vezan na '5 kraj regiona G sadrži ili se sastoji od najmanje jednog modifikovanog nukleozida, na primer najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, na najmanje 6, najmanje 7 modifikovanih nukleozida. Kako se ovde opisuje, F sadrži ili se sastoji od 1 do 7 modifikovanih nukleozida, na primer od 2 do 6 modifikovanih nukleozida, na primer od 2 do 5 modifikovanih nukleozida, na primer od 2 do 4 modifikovana nukleozida, na primer od 1 do 3 modifikovana nukleozida, na primer 1, 2, 3 ili 4 modifikovana nukleozida. Region F se opisuje tako da ima najmanje jedan modifikovani nukleozid na 5' kraju i 3' kraju regiona.
Kako se ovde opisuje, modifikovani nukleozidi u regionu F imaju 3' endo strukturu. Kako se ovde opisuje, jedan ili više modifikovanih nukleozida u regionu F su 2' modifikovani nukleozidi. Kako se ovde opisuje, svi nukleozidi u regionu F su 2' modifikovani nukleozidi.
Kako se ovde opisuje, region F sadrži DNK i/ili RNK pored 2' modifikovanih nukleozida. Bokove koji sadrže DNK i/ili RNK karakteriše to što imaju 2' modifikovani nukleozid na 5' i 3' kraju (uz G region) F regiona. Kako se ovde opisuje, region F sadrži DNK nukleozide, na primer 1 do 3 preklapajuća DNK nukleozida, na primer 1 do 3 ili 1 do 2 preklapajuća DNK nukleozida. DNK nukleozidi u bokovima ne bi trebali moći da regrutuju RNazu H. Kako se ovde opisuje, 2' modifikovani nukleozidi i DNK i/ili RNK nukleozidi u F regionu izmenjuju se sa 1 do 3 2' modifikovana nukleozida i 1 do 3 DNK i/ili RNK nukleozida. Takvi bokovi se mogu zvati i naizmeničnim bokovima. Dužina boka 5' (regiona F) u oligonukleotidima sa naizmeničnim bokovima može biti 4 do 10 nukleozida, na primer 4 do 8, na primer 4 do 6 nukleozida, na primer 4, 5, 6 ili 7 modifikovanih nukleozida. Kako se ovde opisuje, izmenjuje se samo 5' bok oligonukleotida. Konkretni primeri regiona F sa naizmeničnim nukleozidima su
2’1-3-N’1-4-2’1-3
2’1-2-N’1-2-2’1-2-N’1-2-2’1-2
gde 2' označava modifikovani nukleozid, a N' je RNK ili DNK. Kako se ovde opisuje, svi modifikovani nukleozidi u naizmeničnim bokovima su LNA, a N' je DNK. U još jednoj realizaciji, jedan ili više od 2' modifikovanih nukleozida u regionu F odabrani su između 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-O-metil-RNK, 2'-amino-DNK jedinica, 2'-fluoro -DNK jedinica, 2'-alkoksi-RNK, MOE jedinica, LNA jedinica, jedinica arabino nukleinske kiseline (ANA) i 2'-fluoro-ANA jedinica.
Kako se ovde opisuje, F regiona sadrži i LNA i 2' supstituisani modifikovani nukleozid. To se često naziva mešanim krilom ili mešovitim bočnim oligonukleotidima.
Kako se ovde opisuje, svi modifikovani nukleozidi u regionu F su LNA nukleozidi. U još jednoj realizaciji, svi nukleozidi u regionu F su LNA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, LNA nukleozidi u regionu F su nezavisno odabrani iz grupe
koja se sastoji od oksi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET i/ili ENA, bilo u beta-D ili alfa-L konfiguraciji ili njihovih kombinacija. Kako se ovde opisuje, region F sadrži najmanje 1 beta-D-oksi LNA jedinicu, na 5' kraju preklapajuće sekvence.
Region G
Region G (region razmaka) poželjno sadrži ili se sastoji od najmanje 4, na primer
4
najmanje 5, na primer najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15 ili najmanje 16 uzastopnih nukleozida koji mogu da regrutuju gore spomenutu nukleazu, posebno RNaseH. Kako se ovde opisuje, region G sadrži ili se sastoji od 5 do 12, ili od 6 do 10 ili od 7 do 9, na primer 8 uzastopnih nukleotidnih jedinica koje mogu da regrutuju gore pomenutu nukleazu.
Nukleozidne jedinice u regionu G, koje je mogu da regrutuju nukleazu, koje su ovde opisane, odabrane su iz skupine koja se sastoji od DNK, alfa-L-LNA, C4'alkilirane DNK (kako je opisano u PCT/EP2009/050349 i Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300), nukleozida izvedenih iz arabinoze poput ANA i 2'F-ANA (Mangos et al.2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (otključana nukleinska kiselina) (kako je opisano u Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039). UNA je otključana nukleinska kiselina, po pravilu na mestu gde je veza između C2 i C3 riboze uklonjena, što stvara otključani "šećerni" ostatak.
Kako se ovde opisuje, najmanje jedna nukleozidna jedinica u regionu G je DNK nukleozidna jedinica, na primer od 1 do 18 DNK jedinica, na primer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16 ili 17 DNK jedinica, po mogućnosti od 2 do 17 DNK jedinica, na primer od 3 do 16 DNK jedinica, na primer od 4 do 15 DNK jedinica, na primer od 5 do 14 DNK jedinica, na primer od 6 do 13 DNK jedinica, na primer od 7 do 12 DNK jedinica, na primer od 8 do 11 DNK jedinica, poželjnije od 8 do 17 DNK jedinica, ili od 9 do 16 DNK jedinica, od 10 do 15 DNK jedinica ili od 11 do 13 DNK jedinica, na primer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 154, 16, 17 DNK jedinica. U nekim realizacijama, region G se sastoji od 100 % DNK jedinica.
Kako se ovde opisuje, region G se može sastojati od mešavine DNK i drugih nukleozida koji mogu posredovati cepanje RNaze H. Region G se može sastojati od najmanje 50 % DNK, još poželjnije 60 %, 70 % ili 80 % DNK, i još poželjnije 90 % ili 95 % DNK.
Kako se ovde opisuje, najmanje jedna nukleozidna jedinica u regionu G je alfa-L-LNA nukleozidna jedinica, na primer najmanje jedna alfa-L-LNA, na primer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 alfa -L-LNA. Kako se ovde opisuje, region G sadrži najmanje jednu alfa-L-LNA koja je alfa-L-oksi-LNA. Kako se ovde opisuje, region G sadrži kombinaciju DNK i alfa-L-LNA nukleozidnih jedinica.
Kako se ovde opisuje, nukleozidi u regionu G imaju 2' endo strukturu.
Kako se ovde opisuje, region G može sadržavati "gapbreaker" nukleozid, što proizvodi "gapbreaker" oligonukleotid, koji je sposoban da regrutuje Rnazu H.
Region F'
4
Region F' (3' bok ili 3' krilo) vezan na '3 kraj regiona G sadrži ili se sastoji od najmanje jednog modifikovanog nukleozida, na primer najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 modifikovanih nukleozida. Kako se ovde opisuje, F' sadrži ili se sastoji od 1 do 7 modifikovanih nukleozida, na primer od 2 do 6 modifikovanih nukleozida, na primer od 2 do 4 modifikovanih nukleozida, na primer od 1 do 3 modifikovanih nukleozida, na primer 1, 2, 3 ili 4 modifikovana nukleozida. F' region je definisan tako da ima najmanje jedan modifikovani nukleozid na kraju 5' i na kraju 3' regiona.
Kako se ovde opisuje, modifikovani nukleozidi u regionu F' imaju 3' endo strukturu. Kako se ovde opisuje, jedan ili više modifikovanih nukleozida u regionu F' su 2' modifikovani nukleozidi. Kako se ovde opisuje, svi nukleozidi u regionu F' su 2' modifikovani nukleozidi.
Kako se ovde opisuje, jedan ili više modifikovanih nukleozida u regionu F' su 2' modifikovani nukleozidi.
Kako se ovde opisuje, svi nukleozidi u regionu F' su 2' modifikovani nukleozidi. Kako se ovde opisuje, region F' sadrži DNK ili RNK nukleozide, pored 2' modifikovanih nukleozida. Bokovi koji sadrže DNK ili RNK karakterišu se time što imaju 2' modifikovani nukleozid na 5' kraju (uz region G) i 3' kraju regiona F' . Kako se ovde opisuje, region F' sadrži DNK nukleozide, na primer od 1 do 4 preklapajuća DNK nukleozida, na primer od 1 do 3 ili od 1 do 2 preklapajuća DNK nukleozida. DNK nukleozidi u bokovima ne bi trebali moći da regrutuju RNazu H. U nekim izvedbama 2' modifikovani nukleozidi i DNK i/ili RNK nukleozidi u F' regionu izmenjuju se sa 1 do 3 2' modifikovana nukleozida i 1 do 3 DNK i/ili RNK nukleozida, takvi bokovi se takođe mogu nazvati naizmeničnim bokovima. Dužina 3' boka (region F') u oligonukleotidima sa naizmeničnim bokovima može biti od 4 do 10 nukleozida, na primer 4 do 8, na primer 4 do 6 nukleozida, na primer 4, 5, 6 ili 7 modifikovanih nukleozida. Kako se ovde opisuje, izmenjuje se samo 3' bok oligonukleotida. Konkretni primeri regiona F' sa naizmeničnim nukleozidima su
2’1-2-N’1-4-2’1-4
2’1-2-N’1-2-2’1-2-N’1-2-2’1-2
gde 2' označava modifikovani nukleozid, a N' je RNK ili DNK. Kako se ovde opisuje, svi modifikovani nukleozidi u naizmeničnim bokovima su LNA, a N' je DNK. Kako se ovde opisuje, modifikovani nukleozidi u regionu F' biraju se od 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-O-metil-RNK, 2'-amino-DNK jedinica, 2'-fluoro-DNK jedinica, 2'- alkoksi-RNK, MOE jedinica, LNA jedinica, jedinica arabino nukleinske kiseline (ANA) i 2'-fluoro-ANA jedinica.
4
Kako se ovde opisuje, F' region sadrži i LNA i 2' supstituisani modifikovani nukleozid. To se često naziva mešanim krilom ili mešovitim bočnim oligonukleotidima.
Kako se ovde opisuje, svi modifikovani nukleozidi u regionu F' su LNA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, svi nukleozidi u regionu F' su LNA nukleozidi. Kako se ovde opisuje, LNA nukleozidi u regionu F' se nezavisno biraju iz grupe koja se sastoji od oksi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET i/ili ENA, bilo u beta-D ili alfa-L konfiguracija ili u njihovih kombinacija. Kako se ovde opisuje, region F' ima najmanje 2 beta-D-oksi LNA jedinice, na 3' kraju preklapajuće sekvence.
Region D' i D''
Region D' i D'' mogu se priključiti na 5' kraj regiona F, odnosno 3' kraj regiona F'. Region D' i D'' nije obavezna.
Region D' i D'' može nezavisno sadržavati 0 do 5, na primer 1 do 5, na primer 2 do 4, na primer 0, 1,2, 3, 4 ili 5 dodatnih nukleotida, koji mogu biti komplementarni ili nekomplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom. S tim u vezi, oligonukleotid iz ovog pronalaska, u nekim realizacijama može sadržavati preklapajuću nukleotidnu sekvencu sposobnu da modulira cilj koji se nalazi bočno na 5' i/ili 3' kraju, pomoću dodatnih nukleotida. Takvi dodatni nukleotidi mogu poslužiti kao biološki cepljivi linker osetljiv na nukleazu (videti definiciju linkera). U nekim realizacijama, dodatni 5' i/ili 3' krajnji nukleozidi su povezani fosfodiesterskim vezama i mogu biti DNK ili RNK nukleozidi. U jednoj drugoj realizaciji, dodatni 5' i/ili 3' krajnji nukleozidi su modifikovani nukleozidi koji se mogu na primer uključiti da bi se poboljšala stabilnost na nukleazu ili radi lakše sinteze. U jednoj realizaciji, oligonukleotid iz pronalaska sadrži region D 'i/ili D'' na 5' ili 3' kraju preklapajuće nukleotidne sekvence. U jednoj drugoj realizaciji region D' i/ili D'' se sastoji od 1 do 5 fosfodiesterski povezanih DNK ili RNK nukleozida koji nisu komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
Gepmer oligonukleotid iz predmetnog pronalaska može se predstaviti sledećim formulama:
5’-F-G-F’-3’; konkretno F1-7-G4-12-F’1-7
5’-D’-F-G-F’-3’, konkretno D’1-3-F1-7-G4-12-F’1-7
5’-F-G-F’-D”-3’, konkretno F1-7-G4-12-F’1-7-D”1-3
5’-D’-F-G-F’-D’-3”, konkretno D’1-3-F1-7-G4-12-F’1-7-D”1-3
Poželjni broj i tipovi nukleozida u regionima F, G i F', D' i D'' opisani su iznad. Oligonukleotidni konjugati iz predmetnog pronalaska imaju region C koji je kovalentno vezan za 5' ili 3' kraj oligonukleotida, konkretno gepmer oligonukleotida predstavljenih
4
iznad.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotidni konjugat iz ovog pronalaska sadrži oligonukleotid formule 5'-D'-F-G-F'-3' ili 5'-F-G-F'-D''-3', gde regioni F i F' nezavisno sadrže 1-7 modifikovanih nukleozida, G je region između 6 i 16 nukleozida koji su sposobni regrutovati RNaseH, a region D' ili D'' sadrži 1-5 fosfodiesterski povezanih nukleozida. Poželjno je da je region D' ili D'' prisutan na kraju oligonukleotida gde se razmatra konjugacija sa konjugovanim delom.
Primeri oligonukleotida sa naizmeničnim bokovima mogu se predstaviti sledećim formulama:
2’1-3-N’1-4-2’1-3-G6-12-2’1-2-N’1-4-2’1-4
2’1-2-N’1-2-2’1-2-N’1-2-2’1-2-G6-12-2’1-2-N’1-2-2’1-2-N’1-2-2’1-2
F-G6-12-2’1-2-N’1-4-2’1-4
F-G6-12-2’1-2-N’1-2-2’1-2-N’1-2-2’1-2
2’1-3-N’1-4-2’1-3-G6-12-F’
2’1-2-N’1-2-2’1-2-N1-2-2’1-2-G6-12-F’
Kada se bok označava sa F ili F', on sadrži samo 2' modifikovane nukleozide, poput LNA nukleozida. Poželjni broj i tipovi nukleozida u naizmeničnim regionima i regionima F, G i F', D' i D'' su opisani iznad.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je gepmer koji se sastoji od 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 nukleotida u dužinu, pri čemu se svako od regiona F i F' nezavisno sastoji od 1, 2, 3 ili 4 modifikovane nukleozidne jedinice komplementarne sa PD-L1 ciljnom nukleinskom kiselinom, a region G se sastoji od 8, 9, 10, 11,12,13,14,15,16,17 nukleozidnih jedinica, sposobnih da regrutuju nukleazu kada su u dupleksu sa PD-L1 ciljnom nukleinskom kiselinom, i region D' se sastoji od 2 fosfodiesterski vezane DNK.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je gepmer u kojem se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 3, 4, 5 ili 6 modifikovanih nukleozidnih jedinica, kao što su nukleozidne jedinice koje sadrže 2'-O-metoksietil-ribozni šećer (2'- MOE) ili nukleozidne jedinice koje sadrže 2'-fluoro-deoksiribozni šećer i/ili LNA jedinice, a region G se sastoji od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ili 17 nukleozidnih jedinica, kao što su DNK jedinice ili drugi nukleozidi koji regrutuju nukleazu kao što je alfa-L-LNA, ili mešavina DNK nukleozida i nukleozida koji regrutuju nukleazu.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je gepmer u kojem se svaki od regiona F i F' sastoji od po dve LNA jedinice, a region G se sastoji od 12, 13, 14 nukleozidnih jedinica, po mogućnosti DNK jedinica. Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju 2-12-2, 2-13-2 i 2-
4
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je gepmer u kojem se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od tri LNA jedinice, a region G se sastoji od 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 nukleozidnih jedinica, po mogućnosti DNK jedinica. Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju 3-8-3, 3-9-33-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 i 3-14-3.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je gepmer u kojem se svaki od regiona F i F' sastoji od po četiri LNA jedinice, a region G se sastoji od 8 ili 9, 10, 11 ili 12 nukleozidnih jedinica, po mogućnosti DNK jedinica. Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 i 4-12-4.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 6 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-6-1, 1-6-2, 2-6- 1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-22-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 i 4-6-3 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 7 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 i 4-7-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 8 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-8-1, 1-8-2, 1-8- 3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1,2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4,, 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 i 4-8-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 9 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1,2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 i 4-9-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 10 nukleozida uključujući 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 i 4-10-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 11 nukleozida uključujući 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 i 4-11-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 12 nukleozida uključujući 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 i 4-12-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 13 nukleozida uključujući 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 i 4-13-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 14 nukleozida uključujući 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 i 4-14-4 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 15 nukleozida uključujući, 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 i 3-15-3 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 16 nukleozida uključujući, 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1,2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 i 3-16-3 gepmere.
Specifični gepmer dizajni ove vrste obuhvataju F-G-F' dizajne odabrane iz grupe koja se sastoji od razmaka sa 17 nukleozida uključujući, 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 i 3-17-2 gepmere.
U svim slučajevima dizajn F-G-F' može dalje sadržavati region D' i/ili D'', koji može imati 1, 2 ili 3 nukleozidne jedinice, kao što su DNK jedinice, na primer 2 fosfodiesterski povezane DNK jedinice. Poželjno je da su nukleozidi u regionu F i F' modifikovani nukleozidi, dok su nukleotidi u regionu G poželjno nemodifikovani nukleozidi.
U svakom dizajnu, preferirani modifikovani nukleozid je LNA.
Kako se ovde opisuje, sve internukleozidne veze u razmaku u gepmeru su fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. Kako se ovde opisuje, sve internukleozidne veze u bokovima (F i F' regionima) u gepmeru su fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. Kako se ovde opisuje, sve internukleozidne veze u D' i D'' regionu u gepmeru su fosfodiesterske veze.
Za specifične gepmere kako se ovde objavljuju, kada su ostaci citozina (C) označeni kao 5-metil-citozin, kako se ovde opisuje, jedan ili više C ostataka prisutnih u oligonukleotidu mogu biti nemodifikovani C ostaci.
Kako se ovde opisuje, gepmer je takozvani "shortmer", kako je opisano u WO2008/113832.
1
Dodatni gepmer dizajni objavljeni su u WO2004/046160, WO2007/146511.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je odabran iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 5_1 do 743_1 i 771_1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je odabran iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1, i 735_1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je CMP-ID-NO: 287_1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je CMP-ID-NO: 342_1.
U još jednoj poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, oligonukleotid je CMP-ID-NO: 640_1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je CMP-ID-NO: 466_1.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid je CMP-ID-NO: 566_1.
U još jednoj realizaciji ovog pronalaska, preklapajuća nukleotidna sekvenca oligonukleotidnih motiva i oligonukleotidnih jedinjenja iz ovog pronalaska sadrži dva do četiri dodatna fosfodiesterski vezana nukleozida na 5' kraju preklapajuće nukleotidne sekvence (npr. regionu D'). U jednoj realizaciji, nukleozidi služe kao biocepljivi linker (pogledajte odeljak o biocepljivim linkerima). U jednoj poželjnoj realizaciji, ca (citidinadenozin) dinukleotid je povezan sa 5' krajem preklapajuće nukleotidne sekvence (tj. bilo koje od sekvenci motiva ili oligonukleotidnih jedinjenja navedenih u tabeli 5) putem fosfodiesterske veze. U jednoj poželjnoj realizaciji, ca dinukleotid nije komplementaran sa ciljnom sekvencom na položaju gde je preostali deo preklapajućeg nukleotida komplementaran.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotidna ili preklapajuća nukleotidna sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od nukleotidnih sekvenci motiva sa SEQ ID NO: 766, 767, 768, 769 i 770.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid se bira iz grupe koja se sastoji od oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 i 770_1.
2
Konjugovani ugljenohidratni delovi
U konjugovane ugljenohidratne delove spadaju galaktoza, laktoza, nacetilgalaktozamin, manoza i manoza-6-fosfat. Ugljenohidratni konjugati se mogu koristiti za pojačavanje isporuke ili aktivnosti u raznim tkivima poput jetre i/ili mišića. Videti, na primer, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20 (2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17.
U nekim realizacijama, ugljenohidratni konjugovani ostatak je multivalentan, tako da se, na primer, 2, 3 ili 4 identična ili neidentična gljenohidratna dela mogu kovalentno pridružiti oligonukleotidu, opciono putem jednog ili više linkera. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži oligonukleotid iz ovog pronalaska i konjugovani ugljenohidratni deo.
U nekim realizacijama, konjugovani ostatak sadrži ili može sadržavati manozu ili manozu-6-fosfat. Ovo je posebno korisno za ciljanje mišićnih ćelija, videti na primer US2012/122801.
Konjugovani delovi koji se mogu vezati za asijaloglikoproteinski receptor (ASGPr) posebno su korisni za ciljanje hepatocita u jetri. U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje oligonukleotidni konjugat koji sadrži oligonukleotid iz pronalaska i asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak. Azijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak sadrži jedan ili više ugljenohidratnih delova koji mogu da se vežu za asijaloglikoproteinski receptor (ASPGr koji se vežu za ugljenohidratne delove) sa afinitetom jednakim ili većim od afiniteta galaktoze. Ispitivani su afiniteti brojnih derivata galaktoze za asijaloglikoproteinski receptor (videti na primer: Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271,6686) ili se oni lako određuju postupcima uobičajenim za struku.
Ovde se opisuje antisense oligonukleotidni konjugat koji sadrži a) oligonukleotid (region A) koji sadrži preklapajuću nukleotidnu sekvencu dužine 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90 % komplementarnosti sa PD-L1 ciljnom nukleinskom kiselinom; i b) najmanje jedan asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak (region C) kovalentno vezan za oligonukleotid iz tačke a). Oligonukleotid ili preklapajuća nukleotidna sekvenca mogu biti onako kako je opisano u bilo kojem od odeljaka "oligonukleotidi iz predmetnog pronalaska", "dizajn oligonukleotida" i "gepmer dizajn".
U nekim realizacijama konjugovani ostatak usmjeren na asijaloglikoproteinski receptor sadrži barem jedan ugljenohidratni deo koji veže ASPGr, odabran iz grupe koju čine galaktoza, galaktozamin, N-formil-galaktozamin, N-acetilgalaktosamin, N-propionilgalaktozamin, Nn-butanoil-N-butanoamin izobutanoilgalaktozamin. U nekim realizacijama, asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak je monovalentni, dvovalentni, trivalentni ili četverovalentni (tj. sadrži 1,2, 3 ili 4 terminalna ugljenohidratna dela sposobna da se vežu za asijaloglikoproteinski receptor). Poželjno je da asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak bude dvovalentan, još poželjnije trovalentan. U jednoj poželjnoj realizaciji, asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak sadrži 1 do 3 N-acetilgalaktozamin (GalNAc) dela (koji se takođe nazivaju GalNAc konjugat). U nekim realizacijama oligonukleotidni konjugat sadrži asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak koji je trivalentni N-acetilgalaktozamin (GalNAc) deo. GalNAc konjugati su korišteni sa fosfodiesterskim, metilfosfonatnim i PNA antisense oligonukleotidima (npr. US5,994517 i Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792 and Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 ) i siRNK (npr. WO 2009/126933, WO 2012/089352 & WO 2012/083046) i sa LNA i 2'-MOE modifikovanim nukleozidima WO 2014/076196 WO 2014/207232 i WO 2014/179620.
Da bi se stvorio asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak, ugljenohidratni delovi koji se vežu za ASPGr (poželjno GalNAc) su vezani za molekul grananja kroz C-l ugljenike saharida. Ugljenohidratni delovi koji se vežu na ASPGr poželjno su povezani sa molekulom grananja pomoću spejsera. Poželjni spejser je fleksibilni hidrofilni spejser (US patent 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 str. 1538-1546). Poželjni fleksibilni hidrofilni spejser je PEG spejser. Poželjni PEG spejser je PEG3 spejser (tri jedinice etilena). Molekul grananja može biti bilo koji mali molekul koji dozvoljava vezivanje dva ili tri krajnja ugljenohidratna dela koja vežu ASPGr, a dodatno omogućava vezivanje tačke grananja na oligonukleotid. Primer molekula grananja je di-lizin. Molekula di-lizina sadrži tri aminske grupe preko kojih se mogu vezati tri ugljenohidratna ostatka koja vežu ASPGr, i karboksilno reaktivnau grupu preko koje se di-lizin može vezati za oligonukleotid. Alternativni molekuli grananja mogu biti "doubler" ili "trebler" molekuli, poput onih od Glen Research. U nekim realizacijama, molekul grananja se može odabrati iz grupe koja se sastoji od 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoksitritiloksi)pentilamido]propil-2-[(2-cijanoetil)-(N, N- diizopropil)]fosforamidit (Glen Research Kataloški broj: 10-1920-xx), tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimetoksitritiloksi)propiloksimetil]etil -[(2-cijanoetil)-(N, N-diizopropil)]-fosforamidit (Glen Research Kataloški broj: 10-1922-xx), tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimetoksitritiloksi)propiloksimetil]metilenoksipropil-[(2-cijanoetil)-(N,N-diizopropil)]-fosforamidit i 1-[5-(4,4'-dimetoksi-tritiloksi)pentilamido]-3-[5-fluorenometoksi-karboniloksi-pentilamido]-propil-2-[(2-cijanoetil)-(N, N-diizopropil)]- fosforamidit (Kataloški broj
4
Glen Research: 10-1925-xx). WO2014/179620 i PCT aplikacija br. PCT/EP2015/073331 opisuju stvaranje različitih GalNAc konjugovanih delova. Između molekule grananja i oligonukleotida može se umetnuti jedan ili više linkera. U jednoj požejnoj realizaciji, linker je biocepljivi linker. Linker se može odabrati između povezivača opisanih u odeljku "Linkeri" i pododeljcima ovog odeljka.
Azijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak, posebno GalNAc konjugovani ostatak, može biti vezan za 3'- ili 5'-kraj oligonukleotida, uz korištenje postupaka poznatih u struci. U poželjnim realizacijama asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak povezan je sa 5'-krajem oligonukleotida.
Farmakokinetički modulatori vezani za isporuku siRNK opisani su u WO2012/083046. U nekim realizacijama konjugovani ostatak ugljenih hidrata sadrži farmakokinetički modulator odabran iz grupe koja se sastoji od hidrofobne grupe koja ima 16 ili više atoma ugljenika, hidrofobne grupe koja ima 16-20 atoma ugljenika, palmitoila, heksadek-8-enoila, oleila, (9E, 12E) -oktadeka-9,12dienoila, dioktanoila i C16-C20 acila i holesterola. U jednoj poželjnoj realizaciji, farmakokinetički modulator koji sadrži ugljenohidratni konjugat je konjugat GalNAc.
Poželjni konjugovani delovi ugljenih hidrata sadrže jedan do tri terminalna ugljenohidratna dela koja vežu ASPGr, po mogućnosti N-acetilgalaktozamin deo(delove). U nekim realizacijama ugljenohidratni konjugovani ostatak sadrži tri ugljenohidratna ostatka koja vežu ASPGr, po mogućnosti N-acetilgalaktozamin delove, povezane spejserom za molekul grananja. Spejser molekul može biti dugačak između 8 i 30 atoma. Poželjni ugljenohidratni konjugovani ostatak sastoji se od tri terminalna GalNAc dela povezana preko PEG spejsera sa molekulom grananja di-lizina. Poželjno je da PEG spejser bude 3PEG odstojnik. Pogodni asijaloglikoproteinski receptori koji ciljaju konjugirane delove prikazani su na slici 1. Poželjni asijaloglikoproteinski receptor koji cilja konjugovani ostatak prikazan je na slici 3.
Drugi konjugovani delovi GalNAc mogu obuhvatati, na primer, male peptide na koje su vezani GalNAc delovi, kao što su Tyr-Glu-Glu-(aminoheksil GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3; glikotripeptid koji se veže za asijaloglikoproteinski receptor na hepatocitima, vidi npr. Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); klastere galaktoze na bazi lizina (npr. L3G4; Biessen i dr., Cardovasc. Med., 1999, 214); i klastere galaktoze na bazi holana (npr. motiv prepoznavanja ugljenih hidrata za asijaloglikoproteinski receptor).
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotidni konjugat bira se iz skupine koja se sastoji od sledećeg CPM ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 i 770_2.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotidni konjugat odgovara jedinjenju predstavljenom na slici 4.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotidni konjugat odgovara jedinjenju predstavljenom na slici 5.
U drugoj poželjnoj realizaciji, antisens konjugat oligonukleotida odgovara jedinjenju predstavljenom na slici 6.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotidni konjugat odgovara jedinjenju predstavljenom na slici 7.
Kako se ovde opisuje, antisense oligonukleotidni konjugat odgovara jedinjenju predstavljenom na slici 8.
Linkeri
Biocepljivi linkeri (region B)
Upotreba konjugata često je povezana sa pojačanim farmakokinetičkim ili farmaceutski dinamičkim svojstvima. Međutim, prisustvo konjugovanog dela može ometati aktivnost oligonukleotida prema predviđenom cilju, na primer putem steričke prepreke koja sprečava hibridizaciju ili regrutaciju nukleaze (npr. RNKseH). Upotreba fiziološki labilne veze (biopokretni linker) između oligonukleotida (regiona A ili prvog regiona) i konjugovanog dela (regiona C ili trećeg regiona) omogućava poboljšanje svojstava zbog prisustva konjugovanog dela, istovremeno osiguravajući da kad se nađe u ciljnom tkivu, konjugovana grupa ne sprečava efikasnu aktivnost oligonukleotida.
Do cepanja fiziološki labilne veze dolazi spontano kada molekul koji sadrži labilnu vezu dospe do odgovarajućeg unutar- i/ili vanćelijskog okruženja. Na primer, pH labilna veza može se cepati kada molekul uđe u zakiseljeni endosom. Stoga se pH labilna veza može smatrati endosomskom vezom koja se cepa. Veze koje se mogu cepati enzimima mogu se cepati kada su izložene enzimima poput onih koji su prisutni u endosomu ili lizosomu ili u citoplazmi. Disulfidna veza može se rascepiti kad molekul uđe u reduktivnije okruženje ćelijske citoplazme. Stoga se disulfid može smatrati citoplazmatski cepljivom vezom. Kako se ovde koristi, pH-labilna veza je labilna veza koja se selektivno prekida pod kiselim uslovima (pH<7). Takve veze mogu se nazvati i endosomno labilnim vezama, jer ćelijski endosomi i lizosomi imaju pH manji od 7.
Za biocepljive linkere povezane sa konjugovanim delom za ciljnu isporuku, poželjno je da je brzina cepanja koja se dešava u ciljnom tkivu (na primer mišići, jetra, bubreg ili tumor) veća od one koja se nalazi u krvnom serumu. Prikladne postupke za određivanje nivoa ( %) cepanja u ciljnom tkivu naspram seruma ili cepanja pomoću S1 nukleaze opisane su u odeljku "Materijali i postupci". U nekim realizacijama, biocepljivi linker (koji se naziva i fiziološki labilni linker, ili nukleazno osetljivi linker ili region B), u konjugatu ovog pronalaska, cepa se najmanje oko 20 %, na primer najmanje oko 30 %, na primer najmanje oko 40 %, na primer najmanje oko 50 %, na primer najmanje oko 60 %, na primer najmanje oko 70 %, na primer najmanje oko 75 %, u odnosu na standardni linker.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotidni konjugat sadrži tri regiona: i) prvi region (region A), koji sadrži 10-25 preklopljenih nukleotida komplementarnih sa ciljnom nukleinskom kiselinom; ii) drugi region (region B) koji sadrži biocepljivi linker i iii) treći region (region C) koji sadrži konjugovani ostatak, poput asijaloglikoproteinskog receptora koji cilja konjugovani ostatak, pri čemu je treći region kovalentno povezan sa drugim regionom koji je kovalentno vezan za prvi region.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotidni konjugat sadrži biocepljivi linker (region B) između preklapajuće nukleotidne sekvence (regiona A) i asijaloglikoproteinskog receptora koji cilja konjugovani ostatak (region C).
U nekim realizacijama, biocepljivi linker može biti smešten ili na 5' kraju i/ili na 3'-kraju preklopljenih nukleotida komplementarnih sa ciljnom nukleinskom kiselinom (regionom A). U jednoj poželjnoj realizaciji biocepljivi linker je na 5'-kraju.
U nekim realizacijama, cepivi linker je osetljiv na nukleazu(nukleaze) koja se na primer može eksprimirati u ciljnoj ćeliji. U nekim realizacijama, biocepljivi linker sastoji se od 2 do 5 uzastopnih fosfodiesterskih veza. Linker može biti (npr. 1 - 10 kako je detaljno opisano u definiciji linkera) fosfodiesterski povezani nukleozid kratkog regiona. U nekim realizacijama, nukleozidi u biocepljivom linkeru, regionu B, se (opciono nezavisno) biraju iz grupe koja se sastoji od DNK i RNK ili njihovih modifikacija koje ne ometaju cepanje nukleaze. Modifikacije DNK i RNK nukleozida koje ne ometaju cepanje nukleaza mogu biti nukleobaze koje se ne pojavljuju u prirodi. Određeni nukleozidi sa modifikovanim šećerom mogu takođe omogućiti cepanje nukleaze, poput alfa-L-oksi-LNA. U nekim realizacijama, svi nukleozidi regije B sadrže (opciono nezavisno) ili 2'-OH ribozni šećer (RNK) ili 2'-H šećer - tj. RNK ili DNK. U jednoj poželjnoj realizaciji, najmanje dva uzastopna nukleozida regiona B su DNK ili RNK nukleozidi (na primer, najmanje 3 ili 4 ili 5 uzastopnih DNK ili RNK nukleozida). U jednom još poželjnijem ostvarenju, nukleozidi regiona B su DNK nukleozidi. Poželjno, region B se sastoji od 1 do 5 ili 1 do 4, na primer 2, 3, 4 uzastopna fosfodiestersko vezana DNK nukleozida. U poželjnim realizacijama, region B je tako kratak da ne regrutuje RNKseH. U nekim realizacijama, region B ne sadrži više od 3 ili ne više od 4 uzastopna fosfodiestersko vezana DNK i/ili RNK nukleozida (poput DNK nukleozida).
Tamo gde se region B sastoji od fosfodiesterski povezanih nukleozida, regioni A i B mogu zajedno tvoriti oligonukleotid koji je vezan za region C. U tom kontekstu region A se može razlikovati od regiona B po tome što region A počinje sa najmanje jednom, poželjno barem dva modifikovana nukleozida sa povećanim afinitetom vezanja za ciljnu nukleinsku kiselinu (npr. LNA ili nukleozidi sa 2' supstituisanim šećernim delom), a region A može samostalno da modulira ekspresiju ciljne nukleinske kiseline u odgovarajućoj ćelijskoj liniji. Nadalje, ako region A sadrži nukleozide DNK ili RNK, oni su povezani internukleozidnom vezom rezistentnom na nukleazu, poput fosforotioatne ili boranofosfatne veze. Sa druge strane, region B sadrži fofodiesterske veze između nukleozida DNK ili RNK. U nekim realizacijama, region B nije komplementaran sa ili sadrži najmanje 50 % neusklađenih nukleotida u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu.
U nekim realizacijama, region B nije komplementaran sa sekvencom ciljne nukleinske kiseline ili sa preklapajućim nukleotidima koji su komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom u regionu A.
U nekim realizacijama, region B je komplementaran sa sekvencom ciljne nukleinske kiseline. U tom pogledu regioni A i B zajedno mogu činiti jednu preklapajuću sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom.
U nekim aspektima ovog pronalaska, internukleozidna veza između prvog regiona (regiona A) i drugog regiona (regiona B) može se smatrati delom druge regiona.
U nekim realizacijama, sekvenca baza u regionu B je odabrana da obezbedi optimalno mesto cepanja endonukleaze, na osnovu prevladavajućih enzima cepanja endonukleaze prisutnih u ciljnom tkivu ili ćelijskom ili podćelijskom odeljku. U tom pogledu, izoliranjem ekstrakata ćelija iz ciljanih tkiva i neciljanih tkiva, sekvence cepanja endonukleaze za upotrebu u regionu B mogu se odabrati na osnovu preferencijalne aktivnosti cepanja u željenoj ciljnoj ćeliji (npr. jetre/hepatocita) u odnosu na neciljanu ćeliju (npr. bubrega). U tom pogledu, jačina jedinjenja za ciljano nishodnu regulaciju može se optimizovati za željeno tkivo/ćeliju.
U nekim realizacijama, region B sadrži dinukleotid sekvence AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC ili GG, pri čemu C može biti 5-metilcitozin, i/ili se T može zameniti sa U. Poželjno je da internukleozidna veza bude fosfodiesterska veza. U nekim realizacijama, region B sadrži trinukleotid sekvence AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC i GGG pri čemu C može biti 5-metilcitozin i/ili se T može zameniti sa U. Poželjno je da internukleozidne veze budu fosfodiesterske veze. U nekim realizacijama, region B sadrži trinukleotid sekvence AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCG CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX i GGGX, pri čemu X može da se bira iz grupe koja se sastoji od A, T, U, G, C i njihovih analoga, pri čemu C može biti 5-metilcitozin i/ili se T može zameniti sa U. Poželjno je da internukleozidne veze budu fosfodiesterske veze. Biće prepoznatljivo da u referiranju na nukleobaze A, T, U, G, C (koje se javljaju u prirodi), one mogu biti zamenjene nukleobaznim analogima koji funkcionišu kao ekvivalentni za prirodne nukleobaze (npr. bazni par sa komplementarnim nukleozidom).
Ostali linkeri (region Y)
Linker može imati najmanje dve funkcije, jednu za vezivanje za oligonukleotid i drugu za vezivanje za konjugovani ostatak. Primeri funkcije linkera mogu biti elektrofilna funkcija za reakciju sanukleofilnim grupama na oligonukleotidu ili konjugovanom delu, ili nukleofilna funkcija za reakciju sa elektrofilnim grupama. U nekim realizacijama, funkcije linkera obuhvataju amino, hidroksil, karboksilnu kiselinu, tiol, fosforamidat, fosforotioat, fosfat, fosfit, nezasićenja (npr. dvostruke ili trostruke veze). Neki primeri linkera (regiona Y) obuhvataju 8-amino-3,6-dioksaoktansku kiselinu (ADO), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), 6-aminoheksansku kiselinu (AHEX ili AHA), 6 -aminoheksiloksi, 4-aminomaslenu kiselinu, 4-aminocikloheksilkarboksilnu kiselinu, sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-l-karboksi-(6-amido-kaproat)(LCSMCC), sukcinimidil m-maleimido-benzoilat (MBS), sukcinimidid-maleimido-kaproilat (EMCS), sukcinimidil 6-(beta -maleimido-propionamido) heksanoat (SMPH), sukcinimidil N-(amaleimido acetat) (AMAS), sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirat (SMPB), beta -alanin (beta -ALA), fenilglicin (PHG), 4-aminocikloheksansku kiselinu (ACHC), beta-(ciklopropil) alanin (beta -CYPR), amino dodekansku kiselinu (ADC), alilen dioli, polietilen glikoli, aminokiseline. U nekim realizacijama linker (region Y) je amino alkil, kao što je C2-C36 aminoalkilna grupa, uključujući, na primer C6 do C12 amino alkil grupe. U jednoj poželjnoj realizaciji, linker (region Y) je C6 aminoalkilna grupa. Aminoalkilna grupa može da se doda oligonukleotidu (regionu A ili regionu A-B) u sklopu standardne sinteze oligonukleotida, na primer upotrebom (npr. zaštićenog) aminoalkilnog fosforamidita. Vezna grupa između aminoalkila i oligonukleotida može, na primer, biti fosforotioat ili fosfodiester, ili jedna od ostalih nukleozidnih grupa koje se ovde navode. Aminoalkilna grupa je kovalentno vezana za 5' ili 3'-kraj oligonukleotida. Komercijalno dostupni aminoalkilni linkeri su na primer 3'-amino-modifikator reagens za povezivanje na 3'-kraju oligonukleotida, a za povezivanje na 5'-kraju oligonukleotida, dostupan je 5'-amino-modifikator C6. Ovi reagensi su dostupni kod kompanije Glen Research Corporation (Sterling, VA). Ova ili slična jedinjenja koristili su Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 za povezivanje fluoresceina sa 5'-krajem oligonukleotida. Širok spektar dodatnih linker grupa poznati je u struci i mogu biti korisni u vezivanju konjugovanih delova na oligonukleotide. Pregled mnogih korisnih linker grupa može se naći, na primer, kod Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, str. 303-350. Ostala jedinjenja, poput akridina, vezana su za 3'-terminalnu fosfatnu grupu oligonukleotida preko polimetilenske veze (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81,3297). Bilo koja od gore navedenih grupa može da se koristi kao pojedinačni linker (region Y) ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih linkera (regionaY-Y' ili region Y-B ili B-Y).
Linkeri i njihova upotreba u pripremi konjugata oligonukleotida daju se u okviru struke, kao na primer u WO96/11205 i WO98/52614 i US Pat. br. 4.948.882; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,580,731; 5,486,603; 5,608,046; 4,587,044; 4,667,025; 5,254,469; 5,245,022; 5,112,963; 5,391,723; 5,510475; 5,512,667; 5,574,142; 5,684,142; 5,770,716; 6,096,875; 6.335.432; i 6.335.437, WO2012/083046.
Postupak proizvodnje
Ovde su opisani postupci za proizvodnju oligonukleotida iz predmetnog pronalaska koji obuhvataju izazivanje reakcije nukleotidnih jedinica i stvaranja kovalentno povezanih preklapajućih nukleotidnih jedinica sadržanih u oligonukleotidu. Poželjno, postupak koristi fosforamiditnu hemiju (videti na primer et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, str.
287-313). Kako se ovde opisuje, postupak dodatno obuhvaća izazivanje reakcije preklapajuće nukleotidne sekvence sa konjugovanim delom (ligandom). Ovde se opisuje postupak za proizvodnju preparata iz ovog pronalaska, koji se sastoji od mešanja oligonukleotida ili konjugovanog oligonukleotida iz pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim razređivačem, rastvaračem, nosačem, solju i/ili adjuvansom.
Farmaceutski preparat
Kako se ovde opisuje, pronalazak osigurava farmaceutske preparate koji sadrže bilo koji od gore pomenutih oligonukleotida i/ili oligonukleotidnih konjugata i farmaceutski prihvatljiv razređivač, rastvarač, nosač, so i/ili adjuvans. U farmaceutski prihvatljiv razređivač spada fiziološki rastvor puferiran sa fosfatom (PBS), a farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju soli natrijuma i kalijuma. U nekim realizacijama, farmaceutski prihvatljiv razređivač je sterilni fiziološkia rastvor puferiran sa fosfatom. U nekim realizacijama, oligonukleotid se koristi u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču u koncentraciji od 50 -300 µM rastvora.
Pogodne formulacije za upotrebu u ovom pronalasku mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. izd., 1985. Za kratki pregled postupaka za isporuku lekova, videti npr. Langer (Science 249:1527-1533, 1990). WO2007/031091 daje dodatne pogodne i poželjne primere farmaceutski prihvatljivih razređivača, nosača i adjuvanasa. Odgovarajuće doze, formulacije, načini primene, preparati, oblici doziranja, kombinacije sa drugim terapijskim agensima, formulacije za prolekove takođe su date u WO2007/031091.
Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati iz ovog pronalaska mogu se mešati sa farmaceutski prihvatljivim aktivnim ili inertnim supstancama za pripremu farmaceutskih preparata ili formulacija. Sastavi i metodi za formulaciju farmaceutskih preparata ovise o brojnim kriterijima, uključujući način primene, opseg bolesti ili dozu koju treba primeniti.
Ovi preparati se mogu sterilizovati uobičajenim tehnikama sterilizacije ili mogu biti sterilno filtrirani. Dobijeni vodeni rastvori mogu se pakovati za upotrebu takvi kakvi jesu, ili liofilizovati, pri čemu se liofilizovani preparat kombinuje sa sterilnim vodenim nosačem pre primene.
PH preparata tipično se kreće između 3 i 11, poželjnije između 5 i 9 ili između 6 i 8, a najpoželjnije između 7 i 8, na primer 7 do 7,5. Dobijeni preparati u čvrstom obliku mogu se pakovati u više jedinica za jednu dozu, od kojih svaka sadrži fiksnu količinu gore pomenutog agensa ili agenasa, na primer u zatvoreno pakovanju u vidu tableta ili kapsula. Preparat u čvrstom obliku takođe se može pakovati u spremnik za fleksibilnu količinu, kao što je cev koja se može stisnuti, namenjena za lokalno primenu u obliku kreme ili masti.
U nekim realizacijama, oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat iz ovog pronalaska je prolek. Konkretno, s obzirom na oligonukleotidne konjugate, konjugovani ostatak se odcepljuje od oligonukleotida nakon što se prolek isporuči na mesto delovanja, npr. u ciljnu ćeliju.
Aplikacije
Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati predmetnog pronalaska mogu da se
1
koriste kao istraživački reagensi, na primer, za dijagnostiku, terapiju i profilaksu.
U istraživanju se takvi oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati mogu da koriste za specifičnu modulaciju sinteze proteina PD-L1 u ćelijama (npr. in vitro ćelijske kulture) i kod eksperimentalnih životinja, čime se olakšava funkcionalna analiza cilja ili procena koliko je cilj kao takav upotrebljiv za terapijsku intervenciju. Najčešće se ciljna modulacija postiže razgradnjom ili inhibicijom mRNK koja proizvodi protein, čime se sprečava stvaranje proteina, ili razgradnjom ili inhibicijom modulatora gena ili mRNK koja proizvodi protein.
Ako se oligonukleotid iz pronalaska koristi u istraživanju ili dijagnostici, ciljna nukleinska kiselina može da bude cDNK ili sintetička nukleinska kiselina izvedena iz DNK ili RNK.
Ovde je opisan in vivo ili in vitro postupak za modulaciju ekspresije PD-L1 u ciljnoj ćeliji koja eksprimira PD-L1, a navedeni postupak podrazumeva primenu oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata iz pronalaska u delotvornoj količini za navedenu ćeliju.
Kako se ovde opisuje, ciljna ćelija je ćelija sisara, posebno ćelija čoveka. Ciljna ćelija može biti in vitro ćelijska kultura ili in vivo ćelija koja čini deo tkiva sisara. Kako se ovde opisuje, ciljna ćelija je prisutna u jetri. Ciljna ćelija jetre može da bude odabrana od parenhimskih ćelija (npr. Hepatocita) i neparenhimskih ćelija kao što su Kupffer ćelije, LSEC-ovi, zvezdaste ćelije (ili Ito ćelije), holangiociti i leukociti povezani sa jetrom (uključujući T ćelije i NK ćelije). Kako se ovde opisuje, ciljna ćelija je ćelija koja prezentuje antigen. Antigen-prezentujuće ćelije na svojoj površini prikazuju strane antigene složene sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) klase I ili klase II. U nekim realizacijama antigen prezentujuća ćelija eksprimira MHC klase II (tj. profesionalne ćelije koje prezentuju antigen, poput dendritičnih ćelija, makrofaga i B ćelija).
U dijagnostici oligonukleotidi mogu da se koriste za otkrivanje i kvantifikaciju ekspresije PD-L1 u ćelijama i tkivima severnim blotiranjem, hibridizacijom na in situ ili sličnim tehnikama.
U terapeutske svrhe, oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati iz ovog pronalaska ili njihovi farmaceutski preparati mogu se davati životinji ili čoveku za koje se sumnja da imaju bolest ili poremećaj, koji se može ublažiti ili lečiti smanjenjem ekspresije PD-L1, posebno smanjenjem ekspresije PD-L1 u ciljnim ćelijama jetre.
Ovde su opisani postupci za lečenje ili prevenciju bolesti, koji podrazumevaju primenu terapeutski ili profilaktički delotvorne količine oligonukleotida, oligonukleotidnog konjugata ili farmaceutskog preparata iz pronalaska na pojedincu koji ima bolest ili joj je sklon.
2
Pronalazak se takođe odnosi na oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski preparat iz prema ovom pronalasku koji se upotrebljavaju kao lek.
Oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski preparat prema ovom pronalasku se po pravilu daju u delotvornoj količini.
Ovde je opisana upotreba oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata ili farmaceutskog preparata prema pronalasku kako je opisan, za proizvodnju leka za lečenje bolesti ili poremećaja kako je ovde objavljeno. Kako se ovde opisuje, u bolest spadaju a) virusne infekcije jetre kao što su HBV, HCV i HDV; b) parazitske infekcije poput malarije, toksoplazmoze, lajšmanijaze i tripanosomijaze i c) karcinom jetre ili metastaze na jetri.
Ovde su opisani oligonukleotidi, oligonukleotidni konjugati ili farmaceutski preparati za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja u koje spadaju virusne ili parazitske infekcije. Kako se ovde opisuje, u bolest spadaju a) virusne infekcije jetre kao što su HBV, HCV i HDV; b) parazitske infekcije poput malarije, toksoplazmoze, lajšmanijaze i tripanosomijaze i c) karcinom jetre ili metastaze na jetri.
Bolest ili poremećaj, kako se ovde navode, povezani su sa iscrpljenim imunitetom. Konkretno, bolest ili poremećaj su povezani sa iscrpljenim odgovorom T ćelija specifičnih za virus. Kako se ovde opisuje, bolest ili poremećaj mogu se ublažiti ili lečiti smanjenjem ekspresije PD-L1.
Postupci iz ovog pronalaska se poželjno koriste za lečenje ili profilaksu bolesti povezanih sa iscrpljenim imunitetom.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski preparati prema ovom pronalasku koriste se u obnavljanju imunološkog odgovora protiv karcinoma jetre ili metastaza na jetri.
Kako se ovde opisuje, oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski preparati prema ovom pronalasku koriste se za obnavljanje imunološkog odgovora na patogen. Kako se ovde opisuje, patogen se može naći u jetri. Patogeni mogu biti virus ili parazit, posebno oni koji su ovde opisani. U jednoj poželjnoj realiziaciji, patogen je HBV.
Ovde je opisana upotreba oligonukleotida, oligonukleotidnog konjugata ili farmaceutskog preparata kako se ovde definišu, za proizvodnju leka za obnavljanje imuniteta protiv virusne ili parazitske infekcije koji su ovde navedeni.
Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati ili farmaceutski preparati iz ovog pronalaska mogu se koristiti u lečenju virusnih infekcija, posebno virusnih infekcija u jetri gde je zahvaćen put PD-1 (videti, na primer, Kapoor and Kottilil 2014 Future Virol vol.9 str.
565-585 i Salem and El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 str. 2449-2458). U virusne infekcije jetre spadaju infekcije u grupi koju čine virusi hepatitisa, posebno HBV, HCV i HDV, posebno hronični oblici ovih infekcija. U jednoj realizaciji, oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati ili farmaceutski preparati ovog pronalaska koriste se za lečenje HBV, posebno hroničnog HBV. Pokazatelji hroničnih HBV infekcija su visok nivo virusnog opterećenja (HBV DNK) i još veći nivo praznih čestica HBsAg (> 100 puta viši od viriona) u cirkulaciji.
Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati iz predmetnog pronalaska mogu se takođe koristiti za lečenje virusnih infekcija jetre koje se javljaju kao koinfekcije kod HIV-a. Ostale virusne infekcije koje se mogu lečiti oligonukleotidima ili oligonukleotidnim konjugatima ili farmaceutskim preparatima ovog pronalaska su lcmv (virus limfocitnog horiomeningitisa) i HIV kao mono infekcija, HSV-1 i -2 i drugi herpesvirusi. Ovi virusi nisu hepatotrofni, ali mogu biti osetljivi na nishodnu regulaciju PDL1.
U nekim realizacijama, obnavljanje imuniteta ili imunološkog odgovora podrazumeva poboljšanje odgovora T-ćelija i/ili NK ćelija, i/ili ublažavanje iscrpljenosti T-ćelija, posebno za obnavljanje odgovora T-ćelija specifičnih za HBV, odgovora T-ćelija specifičnih za HCV i ili odgovora T-ćelija specifičnih za HDV. Poboljšanje odgovora T ćelija može se, na primer, proceniti kao porast T ćelija u jetri, posebno kao porast CD8+ i/ili CD4+ T ćelija u odnosu na kontrolu (npr. nivo pre tretmana ili nivo kod pojedinca koji se tretira placebom). U dodatnoj realizaciji, obnavljaju se ili povećavaju virusno specifične CD8+ T ćelije ili u odnosu na kontrolu), konkretno se obnavljaju ili povećavaju HBV specifične CD8+ T ćelije, ili HCV specifične CD8+ T ćelije, ili HDV specifične CD8+ T ćelije u odnosu na kontrolu. U jednoj poželjnoj realizaciji, CD8+ T ćelije specifične za HBV površinski antigen (HBsAg), i/ili CD8+ T ćelije specifične za HBV e antigen (HBeAg), i/ili CD8+ T ćelije specifične za HBV jedreni antigen (HBcAg) povećane su u ispitanika lečenih oligonukleotidom, oligonukleotidnim konjugatom ili farmaceutskim preparatom iz ovog pronalaska u poređenju sa kontrolom. Poželjno je da CD8+ T ćelije specifične za HBV antigen proizvode jedan ili više citokina, poput interferona-gama (IFN-γ) ili faktora nekroze tumora alfa (TNF-α). Porast gore opisanih CD8+ T ćelija posebno se primećuje u jetri. Ovde opisano povećanje trebalo bi biti statistički značajno u odnosu na kontrolu. Poželjno, porast iznosi najmanje 20 %, na primer 25 %, na primere 50 %, na primer 75 % u odnosu na kontrolu. U još jednoj realizaciji, ćelije prirodne ubice (NK) i/ili T ćelije prirodne ubice (NKT) aktiviraju se oligonukleotidima ili oligonukleotidnim konjugatima iz predmetnog pronalaska.
Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati ili farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu se koristiti u lečenju parazitskih infekcija, posebno parazitskih infekcija gde
4
je zahvaćen put PD-1 (videti, na primer, Bhadra et al.2012 J Infect Dis vol 206 str. 125-134; Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol.108 str.9196-9201; Esch et al. J Immunol vol 191 str. 5542-5550; Freeman and Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 str. 113-115; Gutierrez et al.2011 Infect Immun Vol 79 str.1873-1881; Joshi et al.2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431; Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 str. 58-64; Wykes et al. 2014 Front Microbiol Vol 5 str. 249). U parazitske infekcije spadaju one iz grupe koju čine malarija, toksoplazmoza, lajšmanijaza i tripanosomijaza. Infekciju malarije izazivaju protozoe iz roda Plasmodium, posebno vrste P. vivax, P. malariae i P. falciparum. Toksoplazmoza je parazitska bolest koju izaziva Toxoplasma gondii. Lajšmanijaza je bolest koju izazivaju protozojski paraziti iz roda Leishmania. Tripanosomijazu izazivaju protozoe iz roda Trypanosoma. Chaga bolest je tropska bolest koju izaziva vrsta Trypanosoma cruzi, a bolest spavanja izaziva vrsta Trypanosoma brucei.
U nekim realizacijama obnavljanje imuniteta podrazumeva obnavljanje specifičnog odgovora T ćelija i NK ćelija na parazita, posebno specifičnog odgovora T-ćelija na Plasmodium, specifičnog odgovora T-ćelija i NK ćelija na Toxoplazma gondii, specifičnog odgovora T ćelija i NK ćelija na Leishmania, specifični odgovor T ćelija i NK ćelija na Trypanosoma Cruzi, ili specifični odgovor T ćelija i NK ćelija na Trypanosoma brucei. U još jednoj realizaciji, obnavlja se specifični odgovor CD8+ T ćelija i NK ćelija na parazite.
Primena leka
Oligonukleotidi ili farmaceutski preparati iz ovog pronalaska mogu se davati lokalno (na primer na kožu, inhalacijski, oftalmološki ili u oči) ili enteralno (na primer oralno ili kroz gastrointestinalni trakt) ili parenteralno (na primer intravenski, potkožno, intra-mišićno, intracerebralno, intracerebroventrikularno ili intratekalno).
U jednoj poželjnoj realizaciji, oligonukleotid ili farmaceutski preparat iz ovog pronalaska daju se na parenteralni način, uključujući intravensku, intraarterijsku, potkožnu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju, intratekalnu ili intrakranijalnu, npr. intracerebralnu ili intraventrikularnu, intravitrealnu primenu. U jednoj realizaciji, aktivni oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat daju se intravenozno. U jednoj drugoj realizaciji, aktivni oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat daju se supkutano.
U nekim realizacijama, oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski preparat iz pronalaska daju se u dozi od 0,1-15 mg/kg, npr. od 0,1-10 mg/kg, npr. od 0,2-10 mg/kg, npr. od 0,25-10 mg/kg, npr. od 0,1-5 mg/kg, npr. od 0,2-5 mg/kg, npr. od 0,25-5 mg/kg. Primena leka može biti jednom nedeljno, svake druge nedelje, svake treće nedelje ili čak jednom mesečno.
Kombinovane terapije
U nekim realizacijama, oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski preparat iz pronalaska su namenjeni za upotrebu u kombinovanom lečenju sa drugim terapijskim agensom. Terapijski agens može, na primer, biti standardna terapija za gore opisane bolesti ili poremećaje.
Za lečenje hroničnih HBV infekcija preporučuje se kombinacija antivirusnih lekova i modulatora imunološkog sistema kao standardne terapije. Na primer, antivirusni lekovi koji deluju protiv HBV su analozi nukleotida ili nukleozida. Postoji pet nukleozidnih ili nukleotidnih analoga licenciranih za terapiju HBV-a, i to lamivudin (Epivir), adefovir (Hepsera), tenofovir (Viread), telbivudin (Tyzeka), entekavir (Baraclude), koji su efikasni u suzbijanju replikacije virusa (HBV DNK) ali nemaju uticaj na nivo HBsAg. U ostale antivirusne lekove spadaju ribavirin i terapija HBV antitelima (monoklonalnim ili poliklonskim). Modulatori imunološkog sistema mogu, na primer, biti interferon alfa-2a i PEGilirani interferon alfa-2a (Pegasys), ili TLR7 agonisti (npr. GS-9620), ili terapijske vakcine. Tretman IFN-α pokazuje samo vrlo skromno delovanje na smanjenje virusnog opterećenja, ali dovodi do smanjenja broja HBsAg, iako vrlo neefikasno (<10 % nakon 48-nedeljne terapije).
Oligonukleotidni ili oligonukleotidni konjugati iz predmetnog pronalaska mogu se takođe kombinovati sa drugim antivirusnim lekovima efikasnim protiv HBV, kao što su antisense oligonukleotidi opisani u WO2012/145697 i WO2014/179629 ili molekule siRNK opisane u WO2005/014806, WO2012/024170, WO2012/2055362, WO2013/003520 i WO2013/159109.
Kada se oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati iz ovog pronalaska daju u kombinaciji sa drugim agensima, pojedincu se mogu davati jedan za drugim ili istovremeno. Alternativno, farmaceutski preparati iz predmetnog pronalaska mogu se sastojati od kombinacije oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata iz predmetnog pronalaska u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim pomoćnim sredstvom, kako je ovde opisano, i drugog terapijskog ili profilaktičkog agensa poznatog u struci.
PRIMERI
Materijali i postupci
Sekvence motiva i oligonukleotidna jedinjenja
Tabela 5: lista sekvenci motiva oligonukleotida (naznačenih kao SEQ ID NO) koje ciljaju transkript humanog PD-L1 (SEQ ID NO: 1), njihovi dizajni, kao i specifična antisense oligonukleotidna jedinjenja (naznačena kao CMP ID NO), dizajnirana na osnovu sekvence motiva.
1
2
4
1
2
4
1
2
4
Sekvence motiva predstavljaju preklapajuću sekvencu nukleobaza prisutnu u oligonukleotidu.
Dizajni se odnose na gepmer dizajn, F-G-F', gde svaki broj predstavlja broj uzastopnih modifikovanih nukleozida, npr. 2' modifikovana nukleozida (prvi broj = 5' bok), nakon čega sledi broj DNK nukleozida (drugi broj = region razmaka), nakon čega sedi broj modifikovanih nukleozida, npr. 2' modifikovana nukleozida (treći broj = 3' bok), kojima opciono prethode ili slede dodatni ponovljeni regioni DNK i LNA, koji nisu obavezno deo preklapajuće sekvence koja je komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
Oligonukleotidna jedinjenja predstavljaju specifične dizajne sekvence motiva. Velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNA nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, svi LNA C su 5-metil citozin, sve internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze.
Tabela 6: Oligonukleotidi koji ciljaju mišji PD-L1 transkript (SEQ ID NO: 4), njihovi dizajni, kao i specifična oligonukleotidna jedinjenja (naznačena kao CMP ID NO), dizajnirana na osnovu sekvence motiva.
Sekvence motiva predstavljaju preklapajuću sekvencu nukleobaza prisutnu u oligonukleotidu.
Dizajni se odnose na gepmer dizajn, F-G-F', gde svaki broj predstavlja broj uzastopnih modifikovanih nukleozida, npr. 2' modifikovana nukleozida (prvi broj = 5' bok), nakon čega sledi broj DNK nukleozida (drugi broj = region razmaka), nakon čega sledi broj modifikovanih nukleozida, npr. 2' modifikovana nukleozida (treći broj = 3' bok), kojima opciono prethode ili slede dodatni ponovljeni regioni DNK i LNA, koji nisu obavezno deo preklapajuće sekvence koja je komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
Oligonukleotidna jedinjenja predstavljaju specifične dizajne sekvence motiva. Velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNA nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, svi LNA C su 5-metil citozin, sve internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze.
Tabela 7: Oligonukleotidne sekvence motiva i antisense jedinjenja sa 5' ca biocepljivim linkerom.
Velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNA nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, svi LNA C su 5-metil citozin, indeks o predstavlja fosfodiestersku internukleozidnu vezu, i ako nije drugačije naznačeno, druge internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze.
Tabela 8: GalNAc konjugovana antisense oligonukleotidna jedinjenja.
GN2 predstavlja trovalentni klaster GalNAc prikazan na slici 3, C6 predstavlja aminoalkilnu grupu sa 6 ugljenika, velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNA nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, svi LNA C su 5-metil citozin, indeks o predstavlja fosfodiestersku nukleozidnu vezu, i ako nije drugačije naznačeno, internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze. Hemijski crteži koji predstavljaju neke od molekula prikazani su na slikama 4 do 8.
Mišji modeli AAV/HBV
Pasterov model:
HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgeni H-2 klase l-/klase ll-nokaut miševi (ovde se nazivaju HLA-A2/DR1) stvoreni su i uzgojeni u Institutu Pasteur. Ovi miševi predstavljaju in vivo eksperimentalni model za proučavanje imunološke funkcije čoveka bez ikakvog ometanja mišjeg MHC odgovora (Pajot et al., 2004 Eur J Immunol.34(11):3060-9.
U ovim studijama korišten je adeno-povezani virusni vektor (AAV), AAV serotip 2/8 koji nosi replikacijski kompetentni HBV DNK genom. AAV-HBV vektor (serija GVPN # 6163) razređen je u sterilnom fiziološkom rastvoru puferiranom sa fosfatom (PBS) da bi se postigao titar od 5 x 10<11>vg/ml. Miševima je intravenozno (iv) injektirano 100 µL ovog razblaženog rastvora (doza/miš: 5 x 10<10>vg) u repnu venu. Kompletne virusne čestice koje sadrže HBV DNK otkrivene su u krvi miševa koji su nosili HBV. HBcAg je otkriven do jedne godine u jetri, zajedno sa HBV cirkulišućim proteinima HBeAg i HBsAg u krvi. U svih miševa transdukovanih sa AAV2/8-HBV, u serumu su perzistirali HBsAg, HBeAg i HBV DNK najmanje godinu dana (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).
Šangajski model:
U ovom modelu, miševi zaraženi rekombinantnim adeno-povezanim virusom (AAV) koji nose HBV genom (AAV/HBV) održavaju stabilnu viremiju i antigenimiju duže od 30 nedelja (Dan Yang, et al.2014 Cellular & Molecular Immunology 11,71-78).
Mužjaci miševa C57BL/6 (stari 4-6 nedelja), bez specifičnih patogena, kupljeni su od kompanije SLAC (Šangajski laboratorijski centar za životinje Kineske akademije nauka) i smešteni u objektu za životinje u pojedinačnim prozračenim kavezima. Poštovane su smernice za negu i upotrebu životinja kako je naznačeno kod WuXi IACUC (Institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja, WUXI IACUC broj protokola R20131126-Miš). Miševima je omogućena aklimatizacija u novo okruženje tokom 3 dana i grupisani su prema eksperimentalnom dizajnu.
Rekombinantni AAV-HBV razređen je u PBS, 200 µL po injekciji. Ovaj rekombinantni virus nosi 1,3 kopije HBV genoma (genotip D, serotip ayw).
Na dan 0, svim miševima je ubrizgano kroz repnu venu 200 µL AAV-HBV. Na dan 6, 13 i 20 nakon injekcije AAV, svim miševima je uzeta submandibularna krv (0,1 ml krvi/miš) za prikupljanje seruma. Na dan 22 nakon injekcije, miševi sa stabilnom viremijom bili su spremni za lečenje oligonukleotidom. Oligonukleotidi mogu biti nekonjugovani ili konjugovani sa GalNAc.
DNK vakcina
DNK plazmida nije sadržavala endotoksine i proizvela ih je kompanija Plasmid-Factory (Nemačka). pCMV-S2.S ayw kodira preS2 i S domene antigena HBsAg (genotip D), a njegovu ekspresiju kontroliše citomegalovirusni neposredni rani genski promotor (Michel et al. 1995 Proc Natl Acad Sci USA92:5307-5311). pCMV-HBc kodira HBV kapsidu koja nosi jedreni antigen hepatitisa (HBc) Ag (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).
Lečenje DNK vakcinom provedeno je kako je ovde opisano. Pet dana pre vakcinisanja miševima je u mišić ubrizgan kardiotoksin (CaTx, Latoxan refL81-02, 50 µl/mišić). CaTx depolarizuje mišićna vlakna da bi indukovao ćelijsku razgradnju, 5 dana nakon injekcije pojavljuju se nova mišićna vlakna koja će primiti DNK vakcinu radi veće efikasnosti za transfekciju. PCMV-S2.S ayw i pCMVCore u količini od 1 mg/ml pomešani su u jednakoj količini i svaki miš je dobio ukupno 100 µg u dvostranoj intramuskularnoj injekciji u prednje mišiće tibije tretireane kardiotoksinom, kao što je prethodno opisano u Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci USA92:5307-5311, pod anestezijom (100 µL12,5 mg/ml ketamina, 1,25 mg/ml ksilazina).
Anti-PD-L1 antitelo
Ovo je mišji anti-PD-L1 IgG1 klon antitela 6E11, interno proizveden u Genetechu. To je surogatno antitelo koje unakrsno blokira atezolizumab i ima sličnu in vitro aktivnost blokiranja atezolizumaba, proizvedeno interno u Roche-u. Antitela su davana intraperitonealnom (ip) injekcijom u dozi od 12,5 µg/g.
Sinteza oligonukleotida
Sinteza oligonukleotida je opšte poznata u struci. U nastavku se daje protokol koji se može primenjivati. Moguće je da su oligonukleotidi iz predmetnog pronalaska proizvedeni uz pomoć neznatno različitih postupaka u pogledu aparature, nosača i korištenih koncentracija.
Oligonukleotidi se sintetizuju na uridinskim univerzalnim nosačima uz pomoć fosforamiditnog pristupa na Oligomaker 48 sintetizatoru na skali od 1 µmol. Na kraju sinteze, oligonukleotidi se odvajaju od čvrstog nosača pomoću vodenog amonijaka tokom 5-16 sati na 60 °C. Oligonukleotidi se pročišćavaju pomoću HPLC reverzne faze (RP-HPLC) ili ekstrakcijom u čvrstoj fazi, i karakterišu se pomoću UPLC, a molekularna masa se dodatno potvrđuje pomoću ESI-MS.
Elongacija oligonukleotida:
Kuplovanje β-cijanoetil-fosforamidita (DNK-A (Bz), DNK-G (ibu), DNK-C (Bz), DNK-T, LNA-5-metil-C (Bz), LNA-A (Bz), LNA-G (dmf), LNA-T ili amino-C6 linker) izvodi se pomoću rastvora 0,1 M5'-O-DMT-zaštićenog amidita u acetonitrilu i DCI (4,5-dicijanoimidazol) u acetonitrilu (0,25 M) kao aktivatoru. Za završni ciklus može da se koristi fosforamidit sa željenim modifikacijama, npr. C6 linkerom za vezivanje konjugovane grupe ili sa samom konjugovanom grupom. Tiolacija za uvođenje fosfortioatnih veza vrši se
1
upotrebom ksantan hidrida (0,01 M u acetonitrilu/piridinu 9:1). Fosfordiesterske veze mogu da se uvedu pomoću 0,02 M joda u THF/piridinu/vodi 7:2:1. Ostali reagensi su oni koji se inače koriste za sintezu oligonukleotida.
Za konjugaciju sinteze nakon čvrste faze, komercijalno dostupan C6 amino linker fosforamidit može se koristiti u poslednjem ciklusu sinteze čvrste faze, a nakon uklanjanja zaštite i odvajanja od čvrstog nosača izoluje se aminolinkovani oligonukleotid. Konjugati se uvode aktiviranjem funkcionalne grupe pomoću standardnih postupaka sinteze.
Alternativno, konjugovani ostatak može da se doda oligonukleotidu dok je još uvek na čvrstom nosaču upotrebom fosforamidita GalNAc- ili GalNAc-klastera kako je opisano u PCT/EP2015/073331 ili u EP prijavi BR.15194811.4.
Pročišćavanje uz pomoć RP-HPLC:
Sirova jedinjenja se pročišćavaju preparativnom RP-HPLC na koloni Phenomenex Jupiter C1810µ 150x10 mm. 0,1 M amonijum acetata pH8 i acetonitrila koriste se kao puferi pri brzini protoka od 5 ml/min. Sakupljene frakcije se liofilizuju i tako daju pročišćeno jedinjenje tipično u obliku bele čvrste supstance.
Skraćenice:
DCI: 4,5-dicijanoimidazol
DCM: Dihlormetan
DMF: Dimetilformamid
DMT: 4,4'-dimetoksitritil
THF: Tetrahidrofuran
Bz: Benzoil
Ibu: Izobutiril
RP-HPLC: Tečna hromatografija visokih performansi na reverznim fazama
Tmanaliza
Ciljni dupleksi oligonukleotida i RNK (fosfatno vezani, PO) razblažuju se na 3 mM u 500 ml vode bez RNaze i pomešaju sa 500 ml 2x Tmpufera (200 mM NaCI, 0,2 mM EDTA, 20 mM nafosfata, pH7,0). Rastvor se zagreva na 95 °C tokom 3 min, a zatim pusti da se hladi na sobnoj temperaturi 30 min. Temperature topljenja dupleksa (Tm) meri se na Lambda 40 UV/VIS spektrofotometru opremljenom Peltierovim programatorom temperature PTP6 pomoću PE Templab softvera (Perkin Elmer). Temperatura se povećava sa 20 °C na 95 °C, a zatim hladi na 25 °C, uz beleženje apsorpcije na 260 nm. Prvi derivat i lokalni maksimumi topljenja i hlađenja koriste se za procenu Tmdupleksa.
Analiza cepanja in vitro linkera specifičnog za tkivo
1 1
Oligonukleotidi označeni FAM-om sa biocepljivim linkerom koji se testira (npr. DNK fosfodiesterski linker (PO linker)) podvrgavaju se in vitro cepanju pomoću homogenata relevantnih tkiva (npr. jetre ili bubrega) i seruma.
Uzorci tkiva i seruma uzimaju se od pogodne životinje (npr. miša, majmuna, svinje ili pacova) i homogenizuju u puferu za homogenizaciju (0,5 % Igepal CA-630, 25 mM Tris pH8,0, 100 mM NaCl, pH8,0 (prilagođen 1 N NaOH). Homogenatima tkiva i seruma dodaje se oligonukleotid do koncentracije od 200 µg/g tkiva. Uzorci se inkubiraju 24 sata na 37 °C, a zatim se ekstrahuju fenol-hloroformom. Rastvori se podvrgavaju AIE HPLC analizama na Dionex Ultimate 3000 pomoću Dionex DNKpac p-100 kolone i gradijenta u rasponu od 10 mM-1 M natrijum perhlorata uz pH 7,5. Sadržaj cepljenog i necepljenog oligonukleotida određuje se prema standardu, pomoću fluorescentnog detektora na 615 nm i uv detektora na 260 nm.
Analiza cepanja S1 nukleaze
FAM-obeleženi oligonukleotidi sa linkerima osetljivim na S1 nukleazu (npr. DNK fosfodiesterski linker (PO linker)) podvrgavaju se in vitro cepanju u ekstraktu S1 nukleaze ili serumu.
100 µM oligonukleotida se podvrgava in vitro cepanju pomoću S1 nukleaze u nukleaznom puferu (60 U pr. 100 µL) tokom 20 i 120 minuta. Enzimska aktivnost se zaustavlja dodavanjem EDTA u puferski rastvor. Rastvori se podvrgavaju AIE HPLC analizama na Dionex Ultimate 3000 pomoću Dionex DNKpac p-100 kolone i gradijenta u rasponu od 10 mM-1 M natrijum perhlorata uz pH 7,5. Sadržaj cepljenog i necepljenog oligonukleotida određuje se prema standardu, pomoću fluorescentnog detektora na 615 nm i uv detektora na 260 nm.
Priprema mononuklearnih ćelija jetre
Ćelije jetre od AAV/HBV miševa bile su pripremane kako je opisano u nastavku i prema postupku opisanom u Tupin et al. 2006 Methods Enzymol 417:185-201 sa manjim izmenama. Nakon eutanazije miša, jetra je perfuzirana sa 10 ml sterilnog PBS-a kroz hepatičnu portalnu venu pomoću šprica s iglom G25. Kada organ izbledi, prikuplja se u Hankovom izbalansiranom slanom rastvoru (HBSS) (GIBCO® HBSS, 24020) 5 % dekomplementiranog fetalnog telećeg seruma (FCS). Prikupljena jetra lagano se propušta kroz 100 µM cedilo za ćelije (BD Falcon, 352360) i ćelije su suspendovane u 30 ml HBSS 5 % FCS. Ćelijska suspenzija je centrifugirana na 50 g tokom 5 minuta. Supernatanti su zatim centrifugirani na 289 g tokom 10 minuta na 4 °C. Nakon centrifugiranja, supernatanti su odbačeni i peleti su ponovno suspendovani u 15 ml na sobnoj temperaturi u 35 %
1 2
izotoničnom rastvoru Percoll (GE Healthcare Percoll # 17-0891-01 razblaženi u RPMI1640 (GIBCO, 31870)) i prebačeni u 15 ml epruvetu. Ćelije su dalje centrifugirane na 1360 g tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi. Supernatant je odbačen aspiracijom, a mononuklearne ćelije koje sadrže pelet isprane su dva puta sa HBSS+5 % FCS.
Ćelije su uzgajane u potpunom medijumu (α-minimalni esencijalni medij (Gibco, 22571), dopunjen sa 10 % FCS (Hyclone, # SH30066, serija APG21570), 100 U/mL penicilina 100 µg/mL streptomicina 0,3 mg/mL L- glutamina (Gibco, 10378), 1X neesencijalnih aminokiselina (Gibco, 11140), 10 mM Hepes (Gibco, 15630), 1 mM natrijum piruvata (Gibco, 11360) i 50 µM β-merkaptoetanola (LKB, 1830)).
Površinsko označavanje ćelija
Ćelije su posejane u ploče sa 96 bunarčića sa dnom oblika U i isprane sa PBS FACS (PBS koji sadrži 1 % goveđeg serumskog albumina i 0,01 % natrijum azida). Ćelije su inkubirane sa 5 µL PBS FACS koji je sadržavao anti-mišje CD16/CD32 antitelo pacova i fiksirajući žuti LD marker održivosti, Thermofisher, L34959 tokom 10 minuta u mraku na 4 °C. Zatim su ćelije bojene 20 minuta u mraku na 4 °C sa 25 pL PBS FACS-a koji sadrži monoklonska antitela (Mab) na NK P46 BV421 (Mab anti-mišji NK P46 pacova, Biolegend, 137612) i F4/80 (Mab anti-mišji F4/80 FITC pacova, BD Biolegend, 123108) i dva dopunska površinska markera: Dodani su i PD1 (Mab anti-mišji PD1 PE pacova, BD Biosciences, 551892) i PDL1 (Mab anti-mišji PDL1 BV711 pacova, Biolegend, 124319).
Analiza bojenja unutarćelijskih citokina (ICS)
ICS testovi su izvedeni i na splenocitima i na mononuklearnim ćelijama jetre. Ćelije su zasejane na ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom. Ploče sa ćelijama inkubirane su preko noći na 37 °C bilo u kompletnom medijumu samo kao negativna kontrola ili sa peptidima opisanim u Tabeli 9 u koncentraciji od 2 µg/ml. Brefeldin A u količini od 2 ug/mL (Sigma, B6542) dodan je nakon jednog sata inkubacije.
Nakon kulture preko noći, ćelije su isprane sa PBS FACS-om i inkubirane sa 5 µL PBS FACS-a koji je sadržavao anti-mišje CD16/CD32 antitelo pacova i fiksirajući žuti LD marker održivosti, Thermofisher, L34959 tokom 10 minuta u mraku na 4 °C. Zatim su ćelije bojene 20 minuta u mraku na 4 °C sa 25 µL PBS FACS koji sadrži Mab. Mešavina se sastojala od monoklonskih antitela na CD3 (Mab anti-mišji CD3-PerCP hrčka, BD Biosciences, 553067), CD8 (Mab anti-mišji CD8-APC-H7 pacova, BD Biosciences, 560182), CD4 (Mab anti-mišji CD4-PE-Cy7 pacova, BD Biosciences, 552775) i NK ćelije (Mab antimišji NK P46 BV421 pacova, Biolegend, 137612). Ćelije su fiksirane nakon nekoliko pranja i permeabilizirane 20 minuta u mraku na sobnoj temperaturi sa Cytofix/Cytoperm, isprane
1
rastvorom Perm/Wash (BD Biosciences, 554714) na 4 °C.
Unutarćelijsko citokinsko bojenje antitelima na IFNγ (Mab anti-mišji IFNγ-APC pacova, klon XMG1.2, BD Biosciences, 554413) i faktor nekroze tumora alfa (TNFα) (Mab anti-mišji TNFα-FITC pacova, klon MP6-XT22; 1/250 (BD Biosciences 554418) izvedeni su 30 minuta u mraku na 4 °C. Pre analize protočnom citometrijom pomoću MACSOuant analizatora, ćelije su isprane sa Perm/Wash i ponovno suspendovane u PBS FACS koji je sadržavao 1 % formaldehida.
Žive ćelije CD3+ CD8+ CD4- i ćelije CD3+ CD8- CD4+ izdvojene su i predstavljene na tačkastom grafikonu. Dva regiona su definisani za izdvajanje za pozitivne ćelije za svaki citokin. Brojevi događaja na mestima izdvajanja podeljeni su sa ukupnim brojem događaja u roditeljskoj populaciji da bi se dobili procenti odgovarajućih T ćelija. Za svakog miša procenat dobijen u samom medijumu smatran je pozadinom i oduzet od procenta dobijenog peptidnim stimulacijama.
Prag pozitivnosti definisan je u skladu sa pozadinom eksperimenta, tj. srednjim procentom obojenih ćelija dobijenim za svaku grupu u samom medijumu plus dve standardne devijacije. Samo je procenat citokina koji predstavlja najmanje 5 događaja smatran pozitivnim.
Tabela 9: HLA-A2/DR1 ograničeni epitopi sadržani u HBV Core proteinu i domenima omotača HBsAg (S2+S).
1 4
1
Primer 1 Ispitivanje delotvornosti in vitro
Šetnja genomom je izvedena duž transkripta humanog PD-L1 prvenstveno pomoću od 16 do 20-mer gepmera. Ispitivanje delotvornosti je izvedeno u in vitro eksperimentu na monocitnoj humanoj ćelijskoj liniji leukemije THP1 i na humanoj ćelijskoj liniji ne-Hodgkinovog K limfoma (KARPAS-299).
Ćelijske linije
Linija THP1 i Karpas-299 su originalno kupljene od Evropske zbirke autentičnih ćelijskih kultura (ECACC) i održavane u skladu sa preporukama dobavljača u humidifikovanom inkubatoru na 37 °C sa 5 % CO2.
Delotvornost oligonukleotida
THP-1 ćelije (3,104 u RPMI-GLutamaxu, 10 % FBS, 1 % Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific) dodane su u oligonukleotide (4-5 ul) na ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom i uzgajane 6 dana do konačnog volumena od 100 µl/bunarčić. Oligonukleotidi su pregledani u jednoj koncentraciji (20 µM) i u koncentracijama raspona doza od 25 µM do 0,004 µM (razređivanje 1:3 u vodi). Ukupna mRNK je ekstrahovana pomoću kompleta MagNA Pure 96 Cellular RNK Large Volume na MagNA Pure 96 sistemu (Roche Diagnostics) prema uputama proizvođača.
Za analizu ekspresije gena, RT-qPCR je izveden pomoću TaqMan RNK-to-ct 1-Step kompleta (Thermo Fisher Scientific) na QuantStudio mašini (Applied Biosystems) sa unapred dizajniranim Taqmanovim prajmerima koji ciljaju humani PDL1 i ACTB koji se koriste kao endogena kontrola (Thermo Fisher Scientific). Relativni nivo ekspresije mRNK PD-L1 izračunat je upotrebom 2(-Delta Delta C (T)) postupka i procenat inhibicije u vidu % upoređen je sa kontrolnim uzorkom (netretirane ćelije).
Ćelije Karpas-299 uzgajane su u RPMI1640, 2 mM glutamina i 20 % FBS (Sigma). Ćelije su postavljene na ploče od 10000 ćelija/bunarić u 96 bunarčića koje su inkubirane 24 sata pre dodavanja oligonukleotida rastvorenih u PBS. Konačna koncentracija oligonukleotida je bila u pojedinačnoj dozi od 5 µM, u konačnoj zapremini kulture bila je 100 µl/bunarčiću ili dodana u doznom odgovoru u rasponu od 50 µM, 15,8 µM, 5,0 µM, 1,58
1
µM, 0,5 µM, 0,158 µM, 0,05 µM, do 0,0158 µM u 100 µL volumena kulture. Ćelije su sakupljene 3 dana nakon dodavanja oligonukleotidnih jedinjenja i RNK je ekstrahovana pomoću PureLink Pro 96 RNK Purification kompleta za pročišćavanje (Ambion), prema uputstvima proizvođača. cDNK je sintetizovana korištenjem M-MLT reverzne transkriptaze, prajmera Random Decamers RETROscript, inhibitora RNaze (Ambion) i kompleta od 100 mM dNTP (Invitrogen, PCR Grade) prema uputama proizvođača. Za analizu ekspresije gena, qPCR je izveden pomoću TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X) (Ambion) u dupleksu postavljenom sa TaqMan prajmer testovima za PD-L1 (Applied Biosystems; Hs01125299_m1) i TBP (Applied Biosystems; 4325803). Relativni nivo ekspresije mRNK PD-L1 prikazan je u tabeli 10 kao % kontrolnog uzorka (ćelije tretirane PBS-om).
Tabela 10: in vitro efikasnost anti-PD-L1 jedinjenja u ćelijskim linijama THP1 i KARPAS-299 (Prosek iz n = 3 eksperimenta). Nivoi PD-L1 mRNK su normalizovani na TBP u ćelijama KARPAS-299 ili ACTB u ćelijama THP1 i prikazani kao % kontrole (ćelije tretirane PBS-om).
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
Primer 2 - Ispitivanje delotvornosti in vitro u krivoj koja predstavlja odgovor na dozu
Deo oligonukleotida iz Tabele 10 testiran je u ćelijama KARPAS-299 upotrebom polulogaritamskih serijskih razblaženja u PBS (50 µM, 15,8 µM, 5,0 µM, 1,58 µM, 0,5 µM, 0,158 µM, 0,05 µM, do 0,0158 µM oligonukleotida) u testu delotvornosti in vitro opisanom u Primeru 1. Procenjena je IC50 i maksimalna inhibicija (% rezidualne ekspresije PD-L1) za
1
oligonukleotide.
EC50 proračuni su izvedeni u GraphPad Prism6. IC50 i maksimalni nivo nokdauna PD-L1 prikazani su u tabeli 11 kao % kontrolnih (PBS) tretiranih ćelija.
Tabela 11: Maksimalna inhibicija kao % fiziološkog rastvora i EC50 u ćelijskoj liniji KARPAS-299.
1
14
Deo oligonukleotida iz tabele 6 testiran je u THP-1 ćelijama pomoću serije 1:3 u vodi od 25 µM do 0,004 µM u testu delotvornosti in vitro opisanom u primeru 1. Procenjena je IC50 i maksimalna inhibicija (procenat rezidualne PD-L1 ekspresije) za oligonukleotide.
EC50 proračuni su izvedeni u GraphPad Prism6. IC50 i maksimalni nivo nokdauna PD-L1 prikazani su u tabeli 12 kao % kontrolnih (PBS) tretiranih ćelija.
Tabela 12: Maksimalna inhibicija kao % fiziološkog rastvora i EC50 u ćelijskoj liniji THP1.
14
Rezultati u tabelama 7 i 8 su prikazani i na slici 2 u odnosu na njihov položaj gde ciljaju PD-L1 pre mRNK sekvence SEQ ID NO: 1.
Iz ovoga se može videti da gotovo sva jedinjenja imaju EC50 vrednosti ispod 1 µM i ciljni nokdaun ispod 25 % od nivoa ekspresije PD-L1 u kontrolnim ćelijama (tretiranim fiziološkim rastvorom).
Primer 3 - In vitro potentnost i delotvornost i in vivo smanjenje PD-L1 kod miševa indukovanih sa poly(I:C) pomoću golih i GalNAc konjugovanih PD-L1 antisens oligonukleotida
Ispitivanje efikasnosti i potentnosti izvedeno je u in vitro eksperimentu u studijama odgovora na dozu u ćelijama MCP-11 pomoću oligonukleotida iz tabele 6. Isti oligonukleotidi kao i GalNAc konjugovane verzije (tabela 8 CMP ID NO 755_2-765_2) testirani su in vivo na ženskim miševima C57BL/6J indukovanim sa poly(I:C) na njihovu sposobnost da smanje PD-L1 mRNK i ekspresiju proteina
In vitro test
MCP-11 ćelije (originalno kupljene od ATCC) suspendovane su u DMEM (Sigma kat. br. D0819) dopunjenog sa 10 % konjskog seruma, 2 mM L-glutamina, 0,025 mg/ml gentamicina i 1 mM natrijum piruvata dodanih u gustini od 8000 ćelija/bunarčić u oligonukleotide (10 µl) na pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i kultivisane su 3 dana u konačnoj zapremini od 200 µl/bunarčić u humidifikovanom inkubatoru na 37 °C sa 5 % CO2. Oligonukleotidi su pregledani u koncentracijama doznih raspona (50 µM, 15,8 µM, 5,0
14
µM, 1,58 µM, 0,5 µM, 0,158 µM, 0,05 µM i 0,0158 µM).
Ukupna mRNK je ekstrahovana pomoću PureLink Pro 96 RNK Purification kompleta za pročišćavanje (Ambion), prema uputama proizvođača. cDNK je sintetizovana pomoću M-MLT reverzne transkriptaze, prajmera Random Decamers RETROscript, inhibitora RNaze (Ambion) i kompleta 100 mM dNTP (Invitrogen, PCR Grade) prema uputama proizvođača. Za analizu ekspresije gena, qPCR je izveden pomoću TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)(Ambion) u dupleksu postavljenom sa TaqMan testovima prajmera za PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) i Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm01197698-m1). Relativni nivo ekspresije mRNK PD-L1 prikazan je u tabeli 9 kao % rezidualne ekspresije PD-L1 u % PBS kontrolnih uzoraka (ćelije tretirane PBS-om). EC50 proračuni su izvedeni u GraphPad Prism6. EC50 i maksimalni PD-L1 nokdaun nivo prikazani su u tabeli 13 kao % kontrolnih (PBS) ćelija.
In vivo test
Ženkama miševa C57BL/6J (20-23 g; 5 miševa po grupi) ubrizgano je supkutano 5 mg/kg oligonukleotida nekonjugovanih sa mišjim PD-L1 ili 2,8 mg/kg oligonukleotida GalNAc-konjugovanih sa mišjim PD-L1. Tri dana kasnije, miševima je ubrizgano iv. 10 mg/kg poly(I:C) (LWM, Invivogen). Miševi su eutanizirani 5 h nakon ubrizgavanja poly(I:C), a uzorci jetre stavljeni su u RNKIater (Thermo Fisher Scientific) za ekstrakciju RNK ili smrznuti na suvom ledu za ekstrakciju proteina.
Ukupna mRNK je ekstrahovana iz homogenizovanih uzoraka jetre pomoću PureLink Pro 96 RNK Purification kompleta za pročišćavanje (Ambion), prema uputama proizvođača. cDNK je sintetizovana putem M-MLT reverzne transkriptaze, prajmera Random Decamers RETROscript, inhibitora RNaze (Ambion) i kompleta 100 mM dNTP (Invitrogen, PCR Grade) prema uputama proizvođača. Za analizu ekspresije gena, qPCR je izveden pomoću TaqMan® Fast Advanced Master Mix TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X) (Ambion) u dupleksu postavljenom sa TaqMan testovima prajmera za mRNK PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054 -m1) i TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). Relativni nivo ekspresije mRNK PD-L1 prikazan je u tabeli 13 kao % kontrolnih uzoraka miševa kojima je ubrizgan fiziološki rastvor i poly(I:C).
Homogenati jetre pripremljeni su homogenizacijom uzoraka jetre u 2 ml na 100 mg tkivnog reagensa za ekstrakciju proteina iz tkiva T-PER® (Thermo Fisher Scientific) pomešanog sa 1x koktel inhibitora zaustavljanja proteaze, bez EDTA (Thermo Fisher Scientific). Koncentracije proteina u homogenatima jetre izmerene su pomoću testnih reagensa Coomassie Plus (Bradford) Assay Reagent (Thermo Scientific) prema uputama
14
proizvođača. Homogenati jetre (40 µg proteina) odvojeni su na 4-12 % poliakrilamidnim gelovima Bis-Tris Plus (Thermo Fisher Scientific) u puferu 1xMOPS, i prebačeni u nitrocelulozne membrane pomoću iBLOT sistema za suho blotiranje (Thermo Fisher Scientific) prema uputama proizvođača. Svaki blot je vodoravno presečen na dva dela na opsegu od 64 kDa. Nakon blokade u TBS koji sadrži 5 % obranog mleka i 0,05 % Tween20, membrane su inkubirane preko noći na 4 °C sa zečjim monoklonskim anti-vinkulinom (Abcam kat. Br. Ab129002) razređenim 1:10000 (gornje membrane) ili kozjim poliklonskim anti-mPD-L1 (R&D Systems kat. br. AF1019) razređenim 1:1000 (donje membrane) u TBS-u koji sadrži 5 % obranog mleka i 0,05 % Tween20. Membrane su isprane u TBS-u koji sadrži 0,05 % Tween20 i izložene 1 sat na sobnoj temperaturi HRP-konjugovanom antizečijem IgG svinje (DAKO) razređenim 1:3000 (gornje membrane) ili HRP-konjugovanom anti-kozjim IgG svinje (DAKO) razblaženim 1:2000 u TBS-u koji sadrži 5 % obranog mleka i 0,05 % Tween20. Nakon pranja membrana, reaktivnost je detektovana pomoću ECL select (Amersham GE Healthcare). Za svaku grupu miševa tretiranih oligonukleotidima, intenzitet PD-L1 pojaseva u odnosu na vinkulinske pojaseve procenjena je poređenjem sa intenzitetom PD-L1/vinkulinskih pojaseva miševa kojima je ubrizgavan fiziološki rastvor i poly(I:C) (kontrola). Rezultati su prikazani u tabeli 13, a western blotovi sa parovima golih i konjugovanih oligonukleotida na slici 9 AE.
Tabela 13: Delotvornost oligonukleotida in vitro i in vivo na mišji PD-L1
14
++: slično intenzitetu kontrole PD-L1/vinkulinskog pojasa; +: slabiji od intenziteta kontrole PD-L1/vinkulinskog pojasa; : mnogo slabiji od intenziteta kontrole PD-L1/vinkulinskog pojasa; nd = nije određeno.
Iz podataka u tabeli 13 vidi se da GalNAc konjugacija oligonukleotida jasno poboljšava in vivo smanjivanje PD-L1. Smanjenje mRNK generalno je u korelaciji sa smanjenjem proteina PD-L1. Osim za CMP ID NO: 754_1, niska in vitro vrednost EC50 po pravilu odražava dobru in vivo smanjenje PD-L1 mRNK nakon što se oligonukleotid konjuguje sa GalNAc.
Primer 4 - In vivo PK/PD u sortiranim hepatocitima i neparenhimskim ćelijama miševa kojima je indukovan poly(I:C)
Raspodela golih i GalNAc konjugovanih oligonukleotida kao i smanjenje PD-L1 mRNK istražena je u hepatocitima i neparenhimskim ćelijama izoliranim od miševa indukovanih sa poly(I:C).
Ženkama miševa C57BL/6J (n = 3 po grupi) ubrizgano je supkutano 5 mg/kg
14
nekonjugovanog oligonukleotida (748_1) ili 7 mg/kg konjugovanih oligonukleotida (759_2) GalNAc koji ciljaju PD-L1 mRNK miša. Dva dana kasnije, miševima je ubrizgano ip 15 mg/kg poly(I:C) (LWM, Invivogen). Miševi su anestezirani 18-20 h nakon ubrizgavanja poly(I:C) i jetra je perfuzirana, uz protok od 7 ml u minuti kroz šuplju venu, Hankovim izbalansiranim slanim rastvorom koji je sadržavao 15 mM Hepesa i 0,38 mM EGTA tokom 5 min., a nakon toga rastvorom kolagenaze (Hankov izbalansirani slani rastvor koji sadrži 0,17 mg/ml kolagenaze tipa 2 (Worthington 4176), 0,03 % BSA, 3,2 mM CaCl2 i 1,6 g/l NaHCO
3) tokom 12 minuta. Nakon perfuzije, jetra je uklonjena, a jetrena kapsula otvorena, jetrena suspenzija filtrirana je kroz cedilo od 70 sati pomoću William E medijuma, a alikvot ćelijska suspenzija (= mešovite ćelije jetre) uklonjena je i ostavljen za kasniju analizu. Ostatak ćelijske suspenzije je centrifugiran 3 min na 50xg. Supernatant je sakupljen za kasnije pročišćavanje neparenhimskih ćelija. Pelet je resuspendovan u 25 ml medijuma William E (Sigma kat. Br. W1878, dopunjen sa 1x Pen/Strep, 2 mM L-glutaminom i 10 % FBS (ATCC # 30-2030)), pomešan sa 25 ml medijuma William William koji sadrži 90 % perkola, i hepatociti su istaloženi centrifugiranjem na 50xg tokom 10 minuta. Nakon dva puta ispiranja u William E medijumu, istaloženi hepatociti su resuspendovani u Williams E medijumu. Supernanat koji sadrži neparenhimske ćelije centrifugiran je na 500xg 7 minuta, a ćelije su resuspendovane u 4 ml RPMI medijuma i centrifugirane kroz dva sloja perkola (25 % i 50 % perkola) na 1800xg tokom 30 minuta. Nakon sakupljanja neparenhimskih ćelija između dva perkolna sloja, ćelije su isprane i resuspendovane u RPMI medijumu.
Ukupna mRNK je ekstrahirana iz pročišćenih hepatocita, neparenhimskih ćelija i ukupne suspenzije jetre (nefrakcionisane ćelije jetre) upotrebom PureLink Pro 96 RNK Purification kompleta za pročišćavanje (Ambion), prema uputama proizvođača. cDNK je sintetizovana putem M-MLT reverzne transkriptaze, prajmera Random Decamers RETROscript, inhibitora RNaze (Ambion) i 100 mM dNTP skupa (Invitrogen, PCR Grade) prema uputama proizvođača. Za analizu ekspresije gena, qPCR je izveden pomoću TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)(Ambion) u dupleksu postavljenom TaqMan testovima prajmera za PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) i TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). Relativni nivo ekspresije mRNK PD-L1 prikazan je u tabeli 10 kao % kontrolnih uzoraka miševa kojima je ubrizgan fiziološki rastvor i poly(I:C).
Analiza sadržaja oligonukleotida izvedena je pomoću testa ELISA putem biotinilirane sonde za hvatanje sa sekvencom i sonde za detekciju konjugovanog digoksigenina sa sekvencom 5'-DIG-C12-S1- -3'. Sonde su se sastojale samo od LNA
14
sa fosfodiesterskom okosnicom. Uzorci jetre (približno 50 mg) homogenizovani su u 1,4 ml MagNa pufera za čistu lizu (Roche Cat. br.03604721001) u Eppendorfovoj epruveti od 2 ml koja sadrži jednu kuglicu od nerđajućeg čelika od 5 mm. Uzorci su homogenizovani na Retsch MM400 homogenizatoru (Merck Eurolab) dok se nije dobio jednolični lizat. Uzorci su inkubirani tokom 30 min. na sobnoj temperaturi. Standardi su generisani dodavanjem nekonjugovanog antisense oligonukleotidnog jedinjenja (CMP ID NO748_1) u definisanin koncentracijama u neobrađeni uzorak jetre, i njihovom obradom u svojstvu uzoraka. Koncentracije "spike-in" se odabiru tako da odgovaraju očekivanom oligo sadržaju u uzorku (unutar ~ 10 puta).
Homogenizovani uzorci razređeni su najmanje 10 puta u 5 x SSCT puferu (750 mM NaCl i 75 mM natrijum citrata, koji sadrži 0,05 % (v/v) Tween-20, pH7,0) i u seriji od 6 puta dvostrukih razređenja pomoću rastvora za detekciju hvatanja (35 nM sonda za hvatanje i 35 nM sonda za detekciju u puferu 5xSSCT) i inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su prebačeni na ploču presvučenu streptavidinom sa 96 bunarčića (Nunc Cat. br.
436014) sa po 100 µL u svakom bunarčiću. Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje. Oprati tri puta sa 2 x SSCT pufera i dodati 100 µL anti-DIG-AP Fab fragmenta (Roche Applied Science, Cat. br. 11 093 274 910) razblaženog 1:4000 u PBST (fiziološki rastvor puferiran sa fosfatom, koji sadrži 0,05 % (v/v) Tween-20, pH7,2, sveže pripremljeno) je dodato u svaki bunarčić i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje. Oprati tri puta sa 2 x SSCT pufera i dodati 100 µL rastvora supstrata alkalne fosfataze (AP) (supstrat Blue Phos, KPL kod 50-88-00, sveže pripremljen). Intenzitet boje izmeren je spektrofotometrijski na 615 nm nakon 30 minuta inkubacije uz lagano mešanje. Sirovi podaci su izvezeni iz čitača (softver Gen5 2.0) u format excel i dalje analizirani u excelu. Standardne krive generisane su pomoću softvera GraphPad Prism 6 i logističkog 4PL regresijskog modela.
Tabela 14: Ekspresija PD-L1 i oligo sadržaj u ukupnoj suspenziji ćelija jetre, hepatocita i neparenhimskih ćelija od poly(I:C) miševa lečenih nekonjugovanim i GalNAc konjugovanim oligonukleotidima, n = 3.
1
Rezultati pokazuju da goli (CMP ID NO: 748_1) i konjugovani (CMP ID NO: 759_2) oligonukleotid jednako dobro smanjuju PD-L1 mRNK u ukupnim ćelijama jetre. U izolovanim hepatocitima, delovanje konjugovanog oligonukleotida je gotovo pet puta jače od delovanja golog oligonukleotida, dok su goli oligonukleotidi dvostruko jači od GalNAckonjugovanih oligonukleotida u neparenhimskim ćelijama. U hepatocitima i neparenhimskim ćelijama smanjenje ekspresije PD-L1 mRNK donekle je u korelaciji sa sadržajem oligonukleotida u ovim tipovima ćelija.
Primer 5 - In vivo nokdaun PD-L1 kod miševa AAV/HBV upotrebom golih i GalNAc konjugovanih PD-L1 antisens oligonukleotida
U predmetnoj studiji AAV/HBV miševi su lečeni golim ili GalNAc konjugovanim PD-L1 antisens oligonukleotidima, a u jetri je procenjena ekspresija PD-L1 mRNK i ekspresija HBV gena.
Ženke HLA-A2/DR1 miševa starih 5-8 nedelja (5 životinja iz pr. grupe) prethodno su lečene placebom u nedelji -1 (fiziološki rastvor), golim PD-L1 antisense oligonukleotidima (CMP ID NO752_1 sa 5 mg/kg supkutano) i GalNAc PD-L1 antisense oligonukleotidima (CMP ID NO763_2 sa 7 mg/kg supkutano), ove doze odgovaraju ekvimolarnim koncentracijama oligonukleotida. Miševi su transdukovani sa 5x10<10>vg AAV-HBV u nedelji 0 (za više detalja videti opis AAV/HBV mišjeg modela u odeljku Materijali i postupci). Od nedelje 1 nakon AAV-HBV transdukcije do nedelje 4, miševi su primili 4 dodatne supkutane injekcije PD-L1 oligonukleotida ili placeba (fiziološki rastvor), u razmaku od nedelje dana.
Uzorci krvi su uzimani nedelju dana pre transdukcije i nedelju dana nakon svake injekcije.
Miševi su žrtvovani dve nedelje nakon poslednje injekcije, a jetra im je odstranjena nakon PBS perfuzije. Jetra je izrezana na manje komade i direktno smrznuta.
Za merenje ekspresije HBV gena, ekstrahirana je DNK iz seruma pomoću Qiagen Biorobota i QIAamp One za sve komplete nukleinskih kiselina, kat. br. 965672, serum je
1 1
razređen u razblaženju 1:20 u PBS-u, ukupno je 100 µl lizirano u 200ul pufera AL. DNK je eluirana iz kompleta u 100 µl.
Za qPCR u stvarnom vremenu korištena je glavna kompozicija TaqMan Gene Expression Master (kat.br. 4369016, Applied Biosystems), zajedno sa smešom prajmera pripremljenom dodavanjem 1:1:0,5 sledećih prajmera F3_core, R3_core, P3_core (Integrated DNK Technologies, svi rekonstituisani na 100 µM)
Prednji
Obrnuti
Sonda
-3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)
Standardna kriva pomoću HBV plazmida (genotip D, GTD) pripremljena je pomoću desetorostrukog razblaženja počevši od 1 x10<9>kopija/μl do 1 copije/μl, koje se koristilo u 5μl po reakciji.
Za svaku reakciju dodano je 10 µl Master Expression Master Mix, 4,5 µl vode, 0,5 µl osnovne smeše i 5 µl uzorka ili standarda, i pokrenut je qPCR.
Za analizu je izračunat broj kopije / ml / bunarčić pomoću standardne krive. Rezultati su prikazani u tabeli 15.
Ekspresija PD-L1 mRNK izmerena je pomoću qPCR.
mRNK je ekstrahovana iz smrznutih komada jetre koji su dodani u epruvete od 2 ml koje su sadržavale keramičke kuglice (epruvete Lysing Matrix D, 116913500, mpbio) i 1 ml Trizola.
Komad jetre homogeniziran je pomoću Precellys Tissue Disruptor.200 μl hloroforma je dodano homogenatu, vorteksirano i centrifugirano na 4 °C tokom 20 min na 10000 o/min. RNK koja sadrži bistru fazu (oko 500 uI) prebačena je u svežu epruvetu i dodat je isti volumen 70 % EtOH. Nakon dobrog mešanja, otopina je prebačena na RNeasy spin kolonu i RNK je dalje ekstrahovana prema priručniku RNeasy Kit RNeasy Mini Kit, kat. br. 74104, Qiagen (uključujući komplet RNK digestion RNase-free DNase Set, kat. br.79254.). Elucija u 50μl H2O. Izmerena je konačna koncentracija RNK i prilagođena na 100 ng/ul za sve uzorke.
qPCR je proveden na 7,5 µl RNK pomoću kompleta Taqman RNK-to-ct 1-step, kat. br. 4392938, Thermo Fisher, prema uputama proizvođača. Mešoviti prajmer je sadržavao PD-L11-3 (broj prajmera Mm00452054_m1, Mm03048247_m1 i Mm03048248_m1) i endogonske kontrole ((ATCB Mm00607939_s1, CANX Mm00500330_m1, YWHAZ Mm03950126_s1 i GUSB Mm01197698_m1)
1 2
Podaci su analizirani postupkom 2^-ddct. Za izračunavanje dct vrednosti korištena je srednja vrednost sve četiri endogene kontrole. Ekspresija PD-L1 u odnosu na srednju vrednost endogenih kontrola i u % fiziološkog rastvora
Tabela 15: Ekspresija PD-L1 mRNK i HBV DNK kod AAV/HBV miševa tretiranih nekonjugovanim i GalNAc konjugovanim oligonukleotidima, n = 5.
Iz ovih rezultata se može videti da goli i GalNAc konjugovani oligonukleotidi mogu da smanje ekspresiju PD-L1 mRNK u jetri AAV/HBV miša, s tim da GalNAc konjugovani oligonukleotid daje nešto bolji rezultat. Oba oligonukleotida proizvela su i određeno smanjenje HBV DNK u serumu.
Primer 6 - In vivo delovanje na odgovor T ćelija kod AAV/HBV miševa
U ovoj studiji AAV/HBV miševi od instituta Pasteur lečeni su antitelom ili antisense oligonukleotidima koji ciljaju PD-L1. Antisense oligonukleotidi su bili goli ili konjugovani sa GalNAc. Tokom lečenja životinje su imunizovane DNK vakcinom na HBs i HBc antigene (vidi odeljak Materijali i postupci) kako bi se osiguralo efikasno prajmovanje T ćelija antigen prezentujućim ćelijama. Procenjeno je kako je lečenje uticalo na ćelijsku populaciju u jetri i slezini, kao i na ekspresiju PD-L1 na tim populacijama i da li se može identifikovati odgovor T ćelija specifičan za HBV.
Protokol lečenja:
Ženke HLA-A2/DR1 miševa lečene su prema protokolima u nastavku. Studija je provedena u dve odvojene podstudije, sa neznatnim razlikama u režimima primene, kako je naznačeno u donjim tabelama 16 i 17.
DNK vakcina i anti-PD-L1 antitelo davani su miševima na način opisan u odeljku o materijalima i postupcima. Korišteni antisense oligonukleotidi su bili CMP ID NO748_1 (goli) od 5 mg/kg i CMP ID NO: 759_2 (GalNAc konjugovani) od 7 mg/kg, oba davana kao subkutane injekcije (sc).
1
Tabela 16: Protokol lečenja miševa AAV/HBV sa DNK vakcinom i DNK vakcinom anti-PD-L1 antitelo, 6 miševa u svakoj grupi
Izotip = kontrola sa mišjim IgG Ab, CaTx = kardiotoksin, DNK = DNK vakcina, Ab = anti-PD-L1 Ab i * = sakupljanje seruma
Tabela 17: Protokol lečenja miševa AAV/HBV sa DNK vakcinom i DNK vakcinom goli ili konjugovani PD-L1 oligonukleotid (ASO), 7 miševa u svakoj grupi
1 4
DNK = DNK vakcina, CaTx = kardiotoksin, Ab = anti-PD-L1 antitelo, ASO = goli PDL-1 oligonukleotid, GN-ASO = GalNAc-PDL-1 oligonukleotid i * = prikupljanje seruma U vreme žrtvovanja, prikupljeni su krv, mononuklearne ćelije slezine i jetre svakog miša iz svake grupe, iz njih su uklonjena crvena krvna zrnca (Lysing Buffer, BD biosciences,
1
555899). Mononuklearne ćelije jetre su zahtevale specifičnu pripremu kako je opisano u Odeljku o materijalima i postupcima.
Populacije ćelija:
U jetri je populacija ćelija analizirana površinskim obeležavanjem mononuklearnih ćelija jetre (vidi materijale i postupke) pomoću citometrije.
Nisu primećene značajne promene u učestalosti NK ćelija u slezini i jetri kod lečenih miševa u odnosu na kontrolne grupe (tj. grupe sa placebom i DNK imunizovane grupe). Tabela 18 pokazuje da je kod grupa koja je tretirana golim PD-L1 oligonukleotidom (CMP ID NO748_1) i GalNAc konjugovanim PD-L1 oligonukleotidom (CMP ID NO: 759_2) u jetri postojao značajan porast broja T ćelija u odnosu na bilo koju kontrolnu grupu (tj. grupe sa placebom i DNK imunizovane grupe) koje su predstavljene na slici 10 A. Ovaj porast je posledica povećanja populacija CD4+ i CD8+ T ćelija (tabela 18 i slika 10B, odnosno 10C).
Tabela 18: T ćelije u jetri nakon tretmana izraženo u milionima ćelija
Ekspresija PD-L1:
Ekspresija proteina PD-L1 ispitivana je na makrofazima, B i T ćelijama slezine i jetre u vreme žrtvovanja. Prisustvo PD-L1 antitela u mešavini površinskih obeležavajućih antitela (vidi materijale i postupke) omogućilo je kvantifikaciju PD-L1 ekprimirajućih ćelija putem
1
citometrije.
U slezini nije uočena značajna razlika između tretmana u % makrofaga, B ćelija i CD4+ T ćelija koje eksprimiraju PD-L1. % CD8+ T ćelija koje eksprimiraju PD-L1 bio je niži kod miševa koji su tretirani golim PD-L1 oligonukleotidom (CMP ID NO748_1) i GalNAc konjugovanim PD-L1 oligonukleotidom (CMP ID NO: 759_2) u odnosu na druge tretmane (podaci nisu prikazani).
U jetri, PD-L1 je izražen uglavnom na CD8+ T ćelijama sa srednjom učestalošću od 32 % i 41 % u kontrolnim grupama (dve grupe sa placebom, odnosno DNK vakcinom, slika 11 A). Tretman golim PD-L1 oligonukleotidom ili GalNAc PD-L1 oligonukleotidom za rezultat je imao smanjenu učestalost CD8+ T ćelija koje eksprimiraju PD-L1 (videti tabelu 19, slika 11 A). Značajne varijacije u % ćelija koje eksprimiraju PD-L1 primećene su i kod B ćelija i CD4+ T ćelija nakon tretmana ASO, iako ovi tipovi ćelija izražavaju znatno manje PD-L1 od CD8+ T ćelija (videti tabelu 19 i slike 11B i C). Tretman anti-PD-L1 Ab, takođe je za rezultat imao očito smanjenu ekspresiju PD-L1 kod svih tipova ćelija. Međutim, moguće je da je ovo smanjenje posledica delomične blokade epitopa PD-L1 anti-PD-L1 antitelom koje se koristi za lečenje, tako da je u mešavini površinskih obeležavajućih antitela sprečeno vezivanje na PD-L1 antitela za detekciju PD-L1. Stoga ono što se čini kao nishodna regulacija PD-L1 uz pomoć anti-PD-L1 antitela koje se koristi za lečenje može biti rezultat nadmetanja epitopa između antitela za lečenje i antitela za otkrivanje.
Tabela 19: % populacije ćelija jetre sa ekspresijom PD-L1
1
HBV specifični T ćelijski odgovor:
NK ćelije i CD4+ i CD8+ T ćelije koje proizvode proupalne citokine otkrivene su pomoću testova bojenja unutarćelijskih citokina (videti odeljak Materijali i postupci) koji otkrivaju stvaranje IFNγ i TNFα.
U slezini se nisu otkrile NK ćelije, a otkriveno je vrlo malo CD4+ T ćelija koje luče IFNγ- i TNFα (frekventnost <0,1 %) nakon žrtvovanja. CD8+ T ćelije koje proizvode IFNγ koje ciljaju dva HBV antigena otkrivene su kod miševa koji su lečeni golim PD-L1 oligonukleotidom ili GalNAc PD-L1 oligonukleotidom, kao i kod miševa iz ove studije koji su primili samo DNK vakcinu (podaci nisu prikazani).
U jetri DNK imunizovanih miševa koji su nosili HBV, prilikom žrtvovanja nisu otkrivene NK ćelije koje proizvode IFNγ, dok su CD4+ T ćelije koje luče IFNγ specifične za jedro ili za S2+S otkrivene u jetri nekoliko DNK imunizovanih miševa uz malu frekventnost (<0,4 %, podaci nisu prikazani). U većini DNK imunizovanih miševa otkrivene su HBV S2+S specifične CD8+ T ćelije koje proizvode IFNγ. Frekventnost CD8+ T ćelija koje luče IFNγ povećala se kod miševa koji su lečeni kombinacijom DNK vakcine i golog PD-L1 oligonukleotida ili GalNAc PD-L1 oligonukleotida, dok lečenje anti-PD-L1 antitelom nije proizveo očigledan dodatni efekat na DNK vakcinaciju (slika 12). U većini DNK imunizovanih grupa (osim anti-PD-L1 antitela) otkrivene su CD8+ T ćelije koje proizvode IFNγ i ciljaju antigene omotača i jedra (slika 12B). Većina S2-S specifičnih T ćelija proizvodile su i IFNγ i TNFα (slika 12C). Rezultati su prikazani i u Tabeli 20.
Tabela 20: % HBV antigen (S2-S ili jedra) specifičnih CD8+ T ćelija od ukupne populacije ćelija IFNγ ili IFNγ TNFα
1
Primer 7 - In vivo delovanje na HBV antigen i HBV DNK u serumu AAV/HBV miševa
U ovoj studiji AAV/HBV miševi Šangaj (videti odeljak Materijali i postupci) tretirani su GalNAc konjugovanim PD-L1 antisense oligonukleotidom CMP ID NO 759_2.
Procenjivano je to kako je tretman uticao na HBe i HBs antigene i nivoe HBV DNK u serumu u odnosu na životinje lečene placebom.
Protokol lečenja:
U ovoj studiji su korišteni muški miševi C57BL/6 zaraženi rekombinantnim adenopovezanim virusom (AAV) koji nosi HBV genom (AAV/HBV), kako je opisano u šangajskom modelu u odeljku o materijalima i postupcima. Miševima (grupa prvih 6 miševa) je ubrizgavan jednom nedeljno tokom 8 nedelja antisense oligonukleotid CMP ID NO: 759_2 u količini od 5 mg/kg ili placebo (fiziološki rastvor), oba u vidu potkožnih injekcija (supkutano). Uzorci krvi su uzimani svake nedelje tokom tretmana, kao i 6 nedelja nakon tretmana. Nivoi HBV DNK, HBsAg i HBeAg izmereni su u uzorcima seruma kako je opisano u nastavku. Rezultati za prvih 10 nedelja prikazani su u tabeli 21 i na slici 13. Studija je još bila u toku u vreme podnošenja prijave, pa podaci za preostale 4 nedelje nisu
1
prikupljeni.
Detekcija HBsAg i HBeAg:
Serumski nivoi HBsAg i HBeAg određeni su u serumu inficiranog AAV-HBV miša upotrebom HBsAg hemolineziscentnog imunološkog testa (CLIA) i HBeAg CLIA kompleta (Autobio diagnostika Co. Ltd., Zhengzhou, Kina, kat. CL0310-2, odnosno CL0312-2), prema protokolu proizvođača. Ukratko, 50 µl seruma prebačeno je na odgovarajuću mikrotitarsku ploču obloženu antitelima i dodano je 50 µl enzimskog konjugovanog reagensa. Ploča je inkubirana 60 minuta na mućkalici na sobnoj temperaturi, pre nego što su svi bunarčići isprani šest puta puferom za pranje pomoću automatske podloške. U svaki bunarčić dodato je 25µl supstrata A, a zatim 25µl supstrata B. Ploča je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi, pre nego što je merena luminiscencija pomoću Envision čitača luminiscencije. HBsAg je dat u jedinici IU/ml; gde je 1 ng HBsAg = 1,14 IU. HBeAg je dat u jedinici NCU/ml seruma.
Ekstrakcija HBV DNK i qPCR:
U početku je serum miševa razblažen sa faktorom 10 (1:10) sa slanim rastvorom puferiranim sa fosfatom (PBS). DNK je ekstrahovana pomoću robota MagNA Pure 96 (Roche). 50 pI razblaženog seruma pomešano je u patroni za obradu sa 200ul MagNA Pure 96 eksternim puferom za lizu (Roche, kat. Br. 06374913001) i inkubirano 10 minuta. Zatim je DNK ekstrahovana pomoću "MagNA Pure 96 DNK i kompleta Viral Nucleic Acid Small Volume" (Roche, kat. Br. 06543588001) i protokola "Viral NA Plasma SV external lysis 2.0". Volumen DNK elucije bio je 50µl.
Kvantifikacija ekstrahirane HBV DNK izvedena je pomoću Taqman qPCR mašine (ViiA7, life technologies). Svaki uzorak DNK testiran je u duplikatu u PCR-u. 5 µl uzorka DNK je dodato u 15 µl PCR mastermiksa koji sadrži 10 µl TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Kat. Br. 4369016), 0,5 µl PrimeTime XL qPCR prajmera/sonde (IDT) i 4,5 µl destilirane vode na ploči sa 384 bunarčića, i PCR je izveden pomoću sledećih postavki: UDG inkubacija (2min, 50 °C), enzimsko aktiviranje (10min, 95 °C) i PCR (40 ciklusa uz 15 sek., 95 ° za denaturaciju i 1min, 60 °C za topljenje i produženje). Brojevi kopija DNK izračunati su iz Ctvrednosti zasnovanih na standardnoj HBV plazmid DNK krivoj pomoću ViiA7 softvera.
Sekvence za TaqMan primere i sonde (IDT):
Prednji jedreni prajmer (F3_core): (SEQ ID NO: 784) Obrnuti prajmer
785)
1
Taqmanova sonda (P3_core): 56-FAM/ /ZEN/
Tabela 21: Nivoi HBV-DNK, HBsAg i HBeAg u serumu miševa AAV/HBV nakon tretmana GalNAc konjugovanim PD-L1 antisense oligonukleotidom.
Iz ove studije se može videti da GalNAc konjugovani PD-L1 antisense oligonukleotid CMP NO759_2 ima značajno delovanje na smanjenje nivoa HBV-DNK, HBsAg i HBeAg u serumu nakon 6 nedelja lečenja, a i delovanje koje se zadržava najmanje 2 nedelje nakon završetka lečenja.
Primer 8 - In vitro nokdaun PD-L1 u humanim primarnim hepatocitima upotrebom GalNAc konjugovanih PD-L1 oligonukleotida
Sposobnost GalNAc konjugovanih PD-L1 antisense oligonukleotidnih jedinjenja da smanje PD-L1 transkript u primarnim humanim hepatocitima istraživana je pomoću genomike.
Ćelijska kultura
Kriokonzervisani humani hepatociti suspendovani su u WME, dopunjeni sa 10 %
1 1
fetalnog telećeg seruma, sa penicilinom (100 U/ml), streptomicinom (0,1 mg/ml) i L-glutaminom (0,292 mg/ml) pri gustini od približno 5x10<6>ćelija/ml, i zasejani su na ploče obložene kolagenom sa 24 bunarčića (Becton Dickinson AG, Allschwil, Švajcarska) pri gustini od 2 x 10<5>ćelija/bunarčić. Ćelije su prethodno kultivisane tokom 4 sata što je omogućilo vezivanje za ploče sa ćelijskim kulturama pre početka tretmana oligonukleotidima u konačnoj koncentraciji od 100 µM. Korišteni oligonukleotidi prikazani su u tabeli 21 i tabeli 8, placebo je bilo PBS. Podloga za setvu zamenjena je sa 315 µl WME bez seruma (dopunjenog penicilinom (100 U/ml), streptomicinom (0,1 mg/ml), L-glutaminom (0,292 mg/ml)), i 35 µl 1 mM esencijalnih rasvora oligonukleotida u PBS-u je dodano ćelijskoj kulturi i ostavljeno na ćelijama 24 sata ili 66 sati.
Priprema biblioteke
Profilisanje ekspresije transkripta izvedeno je pomoću Illumina Stranded mRNK hemije na platformi za sekvenciranje Illumina sa strategijom sekvenciranja od 2 x 51 bp uparenih očitavanja na kraju i minimalnom dubinom čitanja od 30M po uzorku (Q kvadrat EA). Ćelije su lizirane u bunarčićima dodavanjem 350 µl Qiagen RLT pufera i pristupilo im se kroz šemu randomizacije.
mRNK je pročišćena pomoću Qiagen RNeasy Mini Kit. mRNK je kvantifikovana i integritet je procenjen upotrebom Agilent bioanalizatora. Nakon početne procene kvaliteta izolovane RNK, uočeno je da su svi uzorci zadovoljavali ulaznu metriku kvaliteta od 100 ng sa RIN ocjenom > 7,0.
Biblioteke za sekvenciranje generisane su za sve uzorke korištenjem pripreme biblioteke Illumina TruSeq Stranded mRNK, počevši od 100 ng ukupne RNK. Konačne biblioteke cDNK analizirane su po raspodeli veličina i korištenjem Agilent bioanalizatora (DNK1000 komplet), kvantificirane sa qPCR (KAPA Library Quant Kit) i normalizovane na 2 nM u pripremi za sekvenciranje. Standardni komplet za generisanje klastera v5 korišten je za vezivanje biblioteka cDNK na protočnoj ćelijskoj površini i cBot izotermno za pojačavanje povezanih konstrukta cDNK do klonskih klastera od po ~ 1000 kopija. DNK sekvenca je određena tehnologijom sekvenciranja sintezom pomoću kompleta TruSeq SBS.
Obrada podataka
Očitavanja Illumina sekvenciranja uparenih krajeva dužine 2x51 bp su mapirana na humanom referentnom genomu hg19 pomoću GSNAP programa za kratko poravnavanje čitanja. Poravnanja u SAM formatu su pretvorena u datoteke sortiranog poravnanja BAM formata pomoću programa SAMTOOLS. Brojevi očitavanja gena procenjeni su za PD-L1 na osnovu obeležavanja egzona iz NCBI RefSeq, naznačenih u odgovarajućoj GTF datoteci za
1 2
hg19. Primenjen je korak normalizacije za različitu veličinu biblioteke svakog uzorka pomoću DESeq2 R paketa.
Smanjenje transkripta PD-L1 nakon inkubacije sa GalNAc konjugovanim PD-L1 antisense oligonukleotidnim jedinjenjima prikazano je u tabeli 22.
Tabela 22: Smanjenje PD-L1 transkripta u humanim primarnim hepatocitima nakon tretmana GalNAc konjugovanim oligonukleotidima, n = 4
1
Svih pet GalNAc konjugovanih antisense jedinjenja pokazalo je značajno smanjenje PD-L1 transkripta nakon 24 i 66 sati inkubacije u poređenju sa uzorcima tretiranim placebom.
Primer 9 - EC50 konjugovanih i golih PD-L1 antisense oligonukleotida u HBV zaraženim ASGPR-HepaRG ćelijama
Potentnost dva gola oligonukleotida i ekvivalentnog GalNAc konjugovanog PD-L1 antisense oligonukleotida poređena je u HBV inficiranim ASGPR-HepaRG ćelijama.
Ćelijska linija
HepaRG ćelije (Biopredic International, Saint-Gregoire, Francuska) uzgajane su u Williams E medijumu (dopunjenom sa 10 % dodatka za rast HepaRG (Biopredic). Iz ove ćelijske linije generisana je hentaRG ćelijska linija koja stabilno prekomerno eksprimira humane ASGPR1 i ASGPR2, lentivirusnim postupkom. Proliferirajuće HepaRG ćelije transdukovane su na MOI300 lentivirusom proizvedenim na zahtev Sirion biotech (CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro) koji kodira humane ASGPR1 i 2 pod kontrolom CMV promotora i gena za rezistenciju na puromicin. Transdukovane ćelije su birane tokom 11 dana sa 1µg/ml puromicina, a zatim održavane u istoj koncentraciji antibiotika kako bi se obezbedila stabilna ekspresija transgena. Prekomerna ekspresija ASGPR1/2 potvrđena je i na nivou mRNK pomoću RT-qPCR (ASGPR1: 8560 puta u odnosu na netransdukovane, ASGPR2: 2389 puta u odnosu na netransdukovane) i na nivou proteina analizom protočne citometrije.
Ćelije su diferencirane pomoću 1,8 % DMSO najmanje 2 nedelje pre infekcije. HBV genotip D je izveden iz supernatanta ćelijske kulture HepG2.2.15 i koncentrovan je PEG precipitacijom. Da bi se procenila aktivnost testnih jedinjenja na HBV, diferencirane ASGPR-HepaRG ćelije na pločama sa 96 bunarčića su zaražene HBV-om na MOI od 20 do 30 tokom 20 sati, pre nego što su ćelije isprane 4 puta PBS-om kako bi se uklonio HBV-
1 4
inokulum.
Potentnost oligonukleotida
Sledeći oligonukleotidi
dodani su HBV zaraženim ASGPR-HepaRG ćelijama 7. i 10. dana nakon infekcije u serijskim razređenjima od 25 µM do 0,4 nM (1:4 razređenja u PBS). Ćelije su sakupljene 13. dana nakon infekcije.
Ukupna mRNK je ekstrahovana pomoću kompleta MagNA Pure 96 Cellular RNK Large Volume na MagNA Pure 96 sistemu (Roche Diagnostics) prema uputama proizvođača. Za analizu ekspresije gena, RT-qPCR je izveden kako je opisano u primeru 5.
Podaci su analizirani postupkom 2^-ddct. ActinB je korišten kao endogena kontrola za izračunavanje dct vrednosti. Expresija PD-L1 je relativna na endogene kontrole i fiziološki rastvor.
EC50 proračuni su izvedeni u GraphPad Prism6 i prikazani u tabeli 23.
Tabela 23: EC50 u ASGPR-HepaRG HBV zaraženim ćelijama, n = 4.
Ovi podaci jasno pokazuju da GalNAc konjugacija PD-L1 antisense oligonukleotida značajno poboljšava EC50 vrednosti.
Primer 10 - Stimulacija funkcije T ćelija u PBMC izvedenim od hroničnih HBV pacijenata
Istraživano je mogu li gola PD-L1 antisense jedinjenja povećati funkciju T ćelija kod pacijenata koji su hronično inficirani HBV-om (CHB) nakon ex-vivo stimulacije HBV
1
antigenom mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC).
Smrznute PBMC od tri bolesnika sa hroničnom HBV zarazom su odmrznute i zasejane gustinom od 200000 ćelija/bunarčić u 100 µl medijuma (RPMI1640+GlutaMax 8 % humanog seruma 25mM hepesa 1 % PenStrep). Sledećeg dana ćelije su stimulisane sa 1µM PeµMix HBV velikim proteinom omotača ili 1 µM PeµMix HBV jedrenim proteinom (vidi tabelu 9) sa ili bez 5µM CMP ID NO: 466_1 ili CMP ID NO: 640_1 u 100 µl medijuma koji je sadržavao 100 µg/ml IL-12 i 5 ng/ml IL-7 (stimulacija konkanavalinom primenjena je samo 8. dana). Četiri dana kasnije tretman PD-L1 antisens oligonukleotidom obnovljen je pomoću medijuma koji je sadržavao 50 IU IL-2. Osmog dana nakon prve stimulacije, ćelije su ponovo stimulisane PeµMix-om ili 5µg/ml konkanavalinom A plus PD-L1 antisense oligonukleotidom tokom 24 sata. U poslednjih 5 sati stimulacije dodano je 0,1 µl Brefeldina A, 0,1 µl Monensina i 3 µl anti-humanog CD-107 (APC).
Nakon 24 sata ćelije su isprane puferom za bojenje (PBS 1 % BSA 0,09 % natrijum azida EDTA) i površinsko bojenje je primenjeno 30 minuta na 4 °C [antihumani CD3 (BV605), antihumani CD4 (FITC), antihumani CD8 (BV711), antihumani PDL1 (BV421), antihumani PD1 (PerCP-Cy5.5) i živo i mrtvo bojenje (BV510) (BD Biosciences)]. Ćelije su fiksirane u BD fiksacijskom puferu 15 minuta na 4 °C. Sledećeg jutra, ćelije su permeabilizirane sa BD Perm/Wash puferom 15 minuta na 4 °C, a unutarćelijsko bojenje je izvršeno 30 minuta na 4 °C [anti-humani INFγ (PE)]. Nakon pranja u Perm/Wash puferu, ćelije su rastvorene u 250µl pufera za bojenje.
FACS merenje je provedeno na BD Fortessa (BD Biosciences). Za analizu, cela ćelijska populacija prvo je izdvojena na žive ćelije (živo i mrtvo bojenje, BV510), a zatim na CD3+ (BV605) ćelije. CD3+ ćelije su zatim grafovane kao CD107a+ (APC) nasuprot IFNγ+ (PE).
Rezultati su prikazani u tabeli 24.
Tabela 24: Delovanje tretmana PD-L1 ASO na CD3+ T ćeliju od PBMC izolovanih od tri bolesnika hronično zaraženih HBV-om.
1
Iz ovih podataka se može videti da je stimulacija antigenom sama po sebi sposobna indukovati aktivaciju T ćelija (povećanje % CD3+ ćelija koje eksprimiraju INFγ i/ili CD107a) u PBMC-ima pacijenata sa CHB (n = 3). Dodavanje PD-L1 antisense oligonukleotida CMP466_1 ili 640_1 za rezultat je imalo dodatno povećanje odgovora CD3+ T ćelija. Ovaj porast uglavnom je primećen u grupi stimuliranoj HBV omotačem.
1
1
�
�
11
��
�
��
�
�
�
�
1
1
11
��
�
��
�
�
�
�
�
�
11
12
1
14
�
�
�
�
�
�
21
22
�
��
2
�
�
�
�
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4

Claims (20)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antisens oligonukleotid formule
pri čemu velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNA nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, svi LNA C su 5-metil citozin, a sve internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze.
2. Konjugat antisens oligonukleotida koji sadrži oligonukleotid prema zahtevu 1 i konjugovani ostatak koji je kovalentno vezan za navedeni oligonukleotid.
3. Konjugat antisens oligonukleotida prema zahtevu 2, pri čemu između oligonukleotida i konjugovanog dela prisutan je linker.
4. Konjugat antisens oligonukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili 3, pri čemu konjugovani ostatak je ostatak koji cilja asijaloglikoproteinske receptore .
5. Konjugat antisens oligonukleotida prema zahtevu 4, pri čemu ostatak koji cilja asijaloglikoproteinski receptor je trovalentni N-acetilgalaktozaminski (GalNAc) ostatak.
6. Konjugat antisens oligonukleotida prema bilo kojem od zahteva 3 do 5, pri čemu, linker je fiziološki labilni linker.
7. Konjugat antisens oligonukleotida prema zahtevu 6, pri čemu, fiziološki labilni linker je susceptibilan na nukleazu.
8. Konjugat antisens oligonukleotida prema zahtevu 6 ili 7, pri čemu fiziološki labilni linker sadrži citidin-adenozin dinukleotid.
9. Konjugat antisens oligonukleotida prema zahtevu 2, pri čemu između oligonukleotida i konjugovanog dela prisutan je linker; pri čemu nadalje konjugovani ostatak obuhvata ostatak koji cilja asijaloglikoproteinski receptor i koji je trovalentni N-acetilgalaktozaminski ostatak (GalNAc); pri čemu linker je fiziološki labilni linker; i pri čemu fiziološki labilni linker sadrži citidin-adenozin dinukleotid.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antisense oligonukleotid prema zahtevu 1 ili konjugat antisens oligonukleotida prema bilo kom od zahteva 2 do 9, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, rastvarač, nosač, so i/ili adjuvans.
11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, pri čemu farmaceutski prihvatljiv razređivač je sterilni fiziološki rastvor puferovan fosfatom.
12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu, farmaceutski prihvatljiva so je natrijum.
13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu, farmaceutski prihvatljiva so je kalijum.
14. In vitro postupak za moduliranje ekspresije PD-L1 u ciljnoj ćeliji koja eksprimira
4
PD-L1, pri čemu ovaj postupak obuhvata primenu na navedenoj ćeliji antisens oligonukleotida prema zahtevu 1, konjugata antisens oligonukleotida prema bilo kom od zahteva 2 do 9 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kom od zahteva 10 do 13 u delotvornoj količini.
15. Antisens oligonukleotid prema zahtevu 1, konjugat antisens oligonukleotida prema bilo kom od zahteva 2 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 10 do 13 za primenu u obnavljanju imunskog odgovora na virus.
16. Antisens oligonukleotid, konjugat antisens oligonukleotida ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 15, pri čemu naznačeni virus je HBV virus.
17. Antisens oligonukleotid prema zahtevu 1, konjugat antisens oligonukleotida prema bilo kom od zahteva 2 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 10 do 13 za primenu u obnavljanju imunskog odgovora na parazita.
18. Antisens oligonukleotid, konjugat antisens oligonukleotida ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 15 do 16, pri čemu obnavljanje imunskog odgovora podrazumeva povećanje u jetri CD8+ T ćelija specifičnih za jedan ili više HBV antigena u odnosu na kontrolu.
19. Antisens oligonukleotid prema zahtevu 1, konjugat antisens oligonukleotida prema bilo kom od zahteva 2 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 10 do 13 za upotrebu kao lek.
20. Antisens oligonukleotid prema zahtevu 1, konjugat antisens oligonukleotida prema bilo kom od zahteva 2 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 10 do 13 za upotrebu u lečenju HBV infekcije.
4
RS20210240A 2016-03-14 2017-03-14 Oligonukleotidi za smanjenje ekspresije pd-l1 RS61528B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16160149 2016-03-14
PCT/EP2017/055925 WO2017157899A1 (en) 2016-03-14 2017-03-14 Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
EP17710874.3A EP3430141B1 (en) 2016-03-14 2017-03-14 Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61528B1 true RS61528B1 (sr) 2021-04-29

Family

ID=58314191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210240A RS61528B1 (sr) 2016-03-14 2017-03-14 Oligonukleotidi za smanjenje ekspresije pd-l1

Country Status (30)

Country Link
US (5) US20170283496A1 (sr)
EP (2) EP3786297A1 (sr)
JP (4) JP6748219B2 (sr)
KR (5) KR20250065735A (sr)
CN (5) CN114736901B (sr)
AR (2) AR108038A1 (sr)
AU (4) AU2017235278C1 (sr)
CA (2) CA3013683C (sr)
CL (4) CL2018002570A1 (sr)
CO (1) CO2018007761A2 (sr)
CR (2) CR20180432A (sr)
DK (1) DK3430141T3 (sr)
ES (1) ES2857702T3 (sr)
HR (1) HRP20210315T1 (sr)
HU (1) HUE053172T2 (sr)
IL (5) IL296483B2 (sr)
LT (1) LT3430141T (sr)
MX (2) MX2018010830A (sr)
MY (1) MY194912A (sr)
PE (3) PE20230157A1 (sr)
PH (1) PH12018501964A1 (sr)
PL (1) PL3430141T3 (sr)
PT (1) PT3430141T (sr)
RS (1) RS61528B1 (sr)
RU (1) RU2747822C2 (sr)
SG (1) SG11201807854SA (sr)
SI (1) SI3430141T1 (sr)
TW (5) TWI794662B (sr)
UA (1) UA127432C2 (sr)
WO (1) WO2017157899A1 (sr)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2572826C2 (ru) 2008-12-02 2016-01-20 Чиралджен, Лтд. Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
AU2012284265B2 (en) 2011-07-19 2017-08-17 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
JP6453212B2 (ja) 2012-07-13 2019-01-16 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． キラル制御
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
RU2018106515A (ru) 2015-07-21 2019-08-21 Зе Чилдрен'С Медикал Сентер Корпорейшн Pd-l1-экспрессирующие гемопоэтические стволовые клетки и применения
KR20250065735A (ko) 2016-03-14 2025-05-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-l1 발현의 감소를 위한 올리고뉴클레오티드
EP3475424A1 (en) 2016-06-22 2019-05-01 ProQR Therapeutics II B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
WO2018024849A1 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 Aalborg Universitet ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOs) DESIGNED TO INHIBIT IMMUNE CHECKPOINT PROTEINS
US10941402B2 (en) 2016-09-01 2021-03-09 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified single-stranded RNA-editing oligonucleotides
CN110191952A (zh) 2016-10-07 2019-08-30 瑟卡尔纳制药有限公司 治疗癌症的新方法
WO2019060708A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Children's Medical Center Corporation TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS
UA126931C2 (uk) 2017-10-16 2023-02-22 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг МОЛЕКУЛИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ ДЛЯ ЗМЕНШЕННЯ РІВНЯ мРНК PAPD5 І PAPD7 ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙНОГО ГЕПАТИТУ B
SI3684377T1 (sl) 2017-10-20 2023-05-31 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Postopki zdravljenja okužbe s hepatitisom B
EA202091693A1 (ru) 2018-01-12 2021-04-14 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антисмысловые олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на альфа-синуклеин, и их применения
BR112020013994A2 (pt) 2018-01-12 2020-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Oligonucleotídeos antissenso que direcionam alfa-sinucleína e seus usos
GB201808146D0 (en) 2018-05-18 2018-07-11 Proqr Therapeutics Ii Bv Stereospecific Linkages in RNA Editing Oligonucleotides
MX2020013930A (es) 2018-06-22 2021-03-09 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion del canal de sodio dependiente de voltaje alfa subunidad 9 (scn9a).
WO2020007772A1 (en) * 2018-07-02 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting gbp-1
WO2020011653A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting kynu
EP4512407A3 (en) 2018-07-13 2025-09-24 F. Hoffmann-La Roche AG Oligonucleotides for modulating rtel1 expression
US20210380978A1 (en) * 2018-10-15 2021-12-09 The Brigham And Women`S Hospital, Inc. The long non-coding RNA INCA1 and Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1 (HNRNPH1) as therapeutic targets for immunotherapy
WO2020178258A1 (en) * 2019-03-05 2020-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Intracellular targeting of molecules
US20220177894A1 (en) 2019-04-02 2022-06-09 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
JP2022532998A (ja) * 2019-04-26 2022-07-21 ストーク セラピューティクス，インク． 選択的イントロンのスプライシングを調節するための方法及び組成物
AU2020269886A1 (en) 2019-05-03 2021-12-02 Secarna Pharmaceuticals Gmbh & Co. Kg PD-L1 antisense oligonucleotides for use in tumor treatment
CN114901821A (zh) * 2019-12-19 2022-08-12 豪夫迈·罗氏有限公司 Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
JP2023506550A (ja) * 2019-12-19 2023-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのｓｂｄｓ阻害剤の使用
EP4077672A1 (en) * 2019-12-20 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Enhanced oligonucleotides for inhibiting scn9a expression
CN114828852A (zh) * 2019-12-24 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗hbv的靶向hbv的抗病毒药剂和/或免疫调节剂的药物组合
WO2021173812A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Aligos Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting pd-l1
CA3190794A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Soren Ottosen Oligonucleotide treatment of hepatitis b patients
CN114507663A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 寡核苷酸及其在抗乙型肝炎和丁型肝炎病毒中的应用
TW202246500A (zh) * 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
CN115216474B (zh) * 2021-04-15 2025-09-30 武汉大学 促进pd-l1外显子3跳跃的反义寡核苷酸及其应用
JP2024528270A (ja) * 2021-08-04 2024-07-26 ヘパジーン セラピューティクス（エイチケー）リミティド 治療活性剤の送達のためのリガンド共役体
CN113789324B (zh) * 2021-08-17 2023-08-25 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种aie探针及其制备方法与在荧光定量pcr方法中的应用
CA3234478A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 Souphalone LUANGSAY Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
WO2024011109A2 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treatment of achromotopsia
CN116597936A (zh) * 2023-01-30 2023-08-15 溪砾科技(深圳)有限公司 一种识别mRNA非翻译区药物作用靶点的方法、装置及计算机可读存储介质
CN121488037A (zh) * 2023-07-20 2026-02-06 上海舶望制药有限公司 用于抑制pd-l1表达的组合物和方法

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
WO1993007883A1 (en) 1991-10-24 1993-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
RU2123528C1 (ru) * 1990-11-08 1998-12-20 Чирон Корпорейшн Способ получения белков hcv, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, асиалогликопротеин (варианты), композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе (варианты), способ очистки асиалогликопротеина и способ понижения содержания или элиминации hcv
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
PT804456E (pt) 1994-10-06 2003-01-31 Peter Eigil Nielsen Conjugados de acidos nucleicos dos peptidos
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
IL132941A0 (en) 1997-05-21 2001-03-19 Univ Leland Stanford Junior Composition and method for enhancing transport across biological membranes
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
CZ296576B6 (cs) 1999-02-12 2006-04-12 Sankyo Company Limited Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US20060276422A1 (en) 2001-05-18 2006-12-07 Nassim Usman RNA interference mediated inhibition of B7-H1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2005007855A2 (en) 2003-07-14 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF B7-H1 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
ES2350687T3 (es) * 2002-07-03 2011-01-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Composiciones de inmunopotenciación.
US9045518B2 (en) 2002-11-18 2015-06-02 Santaris Pharma A/S Amino-LNA, thio-LNA and alpha-L-oxy-LN
HUE042261T2 (hu) 2003-06-12 2019-06-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Gén kikapcsolásra alkalmas konzervált HBV és HCV szekvenciák
DE60319354T2 (de) 2003-07-11 2009-03-26 Lbr Medbiotech B.V. Mannose-6-Phosphat Rezeptor vermittelter Gentransfer zu Muskelzellen
ES2671893T3 (es) * 2004-10-06 2018-06-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 y PD-1 en el tratamiento del carcinoma de células renales
ZA200703482B (en) * 2004-10-06 2008-09-25 Mayo Foundation B7-H1 and methods of diagnosis, prognosis, and treatment of cancer
US20120122801A1 (en) 2005-01-05 2012-05-17 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
CN101355965A (zh) 2005-06-08 2009-01-28 达纳－法伯癌症研究院 通过抑制程序性细胞死亡1（pd-1）途经治疗持续性感染和癌症的方法及组合物
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
EP2023940B1 (en) 2006-05-05 2011-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of sglt2
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
CN103536915A (zh) 2006-12-27 2014-01-29 埃默里大学 用于治疗传染病和肿瘤的组合物和方法
WO2008113832A2 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S SHORT RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF TARGET mRNA
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CA2692579C (en) 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
DK2285819T3 (da) 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
CA2744449C (en) 2008-11-28 2019-01-29 Emory University Methods for the treatment of infections and tumors
AU2009333580B2 (en) * 2008-12-09 2016-07-07 Genentech, Inc. Anti-PD-L1 antibodies and their use to enhance T-cell function
US9181525B2 (en) * 2009-03-06 2015-11-10 Mie University Method for enhancing a function of a T cell
CN102459596B (zh) * 2009-05-06 2016-09-07 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
KR101704988B1 (ko) * 2009-05-28 2017-02-08 큐알엔에이, 인크. 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
CA2792561C (en) * 2010-04-06 2021-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene
US8765708B2 (en) * 2010-05-18 2014-07-01 Kevin Petrecca Method for reducing expression of downregulated in renal cell carcinoma in malignant gliomas
EP2580228B1 (en) 2010-06-08 2016-03-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2'-amino and 2'-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2012024170A2 (en) 2010-08-17 2012-02-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
LT3124610T (lt) 2010-10-28 2019-08-12 Benitec Biopharma Limited Hbv gydymas
EP2652134B1 (en) 2010-12-17 2017-03-01 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for sirna
ES2605990T3 (es) 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
PH12019502377A1 (en) 2011-04-21 2022-11-14 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
HRP20181564T1 (hr) 2011-06-30 2018-11-30 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Pripravci i postupci za inhibiciju ekspresije gena virusa hepatitisa b
AU2012284265B2 (en) 2011-07-19 2017-08-17 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
EP3453761A1 (en) 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
CN104136451A (zh) 2011-09-07 2014-11-05 玛瑞纳生物技术有限公司 具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途
WO2013049307A2 (en) 2011-09-30 2013-04-04 University Of Miami Enhanced immune memory development by aptamer targeted mtor inhibition of t cells
HUE059406T2 (hu) * 2011-10-17 2022-11-28 Io Biotech Aps PD-L1 alapú immunterápia
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
JP2016528873A (ja) 2012-05-16 2016-09-23 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法
CA2873766A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating atp2a2 expression
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
US10077443B2 (en) 2012-11-15 2018-09-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
KR102291355B1 (ko) 2012-11-30 2021-08-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-l1 억제제 공동치료를 필요로 하는 환자의 식별방법
WO2014118272A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
CN104955952A (zh) * 2013-01-30 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Lna寡核苷酸碳水化合物缀合物
DK2991656T3 (da) 2013-05-01 2020-03-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af apolipoprotein c-iii-ekspression
ES2770667T3 (es) 2013-06-27 2020-07-02 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligómeros antisentido y conjugados que se dirigen a PCSK9
WO2015114146A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Sividon Diagnostics Gmbh Method for predicting the response to an anti-her2 containing therapy and/or chemotherapy in patients with breast cancer
US20170224777A1 (en) 2014-08-12 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine
WO2016055601A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
WO2016138278A2 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting checkpoint gene expression and uses thereof
GB201507926D0 (en) * 2015-05-08 2015-06-24 Proqr Therapeutics N V Improved treatments using oligonucleotides
US10577388B2 (en) * 2015-10-02 2020-03-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
MX378999B (es) 2015-11-16 2025-03-10 Hoffmann La Roche Fosforamidita de agrupacion de n-acetilgalactosamina (galnac).
WO2017100587A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting programmed cell death 1 ligand 1 (pd-l1) and methods of use thereof
KR20250065735A (ko) 2016-03-14 2025-05-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-l1 발현의 감소를 위한 올리고뉴클레오티드
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017235278A1 (en) 2018-08-09
CN114717235A (zh) 2022-07-08
TWI790485B (zh) 2023-01-21
IL317818A (en) 2025-02-01
TWI840950B (zh) 2024-05-01
MX2022012221A (es) 2022-10-27
CN114736901A (zh) 2022-07-12
JP2019512498A (ja) 2019-05-16
JP2022034059A (ja) 2022-03-02
CR20180432A (es) 2018-11-21
IL290294B (en) 2022-10-01
US10829555B2 (en) 2020-11-10
US20170283496A1 (en) 2017-10-05
KR20220100095A (ko) 2022-07-14
AU2017235278C1 (en) 2022-03-10
IL296483B1 (en) 2023-06-01
AR118719A2 (es) 2021-10-27
US11466081B2 (en) 2022-10-11
IL290294B2 (en) 2023-02-01
JP7002603B2 (ja) 2022-02-10
MX2018010830A (es) 2019-02-07
KR20230136689A (ko) 2023-09-26
PE20181892A1 (es) 2018-12-11
IL303077B1 (en) 2025-02-01
JP2024029180A (ja) 2024-03-05
CR20200119A (es) 2021-04-19
HUE053172T2 (hu) 2021-06-28
AU2017235278A8 (en) 2018-08-16
KR20210120131A (ko) 2021-10-06
KR20180120702A (ko) 2018-11-06
IL303077A (en) 2023-07-01
LT3430141T (lt) 2021-03-25
TW202128998A (zh) 2021-08-01
SI3430141T1 (sl) 2021-04-30
RU2747822C2 (ru) 2021-05-14
CN114736900A (zh) 2022-07-12
CA3120687A1 (en) 2017-09-21
SG11201807854SA (en) 2018-10-30
TWI721128B (zh) 2021-03-11
CL2018002570A1 (es) 2018-12-28
IL296483B2 (en) 2023-10-01
IL290294A (en) 2022-04-01
US12552862B2 (en) 2026-02-17
CA3013683C (en) 2021-07-13
CN114085836B (zh) 2024-01-26
US20210147535A1 (en) 2021-05-20
RU2018134379A (ru) 2020-04-15
PL3430141T3 (pl) 2022-02-28
CN114736900B (zh) 2024-05-10
EP3786297A1 (en) 2021-03-03
CN108779465B (zh) 2022-05-13
RU2018134379A3 (sr) 2020-06-23
AU2017235278B2 (en) 2021-11-11
JP6748219B2 (ja) 2020-08-26
EP3430141A1 (en) 2019-01-23
TW202128997A (zh) 2021-08-01
PE20201499A1 (es) 2020-12-29
KR102306797B1 (ko) 2021-10-05
TW202328448A (zh) 2023-07-16
KR102580776B1 (ko) 2023-09-20
ES2857702T3 (es) 2021-09-29
AU2021236439A1 (en) 2021-10-14
JP2020172488A (ja) 2020-10-22
CN114736901B (zh) 2024-05-31
TW201734209A (zh) 2017-10-01
JP7791222B2 (ja) 2025-12-23
CL2020000865A1 (es) 2020-08-28
US20230331837A1 (en) 2023-10-19
UA127432C2 (uk) 2023-08-23
KR102417646B1 (ko) 2022-07-07
US10745480B2 (en) 2020-08-18
EP3430141B1 (en) 2020-12-30
US20200048344A1 (en) 2020-02-13
IL303077B2 (en) 2025-06-01
CO2018007761A2 (es) 2018-08-10
AU2022202479A1 (en) 2022-05-12
IL296483A (en) 2022-11-01
CA3013683A1 (en) 2017-09-21
CL2020001126A1 (es) 2020-08-28
DK3430141T3 (da) 2021-03-01
KR102805002B1 (ko) 2025-05-09
BR112018068410A2 (pt) 2019-01-15
NZ744548A (en) 2024-05-31
PE20230157A1 (es) 2023-02-01
MY194912A (en) 2022-12-22
WO2017157899A1 (en) 2017-09-21
AU2022202479B2 (en) 2025-03-20
JP7447073B2 (ja) 2024-03-11
IL260759B (en) 2022-03-01
TW202428874A (zh) 2024-07-16
PH12018501964A1 (en) 2019-06-24
HRP20210315T1 (hr) 2021-04-16
PT3430141T (pt) 2021-02-25
AU2024203581A1 (en) 2024-06-20
CN114085836A (zh) 2022-02-25
KR20250065735A (ko) 2025-05-13
AU2021236439B2 (en) 2022-06-16
AR108038A1 (es) 2018-07-11
TWI794662B (zh) 2023-03-01
CL2020001127A1 (es) 2020-08-28
US20200247884A1 (en) 2020-08-06
CN108779465A (zh) 2018-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7791222B2 (ja) Ｐｄ－ｌ１発現低減用のオリゴヌクレオチド
US20250319114A1 (en) NUCLEIC ACID MOLECULE FOR REDUCTION OF PAPD5 AND PAPD7 mRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION
RU2835926C1 (ru) Олигонуклеотиды для понижения экспрессии pd-l1
HK40077444A (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
HK40077417A (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
HK40077445A (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
HK40064608A (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
HK1263057A1 (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
HK1263057B (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
BR112018068410B1 (pt) Oligonucleotídeos para redução da expressão de pd-l1