RS62047B1 - Imunosupresivni agensi i njihova upotreba u terapiji - Google Patents

Imunosupresivni agensi i njihova upotreba u terapiji

Info

Publication number
RS62047B1
RS62047B1 RS20210577A RSP20210577A RS62047B1 RS 62047 B1 RS62047 B1 RS 62047B1 RS 20210577 A RS20210577 A RS 20210577A RS P20210577 A RSP20210577 A RS P20210577A RS 62047 B1 RS62047 B1 RS 62047B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
agent
peptide
pcna
composition
Prior art date
Application number
RS20210577A
Other languages
English (en)
Inventor
Marit Otterlei
Original Assignee
Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu filed Critical Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu
Publication of RS62047B1 publication Critical patent/RS62047B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na nove agense, naročito njihove peptide ili mimetike, i njihove kodirajuće nukleinske kiseline, farmaceutske kompozicije koje obuhvataju najmanje jedan od pomenutih agenasa i njihovu upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta koja je izazvana oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi. Ti agensi mogu biti korisni sami ili u kombinaciji sa drugim terapijski aktivnim jedinjenjima, kao što su imunosupresivna jedinjenja, antizapaljenjska jedinjenja, antimikrobna jedinjenja itd. Takva jedinjenja mogu, na primer, biti antagonisti ili inhibitori puteva prenosa signala, naročito signalni putevi toličnih receptora, kao što su antagonisti toličnih receptora i/ili inhibitori protein kinaze. Opisani su i terapijski postupci koji obuhvataju korišćenje pomenutih agenasa za gorepomenute upotrebe. Ti agensi mogu se koristiti i u proizvodnji ili pripremi medikamenata za gorepomenute terapije.
[0002] APIM peptidi predstavljaju grupu peptida koji stupaju u interakciju sa PCNA (proliferišućim ćelijskim nuklearnim antigenom) pomoću novog motiva koji stupa u interakciju sa PCNA (Gilljam et al., 2009. Identification of a novel, widespread, and functionally important PCNA-binding motif, J. Cell Biol.
186(5), pp.645-654). Taj motiv se zove APIM (AlkB homolog 2 (hABH2) motiv koji stupa u interakciju sa PCNA) jer je prvi put identifikovan kao medijator interakcije između hABH2 i PCNA, ali će nakon čitanja otkrivanja u nastavku biti jasno da su APIM motivi sada identifikovani u širokom opsegu proteina.
Obično se PCNA vezujući motiv pronađen u APIM peptidima definiše pomoću konsenzus sekvence, [R/K]-[F/W/Y]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO:19).
[0003] PCNA je član porodice proteina klizećih stega, za koju se zna da je uključena i u replikaciju DNK kao i u popravku DNK. Glavna funkcija PCNA je da obezbedi replikativne polimeraze visoke procesivnosti koje su potrebne za duplikaciju genoma. U živim ćelijama S-faze, PCNA obeležena zelenim fluorescentnim proteinom (GFP) formira različita žarišta koja predstavljaju mesta replikacije. Zbog toga se može koristiti kao marker S-faze.
[0004] Brojni proteini koji su uključeni u ćelijske procese kao što su popravka DNK, sklapanje hromatina, epigenetsko i hromatinsko remodelovanje, kohezija sestre hromatida, kontrola i preživljavanje ćelijskog ciklusa nalaze se u takozvanim fabrikama za replikaciju koje sadrže više od dvanaest replikacionih viljuški. Mnogi od ovih proteina stupaju u interakciju sa PCNA i pokazalo se da se zajedno lokalizuju sa PCNA u žarištima replikacije. Naročito je poznato da su proteini koji stupaju u interakciju sa PCNA uključeni u popravku DNK i replikaciju i ćelijsku proliferaciju. Stoga, razni proteini stupaju u interakciju sa PCNA i smatra se da su mnoge od ovih interakcija posredovane konzerviranom peptidnom sekvencom koja stupa u interakciju sa PCNA, koja se naziva PIP-kutija (QxxL/I/MxxF/DF/Y [SEQ ID NO: 1205]), u kojoj x može biti bilo koja aminokiselina. Međutim, peptidi koji sadrže PIP-kutiju obično su ekstremno citotoksični i zbog toga nisu pogodni za upotrebu u terapiji.
[0005] Međutim, pokazalo se da su APIM peptidi korisni u terapiji. Konkretno su se APIM peptidi pokazali kao efikasni u senzibilizovanju ćelija na citotoksične i citostatičke agense, naročito agense koji oštećuju DNK (WO 2009/104001) i zapravo kao citotoksični agens koji samostalno izaziva apoptozu (Müller et al., 2013. Targeting Proliferating Cell Nuclear Antigen and Its Protein Interactions Induces Apoptosis in Multiple Myeloma Cells, PLOS One, 8(7), e70430, pp.1-12). Samim tim su se APIM peptidi pokazali kao korisni u kombinaciji sa citotoksičnim i/ili citostatičkim agensima u lečenju poremećaja ili stanja u kom je poželjno inhibirati rast ćelija ili u lečenju koje uključuje citostatičku terapiju, tj. sprečavanje ili inhibiciju neželjene proliferacije ćelija.
[0006] PCNA se pokazao kao ključni regulator preživljavanja neutrofila, a ciljanje PCNA u ovim ćelijama predloženo je za lečenje zapaljenjskih bolesti zavisnih od neutrofila (De Chiara et al., 2012, Frontiers in Immunology, Vol.3, Article 311 i WO 2011/104309). Neutrofili proizvode razne citokine i smatra se da igraju važnu ulogu u raznim stanjima (Cassatella et al., 1997, Annals of the New York Academy of Sciences, vol.832, pp.233-242).
[0007] Tokom rada koji je doveo do ovog pronalaska, utvrđeno je da je PCNA prisutan u citozolu u nekim tipovima ćelija, naročito terminalno diferenciranim ćelijama, u kojima se smatra da on stupa u interakciju sa raznim citozolnim polipeptidima u regulaciji apoptoze, npr. putem kaspaza. Shodno tome, ne očekuje se da je PCNA prisutan u citozolu neproliferišućih ćelija, naročito ćelija koje nisu terminalno diferencirane.
[0008] Međutim pronalazači su iznenađujuće otkrili da APIM peptidi imaju efekat na neproliferišuće ćelije. Pored toga, pronalazači su utvrdili da se APIM peptidi mešaju sa proteinskim interakcijama između proteina uključenih u razne puteve prenosa signala, naročito puteve prenosa signala toličnih receptora. Kao što je detaljnije prikazano u primerima, pronalazači su utvrdili da APIM peptidi mogu smanjiti oslobađanje prozapaljenjskih citokina iz neproliferišućih imunih ćelija, npr. imunih ćelija koje nisu terminalno diferencirane, kao što su monociti, bez izazivanja apoptoze.
[0009] Tolični receptori (TLR) obrazuju jednu od glavnih klasa transmembranskih receptora za prepoznavanje obrazaca (PRR). U tom smislu, ćelije urođenog imunog sistema prepoznaju molekulske obrasce povezane sa patogenom (PAMP) putem PRR. Kod ljudi je identifikovano deset različitih TLR koji prepoznaju razne PAMP.
[0010] TLR1, 2, 4, 5 i 6 su lokalizovani na ćelijskoj površini i detektuju uglavnom komponente bakterijskog ćelijskog zida, kao što je lipopolisaharid (LPS) iz gram negativnih bakterija. TLR4 prepoznaje LPS. TLR3, 7, 8 i 9 se lokalizuju na intracelularnim delovima vezanim za membranu, uključujući endolizozome, gde oni prepoznaju virusne i bakterijske nukleinske kiseline. TLR3 prepoznaje dvolančanu RNK (dsRNK) iz virusa i sintetičku dsRNK analognu poliinoziničnu-policitidiličnu kiselinu (polylC).
[0011] Kada se aktiviraju, PRR indukuju intracelularne puteve prenosa signala koji dovode do ekspresije i sekrecije citokina i hemokina, koji funkcionišu tako da koordiniraju imuni odgovor u odbrani domaćina od mikrobnih patogena.
[0012] Po vezivanju liganda, TLR regrutuju glavne adaptorske proteine MyD88 i/ili TRIF i aktiviraju puteve prenosa signala koji pokreću ekspresiju i sekreciju citokina potrebnih da se izazove imuni odgovor. Svi TLR osim TLR3 koriste MyD88-zavistan put. Aktivacija MyD88 puta izaziva proizvodnju zapaljenjskih citokina putem transkripcionog faktora NF-κB i mitogen-aktiviranih protein kinaza (MAPK). I TLR3 i TLR4 regrutuju adaptorski TRIF i izazivaju interferone tipa I (IFN) putem transkripcionog faktora IRF3. Pored toga, TRIF aktivira NF-κB i MAPK.
[0013] TLR signaliziranje aktivira i fosfatidilinozitid 3-kinazu (PI3K)/Akt put. Ukazano je da je PI3K/Akt dejstvo potrebno za punu aktivaciju IRF3 u TRIF-zavisnom putu tokom TLR3 i 4 signaliziranja. Pored TLR3, citozolni receptori uključujući RIG-1, MDA5 i PKR takođe prepoznaju dsRNK i posreduju u antivirusnim odgovorima preko signalnih puteva sličnih TLR.
[0014] Dakle, razni signalni putevi su uključeni u koordinisanje odgovora urođenog ćelijskog imunog odbrambenog sistema, koji je centralan za preživljavanje mikrobnih i parazitskih izazova. Ovaj sistem je takođe relevantan za upravljanje devijantnim ćelijama nakon virusnih infekcija i kod autoimunih bolesti. Sistem koristi citokine i hemokine kako bi komunicirao i koordinirao imune odgovore, a ovi signali su izuzetno važni u kontrolisanju lokalnih i sistemskih odgovora. Međutim, citokini i hemokini su povezani sa raznim bolestima i poremećajima, obično zbog abnormalnih nivoa ovih molekula, koji mogu da pokrenu neželjene odgovore in vivo. Na primer, prekomerna sekrecija citokina, kao što je u takozvanoj „citokinskoj olujiˮ, može imati ozbiljne neželjene efekte na zdravlje.
[0015] Citokini i hemokini su peptidni, proteinski ili glikoproteinski signalizirajući molekuli koji se u velikoj meri koriste u ćelijskoj komunikaciji. Pojmovi citokin i hemokin ovde se koriste jedan umesto drugog i obuhvataju velike i različite porodice molekula koji se u velikoj meri proizvode u telu. Dok su skoro sve nukleisane ćelije sposobne da proizvode citokine i hemokine, imune ćelije su naročito važan izvor citokina i hemokina. Imune ćelije mogu se, barem u izvesnoj meri, identifikovati i okarakterisati mešavinom citokina i hemokina koje one izlučuju jer to čini ključni deo njihove uloge u imunom sistemu.
[0016] Monociti predstavljaju tip imune ćelije (leukocit ili belo krvno zrnce) koje proizvodi koštana srž od prekursora hematopoetskih matičnih ćelija koji se nazivaju monoblasti. Monociti su neproliferišuće ćelije koje nisu terminalno diferencirane. Shodno tome, monociti se prevashodno nalaze u krvi i slezini, i obično čine između oko 3-8% leukocita u krvi. Ove ćelije imaju tendenciju da cirkulišu u krvotoku tokom oko jednog ili tri dana pre prelaska u tkiva u organizmu, gde se terminalno diferenciraju u različite tipove makrofaga, u zavisnosti od anatomske lokacije.
[0017] Monociti karakteristično prikazuju receptor CD14 na ćelijskoj površini, a takođe mogu eksprimirati i prikazivati receptor CD16 na površini ćelije. Ove ćelije su naročito povezane sa oslobađanjem prozapaljenjskih citokina i hemokina kao što su TNFa, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, BazniFGF, G-CSF, GM-CSF, INFγ, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-β, CCL5 i VEGF, naročito nakon stimulacije komponentama mikrobnih ćelija (kao što je LPS) i/ili virusa (kao što su dvolančane nukleinske kiseline). Monociti se često nalaze u veoma visokim nivoima kod subjekata sa ozbiljnim infekcijama, npr. u slučajevima sepse i septikemije, tamo gde se smatra da prekomerna proizvodnja citokina i hemokina doprinosi simptomima i komplikacijama povezanim sa ovim uslovima, npr. sindrom disfunkcije više organa (tj. nefunkcionisanje više organa).
[0018] Zapravo, nekontrolisano ili prekomerno oslobađanje citokina i/ili hemokina (npr. hipercitokinemija) iz imunih ćelija u krvi, kao što su monociti, povezano je sa raznim poremećajima. Na primer, smatra se da prekomerno oslobađanje prozapaljenjskih citokina i/ili hemokina predstavlja prevashodno primarnu vodeću silu bolesti i smrti koju uzrokuju infekcije Plasmodium falciparum, tj. malarija. Druge infektivne bolesti, uključujući bakterijske, gljivične i neke virusne infekcije (npr. grip, kao što je svinjski grip, ptičiji grip), mogu dovesti do prekomernog prozapaljenjskog oslobađanja citokina i/ili hemokina u krv. Takve infekcije mogu biti lokalne ili sistemske. Pored toga, alogenski transplantati tkiva mogu dovesti do bolesti kalem protiv domaćina, u kojoj imune ćelije proizvode prekomerne nivoe citokina i hemokina, kao što je TNFa.
[0019] Terapije za poremećaje uzrokovane, ili povezane sa, prekomernim oslobađanjem citokina i hemokina obično su fokusirane na inhibiciju određenih citokina i hemokina ili malih grupa povezanih citokina i hemokina. Na primer, terapije mogu da koriste konkretne vezujuće proteine, kao što su antitela ili rastvorljivi receptori, kako bi se neutralisali oslobođeni i neželjeni citokini i hemokini.
Alternativno se vezujući proteini ili antagonisti malih molekula mogu koristiti za blokiranje receptora citokina i hemokina da bi se sprečilo nishodno signaliziranje. Međutim, kombinacija takvih terapija može biti potrebna za suzbijanje viška nekoliko citokina i hemokina, a kombinovanje više terapijskih agenasa može biti skupo i može imati neželjene i nepredvidljive neželjene efekte. Dok se korišćenje kortikosteroida preporučuje za upotrebu kod subjekata koji pate od hipercitokinemije, postoje ograničeni dokazi da su takva lečenja efikasna. Dalje, dosadašnje terapije su se fokusirale na lečenje određenih tkiva, kao što su pluća, npr. lečenje COPD (hronične opstruktivne plućne bolesti), na primer, inhibiranjem G-CSF (granulocitnog faktora koji stimuliše kolonije).
[0020] Shodno tome, ostaje potreba za efikasnim terapijama pogodnim za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja uzrokovanih, ili povezanih sa, prekomernim oslobađanjem citokina i hemokina (npr. infektivnim bolestima), koje takođe imaju minimalne neželjene efekte.
[0021] Kao što je gore pomenuto, pronalazači su iznenađujuće zaključili da APIM peptidi mogu smanjiti oslobađanje prozapaljenjskih citokina i hemokina iz neproliferišućih imunih ćelija, npr. neterminalno diferenciranih imunih ćelija, kao što su monociti, bez izazivanja apoptoze. Stoga, pronalazači su utvrdili da APIM peptidi mogu funkcionisati putem opšteg mehanizma na neproliferišućim imunim ćelijama kako bi se inhibiralo (npr. snizilo, smanjilo, oslabilo itd.) oslobađanje citokina i/ili hemokina iz pomenutih ćelija, npr. kada te ćelije stimuliše bilo koja od različitih komponenti, npr. komponenti iz inficiranih tela (mikrobnih, virusnih i parazitskih), kao što je LPS ili dvolančana nukleinska kiselina.
[0022] Ova iznenađujuća otkrića navela su pronalazače da predlože nove terapijske upotrebe za APIM peptide, tj. peptide koji obuhvataju PCNA vezujući motiv, naime za upotrebu u lečenju stanja ili poremećaja povezanog sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, naročito stanja ili poremećaja povezanih sa prekomernim, neželjenim ili nekontrolisanim prozapaljenjskim oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, npr. infektivne bolesti ili infekcije ili bolesti ili stanja koje infekcija pogoršava ili uzrokuje.
[0023] Alternativno gledano, pronalazači predlažu upotrebu APIM peptida za lečenje ili sprečavanje prekomernog, neželjenog ili nekontrolisanog prozapaljenjskog oslobađanja citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi kod subjekta, npr. subjekta sa infektivnom bolešću ili infekcijom ili bolešću ili stanjem koje infekcija pogoršava ili uzrokuje.
[0024] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje agens, ili kompoziciju koja sadrži agens, za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta koja je izazvana oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, pri čemu pomenuti agens obuhvata:
(i) oligopeptidno jedinjenje koje obuhvata motiv koji stupa u interakciju sa PCNA i peptid koji prodire u ćelije (CPP),
pri čemu taj motiv koji stupa u interakciju sa PCNA predstavlja X1X2X3X4X5(SEQ ID NO: 2) i pri čemu je:
X1izabrano iz grupe koju čine arginin (R), lizin (K) i histidin (H);
X2izabrano iz grupe koju čine triptofan (W), fenilalanin (F) i tirozin (Y);
X3izabrano iz grupe koju čine leucin (L), izoleucin (I), valin (V), alanin (A), metionin (M), serin (S), treonin (T), asparagin (N), glutamin (Q) i cistein (C);
X4izabrano iz grupe koju čine valin (V), leucin (L), izoleucin (I), alanin (A), metionin (M), glicin (G), serin (S), treonin (T), asparagin (N), glutamin (Q), arginin (R), lizin (K), histidin (H) i cistein (C); i X5izabrano iz grupe koju čine arginin (R), lizin (K), histidin (H) i prolin (P); ili
(ii) molekul nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu koja kodira oligopeptidno jedinjenje iz (i).
[0025] U nekim načinima ostvarivanja, agens kao što je ovde definisan može se koristiti u kombinaciji sa jednim dodatnim aktivnim agensom ili više njih, npr. drugim terapijski aktivnim agensima, kao što su imunosupresivna jedinjenja, antizapaljenjska jedinjenja, antimikrobna jedinjenja, steroidi (npr. kortikosteroid), inhibitori kinaze (kao što su p38 MAPK inhibitori, PI3K inhibitori klase I) itd., kako bi se pojačao efekat agensa. Međutim, u nekim načinima ostvarivanja, agens kao što je ovde definisan može se koristiti sam, tj. kao jedini aktivni agens u kompoziciji i/ili leku.
[0026] Stoga, u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju (npr. farmaceutsku kompoziciju) kao što je ovde definisano za upotrebu u kombinaciji sa jednim dodatnim aktivnim agensom ili više njih, npr. terapijski aktivnim agensom, u lečenju hipercitokinemije kod subjekta koja je izazvana oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi.
[0027] Terapijski aktivni agens može biti, ali nije ograničen na, imunosupresivno jedinjenje, antizapaljenjsko jedinjenje, antimikrobno jedinjenje, steroid (npr. kortikosteroid) ili inhibitor kinaze (kao što je p38 MAPK inhibitor ili PI3K inhibitor klase I).
[0028] Lek može biti u obliku pojedinačne kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) koja obuhvata i agens kao što je ovde definisan i jedan dodatni aktivni agens ili više njih, npr. terapijski aktivni agens, ili može biti u obliku kompleta ili proizvoda koji ih sadrži za odvojeno (npr. istovremeno ili sekvencijalno) davanje.
[0029] Stoga, u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje proizvod ili komplet koji sadrži agens kao što je ovde definisan zajedno sa jednim dodatnim aktivnim agensom ili više njih, npr. terapijski aktivnim agensom, u obliku kombinovanog preparata za odvojenu, istovremenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta koja je izazvana oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi.
[0030] Oligopeptidno jedinjenje (npr. peptid) koje može stupati u interakciju sa PCNA kao što je ovde otkriveno može da sadrži ili obuhvata peptidni motiv (ili sekvencu) koja se uopšteno može definisati kao: X1X2X3X4X5(SEQ ID NO: 1), pri čemu:
X1predstavlja baznu aminokiselinu;
X2predstavlja aromatičnu aminokiselinu;
X3predstavlja nenaelektrisanu aminokiselinu izuzev aromatične aminokiseline, glicina (G) i prolina (P);
X4predstavlja bilo koju aminokiselinu izuzev prolina (P), kisele aminokiseline ili aromatične aminokiseline; i
X5predstavlja baznu aminokiselinu ili prolin (P).
[0031] Kako bi oligopeptidno jedinjenje, koje može stupati u interakciju sa PCNA, ili njegovom kodirajućom nukleinskom kiselinom, moglo da funkcioniše u upotrebama prema ovom pronalasku, to jedinjenje mora imati sposobnost ulaska u ćeliju, tj. prelaženja u citozol (citoplazmu) kroz ćelijsku membranu, i opciono u jednu drugu ćelijsku lokaciju ili više njih, npr. jezgro. Ovo se može postići stvaranjem oligopeptidnog jedinjenja koje obuhvata domen koji asistira prilikom prelaska jedinjenja kroz ćelijsku membranu, tj. stvaranjem fuzionog peptida ili himernog peptida (peptida obrazovanog od dvaju domena ili više njih koji se obično ne mogu naći u prirodi), koji obuhvata peptid koji prodire u ćelije (peptid unosa ili uvoza, ili domen transdukcije peptida). Fuzioni peptid (oligopeptidno jedinjenje) opciono može obuhvatati dalje sekvence za olakšavanje ciljanja peptida (tj. za usmeravanje na peptid) do određene supcelularne lokacije, npr. ciljanog peptida, signalnog peptida ili prelaznog peptida.
[0032] Kako oligopeptidno jedinjenje obuhvata motiv koji stupa u interakciju sa PCNA i peptid koji prodire u ćelije (CPP), biće očigledno da jedinjenje obuhvata najmanje 5 ostataka, a konačna veličina jedinjenja zavisiće od veličine i broja domena koji čine pomenuto jedinjenje, tj. motiv koji stupa u interakciju sa PCNA i CPP mogu se posmatrati kao domeni oligopeptidnog jedinjenja. Stoga se domen može posmatrati kao različiti deo (tj. sekvenca unutar peptidne sekvence pune dužine) oligopeptidnog jedinjenja koje se može dodeliti ili pripisati određenoj funkciji ili svojstvu.
[0033] Oligopeptidno jedinjenje za upotrebu u ovom pronalasku obuhvata najmanje 2 domena, tj. domen motiva koji stupa u interakciju sa PCNA i CPP. Međutim, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati dodatne domene koji mogu olakšati njegovu funkciju i/ili stabilnost, npr. mogućnost peptida da stupa u interakciju sa svojim ciljem, tj. PCNA ili ekvivalentnim proteinom. Stoga, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati najmanje 2, 3, 4 ili 5 domena, npr.6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 ili više domena. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati jedan domen veznik ili više njih, tj. domen koji pravi razmak između dva druga domena, tj. zauzima prostor između njih i povezuje dva domena oligopeptidnog jedinjenja. U daljim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati domen koji usmerava oligopeptidno jedinjenje na celularnu ili supcelularnu lokaciju, npr. signalni peptid (takođe poznat i kao ciljni ili tranzitni peptid), kao što je signalna sekvenca nuklearne lokalizacije (NLS). Opet u drugim načinima ostvarivanja, jedan domen veznik ili više njih mogu imati dodatnu funkciju, tj. domen veznika može funkcionisati i kao signalni peptid, npr. NLS.
Alternativno, u nekim načinima ostvarivanja domen signalnog peptida može funkcionisati kao domen veznika.
[0034] U primernom načinu ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati domen motiva koji stupa u interakciju sa PCNA, CPP i domen veznika. U daljem primernom načinu ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati i domen signalne sekvence nuklearne lokalizacije. Opet u drugom načinu ostvarivanja domen signalne sekvence nuklearne lokalizacije može funkcionisati kao domen veznika.
[0035] Dakle, videće se da u takvim načinima ostvarivanja, agens ovog pronalaska može biti u obliku konstrukta koji sadrži (tj. obuhvata) oligopeptidno jedinjenje koje obuhvata motiv koji stupa u interakciju sa PCNA kao što je ovde definisan, zajedno sa CPP i opciono dodatnim domenima. Samim tim ovaj pronalazak u ovom aspektu može obezbediti konstrukt koji obuhvata oligopeptidno jedinjenje koje može stupati u interakciju sa PCNA.
[0036] Kao što je prethodno naznačeno, utvrđeno je da ovde opisani PCNA motiv posreduje u interakciji oligopeptidnog jedinjenja (npr. peptida) ili proteina koji sadrži takav motiv sa PCNA. Stoga se jedinjenje utoliko može okarakterisati kao sposobno da stupa u interakciju sa PCNA, tj. oligopeptidna jedinjenja za korišćenje u upotrebama ovog pronalaska moraju biti kompetentni i/ili vešti molekuli koji stupaju u interakciju sa PCNA. PCNA protein koji se koristi za određivanje mogućnosti i/ili afiniteta interakcije oligopeptidnog jedinjenja:PCNA može biti od bilo kog pogodnog izvora, npr. PCNA iz bilo koje životinje, naročito sisara kao što je čovek, glodar (npr. miš, pacov), pas ili bilo koja druga nehumana životinja. U poželjnim načinima ostvarivanja, interakcija oligopeptidnog jedinjenja:PCNA se određuje, karakteriše ili ocenjuje pomoću humanog PCNA proteina.
[0037] Ta interakcija može biti direktna ili indirektna i može uključivati direktno vezivanje motiva za PCNA protein ili se motiv može vezati indirektno, na primer vezivanje može biti posredovano drugim molekulom. Ovo pozivanje na „koji stupa u interakciju sa PCNAˮ ili „koji se vezuje za PCNAˮ stoga može uključivati bilo koji oblik interakcije, i direktno i indirektno vezivanje.
[0038] Bilo koje pozivanje na „motivˮ u ovom tekstu trebalo bi označavati X1X2X3X4X5kao što je ovde definisano.
[0039] X1je izabrano iz grupe koju čine lizin (K), arginin (R) i histidin (H).
[0040] X2je izabrano iz grupe koju čine fenilalanin (F), triptofan (W) i tirozin (Y). U nekim načinima ostvarivanja, X2može biti izabrano od W i Y, F i Y ili F i W ili u konkretnim načinima ostvarivanja X2može biti F ili W ili Y.
[0041] Vezivanje motiva za PCNA može se u određenim načinima ostvarivanja poboljšati kada
X2predstavlja W ili Y. Stoga, u jednom načinu ostvarivanja, X2nije F. Međutim, kao što je prethodno naznačeno, u drugim načinima ostvarivanja može biti F.
[0042] X3je izabrano iz grupe koju čine leucin (L), izoleucin (I), valin (V), alanin (A) metionin (M), serin (S), treonin (T), glutamin (Q), aspargin (N) i cistein (C). Određenije, X3može biti izabrano od L, I, V, A, M, S ili T. Poželjno, X3nije N ili Q i/ili u određenim načinima ostvarivanja X3nije M, S i/ili T.
[0043] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, X3može biti izabrano od L, I, A, V, M, S i T, a poželjno od L, I, A, V, S i T.
[0044] U nekim načinima ostvarivanja, X3može biti hidrofobna, a poželjnije alifatična aminokiselina izabrana sa gornje liste. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, X3može biti izabrano od L, I, A, V, M, a poželjno od L, I, V i A.
[0045] X4je izabrano od L, I, V, A, M, S, T, Q, N, H, K, R, G ili C. U određenim načinima ostvarivanja X4nije C i/ili N ili Q. U određenim načinima ostvarivanja X4nije H, a poželjno X4nije R, K ili H. Opet u drugim načinima ostvarivanja X4nije S ili T. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, X4može biti izabrano od L, V, I, A, M, S, T i G, a poželjno od L, V, A, I, S i T.
[0046] U drugim načinima ostvarivanja, X4može biti hidrofobna aminokiselina, a poželjnije alifatična aminokiselina izabrana sa gornje liste ili G. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, X4može biti izabrano od L, I, A, V, M i G a poželjno od L, V, I i A.
[0047] X5je izabrano od K, R, H i P.
[0048] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja X5predstavlja baznu aminokiselinu izabranu od K, R i H.
[0049] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja X3i/ili X4predstavlja polarnu aminokiselinu izabranu sa gornje liste. Shodno tome, u određenim načinima ostvarivanja samo jedno od X3i X4predstavlja polarnu aminokiselinu izabranu sa gornje liste.
[0050] U nekim načinima ostvarivanja X4i/ili X5predstavlja baznu aminokiselinu izabranu sa gornje liste. Shodno tome, u određenim načinima ostvarivanja X5predstavlja baznu aminokiselinu izabranu sa gornje liste.
[0051] Funkcionalno ekvivalentna aminokiselina može se definisati kao aminokiselina koja se može koristiti kao susptituent u peptidu ili proteinu za konvencionalnu aminokiselinu bez značajnog uticaja na funkciju peptida ili proteina (ili aminokiselina za koju se ne očekuje da značajno pogađa ili menja funkciju peptida ili proteina), npr. aminokiselina koja ima slična strukturna i/ili hemijska svojstva kao konvencionalna aminokiselina. Stoga se može smatrati da funkcionalno ekvivalentna aminokiselina ima baznu strukturu standardne aminokiseline, sa nestandardnom ili nekonvencionalnom R-grupom koja je strukturno i/ili hemijski slična standardnoj R-grupi. R-grupa je poželjno strukturno slična standardnoj R-grupi aminokiseline koja se supstituiše.
[0052] Konvencionalna ili standardna aminokiselina predstavlja aminokiselinu koja se koristi in vivo kako bi se proizveo molekul polipeptida ili proteina, tj. proteinogenska aminokiselina. Drugim rečima, aminokiselinu sa standardnom ili konvencionalnom R-grupom ili aminokiselinu koja poseduje bočni lanac koji se kodira po standardnom genetičkom kodu, tj. „kodirane aminokiselineˮ.
[0053] Stoga, oligopeptidno jedinjenje za upotrebu u ovom pronalasku obuhvata motiv [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q/C]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K/C]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 2), pri čemu pomenuto oligopeptidno jedinjenje može stupati u interakciju sa PCNA.
[0054] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 3).
[0055] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 4).
[0056] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
1
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 5).
[0057] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T/R/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 6).
[0058] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 7).
[0059] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 8).
[0060] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 9).
[0061] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 10).
[0062] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[L/I/V/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 11).
[0063] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G]-[K/R] (SEQ ID NO: 12).
[0064] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/I/A/V/M/T]-[L/I/V/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 13).
[0065] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/V/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 14).
[0066] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/F]-[L/V/I/A/T]-[L/V/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 15).
[0067] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A]-[L/V/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 16).
[0068] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A/T]-[L/V/A/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 17).
[0069] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[F/Y]-[L/V/I/A]-[L/V/A/I/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 18).
[0070] U drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[F/W/Y]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO: 19).
[0071] Opet u drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[R/K]-[W/Y]-[L/V/I/A/S/T]-[L/V/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 20).
[0072] Opet u drugom načinu ostvarivanja motiv se može definisati kao:
[K]-[F/Y/W]-[L/V/I/A/T]-[L/V/A/I/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 21).
[0073] U nekim načinima ostvarivanja X1i X2predstavljaju RW, RF, KF, KW, RY ili KY.
[0074] U nekim načinima ostvarivanja X3i X4predstavljaju LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ, VM, TL, SL, IT, VT, LG, MA, ML, NL, QL, QI, TI, SI, AS, VS, SV, CA, IG, LR, VR, TK ili IR. U nekim načinima ostvarivanja X3i X4predstavljaju LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ ili VM. U nekim načinima ostvarivanja X3i X4predstavljaju LV, IV, SV, LS, AV, LG, LA, IR, LR, VR, AR, IK, LK, VK ili AK. U naročito poželjnim načinima ostvarivanja X3i X4predstavljaju LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS ili LT, poželjno LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA ili AI. Stoga, u određenim načinima ostvarivanja X3i X4nisu AG, AC, CC, NN, QQ, NQ, QN, TS, SS, ST ili TT.
[0075] U nekim načinima ostvarivanja X2i X3nisu FS ili FT.
[0076] U nekim načinima ostvarivanja X5predstavlja K.
Stoga, u poželjnom načinu ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje ima ili obuhvata sekvencu RWLVK (SEQ ID NO: 28). U drugim poželjnim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje ima ili obuhvata sekvencu izabranu od bilo koje ili više njih od: RWLLK (SEQ ID NO: 22); RFLLK (SEQ ID NO: 23); RYLLK (SEQ ID NO: 24); RWLLR (SEQ ID NO: 25); RFLLR (SEQ ID NO: 26); RYLLR (SEQ ID NO: 27); RWLVK (SEQ ID NO: 28); RFLVK (SEQ ID NO: 29); RYLVK (SEQ ID NO: 30); RWLVR (SEQ ID NO: 31); RFLVR (SEQ ID NO: 32); RYLVR (SEQ ID NO: 33); RWIVK (SEQ ID NO: 34); RFIVK (SEQ ID NO: 35); RYIVK (SEQ ID NO: 36); RWIVR (SEQ ID NO: 37); RFIVR (SEQ ID NO: 38); RYIVR (SEQ ID NO: 39); RWLSK (SEQ ID NO: 40); RFLSK (SEQ ID NO: 41); RYLSK (SEQ ID NO: 42); RWLSR (SEQ ID NO: 43); RFLSR (SEQ ID NO: 44); RYLSR (SEQ ID NO: 45); RWISK (SEQ ID NO: 46); RFISK (SEQ ID NO: 47); RYISK (SEQ ID NO: 48); RWISR (SEQ ID NO: 49); RFISR (SEQ ID NO: 50); RYISR (SEQ ID NO: 51); RWSVK (SEQ ID NO: 52); RFSVK (SEQ ID NO: 53); RYSVK (SEQ ID NO: 54); RWSVR (SEQ ID NO: 55); RFSVR (SEQ ID NO: 56); RYSVR (SEQ ID NO: 57); RWAVK (SEQ ID NO: 58); RFAVK (SEQ ID NO: 59); RYAVK (SEQ ID NO: 60); RWAVR (SEQ ID NO: 61); RFAVR (SEQ ID NO: 62); RYAVR (SEQ ID NO: 63); RWLGR (SEQ ID NO: 64); RFLGR (SEQ ID NO: 65); RYLGR (SEQ ID NO: 66); RWLGK (SEQ ID NO: 67); RFLGK (SEQ ID NO: 68); RYLGK (SEQ ID NO: 69); RWLAR (SEQ ID NO: 70); RFLAR (SEQ ID NO: 71); RYLAR (SEQ ID NO: 72); RWLAK (SEQ ID NO: 73); RFLAK (SEQ ID NO: 74); RYLAK (SEQ ID NO: 75); RWLTK (SEQ ID NO: 76); RFLTK (SEQ ID NO: 77); RYLTK (SEQ ID NO: 78); RWLTR (SEQ ID NO: 79); RFLTR (SEQ ID NO: 80); RYLTR (SEQ ID NO: 81); RWITK (SEQ ID NO: 82); RFITK (SEQ ID NO: 83); RYITK (SEQ ID NO: 84); RWITR (SEQ ID NO: 85); RFITR (SEQ ID NO: 86); RYITR (SEQ ID NO: 87); RWTVK (SEQ ID NO: 88); RFTVK (SEQ ID NO: 89); RYTVK (SEQ ID NO: 90); RWTVR (SEQ ID NO: 91); RFTVR (SEQ ID NO: 92); RYTVR (SEQ ID NO: 93); RWIRK (SEQ ID NO: 94); RFIRK (SEQ ID NO: 95); RYIRK (SEQ ID NO: 96); RWIRR (SEQ ID NO: 97); RFIRR (SEQ ID NO: 98); RYIRR (SEQ ID NO: 99); RWLRK (SEQ ID NO: 100); RFLRK (SEQ ID NO: 101); RYLRK (SEQ ID NO: 102); RWLRR (SEQ ID NO: 103); RFLRR (SEQ ID NO: 104); RYLRR (SEQ ID NO: 105); KWLLK (SEQ ID NO: 106); KFLLK (SEQ ID NO: 107); KYLLK (SEQ ID NO: 108); KWLLR (SEQ ID NO: 109); KFLLR (SEQ ID NO: 110); KYLLR (SEQ ID NO: 111); KWLVK (SEQ ID NO: 112); KFLVK (SEQ ID NO: 113); KYLVK (SEQ ID NO: 114); KWLVR (SEQ ID NO: 115); KFLVR (SEQ ID NO: 116); KYLVR (SEQ ID NO: 117); KWIVK (SEQ ID NO: 118); KFIVK (SEQ ID NO: 119); KYIVK (SEQ ID NO: 120); KWIVR (SEQ ID NO: 121); KFIVR (SEQ ID NO: 122); KYIVR (SEQ ID NO: 123); KWLSK (SEQ ID NO: 124); KFLSK (SEQ ID NO: 125); KYLSK (SEQ ID NO: 126); KWLSR (SEQ ID NO: 127); KFLSR (SEQ ID NO: 128); KYLSR (SEQ ID NO: 129); KWISK (SEQ ID NO: 130); KFISK (SEQ ID NO: 131); KYISK (SEQ ID NO: 132); KWISR (SEQ ID NO: 133); KFISR (SEQ ID NO: 134); KYISR (SEQ ID NO: 135); KWSVK (SEQ ID NO: 136); KFSVK (SEQ ID NO: 137); KYSVK (SEQ ID NO: 138); KWSVR (SEQ ID NO: 139); KFSVR (SEQ ID NO: 140); KYSVR (SEQ ID NO: 141); KWAVK (SEQ ID NO: 142); KFAVK (SEQ ID NO: 143); KYAVK (SEQ ID NO: 144); KWAVR (SEQ ID NO: 145); KFAVR (SEQ ID NO: 146); KYAVR (SEQ ID NO: 147); KWLGR (SEQ ID NO: 148); KFLGR (SEQ ID NO: 149); KYLGR (SEQ ID NO: 150); KWLGK (SEQ ID NO: 151); KFLGK (SEQ ID NO: 152); KYLGK (SEQ ID NO: 153); KWLAR (SEQ ID NO: 154); KFLAR (SEQ ID NO: 155); KYLAR (SEQ ID NO: 156); KWLAK (SEQ ID NO: 157); KFLAK (SEQ ID NO: 158); KYLAK (SEQ ID NO: 159); KWLTK (SEQ ID NO: 160); KFLTK (SEQ ID NO: 161); KYLTK (SEQ ID NO: 162); KWLTR (SEQ ID NO: 163); KFLTR (SEQ ID NO: 164); KYLTR (SEQ ID NO: 165); KWITK (SEQ ID NO: 166); KFITK (SEQ ID NO: 167); KYITK (SEQ ID NO: 168); KWITR (SEQ ID NO: 169); KFITR (SEQ ID NO: 170); KYITR (SEQ ID NO: 171); KWTVK (SEQ ID NO: 172); KFTVK (SEQ ID NO: 173); KYTVK (SEQ ID NO: 174); KWTVR (SEQ ID NO: 175); KFTVR (SEQ ID NO: 176); KYTVR (SEQ ID NO: 177); KWLRK (SEQ ID NO: 178); KFLRK (SEQ ID NO: 179); KYLRK (SEQ ID NO: 180); KWLRR (SEQ ID NO: 181); KFLRR (SEQ ID NO: 182); KYLRR (SEQ ID NO: 183); KWIRK (SEQ ID NO: 184); KFIRK (SEQ ID NO: 185); KYIRK (SEQ ID NO: 186); KWIRR (SEQ ID NO: 187); KFIRR (SEQ ID NO: 188); KYIRR (SEQ ID NO: 189); RWVVK (SEQ ID NO: 190); RFVVK (SEQ ID NO: 191); RYVVK (SEQ ID NO: 192); RWVVR (SEQ ID NO: 193); RFVVR (SEQ ID NO: 194); RYVVR (SEQ ID NO: 195); KWVVK (SEQ ID NO: 196); KFVVK (SEQ ID NO: 197); KYVVK (SEQ ID NO: 198); KWVVR (SEQ ID NO: 199); KFVVR (SEQ ID NO: 200); KYVVR (SEQ ID NO: 201); RWALK (SEQ ID NO: 202); RFALK (SEQ ID NO: 203); RYALK (SEQ ID NO: 204); RWALR (SEQ ID NO: 205); RFALR (SEQ ID NO: 206); RYALR (SEQ ID NO: 207); KWALK (SEQ ID NO: 208); KFALK (SEQ ID NO: 209); KYALK (SEQ ID NO: 210); KWALR (SEQ ID NO: 211); KFALR (SEQ ID NO: 212); KYALR (SEQ ID NO: 213); RWVLK (SEQ ID NO: 214); RFVLK (SEQ ID NO: 215); RYVLK (SEQ ID NO: 216); RWVLR (SEQ ID NO: 217); RFVLR (SEQ ID NO: 218); RYVLR (SEQ ID NO: 219); KWVLK (SEQ ID NO: 220); KFVLK (SEQ ID NO: 221); KYVLK (SEQ ID NO: 222); KWVLR (SEQ ID NO: 223); KFVLR (SEQ ID NO: 224); KYVLR (SEQ ID NO: 225); RWILK (SEQ ID NO: 226); RFILK (SEQ ID NO: 227); RYILK (SEQ ID NO: 228); RWILR (SEQ ID NO: 229); RFILR (SEQ ID NO: 230); RYILR (SEQ ID NO: 231); KWILK (SEQ ID NO: 232); KFILK (SEQ ID NO: 233); KYILK (SEQ ID NO: 234); KWILR (SEQ ID NO: 235); KFILR (SEQ ID NO: 236); KYILR (SEQ ID NO: 237); RWVIK (SEQ ID NO: 238); RFVIK (SEQ ID NO: 239); RYVIK (SEQ ID NO: 240); RWVIR (SEQ ID NO: 241); RFVIR (SEQ ID NO: 242); RYVIR (SEQ ID NO: 243); KWVIK (SEQ ID NO: 244); KFVIK (SEQ ID NO: 245); KYVIK (SEQ ID NO: 246); KWVIR (SEQ ID NO: 247); KFVIR (SEQ ID NO: 248); KYVIR (SEQ ID NO: 249); RWIIK (SEQ ID NO: 250); RFIIK (SEQ ID NO: 251); RYIIK (SEQ ID NO: 252); RWIIR (SEQ ID NO: 253); RFIIR (SEQ ID NO: 254); RYIIR (SEQ ID NO: 255); KWIIK (SEQ ID NO: 256); KFIIK (SEQ ID NO: 257); KYIIK (SEQ ID NO: 258); KWIIR (SEQ ID NO: 259); KFIIR (SEQ ID NO: 260); KYIIR (SEQ ID NO: 261); RWLIK (SEQ ID NO: 262); RFLIK (SEQ ID NO: 263); RYLIK (SEQ ID NO:
1
264); RWLIR (SEQ ID NO: 265); RFLIR (SEQ ID NO: 266); RYLIR (SEQ ID NO: 267); KWLIK (SEQ ID NO: 268); KFLIK (SEQ ID NO: 269); KYLIK (SEQ ID NO: 270); KWLIR (SEQ ID NO: 271); KFLIR (SEQ ID NO: 272); KYLIR (SEQ ID NO: 273); RWIAK (SEQ ID NO: 274); RFIAK (SEQ ID NO: 275); RYIAK (SEQ ID NO: 276); RWIAR (SEQ ID NO: 277); RFIAR (SEQ ID NO: 278); RYIAR (SEQ ID NO: 279); KWIAK (SEQ ID NO: 280); KFIAK (SEQ ID NO: 281); KYIAK (SEQ ID NO: 282); KWIAR (SEQ ID NO: 283); KFIAR (SEQ ID NO: 284); KYIAR (SEQ ID NO: 285); RWVAK (SEQ ID NO: 286); RFVAK (SEQ ID NO: 287); RYVAK (SEQ ID NO: 288); RWVAR (SEQ ID NO: 289); RFVAR (SEQ ID NO: 290); RYVAR (SEQ ID NO: 291); KWVAK (SEQ ID NO: 292); KFVAK (SEQ ID NO: 293); KYVAK (SEQ ID NO: 294); KWVAR (SEQ ID NO: 295); KFVAR (SEQ ID NO: 296); KYVAR (SEQ ID NO: 297); i RWLVP (SEQ ID NO: 1209).
[0077] Ove konkretne sekvence navedene su primera radi i nisu predviđene da ograničavaju obim ovog pronalaska. U nekim poželjnim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje ima ili obuhvata sekvencu RWLVK (SEQ ID NO: 28) ili KFIVK (SEQ ID NO: 119) ili RWLVP (SEQ ID NO: 1209).
[0078] Dok su prethodno navedeni motivi koji stupaju u interakcije sa PCNA poželjni motivi ovog pronalaska, u nekim načinima ostvarivanja bilo koji od ovih motiva ili više njih može biti izuzeto, npr. bilo koji motiv 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 ili više njih može biti izuzeto, kao što je bilo koji motiv 25, 30, 40, 50 ili više njih ili bilo koji ceo broj u ovom opsegu. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje nema ili ne obuhvata sekvencu izabranu od bilo koje ili više njih od SEQ ID NO: 22-297 i 1209.
[0079] Naročiti motivi koji stupaju u interakcije sa PCNA koji se mogu izuzeti ili odbaciti uključuju bilo koji od ili više sledećih: KYMVR (SEQ ID NO: 298), KFLAK (SEQ ID NO: 158), KWLIK (SEQ ID NO: 268), KFLIK (SEQ ID NO: 269), KWLIOrn (SEQ ID NO: 299), KWLIDbu (SEQ ID NO: 300) i KWQLR (SEQ ID NO: 301).
[0080] Oligopeptidno jedinjenje poželjno je izolovano jedinjenje, npr. izolovani peptid, a najpoželjnije oligopeptidno jedinjenje predstavlja sintetičko jedinjenje, npr. sintetički peptid. Molekul nukleinske kiseline koji kodira oligopeptidno jedinjenje poželjno je izolovani molekul nukleinske kiseline, a najpoželjnije molekul nukleinske kiseline predstavlja sintetički molekul nukleinske kiseline. Drugim rečima, oligopeptidno jedinjenje i njegov kodirajući molekul nukleinske kiseline su nenativni, tj. molekuli koji se ne javljaju prirodno.
[0081] Tehnologija peptida koji prodire u ćelije (CPP) izuzetno se razvila poslednjih godina pa je u tehnici poznat i opisan poznat širok spektar peptida koji prodiru u ćelije i zaista je opseg takvih peptida komercijalno dostupan. Peptidi koji prodiru u ćelije mogu dosta varirati u veličini, sekvenci i naelektrisanju, i naravno u mehanizmu funkcije (koji trenutno nije poznat za neke peptide i nije u potpunosti razjašnjen za druge), ali dele zajedničku mogućnost translokacije po plazmatskoj membrani i isporučuju pričvršćenu ili povezanu grupu (takozvani „teretˮ) u citoplazmu ćelije. CPP stoga predstavljaju vektore isporuke bazirane na peptidima.
[0082] Iako CPP nisu okarakterisani pojedinačnim strukturnim ili funkcionalnim motivom, dostupne su alatke za identifikovanje CPP pa stručnjak iz ove oblasti može brzo odrediti da li peptidna sekvenca može imati funkciju olakšavanja unosa peptida od kog se obrazuje domen, tj. da li domen može imati funkciju unosa (uvoza) peptida, npr. CPP. Na primer, Hansen et al (Predicting cell-penetrating peptides, Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, pp.572-579), obezbeđuje pregled postupaka za predviđanje CPP na osnovu analize glavnih komponenti prediktoraˮ) i odgovarajućih algoritama baziranih na originalnom radu Hällbrink et al (Prediction of Cell-Penetrating Peptides, International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 2005, 11(4), pp.249-259). Ukratko, metodologija radi izračunavanjem zrezultata peptida kandidata na osnovu numeričke vrednosti i povezanog opsega. Ako z-rezultati potpadaju u opseg poznatih CPP z-rezultata, ispitani peptidi se klasifikuju kao CPP. Pokazalo se da postupak ima visoku preciznost (oko 95% predviđanja poznatih CPP).
[0083] Naknadno su razvijeni dodatni postupci za predviđanje CPP (vidi npr. Sanders et al., Prediction of Cell Penetrating Peptides by Support Vector Machines, PLOS Computational Biology, 2011, 7(7), pp.1-12) i dostupna je CPP baza podataka (Gautam et al., CPPSite: a curated database of cell penetrating peptides, Database, 2012, Article ID bas015 i http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.php). Shodno tome, bilo koji pogodan CPP može se iskoristiti u ovom pronalasku a, kako će biti reči u nastavku, razni CPP su već identifikovani i ispitani i mogli bi činiti osnovu za utvrđivanje i identifikovanje novih CPP.
[0084] CPP se mogu dobiti iz proteina koji se prirodno javljaju koji mogu da se translociraju preko ćelijskih membrana kao što je Drosophila homeoboks protein antenapedije (transkripcioni faktor), virusni proteini kao što su HIV-1 transkripcioni faktor TAT i kapsidni protein VP22 iz HSV-1 i/ili se mogu dobiti sintetički, npr. iz himernih proteina ili sintetičkih polipeptida kao što je poliarginin. Kao što je prethodno naznačeno, ne postoji samo jedan mehanizam koji je odgovoran za efekat transdukcije pa se samim tim dizajn CPP može bazirati na različitim strukturama i sekvencama. Peptidi koji prodiru u ćelije prikazani su i kod Jarver et al.2006 (Biochimica et Biophysica Acta 1758, pages 260-263), a u tabeli 1 u nastavku navedeni su razni reprezentativni peptidi. US 6,645,501 dalje opisuje razne peptide koji prodiru u ćelije koji se mogu koristiti.
1
1 7
1
[0085] CPP dobijeni iz antenapedije (Antp klasa) predstavljaju klasu od naročitog značaja, baziranu oko 16. aminokiselinske sekvence penetratina kao što je prikazano u tabeli 1, koja odgovara trećoj petlji proteina antenapedije i pokazalo se da je odgovorna za translokaciju proteina. Penetratin je u velikoj meri razvijen kao vehikulum za isporuku, uključujući naročito za farmaceutsku upotrebu, pa je predložen i opisan širok spektar derivata penetratina. Kao reference se naročito mogu uzeti WO 91/1891, WO 00/1417, WO 00/29427, WO 2004/069279 i US 6,080,724. Stoga, 16. aminokiselinska sekvenca penetratina može biti modifikovana i/ili okrnjena, ili se peptid može hemijski modifikovati ili se mogu napraviti retro-, inverzni- ili retro-inverzni analozi, a da se pritom zadrži dejstvo prodiranja u ćelije.
[0086] Druga grupa peptida koji prodiru u ćelije koja se poželjno može koristiti zasnovana je na HIV-TAT sekvenci i HIV-TAT, a njegovi fragmenti predstavljaju poželjnu klasu CPP za upotrebu prema ovom pronalasku. Razni CPP bazirani na TAT opisani su u US 5,656,122. Primerni HIV-TAT peptid kao što se upotrebljava u primerima u nastavku predstavlja RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 335), ali će se lako uvideti da se mogu upotrebljavati duži ili kraći TAT fragmenti.
[0087] Kao što je prethodno pomenuto, ne postoje određene strukturne karakteristike ili motivi sekvenci koji su zajednički za sve CPP. Međutim, razne klase CPP mogu se identifikovati određenim karakteristikama, kao što su na primer peptidi koji su amfipatički i neto pozitivno naelektrisani. Druge grupe CPP mogu imati strukturu koja ispoljava visok α-spiralni sadržaj. Druga grupa mogu biti peptidi koje karakteriše visok sadržaj baznih aminokiselina. CPP stoga mogu biti ili mogu obuhvatati oligomere baznih kiselina kao što je arginin npr.5 do 20, 6 do 15 ili 6 do 12 R ostatke npr. R7(SEQ ID NO: 334), R8(SEQ ID NO: 336) ili R11(SEQ ID NO: 337) ili QSR8(SEQ ID NO: 338).
[0088] Amfipatički peptidi bogati prolinom su druga klasa CPP i takvi peptidi okarakterisani prisustvom prstenova pirolidina od prolina opisani su u Pujals et al.2008 Advanced Drug Delivery Reviews 60, pages 473-484.
[0089] Drugi uspešno razvijeni CPP uključuju pVEC (Elmquist et al.2003 Biol. Chem 384, pages 387-393; Holm et al.2005 Febs Lett.579, pages 5217-5222) i peptide dobijene iz kalcitonina (Krauss et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, pages 51-54).
[0090] Komercijalno dostupni CPP uključuju Chariot, baziran na Pep-1 peptidu (Active Motif, Francuska), Syn-B vektore bazirane na protegrin peptidu PG-1 (Syntem, Francuska) i Express-si dostavu baziranu na MPG peptidu od Genospectra, SAD.
[0091] Drugi CPP uključuju R41, R8, M918 i YTA-4 peptide (SEQ ID NO: 1210-1213, tim redom) otkrivene u Eriksson et al.2013, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol.57(8), pp.3704-3712.
[0092] U nekim načinima ostvarivanja CPP mogu biti ciklični peptidi, kao što su peptidi otkriveni u Oh et al., 2014, Mol. Pharmaceutics, vol.11, pp.3528-3536. Određenije, CPP mogu biti amfifilični ciklični CPP, naročito koji sadrže ostatke triptofana i arginina. U nekim načinima ostvarivanja CPP mogu biti ciklični peptidi poliarginina i mogu se modifikovati dodavanjem grupe masnog acila, npr. oktanoila,
1
dodekanoila, heksadekanoila, N-acetil-L-triptofanil-12-aminododekanoila itd. Pogodni ciklični CPP za upotrebu u ovom pronalasku predstavljeni su u SEQ ID NO: 1214-1220.
[0093] Pored javno dostupnih i prijavljenih CPP, novi ili derivati CPP peptida mogu se dizajnirati i sintetisati na osnovu poznatih ili prijavljenih kriterijuma (npr. poznate CPP sekvence ili karakteristike kao što su sadržaj bazne aminokiseline, α-spiralni sadržaj itd. kao što je prethodno rečeno). Pored toga, nasumično dizajnirani ili drugi peptidi mogu se detaljno pregledati na CPP dejstvo, na primer kuplovanjem ili pričvršćivanjem takvog peptida koji sadrži reporterski molekul, npr. obeležje ili oznaku koja se može detektovati kao što je fluorescentna oznaka na željenom teretu (npr. oligopeptidno jedinjenje kao što je ovde opisano) i ispitivati da se vidi je li konstrukt translociran kroz ćelijsku membranu, na primer dodavanjem ovih peptida živim ćelijama nakon čega sledi ispitivanje ćelijskog uvoza, npr. upotrebom konfokalne mikroskopije.
[0094] Zapravo, iako je generalno slučaj da će CPP prodirati ili ulaziti u skoro bilo koji tip ćelije, u nekim se slučajevima može primetiti da uspešna ili efikasna isporuka može zavisiti, ili može varirati u zavisnosti, od tačne prirode tereta (npr. peptidna sekvenca tereta) i/ili korišćenog CPP. Stručnjak iz ove oblasti bi svakako trebao biti sposoban da odredi optimalne peptidne sekvence i kombinacije itd., i da ispita i/ili modifikuje teret i/ili CPP sekvencu ili strukturu itd.
[0095] Dakle, ukratko, stručnjak iz ove oblasti biće svestan pogodnih peptidnih sekvenci koje mogu olakšati unos oligopeptidnog jedinjenja, ali primera radi sekvenca može uključivati Penetratin™, 16-aminokiselinski peptid koji odgovara trećoj spirali homeodomena proteina antenapedije, R bogate oznake kao što su R6-Penetratin (u čijem se N-terminusu penetratina dodaju ostaci arginina) i derivati HIV Tat proteina kao što je GRKKRRQRRRPPQQ (SEQ ID NO: 339).
[0096] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja domen koji olakšava celularni unos oligopeptidnog jedinjenja predstavlja CPP i može se izabrati od bilo kog od:
(i) peptida klase antenapedije;
(ii) peptida klase protegrina;
(iii) peptida klase HIV-TAT;
(iv) amfipatičke klase peptida izabranog od amfipatičkog i neto pozitivno naelektrisanog peptida, amfipatičkog peptida bogatog prolinom, peptida baziranog na Pep-1 peptidu i peptida baziranog na MPG peptidu;
(v) peptida koji ispoljava visok α-spiralni sadržaj;
(vi) peptida koji obuhvata oligomere baznih kiselina;
(vii) pVEC;
(viii) peptida dobijenog iz kalcitonina; i
(ix) amfifiličnog cikličnog CPP.
1
[0097] U nekim načinima ostvarivanja domen koji olakšava celularni unos oligopeptidnog jedinjenja predstavlja CPP i može se izabrati od sekvence izabrane od bilo koje od SEQ ID NO: 302-1162 ili njegovog fragmenta i/ili derivata. Detalji i svojstva CPP identifikovanih u SEQ ID NO: 340-1162 mogu se pronaći na http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.php, CPPSite: A database of cell penetrating peptides.
[0098] U nekim načinima ostvarivanja domen koji olakšava celularni unos oligopeptidnog jedinjenja predstavlja SEQ ID NO: 337.
[0099] U nekim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje obuhvata i jedan domen ili više njih koji obezbeđuju signalnu (ciljnu ili tranzitnu) sekvencu. U nekim načinima ostvarivanja, signalna sekvenca može ciljati oligopeptidno jedinjenje na konkretnom tipu ćelije. Pored toga ili alternativno, u nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati signalni peptid koji lokalizuje jedinjenje na specifičnom intracelularnom odeljku, npr. jezgru. U nekim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje se usmerava na citozol, što se može postići bez dodatnog signalnog peptida, tj. peptid unosa (uvoza), npr. CPP, može biti dovoljan za usmeravanje ili lokalizovanje oligopeptidnog jedinjenja na citozol ćelije.
[0100] Signalna sekvenca ili domen signalne sekvence se stoga mogu posmatrati kao bilo koja sekvenca koja dejstvuje da lokalizuje, ili alternativno rečeno, da usmeri, translocira ili prenese, oligopeptidno jedinjenje na bilo koju drugu lokaciju npr. na bilo koji željeni tip ćelije ili supcelularnu lokaciju, npr. jezgro.
[0101] Kao što je prethodno pomenuto, oligopeptidno jedinjenje (ili konstrukti) za upotrebu u ovom pronalasku može obuhvatati jednu signalnu sekvencu ili više njih (tj. jedan domen ili više njih koji funkcionišu kao signalne sekvence), npr. signalni peptid koji usmerava jedinjenje (ili konstrukt) u određeni supcelularni odeljak, kao što je jezgro. Signali nuklearne lokalizacije (NLS) ponovo su dobro poznati u tehnici i naširoko su opisani u literaturi. Na primer, dostupna je pretraživa baza podataka poznatih i predviđenih NLS, vidi npr. Cokol et al (Finding nuclear localization signals, EMBO Reports, 2000, 1(5), pp.411-415). PSORT II baza podataka, http://psort.hgc.jp/ može se koristiti za predviđanje nuklearne lokalizacije proteina bazirano na NLS. Shodno tome, bilo koja poznata ili funkcionalna NLS može se iskoristiti u ovom pronalasku.
[0102] NLS može varirati u dužini i/ili sekvenci pa je opisan širok spektar konkretnih NLS sekvenci.
Generalno je ipak zaključeno da peptidi koji obuhvataju pozitivno naelektrisane aminokiseline (naročito lizin (K), arginin (R) i/ili histidin (H)) mogu funkcionisati kao NLS. Primerni NLS stoga može biti peptid od npr. 4-20, određenije 4-15, 4-12, 4-10 ili 4-8 aminokiselina, pri čemu su najmanje 4 aminokiseline (a određenije najmanje 60, 70, 75, 80, 85 ili 90% aminokiselinskih ostataka u NLS peptidu) pozitivno naelektrisane aminokiseline, poželjno izabrane od K, R ili H. Takav primerni NLS može na primer imati ili obuhvatati sekvencu RKRH (SEQ ID NO: 1163).
2
[0103] Signali nuklearne lokalizacije, uključujući i prave eksperimentalno utvrđene i predviđene ili predložene NLS sekvence, i strategije za identifikovanje NLS takođe su opisani u Lange et al., J. Biol. Chem.2007, 282(8), 5101-5105; Makkerh et al., Current Biology 1996, 6(8), 1025-1027; Leslie et al., Methods 2006, 39, 291-308; i Lusk et al. Nature Reviews MCB 2007, 8, 414-420.
[0104] Klasična NLS sastoji se ili od jednog (monopartitnog) ili dva (bipartitna) proširenja baznih aminokiselina. Monopartitna NLS može biti primer SV40 velikog T antigena NLS (<121>PKKKRKV<132>[SEQ ID NO: 1164]), a bipartitna NLS nukleoplazmina NLS (<155>KRPAATKKAGQAKKKK<170>[SEQ ID NO: 1165]).
Predložena je monopartitna NLS konsenzus sekvenca K-[K/R]-X-[K/R] (SEQ ID NO: 1166) i shodno tome NLS prema ovom pronalasku može u jednom načinu ostvarivanja obuhvatati takvu konsenzus sekvencu ili se sastojati od nje (u kojoj X predstavlja bilo koju aminokiselinu).
[0105] Reprezentativna bipartitna NLS prema ovom pronalasku može imati sekvencu KR-[X]5-20-KKKK (SEQ ID NO: 1167), npr. KR-X10-KKKK (SEQ ID NO: 1168) (gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu).
[0106] Alternativni primer bipartitne NLS može imati oblik RKRH-[X]2-10-KK (SEQ ID NO: 1169) npr. RKRH-X2-KK (SEQ ID NO: 1170), na primer RKRH-II-KK (SEQ ID NO: 1171).
[0107] Onkoprotein c-myc NLS razlikuje se od klasičnih NLS u tome što su samo 3 aminokiselinska ostatka od njih 9 bazna (PAAKRVKLD [SEQ ID NO: 1172]), što ukazuje da NLS ne mora nužno biti usklađena sa prethodno datim konsenzus ili klasičnim sekvencama. Makkerh et al (supra) opisuju NLS sekvence u kojima je grupa baznih aminokiselina (npr. KKKK [SEQ ID NO: 1173]) flankirana neutralnim i kiselim ostacima, na primer PAAKKKKLD (SEQ ID NO: 1174).
[0108] Druge moguće NLS sekvence koje se mogu dati primera radi uključuju: PKKKRKVL (SEQ ID NO: 1175), KKKRK (SEQ ID NO: 1176), KKKRVK (SEQ ID NO: 1177), KKKRKVL (SEQ ID NO: 1178) i RKKRKVL (SEQ ID NO: 1179). Može se koristiti bilo koja NLS koja je derivat poznate NLS npr. SV40, nukleoplazmin, UNG2 ili c-myc NLS.
[0109] Navodna, predložena ili predviđena NLS sekvenca može se ispitati na NLS dejstvo pomoću principa i ispitivanja poznatih i opisanih u tehnici. Na primer, kandidat NLS sekvenca može se pričvrstiti za željeni teret (u ovom slučaju, oligopeptidna jedinjenja kao što je ovde definisano), a konstrukt se može biti obezbeđen reporterskim molekulom koji se može detektovati (npr. oznakom ili obeležjem koje je vizuelno primetno, fluorescentno obeležje) i može stupati u kontakt sa ispitivanom ćelijom. Zatim se može utvrditi distribucija konstrukta u ćeliji.
[0110] Stoga će, ukratko, stručnjak iz ove oblasti imati na umu pogodne signalne sekvence, ali primera radi, sledeće su pomenute ovde. Primeri sekvenci nuklearne lokalizacije uključuju SV40 derivat proteina KKKRK (SEQ ID NO: 1176).
[0111] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje obuhvata signalnu sekvencu (tj. domen koji obuhvata signalni peptid) koja lokalizuje ili usmerava oligopeptidno jedinjenje na supcelularnu lokaciju, kao što je NLS i može se izabrati od bilo kog od:
(i) peptida od 4-20 aminokiselina, pri čemu su najmanje 4 aminokiseline pozitivno naelektrisane aminokiseline, poželjno izabrane od K, R ili H; i/ili
(ii) sekvence izabrane od bilo koje od SEQ ID NO: 1163-1179 ili njenog fragmenta i/ili derivata.
[0112] U nekim načinima ostvarivanja signalna sekvenca nuklearne lokalizacije obuhvata sekvencu izabranu od bilo koje od SEQ ID NO: 1163-1179 ili njenog fragmenta i/ili derivata, pri čemu pomenuti fragment i/ili derivat poželjno obuhvata najmanje 4 pozitivno naelektrisane aminokiseline, poželjno izabrane od K, R ili H.
[0113] U nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje ili konstrukt prema ovom pronalasku može obuhvatati najmanje tri domena, uključujući (i) domen APIM motiva kao što je ovde definisan, (ii) domen veznika, koji može u nekim načinima ostvarivanja obuhvatati signalnu sekvencu nuklearne lokalizacije, i (iii) domen signalne sekvence koja prodire u ćelije.
[0114] Odvojeni elementi ili komponente (domeni) konstrukta prema ovom pronalasku mogu biti sadržani ili predstavljeni u bilo kom redosledu, ali poželjno u gore naznačenim redosledima (npr. APIM oligopeptidno jedinjenje-CPP ili APIM oligopeptidno jedinjenje-veznik-CPP).
[0115] U nekim načinima ostvarivanja, APIM motiv se nalazi na ili prema N-terminusu peptida. Na primer, APIM motiv može biti opisan kao N-terminal za CPP i opciono kao N-terminal za vezujuću sekvencu, ukoliko postoji.
[0116] U poželjnom načinu ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje obuhvata motiv koji stupa u interakciju sa PCNA kao što je izloženo u SEQ ID NO: 28, signalnu sekvencu nuklearne lokalizacije kao što je izloženo u SEQ ID NO: 1176 i signalnu sekvencu koja prodire u ćelije kao što je izloženo u SEQ ID NO: 337.
[0117] Dalje, u nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje ili konstrukt prema ovom pronalasku može sadržati više od jednog motiva koji stupa u interakciju sa PCNA. Stoga, alternativno rečeno, agens za upotrebu u ovom pronalasku može sadržati ili kodirati oligopeptidno jedinjenje koje obuhvata više od jednog motiva koji stupa u interakciju sa PCNA. Konstrukt ili oligopeptidno jedinjenje može na primer sadržati 1-10, npr.1-6, ili 1-4 ili 1-3 ili jedan ili dva motiva. Unutar konstrukta je sadržana i signalna sekvenca, takvi motivi mogu biti razmaknuti ili locirani prema izboru, npr. mogu biti grupisani zajedno ili ih mogu razdvajati elementi signalne sekvence npr. motiv-motiv-CPP, motiv-veznikmotiv-CPP; ili motiv-veznik-motiv-motiv-CPP; ili motiv-motiv-veznik-CPP itd.
[0118] Kao što je ovde spomenuto „fragmentˮ može obuhvatati najmanje 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% aminokiselina sekvence iz koje je izveden. Pomenuti fragment može se dobiti iz centralnih ili N-terminalnih ili C-terminalnih delova sekvence. Iako će veličina fragmenta zavisiti od veličine originalne sekvence, u nekim načinima ostvarivanja fragmenti mogu biti za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više aminokiselinskih ostataka kraći od sekvence iz koje su izvedeni, npr.1-10, 2-9, 3-8, 4-7 aminokiselinskih ostataka kraći od sekvence iz koje su izvedeni.
[0119] Kao što je ovde spomenuto „derivatˮ sekvence je najmanje 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičan sekvenci sa kojom se poredi.
[0120] Identitet sekvence može se utvrditi, npr. pomoću banke podataka sekvenci proteina SWISS-PROT pomoću FASTA pep-cmp sa varijabilnim pamfaktorom i vrednosti stvaranja praznine podešene na 12,0, a vrednosti proširenja praznine podešene na 4,0 i prozora od 2 aminokiseline. Pomenuto poređenje je poželjno izvedeno preko pune dužine sekvence, ali se može izvesti i preko manjeg prozora poređenja, npr. manjeg od 200, 100, 50, 20 ili 10 susednih aminokiselina.
[0121] Takvi polipeptidi povezani sa identitetom sekvence, tj. derivati, poželjno su funkcionalno ekvivalentni peptidima koji su izloženi u navedenim SEQ ID NO. Slično, peptidi sa sekvencama kao što su izložene u SEQ ID No. mogu se modifikovati bez uticaja na sekvencu polipeptida kao što je opisano u nastavku.
[0122] Dalje, „fragmentiˮ kao što su ovde opisani mogu biti funkcionalni ekvivalenti. Ovi fragmenti poželjno zadovoljavaju ovde pomenute uslove identiteta (u odnosu na uporedivi region).
[0123] Kao što je ovde spomenuto, da bi se postigla „funkcionalna ekvivalencijaˮ, peptid može prikazati određenu smanjenu efikasnost pri izvođenju funkcije koja se odnosi na matični molekul (tj. molekul iz kog je izveden, npr. aminokiselinskom supstitucijom), ali je poželjno podjednako efikasan ili je efikasniji. Stoga se funkcionalna ekvivalencija može odnositi na peptid koji je efikasan u lokalizovanju ili usmeravanju oligopeptidnog jedinjenja na tip ćelije ili celularnu lokaciju, npr. radi olakšavanja unosa peptida kao što je prethodno opisano. Ovo se može ispitatati poređenjem efekata peptida derivata koji se odnose na peptid iz kog je izveden na kvalitativan ili kvantitativan način, npr. izvođenjem prethodno opisanih in vitro analiza. Ako su kvantitativni rezultati mogući, derivat je najmanje 30, 50, 70 ili 90% efikasan kao matični peptid.
[0124] Funkcionalno ekvivalentni peptidi koji se odnose na ili su izvedeni iz matičnog peptida, mogu se dobiti modifikovanjem matične sekvence aminokiseline jednostrukom ili višestrukom aminokiselinskom supstitucijom, dodavanjem i/ili brisanjem (čime se postiže to da oni zadovoljavaju gore pomenute zahteve za identitet sekvence), ali bez uništavanja funkcije molekula. Matična sekvenca poželjno ima manje od 20 supstitucija, dodavanja ili brisanja, npr. manje od 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 takve modifikacije. Takve peptide mogu kodirati „funkcionalno ekvivalentni molekuli nukleinskih kiselinaˮ koji se mogu generisati odgovarajućom supstitucijom, dodavanjem i/ili brisanjem jedne baze ili više njih.
[0125] Domeni (koji se mogu posmatrati kao komponente, elementi ili odvojeni delovi) oligopeptidnog jedinjenja ili konstrukt kao što je ovde opisan mogu se međusobno pričvrstiti ili povezati na bilo koji željeni ili odgovarajući način prema tehnikama dobro poznatim u tehnici. Stoga se domeni mogu povezati ili hemijski konjugovati, npr. pomoću poznatih tehnologija hemijskog kuplovanja ili se jedinjenja
2
ili konstrukti mogu formirati kao pojedinačna celina pomoću tehnika genetskog modifikovanja npr. tehnika za stvaranje fuzionih proteina, ili se jednostavno mogu sintetisati kao celina, npr. pomoću tehnika sinteze peptida.
[0126] Domeni se mogu direktno međusobno povezati ili se mogu indirektno povezati pomoću jedne sekvence veznika (ili spejsera) ili više njih. Stoga, sekvenca veznika može da razmakne ili odvoji dva pojedinačna domena ili više njih (tj. dela, npr. ili da razdvoji elemente motiva) u oligopeptidnom konstruktu ili jedinjenju. Tačna priroda sekvence veznika nije kritična i može biti varijabilne dužine i/ili sekvence, na primer može imati 0-40, određenije 0-20, 0-15, 0-12, 0-10, 0-8 ili 0-6, 0-4 ili 0-3 ostatka, npr. 1, 2 ili 3 ili više ostataka. Reprezentativni primer sekvence veznika, ukoliko je prisutna, može imati 1-15, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6 ili 1-4 ostatka itd. Priroda ostataka nije kritična i oni na primer mogu biti bilo koja aminokiselina, npr. neutralna aminokiselina ili alifatična aminokiselina, ili alternativno mogu biti hidrofobni ili polarni ili naelektrisani ili obrazovati strukturu npr. prolin. Pokazalo se da je opseg različitih sekvenci veznika koristan, uključujući kratke (npr.1-6) sekvence neutralnih i/ili alifatičnih aminokiselina.
[0127] Primerne sekvence veznika uključuju dakle bilo koji pojedinačni aminokiselinski ostatak, npr. A, I, L, V, G, R, Q, T ili W, ili di-, tri- tetra- penta- ili heksa-peptid sastavljen od takvih ostataka.
[0128] Kao reprezentativni veznici mogu se navesti I, II, IL, R, W, WW, WWW, RIL, RIW, GAQ, GAW, VAT, IILVI (SEQ ID NO: 1180), IILVIII (SEQ ID NO: 1181) itd.
[0129] Veznici između različitih domena (komponente, elementi ili delovi) mogu biti isti ili različiti.
[0130] Kao što je prethodno pomenuto, u nekim načinima ostvarivanja veznik može obuhvatati NLS ili se sastojati od nje. Alternativno gledano, u nekim načinima ostvarivanja NLS, kada je prisutna, može funkcionisati i kao signalni peptid i kao veznik. Stoga, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati signalni peptid (npr. NLS) i veznik.
[0131] Reprezentativna jedinjenja (ili određenije konstrukti) za upotrebu u postupcima i upotrebama ovog pronalaska uključuju:
MDRWLVKRILVATK (SEQ ID NO: 1182),
MDRWLVKRILKKKRKVATKG (SEQ ID NO: 1183), MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1184), MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1185), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG (SEQ ID NO: 1186), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1187), MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1188), MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1189), MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1190), MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 1191),
MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1192), MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1193), MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 1194),
MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1195),
MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1196),
Ac-MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1197),
Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1198),
Ac-MDRFLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1199),
Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 1200),
Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1201), MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1202), MDRWSVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1203)
MDRWAVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1204) ili MDRWLVPWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1208).
[0132] U naročito poželjnom načinu ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje obuhvata sekvencu kao što je izloženo u SEQ ID NO: 1198, 1203, 1204 ili 1208.
[0133] Prethodno prikazana oligopeptidna jedinjenja obuhvataju N-terminalne aminokiseline koje ne čine deo domena koji su od suštinske važnosti da bi jedinjenja imala dejstvo u upotrebama ovog pronalaska, tj. „MDˮ sekvencu. Neki od peptida takođe obuhvataju N-terminalnu modifikaciju, npr. acetilne grupe. Ove dodatne aminokiseline i modifikacije mogu da olakšaju proizvodnju oligopeptidnih jedinjenja, npr. in vitro ili in vivo, i/ili da pomognu zaštitu jedinjenja od degradacije in vivo. Biće očigledno da oligopeptidna jedinjenja ne zahtevaju ove dodatne aminokiseline ili modifikacije za njihovo dejstvo. Shodno tome, dalje reprezentativne sekvence prema ovom pronalasku uključuju bilo koju od SEQ ID NO: 1182 do 1204 ili 1208, izostavljajući N-terminalne „MDˮ i/ili „Acˮ grupe. U drugim načinima ostvarivanja, C-terminalni K ili G ostatak mogu se pored toga ili alternativno izostaviti. Dalje, ne očekuje se da prisustvo dodatnih aminokiselina ili modifikacija na bilo kom terminusu remeti ili inhibira funkciju ovde opisanih oligopeptidnih jedinjenja. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati N-terminalnu sekvencu, npr. sekvencu na N-terminusu koja ne obuhvata gore definisani domen, npr. takozvanu N-terminalnu flankirajuću sekvencu. U nekim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati C-terminalnu sekvencu, npr. sekvencu na C-terminusu koja ne obuhvata gore definisani domen, npr. takozvanu C-terminalnu flankirajuću sekvencu. U nekim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati N-terminalnu i C-terminalnu flankirajuću sekvencu.
[0134] Flankirajuća sekvenca može obuhvatati od oko 1-150 aminokiselina, kao što je 1-120, 1-100, 1-90,
2
1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-35, 1-30 itd. Stoga, flankirajuća sekvenca može obuhvatati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina, npr.1-40, 2-39, 3-38, 4-37, 5-36, 6-35, 7-34, 8-33, 9-32, 10-31, 11-30, 12-29, 13-28, 14-27, 15-26 aminokiselina ili bilo koju od njihovih kombinacija.
[0135] Oligopeptidna jedinjenja sa sekvencama izloženim u SEQ ID NO.1182-1204 i 1208 obuhvataju odvojene domene (tj. komponente) koji čine konstrukte (tj. sekvencu koja sadrži motiv, veznik/NLS, CPP, itd.). Stoga će se videti da SEQ ID NO.1182-1204 i 1208 predstavljaju konstrukte koji obuhvataju najmanje jednu sekvencu koja sadrži motiv, veznik/NLS i CPP, u nekim slučajevima povezane sekvencama veznika koje mogu varirati u sekvenci, kao što je naznačeno. Koriste se NLS sekvence bazirane na SV40 ili UNG2 NLS sekvencama i CPP sekvence bazirane na penetratinu, HIV-TAT ili R bogatom peptidu bogatom R.
[0136] Ovde se koristi standardni jednoslovni kod aminokiselina, tako da K označava lizin (Lys), I označava izoleucin (IIe) i tako dalje.
[0137] Oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati nekonvencionalne ili nestandardne aminokiseline. Domeni izuzev motiva koji stupa u interakciju sa PCNA u oligopeptidnom jedinjenju mogu inkorporirati nestandardne aminokiseline. U nekim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati jednu ili više, npr. najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 nekonvencionalnih aminokiselina, tj. aminokiselina koje poseduju bočni lanac koji ne kodira standardni genetički kod, ovde nazvanih „nekodirane aminokiselineˮ (vidi npr. tabelu 2). One mogu biti izabrane od aminokiselina koje su obrazovane metaboličkim procesima kao što su ornitin ili taurin, i/ili veštački modifikovanih aminokiselina kao što su 9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonil (Fmoc), (tert)-(B)util (o)ksi (k)arbonil (Boc), 2,2,5,7,8-pentametilhroman-6-sulfonil (Pmc) zaštićene aminokiseline ili aminokiseline sa benziloksi-karbonil (Z) grupom. Ako su prisutne takve nekodirane aminokiseline, one nisu locirane unutar motiva. U nekim načinima ostvarivanja, nekodirane aminokiseline su prisutne u više od jednog domena oligopeptidnog jedinjenja.
[0138] In vitro i/ili in vivo stabilnost oligopeptidnog jedinjenja može se poboljšati ili pojačati upotrebom sredstava za stabilizovanje ili zaštitu poznatih u tehnici, na primer dodavanjem grupa za zaštitu ili stabilizovanje, inkorporisanjem derivata ili analoga ili hemijske modifikacije aminokiselina. Takve grupe za zaštitu ili stabilizovanje mogu se na primer dodati na N i/ili C-terminusu. Primer takve grupe je acetilna grupa, a u tehnici su poznate druge zaštitne grupe ili grupe koje mogu stabilizovati peptid.
[0139] Oligopeptidna jedinjenja za upotrebu u ovom pronalasku obično će obuhvatati samo aminokiseline sa L-konfiguracijom, ali može biti prisutna jedna aminokiselina ili više njih sa D konfiguracijom. U nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje sadrži najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 D-aminokiselina i one se poželjno nalaze u motivu, ali u drugom načinu ostvarivanja, D-aminokiseline su prisutne samo izvan motiva. Opet u daljim načinima ostvarivanja, D-aminokiseline mogu se naći u više od jednog domena oligopeptidnog jedinjenja. Oligopeptidno jedinjenje može biti linearno ili ciklično.
2
[0140] Retro-inverzna oligopeptidna jedinjenja obuhvataju D-aminokiseline u obrnutom (suprotnom) redosledu u odnosu na matičnu ili referentnu sekvencu jedinjenja. Retro-inverzni analog samim tim ima obrnute terminuse i obrnut redosled npr. peptidnih veza, pri čemu se približno održava topologija bočnih lanaca kao u matičnoj ili referentnoj sekvenci.
[0141] Oligopeptidno jedinjenje može uključivati delimične retro-inverzne sekvence, tj. domen ili deo domena može obuhvatati retro-inverznu sekvencu.
[0142] „Oligopeptidno jedinjenjeˮ označava jedinjenje koje se sastoji od aminokiselina ili ekvivalentnih podjedinica, koje su međusobno povezane peptidnim ili ekvivalentnim vezama. Stoga, pojam „oligopeptidno jedinjenjeˮ uključuje peptide i peptidomimetike.
[0143] „Ekvivalentnom podjedinicomˮ označava se podjedinica koja je strukturno i funkcionalno slična aminokiselini. Grupa okosnica podjedinice može se razlikovati od standardne aminokiseline, npr. ona može inkorporirati jedan atom azota ili više njih umesto jednog atoma ugljenika ili više njih. U poželjnim načinima ostvarivanja, podjedinica obuhvata standardnu aminokiselinsku okosnicu, tj. okosnicu standardne ili kodirane aminokiseline. Drugim rečima, podjedinica je poželjno aminokiselina. Međutim, aminokiselinska podjedinica može obuhvatati nestandardnu (nekodiranu) R-grupu.
[0144] „Peptidomimetikomˮ se označava jedinjenje koje je funkcionalno ekvivalentno ili slično peptidu i koje može usvojiti trodimenzionalnu strukturu sličnu njegovim peptidnim pandanima, ali koji se ne sastoji samo od aminokiselina povezanih peptidnim vezama. Poželjna klasa peptidomimetika su peptoidi, tj. N-supstituisani glicini. Peptoidi su blisko povezani sa njihovim prirodnim peptidnim pandanima, ali se hemijski razlikuju po tome što su njihovi bočni lanci dodati na atome azota duž molekulske okosnice, pre nego na α-ugljenike kao što su kod aminokiselina.
[0145] Peptidomimetici, naročito nepeptidni molekuli mogu se generisati kroz razne procese, uključujući konformaciono-bazirani dizajn leka, skrining, dizajn fokusirane biblioteke i klasičnu medicinsku hemiju. Ne samo da se mogu koristiti oligomeri neprirodnih aminokiselina ili drugi organski gradeći blokovi, već se mogu koristiti postupci poznati u tehnici i ugljeni hidrati, heterociklična ili makrociklična jedinjenja ili bilo koji organski molekul koji obuhvata strukturne elemente i konformaciju koja obezbeđuje molekulsku elektrostatičku površinu koja oponaša ista svojstva kao 3-dimenzionalna konformacija peptida.
[0146] Stoga peptidomimetici mogu malo ili nimalo ličiti na peptidnu okosnicu. Peptidomimetici mogu obuhvatati čitav sintetički nepeptidni oblik (npr. baziran na okosnici ugljenih hidrata sa odgovarajućim supstituentima) ili mogu zadržati jedan element peptida ili više njih na kojima su bazirani, npr. derivatizacijom jedne aminokiseline ili više njih ili zamenom jedne aminokiseline ili više njih alternativnim nepeptidnim komponentama. Obrasci poput peptida uključuju pseudopeptide i ciklične peptide. Strukturni elementi koji se smatraju viškom za funkciju peptida mogu se svesti na minimum kako bi se zadržala samo funkcija rešetke ili uklonila tamo gde je prikladno.
2
[0147] Peptidomimetici mogu zadržati jedan peptidni element ili više njih, tj. više od jedne aminokiseline, iako se takve aminokiseline mogu zameniti njihovim nestandardnim ili strukturnim analogom. Aminokiseline zadržane u sekvencama mogu se takođe derivatizovati ili modifikovati (npr. obeležiti, glikozilisati ili metilisati) sve dok se zadržavaju funkcionalna svojstva oligopeptidnog jedinjenja. Peptidomimetici su označeni kao „da se mogu dobiti odˮ određene polipeptidne sekvence. Pod ovim se podrazumeva da je peptidomimetik dizajniran uz pozivanje na gore definisanu peptidnu sekvencu, tako da on zadržava strukturne karakteristike peptida koje su neophodne za njegovu funkciju. Ovo mogu biti određeni bočni lanci peptida ili vezujući potencijal vodonika strukture. Takve karakteristike mogu pružiti nepeptidne komponente ili jedan aminokiselinski ostatak ili više njih ili se veze koje povezuju pomenute aminokiselinske ostatke polipeptida mogu modifikovati tako da se poboljšaju određene funkcije peptida kao što su stabilnost ili otpornost na proteaze, dok se zadržavaju strukturne karakteristike peptida koje su ključne za njegovu funkciju.
[0148] Primeri nestandardnih ili strukturnih analognih aminokiselina koji se mogu koristiti su D aminokiseline, amidni izoetri (kao što je N-metilamid, retro-inverzni amid, tioamid, tioestar, fosfonat, ketometilen, hidroksimetilen, fluorovinil, (E)-vinil, metilenamino, metilenetio ili alkan), L-N metilaminokiseline, D-α metilaminokiseline, D-N-metilaminokiseline. Primeri nekonvencionalnih, tj. nekodiranih aminokiselina navedeni su u tabeli 2.
TABELA 2
2
2
[0149] U poželjnim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje je peptid. U naročito poželjnim načinima ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje je peptid koji se sastoji od L-aminokiselina. Opet u daljem poželjnom načinu ostvarivanja, oligopeptidno jedinjenje je peptid koji se sastoji od standardnih ili
1
kodiranih L-aminokiselina.
[0150] Kao što je prethodno pomenuto, oligopeptidno jedinjenje može obuhvatati nestandardne aminokiseline. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja oligopeptidno jedinjenje može inkorporirati diaminokiseline i/ili β-aminokiseline. Međutim, u poželjnim načinima ostvarivanja, najmanje domen APIM motiva, sastoji se od α-aminokiselina. Najpoželjnije, oligopeptidno jedinjenje, tj. svi domeni i opciono sve flankirajuće sekvence, sastoji se od α-aminokiselina.
[0151] Kao što je prethodno pomenuto, ovde definisano oligopeptidno jedinjenje obuhvata više od 5 podjedinica, ali će dužina konstrukta zavisiti od veličine CPP sekvence i od broja i veličine drugih domena, npr. domena veznika, flankirajućih sekvenci itd., ukoliko su prisutne. Stoga se prefiks „oligoˮ koristi da bi se označio relativno mali broj podjedinica kao što su aminokiseline, tj. manje od 200, poželjno manje od 150, 100, 90, 80, 70, 60 ili 50 podjedinica. Oligopeptidno jedinjenje ovog pronalaska stoga može obuhvatati više od 5, ali ne više od 200 podjedinica. Poželjno, obuhvata najmanje 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 podjedinica. Alternativno definisano obuhvata najviše 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31 ili 30 podjedinica. Reprezentativni opsezi podjedinica stoga uključuju 12-50, 12-45, 12-40, 12-35, 12-30, 12-25, 12-22, 12-20, 12-18 itd., pri čemu su poželjni 12-30 i 12-40.
[0152] Priroda podjedinica oligopeptidnog jedinjenja izvan domena APIM motiva i sekvenca peptida unosa nije kritična, tako da podjedinice izvan motiva mogu na primer biti podjedinice koje se mogu naći u nativnom proteinu koji obuhvata motiv, kao što je hABH2, ili mogu biti alaninski ostaci ili bilo koji drugi pogodni ostaci.
[0153] Peptidomimetici obično imaju duži poluživot unutar tela pacijenta, tako da mogu biti poželjni u načinima ostvarivanja gde je poželjan dugotrajan efekat. Ovo može da pomogne u smanjenju učestalosti na kojoj je kompoziciju potrebno ponovo dati. Međutim, zbog biološko-bezbednosnih razloga kraći poluživot može biti poželjan u drugim načinima ostvarivanja; u tim načinima ostvarivanja, poželjni su peptidi.
[0154] Oligopeptidno jedinjenje može biti deo veće jedinice, npr. može se spojiti sa polipeptidom kako bi se obrazovao rekombinantni fuzioni protein ili pričvrstiti za rešetku kako bi se obrazovao peptidni aptamer. Stoga, fuzioni proteini ili aptameri koji inkorporiraju oligopeptidno jedinjenje mogu se takođe iskoristiti u upotrebama i postupcima ovog pronalaska, tj. u nekim načinima ostvarivanja agens može biti fuzioni protein ili aptamer koji obuhvata gore definisano oligopeptidno jedinjenje.
[0155] Opet dalji aspekti uključuju farmaceutske kompozicije koje obuhvataju ovde definisani agens, npr. koji obuhvata oligopeptidno jedinjenje, fuzioni protein ili aptamer, zajedno sa najmanje jednim farmakološki prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom, pri čemu je pomenuta kompozicija za korišćenje u upotrebama ovog pronalaska definisanih u nastavku.
[0156] U daljem aspektu, molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid koji ima ili obuhvata (npr.) SEQ ID NO: 2, kao što je gore definisano, obezbeđen je za korišćenje u upotrebama ovog pronalaska.
2
Alternativno gledano, agens za upotrebu u ovom pronalasku može biti molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid koji ima ili obuhvata (npr.) SEQ ID NO: 2, kao što je gore definisano. Ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira oligopeptidno jedinjenje ili konstrukt (npr. peptid) kao što je gore definisano, koji obuhvata domen motiva (APIM motiva) koji stupa u interakciju sa PCNA kao što je gore definisano i peptid koji prodire u ćelije. Ovde je obezbeđen i komplement takvog molekula nukleinske kiseline za upotrebu u ovom pronalasku. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja molekul nukleinske kiseline takođe može kodirati jedan ili više veznika i/ili signalne sekvence, kao što je gore definisano.
[0157] Molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska obuhvata najmanje 15 nukleotida, poželjno najmanje 36 nukleotida, a poželjno najviše 800 nukleotida, poželjnije najviše 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75 ili 50 nukleotida. Molekul nukleinske kiseline poželjno je izolovani ili sintetički molekul.
[0158] Dalji aspekt se odnosi na vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline kao što je ovde definisano za korišćenje u upotrebama definisanim u nastavku. Taj vektor poželjno obuhvata sekvencu promotera operativno povezanu sa sekvencom koja kodira peptid kao što je gore definisano. Vektor može sadržati i dalje elemente koji se obično nalaze u vektoru kao što je poreklo replikacije, marker za selekciju kao što je otpornost na antibiotike, i/ili višestruko klonirajuće mesto. Vektor može dalje biti ekspresioni vektor i može obuhvatati dalje elemente, npr. transkripcione i/ili translacione kontrolne ili regulatorne elemente za ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Takvi kontrolni elementi, npr. promoteri, vezujuća mesta ribozoma, pojačivači, terminatori itd. dobro su poznati i naširoko opisani u tehnici.
[0159] Vektor može na primer biti plazmid ili virusni genom (ili njegov deo), virusni genom je poželjno od virusa izabranog od retrovirusa, adenovirusa i virusa povezanog sa adenovirusom. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, vektor se može davati u obliku virusa koji obuhvata vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koja kodira gore opisano oligopeptidno jedinjenje. Alternativno gledano, u nekim načinima ostvarivanja taj vektor može biti virus.
[0160] Kao što je prethodno pomenuto, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) koja obuhvata agens kao što je ovde definisano za korišćenje u upotrebama ovog pronalaska. Shodno tome, pomenuta kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može obuhvatati oligopeptidno jedinjenje (uključujući fuzioni protein ili aptamer) i/ili molekul nukleinske kiseline kao što je ovde definisano i/ili vektor kao što je ovde definisano, zajedno sa najmanje jednim farmakološki (ili farmaceutski) prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom.
[0161] Taj ekscipijens može uključivati bilo koje ekscipijense poznate u tehnici, na primer bilo koji nosač ili razblaživač ili bilo koji drugi sastojak ili agens kao što je pufer, antioksidans, helatni agens, sredstvo za vezivanje, sredstvo za oblaganje, sredstvo za raspadanje, punilac, ukus, boja, sredstvo za klizanje, lubrikans, konzervans, sredstvo za apsorpciju i/ili zaslađivač itd.
[0162] Taj ekscipijens može biti izabran iz grupe koju čine, na primer, mlečna kiselina, dekstroza, natrijum-metabisulfat, benzil alkohol, polietilenglikol, propilenglikol, mikrokristalna celuloza, laktoza, skrob, hitozan, prethodno želatinirani skrob, kalcijumkarbonat, kalcijumsulfat, dekstrati, dekstrin, dekstroza, dibazni kalcijumfosfatdihidrat, trobazni kalcijumfosfat, magnezijumkarbonat, magnezijumoksid, maltodekstrin, manitol, praškasta celuloza, natrijumhlorid, sorbitol i/ili talk.
[0163] Farmaceutska kompozicija može biti obezbeđena u bilo kom obliku poznatom u tehnici, na primer u obliku tablete, kapsule, obložene tablete, tečnosti, suspenzije, tablete, vrećice, implantata, sredstva za udisanje, praška, peleta, emulzije, liofilizata, šumeće tablete, spreja, melema, emulzije, balzama, flastera ili bilo koje njihove mešavine. Može biti obezbeđena npr. u obliku gastričnog preparata otpornog na tečnost i/ili u obliku sa odloženim dejstvom. Može biti u obliku pogodnom za oralno, parenteralno, topiklano, rektalno, genitalno, supkutano, transuretralno, transdermalno, intranazalno, intraperitonealno, intramuskularno i/ili intravensko davanje i/ili za davanje inhalacijom.
[0164] U reprezentativnom načinu ostvarivanja, farmaceutska kompozicija može biti u obliku pogodnom za lipozomalno davanje, tako da su poželjno obezbeđeni lipozomi koji sadrže farmaceutsku kompoziciju. Kada se koriste lipozomi, možda neće biti neophodno uključivanje daljeg ekscipijensa, tako da su obezbeđni i lipozomi koji sadrže agens, npr. oligopeptidno jedinjenje, kao što je ovde definisano, za korišćenje u upotrebama ovog pronalaska.
[0165] Kao što je gore pomenuto, ovde definisani agensi, tj. oligopeptidna jedinjenja i molekuli nukleinske kiseline, i farmaceutske kompozicije koje obuhvataju pomenute agense ispoljavaju terapijska svojstva u lečenju raznih stanja ili poremećaja, naročito poremećaja povezanih sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi i infektivnih bolesti ili poremećaja ili stanja koje infekcija pogoršava ili uzrokuje.
[0166] Kao što je ovde spomenuto „poremećajˮ, „bolestˮ ili „stanjeˮ odnosi se na osnovni patološki poremećaj u simptomatskom ili asimptomatskom organizmu (subjektu) u odnosu na normalan organizam (subjekat), koji može nastati, na primer, od infekcije i/ili stečene ili kongenitalne genetske nesavršenosti.
[0167] Kao što je istaknuto u primerima, pronalazači su utvrdili da oligopeptidna jedinjenja koja obuhvataju motiv koji stupa u interakciju sa PCNA mogu smanjiti oslobađanje citokina u krv, naročito iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, npr. monocita. Citokini se mogu osloboditi u krv nakon stimulacije raznim supstancama i veštačkim/sintetičkim supstancama. Na primer, mogu se koristiti LPS i poli I:C kako bi se simulirale ili predstavile bakterijske i virusne infekcije, tim redom. Prekomerni nivoi prozapaljenjskih citokina povezani su sa raznim bolestima, npr. infektivnim bolestima, i očekuje se da ovde definisani agensi mogu biti efikasni u lečenju ili sprečavanju pomenutih poremećaja. Na primer, smatra se da simptomi i komplikacije povezane sa sepsom nastaju kao rezultat prekomerne proizvodnje
4
prozapaljenjskih citokina u krvi. Stoga bi se očekivalo da se uvođenjem ili davanjem ovde otkrivenih agenasa, npr. intravenski, leči ili sprečava sepsa smanjivanjem ili inhibiranjem oslobađanja pomenutih citokina u krv. Stoga se može očekivati da se ovde opisani agensi iskoriste u lečenju ili sprečavanju bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa nekontrolisanim, nepoželjnim ili prekomernim oslobađanjem citokina (npr. hipercitokinemije) iz imunih ćelija u krvi, npr. naročito nekontrolisanim, neželjenim ili prekomernim oslobađanjem jednog prozapaljenjskog citokina ili više njih.
[0168] Pronalazači su pokazali da neki od proteina uključenih u puteve prenosa signala toličnih receptora, koji su kao što je prethodno rečeno uključeni u regulaciju imunih odgovora, obuhvataju motiv koji stupa u interakciju sa PCNA. Shodno tome, smatra se da se ovde otkrivena oligopeptidna jedinjenja mogu mešati sa interakcijom pomenutih proteina sa PCNA, npr. u neproliferišućim ćelijama u krvi, čime se inhibira oslobađanje prozapaljenjskih citokina u krv. Shodno tome, ovde otkrivena oligopeptidna jedinjenja pronalaze svoju naročitu primenu u lečenju ili sprečavanju stanja ili poremećaja povezanog sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, naročito stanja ili poremećaja povezanih sa prekomernim, neželjenim ili nekontrolisanim prozapaljenjskim oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, npr. infektivne bolesti ili infekcije ili bolesti ili stanja koje infekcija pogoršava ili uzrokuje.
[0169] Drugim rečima, ovde otkrivena oligopeptidna jedinjenja naročito se koriste u lečenju ili sprečavanju prekomernog, neželjenog ili nekontrolisanog prozapaljenjskog citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi kod subjekta, npr. subjekta sa infektivnom bolešću ili infekcijom ili bolešću ili stanjem koje infekcija pogoršava ili uzrokuje.
[0170] Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da efekat APIM peptida na oslobađanje citokina može zavisiti od jačine interakcije između APIM peptida i njegovog(njihovih) polipeptidnog(ih) cilja(eva). Stoga, kako različiti APIM peptidi mogu stupati u interakciju sa ciljanim polipeptidima različitih afiniteta, smatra se da se doza bilo kog APIM peptida može nezavisno odrediti. Međutim, doza bilo kog APIM peptida može se rutinski odrediti. Generalno, pogodna doza može se definisati kao doza koja ne izaziva apoptozu, tj. doza koja ne dovodi do apoptoze, koja se može utvrditi analiziranjem minimalne koncentracije oligopeptidnog jedinjenja potrebne za izazivanje apoptoze u ćeliji, npr. pomoću standardnog in vitro ispitivanja.
[0171] Budući da terapijske primene i upotrebe ovog pronalaska generalno mogu uključivati inhibiranje oslobađanja citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, u ovde otkrivenoj terapiji i upotrebama mogu se ciljati bilo koje neproliferišuće imune ćelije u krvi. Takve neproliferišuće imune ćelije mogu uključivati zdrave ili bolesne ćelije, a naročito ćelije koje su uključene u oslobađanje citokina. Na primer, takve ćelije mogu naročito uključivati monocite, npr. ćelije koje prikazuju receptor CD14 na ćelijskoj površini i/ili receptor CD16 na ćelijskoj površini.
[0172] Ćelije koje treba ciljati u ovde otkrivenim i obuhvaćenim terapijama i upotrebama naročito su povezane sa oslobađanjem prozapaljenjskih citokina i hemokina. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, pored toga, ili kao alternativa prikazanim receptorima ćelijskih površina, neproliferišuće imune ćelije, npr. monociti, mogu se okarakterisati ili definisati njihovom mogućnošću da oslobađaju (npr. izlučuju) bilo koji citokin ili hemokin ili više njih izabranih od TNFa, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, BazniFGF, G-CSF, GM-CSF, INFγ, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-β, CCL5 i VEGF.
[0173] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, neproliferišuće imune ćelije predstavljaju monocite, naročito monocite koji prikazuju receptor CD14 na ćelijskoj površini i/ili receptor CD16 na ćelijskoj površini. U nekim načinima ostvarivanja, neproliferišuće imune ćelije predstavljaju monocite koji mogu oslobađati (npr. monocite koji izlučuju ili oslobađaju) bilo koji citokin ili hemokin ili više njih izabranih od TNFa, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, BazniFGF, G-CSF, GM-CSF, INFγ, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-β, CCL5 i VEGF.
[0174] Kako se ovde upotrebljava, pojam „lečenjeˮ se široko odnosi na bilo koji efekat ili fazu (ili intervenciju) koja je korisna u upravljanju kliničkim stanjem ili poremećajem i stoga uključuje i terapijska i profilaktička lečenja. Lečenje može uključivati smanjivanje, ublažavanje, poboljšavanje, usporavanje razvoja, ili eliminisanje stanja ili njegovog jednog simptoma ili više njih, koje se leči, u odnosu na stanje ili simptom pre lečenja, ili poboljšavanje kliničkog statusa subjekta na bilo koji način. Lečenje može uključivati bilo koju kliničku fazu ili intervenciju koja doprinosi, ili je deo, programa ili režima lečenja. Profilaktičko lečenje može uključivati odlaganje, ograničavanje, smanjivanje ili sprečavanje stanja ili nastanka stanja, ili njegovog jednog simptoma ili više njih, na primer u odnosu na stanje ili simptom pre profilaktičkog lečenja. Profilaksa stoga izričito uključuje i apsolutno sprečavanje javljanja ili razvoja stanja, ili njegovog simptoma, i bilo koje odlaganje početka ili razvoja stanja ili simptoma, ili smanjivanje ili ograničavanje razvoja ili napredovanja stanja ili simptoma.
[0175] Lečenje prema nekim apsektima ovog pronalaska stoga uključuje smanjivanje ili snižavanje nivoa ili količina jednog citokina ili više njih oslobođenih u krv iz neproliferišućih imunih ćelija, npr. kao odgovor na infekciju, kao što je mikrobna, virusna ili parazitska infekcija. Lečenje takođe uključuje sprečavanje ili inhibiciju oslobađanja u krv jednog ili više citokina iz neproliferišućih imunih ćelija, npr. sprečavanje ili inhibiciju oslobađanja citokina iznad nivoa ili količine za koju se smatra da je unutar normalnog opsega. Stoga, u nekim aspektima ovog pronalaska, lečenje se može smatrati kao održavanje nivoa ili količine jednog citokina u krvi ili više njih unutar normalnog opsega. Normalni opseg može zavisiti od subjekta koji se leči. Stoga, na primer, normalni opseg može biti količina ili nivo pomenutog jednog citokina ili više njih kod zdravog subjekta. Alternativno, normalan opseg može biti prosečni ili uobičajeni nivo ili količina pomenutog jednog citokina ili više njih kod subjekata koji pate od određene bolesti ili stanja kao što je ovde definisano, npr. infekcije. Stoga, lečenje može podrazumevati smanjivanje ili snižavanje prekomernog, neželjenog ili nivoa ili količine jednog citokina ili više njih iznad normalne koja je oslobođena u krv iz neproliferišućih imunih ćelija. Lečenje takođe može obuhvatati sprečavanje ili inhibiciju oslobađanja neželjenih, prekomernih ili količina ili nivoa iznad normalnih jednog od više citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi. Pojam „lečenjeˮ ne označava nužno izlečenje ili potpuno ukidanje ili eliminaciju neželjenog, prekomernog ili oslobađanja citokina iznad normalnog iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi.
[0176] Pojam „poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krviˮ ovde se široko upotrebljava kako bi obuhvatio bilo koji poremećaj ili stanje koje uključuje povećane, nepoželjne, neželjene ili prekomerne količine ili nivoe citokina u krvi kao rezultat oslobađanja citokina iz neproliferišućih imunih ćelija. Dakle nisu uključena samo stanja u kojima su nivoi jednog citokina ili više njih u krvi povišeni, na primer u odnosu na normalne ili zdrave nivoe citokina, ili nivoe citokina u odsustvu stanja o kom se radi (npr. u poređenju ili u odnosu na zdrav ili kontrolni subjekat, ili u poređenju ili u odnosu na nivoe citokina uzete od zdravog ili nezahvaćenog tkiva kod istog subjekta), već i stanja u kojima nivo citokina nije povišen (ili nije u velikoj meri ili značajno povišen) u odnosu na normalan, već u kom je nivo citokina koji se javlja neželjen ili nepoželjan, bilo generalno ili u određenom kontekstu. Ovo na primer može uključivati neželjeno ili nepoželjno oslobađanje citokina koje se može javiti kod „normalnogˮ odgovora, npr. imunog odgovora ili zapaljenjskog odgovora itd. (drugim rečima „normalnogˮ odgovora koji se može javiti u određenom (npr. normalnom) kontekstu, ali koji svejedno može biti neželjen). Takav neželjen odgovor na oslobađanje citokina može na primer biti oslobađanje citokina koje daje neželjeni zapaljenjski odgovor ili neželjeni imuni odgovor kao što je autoimuni odgovor, alergijska reakcija, odbacivanje transplantovanog organa ili tkiva itd.
[0177] Poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi okarakterisano je kao hipercitokinemija, koja se može smatrati neželjenim ili prekomernim oslobađanjem, ili povećanjem nivoa ili količine, jednog citokina u krvi ili više njih. U nekim načinima ostvarivanja, hipercitokinemija može biti globalno oslobađanje citokina, koje obuhvata neželjeno (npr. nekontrolisano, prekomerno ili iznad normalnog) oslobađanje ili povećavanje višestrukih citokina, npr. povećanje nivoa najmanje 2 ovde definisana citokina, kao što je povećanje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više citokina kao što je ovde definisano. Oslobađanje ili povećanje višestrukih citokina može se nazvati „citokinska olujaˮ. Shodno tome, poremećaj ili stanje kog treba lečiti predstavlja stanje koje dovodi do, npr. može dovesti do, hipercitokinemije, kao što je citokinska oluja, npr. sepsa ili malarija. U drugim načinima ostvarivanja, hipercitokinemija je povezana sa oslobađanjem specifičnih citokina u krv, npr. povećanjem određenog citokina. Na primer, prekomerno ili povišeno oslobađanje interferon-β (INF-β) kao odgovor na virusnu infekciju, npr. akutna ili trajna (hronična) virusna infekcija, vremenom može dovesti do brojnih zapaljenjskih ili autoimunih bolesti, kao što je sistemski eritemski lupus, anemija i druge autoimune bolesti.
[0178] Ovde opisani agens koristi se kao direktni terapijski agens, npr. za lečenje poremećaja ili stanja povezanog sa hipercitokinemijom, tj. za olakšavanje smanjivanja nivoa ili količina pomenutog neželjenog ili prekomernog (iznad normalnog) jednog citokina ili više njih kod subjekta kod kog je poremećaj ili stanje već napredovalo do hipercitokinemije. Stoga, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može se posmatrati kao poremećaj ili stanje koje dovodi do (može dovesti do) hipercitokinemije. Alternativno gledano, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može se posmatrati kao hipercitokinemija koja nastaje kao rezultat povezanog poremećaja ili stanja, npr. hipercitokinemija koja nastaje kao rezultat infekcije.
[0179] Neželjeno ili prekomerno oslobađanje (npr. nekontrolisano ili iznad normalnog) ili povećanje nivoa ili količine jednog citokina u krvi ili više njih može se definisati kao povećanje jednog citokina ili više njih za najmanje 10% u odnosu na normalne nivoe. Kao što je prethodno pomenuto, normalni nivoi se mogu definisati, npr. u odnosu na nivoe u krvi zdravog subjekta ili nivoe u drugom tkivu subjekta kog treba lečiti. U nekim načinima ostvarivanja normalni nivoi se mogu definisati u odnosu na prosečne ili uobičajene nivoe kod subjekta sa poremećajem ili stanjem kog treba lečiti ili sprečiti, npr. prosečne ili uobičajene nivoe kod subjekta u ranoj fazi poremećaja ili stanja, tj. stanja gde će napredovanje stanja dovesti do neželjenog oslobađanja jednog citokina ili više njih. U nekim načinima ostvarivanja, neželjeno ili prekomerno oslobađanje ili povećanje može biti povećanje za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50%, npr. najmanje 60, 70, 80, 90 ili 100%. Opet u drugim načinima ostvarivanja, može biti povećanje od najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 puta u odnosu na normalne nivoe, kao što je najmanje 15, 20, 30, 40, 50 ili 100 puta od normalnih nivoa. Biće očigledno da će opseg povećanja, u izvesnoj meri, zavisiti od prirode jednog citokina o kom se radi ili više njih. Stoga se gornje vrednosti mogu primeniti na jedan citokin ili se to povećanje može izmeriti kao prosek ukupnog povećanja, tj. tamo gde je više od jednog citokina povećano.
[0180] Smanjenje neželjenih ili prekomernih (npr. nekontrolisanih ili iznad normalnih) nivoa ili količina jednog citokina u krvi ili više njih može se definisati kao smanjenje jednog citokina ili više njih za najmanje 10%, npr. u odnosu na nivoe pre lečenja. U nekim načinima ostvarivanja, neželjeni ili prekomerni nivoi ili količine mogu se smanjiti za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50%, npr. najmanje 60, 70, 80, 90 ili 100%. Opet u drugim načinima ostvarivanja, to može biti smanjenje od najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 puta od količina ili nivoa pre lečenja, kao što je smanjenje od najmanje 15, 20, 30, 40, 50 ili 100 puta. U nekim načinima ostvarivanja, smanjenje može biti smanjenje količine ili nivoa u okviru oko 25% ili manje od normalnog nivoa, pri čemu je normalni nivo kao što je gore definisano. Stoga, ovo smanjenje može biti smanjenje do unutar oko 20, 15, 10, 5% ili manje od normalnog nivoa. Biće očigledno da će opseg smanjivanja ili snižavanja, u izvesnoj meri, zavisiti od prirode jednog citokina o kom se radi ili više njih. Stoga se gornje vrednosti mogu primeniti na jedan citokin ili se smanjenje ili snižavanje može izmeriti kao prosek ukupnog smanjenja, tj. tamo gde je nivo ili količina više od jednog citokina smanjena.
[0181] U nekim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovode do smanjenja citokina i/ili hemokina izabranog od bilo kog ili više od TNFa, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, BazniFGF, G-CSF, GM-CSF, INFγ, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-β, CCL5 i VEGF. U nekim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovode do smanjenja jednog ili više od TNFa, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-17, G-CSF, INFγ, CXCL10, CCL2, CCL3 i CCL4 (npr. kod bolesti ili stanja povezanog sa bakterijskom infekcijom). U daljim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovode do smanjenja jednog ili više od TNFa, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-17, G-CSF i INFγ (npr. kod bolesti ili stanja povezanog sa bakterijskom infekcijom). U nekim određenijim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovodi do smanjenja jednog ili više od IFNγ, IL-1RA, IL-2, 4 i 9 (npr. kod bolesti ili stanja povezanog sa bakterijskom infekcijom). Opet u daljim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovode do smanjenja jednog ili više od TNFa, IL-1β, IL-8 (CXCL8), CXCL10, CCL2, CCL3 i CCL4 (npr. kod bolesti ili stanja povezanog sa virusnom infekcijom). U nekim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovode do smanjenja jednog ili više od TNFa, IL-8 (CXCL8), CXCL10, CCL2, CCL3 i CCL4 (npr. kod bolesti ili stanja povezanog sa virusnom infekcijom). U nekim određenijim načinima ostvarivanja, agens ili kompozicija dovode do smanjenja jednog ili više od IL-1RA, CCL2, 3 i 4 (npr. kod bolesti ili stanja povezanog sa virusnom infekcijom).
[0182] Identifikacija, karakterizacija, dijagnoza i/ili napredovanje poremećaja ili stanja kog treba lečiti i/ili efikasnost lečenja može se olakšati merenjem jednog citokina u krvi ili više njih. U tehnici su dobro poznata razna ispitivanja za merenje citokina, a standardni kompleti su komercijalno dostupni.
Uobičajeni postupci se oslanjaju na imunološka ispitivanja, npr. ELISA, RIA itd., i mogu se izvoditi pomoću raznih uzoraka krvi, kao što su serum, plazma ili cela krv.
[0183] Stoga, u opštem načinu ostvarivanja ovog pronalaska poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi predstavlja zapaljenjsku bolest (npr. zapaljenjski artritis, psorijazni artritis, reumatoidni artritis, zapaljenjsku bolest creva) ili autoimunu bolest (npr. sistemski eritemski lupus). Shodno tome, može se primetiti da ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa zapaljenjskom ili autoimunom bolešću.
[0184] U nekim određenijim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi predstavlja infekciju ili infektivnu bolest. Stoga, ovaj pronalazak može obezbediti agens ili kompoziciju kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa infekcijom ili infektivnom bolešću.
[0185] „Infekcijaˮ ili „infektivna bolestˮ može se definisati kao bolest, stanje ili poremećaj uzrokovan napadom na subjekta, npr. jednog organa ili tkiva pomenutog subjekta ili više njih, od strane jednog organizma koji uzrokuje bolest ili više njih i njihovih naknadnih umnožavanja. U nekim slučajevima, infekcija ili infektivna bolest može se okarakterisati reakcijom subjekta (npr. organa ili tkiva pomenutog subjekta) na pomenute organizme i, u nekim slučajevima, na toksine koje proizvode pomenuti organizmi. Infekcija ili infektivna bolest može biti mikrobna, virusna ili parazitska infekcija i može biti lokalna ili sistemska. Mikrobna infekcija može biti bilo koja bakterijska ili gljivična infekcija, tj. uzrokovana bakterijom ili gljivicom. U naročito poželjnim načinima ostvarivanja, bolest, stanje ili poremećaj uzrokovan virusnom infekcijom nije hiperproliferativna bolest koju izaziva virus, kao što su bradavice i bolest koju izaziva EBV (npr. infektivna mononukleoza), stvaranje ožiljka i slično.
[0186] U nekim načinima ostvarivanja, infektivna bolest ili infekcija može biti bakterijska infekcija ili bolest. Primeri bakterija koje uzrokuju ovde opisane infekcije ili infektivne bolesti mogu biti gram pozitivne ili gram negativne, ili one koje ne odgovaraju prilikom gram ispitivanja. Mogu biti aerobne ili anaerobne bakterije. Na primer, bakterije mogu biti iz bilo kog roda od Achromobacter, Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Alteromonas, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Borrelia, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Cardiobacterium, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Edwardsiella, Eikenella, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Helicobacter, Kingella, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Mobiluncus, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Salmonella, Shewenella, Shigella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Treponem and Yersinia, kao što su Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Chlamydia, Clostridium, Helicobacter, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Legionella, Listeria, Mycobacterium, Proteus, Klebsiella, Fusobacterium ili druge enterične ili koliformne bakterije.
[0187] Stoga, na primer, infekcija ili infektivna bolest može biti uzrokovana gram pozitivnim bakterijama kao što su, M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, M. bovis soj BCG, BCG podsojevi, M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium subspecies paratuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus anthracis, B. subtilis, Nocardia asteroides, Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes i Enterococcus species.
[0188] U drugim načinima ostvarivanja, infekcija ili infektivna bolest može biti uzrokovana gram negativnim bakterijama kao što su Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumonijae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Chlamydi
4
trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetti, Escherichia coli, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Haemophilus gripe, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia coli, E. hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum i Cowdria ruminantium.
[0189] Stoga, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može biti rezultat, npr. uzrokovano, bakterijskom infekcijom ili infektivnom bolešću, kao što je sepsa.
[0190] U nekim načinima ostvarivanja, bakterijska infekcija može biti povezana sa određenim poremećajem ili stanjem, tj. subjekti koji pate od određenog poremećaja ili stanja mogu biti naročito podložni jednoj bakterijskoj infekciji ili više njih. Na primer, uobičajeno je za subjekte sa cističnom fibrozom da pate od hroničnih Pseudomonas infekcija. Stoga se može smatrati da se ovaj pronalazak produžava na agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije koju infekcija pogoršava ili uzrokuje, npr. bakterijska pneumonija, cistična fibroza, čirevi na želucu, bakterijski meningitis, legioneloza (legionarska bolest), legioneloza (pontijska groznica), pertusis (veliki kašalj), salmoneloza, tuberkuloza itd.
[0191] Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, stanje ili bolest uzrokovana infekcijom je sepsa, koja predstavlja stanje koje nastaje kao rezultat ozbiljne infekcije. Shodno tome, može se reći da ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa sepsom.
[0192] U nekim načinima ostvarivanja, stanje ili bolest pogoršano infekcijom je cistična fibroza, koja predstavlja stanje koje je uobičajeno povezano sa hroničnom Pseudomonas infekcijom. Shodno tome, može se smatrati da ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju subjekta sa cističnom fibrozom, npr. koji pati od infekcije, tj. ublažavanje jednog simptoma ili više njih kod subjekta koji pati od cistične fibroze).
[0193] U nekim načinima ostvarivanja, infektivna bolest ili infekcija može biti gljivična infekcija ili bolest. U nekim aspektima ovog pronalaska gljivica može biti plesan ili kvasac, poželjno kvasac. Gljivica može biti izabrana od bilo koje ili više njih od Dermatophyte, Aspergillus sp. (kao što je Aspergillus fumigatus, Aspergillus nigricans ili flavescens), Zygomycota sp., Fusarium sp., Trichophyton sp,. Basidiobolus ranarum, Piedraia sp. (kao što je Piedraia hortae), Blastomyces dermatitidis, Candida sp. (kao što je Candida albicans), Chrysosporium, Coccidioides sp. (kao što su Coccidioides immitis i Coccidioides posadasii), Conidiobolus sp. (kao što su Conidiobolus coronatus i Conidiobolus incongruus), Cryptococcus sp. (kao što su Cryptococcus gattii i Cryptococcus neoformans), Histoplasma sp. (kao što su Histoplasma farciminosum i Histoplasma capsulatum), Exserohilum rostratum,
Cladosporium sp., Saccharomyces sp., Lacazia Ioboi, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, Pneumocystis jirovecii, Sporothrix schenckii, Diheterospora zeaspora, Absidia corymbifera, Apophysomyces elegans, Mucor indicus, Rhizomucor pusillus, Rhizopus oryzae, Cunninghamella bertholletiae, Cokeromyces recurvatus, Saksenaea vasiformis, Syncephalastrum
racemosum i Conidiobolus sp. (kao što su Conidiobolus coronatus i Conidiobolus incongruus).
[0194] Kao reprezentativni primer, gljivice koje uzrokuju infekcije ili infektivne bolesti uključuju gljivice od rodova Candida, Aspergillus, Pneumocystis, Penicillium i Fusarium. Reprezentativne gljivične vrste uključuju, ali nisu ograničene na, Candida albicans, Candida dubliniensis, Cryptococcus neoformans, Histoplama capsulatum, Aspergillus fumigatus, Coccidiodes immitis, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermitidis, Pneomocystis carnii, Penicillium marneffi i Alternaria alternate itd.
[0195] Razni spoljašnji i fiziološki uslovi mogu doprineti razvoju gljivičnih bolesti i infekcija. Gljivične infekcije (mikoze) obično počinju u plućima ili na koži, npr. gljivična infekcija (mikoza) može nastati kao rezultat inhalacije gljivičnih spora ili lokalizovana kolonizacija kože može započeti trajne infekcije. Stoga, bolest ili stanje koje gljivična infekcija (mikoza) pogoršava ili uzrokuje može biti u bilo kom tkivu ili organu subjekta kog treba lečiti, kao što su pluća (uključujući respiratorni trakt), koža (uključujući rane), usta, uho, oko itd. Stoga, gljivična infekcija može biti respiratorna infekcija, kožna infekcija, infekcija uha, infekcija oka itd.
[0196] Stoga, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može biti rezultat, npr. uzrokovano, gljivičnom infekcijom ili infektivnom bolešću, uzrokovano bilo kojom gore opisanom gljivicom (ili gljivicom iz jednog ili više rodova) ili više njih.
[0197] Stoga, uopštenije, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može biti rezultat, ili pogoršano usled, mikrobne infekcije, kao što je mikrob izabran od bilo koje ili više njih iz rodova Actinebacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes, Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholderia, Fusobacterium i Mycobacterium, na primer, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia i Streptococcus Pyogenes.
[0198] U nekim načinima ostvarivanja, infektivna bolest ili infekcija može biti virusna infekcija ili bolest. Primeri virusa koji uzrokuju infekcije ili infektivne bolesti uključuju lizavirus australijskih slepih miševa, bana virus, virus šume Barma, Bunyamwera virus, Bunyavirus La Crosse, Bunyavirus snowshoe hare, virus herpesa Cercopithecine, Chikungunya virus, virus Krimsko-kongoanske hemoragijske groznice, denga virus, dori virus, Dagba virus, Duvenhag virus, virus istočnog konjskog encefalitisa, virus ebole, ehovirus, virus encefalomijokarditisa, lizavirus evropskih slepih miševa, Hantan virus, hendra virus, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, virus hepatitisa E, virus hepatitisa delta, humani herpesvirus 1, humani adenovirus, humani astrovirus, humani korona virus, humani citomegalovirus, humani enterovirus 68-70, humani herpesvirus 2, humani herpes virus 6, humani herpes virus 7, humani herpes virus 8, humani imunodeficijentni virus, humani paragrip, humani parvovirus B19, humani respiratorni sincitijalni virus, humani rinovirus, humani SARS korona virus, humani T-limfotropski virus, humani torovirus, virus gripa A, virus gripa B, virus gripa C, virus Isfahana, JC poliomavirus, virus japanskog encefalitisa, arenavirus Junina, KI Poliomavirus, Kunjin virus, virus slepog miša sa Lagosa, marburgvirus sa jezera Viktorija, langat virus, lasa virus, Lordsdejl virus, Louping ill virus, virus limfocitnog horiomeningitisa, mačupo virus, majaro virus, virus malih boginja, Mengo virus encefalomijokarditisa, Mokola virus, Molluscum contagiosum virus, virus boginja majmuna, virus zauški, virus encefalitisa doline Murray, virus Njujorka, Nipa virus, Norwalk virus, O'nyong-nyong virus, Orf virus, virus oropouče, Pichinde virus, virus dečije paralize, Punta toro flebovirus, virus pumala, virus besnila, virus groznice doline Rift, virus reke Ros, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, virus rubeole, sagijama virus, sicilijanski virus peščane mušice, Sapporo virus, virus Semliki šume, virus Seula, Sindbis virus, virus Sautemptona, St. louis virus encefalitisa, Tick-borne powassan virus, Toskana virus, Uukuniemi virus, virus varičela zoster, virus variole, venecuelski konjski virus encefalitisa, virus vezikularnog stomatitisa, zapadni konjski virus encefalitisa, virus zapadnog Nila i virus žute groznice.
[0199] Kao reprezentativni primer, virusi koji uzrokuju ovde opisane infekcije ili infektivne bolesti naročito mogu biti izabrani od bilo kog ili više njih iz grupe koju čine denga virus, virus ebole, ehovirus, virus encefalomijokarditisa, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, virus hepatitisa E, virus hepatitisa delta, humani virus herpesa 1, humani adenovirus, humani astrovirus, humani korona virus, humani citomegalovirus, humani enterovirus 68-70, humani herpesvirus 2, humani herpesvirus 6, humani herpesvirus 7, humani herpesvirus 8, humani virus imunodeficijencije, humani paragrip, humani parvovirus B19, humani respiratorni sincijalni virus, humani rinovirus, humani SARS korona virus, humani T-limfotropski virus, humanitorovirus, virus gripa A, virus gripa B, virus gripa C, japanski virus encefalitisa, virus malih boginja, virus zauški, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, virus rubeole, virus zapadnog Nila i virus žute groznice.
[0200] Međutim, kao što je prethodno pomenuto, u naročito poželjnim načinima ostvarivanja, virusna infekcija nije infekcija koja uzrokuje ili dovodi do hiperproliferativne bolesti izazvane virusom, kao što su bradavice i bolest izazvana EBV (npr. infektivna mononukleoza), stvaranje ožiljka i slično.
[0201] Stoga, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može biti rezultat, npr. uzrokovano, virusnom infekcijom ili infektivnom bolešću, kao što je SIDA/HIV, denga groznica, male boginje, zauške, rubeola, grip i hepatitis.
[0202] Shodno tome, može se smatrati da ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa virusnom infekcijom, npr. SIDA/HIV, denga groznicom, malim boginjama, zauškama, rubeolom, gripom ili hepatitisom.
[0203] U nekim načinima ostvarivanja, infektivna bolest ili infekcija može biti parazitska infekcija ili bolest. Primeri parazita koji uzrokuju infekcije ili infektivne bolesti uključuju Plasmodium sp., kao što su infekcije Plasmodium falciparum, Plasmodium knowlesi, Plasmodium vivax, Plasmodium
4
berghei i Plasmodium yoelii, protozou kao što je Toxoplasma vrsta npr. Toxoplasma gondii, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania vrste kao što su Leishmania major, Schistosoma kao što su Schistosoma mansoni i Entamoeba histolytica.
[0204] Stoga, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi može biti rezultat, npr. uzrokovano, parazitskom infekcijom ili infektivnom bolešću, kao što su malarija, toksoplazmoza, tripanosomijaza i šistosomijaza.
[0205] U daljim načinima ostvarivanja stanje ili bolest uzrokovana infekcijom je parazitska infekcija, kao što je malarija, koja predstavlja stanje koje je rezultat parazitske infekcije, npr. Plasmodium infekcije, kao što je Plasmodium falciparum, Plasmodium knowlesi, Plasmodium vivax, Plasmodium
berghei ili Plasmodium yoelii infekcija. Shodno tome, može se smatrati da ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa parazitskom infekcijom, npr. malarijom, toksoplazmozom, tripanosomijazom ili šistozomijazom.
[0206] Opet u daljim načinima ostvarivanja, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi predstavlja bolest kalem protiv domaćina (GVHD), tj. imuni odgovor povezan sa transplantacijom ćelija, tkiva ili organa primaocu iz genetski neidentičnog davaoca istih vrsta. Može se smatrati da je transplantat alograft, alogeneski transplantat ili homograft. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, transplantat može biti transplantat matičnih ćelija i/ili koštane srži.
Shodno tome, agens ili kompozicija mogu biti za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa bolešću kalem protiv domaćina.
[0207] Opet u daljim načinima ostvarivanja, poremećaj ili stanje povezano sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi predstavlja traumu, npr. traumu uzrokovanu povredom (tj. fizičkom ranom ili povredom, kao što je fraktura ili udarac, npr. politrauma (koja zahvata više mesta), trauma glave, trauma grudnog koša, trauma abdomena ili trauma ekstremiteta) ili operacija. U nekim slučajevima, povreda ili rana koja nastaje kao rezultat traume može biti opekotina. Opekotinu može uzrokovati toplota, struja, hemikalije, trenje ili zračenje. U nekim načinima ostvarivanja, opekotina predstavlja delimično duboku ili opekotinu drugog stepena (koja obuhvata oštećenje nekih osnovnih slojeva kože). U nekim načinima ostvarivanja, opekotina je duboka ili opekotina trećeg stepena (koja obuhvata oštećenje koje se širi na sve slojeve kože). U nekim načinima ostvarivanja, opekotina predstavlja opekotinu četvrtog stepena, koja dodatno uključuje povredu dubljih tkiva, kao što je mišić ili kost.
[0208] Shodno tome, agens ili kompozicija može biti za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa traumom (npr. uzrokovanom povredom ili operacijom).
[0209] Hipercitokinemija, koja može biti rezultat bolesti ili stanja kao što je ovde opisano, kao što je sepsa, malarija, bolest kalem protiv domaćina (GVHD) itd. može kod nekih subjekata dovesti do, ili povećati rizik od, sindroma disfunkcije više organa (MODS), koji je takođe poznat i kao multipla insuficijencija organa (MOF) ili multisistemska insuficijencija organa (MSOF). Stoga, u nekim načinima ostvarivanja ovaj pronalazak obezbeđuje agens ili kompoziciju kao što je ovde definisano za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta sa MODS.
[0210] Kao što je prethodno napomenuto, u nekim načinima ostvarivanja agens ili kompozicija kao što je ovde definisana koristi se u kombinaciji sa jednim dodatnim aktivnim agensom ili više njih, npr. imunosupresivnim jedinjenjem, antizapaljenjskim jedinjenjem, antimikrobnim jedinjenjem ili steroidom (npr. kortikosteroidom) ili inhibitorom kinaze (kao što je p38 MAPK inhibitor ili PI3K inhibitor klase I), kako bi se pojačao ili dopunio efekat ovde definisanog agensa ili kompozicije, npr. da bi se lečili simptomi bolesti ili stanja koji nisu direktno zahvaćeni agensom ili kompozicijom ovog pronalaska. Ipak, u nekim načinima ostvarivanja, agens kao što je ovde definisan može se koristiti sam, tj. kao jedini aktivni agens u kompoziciji i/ili leku.
[0211] U nekim načinima ostvarivanja, dodatni aktivni agens je imunosupresivno jedinjenje. Pogodna imunosupresivna jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, bilo koji ili više njih iz grupe koju čine glukokortikoidi, ciklofosfamid, metotreksat, azatioprin, merkaptopurin, daktinomicin, antraciklin, mitomicin C, bleomicin i mitramicin.
[0212] U nekim načinima ostvarivanja, dodatni aktivni agens predstavlja antizapaljenjsko jedinjenje. Pogodna antizapaljenjska jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, bilo koji ili više njih iz grupe koju čine diklofenak, ibuprofen, naproksen, celekoksib, mefenaminska kiselina, etorikoksib, indometacin i aspirin.
[0213] U nekim načinima ostvarivanja, dodatni aktivni agens predstavlja antibiotsko jedinjenje. Pogodna antibiotska jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, bilo koji ili više njih iz grupe koju čine aminokumarini (kao što su novobiocin, albamicin, kumermicin i klorobiocin), aminoglikozidi (kao što su amikacin, apramicin, gentamicin, kanamicin, neomicin, netilmicin, tobramicin, paromomicin i spektinomicin), ansamicini (kao što su geldanamicin, herbimicin, rifaksimin i streptomicin), karbapenemi (kao što je ertapenem, doripenem, cilastatin ('Imipenem') i meropenem), cefalosporini (kao što su cefadroksil, cefazolin, cefalotin ('cefalotin'), cefaleksin, cefaklor, cefamandol, cefoksitin, cefprozil, cefuroksim, cefiksim, cefdinir, cefoperazon, cefotaksim, cefpodoksim, ceftazidim, ceftibuten, ceftizoksim, ceftriakson, cefepim, ceftarolin fozamil i ceftobiprol) glikopeptidi (kao što su teikoplanin, vankomicin i telavancin), linkozamidi (kao što je klindamicin i linkomicin), lipopeptidi (kao što je daptomicin), makrolidi (kao što su azitromicin, klaritromicin, diritromicin, eritromicin, roksitromicin, troleandomicin, telitromicin i spiramicin), monobaktami (kao što je aztreonam), nitrofurani (kao što su furazolidon i nitrofurantoin), oksazolidononi (kao što su linezolid, pozizolid, radezolid i torezolid), penicilini (kao što je amoksicilin, ampicilin, azlocilin, karbenicilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukloksacilin, mezlocilin, meticilin, nafcilin, oksacilin, penicilin G, penicilin V, piperacilin, temocilin i tikarcilin), kombinacije penicilina (kao što su amoksicilin/klavulanat, ampicilin/sulbaktam, piperacilin/tazobaktam i
4
tikarcilin/klavulanat), polietri (kao što je monensin), polipeptidi (kao što su bacitracin, kolistin i polimiksin B), kvinoloni (kao što su ciprofloksacin, enoksacin, gatifloksacin, levofloksacin, lomefloksacin, moksifloksacin, nalidinska kiselina, norfloksacin, ofloksacin, trovafloksacin, grepafloksacin, sparfloksacin i temafloksacin); sulfonamidi (kao što su mafenid, sulfacetamid, sulfadijazin, srebro-sulfadijazin, sulfadimetoksin, sulfametizol, sulfametoksazol, sulfanilimid, sulfasalazin, sulfisoksazol, sulfametoksazol (Ko-trimoksazol, TMP-SMX, 'Trimetoprim') i sulfonamidohrizoidin), tetraciklini (kao što su demeklociklin, doksiciklin, minociklin, oksitetraciklin i tetraciklin) i drugi (kao što su klofazimin, dapson, kapreomicin, cikloserin, etambutol, etionamid, izoniazid, pirazinamid, rifampicin ('Rifampin'), rifabutin, rifapentin, streptomicin, arsfenamin, hloramfenikol, fosfomicin, fuzidinska kiselina, metronidazol, mupirocin, platensimicin, kvinupristin (dalfopristin), tiamfenikol, tigeciklin, tinidazol i trimetoprim).
[0214] U nekim načinima ostvarivanja, dodatni aktivni agens je antigljivično jedinjenje. Pogodna antigljivična jedinjenja (antimikotici) uključuju, ali nisu ograničena na, bilo koje ili više njih iz grupe koju čine polienski antigljivični preparati (kao što su amfotercin B, kandicidin, filipin, hamicin, natamicin, nistatin i rimocidin), imidazoli (kao što su bifonazol, butokonazol, klotrimazol, ekonazol, fentikonazol, izokonazol, ketokonazol, mikonazol, omokonazol, oksikonazol, sertakonazol, sulkonazol i tiokonazol), trijazoli (kao što su albakonazol, flukonazol, izavukonazol, itrakonazol, posakonazol, ravukonazol, terkonazol i vorikonazol), tiazoli (kao što je abafungin), alilamini (kao što su amorolfin, butenafin, naftifin i terbinafin), ehinokandini (kao što su anidulafungin, kaspofungin i mikafungin) i drugi kao što su benzoična kiselina, ciklopiroks, flukitozin ili 5-fluorocitozin, griseofulvin, haloprogin, poligodijal, tolnaftat, undecilenska kiselina i kristalno ljubičasta.
[0215] U nekim načinima ostvarivanja, dodatni aktivni agens je inhibitor kinaze. Pogodni inhibitor kinaze uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji ili više njih iz grupe koju čine p38 MAPK inhibitori (kao što su VX-702, SB203580, VX-745, LY2228820, BIRB 796 (doramapimod), PH-797804 i TAK-715) i PI3K inhibitori klase I (kao što su AS-605240, BYL719, CAL-101, GDC-0941 (bizmezilatna so), GDC-0941 (slobodna baza), GSK2636771, IC-87114, IPI-145, LY294002, NVP-BKM120 (Buparlisib), PIK-75, TG100-115 i TGX-221).
[0216] Kao što je prethodno rečeno, pogodna doza može se definisati kao doza koja ne izaziva apoptozu, tj. doza koja ne dovodi do apoptoze. U nekim načinima ostvarivanja, pogodna doza se može definisati kao „mala dozaˮ ili „mala količinaˮ agensa (npr. oligopeptidnog jedinjenja), koja se može smatrati dozom ili količinom koja nije dovoljna da direktno ili indirektno uzrokuje ili izazove apoptozu. Alternativno gledano, „mala dozaˮ ili „mala količinaˮ agensa je doza ili količina koja predstavlja efikasnu dozu ili količinu za smanjivanje ili inhibiranje oslobađanja citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi.
[0217] Shodno tome se velika doza ili količina može smatrati efikasnom dozom ili količinom koja je dovoljna da se direktno ili indirektno uzrokuje ili izazove apoptozu (tj. citotoksične doze ili doze koje dovode do povećane osetljivosti na druge citotoksične ili citostatičke agense).
[0218] Efikasna doza ili količina agensa može zavisiti od karakteristika peptida, npr. jačine interakcije
4
između motiva koji stupa u interakciju sa PCNA i vezujućeg domena ciljanog(ih) proteina. Dalje, efikasna doza ili količina agensa mogu zavisiti od prirode korišćenog jedinjenja (tj. peptida, molekula nukleinske kiseline itd.), načina davanja, toka lečenja, uzrasta i telesne mase pacijenta, medicinske indikacije, tela ili dela tela kog treba lečiti i može varirati ili se prilagođavati prema izboru. Ipak, generalno, mala doza ili količina može dovesti do opsega aktivne koncentracije od oko 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,50, 1,75, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 do 10µM, npr.0,01 do 10µM, npr.0,05 do 7,5µM, kao što je 0,1 do 7,5µM, npr. 0,5 do 5µM. Velika doza ili količina mogu dovesti do opsega aktivne koncentracije od oko 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 do 50µM, npr.1,0 do 50µM, npr.2,0 do 40µM, kao što je 3,0 do 30µM, npr.5,0 do 25µM. Pomenute koncentracije se određuju po količini samog jedinjenja, pa bi se trebala predvideti odgovarajuća dopuštena odstupanja kako bi se u obzir uzela i čistoća kompozicije.
[0219] Subjekat je životinja (tj. bilo koja humana ili nehumana životinja), poželjno sisar, najpoželjnije čovek.
[0220] Stručnjak iz ove oblasti biće svestan pogodnih postupaka za uvođenje agenasa u ćelije kao što je ovde definisano. Primera radi, nekoliko pogodnih postupaka je ukratko predstavljeno u nastavku. Kao što je detaljno bilo reči, mogu se koristiti postupci isporuke posredovani peptidima, naročito peptidima koji prodiru u ćelije (CPP), koji, kao što je prethodno rečeno, predstavljaju kratke, u nekim slučajevima polikatjonske, sekvence koje mogu olakšati ćelijski unos peptida, proteina ili nukleotidnih molekula koji sadrže CPP ili za koje su CPP vezani, na primer pojačavanjem unosa endozoma ćelija sisara. Kao što je prethodno pomenuto, ovde definisano oligopeptidno jedinjenje obuhvata CPP. Ipak, mogu biti korisni i dodatni mehanizmi za olakšavanje unosa agenasa ovog pronalaska, naročito za agense koji obuhvataju ili koji se sastoje od molekula nukleinske kiseline. Mikroinkapsulacija obezbeđuje jednostavan i ekonomičan način za obuhvatanje bioaktivnih materijala unutar polupropusne polimerne membrane radi zaštite bioakitvnih materijala i oslobađanja obuhvaćenih supstanci ili njihovih proizvoda na kontrolisan način. Kod fotohemijske internalizacije (PCI) ćelija u lizozom ili endozom uzima i molekul od značaja i fotosenzitivno jedinjenje. Ćelije se zatim izlažu svetlu pogodnih talasnih dužina kako bi se fotosenzitivno jedinjenje aktiviralo, čime se uzrokuje da fotosenzitivno jedinjenje probije membranu lizozoma ili endozoma, čime se molekul od značaja oslobađa u citozol ćelije.
[0221] Drugi postupci uključuju mikroinjekciju, fuziju crvenih krvnih zrnaca posredovanu duhom, fuziju lipozoma, osmotsku lizu pinozoma, opterećenje struganjem, elektroporaciju, kalcijumfosfatnu i transfekciju posredovanu virusom i upotrebu kopolimernih nosača.
[0222] Hitozan i derivati hitozana rastvorljivi u vodi, određenije glikohitozan, pojavljuju se kao poželjni nosači leka zbog njihove in vivo biokompatibilnosti i biorazgradivosti. Poželjni primer je glikolhitozan hidrofobno modifikovan 5 β-holanskom kiselinom.
[0223] Ovaj pronalazak će sada biti dalje opisan uz pozivanje na sledeće neograničavajuće primere i crteže na kojima:
4
Fig.1 prikazuje da ATX-101 (SEQ ID NO: 1198, koja sadrži APIM motiv, RWLVK (SEQ ID NO: 28)) utiče na MAPK i PI3K/Akt puteve u višestrukim ćelijskim linijama mijeloma, pri čemu: (A) pokazuje ćelijski rast (MTT ispitivanje) netretiranih JJN-3 ćelija (◆) i nakon dodavanja 6 µM ATX-101 (▲), 5 µM LY294002 (PI3K inhibitor klase I) i 10 µM SB20358 (p38 MAPK inhibitor) (•) (levi i desni panel, tim redom), i kombinacije ATX-101 i inhibitora kinaze (□). Podaci su iz jednog reprezentativnog eksperimenta od njih triju; a (B) pokazuje kvantifikaciju p70 S6 kinaze Thr389, Akt Ser473, ERK1 Thr202/Tyr204, a ERK2 Thr185/Tyr187 fosforilacija u JJN-3 ćelijama nakon 4, 8 i 24 h lečenja sa 6 µM ATX-101 Vestern blot analizom. Nivoi fosforilisane kinaze korigovani su zbog razlika u opterećenju (βtubulin) i normalizovane do netretiranih kontrolnih ćelija. Podaci su iz tri nezavisna eksperimenta (srednja vrednost ± SD).
Fig.2 prikazuje da ATX-101 smanjuje izlučivanje citokina monocita nakon TLR stimulacije, pri čemu: (A) i (B) prikazuju multipleksnu analizu nivoa citokina kog proizvode monociti periferne krvi nakon 4h lečenja sa 4 µM ATX-101 u kombinaciji sa 10 ng/ml LPS (A) i 40 µg/ml polylC stimulacijom (B).
Izmereni nivoi citokina su normalizovani do nivoa citokina iz monocita stimulisanih samo TLR ligandom. Dvostruko ili veće povećanje nivoa citokina nakon TLR stimulacije definisano je kao indukcija citokina. Podaci su od tri davaoca (srednja vrednost ± SD); (C) prikazuje ELISA IFN-β nivoa koje proizvode monociti periferne krvi od petorice davalaca. Izolovani monociti stimulisani su sa 10 ng/ml LPS i 40 µg/ml polylC samog i u kombinaciji sa 4 µM ATX-101 tokom 4 h. Davalac 1 je tretiran sa 6 µM ATX-101. # Ispod linearnog opsega; ¤ iznad linearnog opsega; a (D) prikazuje konfokalnu fluorescentnu sliku imunofluorescentno obojenog PCNA (zeleno) u sveže izolovanim monocitima periferne krvi. DRAQ5 je korišćen za nuklearno bojenje (crveno). Stub, 5 µm.
Fig.3 prikazuje da ATX-101 smanjuje Akt fosforilaciju u monocitima, pri čemu: (A) prikazuje Vestern blot analizu Akt Ser473 fosforilacije u monocitima periferne krvi stimulisane sa 10 ng/ml LPS i 40 µg/ml polylC samog i u kombinaciji sa 4 µM ATX-101 tokom 4 h. Gornji panel prikazuje kvantifikaciju fosforilisanog Akt korigovanog zbog razlika u opterećenju (β-tubulin) i normalizovanog do netretiranih kontrolnih ćelija. Podaci su od jednog reprezentativnog davaoca od trojice; a (B-E) prikazuje multipleksnu analizu nivoa citokina koje proizvode monociti periferne krvi stimulisani sa 10 ng/ml LPS (B i D, isti davalac) i 40 µg/ml polylC (C i E, isti davalac) nakon 4 h. (B i C) Stimulisani monociti tretirani su sa 4 µM ATX-101, 10 µM SB203580 (p38 MAPK inhibitor) i kombinacijom ATX-101 i SB203580. (D i E) Stimulisani monociti tretirani su sa 4 µM ATX-101, 5 i 10 µM LY294002 (PI3K inhibitor klase I) i kombinacijom ATX-101 i LY294002. Izmereni nivoi citokina su normalizovani do nivoa citokina iz monocita stimulisanih samo TLR ligandom. Dvostruko ili veće povećanje nivoa citokina nakon TLR stimulacije definisano je kao indukcija citokina. # Vrednost je previše niska da bi
4
se mogla videti na stubičastom dijagramu; ¤ merenje citokina je izvan opsega. Podaci su iz reprezentativnih eksperimenata od njih dvaju.
Fig.4 prikazuje da ATX-101 smanjuje Akt fosforilaciju i nivoe PACT proteina u HaCaT ćelijama, pri čemu: (A) prikazuje kvantifikaciju Akt Ser473 fosforilacije i nivoe PACT proteina u HaCaT ćelijama tretiranim sa 12 µM ATX-101, 2 µg/ml polylC i kombinacijom ATX-101 i polylC tokom 4 h Vestern blot analizom. Nivoi proteina korigovani su zbog razlika u opterećenju (β-tubulin) i normalizovani do netretiranih kontrolnih ćelija. Podaci su iz tri nezavisna eksperimenta (srednja vrednost ± SD); a (B) prikazuje konfokalnu fluorescentnu sliku imunofluorescentno obojenog PCNA u HaCaT ćelijama. Stub, 5 µm.
Fig.5 prikazuje da ATX-101 smanjuje izlučivanje citokina monocita nakon TLR stimulacije, pri čemu: (A) i (B) prikazuju multipleksnu analizu nivoa citokina koje proizvode monociti periferne krvi nakon 4h lečenja sa 4 µM ATX-101 u kombinaciji sa 10 ng/ml PAM3Cys (A) i 10 µg/ml R848 stimulacijom (B). Izmereni nivoi citokina normalizovani su do nivoa citokina iz monocita stimulisanih samo TLR ligandom. Dvostruko ili veće povećanje nivoa citokina nakon TLR stimulacije definisano je kao indukcija citokina. ¤ Merenje citokina je izvan opsega. Podaci su iz jednog eksperimenta od njih dvaju.
Fig.6 prikazuje da ATX-A (SEQ ID NO: 1206, koja sadrži motiv RALVK (SEQ ID NO: 1207), koji nije sposoban da ulazi u interakciju sa PCNA) smanjuje manje efikasno izlučivanje citokina monocita nakon TLR stimulacije, pri čemu multipleksna analiza LPS- i polylC-izazvanih nivoa citokina koje proizvode monociti periferne krvi nakon 4 h lečenja sa 4 µM ATX-101 ili 4 µM ATX-A u kombinaciji sa 10 ng/ml LPS i 40 µg/ml polylC (levi i desni panel, tim redom). Izmereni nivoi citokina normalizovani su do nivoa citokina iz monocita stimulisanih samo TLR ligandom. Podaci su od jednog davaoca. Dobijaju se slični rezultati za IL-6 izlučivanje kod druga dva davaoca.
Fig.7 prikazuje da Akt inhibitor SC66 smanjuje izlučivanje citokina monocita do ili ispod bazalnih nivoa nakon TLR stimulacije, pri čemu multipleksna analiza nivoa citokina koje proizvode monociti periferne krvi nakon 4 h lečenja sa 4 µM ATX-101 i 1 µg/ml SC66 u kombinaciji sa 10 ng/ml LPS (levi panel) i 40 µg/ml polylC stimulacije (desni panel). Izmereni nivoi citokina normalizovani su do nivoa citokina iz monocita stimulisanih samo TLR ligandom. Dvostruko ili veće povećanje nivoa citokina nakon TLR stimulacije definisano je kao indukcija citokina. # Vrednost je previše niska da bi se mogla videti na stubičastom dijagramu; ¤ Merenje citokina je izvan opsega. Podaci su iz jednog eksperimenta od njih dvaju.
Fig.8 prikazuje grafikon koji predstavlja rezultate FRET analize. Normalizovana FRET (NFRET) merenja prikazana su između EYFP (žuti fluorescentni protein)/ ECFP (cijanofluorescentni protein) (traka 1, pozadina usled dimerizacije oznaka). EYFP-APIM motiv / ECFP-PCNA za razne motive prikazani su u drugim trakama.
4
PRIMERI
Pozadina eksperimenata
[0224] Pronalazači su odredili da više od 20 različitih signalizirajućih kinaza, uglavnom citoplazmatskih, sadrže APIM sekvencu, što ukazuje na to da oni stupaju u interakciju sa PCNA. U njih spadaju tri direktna člana PI3K/Akt puta (p110-α, p110-γ, i PI3K-C2β) i nekoliko kinaza koje direktno ili indirektno utiču na MAPK puteve (ERK8, MK2, MK5, MST4 i TAO2). PCNA stoga nije povezivan sa signalnom transdukcijom. Pronalazači su odredili da PCNA igra ulogu u putevima prenosa signala nishodno od TLR. Pronalazači su ustanovili da se putevi prenosa signala mogu prekinuti ciljanjem PCNA oligopeptidnih jedinjenja koja obuhvataju APIM motiv. Smatra se da ova jedinjenja ulaze u kompeticiju sa PCNA za proteine koji stupaju u interakciju sa PCNA. Efekti oligopeptidnih jedinjenja koja obuhvataju APIM motiv na putevima prenosa signala ustanovljeni su pomoću primernog peptida ATX-101 koji sadrži APIM i prodire u ćelije (SEQ ID NO: 1198, koja sadrži APIM motiv, RWLVK (SEQ ID NO: 28)).
[0225] Pronalazači su iznenađujuće zaključili da je ATX-101 lečenje smanjilo sekreciju citokina iz monocita periferne krvi nakon stimulacije različitim TLR ligandima i da je smanjilo Akt fosforilaciju. Ovi podaci znače da ciljanje PCNA utiče na puteve prenosa signala, uključujući PI3K/Akt i MAPK puteve, verovatno inhibicijom PCNA-vezivanja signalnih proteina koji sadrže APIM sekvencu. Ovi podaci ukazuju da će regulatorna uloga PCNA u signalnoj transdukciji i peptidi koji sadrže APIM biti korisni u lečenju ili sprečavanju poremećaja ili stanja povezanog sa oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, kao što je poremećaj ili stanje koje dovodi do ili proističe iz, ili je povezano sa, hipercitokinemijom.
Materijali i postupci
Ćelijske linije
[0226] Ćelijske linije multiplog mijeloma JJN-3 (poklon od J. Ball, University of Birmingham, Ujedinjeno Kraljevstvo) gajene su u RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Nemačka) uz dodatak 10% FCS, 2mM glutamina (Sigma-Aldrich), 2,5 µg/ml amfotercina B (Sigma-Aldrich) i 100 µg/ml gentamicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). HaCaT ćelije (spontano transformisani keratinociti) kultivisane su u DMEM (Sigma-Aldrich) koji sadrži FCS, glutamin, amfotercin B i gentamicin. Sve ćelije su kultivisane na 37°C u vlažnoj atmosferi 5% CO2.
Izolacija i stimulacija monocita periferne krvi
[0227] Mononuklearne ćelije periferne krvi izolovane su iz A+ slojeva belih krvnih zrnaca u ugrušku (Blood Bank, St. Olav's University Hospital, Trondheim, Norveška) centrifugiranjem gradijenta gustine (Lymphoprep; Axis-Shield PoC, Oslo, Norveška). Mononuklearne ćelije posejane su na 4 miliona ćelija/ml u RPMI 1640 koji ne sadrži serum uz dodatak glutamina i gentamicina. Nakon 60-90 min, populacija prijanjajućih ćelija je oprana pre kultivisanja u podlozi, 10% toplotno-neaktivnim humanim serumom (Blood Bank, St. Olav's University Hospital). ATX-101 (4 µM [Innovagen, Lund, Švedska]), ATX-A (4 µM, [Innovagen]) (ATX-A je predstavljen u SEQ ID NO: 1206 i sadrži motiv RALVK (SEQ ID NO: 1207), koji nema sposobnost stupanja u interakciju sa PCNA), p38 inhibitor (SB203580, 10 µM, [Sigma-Aldrich]), PI3K inhibitor (LY294002, 5 i 10 µM, [Sigma-Aldrich]) i Akt inhibitor (Akt inhibitor XVIII SC66, 1 µg/ml, [Sigma-Aldrich]) dodati su u podlogu koja ne sadrži serum i inkubirani tokom 5 minuta pre nego što su LPS (10 ng/ml, [Sigma-Aldrich]), polylC (40 µg/ml, [GE Healthcare, Little Chalfont, UK]), PAM3Cys (10 ng/ml, [Invivogen, San Diego, CA, SAD]) ili R848 (10 µg/ml, [Invivogen]) dodati u podlogu koja sadrži serum. Ćelije su inkubirane tokom 4 h pre sakupljanja supernatanata i zamrzavanja pre dalje analize citokina putem 27-plex ispitivanja (ispitivanje Bio-Plex ProTM humani citokin 27-plex).
Priprema ćelijskih ekstrakata i vestern analiza
[0228] Mononuklearne ćelije su posejane i stimulisane kao što je prethodno opisano. JJN-3 ćelije su tretirane sa ATX-101 (6 µM) tokom 4 h. HaCaT ćelije su tretirane sa ATX-101 (12 µM), polylC (2 µg/ml) i LPS (100 ng/ml) tokom 4 h. Ćelije su sakupljene, ćelijska kuglica je ponovo suspendovana u 1x upakovanoj ćelijskoj zapremini pufera 1 (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 200 mM KCI) i razblažena u istoj zapremini (upakovana ćelijska zapremina pufer 1) pufera 2 (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 200 mM KCI, 10 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 40% glicerol, 0,5% NP40, 1 mM DTT, 1% kokteli inhibitora fosfataze 1 i 3 [Sigma-Aldrich], 2% kompletni inhibitor proteaze koji ne sadrži EDTA [Roche, Oslo, Norveška] i 2 µl/ml Omnicleave [Epicentre Technologies, Madison, WI, SAD]). Nakon inkubacije tokom 1,5 h na 4°C, ćelijski ekstrakti su centrifugirani na 14,000 o/min tokom 10 minuta. Supernatanti su sakupljeni i razdvojeni na 10% Bis-Tris-HCl gelovima (NuPAGE, Invitrogen). Nakon elektroforeze na gelu, membrane polivinilidenfluorida (Immobilion, Millipore, Oslo, Norveška) su blokirane u 50% Odyssey blokirajućem puferu (LI-COR Bioscience, Cambridge, UK) u TBS. Primarna antitela protiv (a) P-Akt (monoklonalna, Ćelijsko signaliziranje, Beverly, MA, SAD), PACT (monoklonalna, Santa Cruz biotechnology Inc., Dallas, TX, SAD), P-p70 S6 kinaze (monoklonalno, Ćelijsko signaliziranje), P-ERK1/2 (monoklonalno, Ćelijsko signaliziranje) i β-tubulina (poliklonalno, Abcam, Cambridge, UK), kao i fluorescentno obeležena sekundarna antitela, kozje α-zečje 680RD i kozje α-mišje 800CW (LI-COR) razblažena su u 20% Odyssey blokirajućem puferu u TBST (TBS sa 0,1% Tween 20). Proteini su vizualizovani Odyssey sistemom
1
infracrvenog slikanja (LI-COR) i kvantifikovani pomoću Odyssey Image Studio V2. Nivoi proteina upoređeni su sa nivoom proteina kod netretiranih ćelija, koji je podešen na 100%. β-tubulin je koriščen kao referenca za normalizovanje podataka.
Imunofluorescencija i konfokalno snimanje
[0229] HaCaT ćelije i monociti periferne krvi gajeni su na sudovima sa staklenim dnom i obojeni su kao što je opisano upotrebom antitela α-PCNA (PC10, Santa Cruz biotechnology Inc.; 1:1000) i Alexa fluor 532 kozjim α-mišjim (Invitrogen). Jezgra su obojena sa DRAQ5 pre slikanja prema uputstvu proizvođača (eBioscience, San Diego, CA, SAD). Fluorescentne slike dobijene su pomoću mikroskopa za lasersko skeniranje Zeiss LSM 510 Meta opremljenog sa Plan-Apochromate 63×/1.4 objektivom uronjenim u ulje u 2% FCS u PBS na sobnoj temperaturi pomoću Zeiss LSM 510 softvera. Obojene ćelije su pobuđene na λ= 543 nm i detektovane na λ>= 560-615 za Alexa fluor 532. DRAQ5 je pobuđen na λ= 633 nm i detektovan na λ> 650 nm. Debljina isečka bila je 1 µm. Sve slike su opremljene uzastopnim skenovima. Nije izvođena obrada slika, izuzev podešavanja kontrasta i intenziteta.
IFN-β ELISA
[0230] Monociti su stimulisani kao što je gore opisano. IFN-β je izmeren u supernatantima sa kompletom VeriKine-HSTMHuman IFN- β Serum ELISA (Pestka Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ, SAD) prema uputstvima proizvođača sa sledećim prilagođavanjima: količina supernatanta je udvostručena sa 50 na 100 µl; pufer uzorka je smanjen sa 50 na 25 µl; a rastvor antitela je snižen sa 50 na 25 µl (razblaživač za ispitivanje smanjenja, čime se održava ista zapremina koncentrata antitela i dodatka razblaživača). OD je izmeren na 450 nm.
Ispitivanje preživljavanja ćelija
[0231] Ćelije su posejane u ploče sa 96 bunarčića, a ATX-101, inhibitori kinaze (SB203580 i BIRB0796) i polylC dodati su sami ili u kombinaciji u naznačenim koncentracijama. Ćelije su kontinuirano izlagane i sakupljane svaki dan tokom naredna četiri dana pomoću MTT (3-(4.5-Dimetiltiazol-2-il)-2.5 difeniltetrazolium bromid) ispitivanja (Gilljam et al., 2009, supra). Korišćen je prosek od najmanje 4 bunarčića kako bi se izračunalo preživljavanje ćelija.
Primer 1: Ciljanje PCNA sa peptidima koji sadrže APIM utiče na prenos signala u višestrukim ćelijama mijeloma
2
[0232] Ćelije multiplog mijeloma izlučuju citokine i odgovaraju na razne faktore za stimulaciju rasta iz njihove tumorske mikrosredine u petljama pozitivnih povratnih informacija koje idu u prilog rastu ćelija mijeloma. MAPK i PI3K/Akt putevi su predloženi kao potencijalni terapijski ciljevi u multiplom mijelomu, sami i u kombinaciji jer su ovi putevi često pogrešno regulisani i između njih postoji opsežna unakrsna komunikacija. Dalje, ovi putevi su važni za proizvodnju citokina.
[0233] Došlo se do zaključka da je ATX-101 povećao efekat inhibiranja rasta p38 MAPK i inhibitora PI3K klase I u ćelijskoj liniji multiplog mijeloma JJN-3 (Fig.1A). Pored toga, ATX-101 je povećao efekte inhibiranja rasta ERK5 i inhibitora MAPK kinaze 1 (MEK1) i pojačao je citotoksične efekte melfalana u kombinaciji sa ovim inhibitorima kao i p38 inhibitorom u drugoj ćelijskoj liniji multiplog mijeloma (RPMI-8226). Kako bi se dalje razjasnilo da li je ATX-101 direktno uticao na MAPK i PI3K puteve, analizirani su nivoi fosforilacije nishodnih kinaza u JJN-3 ćelijama u različitim vremenskim tačkama nakon dodavanja ATX-101. Lečenjem sa ATX-101 smanjile su se i fosforilacija Akt i p70 S6 kinaza (nishodno od mTOR). Nasuprot tome, detektovano je prolazno povećanje ERK1/2 fosforilacije nakon ATX-101 lečenja (Fig.1B).
[0234] Ovi rezultati znače da ATX-101 utiče na važne puteve prenosa signala u ćelijama multiplog mijeloma uključujući PI3K/Akt/mTOR i MAPK puteve.
Primer 2: Ciljanje PCNA sa peptidima koji sadrže APIM smanjuju izlučivanje citokina monocita nakon TLR stimulacije
[0235] Sledeće, istraživano je da li bi ATX-101 mogao uticati na izlučivanje citokina iz primarnih monocita, koje se delimično reguliše PI3K/Akt i MAPK putevima. Različitim TLR ligandima stimulisani su monociti periferne krvi da bi se izazvala proizvodnja citokina i izmerena je koncentracija 27 citokina u supernatantima ćelijske kulture. Izlučivanje citokina izazvanih LPS efikasno je smanjeno dodavanjem ATX-101 (Fig.2A). Slično, ATX-101 lečenje je smanjilo izlučivanje CXCL10, CCL2, CCL3 i CCL4 nakon TLR3 stimulacije sa polylC (Fig.2B). Pronađeno je slično smanjenje kod izlučivanja citokina izazvanog TLR7/8 ligandom R848 i TLR2 ligandom PAM3Cys (Fig.5). Ovi rezultati pokazuju da ciljanje PCNA sa peptidima koji sadrže APIM utiče na proizvodnju citokina. Mehanizam verovatno predstavlja inhibiciju višestrukih interakcija kinaze-PCNA, čime se utiče na signalne puteve nishodno od proteina TLR adaptora jer je ATX-101 lečenje smanjilo izlučivanje citokina nishodno od TLR koje zavisi i od MyD88 i od TRIF.
[0236] ATX-101 lečenje je smanjilo CXCL10 izlučivanje izazvano polylC i takođe proizvodnju bazalnog nivoa citokina iz izolovanih monocita (Fig.2A i B). Izmereni su IFN-β nivoi u supernatantima iz LPS- i polylC-stimulisanih monocita jer izazivanje CXCL10 ekspresije predstavlja sekundarni događaj i zahteva početno izlučivanje IFN-β. U skladu sa smanjenim izlučivanjem CXCL10, ATX-101 lečenje je takođe smanjilo izlučivanje IFN-β, što ide u prilog tome da ATX-101 utiče na signaliziranje nishodno od TLR adaptora TRIF (Fig.2C). Važno je da ATX-101 lečenje pri korišćenoj koncentraciji nije izazvalo apoptozu u monocitima. Dalje, mutantna verzija ATX-101, ATX-A koja se ne vezuje za PCNA, nije mogla ili je bila manje efikasna u smanjenju izlučivanja citokina u poređenju sa ATX-101 (Fig.6). Ovi rezultati stoga ukazuju da ATX-101 utiče na izlučivanje citokina specifičnim ciljanjem PCNA. Monociti sadrže suštinske količine PCNA u citoplazmi u poređenju sa na primer HeLa ćelijama (Fig.2D). Zbirno, ovi podaci pokazuju da PCNA može imati regulatornu ulogu u urođenom imunom odgovoru.
Primer 3: Smanjenje Akt fosforilacije od strane peptida koji sadrže APIM će verovatno uticati na proizvodnju citokina u TLR-stimulisanim monocitima
[0237] Aktivacija NF-κB, MAPK i PI3K/Akt put predstavljaju važne karakteristike nakon aktivacije TLR, a naši rezultati ukazuju da ATX-101 utiče na dva od ovih puteva u ćelijskoj liniji multiplog mijeloma JJN-3 (Fig.1). Kako bi se ispitalo da li je ATX-101 uticao na PI3K/Akt put u monocitima slično JJN-3 ćelijama, analizirani su nivoi Akt fosforilacije u monocitima. LPS- i polylC-indukovana Akt fosforilacija kao i bazalni nivo Akt fosforilacije smanjen je ATX-101 lečenjem (Fig.3A). Kako bi se dalje istražilo da li je ATX-101 smanjio ili povećao efekat konkretnih inhibitora PI3K, Akt i p38 MAPK u odnosu na proizvodnju citokina sličnu smanjenom ćelijskom rastu primećenom u JJN-3 ćelijama (Fig.1A), izmereno je izlučivanje citokina iz LPS- i polylC-stimulisanih monocita u prisustvu inhibitora kinaze same i u kombinaciji sa ATX-101.
[0238] I ATX-101 i p38 MAPK inhibitor smanjili su izlučivanje citokina iz stimulisanih monocita, a kombinacija ATX-101 i inhibitora dovela je do povećanog smanjenja većine citokina (Fig.3B i C). PI3K inhibitor LY294002 je sa druge strane imao manje efekta na indukovano izlučivanje citokina sam i u kombinaciji sa ATX-101, ali svejedno je kombinacija pokazala smanjenje u izlučivanju nekih citokina (npr. IFNγ, IL-1RA, IL-2, 4 i 9 nakon LPS i IL-1RA, CCL2, 3 i 4 nakon polylC stimulacije) (Fig.3D i E). Direktna inhibicija Akt, centralna kinaza je dalje nishodno na PI3K putu smanjila izlučivanje svih citokina do ili ispod bazalnih nivoa, što ukazuje na ključnu ulogu u regulaciji citokina (Fig.7); ipak, ovako jak pojedinačni odgovor agensa inhibitora (u odsustvu apoptoze) nije omogućio ispitivanje njegove kombinacije sa ATX-101. Ukratko, ovi rezultati verifikuju da su i p38 MAPK i PI3K/Akt put važni za izlučivanje citokina iz monocita i ukazuju da ciljano PCNA sa APIM-peptidima pojačava efekat inhibiranja ovih puteva. Stoga su, rezultati prikazani na Fig.1, tj. povećana inhibicija rasta ćelija samim ATX-101 i u kombinaciji sa MAPK i PI3K inhibitorima puta i smanjena Akt aktivacija nakon ATX-101 lečenja u JJN-3 ćelijama, u zajedničkoj relaciji sa smanjenom proizvodnjom citokina i smanjenom Akt aktivacijom u monocitima. Ovi podaci i dalje idu u prilog tome da PCNA ima regulatornu ulogu u transdukciji signala, što utiče i na rast ćelija i na proizvodnju citokina.
4
Primer 4: Peptidi koji sadrže APIM smanjuju Akt fosforilaciju i PACT nivoe proteina u HaCaT keratinocitima
[0239] Kako bi se dalje podržala moguća regulatorna uloga PCNA kod ćelijskog odgovora na TLR agoniste, korišćena je ćelijska linija HaCaT humanog keratinocita koja eksprimira funkcionalni TLR3 i odgovara na polylC lečenje. Ispitani su nivoi Akt fosforilacije u HaCaT ćelijama i došlo se do zaključka da je ATX-101 lečenje smanjilo Akt fosforilaciju u nestimulisanim i stimulisanim ćelijama slično JJN-3 ćelijama i monocitima (Fig.4A). Humani keratinociti reaguju na polylC preko poznatih dsRNK osetljivih receptora TLR3, PKR, RIG-I i MDA5. dsRNK-vezujući PACT protein koji sadrži APIM predstavlja aktivator PKR i RIG-I. Stoga, PACT može stupati u interakciju sa PCNA, a ova interakcija može imati regulatornu ulogu u odgovoru na polylC u HaCaT ćelijama. Stoga su ispitani PACT nivoi proteina u HaCaT ćelijama tretiranim sa polylC i ATX-101, i kombinacijom oba.
[0240] ATX-101 dodavanje nestimulisanim ćelijama nije imalo jasnog efekta na nivo PACT proteina, ali je dodavanje ATX-101 dalje smanjilo nivo proteina PACT u polylC-stimulisanim ćelijama (Fig.4A). Mutantni peptid ATX-A imao je manje efekta na Akt fosforilaciju i PACT nivoe proteina od ATX-101 slično onome što je primećeno za izlučivanje citokina. Stoga, ovi podaci ukazuju da APIM-peptidi utiču na PI3K/Akt put kao i na PACT nivoe proteina kao odgovor na polylC u HaCaT ćelijama. Pretpostavka je da se APIM-peptidi mešaju sa nekoliko puteva prenosa signala ciljanjem interakcija PCNA sa citoplazmatskim signalizirajućim proteinima kao što je PACT. PCNA je uglavnom detektovan u jezgru HaCaT ćelija, ali neke ćelije takođe sadrže PCNA u citoplazmi (Fig.4B).
Diskusija
[0241] Pokazano je da ciljanje PCNA sa peptidom koji sadrži APIM, npr. ATX-101, utiče na ćelijski odgovor na TLR agoniste, što ide u prilog ulozi za PCNA u odgovorima na ćelijski stres. ATX-101 lečenje je smanjilo izlučivanje citokina iz monocita i smanjilo je Akt fosforilaciju u monocitima i HaCaT ćelije stimulisane različitim TLR ligandima. APIM-sekvenca je pronađena u preko 200 proteina uključujući nekoliko signalizirajućih kinaza koje su opisane da dejstvuju u TLR signaliziranju. Stoga, ATX-101 verovatno utiče na nekoliko puteva prenosa signala.
[0242] Naši podaci ukazuju da ATX-101 reguliše nadole PI3K/Akt put, poznati regulator proizvodnje citokina kao što je prikazano upotrebom Akt inhibitora SC66. Stoga, smanjena Akt aktivacija verovatno doprinosi smanjenom izlučivanju citokina iz TLR-stimulisanih monocita nakon ATX-101 lečenja.
[0243] U našim eksperimentima, primećeno je da nema jake indukcije IL-12 putem ispitanih TLR liganda; međutim, ATX-101 lečenje je smanjilo bazalni nivo IL-12 (Fig.2A i Fig.5). Stoga, ATX-101 takođe može uticati na izlučivanje citokina mešanjem sa PI signaliziranjem.
[0244] Naši podaci ukazuju da ATX-101 nije smanjila izlučivanje citokina njegovim peptidom koji prodire u ćelije već ciljanjem PCNA putem APIM-sekvence jer je mutantna ATX-A sa pojedinačnom aminokiselinskom promenom u APIM daleko manje smanjila izlučivanje citokina od ATX-101. Mali primećeni efekti ATX-A su verovatni jer ATX-A i dalje ima neku slabu PCNA-vezujuću mogućnost.
[0245] Inicijalno je pronađeno da se ATX-101 mešala sa putevima prenosa signala uključujući PI3K/Akt put u ćelijskoj liniji JJN-3 multiplog mijeloma nezavisno od TLR stimulacije. ATX-101-posredovani efekat na puteve prenosa signala samim tim nije ograničen na TLR signaliziranje. Ćelijski cilj ATX-101 je PCNA i stoga naši podaci ukazuju na novu regulatornu funkciju PCNA u signalnim putevima verovatno dejstvovanjem citoplazmatske vezujuće platforme. Stoga, APIM-posredovane PCNA interakcije igraju ulogu u odgovoru na ćelijski stres na patogene i molekulske modele povezane sa oštećenjem koje prepoznaje TLR. ATX-101 smanjuje izlučivanje citokina iz monocita u dozama koje ne izazivaju apoptozu.
Primer 5: In silico karakterizacija APIM konsenzus motiva
[0246] Pronalazači su izveli analize sekvenci kako bi odredili koliko se varijacija unutar APIM motiva javlja prirodno, tj. u nativnim sekvencama u raznim vrstama. Kako je PCNA visoko zatvorena u eukariotskim organizmima, očekuje se da je varijacija sekvenci APIM motiva u ortolozima polipeptida za koje se smatra da stupaju u interakciju sa PCNA predstavlja reprezentativnu varijaciju koja može da se koristi u oligopeptidnim jedinjenjima ovog pronalaska, tj. može se dozvoliti varijacija aminokiselina unutar APIM motiva na nekim položajima, naročito X3i X4, bez gubljenja afiniteta za PCNA.
[0247] Pronalazači su koristili identifikovanih 657 humanih polipeptidnih sekvenci koje obuhvataju motiv [K/R]-[F/W/Y]-[A/L/V/I]-[A/L/V/I]-[K/R] (SEQ ID NO:19) od moguće 21673 polipeptidne sekvence. Od 657 identifikovanih sekvenci, 291 je bilo isključeno jer su bile dostupne beznačajne informacije o funkciji polipeptida. Smatralo da će preostalih 366 polipeptida verovatno stupati u interakciju sa PCNA i ove sekvence su korišćene kako bi se identifikovali ortolozi u: Bos taurus (288 ortologa); Rattus norvegicus (286 ortologa); Mus musculus (312 ortologa); Gallus gallus (236 ortologa); Xenopus tropicalis (200 ortologa); Danio rerio (189 ortologa); Caenrhabditis elegans (102 ortologa); Drosophila melanogaster (136 ortologa); i Saccharomyces cerevisiae (65 ortologa). Poravnanje domena ortologa koji obuhvataju APIM motiv značilo je da se taj motiv može definisati kao:
pri čemu konkretne kombinacije aminokiselina na položajima 3 i 4 koje su bile identifikovane u ortologu uključuju:
LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, Al, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ, VM, TL, SL, IT, VT, LG, MA, ML, NL, QL, QI, TI, SI, AS, VS, SV, CA, IG, LR, VR, TK i IR. Naročito uobičajene kombinacije su LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS i LT, pri čemu su najuobičajenije LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA i AI.
[0248] Stoga je najšira definicija APIM motiva izvedena iz ove analize, a bilo bi razumno očekivati da svi polipeptidi koji obuhvataju APIM motiv prema ovoj definiciji stupaju u interakciju sa, tj. da se vezuju za, PCNA.
Primer 6: In vivo karakterizacija APIM konsenzus motiva
[0249] Ovaj rad opisan u ovom primeru istražuje interakciju između APIM peptida i PCNA.
[0250] U živim ćelijama S-faze, PCNA označen zelenim fluorescentnim proteinom (EGFP) obrazuje različita žarišta koja predstavljaju mesta replikacije i stoga se mogu koristiti kao marker S-faze.
[0251] PCNA označen cijanofluorescentnim proteinom (ECFP) zajednički je eksprimiran sa raznim konstruktima APIM peptida koji su spojeni sa žutim fluorescentnim proteinom (EYFP). Da bi se ispitao stepen proksimiteta APIM peptida i PCNA, izmeren je prenos energije fluorescentnte rezonance (FRET).
[0252] Žive HeLa ćelije ispitivane su 16-24 sata nakon prolazne transfekcije (po Fugene 6 (Roche Inc.) prema preporukama proizvođača) ECFP i EYFP fuzionih konstrukata. Fluorescentne slike dobijene su pomoću Zeiss LSM 510 Meta laserskog mikroskopa za skeniranje opremljenog sa Plan-Apochromate 63x/1.4 objektivom uronjenim u ulje. Pojačani cijanofluorescentni protein (ECFP) pobuđen je na λ= 458 nm i detektovan na λ= 470-500 nm, a pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP) je pobuđen na λ= 514 nm i detektovan na λ= 530-600 nm, upotrebom uzastopnih skenova. Debljina isečka bila je 1 µm.
[0253] Prenos energije fluorescentnte rezonance (FRET) javlja se ukoliko su oznake (EYFP i ECFP) razdvojene manje od 100 Å (10 nm). FRET je detektovan pomoću postupka senzibilizovane emisije, merenjem emisije primaoca (EYFP) nakon pobuđivanja davaoca (ECFP). FRET je bio prisutan kada je intenzitet emitovanog svetla iz EYFP nakon pobuđivanja ECFP fluorohroma bio jači od svetla emitovanog od strane samih ECFP ili EYFP-označenih proteina, nakon pobuđivanja sa EYFP i ECFP laserima tim redom (curenje), datih jednačinom: FRET= I2- I1(ID2/ID1) - I3(IA2/IA3) je >0. FRET je normalizovan za nivoe ekspresije upotrebom jednačine: NFRET= FRET/ (I1x I3)<1⁄2>. NFRETje izračunato od srednjih intenziteta (I) unutar regiona od značaja (ROI) koji sadrže više od 25 piksela gde su svi pikseli imali intenzitete ispod 250, a prosečni intenziteti bili su između 100 i 200 i za davaoca i za primaoca konstrukata. Kanal 1 (ECFP) i 3 (EYFP) izmereni su kao što je gore opisano za slikanje, a kanal 2 (FRET) je pobuđen sa λ=458 nm i detektovan na λ=530-600 nm. ID1, D2, D3i IA1, A2, A3određeni su za ćelije transfektovane smo ECFP i EYFP konstruktima, sa istim podešavanjima i istim intenzitetima fluorescencije kao zajednički transfektovane ćelije (I1i I3). ECFP-PCNA i EYFP-PCNA su uključeni kao pozitivne kontrole, a usled dimerizacije zajednički eksprimiranih oznaka, ECFP i EYFP proteini eksprimirani iz praznih vektora uključeni su kao negativne kontrole u svim eksperimentima.
[0254] Fig.8 prikazuje da bi se značajan FRET signal mogao detektovati za sve od ispitanih varijanti, što verifikuje da veliki broj peptida unutar ovde opisane definicije APIM motiva (i koji se javljaju u polipeptidima za koje se očekuje da stupaju u interakciju sa PCNA) može stupiti u interakciju sa PCNA i stoga se očekuje da će pronaći upotrebu u ovde opisanom postupku i upotrebama, tj. kao imunosupresivni peptidi, npr. za inhibiranje ili sprečavanje oslobađanja citokina za neproliferišućih imunih ćelija u krvi i lečenje ili sprečavanje poremećaja ili stanja povezanog sa njim.
Primer 7: Identifikacija citozolnih proteina uključenih u ćelijsko signaliziranje koji stupaju u interakciju sa PCNA
[0255] Nekoliko citozolnih proteina sadrže APIM što ukazuje na to da oni mogu stupati u interakciju sa PCNA. Kako bi se dalje istražio PCNA-„interaktomˮ, pronalazač je izveo eksperimente PCNA zajedničke imunoprecipitacije (co-IP) na ekstraktima iz HaCaT ćelija umreženih upotrebom formaldehida niske koncentracije da bi se sačuvali proteinski kompleksi u njihovoj in vivo konformaciji. Eluat je odvojen na gelu, a delovi gela su podvrgnuti triptičnoj digestiji i Orbitrap-MS. Lažno antitelo specifično za TOM20 korišćeno je u kontroli zajedničkog IP ispitivanja. Relevantni proteini detektovani putem MS u PCNA povlačenju, ali ne u lažnom povlačenju, navedeni su u tabeli 3.
[0256] Detektovani proteini koji sadrže APIM uključuju MST4 i PLK3, koji su uključeni u regulisanje ERK i Akt tim redom. Detektovan je i PACT protein. Ovi proteini su uključeni u puteve ekspresije citokina i hemokina. PCNA je takođe povlačila protein BRE koji sadrži APIM, proteinski deo BRCA-1-kompleksa u jezgrima i BRISK-kompleks u citozolu, za koje je skoro otkriveno da su uključeni u regulaciju apoptoze izazvane TNF. Jedan interesantan identifikovan protein PIP-kutije bio je TAB2 koji je uključen u pozitivne povratne informacije u kompleksu kinaze u NFkB signaliziranju. Sve u svemu, 20 proteina koji sadrže APIM i 23 proteina koja sadrže PIP-kutiju detektovani su isključivo u PCNA povlačenju u odsustvu celularnog stresa.
[0257] Lažno antitelo bi idealno trebalo da cilja nepovezani protein. Ipak, kako PCNA ima mnogo partnera za interakciju i verovatno će dejstvovati kao signalizirajuće sedište u citoplazmi, teško je dobiti idealno lažno antitelo. Zapravo, ovde odabrani lažni protein (TOM20) detektovan je u PCNA povlačenju putem MS (Mascot-rezultat 32,53, nije detektovan putem Sequest; podaci nisu prikazani). Tabela 4 uključuje nekoliko zanimljivih proteina koji nisu ekskluzivno pronađeni, već obogaćeni, u PCNA povlačenju u poređenju sa lažnim povlačenjem, na osnovu broja detektovanih peptida i Mascot/Sequest rezultata. U njih spada nekoliko proteina u MAPK putevima, uključujući TAO3, MAPKK3, ERK1/2 i proteine koji sadrže APIM MK2 i TAO1. Akt1 i p38 alfa su takođe obogaćeni u PCNA povlačenju, međutim, ovi proteini su detektovani u delovima gela koji odgovaraju različitim molekulskim masama od α-PCNA i α-lažnog povlačenja što ukazuje da je regulacija putem PTM važna za njihovu lokalizaciju na PCNA kompleksima. APIM-protein PACT detektovan je iz dela gela sa očekivanom molekulskom masom (MM) PACT-a samo u PCNA povlačenju (tabela 3). PACT je pronađen i u PCNA i lažnom povlačenju (manje u lažnom) i u delu gela sa 5-10 kDa većom molekulskom masom od predviđene (tabela 4).
Povećanje molekulske mase ukazuje da se PACT može regulisati putem PTM, npr. poliubikvitinacijom koja dovodi do degradacije. Stimulacija HaCat ćelija i sa polylC i sa ATX-101, i kombinacijom, dovela je do brze (4h) degradacije PACT (Fig.4A). Sve u svemu, podaci ukazuju da su PCNA i PACT u zajedničkom kompleksu, direktno u interakciji preko APIM. Puna lista proteina koji sadrže APIM ili motiv PIP-kutije motiv identifikovan u ispitivanju povlačenja data je u tabeli 5.
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
Proteini koji sadrže APIM ili PIP u povlačenju upotrebom anti-PCNA* od nestimulisanih, slabo umreženih HaCat ćelija:
1 Primer 8: Određivanje nivoa apoptoze u neproliferišućim imunim ćelijama (monocitima) iz krvi kada su tretirane peptidima koji sadrže APIM
[0258] Korišćeno je bojenje aneksina kako bi se odredila ćelijska vijabilnost i ćelije su prebrojane upotrebom protočne citometrije.
[0259] Limfociti periferne krvi izolovani su iz A+ slojeva belih krvnih zrnaca u ugrušku (Blood Bank, St. Olav's University Hospital) centrifugacijom gradijenta gustine (Lymphoprep; Axis-Shield PoC, Oslo, Norveška). Frakcija prijanjajućih ćelija nakon inkubacije od 90 minuta, koja se naziva monocitima, oprana je dva puta sa HANKS i održavana u RPMI 1640 uz dodatak 2mM glutamina, 100 mg/ml gentamicina i 25% toplotno neaktivnog HS tokom noći. Ćelije su kultivisane na 37°C u vlažnoj atmosferi 5% CO2tokom noći. Sledećeg dana ćelije su tretirane različitim koncentracijama peptida ATX-101 (SEQ ID NO: 1198) koji sadrže APIM i ATX-P (MDRWLVPWKKKRKIRRRRRRRRRRR, SEQ ID NO: 1208). Lečenje R11peptidom i lečenje bez njega korišćeni su kao kontrole. Nakon 4 sata, ćelije su jednom oprane u PBS i ponovo suspendovane u puferu prema preporuci proizvođača kompleta Annexin V-Pacific Blue (Invitrogen). Ćelije su identifikovani monociti prema veličini (FSC) i granularnosti (SSC).
[0260] U tabeli 6 je prikazano da nije bilo značajnog povećanja u ćelijama pozitivnim na aneksin (apoptotske ćelije) kada su tretirane APIM peptidima.
[0261] Dalje, kao što je ovde bilo reči, 4 µM doza ATX-101 smanjuje proizvodnju citokina iz TLS-liganda stimulisanu monocitima u odsustvu apoptoze. Zabeleženo je da je ista doza pokazala nisku toksičnost na normalnim ćelijama u BMCS ispitivanjima (Müller et al,. PloS One, 2013, v.8: e70430).
Tabela 6
Primer 9: Određivanje interakcije APIM peptida sa PCNA
[0262] Mikrotermoforeza (MST) je korišćena kako bi se odredila konstanta disocijacije za razne peptide koji sadrže APIM.
2
[0263] PCNA je obeležen fluorescentnim molekulom. Koncentracija PCNA održavana je konstantnom, dok su razblaženja svakog peptida koji sadrži APIM pripremljena (1:1). U mešavini proteina i peptida, signal je snimljen u svim kapilarima sa različitim koncentracijama neobeleženog peptida i primećena je svaka promena termoforetskih svojstava kao promena intenziteta fluorescencije.
[0264] Tabela 7 pokazuje da i ATX-101 i ATX-101-P (prirodna varijanta APIM u ABH2) pokazuju jače interakcije sa PCNA u odnosu na ATX-A, negativnu kontrolu (niska Kd vrednost znači jaku interakciju, dok visoka Kd vrednost znači slabu interakciju). Dalje, putem MST se ne mogu dobiti podaci o konkretnim interakcijama sa R11, što znači da ovaj peptid ne stupa u interakciju sa PCNA.
Tabela 7
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Agens, ili kompozicija koja sadrži agens, za upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta koja je izazvana oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi, pri čemu pomenuti agens obuhvata: (i) oligopeptidno jedinjenje koje obuhvata motiv koji stupa u interakciju sa PCNA i peptid koji prodire u ćelije (CPP), pri čemu taj motiv koji stupa u interakciju sa PCNA predstavlja X1X2X3X4X5(SEQ ID NO: 2) i pri čemu je: X1izabrano iz grupe koju čine arginin (R), lizin (K) i histidin (H); X2izabrano iz grupe koju čine triptofan (W), fenilalanin (F) i tirozin (Y); X3izabrano iz grupe koju čine leucin (L), izoleucin (I), valin (V), alanin (A), metionin (M), serin (S), treonin (T), asparagin (N), glutamin (Q) i cistein (C); X4izabrano iz grupe koju čine valin (V), leucin (L), izoleucin (I), alanin (A), metionin (M), glicin (G), serin (S), treonin (T), asparagin (N), glutamin (Q), arginin (R), lizin (K), histidin (H) i cistein (C); i X5izabrano iz grupe koju čine arginin (R), lizin (K), histidin (H) i prolin (P); ili (ii) molekul nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu koja kodira oligopeptidno jedinjenje iz (i).
  2. 2. Agens ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti agens ili kompozicija obezbeđena u obliku kombinovanog preparata sa jednim dodatnim aktivnim agensom ili više njih za odvojenu, istovremenu ili sekvencijalnu upotrebu ili davanje.
  3. 3. Komplet ili proizvod koji sadrži agens ili kompoziciju za upotrebu kao što je definisano u zahtevu 1 i jedan dodatni aktivni agens ili više njih u obliku kombinovanog preparata za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu u lečenju hipercitokinemije kod subjekta koja je izazvana oslobađanjem citokina iz neproliferišućih imunih ćelija u krvi.
  4. 4. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu pomenute neproliferišuće imune ćelije prikazuju receptor CD14 na ćelijskoj površini i/ili receptor CD16 na ćelijskoj površini, pri čemu su pomenute neproliferišuće imune ćelije poželjno monociti.
  5. 5. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 do 4, pri čemu jedan dodatni aktivni agens ili više njih predstavlja inhibitor kinaze, imunosupresivno jedinjenje, antizapaljenjsko jedinjenje, antimikrobno jedinjenje ili steroid. 1
  6. 6. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu pomenuti subjekat ima: (A) infekciju ili infektivnu bolest, a opciono pomenuti subjekat ima i cističnu fibrozu, pri čemu je ta infekcija ili infektivna bolest poželjno: (a) mikrobna infekcija ili mikrobna infektivna bolest, pri čemu je ta mikrobna infekcija ili mikrobna infektivna bolest dalje poželjno: (i) bakterijska infekcija ili bakterijska infektivna bolest, kao što je sepsa, bakterijski meningitis, bakterijska pneumonija, čirevi na želucu, legioneloza, pertusis, salmoneloza ili tuberkuloza; ili (ii) gljivična infekcija ili gljivična infektivna bolest; (b) virusna infekcija ili virusna infektivna bolest, kao što je SIDA/HIV, denga groznica, male boginje, zauške, rubeola, grip ili hepatitis; ili (c) parazitska infekcija ili parazitska infektivna bolest, kao što je malarija, toksoplazmoza, tripanosomijaza ili šistosomijaza; (B) zapaljenjsku bolest ili autoimunu bolest; ili (C) traumu, pri čemu pomenutu traumu poželjno uzrokuje povreda ili operacija, pri čemu je pomenuta trauma koju uzrokuje povreda dalje poželjno politrauma, trauma glave, trauma grudnog koša, trauma abdomena ili trauma ekstremiteta i/ili opekotina.
  7. 7. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu pomenuti subjekat ima bolest kalem protiv domaćina (GVHD).
  8. 8. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu agens ili kompozicija dovode do smanjenja jednog citokina ili hemokina ili više njih izabranih od bilo kog ili više njih od TNFα, IL1RA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, BazniFGF, G-CSF, GM-CSF, INFγ, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-β, CCL5 i VEGF.
  9. 9. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu X3i/ili X4predstavlja serin (S) ili treonin (T). 2
  10. 10. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu motiv koji stupa u interakciju sa PCNA obuhvata sekvencu izabranu od: [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q]-[V/L/I/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 3); [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 4); [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 5); [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T/R/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 6); [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 7); [R/K]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 8); [R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 9); [R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 10); [R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[V/L/I/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 11); [R/K]-[VV/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G]-[K/R] (SEQ ID NO: 12); [R/K]-[W/F]-[L/I/A/V/M/T]-[V/L/I/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 13); [R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 14); [R/K]-[W/F]-[L/V/I/A/T]-[V/L/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 15); [R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A]-[V/L/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 16); [R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A/T]-[V/L/A/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 17); [R/K]-[F/Y]-[L/V/I/A]-[V/L/A/I/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 18); [R/K]-[W/F/Y]-[L/I/V/A]-[V/L/I/A]-[K/R] (SEQ ID NO: 19); [R/K]-[W/Y]-[L/V/I/A/S/T]-[V/L/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 20); ili [K]-[F/Y/W]-[I/L/V/A/T]-[V/L/A/I/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 21).
  11. 11. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu motiv koji stupa u interakciju sa PCNA obuhvata sekvencu izabranu od bilo koje od SEQ ID NO: 22 do 297 ili 1209.
  12. 12. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu: (a) X1i X2su RW, RF, KF, KW, RY ili KY; i/ili (b) X3i X4su LV, LL, LA, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ, VM, TL, SL, IT, VT, LG, MA, ML, NL, QL, QI, TI, SI, AS, VS, SV, CA, IG, LR, VR, TK ili IR; i/ili (c) X3i X4nisu AG, AC, CC, NN, QQ, NQ, QN, TS, SS, ST ili TT.
  13. 13. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu je CPP izabran od bilo kog od: (i) peptida klase antenapedija; (ii) peptida klase protegrina; (iii) peptida klase HIV-TAT; (iv) peptida amfipatičke klase izabranog od amfipatičkog i neto pozitivno naelektrisanog peptida, amfipatičkog peptida bogatog prolinom, peptida baziranog na Pep-1 peptidu i peptida baziranog na MPG peptidu; (v) peptida koji ispoljava visok α-spiralni sadržaj; (vi) peptida koji obuhvata oligomere baznih aminokiselina; (vii) pVEC; (viii) peptida dobijenog iz kalcitonina; i (ix) amfifiličnog cikličnog CPP, pri čemu je CPP poželjno izabran iz grupe koju čini bilo koji od SEQ ID NO: 337, 302 do 336, 338 do 1162, ili 1210 do 1220 ili njegov fragment i/ili derivat i/ili pri čemu agens dalje obuhvata domen veznika, pri čemu taj domen veznika poželjno obuhvata signalnu sekvencu nuklearne lokalizacije, pri čemu domen veznika ili signalna sekvenca nuklearne lokalizacije dalje poželjno obuhvata sekvencu izabranu od bilo koje od: (i) peptida od 4-20 aminokiselina, pri čemu su najmanje 4 aminokiseline pozitivno naelektrisane aminokiseline, poželjno izabrane od K, R ili H; i/ili (ii) sekvence izabrane od bilo koje od SEQ ID NO: 1176, 1163 do 1175 ili 1177 do 1181 ili njenog fragmenta i/ili derivata, pri čemu taj domen veznika ili signalna sekvenca nuklearne lokalizacije poželjno obuhvata sekvencu izabranu od bilo koje od SEQ ID NO: 1163-1181 ili njen fragment i/ili derivat, pri čemu pomenuti fragment i/ili derivat poželjno obuhvata najmanje 4 pozitivno naelektrisane aminokiseline, poželjno izabrane od K, R ili H.
  14. 14. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, pri čemu agens obuhvata motiv koji stupa u interakciju sa PCNA kao što je definisan u SEQ ID NO: 28, veznik ili signalnu sekvencu nuklearne lokalizacije kao što je definisana u SEQ ID NO: 1176 i signalnu sekvencu koja prodire u ćelije kao što je definisana u SEQ ID NO: 337 i/ili pri čemu agens obuhvata sekvencu kao 4 što je definisana u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1198, 1182 do 1197, 1199 do 1204 ili 1208.
  15. 15. Agens, kompozicija, komplet ili proizvod za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 14, pri čemu agens obuhvata sekvencu kao što je definisana u SEQ ID NO: 1198, 1203, 1204 ili 1208.
RS20210577A 2013-11-06 2014-11-06 Imunosupresivni agensi i njihova upotreba u terapiji RS62047B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1319620.9A GB201319620D0 (en) 2013-11-06 2013-11-06 Immunosuppressive agents and their use in therapy
PCT/EP2014/073966 WO2015067712A1 (en) 2013-11-06 2014-11-06 Immunosuppressive agents and their use in therapy
EP14793594.4A EP3065759B1 (en) 2013-11-06 2014-11-06 Immunosuppressive agents and their use in therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62047B1 true RS62047B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=49767770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210577A RS62047B1 (sr) 2013-11-06 2014-11-06 Imunosupresivni agensi i njihova upotreba u terapiji

Country Status (11)

Country Link
US (2) US10517923B2 (sr)
EP (1) EP3065759B1 (sr)
DK (1) DK3065759T3 (sr)
ES (1) ES2869901T3 (sr)
GB (1) GB201319620D0 (sr)
HR (1) HRP20210792T1 (sr)
LT (1) LT3065759T (sr)
PL (1) PL3065759T3 (sr)
PT (1) PT3065759T (sr)
RS (1) RS62047B1 (sr)
WO (1) WO2015067712A1 (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12060396B2 (en) 2013-04-11 2024-08-13 Vanderbilt University Fused in sarcoma (FUS) nuclear translocation inhibitors for preventing fibrosis
GB201319620D0 (en) * 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Immunosuppressive agents and their use in therapy
GB201319621D0 (en) 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Antimicrobial agents and their use in therapy
GB201507722D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Anti-bacterial agents and their use in therapy
GB201507721D0 (en) * 2015-05-06 2015-06-17 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Immunosuppressive agents and their use in therapy
EP3432908A4 (en) * 2016-03-21 2020-07-29 Rhode Island Council on Postsecondary Education PEPTIDES SENSITIVE TO PH
WO2020138674A1 (ko) * 2018-12-26 2020-07-02 (주)케어젠 근육 이완용 조성물
MX2020014330A (es) * 2018-12-26 2021-03-09 Caregen Co Ltd Composicion para relajacion muscular.
KR102463320B1 (ko) * 2020-06-12 2022-11-07 (주)케어젠 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 완화, 예방 또는 치료용 조성물
CN115916236B (zh) * 2020-06-12 2025-08-15 凯尔格恩有限公司 包含五肽作为活性成分的组合物
KR102483938B1 (ko) * 2020-06-12 2023-01-04 (주)케어젠 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지 또는 아토피피부염 개선용 조성물
KR102570768B1 (ko) * 2020-06-12 2023-08-28 (주)케어젠 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 다한증 치료용 조성물
KR102469721B1 (ko) * 2020-06-12 2022-11-23 (주)케어젠 보툴리눔 톡신 유사 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
KR102456989B1 (ko) * 2020-06-12 2022-10-21 (주)케어젠 항비만 활성을 가지는 디옥시콜산-펩타이드 결합체 및 이의 용도
US11741686B2 (en) 2020-12-01 2023-08-29 Raytheon Company System and method for processing facility image data

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198541A (en) 1987-08-11 1993-03-30 New York University Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins
US6316003B1 (en) * 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
AU669723B2 (en) 1992-05-19 1996-06-20 Xoma Corporation Improved methods for the preparation of endotoxin-binding proteins
US5420019A (en) 1993-02-02 1995-05-30 Xoma Corporation Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
DK0690720T3 (da) 1993-03-12 2001-08-27 Xoma Technology Ltd Terapeutiske anvendelser af baktericide/permeabilitetsforøgende proteinprodukter
JP4139863B2 (ja) 1993-03-12 2008-08-27 ゾーマ テクノロジー リミテッド 殺菌性／透過性が向上したタンパク質の機能領域に由来する生物学的に活性なペプチドおよびその使用
ATE269099T1 (de) 1993-10-15 2004-07-15 Xoma Technology Ltd Bpi-protein-produkte für definierte funktionen des reticuloendothelialen systems
CA2181164C (en) 1994-01-14 2008-01-08 Arnold Horwitz Anti-gram-positive bacterial methods and materials
MX9602570A (es) 1994-01-14 1997-04-30 Xoma Corp Metodos y materiales anti-fungosos.
US5643875A (en) 1994-01-24 1997-07-01 Friedmann; Nadav Human therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing (BPI) protein products
US5447913A (en) 1994-03-11 1995-09-05 Xoma Corporation Therapeutic uses of bactericidal/permeability-increasing protein dimer products
US5578568A (en) 1994-04-22 1996-11-26 Xoma Corporation Method of treating conditions associated with intestinal ischemia/reperfusion
US5646114A (en) 1994-07-11 1997-07-08 Xoma Corporation Anti-protozoan methods
JPH10508576A (ja) 1994-09-15 1998-08-25 ゾーマ コーポレイション 抗真菌性ペプチド
US5912228A (en) 1995-01-13 1999-06-15 Xoma Corporation Therapeutic compositions comprising bactericidal/permeability-increasing (BPI) protein products
US5494896A (en) 1995-03-31 1996-02-27 Xoma Corporation Method of treating conditions associated with burn injuries
US6057291A (en) * 1995-06-02 2000-05-02 University Of British Columbia Antimicrobial cationic peptides
WO1997004008A1 (en) 1995-07-20 1997-02-06 Xoma Corporation Anti-fungal peptides
US5686414A (en) 1995-11-14 1997-11-11 Xoma Corporation Methods of treating conditions associated with corneal transplantation
US5851802A (en) 1996-03-22 1998-12-22 Xoma Corporation Methods for recombinant microbial production of fusion proteins and BPI-derived peptides
ES2153665T3 (es) 1996-05-10 2001-03-01 Xoma Technology Ltd Usos terapeuticos de productos proteicos bactericidas/incrementadores de la permeabilidad (bpi) para la meningococemia humana.
US5741779A (en) 1996-05-10 1998-04-21 Xoma Corporation Antithrombotic materials and methods
NZ332954A (en) 1996-05-23 2000-07-28 Xoma Corp Use of BPI protein products to treat humans with hemorrhage due to trauma
US5888973A (en) 1996-08-09 1999-03-30 Xoma Corporation Anti-chlamydial uses of BPI protein products
AU744918B2 (en) 1996-11-01 2002-03-07 Xoma Corporation Therapeutic uses of BPI protein products in cystic fibrosis patients
US6482796B2 (en) 1996-11-01 2002-11-19 Xoma Corporation Therapeutic uses of N-terminal BPI protein products in ANCA-positive patients
US6093573A (en) 1997-06-20 2000-07-25 Xoma Three-dimensional structure of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI)
US6013631A (en) 1998-06-19 2000-01-11 Xoma Corporation Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs
SE512161C2 (sv) 1998-06-30 2000-02-07 Sandvik Ab Hårdmetall och användning av denna vid olje- och gasutvinning
AU6163099A (en) 1998-09-25 2000-04-17 Xoma Technology Ltd. Antifungal and antibacterial peptide
CA2359681A1 (en) 1999-01-22 2000-07-27 Xoma Technology Ltd. Method of treating chronic cardiac disease
US6153584A (en) 1999-04-01 2000-11-28 Levy; Ofer Therapeutic uses of BPI protein products in BPI-deficient humans
US6355616B1 (en) 1999-06-25 2002-03-12 Xoma (Us) Technology Ltd. Derivative compounds derived from or based on bactericidal/permeability-increasing protein
AU4209900A (en) 1999-07-12 2001-01-30 Xoma Technology Ltd. Methods to identify inhibitors of f1/f0 atpase
AU4204200A (en) 1999-07-12 2001-01-30 Xoma Technology Ltd. Therapeutic uses of bpi protein products for inhibiting H+/K+ atpase activity
US6376211B1 (en) 1999-07-12 2002-04-23 Xoma Technology Ltd. Agents and methods for inhibiting F1/F0 ATPase
AU4203900A (en) 1999-07-12 2001-01-30 Xoma Technology Ltd. Method to identify antimicrobial agents
CA2410514A1 (en) * 2000-05-30 2001-12-06 Advanced Research & Technology Institute Compositions and methods for identifying agents which modulate pten function and pi-3 kinase pathways
AU2002211885A1 (en) 2000-10-11 2002-04-22 Xoma Technology Ltd. Antifungal peptides
AU2002241589B2 (en) 2000-12-01 2007-07-19 Xoma Technology Ltd. Modulation of pericyte proliferation using BPI protein products or BPI inhibitors
AU2002255952A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Helix Biomedix, Inc. Short bioactive peptides and methods for their use
US7517857B2 (en) 2002-01-29 2009-04-14 Posco Immune-modulating peptide
WO2005068504A1 (ja) * 2004-01-19 2005-07-28 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. 炎症性サイトカイン抑制剤
JP2008544743A (ja) * 2005-05-10 2008-12-11 インターミューン インコーポレイテッド ストレス活性化蛋白質キナーゼ系をモジュレートするためのピリドン誘導体
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7579318B2 (en) * 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
JP2010509234A (ja) * 2006-11-02 2010-03-25 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 新生物疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置する方法
US8419332B2 (en) * 2007-10-19 2013-04-16 Atlas Bolt & Screw Company Llc Non-dimpling fastener
GB0803352D0 (en) * 2008-02-22 2008-04-02 Ntnu Technology Transfer As Oligopeptidic compounds and uses thereof
EP2362782A1 (en) * 2008-11-17 2011-09-07 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, and the other Members of Board, of the College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth A vaccinia virus protein a46 peptide and use thereof
GB0916576D0 (en) * 2009-09-22 2009-10-28 Malmsten Nils M Polypeptides and uses thereof
AT510991A5 (de) * 2009-10-09 2015-02-15 Kemijski Inst Peptide für die Inhibition MyD88-abhängiger Signalwege
JP2013522169A (ja) 2010-02-24 2013-06-13 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 炎症および好中球減少症の処置のための化合物
EP2707369B1 (en) * 2011-05-09 2016-07-27 Eip Pharma, LLC Compositions and methods for treating alzheimer's disease
WO2012177892A2 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 University Of Florida Research Foundation, Inc. Type i interferon mimetics as therapeutics for cancer, viral infections, and multiple sclerosis
EP2732032B1 (en) * 2011-07-12 2016-05-11 The University of British Columbia Neuroprotective peptides that inhibit interaction between palmitoyl acyl transferase zinc- finger dhhc type containing 17 (zd17) and c-jun n-terminal kinase (jnk)
WO2013110005A1 (en) * 2012-01-18 2013-07-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Boronate-mediated delivery of molecules into cells
KR101497972B1 (ko) * 2012-03-21 2015-03-03 서울대학교산학협력단 Ｎｏｄ2 신호전달 경로를 표적으로 하는 패혈증 치료제 스크리닝 방법 및 패혈증 치료제
GB201319620D0 (en) * 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Immunosuppressive agents and their use in therapy
GB201319621D0 (en) * 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Antimicrobial agents and their use in therapy

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20210792T1 (hr) 2021-08-20
US10517923B2 (en) 2019-12-31
GB201319620D0 (en) 2013-12-18
DK3065759T3 (da) 2021-05-17
US20200323953A1 (en) 2020-10-15
US20160279193A1 (en) 2016-09-29
PL3065759T3 (pl) 2021-10-25
US11246907B2 (en) 2022-02-15
LT3065759T (lt) 2021-08-10
EP3065759B1 (en) 2021-03-31
PT3065759T (pt) 2021-05-17
EP3065759A1 (en) 2016-09-14
WO2015067712A1 (en) 2015-05-14
ES2869901T3 (es) 2021-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS62047B1 (sr) Imunosupresivni agensi i njihova upotreba u terapiji
Stahlhut et al. Identification of filamin as a novel ligand for caveolin-1: evidence for the organization of caveolin-1–associated membrane domains by the actin cytoskeleton
WO2016177898A1 (en) Immunosuppressive agents and their use in therapy
CN102015758B (zh) 寡肽化合物及其应用
US20200095286A1 (en) Antimicrobial agents and their use in therapy
AU2015368496B2 (en) Cell death-inducing agent, cell growth-inhibiting agent, and pharmaceutical composition for treatment of disease caused by abnormal cell growth
PT2352508E (pt) Péptidos do domínio citoplasmático muc1 como inibidores de cancro
EP3066113A2 (en) Peptide inhibitors of tead/yap-taz interaction
US10570180B2 (en) Anti-bacterial agents and their use in therapy
WO2012126118A1 (en) Polypeptides with affinity for heat shock proteins (hsps) and hsp associated complexes (hacs) and their use in diagnosis and therapy
CN111601815A (zh) 靶向细胞中c-Myc的嵌合分子
EP1856145B1 (en) Voltage dependent anion channel (vdac1) compositions and methods of use thereof for regulating apoptosis
WO2007109908A1 (en) Therapeutic yb-1 phosphorylation decoys
CA2799066C (en) Method for cancer therapy
WO2025012176A1 (en) Designed ankyrin repeat protein agents targeting brachyury and their use in treatment of chordoma
WO2025212653A1 (en) Methods including bh3 profiling of car t cells
EA049385B1 (ru) Пептиды bnip3 для лечения реперфузионного повреждения
Filipenko et al. Annexin II: analysis of a pleiotropic protein
Choy Regulation of lysosome biogenesis by phosphoinositides and phagocytosis
JP2021534826A (ja) がんの処置のためのペプチド治療薬およびその使用