ES2870505T3

ES2870505T3 - Gel de cartílago para la reparación cartilaginosa, que comprende quitosano y condrocitos

Info

Publication number: ES2870505T3
Application number: ES15817457T
Authority: ES
Inventors: Pascale Hazot; Gerin Frédéric Mallein
Original assignee: Advanced Chitosan Solutions Biotech
Current assignee: Advanced Chitosan Solutions Biotech
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2021-10-27
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: DK3226923T3; CA2969285C; EP3226923A1; FR3029116B1; PT3226923T; WO2016087762A1; JP2017535405A; US10612001B2; US20200248144A1; US20170306295A1; US11718828B2; JP6821583B2; FR3029116A1; EP3226923B1; FR3062064B1; CA2969285A1; FR3062064A1

Abstract

Procedimiento in vitro de obtención de una composición implantable para la reparación tisular del cartílago que comprende partículas de hidrogel de quitosano y células aptas para formar cartílago hialino, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas sucesivas: (i.) Amplificación de células primarias, en una estructura tridimensional que comprende partículas de hidrogel físico de quitosano o de derivado de quitosano, y luego (ii.) Inducción de la síntesis de matriz extracelular por dichas células amplificadas, dentro de la estructura tridimensional de la etapa (i.), en donde dichas células son condrocitos articulares primarios y/o células madre mesenquimatosas primarias diferenciadas en condrocitos y dichas células no son células madre embrionarias humanas, y en donde dichas células no penetran en las partículas de hidrogel.

Description

DESCRIPCIÓN

Gel de cartílago para la reparación cartilaginosa, que comprende quitosano y condrocitos

La presente invención está relacionada con composiciones que permiten en particular la reconstrucción del cartílago, y con un procedimiento que permite obtener dichas composiciones. Más particularmente, la presente solicitud se refiere a un entorno o estructura extremadamente favorable no solo para la proliferación de células aptas para formar cartílago hialino, sino también para la síntesis de matriz extracelular de cartílago por estas células; las células en este entorno o estructura constituyen una composición implantable que puede ser injertada a nivel de lesiones de cartílago en seres humanos o en animales. La estructura constituye también por otra parte un entorno favorable durante la implantación.

El cartílago, o tejido cartilaginoso, está constituido por células específicas, a saber, por condrocitos, distribuidas dentro de una matriz extracelular, que consta de al menos un 80 % de agua. Los condrocitos son capaces de sintetizar o degradar los componentes de la matriz extracelular del cartílago, compuesta por glicosaminoglicanos y fibras de colágeno, esencialmente de tipo II para el cartílago hialino. Los condrocitos son, por tanto, responsables no solo de la síntesis sino también del mantenimiento del tejido cartilaginoso.

El cartílago, y particularmente el cartílago articular en la edad adulta, posee una capacidad de autorreparación muy baja, a causa, en particular, de su carácter avascular y a causa de que los condrocitos maduros no proliferan. Las lesiones cartilaginosas son, por tanto, esencialmente irreversibles y, por consiguiente, constituyen una causa importante de dolor y hándicap, en particular como consecuencia de un traumatismo, desgaste mecánico o enfermedad degenerativa articular como la artrosis. En la actualidad, no existe una solución terapéutica completamente satisfactoria, que permita tratar las lesiones cartilaginosas, y especialmente las lesiones grandes.

Se han probado diferentes procedimientos quirúrgicos, que consisten ya sea en rellenar la lesión con materiales destinados a imitar las propiedades elásticas y compresibles del cartílago natural, o en injertar células, en particular, condrocitos, con la esperanza de que sinteticen de novo la matriz extracelular y reparen así la lesión. Un enfoque más prometedor se basa en el injerto de un tejido cartilaginoso, es decir, un neotejido obtenido a partir de condrocitos. El injerto de condrocitos autólogos ("ACI" para autologous chondrocytes implantation) se utiliza ya desde hace varias décadas para tratar a pacientes que padecen lesiones cartilaginosas. No obstante, una gran dificultad en el injerto de condrocitos, y especialmente de condrocitos autólogos, radica en el número de células a implantar. En efecto, generalmente solo se puede tomar un pequeño número de condrocitos del cartílago nativo del paciente que se debe tratar; por consiguiente, es necesario proceder a una primera etapa de expansión de los condrocitos tomados a fin de aumentar drásticamente su número. Sin embargo, la expansión in vitro de condrocitos hasta la obtención de un número suficiente de células para una implantación resulta muy delicada. Durante esta expansión, se sabe, en efecto, que los condrocitos se desdiferencian y pierden su fenotipo condrocitario, expresando en ese caso colágeno de tipo I en lugar de colágeno de tipo II, para que una vez reimplantados, no den lugar a la formación de un tejido con propiedades satisfactorias, sino más bien a un tejido de estilo cicatrizal o bien, en el contexto de una reparación cartilaginosa, a la formación de un fibrocartílago no funcional, esencialmente compuesto por colágeno de tipo I. Algunos autores han propuesto medios de cultivo que permiten rediferenciar los condrocitos que se han desdiferenciado, durante la etapa de proliferación en monocapas. No obstante, estos procedimientos requieren periodos de tiempo relativamente largos, del orden de 4 semanas para la etapa de proliferación (Liu et al, 2007) durante el transcurso de la cual los condrocitos deben someterse a varios pases para alcanzar un número suficiente. Sin embargo, se ha constatado que la rediferenciación es más complicada después de 2 pases en particular (Hautier et al, 2008).

Otros han realizado pruebas con la rediferenciación de los condrocitos, después de la etapa de proliferación en monocapas, por siembra en estructuras 3D (tridimensionales), denominadas "andamios". Estas estructuras ofrecen la ventaja de imitar la arquitectura del tejido cartilaginoso. Dicho entorno es favorable para la rediferenciación de los condrocitos y para la síntesis de matriz extracelular como se observa por la secreción de proteoglicanos y colágeno de tipo II (Tallheden et al, 2005). Sin embargo, la etapa de multiplicación previa se acorta deliberadamente para limitar la desdiferenciación de los condrocitos.

La siembra en estructura 3D también puede ofrecer la ventaja de facilitar la implantación in vivo de los condrocitos, limitar las fugas celulares y tratar lesiones grandes.

Se han probado numerosos materiales para la siembra de condrocitos en estructura 3D; se pueden mencionar alginato, colágeno, polietilenglicol y ácido poliláctico. Los más adecuados son aquellos que cumplen con las siguientes propiedades biológicas: citocompatibilidad, baja inmunogenicidad, y biodegradabilidad con productos de degradación no tóxicos. Así, los polímeros naturales, que presentan estas propiedades biológicas, indudablemente por sus similitudes químicas y biológicas con los tejidos vivos, se presentan como los candidatos de selección. Los polímeros naturales son altamente biocompatibles, fácilmente biorreabsorbibles y bioasimilables por el organismo.

Un polímero natural mencionado a menudo por sus atractivas propiedades como biomaterial de base de estructuras tridimensionales, es el quitosano.

En efecto, de acuerdo con la bibliografía, este biopolímero es conocido por ser biodegradable, biocompatible, no tóxico, hemocompatible, citocompatibles, y además, bioactivo, hemostático, cicatrizante, bacteriostático y fungistático. Asimismo, el quitosano es conocido por favorecer la adhesión celular. También es apreciado por su capacidad de mantener el fenotipo condrocitario y estimular el proceso de síntesis de matriz extracelular durante el cultivo de condrocitos. Por otro lado, no se ha informado de infección o alergia alguna relacionada con el quitosano, por tanto, es no inmunógeno. En cuanto a su tiempo de resorción, es posible variarlo jugando con sus propiedades físicoquímicas.

El quitosano es relativamente fácil de utilizar y puede producirse en diferentes formas físicas, en particular, soluciones, películas (Lahiji, et al, 2000), fibras, esponjas, bolitas, hidrogeles o micropartículas. Por ello, se ha utilizado en una gran variedad de estructuras.

En el contexto de la siembra de condrocitos en estructura 3D, se presta especial atención a las estructuras que permiten tanto una buena distribución y un buen mantenimiento de los condrocitos como un entorno favorable para la estimulación de su potencial condrogénico. A este respecto, se consideraron diferentes enfoques. Entre las diferentes estructuras probadas, se pueden mencionar las bolitas o fragmentos de material, los polímeros destinados a encapsular las células y los hidrogeles cuyo tamaño de poros se ajusta a fin de que los condrocitos puedan alojarse en ellos. Algunos autores han contemplado composiciones inyectables, con un polímero que encapsula los condrocitos (documento WO2011/104131, Univ. de Liége et al). Según algunas variantes, el polímero se reticula in situ, una vez inyectado con los condrocitos en la lesión (Hoemann et al, 2005). No obstante, este enfoque tiene el inconveniente de que los condrocitos inyectados tienden a no permanecer en el sitio de inyección, debido al tiempo de polimerización. En cambio, otros autores han probado composiciones, a partir de un polímero reticulado in situ y permitiendo la realización de un tejido que puede ser injertado en forma de tapón (Hao et al, 2010). Con todo, estos procedimientos pueden presentar dificultades durante la implantación. A fin de imitar en el mejor de los casos la estructura del tejido cartilaginoso, algunos autores han probado la forma de hidrogel y, más particularmente, el hidrogel físico, sintetizado sin la adición de un agente de reticulación y favoreciendo así la biocompatibilidad y la biorreabsorción de la estructura. Por tanto, se ha contemplado la elaboración de un neotejido por la puesta en contacto con un hidrogel físico de quitosano (Montembault et al). No obstante, la etapa de multiplicación previa en monocapas es deliberadamente rápida a fin de evitar o limitar la desdiferenciación de los condrocitos antes de la siembra, implicando, por consiguiente, una multiplicación de las células relativamente baja.

Según una variante, la estructura tridimensional se reabsorbe en gran medida durante el transcurso de la etapa in vitro de síntesis de la matriz extracelular, dicha estructura ya no forma parte del injerto (véase, en particular, el documento WO02078760, Laboratoires Genevrier et al). Dicho procedimiento es particularmente largo de aplicar, de 4 a 6 semanas, antes de obtener un neotejido apto para ser injertado, y dicho neotejido ya no está soportado por la estructura 3D en el momento de la implantación.

Otro polímero que se ha probado con frecuencia en el campo de la implantación de condrocitos es el ácido hialurónico. Es un polisacárido natural, también biocompatible y biodegradable. Por otro lado, se trata de un componente principal del líquido sinovial y de los glicosaminoglicanos (GAG) presentes en el cartílago articular. El ácido hialurónico ayuda a proteger las articulaciones aumentando la viscosidad del líquido sinovial y haciendo que el cartílago sea más elástico. Por otra lado, se ha demostrado que el ácido hialurónico favorece la expresión del fenotipo condrocitario.

Por ello, el ácido hialurónico se ha combinado a veces con composiciones de quitosano, en el cultivo de condrocitos. Unos autores (Correia et al, 2011) han propuesto, por ejemplo, estructuras tridimensionales de tipos esponjas de una mezcla de quitosano y ácido hialurónico para la siembra de condrocitos. No obstante, estas estructuras no permiten un reparto homogéneo de las células con la observación de un gradiente celular que crece del exterior al interior de la estructura.

El documento de Denuziére et al (1998) describe esponjas de complejos polielectrolitos en particular a base de quitosano y ácido hialurónico. Las cadenas policatiónicas del quitosano interactúan electrostáticamente con las cadenas polianiónicas del ácido hialurónico. Sin embargo, la conclusión que se deduce es que se prefieren las esponjas de quitosano solo, con respecto a las esponjas de quitosano complejadas con GAG tales como ácido hialurónico, para la proliferación de los condrocitos y para otras propiedades biológicas asociadas.

También se ha propuesto un hidrogel de quitosano y ácido hialurónico fotoreticulado dentro del cual se encapsulan los condrocitos (Park et al, 2013). No obstante, dicho encapsulamiento no favorece suficientemente la proliferación a pesar de los tiempos de cultivo relativamente largos (factor de proliferación 4 en 3 semanas).

Por otro lado, aunque el quitosano parece poseer, de acuerdo con la bibliografía, propiedades interesantes para la reconstrucción del cartílago, cabe señalar que la tasa de proliferación y de síntesis de matriz extracelular de condrocitos sobre las esponjas de quitosano solo depende en gran medida del tamaño de los poros de la estructura (Griffon et al, 2006). Algunos autores incluso han considerado que el quitosano no era adecuado para la proliferación de condrocitos (Suh et al, 2000).

En la actualidad, ninguno de estos entornos 3-D (tridimensionales) resuelve el problema de la proliferación de condrocitos, en un estado compatible con la regeneración del tejido cartilaginoso para un trasplante. Por tanto, existe una gran necesidad de obtener, según un procedimiento rápido, un número satisfactorio de condrocitos, que sean diferenciados y aptos para generar un tejido cartilaginoso con propiedades adecuadas.

Por otro lado, el conjunto de los procedimientos proponen cambios de entorno entre la etapa de multiplicación y la etapa de diferenciación, lo que implica pérdidas de materia y de tiempo, así como el uso de la tripsinación, perjudicial para las células.

Los presentes inventores han desarrollado un procedimiento que permite obtener condrocitos con un número suficiente, dentro de una estructura que asegura tanto su perfecta multiplicación, su rediferenciación como la producción de matriz cartilaginosa. Esta estructura también es apropiada para la implantación a nivel de la lesión.

En este contexto, los presentes inventores han encontrado, de una manera perfectamente inesperada, que el quitosano, en forma de partículas de hidrogel físico, es un entorno excelente para los condrocitos, no solo para la síntesis de matriz extracelular de cartílago hialino, sino también para su multiplicación. En efecto, contra todo pronóstico, los inventores pudieron llevar a cabo en la misma estructura de quitosano, una etapa de proliferación que permite obtener una tasa de proliferación similar incluso superior a la observada por la técnica ordinaria de las monocapas (sobre plástico o en esponjas) y que posibilita fácilmente la rediferenciación de las células. Por consiguiente, los inventores han desarrollado un procedimiento, que permite sucesivamente multiplicar condrocitos, directamente después de la extracción en el estado primario, y luego inducir la rediferenciación y la síntesis de matriz extracelular específica, dentro de una misma estructura, evitando así las etapas de tripsinación y cambio de estructura. Asimismo, esta estructura es compatible con la implantación in vivo sin requerir una modificación adicional.

Gracias al procedimiento de la invención, es posible obtener de este modo una composición que comprende condrocitos, distribuidos de manera homogénea dentro de la estructura y con una densidad que permite su reimplantación, en un tiempo reducido con respecto a lo descrito hasta ahora, en condiciones muy favorables para la reparación del tejido cartilaginoso, en una estructura directamente compatible con la implantación.

En el contexto de esta invención, los términos que a continuación se exponen tienen más particularmente el siguiente significado: Por quitosano, se entiende un polisacárido compuesto por unidades de D-glucosamina (unidad desacetilada) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) unidas en p-(1-4). Puede producirse por desacetilación química o enzimática de la quitina; también existe en el estado natural. En el quitosano de origen natural, el polisacárido está generalmente asociado a cantidades insignificantes de beta-glucano. En el contexto de la presente invención, la presencia natural de beta-glucano, en cantidades acordes con las que se encuentran naturalmente en el quitosano, es irrelevante. Un quitosano será denominado "puro" incluso en caso de presencia de beta-glucano, siempre que la presencia de este último sea inferior al 5 % en masa, con respecto al polisacárido.

Por derivado del quitosano, se indica cualquier polímero de quitosano que haya sido sometido a una reacción destinada a modificar los grupos químicos del quitosano para cambiar sus funcionalidades, por ejemplo, metilación, halogenación .... Preferentemente, un derivado de quitosano no posee más de tres tipos de derivación, preferente y únicamente dos tipos de derivación, y preferentemente aún únicamente un tipo de derivación. Los derivados de quitosano particularmente contemplados en el contexto de la presente invención son el glicol-quitosano, el N-succinilquitosano, el N- o el O-carboximetil-quitosano, sin que esta lista sea limitativa.

El grado de acetilación (DA) es el porcentaje de unidades acetiladas con respecto al número de unidades totales (unidades acetiladas y desacetiladas), puede determinarse por espectrometría de infrarrojos por transformada de Fourier (IRTF) o por RMN de protones.

Por hidrogel de quitosano, se entiende que el constituyente mayoritario, por ende, más del 80 %, incluso más del 90 %, incluso el 95 %, del hidrogel (en masa) es el quitosano, excluyendo el agua. Del mismo modo, un hidrogel de derivado de quitosano se entiende como un hidrogel cuyo constituyente mayoritario, más del 80 %, incluso más del 90 % o 95 % del hidrogel es el derivado del quitosano, excluyendo el agua.

Un hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano, se entiende como un hidrogel que comprende preferentemente al menos un 70 % de agua, incluso al menos un 80 % de agua.

Por hidrogel físico, se entiende un hidrogel obtenido por un procedimiento de gelificación en medio acuoso o en medio hidroalcohólico, sin necesidad de añadir un agente de reticulación.

Por fenotipo condrocitario, se indica las células de tipo condrocitos, que expresan preferentemente colágeno de tipo II con respecto al colágeno de tipo I.

Por ácido hialurónico, se entiende un polisacárido compuesto por unidades de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina, unidos entre sí por enlaces glicosídicos.

Por derivado del ácido hialurónico, se indica cualquier polímero de ácido hialurónico que haya sido sometido a una reacción destinada a modificar los grupos químicos del ácido hialurónico para cambiar sus funcionalidades, por ejemplo, por esterificación.

La presente invención se refiere por tanto, según un primer aspecto, a un procedimiento in vitro de obtención de una composición, que sea implantable por artroscopia para la reparación cartilaginosa, que comprende partículas o fragmentos de hidrogel físico de quitosano o de un derivado de quitosano, y células que forman cartílago, preferentemente cartílago hialino. La composición obtenida al final de la aplicación del procedimiento puede calificarse como gel de cartílago. Dicho gel de cartílago comprende en efecto células, que sintetizan la matriz cartilaginosa, todo ello distribuido de manera homogénea sin gradiente celular, en una estructura tridimensional a base de partículas de quitosano.

Dicho procedimiento según la invención comprende en particular una etapa de amplificación de células primarias, en una estructura tridimensional (estructura 3D) y luego una etapa de rediferenciación e inducción de la síntesis de matriz extracelular, dentro de esta misma estructura tridimensional, es decir, sin cambiar las células del entorno. Como se ha indicado anteriormente, el quitosano es, en efecto, un biomaterial biocompatible, biorreabsorbible con productos de degradación no tóxicos, no inmunógeno, citocompatible y bioactivo. Además, es totalmente compatible con los requisitos farmacéuticos como dispositivo implantable. En el contexto de la invención, el hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano es un hidrogel físico, obtenido sin adición de agente de reticulación.

Por este procedimiento, es posible obtener una composición o neotejido que comprende condrocitos, dentro de una estructura matricial, que está inmediatamente lista para la implantación, con condrocitos no dañados aptos para continuar la síntesis de matriz cartilaginosa después de la reimplantación. Debido a la ausencia de cambio de estructura 3D, el procedimiento es más fácil de aplicar y permite obtener un neotejido de buena calidad. Este procedimiento también es más rápido que los descritos en la técnica anterior.

El procedimiento según la invención se caracteriza, por tanto, por las siguientes etapas:

(i.) Amplificación de células primarias, en una estructura tridimensional que comprende partículas de hidrogel físico de quitosano puro o de derivado de quitosano, y luego

(ii.) Inducción de la diferenciación, o rediferenciación, y de la síntesis de matriz extracelular por dichas células amplificadas, dentro de la estructura tridimensional de la etapa (i.).

Estas dos etapas se llevan a cabo sucesivamente y no simultáneamente para optimizar las condiciones y los rendimientos de cada una de estas etapas.

Las células:

Las células que se amplifican, en la primera etapa, se siembran en esta estructura 3D. Pueden ser bien condrocitos, bien células precursoras de condrocitos obtenidos a partir de células madre, por ejemplo, células madre mesenquimatosas, o bien células pluripotentes inducidas (IPS). Pueden tratarse de cualquier célula que se haya diferenciado en condrocitos. De forma preferente, se trata de condrocitos, y más preferentemente de condrocitos articulares.

En el contexto de la invención, también es posible utilizar cocultivos de condrocitos diferenciados y/o células madre diferenciadas en condrocitos.

Los condrocitos o las células madre pueden obtenerse por cualquier método conocido por el experto en la materia que permite recuperar estas células a partir de una muestra biológica que pueda contenerlas. Dichos métodos se describen en particular en el documento FR2965278 (Univ. de Caen Basse-Normandie, et al).

Se trata preferentemente de células humanas o animales, en particular, equinas o caninas. Puede tratarse de células articulares, auriculares o incluso procedentes del tabique nasal.

Las células particularmente preferidas son las células humanas, por ejemplo condrocitos humanos, y más particularmente condrocitos articulares humanos para un paciente humano. Lo mismo se aplica a un animal, en particular, a un caballo o a un perro.

Las células primarias sembradas en la estructura pueden ser células alogénicas, xenogénicas, heterólogas, o autólogas, frente al organismo que debe ser tratado. Según una implementación preferida, se trata de células autólogas, es decir, que proceden del paciente, humano o animal, que debe ser tratado. De forma muy preferida, se trata de condrocitos humanos autólogos, que podrán ser reimplantados en el donante al final del procedimiento de la invención. Lo mismo se aplica a los condrocitos animales, por ejemplo, a los caballos de carreras o a los perros, que también pueden beneficiarse de un injerto de condrocitos. También puede tratarse de células xenogénicas o alogénicas, debido a que ciertas medidas bien conocidas por el experto en la materia pueden aplicarse para evitar el rechazo durante la implantación.

Según un modo de realización, no se trata de células madre embrionarias humanas.

La estructura tridimensional y el quitosano:

Las células se siembran dentro de una estructura tridimensional o andamio, o incluso un biomaterial, que comprende fragmentos o partículas de hidrogel físico de quitosano puro, o de derivado de quitosano. Dichas partículas forman así un andamiaje o estructura compatible y propicia para la formación de un tejido tridimensional, hasta que las células produzcan suficiente matriz extracelular para mantener la estructura mecánicamente. Las células se añaden después de la fase de gelificación y formación de las partículas de hidrogel de quitosano. Por tanto, las células se encuentran en el exterior de los fragmentos o partículas de hidrogel; permanecen en la superficie de los fragmentos o partículas, no están aprisionadas ni encapsuladas en el hidrogel, tampoco se infiltran en los poros del hidrogel. Por tanto, pueden circular libremente alrededor de las partículas, así como los nutrientes y los desechos, durante las diferentes etapas del procedimiento de la invención. La mezcla realizada al principio del cultivo entre las partículas de quitosano y las células permite así favorecer una buena distribución de las células dentro de la estructura tridimensional al final de este procedimiento. El quitosano utilizado para la concepción del dispositivo o estructura tridimensional se obtiene, por ejemplo, por desacetilación de la quitina que puede proceder del exoesqueleto de artrópodos (gambas, insectos, cangrejo...), del endoesqueleto de los cefalópodos (calamares) o de la pared celular de los hongos. Según su origen, el quitosano puede ser de conformación a (pared celular de los hongos, gambas, cangrejos) o p (calamares) o 9 (insectos), lo cual influye de forma considerable en sus propiedades biológicas.

En el contexto de la presente invención, el quitosano utilizado puede proceder de estas diferentes fuentes, pero preferentemente se utilizará un quitosano de origen no animal, por razones de biocompatibilidad, de bajo contenido de endotoxinas, de reproducibilidad de los lotes y de conformidad con las normas farmacéuticas. De manera preferencial, el quitosano utilizado en el contexto de la presente invención es quitosano extraído de la pared celular de los hongos, más particularmente de los champiñones de París, Agaricus bisporus. En efecto, en el contexto de los dispositivos implantables, por motivo de los requisitos reglamentarios, es particularmente ventajoso no tener ninguna materia que sea de origen animal. El quitosano utilizado en la presente invención, extraído de los champiñones París, cumple con los requisitos farmacéuticos en términos de los niveles de endotoxinas, residuos microbiológicos y metales pesados.

Sucesión de las etapas:

El procedimiento de la invención se caracteriza en particular por la sucesión de dos etapas, una primera etapa de amplificación de células primarias en una estructura tridimensional y una segunda etapa de inducción de la diferenciación y síntesis de matriz extracelular (MEC), dentro de esta misma estructura tridimensional. La ventaja importante de este procedimiento radica en el hecho de que no es necesario cambiar las células de estructura, entre la etapa de amplificación y la etapa de rediferenciación con síntesis de MEC, ni siquiera entre la etapa de rediferenciación y la de implantación. De ello se deduce que en ningún momento es necesario proceder a una etapa de tripsinización de las células. En efecto, después de la extracción, las células primarias son sembradas en la estructura de la invención, sin un etapa de proliferación previa y, por tanto, sin necesidad de separarlas, en particular por tripsinización, o por cualquier otro medio que pueda dañar la pared celular. A continuación se proliferan dentro de la estructura, y luego son inducidas a rediferenciarse y a producir matriz cartilaginosa, de nuevo sin necesidad de separarlas, tripsinizarlas o someterlas a cualquier otro tratamiento de naturaleza que pueda dañar la pared celular. El procedimiento de la invención permite por tanto obtener células que, después de la extracción, no han sido dañadas y no han sido sometidas a condiciones de estrés, lo que permite garantizar no solo una optimización del número de células extraídas, reduciendo la muerte celular, sino también garantiza que las células, al final del procedimiento, no están en programas para muerte celular y no expresan señales que puedan ser perjudiciales para el organismo huésped, después de la reimplantación. Al final de una semana de cultivo y en general, durante todo el periodo de cultivo, la tasa de viabilidad de las células es superior al 90 %, incluso superior al 93 % o incluso superior al 97 %. Preferentemente, las dos etapas principales del procedimiento de la invención, es decir, la amplificación, por una parte, y la rediferenciación y la síntesis de m Ec , por otra parte, se entienden como etapas distintas. En efecto, los inventores han observado que la capacidad de proliferar y la capacidad de producir MEC eran etapas preferentemente sucesivas para las células tales como los condrocitos, por lo que los rendimientos de proliferación y síntesis de matriz cartilaginosa eran mucho mejores cuando las dos etapas eran distintas. Asimismo, existen medios que pueden favorecer una u otra de estas etapas, de manera exclusiva, por lo que es preferible realizarlas una tras otra. Preferentemente, las dos etapas tales como las descritas son por tanto no solo sucesivas sino también distintas, la segunda etapa no comienza hasta el final de la primera etapa.

Se considera que la etapa de amplificación es distinta de la etapa de síntesis de matriz cartilaginosa cuando el número de condrocitos aumenta durante la primera etapa y permanece relativamente estable durante la segunda etapa, con poca o ninguna amplificación.

Se considera que la etapa de amplificación es distinta de la etapa de síntesis de matriz cartilaginosa en función de la viscosidad del medio: con la observación de una baja viscosidad durante la etapa de amplificación y un aumento de la viscosidad durante la segunda etapa, confirmando la producción de matriz extracelular.

Preferentemente, durante la primera etapa, la síntesis de la matriz extracelular es baja.

También es posible observar si se sintetiza dicha matriz utilizando, por ejemplo, métodos de inmunohistoquímica, tales como los descritos en los siguientes ejemplos.

El colágeno de tipo II (COLII) es un marcador característico del cartílago hialino; se trata de un homotrímero de tres cadenas a1(II), codificadas por el gen Col2a1. El análisis de este tipo de colágeno se realiza de forma tradicional para identificar condrocitos diferenciados.

El colágeno de tipo I (COLI), heterotrímero al2 a2i producido a partir de los genes C o lla l y Col1a2 es, a su vez, de forma tradicional considerado como un marcador de la desdiferenciación de los condrocitos.

El procedimiento según la invención se caracteriza por el mantenimiento de la capacidad de las células que han sido cultivadas dentro de la estructura para rediferenciarse en condrocitos. Por mantenimiento de esta capacidad, se entiende que la mayoría de las células, al final de la segunda etapa, presenta un fenotipo condrocitario, preferentemente al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %.

Los inventores han observado en efecto que la mayoría de las células sembradas en la estructura tal como se describe, a base de partículas de hidrogel de quitosano o de un derivado, presentan un fenotipo condrocitario estable durante la segunda etapa del procedimiento de síntesis de matriz extracelular. Al final del procedimiento, las células dentro de la composición no presentan ninguna o poca expresión de colágeno de tipo I y/o no la producen a nivel proteico pero expresan un índice de diferenciación COLII/COLI superior a 1. Preferentemente, las células presentes en esta composición sintetizan proteínas de colágeno de tipo II con una relación proteica COLII/COLI superior a 1, preferentemente superior a 1,5; y/o la tasa de ARN mensajeros de colágeno de tipo II es significativamente superior a la tasa de ARN mensajeros de tipo I.

El procedimiento según la invención, tal como se ha descrito anteriormente, permite preferentemente obtener la composición o gel de cartílago listo para su implantación en menos de 40 días, preferentemente en menos de 36 días, incluso en menos de una treintena de días, por ejemplo, en menos de 28 días, o bien en menos de 21 días. Por tanto, permite, a partir de una biopsia de condrocitos o de células madre primarias diferenciadas en condrocitos, obtener una composición lista para su implantación, teniendo un número suficiente de condrocitos para poder reparar la lesión articular, y ello en un mes y medio, o menos de un mes, o menos de tres semanas.

Con este fin, la etapa de amplificación se lleva a cabo en una a tres semanas, preferentemente en aproximadamente dos semanas, de 12 a 16 días, o incluso en menos de dos semanas.

Durante esta etapa, la multiplicación del número de células vivas, con respecto al número de células sembradas inicialmente en la estructura, es de al menos 4, incluso al menos 6, incluso al menos 7 o superior a 7.

Por supuesto, se puede decidir prolongar la etapa de multiplicación durante un tiempo suficiente para obtener un número determinado de células, siempre y cuando no se alcance la confluencia. Por supuesto, la densidad de las células durante la siembra en la estructura 3D debe adaptarse en consecuencia.

Según una implementación preferida, la etapa de multiplicación dura entre 1 y 3 semanas y debe permitir multiplicar las células dentro de la estructura 3D por un factor de al menos 4, incluso al menos 6, incluso al menos 7.

Por consiguiente, una biopsia de 300 a 500 mg de cartílago, que comprende aproximadamente de 106 a 1,5 x 106 células permite obtener, al final de la etapa de amplificación de 4 x 106 células a 10,5 x 106 células debido al factor de amplificación observado por los inventores, y ello en 1 a 3 semanas. Dicho número de células se considera apropiado para la implantación de un injerto de condrocitos.

La segunda etapa, relacionada con la rediferenciación acompañada de la síntesis de matriz extracelular, puede tener una duración variable.

Para la reimplantación del gel de cartílago, es preferible, no obstante, que dicha etapa dure entre 2 y 4 semanas, preferentemente aproximadamente tres semanas, si bien menos. La duración de esta segunda etapa puede ajustarse opcionalmente en función del modo de reimplantación seleccionado.

Al final de la implementación del procedimiento de la invención, se obtiene por tanto una composición o gel de cartílago, que comprende células condrocitarias, distribuidas en una matriz cartilaginosa recién sintetizada, y que son aptas para continuar la síntesis de tejido cartilaginoso, dentro de una estructura 3D compuesta por partículas de hidrogel físico de quitosano o de un derivado de quitosano, de manera que dicha composición o gel de cartílago es directamente implantable en un ser humano o un animal, en particular para rellenar una lesión articular cartilaginosa, por ejemplo, como consecuencia de lesiones traumáticas y limitadas del cartílago articular, o de lesiones de tipo artrosis incipiente superficial, o de lesiones más profundas de tipo osteocondral.

Al final del procedimiento, se obtiene por tanto un kit o gel de cartílago listo para su inyección o implantación in vivo en un ser humano o un animal. Si la estructura 3D que comprende las partículas de hidrogel de quitosano o el derivado de quitosano, puede ser en parte biodegradada durante el procedimiento, es preferentemente muy escasa, preferentemente menos de 50 % de la estructura 3D inicial a base de partículas de hidrogel de quitosano antes de la siembra.

En función de la duración de las etapas del procedimiento de la invención, en particular de la etapa de síntesis de MEC, también es factible que la composición de la invención o gel de cartílago pueda ser inyectable en un ser humano o un animal. A este respecto, la duración de la segunda etapa de síntesis de MEC se reducirá en algunos días, a fin de asegurar que la composición siga siendo inyectable.

En cambio, en particular cuando se desea obtener un implante que tiene una forma bien determinada, la etapa de síntesis de MEC se ajustará a fin de obtener la consistencia deseada y poder enseguida ajustar la forma de la composición a la deseada. También es factible producir directamente la estructura en un recipiente que tiene la forma deseada y llevar a cabo las diferentes etapas del procedimiento en este recipiente de tal manera que al final de la etapa de síntesis de matriz cartilaginosa, el gel de cartílago tenga la forma inducida por el recipiente.

La composición como se ha descrito anteriormente comprende cartílago hialino, sintetizado por las células durante la segunda etapa del procedimiento, de ahí el nombre de gel de cartílago.

Una ventaja importante de la presente invención radica en efecto en el carácter directamente implantable de la composición obtenida al final del procedimiento. En particular, no es necesario cambiar las células de estructura 3D, por tanto, no es necesario someterlas a tratamiento alguno. Tampoco es necesario asegurar la desaparición de la estructura, ni esperar a dicha degradación. Por el contrario, según el procedimiento de la invención, la estructura a base de quitosano siempre está presente al final de la etapa de síntesis de MEC y forma parte de la composición, o neotejido, destinado a ser implantado. En efecto, dicha estructura sirve de andamiaje que asegura el mantenimiento de las células en un entorno adecuado tal para que permita, tras la implantación, la continuación de la síntesis de MEC, a fin de insertarse perfectamente en el nivel de la lesión, por ejemplo, articular. Por tanto, la estructura de quitosano no solo da lugar a favorecer la síntesis de MEC in vitro, sino también, después de la reimplantación, a someter a las células implantadas; por tanto, participa en la estructura del neotejido reimplantado.

La estructura asegura por otra parte una distribución espacial óptima de las células sembradas, permite por tanto una distribución armoniosa de la MEC sintetizada, durante el procedimiento de la invención, y también después de la reimplantación.

El número de células implantadas en la estructura de la invención es variable en función del tamaño de la lesión que se desea rellenar, y también en función del número de células que es factible extraer con fines de siembra. No obstante, preferentemente, al menos aproximadamente 105 células primarias son sembradas, en particular, al menos aproximadamente 6x105 células primarias, o al menos 106 células primarias, preferentemente condrocitos primarios humanos, caninos o equinos; al final del procedimiento de la invención, la composición final comprende preferentemente al menos 3x105 condrocitos, o al menos 6x106 condrocitos, incluso más aún. Para la obtención de una composición directamente implantable en una lesión cartilaginosa, se sembrarán preferentemente 106 a 1,5 x 106 células permitiendo obtener, al final de la etapa de amplificación de 4 a 10,5 x 106 células.

Según una implementación de la invención, los condrocitos dentro de la composición están en una concentración de aproximadamente al menos 106 células/g, preferentemente aproximadamente 6x106 células/g de estructura 3D en el momento del cultivo.

Medios de cultivo:

Según un modo de realización particularmente preferido, se utilizan dos medios de cultivo diferentes. Uno para la primera etapa de amplificación y el otro para la segunda etapa de inducción de la rediferenciación y síntesis de MEC; el paso de una a otra de las etapas se realiza por ende por el cambio de medio, siendo los dos medios distintos. En particular, es factible utilizar durante la primera etapa un medio que favorece la proliferación de las células, sin inducir la síntesis de MEC. La proliferación de las células viene acompañada generalmente de un fenómeno de desdiferenciación; se utilizará, no obstante, un medio que preserva su capacidad para rediferenciarse en condrocitos al final de la etapa de proliferación. En efecto, los inventores han destacado el hecho de que, dentro de una estructura tridimensional, era preferible proceder a una etapa de intensa amplificación, sin por ello inducir la síntesis de MEC.

En efecto, las estructuras tridimensionales y el quitosano eran conocidos antes de la invención por su capacidad de favorecer el fenotipo condrocitario limitando la desdiferenciación, durante la etapa de síntesis de matriz extracelular. De una manera perfectamente inesperada, los inventores han demostrado que era posible amplificar los condrocitos sin inducir una síntesis masiva de matriz extracelular, dentro de una estructura tridimensional a base de hidrogel de quitosano o de un derivado.

Un medio particularmente adecuado para la etapa de proliferación es un medio que induce la amplificación, en particular, un medio que comprende el factor de crecimiento fibroblástico (FGF-2, "fibroblast growth factor'), y adicionalmente también insulina, correspondiente a un medio denominado "FI" ilustrado en la parte experimental (Claus et al, 2012). El FGF-2 está preferentemente presente entre 2 y 10 ng/ml y la insulina entre 2 y 10 pg/ml. No obstante, otros medios de cultivo, bien conocidos por el experto en la materia, también se pueden utilizar, en particular, todos los medios de cultivo generalmente utilizados para esta clase de células, pero en monocapas. Debido a la estructura tridimensional y al quitosano, las células sembradas en la estructura de la invención conservan principalmente su morfología redonda y su capacidad de rediferenciarse posteriormente en condrocitos.

Para el medio de cultivo de la segunda etapa, se utilizan preferentemente medios utilizados de forma tradicional a fin de favorecer la diferenciación o rediferenciación de condrocitos desdiferenciados y permitiendo la síntesis de MEC específica. Dichos medios son bien conocidos por el experto en la materia. Un medio especialmente preferido comprende BMP-2 (Bone morphogenetic protein 2, proteína morfogenética ósea 2); preferentemente, el medio es el utilizado en la parte experimental, compuesto en concreto por BMP-2 e insulina, y preferentemente también por triyodotironina T3 (Liu et al, 2007, Claus et al, 2012), correspondiente a un medio denominado "BIT". La BMP-2 está preferentemente en una concentración comprendida entre 100 y 500 ng/ml, la insulina entre 2 y 10 pg/ml y la triyodotironina T3 entre 50 y 250 mM.

La BMP-2 se seleccionará preferentemente de la misma especie que las células utilizadas, es decir, una BMP-2 humana para células humanas. Lo mismo se aplica a las células animales.

Tanto para el medio de cultivo de la primera etapa como para el de la segunda, se da preferencia a los medios de cultivo que no se oponen a la reimplantación posterior de la composición, al final de la etapa de síntesis de MEC. En particular, se evitarán los compuestos que puedan generar reacciones de rechazo, no compatibles con la normativa relativa a los dispositivos implantables.

Adicionalmente, es posible prever etapas de eliminación del medio de cultivo antes de la inyección o la reimplantación al final de las dos etapas mencionadas anteriormente.

La primera y la segunda etapa pueden, independientemente entre sí, llevarse a cabo en condiciones de normoxia o hipoxia.

Realización de hidrogel de quitosano:

El hidrogel de quitosano puro, o de derivado de quitosano, se realiza a partir de quitosano, preferentemente extraído de hongos y cuya masa molar promedio en peso (Mw), será preferentemente superior a 150 kDa (es decir, 150.000 g/mol) para favorecer el procedimiento de gelificación física por la presencia de largas cadenas macromoleculares. Se comprenderá preferentemente entre 150 y 220 kDa.

Si el quitosano es de masa molar muy diferente, en particular, si se extrae de otra fuente, el procedimiento de realización de hidrogel físico de quitosano descrito en la parte experimental podrá ser fácilmente adaptado por el experto en la materia, utilizando técnicas bien conocidas.

Asimismo, también es posible utilizar quitosano, para el hidrogel, que tenga un grado variable de acetilación; sin embargo, preferentemente, el grado de acetilación del quitosano está comprendido entre el 5 % y el 60 %, preferentemente superior a 25 %, por ejemplo, entre el 25 y el 60 %, o entre el 28 y el 40 %. Este grado de acetilación induce en efecto un entorno favorable para las células, lo que conlleva a una buena adhesión entre el hidrogel formado y las células, y buenos resultados en la condrogénesis.

Para la formación del hidrogel, se utiliza preferentemente una solución de quitosano, cuya concentración es lo suficientemente elevada como para permitir el entrelazamiento de las cadenas macromoleculares, y así favorecer la gelificación física. En efecto, el hidrogel se obtiene en el contexto de la invención por un proceso completamente físico, sin ningún reticulante químico. La concentración de quitosano en solución puede estar comprendida entre 0,5-4 % (p/p), preferentemente superior a 1,5 %, incluso 2 %. Preferiblemente, el quitosano, o el derivado de quitosano tiene una concentración en masa en el hidrogel comprendida entre 3,4 y 4,2 % antes de la neutralización.

Se pueden utilizar varios procedimientos de gelificación del quitosano en el contexto de la presente invención. Pueden mencionarse en particular los siguientes procedimientos, particularmente bien adaptados como la gelificación física por vía gaseosa (amoniaco) o la gelificación física en medio hidroalcohólico o acuoso.

Preferiblemente, el hidrogel utilizado en el contexto de la presente invención se obtiene por un procedimiento de evaporación en medio alcohólico, como se ilustra en el ejemplo 1 en la parte experimental; dicho procedimiento también se denomina gelificación hidroalcohólica.

El hidrogel obtenido tiene preferentemente entre 3 y 5 mm de espesor.

El tamaño de los poros del hidrogel obtenido debe ser tanto inferior al tamaño de las células como suficiente para permitir la libre difusión de nutrientes y la eliminación de desechos. Los modos de realización descritos anteriormente y aplicados en la parte experimental permiten obtener dicho tamaño de poros. Cabe indicar que, en el contexto de la presente invención, el hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano es tal que el tamaño de sus poros no permite la penetración de las células en el interior del hidrogel. Por tanto, las células sembradas dentro de la estructura tridimensional según la invención proliferan sin penetrar en el hidrogel. Debido a que las células no se multiplican en los poros del hidrogel sino que pueden circular libremente alrededor de las partículas de hidrogel, permite obtener un reparto, o distribución, homogéneo de las células en la estructura, sin los grandes gradientes celulares reportados en Correia et al, 2011.

El experto en la materia está en condiciones de determinar el tamaño de los poros de un hidrogel y ajustar los parámetros de su realización a fin de asegurar que el tamaño de los poros es lo suficientemente pequeño como para impedir la penetración de las células, en particular, de condrocitos, permitiendo sin embargo al mismo tiempo la libre difusión de los nutrientes.

A fin de obtener las partículas de hidrogel que constituyen la base de la estructura tridimensional de la invención, el hidrogel así obtenido se manipula por cualquier medio adecuado, bien conocido por el experto en la materia; de este modo, el hidrogel se fragmenta en partículas.

Las partículas de hidrogel así obtenidas son de forma irregular, pero presentan preferentemente una distribución de tamaño relativamente homogéneo, es decir, el 50 % de las partículas tienen un tamaño comprendido entre -20 % y 20 % del tamaño promedio. Según una implementación preferida, las partículas tienen un tamaño promedio comprendido entre 10 pm y 1500 pm; preferentemente entre 200 pm y 1200 pm (1,2 mm), y preferentemente aún entre 400 pm y 700 pm. Por tamaño de partículas, se entiende la longitud de la arista, si las partículas se comparan con rectángulos, la longitud del diámetro mayor si las partículas se comparan con elipses. Las partículas son preferentemente comparables con elipses. Los inventores han puesto de manifiesto mejores resultados para partículas de un tamaño promedio superior a una centena de micrómetros, en particular, más allá de 60 pm, incluso más allá de 400 pm e inferior a 1,2 mm.

Una cierta variabilidad de los tamaños de partículas de hidrogel de quitosano parece ser favorable para el cultivo de condrocitos.

Según una implementación preferida, el hidrogel se obtiene primero por gelificación por vía hidroalcohólica, y luego se fragmenta por cualquier medio apropiado.

Concepción de la estructura tridimensional:

La estructura tridimensional según la invención comprende, por tanto, partículas de hidrogel físico de quitosano o de uno de sus derivados, como se ha detallado anteriormente, constituyendo una estructura tridimensional dentro de la cual las células son sembradas, o migran naturalmente. Según un modo de realización preferido, las células se mezclan con las partículas de hidrogel. El hidrogel físico de quitosano puro o de derivado de quitosano está preferentemente constituido únicamente por quitosano o por un derivado, y agua con un contenido preferentemente de al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %. En concreto, no se introduce en la composición de este hidrogel, ni agente químico de reticulación, ni otro polímero, en particular, polisacárido o derivado, aparte del p-glucano asociado naturalmente al quitosano. El alto porcentaje de agua asegura que se trata efectivamente de un hidrogel de quitosano y no de una estructura de tipo esponja u otra, obtenida por liofilización de una solución de quitosano. Cabe destacar que el alto porcentaje de agua en el hidrogel permite imitar lo mejor posible el entorno natural de los condrocitos, el tejido cartilaginoso comprendiendo aproximadamente un 80 % de agua.

Según una implementación particularmente preferida, se añade una molécula aniónica a las partículas de hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano que permite reforzar las propiedades mecánicas y biológicas de la estructura tridimensional. Esta molécula no se introduce en la composición del hidrogel, se trata de un constituyente que se añade después de la gelificación del hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano, y preferentemente después de la realización de las partículas de hidrogel. La molécula aniónica interactúa por tanto únicamente en la superficie de las partículas de hidrogel según la invención, favoreciendo así la formación de partículas de quitosano pilosas por las cadenas lineales de esta molécula aniónica. La molécula aniónica asociada a la superficie de las partículas de quitosano, se encuentra preferentemente en forma de polímero, se trata, por ejemplo, de ácido hialurónico, o de condroitín sulfato. Las cadenas de quitosano presentan cargas positivas, debidas a los grupos aminas en forma protonada NH3+, y las cadenas de esta molécula aniónica interactúan por enlaces electrostáticos, formando así un complejo estable en un medio fisiológico (pH comprendido entre 5 y 8, y más generalmente comprendido entre 6 y 7). La molécula aniónica permite así reticular de manera electrostática los fragmentos o partículas de hidrogel al interactuar con las cadenas catiónicas del quitosano en la periferia de las partículas, reforzando así las propiedades mecánicas de la estructura tridimensional o "andamio" dentro del cual se siembran las células.

Cabe destacar que la molécula aniónica puede añadirse a la estructura tridimensional antes de la siembra con las células primarias, y por tanto estar presente durante la etapa de proliferación y síntesis de MEC, y por tanto también durante la implantación posterior de la composición. En el contexto de la invención, también se prevé proceder a la siembra de las células primarias en una estructura tridimensional desprovista de la molécula aniónica y añadir esta última bien en el transcurso de la primera etapa de multiplicación, bien al final de la primera etapa en el momento de iniciar la segunda etapa de rediferenciación, o bien al final de la segunda etapa de rediferenciación y síntesis de MEC, antes de la implantación.

La molécula aniónica será preferentemente ácido hialurónico, uno de los constituyentes del líquido sinovial, conocido por sus propiedades de condroprotección y favorable para la condrogénesis. Así, se añade la cantidad de ácido hialurónico necesaria para modificar las características viscoelásticas de la estructura tridimensional. Las interacciones electrostáticas se producen entre los grupos aminas en forma protonada NH3+ del quitosano y los grupos carboxílicos del ácido hialurónico.

También puede tratarse de un derivado de ácido hialurónico o un complejo de ácido hialurónico. La proporción relativa de la molécula aniónica con respecto al hidrogel de quitosano está preferentemente comprendida entre 1 y 10 %, preferentemente entre 1 y 3 %.

El ácido hialurónico puede ser de origen animal, por ejemplo, por extracción de la cresta de gallo o de origen no animal, obtenido por fermentación bacteriana. En el contexto de la presente invención, el ácido hialurónico será preferentemente seleccionado entre un origen bacteriano. En efecto, el ácido hialurónico obtenido por fermentación bacteriana es conocido por sus mejores propiedades de biocompatibilidad, evitando así las alergias y los rechazos, de reproducibilidad de los lotes y de conformidad con las normas farmacéuticas. El ácido hialurónico utilizado en el contexto de la presente invención cumple con las normas farmacéuticas.

Su masa molecular en peso es preferentemente de 50 kDa a 4 MDa, se seleccionará preferentemente siendo superior a 500 kDa, preferentemente entre 500 kDa y 2 MDa, por ejemplo, entre 1 MDa y 2 MDa.

De manera particularmente preferida en el contexto de la presente invención, los constituyentes de la estructura tridimensional, que son partículas de hidrogel de quitosano o de derivados de quitosano, con o sin adición de cadenas de compuesto aniónico, deben ser reabsorbibles in vivo. A fin de obtener dicha propiedad, es importante que ninguno de los constituyentes de la estructura tridimensional se oponga a su carácter reabsorbible.

Preferentemente, la asociación de partículas de hidrogel de quitosano o de derivados de quitosano, con o sin las cadenas de compuesto aniónico, se reabsorberá después de varias semanas una vez implantada, por ejemplo, después de al menos dos semanas, preferentemente al menos 4 semanas. En general, se prefiere que el tiempo de reabsorción no supere los 6 meses, preferentemente incluso no supere los 4 meses. Según el tipo de aplicación prevista, el tiempo de reabsorción puede ser ajustado por el experto en la materia.

Es importante destacar que las composiciones según la presente invención pueden adaptarse en términos de forma, diámetro, concentración, contenido en función de las diferentes aplicaciones previstas. En concreto, la estructura tridimensional formada por partículas de hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano, con o sin las cadenas de compuesto aniónico, puede prepararse a fin de que su forma corresponda a la de la lesión observada en la que se reimplantará al final del procedimiento según la invención.

A pesar de ello, ninguna etapa de deshidratación es necesaria o deseada antes de la reimplantación.

Como se ha especificado anteriormente, el procedimiento permite obtener una composición o gel de cartílago listo para su implantación o inyección in vivo, en particular, en un ser humano, o un animal tal como el perro o el caballo. No obstante, antes de su implantación, se puede prever el cambio de medio, o bien añadir compuestos adicionales, en particular, solubles dentro de la estructura tridimensional. Por ejemplo, es posible añadir compuestos farmacéuticos tales como agentes antiinflamatorios, anestésicos, analgésicos, corticosteroides, vitaminas, minerales, compuestos destinados a reducir la respuesta inmunitaria, y/o a favorecer el injerto, la totalidad o parte de estos compuestos o una combinación de estos compuestos, sin que esta lista sea limitativa.

Según un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una estructura tridimensional formada por partículas de hidrogel físico de quitosano o de un derivado de quitosano, y por una molécula aniónica asociada a estas partículas. Dicha matriz puede utilizarse ventajosamente para sembrar condrocitos haciéndolos proliferar y luego sintetizar la matriz extracelular, especialmente la matriz característica del cartílago hialino, en particular, para un uso según la presente invención, antes de ser implantada o inyectada, en forma de gel de cartílago, en particular, dentro de una lesión articular. Como se ha demostrado en el contexto de la presente invención, dicha estructura permite en efecto asegurar no solo la proliferación de células tales como condrocitos, y proporciona también un entorno particularmente favorable para la síntesis de la matriz de cartílago hialino. La invención también se refiere a una composición implantable o inyectable, que comprende esta estructura tridimensional y condrocitos diferenciados aptos para sintetizar tejido cartilaginoso. Cabe señalar que la composición, o gel de cartílago, también comprende la matriz cartilaginosa, sintetizada por los condrocitos que contiene.

Los diferentes elementos mencionados son los descritos para el primer aspecto de la invención, en particular, la estructura tridimensional, el quitosano o su derivado, el hidrogel, las partículas, la molécula aniónica, con respecto al procedimiento de la invención. Las implementaciones preferidas en el contexto de este primer aspecto lo son también en el contexto de este segundo aspecto. En particular, el quitosano es preferentemente un quitosano obtenido a partir de hongos, y más particularmente extraído de la pared celular de los champiñones de París, Agaricus bisporus. Las partículas tienen los tamaños especificados anteriormente, bien entre 10 pm y 1200 pm, preferentemente entre 400 y 700 |jm en promedio. Por tanto, la estructura es preferentemente una estructura 3D formada por partículas de hidrogel físico de quitosano, de tamaño promedio comprendido entre 400 jm y 700 jm , en donde dicho quitosano se extrae a partir de champiñones de París.

En cuanto a la molécula aniónica, como se especifica para el procedimiento de la invención, se trata preferentemente de una molécula polimérica y más preferentemente de ácido hialurónico o de un derivado de ácido hialurónico o un complejo de ácido hialurónico, y más específicamente de ácido hialurónico procedente de fermentación bacteriana. Los condrocitos diferenciados, presentes dentro de la composición de la invención, son, por ejemplo, condrocitos articulares. De manera muy preferida, se trata de condrocitos humanos o animales, en particular, caninos o equinos. Los condrocitos son condrocitos diferenciados, que presentan un fenotipo condrocitario, en particular, con un índice de diferenciación COLII/COLI superior a 1. Preferentemente, los condrocitos presentes en esta composición sintetizan principalmente las proteínas de colágeno de tipo II con una relación proteica COLII/COLI superior a 1, preferentemente superior a 1,5; y/o la tasa de ARN mensajeros de colágeno de tipo II es significativamente superior al nivel de ARN mensajeros de tipo I, con una relación del nivel transcripcional COLII/COLI de las células superior a 1, por ejemplo, superior a 100, o superior a 1000.

Según una implementación de la invención, la proporción relativa de los condrocitos dentro de la composición corresponde a una concentración comprendida entre 106 y 107 células/g de estructura de hidrogel 3D, en el momento del cultivo.

La composición de la invención también puede comprender otros compuestos o moléculas, y en particular, la matriz extracelular (MEC).

De manera preferente, una composición como se describe, o gel de cartílago, es susceptible de obtenerse por la implementación del procedimiento de la invención, en particular, por el cultivo de las células dentro de la estructura tridimensional, y luego su proliferación, seguido de su rediferenciación acompañada de la síntesis de MEC.

También se puede prever la adición de compuestos adicionales, en particular, solubles, por ejemplo, seleccionados entre agentes antiinflamatorios, anestésicos, analgésicos, corticosteroides, vitaminas, minerales, compuestos destinados a reducir la respuesta inmunitaria, y/o a favorecer el injerto, la totalidad o parte de estos compuestos o una combinación de estos sin que esta lista sea limitativa.

Como se ha descrito en el contexto del procedimiento de la invención, la estructura tridimensional descrita es ventajosamente reabsorbible, en particular, biorreabsorbible in vivo. Las propiedades del hidrogel de quitosano o del derivado de quitosano se seleccionarán en función de la escala de tiempo deseada hasta que la estructura tridimensional se reabsorba completamente, una vez implantada la composición. Preferentemente, el tiempo de reabsorción se adaptará a fin de que dicha reabsorción tenga lugar de forma concomitante con la síntesis de la matriz cartilaginosa por los condrocitos presentes en la composición; de manera preferente, el tiempo de reabsorción se ajustará de tal manera que la matriz cartilaginosa formada por los condrocitos se sustituya completamente con la estructura tridimensional de hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano.

Según otro aspecto de la invención, la composición tal como la obtenida al final del procedimiento de la invención, o tal como se describe según el segundo aspecto de la invención, es para un uso terapéutico y/o quirúrgico, en particular, para un uso como implante o injerto en la reparación o la reconstrucción de tejido cartilaginoso, o en el tratamiento de la artrosis, y más generalmente en el tratamiento de cualquier patología caracterizada por una degradación o una desaparición del tejido cartilaginoso, en particular, lesión cartilaginosa, por ejemplo, como consecuencia de lesiones traumáticas y limitadas del cartílago articular, o de lesiones más profundas de tipo osteocondral. Dicha composición para un uso in vivo se contempla en particular en cirugía, reumatología, o como vector de principio activo. La composición, o gel de cartílago, es implantable por artroscopia.

Un uso especialmente previsto es el injerto de condrocitos. Preferentemente, los condrocitos presentes dentro de la composición a injertar son células autólogas o alogénicas, preferentemente se trata de condrocitos humanos, caninos o equinos.

Según todavía otro aspecto, la presente invención también se refiere a una estructura tridimensional formada por partículas o fragmentos de hidrogel físico de quitosano puro o de un derivado de quitosano, y su uso para la siembra de células in vitro, en particular, con fines de proliferación y síntesis de matriz extracelular, en particular, para la implementación del procedimiento según el primer aspecto de la presente invención. La estructura tridimensional es como se ha descrito anteriormente; lo mismo sucede para el hidrogel de quitosano o de derivado de quitosano. Este último se extrae preferentemente de los champiñones de París como se ha explicado anteriormente, que tiene una masa molar promedio en peso, comprendida preferentemente entre 150 y 220 kDa. Las partículas de hidrogel tienen preferentemente un tamaño promedio comprendido entre 200 jm y 1, 2 mm, y más preferentemente entre 400 y 700 jm . Una molécula aniónica se añade preferentemente a las partículas de hidrogel de la estructura tridimensional; se trata preferentemente de un polímero aniónico, especialmente de ácido hialurónico o un derivado de ácido hialurónico o un complejo de ácido hialurónico, en particular, obtenido por fermentación bacteriana.

Todas las implementaciones preferentes detalladas anteriormente relativas a los elementos de la estructura tridimensional son también aplicables a este aspecto de la invención, y especialmente las siguientes características: las partículas de hidrogel tienen preferentemente un tamaño comprendido entre 200 |jm y 1,2 mm, preferentemente entre 400 y 700 jm , y/o el quitosano tiene una masa molar promedio en peso comprendida preferentemente superior a 50 kDa, preferentemente entre 150 y 220 kDa, y/o el quitosano tiene un grado de acetilación comprendido entre 5 y 60 %, preferentemente entre 28 y 40 %, y/o el ácido hialurónico tiene una masa molar promedio en peso comprendida entre 50 kDa y 4 MDa, preferentemente entre 1 y 2 MDa.

La proporción de ácido hialurónico con respecto al hidrogel de quitosano está preferentemente comprendida entre 1 y 10 %, preferentemente entre 1 y 3 %. Como se ha descrito anteriormente, esta estructura tridimensional se utiliza ventajosamente para la siembra o cultivo de células primarias, en particular, condrocitos primarios, o células madre primarias diferenciadas en condrocitos, en particular, células madre mesenquimatosas. No obstante, otros tipos de células pueden cultivarse en esta estructura tridimensional, en particular, células óseas, fibroblastos, queratinocitos, o combinaciones de algunas de estas células, sin que esta lista sea limitativa. Los presentes inventores han demostrado en efecto que esta estructura tridimensional proporciona una arquitectura tridimensional particularmente favorable para las células, ya sea en fases de proliferación o de multiplicación, así como en fases de síntesis de matriz extracelular. Por otro lado, como se ha descrito anteriormente, esta estructura tridimensional es biodegradable y biorreabsorbible, y por tanto puede implantarse in vivo, en seres humanos o animales, una vez sembradas las células.

En el contexto de la presente invención, también está previsto implantar in vivo dicha estructura tridimensional de la invención, es decir, una estructura tridimensional que comprende fragmentos o partículas de hidrogel físico de quitosano o de derivado de quitosano, reticuladas de manera electrostática por una molécula aniónica, preferentemente un polímero, en particular, ácido hialurónico o derivado de ácido hialurónico o un complejo de ácido hialurónico, dicha estructura estando desprovista de células, para que la estructura 3D sea colonizada con precisión, in vivo, por células.

La estructura tridimensional tal y como se describe en el contexto de los diferentes aspectos de esta invención, se esteriliza preferentemente antes de cualquier siembra.

FIGURAS:

Fig.1: muestra una imagen de hidrogel físico de quitosano puro, obtenida por criomicroscopía electrónica de barrido.

Fig.2: muestra una imagen de hidrogel físico de quitosano puro deshidratado, obtenida por microscopía electrónica de barrido.

Fig.3: muestra una imagen de partículas de hidrogel físico de quitosano puro, después del tratamiento con eosina, obtenida por microscopía óptica.

Fig.4: muestra la tasa de supervivencia de las células sembradas en una estructura 3D de tipo M1, en función de la densidad inicial de condrocitos, medida con el kit Live and Dead en fracciones de cultivos a los 7 días (en curso de amplificación, en medio FI). El recuento de células muertas (en negro) y de células vivas (grises) se realiza con el software ImageJ a partir de imágenes tomadas por microscopía de fluorescencia a x20. El porcentaje de células muertas se calcula para cada condición realizando la relación células muertas/células totales.

Fig.5: muestra la evolución en función del tiempo de la población de condrocitos dentro de estructuras 3D a base de partículas de hidrogel físico de quitosano extraído de hongos, suplementadas o no con ácido hialurónico, con tamaños de partículas diferentes, o dentro de estructuras 3D a base de partículas de hidrogel físico de quitosano extraído de calamar, o incluso de condrocitos cultivados en monocapas, en las condiciones de cultivo "FI". El número de células se representa en la ordenada, el tiempo de cultivo en días se representa en la abscisa Fig.6: muestra la evolución de la población de condrocitos en función del tiempo para diferentes densidades iniciales de condrocitos cultivados en monocapas, en las condiciones de cultivo "FI", confirmando que la población celular obtenida es idéntica a partir de los 7 días, independientemente de la densidad inicial.

Fig.7: muestra las imágenes de microscopía óptica en función del tiempo, de condrocitos cultivados dentro de estructuras tridimensionales de partículas de hidrogel puro (M1).

La Fig.7A representa las células al final de la etapa de amplificación, en medio FI, 14 días después de la siembra.

La Fig.7B representa las células en el transcurso de la etapa de síntesis de MEC, en medio BIT, 24 días después de la siembra, es decir, 10 días después de la inducción de la rediferenciación y la síntesis de MEC. El factor de aumento es x 20.

Fig.8: muestra la cantidad de ARN mensajeros del colágeno de tipo I y del colágeno de tipo II en relación con el gen GAPDH, medida por RT-PCR cuantitativa, para condrocitos cultivados dentro de una estructura 3D (M1) con varias densidades celulares iniciales en comparación con la técnica monocapa, al cabo de 35 días de cultivo.

Fig.9: muestra la relación de los ARN mensajeros de los genes COLII/COLI, obtenida por RTC-PCR cuantitativa, de condrocitos sembrados dentro de una estructura 3D (M1) con varias densidades celulares iniciales en comparación con la técnica monocapa, al cabo de 35 días de cultivo.

Fig.10: muestra el análisis por transferencia Western, de las tasas proteicas del colágeno de tipo I y del colágeno de tipo II, para los condrocitos cultivados en estructura tridimensional M1 en comparación con los condrocitos cultivados en monocapas, al cabo de 35 días. El nivel de expresión de actina sirve de control.

Fig.11: muestra el análisis por inmunohistoquímica de condrocitos cultivados en estructura 3D M1 y M2, en comparación con los cultivados en monocapas (x20) (MC) al cabo de 35 días, para una misma densidad celular inicial (6,105 células) por tinción HES y SO, así como inmunotinción de colágeno de tipo I y de colágeno de tipo II. Ejemplos:

Ejemplo 1: Síntesis de hidrogel físico a base de quitosano.

El quitosano utilizado es de origen no animal, se extrae de la pared celular de los champiñones de París, Agaricus bisporus. Su masa molar promedio en peso (Mw) es de 170 g/mol; y su grado de acetilación (DA) es del 32 %. Se utiliza en forma en polvo.

El quitosano puro se pone en solución en una solución ácida de ácido acético (1 % en agua) en una cantidad estequiométrica con los grupos amina del quitosano. La solución se agita a temperatura ambiente hasta que el quitosano se disuelve completamente, o bien durante al menos 3 h, preferentemente al menos 6 h.

A continuación, se añade 1,2-propanediol en una cantidad idéntica al ácido acético y se deja agitar durante al menos 30 min, preferentemente 1 h a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla puede desgasificarse a temperatura ambiente, o al vacío si es necesario, si la solución contiene muchas burbujas de aire.

A continuación, la solución se vierte en recipientes, de tipo placa de pocillos múltiples o placas de Petri de 3 cm de diámetro, y luego se deja reposar, preferentemente durante una noche. A continuación, la solución se introduce en una estufa al vacío, preferentemente a 50 °C, durante el tiempo necesario para la formación del gel, preferentemente al menos 20 horas.

La etapa de gelificación también puede llevarse a cabo a temperatura ambiente, pero entonces requiere tiempos más largos (5-8 días en función de las características intrínsecas del quitosano).

El espesor de la solución antes de la gelificación puede estar comprendido entre 2 y 7 mm, preferentemente entre 3 6 mm, para favorecer la evaporación y las interacciones de tipo hidrófobas para una buena fijación de gel.

El hidrogel físico obtenido se neutraliza en un medio básico, con una solución de sosa NaOH 0,1 N, preferentemente durante 1 h. A continuación, se procede a realizar varios lavados con agua, preferentemente estéril. Los lavados duran preferentemente de manera aproximada 1 hora cada uno para retirar los excesos de alcohol y llevar el hidrogel a un pH neutro. En general, se realizaron al menos 6 lavados.

El gel así obtenido tiene un contenido de agua de aproximadamente 80 % en masa. La concentración final en masa de quitosano en el hidrogel está comprendida entre 1 % y 4,5 % antes de la neutralización, preferentemente entre 3,4 y 4,2 % antes de la neutralización. Es importante controlar las condiciones de temperatura y humedad durante la síntesis de hidrogeles a base de quitosano, especialmente cuando se extrae de los hongos, preferentemente en condiciones de temperatura ambiente inferiores a 25 °C.

El hidrogel obtenido al final de estas diferentes etapas tiene un espesor de 3 a 6 mm, preferentemente entre 4 y 5 mm de espesor, es de color blanco translúcido, y sus superficies son lisas y regulares. No obstante, su aspecto puede variar en función de las propiedades intrínsecas del quitosano de base, en particular, del grado de acetilación, masa molar y concentración. Se presenta en la forma de un bloque viscoelástico, cuyas propiedades mecánicas dependen de las características intrínsecas del quitosano de partida, en particular, de nuevo el grado de acetilación, la masa molar y la concentración.

El hidrogel obtenido es fácil de manipular, se puede desprender sin dificultad y sin rasgarse de la superficie plana sobre la que se realizó.

La observación por microscopía electrónica de barrido convencional del hidrogel deshidratado muestra una estructura fibrilar 3D, porosa, similar a la de un tejido vivo, como se representa en la Figura 2. La observación por criomicroscopía electrónica de barrido del hidrogel hidratado, como se representa en la Figura 1, muestra un tamaño de poros de 1 3 |jm que no posibilita la penetración de las células dentro del hidrogel pero posibilita la libre difusión de nutrientes y residuos celulares.

Ejemplo 2: Síntesis de partículas/fragmentos de hidrogel de quitosano a fin de producir la estructura 3D (estructura M1 y estructura M2).

Estructura M1:

El hidrogel de quitosano obtenido al final del ejemplo 1 se corta en pequeños cuadrados de 1 mm de lado y se coloca en 10 ml de agua, preferentemente estéril. A continuación, el hidrogel se tritura con un ultra-turrax, a razón de 6.000 a 17.000 rpm, durante 10 segundos 2-4 veces. Para obtener partículas de tamaño homogéneo y diámetro esperado, la molienda se realiza preferentemente a 6.000 rpm durante 10 segundos 3 veces, permitiendo tamaños de partículas de: 400-700 pm (50 %), incluso de 250-900 pm (> 80 %), con una media del orden de 650 micrómetros.

La solución obtenida se centrifuga, preferentemente a 1375 g durante 7 minutos, para recuperar el residuo constituido por partículas de hidrogel de quitosano. La figura 3 ilustra un ejemplo de partículas de quitosano obtenidas. Se utiliza una minicuchara para medir la cantidad de partículas de quitosano que entrarán en contacto con las células condrogénicas. Las pruebas preliminares han permitido validar la reproducibilidad de la medición.

Estructura M2:

Para reforzar las propiedades viscoelásticas de la estructura 3D en donde se siembran los condrocitos, los inventores también han producido una segunda estructura (M2), añadiendo un constituyente aniónico, interactuando con las funciones catiónicas del quitosano. El polímero seleccionado es el ácido hialurónico, preferentemente de origen bacteriano, ya que se sabe que dicho constituyente tiene mejores propiedades de biocompatibilidad, a fin de evitar las alergias o los posibles rechazos. La masa molecular en peso del ácido hialurónico utilizado en la realización de la estructura M2 es de aproximadamente 2 MDa. El ácido hialurónico se añade después de la preparación de las partículas de hidrogel de quitosano.

Ejemplo 3: Cultivo de las células dentro de la estructura 3D.

Las células utilizadas en el contexto de este ejemplo son condrocitos humanos obtenidos a partir de muestras humanas y tratados según el protocolo descrito en el documento FR2965278 (Univ. de Caen Basse-Normandie, et al).

Las partículas de hidrogel obtenidas al final del ejemplo 2, con el ácido hialurónico (estructura 3D M2) o sin él (estructura 3D M1), se esterilizan, por ejemplo a 121 °C durante 15 min, antes de la puesta en contacto con las células. Se toman algunas minicucharas de partículas de hidrogel, preferentemente 2 minicucharas que corresponden de 80 a 84 partículas, que se introducen en el pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos previamente cubierto con un inserto (tamaño de poros de 8 pm). Se añaden las células, entre 105 y 107, preferentemente del orden de 6.105células/pocillo, para 80-84 partículas de hidrogel, que se mezclan cuidadosamente con las partículas de hidrogel de quitosano. Esta proporción de células con respecto a la estructura 3D corresponde a aproximadamente 6,7 x 106 células por gramo de estructura 3D en el momento de la siembra.

El cultivo se realiza en una atmósfera controlada en una estufa a 37 °C con una tasa de CO2 de 5 %, en condiciones de normoxia.

Las células se adhieren espontáneamente a las partículas de hidrogel de quitosano. La cantidad de células que caen al fondo del pocillo se considera insignificante.

Como control, 6.105 células, obtenidas como se ha descrito anteriormente, se cultivan en monocapas sobre plástico en placas de 24 pocillos con las mismas condiciones de cultivo idénticas a las descritas anteriormente para las estructuras 3D (atmósfera controlada en una estufa a 37 °C, con una tasa de CO2 del 5 %, normoxia). Las células también se adhieren espontáneamente.

Ejemplo 4: Etapa de proliferación de las células.

En esta etapa, el medio de cultivo seleccionado es favorable a la multiplicación de las células.

El medio seleccionado es una solución de 50/50 DMEM-HAM F12 1 % AB (estreptomicina/penicilina) 10 SVF adicionada con una solución denominada "FI" que comprende FGF-2 a 5 ng/ml Insulina a 5 pg/ml. (Claus et al; 2012).

La mezcla descrita en la etapa anterior se recubre, después de un periodo corto de tiempo, con este medio de cultivo conocido por ser favorable a la proliferación de las células.

Durante esta fase de amplificación, el medio de cultivo se renueva 3 veces por semana, para los cultivos en las estructuras 3D, así como para los cultivos en monocapas. El periodo de proliferación dura entre una y dos semanas para obtener un número suficiente de células. Los inventores observaron que la fase de amplificación dura aproximadamente dos semanas, cuando las células se sembraron en una estructura constituida por partículas de hidrogel puro (estructura 3D M1) y pudo acortarse a 1 semana en presencia de partículas de hidrogel suplementadas con cadenas lineales de una molécula aniónica tal como ácido hialurónico (estructura 3D M2).

Por otro lado, se puede aumentar por completo la cantidad inicial de células de 6.105 células/inserto, si se cumple la condición de número de células/masa de hidrogel o número de células/volumen de hidrogel, o número de células/número de partículas de hidrogel. Como ejemplo, es posible sembrar por completo de 1 a 1,5 x 106 células/inserto, siempre que se añada la cantidad necesaria en la estructura 3D, para obtener más de 4 x106 células/inserto al final del procedimiento, incluso 10,5 x 106 células/inserto, incluso más.

Seguimiento por microscopía óptica:

Se realizó un seguimiento por microscopía óptica en fase inversa. Permitió validar que las células se adhieran bien a las partículas de hidrogel de quitosano y que este entorno es favorable para su cultivo. Las condiciones de cultivo (estructura tridimensional M1 o M2, y medio de cultivo FI) favorecen la proliferación y la división de los condrocitos. Las células observadas pueden proliferar de forma aislada o en montones/racimos. Los cultivos en estructuras 3D de partículas de hidrogel muestran células predominantemente redondas. La forma alargada, característica de los fibroblastos, no se observa en las estructuras 3D M1 y M2, excepto a veces en la periferia, es decir, en la interfaz entre la estructura y el entorno exterior.

Como control, los inventores realizaron en paralelo cultivos en monocapas. Al cabo de 24 días de cultivo, en el mismo medio FI que las células sembradas en las estructuras M1 y M2, los condrocitos adoptan una morfología alargada característica de las células fibroblásticas.

Viabilidad de las células:

La viabilidad de los condrocitos sembrados en las estructuras tridimensionales se midió con el kit Live and Dead en fracciones de cultivos a los 7 días (en el transcurso de la amplificación, en medio FI). El recuento de células muertas (rojas) y de células vivas (verde) se realiza con el software ImageJ a partir de imágenes tomadas por microscopía de fluorescencia a x20. El porcentaje de células muertas se calcula para cada condición realizando la relación células muertas/células totales. La viabilidad es superior al 93 %, incluso superior al 97 %, lo que muestra una buena biocompatibilidad de la estructura 3D.

La figura 4 ilustra los resultados obtenidos.

Pruebas de proliferación:

Las pruebas de proliferación se realizaron mediante el recuento de las células totales en el Cellometer T4 después del desprendimiento de las células con tripsina y la tinción de las células muertas con azul de tripano.

Las mediciones se realizaron después de 1 día (D1), 14 días (D14) y 21 días (D21) de cultivo después de la siembra de condrocitos primarios en el D0.

La figura Fig.5 ilustra la evolución de la población celular.

Después de 7 días, se observa claramente el aumento del número de células. Las células sobreviven y proliferan muy bien en la estructura 3D de hidrogel, así como en monocapas (MC).

En la estructura tridimensional, M1 o M2, las células siguen siendo redondas durante la etapa de multiplicación mientras que adoptan una forma alargada, de tipo fibroblástico, en monocapas.

Por otro lado, la figura 6 ilustra que en las monocapas, la población celular es idéntica a partir de los 7 días, sea cual sea la densidad inicial de las células sembradas.

En conclusión, al final de esta etapa de proliferación, se observa que la amplificación de las células en la estructura tridimensional compuesta por partículas de hidrogel de quitosano puro (estructura M1) es casi tan productiva como en las monocapas (MC), que es el protocolo de referencia para la multiplicación de células tales como los condrocitos, pero que impone una etapa de tripsinización que puede evitarse utilizando la estructura M1.

La adición de ácido hialurónico a la estructura tridimensional de las partículas de hidrogel de quitosano (estructura M2) da lugar a una aceleración muy grande de la proliferación de las células, mucho mayor que la estructura M1 o que el cultivo en monocapas, en particular, por un factor de 2.

Ejemplo 5: Diferenciación y producción de matriz extracelular

En el contexto de la presente invención, las etapas de multiplicación y diferenciación son preferentemente distintas: en un primer tiempo las células se multiplican y en un segundo tiempo, se diferencian y producen la matriz extracelular. El medio de cultivo utilizado para la etapa anterior de multiplicación se modifica al cabo de 15 días. El medio de cultivo "FI" se reemplaza con un medio "BIT" para favorecer la etapa de diferenciación de las células y producción de la matriz extracelular.

A continuación, el medio de cultivo se compone preferentemente de: 50/50 DMEM-HAM F12+1 % AB (estreptomicina/penicilina)+ 10 SVF, al que se añade una solución BIT compuesta por: BMP-2 a 200 ng/ml Insulina a 5 |jg/ml triyodotironina T3 a 100 mM (Claus et al, 2012).

Este nuevo medio de cultivo se renueva cada dos o tres días. El periodo de rediferenciación y condrogénesis dura preferentemente 3 semanas. Como control, el mismo cambio de medio se efectúa para las células cultivadas en monocapas.

Seguimiento por microscopía óptica:

Se sabe que las células con aspecto fibrilar en monocapas en medio FI se redondean después de 1 semana de cultivo en medio BIT. Las células cultivadas en monocapas (correspondientes al control) cambian de aspecto después del paso en medio BIT, lo que indica que el cambio de medio de cultivo induce un cambio en el comportamiento de las células.

En los hidrogeles (estructuras M1 y M2), las células son principalmente redondas al final de la fase de amplificación y continúan siéndolo durante toda la fase de producción de la matriz extracelular. Este punto se ilustra en particular en la figura Fig.7.

Al final del cultivo, en el D35, las células son perfectamente redondas en los hidrogeles (estructuras M1 y M2), menos en las monocapas. En estructuras tridimensionales, las células pueden aglutinar las partículas de hidrogel y formar una especie de "bolita" más o menos compacta. Esta observación se realiza en la mayoría de las condiciones que contienen los hidrogeles, pero no en las monocapas que sirven como control. Esta observación constituye una evidencia de la elevada producción de matriz extracelular que se ha acumulado alrededor de las células. Las células fabrican más matriz extracelular en el entorno tridimensional que en las monocapas.

Cabe señalar que la composición constituida por dichas bolitas, sigue siendo, sin embargo, en ciertas condiciones, inyectable, a pesar de la síntesis de una gran cantidad de matriz extracelular. En cualquier caso, la composición es implantable.

Pruebas PCR:

Por PCR, se cuantificó la tasa de transcripción de las siguientes proteínas: COLI, COLII y GAPDH. La tasa de transcripción sirve de referencia para comparar los niveles de transcripción COLI y COLII. En efecto, es bien sabido que el fenotipo condrocitario y la producción de matriz extracelular van acompañados de una elevada síntesis de transcritos COLII, mientras que los transcritos COLI suelen acompañar el proceso de desdiferenciación, en particular, hacia un fenotipo fibroblástico. Los resultados se presentan en la figura 8.

Los resultados COLII/GAPDH realizados al final de la etapa de síntesis de MEC, muestran que hay más transcritos de COLII para los cultivos de hidrogel que para los cultivos en monocapas. Los resultados COLI/GAPDH muestran que, por el contrario, hay más transcritos de COLI en los cultivos en monocapas que en los cultivos dentro de las estructuras tridimensionales.

El resultado del cálculo de la relación COLII/COLI se ilustra en la figura Fig.9. Se muestra que hay una relación mucho mejor, y por tanto una rediferenciación mucho mejor después de la desdiferenciación, dentro de las estructuras 3D constituidas por partículas de hidrogel de quitosano en comparación con las monocapas. El entorno tridimensional ensayado favorece por tanto la rediferenciación de los condrocitos desdiferenciados, como consecuencia de una intensa multiplicación previa, por un factor de al menos 6. Esta estructura 3D favorece la expresión del fenotipo condrocitario.

Las condiciones de cultivo (estructura tridimensional a base de hidrogel de quitosano y medio de cultivo BIT) favorecen por tanto la rediferenciación de los condrocitos y la producción de matriz cartilaginosa, en comparación con un cultivo en monocapas.

Pruebas de transferencia Western:

Tras haber verificado las tasas de transcripción de los genes ColI y ColII, en función de las condiciones de cultivo (3D o monocapas), se verificó la tasa de síntesis de las proteínas correspondientes, por la técnica de transferencia Western. Los resultados de diferentes transferencias Western se ilustran en la Fig.10.

Los resultados de transferencia Western anti-COLII muestran la presencia de COLII en todas las condiciones. Los resultados de WB anti-COLI, muestran manchas más intensas en las monocapas. Esta observación corrobora lo revelado en la Q-PCR: la relación COLII/COLI es superior en las estructuras 3D de hidrogel que en las monocapas. El análisis de transferencia Western muestra la expresión de las proteínas características del cartílago articular en la estructura 3D.

Resultados de inmunohistoquímica:

Las composiciones obtenidas se observaron luego en inmunohistoquímica, a fin de comparar la implementación del nuevo procedimiento, en estructura tridimensional, y el cultivo tradicional en monocapas, a nivel de la síntesis de MEC, proteoglicanos, colágeno de tipos I y II. Los resultados se ilustran con las fotos de la figura Fig.11.

Se observa la mayor presencia de proteoglicanos en las estructuras tridimensionales (M1 y M2 en la figura 11) que en monocapas (MC en la figura 11) gracias a la tinción con Safranina O (SO), lo que pone de manifiesto la presencia de GAG. Por otro lado, se observa la gran producción de matriz extracelular y colágeno de tipo II en las imágenes de inmunohistoquímica de las células en un entorno tridimensional, marcadas respectivamente por la tinción HES, que pone de relieve los núcleos y la MEC, y por inmunotinción de Colágeno II, lo que pone de manifiesto la presencia de COLII. La tinción de las células dentro de la matriz por inmunotinción de Colágeno I confirma por otra parte la ausencia casi total de colágeno I, cuando los condrocitos se cultivan dentro de estructuras tridimensionales.

Ejemplo 6: Injerto de condrocitos

El conjunto de células y estructura 3D (ya sea la estructura M1 constituida por partículas de hidrogel de quitosano, o bien la estructura M2, constituida por partículas de hidrogel de quitosano suplementadas con una molécula aniónica de tipo ácido hialurónico) constituye al final del cultivo, entre 3 y 6 semanas, un neotejido cartilaginoso que puede ser inyectado o implantado por artroscopia.

Obviamente, es posible aumentar el número de células en un inserto aumentando la cantidad de hidrogel, Cumpliendo, no obstante, las mismas condiciones de número de células con respecto a la masa de hidrogel, o al número de partículas de hidrogel, que constituyen la estructura 3D.

Como ejemplo, para una muestra de 0,3 g-0,5 g de cartílago humano, se pueden extraer 1-1,5x106 células (condrocitos). En la medida en que los inventores han demostrado, en los ejemplos anteriores, que a partir de 6.105 células iniciales por inserto, es posible obtener 3,6x106 células/inserto en 0,09 g de estructura de hidrogel, correspondiente a 80-84 partículas de hidrogel, se obtienen los siguientes datos de concentración:

- Concentración inicial de 6,7x106 células/g de biomaterial,

- Concentración final superior a 40 x106 células/g de biomaterial (estructura 3D).

Para una muestra de 1 a 1,5.106 células, se puede conseguir por tanto más de 3.106 células, incluso más de 10,5.106 células, tras la finalización del procedimiento, en 2-5 semanas, que es más que suficiente para un injerto en donde las cantidades recomendadas son de 3,2-6,5 x106 células.

Como conclusión de los ejemplos anteriores, se observan los siguientes puntos:

Durante la fase de amplificación/multiplicación:

- un rendimiento equivalente incluso superior en la estructura tridimensional que comprende las partículas de hidrogel de quitosano puro en comparación con el cultivo en monocapas,

- un rendimiento mucho mayor en la estructura tridimensional que comprende las partículas de hidrogel suplementadas con ácido hialurónico que en las monocapas.

Durante la fase de diferenciación y producción de MEC:

- una rediferenciación de las células en estructuras 3D y en monocapas, como lo demuestran los análisis de PCR, WB e inmunohistoquímica;

- una relación de ARN mensajeros COLII/COLI significativamente superior en la estructura tridimensional en comparación con el cultivo en monocapas,

- una relación proteica COLII/COLI significativamente superior en la estructura tridimensional que en las monocapas - un fenotipo condrocitario estable en la estructura 3D

- la producción de matriz cartilaginosa abundante en la estructura 3D

La sucesión de etapas, en un mismo medio tridimensional, que comprende partículas de hidrogel de quitosano con/sin molécula estructurante, de amplificación y luego de diferenciación/condrogénesis es muy favorable para obtener un neotejido cartilaginoso inyectable o implantable con excelentes propiedades mecánicas y biológicas. La adición de ácido hialurónico mejora el sistema acelerando el proceso de amplificación de las células y permitiendo aumentar el número de células a implantar o ganar una semana en el protocolo global.

La configuración de la estructura permite optimizar la superficie de contacto con las células.

Ejemplo 7: Comparación de diferentes estructuras 3D.

Los inventores han reproducido las estructuras 3D descritas en los ejemplos anteriores, en concreto en el ejemplo 2, variando el tipo de quitosano que constituye las partículas de hidrogel, el tamaño de las partículas de hidrogel, y la presencia y concentración de ácido hialurónico. Se compararon las tasas de proliferación y los resultados obtenidos se ilustran en la tabla 1. Se asignó el valor 1 a la estructura M1, que corresponde a partículas de varios cientos de micrómetros, obtenidos a partir del quitosano de hongos.

La tasa de proliferación obtenida con la estructura M2 (extracto de hongos y suplementado con ácido hialurónico 2 M) es 2 veces superior con respecto a la estructura M1 (extracto de hongos no suplementado con ácido hialurónico), que, a su vez, permite obtener una tasa de proliferación 1,5 veces superior con respecto a la del quitosano extraído de calamares, o con partículas de tamaño del orden de decenas de pm.

T l 1: R l i n r lif r i n.

REFERENCIAS:

Claus S, Mayer N, Aubert-Foucher E, Chajra H, Perrier-Groult E, Lafont J, Piperno M, Damour O, Mallein-Gerin F. Cartilage-characteristic matrix reconstruction by sequential addition of soluble factors during expansion of human articular chondrocytes and their cultivation in collagen sponges. Tissue Eng Part C Methods. 2012;18(2):104-12. Correia CR, et al. Chitosan scaffolds containing hyaluronic acid for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. Julio de 2011; 17(7):717-30.

Denuziere A, Ferrier D, Damour O, Domard A. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes: biological properties. Biomaterials. 1998; 19(14): 1275-85. Griffon DJ, Sedighi MR, Schaeffer DV, Eurell JA, Johnson AL. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. Mayo de 2006;2(3):313-20. Hao T, Wen N, Cao JK, Wang HB, Lü SH, Liu T, Lin QX, Duan CM, Wang CY. The support of matrix accumulation and the promotion of sheep articular cartilage defects repair in vivo by chitosan hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. Febrero de 2010;18(2):257-65.

Hautier A, et al. Bone morphogenetic protein-2 stimulates chondrogenic expression in human nasal chondrocytes expanded in vitro. Growth Factors. 2008;26(4):201-11.

Hoemann CD, Sun J, Légaré A, McKee MD, Buschmann MD. Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesive chitosan-based cell-delivery vehicle. Osteoarthritis Cartilage. 2005; 13(4):318-29.

Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford DS, Frondoza CG. Chitosan supports the expression of extracellular matrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes. J Biomed Mater Res. 2000;51(4):586-95.

Liu G, et al. Optimal combination of soluble factors for tissue engineering of permanent cartilage from cultured human chondrocytes. J Biol Chem. 13 de julio de 2007;282(28):20407-15.

Montembault A, Tahiri K, Korwin-Zmijowska C, Chevalier X, Corvol MT, Domard A. A material decoy of biological media based on chitosan physical hydrogels: application to cartilage tissue engineering. Biochimie. Mayo de 2006;88(5):551-64.

Park H, Choi B, Hu J, Lee M. Injectable chitosan hyaluronic acid hydrogels for cartilage tissue engineering. Acta Biomater. Enero de 2013;9(1):4779-86.

Suh JK, Matthew HW. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review. Biomaterials. 2000;21(24):2589-98.

Tallheden T, et al. Proliferation and differentiation potential of chondrocytes from osteoarthritic patients. Arthritis Res Ther. 2005;7(3):R560-8.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro de obtención de una composición implantable para la reparación tisular del cartílago que comprende partículas de hidrogel de quitosano y células aptas para formar cartílago hialino, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas sucesivas:

(i.) Amplificación de células primarias, en una estructura tridimensional que comprende partículas de hidrogel físico de quitosano o de derivado de quitosano, y luego

(ii.) Inducción de la síntesis de matriz extracelular por dichas células amplificadas, dentro de la estructura tridimensional de la etapa (i.),

en donde dichas células son condrocitos articulares primarios y/o células madre mesenquimatosas primarias diferenciadas en condrocitos y dichas células no son células madre embrionarias humanas,

y en donde dichas células no penetran en las partículas de hidrogel.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde las dos etapas (i) y (ii) se llevan a cabo dentro de la misma estructura tridimensional sin ninguna etapa de tripsinización de las células.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicha composición se realiza en menos de 45 días, preferentemente menos de 35 días, en particular menos de 28 días.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de amplificación dura entre 1 y 3 semanas, preferentemente menos de dos semanas, y permite la multiplicación del número de células por al menos 4, preferentemente por 6.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las partículas de hidrogel tienen un tamaño promedio comprendido entre 10 pm y 1,5 mm, preferentemente entre 400 pm y 700 pm.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el quitosano tiene una masa molar promedio en peso superior a 50 kDa, preferentemente entre 150 y 220 kDa.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el quitosano se extrae a partir de hongos, preferentemente a partir de Agaricus bisporus.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la estructura tridimensional comprende también un polímero aniónico asociado a las partículas de hidrogel de quitosano en la superficie, preferentemente ácido hialurónico, que está presente durante las dos etapas o se añade al final de la etapa (i.) o (ii.).

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el ácido hialurónico se extrae a partir de fermentación bacteriana, con una masa molar promedio en peso superior a 1 MDa, preferentemente superior a 2 MDa.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la tasa de viabilidad de las células es superior al 90 %, preferentemente superior al 93 %.

11. Composición implantable que comprende una estructura tridimensional formada por partículas de hidrogel físico de quitosano o de derivado de quitosano, asociadas a un polímero aniónico, preferentemente ácido hialurónico, y condrocitos diferenciados o cualquier célula diferenciada en condrocitos, o células madre diferenciadas en condrocitos, o células precursoras de condrocitos, o células pluripotentes inducidas (IPS), o células madre mesenquimatosas, en donde dichas células no son células madre embrionarias humanas,

en donde dicha composición es susceptible de ser obtenida por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Composición implantable según la reivindicación 11, en donde los condrocitos sintetizan preferentemente proteínas de colágeno de tipo II y ARN mensajeros de colágeno de tipo II, que expresan una relación COLII/COLI superior a 1.

13. Composición implantable por artroscopia según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, para un uso en la reparación cartilaginosa o para un uso como implante, o como injerto o como vector de un principio activo en seres humanos o animales.

14. Composición implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el contenido de agua dentro del hidrogel de quitosano es superior al 70 %, preferentemente superior al 80 %.

15. Composición implantable según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el hidrogel físico de quitosano se sintetiza sin un agente de reticulación.

16. Estructura tridimensional formada por partículas de hidrogel físico de quitosano o de derivado de quitosano, asociadas a un polímero de ácido hialurónico, en donde dicho quitosano se extrae a partir de hongos, y en donde dichas partículas de hidrogel tienen un tamaño promedio comprendido entre 400 |jm y 700 |jm.

17. Estructura tridimensional según la reivindicación 16, que asegura una distribución espacial óptima de las células sembradas.

18. Uso de una estructura tridimensional formada por partículas de hidrogel físico de quitosano o de derivado de quitosano, asociadas a un polímero aniónico, preferentemente ácido hialurónico, para la siembra de condrocitos, o de células madre diferenciadas en condrocitos, o de células precursoras de condrocitos, o de células pluripotentes inducidas (IPS), o de células madre mesenquimatosas con fines de proliferación y síntesis de matriz extracelular de dichas células, en donde dichas células no son células madre embrionarias humanas.

19. Uso de una estructura tridimensional según la reivindicación 16 o 17, para la siembra de células, preferentemente de células óseas, fibroblastos, queratinocitos o combinaciones de algunas de estas células.