ES2870989T3 - Dispositivos y métodos para el análisis de muestras - Google Patents

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Peter J Karabatsos
Andrew S Schapals
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Shelley R Holets-Mccormack
Sophie Laurenson
Andrew T Fischer
Richard Haack
Stefan Hershberger
Dustin House
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M Shawn Murphy
Mark R Pope
Edna M Prieto-Ballengee
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Sergey Tetin
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Abstract

Un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado para la detección de analitos que comprende: un módulo microfluídico digital; y un módulo nanoporoso conectado de forma fluida al módulo microfluídico digital y que comprende al menos un nanoporo en una capa, en donde el módulo microfluídico digital facilita el movimiento de una nanogota hacia el al menos un nanoporo.

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivos y métodos para el análisis de muestras
Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes de patente provisionales de EE.UU. n.° 62/142.872, presentada el 3 de abril de 2015, 62/278.303, presentada el 13 de enero de 2016 y 62/279.488, presentada el 15 de enero de 2016.
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a métodos, dispositivos y sistemas para el análisis de analitos utilizando un dispositivo nanoporoso, p. ej., acoplado operativamente a un dispositivo microfluídico. Srikoundinya Punnamaraju: "Voltage and Photo Induced Effects in Droplet-Interface-Bilayer Lipid Membranes", , 8 de noviembre de 2011 (08-11­ 2011), páginas 1-160, se refiere a la formación de una doble capa interfacial entre nanogotas (DIB, Droplet Interface Bilayer) entre dos nanogotas en un dispositivo microfluídico digital, y desvela la inserción de nanoporos biológicos en bicapas lipídicas artificiales para investigar el efecto de la concentración de nanoporos y el cambio de tensión en la corriente de la DIB.
Antecedentes
Los métodos y dispositivos que pueden analizar con exactitud los analitos de interés en una muestra son esenciales para el diagnóstico, el pronóstico, la evaluación ambiental, la seguridad alimentaria, la detección de agentes de guerra química o biológica, y similares. Dichos métodos y dispositivos no solo deben ser exactos, precisos y sensibles, sino que también son ventajosos en el análisis de muestras diminutas de manera rápida y con una instrumentación mínima. Como tales, hay un interés en los métodos y dispositivos con capacidades mejoradas de análisis de muestras. A continuación en el presente documento, el término "realización" se refiere a la divulgación y solo forma parte de la invención si entra dentro del alcance de las reivindicaciones.
Sumario
Las realizaciones de la presente divulgación se refieren a métodos, sistemas y dispositivos para el análisis de uno o varios analitos en una muestra. En determinadas realizaciones, la muestra puede ser una muestra biológica. El alcance de la protección está definido por las reivindicaciones adjuntas.
El método para el análisis de un analito en una muestra puede implicar poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el soporte sólido con un segundo miembro de unión, donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y donde el segundo miembro de unión incluye un marcador escindible fijado al mismo; retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión; escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión que está unido al analito unido al primer miembro de unión; trasladar el marcador escindido a través de o por un nanoporo de una capa; determinar el número de marcadores que se trasladan a través de la capa; determinar la concentración del analito en la muestra basándose en el número de marcadores que se trasladan a través de la capa. En determinadas realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de la capa por unidad de tiempo. En otras realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante la determinación del momento en el que el número de marcadores que se trasladan a través de la capa alcanza un umbral o mediante el establecimiento de un período de tiempo y el recuento del número acumulativo de recuentos en el período de tiempo establecido.
En otra realización, el método puede incluir combinar la muestra que contiene el analito diana con una cantidad conocida del analito diana o una molécula competidora, donde el analito diana (combinado con la muestra) o la molécula competidora se fijan a un marcador a través de un enlazador escindible para producir un analito marcado o una molécula competidora marcada, respectivamente, y el analito marcado o la molécula competidora marcada compiten con el analito diana por la unión a un primer miembro de unión. El método puede incluir además poner en contacto la muestra combinada con el primer miembro de unión, donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito diana (y al analito marcado o molécula competidora marcada); poner en contacto el soporte sólido con tampón para una etapa de lavado opcional; escindir el marcador fijado al analito marcado o competidor marcado que está unido al primer miembro de unión inmovilizado sobre el soporte sólido; trasladar el marcador escindido a través de o por un nanoporo de una capa; determinar el número de marcadores que se trasladan a través de la capa; determinar la concentración del analito en la muestra basándose en el número de marcadores que se trasladan a través de la capa. En determinadas realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de la capa por unidad de tiempo. En otras realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante la determinación del momento en el que el número de marcadores que se trasladan a través de la capa alcanza un umbral o mediante el establecimiento de un período de tiempo y el recuento del número acumulativo de recuentos en el período de tiempo establecido. En esta realización, el número de marcadores trasladados a través del nanoporo o el momento en el que el número de marcadores trasladados a través de la capa alcanza un umbral puede estar inversamente correlacionado con la concentración del analito en la muestra. Por ejemplo, cuanto menor es el recuento o mayor es el período de tiempo para alcanzar un umbral, mayor será la concentración del analito diana en la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método que comprende poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y donde el segundo miembro de unión comprende un marcador escindible fijado al mismo; retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión; escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión que está unido al analito unido al primer miembro de unión; trasladar el marcador escindido a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde el número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método que comprende poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un aptámero; retirar el aptámero no unido al analito unido al sustrato sólido; disociar el aptámero unido al analito y trasladar el aptámero disociado a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende un sustrato inferior, que comprende una serie de electrodos; un sustrato superior separado del sustrato inferior; y una capa nanoporosa dispuesta entre los sustratos inferior y superior. El dispositivo incluye una parte proximal y una parte distal, y la capa nanoporosa está dispuesta en la parte distal. La serie de electrodos de la parte proximal está configurada para generar una nanogota. La serie de electrodos está configurada para colocar la nanogota por la capa nanoporosa de modo que la nanogota sea dividida por la capa nanoporosa en una primera parte y una segunda parte, en donde al menos dos electrodos de la serie de electrodos están colocados por la capa nanoporosa, donde los dos electrodos forman un ánodo y un cátodo y funcionan para impulsar la corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa cuando se coloca una nanogota de líquido por la capa nanoporosa.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende un sustrato inferior, que comprende una serie de electrodos; un sustrato superior separado del sustrato inferior y que comprende un electrodo; y una capa nanoporosa dispuesta entre los sustratos inferior y superior. El dispositivo incluye una parte proximal y una parte distal, y la capa nanoporosa está dispuesta en la parte distal. La serie de electrodos y el electrodo de la parte proximal están configurados para generar una nanogota. La serie de electrodos y el electrodo están configurados para colocar la nanogota por la capa nanoporosa de modo que la capa nanoporosa divida la nanogota en una primera parte y una segunda parte, en donde al menos un electrodo de la serie de electrodos está en contacto con la primera parte de una nanogota colocada por la capa nanoporosa y el electrodo del sustrato superior está colocado para estar en contacto con la segunda parte de la nanogota colocada por la capa nanoporosa, donde los dos electrodos forman un ánodo y un cátodo y funcionan para impulsar la corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa cuando se coloca una nanogota de líquido por la capa nanoporosa.
En un aspecto, la presente invención de la divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método que comprende poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito marcado, en donde el analito marcado está marcado con un marcador escindible; retirar el analito marcado no unido al miembro de unión; escindir el marcador fijado al analito marcado que está unido al miembro de unión; trasladar el marcador escindido a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde el número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método que comprende poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito marcado, en donde el analito marcado comprende un aptámero; retirar el analito marcado no unido al miembro de unión; disociar el aptámero unido al analito marcado que está unido al miembro de unión y trasladar el aptámero disociado a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método que comprende poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión está marcado con un marcador escindible; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido; retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado; escindir el marcador fijado al miembro de unión que está unido al analito inmovilizado; trasladar el marcador escindido a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde el número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa el traslado de los marcadores a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método comprende poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión comprende un aptámero; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido; retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado; disociar el aptámero unido al miembro de unión que está unido al analito inmovilizado y trasladar el aptámero disociado a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En determinados aspectos, el marcador puede ser un polímero aniónico, un polímero catiónico o una nanopartícula. En determinados casos, el marcador puede incluir un polímero aniónico, tal como, un polímero oligonucleotídico. En determinados casos, el polímero oligonucleotídico puede ser un ácido desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico. En determinados casos, el polímero oligonucleotídico puede ser un aptámero de ADN o un aptámero de ARN, donde el aptámero no se une al analito. En casos ilustrativos, el marcador puede incluir una nanopartícula que puede ser una nanopartícula cargada positivamente o una nanopartícula cargada negativamente.
En determinadas realizaciones, el marcador puede ser un marcador esférico, tal como, un dendrímero, una perla, una nanopartícula, p. ej., una nanoperla y similares. En determinadas realizaciones, el marcador no puede ser lineal o esencialmente lineal ni de forma alargada, tal como, un polímero de unidades de ribosa o desoxirribosa, un oligonucleótido y un ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN.
En determinados casos, el primer y el segundo miembro de unión pueden ser aptámeros, anticuerpos o receptores. Por ejemplo, el primer miembro de unión puede ser un receptor y el segundo miembro de unión puede ser un anticuerpo o el primer miembro de unión puede ser un anticuerpo y el segundo miembro de unión puede ser un receptor. En determinados casos, el primer miembro de unión puede ser un primer anticuerpo y el segundo miembro de unión puede ser un segundo anticuerpo.
En determinados casos, el marcador puede estar cargado negativamente y el traslado puede incluir aplicar un potencial positivo por la capa, trasladando así el marcador por la capa.
En determinados casos, el marcador puede estar cargado positivamente y el traslado puede incluir aplicar un potencial negativo por la capa, trasladando así el marcador por la capa.
En otras realizaciones, el marcador puede ser un ácido nucleico y el marcador puede hibridarse con un oligonucleótido que incluya una secuencia complementaria a la secuencia del marcador antes del traslado.
En otra realización, se proporciona un método para medir un analito presente en una muestra biológica utilizando un aptámero como segundo miembro de unión. Por ejemplo, el método puede incluir poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un aptámero; retirar el aptámero no unido al analito unido al sustrato sólido; disociar el aptámero del analito que está unido al sustrato sólido y trasladar el aptámero disociado a través de uno o varios nanoporos de una capa; determinar el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa; medir el analito en la muestra en función del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa. En esta realización, el segundo miembro de unión no está fijado a un marcador, ya que el segundo miembro de unión es detectado directamente por el/los nanoporo/s.
El aptámero puede ser un aptámero de ADN o un aptámero de ARN. El primer miembro de unión puede ser un anticuerpo. En un determinado caso, el analito puede ser un ligando y el primer miembro de unión puede ser un receptor.
También se desvelan en el presente documento métodos para analizar simultáneamente varios analitos diferentes en una muestra, por ejemplo, el método puede incluir el análisis de un primer y un segundo analito; un primer, un segundo y un tercer analito; y así sucesivamente. En determinados casos, el método para el análisis de una pluralidad de analitos diferentes en una muestra puede incluir poner en contacto la muestra con una pluralidad de primeros miembros de unión diferentes, donde un primer miembro de unión de los primeros miembros de unión diferentes se une específicamente a un primer analito de la pluralidad de los analitos diferentes, un segundo miembro de unión de los primeros miembros de unión diferentes se une específicamente a un segundo analito de la pluralidad de analitos diferentes, y así sucesivamente. El método puede incluir además poner en contacto los analitos diferentes con una pluralidad de segundos miembros de unión, donde un primer miembro de unión de la pluralidad de segundos miembros de unión se une al primer analito, un segundo miembro de unión de la pluralidad de segundos miembros de unión se une al segundo analito, y así sucesivamente. En determinados casos, cada uno de la pluralidad de segundos miembros de unión diferentes puede incluir un marcador que sea distinto o distinguible de los otros (p. ej., cada uno de los segundos miembros de unión diferentes tiene un marcador diferente). Por ejemplo, el primer miembro de unión de la pluralidad de los segundos miembros de unión puede incluir un primer marcador, el segundo miembro de unión de la pluralidad de los segundos miembros de unión puede incluir un segundo marcador, y así sucesivamente, donde el primer y el segundo marcador se distinguen entre sí. La distinción de los marcadores se puede realizar mediante cualquier método adecuado, p. ej., basado en la naturaleza o las propiedades características de los marcadores.
El método puede incluir además retirar los segundos miembros de unión no unidos; escindir los marcadores fijados a la pluralidad de segundos miembros de unión unidos a los analitos; trasladar los marcadores a través de nanoporos de una capa; determinar el número de cada uno de los marcadores que se trasladan a través de la capa; medir la pluralidad de analitos diferentes de la muestra basándose en el número de cada uno de los marcadores que se trasladan a través de la capa. En determinadas realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de la capa por unidad de tiempo. En otras realizaciones, la concentración del analito se puede determinar determinando el momento en el que el número de marcadores que se trasladan a través de la capa alcanza un umbral. Tal y como se indica en el presente documento, en determinados casos, los segundos miembros de unión pueden ser una pluralidad de aptámeros y que estos aptámeros no estén fijados a un marcador cuando se cuenten los aptámeros. En estas realizaciones, los aptámeros pueden disociarse del analito antes del traslado a través de uno o varios nanoporos.
En determinados casos, los diferentes marcadores, tales como los diferentes aptámeros, se pueden distinguir entre sí mediante espectroscopia de fuerza nanoporosa, medios ópticos o medios eléctricos, o una combinación de los mismos.
También se proporcionan en el presente documento kits, sistemas y dispositivos para llevar a cabo los métodos desvelados. Los kits, sistemas y dispositivos se pueden utilizar para realizar análisis de analitos de forma automatizada o semiautomatizada y, opcionalmente, pueden incluir componentes desechables/consumibles que se utilicen para el análisis de analitos. Los dispositivos automatizados y semiautomatizados pueden utilizar la microfluídica. Los ejemplos de microfluídica incluyen la microfluídica digital (DMF, Digital MicroFluidics), la microfluídica de ondas acústicas superficiales (SAW, Surface Acoustic Wave), dispositivo microfluídico a base de nanogotas y similares. Los ejemplos de microfluídica también incluyen un dispositivo nanoporoso y DMF totalmente integrado, o un dispositivo nanoporoso y de SAW totalmente integrado. En determinados casos, el dispositivo para llevar a cabo los métodos desvelados puede ser un dispositivo microfluídico digital utilizado junto con un dispositivo nanoporoso. En otras realizaciones, el dispositivo para llevar a cabo los métodos desvelados puede ser un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado. Estos dispositivos pueden ser dispositivos de un solo uso o pueden ser reutilizables (utilizados varias veces para el análisis de analitos). Los dispositivos nanoporosos y microfluídicos digitales descritos en el presente documento pueden proporcionar el análisis de analitos de bajo coste, miniaturizado, y se pueden fabricar utilizando tecnologías de bajo coste.
También se desvela en el presente documento un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende un módulo microfluídico y un módulo nanoporoso; comprendiendo el módulo microfluídico una serie de electrodos separados de un electrodo individual dimensionado para superponerse con al menos una parte de la serie de electrodos, donde la serie de electrodos y el electrodo individual transportan al menos una nanogota de fluido a un electrodo de transferencia de la serie de electrodos, en donde el electrodo de transferencia está colocado en una superficie de contacto que acopla operativamente el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso; comprendiendo el módulo nanoporoso un primer microcanal colocado sobre una primera superficie de un primer sustrato; un segundo microcanal colocado en una primera superficie de un segundo sustrato; en donde la primera superficie del primer sustrato está en contacto con la primera superficie del segundo sustrato, encerrando así al primer microcanal y al segundo microcanal para proporcionar un primer canal capilar y un segundo canal capilar, respectivamente, en donde al menos el primer canal capilar se extiende hasta la superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso, y es adyacente al electrodo de transferencia, y está colocado para recibir una nanogota de fluido colocada en el electrodo de transferencia; en donde el primer canal capilar intersecciona con el segundo canal capilar, en donde una capa nanoporosa está colocada entre el primer y el segundo sustrato en el lugar donde el primer y el segundo canal capilar interseccionan.
En determinadas realizaciones, la serie de electrodos puede comprender un primer y un segundo electrodo de transferencia, cada uno de los cuales está configurado para colocar una nanogota de fluido sobre una superficie de los electrodos de transferencia, en donde el primer canal capilar se extiende hasta la superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso, es adyacente al primer electrodo de transferencia y está colocado para recibir una nanogota de fluido ubicada en el primer electrodo de transferencia, y en donde el segundo capilar se extiende hasta la superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso, es adyacente al segundo electrodo de transferencia y está colocado para recibir una nanogota de fluido ubicada en el segundo electrodo de transferencia.
En determinadas realizaciones, el segundo canal capilar puede no extenderse hasta la superficie de contacto y puede no estar conectado a los electrodos del módulo microfluídico, y puede estar conectado a un conducto de ventilación o a un depósito en uno o ambos extremos del segundo capilar. En determinados casos, el segundo capilar está conectado a un primer depósito en un extremo y a un segundo depósito en el otro extremo.
En determinadas realizaciones, el primer depósito y/o el segundo depósito comprende/n un fluido que se colocará frente al primer canal capilar en la intersección, fluido que facilita el funcionamiento de la capa nanoporosa para impulsar la corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa. En determinadas realizaciones, el primer canal capilar y/o el segundo canal capilar varía/n en anchura en sección transversal a lo largo de la longitud del capilar de modo que la anchura disminuye en la intersección en comparación con la anchura en ambos lados de la intersección.
En algunas realizaciones, el primer capilar comprende un primer par de electrodos y el segundo capilar comprende un segundo par de electrodos, en donde el primer par de electrodos está colocado en el primer canal capilar y flanquea el nanoporo de la capa nanoporosa, y en donde el segundo par de electrodos está colocado en el segundo canal capilar y flanquea el nanoporo de la capa nanoporosa. Las nanogotas pueden ser nanogotas que comprendan una molécula para ser detectada y/o contada mediante el transporte a través del nanoporo de la capa nanoporosa.
En determinadas realizaciones, las nanogotas de fluido tienen diferentes composiciones y son una primera nanogota y una segunda nanogota, comprendiendo la primera nanogota una molécula para ser detectada y/o contada mediante el transporte por la capa nanoporosa a través del nanoporo y comprendiendo la segunda nanogota un fluido conductor que carece de la molécula, donde el fluido conductor facilita el transporte de la molécula por la capa nanoporosa a través del nanoporo.
En determinadas realizaciones, el primer canal capilar comprende un primer electrodo colocado próximo a la capa nanoporosa y comprendiendo el segundo canal capilar un segundo electrodo colocado próximo a la capa nanoporosa, en donde cada uno de entre el primer y el segundo electrodo está expuesto en los canales capilares de modo que esté en contacto con un fluido presente en los canales capilares y en donde el primer y el segundo electrodo funcionan para impulsar corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa cuando se coloca un líquido por la capa nanoporosa en el primer y segundo canal capilar.
En determinadas realizaciones, el electrodo de transferencia y el primer canal capilar están esencialmente en el mismo plano, y en donde la nanogota de fluido está alineada con una abertura del primer canal capilar.
En algunas realizaciones, el electrodo de transferencia está en un plano superior al primer canal capilar y en donde el dispositivo está configurado con un acceso vertical para transferir la nanogota de fluido hacia abajo hasta una abertura del primer canal capilar.
En una realización particular, la primera superficie del primer sustrato comprende una primera área en la que se dispone la serie de electrodos y una segunda área en donde se forma el primer microcanal, en donde la serie de electrodos está en un plano superior al plano en el que se forma el primer microcanal.
En algunas realizaciones, el segundo sustrato comprende una muesca en un borde lateral ubicado en la superficie de contacto, en donde la muesca está alineada sobre el primer canal capilar y proporciona un acceso vertical para el transporte de una nanogota ubicada en el electrodo de transferencia hasta la abertura del primer canal capilar.
En algunos casos, el electrodo individual se extiende sobre el electrodo de transferencia y está en configuración biplanar con el electrodo de transferencia, y en donde el electrodo individual y el electrodo de transferencia funcionan para mover la nanogota de fluido hasta el electrodo de transferencia.
En otros casos, el electrodo individual se extiende sobre los electrodos de transferencia y está en configuración biplanar con los electrodos de transferencia, y en donde el electrodo individual y los electrodos de transferencia funcionan para mover las nanogotas de fluido hasta los electrodos de transferencia.
En determinadas realizaciones, el electrodo individual no se extiende sobre el electrodo de transferencia y no está en configuración biplanar con el electrodo de transferencia, en donde la nanogota de fluido se mueve hasta el electrodo de transferencia utilizando electrodos coplanares.
En determinadas realizaciones, el electrodo individual no se extiende sobre los electrodos de transferencia y no está en configuración biplanar con los electrodos de transferencia, en donde las nanogotas de fluido se mueven hasta los electrodos de transferencia utilizando electrodos coplanares.
Por tanto, utilizando los dispositivos, kits, sistemas y métodos como se describe en el presente documento, se puede medir el analito presente en una muestra biológica y se puede diagnosticar a un paciente.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un marcador escindible fijado al mismo, (c) retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión, (d) escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión unido al analito unido al primer miembro de unión, (e) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el traslado del marcador a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de medición o detección de un analito de interés presente en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un primer miembro de unión específica y un segundo miembro de unión específica, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el primer miembro de unión específica comprende un ligando para el agente de inmovilización y el primer miembro de unión específica se une específicamente al analito de interés, el segundo miembro de unión específica comprende un marcador escindible y el segundo miembro de unión específica se une específicamente al analito de interés, en donde se forma un complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica/analito de interés/segundo miembro de unión específica, (b) retirar el segundo miembro de unión específica no unido al complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica/analito/segundo miembro de unión específica, (c) escindir el marcador fijado al analito marcado unido al segundo miembro de unión específica del complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica/analito de interés/segundo miembro de unión específica, (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (e) evaluar los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un aptámero, (c) retirar el aptámero no unido al analito unido al sustrato sólido, (d) disociar el aptámero unido al analito, (e) trasladar el aptámero disociado a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en una la muestra.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende: un primer sustrato, que comprende una serie de electrodos; un segundo sustrato separado del primer sustrato; y una capa nanoporosa dispuesta entre el primer y el segundo sustrato, en donde la serie de electrodos está configurada para colocar la nanogota por la capa nanoporosa de modo que la nanogota sea dividida por la capa nanoporosa en una primera parte y una segunda parte, en donde al menos dos electrodos de la serie de electrodos están colocados por la capa nanoporosa, donde los dos electrodos forman un ánodo y un cátodo y funcionan para impulsar la corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa cuando se coloca una nanogota de líquido por la capa nanoporosa.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende: un primer sustrato, que comprende una serie de electrodos; un segundo sustrato separado del primer sustrato; y una capa nanoporosa dispuesta entre el primer y el segundo sustrato, en donde la serie de electrodos está configurada para colocar una nanogota por la capa nanoporosa de modo que la capa nanoporosa divida la nanogota en una primera parte y una segunda parte, en donde al menos un electrodo de la serie de electrodos está en contacto con la primera parte de una nanogota colocada por la capa nanoporosa y el electrodo del segundo sustrato está colocado para estar en contacto con la segunda parte de la nanogota colocada por la capa nanoporosa, donde los dos electrodos forman un ánodo y un cátodo y funcionan para impulsar la corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa cuando se coloca una nanogota de líquido por la capa nanoporosa.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto la muestra con un analito marcado, en donde el analito marcado está marcado con un marcador escindible, (c) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión, (d) escindir el marcador fijado al analito marcado unido al miembro de unión, (e) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el traslado de los marcadores a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto la muestra con un analito marcado, en donde el analito marcado comprende un aptámero; (c) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión, (d) disociar el aptámero unido al analito marcado y trasladar el aptámero disociado a través de uno o más nanoporos de una capa, y (e) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión está marcado con un marcador escindible, (b) poner en contacto la muestra con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido, (c) retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado, (d) escindir el marcador fijado al miembro de unión unido al analito inmovilizado, (e) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el traslado del marcador a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión comprende un aptámero, (b) poner en contacto la muestra con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido, (c) retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado, (d) disociar el aptámero unido al miembro de unión unido al analito inmovilizado y trasladar el aptámero disociado a través uno o más nanoporos de una capa, y (e) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende un módulo microfluídico y un módulo nanoporoso; comprendiendo el módulo microfluídico una serie de electrodos, en donde la serie de electrodos transporta al menos una nanogota de fluido hasta una primera posición de transferencia de la serie de electrodos, en donde la primera posición de transferencia está en una superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso; comprendiendo el módulo nanoporoso: un primer canal capilar; y un segundo canal capilar; en donde al menos el primer canal capilar se extiende hasta la superficie de contacto y es adyacente a la primera posición de transferencia, y está colocado para recibir una nanogota de fluido colocada en la primera posición de transferencia; en donde el primer canal capilar intersecciona con el segundo canal capilar, en donde una capa nanoporosa está colocada entre el primer y el segundo canal capilar en la ubicación donde interseccionan el primer y el segundo canal capilar.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un marcador escindible fijado al mismo, (c) retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión, (d) escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión unido al analito unido al primer miembro de unión, (e) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el traslado del marcador a través de la capa, en donde cada marcador que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital, en donde la curva patrón del subapartado i) se determina midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido; en donde la curva patrón del subapartado ii) se determina midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control; y en donde la curva patrón del subapartado iii) se determina midiendo el tiempo medio que transcurre entre los eventos de traslado para las concentraciones de analito de control.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un aptámero, (c) retirar el aptámero no unido al analito unido al sustrato sólido, (d) disociar el aptámero unido al analito, y (e) trasladar el aptámero disociado a través de uno o más nanoporos de una capa; y (f) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde cada aptámero que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital, en donde la curva patrón del subapartado i) se determina midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido; en donde la curva patrón del subapartado ii) se determina midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control; y en donde la curva patrón del subapartado iii) se determina midiendo el tiempo medio que transcurre entre los eventos de traslado para las concentraciones de analito de control.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a método para medir un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto la muestra con un analito marcado, en donde el analito marcado está marcado con un marcador escindible, (c) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión, (d) escindir el marcador fijado al analito marcado unido al miembro de unión, (e) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el traslado de los marcadores a través de la capa, en donde cada marcador que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital, en donde la curva patrón del subapartado i) se determina midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido; en donde la curva patrón del subapartado ii) se determina midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control; y en donde la curva patrón del subapartado iii) se determina midiendo el tiempo medio que transcurre entre los eventos de traslado para las concentraciones de analito de control.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito, (b) poner en contacto la muestra con un analito marcado, en donde el analito marcado comprende un aptámero, (c) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión, (d) disociar el aptámero unido al analito marcado y trasladar el aptámero disociado a través de uno o más nanoporos de una capa, y (e) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde cada aptámero que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital, en donde la curva patrón del subapartado i) se determina midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido; en donde la curva patrón del subapartado ii) se determina midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control; y en donde la curva patrón del subapartado iii) se determina midiendo el tiempo medio que transcurre entre los eventos de traslado para las concentraciones de analito de control.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión está marcado con un marcador escindible, (b) poner en contacto la muestra con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido, (c) retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado, (d) escindir el marcador fijado al miembro de unión unido al analito inmovilizado, (e) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (f) evaluar el traslado del marcador a través de la capa, en donde cada marcador que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital, en donde la curva patrón del subapartado i) se determina midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido; en donde la curva patrón del subapartado ii) se determina midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control; y en donde la curva patrón del subapartado iii) se determina midiendo el tiempo medio que transcurre entre los eventos de traslado para las concentraciones de analito de control.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión comprende un aptámero, (b) poner en contacto la muestra con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido, (c) retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado, (d) disociar el aptámero unido al miembro de unión unido al analito inmovilizado y trasladar el aptámero disociado a través uno o más nanoporos de una capa, y (e) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde cada aptámero que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital, en donde la curva patrón del subapartado i) se determina midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido; en donde la curva patrón del subapartado ii) se determina midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control; y en donde la curva patrón del subapartado iii) se determina midiendo el tiempo medio que transcurre entre los eventos de traslado para las concentraciones de analito de control.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido, el miembro de unión comprende un marcador escindible fijado al mismo, y el miembro de unión se une específicamente al analito, (b) retirar el miembro de unión no unido al analito, (c) escindir el marcador fijado al miembro de unión unido al analito, (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa, y (e) evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde cada marcador que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, en donde la medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina: i) contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control; ii) midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándolo con un control; o iii) midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control, en donde el control es una referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado que comprende: un módulo microfluídico y un módulo habilitado para nanoporos; comprendiendo el módulo microfluídico una serie de electrodos separados de un electrodo individual dimensionado para superponerse con al menos una parte de la serie de electrodos, donde la serie de electrodos y el electrodo individual transportan al menos una nanogota de fluido a un electrodo de transferencia de la serie de electrodos, en donde el electrodo de transferencia está colocado en una superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo habilitado para nanoporos; comprendiendo el módulo habilitado para nanoporos un primer microcanal colocado sobre una primera superficie de un primer sustrato; un segundo microcanal colocado en una primera superficie de un segundo sustrato; en donde la primera superficie del primer sustrato está en contacto con la primera superficie del segundo sustrato, encerrando así al primer microcanal y al segundo microcanal para proporcionar un primer canal capilar y un segundo canal capilar, respectivamente, en donde al menos el primer canal capilar se extiende hasta la superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo habilitado para nanoporos, y es adyacente al electrodo de transferencia, y está colocado para recibir una nanogota de fluido colocada en el electrodo de transferencia; en donde el primer canal capilar intersecciona con el segundo canal capilar, en donde una capa está colocada entre el primer y el segundo sustrato en el lugar donde el primer y el segundo canal capilar interseccionan, en donde la capa está desprovista de un nanoporo y separa un líquido iónico presente en el primer y el segundo canal capilar, en donde el primer y el segundo canal capilar están en conexión eléctrica con electrodos para impulsar una tensión desde el primer hasta el segundo canal capilar o viceversa para crear un nanoporo en la capa en la intersección entre el primer y el segundo canal capilar.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para generar un nanoporo en un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado, comprendiendo el método: proporcionar un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado como se ha descrito previamente en el presente documento; aplicar una tensión en el primer y el segundo canal capilar para impulsar la corriente a través de la capa; medir la conductancia por la capa; terminar la aplicación de tensión tras la detección de una conductancia indicativa de la generación de un nanoporo en la capa.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende: un primer sustrato que comprende una serie de electrodos; un segundo sustrato separado del primer sustrato; una abertura en el primer o el segundo sustrato en comunicación fluida con una capa nanoporosa que comprende un nanoporo; y un par de electrodos configurados para aplicar un campo eléctrico a través del nanoporo, en donde la serie de electrodos está configurada para transportar al menos una nanogota de fluido hasta la abertura.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un par de dispositivos nanoporosos y microfluídicos digitales integrados que comprenden: un primer dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado descrito anteriormente en el presente documento, en donde el electrodo individual es un primer electrodo individual y el canal capilar es un primer canal capilar; y un segundo dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende: un tercer sustrato, que comprende un quinto lado y un sexto lado opuesto al quinto lado, en donde el quinto lado comprende una serie de electrodos; un cuarto sustrato separado del tercer sustrato, en donde el cuarto sustrato comprende un séptimo lado dirigido hacia el quinto lado del tercer sustrato y un octavo lado opuesto al séptimo lado, en donde el séptimo lado comprende un segundo electrodo individual y en donde la capa nanoporosa está dispuesta sobre el octavo lado, en donde el cuarto sustrato comprende un segundo canal capilar que se extiende desde el séptimo lado hasta el octavo lado del cuarto sustrato, en donde la capa nanoporosa está colocada sobre una abertura del canal capilar, en donde la capa nanoporosa está interpuesta entre el segundo sustrato y el cuarto sustrato de modo que el nanoporo proporciona un conducto electroosmótico entre el primer canal capilar y el segundo canal capilar, en donde el par de electrodos de detección comprende un segundo electrodo de detección que es el segundo electrodo individual.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado que comprende: un primer sustrato, que comprende un primer lado y un segundo lado opuesto al primer lado, en donde el primer lado comprende una serie de electrodos; un segundo sustrato separado del primer sustrato, en donde el segundo sustrato comprende un tercer lado dirigido hacia el primer lado del primer sustrato y un cuarto lado opuesto al tercer lado; una capa habilitada para nanoporos desprovista de un nanoporo y dispuesta en un lado exterior del dispositivo, en donde el lado exterior se selecciona entre el segundo lado o el cuarto lado, en donde uno entre el primer o segundo sustrato que comprende el lado exterior comprende un canal capilar que se extiende desde el primer lado hasta el segundo lado del primer sustrato, o desde el tercer lado hasta el cuarto lado del segundo sustrato, en donde la capa habilitada para nanoporos está colocada sobre una abertura del canal capilar; y un par de electrodos configurados para aplicar un campo eléctrico por la capa habilitada para nanoporos, en donde la serie de electrodos está configurada para transportar al menos una nanogota de fluido hasta el canal capilar.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para generar un nanoporo en un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado que comprende: proporcionar un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado descrito anteriormente en el presente documento; sumergir ambos lados de la capa habilitada para nanoporos en un líquido iónico de modo que el líquido iónico sobre cada lado de la capa esté en contacto eléctrico con uno cualquiera de los dos electrodos del par de electrodos de detección; aplicar una tensión entre el par de electrodos de detección para impulsar la corriente a través de la capa; medir la conductancia por la capa; terminar la aplicación de tensión tras la detección de una conductancia indicativa de la generación de un nanoporo en la capa.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende un miembro de unión, un marcador y un espaciador.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende: un primer sustrato, que comprende una serie de electrodos; un segundo sustrato separado del primer sustrato; y una capa nanoporosa que tiene una primera superficie y una segunda superficie dispuestas entre el primer y el segundo sustrato, en donde la serie de electrodos está configurada para colocar una primera nanogota en la primera superficie de la capa nanoporosa, en donde al menos dos electrodos de la serie de electrodos están colocados por la capa nanoporosa, donde los dos electrodos forman un ánodo y un cátodo, y funcionan para impulsar la corriente a través de un nanoporo de la capa nanoporosa cuando una nanogota de líquido está en la primera superficie de la capa nanoporosa.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende un módulo microfluídico y un módulo nanoporoso; comprendiendo el módulo microfluídico una serie de electrodos, donde la matriz de electrodos transporta al menos una nanogota de fluido hasta una posición de transferencia de la serie de electrodos, en donde la posición de transferencia está en una superficie de contacto entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso; comprendiendo el módulo nanoporoso: un primer canal capilar que se extiende desde la posición de transferencia hasta una capa nanoporosa.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado que comprende: un primer sustrato, que comprende una serie de electrodos; un segundo sustrato separado del primer sustrato; una primera capa nanoporosa que tiene uno o más nanoporos en la misma; una segunda capa nanoporosa que tiene uno o más nanoporos en la misma; y al menos dos electrodos para crear un campo eléctrico para impulsar marcadores a través de un nanoporo de la primera y la segunda capa nanoporosa.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un kit que comprende cualquiera de los dispositivos mencionados anteriormente para usar en cualquiera de los métodos mencionados anteriormente.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método de uso de cualquiera de los dispositivos mencionados anteriormente para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica o para diagnosticar a un paciente o explorar un suministro de sangre.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito de interés presente en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un miembro de unión y un analito marcado que está marcado con un marcador escindible, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el miembro de unión comprende un ligando para el agente de inmovilización, y el miembro de unión se une específicamente al analito de interés para formar bien un complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito de interés o un complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (b) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión en el complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (c) escindir el marcador fijado al analito marcado unido al miembro de unión en el complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa; y (e) evaluar los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito de interés presente en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un miembro de unión y un analito exógeno, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el analito exógeno comprende un ligando para el agente de inmovilización y se une al soporte sólido para formar un complejo de soporte sólido/analito inmovilizado, y el miembro de unión comprende un marcador escindible y se une específicamente al analito de interés para formar bien un complejo de soporte sólido/analito de interés/miembro de unión o un complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión; (b) retirar el miembro de unión no unido bien del complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión o del complejo de soporte sólido/analito de interés/miembro de unión; (c) escindir el marcador fijado al miembro de unión del complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión; (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa; y (e) evaluar los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito de interés presente en una muestra biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un miembro de unión y un analito marcado que está marcado con un marcador escindible, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el miembro de unión comprende un ligando para el agente de inmovilización, y el miembro de unión se une específicamente al analito de interés para formar bien un complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito de interés o un complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (b) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión en el complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (c) escindir el marcador fijado al analito marcado unido al miembro de unión en el complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa; y (e) evaluar los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito de interés presente en una muestra biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un miembro de unión y un analito exógeno, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el analito exógeno comprende un ligando para el agente de inmovilización y se une al soporte sólido para formar un complejo de soporte sólido/analito inmovilizado, y el miembro de unión comprende un marcador escindible y se une específicamente al analito de interés para formar bien un complejo de soporte sólido/analito de interés/miembro de unión o un complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión; (b) retirar el miembro de unión no unido bien del complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión o del complejo de soporte sólido/analito de interés/miembro de unión; (c) escindir el marcador fijado al miembro de unión del complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión; (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa; y (e) evaluar los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito de interés presente en una muestra biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un miembro de unión y un analito marcado que está marcado con un aptámero, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el miembro de unión comprende un ligando para el agente de inmovilización, y el miembro de unión se une específicamente al analito de interés para formar bien un complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito de interés o un complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (b) retirar el analito marcado no unido al miembro de unión en el complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (c) disociar el aptámero fijado al analito marcado unido al miembro de unión en el complejo de soporte sólido/miembro de unión/analito marcado; (d) trasladar el aptámero disociado a través de uno o más nanoporos de una capa; y (e) evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para medir o detectar un analito de interés presente en una muestra biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto la muestra con un soporte sólido, un miembro de unión y un analito exógeno, en donde el soporte sólido comprende un agente de inmovilización, el analito exógeno comprende un ligando para el agente de inmovilización y se une al soporte sólido para formar un complejo de soporte sólido/analito inmovilizado, y el miembro de unión comprende un aptámero y se une específicamente al analito de interés para formar bien un complejo de soporte sólido/analito de interés/miembro de unión o un complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión; (b) retirar el miembro de unión no unido bien del complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión o del complejo de soporte sólido/analito de interés/miembro de unión; (c) disociar el aptámero unido al miembro de unión del complejo de soporte sólido/analito inmovilizado/miembro de unión; (d) trasladar el marcador a través de uno o más nanoporos de una capa; y (e) evaluar los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
Breve descripción de los dibujos
Los detalles de la materia objeto que se expone en el presente documento, tanto en su estructura como en su funcionamiento, pueden ser evidentes mediante el estudio de las figuras adjuntas, en las que los mismos números de referencia se refieren a las mismas partes. Los componentes de las figuras no están necesariamente a escala, sino que se hace énfasis en ilustrar los principios de la materia objeto. Es más, todas las ilustraciones están destinadas a transmitir conceptos, pudiendo ilustrarse esquemáticamente los tamaños, formas y otros atributos detallados relativos, en lugar de manera literal o precisa.
La Fig. 1A y la Fig. 1B representan un dispositivo microfluídico 10 usado junto con un dispositivo nanoporoso 15. La Fig. 2A y la Fig. 2B representan un esquema de un dispositivo integrado reversiblemente que tiene un módulo microfluídico 20 combinado con un módulo nanoporoso 30 por medio de un canal 40. Las Fig. 2C-2L representan esquemas de ejemplos de dispositivos integrados en los que un módulo microfluídico está conectado de forma fluida a un módulo nanoporoso. El módulo nanoporoso incluye un nanoporo en una capa que separa físicamente dos canales microfluídicos en una ubicación donde interseccionan los dos canales microfluídicos.
La Fig. 3 ilustra un ejemplo de dispositivo integrado que incluye un módulo microfluídico 300 y un módulo nanoporoso 325.
La Fig.4 proporciona un dispositivo integrado 400 en el que los módulos microfluídicos digitales incluyen un módulo nanoporoso incorporado.
La Fig. 5A muestra una vista superior de un dispositivo integrado. La Fig. 5B muestra una vista lateral del dispositivo integrado de la Fig. 5A. La Fig. 6 representa un ejemplo de dispositivo y método de la presente divulgación.
La Fig. 7 representa un ejemplo de dispositivo y método de la presente divulgación.
La Fig. 8 representa una vista lateral de un ejemplo de dispositivo integrado de la presente divulgación.
La Fig. 9 representa un ejemplo de sistema de la presente divulgación.
La Fig. 10 representa un esquema de un proceso de fabricación de un chip DMF de bajo coste.
La Fig. 11 representa un solo chip DMF flexible fabricado de acuerdo con el esquema de la Fig. 10.
La Fig. 12 representa el accionamiento de nanogotas en un chip DMF, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
Las Fig. 13A-13E representan el rendimiento de un inmunoensayo en un chip DMF, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
Las Fig. 14A-14C representan la fabricación y el diseño de un módulo nanoporoso, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 15A muestra un gráfico de la corriente residual medida en tiempo real. La Fig. 15B representa una curva de corriente-tensión (I-V) para un nanoporo.
La Fig. 16A y la Fig. 16B muestran el llenado de un canal capilar en un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 17 muestra un diagrama esquemático para la transferencia de nanogotas entre módulos de un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 18 muestra un diagrama esquemático de un diseño de módulo nanoporoso, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 19 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado adaptado para realizar la transferencia de nanogotas entre los módulos mediante transporte pasivo, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 20 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado adaptado para realizar la transferencia de nanogotas entre los módulos mediante transporte pasivo, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 21 es un diagrama esquemático de un dispositivo microfluídico de silicio que contiene microcanales de silicio que permiten el movimiento pasivo de una nanogota de líquido mediante transporte pasivo, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 22 es una imagen de un microcanal de silicio de un dispositivo microfluídico de silicio que permite el movimiento pasivo de una nanogota de líquido mediante transporte pasivo, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 23A y la Fig. 23B muestran un esquema de un método de fabricación para un sensor de nanoporos integrado, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
Las Fig. 24A-24C muestran el diagrama de dispersión (duración del nivel frente al nivel de bloqueo) para los diagramas obtenidos utilizando eventos de traslado a través de: (Fig. 24A) nanoporos que comprenden ADN bicatenario normal ("ADNbc"); (Fig. 24B) nanoporos que comprenden ADNbc modificado con DBCO; y (Fig. 24C) nanoporos que comprenden estrellas de ADNbc.
La Fig. 25 muestra un esquema de la escisión química mediada por tiol.
La Fig. 26A y la Fig. 26B muestran un esquema de experimentos de fotoescisión realizados en micropartículas magnéticas.
La Fig. 27 muestra un esquema de colocación del reactivo en el chip DMF.
La Fig. 28 muestra un gráfico de barras de muestra frente a flujo de nanoporos (escisión DMF) en s-1.
La Fig. 29 muestra los medios mediante los cuales se determina un umbral para el recuento de señales digitales. Las Fig. 30A-30C muestran bloqueos de corriente durante diferentes períodos de tiempo para tres patrones de 94 nM (Fig. 30A), 182 nM (Fig. 30B) y 266 nM (Fig. 30C).
La Fig. 31 muestra una curva de respuesta a la dosis de un número de eventos durante un período de tiempo fijo (5 min).
La Fig. 32 muestra una curva de dosis-respuesta del tiempo requerido para un número fijo de eventos.
La Fig. 33 muestra una curva de dosis-respuesta de eventos por unidad de tiempo.
La Fig. 34 muestra una curva de dosis-respuesta de eventos por unidad de tiempo utilizando Seq31-SS-biotina. La Fig. 35 muestra un diagrama esquemático de un diseño de cámara nanoporosa en un módulo nanoporoso de silicio, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 36 muestra una tabla que enumera los parámetros físicos utilizados para las simulaciones de campo eléctrico con COMSOL en una cámara nanoporosa de un módulo nanoporoso de silicio, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig.37 es una colección de imágenes que muestran resultados de simulación para gradientes de concentración de contraiones cerca de un nanoporo en un módulo nanoporoso de silicio, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 38 es un gráfico que muestra los efectos del diámetro de una vía de SiO2 fabricada encima de una membrana nanoporosa con un nanoporo sobre el flujo electroosmótico a través del nanoporo, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 39 es un gráfico que muestra los efectos del diámetro de una vía de SiO2 fabricada encima de una membrana nanoporosa con un nanoporo sobre la conductancia a través del nanoporo, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 40 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado con el módulo nanoporoso colocado sobre un lado del módulo DMF, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 41 es una colección de imágenes que muestran el movimiento de líquido desde un módulo DMF a través de un orificio en un sustrato del módulo DMF por fuerza capilar, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 42 es una colección de imágenes que muestra un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado con el módulo nanoporoso colocado sobre un lado del módulo DMF y electrodos configurados para la fabricación de nanoporos, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 43 es un diagrama esquemático de un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado con el módulo nanoporoso colocado sobre un lado del módulo DMF, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 44 es un diagrama esquemático de un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado con el módulo nanoporoso colocado entre dos módulos DMF, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 45 es un gráfico que muestra la fabricación de un nanoporo en una membrana nanoporosa (una ventana de Microscopio Electrónico de T ransmisión (MET)) aplicando una tensión por la membrana nanoporosa, y como lo demuestra la ruptura dieléctrica, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 46A y la Fig. 46B son una colección de gráficos que muestran las curvas de corriente-tensión (I-V) de un nanoporo formado en una membrana, antes y después de un proceso de acondicionamiento, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.
La Fig. 47 muestra un diagrama de dispersión de las medias de las proporciones representadas entre el diámetro medio del marcador de recuento y el tamaño del nanoporo para la S/R (relación señal/ruido).
Descripción detallada
Las realizaciones de la presente divulgación se refieren a métodos, sistemas y dispositivos para el análisis de uno o varios analitos en una muestra. En determinadas realizaciones, la muestra puede ser una muestra biológica.
1. Definiciones
Antes de desvelar las realizaciones de la presente divulgación, debe entenderse que la presente invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento solo tiene el fin de describir realizaciones particulares y no está concebida para ser limitativa.
"Comprende/n", "incluye/n", "que tiene/n", "tiene", "puede/n", "contiene/n", y las variantes de los mismos, como se usan en el presente documento, pretenden ser expresiones términos o palabras de transición abiertas, que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas en singular "un/a", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consiste en" y "que consiste esencialmente en", las realizaciones o los elementos presentados en el presente documento, bien expuestos explícitamente o no.
Para citar intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
"Afinidad" y "afinidad de unión", como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a la tendencia o fuerza de unión del miembro de unión al analito. Por ejemplo, la afinidad de unión puede estar representada por la constante de disociación en equilibrio (Kd), la tasa de disociación (kd) o la tasa de asociación (ka).
"Análogo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que tiene una estructura similar a una molécula de interés (p. ej., análogo de nucleósido, análogo de nucleótido, análogo de fosfato de azúcar, análogo de analito, etc.). Un análogo de analito es una molécula que es estructuralmente similar a un analito, pero para la que el miembro de unión tiene una afinidad diferente.
"Aptámero", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido o una molécula de péptido que puede unirse a dianas preseleccionadas, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y péptidos, entre otros, con alta afinidad y especificidad. Los aptámeros pueden adoptar una variedad de formas debido a su propensión a formar hélices y bucles monocatenarios. Un aptámero de oligonucleótido o ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o ARN monocatenario (ADNmc o ARNmc). Un aptámero peptídico puede incluir un dominio peptídico variable corto, fijado en ambos extremos a un armazón proteico.
"Perla" y "partícula" se utilizan en el presente documento indistintamente y se refieren a un soporte sólido esencialmente esférico.
"Componente", "componentes", o "al menos un componente", se refieren generalmente a un anticuerpo de captura, un reactivo o conjugado de detección, un calibrador, un control, un panel de sensibilidad, un recipiente, un tampón, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor de una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/una solución de pretratamiento, un sustrato (p. ej., en forma de una solución), una solución de detención y similares que se pueden incluir en un kit para el análisis de una muestra de prueba, tal como orina, suero, sangre completa, aspirado tisular o muestra de plasma de un paciente, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento y otros métodos conocidos en la técnica. Algunos componentes pueden estar en solución o liofilizados para reconstituirlos para usar en un ensayo.
"Control", como se usa en el presente documento, se refiere a un patrón de referencia para un analito tal como se conoce o acepta en la técnica, o se determina empíricamente utilizando medios aceptables tales como los que se emplean comúnmente. Un "patrón de referencia" es una sustancia estandarizada que se utiliza como base de medición para una sustancia similar. Por ejemplo, existen patrones de referencia documentados publicados en la Convención de Farmacopea de EE. UU. (u SP-Nf ), códice de productos químicos alimentarios y compendio de suplementos dietéticos (la totalidad de los cuales están disponibles en http://www.usp.org) y otras fuentes bien conocidas. Los métodos para normalizar las referencias se describen en la bibliografía. También son bien conocidos los medios para cuantificar las cantidades de analito presentes mediante el uso de una curva de calibración para el analito o por comparación con un patrón de referencia alternativo. Se puede generar una curva patrón utilizando diluciones o soluciones en serie de concentraciones conocidas de analito, mediante espectroscopia de masas, métodos gravimétricos y mediante otras técnicas conocidas en la técnica. Los patrones de referencia alternativos que se han descrito en la bibliografía incluyen la adición estándar (también conocida como el método de adición estándar) o la reacción en cadena de la polimerasa digital.
"Microfluídica digital (DMF)", "módulo microfluídico digital (módulo DMF)" o "dispositivo microfluídico digital (dispositivo DMF)", como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere a un módulo o dispositivo que utiliza técnicas microfluídicas digitales o basadas en nanogotas para proporcionar la manipulación de volúmenes pequeños y diferenciados de líquidos en forma de nanogotas. La microfluídica digital utiliza los principios de la ciencia de las emulsiones para crear una dispersión fluido-fluido en canales (principalmente emulsión de agua en aceite). Permite la producción de nanogotas/burbujas monodispersas o con una polidispersidad muy baja. La microfluídica digital se basa en la micromanipulación de nanogotas de fluido discontinuas dentro de una red reconfigurable. Se pueden programar instrucciones complejas combinando las operaciones básicas de formación, traslado, división y fusión de nanogotas.
La microfluídica digital funciona con volúmenes diferenciados de fluidos que pueden manipularse mediante señales eléctricas binarias. Mediante el uso de nanogotas de volumen unitario diferenciado, una operación de microfluídica puede definirse como un conjunto de operaciones básicas repetidas, es decir, el movimiento de una unidad de fluido sobre una unidad de distancia. Se pueden formar nanogotas utilizando las propiedades de tensión superficial del líquido. La activación de una nanogota se basa en la presencia de fuerzas electrostáticas generadas por electrodos colocados debajo de la superficie inferior en la que se ubica la nanogota. Se pueden utilizar diferentes tipos de fuerzas electrostáticas para controlar la forma y el movimiento de las nanogotas. Una técnica que se puede utilizar para crear las fuerzas electrostáticas anteriores se basa en la dielectroforesis, que se basa en la diferencia de permisividades eléctricas entre la nanogota y el medio circundante, y puede utilizar campos eléctricos de CA de alta frecuencia. Otra técnica que se puede utilizar para crear las fuerzas electrostáticas anteriores se basa en la electrohumectación, que se basa en la dependencia de la tensión superficial entre una nanogota de líquido presente sobre una superficie y la superficie sobre el campo eléctrico aplicado a la superficie.
"Marcador de arrastre" se refiere a un modificador de la movilidad. El marcador de arrastre puede ser polipéptidos altamente repetitivos modificados genéticamente ("polímeros de proteínas") que están diseñados para ser grandes, solubles en agua y totalmente monodispersos. Se pueden introducir deliberadamente argininas cargadas positivamente a intervalos regulares en la secuencia de aminoácidos para aumentar el arrastre hidrodinámico sin aumentar la longitud del marcador de arrastre. Los marcadores de arrastre se describen en la publicación de patente de EE. UU. n.° 20120141997.
"Secuencia escindible enzimáticamente", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que pueda escindirse por una enzima. Por ejemplo, la enzima puede ser una proteasa o una endonucleasa, tal como una endonucleasa de restricción (también denominada enzimas de restricción). Las endonucleasas de restricción son capaces de reconocer y escindir una molécula de ADN en un sitio de escisión de ADN específico entre nucleótidos predefinidos. Algunas endonucleasas, tales como, por ejemplo, Fokl, comprenden un dominio de escisión que escinde el ADN de forma inespecífica en una posición determinada independientemente de los nucleótidos presentes en esta posición. En algunas realizaciones, el sitio de escisión del ADN específico y el sitio de reconocimiento del ADN de la endonucleasa de restricción son idénticos.
"Proteína globular" se refiere a una proteína soluble en agua que tiene una forma aproximadamente esférica. Los ejemplos de proteínas globulares incluyen, pero sin limitación, ovoalbúmina, beta-globulina, proteína C-reactiva, fibrina, hemoglobina, IgG, IgM y trombina.
"Marcador" o "marcador detectable", como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere a un marcador fijado a un miembro de unión o analito específico mediante un enlazador escindible.
"Nanopartícula/s" y "nanoperla/s" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una nanoperla o nanopartícula dimensionada para trasladarse a través de o por un nanoporo utilizado para contar el número de nanoperlas/nanopartículas que lo atraviesan.
"Nucleobase" o "base" significan aquellos restos heterocíclicos sintéticos y de origen natural comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ácidos nucleicos o polinucleótidos, o la tecnología de ácidos nucleicos peptídicos para generar polímeros. Los ejemplos no limitativos de nucleobases adecuadas incluyen: adenina, citosina, guanina, timina, uracilo, 5-propiniluracilo, 2-tio-5-propinil-uracilo, 5-metilcitosina, pseudoisocitosina, 2-tiouracilo y 2-tiotimina, 2-aminopurina, N9-(2-amino-6-cloropurina), N9-(2,6-diaminopurina), hipoxantina, N9-(7-desaza-guanina), N9-(7-desaza-8-aza-guanina) y N8-(7-desaza-8-aza-adenina). Las nucleobases se pueden unir a otros restos para formar nucleósidos, nucleótidos y análogos de nucleósido/nucleótido.
"Nucleósido" se refiere a un compuesto que consiste en una nucleobase de purina, desazapurina o pirimidina, p. ej., adenina, guanina, citosina, uracilo, timina, 7-desazaadenina, 7-desazaguanosina, que está unido al carbono anomérico de un azúcar pentosa en la posición 1', tal como una ribosa, 2'-desoxirribosa o una 2',3'-di-desoxirribosa.
"Nucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a un éster de fosfato de un nucleósido, p. ej., un éster monofosfato, difosfato o trifosfato, en donde el sitio más común de esterificación es el grupo hidroxilo fijado a la posición C-5 de la pentosa.
"Polímero de nucleobases" u "oligómero de nucleobases" se refiere a dos o más nucleobases que están conectadas por enlaces para formar un oligómero. Los polímeros u oligómeros de nucleobases incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos y oligonucleótidos (p. ej., polímeros y oligómeros de ADN y de ARN), análogos de polinucleótidos y oligonucleótidos e imitadores de polinucleótidos y oligonucleótidos, tales como poliamida o ácidos nucleicos peptídicos. Los polímeros u oligómeros de nucleobases pueden variar en tamaño desde unas pocas nucleobases hasta varios cientos de nucleobases o varios miles de nucleobases. Los polímeros u oligómeros de nucleobases pueden incluir de aproximadamente 2 a 100 nucleobases o de aproximadamente 8000 a 10000 nucleobases. Por ejemplo, los polímeros u oligómeros de nucleobases pueden tener al menos aproximadamente 2 nucleobases, al menos aproximadamente 5 nucleobases, al menos aproximadamente 10 nucleobases, al menos aproximadamente 20 nucleobases, al menos aproximadamente 30 nucleobases, al menos aproximadamente 40 nucleobases, al menos aproximadamente 50 nucleobases, al menos aproximadamente 60 nucleobases, al menos aproximadamente 70 nucleobases, al menos aproximadamente 80 nucleobases, al menos aproximadamente 90 nucleobases, al menos aproximadamente 100 nucleobases, al menos aproximadamente 200 nucleobases, al menos aproximadamente 300 nucleobases, al menos aproximadamente 400 nucleobases, al menos aproximadamente 500 nucleobases, al menos aproximadamente 600 nucleobases, al menos aproximadamente 700 nucleobases, al menos aproximadamente 800 nucleobases, al menos aproximadamente 900 nucleobases, al menos aproximadamente 1000 nucleobases, al menos aproximadamente 2000 nucleobases, al menos aproximadamente 3000 nucleobases, al menos aproximadamente 4000 nucleobases, al menos aproximadamente 5000 nucleobases, al menos aproximadamente 6000 nucleobases, al menos aproximadamente 7000 nucleobases, al menos aproximadamente 8000 nucleobases, al menos aproximadamente 9000 nucleobases o al menos aproximadamente 10000 nucleobases.
"Uno o más nanoporos de una capa" significa que, en una estructura de una sola membrana o estructuras de varias membranas, hay un nanoporo o hay varios nanoporos (p. ej., dos o más) juntos entre sí (p. ej., uno al lado del otro). Cuando hay uno o más nanoporos presentes (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis u otro número de nanoporos según como técnicamente viables), opcionalmente están presentes uno al lado del otro (p. ej., uno al lado del otro) o en serie (p. ej., un nanoporo presente en una capa separado de o apilado sobre (p. ej., sobre o encima de) otro nanoporo de otra capa, etc.) o en una estructura alternativa tal como sería evidente para un experto en la materia. Opcionalmente, dichos nanoporos pueden ser dirigidos de forma independiente, p. ej., estando cada uno dentro de su propio compartimento separado (p. ej., aislado de cualquier otro nanoporo) o, como alternativa, pueden ser dirigidos por un circuito de detección independiente.
"Cepillo de polímero" se refiere a una capa de polímeros fijada por un extremo a una superficie. Los polímeros están muy próximos entre sí y forman una capa o recubrimiento que forma su propio entorno. Los cepillos pueden estar bien en estado de disolvente, cuando las cadenas colgantes se sumergen en un disolvente, o en estado fundido, cuando las cadenas colgantes llenan por completo el espacio disponible. Adicionalmente, hay una clase separada de cepillos de polielectrolitos, cuando las propias cadenas poliméricas portan una carga electrostática. Los cepillos pueden caracterizarse por la alta densidad de las cadenas injertadas. El espacio limitado conduce entonces a una fuerte extensión de las cadenas y a propiedades inusuales del sistema. Se pueden utilizar pinceles para estabilizar coloides, reducir la fricción entre superficies y proporcionar lubricación en articulaciones artificiales
"Polinucleótidos" u "oligonucleótidos" se refieren a polímeros u oligómeros de nucleobases en los que las nucleobases están conectadas por enlaces de fosfato de azúcar (estructura principal de fosfato de azúcar). Los ejemplos de polinucleótidos y oligonucleótidos incluyen polímeros de 2'-desoxirribonucleótidos (ADN) y polímeros de ribonucleótidos (ARN). Un polinucleótido puede estar compuesto enteramente por ribonucleótidos, enteramente por 2-desoxirribonucleótidos o combinaciones de los mismos. "Ácido nucleico" abarca "polinucleótido" y "oligonucleótidos", e incluye polímeros de monómeros de nucleótidos monocatenarios y bicatenarios.
"Análogo de polinucleótido" o "análogo de oligonucleótido" se refiere a polímeros u oligómeros de nucleobases en los que las nucleobases están conectadas por una estructura principal de fosfato de azúcar que comprende uno o más análogos de fosfato de azúcar. Los análogos típicos de fosfato de azúcar incluyen, pero sin limitación, alquilfosfonatos de azúcar, fosforamiditas de azúcar, alquilfosfotriésteres de alquilo o sustituidos de azúcar, fosforotioatos de azúcar, fosforoditioatos de azúcar, fosfatos de azúcar y análogos de fosfatos de azúcar en los que el azúcar es distinto de 2'-desoxirribosa o ribosa, polímeros de nucleobases que tienen interenlaces de azúcar-guanidilo cargados positivamente, tales como los descritos en la patente de EE.UU. n° 6.013.785 y la patente de EE.UU. n° 5.696.253.
Como se usa en el presente documento, un "poro" (denominado como alternativa en el presente documento "nanoporo") o un "canal" (denominado como alternativa en el presente documento "nanoporo" o "nanocanal") se refiere a un orificio, un hueco, un conducto o una ranura de una membrana/capa, donde el poro o canal tiene una dimensión suficiente para permitir el paso o análisis de una sola molécula (p. ej., un marcador) a la vez (p. ej., uno a uno, como en una serie).
"Receptor", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula proteica que reconoce y responde a señales químicas endógenas. Cuando dichas señales químicas endógenas se unen a un receptor, provocan alguna forma de respuesta celular/tisular. Los ejemplos de receptores incluyen, pero sin limitación, receptores neuronales, receptores hormonales, receptores de nutrientes y receptores de superficie celular.
Como se usa en el presente documento, "espaciador" se refiere a un resto químico que extiende el grupo escindible desde el miembro de unión específica, o que proporciona enlace entre el miembro de unión y el soporte, o que extiende el marcador desde el resto fotoescindible. En algunas realizaciones, se pueden incluir uno o más espaciadores en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido o marcador a base de nucleótidos con el fin de distanciar de manera óptima las secuencias del miembro de unión específica. Los espaciadores pueden incluir, pero sin limitación, ácido 6-aminocaproico, ácido 6-aminohexanoico; 1,3-diaminopropano; 1,3-diaminoetano; grupos poliméricos de polietilenglicol (PEG), secuencias cortas de aminoácidos y, como tales, secuencias de poliglicina, de 1 a 5 aminoácidos. En algunas realizaciones, el espaciador es un grupo nitrobencilo, ditioetilamino, espaciador de 6 átomos de carbono, espaciador de 12 átomos de carbono o 3-(9-((3-carboxipropil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato.
"Pareja de unión específica" o "miembro de unión específica", como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere a una de dos o más moléculas diferentes que reconocen específicamente a la otra molécula en comparación con un reconocimiento esencialmente menor de otras moléculas. La una de dos moléculas diferentes tiene un área en la superficie, o en una cavidad, que se une específicamente y, por lo tanto, se define como complementaria con una determinada organización espacial y polar de la otra molécula. Las moléculas pueden ser miembros de un par de unión específica. Por ejemplo, un miembro de unión específica puede incluir, pero sin limitación, una proteína, tal como un receptor, una enzima y un anticuerpo.
Como se usan en el presente documento, "marcador" o "molécula de marcador" se refieren a la molécula (p. ej., escindida del segundo miembro de unión o un aptámero disociado del analito diana) que se traslada a través de o por un nanoporo y proporciona una indicación del nivel de analito de una muestra. Estos términos se refieren a una sola molécula de marcador o a una pluralidad de la misma molécula de marcador. Asimismo, "marcadores", a menos que se especifique lo contrario, se refiere a uno, o a uno o más marcadores.
"Umbral", como se usa en el presente documento, se refiere a un nivel de corte subjetivo y determinado empíricamente por encima del cual los datos adquiridos se consideran "señal", y por debajo del cual los datos adquiridos se consideran "ruido". El uso de un umbral para el recuento de señales digitales se muestra en la Fig. 29. Se emplea un programa informático basado en CUSUM (Cumulative Sums Algorithm, algoritmo de sumas acumulativas) para procesar los datos adquiridos y detectar eventos basándose en la entrada umbral del usuario. La variación entre usuarios se evita mediante la detección de tantos eventos como sea posible y luego filtrando los datos para fines específicos. Por ejemplo, como se puede ver en esta figura, los eventos detectados por encima del umbral establecido tienen un impacto en la población de eventos que se cuentan como señal. Con un umbral "suelto", se contará como señal un número menor de eventos. Con un umbral "apretado", se contará como señal un mayor número de eventos. Establecer el umbral como suelto o apretado es una elección subjetiva basada en la sensibilidad o especificidad deseada para un ensayo, y si en una evaluación dada se prefieren falsos positivos o falsos negativos. Se calculó que los distintivos de bloqueo de la corriente de los eventos de traslado de ADN eran de 1,2 nA, lo cual se basó en una fórmula empírica que relaciona el cambio de corriente con el diámetro del ADN y el espesor de la membrana nanoporosa (H. Kwok, et al., PLoS ONE, 9(3), 392880, 2014).
Como se usa en el presente documento, en referencia al movimiento (p. ej., de una nanopartícula, un marcador, una molécula de marcador u otro elemento) "a través de o por" un nanoporo significa alternativamente, a través de o por, dicho de otra manera, de un lado a otro de un nanoporo, p. ej., del lado cis al trans o viceversa.
"Trazador", como se usa en el presente documento, se refiere a un analito o fragmento de analito conjugado con un marcador, en donde el analito conjugado con el marcador puede competir eficazmente con el analito por sitios en un anticuerpo específico para el analito. Por ejemplo, el trazador puede ser un analito o análogo del analito, tal como ciclosporina o su análogo ISA247, vitamina D y sus análogos, hormonas sexuales y sus análogos, etc.
"Evento de traslado" como se usa en el presente documento se refiere a un evento en el que un marcador se traslada a través de o por (p. ej., del lado cis al trans o viceversa) la capa o nanoporo.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que el que normalmente entendería un experto habitual en la materia. En caso de conflicto, el presente documento, que incluye las definiciones, será la que rija. A continuación, se describen los métodos y materiales preferidos, aunque pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en práctica o evaluar la presente invención. Los materiales, métodos y ejemplos descritos en el presente documento son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
2. Métodos para el análisis de analitos
En el presente documento, se proporcionan métodos para el análisis de analitos. El método puede implicar el recuento de una sola molécula. En determinadas realizaciones, un método para el análisis de analitos puede implicar la evaluación de un analito presente en una muestra. En determinadas realizaciones, la evaluación se puede utilizar para determinar la presencia y/o concentración de un analito en una muestra. En determinadas realizaciones, el método también se puede utilizar para determinar la presencia y/o concentración de una pluralidad de analitos diferentes presentes en una muestra.
En el presente documento, se proporcionan métodos para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión incluye un marcador escindible fijado al mismo; retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión; escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión que está unido al analito unido al primer miembro de unión; trasladar el marcador escindido a través de o por uno o más nanoporos de una capa; detectar o medir marcadores que se trasladan a través de la capa; y evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde el número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En el presente documento, se proporcionan métodos para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión incluye un aptámero; retirar el aptámero no unido al analito unido al sustrato sólido; disociar el aptámero unido al analito y trasladar el aptámero disociado a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En algunas realizaciones, cada marcador, tal como un aptámero, que se traslada a través de la capa es un evento de traslado. La medición del número de eventos de traslado mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad de analito presente en la muestra se puede determinar contando el número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y correlacionando el número de eventos de traslado con un control. La curva patrón se puede determinar midiendo el número de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control durante un período de tiempo establecido. En algunas realizaciones, la cantidad de analito presente en la muestra se puede determinar midiendo la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y correlacionándola con un control. La curva patrón se puede determinar midiendo el tiempo que tarda en producirse un número determinado de eventos de traslado para las concentraciones de analito de control. En algunas realizaciones, la cantidad de analito presente en la muestra se puede determinar midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen y correlacionándolo con un control. La curva patrón se puede determinar midiendo el tiempo medio entre los eventos de traslado que se producen para las concentraciones de analito de control. En algunas realizaciones, el control puede ser un patrón de referencia que comprenda una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital.
En casos ilustrativos, el método puede incluir poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión ("miembros de unión" denominados, como alternativa, "miembros de unión específica", y como se describe en el apartado c) a continuación), donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, segundo miembro de unión que se une específicamente al analito y segundo miembro de unión que incluye un marcador escindible ("marcador" como se define en el presente documento y que se describe en el apartado d) a continuación) fijado al mismo; retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión; escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión que está unido al analito unido al primer miembro de unión; trasladar el marcador a través de nanoporos de una capa; determinar el número de marcadores que se trasladan a través de la capa; determinar la concentración del analito en la muestra basándose en el número de marcadores que se trasladan a través de la capa. En determinadas realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de la capa por unidad de tiempo. En otras realizaciones, la concentración del analito se puede determinar determinando el momento en el que el número de marcadores que se trasladan a través de la capa alcanza un umbral.
La muestra puede ser cualquier muestra de prueba que contenga o se sospeche que contiene un analito de interés. Como se usan en el presente documento, "analito", "analito diana", "analito de interés" se usan indistintamente y se refieren al analito que se mide en los métodos y dispositivos desvelados en el presente documento. Los analitos de interés se describen en más detalle más adelante.
El "contacto" y sus equivalentes gramaticales, como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier tipo de acción de combinación que acerque un miembro de unión con una proximidad suficientemente cercana al analito de interés en la muestra, de modo que se produzca una interacción de unión si el analito de interés específico para el miembro de unión está presente en la muestra. El contacto se puede lograr de diversas formas, incluyendo la combinación de la muestra con un miembro de unión, la exposición de un analito diana a un miembro de unión introduciendo el miembro de unión muy cerca del analito, y similares.
En determinados casos, el primer miembro de unión puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Como se usa en el presente documento, "inmovilizado" se refiere a una asociación estable del primer miembro de unión con una superficie de un soporte sólido. Por "asociación estable" se entiende una asociación física entre dos entidades en las que la semivida media de asociación es de un día o más, p. ej., en condiciones fisiológicas. En determinados aspectos, la asociación física entre las dos entidades tiene una semivida media de dos días o más, una semana o más, un mes o más, incluyendo seis meses o más, p. ej., 1 año o más, en PBS (Phosphate-Buffered Saline, solución salina tamponada con fosfato) a 4 °C. De acuerdo con determinadas realizaciones, la asociación estable surge de un enlace covalente entre las dos entidades, un enlace no covalente entre las dos entidades (p. ej., un enlace iónico o metálico) u otras formas de atracción química, tales como enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals y similares.
El soporte sólido que tiene una superficie sobre la que se inmoviliza el reactivo de unión puede ser cualquier superficie conveniente de configuración plana o no plana, tal como la superficie de un chip microfluídico, una superficie interior de una cámara, una superficie exterior de una perla (como se define en el presente documento) o una superficie interior y/o exterior de una perla porosa. Por ejemplo, el primer miembro de unión puede estar fijado covalentemente o no covalentemente a una perla, p. ej., látex, agarosa, sefarosa, estreptavidina, tosilactivada, epoxi, poliestireno, perla de amino, perla de amina, perla de carboxilo o similares. En determinadas realizaciones, la perla puede ser una partícula, p. ej., una micropartícula. En algunas realizaciones, la micropartícula puede ser de entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 10 micrómetros, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 5 micrómetros, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 1 micrómetro, entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 700 nm, entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 10 micrómetros, entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 5 micrómetros, entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 3 micrómetros, entre aproximadamente 100 nm y 700 nm o entre aproximadamente 500 nm y 700 nm. Por ejemplo, la micropartícula puede ser de aproximadamente 4-6 micrómetros, aproximadamente 2-3 micrómetros o aproximadamente 0,5­ 1,5 micrómetros. Las partículas de menos de aproximadamente 500 nm a veces se consideran nanopartículas. Por tanto, la micropartícula puede ser opcionalmente una nanopartícula de entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 500 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 500 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 500 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 250 nm, aproximadamente 300 nm, aproximadamente 350 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 450 nm o aproximadamente 500 nm.
En determinadas realizaciones, la perla puede ser una perla magnética o una partícula magnética. Las perlas/partículas magnéticas pueden ser ferromagnéticas, ferrimagnéticas, paramagnéticas, superparamagnética o ferrofluídica. Los ejemplos de materiales ferromagnéticos incluyen Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO2, MnAs, MnBi, EuO, NiO/Fe. Los ejemplos de materiales ferrimagnéticos incluyen NiFe2O4, CoFe2O4, Fe3O4 (o FeOFe2O3). Las perlas pueden tener una parte de núcleo sólido que sea magnética y esté rodeada por una o más capas no magnéticas. De manera alternativa, la parte magnética puede ser una capa alrededor de un núcleo no magnético. El soporte sólido sobre el que está inmovilizado el primer miembro de unión puede almacenarse en forma seca o en un líquido. Las perlas magnéticas pueden someterse a un campo magnético antes o después de ponerse en contacto con la muestra, con una perla magnética en la que se inmoviliza el primer miembro de unión.
Después de la etapa de contacto, la muestra y el primer miembro de unión se pueden incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que se produzca la interacción de unión entre el miembro de unión y el analito. Adicionalmente, la incubación puede realizarse en un tampón de unión que facilite la interacción de unión específica. La afinidad y/o especificidad de unión del primer miembro de unión y/o del segundo miembro de unión puede/n manipularse o alterarse en el ensayo mediante la variación del tampón de unión. En algunas realizaciones, la afinidad y/o especificidad de unión puede/n aumentarse mediante la variación del tampón de unión. En algunas realizaciones, la afinidad y/o especificidad de unión puede/n disminuirse mediante la variación del tampón de unión.
La afinidad y/o especificidad de unión del primer miembro de unión y/o del segundo miembro de unión puede/n medirse utilizando los métodos y dispositivos descritos a continuación. En algunas realizaciones, la alícuota de una muestra se analiza utilizando un conjunto de condiciones y se compara con otra alícuota de muestra analizada utilizando un conjunto diferente de condiciones, determinando así el efecto de las condiciones sobre la afinidad y/o especificidad de unión. Por ejemplo, el cambio o la alteración de la condición puede ser uno o más de entre retirar el analito diana de la muestra, añadir una molécula que compita con el analito diana o el ligando por la unión, y cambiar el pH, la concentración de sal o la temperatura. De manera adicional o alternativa, un período de tiempo puede ser la variable, y el cambio de la condición puede incluir esperar un período de tiempo antes de volver a realizar los métodos de detección.
En algunas realizaciones, una vez que el marcador o aptámero haya pasado a través del poro de un dispositivo nanoporoso, el dispositivo se puede reconfigurar para invertir la dirección de movimiento del marcador o aptámero de modo que el marcador o aptámero pueda pasar a través del poro nuevamente y ser medido o detectado nuevamente, por ejemplo, en un ensayo de confirmación de un ensayo de enfermedades infecciosas para confirmar los resultados medidos.
El tampón de unión puede incluir moléculas convencionales para los tampones de unión antígeno-anticuerpo tales como, albúmina (p. ej., BSA [Bovine Serum Albumin, albúmina de suero bovino]), detergentes no iónicos (Tween-20, Triton X-100) y/o inhibidores de proteasa (p. ej., PMSF). En determinados casos, el tampón de unión se puede añadir al chip microfluídico, cámara, etc., antes o después de la adición de la muestra. En determinados casos, el primer miembro de unión puede estar presente en un tampón de unión antes de entrar en contacto con la muestra. El período de tiempo para que se produzca la interacción de unión entre el miembro de unión y el analito se puede determinar empíricamente, y puede depender de la afinidad de unión y la avidez de unión entre el miembro de unión y el analito. En determinadas realizaciones, el contacto o la incubación puede ser durante un período de 5 s a 1 hora, tal como, 10 s-30 minutos, o 1 minuto-15 minutos o 5 minutos-10 minutos, p. ej., 10 s, 15 s, 30 s, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora o 2 horas. Otras condiciones para la interacción de unión, tales como, la temperatura, la concentración de sal, también se puede determinar empíricamente o puede basarse en las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el contacto puede realizarse a temperatura ambiente (21 °C-28 °C, p. ej., 23 °C-25 °C), 37 °C o 4 °C. En determinadas realizaciones, se puede llevar a cabo una mezcla opcional de la muestra con el primer miembro de unión durante la etapa de contacto.
Después de la formación del complejo entre el primer miembro de unión inmovilizado y el analito, se puede retirar cualquier analito no unido de las proximidades del primer miembro de unión junto con la muestra, mientras que el complejo de primer miembro de unión y el analito pueden retenerse debido a su asociación con el soporte sólido.
Opcionalmente, se puede poner en contacto el soporte sólido con un tampón de lavado para retirar cualquier molécula unida de forma no específica al soporte sólido.
Tras la primera etapa de contacto y la retirada opcional de la muestra y/o las etapas de lavado opcionales, el complejo de primer miembro de unión y el analito puede ponerse en contacto con un segundo miembro de unión, conduciendo así a la formación de un complejo de tipo sándwich en el que el analito está unido por los dos miembros de unión. Se puede llevar a cabo una mezcla opcional del segundo miembro con el complejo de primer miembro de unión-analito durante la segunda etapa de contacto. En algunas realizaciones, la inmovilización de las moléculas de analito con respecto a una superficie puede ayudar a retirar cualquier segundo miembro de unión en exceso de la solución sin preocuparse por desalojar la molécula de analito de la superficie. En algunas realizaciones, el segundo miembro de unión puede incluir un marcador, tal como un marcador escindible, fijado al mismo.
Como se ha indicado anteriormente, la segunda etapa de contacto se puede llevar a cabo en condiciones suficientes para la interacción de unión entre el analito y el segundo miembro de unión. Tras la segunda etapa de contacto, se puede retirar cualquier segundo miembro de unión no unido, seguido de una etapa de lavado opcional. Cualquier segundo miembro de unión no unido puede separarse del complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión mediante un medio adecuado tal como, accionamiento de nanogotas, electroforesis, electrohumectación, dielectroforesis, accionamiento electrostático, mediado por campo eléctrico, mediado por electrodo, fuerza capilar, cromatografía, centrifugación o aspiración. Tras la retirada de cualquier segundo miembro de unión no unido de las proximidades del complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión, el marcador fijado al segundo miembro de unión presente en el complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión puede separarse mediante un medio adecuado. En algunas realizaciones, el marcador se escinde o disocia del complejo que queda tras la retirada de los reactivos no unidos. Por ejemplo, el marcador se puede fijar al segundo miembro de unión por medio de un enlazador escindible ("enlazador escindible" como se describe en el apartado f) a continuación). El complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión puede exponerse a un agente de escisión que medie la escisión del enlazador escindible.
En determinadas realizaciones, la separación del marcador del complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión se lleva a cabo en condiciones que no producen la ruptura del complejo, produciendo la liberación de solo el marcador del complejo. En otros casos, la separación del marcador del complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión se lleva a cabo en condiciones que pueden producir la ruptura del complejo, produciendo la liberación del marcador, así como uno o más de entre el segundo miembro de unión, el analito, el primer miembro de unión del complejo. En determinadas realizaciones, el tamaño del nanoporo utilizado para el recuento del marcador puede evitar el traslado del segundo miembro de unión, del analito, del primer miembro de unión a través del nanoporo. En otras realizaciones, donde el complejo de segundo miembro de unión, analito, primer miembro de unión se retiene sobre el soporte sólido, el nanoporo no puede tener un tamaño que excluya al segundo miembro de unión, al analito ni al primer miembro de unión.
La etapa de separación produce la generación de un marcador libre que se puede hacer que se traslade a través de o por un nanoporo o una capa nanoporosa (como se describe en el apartado f) a continuación) bajo la influencia de un campo eléctrico. En determinados casos, la etapa de escisión puede producir la separación de sustancialmente todas las moléculas de marcador fijadas a cada uno del segundo miembro de unión en el complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión. El número de moléculas de marcador puede correlacionarse con el número de moléculas de analito del complejo que son proporcionales a la concentración del analito en la muestra. En determinadas realizaciones, la correlación entre el marcador contado y la concentración de analito puede ser directa (un mayor número de moléculas de marcador se relaciona con una mayor concentración de analito). En realizaciones en las que un competidor marcado o un analito marcado, tal como un trazador (como se define en el presente documento), se combina con la muestra, competidor marcado o analito marcado que compite con el analito en la muestra por unirse al primer miembro de unión, la correlación entre el marcador contado y la concentración de analito puede ser inversa (un menor número de moléculas de marcador se relaciona con una mayor concentración de analito). La correlación entre el número de moléculas de marcador y la concentración de analito, ya sea directa o inversa, puede ser lineal o logarítmica. Por tanto, el número de moléculas de marcador que se trasladan a través del nanoporo se puede utilizar para determinar la concentración de analito en la muestra. En determinadas realizaciones, la concentración del analito se puede determinar mediante el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de la capa por unidad de tiempo. En otras realizaciones, la concentración del analito se puede determinar determinando el momento en el que el número de marcadores que se trasladan a través de la capa alcanza un umbral. En determinadas realizaciones, el número de moléculas de marcador que se trasladan a través de o por un nanoporo se puede determinar por la frecuencia de bloqueo de la corriente en el nanoporo por unidad de tiempo. La detección de la señal se describe en más detalle en el apartado g) a continuación. Como se describe en el apartado d) a continuación, la molécula de marcador puede ser una nanopartícula o una nanoperla ("nanopartícula" y "nanoperla" como se definen en el presente documento).
El número de marcadores incorporados al segundo miembro de unión (es decir, el número de marcadores del conjugado marcador/segundo miembro de unión) proporciona una estequiometría definida con el analito. En determinadas realizaciones, se puede fijar un marcador al segundo miembro de unión utilizando un procedimiento que produzca un número constante de marcadores fijados a cada segundo miembro de unión. El número de marcadores se puede optimizar en función de la velocidad de recuento. Se puede obtener una velocidad de lectura más rápida incluyendo más marcadores en el miembro de unión, ya que la velocidad de recuento depende de la concentración. El número de marcadores se puede optimizar en función de la estequiometría de la incorporación del marcador, por ejemplo, la tasa de incorporación 1:1 o 1:4. En algunas realizaciones, hay una tasa de incorporación de 1:5. Por ejemplo, un segundo miembro de unión puede tener 1 molécula de marcador, 2 moléculas de marcador, 3 moléculas de marcador, 4 moléculas de marcador o hasta 10 moléculas de marcador fijadas al mismo. En algunas realizaciones, un segundo miembro de unión puede tener 5 moléculas de marcador fijadas al mismo. Se conocen varios métodos de conjugación para conjugar un marcador con un segundo miembro de unión (p. ej., un péptido, un polipéptido, un ácido nucleico), cualquiera de los cuales se puede utilizar para preparar segundos miembros de unión marcados para usar en los presentes métodos y dispositivos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la conjugación específica del sitio de un marcador con un anticuerpo específico de un analito utilizando química de tiol-maleimida, química de aminasuccinimidilo, tecnología THIOBRIDGE™, utilizando anticuerpos con un marcador de hexahistidina C-terminal o N-terminal, anticuerpos con un marcador de aldehído, reacción clic sin cobre y similares.
En algunas realizaciones, los métodos pueden medir la cantidad de analito mediante la determinación del número de eventos de traslado. En algunas realizaciones, uno o más eventos de traslado pueden corresponder a un evento de unión entre un miembro de unión y un analito dependiendo de la estequiometría de la incorporación del marcador al miembro de unión específica. Por ejemplo, si se incorpora un marcador por miembro de unión, entonces, un evento de traslado representa la unión del miembro de unión al analito; si se incorporan dos marcadores por miembro de unión, entonces, dos eventos de traslado representan la unión del miembro de unión al analito; si se incorporan tres marcadores por miembro de unión, entonces, tres eventos de traslado representan la unión del miembro de unión al analito, etc.
En otra realización, el segundo miembro de unión puede ser un aptámero que se una específicamente al analito. En esta realización, no se puede fijar un marcador al aptámero. En cambio, el aptámero se cuenta a medida que se traslada a través de o por un nanoporo, es decir, el aptámero tiene la doble función de ser el segundo miembro de unión y de ser el marcador. En estas realizaciones, el aptámero del complejo de primer miembro de unión-analitoaptámero puede disociarse del complejo mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, antes del traslado a través de o por un nanoporo, el aptámero unido al complejo de primer miembro de unión-analito puede disociarse mediante una etapa de desnaturalización. La etapa de desnaturalización puede implicar la exposición a un reactivo caotrópico, una solución con alto contenido de sal, un reactivo ácido, un reactivo básico, disolvente o una etapa de calentamiento. A continuación, el aptámero se puede trasladar a través de o por un nanoporo y el número de moléculas de aptámero que se trasladan a través de o por un nanoporo para determinar la concentración del analito en la muestra.
Tal y como se indica en el presente documento, el marcador o aptámero puede incluir un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, la etapa de recuento que utiliza un nanoporo no incluye la determinación de la identidad del marcador o del aptámero mediante la determinación de la identidad de al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico presente en el marcador/aptámero. Por ejemplo, la etapa de recuento puede no incluir la determinación de una secuencia del marcador/aptámero. En otras realizaciones, el marcador/aptámero puede no secuenciarse, sin embargo, es posible determinar la identidad del marcador/aptámero en la medida en que un marcador/aptámero pueda distinguirse de otra marcador/aptámero en función de una señal diferenciable asociada con el marcador/aptámero debido a su tamaño, configuración, carga, cantidad de carga y similares. La identificación del marcador/aptámero puede ser útil en métodos que impliquen el análisis simultáneo de una pluralidad de analitos diferentes en una muestra, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más analitos diferentes en una muestra.
En determinadas realizaciones, se puede realizar el análisis simultáneo de varios analitos en una sola muestra utilizando una pluralidad de primeros y segundos miembros de unión diferentes donde un par de primer y segundo miembro de unión sea específico de un solo analito en la muestra. En estas realizaciones, el marcador asociado con el segundo miembro de unión de un primer par de primer y segundo miembro de unión específica de un solo analito puede distinguirse del marcador asociada con el segundo miembro de unión de un segundo par de primer y segundo miembro de unión específica de un analito diferente. Como se ha indicado anteriormente, un primer marcador puede distinguirse de un segundo marcador en función de la diferencia en las dimensiones, carga, etc.
En algunas realizaciones, la concentración de un analito en la muestra líquida que se puede determinar con una exactitud sustancial es menor de aproximadamente 5000 fM (femtomolar), menor de aproximadamente 3000 fM, menor de aproximadamente 2000 fM, menor de aproximadamente 1000 fM, menor de aproximadamente 500 fM, menor de aproximadamente 300 fM, menor de aproximadamente 200 fM, menor de aproximadamente 100 fM, menor de aproximadamente 50 fM, menor de aproximadamente 25 fM, menor de aproximadamente 10 fM, menor de aproximadamente 5 fM, menor de aproximadamente 2 fM, menor de aproximadamente 1 fM, menor de aproximadamente 500 aM (attomolar), menor de aproximadamente 100 aM, menor de aproximadamente 10 aM, menor de aproximadamente 5 aM, menor de aproximadamente 1 aM, menor de aproximadamente 0,1 aM, menor de aproximadamente 500 zM (zeptomolar), menor de aproximadamente 100 zM, menor de aproximadamente 10 zM, menor de aproximadamente 5 zM, menor de aproximadamente 1 zM, menor de aproximadamente 0,1 zM o menor.
En algunos casos, el límite de detección (p. ej., la concentración más baja de un analito que se puede determinar en solución) es de aproximadamente 100 fM, aproximadamente 50 fM, aproximadamente 25 fM, aproximadamente 10 fM, aproximadamente 5 fM, aproximadamente 2 fM, aproximadamente 1 fM, aproximadamente 500 aM (attomolar), aproximadamente 100 aM, aproximadamente 50 aM, aproximadamente 10 aM, aproximadamente 5 aM, aproximadamente 1 aM, aproximadamente 0,1 aM, aproximadamente 500 zM (zeptomolar), aproximadamente 100 zM, aproximadamente 50 zM, aproximadamente 10 zM, aproximadamente 5 zM, aproximadamente 1 zM, aproximadamente 0,1 zM o menor. En algunas realizaciones, la concentración de analito en la muestra líquida que se puede determinar de manera sustancialmente exacta está entre aproximadamente 5000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 3000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 zM, entre aproximadamente 100 fM y aproximadamente 1 zM, entre aproximadamente 100 aM y aproximadamente 0,1 zM, o menor.
El límite superior de detección (p. ej., la concentración superior de un analito que se puede determinar en solución) es de al menos aproximadamente 100 fM, al menos aproximadamente 1000 fM, al menos aproximadamente 10 pM (picomolar), al menos aproximadamente 100 pM, al menos aproximadamente 100 pM, al menos aproximadamente 10 nM (nanomolar), al menos aproximadamente 100 nM, al menos aproximadamente 1000 nM, al menos aproximadamente 10 pM, al menos aproximadamente 100 pM, al menos aproximadamente 1000 pM, al menos aproximadamente 10 mM, al menos aproximadamente 100 mM, al menos aproximadamente 1000 mM o mayor.
En algunos casos, la presencia y/o concentración del analito en una muestra se puede detectar rápidamente, generalmente en menos de aproximadamente 1 hora, p. ej., 45 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 1 minuto o 30 segundos.
En determinadas realizaciones, al menos algunas etapas de los métodos descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo en un dispositivo microfluídico digital, tal como el dispositivo descrito en el apartado 3, a continuación. En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se llevan a cabo utilizando un dispositivo microfluídico digital junto con un dispositivo nanoporoso. Por ejemplo, el dispositivo microfluídico digital y el dispositivo nanoporoso pueden ser dispositivos separados, y se puede generar una nanogota que contenga el uno o varios marcadores escindidos o el uno o varios aptámeros disociados en el dispositivo microfluídico y transportarse al dispositivo nanoporoso. En determinadas realizaciones, una nanogota que contenga el uno o varios marcadores escindidos o el uno o varios aptámeros disociados puede aspirarse del dispositivo microfluídico y transportarse al dispositivo nanoporoso utilizando una pipeta manejada por un usuario o un robot.
En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se llevan a cabo utilizando un dispositivo en el que un módulo microfluídico digital está integrado a un módulo nanoporoso, tal como el dispositivo que se describe a continuación. En determinadas realizaciones, el módulo microfluídico digital y el módulo nanoporoso pueden integrarse de forma reversible. Por ejemplo, los dos módulos pueden combinarse físicamente para formar el dispositivo integrado, dispositivo que luego podría separarse en los módulos individuales. En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se llevan a cabo utilizando un cartucho desechable que incluye un módulo microfluídico con un módulo nanoporoso incorporado. Los ejemplos de realización de los dispositivos utilizados para realizar los métodos proporcionados en el presente documento se describen en más detalle en la siguiente sección.
En determinados casos, el dispositivo microfluídico o el módulo microfluídico del dispositivo integrado (reversible o totalmente) con el módulo nanoporoso puede incluir un primer sustrato y un segundo sustrato dispuestos de manera separada, donde el primer sustrato está separado del segundo sustrato por una distancia/un espacio, y donde al menos las etapas de poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, retirar el segundo miembro de unión no unido al analito unido al primer miembro de unión, y escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión (que permanece unido al analito unido al primer miembro de unión) se lleva a cabo en la distancia/el espacio entre el primer y el segundo sustrato.
Los ejemplos de realización del presente método incluyen generar una nanogota de la muestra y combinar la nanogota de la muestra con una nanogota que contenga el primer miembro de unión para generar una sola nanogota. El primer miembro de unión puede inmovilizarse sobre un sustrato sólido, tal como, una perla (p. ej., una perla magnética). La una sola nanogota se puede incubar durante un tiempo suficiente para permitir la unión del primer miembro de unión a un analito presente en la nanogota de muestra. Opcionalmente, la una sola nanogota se puede agitar para facilitar la mezcla de la muestra con el primer miembro de unión. La mezcla se puede lograr moviendo la una sola nanogota de un lado a otro, moviendo la una sola nanogota alrededor de una pluralidad de electrodos, dividiendo una nanogota y luego fusionando las nanogotas, o usando SAW, y similares. A continuación, la una sola nanogota puede someterse a una fuerza magnética para retener las perlas en una ubicación del dispositivo, mientras que la nanogota puede alejarse y reemplazarse con una nanogota que contenga un segundo miembro de unión. Se puede realizar una etapa de lavado opcional, antes de añadir el segundo miembro de unión, moviendo una nanogota de tampón de lavado a la ubicación en la que se retienen las perlas utilizando la fuerza magnética. Tras un período de tiempo suficiente para que el segundo miembro de unión se una al analito unido al primer miembro de unión, la nanogota que contiene el segundo miembro de unión puede alejarse mientras que las perlas se retienen en la primera ubicación. Las perlas se pueden lavar utilizando una nanogota de tampón de lavado seguida del contacto de las perlas con una nanogota que contenga un reactivo de escisión para escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión. En realizaciones en las que el marcador se fija al segundo miembro de unión mediante un enlazador fotoescindible, las perlas pueden exponerse a la luz de la longitud de onda apropiada para escindir el enlazador. En determinados casos, las perlas pueden exponerse a una nanogota de tampón antes de la escisión del enlazador fotoescindible. Opcionalmente, tras la etapa de lavado para retirar cualquier segundo miembro de unión no unido, se puede dejar una nanogota que contenga tampón cubriendo las perlas, reteniendo la fuerza magnética, se pueden retirar las perlas que están en la primera ubicación y la nanogota de tampón que contiene las perlas se puede mover a una segunda ubicación en la que se pueda llevar a cabo la fotoescisión. La nanogota que contiene los marcadores escindidos se puede mover luego al dispositivo nanoporoso o a la parte del módulo nanoporoso del dispositivo integrado. En realizaciones que utilizan aptámero como segundo miembro de unión, tras la etapa de lavado para retirar cualquier aptámero no unido, se puede dejar una nanogota que contenga tampón cubriendo las perlas, reteniendo la fuerza magnética, se pueden retirar las perlas que están en la primera ubicación y la nanogota de tampón que contiene las perlas se puede mover a una segunda ubicación en la que se pueda llevar a cabo la disociación del aptámero. En otras realizaciones, tras la etapa de lavado, las perlas pueden exponerse a una nanogota de un reactivo para disociar el aptámero unido al analito. Se puede mover una nanogota que contenga el aptámero disociado al nanoporo mientras que las perlas se pueden retener en su sitio utilizando un imán. La nanogota que contiene el aptámero disociado se puede mover al dispositivo nanoporoso o a la parte del módulo nanoporoso del dispositivo integrado.
En una realización alternativa, el primer miembro de unión puede estar inmovilizado sobre una superficie del primer o del segundo sustrato en una ubicación de la distancia/del espacio. El etapa de puesta en contacto de una muestra con el primer miembro de unión puede incluir mover una nanogota de la muestra a la ubicación de la distancia/del espacio en la que esté inmovilizado el primer miembro de unión. Las etapas posteriores pueden ser esencialmente similares a las descritas anteriormente para el primer miembro de unión inmovilizado sobre perlas magnéticas.
Tras la etapa de escisión/disociación, la nanogota que contiene el uno o varios marcadores escindidos/el uno o varios aptámeros disociados se puede mover al dispositivo nanoporoso o al módulo nanoporoso del dispositivo integrado. Como se ha indicado anteriormente, la/s nanogota/s se puede/n mover utilizando un sistema de transferencia de líquido, tal como una pipeta. En determinados casos, el módulo microfluídico se puede conectar de forma fluida al módulo nanoporoso. La conexión fluídica se puede realizar conectando el módulo microfluídico al módulo nanoporoso por medio de un canal o colocando el módulo nanoporoso dentro del módulo microfluídico, ya sea de forma reversible o durante el proceso de fabricación del dispositivo integrado. Dichos dispositivos se describen en más detalle en el siguiente apartado.
En las realizaciones anteriores, opcionalmente, tras la combinación, una nanogota se puede manipular (p. ej., mover de un lado a otro, mover en una dirección circular, hacer oscilar, dividir/fusionar, exponer a SAW, etc.) para facilitar la mezcla de la muestra con los reactivos del ensayo, tal como, el primer miembro de unión, segundo miembro de unión, etc.
El movimiento de las nanogotas en el dispositivo nanoporoso y microfluídico integrado se puede llevar a cabo utilizando fuerza eléctrica (p. ej., electrohumectación, dielectroforesis, mediada por electrodos, optoelectrohumectación, mediada por campo eléctrico y accionamiento electrostático), presión, ondas acústicas superficiales y similares. La fuerza utilizada para mover las nanogotas se puede determinar en función de las características específicas del dispositivo, que se describen en los siguientes apartados a) a g) a continuación, y para el dispositivo particular descrito en el apartado 3.
a) Multiplexación
Los métodos pueden incluir uno o más (o, como alternativa, dos o más) miembros de unión específica para detectar uno o más (o, como alternativa, dos o más) analitos diana en la muestra en un ensayo de multiplexación. Cada uno de los uno o más (o, como alternativa, dos o más) miembros de unión específica se une a un analito diana diferente y cada miembro de unión específica se marca con un marcador y/o aptámero diferente. Por ejemplo, un primer miembro de unión específica se une a un primer analito diana, un segundo miembro de unión específica se une a un segundo analito diana, un tercer miembro de unión específica se une a un tercer analito diana, etc. y el primer miembro de unión específica se marca con un primer marcador y/o aptámero, el segundo miembro de unión específica se marca con un segundo marcador y/o aptámero, el tercer miembro de unión específica se marca con un tercer marcador y/o aptámero, etc. En algunas realizaciones, una primera condición provoca la escisión o liberación del primer marcador si el primer miembro de unión específica está marcado con un marcador, o la disociación o liberación del primer aptámero si el primer miembro de unión específica está marcado con un aptámero, una segunda condición provoca la escisión o liberación del segundo marcador si el segundo miembro de unión específica está marcado con un marcador, o la disociación o liberación del segundo aptámero si el segundo miembro de unión específica está marcado con un aptámero, una tercera condición provoca la escisión o liberación del tercer marcador si el tercer miembro de unión específica está marcado con un marcador, o la disociación o liberación del tercer aptámero si el tercer miembro de unión específica está marcado con un aptámero, etc. En algunas realizaciones, las condiciones de la muestra se pueden cambiar en diferentes momentos durante el ensayo, permitiendo la detección del primer marcador o aptámero, el segundo marcador o aptámero, el tercer marcador o aptámero, etc., detectando así uno o más (o, como alternativa, dos o más) analitos diana. En algunas realizaciones, los uno o más (o, como alternativa, dos o más) marcadores escindidos y/o aptámeros disociados se detectan simultáneamente a través del poro en función de la duración de la residencia en el nanoporo, la magnitud de la impedancia de corriente o una combinación de las mismas.
b) Ejemplos de analitos diana
Como apreciarán los expertos en la materia, se puede detectar cualquier analito que pueda unirse específicamente a un primer miembro de unión y un segundo miembro de unión y, opcionalmente, cuantificarlo utilizando métodos y dispositivos de la presente divulgación.
En algunas realizaciones, el analito puede ser una biomolécula. Los ejemplos no limitativos de biomoléculas incluyen macromoléculas tales como, proteínas, lípidos y carbohidratos. En determinados casos, el analito puede ser hormonas, anticuerpos, factores de crecimiento, citocinas, enzimas, receptores (p. ej., receptores neurales, hormonales, de nutrientes y de superficie celular) o sus ligandos, marcadores de cáncer (p. ej., PSA (Prostate-Specific Antigen, antígeno específico de la próstata), TNF-alfa (Tumor Necrosis Factor alfa, factor de necrosis tumoral alfa), marcadores del infarto de miocardio (p. ej., troponina, creatina quinasa y similares), toxinas, fármacos (p. ej., fármacos de adicción), agentes metabólicos (p. ej., incluyendo vitaminas) y similares. Las realizaciones no limitativas de analitos proteicos incluyen péptidos, polipéptidos, fragmentos de proteínas, complejos de proteínas, proteínas de fusión, proteínas recombinantes, fosfoproteínas, glicoproteínas, lipoproteínas o similares.
En determinadas realizaciones, el analito puede ser una proteína modificada después de la traducción (p. ej., proteína fosforilada, metilada, glicosilada) y el primer o segundo miembro de unión puede ser un anticuerpo específico para una modificación posterior a la traducción. Una proteína modificada puede unirse a un primer miembro de unión inmovilizado sobre un soporte sólido donde el primer miembro de unión se une a la proteína modificada pero no a la proteína no modificada. En otras realizaciones, el primer miembro de unión puede unirse tanto a la proteína modificada como a la no modificada, y el segundo miembro de unión puede ser específico de la proteína modificada después de la traducción.
En algunas realizaciones, el analito puede ser una célula, tal como, célula tumoral circulante, bacteria patogénica, virus (incluyendo retrovirus, virus del herpes, adenovirus, lentivirus, Filovirus (ébola), virus de la hepatitis (p. ej., A, B, C, D y E); VPH, etc.; esporas, etc.
Una lista no limitativa de analitos que pueden ser analizados mediante los métodos presentados en el presente documento incluye la proteína beta amiloide Ap42, fetuína-A, tau, secretogranina II, proteína priónica, Alfa-sinucleína, proteína tau, cadena ligera del neurofilamento, parkina, quinasa putativa 1 inducida por PTEN, DJ-1, quinasa rica en repeticiones de leucina 2, ATP13A2 mutada, Apo H, ceruloplasmina, Coactivador-1 alfa del receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PGC-1a), transtiretina, proteína de unión a vitamina D, quinasa proapoptótica R (PKR) y su PKR fosforilada (pPKR), CXCL13, IL-12p40, CXCL13, IL-8, Dkk-3 (semen), fragmento de endocan p14, suero, ACE2, autoanticuerpo contra CD25, hTERT, CAI25 (MUC 16), VEGF, sIL-2, Osteopontina, proteína 4 del epidídimo humano (HE4), Alfa-fetoproteína, albúmina, albuminuria, microalbuminuria, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), interleucina 18 (IL-18), molécula 1 de lesión renal (KIM-1), proteína de unión a ácidos grasos del hígado (L-FABP), LMP1, BARF1, IL-8, antígeno carcinoembrionario (CEA), BRAF, CCNI, EGRF, FGF19, FRS2, GREB1 y LZTS1, alfa-amilasa, antígeno carcinoembrionario, CA 125, IL8, tiorredoxina, niveles de microglobulina beta-2: actividad de control del virus, receptores del factor de necrosis tumoral alfa: actividad de control del virus, CA15-3, hormona estimulante del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), invasión y metástasis 1 del linfoma de linfocitos T (TIAM1), N-cadherina, EC39, anfirregulina, dUTPasa, gelsolina secretora (pGSN), PSA (antígeno específico de la próstata), timosina pI5, insulina, péptido C plasmático, hemoglobina glicosilada (HBA1c), proteína C reactiva (CRP), interleucina 6 (IL-6), ARHGDIB (inhibidor 2 de la disociación de Rho GDP), CFL1 (Cofilina-1), PFN1 (profilina-1), GSTP1 (glutatión S-transferasa P), S100A11 (Proteína S100-A11), PRDX6 (peroxiredoxina-6), HSPE1 (proteína de choque térmico de 10 kDa, mitocondrial), LYZ (precursor de la lisozima C), GPI (glucosa-6-fosfato isomerasa), HIST2H2AA (Histona H2A de tipo 2-A), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), HSPG2 (precursor de la proteína del núcleo del proteoglicano sulfato de heparán específico de la membrana basal), LGALS3BP (precursor de la proteína de unión a galectina-3), CTSD (precursor de la catepsina D), APOE (precursor de la apolipoproteína E), IQGAP1 (proteína de tipo activadora de Ras GTPasa IQGAP1), CP (precursor de ceruloplasmina) e IGLC2 (proteína IGLC1), PCDGF/GP88, EGFR, HER2, MUC4, IGF-IR, p27(kip1), Akt, HER3, HER4, PTEN, PIK3CA, SHIP, Grb2, Gab2, PDK-1 (proteína quinasa 1 dependiente de 3-fosfoinosítido), TSC1, TSC2, mTOR, MIG-6 (inhibidor de retroalimentación del receptor ERBB 1), S6K, src, KRAS, proteína quinasa 1 activada por mitógenos MEK, cMYC, topoisomerasa TOPO II (ADN) II alfa 170 kDa, FRAP1, NRG1, ESR1, ESR2, PGR, CDKN1B, MAP2K1, NEDD4-1, FOXO3A, PPP1R1B, PXN, ELA2, CTNNB1, AR, EPHB2, KLF6, ANXA7, NKX3-1, PITX2, MKI67, PHLPP, adiponectina (ADIPOQ), cadena alfa de fibrinógeno (FGA), leptina (LEP), receptor específico del producto final de la glicosilación avanzada (AGER también conocido como RAGe ), alfa-2-HS-glicoproteína (AHSG), angiogenina (ANG), molécula CD14 (CD14), ferritina (FTH1), proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFBP1), receptor de interleucina 2, alfa (IL2RA), molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM1) y factor de von Willebrand (VWF), mieloperoxidasa (MPO), IL1a, TNFa, anticuerpo perinuclear anticitoplasma de neutrófilos (p-ANCA), lactoferrina, calprotectina, proteína de tumor de Wilm-1, Aquaporina-1, MLL3, AMBP, VDAC1, enterotoxinas de E. coli (exotoxina termolábil, enterotoxina termoestable), antígeno HA de la gripe, toxina tetánica, toxina diftérica, toxinas botulínicas, toxina Shiga, toxina I similar a Shiga, toxina II similar a Shiga, toxinas A y B de Clostridium difficile, etc.
Los ejemplos de dianas de aptámeros de ácido nucleico que se pueden medir en una muestra, tal como una muestra ambiental, una muestra biológica obtenida de un paciente o sujeto que lo necesita utilizando los presentes métodos y dispositivos incluyen: drogas (p. ej., cocaína), biomarcadores de proteínas (incluyendo, pero sin limitación, nucleolina, modulador esencial del factor nuclear-kB (NEMO), CD-30, proteína tirosina quinasa 7 (PTK7), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), glicoforma de MUC1, cadenas pesadas de inmunoglobulina p (IGHM), inmunoglobulina E, integrina avp3, a-trombina, HIV gp120, NF-kB, factor de transcripción E2F, HER3, inhibidor del activador del plasminógeno, tenascina C, CXCL12/SDF-1, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), células de cáncer gástrico, HGC-27); células (incluyendo, pero sin limitación, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), células de cáncer colorrectal, (DLD-1), células de adenocarcinoma de pulmón H23, Células de Ramos, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLAT), CCRF-CEM, células de leucemia mieloide aguda (LMA) (HL60), células de cáncer de pulmón microcítico (CPM), NCIH69, células de glioblastoma humano, U118-MG, células PC-3, células de cáncer de mama humano que sobreexpresan HER-2, SK-BR-3, estirpe celular de cáncer de páncreas (Mia-PaCa-2)); y agentes infecciosos (incluyendo, pero sin limitación, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Shigella dysenteriae, Escherichia coli Ol57:H7, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella O8, Salmonella enteritidis).
Los ejemplos de dianas de aptámeros de proteínas o péptidos que se pueden medir en una muestra obtenida de un paciente o sujeto que lo necesita utilizando los presentes métodos y dispositivos incluyen, pero sin limitación: proteína de la cápside del núcleo del VHB, CDK2, factor de transcripción E2F, timidilato sintasa, Ras, EB1 y receptor para productos finales glicosilados avanzados (RAGE, Receptor for Advanced Glycated End products). Los aptámeros, y el uso y los métodos de producción de los mismos se revisan en, p. ej., Shum et al., J Cancer Ther. 20134:872; Zhang et al., Curr Med Chem. 2011 ;18:4185; Zhu et al., Chem Commun (Camb). 201248:10472; Crawford et al., Brief Funct Genomic Proteomic. 20032:72; Reverdatto et al., PLoS One. 20138:e65180.
c) Muestras
Como se usan en el presente documento, "muestra", "muestra de prueba", "muestra biológica" se refiere a una muestra líquida que contiene o se sospecha que contiene un analito de interés. La muestra se puede obtener de cualquier fuente adecuada. En algunos casos, la muestra puede comprender un líquido, partículas sólidas fluidas o suspensión fluida de partículas sólidas. En algunos casos, la muestra puede procesarse antes del análisis descrito en el presente documento. Por ejemplo, la muestra se puede separar o purificar de su fuente antes del análisis; sin embargo, en determinadas realizaciones, se puede analizar directamente una muestra sin procesar que contenga el analito. La fuente de la molécula de analito puede ser sintética (p. ej., producida en un laboratorio), el medio ambiente (p. ej., muestras de aire, de suelo, de líquidos, p. ej., suministros de agua, etc.), un animal, p. ej., un mamífero, una planta o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo particular, la fuente de un analito es una sustancia corporal humana (p. ej., fluido corporal, sangre, suero, plasma, orina, saliva, sudor, esputo, semen, moco, fluido lagrimal, líquido linfático, líquido amniótico, líquido intersticial, lavado pulmonar, líquido cefalorraquídeo, heces, tejido, órgano o similar). Los tejidos pueden incluir, pero sin limitación, tejido del músculo esquelético, tejido hepático, tejido pulmonar, tejido renal, tejido miocárdico, tejido cerebral, médula ósea, tejido del cuello del útero, piel, etc. La muestra puede ser una muestra líquida o un extracto líquido de una muestra sólida. En determinados casos, la fuente de la muestra puede ser un órgano o tejido, tal como una muestra de biopsia, que puede solubilizarse por desintegración tisular/lisis celular.
Se puede analizar un intervalo amplio de volúmenes de la muestra líquida. En algunos ejemplos de realización, el volumen de la muestra puede ser de aproximadamente 0,5 nl, aproximadamente 1 nl, aproximadamente 3 nl, aproximadamente 0,01 pl, aproximadamente 0,1 pl, aproximadamente 1 pl, aproximadamente 5 pl, aproximadamente 10 pl, aproximadamente 100 pl, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml, o similar. En algunos casos, el volumen de la muestra líquida está entre aproximadamente 0,01 pl y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,01 pl y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 0,01 pl y aproximadamente 100 pl, o entre aproximadamente 0,1 pl y aproximadamente 10 pl.
En algunos casos, la muestra líquida se puede diluir antes de utilizarla en un ensayo. Por ejemplo, en realizaciones en las que la fuente de una molécula de analito es un fluido corporal humano, sangre, suero), el fluido se puede diluir con un disolvente apropiado (p. ej., un tampón tal como el tampón PBS). Una muestra líquida se puede diluir aproximadamente 1 vez, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 100 veces o más, antes de su uso.
En algunos casos, la muestra se puede someter a un procesamiento preanalítico. El procesamiento preanalítico puede ofrecer una funcionalidad adicional, tal como la retirada de proteínas inespecíficas y/o una funcionalidad de mezcla eficaz, pero que se puede implementar de forma económica. Los métodos generales de procesamiento preanalítico pueden incluir el uso de atrapamiento electrocinético, electrocinética AC, ondas acústicas superficiales, isotacoforesis, dielectroforesis, electroforesis u otras técnicas de preconcentración conocidas en la técnica. En algunos casos, la muestra líquida se puede concentrar antes de su uso en un ensayo. Por ejemplo, en realizaciones en las que la fuente de una molécula de analito es un fluido corporal humano, sangre, suero), el fluido puede concentrarse por precipitación, evaporación, filtración, centrifugación o una combinación de los mismos. Una muestra líquida se puede concentrar aproximadamente 1 vez, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 100 veces o más, antes de su uso.
En determinadas realizaciones, el analito no se amplifica (es decir, el número de copias del analito no aumenta) antes de la medición del analito. Por ejemplo, en los casos en los que el analito sea ADN o ARN, el analito no se replica para aumentar el número de copias del analito. En determinados casos, el analito es una proteína o una molécula pequeña.
d) Miembros de unión específica
Como apreciarán los expertos en la materia, los miembros de unión serán determinados por el analito que se vaya a analizar. Se conocen miembros de unión para una amplia variedad de moléculas diana, o se pueden encontrar o desarrollar fácilmente utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, cuando el analito diana es una proteína, los miembros de unión pueden incluir proteínas, particularmente anticuerpos o fragmentos de los mismos (p. ej., fragmentos de unión al antígeno (Fab, antigen-binding fragments), fragmentos de Fab, fragmentos F(ab')2, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios ("scFv", single-chain Fvs), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio único, tales como dominios de cadena pesada variable ("VHH" [variable heavy chain]; también conocidos como "fragmentos VHH") derivados de animales de la familia Camelidae (los VHH y los métodos para producirlos se describen en Gottlin et al., Journal of Biomolecular Screening, 14:77-85 (2009)), anticuerpos recombinantes de dominio único VHH y fragmentos Vnar, Fv unidos por disulfuro ("sdFv", disulfide-linked Fvs) y anticuerpos antiidiotípicos ("anti-Id"), y fragmentos de unión a epítopo funcionalmente activos de cualquiera de los anteriores, anticuerpos policlonales o monoclonales de longitud completa, fragmentos de tipo anticuerpo, etc.), otras proteínas, tales como las proteínas receptoras, Proteína A, Proteína C o similar. En caso de que el analito sea una molécula pequeña, tal como, esteroides, bilinas, retinoides y lípidos, el primer y/o segundo miembro de unión puede ser una proteína de armazón (p. ej., lipocalinas) o un receptor. En algunos casos, el miembro de unión para analitos proteicos puede ser un péptido. Por ejemplo, cuando el analito diana es una enzima, los miembros de unión adecuados pueden incluir sustratos enzimáticos y/o inhibidores enzimáticos que pueden ser un péptido, una molécula pequeña y similares. En algunos casos, cuando el analito diana es una especie fosforilada, los miembros de unión pueden comprender un agente de unión a fosfato. Por ejemplo, el agente de unión a fosfato puede comprender medios de afinidad de iones metálicos tales como los descritos en la patente de EE.UU. n.° 7.070.921 y la solicitud de patente de EE.UU. n° 20060121544.
En determinados casos, al menos uno de los miembros de unión puede ser un aptámero, tal como los descritos en las patentes de EE.UU. n.° 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337. Se pueden desarrollar aptámeros de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ADN monocatenario o moléculas de ARN monocatenario) para capturar prácticamente cualquier molécula diana. Los aptámeros se unen a las moléculas diana de una manera dependiente de la configuración, muy específica, normalmente con una afinidad muy alta, aunque se pueden seleccionar aptámeros con menor afinidad de unión. Los aptámeros pueden distinguir entre moléculas de analito diana basándose en diferencias estructurales muy pequeñas, como la presencia o ausencia de un grupo metilo o hidroxilo, y determinados aptámeros pueden distinguir entre enantiómeros D y L y diastereómeros. Los aptámeros se pueden unir a dianas moleculares pequeñas, incluyendo fármacos, iones metálicos y colorantes orgánicos, péptidos, biotina y proteínas. Los aptámeros pueden conservar la actividad funcional tras la biotinilación, el marcaje con fluoresceína y cuando se adhieren a superficies vítreas y microesferas.
Los aptámeros de ácido nucleico son oligonucleótidos que pueden ser oligodesoxinucleótidos monocatenarios, oligoribonucleótidos u oligodesoxinucleótidos, u oligoribonucleótidos modificados. "Modificado/s" incluye nucleótidos con una base y/o un azúcar modificados covalentemente. Por ejemplo, los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos que tienen azúcares que están fijados covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Por tanto, los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares sustituidos en 2' tales como 2'-O-metil-; 2-O-alquil; 2-O-alil; 2'-S-alquil; 2'-S-alil; 2'-fluoro-; 2'-halo o 2-azido-ribosa, azúcares a-anoméricos análogos de azúcares carbocíclicos; azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa y sedoheptulosa. En algunas realizaciones, el miembro de unión comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-11.
Se pueden diseñar aptámeros peptídicos para interferir con las interacciones de proteínas. Los aptámeros peptídicos se pueden basar en un armazón proteico al que se fija un bucle peptídico variable, limitando así la configuración del aptámero. En algunos casos, la parte de armazón del aptámero peptídico deriva de la tiorredoxina A bacteriana (T rxA).
Cuando la molécula diana es un carbohidrato, los componentes de captura potencialmente adecuados (como se definen en el presente documento) incluyen, por ejemplo, anticuerpos, lectinas y selectinas. Como apreciarán los expertos habituales en la materia, cualquier molécula que pueda asociarse específicamente con una molécula diana de interés se puede utilizar como miembro de unión.
Para determinadas realizaciones, los complejos de analito diana/miembro de unión adecuados pueden incluir, pero sin limitación, anticuerpos/antígenos, antígenos/anticuerpos, receptores/ligandos, ligandos/receptores, proteínas/ácido nucleico, enzimas/sustratos y/o inhibidores, carbohidratos (incluyendo glicoproteínas y glicolípidos)/lectinas y/o selectinas, proteínas/proteínas, proteínas/moléculas pequeñas, etc.
En una realización particular, el primer miembro de unión se puede fijar a un soporte sólido a través de un enlace, que puede comprender cualquier resto, funcionalización o modificación del soporte y/o elemento de unión que facilite la fijación del elemento de unión al soporte. El enlace entre el miembro de unión y el soporte puede incluir uno o más enlaces químicos o físicos (p. ej., fijación no específica a través de las fuerzas de van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas/hidrófilas; etc.) enlaces y/o espaciadores químicos que proporcionan dicho enlace/s.
En determinadas realizaciones, un soporte sólido también puede comprender una capa de protección, bloqueo o pasivación que pueda eliminar o reducir al mínimo la fijación no específica de componentes que no sean de captura (p. ej., moléculas de analito, miembros de unión) a la superficie de unión durante el ensayo que puedan conducir a señales de falso positivo durante la detección o pérdida de señal. Los ejemplos de materiales que se pueden utilizar en determinadas realizaciones para formar capas de pasivación incluyen, pero sin limitación: polímeros, tales como poli(etilenglicol), que repelen la unión inespecífica de proteínas; proteínas naturales con esta propiedad, tales como seroalbúmina y caseína; tensioactivos, p. ej., tensioactivos bipolares, tales como las sulfobetaínas; lípidos de cadena larga de origen natural; cepillos poliméricos y ácidos nucleicos, tales como ADN de esperma de salmón.
Determinadas realizaciones utilizan miembros de unión que son proteínas o polipéptidos. Como se sabe en la técnica, se puede utilizar cualquier número de técnicas para fijar un polipéptido a una amplia variedad de soportes sólidos. Se conoce una amplia variedad de técnicas para añadir restos reactivos a las proteínas, por ejemplo, el método esbozado en la patente de EE.UU. n.° 5.620.850. Además, se conocen métodos para la fijación de proteínas a superficies, por ejemplo, véase Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990).
Como se explica en el presente documento, la unión entre los miembros de unión y el analito, es específica, p. ej., como cuando el miembro de unión y el analito son partes complementarias de un par de unión. En determinadas realizaciones, el miembro de unión se une específicamente al analito. Por "unirse específicamente" o "especificidad de unión" se entiende que el miembro de unión une la molécula de analito con suficiente especificidad para diferenciar entre la molécula de analito y otros componentes o contaminantes de la muestra de prueba. Por ejemplo, el miembro de unión, de acuerdo con una realización, puede ser un anticuerpo que se una específicamente a un epítopo sobre un analito. El anticuerpo, de acuerdo con una realización, puede ser cualquier anticuerpo capaz de unirse específicamente a un analito de interés. Por ejemplo, los anticuerpos apropiados incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio (dAb, domain Antibodies) (p. ej., tal como se describe en Holt et al., (2014) Trends in Biotechnology 21:484-490), e incluyendo anticuerpos de dominio único sdAb (single domain Antibodies) de origen natural, p. ej., como los de peces cartilaginosos y camélidos, o que son sintéticos, p. ej., nanocuerpos, VHH u otra estructura de dominio), anticuerpos sintéticos (a veces denominados miméticos de anticuerpos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (a veces denominadas "conjugados de anticuerpos") y fragmentos de cada uno, respectivamente. Como otro ejemplo, la molécula de analito puede ser un anticuerpo y el primer miembro de unión puede ser un antígeno y el segundo miembro de unión puede ser un anticuerpo secundario que se una específicamente al anticuerpo diana, o el primer miembro de unión puede ser un anticuerpo secundario que se una específicamente al anticuerpo diana y el segundo miembro de unión puede ser un antígeno.
En algunas realizaciones, el miembro de unión puede ser anticuerpos programados químicamente (cpAb, chemically programmed Antibodies) (descritos en Rader (2014) Trends in Biotechnology 32:186-197), cpAb biespecíficos, moléculas de reclutamiento de anticuerpos (ARM, Antibody-Recruiting Molecules) (descritas en McEnaney et al., (2012) ACS Chem. Biol. 7:1139-1151), agentes de captura ramificados, tales como un agente de captura de triligandos (descrito en Millward et al., (2011) J. Am. Chem. Soc. 133:18280-18288), proteínas de unión diseñadas derivadas de armazones sin anticuerpos, tales como monocuerpos (derivados del décimo dominio de fibronectina de tipo III de la fibronectina humana), aficuerpos (derivados de la proteína A de unión a la inmunoglobulina), DARPin (basados en módulos de repetición ankirina), anticalinas (derivadas de la proteína de unión a lipocalinas bilina y lipocalina humana 2), y péptidos de nudos de cisteína (knottins) (descritos en Gilbreth y Koide, (2012) Current Opinion in Structural Biology 22:1-8; Banta et al. (2013) Annu. Rev. Biomed. Eng. 15:93-113), dominios WW (descritos en Patel et al. (2013) Protein Engineering, Design & Selection 26(4):307-314), ligandos de receptores reutilizados, afitinas (descritas en Behar et al., (2013) 26:267-275) y/o adhironas (descritas en Tiede et al., (2014) Protein Engineering, Design & Selection 27:145-155).
De acuerdo con una realización en la que un analito es una célula biológica (p. ej., de mamífero, ave, reptil, otro vertebrado, insecto, levadura, bacteria, célula, etc.), los miembros de unión pueden ser ligandos que tengan afinidad específica por un antígeno de superficie celular (p. ej., un receptor de superficie celular). En una realización, el miembro de unión puede ser un receptor de molécula de adhesión, o una parte del mismo, que tenga especificidad de unión por una molécula de adhesión celular expresada sobre la superficie de un tipo de célula diana. En uso, el receptor de la molécula de adhesión se une a una molécula de adhesión sobre la superficie extracelular de la célula diana, inmovilizando o capturando así a la célula, y, a continuación, se puede detectar la célula unida utilizando un segundo miembro de unión, que puede ser el mismo que el primer miembro de unión o puede unirse a una molécula diferente expresada sobre la superficie de la célula.
En algunas realizaciones, la afinidad de unión entre las moléculas de analito y los miembros de unión debe ser suficiente para permanecer unidos en las condiciones del ensayo, incluyendo las etapas de lavado para retirar moléculas o partículas que estén unidas de forma inespecífica. En algunos casos, por ejemplo, en la detección de determinadas biomoléculas, la constante de unión de la molécula de analito a su miembro de unión complementario puede estar entre al menos aproximadamente 104 y aproximadamente 106 M-1, al menos aproximadamente 105 y aproximadamente 109 M-1, al menos aproximadamente 1o7 y aproximadamente 109 M-1, mayor de aproximadamente 109 M-1, o mayor.
e) Marcador
Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir un miembro de unión específico unido a un marcador, tal como un marcador para analizar un analito por impedancia. Los marcadores incorporados no interfieren sustancialmente con la ejecución del esquema de reacción. Por ejemplo, el marcador incorporado no interfiere con la constante de unión de ni con la interacción entre el analito y su miembro de unión complementario. El tamaño y el número de marcadores incorporados pueden estar relacionados con la velocidad de captura y la velocidad de lectura. La velocidad de captura y de lectura se puede aumentar aumentando el tamaño y/o el número de marcadores incorporados. Por ejemplo, el tamaño y el número de marcadores incorporados pueden aumentar la carga y aumentar la zona de captura del nanoporo. El marcador incorporado no altera la cinética del miembro de unión, por ejemplo, la cinética de anticuerpos, ni el esquema de reacción. Los ejemplos de marcadores incluyen polímeros tales como un polímero aniónico o un polímero catiónico (p. ej., un polipéptido con una carga neta positiva, tal como, polihistidina o polilisina), donde el polímero tiene una longitud de aproximadamente 5-1000 restos; una proteína (p. ej., una proteína globular) que no reaccione de forma cruzada con el miembro de unión ni/o interfiera con el ensayo, un dendrímero, p. ej., un dendrímero de ADN; y una nanopartícula cargada, p. ej., una nanoperla. Un marcador polimérico puede incluir un ácido nucleico, tal como, un ácido desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico. Un marcador polimérico puede incluir un polímero de nucleobases. En determinados casos, el marcador puede ser un aptámero de ADN o de ARN, donde el aptámero no se une al analito. En algunos casos, donde el marcador es un aptámero, se puede desnaturalizar opcionalmente antes del traslado a través del nanoporo. un marcador polimérico o una nanopartícula (p. ej., una nanoperla) puede ser lo suficientemente grande para generar una señal reproducible a medida que se traslada a través de o por un nanoporo. Los aptámeros pueden tener una longitud de 20 a 220 bases, p. ej., 20-60 bases de largo. El tamaño de la nanopartícula (p. ej., una nanoperla o un dendrímero) puede variar de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 950 nm de diámetro, por ejemplo, 10 nm-900 nm, 20 nm-800 nm, 30 nm-700 nm, 50 nm-600 nm, 80 nm-500 nm, 100 nm-500 nm, 200 nm-500 nm, 300 nm-500 nm o 400 nm-500 nm de diámetro, p. ej., 10 nm, 20 nm, 30 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm o 900 nm. Cuando se utiliza como marcador, un tamaño preferido para la nanopartícula es aquel que con el que pueda pasar a través de o por un nanoporo (como se describe en más detalle en el presente documento). En determinados casos, la nanoperla/nanopartícula puede estar hecha de un material que tenga una carga neta negativa o positiva, o puede tratarse para que tenga una carga neta negativa o positiva. Los ejemplos de nanoperlas/nanopartículas incluyen las fabricadas a partir de polímeros orgánicos o inorgánicos. Los polímeros orgánicos incluyen polímeros tales como poliestireno, carbono, poliacrilamida, etc. Los polímeros inorgánicos incluyen nanoperlas/nanopartículas de silicio o metal. En determinados casos, las nanoperlas/nanopartículas pueden no ser magnéticas.
En determinados casos, el marcador puede ser un ADN o ARN monocatenario. El ADN o ARN monocatenario se puede hibridar con una molécula sonda antes del traslado a través de o por un nanoporo. En determinados casos, el método puede incluir el análisis de varios analitos en una sola muestra. Los segundos miembros de unión que se unen a los diferentes analitos en una muestra pueden incluir diferentes ADN o ARN monocatenarios fijados a los mismos como marcadores, y los diferentes ADN o ARN monocatenarios pueden hibridarse con diferentes sondas que distingan aún más los diferentes ADN o ARN monocatenarios entre sí a medida que atraviesen los nanoporos. En otras realizaciones, los marcadores fijados a los diferentes segundos miembros de unión pueden tener diferentes estructuras de horquilla (p. ej., longitud de la estructura de horquilla) que son distinguibles cuando los marcadores pasan a través de o por un nanoporo. En otra realización más, los marcadores fijados a los diferentes segundos miembros de unión pueden tener diferentes longitudes que sean distinguibles cuando los marcadores pasen a través de o por los nanoporos, por ejemplo, los marcadores pueden ser ADN bicatenario de diferentes longitudes (p. ej., 25 pb, 50 pb, 75 pb, 100 pb, 150 pb, 200 pb o más). En determinados casos, los marcadores fijados a los diferentes segundos miembros de unión pueden tener diferentes longitudes de polietilenglicol (PEG) o pueden ser ADN o ARN modificado diferencialmente con PEG.
Cabe señalar que la referencia a un marcador o una molécula de marcador abarca un solo marcador o una sola molécula de marcador, así como varios marcadores (pudiendo ser todos idénticos). Además, cabe señalar que el nanoporo abarca un solo nanoporo, así como varios nanoporos presentes en una sola capa, tal como, un sustrato, una membrana y similares. Como tal, el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de o por un nanoporo en una capa/lámina/membrana se refiere al recuento de varios marcadores que se trasladan a través de o por uno o más nanoporos de una capa/lámina/membrana. Los nanoporos pueden estar presentes en una sola capa, tal como un sustrato o una membrana, la capa puede estar hecha de cualquier material adecuado que sea eléctricamente aislante o que tenga una alta resistencia eléctrica, tal como una bicapa lipídica, un material dieléctrico, p. ej., nitruro de silicio y sílice, membrana atómicamente delgada tal como el grafeno, silicio, siliceno, disulfuro de molibdeno (MoS2), etc., o una combinación de los mismos.
El marcador puede tener cualquier tamaño o forma. En algunas realizaciones, el marcador puede ser una nanopartícula o una nanoperla de aproximadamente 10 y 950 nm de diámetro, p. ej., 20-900 nm, 30-800 nm, 40­ 700 nm, 50-600 nm, 60-500 nm, 70-400 nm, 80-300 nm, 90-200 nm, 100-150 nm, 200-600 nm, 400-500 nm, 2-10 nm, 2-4 nm o 3-4 nm de diámetro. El marcador puede ser esencialmente esférico, por ejemplo, una perla o nanoperla esférica o semiesférica. El marcador puede ser una proteína de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 50 kDa de tamaño, p. ej., de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 1,0 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 2,0 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 200 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 250 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 300 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 1,0 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 2,0 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 200 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 250 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 1,0 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 2,0 kDa a aproximadamente 250 kDa de tamaño, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 200 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 1,0 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 2,0 kDa a aproximadamente 200 kDa de tamaño, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1,0 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 2,0 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 0,5 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 0,8 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 1,0 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 2,0 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 90 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 70 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa, de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 90 kDa, de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 70 kDa, de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 60 kDa, de aproximadamente 40 kDa a aproximadamente 90 kDa, de aproximadamente 40 kDa a aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 40 kDa a aproximadamente 70 kDa o de aproximadamente 40 kDa a aproximadamente 60 kDa.
En determinadas realizaciones, el marcador puede ser una nanopartícula. Tal y como se indica en el presente documento, la nanopartícula se puede fijar reversiblemente (p. ej., escindiblemente) al segundo miembro de unión. En determinados aspectos, la nanopartícula puede ser una nanoperla de un diámetro definido que puede la propiedad de la nanoperla medida por la capa nanoporosa. En determinados casos, los métodos, sistemas y dispositivos de la presente divulgación se pueden utilizar para analizar simultáneamente una pluralidad de analitos diferentes en una muestra. Para dicho análisis se puede utilizar una pluralidad de segundos miembros de unión, cada uno de los cuales se une específicamente a un analito afín. Cada uno de los segundos miembros de unión diferentes puede unirse a una nanoperla de diferente tamaño que se puede utilizar para identificar el segundo miembro de unión. Por ejemplo, los diferentes marcadores de nanoperlas pueden tener diferentes diámetros, tales como, 1 nm, 2 nm, 4 nm, 6nm, 8 nm, 10 nm, 12 nm, 14 nm o mayores, tales como de hasta 20 nm, 30 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 950 nm o 990 nm.
En determinadas realizaciones, todas las nanoperlas de diferentes diámetros pueden trasladarse a través de una capa nanoporosa que tenga nanoporos de un solo diámetro, donde las nanoperlas de diferentes tamaños pueden identificarse en función de la duración de la residencia en el nanoporo, la magnitud de la impedancia de corriente o una combinación de las mismas. En determinados casos, un dispositivo de capas nanoporosas apiladas que contiene varias capas nanoporosas, donde una primera capa puede tener nanoporos de un primer diámetro y la segunda capa puede tener nanoporos de un segundo diámetro, se puede utilizar para detectar y contar las nanoperlas que se trasladan a través de o por los nanoporos. Las varias capas nanoporosas pueden disponerse de modo que la capa con nanoporos de mayor diámetro se coloque corriente arriba de la capa que tenga nanoporos de menor diámetro. En el documento US20120080361, se desvelan ejemplos de capas nanoporosas apiladas.
Los ejemplos de nanopartículas que se pueden utilizar como marcadores en los presentes métodos incluyen nanopartículas de oro o nanopartículas de poliestireno que varían en diámetro de 5 nm a 950 nm.
En determinados casos, el marcador puede ser un polímero, tal como, un ácido nucleico. La presencia del marcador se puede determinar detectando una característica de señal del marcador, tal como una señal relacionada con el tamaño o la longitud del marcador polimérico. El tamaño o la longitud del marcador polimérico se puede determinar midiendo su tiempo de residencia en el poro o canal, p. ej., midiendo la duración del bloqueo transitorio de la corriente.
Los elementos que pueden formar parte o todo, asociarse con o fijarse al marcador incluyen: una nanopartícula; partícula de oro; partícula de plata; recubrimiento o depósito de plata, cobre, zinc u otro metal; polímero; marcador de arrastre (como se define en el presente documento); partícula magnética; partícula flotante; partícula de metal; resto cargado; marcador de dielectroforesis, dióxido de silicio, con y sin impurezas (p. ej., cuarzo, vidrio, etc.); poli(metacrilato de metilo) (PMMA); poliimida; nitruro de silicio; oro; plata; punto cuántico (incluyendo punto cuántico CdS); punto de carbono; un fluoróforo; un inactivador; polímero; poliestireno; partícula de Janus; partícula de dispersión; partícula fluorescente; partícula fosforescente; esfera; cubo; aislante; conductor; partícula con código de barras o marcada; partícula porosa; partícula sólida; nanocubierta; nanovarilla; microesfera; analito tal como un virus, una célula, un parásito y un organismo; ácido nucleico; proteína; elemento de reconocimiento molecular; espaciador; PEG; dendrímero; modificador de la carga; material magnético; enzima; ADN que incluye secuencia de aptámeros; ADN amplificable; secuencia repetida de ADN; fusión o conjugado de elementos detectables con elementos de reconocimiento molecular (p. ej., miembro de unión diseñado); aptámero anti-anticuerpo; aptámero dirigido a proteína de unión a anticuerpo; compuesto detectable absorbido o adsorbido; hemo; luciferina; un fósforo; un azido o alquino (p. ej., alquino terminal o no terminal) u otro participante de química clic.
En determinadas realizaciones, el marcador se puede seleccionar para proporcionar una tasa de captura que sea lo suficientemente alta como para permitir un análisis rápido de una muestra. En determinadas realizaciones, la velocidad de captura del marcador puede ser de aproximadamente 1 evento cada 10 segundos, 1 evento cada 5 segundos, 1 evento por segundo o mayor. En determinadas realizaciones, se pueden utilizar marcadores de polímeros lineales, tales como polímeros de ribosa, polímeros de desoxirribosa, oligonucleótidos, ADN o ARN. Normalmente, para una solución de ADN 1 nM, las velocidades de captura son de aproximadamente 1 evento s-1 utilizando un nanoporo en estado sólido (Si3N4), sin gradiente de sal, una tensión de 200-800 mV y una concentración de sal (KCl) de 1 M.
En determinados casos, los marcadores de polímeros lineales, tales como, polímeros de ribosa, polímeros de desoxirribosa, oligonucleótidos, ADN o ARN puede que no se utilicen, ya que la velocidad de captura de estos marcadores puede ser demasiado baja para determinadas aplicaciones. Los marcadores que son de forma hemisférica, esférica o esencialmente esférica, se trasladan rápidamente a través de los nanoporos y, por lo tanto, acortan la duración del ensayo. En determinados casos, el tamaño del marcador esférico o hemisférico se puede seleccionar basándose en la velocidad de captura necesaria para el ensayo. Por ejemplo, para una mayor velocidad de captura, se pueden seleccionar marcadores esféricos o hemisféricos de mayor tamaño. En determinados casos, el marcador puede ser un marcador esférico, tal como, una nanopartícula/nanoperla que tenga una velocidad de captura de aproximadamente 10 veces, 30 veces, 50 veces, 100 veces, 300 veces, 500 veces o 1000 veces más rápida que la velocidad de captura de un marcador lineal, tal como, un marcador de ADN, en las mismas condiciones de medición.
En algunas realizaciones, el marcador puede estar conjugado con un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado de CPSP-anticuerpo. En algunas realizaciones, el marcador se puede conjugar a un anticuerpo con un espaciador, por ejemplo, un conjugado de CPSP-anticuerpo con un espaciador. En algunas realizaciones, el marcador puede estar conjugado con un oligonucleótido y un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo. En algunas realizaciones, el marcador puede estar conjugado con un oligonucleótido y un anticuerpo con un espaciador, por ejemplo, un conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo con espaciador. En algunas realizaciones, el marcador puede estar conjugado con un oligonucleótido, por ejemplo, un conjugado de oligonucleótidos de CPSP. En algunas realizaciones, el espaciador incluye un grupo nitrobencilo, ditioetilamino, espaciador de 6 átomos de carbono, espaciador de 12 átomos de carbono o 3-(9-((3-carboxipropil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato. En algunas realizaciones, el espaciador comprende un grupo nitrobencilo y el marcador es una molécula de ADN. En algunas realizaciones, el espaciador es ditioetilamino y el marcador es una nanopartícula carboxilada. En algunas realizaciones, el espaciador es 3-(9-((3-carboxipropil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato y el marcador es un oligonucleótido. En algunas realizaciones, el espaciador comprende un espaciador de 6 átomos de carbono o un espaciador de 12 átomos de carbono, y el marcador es biotina.
f) Enlazador escindible
Los marcadores utilizados en los métodos descritos en el presente documento se pueden unir a un miembro de unión específico mediante un enlazador genérico. El enlazador escindible garantiza que el marcador se pueda retirar. El enlazador genérico puede ser un enlazador escindible. Por ejemplo, el enlazador se puede unir al segundo miembro de unión mediante un enlazador escindible. El complejo de primer miembro de unión-analito-segundo miembro de unión puede exponerse a un agente de escisión que medie la escisión del enlazador escindible. El enlazador se puede escindir mediante cualquier método adecuado, incluyendo la exposición a ácidos, bases, nucleófilos, electrófilos, radicales, metales, agentes reductores u oxidantes, luz, temperatura, enzimas, etc. Los enlazadores adecuados se pueden adaptar a partir de grupos bloqueantes químicos convencionales, como los desvelados en Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons. Otros enlazadores escindibles adecuados utilizados en las síntesis en fase sólida se desvelan en Guillier et al., (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000). El enlazador puede ser escindible con ácido, escindible con base o fotoescindible. Una reacción rédox puede formar parte del esquema de escisión. El enlazador escindible puede ser un polímero cargado.
El enlazador puede ser un enlazador fotoescindible, un enlazador escindible químicamente o un enlazador escindible térmicamente. En realizaciones, el enlazador puede ser un enlazador escindible termosensible. Cuando el enlazador es un grupo fotoescindible, el agente de escisión puede ser luz de longitud de onda apropiada que rompa o escinda el grupo fotoescindible. En muchas realizaciones, la longitud de onda de la luz utilizada para escindir el grupo de enlace fotoescindible varía de aproximadamente 180 nm a 400 nm, p. ej., de aproximadamente 250 nm a 400 nm o de aproximadamente 300 nm a 400 nm. Es preferible que la luz requerida para activar la escisión no afecte a los otros componentes del analito. Los enlazadores adecuados incluyen aquellos basados en compuestos de O-nitrobencilo y compuestos de nitroveratrilo. También se pueden utilizar enlazadores basados en la química de la benzoína (Lee et al., J. Org. Chem. 64:3454-3460, 1999). En algunas realizaciones, el enlazador fotoescindible puede derivar del siguiente resto:
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Como alternativa, cuando el enlazador de escisión es un grupo escindible químicamente, el agente de escisión puede ser un agente químico capaz de escindir el grupo. Un enlazador escindible químicamente puede escindirse mediante escisión basada en oxidación/reducción, escisión catalizada por ácido, escisión catalizada por base o desplazamiento nucleofílico. Por ejemplo, cuando el grupo de enlace es un disulfuro, se puede utilizar la escisión mediada por tiol con ditiotreitol o betamercaptoetanol para liberar el marcador. En otras realizaciones más en las que el grupo de enlace es un sitio de restricción, el agente es un agente catalítico, tal como una enzima que puede ser una enzima hidrolítica, una enzima de restricción u otra enzima que escinda el grupo enlazador. Por ejemplo, la enzima de restricción puede ser de una enzima de restricción de tipo I, tipo II, tipo IIS, tipo III y tipo IV.
En algunas realizaciones, el enlazador de escisión es una secuencia escindible enzimática. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones del presente documento, una secuencia escindible enzimática es una secuencia de ácido nucleico de 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 nucleótidos de longitud En una realización, la secuencia escindible enzimática comprende una secuencia de al menos 10 nucleótidos. En una realización, la secuencia escindible enzimática comprende una secuencia de entre 2 y 20 nucleótidos. En una realización, la secuencia escindible enzimática comprende una secuencia de entre 2 y 15 nucleótidos. En una realización, la secuencia escindible enzimática comprende una secuencia de entre 4 y 10 nucleótidos. En una realización, la secuencia escindible enzimática comprende una secuencia de entre 4 y 15 nucleótidos.
Por ejemplo, el enlazador escindible puede ser un acridinio, éteres tales como éter bencílico sustituido o derivados del mismo (p. ej., éter bencilhidrílico, éter indanílico, etc.) que se pueden escindir mediante condiciones reductoras ácidas o suaves (por ejemplo, peróxido de hidrógeno para producir una acridona y una sulfonamida), un polímero cargado generado utilizando la eliminación de P, donde una base suave puede servir para liberar el producto, acetales, incluyendo sus análogos de tio, donde el desprendimiento se realiza con ácido suave, particularmente en presencia de un compuesto de carbonilo de captura, enlaces fotolábiles (p. ej., O-nitrobenzoílo, 7-nitroindanilo, éteres o ésteres de 2 -nitrobenzhidrilo, etc.) o enlazadores peptídicos, que están sujetos a hidrólisis enzimática (p. ej., enlazadores escindibles enzimáticos), particularmente cuando la enzima reconoce una secuencia específica, tal como un péptido para el factor Xa o enteroquinasa. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero sin limitación, enlazadores disulfuro, enlazadores lábiles a los ácidos (incluyendo enlazadores de dialcoxibencilo), enlazadores Sieber, enlazadores de indol, enlazadores Sieber de t-butilo, enlazadores escindibles electrofílicamente, enlazadores escindibles nucleofílicamente, enlazadores fotoescindibles, escisión en condiciones reductoras, condiciones oxidativas, escisión mediante el uso de enlazadores de captura de seguridad y escisión mediante mecanismos de eliminación.
Los enlazadores escindidos electrofílicamente normalmente son escindidos por protones e incluyen escisiones sensibles a los ácidos. Los enlazadores adecuados incluyen los sistemas bencílicos modificados tales como tritilo, ésteres de p-alcoxibencilo y amidas de p-alcoxibencilo. Otros enlazadores adecuados incluyen grupos terc-butiloxicarbonilo (Boc) y el sistema acetal. También se puede considerar el uso de metales tiofílicos, tales como níquel, plata o mercurio, en la escisión de tioacetal u otros grupos protectores que contienen azufre para la preparación de moléculas enlazadoras adecuadas.
Para la escisión nucleofílica, se pueden utilizar grupos tales como ésteres que sean lábiles en agua (es decir, que se puedan escindir simplemente a pH básico) y grupos que sean lábiles a nucleófilos no acuosos. Se pueden utilizar iones de fluoruro para escindir enlaces de silicio-oxígeno en grupos tales como el triisopropilsilano (TIPS) o el tbutildimetilsilano (Tb DMS).
Se puede utilizar un enlazador susceptible de escisión reductora tal como con la reducción del enlace disulfuro. Se ha utilizado la hidrogenación catalítica utilizando catalizadores a base de paladio para escindir los grupos bencilo y benciloxicarbonilo.
Los enfoques basados en la oxidación son bien conocidos en la técnica. Estos incluyen la oxidación de grupos palcoxibencilo y la oxidación de enlazadores de azufre y selenio. También se puede utilizar yodo acuoso para escindir disulfuros y otros enlazadores a base de azufre o selenio.
Los enlazadores de captura de seguridad son aquellos que se escinden en dos etapas. En un sistema preferido, la primera etapa es la generación de un centro nucleófilo reactivo seguido de una segunda etapa que implica una ciclación intramolecular que produce la escisión. Por ejemplo, los enlaces de éster levulínico se pueden tratar con hidrazina o fotoquímica para liberar una amina activa, que luego se puede ciclar para escindir un éster en otra parte de la molécula (Burgess et al., J. Org. Chem. 62:5165-5168, 1997).
También se pueden utilizar reacciones de eliminación. Por ejemplo, se puede utilizar la eliminación catalizada por bases de grupos tales como Fmoc y cianoetilo, y la eliminación reductora catalizada por paladio de sistemas alílicos.
Cuando el enlazador es un enlazador escindible térmicamente o un enlazador termosensible, el agente de escisión puede ser una elevación de la temperatura localizada por encima de un umbral para romper o escindir el grupo escindible térmicamente. En algunas realizaciones, la temperatura se puede elevar en una región localizada utilizando irradiación de microondas para inducir hipertermia en las partículas. Se pueden utilizar métodos de hipertermia de partículas tales como los revisados en Dutz y Hergt ("Nanotechnology", 25:452001 (2014)) y descritos en la patente de EE.UU. n.° 7.718.445, publicación de patente de EE. UU. n.° 20030082633, publicación de patente Internacional n.° WO 2002029076 y publicación de patente de EE.UU. n.° 20020197645. En algunas realizaciones, la elevación de la temperatura se puede lograr fototérmicamente transfiriendo energía desde la luz a un diana absorbente, tal como un colorante, pigmento o agua. En un aspecto, la fuente de luz es un láser. En algunas realizaciones, la temperatura elevada puede provocar la separación térmica del ADN bicatenario.
g) Capa nanoporosa
En la presente divulgación, la detección y/o el recuento del marcador (p. ej., polímero, aptámero, nanopartícula) se puede llevar a cabo mediante el traslado del marcador a través de o por un nanoporo o nanocanal. En algunas realizaciones, la detección y/o el recuento del marcador (p. ej., polímero, aptámero, nanopartícula) se puede llevar a cabo mediante el traslado del marcador a través de o por al menos uno o más nanoporos o nanocanales. En algunas realizaciones, al menos a o más nanoporos o nanocanales se presentan uno al lado del otro o en serie. En algunas realizaciones, el nanoporo o nanocanal está dimensionado para el traslado de no más de un marcador a la vez. Por tanto, en algunas realizaciones, las dimensiones del nanoporo normalmente dependerán de las dimensiones del marcador que se vaya a explorar. un marcador con una región bicatenaria puede requerir una dimensión del nanoporo mayor que las que bastan para el traslado de un marcador que sea totalmente monocatenario. Adicionalmente, un marcador de nanopartículas, tal como un marcador de nanoperlas, puede requerir poros o canales mayores a los de los marcadores oligoméricos. Normalmente, un poro de aproximadamente 1 nm de diámetro puede permitir el paso de un polímero monocatenario, mientras que las dimensiones de los poros de 2 nm de diámetro o mayores permitirán el paso de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. En algunas realizaciones, el nanoporo o nanocanal es selectivo de un marcador monocatenario (p. ej., de aproximadamente 1 nm a menos de 2 nm de diámetro) mientras que, en otras realizaciones, el nanoporo o nanocanal tiene un diámetro suficiente para permitir el paso de polinucleótidos bicatenarios (p. ej., 2 nm o mayores). El tamaño de poro seleccionado proporciona una relación señal-ruido óptima para el analito de interés.
En algunas realizaciones, el poro puede tener un diámetro de entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 1000 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 1000 nm, entre aproximadamente 100 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 700 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 700 nm, entre aproximadamente 100 nm y 700 nm, entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 500 nm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm o entre aproximadamente 100 nm y 500 nm. Por ejemplo, el poro puede ser de aproximadamente 0,1 nm, aproximadamente 0,2 nm, aproximadamente 0,3 nm, aproximadamente 0,4 nm, aproximadamente 0,5 nm, aproximadamente 0,6 nm, aproximadamente 0,7 nm, aproximadamente 0,8 nm, aproximadamente 0,9 nm, aproximadamente 1 ,0 nm, aproximadamente 1,5 nm, aproximadamente 2 , 0 nm, aproximadamente 2,5 nm, aproximadamente 3,0 nm, aproximadamente 3,5 nm, aproximadamente 4,0 nm, aproximadamente 4,5 nm, aproximadamente 5,0 nm, aproximadamente 7,5 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 40 nm, aproximadamente 45 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 55 nm, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 65 nm, aproximadamente 70 nm, aproximadamente 75 nm, aproximadamente 80 nm, aproximadamente 85 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 250 nm, aproximadamente 300 nm, aproximadamente 3500 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 450 nm, aproximadamente 500 nm, aproximadamente 550 nm, aproximadamente 600 nm, aproximadamente 650 nm, aproximadamente 700 nm, aproximadamente 750 nm, aproximadamente 800 nm, aproximadamente 850 nm, aproximadamente 900 nm, aproximadamente 950 nm o aproximadamente 1000 nm de diámetro.
En general, los nanoporos son más cortos que los nanocanales. Un nanocanal es esencialmente más largo que un nanoporo y puede ser útil en aplicaciones en las que sea deseable aumentar el tiempo que tarda una molécula en trasladarse a través de él (en comparación con el tiempo de traslado a través de o por un nanoporo del mismo diámetro). La longitud de un nanoporo puede variar de aproximadamente 0,1 nm a menos de aproximadamente 200 nm. La longitud de un nanocanal puede variar de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 100 pm, o más. El diámetro de un nanoporo y de un nanocanal pueden ser similares.
Se pueden utilizar diversos tipos de nanoporos para analizar los marcadores/aptámero. Estos incluyen, entre otros, nanoporos biológicos que emplean un poro o canal biológico embebido en una membrana. Otro tipo de capa nanoporosa es un nanoporo en estado sólido en el que el canal o poro está hecho en su totalidad o en parte de un componente en estado sólido fabricado o esculpido, tal como silicio. En algunas realizaciones, el nanoporo es un nanoporo en estado sólido producido utilizando la descomposición dieléctrica controlada. En algunas realizaciones, el nanoporo es un nanoporo en estado sólido producido mediante un método distinto de la descomposición dieléctrica controlada.
En determinadas realizaciones, la longitud de un nanoporo puede ser de hasta aproximadamente 200 nm, p. ej., de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 0,5 nm, de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 2 nm, de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm. El número de nanoporos de una capa nanoporosa puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000, 30000, 100000, 300000 o más. La distancia entre los nanoporos de una capa de centro a centro puede ser de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 1000 nm, por ejemplo, 100 nm, 150 nm, 200 nm o 300 nm.
En determinadas realizaciones, varias capas nanoporosas, conteniendo cada una uno o más nanoporos, se pueden disponer en serie entre sí, para detectar y/o contar el marcador (p. ej., polímero, aptámero, nanopartícula). En este caso, la detección y/o el recuento del marcador se puede llevar a cabo trasladando el marcador a través de o por cada capa nanoporosa. Como tal, el recuento del número de marcadores que se trasladan a través de o por un nanoporo en una capa/lámina/membrana se refiere al recuento de varios marcadores que se trasladan a través de o por uno o más nanoporos de una o más capas/láminas/membranas. En determinadas realizaciones, cuando hay más de una capa nanoporosa (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis u otro número de capas nanoporosas según sea técnicamente viable), opcionalmente, están presentes en serie, en donde al menos un nanoporo de una capa está separado de o apilado en (p. ej., sobre o encima de) otro nanoporo de otra capa, etc.). Cuando las capas nanoporosas están en serie, se pueden utilizar al menos dos electrodos para crear un campo eléctrico para conducir marcadores a través de los poros y, opcionalmente, electrodos adicionales colocados entre las capas nanoporosas pueden proporcionar mayor corriente de conducción.
i) Poros biológicos
Para detectar y, opcionalmente, contar los marcadores/aptámero, se puede utilizar cualquier poro biológico con dimensiones de canal que permitan el traslado de los marcadores. Dos amplias categorías de canales biológicos son adecuadas para los métodos desvelados en el presente documento. Los canales no controlados por tensión permiten el paso de moléculas a través del poro sin requerir un cambio en el potencial de la membrana para activar o abrir el canal. Por otra parte, los canales controlados por tensión requieren un intervalo particular de potencial de membrana para activar la apertura del canal. La mayoría de los estudios con nanoporos biológicos han utilizado a-hemolisina, un canal heptamérico homo-oligomérico en forma de hongo de aproximadamente 10 nm de longitud que se encuentra en Staphylococcus aureus. Cada subunidad aporta dos cadenas beta para formar un barril beta antiparalelo de 14 cadenas. El poro formado por la estructura de barril beta tiene una entrada con un diámetro de aproximadamente 2 .6 nm que contiene un anillo de restos de lisina y abre a una cavidad interna con un diámetro de aproximadamente 3.6 nm. El tallo del poro de hemolisina, que penetra en la bicapa lipídica, tiene un diámetro interior medio de aproximadamente 2,0 nm con una constricción de 1,5 nm entre el portal y el tallo. Las dimensiones del tallo son suficientes para el paso de ácidos nucleicos monocatenarios, pero no de ácidos nucleicos bicatenarios. Por tanto, los poros de a-hemolisina se pueden utilizar como un nanoporo selectivo para polinucleótidos monocatenarios y otros polímeros de dimensiones similares.
En otras realizaciones, el nanoporo biológico tiene una dimensión suficiente para el paso de polímeros mayores que un ácido nucleico monocatenario. Un ejemplo de poro es la proteína porina mitocondrial, un canal aniónico dependiente de la tensión (VDAC, Voltage Dependent Anion Channel) ubicado en la membrana externa mitocondrial. La proteína porina está disponible en forma purificada y, cuando se reconstituye en bicapas lipídicas artificiales, genera canales funcionales capaces de permitir el paso de ácidos nucleicos bicatenarios (Szabo et al., 1998, FASEB J. 12:495-502). Los estudios estructurales sugieren que la porina también tiene una estructura de tipo barril beta con 13 o 16 cadenas (Rauch et al., 1994, Biochem Biophys Res Comm 200:908-915). La porina muestra una conductancia mayor en comparación con la conductancia de los poros formados por la a-hemolisina, maltoporina (LamB) y gramicidina. Las propiedades de mayor conductancia de la porina respaldan los estudios que muestran que el canal de la porina está suficientemente dimensionado para el paso de ácidos nucleicos bicatenarios. El diámetro de poro de la molécula de porina se estima en 4 nm. Se estima que el diámetro de un ácido nucleico bicatenario no enrollado es de aproximadamente 2 nm.
Otro canal biológico que puede ser adecuado para escanear polinucleótidos bicatenarios son los canales que se encuentran en B. subtilis (Szabo et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:25275-25282). Las vesículas de la membrana plasmática creadas a partir de B. subtilis e incorporadas a membranas artificiales permiten el paso del ADN bicatenario por la membrana. La conductancia de los canales formados por las preparaciones de membrana de B. subtilis es similar a las de la porina mitocondrial. Aunque hay una caracterización incompleta (p. ej., forma purificada) de estos canales, no es necesario tener formas purificadas para los fines del presente documento. Mediante la dilución de preparaciones de membranas plasmáticas, ya sea disolviéndolas en detergentes apropiados o incorporándolas a membranas lipídicas artificiales de suficiente superficie, se pueden aislar canales individuales en un aparato de detección. La limitación de la duración del contacto de las preparaciones de membranas (o preparaciones de proteínas) con las membranas artificiales mediante lavados en el momento adecuado proporciona otro método para incorporar canales individuales a las bicapas lipídicas artificiales. Se pueden utilizar propiedades de conductancia para caracterizar los canales incorporados a la bicapa.
En determinados casos, los nanoporos pueden ser nanoporos híbridos, en los que se introduce un poro biológico en un nanoporo en estado sólido, p. ej., un nanoporo fabricado con un material no biológico. Por ejemplo, se puede introducir un poro de a-hemolisina en un nanoporo en estado sólido. En determinados casos, los nanoporos pueden ser un nanoporo híbrido descrito en Hall et al., Nature Nanotechnology, 28 de noviembre de 2010, vol. 5, pág. 874­ 877.
ii) Poros en estado sólido
En otras realizaciones, el análisis de los marcadores se lleva a cabo mediante el traslado del marcador a través de o por un nanoporo o nanocanal fabricado a partir de materiales no biológicos. Los nanoporos o nanocanales se pueden fabricar a partir de una variedad de materiales en estado sólido utilizando una serie de técnicas diferentes, incluyendo, entre otras, deposición química, deposición electroquímica, electrodeposición en placa, esculpido por haz de electrones, esculpido por haz de iones, nanolitografía, grabado químico, ablación con láser, haz de iones enfocado, deposición de capa atómica y otros métodos bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Li et al., 2001, Nature 412:166-169; y documento WO 2004/085609).
En realizaciones específicas, los nanoporos pueden ser los nanoporos descritos en los documentos WO13167952A1 o WO13167955A1. Como se describe en los documentos WO13167952A1 o WO13167955A1, se pueden formar nanoporos que tengan un tamaño de poro exacto y uniforme agrandando con precisión un nanoporo formado en una membrana. El método puede implicar agrandar un nanoporo aplicando un alto potencial eléctrico por el nanoporo; medir la corriente que fluye a través del nanoporo; determinar el tamaño del nanoporo basándose en parte en la corriente medida; y retirar el potencial eléctrico aplicado al nanoporo cuando el tamaño del nanoporo corresponda al tamaño deseado. En determinados casos, el potencial eléctrico aplicado puede tener una forma de onda pulsada que oscile entre un valor alto y un valor bajo, pudiéndose medir la corriente que fluye a través del nanoporo mientras se aplica el potencial eléctrico al nanoporo a un valor bajo.
Los materiales en estado sólido incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, cualquier material semiconductor conocido, materiales aislantes y metales recubiertos con material aislante. Por tanto, al menos parte del/de los nanoporo/s puede comprender, sin limitación, silicio, sílice, siliceno, óxido de silicio, grafeno, nitruro de silicio, germanio, arseniuro de galio o metales, óxidos metálicos y coloides metálicos recubiertos con material aislante.
Para crear un poro de dimensiones nanométricas, se pueden emplear diversos procedimientos de retroalimentación en el proceso de fabricación. En realizaciones en las que los iones pasan a través de un orificio, la detección del flujo de iones a través del material en estado sólido proporciona una forma de medir el tamaño de los poros generados durante la fabricación (véase, p. ej., solicitud publicada de EE.UU. n.° 2005/0126905). En otras realizaciones, en las que los electrodos definen el tamaño del poro, la corriente de efecto túnel electrónico entre los electrodos aporta información sobre la distancia entre los electrodos. Los aumentos en la corriente de efecto túnel indican una disminución en el espacio de separación entre los electrodos. Otras técnicas de retroalimentación resultarán evidentes para el experto en la materia.
En algunas realizaciones, el nanoporo se fabrica mediante la esculpido por haz de iones, como se describe en Li et al., 2003, Nature Materials 2:611-615. En algunas realizaciones, el nanoporo se fabrica utilizando una corriente alta, como se describe en los documentos WO13167952A1 o WO13167955A1. En otras realizaciones, los nanoporos se pueden crear mediante una combinación de litografía por haz de electrones y esculpido por haz de electrones de alta energía (véase, p. ej., Storm et al., 2003, Nature Materials 2:537-540). Un enfoque similar para generar un nanoporo adecuado mediante la técnica de pulverización catódica por haz de iones se describe en Heng et al., 2004, Biophy J 87:2905-2911. Los nanoporos se forman utilizando litografía con un haz de electrones de alta energía enfocado en semiconductor de óxido metálico (CMOS, Complementary Metal Oxide Semiconductor [semiconductor complementario de óxido metálico]), combinado con técnicas generales para producir películas ultrafinas. En otras realizaciones, el nanoporo se construye como se proporciona en las patentes de EE.Uu . n.° 6.627.067; 6464842; 6783643; y la publicación de EE.UU. n.° 2005/0006224 mediante esculpido de nitruro de silicio.
En algunas realizaciones, los nanocanales se pueden construir como un nanotubo de oro o plata. Estos nanocanales se forman utilizando una plantilla de material poroso, tal como filtros de policarbonato preparados utilizando un método de grabado de pistas y depositando oro u otro metal adecuado sobre la superficie del material poroso. Las membranas de policarbonato grabadas en pistas normalmente se forman exponiendo un material de membrana sólido a partículas nucleares de alta energía, lo que crea pistas en el material de la membrana. A continuación, se emplea el grabado químico para convertir las pistas grabadas en poros. Los poros formados tienen un diámetro de aproximadamente 10 nm y mayor. El ajuste de la intensidad de las partículas nucleares controla la densidad de los poros formados en la membrana. Se forman nanotubos en la membrana grabada depositando un metal, normalmente oro o plata, en los poros grabados en las pistas mediante un método de metalizado no electrolítico (Menon et al., 1995, Anal Chem 67:1920-1928). Este método de deposición de metales utiliza un catalizador depositado en la superficie del material poroso, que luego se sumerge en una solución que contiene Au (I) y un agente reductor. La reducción de Au (I) a Au metálico se produce en superficies que contienen el catalizador. La cantidad de oro depositado depende del tiempo de incubación, de modo que al aumentar el tiempo de incubación, se reduce el diámetro interior de los poros del material filtrante. Por tanto, se puede controlar el tamaño de poro ajustando la cantidad de metal depositado en el poro. La dimensión de los poros resultantes se mide utilizando diversas técnicas, por ejemplo, propiedades de transporte de gases utilizando difusión simple o midiendo el flujo de iones a través de los poros utilizando sistemas de pinzamiento zonal. El material de soporte se deja intacto o se retira para dejar nanotubos de oro. La técnica de metalizado no electrolítico es capaz de formar tamaños de poro de menos de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 5 nm de diámetro, o mayores según se requiera. Los nanotubos de oro que tienen un diámetro de poro de aproximadamente 0,6 nm parecen distinguir entre R(bpy)2+2 y viológeno metílico, demostrando la selectividad de los nanoporos de oro (Jirage et al., 1997, Science 278:655-658). La modificación de la superficie de un nanotubo de oro se realiza fácilmente fijando compuestos que contienen tiol a la superficie del oro o derivatizando la superficie de oro con otros grupos funcionales. Este rasgo distintivo permite la fijación de compuestos modificadores de poros, así como los marcadores de detección, como se analiza en el presente documento. Se pueden utilizar dispositivos, tales como los aparatos cis/trans utilizadospara los poros biológicos descritos en el presente documento, con los nanoporos de oro para analizar moléculas de un solo código.
Cuando el modo de detección del marcador implica un flujo de corriente a través del marcador (p. ej., corriente de efecto túnel electrónico), la membrana en estado sólido puede metalizarse mediante diversas técnicas. La capa conductora puede depositarse en ambos lados de la membrana para generar electrodos adecuados para interrogar al marcador a lo largo de la cadena, por ejemplo, corriente de efecto túnel electrónico longitudinal. En otras realizaciones, la capa conductora se puede depositar en una superficie de la membrana para formar electrodos adecuados para interrogar al marcador a través del poro, por ejemplo, corriente de efecto túnel transversal. Se conocen diversos métodos para depositar materiales conductores, incluyendo, deposición por pulverización catódica (es decir, deposición física de vapor), deposición no electrolítica (p. ej., suspensiones coloidales) y deposición electrolítica. Otras técnicas de deposición de metales son la evaporación de filamentos, evaporación de la capa metálica, evaporación por haz de electrones, evaporación instantánea y evaporación por inducción, y serán evidentes para el experto en la materia.
En algunas realizaciones, los electrodos de detección se forman mediante deposición por pulverización catódica, en la que un haz de iones bombardea un bloque de metal y vaporiza átomos de metal, que luego se depositan sobre un material de oblea en forma de película delgada. Dependiendo del método de litografía que se utilice, a continuación, las películas metálicas se graban mediante grabado con iones reactivos o se pulen utilizando pulido químico-mecánico. Las películas metálicas se pueden depositar sobre nanoporos preformados o depositar antes de la fabricación del poro.
En algunas realizaciones, los electrodos de detección se fabrican por electrodeposición (véase, p. ej., Xiang et al., 2005, Angew. Chem. Int. Ed. 44:1265-1268; Li et al., Applied Physics Lett. 77(24):3995-3997; y solicitud de publicación de EE.UU. n.° 2003/0141189). Este proceso de fabricación es adecuado para generar un nanoporo y los correspondientes electrodos de detección colocados en una cara de la película en estado sólido, tal como, por ejemplo, para detectar el efecto túnel electrónico transversal. Inicialmente, se utiliza un proceso litográfico convencional para formar un par de electrodos enfrentados sobre una capa de dióxido de silicio que se apoya en una oblea de silicio. Una solución de electrolitos cubre los electrodos, y se depositan iones metálicos sobre uno de los electrodos haciendo pasar corriente a través del par de electrodos. La deposición de metal sobre los electrodos disminuye a lo largo del tiempo la distancia de separación entre los electrodos, creando no solo electrodos de detección, sino un espacio nanométrico dimensionado para el traslado de moléculas codificadas. La distancia de separación entre los electrodos se puede controlar mediante una serie de procesos de retroalimentación.
Cuando la detección se basa en imágenes de efectos de campo inducidos por carga, se puede fabricar un semiconductor como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.413.792 y la solicitud publicada en EE.UU. n° 2003/0211502. Los métodos de fabricación de estos dispositivos nanoporosos pueden utilizar técnicas similares a las empleadas para fabricar otros nanoporos en estado sólido.
La detección del marcador, tal como un polinucleótido, se lleva a cabo como se describe a continuación. Para el análisis del marcador, el nanoporo se puede configurar en diversos formatos. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una membrana, ya sea biológica o en estado sólido, que contiene el nanoporo sostenido entre dos depósitos, también conocidos como cámaras cis y trans (véase, p. ej., la patente de EE.UU. n.° 6.627.067). Un conducto para la migración de electrones entre las dos cámaras permite el contacto eléctrico de las dos cámaras, y una polarización de la tensión entre las dos cámaras impulsa el traslado del marcador a través de los nanoporos. Se utiliza una variación de esta configuración en el análisis del flujo de corriente a través de los nanoporos, como se describe en las patentes de EE.UU. n.° 6.015.714 y 6.428.959; y Kasianowiscz etal., 1996, ProcNatlAcadSci, EE.UU., 93:13770-13773.
En la publicación de solicitud de EE. UU. n°. 2003/0141189, se desvelan variaciones del dispositivo anterior. Un par de nanoelectrodos, fabricados por electrodeposición, se coloca sobre una superficie de sustrato. Los electrodos están enfrentados entre sí y tienen una distancia de separación suficiente para el paso de un solo ácido nucleico. Un material aislante protege los nanoelectrodos, dejando al descubierto solo las puntas de los nanoelectrodos para la detección del ácido nucleico. El material aislante y los nanoelectrodos separan una cámara que sirve como depósito de muestras y una cámara a la que se administra el polímero mediante traslado. Los electrodos de cátodo y ánodo proporcionan un campo eléctrico de electroforesis para impulsar el marcador desde la cámara de muestras hasta la cámara de administración.
La polarización de la corriente utilizada para impulsar el marcador a través del nanoporo se puede generar aplicando un campo eléctrico dirigido a través del nanoporo. En algunas realizaciones, el campo eléctrico es una polarización de la tensión constante o de la corriente constante. En otras realizaciones, el movimiento del marcador se controla mediante una operación pulsada de los parámetros del campo eléctrico de electroforesis (véase, p. ej., la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2003/141189 y la patente de e E.UU. n.° 6.627.067). Los pulsos de corriente pueden proporcionar un método de traslado preciso de una o solo unas cuantas bases de un marcador oligonucleotídico durante un período de tiempo definido a través del poro y retener brevemente el marcador dentro del poro y, por lo tanto, proporcionar una mayor resolución de las propiedades eléctricas del marcador.
Los dispositivos nanoporosos pueden comprender además un campo eléctrico o electromagnético para restringir la orientación del marcador oligonucleotídico cuando pasa a través del nanoporo. Este campo de retención se puede utilizar para disminuir el movimiento del marcador oligonucleotídico dentro del poro. En algunas realizaciones, se proporciona un campo eléctrico que es ortogonal a la dirección del traslado para restringir el movimiento de la molécula de marcador dentro del nanoporo. Esto se ilustra en la publicación de solicitud de EE.UU. n.° 2003/0141189 mediante el uso de dos placas conductoras paralelas encima y debajo de la placa de muestra. Estos electrodos generan un campo eléctrico ortogonal a la dirección de traslado de una molécula de marcador y, por lo tanto, retienen la molécula de marcador en una de las placas de muestra. Una estructura principal cargada negativamente de un ADN, o un ácido nucleico modificado para tener cargas negativas sobre una cadena, se orientará sobre la placa anódica, limitando así el movimiento de la molécula de marcador.
En otras realizaciones más, el control de la posición del marcador se lleva a cabo mediante el método descrito en la publicación de solicitud de EE. UU. n.° 2004/0149580, que emplea un campo electromagnético creado en el poro por medio de una serie de posiciones de electrodos cerca o encima del nanoporo. En estas realizaciones, un conjunto de electrodos aplica una tensión de corriente continua y un potencial de radiofrecuencia mientras que un segundo conjunto de electrodos aplica una tensión de corriente continua opuesta y un potencial de radiofrecuencia que tiene un desfase de 180 grados con respecto al potencial de radiofrecuencia generado por el primer conjunto de electrodos. Este cuadrupolo de radiofrecuencia contiene una partícula cargada (p. ej., ácido nucleico) en el centro del campo (es decir, centro del poro).
En ejemplos de realización, la membrana nanoporosa puede ser una pila multicapa de capas conductoras y capas dieléctricas, en la que una capa conductora embebida o puertas de capa conductora proporcionan un campo eléctrico medible y bien controlado dentro y alrededor del nanoporo a través del cual se traslada el marcador. En un aspecto, la capa conductora puede ser grafeno. Se encuentran ejemplos de membranas nanoporosas apiladas en los documentos US20080187915 y US20140174927, por ejemplo.
Se entiende que el nanoporo puede estar ubicado en una membrana, capa u otro sustrato, cuyos términos se han utilizado indistintamente para describir un sustrato bidimensional que comprende un nanoporo.
En determinadas realizaciones, el nanoporo se puede formar como parte del proceso de ensayo para detectar y/o determinar la concentración de un analito utilizando el nanoporo. Específicamente, un dispositivo para detectar y/o determinar la concentración de un analito utilizando un nanoporo se puede proporcionar inicialmente sin un nanoporo formado en una membrana o capa. El dispositivo puede incluir una membrana que separe dos cámaras en los lados opuestos de la membrana (una cámara cis y una cámara trans). Las cámaras cis y trans pueden incluir una solución salina y pueden estar conectadas a una fuente de electricidad. Cuando se va a crear un nanoporo en la membrana, se aplica una tensión a la solución salina de la cámara cis y trans, y se mide la conductancia a través de la membrana. Antes de la creación de un nanoporo, no hay corriente o hay una corriente mínima medida por la membrana. Tras la creación de un nanoporo, la corriente medida por la membrana aumenta. La tensión se puede aplicar durante un tiempo suficiente para crear un nanoporo del diámetro deseado. Tras la creación de un nanoporo, se puede trasladar un analito o marcador a través del nanoporo y se puede detectar el evento de traslado. En determinadas realizaciones, la misma solución salina se puede utilizar para la creación de nanoporos, así como para la detección del traslado de un analito o marcador a través del nanoporo. Se puede utilizar cualquier solución salina adecuada para la creación de nanoporos y/o el traslado de un analito o marcador a través del nanoporo. Se puede utilizar cualquier solución salina que no dañe el marcador de recuento. Los ejemplos de soluciones salinas incluyen cloruro de litio, cloruro de potasio, cloruro sódico, cloruro cálcico, cloruro de magnesio y similares. La concentración de la solución salina se puede seleccionar basándose en la conductividad deseada de la solución salina. En determinadas realizaciones, la solución salina puede tener una concentración que varíe de 1 mM a 10 M, p. ej., 10 mM-10 M, 30 mM-10 M, 100 mM-10 M, 1 M-10 M, 10 mM-5 M, 10 mM-3 M, 10 mM-1 M, 30 mM-5 M, 30 mM-3 M, 30 mM-1 M, 100 mM-5 M, 100 mM-3 M, 100 mM-1 M, 500 mM-5 M, 500 mM-3 M o 500 mM-1 M, tal como, 10 mM, 30 mM, 100 mM, 500 mM, 1 M, 3 M, 5 M o 10 M.
En algunas realizaciones, el nanoporo puede bloquearse, y el nanoporo bloqueado se elimina modulando el patrón de tensión aplicado por los electrodos por la capa o membrana nanoporosa. En algunos casos, un nanoporo bloqueado se elimina invirtiendo la polaridad de la tensión por la capa o membrana nanoporosa. En algunos casos, un nanoporo bloqueado se elimina aumentando la magnitud de la tensión aplicada por la capa o membrana nanoporosa. El aumento de la tensión puede ser un aumento transitorio, que dure 10 segundos (s) o menos, p. ej., 8 s o menos, 6 s o menos, 5 s o menos, 4 s o menos, 3 s o menos, 2 s o menos, 1 s o menos, 0,5 s o menos, 0,4 s o menos, 0,3 s o menos, 0 , 2 s o menos, incluso 0 ,1 s o menos.
h) Detección de señales
La interrogación del marcador/aptámero por traslado a través de un nanoporo y la detección de la propiedad detectable genera una señal que se puede utilizar para contar (es decir, determinar la cantidad o concentración) y/o identificar (es decir, determinar la presencia de) el marcador/aptámero. El tipo de método de detección empleado puede corresponder a la propiedad que se esté detectando para los marcadores.
En algunas realizaciones, la propiedad detectable es el efecto del marcador sobre las propiedades eléctricas del nanoporo cuando el marcador se desplaza a través del poro. Las propiedades eléctricas del nanoporo incluyen, entre otras, amplitud de corriente, impedancia, duración y frecuencia. En determinados casos, el marcador se puede identificar mediante el uso de espectroscopia de fuerza de nanoporos (véase, por ejemplo, Tropini C. y Marziali A., Biophysical Journal, 2007, Vol. 92, 1632-1637). Los dispositivos para detectar las propiedades eléctricas del poro pueden incluir un nanoporo incorporado en una capa tal como, una película delgada o una membrana, donde la película o membrana separa una cámara cis y una cámara trans conectadas por un puente conductor. El marcador que se va a analizar puede estar presente en el lado cis del nanoporo en una solución acuosa que normalmente comprende una o más sales disueltas, tal como cloruro de potasio. La aplicación de un campo eléctrico por el poro utilizando electrodos colocados en el lado cis y trans del nanoporo provoca el traslado del marcador a través del nanoporo, lo que afecta a la migración de iones a través del poro, alterando así las propiedades eléctricas del poro. La corriente se puede medir a una frecuencia de tiempo adecuada para obtener suficientes puntos de datos para detectar un patrón de señales de corriente. El patrón de señales generado se puede comparar luego con un conjunto de patrones de referencia en donde cada patrón de referencia se obtiene del examen de una sola población de marcadores conocidos unidos al analito en una muestra con una concentración de analito conocida. Como se ha indicado previamente, se puede contar el número de marcadores del mismo tipo que se trasladan a través de uno o varios nanoporos por unidad de tiempo, tal como, el número de marcadores del mismo tipo que se trasladan a través de o por uno o varios nanoporos cada 15 min, 13 min, 10 min, 8 min, 6 min, 4 min, 2 min, 1 min, 30 s, cada 20 s, cada 15 s, cada 10 s, cada 5 s, cada 1 s, cada 100 ms, cada 10 ms o cada 1 ms. En algunos casos, se puede contar el número de marcadores del mismo tipo que se trasladan a través de uno o varios nanoporos durante un determinado período de tiempo para determinar la cantidad de tiempo hasta alcanzarse un recuento de umbral. Los cambios en la amplitud de la corriente, duración de la corriente, frecuencia de la corriente y magnitud de la corriente pueden definir un patrón de señales para el marcador y se pueden utilizar para distinguir diferentes marcadores entre sí. La medición de las propiedades de la corriente de un nanoporo, tal como mediante técnicas de pinzamiento zonal, se describe en las publicaciones analizadas anteriormente y en diferentes obras de referencia, por ejemplo, Hille, B, 2001, "Ion Channels of Excitable Membranes", 3a Ed., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass. El número de recuentos medidos durante un período de tiempo (recuentos/tiempo) es proporcional a la concentración de la molécula (p. ej., marcador) que se traslada a través del o por el nanoporo. La concentración del marcador se puede determinar generando una curva patrón. Por ejemplo, se puede trasladar una serie de concentraciones diferentes de una molécula patrón a través de un nanoporo y se pueden medir los recuentos/tiempo para calcular una tasa de recuento para cada concentración. La tasa de recuento del marcador que se mide se compararía con la curva patrón para calcular la concentración del marcador.
En algunas realizaciones, la propiedad detectable del marcador puede ser un efecto túnel cuántico de electrones. El efecto túnel cuántico es el efecto mecánico-cuántico de la transición a través de un estado de energía clásicamente prohibido mediante las propiedades de onda cuántica de una partícula. El efecto túnel electrónico se produce cuando existe una barrera potencial para el movimiento de electrones entre un donante y un aceptor. Para detectar la efecto túnel electrónico, se puede colocar una punta de electrodo microfabricada a aproximadamente 2 nanómetros de la muestra. A una distancia de separación adecuada, los electrones hacen un túnel a través de la región entre la punta y la muestra, y si se aplica una tensión entre la punta y la muestra, una corriente neta de electrones (es decir, corriente de efecto túnel) fluye a través del espacio en la dirección de la polarización de la tensión. Cuando el nanodispositivo utiliza electrodos de detección para medir la corriente de efecto túnel, los electrodos se colocan cerca del marcador de traslado de modo que haya un efecto túnel electrónico entre los electrodos de detección y el marcador. Como se analiza en más detalle a continuación, la disposición de los electrodos con respecto al marcador de traslado puede dictar el tipo de transporte de electrones que se produce a través del marcador.
En algunas realizaciones, el análisis del marcador puede implicar la detección del flujo de corriente que se produce a través de la cadena de ácido nucleico (es decir, longitudinalmente a lo largo de la cadena de ácido nucleico) (Murphy et al., 1994, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91(12):5315-9). Se desconoce el mecanismo exacto de transferencia electrónica, aunque el efecto túnel electrónico se da como una explicación de las propiedades de transporte del ADN. Sin embargo, la física subyacente al transporte de electrones a través de un ácido nucleico bicatenario no es limitativa para los fines del presente documento, y la detección de la corriente que fluye a través del ácido nucleico sirve para distinguir un marcador polimérico de otro marcador polimérico. Para la detección del flujo de electrones que se produce longitudinalmente a través de la cadena de la molécula de marcador, los electrodos de detección se pueden colocar longitudinalmente en la dirección del traslado de la molécula de marcador de modo que haya un espacio entre los electrodos paralelo a la cadena de una molécula de marcador extendida. En diversas realizaciones, los electrodos de detección se pueden colocar en lados opuestos de una o varias capas (p. ej., membrana) que separan los dos lados del nanoporo, mientras que, en otras realizaciones, los electrodos de detección se pueden colocar dentro de la/s capa/s que separa/n los dos lados del nanoporo.
Otro modo de flujo de electrones en un ácido nucleico es el que se produce por el ácido nucleico, por ejemplo, una dirección transversal a una cadena de ácido nucleico extendida (p. ej., por el diámetro de un ácido nucleico bicatenario). En un ácido nucleico bicatenario, el transporte de electrones se puede producir a través de las bases emparejadas mientras que, en un ácido nucleico monocatenario, el transporte de electrones se puede producir a través de una sola base no emparejada. Asimismo, las diferencias en las composiciones químicas, las estructuras de hidratación, las interacciones con iones cargados, la orientación espacial de cada base y las diferentes combinaciones de emparejamiento de bases pueden alterar las características de transporte de los electrones transversales y, por tanto, proporcionar una base para distinguir las moléculas de marcador que difieren en la secuencia y/o la estructura principal polimérica. Para la detección del flujo de electrones por una molécula de marcador (es decir, transversalmente a una cadena de ácido nucleico extendida), los electrodos de detección están colocados en un lado del nanoporo para interrogar a la molécula de marcador por en lugar de a través del nanoporo.
En realizaciones de detección longitudinal o transversal, el espesor de los electrodos puede determinar el número total de bases interrogadas por los electrodos. Para la detección transversal, se pueden dimensionar las puntas de los electrodos de detección para interrogar a una sola base nucleica (como se define en el presente documento) y, por lo tanto, obtener una resolución de una sola base. En otras realizaciones, las dimensiones del electrodo de detección están dispuestas para interrogar a más de una nucleobase. Por tanto, en algunas realizaciones, el número de nucleobases interrogadas en cualquier momento puede ser de aproximadamente 2 o más, aproximadamente 5 o más, aproximadamente 10 o más, o aproximadamente 20 o más, dependiendo de la resolución requerida para detectar diferencias en las diversas secuencias poliméricas de la molécula de marcador.
En otras realizaciones, las diferencias en la estructura de un marcador pueden detectarse como diferencias en la capacitancia. Este tipo de medición se ilustra en el documento US2003/0141189. La capacitancia provoca un cambio de fase en una tensión de CA aplicada a una frecuencia e impedancia aplicadas definidas. Se determinan las características de cambio de fase para cada nucleobase para ácidos nucleicos de secuencia y estructura conocidas, y se utilizan como patrones de referencia para identificar características de bases individuales. El análisis del vecino más cercano puede permitir que las mediciones de capacitancia se extiendan a más de una sola nucleobase.
En otras realizaciones, la técnica de detección se puede basar en imágenes de campos inducidos por la carga, como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.413.792 y la solicitud publicada en EE.UU. n° 2003/0211502. Para detectar un marcador basándose en los campos inducidos por la carga, se utiliza un dispositivo semiconductor descrito anteriormente. La aplicación de una tensión entre una región fuente y una región de drenaje produce un flujo de corriente desde la fuente al drenaje si se forma un canal para el flujo de corriente en el semiconductor. Debido a que cada nucleobase tiene una carga asociada, el paso de una molécula de marcador a través del poro del semiconductor induce un cambio en la conductividad del material semiconductor que reviste el poro, induciendo así una corriente de una magnitud y forma de onda especificadas. Las diferentes bases producen corrientes de diferente magnitud y forma de onda debido a las diferencias en la carga, distribución de carga y tamaño de las bases. En las realizaciones desveladas en la patente de EE.UU. n.° 6.413.792, el polímero pasa a través de un poro formado por una capa de silicio de tipo p. El traslado de la molécula de marcador se realiza mediante métodos similares a los utilizados para mover un polímero a través de otros tipos de canales, como se ha descrito anteriormente. Se espera que la magnitud de la corriente sea del orden del intervalo de los microamperios, que es mucho más alta que las corrientes de picoamperios esperadas detectadas mediante el efecto túnel electrónico. Debido a que las regiones de bloques de polímero de la molécula de marcador comprenden más de una sola nucleobase, estas regiones de bloques de polímero deberían producir señales distintivas que reflejaran la carga y la distribución de carga de las regiones de bloques de polímero.
Se ha de entender que, aunque las descripciones anteriores se refieren a técnicas de detección individuales, en algunas realizaciones, se puede utilizar una pluralidad de técnicas diferentes para explorar una sola molécula de marcador (véase, p. ej., Kassies et al., 2005, J Microsc 217:109-16). Los ejemplos de varios modos de detección incluyen, entre otros, el bloqueo de corriente en combinación con la corriente de efecto túnel electrónico, y el bloqueo de corriente en combinación con la generación de imágenes de campos inducidos por la carga. Se puede utilizar la detección concomitante con diferentes modos de detección para identificar una molécula de marcador correlacionando el tiempo de detección de la señal resultante entre diferentes modos de detección.
En algunas realizaciones, la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa o la detección de los marcadores que se trasladan a través de la capa incluye observar un efecto de bloqueo de la corriente de los marcadores en los nanoporos. En algunas realizaciones, cuando el efecto de bloqueo de la corriente está por encima de un nivel de umbral, hay un analito presente en la muestra.
3. Dispositivo para el análisis de analitos
La presente divulgación describe un dispositivo microfluídico utilizado junto con un dispositivo nanoporoso y un dispositivo nanoporoso y microfluídico integrado. El dispositivo microfluídico desvelado utilizado junto con un dispositivo nanoporoso y un dispositivo nanoporoso y microfluídico integrado se pueden utilizar en el método de análisis de analitos, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en determinados casos, los dispositivos descritos en el presente documento se pueden utilizar para otras aplicaciones. Asimismo, en determinados casos, los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar con otros dispositivos.
En las Fig. 1A y 1B, se muestra un dispositivo microfluídico utilizado junto con un dispositivo nanoporoso. El dispositivo microfluídico 10 se representa con una nanogota 11 de fluido que se va a analizar en el dispositivo nanoporoso 15. La nanogota de fluido puede incluir un marcador (p. ej., un marcador escindido o un aptámero) que se contará utilizando el dispositivo nanoporoso. El dispositivo nanoporoso 15 incluye una primera cámara 16, una capa 17 con un nanoporo 18 y una segunda cámara 19. Las Fig. 1A y 1B representan una etapa 1 de transferencia de líquido en la que la nanogota 11 de fluido se retira del dispositivo microfluídico 10 y se coloca en el dispositivo nanoporoso 15. Como se muestra en la Fig. 1A, la nanogota 11 de fluido se deposita sobre la capa 17 de una manera que hace que la nanogota sea disgregada por la capa 17 y se coloque en el nanoporo 18. La nanogota de fluido se puede introducir en el dispositivo nanoporoso 15 por un acceso de entrada (no mostrado). El acceso de entrada se puede colocar sobre una sección de la capa 17. Por ejemplo, el acceso de entrada puede estar ubicado en una abertura de una pared de una cámara en la que se coloca la capa que contiene el nanoporo. En la Fig. 1B, la nanogota 11 de líquido se deposita en la primera cámara 16. Una etapa 2 de adición de tampón introduce un tampón en la segunda cámara 19. En otras realizaciones, el tampón se puede añadir a la segunda cámara 19 antes de la introducción de la nanogota 11 de líquido en la primera cámara 16. En otras realizaciones adicionales, la nanogota 11 de líquido se puede depositar en la segunda cámara 19 antes o después de añadirse el tampón a la primera cámara 16. En la Fig. 1A, no es necesaria una etapa de adición de un tampón en ninguna de las cámaras.
En otra realización, el dispositivo puede ser un dispositivo integrado. El dispositivo integrado puede incluir un módulo microfluídico y un módulo nanoporoso que pueden construirse por separado y luego combinarse para formar el dispositivo, o el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso pueden incorporarse conjuntamente en un solo dispositivo.
Las Fig. 2A y 2B representan un esquema de un dispositivo integrado que tiene un módulo microfluídico combinado con un módulo nanoporoso, y los dos módulos están integrados mediante su conexión utilizando un canal. Aunque las Fig. 2A y 2B representan un dispositivo que incluye módulos individuales que se combinan para generar un dispositivo integrado, se entiende que el dispositivo de las Fig. 2A y 2B también se puede fabricar como un dispositivo unitario en el que los dos módulos están conectados.
En las Fig. 2A y 2B, panel superior, se representa un módulo microfluídico 20 con una nanogota 25 de fluido que se va a analizar en el dispositivo nanoporoso 30. El módulo nanoporoso 30 incluye una primera cámara 31, una capa 32 con un nanoporo 33 y una segunda cámara 34. El módulo microfluídico 20 está integrado al módulo nanoporoso 30 por medio de un canal 40. El canal conecta de forma fluida los dos módulos y facilita el movimiento de la nanogota 25 desde el módulo microfluídico 20 hasta el módulo nanoporoso 30. El panel central ilustra el movimiento de la nanogota 25 desde el módulo microfluídico 20 hasta el módulo nanoporoso 30 por medio del canal 40. Como se muestra en la Fig. 2A, el canal puede conectar el módulo microfluídico 20 a un acceso de entrada del módulo nanoporoso 30. El acceso de entrada (no mostrado) se puede colocar de manera que la nanogota 25 de fluido se deposite sobre la capa 32 de una manera que haga que la nanogota sea disgregada por la capa 32 y se coloque en el nanoporo 33. Al final del proceso de transferencia, la nanogota de fluido se coloca por el nanoporo 33 (Fig. 2A, panel inferior). En otras realizaciones, el canal 40 puede conectar el módulo microfluídico 20 con un acceso de entrada de una primera o segunda cámara del módulo nanoporoso 30. Dicha realización se muestra en la Fig. 2B, donde el canal 40 conecta el módulo microfluídico 20 con un acceso de entrada en una primera cámara 31 del módulo nanoporoso 30. Después o antes de la transferencia de la nanogota 25 de líquido a la primera cámara 31, se puede añadir un tampón a la segunda cámara. En la etapa 2 de la Fig. 2B, se añade tampón a la segunda cámara 34 después de la transferencia de la nanogota 25 a la primera cámara 31. Opcionalmente, una vez completada la transferencia, se puede retirar el canal 40 y los dos módulos se pueden separar. Los dispositivos y módulos microfluídicos y nanoporosos mostrados en las Fig. 1A, 1B, 2A y 2B, respectivamente, son funcionales cada uno individualmente.
Las Fig. 2C-2H representan una realización de un dispositivo integrado que incluye un módulo microfluídico digital 50 y un módulo nanoporoso 60. El módulo microfluídico digital se representa con una serie de electrodos 49 que están conectados operativamente a una pluralidad de depósitos 51 de reactivo utilizados para la generación de nanogotas que se transportarán al módulo nanoporoso. Uno o más de los depósitos 51 pueden contener un reactivo o una muestra. Pueden estar presentes diferentes reactivos en diferentes depósitos. También se muestran en el módulo microfluídico 50 almohadillas de contacto 53 que conectan la serie de electrodos 49 con una fuente de alimentación (no mostrada). Las líneas de seguimiento que conectan la serie de electrodos 49 con las almohadillas de contacto no se representan. La serie de electrodos 49 transporta una o más nanogotas (tal como una nanogota de tampón o una nanogota que contiene tampón y/o marcador (p. ej., marcador escindido o aptámero disociado)) a uno o ambos de los electrodos de transferencia 71 y 72 ubicados en la superficie de contacto 100 entre el módulo microfluídico digital 50 y un módulo nanoporoso 60. El módulo microfluídico digital 50 y el módulo nanoporoso 60 están conectados operativamente en la superficie de contacto 100. El módulo nanoporoso 60 incluye al menos dos canales capilares microfluídicos 61 y 62 que interseccionan entre sí en la ubicación en la que está dispuesta una capa nanoporosa 70. Los dos canales capilares microfluídicos 61 y 62 están ubicados en dos sustratos diferentes en el módulo nanoporoso (representado en la Fig. 2D). Por tanto, el módulo nanoporoso incluye un primer sustrato 63 (p. ej., sustrato inferior) que incluye un canal capilar microfluídico 61 en una superficie superior del primer sustrato 63 y además incluye un segundo sustrato 64 (p. ej., sustrato superior) con un canal capilar microfluídico 62 en la primera superficie del segundo sustrato. El segundo sustrato 64 se superpone al canal capilar microfluídico 61 y el primer sustrato 63 subyace al canal capilar microfluídico 62. El canal capilar 62 se superpone al canal capilar 61 en el punto de intersección de los dos canales, en la ubicación de la capa nanoporosa 70 (véase también la Fig. 2D, panel inferior). Los dos canales capilares están físicamente separados en la intersección por la capa nanoporosa 70 colocada en la intersección. La capa nanoporosa 70 incluye al menos un nanoporo (no mostrado) que está colocado en la intersección de los canales capilares y que permite el transporte de moléculas de un canal capilar al otro a través del nanoporo. Los canales capilares 61 y 62 se abren en la superficie de contacto 100 en los primeros extremos de los canales capilares y se abren a un depósito/conducto de ventilación (84 y 85, como se ve en la Fig. 2C) en los segundos extremos de los canales capilares. También se muestra en la Fig. 2C un sustrato de cubierta 101 que está colocado sobre la serie de electrodos 49. El sustrato de cubierta 101 define un espacio en el módulo microfluídico en el que se manipulan las nanogotas. El sustrato de cubierta 101 puede incluir opcionalmente un electrodo 55 (p. ej., un electrodo de referencia) dispuesto sobre una superficie inferior del sustrato de cubierta 101 que proporciona una configuración de electrodos biplanar para manipular nanogotas en el módulo microfluídico 50. En ausencia de una configuración de electrodos biplanar, las nanogotas pueden manipularse en el módulo microfluídico 50 utilizando un accionamiento de electrodo coplanar, por ejemplo, utilizando la serie de electrodos 49 u otra configuración de electrodos coplanar. Por ejemplo, se pueden utilizar los electrodos coplanares descritos en el documento US6911132 para manipular nanogotas en el módulo microfluídico 50.
La Fig. 2D, panel superior, muestra un esquema de una vista frontal de una sección transversal de la superficie de contacto 100 en la que el módulo microfluídico digital 50 y un módulo nanoporoso 60 están conectados operativamente. En el panel inferior de la Fig. 2D, se representa un esquema de una vista lateral de una sección transversal del dispositivo en el electrodo de transferencia 72. La Fig. 2D, panel superior, muestra dos nanogotas (65a y 65b) colocadas en dos electrodos de transferencia 71 y 72 que están ubicados en la superficie de contacto 100 entre el módulo microfluídico 50 y un módulo nanoporoso 60. Como se ilustra en la Fig. 2D, panel superior, la nanogota 65a colocada en el electrodo 71 está alineada con la abertura del canal capilar 61 mientras que la nanogota 65b colocada en el electrodo 72 está alineada con la abertura del canal capilar 62. La Fig. 2D, panel inferior, ilustra una vista lateral de una sección transversal del dispositivo integrado que muestra la colocación de la nanogota 65b sobre el electrodo de transferencia 72. La nanogota 65b está colocada para moverse hacia el canal capilar 62. También se muestra el canal capilar 61; sin embargo, el canal capilar está a una distancia del electrodo de transferencia 72 y está alineado con el electrodo de transferencia 71 (no mostrado). También se representa el sustrato de cubierta 101 con un electrodo 55 dispuesto sobre la superficie inferior del sustrato de cubierta 101. En las realizaciones de los dispositivos integrados representados en las Fig. 2D-2H, el módulo nanoporoso está dispuesto sobre el mismo sustrato que la serie de electrodos del módulo microfluídico.
La distancia vertical entre la superficie superior de los electrodos de transferencia y la entrada a los canales capilares se puede determinar por el espesor de los sustratos que forman la parte inferior del módulo microfluídico y el módulo nanoporoso. La distancia vertical se puede establecer en función del volumen de las nanogotas que se transfieran al módulo nanoporoso. La distancia vertical se puede ajustar variando el espesor de los sustratos. Por ejemplo, los sustratos (p. ej., el sustrato 63) del módulo nanoporoso pueden mantenerse relativamente delgados, o se puede aumentar el espesor del sustrato sobre el que están dispuestos los electrodos de transferencia (p. ej., utilizando un sustrato más grueso) para garantizar que la nanogota esté alineada con la entrada del canal capilar. En la Fig. 2E, se representa un ejemplo de dispositivo en el que las nanogotas se alinean con la entrada a los canales capilares utilizando un módulo microfluídico que tiene un sustrato inferior más grueso. El dispositivo mostrado en la Fig. 2E tiene la misma configuración que la descrita para las Fig. 2C-2D. Sin embargo, el espesor del sustrato 59a sobre el que se coloca la serie de electrodos se aumenta con relación al espesor de la parte del sustrato sobre la que está dispuesto el módulo nanoporoso. La Fig. 2E, panel superior, representa una vista frontal de una sección transversal en la superficie de contacto 100 entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso. La Fig. 2E, panel inferior, representa una vista lateral de una sección transversal en la posición del electrodo de transferencia 72 y el canal capilar 62. Como se ilustra en la Fig. 2E, el sustrato 59a sobre el que están dispuestos el conjunto de electrodos 49 y los electrodos de transferencia 71 y 72 es más grueso que el sustrato 59b sobre el que está dispuesto el módulo nanoporoso. Como se muestra en la Fig. 2E, panel inferior, el sustrato 59a tiene una primera altura H1 mientras que el sustrato 59b tiene una segunda altura H2, siendo H1 superior a H2. La diferencia de altura entre los sustratos 59a y 59b produce la alineación de los canales capilares 61 y 62 en el módulo nanoporoso con las nanogotas colocadas en los electrodos 71 y 72, respectivamente. También se muestra en el panel inferior de la Fig. 2E el canal 61. Como se hace evidente a la luz de la Fig. 2C, el canal capilar 62 es perpendicular al canal capilar 61 en la ubicación de la capa nanoporosa 70. El canal 61 está alineado con el electrodo de transferencia 71 y está configurado para recibir la nanogota 65a colocada en el electrodo de transferencia 71. Aunque los dos canales capilares se representan perpendiculares entre sí en el punto de intersección, también se prevén otras configuraciones en las que los dos canales interseccionan en un ángulo distinto de 90 grados.
Al entrar en contacto con el canal capilar, las nanogotas se mueven hacia el canal capilar a través de cualquier medio adecuado, tal como, acción capilar. El movimiento de una nanogota hacia el canal capilar puede facilitarse mediante métodos/materiales adicionales. Por ejemplo, las nanogotas pueden moverse hacia el canal capilar por difusión, movimiento browniano, convección, bombeo, presión aplicada, flujo impulsado por gravedad, gradientes de densidad, gradientes de temperatura, gradientes químicos, gradientes de presión (positivos o negativos), presión neumática, reacciones químicas productoras de gas, flujo centrífugo, presión capilar, absorción, mediada por campo eléctrico, mediada por electrodos, electroforesis, dielectroforesis, magnetoforesis, campos magnéticos, flujo impulsado magnéticamente, fuerza óptica, quimiotaxis, fototaxis, flujo impulsado por gradiente de tensión superficial, efecto Marangoni, convección termo-capilar, gradientes de energía superficial, acostoforesis, ondas acústicas superficiales, flujo electroosmótico, termoforesis, electrohumectación, optoelectrohumectación, o combinaciones de los mismos. Adicionalmente, o como alternativa, el movimiento de una nanogota hacia el canal capilar puede facilitarse utilizando, por ejemplo, una fuerza de accionamiento, tal como las que se desvelan en el presente documento; utilizando un recubrimiento hidrófilo en el capilar; tamaño variable (p. ej., anchura y/o altura y/o diámetro y/o longitud) del canal capilar).
En las realizaciones representadas en las Fig. 2C-2H, el flujo de un fluido por los canales capilares 61 y 62 se controla al menos en parte cambiando la sección transversal de los capilares; el fluido se mueve inicialmente con relativa rapidez hasta que entra en una parte más estrecha de los capilares. Una o ambas nanogotas pueden ser nanogotas que contengan el analito que se va a detectar o contar (o marcador escindido o aptámero disociado) o solución conductora (p. ej., tampón que no contenga un analito) para el análisis por medio del nanoporo. En determinados casos, una nanogota 65a puede ser una nanogota que contenga un analito/marcador/aptámero mientras que la otra nanogota 65b puede ser una nanogota de tampón. Si bien se representa una sola nanogota para cada canal, en la práctica, se pueden transportar varias nanogotas al módulo nanoporoso. Por ejemplo, las varias nanogotas se pueden transportar al módulo nanoporoso de manera secuencial. En algunos casos, se pueden agrupar varias nanogotas en uno o ambos electrodos de transferencia para generar una nanogota mayor que se transporte al módulo nanoporoso.
La Fig. 2F ilustra un ejemplo de configuración de los diversos electrodos utilizados en el dispositivo integrado. Como se ha indicado anteriormente, un electrodo individual continuo 55 (no mostrado en la Fig. 2F) se coloca separado de la serie de electrodos 49 en el módulo microfluídico 60. La serie de electrodos incluye una serie de electrodos controlables individualmente. El electrodo 55 está dispuesto sobre una superficie inferior del sustrato de cubierta 101. El electrodo 55 y la serie de electrodos mueven las nanogotas hacia los electrodos de transferencia. Aunque se muestra que el electrodo 55 no cubre los electrodos de transferencia 71 y 72, en determinados ejemplos de dispositivo, el sustrato de cubierta 101 y el electrodo 55 pueden extenderse sobre los electrodos de transferencia. En realizaciones en las que el electrodo 55 no cubre los electrodos de transferencia, Se pueden utilizar electrodos coplanares para mover nanogotas al electrodo de transferencia (p. ej., accionamiento coplanar como se describe en el documento US6911132). Como se describe en el presente documento, el electrodo individual 55 puede servir como referencia o como electrodo de conexión a tierra, mientras que la serie de electrodos 49 puede ser controlable individualmente (por ejemplo, la serie de electrodos puede ser electrodos de accionamiento que se pueden accionar de forma independiente). Pares de electrodos: el par 80a y 80b, y el par 90a y 90b están colocados en el módulo nanoporoso. Los pares de electrodos 80a, 80b y 90a, 90b se utilizan para establecer polaridad opuesta por la capa nanoporosa 70 para impulsar moléculas cargadas a través del/de los nanoporo/s de la capa nanoporosa 70. En algunas realizaciones, el par de electrodos 80a y 80b puede ser de electrodos positivos y el par de electrodos 90a y 90b puede ser de electrodos negativos. La Fig. 2G ilustra una configuración de electrodos alternativa para el módulo nanoporoso en la que se utilizan dos electrodos 80 y 90 (en lugar de cuatro) para establecer una diferencia de polaridad por la capa nanoporosa 70. Estos ejemplos demuestran el uso de configuraciones de electrodos simétricas (cuatro electrodos) o asimétricas (dos electrodos) que generan un gradiente de potencial eléctrico por la capa nanoporosa para trasladar moléculas cargadas a través del nanoporo.
La Fig. 2H ilustra una configuración alternativa de los canales capilares en la que solo un canal 61 está conectado al módulo microfluídico en la superficie de contacto 100. El otro canal 62 está conectado a dos depósitos que pueden llenarse con un líquido conductor para facilitar la transferencia de moléculas cargadas por el nanoporo.
En determinados casos, los dispositivos integrados proporcionados en el presente documento pueden fabricarse mediante la formación de depósitos y una serie de electrodos para la parte del módulo microfluídico digital en una primera área de una superficie superior de un primer sustrato. Se puede preparar un segundo sustrato disponiendo un electrodo individual (p. ej., electrodo 55) sobre la superficie inferior del segundo sustrato y colocado sobre la serie de electrodos controlables individualmente de una manera espaciada para proporcionar una orientación enfrentada entre el electrodo individual y la serie de electrodos para el accionamiento de nanogotas biplanar. Como se usa en el presente documento, "accionamiento de nanogotas" se refiere a la manipulación de nanogotas utilizando un dispositivo microfluídico como se desvela en el presente documento o utilizando un accionador de nanogotas como se desvela en los documentos US6.911.132, US6.773.566 o US6.565.727. Por tanto, la configuración de los electrodos biplanares o de la serie de electrodos de los dispositivos desvelados en el presente documento puede ser similar a la desvelada en los documentos US6.911.132, u S6.773.566 o US6.565.727. El electrodo 55 sobre el segundo sustrato también puede denominarse electrodo de referencia. Los electrodos del módulo microfluídico se pueden recubrir opcionalmente con un material dieléctrico. También se puede proporcionar un recubrimiento hidrófobo sobre el material dieléctrico.
En determinadas realizaciones, se puede formar un microcanal sobre un tercer sustrato que puede estar dispuesto sobre una segunda área del primer sustrato sobre el que está dispuesta la serie de electrodos 49. Por ejemplo, se puede unir un tercer sustrato sobre una segunda área del primer sustrato en donde la serie de electrodos microfluídicos está dispuesta en la primera área. El sustrato puede tener un microcanal preformado o puede formarse un microcanal después de la etapa de unión. Se puede disponer un cuarto sustrato con un segundo microcanal encima del sustrato que contiene el microcanal para proporcionar un dispositivo integrado como se muestra en la Fig. 2C-2H. La capa nanoporosa se puede disponer sobre cualquier microcanal en la ubicación de la intersección de los dos microcanales. Por tanto, los sustratos que forman el módulo nanoporoso pueden incluir microcanales que estén abiertos por ambos extremos y por un lado. La colocación del cuarto sustrato sobre el tercer sustrato cierra los microcanales formando así canales capilares (p. ej., 61 y 62).
En determinadas realizaciones, se puede formar un microcanal sobre un sustrato separado que se puede disponer sobre el primer sustrato sobre el que está dispuesta la serie de electrodos microfluídicos. Por ejemplo, se puede unir otro sustrato sobre la segunda área del primer sustrato en donde la serie de electrodos microfluídicos está dispuesta en la primera área. El sustrato puede tener un microcanal preformado o puede formarse un microcanal después de la etapa de unión. Se puede disponer otro sustrato con un segundo microcanal encima del sustrato que contiene el microcanal para proporcionar un dispositivo integrado como se muestra en la Fig. 2C-2H. La capa nanoporosa se puede disponer sobre cualquier microcanal en la ubicación de la intersección de los dos microcanales 61 y 62.
En algunas realizaciones, se puede introducir un microcanal en la segunda área adyacente a la primera área sobre el primer sustrato sobre el que está dispuesta la serie de electrodos microfluídicos. Por ejemplo, el microcanal se puede grabar sobre la superficie superior de la segunda área. Se puede colocar una capa nanoporosa en una ubicación del microcanal. La capa nanoporosa puede incluir uno o varios nanoporos preformados. En realizaciones alternativas, el/los nanoporo/s se pueden formar después de colocar la capa en una ubicación del microcanal. Se puede preparar un tercer sustrato introduciendo un microcanal sobre la superficie inferior del tercer sustrato. El tercer sustrato se puede colocar sobre la segunda área del primer sustrato de modo que la superficie superior de la segunda área del primer sustrato esté en contacto por su superficie superior con la superficie inferior del tercer sustrato, creándose así canales capilares cerrados 61 y 62.
Las Fig. 2I-2K representan dispositivos en los que el módulo microfluídico digital 250 y el módulo nanoporoso 260 comparten un (primer) sustrato inferior común 210 en el que la serie de electrodos 249 (una serie de electrodos controlables individualmente) para el módulo microfluídico está dispuesta sobre una primera área y se forma un canal microfluídico 261 en una segunda área. El canal microfluídico 261 del primer sustrato está alineado con el electrodo de transferencia 271. Un segundo sustrato 220 que tiene un electrodo individual continuo 255 (p. ej., un electrodo de referencia) está dispuesto separado de la serie de electrodos 249 del módulo microfluídico digital 250. Un tercer sustrato 230 que comprende un canal microfluídico 262 formado en una superficie inferior del tercer sustrato está colocado sobre la segunda área de la primera superficie 210 cubriendo así la superficie superior del primer sustrato en el que se forma el canal microfluídico 261. El primer sustrato y el tercer sustrato del módulo nanoporoso encierran los canales microfluídicos 261 y 262, proporcionando así los canales capilares 261 y 262. Se entiende que "canal/es de microfluídico/s" y "microcanal/es" se utilizan en el presente documento indistintamente para referirse a un conducto o un recorte de una superficie de un sustrato. Al colocar un sustrato sobre el conducto, el conducto se encierra formando un canal capilar. Al igual que la Fig. 2C, los canales capilares se pueden conectar de forma fluida al módulo microfluídico por un extremo de la superficie de contacto 100 entre el módulo microfluídico 250 y el módulo nanoporoso 260 y con un depósito o conducto de ventilación en el otro extremo. En otras realizaciones, el segundo canal capilar 262 se puede configurar de manera similar al canal capilar 62 de la Fig. 2H, es decir, el segundo canal capilar 262 puede no estar conectado al módulo microfluídico por ningún extremo, y puede estar conectado a un depósito/conducto de ventilación por ambos extremos. En la Fig. 2I, se muestra una vista superior del dispositivo y, en la Fig. 2I (continuación), se muestra una vista frontal de una sección transversal del dispositivo en la superficie de contacto entre los módulos. Como es evidente a la luz de la vista frontal, la nanogota 265a está en un plano superior al de la entrada al canal capilar 261. Para permitir que la nanogota 265a fluya hacia el canal capilar 261, se crea una muesca 280 en un borde lateral del tercer sustrato 230 a fin de proporcionar espacio para el movimiento de la nanogota hacia abajo por el microcanal 261. Por tanto, la conexión fluídica entre el módulo microfluídico y el módulo nanoporoso es proporcionada por un acceso vertical formado por la muesca 280 que proporciona una abertura en la parte superior del primer canal capilar 261 en un extremo del primer canal capilar 261 en la superficie de contacto 100. Se entiende que la muesca 280 es la Fig. 2I no está dibujada a medida y puede ser de cualquier tamaño adecuado que permita la comunicación fluida entre el electrodo de transferencia 271 y el primer canal capilar 261 en la superficie de contacto 100. Además, la muesca puede variar de tamaño. Por ejemplo, la muesca puede ser un recorte que se extienda a lo largo del borde lateral del tercer sustrato 230 en la superficie de contacto 100 y puede tener proporciones que coincidan con la anchura del electrodo de transferencia 271 o la anchura del canal capilar 261 o una longitud intermedia. El recorte se puede extender nominalmente a lo largo de la anchura del tercer sustrato 230 de modo que quede descubierta una región relativamente menor del canal capilar 261. En otras realizaciones, el recorte se puede extender sobre una longitud sustancial del canal capilar 261. Una capa 270 que contiene un nanoporo se coloca por el primer canal capilar 261 en la posición en la que interseccionan los dos canales capilares. La capa 270 se coloca en un sustrato de soporte 275. En determinados casos, el primer sustrato 210 puede ser un sustrato de vidrio y el sustrato de soporte 275 puede ser una junta de PDMS.
En la Fig. 2J, se representa una vista lateral de una sección transversal del dispositivo mostrado en la Fig. 2I. La sección transversal está en la región del dispositivo en la que el primer canal capilar 261 está alineado con el primer electrodo de transferencia 271. También se muestra una parte del módulo microfluídico 250 con la serie de electrodos 249, el segundo sustrato 220 con un electrodo individual 255 (p. ej., electrodo de referencia) colocado separado del conjunto de electrodos 249. Como se muestra en la Fig. 2J, el electrodo individual 255 no cubre los electrodos de transferencia. Si bien no se ilustra en estas figuras, el segundo sustrato 220 y el electrodo individual 255 (que puede ser un electrodo de referencia) pueden cubrir los electrodos de transferencia 271 y 272, proporcionando una configuración de electrodos biplanar. En esta realización, las nanogotas se pueden mover a los electrodos de transferencia 271 y 272 utilizando los electrodos biplanares. El primer capilar 261 está ubicado en el primer sustrato 210 y está ubicado en un plano inferior al plano en el que está presente la nanogota 265a. El tercer sustrato 230, que incluye el segundo microcanal (que está encerrado por la superficie superior del primer sustrato 210 para proporcionar el canal capilar 262), está dispuesto sobre el primer sustrato. El tercer sustrato 230 incluye la muesca 280 (o recorte) en el borde lateral adyacente al módulo microfluídico en la superficie de contacto 100. La muesca 280 abre el capilar 261 sobre una parte superior en el extremo del canal capilar 261 proporcionando un acceso vertical para la entrada al canal capilar 2 61. Como se muestra con la dirección de la flecha, la nanogota se desplaza hacia abajo hasta el capilar 261 y luego procede a fluir hacia la intersección del primer y del segundo canal capilar. El segundo canal capilar 262 intersecciona con el primer capilar 261 en la ubicación de la capa nanoporosa 270. Se representa un sustrato de soporte 275 colocado sobre el primer canal capilar 261 (y debajo del segundo canal capilar 262). El sustrato de soporte 275 incluye la capa nanoporosa 270. Como se muestra en una vista superior de la capa nanoporosa se muestra en el recuadro, el sustrato de soporte 275 rodea la capa nanoporosa. En algunas realizaciones, el sustrato de soporte puede ser una primera capa con un recorte en el centro y una segunda capa con un recorte en el centro. La capa nanoporosa se puede disponer en el recorte entre la primera y la segunda capa. Se puede utilizar una capa nanoporosa en un sustrato de soporte en dispositivos en los que el sustrato inferior 210 esté hecho de vidrio.
La Fig. 2K muestra una vista lateral adicional de una sección transversal del dispositivo mostrado en la Fig. 21. En la Fig. 2J, la sección transversal está en la ubicación del primer electrodo de transferencia 271. En la Fig. 2K, la sección transversal está en la ubicación del segundo electrodo de transferencia 272. Como se muestra en la Fig. 2K, la entrada al segundo canal capilar 262 está alineada con la posición de la nanogota 265b presente en el segundo electrodo de transferencia 272. También se muestra en la Fig. 2K el primer canal capilar 261 que intersecciona con el segundo canal capilar 262 en la ubicación de la capa nanoporosa 270.
En otra realización, como se muestra en la Fig. 2L, el primer sustrato 210 puede incluir una primera parte 210a en la que estén dispuestos la serie de electrodos 249 y los electrodos de transferencia 271 y 272, y una segunda parte 210b sobre la que se disponga un sustrato 290 que contenga el canal capilar 261a. Al igual que el dispositivo que se muestra en las Fig. 2I-2K, el canal capilar 261a está por debajo del plano sobre el que se encuentran los electrodos de transferencia. El canal capilar 262 está ubicado en el sustrato 230 en el que la entrada al canal capilar 262 está en el mismo plano que los electrodos de transferencia del módulo microfluídico 250. Además, al igual que las Fig. 2I-2K, la entrada al canal capilar 262 está alineada con el electrodo de transferencia 272. Por tanto, una nanogota colocada sobre el electrodo 272 puede desplazarse de manera esencialmente horizontal hacia el canal capilar 262. Al igual que el dispositivo mostrado en las Fig. 2I-2K, el sustrato 230 incluye una muesca 280 en un borde lateral del sustrato 230 para proporcionar espacio para que una nanogota colocada sobre el electrodo de transferencia 271 se desplace hacia el capilar 261a que está ubicado en el sustrato 290. También se muestra en la Fig. 2L la capa nanoporosa 270. En esta realización, la capa nanoporosa está dispuesta directamente sobre el sustrato 290 en ausencia de la capa de soporte 275. Por ejemplo, en realizaciones en las que ambos sustratos que contienen los canales se forman a partir de PDMS, la capa nanoporosa se puede disponer directamente entre los sustratos en ausencia de un sustrato de soporte. La Fig. 2L, panel superior, representa una vista lateral de una sección transversal a través del dispositivo en la ubicación en la que se encuentran el electrodo de transferencia 271 y el canal capilar 261a. La Fig. 2L, panel inferior, representa una vista lateral de una sección transversal a través del dispositivo en la ubicación en la que se encuentran el electrodo de transferencia 272 y el canal capilar 262. Desde la parte superior, el dispositivo tiene el mismo aspecto que el que se muestra en la Fig. 21. Por tanto, los electrodos de transferencia 271 y 272 están separados del mismo modo que los electrodos de transferencia 71 y 72 en el dispositivo mostrado en la Fig. 21.
Los electrodos del módulo nanoporoso para el transporte de moléculas por la capa nanoporosa a través de uno o varios nanoporos se pueden fabricar después de colocar la capa nanoporosa en el dispositivo. Por ejemplo, los electrodos se pueden disponer en aberturas introducidas en los sustratos y colocarse en los canales capilares de modo que queden expuestos en los canales capilares y estén en contacto con el fluido presente en los canales capilares. La distancia de los electrodos al nanoporo se puede determinar empíricamente en función de la resistencia, la anchura, el diámetro y/o la longitud del/de los canal/es capilar/es.
La capa nanoporosa se puede disponer sobre cualquier canal. La capa nanoporosa se puede adherir a la superficie del sustrato que contenga el microcanal mediante unión por plasma o mediante un elemento comprimible, tal como una junta. En determinados casos, el sustrato que contiene el primer canal puede ser un sustrato de vidrio. En esta realización, un sustrato de soporte, tal como, una capa de PDMS se puede utilizar para colocar la capa nanoporosa. Por ejemplo, la capa nanoporosa puede estar provista de una junta de PDMS.
Se puede emplear cualquier método adecuado para formar los canales sobre el sustrato. En determinados casos, se puede utilizar litografía o estampado para crear los canales para el módulo nanoporoso. En otras realizaciones, los canales se pueden grabar en los sustratos. En determinadas realizaciones, se puede utilizar una combinación de métodos adecuados para formar canales en los sustratos. Por ejemplo, se puede formar un canal en un sustrato de vidrio utilizando un proceso de grabado y se puede formar otro canal en un sustrato de PDMS utilizando un método apropiado, tal como, litografía suave, litografía de nanoimpresión, ablación con láser o estampado (p. ej., estampado suave). La altura/anchura/diámetro de los microcanales se puede determinar empíricamente. La altura/anchura/diámetro de los microcanales puede estar en el intervalo de 0,5 pm a aproximadamente 50 pm, p. ej., 0,5 pm-40 pm, 1 pm-30 pm, 2 pm-20 pm, 3 pm-10 pm, 5 pm-10 pm, tal como, 0,5 pm, 1 pm, 2 pm, 3 pm, 4 pm, 5 pm, 6 pm, 7 pm, 8 pm, 9 pm, 10 pm, 15 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm o 50 pm. Tal y como se indica en el presente documento, la altura/anchura/diámetro de los canales puede variar a lo largo de la longitud de los canales.
En determinadas realizaciones, la capa nanoporosa (p. ej., 70 o 270) puede incluir un recubrimiento de material aislante en uno o ambos lados de la capa nanoporosa. El material aislante puede reducir la capacitancia de contacto y disminuir el ruido asociado con la detección del traslado de una molécula a través del/de los nanoporo/s en la capa nanoporosa. En otra realización, el área superficial de la capa nanoporosa expuesta a un fluido en los canales capilares en contacto de fluido con la capa nanoporosa (p. ej., los canales capilares 61 y 62 o 261 y 262) se puede reducir. La reducción del área superficial de la capa nanoporosa que está en contacto con un fluido que contiene las moléculas que se van a detectar o a contar por el/los nanoporo/s puede minimizar la capacitancia de contacto y reducir el ruido de fondo. El área superficial de la capa nanoporosa en contacto con un fluido en los canales capilares se puede reducir reduciendo el tamaño del canal capilar en la ubicación de la capa nanoporosa. Por ejemplo, se puede reducir la altura o la anchura, o ambas (por ejemplo, diámetro) de los canales capilares en la ubicación de la capa nanoporosa. En otra realización, se puede reducir la superficie de la capa nanoporosa. En determinados dispositivos, se puede incluir una combinación de estas realizaciones para reducir la capacitancia de contacto. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un dispositivo integrado como se desvela en el presente documento puede incluir canales capilares que tengan una dimensión disminuida en la ubicación de la capa nanoporosa y/o puede incluir una capa nanoporosa que esté recubierta con un material aislante (p. ej., PDMS) en uno o ambos lados de la capa nanoporosa y/o puede incluir una capa nanoporosa que tenga un área superficial mínima.
La Fig. 3 ilustra otro ejemplo de dispositivo integrado que incluye un módulo microfluídico 300 y un módulo nanoporoso 325. En contraste con el módulo nanoporoso de las Fig. 1A, 1b , 2A y 2B, el módulo nanoporoso 325 no es funcional como un dispositivo independiente, sino que funciona como un nanoporo una vez integrado con el módulo microfluídico 300. El módulo microfluídico 300 incluye una abertura 302 dimensionada para permitir la inserción del módulo nanoporoso 325. Como se representa en la Fig. 3, el módulo microfluídico incluye una nanogota fluídica 301 que se analizará utilizando el módulo nanoporoso 325, que contiene una capa 311 con un nanoporo 305. T ras la inserción del módulo nanoporoso 325 en el módulo microfluídico 300, se crean una primera cámara 306 y una segunda cámara 307 separadas por la capa 311. La capa 311 también divide la nanogota 301 de fluido por el nanoporo 305.
La Fig. 4 proporciona un dispositivo integrado 400 en el que los módulos microfluídicos digitales incluyen un módulo nanoporoso incorporado. En la Fig. 4, el módulo nanoporoso está colocado corriente abajo del área del módulo microfluídico en el que se genera una nanogota 401 de fluido. El módulo microfluídico mueve la nanogota 401 hasta el módulo nanoporoso de modo que la nanogota 401 se divide por la capa 402 y se coloca en el nanoporo 403. La Fig. 4 muestra una vista superior del dispositivo. El sustrato superior no se ha mostrado para mayor claridad. Se ha representado el nanoporo 403 en la capa nanoporosa 402, aunque desde la vista superior, el nanoporo 403 no será visible. La capa nanoporosa 402 se puede fijar al sustrato inferior o al sustrato superior.
En las Fig. 1A, 1B, 2A, 2B, 3 y 4, aunque se muestra un solo nanoporo, se entiende que la capa puede incluir uno o más nanoporos. Adicionalmente, se puede colocar más de una nanogota en el módulo o dispositivo nanoporoso. La/s nanogota/s se puede/n analizar aplicando una tensión por el/los nanoporo/s. La aplicación de la tensión puede provocar el movimiento de moléculas cargadas por el/los nanoporo/s. Cuando un marcador se desplaza a través del/de los nanoporo/s, una disminución de la corriente eléctrica por el nanoporo indica el traslado. En determinadas realizaciones, es posible que las cámaras del módulo nanoporoso no se llenen con una solución conductora (p. ej., tampón): la solución conductora puede ser proporcionada por la nanogota de fluido una vez que se coloca por la capa nanoporosa. En determinados casos, la primera y la segunda cámara, por las que se aplica tensión para medir el traslado de un marcador/aptámero presente en la nanogota de fluido, pueden estar definidas por las paredes del dispositivo nanoporoso y la capa nanoporosa (p. ej., véanse las Fig. 1B y 2B). La primera y la segunda cámara se pueden vaciar antes de la introducción de la nanogota de fluido o pueden contener un fluido conductor. En otros casos, la primera y la segunda cámara pueden ser paredes definidas del módulo microfluídico y la capa nanoporosa (p. ej., véase la Fig. 3). En otros casos, la primera y la segunda cámara pueden estar definidas por la nanogota fluídica dividida por la capa nanoporosa (p. ej., véanse las Fig. 1A, 2 A y 4). En determinados casos, la tensión para conducir moléculas cargadas por el/los nanoporo/s se puede aplicar a la nanogota de fluido, por ejemplo, en realizaciones en las que no esté presente una solución conductora en las cámaras. La tensión se puede aplicar a la nanogota de fluido mediante los electrodos que están en contacto directo o indirecto con la nanogota de fluido. Se entiende que la dimensión de la capa nanoporosa es mayor que la de la nanogota, de modo que la nanogota se divide por la capa y se conecta solo a través del/de los nanoporo/s.
Las Fig. 5A, 5B, 6 y 7 ilustran el movimiento de nanogotas en dispositivos que tienen un módulo microfluídico digital y una capa nanoporosa. En la Fig. 5A, se representan los componentes de un dispositivo microfluídico digital/nanoporoso integrado 450. Una vista superior muestra que una nanogota 401 que se va a analizar utilizando el nanoporo 403 de la capa nanoporosa 402 se coloca por la capa nanoporosa 402. El nanoporo 403 se muestra en este caso con fines ilustrativos, aunque desde una vista superior, el nanoporo no es visible. El dispositivo 450 incluye un sustrato 411 sobre el que se dispone una serie de electrodos 405. La serie de electrodos se utiliza para colocar una nanogota 401 mediante la división de la nanogota por la capa nanoporosa 402. Las flechas 451 y 452 representan la dirección en la que la nanogota 401 puede moverse por la serie de electrodos hasta la capa nanoporosa 402. Tras la colocación de la nanogota 401 por la capa nanoporosa 402, los electrodos 404 y 406 colocados debajo de la nanogota 401 pueden activarse para proporcionar una tensión diferencial por la capa nanoporosa 402, facilitando así el movimiento de las moléculas (p. ej., marcador escindido o aptámero) en la nanogota 401 por el nanoporo 403. Los electrodos 404 y 406 son electrodos de doble función, sirven para mover la nanogota hasta la capa nanoporosa y para impulsar el marcador/aptámero por el nanoporo 403.
La Fig. 5B representa una vista lateral del dispositivo 450, en este caso, se representa un sustrato superior 412 omitido en la vista superior mostrada en la Fig. 5A. Se muestra que el sustrato superior 412 incluye un electrodo 414. El electrodo 414 puede ser un electrodo individual o una serie de electrodos. La capa nanoporosa se extiende desde el sustrato superior hasta el sustrato inferior. La nanogota 401 se divide por la capa nanoporosa 402. Aunque en la Fig. 5B se muestran electrodos biplanares, el dispositivo puede no incluir electrodos en ambos sustratos; en cambio, el sustrato superior o inferior puede incluir electrodos coplanares. Los electrodos 404 y 406 de las proximidades de la nanogota 401 tienen polaridad opuesta e impulsan al marcador/aptámero por el nanoporo 403.
La Fig. 6 muestra la división de la nanogota 401 por la capa nanoporosa 402 que tiene un nanoporo 403. 1 a representa la nanogota movida por los electrodos 405 en la dirección indicada por las flechas hacia la capa nanoporosa 402. En 2a, la nanogota 401 ha sido dividida por la capa nanoporosa 402 y colocada de modo que la nanogota esté conectada por medio del nanoporo 403. En 3a, los electrodos colocados por la capa nanoporosa 402 debajo de la nanogota 401, se activan para proporcionar un ánodo (-) y un cátodo (+). Los electrodos activados impulsan las moléculas cargadas negativamente (incluyendo los marcadores/aptámeros que se están contando) presentes en la nanogota 401 a través del nanoporo 403. A medida que los marcadores/aptámeros se trasladan a través del nanoporo 403, el número de marcadores/aptámeros se puede contar como se explica en el presente documento. La etapa 3a sirve para recoger todos los marcadores/aptámeros que se dividieron por la capa nanoporosa, al dividirse la nanogota, en un lado de la nanogota.
Una vez que se hayan trasladado esencialmente todos los marcadores/aptámeros a un lado de la membrana nanoporosa, se puede invertir la polaridad de los electrodos, como se muestra en 4a, y se trasladan los marcadores/aptámeros al otro lado de la capa nanoporosa 402 y se cuentan. El número de marcadores contados en la etapa 3a debe ser aproximadamente la mitad del recuento obtenido en la etapa 4a. Las etapas de inversión de la polaridad de los electrodos y de recuento de los marcadores/aptámeros se pueden repetir cualquier número de veces para obtener varias lecturas del número de marcadores/aptámeros de la nanogota.
Las Fig. 7, 1b y 2b muestran dos nanogotas 600a y 600b que se mueven hacia la capa nanoporosa 604 en las direcciones indicadas por las flechas. Una vez en la capa nanoporosa 604, las nanogotas humedecen la capa nanoporosa y son conectadas de forma fluida mediante el nanoporo 605 (3b). En la etapa 4b, un electrodo colocado debajo de la nanogota 600a se activa para que sirva como cátodo y un electrodo colocado debajo de la nanogota 600b se activa para servir como ánodo, y los marcadores escindidos/aptámeros disociados cargados negativamente son impulsados a la nanogota 600a y se cuentan. En la etapa 5b, se invierte la polaridad de los electrodos y los marcadores escindidos/aptámeros disociados cargados negativamente presentes en la nanogota 600a son impulsados a la nanogota 600b y se cuentan. Las etapas de inversión de la polaridad de los electrodos y de recuento de los marcadores escindidos/aptámeros disociados se pueden repetir cualquier número de veces para obtener varias lecturas del número de marcadores escindidos /aptámeros disociados de la nanogota. Las dos nanogotas 600a y 600b pueden ser ambas nanogotas de muestra (p. ej., nanogotas que contienen moléculas que se van a contar) o nanogotas de tampón (p. ej., para humedecer la nanocapa, antes de colocar una o varias nanogotas de muestra en el nanoporo. En algunas realizaciones, una de las nanogotas puede ser una nanogota de tampón mientras que la otra nanogota puede ser la nanogota de muestra. Los marcadores/aptámeros se pueden contar una o varias veces.
La Fig. 8 ilustra un dispositivo microfluídico digital y nanoporoso integrado desde una vista lateral. Los sustratos 91 y 92 están colocados de manera espaciada. El sustrato 92 incluye un electrodo 97 y el sustrato 91 incluye una serie de electrodos 95. La estructura de soporte 98 fija la capa nanoporosa 94 al sustrato 92. En otras realizaciones, la estructura de soporte 98 se puede fijar al sustrato inferior 91. La serie de electrodos 95 se utiliza para mover la nanogota 99 a la capa nanoporosa 94, donde la capa nanoporosa divide la nanogota y conecta de forma fluida los dos lados de la nanogota mediante el nanoporo 93. Los electrodos 96 y 97 sirven para impulsar los marcadores/aptámeros de la nanogota 99 a través del nanoporo 93. Como se ha indicado anteriormente, la polaridad de los electrodos 96 y 97 se puede invertir para trasladar los marcadores/aptámeros a través del nanoporo varias veces.
Aunque las figuras representan un solo nanoporo, se entiende que puede estar presente más de un nanoporo en la capa nanoporosa. Los electrodos que flanquean la capa nanoporosa y se utilizan para proporcionar una diferencia de tensión por la capa nanoporosa pueden estar o no en contacto directo con una nanogota colocada en la capa nanoporosa.
El movimiento de la nanogota fluídica en los dispositivos, módulos y dispositivos nanoporosos y microfluídicos integrados puede llevarse a cabo mediante cualquier medio adecuado. Los medios para mover una nanogota fluídica en diferentes dispositivos/módulos y canales, si es aplicable, pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, las nanogotas fluídicas se pueden mover en el dispositivo o módulo microfluídico utilizando fuerza de manipulación fluídica, tal como, electrohumectación, dielectroforesis, optoelectrohumectación, mediada por electrodos, mediada por campo eléctrico, accionamiento electrostático y similares o una combinación de las mismas. El movimiento de una nanogota fluídica desde un módulo microfluídico hasta un módulo nanoporoso a través de una conexión fluídica, tal como, un canal, puede ser por difusión, movimiento browniano, convección, bombeo, presión aplicada, flujo impulsado por gravedad, gradientes de densidad, gradientes de temperatura, gradientes químicos, gradientes de presión (positivos o negativos), presión neumática, reacciones químicas productoras de gas, flujo centrífugo, presión capilar, absorción, mediada por campo eléctrico, mediada por electrodos, electroforesis, dielectroforesis, magnetoforesis, campos magnéticos, flujo impulsado magnéticamente, fuerza óptica, quimiotaxis, fototaxis, flujo impulsado por gradiente de tensión superficial, efecto Marangoni, convección termo-capilar, gradientes de energía superficial, acostoforesis, ondas acústicas superficiales, flujo electroosmótico, termoforesis, electrohumectación, optoelectrohumectación, o combinaciones de los mismos. Una nanogota fluídica puede moverse en el módulo nanoporoso y colocarse por la capa nanoporosa mediante la fuerza de manipulación fluídica, tal como, electrohumectación, dielectroforesis, optoelectrohumectación, mediada por electrodos, mediada por campo eléctrico, accionamiento electrostático y similares o una combinación de las mismas. El marcador/aptámero en la nanogota puede trasladarse a través del/de los nanoporo/s utilizando potencial eléctrico, potencial electrostático, flujo electrocinético, flujo electro-osmótico, flujo inducido por presión, electroforesis, transporte electroforético, transporte electro-osmótico, transporte por difusión, flujo mediado por campo eléctrico, transporte mediado por dielectroforesis del marcador/aptámero, y otros métodos conocidos por los expertos en la materia o combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de realización de la presente divulgación incluyen contar el número de marcadores presentes en la nanogota colocada por la capa nanoporosa, en primer lugar, mediante el traslado de sustancialmente todos los marcadores al mismo lado de la capa nanoporosa para recoger todos los marcadores en una cámara cis o trans, seguido del traslado de los marcadores al otro lado de la capa nanoporosa y el recuento del número de marcadores que atraviesan el/los nanoporo/s de la capa nanoporosa. Como se usa en el presente documento, "cis" y "trans" en el contexto de una capa nanoporosa se refiere a los lados opuestos de la capa nanoporosa. Estos términos se utilizan en el contexto de un lado de la capa nanoporosa y también en el contexto de una cámara sobre un lado de la capa nanoporosa. Como se entiende por la descripción de los dispositivos, las cámaras cis y trans pueden estar delimitadas por estructuras físicas delimitadas por paredes, sustratos, etc. En algunos casos, las cámaras cis y trans pueden estar delimitadas por una nanogota colocada por una capa nanoporosa. La nanogota puede estar en contacto con una pared o un sustrato en uno o más lados de la nanogota. En determinados casos, las cámaras cis y trans pueden estar delimitadas por la nanogota, la cámara cis puede extenderse desde el lado cis de la capa nanoporosa hasta la periferia de la parte de la nanogota en el lado cis, y la cámara trans puede extenderse desde el lado trans de la capa nanoporosa hasta la periferia de la parte de la nanogota en el lado trans. Una parte de la nanogota en cada lado cis y trans puede estar en contacto con un sustrato. Por tanto, la cámara cis y trans puede estar delimitada por una combinación de la periferia de la nanogota, una parte de los sustratos y la capa nanoporosa.
En determinados casos, el dispositivo microfluídico y/o el módulo microfluídico pueden incluir un fluido inerte que sea inmiscible con la nanogota de muestra y las nanogotas de reactivo. Por ejemplo, el fluido inerte puede ser un fluido pesado que sea más denso que el agua, tal como aceite que sea inmiscible con las nanogotas fluídicas que se generan y procesan en el módulo microfluídico. El fluido inerte puede facilitar la formación de las nanogotas fluídicas, así como aumentar la estabilidad de la forma de las nanogotas de fluido y puede ser útil además para mantener las diferentes nanogotas separadas espacialmente entre sí. Los ejemplos de fluidos inertes incluyen líquidos polares, aceite de silicona, aceite de fluorosilicona, hidrocarburos, alcanos, aceite mineral y aceite de parafina. En determinados casos, el dispositivo o módulo microfluídico y el fluido inerte pueden ser como se desvela en el documento US20070242105. En otras realizaciones, no hay un fluido inmiscible incluido en el dispositivo. En estas realizaciones, el aire ambiente llena los espacios del dispositivo.
Como se usa en el presente documento, "nanogota/s" y "nanogota/s fluídica/s" se usan indistintamente para referirse a un volumen diferenciado de líquido que tiene una forma aproximadamente esférica y está limitado en al menos dos lados por una pared o un sustrato del dispositivo microfluídico, dispositivo nanoporoso, módulo microfluídico o módulo nanoporoso. Aproximadamente esférica en el contexto de la nanogota se refiere a formas tales como esféricas, esfera parcialmente aplanada, p. ej., en forma de disco, en forma de lingote, esfera truncada, elipsoide, hemisférica u ovoide. El volumen de la nanogota en los módulos y dispositivos nanoporosos y microfluídicos desvelados en el presente documento puede variar entre aproximadamente 10 pl y aproximadamente 5 pl, tal como, 10 pl - 1 pl, 7,5 pl -10 pl, 5 pl -1 nl, 2,5 pl - 10 nl o 1 pl - 100 nl, p. ej., 10 pl, 1 pl, 800 nl, 400 nl, 100 nl, 10 nl o menos.
En determinadas realizaciones, el dispositivo integrado puede incluir un módulo microfluídico con un módulo nanoporoso incorporado. El dispositivo integrado puede incluir un primer sustrato y un segundo sustrato con una distancia de separación entre el primer y el segundo sustrato, proporcionando la distancia (que puede llenarse con aire o un líquido inmiscible) el espacio en el que una nanogota de muestra se pone en contacto con el primer miembro de unión (inmovilizado sobre una perla magnética o sobre uno de los dos sustratos); opcionalmente se realiza una etapa de lavado; seguida de la puesta en contacto del analito unido al primer miembro de unión con el segundo miembro de unión; se puede realizar una etapa opcional de mezcla y lavado; y se escinde el marcador fijado al segundo miembro de unión para generar una nanogota que contenga el marcador escindido. La nanogota que contiene el marcador escindido se puede colocar a continuación por una capa nanoporosa ubicada en el espacio entre el primer y el segundo sustrato.
Tal y como se indica en el presente documento, las nanogotas se pueden mover en el dispositivo integrado mediante numerosas formas, tal como, utilizando una fuerza de manipulación fluídica programable (p. ej., electrohumectación, dielectroforesis, accionamiento electrostático, mediada por campo eléctrico, fuerza mediada por electrodos, SAW, etc.). En determinados casos, el dispositivo y el módulo microfluídico pueden mover nanogotas de muestra y reactivos para realizar el análisis de analitos mediante el uso de electrodos. Los electrodos pueden ser coplanares, es decir, estar presentes en el mismo sustrato, o en una orientación enfrentada (biplanares), es decir, estar presentes en el primer y en el segundo sustrato. En determinados casos, el dispositivo o módulo microfluídico puede tener las configuraciones de electrodos que se describen en la patente de EE.UU. n° 6.911.132. En determinados casos, el dispositivo puede incluir un primer sustrato separado de un segundo sustrato por una distancia; el primer sustrato puede incluir una serie de electrodos colocada sobre una superficie superior; se puede disponer una capa dieléctrica sobre la superficie superior del primer sustrato y cubriendo la serie de electrodos para proporcionar una superficie esencialmente plana para el movimiento de las nanogotas. Opcionalmente, se puede colocar una capa de material hidrófobo sobre la superficie superior de la capa dieléctrica para proporcionar una superficie esencialmente plana. En determinados casos, el primer sustrato puede incluir electrodos coplanares, p. ej., electrodos impulsores/de control y de referencia presentes en un solo sustrato. En otros casos, el segundo sustrato que se coloca sobre el primer sustrato puede incluir un electrodo sobre la superficie inferior del segundo sustrato, donde la superficie inferior del segundo sustrato está dirigida hacia la superficie superior del primer sustrato. El electrodo de los segundos sustratos se puede cubrir con un material aislante. La serie de electrodos se puede disponer en una dirección longitudinal a lo largo de una longitud del módulo microfluídico o en una dirección lateral a lo largo de una anchura del módulo microfluídico, o ambas (p. ej., una serie o cuadrícula bidimensional). En determinados casos, la serie de electrodos puede ser activada (p. ej., encendida y apagada) por un procesador de un ordenador acoplado operativamente al dispositivo para mover las nanogotas de una manera programable. Se conocen dispositivos y métodos para accionar nanogotas en un dispositivo microfluídico. En casos ilustrativos, el módulo microfluídico puede ser similar a un accionador de nanogotas conocido en el campo. Por ejemplo, el primer sustrato (inferior) puede contener una serie estampada de electrodos controlables individualmente, y el segundo sustrato (superior) puede incluir un electrodo de conexión a tierra continuo. Se puede recubrir un aislante dieléctrico recubierto con un material hidrófobo sobre los electrodos para disminuir la humectabilidad de la superficie y añadir capacitancia entre la nanogota y los electrodos de control (la serie estampada de electrodos). Para mover una nanogota, se puede aplicar una tensión de control a un electrodo (de la serie de electrodos) adyacente a la nanogota, y al mismo tiempo, el electrodo de justo debajo de la nanogota se desactiva. Mediante la variación del potencial eléctrico a lo largo de una serie lineal de electrodos, se puede utilizar la electrohumectación para mover las nanogotas a lo largo de esta línea de electrodos.
El primer y el segundo sustrato pueden estar hechos de cualquier material adecuado. Los materiales adecuados, sin limitación, incluyen papel, polímero de película delgada, sílice, silicio, silicio procesado, vidrio (rígido o flexible), polímeros (rígidos, flexibles, opacos o transparentes) (p. ej., polimetilmetacrilato (PMMA) y copolímero de olefina cíclica (COC), poliestireno (PS), policarbonato (PC), placa de circuito impreso y polidimetilsiloxano (PDMS). En determinados casos, al menos el primer o el segundo sustrato puede ser esencialmente transparente. Se puede utilizar un sustrato esencialmente transparente en dispositivos en los que se realice la fotoescisión del marcador fijado a un segundo miembro de unión. En realizaciones en las que están presentes electrodos coplanares en uno de los sustratos, los electrodos pueden ser transparentes o no. En otras realizaciones, tales como en las que los electrodos están en orientación enfrentada, (presentes en ambos sustratos) los electrodos de al menos uno de los sustratos pueden ser esencialmente transparentes, por ejemplo, los electrodos pueden estar hechos de óxido de indio y estaño. Los electrodos pueden estar hechos de cualquier material adecuado. Los electrodos pueden estar hechos de cualquier material conductor, tal como metales puros o aleaciones, u otros materiales conductores. Los ejemplos incluyen aluminio, carbono (tal como grafito), cromo, cobalto, cobre, galio, oro, indio, iridio, hierro, plomo, magnesio, mercurio (como una amalgama), níquel, niobio, osmio, paladio, platino, renio, rodio, selenio, silicio (tal como silicio policristalino altamente dopado), plata, tántalo, estaño, titanio, tungsteno, vanadio, zinc, circonio, mezclas de los mismos, y aleaciones o compuestos metálicos de estos elementos. En determinadas realizaciones, el material conductor incluye carbono, oro, platino, paladio, iridio o aleaciones de estos metales, ya que dichos metales nobles y sus aleaciones no reaccionan en un ambiente acuoso.
En determinados casos, el primer sustrato o el segundo sustrato puede tener un primer miembro de unión inmovilizado encima en el espacio. Por ejemplo, una superficie del primer sustrato que está dirigida hacia una superficie del segundo sustrato puede incluir un área sobre la cual esté dispuesto un primer miembro de unión. Tal y como se indica en el presente documento, el primer miembro de unión (p. ej., un polipéptido, por ejemplo, un receptor, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo) se puede inmovilizar sobre la superficie de un sustrato sólido utilizando cualquier método convencional. En determinados casos, una primera posición sobre la superficie del primer o segundo sustrato en el espacio solo puede incluir un tipo de miembro de unión (p. ej., un solo tipo de anticuerpo). En otras realizaciones, una primera posición sobre la superficie del primer o segundo sustrato en el espacio solo puede incluir una pluralidad de miembros de unión diferentes, para el análisis de varios analitos. Como alternativa, el dispositivo puede incluir una pluralidad de ubicaciones sobre la superficie del primer o segundo sustratos, donde cada ubicación puede incluir un primer miembro de unión diferente inmovilizado encima.
En realizaciones en las que una superficie del primer sustrato o del segundo sustrato en el espacio tiene una pluralidad de ubicaciones en las que se inmovilizan primeros miembros de unión diferentes, las ubicaciones pueden disponerse linealmente a lo largo de una longitud del dispositivo. Una nanogota de muestra puede moverse linealmente para entrar en contacto secuencialmente cada una de la pluralidad de ubicaciones. En otra realización, una muestra se puede dividir en varias nanogotas y cada una de las nanogotas puede entrar en contacto independientemente con cada una de la pluralidad de ubicaciones. Tal y como se indica en el presente documento, el primer miembro de unión puede no estar fijado al primer o segundo sustrato y puede estar fijado a una perla que pueda introducirse en el dispositivo microfluídico como, p. ej., una nanogota.
Tal y como se indica en el presente documento, una muestra y cualquier reactivo para analizar la muestra se pueden manipular como volúmenes diferenciados de fluido que se pueden mover entre el primer y el segundo sustrato utilizando una fuerza de manipulación fluídica programable (p. ej., electrohumectación, dielectroforesis, accionamiento electrostático, mediada por campo eléctrico, fuerza mediada por electrodos, etc.). Por ejemplo, al menos uno del primer y del segundo sustrato puede incluir una serie de electrodos para manipular volúmenes diferenciados de fluido, p. ej., mover nanogotas de un lugar a otro entre el primer y el segundo sustrato, mezclar, fusionar, dividir, diluir, etc. En otro ejemplo, se pueden utilizar ondas acústicas superficiales para mover nanogotas para el método de análisis de analitos.
En otra realización, el módulo microfluídico puede mover nanogotas de muestra y reactivos para realizar análisis de analitos utilizando ondas acústicas superficiales. En estas realizaciones, el primer sustrato puede ser un material plano delgado que conduzca a la propagación de ondas acústicas superficiales. El primer sustrato puede ser una capa de cristal piezoeléctrico, tal como una oblea de niobato de litio (LiNbO3), cuarzo, LiTaO3. En determinados casos, la oblea piezoeléctrica se puede acoplar de forma desmontable a un supersustrato, donde las ondas acústicas superficiales (SAW) generadas a partir de un transductor se transmiten al supersustrato a través de un medio de acoplamiento dispuesto entre la capa de cristal piezoeléctrico y el supersustrato. La superficie superior del supersustrato puede estar recubierta por un segundo sustrato y una nanogota se puede mover en un espacio entre el segundo sustrato y la superficie superior del supersustrato mediante SAW generadas por un transductor interdigitado conectado a la capa de cristal piezoeléctrico. En determinados casos, el módulo microfluídico puede ser un dispositivo microfluídico de SAW descrito en el documento WO2011/023949.
En una realización alternativa, el módulo microfluídico puede incluir una primera superficie separada de una segunda superficie con un espacio entre la primera superficie y la segunda superficie, donde se manipulan nanogotas de muestra y de reactivo para realizar el análisis de muestras desvelado en el presente documento. El dispositivo microfluídico puede incluir además una capa de material de generación de ondas acústicas superficiales (SAW) acoplada a la primera superficie; y una estructura de electrodo transductor dispuesta en la capa de material de generación de SAW para proporcionar ondas acústicas superficiales (SAW) en la primera superficie para su transmisión a nanogotas sobre la primera superficie, donde la primera superficie tiene al menos un elemento de dispersión de SAW para afectar a la transmisión, distribución y/o comportamiento de los SAW en la primera superficie, y donde el material generador de SAW se selecciona del grupo que consiste en: material policristalino, material policristalino texturizado, material policristalino de textura biaxial, material microcristalino, material nanocristalino, material amorfo y material compuesto. En determinados casos, el material de generación de SAW puede ser material ferroeléctrico, material piroeléctrico, material piezoeléctrico o material magnetoestrictivo. La disposición de los elementos de dispersión de SAW puede proporcionar, en efecto, una estructura de cristal fonónico que interactúe o afecte al campo acústico en la primera superficie para afectar al movimiento de la nanogota sobre la primera superficie. En determinados casos, el módulo microfluídico puede ser un dispositivo microfluídico de SAW descrito en el documento US20130330247. El dispositivo microfluídico de SAW se puede utilizar junto con un dispositivo nanoporoso o puede tener un módulo nanoporoso integrado con el mismo.
Los dispositivos descritos en el presente documento se pueden utilizar junto con otro dispositivo o dispositivos, tal como, una fuente de energía, un generador de ondas acústicas y similares.
El dispositivo que se puede utilizar para llevar a cabo las etapas del método descritas en el presente documento también puede incluir medios para suministrar reactivo y recoger materiales de desecho. Dichos medios pueden incluir cámaras, almohadillas absorbentes, depósitos, etc. Estos medios pueden conectarse de forma fluida al dispositivo.
El módulo microfluídico se puede conectar de forma fluida a depósitos para suministrar reactivos de análisis de muestras, tal como, primer miembro de unión, segundo miembro de unión, tampón de lavado, reactivo inductor de la escisión y similares. El módulo nanoporoso se puede conectar de forma fluida a un depósito para recoger materiales de desecho, depósitos para suministrar solución conductora a las cámaras cis y trans y similares.
El dispositivo integrado puede ser automático o semiautomático y puede acoplarse de manera desmontable a un alojamiento que comprenda una fuente de electricidad para suministrar tensión a los electrodos y una memoria de acceso aleatorio para almacenar instrucciones para poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y donde el segundo miembro de unión comprende un marcador escindible fijado al mismo; retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión; escindir el marcador fijado al segundo miembro de unión unido al analito unido al primer miembro de unión; trasladar el marcador a través de o por nanoporos de una capa; determinar el número de marcadores que se trasladan a través de la capa; medir el analito en la muestra basándose en el número de marcadores que se trasladan a través de la capa o en el tiempo para trasladar un número conocido de marcadores durante un intervalo fijo de tiempo. Tal y como se indica en el presente documento, el método de análisis de analitos se puede ejecutar utilizando un procesador que controle el dispositivo. Por ejemplo, el dispositivo puede programarse para realizar análisis de analitos como se describe en el presente documento, incluyendo cualquier etapa opcional de mezcla, incubación y lavado como se desvela en el presente documento. El alojamiento puede incluir además un procesador para ejecutar las instrucciones almacenadas en la memoria. Los dispositivos descritos en el presente documento pueden incluir un módulo de adquisición de datos (DAQ, Data Acquisition Module) para procesar señales eléctricas procedentes del dispositivo o módulo nanoporoso. En determinados casos, también se puede incluir un amplificador de pinzamiento zonal para procesar señales eléctricas y lograr una relación señal/ruido óptima.
En determinados casos, los dispositivos descritos en el presente documento se pueden asociar con un sistema para realizar automáticamente al menos algunas etapas de los métodos de análisis de analitos. En la Fig. 9, se muestra un ejemplo de dicho sistema. El sistema ilustrativo incluye un componente de procesamiento 60 que incluye una unidad de procesamiento de datos 63 que tiene un procesador y una memoria, acoplado operativamente a la pantalla 61 y una unidad transmisora/receptora 62 que está en comunicación 64 con una unidad receptora/transmisora 69 de un dispositivo 68 de la presente divulgación. El dispositivo 68 está controlado por el componente de procesamiento 60 que ejecuta instrucciones (etapas de un programa) para realizar al menos algunas etapas de los métodos de análisis de analitos desvelados en el presente documento. En determinados casos, el componente de procesamiento 60 puede ser un ordenador, un medidor con una abertura para la inserción del dispositivo integrado (la abertura puede tener el tamaño y la forma de una ranura para alojar el dispositivo y conectarse operativamente al dispositivo), o una combinación de los mismos. La comunicación 64 entre el componente de procesamiento 60 y el dispositivo 68 puede ser por cable o inalámbrica. El dispositivo 68 puede ser cualquier dispositivo descrito en el presente documento con funcionalidad microfluídica 66 y nanoporosa 67. En determinados casos, el movimiento de una nanogota en los dispositivos desvelados en el presente documento se puede programar como se desvela en la patente de EE.UU. n.° 6.294.063.
Los diferentes procesos ilustrativos descritos en relación con las realizaciones del presente documento se pueden implementar o realizar con un procesador de uso general, un Procesador de Señales Digitales (PSD), un circuito integrado para aplicaciones específicas (ASIC, Application Specific Integrated Circuit), una matriz de compuertas programable de campo (FPGA, Field Programmable Gate Array) u otro dispositivo lógico programable, dispositivos lógicos de compuertas o transistores diferenciados, componentes de hardware diferenciados o cualquier combinación de los mismos diseñada para realizar las funciones descritas en el presente documento. Un procesador de uso general puede ser un microprocesador, pero, como alternativa, el procesador puede ser cualquier procesador convencional, controlador, microcontrolador o máquina de estado convencional. El procesador puede ser parte de un sistema informático que también tenga un puerto de interfaz de usuario que se comunique con una interfaz de usuario y que reciba comandos introducidos por un usuario, tenga al menos una memoria (p. ej., disco duro u otro almacenamiento comparable, y memoria de acceso aleatorio) que almacene información electrónica, incluyendo un programa que funcione bajo el control del procesador y con comunicación a través del puerto de interfaz de usuario, y una salida de video que produzca su salida a través de cualquier tipo de formato de salida de video, p. ej., VGA (Video Graphics Array, adaptador gráfico de vídeo), DVI (Digital Visual Interface, interfaz digital visual), HDMI (High Definition Multimedia Interface, interfaz multimedia de alta definición), DisplayPort o cualquier otro formato.
Un procesador también se puede implementar como una combinación de dispositivos informáticos, p. ej., una combinación de un PSD y un microprocesador, una pluralidad de microprocesadores, uno o más microprocesadores junto con un núcleo PSD, o cualquier otra configuración similar. Estos dispositivos también se pueden utilizar para seleccionar valores para dispositivos como se describe en el presente documento. La cámara puede ser una cámara basada en fototubos, fotodiodos, sensores de píxeles activos (CMOS), CCD (Charged Coupled Device, dispositivo de carga acoplada), fotorresistores, células fotovoltaicas u otra tecnología de captura de imágenes digitales.
Las etapas de un método o algoritmo descritos en relación con las realizaciones desveladas en el presente documento se pueden incorporar directamente en hardware, en un módulo de software ejecutado por un procesador o en una combinación de los dos. Un módulo de software puede residir en la memoria de acceso aleatorio (RAM, Random Access Memory), memoria flash, Memoria de solo lectura (ROM, Read Only Memory), ROM eléctricamente programable (EPROM, Electrically Programmable ROM), ROM eléctricamente programable y borrable (EEPROM, Electrically Erasable Programmable ROM), registros, disco duro, un disco extraíble, un CD-ROM (Compact Disc Read-Only Memory, discos compactos no registrables), una nube o cualquier otra forma de medio de almacenamiento conocida en la técnica. Un ejemplo de medio de almacenamiento está acoplado al procesador de modo que el procesador pueda leer información y escribir información en, el medio de almacenamiento. En la alternativa, el medio de almacenamiento puede ser parte integral del procesador. El procesador y el medio de almacenamiento pueden residir en un ASIC. El ASIC puede residir en un terminal de usuario. En la alternativa, el procesador y el medio de almacenamiento pueden residir como componentes diferenciados en un terminal de usuario.
En una o más realizaciones de ejemplo, las funciones descritas se pueden implementar en hardware, software, firmware, o cualquier combinación de los mismos. Si se implementa en software, las funciones se pueden almacenar en, transmitir sobre o dar lugar a la salida de datos de análisis/cálculo como una o más instrucciones, código u otra información en un medio legible por ordenador. Los medios legibles por ordenador incluyen tanto los medios de almacenamiento del ordenador como los medios de comunicación, incluyendo cualquier medio que facilite la transferencia de un programa de ordenador de un lugar a otro. Un medio de almacenamiento puede ser cualquier medio no transitorio disponible al que se pueda acceder mediante un ordenador. A modo de ejemplo, dichos medios legibles por ordenador pueden incluir RAM, ROM, EEPROM, CD-ROM u otro almacenamiento en disco óptico, almacenamiento en disco magnético u otros dispositivos de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio que se pueda utilizar para transportar o almacenar el código de programa deseado en forma de instrucciones o estructuras de datos y al que se pueda acceder mediante un ordenador. El almacenamiento de memoria también puede ser unidades de disco duro magnéticas giratorias, unidades de disco óptico o unidades de almacenamiento basadas en memoria flash u otro dispositivo de almacenamiento en estado sólido, magnético u óptico. Disco, como se usa en el presente documento, incluye disco compacto (CD, Compact Disc), disco láser, disco óptico, disco versátil digital (DVD, Digital Versatile Disc), disquete y disco Blu-ray, donde los discos suelen reproducir datos magnéticamente, mientras que los discos reproducen los datos de forma óptica con láser. Las combinaciones de los anteriores también deben incluirse dentro del alcance de los medios legibles por ordenador.
En la medida en que las realizaciones desveladas en el presente documento incluyan o funcionen en asociación con medios de memoria, de almacenamiento y/o legibles por ordenador, entonces, los medios de memoria, de almacenamiento y/o legibles por ordenador son no transitorios. Por consiguiente, en la medida en que los medios de memoria, de almacenamiento y/o legibles por ordenador están cubiertos por una o más reivindicaciones, entonces, esos medios de memoria, de almacenamiento y/o legibles por ordenador son solo no transitorios.
En determinados casos, el dispositivo puede ser un dispositivo microfluídico, tal como un dispositivo de laboratorio en chip, dispositivo microfluídico de flujo continuo o dispositivo microfluídico a base de nanogotas, donde el análisis de analitos se puede realizar en una nanogota de la muestra que contenga o que se sospeche que contiene un analito. Los ejemplos de dispositivos microfluídicos que se pueden utilizar en los presentes métodos incluyen los descritos en el documento WO2007136386, US8287808, WO2009111431, WO2010040227, WO2011137533, WO2013066441, WO2014062551 o WO2014066704. En determinados casos, el dispositivo puede ser un dispositivo microfluídico digital (DMF), un dispositivo microfluídico a base de ondas acústicas superficiales (SAW), un dispositivo nanoporoso y DMF totalmente integrado, o un dispositivo nanoporoso y de SAW totalmente integrado. En algunas realizaciones, el elemento DMF y un elemento nanoporoso están acoplados operativamente en el dispositivo nanoporoso y DMF totalmente integrado, o un elemento de SAW y un elemento nanoporoso están acoplados operativamente en el dispositivo nanoporoso y SAW totalmente integrado. En algunas realizaciones, el dispositivo DMF o el dispositivo de SAW se fabrica mediante un método electrónico impreso basado en rollo a rollo. En algunas realizaciones, el elemento DMF o el elemento de SAW se fabrica mediante métodos electrónicos impresos basados en rollo a rollo. En algunas realizaciones, el dispositivo nanoporoso y DMF totalmente integrado o el dispositivo nanoporoso y SAW totalmente integrado comprenden un conducto microfluídico. En algunas realizaciones, el conducto microfluídico acopla el elemento DMF al elemento nanoporoso, y el conducto microfluídico comprende un flujo fluídico que es inducido por fuerzas pasivas o fuerzas activas.
En el documento US8637242, se pueden encontrar ejemplos de técnicas de electrohumectación. También se puede utilizar electroforesis a microescala como la descrita en el documento WO2011057197. En el documento US6294063, se describe un ejemplo de técnica de dielectroforesis.
Los dispositivos de la presente divulgación están generalmente exentos de bombas y válvulas externas y, por lo tanto, son económicos de fabricar y de utilizar. Los dispositivos y los sistemas asociados desvelados en el presente documento, así como todos los métodos desvelados en el presente documento, son útiles para aplicaciones en el campo, tal como, para el análisis de una muestra en el origen de la muestra, tal como, en el punto de atención (p. ej., en clínicas, hospitales, consultorios médicos, instalaciones de laboratorio central, en hogares y similares). En algunos casos, un dispositivo o sistema de la presente divulgación (p. ej., también como se utiliza en los métodos desvelados en el presente documento) incluye una fuente de calor o una fuente de luz configurada para inducir, cuando se active la fuente de calor o la fuente de luz, la escisión de un enlazador térmicamente escindible o fotoescindible que una el marcador al analito, como se describe en el presente documento.
La presente divulgación también describe un dispositivo microfluídico utilizado junto con un dispositivo habilitado para nanoporos y un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico integrado. Un dispositivo habilitado para nanoporos se refiere a un dispositivo que incluye una capa o membrana en la que se puede crear un nanoporo. Un dispositivo habilitado para nanoporos de la presente divulgación incluye dos cámaras separadas por la capa o membrana, donde las dos cámaras incluyen un líquido iónico, (p. ej., una solución de sal, con o sin un analito de interés) para la conducción de corriente. Se puede crear un nanoporo en la capa del dispositivo habilitado para nanoporos aplicando una tensión a través de la capa utilizando el líquido iónico (p. ej., solución de sal, con o sin un analito de interés) en las cámaras. Como se entenderá, cualquiera de los dispositivos nanoporosos (utilizados junto con un dispositivo microfluídico o integrados con un módulo microfluídico) descritos en el presente documento se pueden proporcionar inicialmente como un dispositivo habilitado para nanoporos que incluya una capa en la que se pueda formar un nanoporo, pero que carezca de un nanoporo. Se puede crear un nanoporo en el dispositivo habilitado para nanoporos durante el uso, tal como, antes de utilizar el nanoporo para detectar el traslado de un marcador. En determinadas realizaciones, se puede utilizar un líquido iónico, p. ej., solución de sal, que contenga el marcador que va a ser detectado por el nanoporo tanto para crear el nanoporo como para trasladar un marcador por el nanoporo creado.
En algunas realizaciones, una cualidad del nanoporo que se crea aplicando tensión por la capa, como se ha descrito anteriormente, se evalúa por el nivel de ruido en una corriente medida cuando se aplica una tensión basal por la capa o membrana nanoporosa.
En algunos casos, el nanoporo creado aplicando tensión por la capa, como se ha descrito anteriormente, puede acondicionarse para alterar físicamente el nanoporo y obtener una propiedad electroosmótica deseada, p. ej., aumentar el tamaño de poro y/o reducir el ruido en la corriente medida por el nanoporo cuando se aplica una tensión por la capa o membrana nanoporosa. Por tanto, en algunas realizaciones, un método de generación de un nanoporo en un dispositivo habilitado para nanoporos y microfluídico digital integrado puede incluir acondicionar el nanoporo. El acondicionamiento puede incluir: aplicar alternativamente una primera tensión que tiene una primera polaridad y una segunda tensión que tiene una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad por la capa o membrana nanoporosa, en donde cada una de la primera y la segunda tensión se aplica al menos una vez; y medir una propiedad electroosmótica relacionada con el tamaño del nanoporo. En algunos casos, la propiedad electroosmótica relacionada con el tamaño del nanoporo se mide antes del acondicionamiento, para obtener una estimación inicial del tamaño del nanoporo.
La propiedad electroosmótica puede ser cualquier propiedad adecuada que proporcione una estimación del tamaño del nanoporo. En algunos casos, la propiedad electroosmótica está representada por una curva de corriente-tensión obtenida en un intervalo de tensiones (un intervalo de -1 V a 1 V, p. ej., de -500 mV a 500 mV, de -250 mV a 250 mV, de -200 mV a 200 mV, de 10 mV a 500 mV, de 10 mV a 250 mV, de 10 mV a 200 mV, incluyendo de 15 mV a 200 mV). En algunos casos, la propiedad electroosmótica es una conductancia o resistencia medida por la capa o membrana nanoporosa.
La primera y segunda tensión pueden tener cualquier magnitud adecuada para modificar el nanoporo y obtener las propiedades electroosmóticas deseadas. En algunos casos, la primera y la segunda tensión tienen una magnitud de 100 mV o superior, p. ej., 200 mV o superior, 500 mV o superior, 750 mV o superior, 1,0 V o superior, 2,0 V o superior,, 3,0 V o superior, incluyendo 4,0 V o superior, y en algunos casos tiene una magnitud de 10 V o inferior, p. ej., 9,0 V o inferior, 8,0 V o inferior, 6,0 V o inferior, incluyendo 4,0 V o inferior. En algunas realizaciones, la primera y la segunda tensión tienen una magnitud en el intervalo de 100 mV a 10 V, p. ej., de 200 mV a 9,0 V, de 250 mV a 9,0 V, de 500 mV a 9,0 V, de 1,0 V a 8,0 V, incluyendo de 2,0 V a 6,0 V.
La primera y la segunda tensión se pueden aplicar cada una durante cualquier período de tiempo adecuado para modificar el nanoporo y obtener las propiedades electroosmóticas deseadas. En algunos casos, la primera y la segunda tensión se aplican cada una durante 10 milisegundos (ms) o más, p. ej., 100 ms o más, 200 ms o más, 500 ms o más, 1 segundo (s) o más, 2 s o más, incluyendo 3 s o más, y en algunos casos, se aplica durante 10 s o menos, p.
ej., 5 s o menos, 4 s o menos, 3 s o menos, 2 s o menos, 1 s o menos, 500 ms o menos, 200 ms o menos, incluyendo 100 ms o menos. En algunos casos, cada una de la primera y la segunda tensión se aplica durante una duración en el intervalo de 10 ms a 100 ms, de 100 ms a 200 ms, de 200 ms a 500 ms, de 500 ms a 1 s, de 1 s a 2 s, de 2 s a 3 s, de 3 s a 4 s, de 3 s a 5 s, o de 3 s a 10 s.
La primera y la segunda tensión se pueden aplicar cada una cualquier número adecuado de veces para modificar el nanoporo y obtener las propiedades electroosmóticas deseadas. En algunos casos, cada una de la primera y la segunda tensión se aplica dos veces o más, tres veces o más, 4 veces o más, 5 veces o más, 7 veces o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 50 veces o más, 100 veces o más, 200 veces o más, incluyendo 500 veces o más, y en algunas realizaciones, se aplica durante 10000 veces o menos, p. ej., 5000 veces o menos, 1000 veces o menos, 500 veces o menos, 400 veces o menos, 200 veces o menos, 100 veces o menos, incluyendo 50 veces o menos. En algunas realizaciones, la primera y la segunda tensión se aplican cada una de dos a 50 veces, de 10 a 50 veces, de 30 a 50 veces, de 50 a 100 veces, de 100 a 200 veces, de 100 a 500 veces, de 500 a 1000 veces, de 500 a 1000 veces o de 500 a 10000 veces.
4. Integración de un módulo nanoporoso en un lado de un módulo DMF
Un aspecto de la presente divulgación incluye un dispositivo integrado que incluye un módulo microfluídico digital (DMF) y una capa nanoporosa colocada sobre un lado exterior del módulo DMF (Fig. 40). Se puede acceder al nanoporo de la capa nanoporosa mediante una nanogota en un espacio interno del módulo DMF a través de un orificio (también denominado "abertura") que está presente en el primer (p. ej., superior) o segundo (p. ej., inferior) sustrato del módulo DMF o a través de un lado del módulo DMF entre el primer y segundo sustrato. Como se ha descrito anteriormente, la capa nanoporosa puede incluir una membrana nanoporosa o un sustrato nanoporoso, que, en algunos casos, puede ser una membrana de nitruro de silicio (SiNx) disponible en el mercado en una ventana de microscopio electrónico de transmisión (MET). La capa nanoporosa forma un sello sobre el orificio de modo que, en ausencia de un nanoporo (es decir, antes de la fabricación de un nanoporo, como se describe en el presente documento), un volumen de líquido del módulo DMF se aísla físicamente de cualquier volumen de líquido sobre o alrededor del exterior de la capa nanoporosa. En algunos casos, la capa nanoporosa forma parte de un módulo nanoporoso, donde la capa nanoporosa separa un compartimento dentro del módulo nanoporoso de un volumen de líquido en el módulo DMF (p. ej., una nanogota de líquido en el orificio del sustrato, como se ha descrito anteriormente). La capa nanoporosa o el módulo nanoporoso se sella a la superficie exterior del sustrato de modo que un volumen de líquido (p. ej., una nanogota de líquido en el orificio del sustrato) está aislada físicamente del entorno exterior.
El orificio del sustrato a través del cual una nanogota de líquido en DMF tiene acceso a la capa nanoporosa puede dimensionarse para que sea adecuado para que una nanogota de líquido se mueva a través del orificio por acción capilar. Por tanto, el orificio en el sustrato puede ser un canal capilar. El orificio puede tener cualquier forma y dimensiones de sección transversal adecuadas para soportar el movimiento de una nanogota de líquido a través del orificio de forma pasiva, p. ej., por acción capilar. En algunos casos, el diámetro del orificio es más ancho en el lado DMF que el diámetro del orificio en el lado exterior (es decir, el lado dirigido hacia la capa nanoporosa). En algunos casos, el ángulo entre la superficie inferior del sustrato y la pared del orificio es un ángulo recto u obtuso (p. ej., de 90° o más, p. ej., de 95 ° o más, incluyendo 100° o más).
El dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado puede incluir un par de electrodos, que pueden ser útiles para fabricar el nanoporo en la capa nanoporosa y/o para detectar un analito de interés que haya sido procesado por el módulo DMF, como se describe en otra parte del presente documento. Los electrodos pueden estar hechos de cualquier material adecuado, incluyendo, pero sin limitación, óxido de indio y estaño (ITO). El par de electrodos se puede configurar de cualquier manera adecuada. En algunas realizaciones, un electrodo se coloca en un compartimento del módulo nanoporoso, y un segundo electrodo se coloca en el módulo DMF, penetrando físicamente en el sustrato para acceder al volumen de líquido en el otro lado de la capa nanoporosa (Fig. 40).
En algunas realizaciones, el primer electrodo puede ser el mismo electrodo que el uno solo electrodo continuo (p. ej., el electrodo de referencia) utilizado en el módulo DMF, y el segundo electrodo puede estar dispuesto sobre la superficie superior (es decir, superficie exterior) del sustrato opuesto a la superficie inferior sobre la que está colocado el primer electrodo (Fig. 43). En dichos casos, la superficie superior puede tratarse de manera similar a la superficie inferior (p. ej., recubrimiento con un material de electrodo, tal como óxido de indio y estaño y un polímero, tal como politetrafluoroetileno (incluyendo Teflon®). Por tanto, en algunos casos, donde el segundo electrodo es un electrodo sobre la superficie superior del sustrato al que se fija la capa nanoporosa/módulo nanoporoso, el volumen de líquido sobre la superficie exterior de la capa nanoporosa en relación con el módulo DMF está en contacto eléctrico con el segundo electrodo. La vía eléctrica para la fabricación de nanoporos se puede representar como: segundo electrodo -> líquido (externo) -> membrana nanoporosa (sin un nanoporo) -> líquido (interno al módulo DMF) -> primer electrodo (igual que el uno solo electrodo continuo del DMF). El segundo electrodo también puede estar ausente del área donde se le fija la capa nanoporosa/el módulo nanoporoso para forzar la corriente en el líquido sobre el exterior de la membrana nanoporosa, que, en algunos casos, puede estar contenido dentro del módulo nanoporoso.
En algunas realizaciones, como se muestra en la Fig. 44, el primer electrodo es el mismo electrodo que el uno solo electrodo continuo (p. ej., el electrodo de referencia) utilizado en un primer módulo DMF (p. ej., "chip DMF inferior" en la Fig. 44), y el segundo electrodo puede ser proporcionado por un segundo módulo DMF (p. ej., "chip DMF superior" en la Fig. 44) que tiene un orificio en un sustrato superior correspondiente asociado con el uno solo electrodo continuo del segundo módulo DMF, y la capa nanoporosa se interpone entre los dos módulos DMF entre los orificios de los respectivos sustratos. Por tanto, el primer y el segundo módulo DMF pueden tener una orientación invertida entre sí de modo que el sustrato superior asociado con el uno solo electrodo continuo del primer módulo DMF esté próximo al y dirigido hacia el sustrato superior asociado con el uno solo electrodo continuo del segundo módulo DMF. Los dos módulos DMF pueden colocarse entre sí de modo que, cuando haya un nanoporo en la capa nanoporosa, los dos módulos DMF estén acoplados de forma fluida y eléctrica a través de la membrana nanoporosa. Antes de la formación del nanoporo, los dos volúmenes de fluido de los dos módulos DMF pueden aislarse entre sí. En algunos casos, se interpone una capa estructural entre los dos módulos DMF para proporcionar soporte estructural y reducir la flexión.
También se proporciona en el presente documento un método de fabricación de un nanoporo en una capa habilitada para nanoporos, en un dispositivo de módulo nanoporoso y DMF integrado, como se ha descrito anteriormente. Una implementación del método puede incluir colocar un líquido iónico, p. ej., una solución de sal (p. ej., LiCI, KCI, etc.) en el orificio del módulo DMF utilizando cualquier método adecuado, como se describe en el presente documento, y permitir que la acción capilar mueva el líquido a través del orificio (véase, p. ej., Fig. 40). Se puede colocar un líquido iónico, p. ej., una solución de sal, sobre el otro lado de la capa habilitada para nanoporos (es decir, la membrana nanoporosa antes de la fabricación de un nanoporo). Se sella el módulo nanoporoso desde el módulo DMF, utilizando cualquier método adecuado, tal como, pero sin limitación, PDMS, presión, cera, adhesivo, etc., de modo que el volumen de líquido del orificio se aísle de un volumen de líquido del otro lado de la membrana nanoporosa. La aplicación de un campo eléctrico, tal como una tensión por la capa habilitada para nanoporos conduce a la formación final de un nanoporo, que se puede detectar fácilmente, p. ej., como una ruptura dieléctrica en una traza de corriente.
Tras la creación de un nanoporo en la capa nanoporosa, en algunos casos, se puede llevar a cabo un proceso de acondicionamiento para modificar físicamente el nanoporo y limpiar la señal. En algunos casos, el acondicionamiento incluye variar la tensión aplicada por el nanoporo a lo largo del tiempo.
Tras la fabricación del nanoporo, el módulo DMF puede reactivarse para completar cualquier etapa de preprocesamiento de líquidos para el traslado (p. ej., el reemplazo de la solución en el DMF, tal como el reemplazo de KCI por LiCI). Tras el preprocesamiento, el volumen de líquido DMF, p. ej., se puede colocar una muestra líquida que contenga un analito de interés en el orificio. Entonces, se puede desactivar el sistema DMF y se puede habilitar el módulo nanoporoso para permitir y detectar eventos de traslado.
5. Variaciones sobre los métodos y el uso del dispositivo
Los métodos desvelados para determinar la presencia o cantidad de analito de interés presente en una muestra, y el uso del dispositivo microfluídico, puede ser como se ha descrito anteriormente. Los métodos y el uso del dispositivo microfluídico desvelado también se pueden adaptar en vista de otros métodos para analizar analitos. Los ejemplos de variaciones bien conocidas incluyen, pero sin limitación, inmunoensayo, tal como el inmunoensayo de tipo sándwich (p. ej., inmunoensayos de tipo sándwich monoclonales-policlonales, incluyendo la detección de enzimas (inmunoensayo enzimático (EIA, Enzyme ImmunoAssay) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), inmunoensayo de inhibición competitiva (p. ej., directo e inverso), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT, Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), un ensayo de unión competitiva, transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET, Bioluminescence Resonance Energy Transfer), ensayo de detección de anticuerpos en una sola etapa, ensayo homogéneo, ensayo heterogéneo, ensayo de captura al vuelo, etc. En algunos casos, las siguientes descripciones pueden superponerse al método descrito anteriormente; en otros, las siguientes descripciones pueden proporcionar alternativas.
a) Inmunoensayo
El analito de interés y/o los péptidos o fragmentos del mismo, se pueden analizar utilizando un inmunoensayo. La presencia o cantidad de analito de interés se puede determinar utilizando los anticuerpos descritos en el presente documento y detectando la unión específica al analito de interés. Se puede utilizar cualquier inmunoensayo. El inmunoensayo puede ser un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), un ensayo de inhibición competitiva, tal como ensayo de inhibición competitiva directo o inverso, o un ensayo de unión competitiva, por ejemplo. En algunas realizaciones, se fija un marcador al anticuerpo de captura y al anticuerpo de detección. Como alternativa, una micropartícula o nanopartícula empleada para la captura, también puede funcionar para la detección (p. ej., donde se fija o se asocia mediante algún medio a un enlazador escindible).
Se puede utilizar un formato heterogéneo. Por ejemplo, una vez obtenida la muestra de prueba de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que se está evaluando para determinar el analito de interés y una primera pareja de unión específica, en donde la primera pareja de unión específica y cualquier analito de interés contenido en la muestra de prueba forman un primer complejo de pareja de unión específica-analito de interés. Preferentemente, la primera pareja de unión específica es un anticuerpo anti-analito de interés o un fragmento del mismo. El orden en el que se añaden la muestra de prueba y la primera pareja de unión específica para formar la mezcla es irrelevante. Preferentemente, la primera pareja de unión específica se inmoviliza sobre una fase sólida. La fase sólida utilizada en el inmunoensayo (para la primera pareja de unión específica y, opcionalmente, la segunda pareja de unión específica) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tal como, pero sin limitación, una partícula magnética, una perla o una nanoperla, una microperla, una nanopartícula, una micropartícula, una membrana, una molécula de armazón, una película, un papel de filtro, un disco o un chip (p. ej., un chip microfluídico).
Una vez formada la mezcla que contiene el complejo de primera pareja de unión específica-analito de interés, cualquier analito de interés no unido se retira del complejo utilizando cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, el analito de interés no unido se puede retirar mediante lavado. Convenientemente, sin embargo, la primera pareja de unión específica está presente en exceso con respecto a cualquier analito de interés presente en la muestra de prueba, de modo que todo el analito de interés que esté presente en la muestra de prueba esté unido por la primera pareja de unión específica.
Tras retirar cualquier analito de interés no unido, se añade una segunda pareja de unión específica a la mezcla para formar un complejo de primera pareja de unión específica-analito de interés-segunda pareja de unión específica. La segunda pareja de unión específica es preferentemente un anticuerpo anti-analito de interés que se une a un epítopo en el analito de interés que difiere del epítopo del analito de interés unido por la primera pareja de unión específica. Por otra parte, también preferentemente, la segunda pareja de unión específica está marcada con o contiene un marcador detectable (p. ej., marcador fijado por un enlazador escindible, como se ha descrito anteriormente).
El uso de anticuerpos inmovilizados o fragmentos de los mismos puede incorporarse al inmunoensayo. Los anticuerpos pueden inmovilizarse sobre una variedad de soportes, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica, partículas de látex o partículas de látex de superficie modificada, polímero o película polimérica, plástico o película de plástico, sustrato plano, una superficie microfluídica, trozos de un material de sustrato sólido y similares.
b) Inmunoensayo de tipo sándwich
El inmunoensayo de tipo sándwich mide la cantidad de antígeno entre dos capas de anticuerpos (es decir, un anticuerpo de captura (es decir, al menos un anticuerpo de captura) y un anticuerpo de detección (es decir, al menos un anticuerpo de detección). El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección se unen a diferentes epítopos del antígeno, p. ej., analito de interés. Convenientemente, la unión del anticuerpo de captura a un epítopo no interfiere con la unión del anticuerpo de detección a un epítopo. Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o policlonales como anticuerpos de captura y detección en el inmunoensayo de tipo sándwich.
Generalmente, se emplean al menos dos anticuerpos para separar y cuantificar el analito de interés en una muestra de prueba. Más específicamente, los al menos dos anticuerpos se unen a determinados epítopos del analito de interés o un fragmento del analito de interés que forma un complejo inmunitario que se denomina "sándwich". Se pueden utilizar uno o más anticuerpos para capturar el analito de interés en la muestra de prueba (estos anticuerpos se denominan con frecuencia un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura"), y se pueden utilizar uno o más anticuerpos con un marcador detectable (p. ej., marcador fijado por un enlazador escindible) que también se unen al analito de interés (estos anticuerpos se denominan frecuentemente anticuerpo de "detección" o anticuerpos de "detección") para completar el sándwich. En algunas realizaciones, se puede utilizar un aptámero como segundo miembro de unión y puede servir como marcador detectable. En un ensayo de tipo sándwich, convenientemente, la unión de un anticuerpo a su epítopo no es disminuida por la unión de cualquier otro anticuerpo del ensayo a su epítopo respectivo. En otras palabras, los anticuerpos se seleccionan de modo que uno o más primeros anticuerpos que se ponen en contacto con una muestra de prueba que se sospecha que contiene un analito de interés no se unen a todo ni a parte de un epítopo reconocido por el segundo anticuerpo o anticuerpos posteriores, interfiriendo así con la capacidad de uno o más segundos anticuerpos de detección para unirse al analito de interés.
En una realización preferida, una muestra de prueba que se sospecha que contiene un analito de interés puede ponerse en contacto con al menos un anticuerpo (o anticuerpos) de captura y al menos un anticuerpo de detección de forma simultánea o secuencial. En el formato de ensayo de tipo sándwich, una muestra de prueba que se sospecha que contiene un analito de interés (analito de interés asociado a la membrana, analito de interés soluble, fragmentos de analito asociado a la membrana de interés, fragmentos de analito de interés soluble, variantes de analito de interés [analito de interés asociado a membrana o soluble] o cualquier combinación de los mismos) primero se pone en contacto con el al menos un anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo particular en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-analito de interés. Si se utiliza más de un anticuerpo de captura, se forma un complejo de varios anticuerpos de captura-analito de interés. En un ensayo de tipo sándwich, los anticuerpos, preferentemente, el al menos un anticuerpo de captura, se utilizan en cantidades molares en exceso con respecto a la cantidad máxima de analito de interés o del fragmento de analito de interés esperado en la muestra de prueba.
Opcionalmente, antes de poner en contacto la muestra de prueba con el al menos un primer anticuerpo de captura, el al menos un anticuerpo de captura se puede unir a un soporte sólido que facilite la separación del complejo de anticuerpo-analito de interés de la muestra de prueba. Se puede utilizar cualquier soporte sólido conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, soportes sólidos hechos de materiales poliméricos en forma de sustratos planos o perlas, y similares. El anticuerpo (o anticuerpos) se puede unir al soporte sólido por adsorción, por enlace covalente utilizando un agente de acoplamiento químico o mediante otros medios conocidos en la técnica, siempre que dicha unión no interfiera con la capacidad del anticuerpo para unirse al analito de interés o al fragmento del analito de interés. Por otra parte, si fuera necesario, el soporte sólido puede derivatizarse para permitir la reactividad con diferentes grupos funcionales del anticuerpo. Dicha derivatización requiere el uso de determinados agentes de acoplamiento tales como, pero sin limitación, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida, azido, alquinilo y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
Una vez que la muestra de prueba sospechosa de contener un analito de interés se pone en contacto con el al menos un anticuerpo de captura, la muestra de prueba se incuba para permitir la formación de un complejo de anticuerpo de captura (o anticuerpos de captura)-analito de interés. La incubación se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 10,0, a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 45 °C, y durante un período de al menos aproximadamente un (1) minuto a aproximadamente dieciocho (18) horas, de aproximadamente 2-6 minutos o de aproximadamente 3-4 minutos.
Tras la formación del complejo de anticuerpo (anticuerpos) de captura-analito de interés, a continuación, el complejo se pone en contacto con al menos un anticuerpo de detección (en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo (anticuerpos) de captura -analito de interés-anticuerpo (anticuerpos) de detección). Si el complejo de anticuerpo de captura-analito de interés se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, entonces, se forma un complejo de anticuerpo (anticuerpos) de captura-analito de interés-anticuerpo (anticuerpos) de detección. Al igual que con el anticuerpo de captura, cuando el al menos un anticuerpo de detección (y posteriores) se pone en contacto con el complejo de anticuerpo de captura-analito de interés, Se requiere un período de incubación en condiciones similares a las descritas anteriormente para la formación del complejo de anticuerpo (anticuerpos) de captura-analito de interés-anticuerpo (anticuerpos) de detección. Preferentemente, al menos un anticuerpo de detección contiene un marcador detectable (p. ej., marcador fijado por un enlazador escindible). El marcador detectable se puede unir al al menos un anticuerpo de detección antes de, simultáneamente con o después de la formación del complejo de anticuerpo (anticuerpos) de captura-analito de interés-anticuerpo (anticuerpos) de detección. Se puede utilizar cualquier marcador detectable conocido en la técnica, p. ej., un enlazador escindible como se describe en el presente documento, y otros conocidos en la técnica.
El orden en el que se añaden la muestra de prueba y la/s pareja/s de unión específica para formar la mezcla para el ensayo es irrelevante. Si la primera pareja de unión específica está marcada de forma detectable (p. ej., marcador fijado con un enlazador escindible), entonces, se forman complejos de primera pareja de unión específica marcada de forma detectable-analito. Como alternativa, si se utiliza una segunda pareja de unión específica, y la segunda pareja de unión específica está marcada de forma detectable (p. ej., marcador fijado con un enlazador escindible), entonces, se forman complejos marcados de forma detectable de primera pareja de unión específica-analito de interés-segunda pareja de unión específica. Cualquier pareja de unión específica no unida, bien marcada o no marcada, se puede retirar de la mezcla utilizando cualquier técnica conocida en la técnica, tal como el lavado.
A continuación, se genera una señal indicativa de la presencia del analito de interés o de un fragmento del mismo. Según los parámetros de la señal generada, se puede cuantificar la cantidad de analito de interés de la muestra. Opcionalmente, se puede generar una curva patrón utilizando diluciones en serie o soluciones de concentraciones conocidas de analito de interés mediante espectroscopia de masas, métodos gravimétricos y otras técnicas conocidas en la técnica.
c) Inhibición competitiva directa
En un formato competitivo directo, se utiliza una alícuota de analito de interés marcado (p. ej., analito que tiene un marcador fijado con un enlazador escindible) de una concentración conocida para competir con el analito de interés en una muestra de prueba por la unión al anticuerpo anti-analito de interés.
En un ensayo competitivo directo, se puede poner una pareja de unión específica inmovilizada (tal como un anticuerpo) en contacto secuencial o simultáneamente con la muestra de prueba y un analito de interés marcado, fragmento de analito de interés o variante de analito de interés del mismo. El analito de interés peptídico, fragmento del analito de interés o la variante del analito de interés se puede marcar con cualquier marcador detectable, incluyendo un marcador detectable que comprende un marcador fijado con un enlazador escindible. En este ensayo, el anticuerpo se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Como alternativa, el anticuerpo se puede acoplar a un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-especie, que se haya inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como una micropartícula o un sustrato plano.
En el presente documento, se proporcionan métodos para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito marcado, en donde el analito marcado está marcado con un marcador escindible; retirar el analito marcado no unido al miembro de unión; escindir el marcador fijado al analito marcado unido al miembro de unión; trasladar el marcador escindido a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde el número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En el presente documento, se proporcionan métodos para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido y en donde el miembro de unión se une específicamente al analito; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito marcado, en donde el analito marcado comprende un aptámero; retirar el analito marcado no unido al miembro de unión; disociar el aptámero unido al analito marcado unido al miembro de unión y trasladar el aptámero disociado a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
El analito de interés marcado, la muestra de prueba y el anticuerpo se incuban en condiciones similares a las descritas anteriormente en relación con el formato de ensayo de tipo sándwich. A continuación, se pueden generar dos especies diferentes de complejos de anticuerpo-analito de interés. Específicamente, uno de los complejos de anticuerpo-analito de interés generado contiene un marcador detectable (p. ej., marcador) mientras que el otro complejo de anticuerpoanalito de interés no contiene un marcador detectable. El complejo de anticuerpo-analito de interés se puede, pero no necesariamente, separar del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación del marcador detectable. Independientemente de si el complejo de anticuerpo-analito de interés se separa del resto de la muestra de prueba, a continuación, se cuantifica la cantidad de marcador detectable del complejo de anticuerpo-analito de interés. A continuación, se puede determinar la concentración de analito de interés (tal como el analito de interés asociado a la membrana, analito de interés soluble, fragmentos de analito de interés soluble, variantes de analito de interés [analito de interés asociado a la membrana o soluble] o cualquier combinación de los mismos) en la muestra de prueba, p. ej., como se ha descrito anteriormente. Si es útil, la determinación se puede realizar comparando la cantidad de marcador detectable del complejo de anticuerpo-analito de interés con una curva patrón. La curva patrón se puede generar utilizando diluciones en serie del analito de interés (tal como el analito de interés asociado a la membrana, analito de interés soluble, fragmentos de analito de interés soluble, variantes de analito de interés [analito de interés asociado a la membrana o soluble] o cualquier combinación de los mismos) de concentración conocida, donde la concentración se determina mediante espectroscopia de masas, gravimétricamente y mediante otras técnicas conocidas en la técnica.
Opcionalmente, el complejo de anticuerpo-analito de interés se puede separar de la muestra de prueba uniendo el anticuerpo a un soporte sólido, tal como los soportes sólidos descritos anteriormente en relación con el formato de ensayo de tipo sándwich, y luego retirar el resto de la muestra de prueba del contacto con el soporte sólido.
d) Ensayo competitivo inverso
En un ensayo competitivo inverso, se puede poner en contacto un analito de interés inmovilizado secuencial o simultáneamente con una muestra de prueba y al menos un anticuerpo marcado.
En el presente documento, se proporcionan métodos para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión está marcado con un marcador escindible; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido; retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado; escindir el marcador fijado al miembro de unión unido al analito inmovilizado; trasladar el marcador escindido a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el marcador que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde el número de marcadores que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los marcadores que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
En el presente documento, se proporcionan métodos para medir o detectar un analito presente en una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra con un miembro de unión, en donde el miembro de unión se une específicamente al analito y el miembro de unión comprende un aptámero; poner en contacto la muestra, que puede contener analito unido al miembro de unión, con un analito inmovilizado, en donde el analito inmovilizado está inmovilizado sobre un soporte sólido; retirar el miembro de unión no unido al analito inmovilizado; disociar el aptámero unido al miembro de unión que está unido al analito inmovilizado y trasladar el aptámero disociado a través de o por uno o más nanoporos de una capa; y evaluar el aptámero que se traslada a través de la capa, en donde la medición del número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra, o la detección de aptámeros que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la medición de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde el número de aptámeros que se trasladan a través de la capa mide la cantidad de analito presente en la muestra. En algunas realizaciones, se evalúa la detección de los aptámeros que se trasladan a través de la capa, en donde la detección de marcadores que se trasladan a través de la capa detecta que el analito está presente en la muestra.
El analito de interés se puede unir a un soporte sólido, tal como los soportes sólidos descritos anteriormente en relación con el formato de ensayo de tipo sándwich.
El analito inmovilizado de interés, la muestra de prueba y al menos un anticuerpo marcado se incuban en condiciones similares a las descritas anteriormente en relación con el formato de ensayo de tipo sándwich. A continuación, se generan dos complejos de analito de interés-anticuerpo de especies diferentes. Específicamente, uno de los complejos de analito de interés-anticuerpo generado está inmovilizado y contiene un marcador detectable (p. ej., marcador fijado con un enlazador escindible) mientras que el otro complejo de analito de interés-anticuerpo no está inmovilizado y contiene un marcador detectable. El complejo de analito de interés-anticuerpo no inmovilizado y el resto de la muestra de prueba se retiran de la presencia del complejo de analito de interés-anticuerpo inmovilizado mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como el lavado. Una vez que se retira el complejo de analito de interés-anticuerpo no inmovilizado, a continuación, se cuantifica la cantidad de marcador detectable del complejo de analito de interésanticuerpo inmovilizado tras la escisión del marcador. La concentración de analito de interés en la muestra de prueba se puede determinar comparando la cantidad de marcador detectable como se ha descrito anteriormente. Si es útil, esto se puede realizar con el uso de una curva patrón. La curva patrón se puede generar utilizando diluciones en serie de analito de interés o fragmento de analito de interés de concentración conocida, donde la concentración se determina mediante espectroscopia de masas, gravimétricamente y mediante otras técnicas conocidas en la técnica.
e) Inmunoensayo de una sola etapa o ensayo de captura al vuelo
En un inmunoensayo de una sola etapa o un ensayo de captura al vuelo, se recubre previamente un sustrato sólido con un agente de inmovilización. El agente de captura, el analito y el agente de detección se añaden al sustrato sólido juntos, seguido de una etapa de lavado antes de la detección. El agente de captura se puede unir al analito y comprende un ligando para un agente de inmovilización.
El agente de captura y los agentes de detección pueden ser anticuerpos o cualquier otro resto capaz de realizar la captura o la detección como se describe en el presente documento o se conoce en la técnica. El ligando puede comprender un marcador peptídico y un agente de inmovilización puede comprender un anticuerpo anti-marcador peptídico. De manera alternativa, el ligando y el agente de inmovilización pueden ser cualquier par de agentes capaces de unirse para ser empleados para un ensayo de captura al vuelo (p. ej., par de unión específica, y otros tales como los conocidos en la técnica). Se puede medir más de un analito. En algunas realizaciones, el sustrato sólido se puede recubrir con un antígeno y el analito que se va a analizar es un anticuerpo.
En algunas realizaciones, se utilizan un soporte sólido (tal como una micropartícula) previamente recubierto con un agente de inmovilización (tal como biotina, estreptavidina, etc.) y al menos un primer miembro de unión específica y un segundo miembro de unión específica (que funcionan como reactivos de captura y de detección, respectivamente). El primer miembro de unión específica comprende un ligando para el agente de inmovilización (por ejemplo, si el agente de inmovilización sobre el soporte sólido es estreptavidina, el ligando del primer miembro de unión específica puede ser biotina) y también se une al analito de interés. El segundo miembro de unión específica comprende un marcador detectable y se une a un analito de interés. El soporte sólido y el primer y segundo miembro de unión específica se pueden añadir a una muestra de prueba (secuencial o simultáneamente). El ligando del primer miembro de unión específica se une al agente de inmovilización sobre el soporte sólido para formar un complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica. Cualquier analito de interés presente en la muestra se une al complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica para formar un complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica/analito. El segundo miembro de unión específica se une al complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específica/analito y se detecta el marcador detectable. Se puede emplear una etapa de lavado opcional antes de la detección. En determinadas realizaciones, en un ensayo de una sola etapa se puede medir más de un analito. En otras determinadas realizaciones, se pueden emplear más de dos miembros de unión específica. En otras determinadas realizaciones, se pueden añadir varios marcadores detectables. En otras determinadas realizaciones, se pueden detectar varios analitos de interés.
El uso de un inmunoensayo de una sola etapa o de un ensayo de captura al vuelo se puede realizar en una variedad de formatos como se describe en el presente documento y es conocido en la técnica. Por ejemplo, el formato puede ser un ensayo de tipo sándwich tal como el descrito anteriormente, pero, como alternativa, puede ser un ensayo competitivo, puede emplear un solo miembro de unión específica o utilizar otras variaciones tales como las conocidas.
f) Ensayos combinados (junto con recubrimiento de micropartículas con Ag/Ac)
En un ensayo combinado, un sustrato sólido, tal como una micropartícula, se recubre conjuntamente con un antígeno y un anticuerpo para capturar un anticuerpo y un antígeno de una muestra, respectivamente. El soporte sólido se puede recubrir conjuntamente con dos o más antígenos diferentes para capturar dos o más anticuerpos diferentes de una muestra. El soporte sólido se puede recubrir conjuntamente con dos o más anticuerpos diferentes para capturar dos o más antígenos diferentes de una muestra.
Adicionalmente, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizar agentes de bloqueo para prevenir reacciones de unión bien específicas o no específicas (p. ej., preocupación por los HAMA) entre los compuestos de ensayo. Una vez que el agente (y opcionalmente, cualquier control) está inmovilizado en el soporte, se pueden bloquear los sitios de unión restantes del agente sobre el soporte. Se puede utilizar cualquier reactivo de bloqueo adecuado conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden emplear albúmina de suero bovino ("BSA"), soluciones salinas tamponadas con fosfato ("PBS") de caseína en PBS, Tween 20™ (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) u otro tensioactivo adecuado, así como otros reactivos de bloqueo.
Como se desprende de la presente divulgación, los métodos y dispositivos desvelados en el presente documento, incluyendo las variaciones, se pueden utilizar para diagnosticar una enfermedad, un trastorno o una afección en un sujeto sospechoso de tener la enfermedad, el trastorno o la afección. Por ejemplo, el análisis de la muestra puede ser útil para detectar un marcador de enfermedad, tal como, un marcador de cáncer, un marcador de una afección cardíaca, una toxina, un patógeno, tal como, un virus, una bacteria o una parte de la misma. Los métodos y dispositivos también se pueden utilizar para medir el analito presente en una muestra biológica. Los métodos y dispositivos también se pueden utilizar en ensayos de exploración de sangre para detectar un analito diana. Los ensayos de exploración de sangre se pueden utilizar para analizar un suministro de sangre.
6. Recuento y análisis de datos
El número de eventos de traslado se puede determinar cualitativa o cuantitativamente utilizando cualquier técnica habitual conocida en la técnica. En algunas realizaciones, el número de eventos de traslado se puede determinar calculando primero el cambio de corriente anticipado que se encuentra en un evento de traslado de ADN bicatenario en condiciones de prueba experimentales utilizando la ecuación:
AG = and2ADN (51)
como se hace referencia en Kwok et al., "Nanopore Fabrication by controlled Dielectric Breakdown" Apartado de información complementaria 8 y Kwok, H.; Briggs, K.; y Tabard-Cossa, V.; "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown" - PLoS ONE 9(3): e92880 (2014). Utilizando este valor de bloqueo de la corriente anticipado, Se pueden escanear visual o manualmente los datos del archivo binario de los resultados del nanoporo experimental en busca de eventos de bloqueo de la corriente anticipados aceptables. Utilizando estos eventos, se pueden aplicar y ejecutar los parámetros de Umbral e Histéresis necesarios para el software para nanoporos CUSUM. Los resultados de este software se pueden analizar más a fondo utilizando el software cusumtools readevents.py y filtrando los eventos de bloqueo mayores de 1000 pA (según lo determinado a partir del primer cálculo). Los eventos de flujo, el tiempo entre eventos y otros cálculos se pueden determinar con la herramienta de análisis readevents.py. Se pueden realizar cálculos adicionales sobre los datos generados por CUSUM utilizando el software JMP (SAS Institute, Cary, Carolina del Norte). Se pueden utilizar otros métodos de establecimiento de umbrales para el análisis de datos conocidos en la técnica.
7. Análisis cualitativo
Se puede realizar un ensayo cualitativo utilizando los métodos y el proceso de etapas descritos en el presente documento. Se puede realizar un ensayo directo utilizando el conjugado de enlazador escindible, como se describe en el Ejemplo 17, con una etapa de escisión a base de tiol, como se muestra en la Figura 25. Se entiende que otros enfoques de enlazadores escindibles para realizar dicho ensayo también pueden incluir, pero sin limitación, otros diversos métodos de escisión de un enlazador para permitir el recuento de diversos marcadores, como se describe en el presente documento. Adicionalmente, se pueden emplear aptámeros. Por ejemplo, dichos otros métodos de escisión y/o reactivos alternativos además del método descrito en el Ejemplo 17 pueden incluir los descritos en el Ejemplo 16, Ejemplo 18, Ejemplo 19, Ejemplo 20 y Ejemplo 21, además de otros métodos de escisión descritos en el presente documento y conocidos por los expertos en la materia. También se entiende que, si bien el formato de ensayo demostrado en este ejemplo (Ejemplo 24) representa un ensayo directo, también se pueden implementar otros formatos, tales como formatos de inmunoensayo de tipo sándwich y/o diversos formatos de ensayo competitivos, e incluso formatos de captura al vuelo, tales como los que conocen los expertos en la materia, para realizar un ensayo utilizando los métodos descritos.
Por ejemplo, el formato de inmunoensayo de tipo sándwich para la detección de TSH (Thyroid Stimulating Hormone, hormona estimulante de la tiroides), como se describe en el Ejemplo 9, demostró la capacidad de realizar dicho ensayo en un chip DMF de bajo coste. Adicionalmente, se pueden sintetizar varios reactivos de bioconjugación útiles para la generación de inmunoconjugados u otros miembros de unión específica activos que tengan enlazadores escindibles utilizando diversos enlazadores escindibles heterobifuncionales tales como los descritos en el Ejemplo 1, Ejemplo 2, Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6 , además de otros enlazadores escindibles que son conocidos por los expertos en la materia. Los inmunoconjugados útiles para la práctica de la presente invención se pueden sintetizar mediante métodos como los descritos en el Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6 , así como mediante otros métodos conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, el Ejemplo 8 muestra la funcionalidad de diversas manipulaciones de nanogotas fluídicas en un chip de bajo coste que puede facilitar diversas etapas necesarias para llevar a cabo diversos formatos de ensayo, incluyendo los formatos de ensayo de tipo sándwich y competitivos, y los formatos de captura al vuelo, así como otras variaciones de los mismos conocidas por los expertos en la materia. El Ejemplo 11 muestra la fabricación de un nanoporo que se puede utilizar para contar un marcador escindible en un ensayo, pero se entiende que también se pueden utilizar para este fin otros métodos para la fabricación de nanoporos conocidos por los expertos en la materia. El Ejemplo 16 también representa otra construcción útil para la realización de un ensayo en el que se efectúa una escisión, conduciendo así a la liberación de un marcador contable para que sea contable utilizando el método de recuento de nanoporos, como se describe en este ejemplo. Esta construcción y otras que resultarían evidentes para los expertos en la materia se pueden utilizar en un ensayo como se describe en el presente documento.
El Ejemplo 22 muestra cómo se puede realizar en general el recuento para poder medir los eventos de traslado relacionados con la presencia de una variedad de marcadores que atraviesan el nanoporo. La Fig. 29 muestra el concepto de umbralización de la señal para poder manipular la calidad de los datos en un ensayo de recuento. La Fig. 28 muestra los datos del ensayo cualitativo que son representativos del tipo de datos que se pueden utilizar para determinar la presencia de un analito utilizando dichos métodos de ensayo como se describe en este ejemplo. También se entiende que, si bien se utilizó ADNbc como marcador en este ejemplo en particular, también se pueden utilizar otros marcadores, tales como el marcador descrito en el Ejemplo 5 y/o el Ejemplo 22, incluyendo, pero sin limitación, nanoperlas, dendrímeros y similares. Por otra parte, también se pueden emplear otros marcadores conocidos. Dichas construcciones necesarias para generar los reactivos apropiados se pueden sintetizar a través de diversos ejemplos descritos en el presente documento en esta solicitud, o de otro modo mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.
8. Análisis cuantitativo
Se puede realizar un ensayo cuantitativo utilizando los métodos y el proceso de etapas descritos en el presente documento. Se puede realizar un ensayo directo utilizando el conjugado de enlazador escindible, como se describe en el Ejemplo 17, con una etapa de escisión basada en tiol, y como se muestra en la Fig. 25. Se entiende que otros enfoques de enlazadores escindibles para realizar dicho ensayo también pueden incluir, pero sin limitación, otros diversos métodos de escisión de un enlazador para permitir el recuento de diversos marcadores utilizando un nanoporo, como se describe en el presente documento. Adicionalmente, se pueden emplear aptámeros. Por ejemplo, dichos otros métodos de escisión, además del método descrito en el Ejemplo 17, pueden incluir, pero sin limitación, los descritos en el Ejemplo 18, Ejemplo 19, Ejemplo 20 y Ejemplo 21, además de otros métodos descritos en el presente documento y conocidos por los expertos en la materia. También se entiende que, si bien el formato de ensayo demostrado en este ejemplo (Ejemplo 25) representa un ensayo directo, también se pueden implementar otros formatos, tales como formatos de inmunoensayo de tipo sándwich y/o diversos formatos de ensayo competitivos, e incluso formatos de captura al vuelo, tales como los que conocen los expertos en la materia, para realizar un ensayo.
Por ejemplo, el formato de inmunoensayo de tipo sándwich para la detección de TSH (hormona estimulante de la tiroides), como se describe en el Ejemplo 9, demostró la capacidad de realizar dicho ensayo en un chip DMF de bajo coste. Adicionalmente, los expertos en la materia pueden sintetizar varios reactivos de bioconjugación útiles para la generación de inmunoconjugados u otros miembros de unión específica activos que tengan enlazadores escindibles utilizando diversos enlazadores escindibles heterobifuncionales y conjugados sintetizados mediante métodos tales como los descritos en el Ejemplo 1, Ejemplo 2, Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6 , además de otros enlazadores o conjugados escindibles que podrían sintetizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, el Ejemplo 8 muestra la funcionalidad de diversas manipulaciones de nanogotas fluídicas en un chip de bajo coste que puede facilitar diversas etapas necesarias para llevar a cabo diversos formatos de ensayo, incluyendo los formatos de ensayo de tipo sándwich y competitivos, y los formatos de captura al vuelo, así como otras variaciones de los mismos conocidas por los expertos en la materia. El Ejemplo 16 también representa otra construcción útil para la realización de un ensayo en el que se efectúa una escisión, conduciendo así a la liberación de un marcador contable para que sea contable utilizando el método de recuento de nanoporos como se describe dentro de este ejemplo. Esta construcción, así como otras que resultarían evidentes para los expertos en la materia se pueden utilizar en un ensayo como se describe en el presente documento.
El Ejemplo 22 muestra cómo se puede realizar en general el recuento para poder medir los eventos de traslado relacionados con la presencia de un marcador que atraviesa el nanoporo. La Fig. 29 muestra el concepto de umbralización de la señal para poder manipular la calidad de los datos en un ensayo de recuento. Las Fig. 31, 32 y 33 muestran los datos que resultan del ensayo cuantitativo que son representativos del tipo de datos que se pueden utilizar para determinar la cantidad de un analito utilizando dichos métodos de análisis descritos en este ejemplo. La Figura 34 muestra una curva patrón generada a partir de una construcción que se ha escindido mediante un método químico. También se entiende que, si bien se utilizó ADNbc como marcador en este ejemplo en particular, también se pueden utilizar otros marcadores, tales como el marcador descrito en el Ejemplo 5, incluyendo, pero sin limitación, nanoperlas, dendrímeros y similares. Por otra parte, también se pueden emplear otros marcadores conocidos. Dichas construcciones necesarias para generar los reactivos apropiados se pueden sintetizar como se describe en el presente documento o mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.
9. Kits y cartuchos
También se proporciona en el presente documento un kit para usar en la realización de los métodos descritos anteriormente con o sin el dispositivo desvelado. El kit puede incluir instrucciones para analizar el analito con el dispositivo desvelado. Las instrucciones incluidas en el kit pueden estar pegadas al material de embalaje o pueden estar incluidas como un prospecto. Las instrucciones pueden ser materiales impresos o escritos, pero sin limitarse a ello. La presente divulgación contempla cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Dichos medios incluyen, pero sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (p. ej., discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (p. ej., CD-ROM) y similares. Como se usan en el presente documento, las "instrucciones" pueden incluir la dirección de un sitio de Internet que proporcione las instrucciones.
El kit puede incluir un cartucho que incluya un módulo microfluídico con un módulo nanoporoso incorporado, como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, los módulos nanoporosos y microfluídicos pueden ser componentes separados para una integración reversible conjunta o pueden estar integrados total o irreversiblemente en un cartucho. El cartucho puede ser desechable. El cartucho puede incluir uno o más reactivos útiles para poner en práctica los métodos desvelados anteriormente. El cartucho puede incluir uno o más recipientes que contengan los reactivos, como una o más composiciones separadas o, opcionalmente, como una mezcla cuando la compatibilidad de los reactivos lo permita. El cartucho también puede incluir otro/s material/es que pueda/n ser deseable/s desde el punto de vista del usuario, tales como uno o varios tampones, uno o varios diluyentes, uno o varios patrones (p. ej., calibradores y controles) y/o cualquier otro material útil en el procesamiento de muestras, lavado o realización de cualquier otra etapa del ensayo. El cartucho puede incluir uno o más de los miembros de unión específica descritos anteriormente.
Alternativa o adicionalmente, el kit puede comprender un calibrador o un control, p. ej., analito de interés purificado y opcionalmente liofilizado o en líquido, gel u otras formas en el cartucho o por separado, y/o al menos un recipiente (p. ej., tubo, placa de microvaloración o tiras) para usar con el dispositivo y los métodos descritos anteriormente y/o un tampón, tal como un tampón de ensayo o un tampón de lavado, uno cualquiera de los cuales puede proporcionarse como una solución concentrada. En algunas realizaciones, el kit incluye todos los componentes, es decir, reactivos, patrones, tampones, diluyentes, etc., que son necesarios para realizar el ensayo. Las instrucciones también pueden incluir instrucciones para generar una curva patrón.
El kit puede comprender además patrones de referencia para cuantificar el analito de interés. Los patrones de referencia se pueden emplear para establecer curvas patrón para la interpolación y/o extrapolación de las concentraciones de analito de interés. El kit puede incluir patrones de referencia que varían en términos de nivel de concentración. Por ejemplo, el kit puede incluir uno o más patrones de referencia con un alto nivel de concentración, un nivel de concentración medio o un nivel de concentración bajo. En términos de intervalos de concentraciones para el patrón de referencia, este se puede optimizar según el ensayo. Los ejemplos de intervalos de concentraciones para los patrones de referencia incluyen, pero sin limitación, por ejemplo: aproximadamente 10 fg/ml, aproximadamente 20 fg/ml, aproximadamente 50 fg/ml, aproximadamente 75 fg/ml, aproximadamente 100 fg/ml, aproximadamente 150 fg/ml, aproximadamente 200 fg/ml, aproximadamente 250 fg/ml, aproximadamente 500 fg/ml, aproximadamente 750 fg/ml, aproximadamente 1000 fg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 75 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 150 pg/ml, aproximadamente 200 pg/ml, aproximadamente 250 pg/ml, aproximadamente 500 pg/ml, aproximadamente 750 pg/ml, aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 12,5 ng/ml, aproximadamente 15 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 45 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 55 ng/ml, aproximadamente 60 ng/ml, aproximadamente 75 ng/ml, aproximadamente 80 ng/ml, aproximadamente 85 ng/ml, aproximadamente 90 ng/ml, aproximadamente 95 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 125 ng/ml, aproximadamente 150 ng/ml, aproximadamente 165 ng/ml, aproximadamente 175 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml, aproximadamente 225 ng/ml, aproximadamente 250 ng/ml, aproximadamente 275 ng/ml, aproximadamente 300 ng/ml, aproximadamente 400 ng/ml, aproximadamente 425 ng/ml, aproximadamente 450 ng/ml, aproximadamente 465 ng/ml, aproximadamente 475 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 525 ng/ml, aproximadamente 550 ng/ml, aproximadamente 575 ng/ml, aproximadamente 600 ng/ml, aproximadamente 700 ng/ml, aproximadamente 725 ng/ml, aproximadamente 750 ng/ml, aproximadamente 765 ng/ml, aproximadamente 775 ng/ml, aproximadamente 800 ng/ml, aproximadamente 825 ng/ml, aproximadamente 850 ng/ml, aproximadamente 875 ng/ml, aproximadamente 900 ng/ml, aproximadamente 925 ng/ml, aproximadamente 950 ng/ml, aproximadamente 975 ng/ml, aproximadamente 1000 ng/ml, aproximadamente 2 |jg/ml, aproximadamente 3 jg/ml, aproximadamente 4 jg/ml, aproximadamente 5 jg/ml, aproximadamente 6 jg/ml, aproximadamente 7 jg/ml, aproximadamente 8 jg/ml, aproximadamente 9 jg/ml, aproximadamente 10 jg/ml, aproximadamente 20 jg/ml, aproximadamente 30 jg/ml, aproximadamente 40 jg/ml, aproximadamente 50 jg/ml, aproximadamente 60 jg/ml, aproximadamente 70 jg/ml, aproximadamente 80 jg/ml, aproximadamente 90 jg/ml, aproximadamente 100 jg/ml, aproximadamente 200 jg/ml, aproximadamente 300 jg/ml, aproximadamente 400 jg/ml, aproximadamente 500 jg/ml, aproximadamente 600 jg/ml, aproximadamente 700 jg/ml, aproximadamente 800 jg/ml, aproximadamente 900 jg/ml, aproximadamente 1000 jg/ml, aproximadamente 2000 jg/ml, aproximadamente 3000 jg/ml, aproximadamente 4000 jg/ml, aproximadamente 5000 jg/ml, aproximadamente 6000 jg/ml, aproximadamente 7000 jg/ml, aproximadamente 8000 jg/ml, aproximadamente 9000 jg/m l o aproximadamente 10000 jg/ml.
Cualquier miembro de unión específica que se proporciona en el kit puede llevar incorporado un marcador, tal como un fluoróforo, enzima, aptámero, dendrímero, perla, nanopartícula, micropartícula, polímero, proteína, marcador de biotina/avidina, o similar, o el kit puede incluir reactivos para marcar los miembros de unión específica o reactivos para detectar los miembros de unión específica y/o para marcar los analitos o reactivos para detectar el analito. Si se desea, el kit puede contener uno o más marcadores diferentes. El kit también puede incluir componentes para generar la escisión, tales como un reactivo mediado por la escisión. Por ejemplo, un reactivo mediado por la escisión puede incluir un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) o fr/s(2-carboxietil)fosfina) TCEP. Los miembros de unión específica, calibradores y/o controles se pueden proporcionar en recipientes separados o se pueden dispensar previamente en un formato de ensayo o cartucho apropiado. El marcador se puede detectar utilizando el dispositivo desvelado.
El kit puede incluir uno o más miembros de unión específica, por ejemplo, para detectar uno o más analitos diana en la muestra en un ensayo de multiplexación. El número de diferentes tipos de miembros de unión específica del kit puede variar ampliamente dependiendo del uso previsto del kit. El número de miembros de unión específica del kit puede variar entre 1 y aproximadamente 10, o más. Por ejemplo, el kit puede incluir de 1 a 10 miembros de unión específica, de 1 a 9 miembros de unión específica, de 1 a 8 miembros de unión específica, de 1 a 7 miembros de unión específica, de 1 a 6 miembros de unión específica, de 1 a 5 miembros de unión específica, de 1 a 4 miembros de unión específica, de 1 a 3 miembros de unión específica, de 1 a 2 miembros de unión específica, de 2 a 10 miembros de unión específica, de 2 a 9 miembros de unión específica, de 2 a 8 miembros de unión específica, de 2 a 7 miembros de unión específica, de 2 a 6 miembros de unión específica, de 2 a 5 miembros de unión específica, de 2 a 4 miembros de unión específica, de 3 a 10 miembros de unión específica, de 3 a 9 miembros de unión específica, de 3 a 8 miembros de unión específica, de 3 a 7 miembros de unión específica, de 3 a 6 miembros de unión específica, de 3 a 5 miembros de unión específica, de 3 a 4 miembros de unión específica, de 4 a 10 miembros de unión específica, de 4 a 9 miembros de unión específica, de 4 a 8 miembros de unión específica, de 4 a 7 miembros de unión específica, de 4 a 6 miembros de unión específica, de 5 a 10 miembros de unión específica, de 5 a 9 miembros de unión específica, de 5 a 8 miembros de unión específica, de 5 a 7 miembros de unión específica, de 5 a 6 miembros de unión específica, de 6 a 10 miembros de unión específica, de 6 a 9 miembros de unión específica, de 6 a 8 miembros de unión específica, de 6 a 7 miembros de unión específica, de 7 a 10 miembros de unión específica, de 7 a 9 miembros de unión específica, de 7 a 8 miembros de unión específica, de 8 a 10 miembros de unión específica, de 8 a 9 miembros de unión específica o de 9 a 10 miembros de unión específica. Cada uno de los uno o más miembros de unión específica se puede unir a un analito diana diferente y cada miembro de unión específica puede marcarse con un marcador y/o aptámero diferente. Por ejemplo, el kit puede incluir un primer miembro de unión específica que se una a un primer analito diana, un segundo miembro de unión específica que se una a un segundo analito diana, un tercer miembro de unión específica que se una a un tercer analito diana, etc. y el primer miembro de unión específica se marca con un primer marcador y/o aptámero, el segundo miembro de unión específica se marca con un segundo marcador y/o aptámero, el tercer miembro de unión específica se marca con un tercer marcador y/o aptámero, etc.
Además del uno o más miembros de unión específica, los kits pueden comprender además uno o más componentes de ensayo adicionales, tales como medios tampón adecuados y similares. Los kits también pueden incluir un dispositivo para detectar y medir el marcador y/o un aptámero, tales como los descritos anteriormente. Por último, los kits pueden comprender instrucciones para utilizar los miembros de unión específica en métodos de detección de analitos de acuerdo con la presente invención, donde estas instrucciones de uso pueden estar presentes en el embalaje del kit y/o en un prospecto.
Opcionalmente, el kit incluye componentes de control de calidad (p. ej., paneles de sensibilidad, calibradores y controles positivos). La preparación de reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en hojas de prospectos para una variedad de productos de inmunodiagnóstico. Los miembros del panel de sensibilidad se utilizan opcionalmente para establecer características de rendimiento del ensayo y, además, opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del kit y de la estandarización de los ensayos.
El kit también puede incluir opcionalmente otros reactivos necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico o facilitar las evaluaciones de control de calidad, tales como tampones, sales, enzimas, cofactores enzimáticos, sustratos, reactivos de detección y similares. También se puede incluir en el kit otros componentes, tales como tampones y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (p. ej., reactivos de pretratamiento). El kit puede incluir adicionalmente uno o más controles. Se pueden liofilizar uno más de los componentes del kit, en cuyo caso el kit puede comprender además reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados. Uno o más de los componentes pueden estar en forma líquida.
Los diversos componentes del kit se proporcionan opcionalmente en recipientes adecuados según sea necesario. El kit puede incluir además recipientes para contener o almacenar una muestra (p. ej., un recipiente o cartucho para una muestra de orina, saliva, plasma, líquido cefalorraquídeo o suero, o un recipiente apropiado para almacenar, transportar o procesar tejido para crear un aspirado tisular). Cuando corresponda, opcionalmente, el kit también puede contener recipientes de reacción, recipientes de mezcla y otros componentes que faciliten la preparación de los reactivos o la muestra de prueba. El kit también puede incluir uno o más instrumentos de recogida/adquisición de muestras para ayudar a obtener una muestra de prueba, tales como diversos dispositivos de extracción/transferencia de sangre tales como dispositivos de micromuestreo, microagujas u otros métodos de extracción de sangre indoloros mínimamente invasivos; tubo/s de extracción de sangre; lancetas; tubos capilares de recogida de sangre; otros métodos de extracción de sangre mediante punción en un solo dedo; hisopos bucales, hisopos nasales/de garganta; aguja de calibre 16 o de otro tamaño, hoja circular para biopsia por punción (p. ej., 1 - 8 mm u otro tamaño apropiado), cuchillo quirúrgico o láser (p. ej., particularmente portátil), jeringas, recipiente estéril o cánula, para obtener, almacenar o aspirar muestras tisulares; o similares. El kit puede incluir uno o más instrumentos para ayudar con la aspiración articular, biopsias de cono, biopsias por punción, biopsias por aspiración con aguja fina, biopsia por aspiración con aguja percutánea guiada por imágenes, lavado broncoalveolar, biopsias endoscópicas y biopsias laparoscópicas.
Si el marcador o marcador detectable es, o incluye, al menos un compuesto de acridinio, el kit puede comprender al menos una acridinio-9-carboxamida, al menos un ariléster de acridinio-9-carboxilato o cualquier combinación de los mismos. Si el marcador o marcador detectable es, o incluye, al menos un compuesto de acridinio, el kit también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como un tampón, una solución y/o al menos una solución básica. Si se desea, el kit puede contener una fase sólida, tal como una partícula magnética, perla, membrana, molécula de armazón, película, papel de filtro, disco o chip.
Si se desea, el kit puede comprender además uno o más componentes, solos o en combinación con instrucciones, para analizar la muestra de prueba en busca de otro analito, que puede ser un biomarcador, tal como un biomarcador de un estado patológico o trastorno, tal como una enfermedad infecciosa, enfermedad cardiaca, enfermedad metabólica, enfermedad tiroidea, etc.
La presente invención tiene varios aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitativos.
10. Ejemplos
EJEMPLO 1
Síntesis del enlazador bifuncional de 2-nitrobencil-succinimidilo/maleimidilo fotoescindible.
Figure imgf000065_0001
*En la síntesis anterior, DMF es dimetilformamida.
Síntesis del Compuesto 2. La síntesis del enlazador de sulfosuccinimidilo/maleimidilo fotoescindible se obtiene de Agasti et al., J. Am. Chem. Soc., 134(45), 18499-18502, 2012. En resumen, se disuelve el material de partida ácido 4-[4-(1-hidroxietil)-2-metoxi-5-nitrofenoxi]butírico (0,334 mmol) en diclorometano seco (DCM) bajo atmósfera de argón. Se enfría el matraz hasta 0 °C colocándolo en un baño de hielo. Se añaden a la solución el compuesto hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) (0,368 mmol) y trimetilamina (TEA) (0,835 mmol). Se agita la mezcla de reacción a 0 °C durante 5 min y posteriormente se añade la sal trifluoroacetato de N-(2-aminoetil)maleimida (0,368 mmol). Después de agitar a 0 °C durante 15 min, se deja que la mezcla de reacción suba hasta la temperatura ambiente (TA) y se agita adicionalmente durante 18 h. Tras diluir la mezcla de reacción con DCM (45 ml), se lava la fase orgánica con agua (x2), solución saturada de NaCl (x1) y se seca sobre sulfato de sodio. Se concentra la capa orgánica a presión reducida y se purifica mediante cromatografía ultrarrápida utilizando una columna de SiO2 (eluyente: 100 % de DCM a 3 % de metanol en DCM, v/v). Se disuelve el Compuesto 1 (0,024 mmol) en dimetilformamida anhidra (1 ml). Se añaden sucesivamente a la solución carbonato de N,N'-disulfosuccinimidilo (DSC) (0,071 mmol) y TEA (0,096 mmol). Se agita la mezcla de reacción a TA durante 18 h. Se purifica la mezcla de reacción cargándola directamente en una columna de fase inversa C18 (eluyente: 5 % de acetonitrilo en agua a 95 % de acetonitrilo en agua, v/v). El material de partida y otros productos químicos utilizados para la síntesis pueden adquirirse de Sigma-Aldrich.
EJEMPLO 2
Síntesis de enlazador bifuncional de sulfosuccinimidil/DBCO-2-nitrobencilo fotoescindible.
Figure imgf000066_0001
c o - - - roxe - -meox- -nitrofenoxi]butírico DBCO-amina
Figure imgf000066_0004
producto intermedio de 2-nitrobencil-DBCO
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000066_0003
enlazador bifuncional:
grupos terminales sulfosuccinimidilo/DBCO
con grupo 2-nitrobencilo fotoescindible interno
*En la síntesis anterior, DMF es dimetilformamida.
Síntesis del Compuesto 4. La síntesis del enlazador de sulfosuccinimidil/dibenzocidooctil (DBCO)-alquinilo fotoescindible se obtiene de un procedimiento similar descrito en Agasti et al., J. Am. Chem. Soc., 134(45), 18499­ 18502, 2012. En resumen, se disuelve el material de partida ácido 4-[4-(1-hidroxietil)-2-metoxi-5-nitrofenoxi]butírico (0,334 mmol) en diclorometano seco (DCM) bajo atmósfera de argón. Se enfría el matraz hasta 0 °C colocándolo en un baño de hielo. Se añaden a la solución el compuesto hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) (0,368 mmol) y trimetilamina (TEA) (0,835 mmol). Se agita la mezcla de reacción a 0 °C durante 5 min y posteriormente se añade DBCO-amina (0,368 mmol). Después de agitar a 0 °C durante 15 min, se deja que la mezcla de reacción suba hasta la TA y se agita adicionalmente durante 18 h. Tras diluir la mezcla de reacción con DCM (45 ml), se lava la fase orgánica con agua (x2), solución saturada de NaCl (x1) y se seca sobre sulfato de sodio. Se concentra la capa orgánica a presión reducida y se purifica mediante cromatografía ultrarrápida utilizando una columna de SiO2 (eluyente: 100 % de DCM a 3 % de metanol en DCM, v/v). Se disuelve el Compuesto 3 (0,024 mmol) en dimetilformamida anhidra (1 ml). Se añaden sucesivamente a la solución carbonato de N,N'-disulfosuccinimidilo (DSC) (0,071 mmol) y TEA (0,096 mmol). Se agita la mezcla de reacción a TA durante 18 h. Se purifica la mezcla de reacción cargándola directamente en una columna de fase inversa C18 (eluyente: 5 % de acetonitrilo en agua a 95 % de acetonitrilo en agua, v/v). El material de partida y otros productos químicos utilizados para la síntesis pueden adquirirse de Sigma-Aldrich.
EJEMPLO 3
Acoplamiento y escisión fotoquímica del conjugado de anticuerpo-ADN utilizando enlazador bifuncional de sulfosuccinimidil/maleimidil-2-nitrobencilo.
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000067_0002
Anticuerpo
Bioconjugación y escisión del anticuerpo y el ADN. Las moléculas de ADN se pueden conjugar con anticuerpos utilizando el siguiente esquema. Se puede tiolar el ADN en el extremo 5' replicando una secuencia de ADN en una reacción de PCR utilizando dos cebadores de PCR en los que uno o ambos cebadores están marcados con un grupo 5'-tiol. Se disuelve el ADN marcado (concentración final de 100 pM) en HEPES 50 mM (pH = 7,0) con agitación. Se añade el Compuesto 2 (2 mM) y se deja que la reacción prosiga a TA durante 2 horas. Después del acoplamiento, se inactiva el exceso de grupos maleimida sin reaccionar con exceso de ditiotreitol (DTT). Se purifica el conjugado en una columna de filtración en gel (Sephadex G-25) o mediante diálisis extensa a 4 °C en un tampón de almacenamiento de conjugados apropiado. Se disuelve el enlazador de ADN-succinimidilo purificado (concentración final de 50 pM) en PBS 100 mM (pH = 7,5) con agitación. Se añade el anticuerpo nativo (concentración final de 50 j M) y se deja que la reacción prosiga a TA durante 2 horas. Se purifica el conjugado de Ac-ADN utilizando una columna Sephadex (Sephadex G25) manejada con PBS 100 mM, pH 7,5 o medio de filtración en gel BioGel P-30.
El conjugado se puede escindir antes de la detección del nanoporo iluminando con una lámpara UV a 365 nm. Este ejemplo también se puede utilizar en dendrímeros de ADN utilizando la misma química de bioconjugación.
EJEMPLO 4
Acoplamiento y escisión fotoquímica del conjugado de anticuerpo-ADN utilizando enlazador bifuncional de sulfosuccinimidil/DBCO-2-nitrobencilo.
Figure imgf000068_0001
Bioconjugación y escisión del anticuerpo y el ADN. Las moléculas de ADN se pueden conjugar con anticuerpos utilizando el siguiente esquema. Se puede aminar el ADN en el extremo 5' replicando una secuencia de ADN en una reacción de PCR utilizando dos cebadores de PCR en los que uno o ambos cebadores están marcados con un grupo 5'-amina. Se disuelve el ADN marcado (concentración final de 100 j M) en PBS 100 mM (pH = 7,5) con agitación. Se añade el Compuesto 4 (concentración final de 2 mM) y se deja que la reacción prosiga a TA durante 2 horas. Se purifica el enlazador de ADN-DBCO en una columna de filtración en gel (Sephadex G-25) o mediante diálisis extensa a 4 °C en un tampón de almacenamiento de conjugados apropiado. Se disuelve el enlazador de ADN-DBCO purificado (concentración final de 50 j M) en Tris 50 mM (pH = 7,0) con agitación. Se utiliza la química clic sin cobre para acoplar el enlazador de ADN-DBCO al anticuerpo. Se añade anticuerpo marcado con azido (Kazane et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 109(10), 3731-3736, 2012) (concentración final de 25 j M), y se deja que la reacción prosiga a TA durante 6­ 12 horas. Se purifica el conjugado de Ac-ADN utilizando una columna Sephadex (Sephadex G25) manejada con PBS 100 mM, pH 7,5 o medio de filtración en gel BioGel P-30.
El conjugado se puede escindir antes de la detección del nanoporo iluminando con una lámpara UV a 365 nm. Este ejemplo también se puede utilizar en dendrímeros de ADN utilizando la misma química de bioconjugación.
EJEMPLO 5
Conjugados de nanopartícula-anticuerpo para inmunoensayos digitales (recuento de nanoporos).
Este ejemplo describe la conjugación covalente de un anticuerpo a nanopartículas de poliestireno carboxilado de 26 nm (NP, PC02N), tales como las que se pueden obtener en Bangs Labs (Fishers, IN, Ee . UU.). Las NP de 26 nm tienen una carga superficial de 528,7 jeq/g y un área de estacionamiento de 68,4 sq.A/grupo (según la información del fabricante).
Figure imgf000069_0001
Nanopartículas carboxiladas tampon pH 7,5 NP activadas
(NP)
Activación de nanopartículas de poliestireno carboxilado: Se lava 1,0 ml (100 mg/ml) de NP carboxiladas de 26 nm con 10 ml de MES 0,1 M (ácido 2-[N-morfolin]etanosulfónico, pH 4,5-5,0). Después del lavado, se vuelven a suspender los sedimentos en 100 ml de MES 0,1 M a pH 4,5-5,0 para una concentración de NP de 1,0 mg/ml (0,1 % de sólidos). se transfieren 10,0 ml de suspensión de nanopartículas (10 mg de NP, 5,28 jeq de carboxilo) a un vial y se hacen reaccionar con 10 j l (5,28 jmol, 1,0 equiv/eq. de CO2H) de una solución de EDC a 10 mg/ml recién preparada en agua (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) y 17 j l (7,93 jmol, 1,5 equiv/1 equiv de EDC) de una solución a 10 mg/ml de solución de sulfo-NHS en agua (N-hidroxisulfosuccinimida, Sigma, n.° de cat.
56485) a temperatura ambiente durante 15 min con mezcla continua. Se centrifuga la suspensión reaccionada a 6500 g y se desecha la solución. Se lava el sedimento con 20 ml de PBS 20 mM/EDTA 5 mM a pH 7,5 y se centrifuga a 6500 g. Se retira el sobrenadante. Se vuelve a suspender el sedimento de NP carboxiladas activadas con succinimida en PBS 50 mM, pH 7,5 y se añaden inmediatamente 9,8 j l (52,8 nmol, 0,01 equiv/1 eq de CO2H) de una solución de piridin-ditioetilamina a 1,0 mg/ml en agua y se deja reaccionar con agitación continua durante 2-4 h a temperatura ambiente. Se lavan las NP carboxiladas derivatizadas con piridilo con 10 ml de PBS 20 mM/EDTA 5 mM a pH 7,5 y se vuelven a suspender en 10,0 ml del mismo tampón. Se determina la concentración de nanopartículas mediante espectroscopia uV-Vis (600 nm, dispersión) utilizando una curva de calibración de NP carboxiladas. Se determina la carga de ligando piridilo en las NP reduciendo una cantidad definida de NP con TCEP o DTT 10 mM, retirando el agente reductor mediante centrifugación, volviendo a suspender el sedimento de NP activadas con piridilo en PBS/EDTA a pH 7,2 y haciéndolo reaccionar con el reactivo de Ellman (se mide la A412 del sobrenadante). Si no se utilizan el mismo día para la conjugación de anticuerpos, las NP activadas se almacenan a 4 °C.
Se evalúa una selección de entradas molares de EDC/NHS y piridin-ditioetilamina para determinar la estequiometría deseada para preparar distintos conjugados de anticuerpo-nanopartícula. Se evalúan los parámetros de reacción (pH, temperatura, tiempo) para lograr el resultado de la activación de las NP deseado.
Figure imgf000070_0001
Reducción de anticuerpos: Se mezcla bien 1,0 ml de una solución de anticuerpo a 10 mg/ml (10 mg) con 38 |jl de una solución de 2-MEA a 30 mg/ml recién preparada (concentración de reacción de 10 mM) (clorhidrato de 2-mercaptoetilamina), luego se tapa y se coloca a 37 °C durante 90 min. Se lleva la solución a temperatura ambiente y se retira el exceso de 2-MEA con una columna de desalación, preequilibrada en PBS 20 mM/EDTA 5 mM a pH 7,5. Se determina la concentración del anticuerpo reducido utilizando absorbancia UV-Vis a A280 (absorbancia de proteína) y A320 (corrección de dispersión). Se determina el número de tioles libres mediante la prueba de Ellman. Se optimizan las condiciones según sea necesario para generar 2 o 4 tioles libres (Cys en la región bisagra del anticuerpo). El anticuerpo reducido se utiliza inmediatamente para acoplarlo a NP carboxiladas derivatizadas con piridilo.
Figure imgf000070_0002
Acoplamiento de anticuerpo reducido a nanopartícula activada: Supuestos asumidos: (1) el área de estacionamiento del anticuerpo es de 45 nm2; (2) el área superficial de la nanopartícula de 26 nm es de 2120 nm2; (3) Teóricamente, 47 moléculas de anticuerpo encajan en la superficie de una NP de 26 nm.
Procedimiento: A 10 ml (10 mg) de una solución al 0,1 % de nanopartículas carboxiladas activadas con piridilo en PBS 20 mM/EDTA 5 mM (pH 7,5), se añaden 0,10 mg (0,66 nmol, 0,10 ml) del anticuerpo reducido a 1,0 mg/ml en el mismo tampón que contiene EDTA. Se deja reaccionar la mezcla a temperatura ambiente mezclando durante 2 h, se centrifuga para retirar las moléculas no unidas y se aspira. Se lava el sedimento con 10 ml de PBS a pH 7,2, se centrifuga y se aspira. Se suspende el conjugado de anticuerpo-NP en 10,0 ml de PBS a pH 7,2. Se determina la concentración de Np conjugada (% de sólidos) utilizando espectroscopia UV-Vis (600 nm). Se examina el conjugado de partículas mediante MEB y se determina la distribución del tamaño/carga utilizando el ZetaSizer. Se puede utilizar la cromatografía de exclusión por tamaño para aislar conjugados distintos de una posible distribución de población de conjugados. Se puede determinar la proporción de la incorporación del anticuerpo con respecto a la de la NP mediante citometría de flujo utilizando un conjugado de antígeno marcado con fluorescencia o utilizando un ensayo Micro BCA (uBCA). Se puede evaluar un intervalo de entradas molares del anticuerpo con respecto a la NP, junto con la temperatura de conjugación y el pH para generar una población homogénea de conjugados distintos (es decir, proporción de incorporación de NP de 2 o 4).
Inmunoensayo de recuento de nanoporos
Figure imgf000071_0003
anoporo
Complejo inmunológico
Figure imgf000071_0001
Corriente
El esquema anterior ilustra el ensayo de recuento de nanoporos utilizando el conjugado de nanopartícula activada con anticuerpo reducido cuya preparación se ha descrito anteriormente. El complejo inmunitario formado en el transcurso del inmunoensayo se puede escindir mediante la reducción del enlazador de enlace disulfuro para formar el complejo de anticuerpo-analito-anticuerpo libre y el marcador de nanopartícula libre, que permite contar el marcador de nanopartículas al pasar a través del nanoporo.
EJEMPLO 6
Síntesis de conjugados de CPSP
A. Conjugado de CPSP-anticuerpo.
Figure imgf000071_0002
*En la síntesis anterior, DMF es dimetilformamida.
3-(9-((4-Oxo-4-(perfluorofenoxi)butil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato (2): Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con 3-(9-((3-carboxipropil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato (CPSP) (1) (1 mmol), piridina (5 mmol) y dimetilformamida (10 ml). Se enfrió la solución en un baño de hielo y se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (1,3 mmol). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Se retiraron los componentes volátiles de la reacción al vacío y se recogió el residuo en metanol y se purificó mediante HPLC (High Performance Liquid Chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento) de fase inversa, dando el compuesto del título.
Conjugado de CPSP-anticuerpo (3): Se añadió una solución de 2 (1 pl de una solución 10 mM en DMSO) a una solución de anticuerpo (100 pl de una solución 10 pM en agua) y bicarbonato de sodio acuoso (10 pl de una solución 1 M). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 4 horas. Se realizó la purificación del producto en una columna giratoria, dando el conjugado de CPSP-anticuerpo 3. El valor de "n" varía de una manera dependiente del anticuerpo. La incorporación se puede controlar en cierta medida aumentando o disminuyendo la concentración de éster activo (es decir, compuestos 2, 5, 9 y 13) y/o aumentando o disminuyendo el pH durante la reacción, pero siempre da como resultado una distribución de los valores de incorporación. La Ración de Incorporación media ("R.I.") se determina experimentalmente después de la reacción. Normalmente, "n" es cualquier valor entre 1 y 10.
B. Conjugado de CPSP-anticuerpo con espaciador.
Figure imgf000072_0001
3-(9-((4-((5-Carboxipentil)amino)-4-oxobutil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato (4): Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con 3-(9-((3-carboxipropil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato (CPSP) (1) (1 mmol), piridina (5 mmol) y dimetilformamida (10 ml). Se enfrió la solución en un baño de hielo y se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (1,3 mmol). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. A continuación, se añadió ácido 6-aminocaproico (1,3 mmol) a la reacción en pequeñas porciones seguido de N,N-diisopropiletilamina (5 mmol), y se agitó la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, se retiraron los componentes volátiles de la reacción al vacío y se purificó el residuo mediante HPLC de fase inversa, dando el compuesto del título.
3-(9-((4-Oxo-4-((6-oxo-6-(perfluorofenoxi)hexil)amino)butil)(tosil)carbamoil)acridin-10-io-10-il)propano-1-sulfonato (5): Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con 4 (1 mmol), piridina (5 mmol) y dimetilformamida (10 ml). Se enfrió la solución en un baño de hielo y se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (1,3 mmol). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de este tiempo, se retiraron los componentes volátiles de la reacción bajo una corriente de nitrógeno y se purificó el residuo mediante HPLC de fase inversa, dando el compuesto del título.
Conjugado de CPSP-anticuerpo con espaciador (6): Se añadió una solución de 5 (1 pl de una solución 10 mM en DMSO) a una solución de anticuerpo (100 pl de una solución 10 pM en agua) y bicarbonato de sodio acuoso (10 pl de una solución 1 M). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 4 horas. Se realizó la purificación del producto en una columna giratoria, dando el conjugado de CPSP-anticuerpo con espaciador 6. Normalmente, "n" es cualquier valor entre 1 y 10.
C. Conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo.
Figure imgf000073_0001
*En la síntesis anterior, DMF es dimetilformamida.
9-((3-Carboxipropil)(tosil)carbamoil)-10-(prop-2-in-1-il)acridin-10-io (8): Se cargó un matraz de fondo redondo de 100 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con alcohol propargílico (10 mmol), 2,6-di-tercbutilpiridina (10 mmol) y cloruro de metileno (50 ml) y se enfrió hasta -20 °C. A continuación, se añadió gota a gota anhídrido tríflico a la solución y se agitó la reacción durante 2 horas a -20 °C. Se añadió pentano (25 ml) a la reacción y se separaron las sales precipitadas resultantes por filtración. Se evaporaron los componentes volátiles al vacío y se volvió a disolver el residuo en cloruro de metileno (25 ml) en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Se añadió ácido 4-(N-tosilacridin-9-carboxamido)butanoico (CP-acridina) (7) (1 mmol) en pequeñas porciones y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 18 horas. Se evaporaron los componentes volátiles al vacío, y el residuo se recogió en metanol (5 ml) y se purificó mediante HPLC de fase inversa, dando el compuesto del título.
9-((4-oxo-4-(perfluorofenoxi)butil)(tosil)carbamoil)-10-(prop-2-in-1-il)acridin-10-io (9): Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con 8 (1 mmol), piridina (5 mmol) y dimetilformamida (10 ml). Se enfrió la solución en un baño de hielo y se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (1,3 mmol). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Se retiraron los componentes volátiles de la reacción al vacío y se recogió el residuo en metanol y se purificó mediante HPLC (High Performance Liquid Chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento) de fase inversa, dando el compuesto del título.
Conjugado de CPSP-anticuerpo (10): Se añadió una solución de 9 (1 pl de una solución 10 mM en DMSO) a una solución de anticuerpo (100 pl de una solución 10 pM en agua) y bicarbonato de sodio acuoso (10 pl de una solución 1 M). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 4 horas. Se realizó la purificación del producto en una columna giratoria, dando el conjugado de CPSP-anticuerpo 10. Normalmente, "n" es cualquier valor entre 1 y 10.
Conjugado de oligonuleótido de CPSP-anticuerpo (11): Se agitó una mezcla de una oligoazida (10 nmol en 5 pl de agua), conjugado de CPSP-anticuerpo 10 (10 nmol en 10 pl de agua) y una "solución clic" 0,1 M recién preparada (3 pl - véase más adelante) a temperatura ambiente durante 4 horas. Se diluyó la reacción con acetato de sodio 0,3 M (100 pl) y se precipitó el conjugado de ADN mediante la adición de EtOH (1 ml). Se retiró el sobrenadante y se lavó el residuo 2 veces con EtOH frío (2 x 1 ml). Se recogió el residuo en agua (20 pl) y la solución del conjugado 11 de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo se utilizó sin purificación adicional. Normalmente, "n" es cualquier valor entre 1 y 10.
"solución clic": Se disolvió CuBr (1 mg) en 70 pl de DMSO/t-BuOH 3:1 para formar una solución 0,1 M. (Esta solución debe estar recién preparada y no se puede almacenar). Se disolvió tris(benciltriazolilmetil)amina (TBTA) (54 mg) en 1 ml de DMSO/t-BuOH 3:1 para formar una solución 0,1 M. (Esta solución se puede almacenar a -20 °C). Se añadió 1 volumen de la solución de CuBr 0,1 M a 2 volúmenes de la solución 0,1 M de TBTA para proporcionar una "solución clic".
D. Conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo con espaciador.
Figure imgf000075_0001
9-((4-((5-carboxipentil)amino)-4-oxobutil)(tosil)carbamoil)-10-(prop-2-in-1-il)acridin-10-io (12): Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con 8 (1 mmol), piridina (5 mmol) y dimetilformamida (10 ml). Se enfrió la solución en un baño de hielo y se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (1,3 mmol). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. A continuación, se añadió ácido 6-aminocaproico (1,3 mmol) a la reacción en pequeñas porciones seguido de N,N-diisopropiletilamina (5 mmol), y se agitó la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, se retiraron los componentes volátiles de la reacción al vacío y se purificó el residuo mediante HPLC de fase inversa, dando el compuesto del título.
9-((4-oxo-4-((6-oxo-6-(perfluorofenoxi)hexil)amino)butil)(tosil)carbamoil)-10-(prop-2-in-1-il)acridin-10-io (13):
Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de un agitador magnético y una entrada de nitrógeno con 12 (1 mmol), piridina (5 mmol) y dimetilformamida (10 ml). Se enfrió la solución en un baño de hielo y se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (1,3 mmol). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de este tiempo, se retiraron los componentes volátiles de la reacción bajo una corriente de nitrógeno y se purificó el residuo mediante HPLC de fase inversa, dando el compuesto del título.
Conjugado de CPSP-anticuerpo con espaciador (14): Se añadió una solución de 13 (1 pl de una solución 10 mM en DMSO) a una solución de anticuerpo (100 |jl de una solución 10 jM en agua) y bicarbonato de sodio acuoso (10 |jl de una solución 1 M). Se agitó esta a temperatura ambiente durante 4 horas. Se realizó la purificación del producto en una columna giratoria, dando el conjugado de CPSP-anticuerpo con espaciador 14. Normalmente, "n" es cualquier valor entre 1 y 10.
Conjugado de oligonuleótido de CPSP-anticuerpo (15): Se agitó una mezcla de una oligoazida (p. ej., tal como se comercializa) (10 nmol en 5 j l de agua), conjugado de CPSP-anticuerpo con espaciador 14 (10 nmol en 10 j l de agua) y una "solución clic" 0,1 M recién preparada (3 j l - véase el Ejemplo 6.C) a temperatura ambiente durante 4 horas. Normalmente, "n" es cualquier valor entre 1 y 10. Se diluyó la reacción con acetato de sodio 0,3 M (100 j l) y se precipitó el conjugado de ADN mediante la adición de EtOH (1 ml). Se retiró el sobrenadante y se lavó el residuo 2 veces con EtOH frío (2 x 1 ml). Se recogió el residuo en agua (20 j l ) y la solución del conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo con espaciador 15 se utilizó sin purificación adicional.
Escisión de conjugados de CPSP-anticuerpo con o sin espaciador y conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo con o sin espaciador. Los conjugados de CPSP-anticuerpo con o sin espaciador y conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo con o sin espaciador, como se ha descrito, se escinden o "activan" utilizando una solución básica de peróxido de hidrógeno. En el sistema ARCHITECT®, el producto intermedio de acridona en estado excitado produce un fotón, que se mide. Además, los productos de escisión son una acridona y una sulfonamida. Los conjugados de los Ejemplos 6.A-D se utilizan con el dispositivo desvelado mediante el recuento de las moléculas de acridona y/o sulfonamida.
E. Conjugado de oligonucleótido de CPSP sin anticuerpo.
Figure imgf000076_0001
Conjugado de oligonucleótido de CPSP sin anticuerpo (16): Se puede agitar una mezcla de una oligoazida (p. ej., tal como se comercializa) (10 nmol en 5 j l de agua), propargil-CPSP 8 (10 nmol en 10 j l de agua) y una "solución clic" 0,1 M recién preparada (3 j l - véase el Ejemplo 6.C) a temperatura ambiente durante 4 horas. Se puede diluir la reacción con acetato de sodio 0,3 M (100 j l) y hacer precipitar el conjugado de ADN mediante la adición de EtOH (1 ml). Se puede retirar el sobrenadante y lavar el residuo 2 veces con EtOH frío (2 x 1 ml). Se puede recoger el residuo en agua (20 j l ) y utilizar la solución del conjugado de oligonucleótido de CPSP-anticuerpo con espaciador 16 sin purificación adicional.
EJEMPLO 7
Fabricación de chip inferior DMF de bajo coste.
Se fabricaron chips DMF flexibles de bajo coste utilizando impresión flexográfica de rollo a rollo (R2R) combinada con un proceso de despegue en húmedo para el estampado de los electrodos utilizando el proceso descrito en Lo C-Y et al., Microelectronic Engineering 86 (2009) 979-983 con algunas modificaciones. En la Fig. 10, se muestra un esquema del proceso de fabricación. Se utilizó un rollo de sustrato (1) de tereftalato de polietileno (PET) MELINEX® ST506 de 127 jm (5,0 mil) como material de partida para la impresión de los electrodos DMF. Se sometió a impresión flexográfica una capa (2) de tinta amarilla (Sun Chemical) sobre el sustrato de PET utilizando una placa de impresión de 1,14 mm de espesor (Flint MCO3) a una velocidad de 10 m/minuto utilizando un volumen de transferencia de tinta de 3,8 ml/m2 en un ensamblaje de rodillo Anilox. Se produce una imagen negativa del patrón de electrodos DMF a partir de la etapa de impresión flexográfica (3). Antes de la deposición del metal, se secó la tinta dos veces en un horno de aire caliente (2 x 100 °C). Se utilizó un evaporador de metal EVA R2R para depositar una capa de metal plateado sobre el sustrato de PET impreso para formar una cubierta uniforme de plata con un espesor de 80 nm (4). Se sometió el sustrato de película de tinta metalizada (5) a un proceso de despegue en húmedo utilizando una combinación de acetona más ultrasonidos en un baño de ultrasonidos a una velocidad de 1 m/minuto (6). Este tratamiento físico-químico permite que la capa de plata y tinta se disuelva, manteniendo intacta la capa de solo plata. La retirada de la capa de tinta y plata produjo un patrón de electrodos impresos DMF que consistía en 80 electrodos de accionamiento (2,25 x 2,25 mm) con un espacio de separación entre electrodos de 50 o 140 |jm (7). Como control de calidad, se examinó a simple vista un total de 80-90 chips aleatorios de un solo rollo para determinar la separación entre los electrodos y la variación de la anchura de los cables del conector. Los rendimientos típicos de los chips, que resultaron tener especificaciones de separación aceptables, estaban cerca del 100 %. En la Fig. 11, se muestra un solo chip flexible fabricado. El chip flexible fabricado mide 7,62 cm x 5,08 cm (3" x 2") e incluye electrodos, depósitos, almohadillas de contacto y cables.
Se aplicó un recubrimiento dieléctrico a los electrodos y depósitos utilizando serigrafía rotativa o impresión en huecograbado. Para la serigrafía rotativa, se utilizó un Henkel EDAC PF-455B como recubrimiento dieléctrico imprimiendo con una pantalla Gallus NF (400L) a una velocidad de impresión de 2 m/minuto y una tasa de endurecimiento UV del 50 %. El espesor dieléctrico típico fue de 10-15 jm . Para la impresión en huecograbado, los cilindros se diseñaron para imprimir una tinta dieléctrica de alta viscosidad, tal como IPD-350 (Inkron), a una velocidad de 2 m/minuto utilizando un volumen de tinta de 50 ml/m2 El espesor dieléctrico típico para la impresión en huecograbado fue de 7-8 jm . Se imprimió una capa hidrófoba final utilizando recubrimiento Millidyne Avalon 87 o Cytonix Fluoropel PFC 804 UC con cilindros de huecograbado (140-180 L) y una velocidad de impresión de 8 m/minuto, seguido de cuatro etapas sucesivas de secado en horno (4 x 140 °C). El espesor hidrófobo típico fue de 40-100 nm.
Como alternativa, para pequeños lotes de chips individuales, los recubrimientos dieléctricos e hidrófobos se pueden aplicar mediante deposición química en fase de vapor (CVD, Chemical Vapor Deposition) y recubrimiento por centrifugación, respectivamente.
EJEMPLO 8
Prueba funcional de chip DMF de bajo coste
Se probó la capacidad de accionamiento de un chip inferior DMF a base de PET de 7,62 cm x 5,08 cm (3" x 2") fabricado como se describe en el Ejemplo 7 anterior. La Fig. 12 representa un chip DMF a base de PET de 7,62 cm x 5,08 cm (3" x 2") (1) sobre el cual se coloca un sustrato de vidrio de 0,7 mm de espesor (3). El sustrato de vidrio (3) incluye un electrodo transparente de óxido de indio y estaño (ITO) sobre una superficie inferior del sustrato de vidrio y un recubrimiento de Teflon® sobre el electrodo de ITO. El chip DMF incluye 80 electrodos de accionamiento de plata con un diseño de electrodo de borde recto y una separación de 50 jm entre electrodos, junto con 8 depósitos de tampón (véase el Ejemplo 7 anterior).
Se recubrieron los electrodos inferiores con una capa de Parileno-C dieléctrico (6-7 jm de espesor) y un recubrimiento final de Teflon® (50 nm de espesor) mediante CVD y recubrimiento por rotación, respectivamente. Se pipetearon aproximadamente 50 j l de tampón PBS con tensioactivo al 0,1 % (2) en cuatro depósitos adyacentes sobre el chip DMF inferior. Los tamaños de las nanogotas variaron de 700-1500 nl (una o dos nanogotas) y se verificaron tanto para el movimiento lateral vertical como horizontal (4), además de los patrones de barrido circular necesarios para la mezcla. El accionamiento de las nanogotas se realizó utilizando una tensión de 90 Vrms. Se probó aproximadamente el 90 % de los electrodos de accionamiento del chip y resultaron ser totalmente funcionales.
EJEMPLO 9
Inmunoensayo de TSH sobre chip DMF de bajo coste
Se probó el chip DMF a base de PET de 7,62 cm x 5,08 cm (3" x 2") superpuesto con el sustrato de vidrio como se describe en el Ejemplo 8 anterior para determinar su capacidad para realizar un inmunoensayo de hormona estimulante de la tiroides (TSH), utilizando detección de quimioluminiscencia. Las muestras simuladas incluían material calibrador de TSH añadido a tampón de solución salina tamponada con tris (TBS, Tris Buffered Saline) que contenía un agente bloqueante y un tensioactivo. Se probaron tres muestras: 0, 4, 40 jlU/ml. Se dispensaron 2 j l de anticuerpo de captura anti-TSH beta, recubierto de micropartículas magnéticas de 5 jm (3 x 108 partículas/ml), desde el depósito de micropartículas en mitad de la serie de electrodos DMF. Se separaron las micropartículas magnéticas del tampón conectando una barra magnética de neodimio (7,62 cm x 1,27 cm x 0,63 cm [3'' x 1/2'' x 1/4''] de espesor, permeabilidad relativa jr = 1,05, intensidad de campo remanente Br = 1,32 T) debajo del chip DMF (Fig. 13A). Se movieron 5 j l de muestra al lingote de micropartículas, tras lo que se mezcló la suspensión de micropartículas (Fig. 13B) sobre una configuración cuadrada de cuatro electrodos durante 5 minutos. Se separaron las micropartículas de la muestra mediante el imán, y se trasladó el sobrenadante a un depósito de desechos (Figuras 13C y 13D). Se movieron 2 j l de anticuerpo de detección anti-TSH a 1 jg/m l conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP, HoRseradish Peroxidase) al lingote de micropartículas y se mezclaron durante 2 minutos. Se separaron las micropartículas mediante el imán y se trasladó el sobrenadante al depósito de desechos. Se lavaron las micropartículas que contenían el complejo del inmunoensayo de tipo sándwich un total de cuatro veces con 4 x 2 j l de tampón de lavado PBS que contenía tensioactivo al 0,1 %. El tampón de lavado de cada etapa de lavado se eliminó una vez completada la etapa. El sustrato quimioluminiscente consistía en 1 j l de H2O2 SuperSignal y 1 j l de luminol (ThermoFisher Scientific), que se movió al lingote de micropartículas, seguido de la mezcla durante 6 minutos. La señal quimioluminiscente se midió a una emisión de 427 nm (excitación de 347 nm) utilizando un PMT H10682-110 de Hamamatsu integrado con una fuente de CC de 5 V. Se representó una curva de respuesta a la dosis frente a la luminiscencia relativa (véase la Fig. 13E).
EJEMPLO 10
Fabricación de módulos nanoporosos
Se fabricó un módulo nanoporoso utilizando métodos de fabricación de litografía blanda convencionales junto con la integración de una membrana de nitruro de silicio (SiNx) disponible en el mercado embebida en una ventana de MET (Norcada). El módulo consistía en cuatro capas separadas de PDMS: un sustrato de PDMS superior e inferior que contenía los microcanales de transferencia y dos capas de PDMS intermedias opcionales para sellar la ventana de MET.
Fabricación del molde maestro SU8: se recubrió por centrifugación un sustrato de vidrio seco, limpio, con fotorresistencia (SU8-50) hasta un espesor deseado. A continuación, se expusieron las áreas del sustrato recubierto selectivamente a luz casi UV utilizando una fotomáscara. La máscara expone la fotorresistencia a la luz UV solo en las regiones donde deben permanecer las formas del microcanal de transferencia y del depósito. A la exposición, le siguió un horneado para reticular las regiones de fotorresistencia que estaban expuestas. Luego se utilizó un desarrollador SU8 para retirar el resto de fotorresistencia no expuesta del sustrato. El producto final es un molde maestro: un sustrato de vidrio con microcanales de transferencia estampados y depósitos de fotorresistencia dura.
Fabricación de capas intermedias de PDMS: Para fabricar las capas intermedias de PDMS, se recubrió un portaobjetos de vidrio mediante centrifugación con una solución que contenía monómero de PDMS y su agente de endurecimiento (elastómero de silicona Sylgard 184) en una proporción de monómero de PDMS:agente de endurecimiento de 7:1, seguido del calentamiento sobre una placa caliente durante 30 minutos a 70 °C. Se despegaron las capas de PDMS del sustrato de vidrio y se perforó un recorte de 1,25 mm a través de las capas de PDMS para proporcionar una abertura que permitiera el acceso a la ventana de MET. Se volvió la superficie de las capas de PDMS hidrófila mediante tratamiento con plasma durante 30 segundos utilizando un tratador de corona a una distancia de 8 mm. Se utilizó un segundo tratamiento con plasma (5 segundos) para tratar la superficie de las capas de PDMS y la ventana de MET antes de unir la ventana de SiNx de MET entre las dos capas intermedias de PDMs .
Fabricación de PDMS superior e inferior: Se fabricaron los sustratos de PDMS superior e inferior que contenían microcanales, como se muestra en la Fig. 14B, mezclando monómero de PDMS y agente de endurecimiento en una proporción de monómero de PDMS:agente de endurecimiento de 7:1 y vertiéndolos sobre vidrio que contenía el molde estampado SU8 (6) con los microcanales de transferencia y depósitos estampados (véase el apartado de Fabricación del molde maestro SU8 descrito anteriormente). Los microcanales medían aproximadamente de 110 a 135 pm de ancho y 50 pm de profundidad. Después de desgasificar durante 15 minutos, se calentó el molde SU8 sobre una placa caliente durante 60 minutos a 70 °C (7). Después del endurecimiento, se despegaron los sustratos de PDMS del molde SU8 (8) y se cortaron para producir sustratos de PDMS rectangulares que tenían una dimensión aproximada de 30 mm de largo x 20 mm de ancho x 3 mm de profundidad. Se perforaron orificios de acceso (1,25 mm de diámetro) a través de los sustratos de PDMS para permitir la posterior inserción de electrodos en los microcanales. El ensamblaje final se muestra en la Fig.14A e incluye, de abajo hacia arriba, sustrato de PDMS inferior que contiene un microcanal (1), una primera capa intermedia de PDMS (2) que contiene un recorte colocado sobre el microcanal, la membrana de SiNx en la ventana de MET (3), una segunda capa intermedia de PDMS (4) que también contiene un recorte, y un sustrato superior de PDMS (5) que contiene un segundo microcanal.
Alineación de sustratos de PDMS superior e inferior: Se trató un sustrato inferior de PDMS (preparado como se describe en el apartado de "Fabricación de PDMS superior e inferior", anterior ) con plasma durante 30 segundos, seguido de la unión de una primera capa intermedia de PDMS (preparada como se describe en el apartado de "Fabricación de capas intermedias de PDMS", anterior) sobre el sustrato inferior de PDMS. Del mismo modo, se trató un sustrato superior de PDMS con plasma durante 30 segundos, seguido de la unión de una segunda capa intermedia de PDMS sobre el sustrato superior de PDMS. Se alinearon los recortes de las capas intermedias con los microcanales. Se trataron las piezas de PDMS superior e inferior con plasma de oxígeno durante 30 segundos, seguido de la colocación de la ventana de membrana de SiNx entre las piezas superior e inferior y alineada con los recortes de las capas intermedias de PDMS. Se presionó la pieza superior alineada con la membrana de SiNx alineada con la pieza inferior hasta que se liberaron todas las burbujas de aire. Se calentó el ensamblaje de PDMS nanoporoso final sobre una placa caliente a 100 °C durante 30 minutos y se trató con plasma durante 5 minutos. El ensamblaje final del módulo, mostrado en la Fig. 14C, (9a) contenía dos canales (uno recto y otro "en forma de L"), terminando cada uno en un depósito para una solución (p. ej., un tampón). Se coloca la ventana de MET que contenía la membrana de SiNx en la intersección de los dos microcanales perpendiculares (Fig. 14C, 9b).
EJEMPLO 11
Fabricación de nanoporos
La fabricación de nanoporos se realizó sometiendo una ventana de MET de SiNx, alojada entre dos capas de PDMS, a una polarización del potencial hasta que se produjo la ruptura dieléctrica, abriendo así un orificio de pequeño diámetro en la membrana. Esto permite la formación in situ de un poro dentro del dispositivo microfluídico, antes de la detección de los analitos. Se ha demostrado previamente que la formación de los nanoporos mediante la ruptura dieléctrica es útil para la fabricación rápida de poros de diámetro pequeño en membranas dieléctricas en estado sólido (H. Kwok, K. Briggs, V. Tabard-Cossa, PLoS-One, 9(3), 2014).
Se embebieron membranas de SiNx disponibles en el mercado como ventanas de microscopio electrónico de transmisión (MET) (Norcada) en el módulo de PDMS ensamblado como se describe en el Ejemplo 10 anterior) y se utilizaron para generar el nanoporo. La unión del microcanal perpendicular expuso un área de sección transversal (50 |jm x 50 |jm) de la ventana de MET de SiNx a una solución salina (KCI 1 M) dispuesta en lados opuestos de la membrana (cis y trans). Se colocaron electrodos de Ag/AgCl en cada microcanal aproximadamente a 3 mm del centro de la ventana de MET de SiNx en orificios perforados a través del sustrato de PDMS. Se utilizó una jeringa que contenía una aguja roma para llenar los microcanales cis y trans mediante la adición de etanol a los dos depósitos hasta que se observó que salía líquido por las aberturas del canal en el borde del módulo. Se midió la resistencia para comprobar el sellado adecuado y para garantizar que la membrana de MET de SiNx estuviera intacta. Una resistencia del orden de los MQ indicaba un buen sellado y una membrana que estaba intacta y sin daños. Se eliminó el etanol del microcanal con agua desionizada y se reemplazó por una solución de KCl 1 M inyectando en los dos depósitos. Se midió de nuevo la resistencia para verificar el sellado adecuado.
Se aplicó una tensión constante de 4,4 V al ensamblaje de la membrana y se controló la corriente residual en tiempo real. La corriente residual medida en tiempo real se representa en la Fig. 15a . La Fig. 15A muestra la corriente residual (1) antes de la creación del nanoporo. Se utilizó un valor umbral de >5 nA como valor de corte, es decir, para designar la creación de poros. Tras aproximadamente 10 minutos, se observó un aumento de la corriente residual (2). Se apagó la tensión inmediatamente después de la detección del aumento de la corriente residual. El diámetro del poro creado fue de 6,9 nm, según lo determinado por la siguiente relación:
Figure imgf000079_0001
donde G = conductancia, a = conductividad aparente (12,35 S/m medidos para KCl), L = espesor de la membrana (10 nm), d = diámetro de poro (S. Kowalczyk, A. Grosberg, Y. Rabin, C. Dekker, Nanotech., 22, 2011).
Tras la creación del poro, se utilizó una curva de corriente-tensión (I-V) (véase la Fig. 15B) para verificar que el nanoporo mostraba un comportamiento óhmico, lo que indicaba que el nanoporo tenía una forma simétrica y que la resistencia era independiente de la tensión o de la corriente aplicadas. Se utilizó la misma solución de KCI 1 M tanto para la fabricación de poros como para las curvas I-V.
EJEMPLO 12
Llenado de microcanal seco
Se probó el conducto capilar contenido en el módulo de PDMS ensamblado (es decir, el dispositivo integrado que incluía un módulo DMF y un módulo nanoporoso) para determinar su capacidad para el llenado espontáneo con soluciones con alto contenido de sal desde el ensamblaje de electrodos DMF (Fig. 16A-16C). El llenado se realizó mediante flujo capilar espontáneo (SCF, Spontaneous Capillary Flow). La membrana nanoporosa no se incluyó para permitir una mejor visualización de los microcanales. Con referencia a la Fig.16A, se utilizó un chip DMF de vidrio 7,62 cm x 5,08 cm x 0,070 cm (3" x 2" x 0,0276") que contenía 80 electrodos de accionamiento (1) (2,25 mm x 2,25 mm, 200 nm de espesor de Cr) para mover una nanogota (2) de LiCl 3,6 M, Brij 35 al 0,05 % y colorante azul (para ayudar a la visualización). El módulo de PDMS (3) contenía dos aberturas dirigidas hacia la serie de electrodos DMF (4), dos depósitos (5) y dos microcanales: un canal recto (6) y un canal en forma de L (7). Se colocó el ensamblaje del módulo sobre la superficie de vidrio DMF de modo que las dos aberturas de los canales estuvieran dirigidas hacia el interior de la serie de electrodos DMF. Dado que no se utilizó un chip de electrodos de conexión a tierra superior, el movimiento de las nanogotas se logró mediante el uso de electrodos inferiores coplanares para generar el potencial impulsor.
Se colocó una nanogota de 10 j l de solución salina de LiCI de color azul sobre un electrodo en mitad de la serie de electrodos DMF. Se utilizó una tensión de 100 Vrms (10 kHz) para mover la nanogota al electrodo de transferencia adyacente a la abertura del microcanal recto. Como se muestra en la Fig. 16 B, una vez que la nanogota entró en contacto con la superficie de PDMS (8), se midió el tiempo necesario para llenar el canal recto de 130 jm de diámetro (9) y llegar al depósito. Como se muestra en la Fig. 16C, después de aproximadamente 30 segundos, el volumen de la nanogota era visiblemente menor (10) y el canal estaba medio lleno (11). Se requirió un tiempo total de 53 segundos para llenar todo el microcanal seco (130 jm de diámetro).
Llenado de microcanal húmedo: Se colocó una nanogota de 10 |jl de solución salina de LiCI de color azul sobre un electrodo en mitad de la serie de electrodos DMF. Se utilizó una tensión de 100 Vrms (10 kHz) para mover la nanogota al electrodo de transferencia adyacente a la abertura del microcanal recto. Se llenó el canal previamente con etanol para imitar un canal prehumedecido. Una vez que la nanogota entró en contacto con la superficie de PDMS, se requirió un tiempo <1 segundo para llenar el canal hasta el depósito. Esto fue significativamente más rápido que el canal seco, 10 que sugiere que el prehumedecimiento con una solución hidrófila mejora las velocidades de llenado de los microcanales.
EJEMPLO 13
Transferencia de nanogotas DMF en dispositivo de NP de silicio integrado
Además de sustratos flexibles, tales como de PDMS, se pueden utilizar sustratos rígidos (p. ej., silicio) para fabricar el módulo nanoporoso. La Fig. 17 muestra un chip microfluídico digital (DMF) (1), que contiene electrodos de accionamiento (4), desde los que las nanogotas se transfieren a un chip microfluídico de silicio que contiene un sensor de nanoporos (2). Las nanogotas se transfieren entre los dos chips constituyentes a través de los accesos (3) de la superficie superior de los chips microfluídicos que contienen el sensor de nanoporos. Los accesos están conectados al sensor de nanoporos (5) mediante canales microfluídicos (6). Las nanogotas se mueven desde los accesos, a través de los canales microfluídicos mediante fuerzas capilares, y el movimiento puede ser ayudado por una bomba de papel pasiva fabricada a partir de una serie de micropilares (7) (Fig. 18). Las bombas pasivas también pueden retirar el fluido de los microcanales, permitiendo el uso de diferentes soluciones fluídicas secuencialmente sin contaminación (p. ej., entre soluciones para la formación de nanoporos y la detección de nanoporos).
La fabricación del módulo nanoporoso de silicio puede incluir el uso de procesos de grabado y fotolitografía de CMOS convencionales. La Fig. 18 muestra un ejemplo de un diseño de módulo nanoporoso de silicio, donde el tamaño aproximado del troquel es de 10 mm x 10 mm, con un canal frontal (cis) y un canal posterior (trans) para llenar con uno o varios tampones los nanoporos. El canal frontal tiene un ancho y una profundidad de 30 jm y una longitud de 11 mm. El canal posterior tiene un ancho de 50 jm , una profundidad de 200 jm y una longitud de 11 mm. Las dimensiones de los micropilares son de 30 jm de diámetro del pilar, espaciado de 30 jm y profundidad de 200 jm .
El módulo DMF y el módulo nanoporoso se pueden unir utilizando una superficie de contacto fabricada con plástico moldeado o mediante unión directa (Fig. 19 y 20). Se transfiere una nanogota colocada en un electrodo (4) dentro del chip DMF alineado con un acceso por fuerzas capilares, facilitado por el intercalador (7). Como alternativa, el electrodo superior (8) el chip DMF se puede modificar para facilitar aún más este proceso introduciendo orificios que conecten los electrodos de accionamiento (4) con el intercalador (8) (Fig. 20).
EJEMPLO 14
Transferencia de nanogotas entre el módulo DMF y el módulo nanoporoso por fuerzas capilares
Se probó la capacidad de mover el tampón de traslado con alto contenido de sal desde un chip DMF a un módulo que contenía una membrana nanoporosa adecuada en un chip microfluídico de silicio. Se probó la capacidad de un microcanal serpenteante para mover pasivamente una gota de KCI 1 M (pH = 8) utilizando el flujo capilar espontáneo (SCF) como única fuerza impulsora. Todo el microcanal se fabricó en silicio y sirvió como modelo para la transferencia fluídica en un entorno de silicio a base de CMOS. El microcanal serpenteante fue diseñado para que tuviera dos accesos (para carga fluídica). Las dimensiones del canal medían 160 jm de diámetro, con una longitud aproximado de 2,5 cm. Se demostró que las nanogotas de una solución adecuada para la formación de nanoporos mediante ruptura dieléctrica llenaron la estructura microfluídica de silicio utilizando fuerzas capilares pasivas.
Haciendo referencia a la Fig. 21, se colocaron nanogotas individuales de solución de KCI 1 M (pH = 8,0) en uno de los accesos de entrada (1) que estaba conectado a un canal microfluídico de transporte (2) que conducía a un canal serpenteante de 2,5 cm de longitud (3). El canal terminaba (4) en un acceso (no mostrado) expuesto a la presión atmosférica. En la Fig. 22, se muestra una imagen ampliada del canal serpenteante. El llenado capilar se controló utilizando una cámara sCMOS adaptada a un microscopio óptico. La deposición de la solución salina en el acceso de entrada produjo el llenado espontáneo del microcanal por fuerzas capilares pasivas a una velocidad de varios mm/segundo, demostrando así la capacidad de transferencia de fluido del microcanal a una membrana nanoporosa.
Como prueba adicional de la velocidad de transferencia, se vació el canal de la solución de KCl y se secó bajo una corriente de nitrógeno. Se colocaron más nanogotas de solución de KCl 1 M (pH = 8,0) en el acceso de entrada del microcanal seco y se controló el llenado capilar utilizando un microscopio óptico. Se observaron velocidades de llenado más rápidas, en comparación con el canal "seco" (es decir, en comparación con la primera vez que se introdujo la solución de KCI en el canal), mostrando así que el llenado previo del microcanal de silicio con una solución hidrófila mejora el llenado fluídico posterior.
EJEMPLO 15
Fabricación de sensor de nanoporos integrado con microcanales fluídicos
Un sensor de nanoporos integrado dentro de microcanales fluídicos se fabrica utilizando procesos de fotolitografía y grabado para modificar una oblea de silicio sobre óxido (SOI, Silicon-On-Oxide) (Fig. 23A-23B).
La oblea de SOI (1) se somete a fotolitografía y grabado (2) para producir una estructura adecuada para el movimiento de pequeños volúmenes fluídicos (3) con dimensiones de 30 pm de ancho y 10-30 pm de profundidad del canal.
Se deposita un material de nitruro de silicio (SiN) (5) sobre la oblea de SOI estampada por evaporación (4).
Se deposita una capa de material de óxido (7) sobre el nitruro de silicio (5) por evaporación (6). El silicio subyacente (1) se expone mediante la retirada selectiva de los materiales de óxido y nitruro superpuestos que cubren una de las microestructuras utilizando una combinación de fotolitografía y grabado (6). Esta estructura formará un microcanal para accionar pequeños volúmenes de fluido.
Se expone el nitruro de silicio subyacente de dentro de una segunda microestructura selectivamente mediante la retirada de la capa de óxido superpuesta solo utilizando una combinación de fotolitografía y grabado (8).
Se unen las microestructuras expuestas de manera permanente a una oblea portadora (9) y se invierte la estructura para su posterior procesamiento (10). El material de óxido que hay sobre el lado inverso de la oblea de SOI se estampa selectivamente utilizando una combinación de fotolitografía y grabado para exponer el lado posterior de cada microestructura (11).
EJEMPLO 16
Síntesis de la construcción de ADN-biotina escindible
Síntesis de ADN bicatenario no biotinilado (NP1): Se sintetizaron dos 50-meros monocatenarios utilizando química de fosforamidita convencional (Integrated DNA Technologies). Oligo NP1-1S consistía en una secuencia de ADN de 50 nucleótidos que contenía un grupo amino en el extremo 5', separado del ADN por un espaciador de carbono C-12 (SEQ ID NO: 1) (1, PM =15.522,3 g/mol, £ = 502.100 M-1 cm-1). Oligo NP1-2AS consistía en una secuencia de ADN de 50 nucleótidos complementaria a NP1-1S (SEQ ID NO: 2) (2, PM =15.507,1 g/mol, £ = 487.900 M-1 cm-1). Ambos oligonucleótidos se cuantificaron y liofilizaron antes de la manipulación posterior.
NP1-1S: 1
H 2 N-agtcatacgagtcacaagtcatcctaagataccatacacataccaagttc
NP1-2AS: 2
GAACTTGGT ATGTGT ATGGTATCTTAGGATGACTT GTGACTCGTAT GACT
3
Diseño de ADNbc-NP1 final:
H 2 N-AGTCATACGAGTCACAAGTCATCCTAAGATACCATACACATACCAAGTTC
TCAGTATGCTCAGTGTTCAGTAGGATTCTATGGTATGTGTATGGTTCAAG
Síntesis de la construcción de ADN de 50 pb bicatenario no biotinilado: Se reconstituyó NP1-2AS (1,44 mg, 93,4 nmol) en 0,5 ml de agua destilada, dando una solución 187 pM. Se reconstituyó NP1-1S (1,32 mg, 85,3 nmol) en 0,5 ml de fosfato 50 mM, tampón de cloruro de sodio 75 Mm a pH 7,5, dando una solución 171 pM. La construcción bicatenaria (3) (SEQ ID NO: 1 - cadena directa (parte superior); SEQ ID NO: 2 - cadena inversa (parte inferior)) se preparó mediante la hibridación de 60 pl de solución de NP1-1S (10,2 pmol) con 40 pl de solución de NP1-2AS (7,47 pmol). Se colocó la mezcla en un bloque calefactor a 85 °C durante 30 min, seguido del enfriamiento lento hasta la temperatura ambiente durante 2 horas. Se purificó el material bicatenario inyectando el volumen de hibridación total (100 pl) sobre una columna TosoH G3000SW (7,8 mm x 300 mm) equilibrada con tampón PBS 10 mM, pH 7,2. El eluyente de la columna se controló a 260 y 280 nm. El material bicatenario (3) eluyó a los 7,9 minutos (aproximadamente 20 minutos). El ADN se concentró hasta 150 pl utilizando un concentrador de filtro Amicon de 0,5 ml (valor de corte de PM de 10000 Da). Se calculó que la concentración final de ADN era 40,5 pM, determinada por la absorbancia A260.
Figure imgf000082_0001
NP1 -dísulfuro-biotina
Biotinilación del oligo con amino 5' monocatenario: Se preparó una solución 100 mM de sulfo-NHS-SS-Biotina (4, ThermoFisher Scientific) disolviendo 6 mg de polvo en 0,099 ml de DMSO anhidro (Sigma Aldrich). Se agitó la solución con formación de vórtice y se utilizó inmediatamente para biotinilar el ADN con amino 5'. Se mezclaron aprox. 100 pl de solución de ADNmc (1, 171 pM, 17,1 pmol, 0,265 mg) (SEQ ID NO: 1) en PBS 50 mM, pH 7,5, con 3,4 pl de reactivo de biotinilación 0,1 mM en DMSO (34,1 pmol, exceso molar de 20 veces sobre el ADNmc). Se mezcló la mezcla y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Dos columnas de desalinización por centrifugación Zeba de 0,5 ml (valor de corte de PM de 7000 Da, ThermoFisher Scientific) se equilibraron en PBS 10 mM, pH 7,2. Se añadió la solución de ADNmc biotinilado en bruto a una columna Zeba y se eluyó a 4.600 rpm durante 1,3 minutos. Se transfirió el eluyente a una segunda columna Zeba y se eluyó como se describe. La concentración de NP1-1S-SS-Biotina (5) purificada (SEQ ID NO: 1 se determinó midiendo la absorbancia A260 (2,03 mg/ml, 131 pM).
Formación de ADN bicatenario biotinilado: Se mezclaron aproximadamente 60 pl de solución de NP1-1S-SS-Biotina (5, 7,85 pmol, 131 pM, 2,03 mg/ml) con 42 pl de solución de NP1-2AS (2, 7,85 pmol, 187 pmol/l) (SEQ ID NO: 2). Se colocó la solución en un bloque calefactor a 85 °C durante 30 minutos, seguido del enfriamiento lento hasta la temperatura ambiente durante 2 horas. El producto bicatenario se purificó en una columna TosoH G3000SW (7,8 mm x 300 mm) utilizando PBS 10 mM, pH 7,2, inyectando todo el volumen de hibridación (aprox. 100 pl). El material biotinilado bicatenario eluyó a los 7,9 minutos (tiempo de ejecución de 20 minutos), según lo controlado por la absorbancia A260. Se redujo el volumen de eluyente hasta 480 j l utilizando un concentrador de filtro Amicon de 0,5 ml (valor de corte de PM de 10000 Da). La concentración de NPl-ditio-biotina final (6) (SEQ ID NO: 1 - cadena directa (parte superior); SEQ ID NO: 2 - cadena inversa (parte inferior)) se calculó como 16,3 jM , determinada por la absorbancia A260.
EJEMPLO 17
Síntesis alternativa de la construcción de ADN-biotina escindible
Secuencias de ADN complementarias (NP-31a y NP-31b): Se sintetizaron dos 60-meros monocatenarios utilizando química de fosforamidita convencional (Integrated DNA Technologies). Oligo NP-31a consistía en una secuencia de ADN de 60 nucleótidos que contenía un grupo amino en el extremo 5', separado del ADN por un espaciador de carbono C-6 (SEQ ID NO:
3) (1, PM =18.841,2 g/mol, 1,7 jM/OD). Oligo NP-31b consistía en una secuencia de ADN de 60 nucleótidos complementaria a NP-31a (Se Q ID NO: 4) (2 , PM =18292,8 g/mol, 1,8 jM/OD). Ambos oligonucleótidos se cuantificaron y liofilizaron antes de la manipulación posterior.
1
NP-31a:
H2N-5'GCC CAG TGT CTT TGT AGG AGG AGC AGC GCG TCA ATG TGG CTG ACG GAC CAT GGC AGA TAG3'
2
NP-31b:
5'CTA TCT GCC ATG GTC CGT CAG CCA CAT TGA CGC GCT GCT CCT CCT ACA AAG ACA CTG GGC3'
3
Diseño de ADNbc-NP-31:
H2N-5'GCC CAG TGT CTT TGT AGG AGG AGC AGC GCG TCA ATG TGG CTG ACG GAC CAT GGC AGA TAG3' 3'CGG GTC ACA GAA ACA TCC TCC TCG TCG CGC TGA TAG ACC GAC TGC CTG GTA CCG TCT ATC5'
Biotinilación del oligo con amino 5’ monocatenario NP-31a: Se preparó una solución 10 mM de NHS-S-S-dPEG4-Biotina (4, PM = 751,94 g/mol, Quanta BioDesign, Ltd) disolviendo 15,04 mg de polvo en 2,0 ml de dimetilformamida (Sigma Aldrich). Se agitó la solución con formación de vórtice y se utilizó inmediatamente para biotinilar el ADN con amino 5'. Se mezclaron aprox. 100 j l de solución de ADNmc (1, 100 jM , 0,01 jmol, 0,188 mg) (SEQ ID NO: 3) en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS), pH 7,4, con 10 j l de reactivo de biotinilación 10 mM en DMF (0,1 jmol, exceso molar de 10 veces frente al ADNmc). Se mezcló la mezcla y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Dos columnas de desalinización por centrifugación Zeba de 0,5 ml (valor de corte de PM de 7000 Da, ThermoFisher Scientific) se equilibraron en PBS 10 mM, pH 7,2. Se añadió la solución de ADNmc biotinilado en bruto a una columna Zeba y se eluyó a 4.600 rpm durante 2 minutos. Se transfirió el eluyente a una segunda columna Zeba y se eluyó como se describe. La concentración de NP-31-SS-Biotina (5) purificada (SEQ ID NO: 3) se determinó midiendo la absorbancia A260 (1,45 mg/ml, 77 jM).
Figure imgf000084_0001
Formación de ADN bicatenario biotinilado: Se mezclaron aproximadamente 60 |jl de solución de NP-31-SS-Biotina (5 , 77 jM ) (SEQ ID NO: 3) con 50 j l de solución de NP-31b (2 , 100 jM ). Se colocó la solución en un bloque calefactor a 85 °C durante 30 minutos, seguido del enfriamiento lento hasta la temperatura ambiente durante 2 horas. El producto bicatenario (SEQ ID NO: 3 - cadena directa (parte superior); SEQ ID NO: 4 - cadena inversa (parte inferior)) se purificó sobre una columna TosoH G3000SW (7,8 mm x 300 mm) utilizando PBS 10 mM, pH 7,2, inyectando todo el volumen de hibridación (aproximadamente 100 jl). El material biotinilado bicatenario eluyó a los 7,57 minutos según lo controlado mediante la absorbancia A260. Se redujo el volumen de eluyente utilizando un concentrador de filtro Amicon de 0,5 ml (valor de corte de PM de 10000 Da). La concentración de NPbc-31-SS-Biotina final (6) (SEQ ID NO: 3 -cadena directa (parte superior); SEQ ID NO: 4 - cadena inversa (parte inferior)) se calculó como 11 jM , determinada por la absorbancia A260.
EJEMPLO 18
Síntesis de construcción escindible mediada por tiol de ADN-biotina escindible
Unión de NPmc-31-SS-Biotina a micropartículas magnéticas recubiertas de estreptavidina (MP-SA) y escisión química (TCEP o DTT): Se realizaron experimentos de escisión química en micropartículas magnéticas mediante el siguiente método (véase la Fig. 25). Se incubaron 100 j l de la solución de oligonucleótido modificado NPmc-31-SS-Biotina a 77 jM en PBS, pH 7,2, con 1 j l de micropartículas paramagnéticas de estreptavidina al 0,1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. El exceso de oligo se retiró atrayendo las partículas a un imán y lavando 10 veces con tampón PBST, pH 7,4. Las partículas unidas al oligo se incubaron con concentraciones variables de DTT o TCEP en PBS, pH 7,4 durante 15 minutos. Las micropartículas se lavaron 10 veces con tampón PBST, pH 7,4, para retirar cualquier oligonucleótido escindido. Se incubó la NP-31c de secuencia complementaria (SEQ ID NO: 5) (7, PM = 7494,6 g/mol, 5,2 jM/OD) que contenía un fluoróforo con las micropartículas durante 30 minutos en PBS, pH 7,4, para unirse con cualquier NPmc-31-SS-Biotina sin escindir que permaneciera intacta en la partícula. Las micropartículas fueron atraídas por un imán y se lavaron 10 veces con tampón PBST, pH 7,4, para retirar cualquier exceso de segmentos de NP-31c. Las micropartículas recubiertas preparadas como se ha explicado anteriormente que se lavaron, pero no se sometieron a escisión química sirvieron como control. La señal fluorescente de las partículas se midió mediante microscopía de fluorescencia. La eficiencia máxima de escisión se midió en el 79 % y 93 % para DTT y TCEP, respectivamente, como se muestra en la Tabla 1.
7
NP-31c:
AlexaFluor® 546-5'CTA TCT GCC ATG GTC CGT CAG3'
Tabla 1
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EJEMPLO 19
Síntesis de ADN-biotina escindible: construcción de fotoescisión
Evaluación de una secuencia de ADN fotoescindible y eficacia de la escisión en micropartículas: Se sintetizó una secuencia fotoescindible de ADN monocatenario utilizando química de fosforamidita convencional (Integrated DNA Technologies). El oligonucleótido consistía en 48 nucleótidos que componían dos segmentos de Oligo (Oligo 8-1 (SEQ ID NO: 6) y Oligo 8-2 (SEQ ID NO: 7)) separados por dos restos fotoescindibles (8 , PM = 15.430,1 g/mol, 441800 L mol-1 cm-1). El extremo 5' contenía un grupo amino separado del ADN por un espaciador de carbono C-6. Se sintetizó una cadena complementaria de Oligo 8-2 que contenía un marcador fluorescente (9 , PM = 7738,8 g/mol, 212700 L mol'1 cm'1) (SEQ ID NO: 8). Ambos oligonucleótidos se cuantificaron y liofilizaron antes de la manipulación posterior. Oligo 8-1 (SEQ ID NO: 6): 5'AAA AAA GGT CCG CAT CGA CTG CAT TCA3'
Oligo 8-2 (SEQ ID NO: 7): 5'CCC TCG TCC CCA GCT ACG CCT3'
NP-8 (8) (Oligo 8-1 (SEQ ID NO: 6) y Oligo 8-2 (SEQ ID NO: 7) unidos por dos restos fotoescindibles ("PC", PhotoCleavable): H2N-5'AAAAAAGGTCCGCATCGACTGCATTCA-PC-PC-CCCTCGTCCCCAGCTACGCCT3' NP-9 (9) (SEQ ID NO: 8): AlexaFluor546-5'AGG CGT AGC TGG GGA CGA GGG3'
Se realizaron experimentos de fotoescisión en micropartículas magnéticas mediante el siguiente método (véanse las Fig. 26A y 26B). Se unió NP-8 covalentemente a un anticuerpo para generar un complejo de Ac-oligo (preparado por Biosynthesis Inc.). Se incubaron 100 j l de complejo de anticuerpo-oligo 33 nM con 1 j l de sólidos al 0,1 % de micropartículas de cabra anti-ratón durante 30 minutos a temperatura ambiente. El exceso de complejo de anticuerpooligo se retiró atrayendo las partículas a un imán y lavando l0 veces con tampón PBST, pH 7,4. Se iluminó la solución del complejo de micropartículas con luz ultravioleta (longitud de onda de 300-350 nm) durante 5 minutos. Las micropartículas fueron atraídas por un imán y se lavaron 10 veces con tampón PBST, pH 7,4, para retirar cualquier segmento de Oligo escindido. Tras la resuspensión de partículas en tampón PBST, pH 7,4, se añadió Oligo 9 marcado con fluorescencia (SEQ ID NO: 8) a las micropartículas irradiadas y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las micropartículas recubiertas preparadas como se ha explicado anteriormente que se lavaron, pero no se sometieron a iluminación UV (Oligo 8-2 sin escindir) sirvieron como control. Se obtuvo una imagen de la señal fluorescente (AlexaFluor® 546) en las partículas mediante un microscopio de fluorescencia. La eficiencia de escisión al unirse a micropartículas paramagnéticas se midió al 74 % como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2
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EJEMPLO 20
Enlazadores escindibles térmicamente
Este ejemplo describe enlazadores escindibles térmicamente y su escisión. Dichos enlazadores escindibles térmicamente se pueden emplear, por ejemplo, en un chip DMF, chip microfluídico a base de nanogotas, chip de SAW, o similar, como se describe en el presente documento.
Los enlazadores escindibles térmicamente se escinden elevando la temperatura por encima de un umbral, tal como en la separación térmica de ADN bicatenario. La elevación de la temperatura en el chip DMF se puede realizar de forma fototérmica transfiriendo energía de la luz a una diana absorbente. En un método, una fuente de luz, tal como un láser, que tiene una longitud de onda de aproximadamente 980 nm (intervalo de aproximadamente 930 nm a aproximadamente 1040 nm) se puede aplicar al chip DMF en la región de la muestra de fluido. La luz puede ser absorbida por las moléculas de agua del fluido, produciendo un aumento de la temperatura y la escisión del enlazador. El nivel y la duración del calentamiento se pueden controlar mediante la longitud del pulso, la energía del pulso, el número del pulso y la tasa de repetición del pulso. Por ejemplo, se describe el calentamiento fototérmico utilizando la banda de absorbancia del agua, p. ej., en la patente de Ee .Uu .6.027.496.
El calentamiento fototérmico también se puede realizar acoplando la fuente de luz a un colorante o un pigmento que contenga una diana. En este caso, se imprime un área diana del chip DMF con un colorante o pigmento absorbente, p. ej. negro carbón. Cuando el fluido entra en contacto con la diana, la fuente de luz, p. ej. un diodo láser disponible en el mercado, se dirige a la diana absorbente de luz, produciendo un aumento localizado de la temperatura y la escisión del enlazador. El nivel y la duración del calentamiento se pueden controlar mediante las propiedades de absorbancia de la diana, la longitud de onda de la luz, la longitud del pulso, la energía del pulso, el número del pulso y la tasa de repetición del pulso. Por ejemplo, el calentamiento fototérmico que utiliza una fuente de luz en combinación con una diana absorbente de luz se describe en la patente de EE.UU. 6.679.841.
En un tercer método de calentamiento fototérmico, se puede introducir un colorante o pigmento absorbente en el fluido del chip DMF. Luego, se transmite la luz a través del chip DMF, y la energía se transfiere al material absorbente disuelto o suspendido, produciendo un aumento localizado de la temperatura y la escisión del enlazador. El nivel y la duración del calentamiento se controlan mediante las propiedades de absorbancia del material diana, la longitud de onda de la luz, la longitud del pulso, la energía del pulso, el número del pulso y la tasa de repetición del pulso. En una realización de este método, la diana absorbente de la luz es la suspensión de micropartículas magnéticas que se utiliza en el dispositivo. Por ejemplo, el calentamiento fototérmico utilizando nanopartículas suspendidas en una nanogota de fluido se describe en Walsh et al., Analyst, 140(5), 1535-42 (2015). La referencia de Walsh et al. también demuestra algo del control que se puede lograr en aplicaciones fototérmicas.
EJEMPLO 21
Escisión térmica realizada mediante hipertermia de partículas inducida por microondas
Este ejemplo describe el uso de la hipertermia de partículas inducida por microondas para facilitar la desnaturalización térmica (tal como la desnaturalización del ADNbc, reacciones retro-Michael, retro-Diels-Alder, y otras eliminaciones) para liberar un resto contable mediante un enlazador escindible termosensible, ya que la detección por inmunoensayo puede acelerarse con el uso de radiación de microondas de baja potencia. Dichos enlazadores escindibles termosensibles se pueden emplear, por ejemplo, en un chip DMF, como se describe en el presente documento.
En este ejemplo, la formación de un segmento de ADNbc corto funcionalizado ortogonalmente, tal como una secuencia de 15 pb con una Tf bicatenaria en el intervalo de 40-55 °C, sirve como agente de liberación térmica. El segmento de ADNbc puede reaccionar con el anticuerpo mediante la química de fijación, tal como la interacción sulfhidril-maleimida y nanopartículas (NP) de poliestireno carboxilado (NP) de 26 nm, tales como las que se pueden obtener en Bangs Labs (Fishers, IN, EE. UU.) mediante la química de fijación, tal como la química del ácido carboxílico activado por amina. Las NP de 26 nm tienen una carga superficial de 528,7 peq/g y un área de estacionamiento de 68,4 sq.A/grupo (según la información del fabricante). El anticuerpo y la nanopartícula se asocian a través del segmento de ADNbc que forma un enlazador liberable generado térmicamente. El enlazador térmico se puede escindir utilizando una técnica tal como la irradiación de microondas para generar la hipertermia de partículas y un gradiente de temperatura localizado.
Secuencia de ADN 1 (10) (SEQ ID NO: 9): H2N-5 ' CAA GCC CGG TCG TAA3'
Secuencia de ADN 1b (11) (SEQ ID NO: 10): Maleimida-5' TTA CGA CCG GGC TTG3'
Secuencia de ADNbc (12) (SEQ ID NO: 9 - cadena directa (parte superior); SEQ ID NO: 10 - cadena inversa (parte inferior)):
H2N-5 ' CAA GCC CGG TCG TAA3'
3' GTT CGG GCC AGC ATT5'-Maleimida.
Hibridación del complejo de secuencias de ADN complementarias funcionalizadas ortogonalmente: Se puede mezclar una solución de secuencia de ADN 1 aproximadamente 100 pM (SEQ ID NO: 9) en PBS, pH 7,5, con 1,0 equivalentes molares de la secuencia de ADN 1b (Tf teórica de 51,6 °C según la herramienta de análisis de oligos de Integrated DNA Technologies) (SEQ ID NO: 10) en PBS a pH 7,5 y colocarla en un bloque calefactor a 60 °C durante 30 minutos, seguido del enfriamiento lento hasta la temperatura ambiente durante 2 horas. El producto de ADNbc resultante se purifica en una columna TosoH G3000SW (7,8 mm x 300 mm) utilizando PBS 10 mM, pH 7,2, inyectando todo el volumen de hibridación. Se reduce el volumen de eluyente utilizando un concentrador de filtro Amicon de 0,5 ml. La concentración final de ADNbc se determina mediante la absorbancia A260. El esquema de reacción se muestra a continuación ("Mal" es maleimida).
Figure imgf000087_0002
Nanopartículas carboxiladas (
Figure imgf000087_0001
Activación de nanopartículas de poliestireno carboxilado y adición de ADN bicatenario: Las nanopartículas carboxiladas se preactivan como se describe en el Ejemplo 5, en el apartado "Activación de nanopartículas de poliestireno carboxilado". La carga de ADN en la NP se determina mediante la desnaturalización térmica de las cadenas de ADN unidas, lavado de partículas, hibridación de una secuencia de ADN complementaria marcada con fluorescencia (tal como AlexaFluor546-5'-TTA CGA CCG GGC TTG3' (SEQ ID NO: 11)) y se cuantifica utilizando un microscopio de fluorescencia.
Figure imgf000088_0001
Reducción de anticuerpos y conjugación a un complejo de NP-ADNbc: El anticuerpo se reduce como se describe en el Ejemplo 5, en el apartado "Reducción de anticuerpos". El anticuerpo reducido se puede utilizar inmediatamente para acoplarlo al complejo de NP-ADNbc. El conjugado resultante se centrifuga a 6.500 g y el sobrenadante se retira por decantación. El procedimiento de lavado se repite 5 veces con PBS a pH 7,5 para retirar cualquier anticuerpo libre de la nanopartícula. La proporción de incorporación de anticuerpo activo con respecto a nanopartícula se puede cuantificar utilizando un antígeno marcado con fluorescencia para el anticuerpo dado. Se determina la concentración de NP conjugada (% de sólidos) utilizando espectroscopia UV-Vis (600 nm). Se examina el conjugado de partículas mediante MEB y se determina la distribución del tamaño/carga utilizando el ZetaSizer.
Figure imgf000088_0002
Conjugado de NP-Ac
Inmunoensayo de recuento de nanoporos e hipertermia de partículas inducida por microondas: El esquema anterior ilustra el ensayo de recuento de nanoporos utilizando el conjugado de anticuerpo-nanopartícula desnaturalizado térmicamente cuya preparación se ha descrito anteriormente. Se puede preparar un inmunoensayo de tipo sándwich utilizando micropartículas magnéticas recubiertas con un agente de captura del analito, en el que el analito sanguíneo se incuba con micropartículas magnéticas, se lava y se incuba con el conjugado de anticuerpo-nanopartícula descrito. La hipertermia de partículas se puede inducir utilizando irradiación de microondas para crear un gradiente de temperatura local cerca de la superficie de las partículas. Se pueden utilizar métodos de hipertermia de partículas tales como los revisados en Dutz y Hergt (Nanotechnology, 25:452001 (2014)). La adaptación de estas técnicas a la desnaturalización térmica local en un entorno de inmunoensayo puede proporcionar un método para liberar un resto de recuento (tal como una nanopartícula). Tras la retirada de las micropartículas magnéticas, el resto de recuento (nanopartícula) se cuenta al pasar a través del nanoporo.
EJEMPLO 22
Datos de recuento de nanoporos
Este ejemplo describe los datos de recuento de nanoporos para una variedad de marcadores, p. ej., moléculas híbridas de ADNmc con polietilenglicoles (ESTRELLAS DE ADN), ADNbc, ADNbc marcado con DBCO y dendrímeros de ácido succinámico PAMAM. Se realizó el uso de estos diferentes marcadores junto con nanoporos de diferentes tamaños para proporcionar una optimización de los nanoporos. Se suspendieron diferentes marcadores de polímeros moleculares en un tampón de sal apropiado y se detectaron utilizando un casete de celda fluídicas convencional.
Los registros de corriente-tensión (i-V) (datos voltamétricos) y los registros de corriente-tiempo (i-t) se registraron utilizando instrumentación interna. Se empleó un software informático denominado CUSUM para ejecutar los datos adquiridos y detectar eventos basados en la entrada del umbral por parte del usuario. Se redujo al mínimo cualquier impacto de subjetividad en la evaluación mediante la detección de tantos eventos como fue posible y el filtrado posterior para fines específicos.
Los experimentos iniciales se realizaron con los marcadores añadidos al lado cis de la membrana. Se aplicó una polarización eléctrica de 200 mV a la solución de marcador y se controlaron los bloqueos de corriente utilizando el amplificador Axopatch 200B y el software CUSUM.
Se sabe que las moléculas pequeñas pueden atravesar los nanoporos con bastante rapidez, a menos que el tamaño de poro restrinja su paso. Los bloqueos de corriente de los eventos rápidos pueden deformarse debido al ancho de banda limitado de un sistema. Las moléculas más rápidas pueden incluso no ser detectadas por un sistema en particular.
En los presentes estudios, solo se detectaron polímeros y moléculas mayores marcadas con modificadores de grupos grandes. Las condiciones experimentales y el número de eventos detectables se muestran en la Tabla 3.
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Estos datos confirman que los dendrímeros de ADN, polímeros y dendrímeros de PAMAM se pueden utilizar como marcadores de detección para los sensores de nanoporos en estado sólido.
EJEMPLO 23
Diferenciación de biomoléculas con nanoporos
En este ejemplo, el nanoporo se utilizó para diferenciar biomoléculas (p. ej., estrellas de ADNbc, ADNbc modificado con DBCO y ADNbc regular). Esta metodología se puede utilizar para multiplexar utilizando diferentes tipos de marcadores.
Este ejemplo empleó un oligonucleótido de 50 pb que contenía un punto de ramificación en el medio (pb n.° 25), donde había un oligonucleótido monocatenario unido covalentemente (Estrella de ADN); un oligonucleótido bicatenario de 50 pb que contenía una modificación de dibencilciclooctina (DBCO) en el medio (base n.° 25); y un oligonucleótido de ADN bicatenario modificado con tiol 5'.
Estas diversas moléculas de ADN modificadas se analizaron utilizando tres nanoporos de SiNx diferentes en tampón LiCI 3,6 M. Las moléculas de estrella de ADN se analizaron con un poro de 4,0 nm de diámetro; el ADN modificado con DBCO se analizó con un poro de 3,7 nm de diámetro; el ADN modificado con tiol se analizó con un poro de 4,2 nm de diámetro. Los niveles de bloqueo de la corriente (pA) se representaron frente a los tiempos de duración de los nanoporos (ps), para mostrar la capacidad de los nanoporos para diferenciar las tres biomoléculas diferentes. A nivel de población, los tres marcadores diferentes parecen distinguirse, como se demuestra por las distintas diferencias de patrón en los gráficos de dispersión (Fig. 24A-24C). La identificación de eventos individuales en tiempo real requiere niveles adicionales de nivel de bloqueo e información de tiempo como una forma de distinguir las señales del ruido. La capacidad para diferenciar diferentes marcadores de nanoporos demuestra que los nanoporos se pueden emplear para la multiplexación en diversos ensayos.
EJEMPLO 24
Análisis cualitativo
El siguiente ejemplo describe un método para realizar un ensayo cualitativo. Básicamente, en este ejemplo, se utilizó una construcción para demostrar el principio del ensayo en un chip DMF, y la construcción se escindió, y el marcador se liberó y luego se contó utilizando un nanoporo para generar una señal a medida que trasladaba el nanoporo, indicando así la unión de dos pares de miembros de unión específica (estreptavidina y biotina) en donde esta escisión y el recuento posterior de un marcador de ADNbc se correlacionan con la unión específica que se ha producido durante el ensayo. Asimismo, se realizaron experimentos de control apropiados para confirmar que la señal generada a partir del marcador que se contó durante la medición del traslado de los nanoporos se debió a que el evento de unión específica había ocurrido durante el proceso de ensayo en lugar de estar correlacionado con la presencia de reactivo de escisión de tiol que se introdujo en el flujo del proceso de ensayo. Los detalles de los experimentos realizados se muestran a continuación.
Escisión mediada por tiol utilizando DMF: Se utilizó un ADN bicatenario marcado con biotina que contenía un enlace disulfuro escindible ((6) del Ejemplo 17) como diana para la detección/recuento de los nanoporos. El ensayo de unión consistió en unir el ADN de biotina a micropartículas magnéticas de estreptavidina en un chip DMF, seguido de una etapa de escisión química mediada por tiol (véase la Fig. 25). La ubicación del reactivo en el chip DMF se muestra en la Fig. 27. El ADN diana escindido, separado de las especies unidas a las partículas magnéticas de estreptavidina, se transfirió a una celda fluídica de nanoporos que contenía una membrana de nitruro de silicio de estado sólido (SiNx) con un nanoporo perforado previamente creado mediante ruptura dieléctrica controlada (H. Kwok, et al., PLoS, 9(3), 2014). El material de ADN diana se contó y analizó utilizando el paquete de análisis de software CUSUM de código abierto (NIST).
Los reactivos apropiados se cargaron en un chip DMF de vidrio (7,62 cm x 5,08 cm x 0,070 cm [3" x 2" x 0,0276"]) que contenía 8 depósitos de reactivo. A excepción de los depósitos de desechos, cada depósito contenía aprox. 5 pl de cada reactivo. Las concentraciones de reactivos fueron las siguientes: Biotina-SS-ADN 11 pM en PBS (pH = 7,2); micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina a 10 mg/ml (p/v) M-270 de 2,7 pm (Life Technologies); tampón de lavado PBS (pH = 7,2) ETKT al 0,05 % (etileno-tetra-KIS (etoxilato-bloque-propoxilato)tetro), tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 50 mM. El tamaño aproximado de una nanogota DMF dispensada fue de 1,5 pl.
Se dispensó una nanogota de micropartículas recubiertas con estreptavidina M-270 y se mezcló con 1 nanogota de NPbc-31-SS-biotina durante aprox. 40 minutos. Se realizó la mezcla combinando las 2 nanogotas y se movió en un patrón circular en el chip DMF sobre 12 electrodos (3 x 4). Se conectó el imán inferior para recoger las micropartículas y se movió el sobrenadante a un depósito de desechos. A continuación, se dispensaron dos nanogotas de tampón PBS/ETKT y se movieron al lingote de micropartículas, que luego se volvió a suspender en solución. Se mezcló la suspensión durante 5 minutos antes volver a conectar el imán, y se retiró el sobrenadante al depósito de desechos. La etapa de lavado de partículas se repitió un total de 11 veces, mientras aumentaba gradualmente el tiempo de mezcla hasta 45 minutos. El último sobrenadante de lavado se trasladó a un depósito vacío. Se movieron 5 nanogotas adicionales de PBS/ETKT al mismo depósito. Se retiraron el lavado y el PBS/eTkT del depósito utilizando una jeringa no metálica de calibre 34 (Microfil 34-AWG) y se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml, en preparación para el análisis de nanoporos. La escisión se inició moviendo 2 nanogotas de reactivo TCEP al lingote de micropartículas y mezclando durante 45 minutos. Se conectó el imán inferior, y el sobrenadante (que contenía el ADN escindido) se movió a un depósito vacío. Se movieron 5 nanogotas adicionales de tampón de lavado PBS/ETKT al mismo depósito. El extracto final se retiró del chip DMF utilizando una jeringa no metálica de calibre 34 y se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml, en preparación para el análisis de nanoporos. Se microcentrifugó el eluyente de escisión durante 30 segundos y se colocó en una rejilla magnética durante 1 minuto, para eliminar cualquier rastro de micropartículas.
Análisis de nanoporos: La fabricación de nanoporos se realizó utilizando la ruptura dieléctrica controlada (CBD, Controlled Dielectric Breakdown) de una membrana de SiNx de 10 nm de espesor embebida en una ventana de MET (0,05 |jm x 0,05 |jm) (Norcada NT0052, SiNx de baja tensión). Este método es capaz de producir poros en estado sólido de diámetro pequeño con alta precisión y a un coste mínimo. Se colocó la membrana de SiNx de MET en una celda fluídica de politetrafluoroetileno (PTFE) que contenía dos cámaras de tampón, y se selló utilizando dos juntas de elastómero de silicona. La celda fluídica contenía un canal de volumen de 16 j l en la parte inferior de la celda, que conectaba la solución salina de la cámara superior con la membrana nanoporosa. Para la fabricación de nanoporos, primero se llenó la celda fluídica con etanol desgasificado, intercambiado con agua desionizada desgasificada, y luego se llenó con KCI 0,5 M desgasificado, tamponado a pH 10 con bicarbonato de sodio en agua desionizada 18 MQ. La fabricación se realizó utilizando un amplificador con una tensión de polarización de 8 V. Los dos lados de la celda de fluido se conectaron utilizando cables de plata/cloruro de plata. Como se describe en Kwok etal., mientras se establece una tensión fija de 8 V, la corriente presenta una capacitancia (reducción de corriente) en tiempo real. Cuando la corriente aumenta, se retira la energía de la celda. La frecuencia de muestreo para la fabricación = 25 KHz. Un aumento de la corriente residual indica la formación de un poro, de modo que se apagó la tensión. El diámetro de poro se determinó a partir de la siguiente ecuación basada en la conductancia:
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donde G = conductancia, a = conductividad aparente (12,35 S/m medidos para KCI), L = espesor de la membrana (10 nm), d = diámetro de poro (S. Kowalczyk, A. Grosberg, Y. Rabin, C. Dekker, Nanotech., 22, 2011). Se comprobó el comportamiento óhmico del nanoporo generando una curva I-V. Se determinó que el diámetro medido del nanoporo era de 4,4 nm, y posteriormente se utilizó para la detección de la diana de ADN bc-SS escindida.
Se reemplazó el tampón de sal de la fabricación por LiCl 3,6 M, que se utilizó como tampón de detección para detectar los eventos de traslado. Se colocó una plataforma entre un amplificador Axopatch 200B y la conexión de plata/cloruro de plata a la celda fluídica que alojaba la membrana nanoporosa.
Se diluyeron aprox. 0,2 j l de la diana de ADNbc escindida con TCEP con 1,8 j l de tampón PBS (esto representó una dilución de 10 veces el eluyente de escisión de TCEP), y se cargó todo el volumen y se mezcló en la cámara de celdas nanoporosas, que contenía aproximadamente 30 j l de solución salina de LiCl 3,6 M. El último eluyente de lavado DMF se utilizó como control de escisión negativo (no se diluyó). Se midió el número de traslados de ADN durante 23 y 65 minutos para el eluyente de TCEP y el control negativo, respectivamente, se convirtió a una tasa de flujo (s_1). Los resultados representados en la Fig. 28 demuestran que la diana de bc-SS-ADN se escindió con éxito de las partículas de estreptavidina M-270 utilizando DMF y se detectó utilizando un nanoporo en estado sólido como detector. Se determinó que la S/R fue de 21,9, medida a partir de la tasa de flujo del nanoporo.
Análisis de los datos: Se determinó el número de eventos de traslado calculando primero el cambio de corriente anticipado que se encuentra en un evento de traslado de ADN bicatenario en condiciones de prueba experimentales utilizando la ecuación
AG = "”d*DiV (51)
como se hace referencia en Kwok et al., "Nanopore Fabrication by controlled Dielectric Breakdown" Apartado de información complementaria 8 y Kwok, H.; Briggs, K.; y Tabard-Cossa, V.; "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown" - PLoS ONE 9(3): e92880 (2014). Utilizando este valor de bloqueo de la corriente anticipado, Se escaneó visual o manualmente los datos del archivo binario de los resultados del nanoporo experimental en busca de eventos de bloqueo de la corriente anticipados aceptables. Utilizando estos eventos, se aplicaron y ejecutaron los parámetros de Umbral e Histéresis necesarios para el software para nanoporos CUSUM. Los resultados de este software se analizaron más a fondo utilizando el software cusumtools readevents.py y filtrando los eventos de bloqueo mayores de 1000 pA (según lo determinado a partir del primer cálculo). Los eventos de flujo, el tiempo entre eventos y otros cálculos se determinaron con la herramienta de análisis readevents.py. Se realizaron cálculos adicionales sobre los datos generados por CUSUM utilizando el software JMP (SAS Institute, Cary, Carolina del Norte). Se entiende que este método de establecimiento de umbrales es un enfoque para el análisis de datos y establecimiento de un umbral, y que la presente invención no se limita a este método, pudiéndose utilizar también otros métodos conocidos por los expertos en la materia.
Sumario: Este ejemplo describe un ensayo cualitativo mediante la realización del proceso de etapas como se describe en el presente documento. Se realizó un ensayo directo utilizando el conjugado de enlazador escindible, como se describe en el Ejemplo 17, con una etapa de escisión a base de tiol, como se muestra en la Figura 25. Se entiende que otros enfoques de enlazadores escindibles para realizar dicho ensayo también pueden incluir, pero sin limitación, otros diversos métodos de escisión de un enlazador para permitir el recuento de diversos marcadores, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, dichos otros métodos de escisión y/o reactivos alternativos además del método descrito en el Ejemplo 17 pueden incluir los descritos en el Ejemplo 16, Ejemplo 18, Ejemplo 19, Ejemplo 20 y Ejemplo 21, además de otros métodos de escisión descritos en el presente documento y conocidos por los expertos en la materia. También se entiende que, si bien el formato de ensayo demostrado en este ejemplo (Ejemplo 24) representa un ensayo directo, otros formatos, tales como formatos de inmunoensayo de tipo sándwich y/o diversos formatos de ensayo competitivos, tales como los que conocen los expertos en la materia, también se pueden implementar para realizar un ensayo utilizando los métodos descritos.
Por ejemplo, el formato de inmunoensayo de tipo sándwich para la detección de TSH (hormona estimulante de la tiroides), como se describe en el Ejemplo 9, demostró la capacidad de realizar dicho ensayo en un chip DMF de bajo coste. Adicionalmente, se pueden sintetizar varios reactivos de bioconjugación útiles para la generación de inmunoconjugados u otros miembros de unión específica activos que tengan enlazadores escindibles utilizando diversos enlazadores escindibles heterobifuncionales tales como los descritos en el Ejemplo 1, Ejemplo 2, Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6, además de otros enlazadores escindibles que son conocidos por los expertos en la materia. Los inmunoconjugados útiles para la práctica de la presente invención se pueden sintetizar mediante métodos como los descritos en el Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6, así como mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, el Ejemplo 8 muestra la funcionalidad de diversas manipulaciones de nanogotas fluídicas en un chip de bajo coste que puede facilitar diversas etapas necesarias para llevar a cabo diversos formatos de ensayo, incluyendo los formatos de ensayo de tipo sándwich y competitivos, así como otras variaciones de los mismos conocidas por los expertos en la materia. El Ejemplo 11 muestra la fabricación de un nanoporo que se puede utilizar para contar un marcador escindible en un ensayo, pero se entiende que también se pueden utilizar para este fin otros métodos para la fabricación de nanoporos conocidos por los expertos en la materia. El Ejemplo 16 también representa otra construcción útil para la realización de un ensayo en el que se efectúa una escisión, conduciendo así a la liberación de un marcador contable para que sea contable utilizando el método de recuento de nanoporos, como se describe en este ejemplo.
El Ejemplo 22 muestra cómo se puede efectuar en general el recuento para poder medir los eventos de traslado relacionados con la presencia de una variedad de marcadores que atraviesan el nanoporo. La Fig. 29 muestra el concepto de umbralización de la señal para poder manipular la calidad de los datos en un ensayo de recuento. La Fig. 28 muestra los datos del ensayo cualitativo que son representativos del tipo de datos que se pueden utilizar para determinar la presencia de un analito utilizando dichos métodos de ensayo como se describe en este ejemplo. También se entiende que, si bien se utilizó ADNbc como marcador en este ejemplo en particular, también se pueden utilizar otros marcadores, tales como el marcador descrito en el Ejemplo 5 y/o el Ejemplo 22, incluyendo, pero sin limitación, nanoperlas, dendrímeros y similares. Dichas construcciones necesarias para generar los reactivos apropiados se pueden sintetizar a través de diversos ejemplos del presente documento en esta solicitud o de otro modo mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.
EJEMPLO 25
Análisis cuantitativo
El siguiente ejemplo describe un método para realizar un ensayo cuantitativo. Básicamente, en este ejemplo, y como una ampliación del Ejemplo 24, se generó una curva patrón para demostrar que mayores cantidades de marcador de recuento, siendo el marcador contable en este caso una molécula de ADNbc, se correlacionaron en una curva patrón con la cantidad de agente de unión específica que se ha unido (que a su vez se correlaciona con la cantidad de analito existente en la muestra original) en una etapa de ensayo (unión). La curva patrón para este experimento en particular se puede encontrar en la Figura 31, Figura 32, Figura 34 basada en diversos métodos diferentes de análisis de datos o la Figura 34, que se basa en el flujo para generar una curva patrón. En el último caso, el método de medición que se muestra en la Fig. 34 se basa se basa en los eventos/el tiempo (flujo de eventos de recuento), pero se entiende que también se pueden utilizar otros métodos de medición para generar una curva patrón que se correlacione con la cantidad de concentración de analito que se mide en un determinado muestra. Los detalles de los experimentos realizados son los siguientes.
Fabricación de nanoporos: La fabricación de nanoporos se realizó utilizando la ruptura dieléctrica controlada (CBD) de una membrana de SiNx de 10 nm de espesor embebida en una ventana de MET (0,05 pm x 0,05 pm) (Norcada NT0052, SiNx de baja tensión) ya que este método es capaz de producir poros en estado sólido de diámetro pequeño con alta precisión y a un coste mínimo. Se colocó la membrana de SiNx de MET en una celda fluídica de politetrafluoroetileno (PTFE) que contenía dos cámaras de tampón, y se selló utilizando dos juntas de elastómero de silicona. La celda fluídica contenía un canal de volumen de 16 j l en la parte inferior de la celda, que conectaba la solución salina de la cámara superior con la membrana nanoporosa. Para la fabricación de nanoporos, primero se llenó la celda fluídica con etanol desgasificado, intercambiado con agua desionizada desgasificada, y luego se llenó con KCI 0,5 M desgasificado, tamponado a pH 10 con bicarbonato de sodio en agua desionizada 18 MO. La fabricación se realizó utilizando un amplificador con una tensión de polarización de 8 V. Los dos lados de la celda de fluido se conectaron utilizando cables de plata/cloruro de plata. Como se describe en Kwok et al., mientras se establece una tensión fija de 8 V, la corriente presenta una capacitancia (reducción de corriente) en tiempo real. Cuando la corriente aumenta, se retira la energía de la celda. La frecuencia de muestreo para la fabricación fue de 25 KHz. Un aumento brusco de la corriente residual indicó la formación de un poro, de modo que se apagó la tensión. El tampón KCl 0,5 M se reemplazó por LiCl 3,6 M (pH = 8,3).
El diámetro de poro se determinó a partir de la siguiente ecuación basada en la conductancia:
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donde G = conductancia, a = conductividad aparente (16,06 S/m medidos para LiCl), L = espesor de la membrana (10 nm) y d = diámetro de poro (S. Kowalczyk, A. Grosberg, Y. Rabin, C. Dekker, Nanotech., 22, 2011). Se comprobó el comportamiento óhmico del nanoporo generando una curva I-V. Se determinó que el diámetro medido del nanoporo era de 4,8 nm, y se utilizó posteriormente para la detección de los patrones de calibración de ADN.
Respuesta a la dosis de ADN: se utilizaron patrones de ADN como calibradores para observar una curva de respuesta a la dosis determinando el cambio en la tasa de flujo de los nanoporos con concentraciones crecientes de ADN. Esto generó una curva patrón que se puede utilizar para la cuantificación de un marcador de ADN escindido en un inmunoensayo. Se pipetearon dos j l de un patrón de ADN de 100 pb 1,5 jM (ThermoScientific) en la celda fluídica de PTFE que contenía 30 j l de solución salina de LiCI 3,6 M, para dar una concentración final de ADN de 94 nM. Se mezcló el reactivo pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces antes del análisis de los nanoporos. Se sometió la celda a una polarización de CC de 200 mV y se controló para detectar bloqueos de corriente durante 60 minutos. Se utilizó el software de análisis CUSUM para caracterizar las señales eléctricas y las tasas de recuento. Este procedimiento se repitió dos veces, dando dos puntos adicionales en la curva patrón, 182 nM y 266 nM. Se muestran los bloqueos de corriente durante diferentes períodos de tiempo para los tres patrones: 41 segundos para 94 nM (Fig. 30A); 24 segundos para 182 nM (Fig. 30B); 8 segundos para 266 nM (Fig. 30C). El ruido basal se estimó empíricamente en aproximadamente 900 pA, 900 pA y 1000 pA para la Fig. 30A, Fig. 30B y Fig. 30C, respectivamente.
Los datos de la serie se utilizaron para generar tres tipos diferentes de curvas de respuesta a la dosis: número de eventos durante un período de tiempo fijo (5 minutos) (Fig. 31); tiempo requerido para un número fijo de eventos (200 eventos) (Fig. 32); y eventos por unidad de tiempo (Fig. 33). Cada una de estas curvas se puede utilizar como curva patrón para un inmunoensayo cuantitativo basado en nanoporos, utilizando ADN como marcador. Del mismo modo, se pueden utilizar otros marcadores para cuantificar diversos analitos, tales como dendrímeros, polímeros, nanopartículas y similares.
Respuesta a la dosis de ADN Seq31-SS-Biotina: Se utilizó la construcción de ADN sintético, Seq31-SS-biotina, como material de origen para generar una curva de respuesta a la dosis (Fig. 47). Esta diana se puede utilizar para cuantificar el marcador escindido NP-Seq31-SS-biotina, que se escindió de las perlas de estreptavidina en el ensayo cualitativo. Dado que este material tiene aproximadamente el mismo peso molecular y densidad de carga que el marcador escindido Seq31-SS-biotina, se puede utilizar en una curva de calibración para cuantificar la diana escindida de micropartículas de estreptavidina utilizando TCEP y/o DTT.
Análisis de los datos: Se determinó el número de eventos de traslado calculando primero el cambio de corriente anticipado que se encuentra en un evento de traslado de ADN bicatenario en condiciones de prueba experimentales utilizando la ecuación:
AG = "”d*DiV (51)
como se hace referencia en Kwok et al., "Nanopore Fabrication by controlled Dielectric Breakdown" Apartado de información complementaria 8 y Kwok, H.; Briggs, K.; y Tabard-Cossa, V.; "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown" - PLoS ONE 9(3): e92880 (2014). Utilizando este valor de bloqueo de la corriente anticipado, Se escaneó visual o manualmente los datos del archivo binario de los resultados del nanoporo experimental en busca de eventos de bloqueo de la corriente anticipados aceptables. Utilizando estos eventos, se aplicaron y ejecutaron los parámetros de Umbral e Histéresis necesarios para el software para nanoporos CUSUM. Los resultados de este software se analizaron más a fondo utilizando el software cusumtools readevents.py y filtrando los eventos de bloqueo mayores de 1000 pA (según lo determinado a partir del primer cálculo). Los eventos de flujo, el tiempo entre eventos y otros cálculos se determinaron con la herramienta de análisis readevents.py. Se realizaron cálculos adicionales sobre los datos generados por CUSUM utilizando el software JMP (SAS Institute, Cary, Carolina del Norte). Se entiende que este método de establecimiento de umbrales es un enfoque para el análisis de datos, y que la presente invención no se limita a este método, sino que también se pueden utilizar otros métodos conocidos por los expertos en la materia.
Sumario: Este ejemplo describe un ensayo cuantitativo mediante la realización del proceso de etapas como se describe en el presente documento. Se realizó un ensayo directo utilizando el conjugado de enlazador escindible, como se describe en el Ejemplo 17, con una etapa de escisión basada en tiol, y como se muestra en la Fig. 25. Se entiende que otros enfoques de enlazadores escindibles para realizar dicho ensayo también pueden incluir, pero sin limitación, otros diversos métodos de escisión de un enlazador para permitir el recuento de diversos marcadores utilizando un nanoporo, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, dichos otros métodos de escisión, además del método descrito en el Ejemplo 17, pueden incluir, pero sin limitación, los descritos en el Ejemplo 18, Ejemplo 19, Ejemplo 20 y Ejemplo 21, además de otros métodos descritos en el presente documento y conocidos por los expertos en la materia. También se entiende que, si bien el formato de ensayo demostrado en este ejemplo (Ejemplo 25) representa un ensayo directo, otros formatos, tales como formatos de inmunoensayo de tipo sándwich y/o diversos formatos de ensayo competitivos, tales como los que conocen los expertos en la materia, también se pueden implementar para realizar un ensayo.
Por ejemplo, el formato de inmunoensayo de tipo sándwich para la detección de TSH (hormona estimulante de la tiroides), como se describe en el Ejemplo 9, demostró la capacidad de realizar dicho ensayo en un chip DMF de bajo coste. Adicionalmente, los expertos en la materia pueden sintetizar varios reactivos de bioconjugación útiles para la generación de inmunoconjugados u otros miembros de unión específica activos que tengan enlazadores escindibles utilizando diversos enlazadores escindibles heterobifuncionales y conjugados sintetizados mediante métodos tales como los descritos en el Ejemplo 1, Ejemplo 2, Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6, además de otros enlazadores o conjugados escindibles que podrían sintetizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, el Ejemplo 8 muestra la funcionalidad de diversas manipulaciones de nanogotas fluídicas en un chip de bajo coste que puede facilitar diversas etapas necesarias para llevar a cabo diversos formatos de ensayo, incluyendo los formatos de ensayo de tipo sándwich y competitivos, así como otras variaciones de los mismos conocidas por los expertos en la materia. El Ejemplo 16 también representa otra construcción útil para la realización de un ensayo en el que se efectúa una escisión, conduciendo así a la liberación de un marcador contable para que sea contable utilizando el método de recuento de nanoporos como se describe dentro de este ejemplo.
El Ejemplo 22 muestra cómo se puede realizar en general el recuento para poder medir los eventos de traslado relacionados con la presencia de un marcador que atraviesa el nanoporo. La Fig. 29 muestra el concepto de umbralización de la señal para poder manipular la calidad de los datos en un ensayo de recuento. Las Fig. 31, 32 y 33 muestran los datos que resultan del ensayo cuantitativo que son representativos del tipo de datos que se pueden utilizar para determinar la cantidad de un analito utilizando dichos métodos de análisis descritos en este ejemplo. La Figura 34 muestra una curva patrón generada a partir de una construcción que se ha escindido mediante un método químico. También se entiende que, si bien se utilizó ADNbc como marcador en este ejemplo en particular, también se pueden utilizar otros marcadores, tales como el marcador descrito en el Ejemplo 5, incluyendo, pero sin limitación, nanoperlas, dendrímeros y similares. Dichas construcciones se pueden sintetizar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.
EJEMPLO 26
Simulaciones de campo eléctrico en nanoporos
Se realizó una serie de ejecuciones de simulación con COMSOL en el diseño de membrana nanoporosa propuesto utilizado en el módulo de silicio, para estudiar la influencia del tamaño de la vía de SiO2 sobre la concentración de contraiones y el caudal electroosmótico a través de un nanoporo teórico de 10 nm de diámetro. Una capa superior de SiO2 sirvió para múltiples fines: 1) proporcionar una capa aislante a la membrana de SiNx y, de este modo, reducir el ruido capacitivo del nanoporo; 2) aumentar la robustez y resistencia de la membrana de SiNx dentro del sustrato de silicio; 3) disminuir el tamaño del área de SiNx expuesta a la solución, mejorando así la colocación del poro en la membrana del proceso de ruptura dieléctrica controlada (CBD). Se utilizaron simulaciones de campo eléctrico para determinar la interferencia de la capa de SiO2 en la concentración de contraiones localizados y el flujo electroosmótico a través del poro.
Haciendo referencia a la Fig. 35, se grabó el sustrato de silicio (1), dando las cámaras cis y trans, situadas por encima y por debajo de la membrana de SiNx. Se colocó la membrana de SiNx (50 pm x 50 pm) (2) entre una capa inferior de SiO2 de 300 pm de espesor y una capa superior de SiO2 de 300 pm de espesor (3). La capa superior se fabricó para formar una vía de SiO2 (4), lo que permitió la formación del nanoporo durante la CBD. El diámetro óptimo de la vía de SiO2 se determinó mediante la simulación.
Resultados de la simulación con COMSOL: Las simulaciones de campo eléctrico con COMSOL utilizaron modelos físicos basados en materiales, electrostática, transporte molecular y propiedades de flujo laminar. El potencial eléctrico se basó en la ecuación de Poisson; el flujo iónico se basó en la ecuación de Nernst-Planck; la velocidad del fluido se basó en la ecuación de Stokes. Los parámetros físicos utilizados para la simulación se definen en la Tabla 1, mostrada en la Fig. 36.
Los resultados de COMSOL para gradientes de concentración de contraiones cerca del poro se muestran en la Fig. 37, y muestran poca o ninguna influencia de la concentración iónica cuando el diámetro de la vía de SiO2 era > 50 nm de diámetro. Por debajo de 50 nm, se produjo una acumulación de carga neta cerca de la boca del poro. El efecto más severo se observó a un diámetro de 25 nm, donde se formó un gran gradiente iónico cerca del poro. Los resultados mostraron una influencia bastante grande de la superficie de SiO2 cuando el nanoporo estaba a menos de 25-50 nm de la pared de SiO2.
Se simularon caudales electroosmóticos de contraiones a través del poro como una forma de determinar cualquier influencia que la capa de SiO2 pudiera tener en la detección de los nanoporos (Fig. 38). El caudal electroosmótico más alto se produjo con los diámetros de vía mayores (100-4500 nm). Se observó una reducción del caudal a través del poro para una vía de SiO2 de 50 nm, seguida de una reducción significativa para una vía de 25 nm.
Como se muestra en la Fig. 39, la medición de la conductancia a través del poro frente a los diámetros mostró una curva de saturación por encima de 100 nm, con conductancia decreciente a medida que el diámetro de la vía se reducía de tamaño de 100 nm a 25 nm.
Ejemplo 27
Integración de un módulo nanoporoso a un módulo microfluídico digital (DMF)
El módulo nanoporoso estaba ubicado en un lado del módulo DMF. Había un orificio en el módulo DMF para permitir el transporte de líquido desde el módulo DMF hasta el módulo nanoporoso para la creación de poros y la detección de analitos (p. ej., véase la Fig. 40).
Un electrodo del módulo nanoporoso terminó dentro del volumen de fluido del módulo nanoporoso. El otro electrodo terminó dentro del volumen de fluido del módulo DMF. Este electrodo se encaminó a través de un segundo orificio en el módulo DMF. Para demostrar que el líquido podía moverse a través del orificio dentro del módulo DMF, se empujó un trozo de papel plano sobre la superficie exterior del chip después de que el líquido se moviera a su sitio. El humedecimiento de este papel mostró que el líquido podía moverse desde el módulo DMF a otro módulo ubicado encima de este orificio mediante fuerzas capilares (Fig. 41).
Haciendo referencia a la Fig. 42, el módulo DMF estaba dotado de electrodos de Ag/AgCl para el control de la fabricación de nanoporos. En esta configuración, el volumen de líquido del módulo nanoporoso era una nanogota de LiCI al aire libre. Este líquido se dispensó directamente sobre el módulo nanoporoso y se suspendió el terminal del electrodo dentro de esta nanogota.
Se movió la muestra al orificio del módulo DMF utilizando tecnología DMF. La muestra migró pasivamente a través del orificio para quedar expuesta al módulo nanoporoso para la creación de nanoporos. Se selló el módulo nanoporoso en el módulo DMF (p. ej., utilizando PDMS, presión, cera, etc.), aislando los volúmenes de líquido retenidos dentro de cada módulo. La Fig. 45 muestra la corriente en función del tiempo durante la fabricación del nanoporo.
Una vez que se creó el nanoporo, se utilizó un proceso de acondicionamiento (tensión variable a lo largo del tiempo) para modificar físicamente el nanoporo y limpiar la señal. Este proceso mejoró la simetría en la curva I-V. Las curvas I-V antes y después se muestran en las Fig. 46A y 46B, respectivamente.
EJEMPLO 28
Recuento de marcadores y análisis del tamaño de los poros
Se ejecutó una serie de experimentos utilizando ADN bicatenario en diferentes conjuntos de condiciones para analizar y demostrar determinados atributos en relación con el tamaño de los poros y el tamaño del marcador de recuento. En estos experimentos, se exploraron diversos parámetros, incluyendo la tensión de detección, la longitud del ADN, la concentración de ADN, la concentración de sal y la composición de la sal, el material de la membrana, el espesor de la membrana, el diámetro de nanoporo y otros factores.
A continuación, se analizó el conjunto de datos con respecto a la relación señal/ruido, y se comparó ese factor con diferentes tamaños de poro en relación con el tamaño del marcador de recuento (diámetro molecular estimado). Determinados factores, tales como el material y el espesor de la membrana, por ejemplo, se mantuvieron constantes en este conjunto de experimentos, mientras que otros factores fueron variados.
A partir de un análisis del conjunto de datos agregados, se representaron gráficamente las medias de las proporciones entre el diámetro medio del marcador de recuento y el tamaño de nanoporo para la S/R (proporción de señal a ruido) determinada en el experimento (Fig. 47). La Fig. 47 demuestra que, en general, se pueden obtener datos de recuento útiles a partir de un intervalo de dichas proporciones, en este conjunto de datos en particular entre aproximadamente 0,4 y 0,8 en dicha proporción, suponiendo un diámetro molecular de un ADNbc de aproximadamente 2,0 nm. Se sabe a partir de la bibliografía que el ADNbc lineal tiene aproximadamente ese diámetro molecular y el análisis supone las hebras de ADN a través del poro en su configuración lineal. La Tabla 4 muestra los datos calculados.
Tabla 4
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Si bien las condiciones variaron, como se ha mencionado anteriormente en este ejemplo, el intervalo general en este conjunto de datos muestra que se pueden obtener datos de recuento con una señal a ruido razonable dentro de este intervalo. Asimismo, debería observarse que un experto en la materia reconocería que podrían utilizarse otras proporciones del diámetro molecular de marcador de recuento con respecto al diámetro de nanoporo para lograr una S/R razonable. Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que, en general, un marcador debe tener al menos una dimensión de su diámetro molecular que sea menor que el tamaño del nanoporo para poder atravesar el poro, es decir, en otras palabras, que esta proporción del diámetro molecular del marcador con respecto al diámetro del nanoporo debe ser generalmente inferior a uno para que el marcador pueda atravesar el poro, excepto en los casos en los que quizás se utilicen condiciones como las que se describen en una tecnología denomina espectroscopia de fuerza de nanoporos, en donde se añade energía al sistema para facilitar que se produzcan cambios de configuración en el marcador y así permitir que pase a través del poro después de la deformación a un nivel que permitiría se produjera dicho traslado.
Un experto en la materia también ha de entender que se pueden utilizar otros marcadores para el recuento distintos del ADNbc como se describe en este ejemplo, y que pueden tener comportamientos diferentes a los mostrados en este gráfico. Asimismo, también se ha de entender que también es posible obtener una S/R aceptable a partir de otras proporciones del diámetro molecular con respecto al diámetro del nanoporo para permitir el recuento molecular de dichos marcadores, y que el bloqueo de la corriente puede estar relacionado con el diámetro molecular de dicho marcador de recuento como se describe en la siguiente ecuación
AG = "”d*DiV (51)
que se puede encontrar en las siguientes referencias: Kwok et al., "Nanopore Fabrication by controlled Dielectric Breakdown", Apartado 8 de información suplementaria, y/o Kwok, H.; Briggs, K.; y Tabard-Cossa, V.; "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown" - PLoS ONE 9(3): e92880 (2014). Esta ecuación se puede utilizar para generar una señal de puerta o umbral como se describe en los Ejemplos 24 y 25 del presente documento.
Determinadas condiciones específicas que variaron dentro de este conjunto agregado de experimentos de recuento de nanoporos incluyeron:
Fuerza iónica: 3 o 3,6 M
Longitud del ADN: 10 kpb, 50 pb o 1 kpb
Sal iónica utilizada: bien LiCI o KCI
Material de la membrana: SiNx (constante en todo el conjunto de datos)
Espesor de la membrana: -10 nm (constante en todo el conjunto de datos)
Concentración/es de ADN: varió entre 3 nM y aproximadamente 306 nM
Tensiones: variadas, incluyendo incrementos de entre 50 y 600 mV
Diámetro de nanoporo: una variedad de tamaños de poro, incluyendo 8,0; 1,1; 3,6; 4,2; 2,8; 2,5; 7,7; 3,1; 2,7; 2,6; 2,9 y 4,2 (todos en nanómetros).
Se pueden sacar las conclusiones de que diversas condiciones, incluyendo, entre otras, estas, muestran que se puede obtener, en situaciones en las que el marcador contable sea menor que el diámetro del poro, un bloqueo del flujo de corriente iónica a través del poro cuando se aplica una tensión según la cantidad calculable, pero esta ecuación de Kwok et al. como se hace referencia en este ejemplo [Kwok et al., "Nanopore Fabrication by controlled Dielectric Breakdown", Apartado 8 de información suplementaria, y/o Kwok, H.; Briggs, K.; y Tabard-Cossa, V.; "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown" - PLoS o Ne 9(3): e92880 (2014)].
También se entiende que estas condiciones se pueden aplicar para mostrar diámetros moleculares de marcadores de recuento con respecto a los diámetros de poros que funcionarán con una señal a ruido razonable para otros marcadores además del ADNbc, incluyendo, entre otros, dendrímeros, hemi-dendrímeros, nanoperlas, polímeros aniónicos o catiónicos, aptámeros linealizados desnaturalizados, polipéptidos cargados negativa o positivamente, u otros polímeros cargados o entidades moleculares contables y similares.
Por último, aunque los diversos aspectos y rasgos distintivos de la invención se han descrito con respecto a diferentes realizaciones y ejemplos específicos en el presente documento, todo lo cual puede realizarse o llevarse a cabo de forma convencional, se entenderá que la invención tiene derecho a protección dentro del alcance completo de las reivindicaciones adjuntas.
Se entiende que la descripción detallada anterior y los ejemplos que la acompañan son meramente ilustrativos y que no deben tomarse como limitaciones del alcance de la invención, que está únicamente definida por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
Para los expertos en la materia serán evidentes diferentes cambios y modificaciones de las realizaciones desveladas.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo nanoporoso y microfluídico digital integrado para la detección de analitos que comprende:
un módulo microfluídico digital; y
un módulo nanoporoso conectado de forma fluida al módulo microfluídico digital y que comprende al menos un nanoporo en una capa,
en donde el módulo microfluídico digital facilita el movimiento de una nanogota hacia el al menos un nanoporo.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde el al menos un nanoporo es un nanoporo en estado sólido o un nanoporo biológico.
3. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde el módulo microfluídico digital mueve la nanogota mediante una fuerza de manipulación de fluido seleccionada entre presión de la fuerza eléctrica, electrohumectación, dielectroforesis, fuerza mediada por electrodos, optoelectrohumectación, fuerza mediada por campo eléctrico o accionamiento electrostático, y ondas acústicas superficiales.
4. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde el módulo microfluídico digital comprende:
un primer sustrato que comprende una serie de electrodos; y
un segundo sustrato separado del primer sustrato,
en donde el módulo nanoporoso está dentro del módulo microfluídico digital, el módulo nanoporoso comprende la capa con el al menos un nanoporo en su interior, y la capa está dispuesta entre el primer sustrato y el segundo sustrato; y
en donde un primer electrodo de la serie de electrodos forma un ánodo y un segundo electrodo de la serie de electrodos forma un cátodo, para impulsar corriente a través del al menos un nanoporo.
5. El dispositivo de la reivindicación 4, en donde la capa está fijada a al menos uno de entre el primer sustrato y el segundo sustrato, y en donde el primer electrodo y el segundo electrodo flanquean la capa.
6. El dispositivo de la reivindicación 4, en donde al menos uno de entre el primer sustrato y el segundo sustrato es esencialmente transparente.
7. El dispositivo de la reivindicación 4, en donde los electrodos de la serie de electrodos están dispuestos en un patrón de cuadrícula.
8. El dispositivo de la reivindicación 4, en donde los electrodos de la serie de electrodos están interdigitados.
9. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde el módulo microfluídico digital comprende una capa de material de generación de ondas acústicas superficiales (SAW).
10. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende además al menos un reactivo dispuesto en el módulo microfluídico digital y configurado para ser portado por la nanogota.
11. El dispositivo de la reivindicación 10, en donde el reactivo es un miembro de unión, un marcador escindible o un miembro de unión que incluye un marcador escindible.
12. El dispositivo de la reivindicación 10, en donde el marcador escindible comprende un polímero aniónico, un polímero catiónico, un dendrímero o una nanopartícula cargada, y el miembro de unión comprende un receptor, una enzima o un anticuerpo.
13. Un método para detectar un analito presente en una muestra biológica, comprendiendo el método:
poner en contacto la muestra con un primer miembro de unión en un módulo microfluídico digital, en donde el módulo microfluídico digital está conectado de forma fluida a un módulo nanoporoso que tiene un nanoporo en una capa, y en donde el módulo microfluídico digital facilita el movimiento de una nanogota hacia el nanoporo, en donde el primer miembro de unión está inmovilizado sobre un soporte sólido en el módulo microfluídico digital y en donde el primer miembro de unión se une específicamente al analito;
poner en contacto el analito con un segundo miembro de unión, en donde el segundo miembro de unión se une específicamente al analito y en donde el segundo miembro de unión comprende un marcador escindible fijado al mismo;
retirar el segundo miembro de unión no unido al analito que está unido al primer miembro de unión; escindir el marcador escindible fijado al segundo miembro de unión unido al analito unido al primer miembro de unión;
trasladar el marcador escindible a través del nanoporo en la capa; y detectar el marcador escindible que se traslada a través del nanoporo.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el nanoporo está dispuesto en un dispositivo que comprende: el módulo microfluídico digital; y
el módulo nanoporoso.
15. El método de la reivindicación 14, en donde el nanoporo se forma in situ dentro del dispositivo.
16. El método de la reivindicación 13, en donde el marcador escindible se selecciona del grupo que consiste en un polímero aniónico, un polímero catiónico, un dendrímero y una nanopartícula cargada.
17. El método de la reivindicación 13, en donde el marcador escindible está cargado negativamente y el traslado comprende aplicar un potencial positivo por la capa, trasladando así el marcador escindible a través de la capa.
18. El método de la reivindicación 13, en donde el marcador escindible está cargado positivamente y el traslado comprende aplicar un potencial negativo por la capa, trasladando así el marcador escindible a través de la capa.
19. El método de la reivindicación 13, en donde cada marcador escindible que se traslada a través de la capa es un evento de traslado, y el método comprende además medir los eventos de traslado para medir la cantidad de analito presente en la muestra, en donde la cantidad de analito presente en la muestra se determina mediante:
el recuento de un número de eventos de traslado durante un período de tiempo establecido y la correlación del número de eventos de traslado con un control;
la medición de la cantidad de tiempo para que se produzca un número determinado de eventos de traslado y la correlación con un control; o
la determinación de un tiempo medio entre eventos de traslado y la correlación con un control, en donde el control es un patrón de referencia que comprende una curva de calibración, adición estándar o reacción en cadena de la polimerasa digital.
20. El método de la reivindicación 19, en donde la medición de los eventos de traslado comprende la observación de un cambio en la corriente inducida por una interacción del marcador escindible con el nanoporo.
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