ES2877612T3

ES2877612T3 - Derivados de porfirinas, su procedimiento de preparación y su uso para tratar infecciones virales

Info

Publication number: ES2877612T3
Application number: ES16790328T
Authority: ES
Inventors: Samir Amrane; Marie-Aline Andreola; Geneviève Pratviel; Jean-Louis Mergny
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Bordeaux
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Bordeaux
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2021-11-17
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: US20230107696A1; US20210253591A1; US20200223858A1; US10577375B2; EP3368023A1; US11046704B2; WO2017072319A1; EP3368023B1; US20180319811A1

Abstract

Compuesto de fórmula (I): **(Ver fórmula)** donde X representa un grupo seleccionado de: - un heteroarilo o heterociclo monocíclico o bicíclico de 5 a 10 miembros que comprende al menos un heteroátomo elegido de N, O o S opcionalmente sustituido por un grupo elegido de OH, O-alquilo (C1-C6), alquilo C1-C6, halógeno, CN, NO2, NRR'; - un grupo guanidina de fórmula **(Ver fórmula)** entendiéndose que X puede estar presente en forma de una sal de adición de ácido o base, R y R' idénticos o diferentes independientemente representan un átomo de hidrógeno o un grupo seleccionado de alquilo C1-C6, arilo C6-C10, cicloalquilo C3-C10, estando cada alquilo, cicloalquilo y arilo opcionalmente sustituido por uno o más de OH, O-alquilo (C1-C6), alquilo C1-C6, arilo C6-C10, halógeno, CN, NO2, ... representa un enlace simple opcionalmente presente; M representa un átomo de oro (Au); conjuntamente con un contraión adecuado, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección viral.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de porfirinas, su procedimiento de preparación y su uso para tratar infecciones virales

[0001] La presente invención se refiere a derivados de porfirinas, su preparación y su utilidad en agentes terapéuticos.

[0002] Más específicamente, esta solicitud se refiere al uso de derivados de porfirina como ligandos de G-quadruplex para inhibir infecciones virales, tales como VIH, más particularmente, para inhibir el ciclo de replicación de VIH-1.

[0003] Las secuencias de ARN o ADN ricas en guanina son capaces de plegarse y adoptar estructuras de cuatro cadenas llamadas G-quadruplexes, o "G4". Dichas estructuras inusuales de ácido nucleico se basan en apilar 2, 3 o 4 tétradas; cada una de las cuales está compuesta de cuatro guaninas conectadas por 8 puentes de hidrógeno. Dichas tétradas se estabilizan con la presencia de un catión central, K+ o Na+, presente de manera abundante en el medio celular, y que se coordinan con los oxígenos de los grupos carbonilo. Numerosos estudios termodinámicos han demostrado que dichas estructuras son muy estables. A menudo, tienen temperaturas de desnaturalización térmica por encima de 50°C y algunas son estables a 90°C. Una vez formadas, algunas G4, tal como la que se forma con la secuencia promotora de c-myc, tienen una vida media muy larga y pueden resistir la hibridación en presencia de un exceso elevado de su cadena complementaria (hasta 50 veces). Polimorfismo, dureza y plegamiento rápido son algunas de las características intrínsecas de las G4, que indican con firmeza un papel biológico.

Varios estudios bioinformáticos han determinado la distribución de motivos de quadruplex en el genoma humano: i) El genoma humano tiene 370.000 motivos de quadruplexes potenciales, ii) 40% de los genes codifican una proteína que tiene al menos un quadruplex localizado a 1 kb desde el sitio inicial de la transcripción, iii) sitios de unión a factores de transcripción importantes, tales como SP1, MAZ, Krox ZF5, se posicionan cerca o se solapan con los motivos G4, iv) 37% de los sitios de recombinación preferencial muestran un motivo G4. Estas correlaciones se conservan entre diferentes especies en la evolución de los genomas.

Recientemente varios estudios han confirmado la existencia de G4 en el ADN genómico y el ARN celular. Algunos estudios han usado sondas fluorescentes (anticuerpos o ligandos), que reconocen de manera específica G4 y no se unen a otras estructuras de ADN. Estas sondas permitieron la detección directa de estructuras G4 en cromosomas inmovilizados y confirmaron la presencia de quadruplexes en las regiones reguladoras de genes y regiones subteloméricas. La implicación de G4 en la replicación, transcripción, empalme de ARN o traducción, también, se ha estudiado ampliamente.

[0004] Los quadruplexes se han identificado como dianas terapéuticas, de la siguiente manera:

a) Inhibición de telomerasa

[0005] El reconocimiento de G-quadruplexes se inició para inhibir la telomerasa, una enzima reactivada en el 85% de cánceres, pero inactiva en la mayoría de células normales. Esta enzima reconoce la secuencia telomérica humana en su conformación de cadena única y mantiene la longitud de telómero en células tumorales, lo que las hace “inmortales”. La estrategia es estabilizar G4 teloméricas con productos químicos para prevenir la interacción de telomerasa con su sustrato. Ya se han descubierto ligandos de G4 con propiedades anticancerígenas, es el caso de Braco19, RHPS420 y 360A.

b) Inhibiciones de oncogenes

[0006] Muchos laboratorios se han interesado por el reconocimiento de quadruplex para inhibir la expresión de oncogenes. El oncogén c-myc es una importante diana de esta estrategia: tiene una secuencia G4 en su promotor y el nivel de expresión del gen depende de la formación de esta estructura. La formación de G4 reprime la transcripción y esta inhibición se potencia en presencia de ligandos G4. El mismo tipo de efecto represivo del ligando se observó para los oncogenes KRAS, c-kit y bcl2.

c) Reconocimiento de G4

[0007] Las características únicas de la topología de G4, muy diferente de un ADN o un ARN de cadena doble o de cadena única, la convierten en una diana terapéutica. Las G4 son estructuras compactas cuyo reconocimiento se pueden unir al de proteínas globulares. La gran diversidad estructural de G4 sugiere que se puede alcanzar un grado relativamente alto de selectividad. Los ejemplos de diseño racional de ligandos y cribado in silico son cada vez más numerosos en la literatura. Esta estrategia abre una nueva era prometedora de reconocimiento ofreciendo una alternativa a la estrategia habitual de reconocimiento de proteínas. Además, si las primeras solicitudes estaban relacionadas solamente con cáncer, las nuevas aplicaciones de esta investigación se consideran actualmente en virología.

[0008] En estudio reciente, Harris et al propusieron que las G4 pueden tener un papel biológico en el ciclo de vida de diferentes patógenos (Harris & Merrick, PLoS Pathog. 2015 11(2):e1004562. Los inventores escribieron, también, un artículo describiendo el papel de G4 en el ciclo de replicación de muchos virus (Métifiot et al Nucleic Acid Res. 2014 42, 12352-66). En el caso de coronavirus SARS, una proteína viral llamada “SARS de dominio único” (SUD) tiene dos sitios de unión a G4. Esta proteína viral parece esencial para la virulencia del virus, combatiría la respuesta inmune del huésped reconociendo los quadruplexes del último. En el caso de virus de Epstein-Barr, la proteína viral EBNA1 se une al ADN de G4 e interviene en el ciclo de replicación viral. Finalmente, VPH también presenta secuencias de G4 en su genoma.

[0009] El genoma de ARN de VIH-1 está cambiando muy rápidamente, lo que le da una variabilidad estructural importante, que le permite escapar de la respuesta inmune del organismo infectado. La fidelidad baja de la transcriptasa inversa y de los muchos casos de recombinación genética entre dos ARN virales son los conductores de esta tendencia. Estas recombinaciones se facilitan por la dimerización del ARN viral en la secuencia DIS (Sitio de Inicio de Dímero). Un estudio reciente ha sugerido que también se puede realizar esta recombinación empleando un quadruplex biomolecular utilizando las secuencias cPPT de cada uno de los ARN virales. En otro estudio, se encontró un sitio de recombinación preferencial en la región 5' del gen gag. Esta secuencia rica en guanina es capaz de formar un quadruplex biomolecular con la secuencia homóloga de la otra cadena. Este quadruplex facilita el intercambio de materiales entre el ARN donante y el ARN receptor. La proteína NCp7 se conoce por facilitar el empaquetamiento del ARN viral, la transcripción inversa y la integración del genoma, pero también es capaz de abrir estructuras de ARN intramolecular para promover las estructuras bimoleculares. La NCp7 también promueve la formación de una G4 bimolecular con un ARN receptor.

[0010] Los aptámeros son secuencias de ácido nucleico que pueden adoptar una estructura 3D y reconocen de manera específica una diana determinada. Estos ácidos nucleicos estructurados se descubren utilizando las estrategias “SELEX”. Es un procedimiento de selección in vitro a partir de bibliotecas combinatorias de oligonucleótidos sintéticos que contienen millones de secuencias diferentes. Es interesante indicar que a lo largo de los últimos quince años se seleccionaron muchos aptámeros que adoptan estructuras G4 mediante esta técnica para reconocer diferentes proteínas de VIH-1, tales como la integrasa, RT, gp120 y Rev. Algunos de estos aptámeros pueden impedir la entrada del virus en la célula interactuando con la proteína viral gp120. En lo relativo a la integrasa, el aptámero 93del se une potencialmente al bolsillo catalítico de la enzima. Esta g 4 inhibe fuertemente la infectividad de VIH-1 con una IC50 de 25 nM. Un estudio funcional de los efectos de este aptámero sobre la infectividad de VIH-1 en condiciones in vivo demostró que la fusión, la transcripción y la integración del provirus son inhibidas por 93del. Estos estudios demuestran que ciertas proteínas virales reconocen de manera muy específica y con afinidad alta las estructuras G4.

[0011] En una solicitud anterior (EP14305763.6), los inventores demostraron que, a pesar de su alta variabilidad genética, el genoma de VIH-1 presenta varias secuencias que forman G4muy conservadas. Estas secuencias de G4 se asocian con funciones reguladoras críticas del ciclo de replicación de VIH, tales como i) la iniciación de transcripción inversa formando el punto de inicio central de la síntesis de cadena (+) por la transcriptasa inversa; ii) la iniciación de transcripción inversa formado el primer punto de síntesis de cadena (+) por la transcriptasa inversa; iii) la regulación de la transcripción del provirus. El virus VIH se confrontó con ADN y ARN de G4 sintéticas derivados de su propio genoma. Los efectos inhibitorios observados sugieren que estas G4 “virales” sintéticas actúan como señuelos desviando proteínas virales o celulares de sus dianas naturales en el genoma viral.

[0012] Los documentos US 2011/0064694 y US 2004/0116385 dan a conocer derivados de porfirina y su actividad antiviral. Los derivados de porfirina se dan a conocer entre otros por Sabater et al., Dalton transactions (2015), 44(8), 3701-3707 y WO 200/27379. Perrone et al PLOSone 8, 8, e73121,2013 divulga los efectos antivirales de la unión de G-quadruplex en VIH.

[0013] De acuerdo con el primer objetivo, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I):

donde

X representa un grupo seleccionado de:

- un heteroarilo o heterociclo monocíclico o bicíclico de 5 a 10 miembros que comprende al menos un heteroátomo elegido de N, O o S opcionalmente sustituido por un grupo elegido de OH, O-alquilo (C1-C6), alquilo C1-C6, halógeno, CN, NO2, NRR';

- un grupo guanidina de fórmula

Se entiende que X puede estar presente en forma de una sal de adición de ácido o base,

R y R' idénticos o diferentes independientemente representan un átomo de hidrógeno o un grupo seleccionado de alquilo C1-C6, arilo C6-C10, cicloalquilo C3-C10, estando cada alquilo, cicloalquilo y arilo opcionalmente sustituido por uno o más de OH, O-alquilo (C1-C6), alquilo C1-C6, arilo C6-C10, halógeno, Cn , NO2,

... representa un enlace simple opcionalmente presente;

M representa un átomo de oro (Au);

conjuntamente con un contraión adecuado,

para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección viral.

[0014] Da a conocer compuestos de fórmula (I) como se define anteriormente, donde M representa un átomo de metal, tal como Ni, Co, Mn (ninguno de los cuales forma parte de la invención).

Según una realización, X representa un grupo guanidinio de fórmula

De acuerdo con una realización, X representa una piridina sustituida opcionalmente, tal como una piridina sustituida por un alquilo C1-C6, más particularmente un metilpiridinio.

[0015] Los compuestos Au-MA, Au-PG, tal como se representa en la Figura 5, son particularmente adecuados para el uso de la invención.

De acuerdo con una realización, la presente invención se trata también del uso de un compuesto de fórmula (I) según la invención para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una infección viral.

[0016] De acuerdo con una realización adicional, la presente invención trata también de un compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una infección viral que comprende la administración de un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la invención, tal como se define anteriormente, a un paciente que lo necesita.

[0017] Las infecciones virales incluyen todos los trastornos causados por el virus que comprende secuencias de G quadruplex en su genoma a nivel de ADN o ARN. Las infecciones virales incluyen, particularmente, VIH, virus de Epstein-Barr, VPH, coronavirus SARS, virus de Ébola y virus de Marburgo. De acuerdo con una realización, los compuestos de fórmula (I) son aquellos de fórmula (IA), tales como aquellos de fórmula (I') o aquellos de fórmula (I''). De acuerdo con un objetivo adicional, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (IA):

Donde

X=

A‘ representa un contraanión;

M representa un átomo de oro (Au).

[0018] La presente invención se refiere, particularmente, a los compuestos Au-MA, Au-PG, más particularmente Au-MA, Au-PG, tal como se representa en la Figura 5.

[0019] Da a conocer compuestos de fórmula (IA), tal como se define anteriormente, donde M representa un átomo de metal tal como Ni, Co, Mn (ninguno de los cuales forma parte de la invención).

De acuerdo con un objetivo específico, la presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I'):

Donde

X=

A‘ representa un contraanión;

Au representa un átomo de oro.

También se dan a conocer los compuestos de fórmula (I'') (pero no son parte de la invención):

Donde

X=

A- representa un contraanión;

M representa un átomo de Co, Ni o Mn.

[0020] De acuerdo con una realización, en las fórmula (I), (IA) o (I'), A- representa un ion de halógeno, tal como Cl-. De acuerdo con otro objetivo, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IA), tal como (I'), según la invención, como se define anteriormente, conjuntamente con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

A menos que se especifique lo contrario, los términos utilizados anteriormente o a continuación tienen el significado atribuido a ellos a continuación:

“Halo”, “hal” o “halógeno” hacen referencia a átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.

“Alquilo” representa un grupo de hidrocarburo alifático que puede ser lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono en la cadena. En una realización preferida particularmente, el grupo alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquilo de ejemplo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, isobutilo, n-butilo, terc-butilo, n-pentilo, 3-pentilo.

“Cicloalquilo” se refiere a un sistema de anillos de hidrocarburos monocíclicos o policíclicos no aromáticos de 3 a 10 átomos de carbono. Más preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 4 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente, de 4 a 8 átomos de carbono y, más preferiblemente, de 4 a 6 átomos de carbono. Cicloalquilo monocíclico de ejemplo incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares. Cicloalquilo multicíclico de ejemplo incluye 1-decalina, norbornilo, adamanto-(1- o 2-)ilo.

“Arilo” se refiere a un anillo monocíclico o bicíclico aromático que contiene de 6 a 10 átomos de carbono. Los grupos de arilo de ejemplo incluyen fenilo, naftilo, indenilo, fenantrilo, bifenilo. Más preferiblemente, el grupo arilo es fenilo. El término “heteroarilo” se refiere a un anillo mono-, bi- o multicíclico aromático con de 5 a 14 miembros, preferiblemente de 5 a 10, en el que al menos un miembro del anillo es un heteroátomo, tal como N, O, S. Los ejemplos incluyen pirrolilo, piridilo, pirazolilo, tienilo, pirimidinilo, pirazinilo, tetrazolilo, indolilo, quinolinilo, purinilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, benzotiazolilo, furanilo, benzofuranilo, 1,2,4-tiadiazolilo, isotiazolilo, triazoilo, tetrazolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, carbozolilo, benzimidazolilo, isoxazolilo.

Los términos “heterociclo”, “heterociclilo” o “heterocíclico” hacen referencia a anillos mono-, bi- o multicíclicos saturados o parcialmente insaturados no aromáticos estables de 3 a14, preferiblemente de 5 a10 miembros, donde al menos un miembro del anillo es un heteroátomo, tal como N, O, S. Típicamente, los heteroátomos incluyen, pero no se limitan a, átomos de oxígeno, nitrógeno, sulfuro, selenio y fósforo. Preferiblemente, los heteroátomos son oxígeno, nitrógeno y azufre. Los heterociclos adecuados también se dan a conocer en the Handbook of Chemistry and Physics, 76a Edición, CRC Press, Inc., 1995-1996, páginas 2-25 a 2-26, la divulgación de la cual se incorpora en el presente documento por referencia. El heterocíclico no aromático preferido incluye, pero no se limita a, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, dioxolanilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo, pirrolidinilo, piperidilo, morfolinilo, imidazolidinilo, piranilo. Los heterociclos saturados preferidos se escogen de tetrahidrofuranilo, dioxolanilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo, pirrolidinilo, piperidilo, morfolinilo, imidazolidinilo, más preferiblemente, tetrahidrofuranilo, dioxolanilo, tetrahidropiranilo.

[0021] "Metal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a Au, Ni, Mn, Co.

“Alquilo”, “cicloalquilo”, “arilo”, etc... también se refiere al divalente correspondiente de “alquileno”, “cicloalquileno”, “arileno”, etc., que se forman al eliminar dos átomos de hidrógeno.

[0022] Los compuestos de fórmula (I) o (IA), tal como (I') o (I"), se pueden proporcionar en forma de una base libre o en forma de sales de adición con ácidos, que también forman parte de la invención. Los compuestos de la presente invención pueden poseer un grupo ácido y un grupo básico que pueden formar sales correspondientes. Por lo tanto, la presente invención incluye sales de compuestos de fórmula (I) o (IA), tales como (I') o (I"). Las sales pueden ser, de manera preferente, sales farmacéuticamente aceptables. El grupo ácido puede formar sales con bases. La base puede ser una base orgánica de amina, por ejemplo, trimetilamina, terc-butilamina, trometamina, meglumina, epolamina, etc. El grupo ácido puede también formar sales con bases inorgánicas, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, etc. El grupo básico puede formar sales con ácidos inorgánicos, tales como ácido hidroclórico, ácido sulfúrico, ácido bromhídrico, ácido sulfámico, ácido fosfórico, ácido nítrico, etc. y ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido toluenosulfónico, ácido oxálico, ácido fumárico, ácido maleico, etc. Además, los compuestos de fórmula (I) o (IA), tales como (I') o (I"), pueden formar sales de amonio cuaternario y sales con aminoácidos, tales como arginina, lisina, etc. Se pueden encontrar las listas de sales adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, página 1418 y P.H. Stahl, C.G. Wermuth, Handbook of Pharmaceutical salts - Properties, Selection and Use, Wiley-VCH, 2002, las divulgaciones de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Estas sales se preparan de manera ventajosa con ácidos farmacéuticamente aceptables, pero las sales con otros ácidos útiles, por ejemplo, para la purificación o para el aislamiento de los compuestos de fórmula (I) o (IA), tales como (I') o (I"), también forman parte de la invención.

[0023] Los compuestos de fórmula (I) o (IA), tal como (I'), pueden comprender uno o más átomos de carbono asimétricos. Por lo tanto, pueden existir en forma de enantiómeros o diastereoisómeros. Estos enantiómeros y diastereoisómeros, así como sus mezclas, incluyendo mezclas racémicas, forman parte de la invención.

Se conoce bien en la técnica cómo preparar y aislar tales formas ópticamente activas. Por ejemplo, se pueden separar mezclas de estereoisómeros mediante técnicas estándar que incluyen, pero no se limitan a, resolución de formas racémicas, cromatografía normal, de fase inversa y quiral, formación de sal preferencial, recristalización y similares o mediante síntesis quiral a partir de materiales iniciales quirales o mediante síntesis deliberada de centros quirales diana.

[0024] Los compuestos de fórmula (I) o (IA), tal como (I'), se pueden proporcionar también en forma de un hidrato o de un solvato, es decir, en forma de asociaciones o combinaciones con una o más moléculas de agua o disolvente. Tales hidratos y solvatos también forman parte de la invención. De acuerdo con otro objetivo, la presente invención se refiere al proceso de preparación de un compuesto de fórmula (IA), tal como (I'), según la invención, tal como se define anteriormente.

[0025] Los compuestos y los procesos de la presente invención se pueden preparar de varias maneras bien conocidas por los expertos en la materia. Los compuestos se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante aplicación o adaptación de los procedimientos descritos a continuación o variaciones sobre los mismos, tal como se entiende por el experto en la materia. Las modificaciones y las sustituciones apropiadas resultarán fácilmente obvias y bien conocidas o fácilmente obtenibles de la literatura científica por los expertos en la materia. En particular, se pueden encontrar tales procedimientos en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers, 1989.

Los reactivos y los materiales de partida pueden estar disponibles comercialmente o se sintetizan fácilmente utilizando técnicas bien conocidas por un experto en la materia. Todos los sustituyentes, a menos que se indique lo contrario, son como se definen previamente.

[0026] En las reacciones descritas de aquí en adelante, puede ser necesario proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo, grupos hidroxi, amino, imino, tio o carboxilo, donde estos son deseados para el producto final, para evitar su participación no deseada en las reacciones. Los grupos protectores convencionales llamados Pg en el presente documento se pueden usar de acuerdo con la practica estándar, por ejemplo, véanse, T.W. Greene y P. G. M. Wuts en Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley y Sons, 1991; J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973.

[0027] Se pueden realizar algunas reacciones en presencia de una base. No existe ninguna restricción particular sobre la naturaleza de la base que se usa en esta reacción, y cualquier base utilizada de manera convencional en reacciones de este tipo se puede utilizar igualmente en el presente documento, siempre y cuando no tenga ningún efecto adverso sobre otras partes de la molécula. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen: hidróxido de sodio, carbonato de potasio, trietilamina, hidruros de metal alcalino, tales como, hidruro de sodio e hidruro de potasio; compuestos de alquil litio, tales como, metil litio y butil litio; y alcóxidos de metal alcalino, tales como metóxido de sodio y etóxido de sodio.

Normalmente, las reacciones se llevan a cabo en un disolvente adecuado. Se puede utilizar una variedad de disolventes, siempre y cuando no tenga ningún efecto adverso sobre la reacción o sobre los reactivos involucrados. Los ejemplos de disolventes adecuados incluyen: hidrocarburos, que pueden ser hidrocarburos aromáticos, alifáticos o cicloalifáticos, tales como, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno y xileno; amidas, tales como dimetilformamida; alcoholes, tales como etanol y metanol y éteres, tales como, dietil éter y tetrahidrofurano.

Las reacciones pueden tener lugar en un rango amplio de temperaturas. En general, se descubrió que era conveniente llevar a cabo la reacción a una temperatura de 0°C a 150°C (más preferiblemente desde aproximadamente temperatura ambiente hasta 100°C). El tiempo necesario para la reacción también puede variar considerablemente, dependiendo de muchos factores, de forma destacada de la temperatura de reacción y de la naturaleza de los reactivos. Sin embargo, puesto que la reacción es efectiva bajo condiciones preferidas descritas anteriormente, un periodo de 3 horas a 20 horas será normalmente suficiente.

El compuesto así preparado se puede recuperar de la mezcla de reacción utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, los compuestos se pueden recuperar destilando el disolvente de la mezcla de reacción o, si es necesario, después de destilar el disolvente de la mezcla de reacción, vertiendo el residuo en agua seguido de extracción con un disolvente orgánico inmiscible en agua y destilando el disolvente del extracto. Adicionalmente, el producto se puede, si se desea, purificar adicionalmente utilizando varias técnicas bien conocidas, tales como, recristalización, reprecipitación o varias técnicas de cromatografía, especialmente, cromatografía en columna o cromatografía de capa fina preparativa.

[0028] En particular, los compuestos de la presente invención se pueden preparar utilizando los procesos descritos a continuación.

[0029] De acuerdo con una realización, el proceso de la invención puede comprender la etapa de reacción de un compuesto de fórmula (II)

Donde X se define como en fórmula (I) (IA), tal como (I') anteriormente,

Donde B- representa un contraanión, tal como, trifluoroacetato

[0030] Con un complejo que contiene oro, tal como un complejo de fórmula (III)

KAumA4 (III)

Donde A- es un contraanión, tal como se define en fórmula (IA).

Generalmente, esta etapa se puede llevar a cabo en un disolvente adecuado, tal como un disolvente prótico y polar, tal como agua o ácido acético. Típicamente, se puede realizar esta reacción a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción.

[0031] El proceso de la invención puede comprender, además, la etapa adicional de aislamiento, purificación y/o formulación del compuesto de fórmula (IA), tal como, (I'), seguida de acoplamiento de los compuestos (II) y (III).

[0032] Generalmente, los compuestos de fórmula (III) están disponibles comercialmente o se pueden preparar mediante aplicación o adaptación de procedimientos conocidos.

Los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar según Sabater et al., Dalton transactions (2015), 44(8), 3701-3707.

[0033] Más específicamente, los compuestos de fórmula (II) se pueden obtener utilizando cualquiera de las vías siguientes:

i) Donde X representa un grupo guanidino: los compuestos de fórmula (II) se pueden preparar haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IV)

Donde Pg representa un grupo protector del grupo amino, tal como Boc con el ácido de fórmula (V):

H-B (V)

Donde B se define como en fórmula (II).

Generalmente, se puede llevar a cabo la reacción en un disolvente aprótico, tal como diclorometano.

[0034] Los compuestos de fórmula (IV) se pueden obtener a partir del compuesto de fórmula (VI):

Con un compuesto de fórmula (VII):

Donde Pg se define como anteriormente.

Se puede llevar a cabo esta reacción en un disolvente adecuado, tal como cloroformo.

[0035] La porfirina de fórmula (VI) está disponible comercialmente o se puede preparar mediante aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, tales como los descritos en Bettelheim et al Inorg. Chem. 1987, 26, 1009 1017.

ii) Donde X representa un metilpiridinio, el compuesto de fórmula (II) se puede preparar haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (VIII)

Con un compuesto de fórmula (IX):

Hal-CHa (IX)

Donde Hal represente típicamente I.

Generalmente, esta reacción va seguida de la adición del ácido H-B (V).

La reacción de acoplamiento se puede llevar a cabo en un disolvente adecuado, tal como DMF o acetona o su mezcla y, típicamente, se puede realizar a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción.

[0036] El compuesto de fórmula (VIII) se puede obtener haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (X):

Con un compuesto de fórmula (XI):

en un disolvente, tal como ácido propiónico, a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción.

[0037] Tal como se usa en el presente documento, el término “paciente” se refiere a un animal de sangre caliente, tal como, un mamífero, preferiblemente un humano o un niño humano, que está afectado o tiene potencial de estar afectado por una o más enfermedades y afecciones descritas en el presente documento.

[0038] Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invención que es efectiva en la reducción, eliminación, tratamiento o control de los síntomas de las enfermedades y afecciones descritas en el presente documento. El término “control” sirve para referirse a todos los procesos donde pueda existir una ralentización, interrupción, detención o suspensión de la progresión de las enfermedades y las afecciones descritas en el presente documento, pero no necesariamente indica una eliminación total de todos los síntomas de las enfermedades y afecciones y pretende incluir tratamiento profiláctico y uso crónico.

[0039] Como se usa en el presente documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” hace referencia a aquellos compuestos, materiales, composiciones o formas de dosificación que están dentro del alcance del juicio médico sensato, adecuados para el contacto con los tejidos de ser humano y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problemáticas proporcionales con una relación de beneficio/riesgo razonable.

[0040] La dosis de fármaco para la administración depende de variables, tales como el tipo y el alcance de progresión de la enfermedad o el trastorno, el estado de salud general del paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado y formulación del compuesto, excipientes y su ruta de administración.

[0041] Los compuestos de la presente invención se pueden formular en una preparación farmacéuticamente aceptable, mezclando con un portador, excipiente o un diluente, en particular, para el uso oral o parenteral. Las preparaciones orales pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas o para vía parenteral. Un portador sólido puede incluir una o más sustancias que pueden actuar también como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, rellenos, deslizantes, ayudantes de compresión, aglutinantes o agentes disgregantes de comprimidos, también puede ser un material de encapsulación. Los portadores líquidos pueden incluir agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites y grasas farmacéuticamente aceptables. Las composiciones se pueden administrar de manera conveniente en formas de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica farmacéutica, por ejemplo, tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición; Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000. Se pueden incluir agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes compatibles farmacéuticamente como parte de la composición.

[0042] Los comprimidos, pastillas, polvos, cápsulas, píldoras y similares pueden contener uno o más de cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina o goma tragacanto; un diluyente, tal como almidón o lactosa; un disgregante, tal como almidón y derivados de celulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta o salicilato de metilo. Los comprimidos preferidos contienen lactosa, almidón de maíz, silicato de magnesio, croscarmelosa sódica, povidona, estearato de magnesio o talco, en cualquier combinación. Las cápsulas pueden estar en forma de una cápsula dura o una cápsula blanda, que generalmente se fabrican a partir de mezclas de gelatina mezcladas opcionalmente con plastificantes, así como también una cápsula de almidón. Adicionalmente, las formas de unidad de dosificación contienen otros materiales diferentes que modifican la forma física de unidades de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca o agentes entéricos. Otras formas de dosificación oral, tales como jarabe o elixir, pueden contener agentes edulcorantes, conservantes, colorantes, pigmentos y aromatizantes. Adicionalmente, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de disolución rápida, liberación modificada o liberación sostenida y donde tales formulaciones de liberación sostenida son preferiblemente bimodales.

[0043] Las preparaciones líquidas para administración incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Las composiciones líquidas pueden incluir también aglutinantes, tampones, conservantes, agentes quelantes, edulcorantes, agentes aromatizantes y colorantes y similares. Los disolventes no acuosos incluyen alcoholes, propilenglicol, polietilenglicol, copolímeros de acrilato, aceites vegetales, tal como, aceite de oliva y ésteres orgánicos, tales como, oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen mezclas de alcoholes y agua, hidrogeles, medios tamponados y solución salina. Particularmente, el polímero biocompatible, biodegradable de lactida, el copolímero de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de los compuestos activos. Los vehículos intravenosos pueden incluir regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer y similares. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para estos compuestos activos incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas.

[0044] Otras características de la invención o la divulgación serán evidentes en el transcurso de la siguiente descripción de realizaciones o aspectos de ejemplo que se proporcionan para la ilustración de la invención o la divulgación y no pretenden limitarla.

Descripción de las Figuras:

[0045] Las Figuras 1 a 4 muestran el efecto de los ligandos G4 sobre la replicación de VIH-1.

Figura 1: El efecto de ligandos G4 sobre la estabilidad de G4: Los experimentos de fusión FRET se llevaron a cabo en presencia de 0,5 |iM de ligando G4 y utilizando 0,2 |iM de secuencia de VIH-PRO marcada con fluoróforos. Figura 2: Los efectos de ligandos G4 en comparación con AZT sobre la ineficacia de VIH-1 utilizando el sistema celular HeLa P4 para estudiar la replicación de VIH-1. Las células HeLa P4 contienen un gen lacZ que codifica beta galactosidasa bajo el control de la LTR viral y cuya transcripción se activa mediante la proteína viral Tat. Las células se incuban con el ligando, entonces se infectan con VIH-1. Después de 24 horas, la actividad de beta-galactosidasa, que es proporcional con la ineficacia del virus, se mide a continuación con un lector de placas fluorescente.

Figura 3: La correlación entre la afinidad aparente de los ligandos para la G4 (expresados en estabilización de G4 en ATm °C) y su actividad de inhibición sobre VIH.

Figura 4: La medición de la proliferación celular de células HeLa en función del tiempo en presencia de concentraciones crecientes de ligando Au-MA G4.

La Figura 5 representa la estructura de los compuestos de la invención que se ensayan y se muestran en la Figura 3. X=H2 se refiere al caso donde no hay metal en el centro (M está ausente).

La Figura 6 muestra la estructura de compuestos de técnica anterior comparativos que se ensayan y se muestran en la Figura 3. X=H2 se refiere al caso donde no hay metal en el centro (M está ausente).

[0046] Los siguientes ejemplos describen la síntesis de algunos compuestos según la invención. Estos ejemplos no pretenden ser limitativos y solamente ilustran la presente invención. Son solamente una parte de la invención mientras estén cubiertos por las reivindicaciones.

Ejemplos

1. Síntesis de compuestos de fórmula (I) o (IA)

1.1. [Preparación de pentacloruro de meso-tetrakis(4-(W-metil-piridinio-2-il)fenil) porfirinato oro (III)] (Au-MA)

[0047]

[0048] La síntesis de porfirina no metálica se describió previamente en Sabater et al. Dalton Trans. 2015, 44, 3701.

Etapa 1: Síntesis de 5,10,15,20-tetrakis(4-(pirid-2-il)fenil)porfirina (1)

[0049]

[0050] Se disolvió 4-(Pirid-2-il)benzaldehido (2,8 g, 15,3 mmol) en ácido propiónico (72 ml), se añadió pirrol (1 g, 15,6 mmol) y la mezcla se puso a reflujo durante 1 h en la oscuridad. El disolvente se evaporó y el residuo se secó al vacío. El producto bruto se llevó a dimetilformamida (50 ml) y se filtró. El producto se lavó con dimetilformamida (50 ml) y dietiléter (2x50 ml) y se secó al vacío. Producción: 0,78 g (0,84 mmol, 22 %) sólido púrpura. 1H RMN (250 MHz, CDCh) 8 = 8,99 (s, 8H, pirrol), 8,90 (d, J = 5 Hz, 4H, piridina), 8,44 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 8,38 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 8,10 (d, J = 8 Hz, 4H, piridina), 7,95 (ddd, J = 8, 8, 1 Hz, 4H, piridina), 7,40 (dd, J = 8, 5 Hz, 4H, piridina), -2,66 (s, 2H, NH). CCF R f« 0,20 (SiO2, CH3CN/H2O/KNO3 sat. 8/1/1).

Etapa 2: Síntesis de tetrakis(trifluoroacetato) de 5,10,15,20-tetrak¡s(4-(W-metM-p¡r¡dmio-2¡l)feml)porf¡rma (2)

[0051]

[0052] Se disolvió 5,10,15,20-Tetrakis(4-(pirid-2-il)fenil)porfirin (1) (200 mg, 0,22 mmol) en dimetilformamida (20 ml) y se añadió yodometano en exceso (4 ml). La mezcla se calentó a 155°C durante 3 horas y se añadió acetona (100 ml). Se filtró el precipitado púrpura resultante, se lavó con acetona, cloroformo y dietiléter. El producto se purificó en columna C18 de fase inversa (20 g), elución con agua con TFA al 0,1%, a continuación con agua/acetonitrilo, 80/20, v/v con TFA al 0,1%. Producción: 210 mg (0,14 mmol, 66%) sólido púrpura. 1H RMN (300 MHz, d®-DMSO) 8 = 9,33 (d, J = 6 Hz, 4H, piridina), 9,04 (s, 8H, pirrol), 8,84 (dd, J = 8, 8 Hz, 4H, piridina), 8,55 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 8,48 (dd, J = 8,1 Hz, 4H, piridina), 8,33 (ddd, J = 8, 6, 1 Hz, 4H, piridina), 8,19 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 4,53 (s, 12H, CH3-N), -2,83 (s, 2H, NH). UV-Vis (H2O), X max nm (sM-1 cm-1) 416 (410x103), 516 (15x103), 552 (7x103), 580 (5x103), 634 (3x103). HRES+-MS m/z: calculado para [C68H54Ns]4+ = 245,6112, encontrado: 245,6106. CCF Rf « 0,15-0,20 (SO 2, CH3CN/H2O/KNO3 sat. 8/1/1).

Etapa 3: pentacloruro de 5,10, 15,20-tetrak¡s(4-(W-met¡l-p¡r¡d¡mo-2-¡l)feml) porfmnato oro (NI) (Au-MA)

[0053] Se disolvió tetrakis(trifluoroacetato) de tetrakis(4-(A/-metil-piridinio-2-il)fenil)porfirina (2) (30,5 mg, 0,021 mmol) en agua (10 ml). Se añadió 0,1 ml de NaOH 1 M. Se disolvió KAumCl4 (11,4 mg, 0,030 mmol, 1,4 mol. eq.) en agua (1 ml) y se añadió a la solución de porfirina. La mezcla se puso a reflujo durante 24 horas. La reacción se monitorizó utilizando espectroscopía de UV-visible y se detuvo cuando se completó el desplazamiento de banda de Soret (de 438 a 406 nm, en agua, pH ácido). El medio de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente. Se realizó el desalado de la porfirina utilizando cromatografía de fase inversa en un cartucho C18 Sep-Pak (5g, Waters) mediante elución con agua (200 ml), seguido de metanol (20 ml). Se evaporaron las fracciones recogidas hasta secarlas y el producto se llevó a metanol/agua, 50:50, v/v (20 ml). Se llevó a cabo el intercambio sniónico sobre una columna de resina DOWEX 1x8-200 (forma de cloruro, 1 g). La solución de producto se evaporó a sequedad. El producto se disolvió en metanol y se precipitó con la adición de dietiléter. Después de centrifugación, el sedimento se secó. Producción: 25,3 mg (0,0185 mmol, 88%) sólido rojo. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 8 = 9,61 (s, 8H, pirrol), 9,26 (d, J = 6 Hz, 4H, piridina), 8,86 (dd, J = 8, 8 Hz, 4H, piridina), 8,66 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 8,51 (d, J = 8 Hz,4H, piridina), 8,32-8,27 (m, 12H, piridina y fenilo), 4,66 (s, 12 H, CH3-N). UV-Vis (H2O), X max nm (sM'1 cm'1 ) 406 (400x103), 520 (21x103). ES+-MS m/z = 235,49 [M-5 Cl]5+, 303,10 [M-4Cl]4+, 415,80 [M-3Cl]3+. CCF R f« 0,24 (SiO2,CH3CN/H2O/KNO3 sat. 6/1/1).

1.1. [Preparación de pentacloruro de 5,10,15,20-tetrakis(4-fenilguanidinio)porfirinato oro (III)] (Au-PG)

[0054]

[0055] La síntesis de porfirina no metálica se describió previamente en Sabater et al. J. Biol. Inorg. Chem. 2015, 20, 729.

Etapa 1: Síntesis de 5,10,15,20-tetrakis(4-(W,W’-d¡tercbutoxicarbomlfemlcarboxam¡dma)porf¡rma (3)

[0056]

[0057] Se disolvieron porfirina 5,10,15,20-(tetra-4-aminofenil)porfirina (502 mg, 0,74 mmol) y N,N-bis(terc-butiloxicarbonil)pirazol-1-carboxamidina (1,2 g, 3,8 mmol) en 15 ml de cloroformo anhidro y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, bajo argón, durante 5-7 días mientras se monitorizaba utilizando CCF (SiO2, dietiléter). Después de eliminar el disolvente bajo presión reducida, el producto se purificó utilizando cromatografía de gel de sílice. La columna se eluyó con 250 ml de hexano/diclorometano, 7/3, v/v con trietilamina al 1%, seguido de 500 ml de hexano/diclorometano, 6/4, v/v con trietilamina al 1% y 500 ml de hexano/diclorometano, 50/50 v/v, de trietilamina al 1%. La fracción de interés se secó bajo presión reducida. El residuo sólido se lavó con dietiléter para asegurar la eliminación de derivado de pirazol contaminante. El compuesto puro 3 se obtuvo como un sólido púrpura (790 mg, 65%): Rf = 0,7 (SO 2, hexano/etilacetato, 7/3); 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 8 = 11,83 (s, 4H, N-H), 10,80 (s, 4H, N-H), 8,95 (s, 8H, pirrol), 8,22 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 8,09 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 1,65 (s, 36H, CH3), 1,61 (s, 36H, CH3), -2.75 (s, 2H, N-H porfirina); 13C RMN (75 MHz, CDCl3): 8 = 163,67, 153,69, 153,50, 138,50, 136,75, 135,06,131,23, 120,18, 119,60, 83,93, 79,88, 28,26, 28,18 ppm; HRMS-ES+ m/z [M+H]+ calculado para C88H107N16O16: 1643,8051 (95%), 1644,8081 (100%), encontrado: 1643,8074 (95 %), 1644,8086 (100%). CCF R f« 0,7 (SO 2, hexano/Et2O 1/1).

Etapa 2: Síntesis de tetratrifluoroacetato de 5,10,15,20-tetrakis(4-fenilguanidinio)porfirina (4)

[0058]

[0059] Se disolvió porfirina meso-5,10,15,20-tetrakis(4-(W,W-diterc-butoxicarbonilfenilcarboxamidina)porfirina (3) (800 mg, 0,49 mmol) en 80 ml de diclotometano y reaccionó con 20 mL de ácido trifluoroacético bajo agitación durante 3-4 horas y la mezcla de reacción se evaporó bajo presión reducida. El producto se purificó mediante disolución en metanol, seguido de precipitación con dietil éter. El procedimiento de precipitación se repitió 4 veces. El precipitado se filtró sobre un vidrio fritado, lavado con dietil éter para proporcionar 4 como un sólido púrpura microcristalino (592 mg, 93%); 1H RMN (250 MHz, d®-DMSO): 8 = 10,33 (s, 4H, N-H), 9,01 (s, 8H, pirrol), 8,28 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 7,87 (brs, 16H,N-H2), 7,72 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), -2,90 (s, 2H, N-H porfirina); HRMS-ES+ m/z [M-4(CF3CO2)-3H]+calculado para C48H43N16: 843,3857, encontrado: 843,3873.

Etapa 3: pentacloruro de 5,10,15,20-tetrakis(4-fenilguanidinio)porfirinato oro (III) (Au-PG)

[0060] Se disolvió la porfirina tetratrifluoroacetato de meso-5,10,15,20-tetrakis(4-fenilguanidinio)porfirina (4) (50,2 mg, 0,039 mmol) en 10 ml de ácido acético. Se disolvió KAuCU (53,0 mg, 0,014 mmol) en 2 ml de agua y se añadió a la solución de porfirina. La mezcla se calentó a 110°C durante 24 horas. La reacción se monitorizó mediante espectroscopia de UV-visible y se detuvo cuando se completó el desplazamiento de banda de Soret (la banda de Soret del derivado metalizado de 408 nm en agua ácida). Después de evaporación hasta sequedad, el producto se llevó a agua/metanol, 80/20, v/v y el medio se centrifugó. Se cargó el sobrenadante en un cartucho de fase inversa C18 Sep-Pak (5g, Waters). La elución con agua (200 ml) se siguió con metanol (20 ml) y, a continuación, metanol que contenía 0,5% de ácido trifluoroacético. Se evaporaron las fracciones recogidas hasta sequedad y el producto se llevó a metanol/agua, 50/ 50, v/v (20 ml). Se llevó a cabo el intercambio aniónico sobre una columna de resina DOWEX 1x8-200 (forma de cloruro, 1 g). La solución de producto se evaporó hasta sequedad. El producto se disolvió en metanol (5 ml) y se precipitó con la adición de dietil éter (20 ml). Después de centrifugación, el sedimento se lavó con dietil éter y se secó. Producción: 28,6 mg (0,023 mmol, 60%) sólido rojo. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): 8 = 9,54 (s, 8H, pirrol), 8,41 (d, J = 8 Hz, 8H, fenilo), 7,87 (d, J = 8 Hz 8H, fenilo). UV/vis (H2O): Xmax nm (sM'1 cm'1 ) 408 (285x103). ES+-MS m/z= 346,9 [M-2H-5Cl]3+, 260,2 [M-H-5Cl]4+.

2. Actividad biológica

2.1. Procedimientos

A. Preparación de los oligonucleótidos:

[0061] Se adquirieron oligonucleótidos fluorescentes en Eurogentec (Seraing, Bélgica) con "Reverse-Phase Cartridge Gold purification”. Las concentraciones se determinaron mediante absorción ultravioleta (UV) utilizando los coeficientes de extinción proporcionados por el fabricante. Todos los oligonucleótidos se disolvieron en 20 mM de tampón de fosfato de potasio con pH 7 que contenía 70 mM de KCl.

B. Experimentos de fusión con FRET:

[0062] La secuencia de VIH-PRO (5'TGGCCTGGGCGGGACTGGG3') (SEQ ID N°1) se marcó con fluoresceína en el extremo 5' y TAMRA en el extremo 3'. La transferencia de energía fluorescente entre fluoresceína y tetrametilrodamina es solamente posible cuando los dos fluorocromos están cerca en el estado plegado a baja temperatura. En el estado no plegado a alta temperatura, la FRET se reduce. Los perfiles de fusión con fluorescencia se registraron utilizando un dispositivo de PCR cuantitativo de Stratagene (De Cian A, et al. Fluorescence-based melting assays for studying quadruplex ligands. Methods. Junio de 2007; 42(2):183-95.).

[0063] C. Líneas celulares y virus: Las células HeLa P4 que codifican p-galactosidasa inducible por Tat se mantuvieron en un medio DMEM (Invitrogen) suplementados con 10 % de FCS desactivado, 1 mg/ml de geneticina (G418, Gibco-BRL), gentamicina. Las células MT4 y H9Laí crecieron en un medio de glutamax RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con FCS desactivado al 10%. Los virus VIH-1 se obtuvieron después de 48 horas de cocultivo de células MT4 (0,5 x106 /ml) y células H9Laí (1 x 106 /ml), infectadas crónicamente por el aislado VIH-1Laí, en un medio de glutamax RPMI 1640 suplementado con FCS desactivado al 10%, a 37°C en atmósfera humidificada y 5% de CO2. A continuación, el cultivo se centrifugó y el sobrenadante se aclaró por filtración sobre una membrana de 0,45 pm antes de congelación a -80°C.

[0064] D. Prueba de infectividad viral: Los ligandos G4 se incubaron en presencia de las células HelaP420 minutos antes de infección. La infectividad se analizó en células HelaP4 que expresan el receptor CD4 y el gen de pgalactosidasa bajo el control de la LTR de VIH-1. Las HeLa P4 se pusieron en placas usando 200 pl de medio DMEM suplementado con FCS desactivado al 10% en múltiples placas de 96 pocillos con 10.000 células por pocillo. Después de incubación durante la noche a 37°C en atmósfera humidificada y 5% de CO2, el sobrenadante se descartó y se añadieron 200 pl de preparación viral en disoluciones en serie. Después de 24 horas de infección, el sobrenadante de descartó y los pocillos se lavaron 3 veces con 200 pl de PBS. Cada pocillo se volvió a rellenar con 200 pl de un tampón de reacción que contenía 50 mM de Tris-HCI pH 8,5, 100 mM de p-mercaptoetanol, 0,05 % de Triton X-100 y 5 mM de 4-metilumbelliferil-B-D-galactopiranósido (4-MUG) (Sigma). Después de 24 horas, la reacción se midió en un lector de microplacas fluorescente (Cytofluor II, Applied Biosystems) a 360/460 nm Ex/Em.

[0065] E. Estudio de citotoxicidad de los ligandos G4: HeLa, la línea celular de carcinoma epitelial humano, y Wi38, la línea celular de fibroblasto normal humano, se utilizaron como modelo experimental para evaluar la proliferación celular en presencia de ligandos G4. Las células se sembraron en placas de 384 pocillos. Todas las medidas se llevaron a cabo por duplicado en un experimento. La proliferación celular se midió como la superficie del pocillo ocupado por las células. A continuación, se calculó un índice de proliferación haciendo un promedio de la superficie ocupada en un punto de tiempo anterior al tratamiento. El recuento de células también se evalúa en el último punto de tiempo de la cinética. Las células lisadas de citólisis se tiñeron con un marcador nuclear capaz de entrar solamente en las células con membranas comprometidas. Se informó del número de células lisadas por pocillo a lo largo de la cinética. Para el último punto de tiempo de la cinética, también de calcula un porcentaje de citólisis también después de obtener la citólisis máxima para cada pocillo mediante permebialización de las células.

2.2 Resultados: Los ligandos G4 específicos inhiben la replicación de VIH-1

2.2.1 Los ligandos G-quadruplex

[0066] Como parte de las estrategias anticáncer descritas anteriormente, se ha desarrollado una gran variedad de ligandos quadruplex. Estas moléculas son muy buenas sondas estructurales específicas de G4. Se unen muy poco a ADN de doble cadena o de cadena única, pero reconocen muy bien todos los tipos de G4 con constantes de disociación del orden de decenas hasta cientos de nanomolares. La capacidad de algunos ligandos (por ejemplo, XM14 y Br-360A) para unirse a secuencia de VIH-PRO3 se evaluó utilizando una prueba de estabilización mediante FRET (Figura 1). Se utilizaron 3 diferentes familias de ligandos G4: Salfenos, Bisquinolinios y porfirinas. Esta técnica permite seleccionar moléculas que se unen a VIHPRO marcado con fluoróforos. En esta prueba, los experimentos de desnaturalización térmica se realizaron seguidos de fluorescencia y medición de la emisión de fluorescencia de fluoresceína. La unión del ligando al oligonucleótido fluorescente estabiliza la estructura y esto da como resultado un aumento de la temperatura de la mitad de la disociación del último (Figura 1). Cuanto más aumenta la Tf, más alta es la afinidad del ligando por la diana. Por lo tanto, en el ejemplo mostrado, el ligando 360A estabiliza además la G4 en comparación con el compuesto XM14; su afinidad por G4 es más alta. Estos experimentos se llevaron a cabo en presencia de un competidor de doble cadena compuesto de 26 pares de bases (no se muestran los datos). Por lo tanto, se puede evaluar la selectividad de unión del ligando con G4 en competición con la doble cadena. Si la estabilización se mantiene en presencia de 50 equivalentes molares de equivalentes de doble cadena competidoa no

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula (I):

( I )

donde

X representa un grupo seleccionado de:

- un grupo guanidina de fórmula

... representa un enlace simple opcionalmente presente;

M representa un átomo de oro (Au);

conjuntamente con un contraión adecuado,

para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección viral.

2. Compuesto para su uso, según la reivindicación 1, en el que la infección viral se selecciona del grupo que consiste en VIH, virus de Epstein-Barr, VPH, coronavirus SARS, virus de Ébola y virus de Marburgo.

3. Compuesto para su uso, según la reivindicación 1 o 2, en el que la infección viral es VIH.

4. Compuesto para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto de fórmula (I) es de fórmula (IA):

donde

X=

A- representa un contraanión;

M representa un átomo de oro (Au).

5. Compuestos para su uso, según la reivindicación 4, en los que A- representa un ion de halógeno.

6. Compuesto para su uso, según la reivindicación 4 o 5, en el que A- es Cl-.

7. Compuesto de fórmula (IA):

donde

X=

A- representa un contraanión;

M representa un átomo de oro (Au).

8. Compuesto de fórmula (IA), según la reivindicación 7, en el que A- representa un ion de halógeno.

9. Compuestos, según la reivindicación 7 u 8, en los que A- es Cl-.

10. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IA), según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, conjuntamente con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Procedimiento de preparación de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de fórmula (II):

donde X se define como en la fórmula (I) o (IA) anteriormente,

donde B- representa un contraanión, tal como trifluoroacetato

con un complejo que contiene oro, tal como un complejo de fórmula (III):

KAumA4 (III)

donde A se define como en la fórmula (IA).