ES2880038T3 - Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Jurg M Sommer
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Abstract

Un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido quimérico y un segundo polipéptido, en donde el polipéptido quimérico comprende un factor VIII (FVIII) y un primer Fc, en donde el FVIII está fusionado directamente con el primer Fc, y en donde el segundo polipéptido comprende un segundo Fc, para su uso en el tratamiento profiláctico de hemofilia A en un sujeto humano, en donde el polipéptido híbrido se va a administrar en una dosis de 25 UI/kg a 65 UI/kg en un intervalo de administración de 3 a 8 días entre dos dosis.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, al campo de los terapéuticos para trastornos hemostáticos.
Técnica anterior
La hemofilia A es un trastorno ligado al cromosoma X causado por mutaciones y/o deleciones en el gen del factor VIII (FVIII) que da como resultado una deficiencia de actividad de FVIII (Peyvandi et al. 2006). La enfermedad se caracteriza por hemorragia espontánea y un sangrado excesivo después del traumatismo. Con el tiempo, el sangrado repetido en músculos y articulaciones, que empieza frecuentemente en la segunda infancia, produce artropatía hemofílica y daño articular irreversible. Este daño es progresivo y puede conducir a una movilidad fuertemente limitada de las articulaciones, atrofia muscular y dolor crónico (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003).
El dominio A2 es necesario para la actividad procoagulante de la molécula del factor VIII. Los estudios muestran que el factor VIII porcino tiene actividad procoagulante seis veces mayor que la del factor VIII humano (Lollar, P., y E. T. Parker, J. Biol. Chem. 266:12481-12486 (1991)), y parece que la diferencia en la actividad coagulante entre el factor VIII humano y porcino se basa en una diferencia en la secuencia de aminoácidos entre uno o más restos en los dominios A2 humanos y porcinos (Lollar, P., et al., J. Biol. Chem. 267:23652-23657 (1992)).
El tratamiento de la hemofilia A es por terapia sustitutiva dirigida a la restauración de la actividad de FVIII hasta del 1 al 5 % de los niveles normales para prevenir el sangrado espontáneo (Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med.
344:1773-1779 (2001)). Están disponibles productos de FVIII derivado de plasma y recombinante para el tratamiento de episodios hemorrágicos a voluntad o para evitar que los episodios hemorrágicos ocurran tratando profilácticamente. Basándose en la semivida de estos productos, las pautas de tratamiento requieren una administración intravenosa frecuente. Dicha administración frecuente es dolorosa e inapropiada.
La mortalidad reducida, la prevención del daño articular y la calidad de vida han sido logros importantes debido al desarrollo de FVIII derivado de plasma y recombinante. Una protección prolongada del sangrado representaría otro avance clave en el tratamiento de los pacientes con hemofilia A. Sin embargo, hasta la fecha, no se han desarrollado productos que permitan una protección prolongada. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de métodos mejorados de tratamiento de la hemofilia debida a deficiencia del factor VIII que sean más tolerables y más eficaces que las terapias actuales. El documento de patente US 2005/0260194 A1 se refiere a proteínas híbridas monómerodímero quiméricas de inmunoglobulina.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación proporciona métodos de administración de factor VIII; métodos de administración de polipéptidos quiméricos que comprenden el factor VIII e híbridos de dichos polipéptidos quiméricos; polipéptidos quiméricos que comprenden el factor VIII e híbridos de dichos polipéptidos quiméricos; polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos quiméricos e híbridos; células que comprenden dichos polinucleótidos; y métodos de producción de dichos polipéptidos quiméricos e híbridos usando dichas células.
La presente divulgación proporciona un método de administración de factor VIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico de factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico de factor VIII-Fc, en un intervalo de administración de al menos aproximadamente una con cinco veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fc.
El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente de uno y medio a seis veces más largo, uno y medio a cinco veces más largo, uno y medio a cuatro veces más largo, uno y medio a tres veces más largo, o uno y medio a dos veces más largo, que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, la porción Fc. El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente uno y medio, dos, dos y medio, tres, tres y medio, cuatro, cuatro y medio, cinco, cinco y medio o seis veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, la porción Fc. El intervalo de administración puede ser de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más largo.
El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4 o 5 días o más largo.
La presente divulgación también proporciona un método de administración de factor VIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico del factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico de factor VIII-Fc, para obtener un área bajo la curva de concentración plasmática frente al tiempo (ABC) de al menos aproximadamente uno y un cuarto veces superior al ABC obtenida por una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fc.
La presente divulgación también proporciona un método de administración de factor VIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido que comprende un factor VIII y un Fc en un intervalo de administración de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más largo.
Los métodos de la divulgación se pueden poner en práctica en un sujeto en necesidad de tratamiento profiláctico o tratamiento a voluntad.
El tratamiento a voluntad incluye el tratamiento para un episodio hemorrágico, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo de cabeza (traumatismo craneoencefálico), sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intrabdominal, hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal o sangrado en la cubierta del ilipsoas. El sujeto puede estar en necesidad de profilaxis quirúrgica, tratamiento perioperatorio o tratamiento para cirugía. Dichas cirugías incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, extracción dental, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, artroplastia total de la rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía para traumatismo, cirugía intracraneal, cirugía intrabdominal, cirugía intratorácica o cirugía para reemplazo articular.
Para el tratamiento a voluntad, el intervalo de administración de dicho polipéptido quimérico es aproximadamente una vez cada 24-36, 24-48, 24-72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 o 72 horas, o más largo.
Las dosis terapéuticas que se pueden usar en los métodos de la divulgación son aproximadamente 10 a aproximadamente 100 UI/kg, más específicamente, aproximadamente 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70­ 80, 80-90 o 90-100 UI/kg, y más específicamente, aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 UI/kg.
Las dosis terapéuticas que se pueden usar en los métodos de la divulgación son aproximadamente 10 a aproximadamente 150 UI/kg, más específicamente, aproximadamente 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140­ 150 UI/kg, y más específicamente, aproximadamente 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 UI/kg.
El sujeto en los métodos de la divulgación puede ser un sujeto humano o puede ser un mamífero no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, ratones, perros, primates, monos, gatos, caballos, vacas, cerdos y otros animales domésticos y animales pequeños. La determinación del intervalo de administración y el ABC se pueden llevar a cabo en un único sujeto o en una población de sujetos.
El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser un factor VIII humano, o un factor VIII no humano, tal como factor VIII porcino, de ratón o canino. El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede tener una deleción completa o parcial del dominio B.
El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos el 90 % o el 95 % idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 1 a 740 de SEQ ID NO:8; aminoácidos 1 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos 1 a 684 de SEQ ID NO: 12). El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 1 a 740 de SEQ iD NO:8; aminoácidos 1 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos 1 a 684 de SEQ ID NO:12).
El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos el 90 % o el 95 % idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos -19 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos -19 a 740 de SEQ ID NO:8; aminoácidos -19 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos -20 a 684 de SEQ ID NO:12). El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos -19 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos -19 a 740 de SEQ ID NO:8; aminoácidos -19 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos -20 a 684 de SEQ ID NO:12).
La porción Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede ser al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Fc mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 2333 a 2559 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 741 a 967 de SEQ ID NO:8; aminoácidos 746 a 972 de SEQ ID NO:10; aminoácidos 685 a 924 de SEQ ID NO: 12). La porción Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de Fc mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 2333 a 2559 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 741 a 967 de SEQ ID NO:8; aminoácidos 746 a 972 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 685 a 924 de SEQ ID NO: 12).
El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de SEQ ID NO:2) o al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de SEQ ID NO:2). El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de SEQ ID NO:2) o idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de SEQ ID NO:2).
El polipéptido quimérico puede estar en forma de un híbrido que comprende un segundo polipéptido en asociación con dicho polipéptido quimérico, en donde dicho segundo polipéptido comprende o consiste esencialmente en un Fc.
El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO:4) o al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de SEQ ID NO:4). El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente de una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO:4) o idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de SEQ ID NO:4).
El polipéptido quimérico o híbrido se puede administrar como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente.
La divulgación también proporciona los polipéptidos quiméricos e híbridos anteriormente descritos en sí, polinucleótidos que los codifican, una célula embrionaria humana cultivada que comprende los polinucleótidos y métodos de producción de dichos polipéptidos quiméricos e híbridos, y los polipéptidos producidos por dichos métodos. La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS
FIG. 1. Representación esquemática del monómero de rFVIIIFc.
FIG. 2. WBCT de rFVIIIFc en comparación con ReFacto® en ratones con hemofilia A después de una dosis intravenosa de 50 UI/kg (n = 6 ratones por grupo).
FIG. 3. Actividad cromogénica en plasma de ratones con hemofilia A después de una dosis IV única de 50 UI/kg de rFVIIIFc, ReFacto® y Advate®.
FIG. 4. WBCT de rFVIIIFc y ReFacto® en perros con hemofilia A (A) rFVIIIFc. (B) ReFacto® seguido por rFVIIIFc en un estudio con grupos cruzados.
FIG. 5. Farmacocinética de rFVIIIIFc y ReFacto® intravenosos en perros con hemofilia A (medida por ELISA).
FIG. 6. Actividad de rFVIII y ReFacto® después de una dosis intravenosa única en perros con hemofilia A (medida por el ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII).
FIG. 7. Concentración plasmática media por grupo con el tiempo de rFVIIIFc y Xyntha después de una dosis intravenosa única (125 UI/kg) en macacos cangrejeros (n = 6, media ± DE). Las concentraciones plasmáticas se midieron por ELISA.
FIG. 8. Curvas individuales de concentración plasmática frente al tiempo de rFVIIIFc y Xyntha después de una dosis intravenosa única (125 UI/kg) en macacos cangrejeros (n = 6, media ± DE). Las concentraciones plasmáticas se midieron por ELISA. (A) rFVIIIFc por ELISA. (B) Xyntha por ELISA.
FIG. 9. Actividad cromogénica plasmática media por grupo después de una dosis intravenosa única (125 UI/kg) de rFVIIIFc y Xyntha en macacos cangrejeros (n = 6, media ± DE). La actividad de FVIII se midió usando un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII.
FIG. 10. Curvas de actividad cromogénica plasmática individual frente al tiempo después de una dosis intravenosa única (125 UI/kg) de rFVIIIFc y Xyntha en macacos cangrejeros (n = 6, media ± DE). La actividad de FVIII se midió usando un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII. (A) Actividad cromogénica de rFVIIIFc. (B) Actividad cromogénica de Xyntha.
FIG. 11. Caracterización bioquímica de rFVIII-Fc: Activación del factor X en función de la concentración de factor X.
FIG. 12. Caracterización bioquímica de rFVIII-Fc: Activación del factor X en función de la concentración de factor IXa.
FIG 13. Actividad de FVIII media observada por grupo (±EE) (ensayo de una etapa, 25 Ul/kg (A) o 65 Ul/kg (B); y ensayo cromogénico, 25 UI/kg (C) o 65 UI/kg (D)) frente al tiempo.
FIG. 14. Actividad de FVIII media observada por grupo (±EE) (ensayo de una etapa (A) o ensayo cromogénico (B)) frente al tiempo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación proporciona un método de tratamiento de la hemofilia A con factor VIII usando un intervalo de administración más largo y/o mayor ABC que es posible con los productos de factor VIII actualmente conocidos. La presente divulgación también proporciona polipéptidos quiméricos de factor VIII mejorados, polinucleótidos quiméricos de factor VIII y métodos de producción.
El tratamiento de la hemofilia A es por terapia sustitutiva dirigida a la restauración de la actividad de FVIII hasta del 1 al 5 % de los niveles normales para prevenir el sangrado espontáneo (Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-9 (2001)). Están disponibles productos de FVIII derivado de plasma y recombinante para el tratamiento de episodios hemorrágicos a voluntad o para evitar que los episodios hemorrágicos ocurran tratando profilácticamente. Basándose en la semivida de estos productos (10-12 h) (White G.C., et al., Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (supl 1):94-99; discusión 100 (2003)), las pautas de tratamiento requieren una administración intravenosa frecuente, comúnmente de dos a tres veces a la semana para la profilaxis y de una a tres veces al día para el tratamiento a voluntad (Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007)). Dicha administración frecuente es dolorosa e inapropiada.
La presente divulgación proporciona un método de administración de factor VIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico del factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico de factor VIII-Fc, o un híbrido de dicho polipéptido, en un intervalo de administración al menos aproximadamente una vez y media más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fc.
El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente de uno y medio a seis veces más largo, uno y medio a cinco veces más largo, uno y medio a cuatro veces más largo, uno y medio a tres veces más largo, o uno y medio a dos veces más largo, que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fc. El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente uno y medio, dos, dos y medio, tres, tres y medio, cuatro, cuatro y medio, cinco, cinco y medio o seis veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fc. El intervalo de administración puede ser aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más largo.
El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4 o 5 días o más largo.
La presente divulgación también proporciona un método de administración de factor VIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico del factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico de factor VIII-Fc, o un híbrido de dicho polipéptido, para obtener un área bajo la curva de concentración plasmática frente al tiempo (ABC) al menos aproximadamente uno y un cuarto veces superior al ABC obtenida por una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin porción distinta de factor VIII (un polipéptido que consiste en dicha porción de factor VIII), por ejemplo, sin la porción Fc.
La presente divulgación también proporciona un método de administración de factor VIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido que comprende un factor VIII y un Fc o un híbrido de dicho polipéptido en un intervalo de administración de aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más largo.
Los métodos de la divulgación se pueden poner en práctica en un sujeto en necesidad de tratamiento profiláctico o tratamiento a voluntad.
"Administrar", como se usa en el presente documento, significa dar un polipéptido de factor VIII farmacéuticamente aceptable de la divulgación a un sujeto por una vía farmacéuticamente aceptable. Las vías de administración preferidas son intravenosas, por ejemplo, inyección intravenosa e infusión intravenosa. Las vías de administración adicionales incluyen, por ejemplo, administración subcutánea, intramuscular, oral, nasal y pulmonar. Los polipéptidos quiméricos y las proteínas híbridas se pueden administrar como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente.
"Área bajo la curva de la concentración plasmática frente al tiempo (ABC)", como se usa en el presente documento, es el mismo que el término de la técnica en la farmacología, y se basa en la velocidad y el grado de absorción del factor VIII tras la administración. El ABC se determina en un periodo de tiempo especificado, tal como 12, 18, 24, 36, 48 o 72 horas, o para el infinito, usando una extrapolación basada en la pendiente de la curva. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, el ABC se determina para el infinito. La determinación del ABC se puede hacer en un único sujeto, o en una población de sujetos para la que se calcula el promedio.
"Dominio B" del factor VIII, como se usa en el presente documento, es el mismo que el dominio B conocido en la técnica que se define por identidad interna de la secuencia de aminoácidos y sitios de escisión proteolítica por trombina, por ejemplo, los restos Ser741-Arg1648 del factor VIII humano de longitud completa. Los otros dominios del factor VIII humano se definen por los siguientes restos de aminoácidos: A1, restos Ala1-Arg372; A2, restos Ser373-Arg740; A3, restos Ser1690-Ile2032; C1, restos Arg2033-Asn2172; C2, restos Ser2173-Tyr2332. La secuencia de A3-C1-C2 incluye los restos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, los restos Glu1649-Arg1689, se denomina normalmente el péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII. También se conocen en la técnica las localizaciones de los límites para todos los dominios, que incluyen los dominios B, para factor VIII porcino, de ratón y canino. Preferentemente, el dominio B del factor VIII está delecionado ("factor VIII de dominio B delecionado'' o "FVIII BDD"). Un ejemplo de un FVIII BDD es REFACTO (FVIII BDD recombinante), que tiene la misma secuencia que la porción de factor VIII de la secuencia en la Tabla 2A(i) (aminoácidos -19 a 1438 o 1 a 1438 de SEQ ID NO:2).
Un "factor VIII de dominio B delecionado" puede tener las deleciones completas o parciales desveladas en las patentes de EE. UU. N.26.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 y 6.458.563. En algunas realizaciones, una secuencia de factor VIII de dominio B delecionado de la presente invención comprende una cualquiera de las deleciones desveladas en la col. 4, línea 4 a col. 5, línea 28 y los Ejemplos 1-5 de la patente de EE. UU. N.° 6.316.226 (también en US 6.346.513). En algunas realizaciones, un factor VIII de dominio B delecionado de la presente invención tiene una deleción desvelada en la col. 2, líneas 26-51 y los Ejemplos 5-8 de la patente de EE. u U. N.° 5.789.203 (también US 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620). En algunas realizaciones, un factor VIII de dominio B delecionado tiene una deleción descrita en col. 1, líneas 25 a col. 2, línea 40 de la patente de EE. UU. N.° 5.972.885; col. 6, líneas 1 -22 y Ejemplo 1 de la patente de Ee . UU. N.° 6.048.720; col. 2, líneas 17-46 de la patente de EE. UU. N.° 5.543.502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de la patente de EE. UU. N.° 5.171.844; col. 2, líneas 55-68, Figura 2 y Ejemplo 1 de la patente de EE. UU. N.° 5.112.950; col. 2, línea 2 a col. 19, línea 21 y Tabla 2 de la patente de EE. UU. N.° 4.868.112; col. 2, línea 1 a col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col. 4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26, y col. 11, línea 5 a col. 13, línea 39 de la patente de EE. UU. N.° 7.041.635; o col. 4, líneas 25-53, de la patente de EE. UU. N.° 6.458.563. En algunas realizaciones, un factor VIII de dominio B delecionado tiene una deleción de casi todo el dominio B, pero todavía contiene secuencias del extremo amino del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primaria en dos cadenas de polipéptidos, como se desvela en el documento de patente WO 91/09122. En algunas realizaciones, un factor VIII de dominio B delecionado se construye con una deleción de aminoácidos 747-1638, es decir, prácticamente una deleción completa del dominio B. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Un factor VIII de dominio B delecionado también puede contener una deleción de los aminoácidos 771-1666 o los aminoácidos 868-1562 de factor VIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Deleciones adicionales del dominio B que son parte de la invención incluyen, por ejemplo: deleción de los aminoácidos 982 a 1562 o 760 a 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 a 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 a 1646 (Kaufman (solicitud PCT publicada N.2 WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 a 1648 (Pasek (solicitud PCT N.288/00831)), 816 a 1598 o 741 a 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). Cada una de las deleciones anteriores se puede hacer en cualquier secuencia de factor VIII.
"Polipéptido quimérico", como se usa en el presente documento, significa un polipéptido que incluye dentro de él al menos dos polipéptidos (o subsecuencias o péptidos) de fuentes diferentes. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más polipéptidos de fuentes diferentes, tales como genes diferentes, ADNc diferentes o especies de animales diferentes u otras especies. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, uno o más conectores que unen las subsecuencias diferentes. Así, las subsecuencias se pueden unir directamente o se pueden unir indirectamente, por conectores, o ambos, dentro de un único polipéptido quimérico. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, péptidos adicionales, tales como secuencias señal y secuencias tales como 6His y FLAG que ayudan en la purificación o la detección de proteínas. Además, los polipéptidos quiméricos pueden tener adiciones de aminoácidos o de péptidos a los extremos N y/o C.
El polipéptido quimérico desvelado en el presente documento puede comprender una porción de factor VIII y una porción distinta de factor VIII. Porciones distintas de factor VIII a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Fc, XTEN y albúmina. Los polipéptidos quiméricos a modo de ejemplo desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, polipéptidos quiméricos de factor VIII-Fc, polipéptidos quiméricos de factor VIII-XTEN y polipéptidos quiméricos de factor VIII-albúmina.
Los polipéptidos quiméricos de factor VIII-Fc a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, SEQ ID NO:2, 6, 8, 10 y 12 (Tabla 2), con o sin sus secuencias señal, y el polipéptido quimérico de Fc de SEQ ID NO:4 (Tabla 2).
El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de SEQ ID NO:2) o al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de SEQ ID NO:2). El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1665 de SEQ ID NO:2) o idéntica a la secuencia de aminoácidos del factor VIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1665 de SEQ ID NO:2).
Como se trata anteriormente, los polipéptidos quiméricos a modo de ejemplo incluyen factor VIII fusionado con uno o más polipéptidos XTEN. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009). El factor VIII se puede fusionar o con el extremo N del polipéptido XTEN o con el extremo C del polipéptido XTEN, siempre que el componente de factor VIII de la proteína de fusión de factor VIII-XTEN pueda ser procesado por una proteasa para dar un polipéptido procesado que contiene el factor VIII. Se puede incluir un sitio de proteasa entre la porción XTEN y la porción de factor VIII para permitir dicho procesamiento. Los polipéptidos XTEN incluyen, por ejemplo, los desvelados en los documentos de patente WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682 y US 2009/0092582.
Como se trata anteriormente, los polipéptidos quiméricos a modo de ejemplo también incluyen factor VIII fusionado con uno o más polipéptidos de albúmina. Preferentemente, la albúmina es albúmina humana. El factor VIII se puede fusionar o con el extremo N de la albúmina o con el extremo C de la albúmina, siempre que el componente de factor VIII de la proteína de fusión de factor VIII-albúmina pueda ser procesado por una proproteína convertasa enzimáticamente activa para dar un polipéptido procesado que contiene el factor VIII. Se conocen ejemplos de albúmina, por ejemplo, fragmentos de la misma, que se pueden usar en la presente divulgación. Por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7.592.010; la patente de EE. u U. N.° 6.686.179; y Schulte, Thrombosis Res. 124 Supl. 2:S6-S8 (2009).
En algunas realizaciones, un polipéptido quimérico que comprende una porción de factor VIII tiene una semivida (t1/2) elevada con respecto a un polipéptido que consiste en la misma porción de factor VIII sin la porción distinta de factor VIII. Un polipéptido quimérico de factor VIII con una t1/2 elevada se puede denominar en el presente documento un factor VIII de acción prolongada. Los polipéptidos quiméricos de factor VIII de acción prolongada incluyen, por ejemplo, factor VIII fusionado con Fc (que incluye, por ejemplo, los polipéptidos quiméricos de factor VIII en forma de un híbrido, tal como un híbrido de monómero-dímero de FVIIIFc; véase Ejemplo 1, Fig. 1 y Tabla 2A; y las patentes de EE. UU. N.° 7.404.956 y 7.348.004), factor VIII fusionado con XTEN y factor VIII fusionado con albúmina.
"Cultivo", "cultivar" y "que cultiva", como se usan en el presente documento, significa incubar células en condiciones in vitro que permitan el crecimiento o la división celular o el mantenimiento de las células en un estado vivo. "Células cultivadas", como se usa en el presente documento, significa células que son propagadas in vitro.
"Factor VIII", como se usa en el presente documento, significa el polipéptido funcional de factor VIII en su función normal en la coagulación, a menos que se especifique lo contrario. Así, el término factor VIII incluye polipéptidos de variante que son funcionales. Las proteínas de factor VIII preferidas son las proteínas de factor VIII humano, porcino, canino y murino. Como se describe en la sección Técnica anterior, se conocen las secuencias de polipéptidos y de polinucleótidos de longitud completa, ya que son muchos fragmentos funcionales, mutantes y versiones modificadas. Los ejemplos de secuencias de factor VIII humano se muestran como subsecuencias en SEQ ID NO:2, 6, 8, 10 y 12 (Tabla 2). Los polipéptidos de factor VIII incluyen, por ejemplo, factor VIII de longitud completa, factor VIII de longitud completa menos Met en el extremo N, factor VIII maduro (menos la secuencia señal), factor VIII maduro con una Met adicional en el extremo N y/o factor VIII con una deleción completa o parcial del dominio B. Las variantes de factor VIII preferidas incluyen deleciones de dominio B, tanto deleciones parciales como completas.
Se conocen muchas variantes funcionales del factor VIII, como se trata anteriormente y a continuación. Además, se han identificado cientos de mutaciones no funcionales en el factor VIII en pacientes con hemofilia, y se ha determinado que el efecto de estas mutaciones sobre la función del factor VIII es más debida a dónde se encuentran dentro de la estructura tridimensional del factor VIII que a la naturaleza de la sustitución (Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)). Además, las comparaciones entre el factor VIII de seres humanos y otras especies han identificado restos conservados que es probable que sean requeridos para la función (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); documento de patente US 6.251.632).
Se aisló el gen de factor VIII humano y se expresó en células de mamífero (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); documentos de patente w O 87/04187; W o 88/08035; WO 88/03558; la patente de EE. UU. N.° 4.757.006), y la secuencia de aminoácidos se dedujo de ADNc. Capon et al., patente de EE. UU. N.° 4.965.199 desvelan un método de ADN recombinante para producir factor VIII en células hospedadoras de mamífero y la purificación de factor VIII humano. Se ha informado de la expresión del factor VIII humano en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñón de cría de hámster). Se ha modificado el factor VIII humano para delecionar parte o todo el dominio B (patentes de EE. UU. N.° 4.994.371 y 4.868.112), y se ha realizado la sustitución del dominio B del factor VIII humano con el dominio B del factor V humano (patente de EE. UU. N.° 5.004.803). La secuencia de ADNc que codifica el factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en SEQ ID NOs:1 y 2, respectivamente, de la publicación de solicitud de EE. UU. N.° 2005/0100990.
La patente de EE. UU. N.° 5.859.204, Lollar, J. S., informa de mutantes funcionales del factor VIII que tienen antigenicidad reducida e inmunorreactividad reducida. La patente de EE. UU. N.° 6.376.463, Lollar, J. S., también informa de mutantes del factor VIII que tienen inmunorreactividad reducida. La publicación de solicitud de EE. UU. N.° 2005/0100990, Saenko et al., informa de mutaciones funcionales en el dominio A2 del factor VIII.
Se desvelan varias moléculas funcionales del factor VIII, que incluyen deleciones del dominio B, en las siguientes patentes US 6.316.226 y US 6.346.513, ambas cedidas a Baxter; u S 7.041.635 concedida a In2 gen; US 5.789.203, US 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620 cedidas a Chiron; US 5.972.885 y US 6.048.720 cedidas a Biovitrum, US 5.543.502 y Us 5.610.278 cedidas a Novo Nordisk; US 5.171.844 cedida a Immuno Ag; US 5.112.950 cedida a Transgene S.A.; US 4.868.112 cedida a Genetics Institute.
La secuencia del factor VIII porcino está publicada (Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)), y se ha informado de la secuencia de ADNc porcino completo de la amplificación por PCR de las secuencias del factor VIII de una biblioteca de ADNc de bazo de cerdo (Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996)). El factor VIII híbrido humano/porcino que tiene sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades, y secuencias de aminoácidos específicas, se desveló en la patente de EE. UU. N.° 5.364.771 por Lollar y Runge, y en el documento de patente WO 93/20093. Más recientemente, las secuencias de nucleótido y de aminoácidos correspondientes de los dominios A1 y A2 del factor VIII porcino y un factor VIII quimérico con dominios A1 y/o A2 porcinos sustituidos por los dominios humanos correspondientes se informaron en el documento de patente WO 94/11503. La patente de EE. UU. N.° 5.859.204, Lollar, J. S., también desvela las secuencias de ADNc porcino y de aminoácidos deducidas. El documento de patente 6.458.563 cedido a Emory desvela un factor VIII porcino de dominio B delecionado.
El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos el 90 % o el 95 % idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 1 a 740 de SEQ ID NO:8; aminoácidos 1 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos 1 a 684 de SEQ ID NO: 12). El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 1 a 740 de SEQ iD NO:8; aminoácidos 1 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos 1 a 684 de SEQ ID NO:12).
El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos el 90 % o el 95 % idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos -19 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos -19 a 740 de SEQ ID NO:8; aminoácidos -19 a 745 de SEQ Id NO:10; o aminoácidos -20 a 684 de SEQ ID NO:12). El factor VIII (o porción de factor VIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos del factor VIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos -19 a 1438 de SEQ ID NO:2; aminoácidos -19 a 2332 de SEQ ID NO:6; aminoácidos -19 a 740 de SEQ ID NO:8; aminoácidos -19 a 745 de SEQ ID NO:10; o aminoácidos -20 a 684 de SEQ ID NO:12).
"Cantidad equivalente", como se usa en el presente documento, significa la misma cantidad de actividad de factor VIII como se expresa en unidades internacionales, que es independiente del peso molecular del polipéptido en cuestión. Una unidad internacional (UI) de la actividad de factor VIII corresponde aproximadamente a la cantidad de factor VIII en un mililitro de plasma humano normal. Están disponibles varios ensayos para medir la actividad del factor VIII, que incluyen el ensayo en sustrato cromogénico de la Farmacopea Europea y un ensayo de coagulación de una etapa.
"Fc", como se usa en el presente documento, significa componentes de unión al receptor de Fc neonatal (FcRn) funcional, a menos que se especifique lo contrario. Un componente de unión a FcRn es cualquier molécula que puede ser unida específicamente por el receptor FcRn con el consiguiente transporte activo por el receptor FcRn del componente de unión a FcRn. Así, el término Fc incluye cualquier variante de Fc de IgG que sea funcional. La región de la porción Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). La principal área de contacto de Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn están todos dentro de una única cadena pesada de Ig. Los componentes de unión al FcRn incluyen, por ejemplo, IgG completa, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa de FcRn. Los principales sitios de contacto incluyen los restos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los restos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias hechas a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas, o regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. (El receptor FcRn ha sido aislado de varias especies de mamífero que incluyen seres humanos. Se conocen las secuencias de FcRn humano, FcRn de rata y FcRn de ratón (Story et al. 1994, J. Exp. Med.
180: 2377). Un Fc puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina con o sin la región bisagra de la inmunoglobulina. Las variantes de Fc a modo de ejemplo se proporcionan en los documentos de patente WO 2004/101740 y WO 2006/074199.
Fc (o una porción Fc de un polipéptido quimérico) puede contener una o más mutaciones, y combinaciones de mutaciones.
Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede contener mutaciones que confieren una elevada semivida, tal como M252Y, S254T, T256E, y combinaciones de las mismas, como se desvela en Oganesyan et al., Mol. Immunol.
46:1750 (2009); H433K, N434F, y combinaciones de las mismas, como se desvela en Vaccaro et al., Nat. Biotechnol.
23:1283 (2005); los mutantes desvelados en las páginas 1-2, párrafo [0012] y los Ejemplos 9 y 10 del documento de patente US 2009/0264627 A1; y los mutantes desvelados en la página 2, párrafos [0014] a [0021] del documento de patente US 20090163699 A1.
Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) también puede incluir, por ejemplo, las siguientes mutaciones: la región Fc de IgG se puede modificar según procedimientos bien reconocidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para dar IgG modificada o fragmentos de Fc o porciones de los mismos que se unirán por FcRn. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones remotas de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso potencian la unión al FcRn. Por ejemplo, los siguientes restos de aminoácidos individuales en Fc de IgG1 humana (Fcy1) se pueden sustituir sin pérdida significativa de afinidad de unión al Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, y K447A, donde, por ejemplo, P238A representa prolina natural sustituida por alanina en la posición número 238. Además de la alanina, otros aminoácidos se pueden sustituir por los aminoácidos naturales en las posiciones especificadas anteriormente. Las mutaciones se pueden introducir individualmente en Fc dando lugar a más de cien componentes de unión a FcRn distintos de Fc nativo. Además, se pueden introducir juntas combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales, que dan lugar a cientos de componentes de unión a FcRn. Ciertas de estas mutaciones pueden conferir una nueva funcionalidad al componente de unión a FcRn. Por ejemplo, una realización incorpora N297A, retirando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad, mejorando así la semivida en circulación de los componente de unión a FcRn, y hacer que el componente de unión a FcRn sea incapaz de unirse a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Además, parece que al menos tres receptores de Fc gamma humano reconocen un sitio de unión sobre IgG dentro de la región bisagra inferior, en general, los aminoácidos 234-237. Por lo tanto, otro ejemplo de nueva funcionalidad y posible inmunogenicidad reducida puede surgir de mutaciones de esta región, como por ejemplo reemplazando los aminoácidos 233-236 de IgG 1 humana "ELLG" con la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con deleción de un aminoácido). Se ha mostrado que FcyRI, FcyRII y FcyRIII que median en diversas funciones efectoras no se unirán a IgG1 cuando dichas mutaciones se hayan introducido (Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77; y Armour et al, 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Como ejemplo adicional de nueva funcionalidad que surge de las mutaciones descritas anteriormente, la afinidad por FcRn se puede aumentar por encima de la natural en algunos casos. Este aumento de la afinidad puede reflejar un aumento de la constante de "asociación", una disminución de la constante de "disociación", o ambos, un aumento de la constante de "asociación" y una disminución de la constante de "disociación". Se cree que las mutaciones que confieren un aumento de la afinidad por FcRn incluyen, por ejemplo, T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede ser al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Fc mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 2333 a 2559 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 741 a 967 de SEQ ID NO:8; aminoácidos 746 a 972 de SEQ ID NO:10; aminoácidos 685 a 924 de SEQ ID NO:12). El Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a la secuencia de aminoácidos de Fc mostrada en la Tabla 2 (aminoácidos 1439 a 1665 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 2333 a 2559 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 741 a 967 de SEQ ID NO:8; aminoácidos 746 a 972 de SEQ ID NO:10; aminoácidos 685 a 924 de SEQ ID NO: 12).
Polipéptidos y proteínas "híbridos", como se usa en el presente documento, significa una combinación de un polipéptido quimérico con un segundo polipéptido. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido se pueden asociar a entre sí por interacciones proteína-proteína, tales como interacciones carga-carga o hidrófobas. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido se pueden asociar entre sí por enlace(s) disulfuro u otro(s) enlace(s) covalente(s). Los híbridos se describen en los documentos de patente WO 2004/101740 y WO 2006/074199. Véanse también las patentes de EE. UU. N.° 7.404.956 y 7.348.004. El segundo polipéptido puede ser una segunda copia del mismo polipéptido quimérico o puede ser un polipéptido quimérico no idéntico. Véase, por ejemplo, la Figura 1, el Ejemplo 1 y la Tabla 2. En realizaciones preferidas, el segundo polipéptido es un polipéptido que comprende un Fc. En realizaciones preferidas, el polipéptido quimérico es un polipéptido quimérico de factor VIII-Fc y el segundo polipéptido consiste esencialmente en Fc, por ejemplo, el polipéptido híbrido del Ejemplo 1, que es una proteína de fusión recombinante rFVIIIFc que consiste en una única molécula de FVIII humano recombinante de dominio B delecionado (rFVIII-BDD) fusionado con el dominio Fc dimérico de la IgG 1 humana, sin secuencia conectora intermedia. Este polipéptido híbrido se denomina en el presente documento proteína de fusión de FVIIIFc-Fc monomérico, híbrido de monómero de FVIIIFc, híbrido de FVIIIIFc monomérico y monómero-dímero de FVIIIFc. Véase el Ejemplo 1, la Fig. 1 y la Tabla 2A. Los ejemplos proporcionan datos preclínicos y clínicos para este polipéptido híbrido.
El segundo polipéptido en un híbrido puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO:4) o al menos el 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de SEQ ID NO:4). El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO:4) o idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) con una secuencia señal (aminoácidos -20 a 227 de SEQ ID NO:4).
La Figura 1 es un esquema que muestra la estructura de un polipéptido quimérico de factor VIII de dominio B delecionado-Fc, y su asociación con un segundo polipéptido que es un polipéptido Fc. Para obtener este híbrido, la secuencia codificante de FVIII humano recombinante de dominio B delecionado se obtuvo por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) de ARN de poli(A) de hígado humano (Clontech) usando cebadores específicos de FVIII. La secuencia de FVIII incluye la secuencia señal nativa para FVIII. La deleción del dominio B era de serina 743 (S743; 2287 pb) a glutamina 1638 (Q1638; 4969 pb) para una deleción total de 2682 pb. Entonces, la secuencia codificante para Fc recombinante humano se obtuvo por RT-PCR de una biblioteca de ADNc de leucocitos humanos (Clontech) usando cebadores específicos de Fc. Los cebadores se diseñaron de forma que la secuencia de FVIII de dominio B se fusionara directamente con el extremo N de la secuencia Fc sin conector intermedio. La secuencia de ADN de FVIIIFc se clonó en el vector de expresión dual de mamífero pBUDCE4.1 (Invitrogen) bajo el control del promotor del CMV. Se obtuvo por RT-PCR una segunda secuencia de Fc idéntica que incluye la secuencia señal de Igk de ratón y se clonó en la dirección 3' del segundo promotor, EF1a, en el vector de expresión pBUDCE4.1.
Se transfectó el vector de expresión de rFVIIIFc en células 293 de riñón embrionario humano (HEK293H; Invitrogen) usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se generaron estirpes celulares clonales estables por selección con zeocina (Invitrogen). Se usó una estirpe celular clonal, 3C4-22, para generar FVIIIFc para la caracterización in vivo. Se produjo FVIIIFc recombinante y se purificó (McCue et al. 2009) en Biogen Idec (Cambridge, MA). Se esperaba que la estrategia de transfección descrita anteriormente diera tres productos, es decir, los híbridos de rFVIIIFc monomérico, híbridos de rFVIIIFc dimérico y Fc dimérico. Sin embargo, no se detectó esencialmente rFVIIIFc dimérico en el medio acondicionado de estas células. Más bien, el medio acondicionado contuvo Fc y rFVIIIFc monomérico. Es posible que el tamaño de rFVIIIFc dimérico fuera demasiado grande y previniera la eficiente secreción de la célula. Este resultado fue beneficioso, puesto que hizo menos complicada la purificación del monómero que si hubieran estado presentes las tres proteínas. El material usado en estos estudios tuvo una actividad específica de aproximadamente 9000 UI/mg.
"Intervalo de administración", como se usa en el presente documento, significa la cantidad de tiempo que transcurre entre las dosis múltiples que se administran a un sujeto. La comparación del intervalo de administración se puede hacer en un único sujeto o en una población de sujetos, y luego se puede calcular el promedio obtenido en la población.
El intervalo de administración cuando se administra un polipéptido quimérico del factor VIII, por ejemplo, un polipéptido quimérico de factor VIII-Fc (un polipéptido que comprende un factor VIII o un híbrido) de la divulgación puede ser al menos aproximadamente uno y medio veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII, por ejemplo, sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicho factor VIII). El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente de uno y medio a seis veces más largo, uno y medio a cinco veces más largo, uno y medio a cuatro veces más largo, uno y medio a tres veces más largo, o uno y medio a dos veces más largo, que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII, por ejemplo, sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicho factor VIII). El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente uno y medio, dos, dos y medio, tres, tres y medio, cuatro, cuatro y medio, cinco, cinco y medio o seis veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor VIII sin la porción distinta de factor VIII, por ejemplo, sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicho factor VIII). El intervalo de administración puede ser aproximadamente cada cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más largo. El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4 o 5 días o más largo. Para el tratamiento a voluntad, el intervalo de administración de dicho polipéptido quimérico o híbrido es aproximadamente una vez cada 24-36, 24-48, 24-72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, o 72 horas o más largo.
Preferentemente, la dosis eficaz es 25-65 UI/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, o 65 UI/kg) y el intervalo de administración es una vez cada 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 o más días, o tres veces por semana, o no más de tres veces por semana. Preferentemente, la dosis eficaz es 65 UI/kg y el intervalo de administración es una vez a la semana, o una vez cada 6-7 días.
"Factor VIII de acción prolongada" es un factor VIII que tiene una elevada semivida (también denominada en el presente documento t1/2, t1/2 beta, semivida de eliminación y HL) con respecto a un factor VIII de referencia. La elevada semivida de un factor VIII de acción prolongada puede ser debida a la fusión con uno o más polipéptidos distintos de factor VIII, tales como, por ejemplo, Fc, XTEN o albúmina. La elevada semivida puede ser debida a una o más modificaciones, tales como, por ejemplo, pegilación. Los polipéptidos factor VIII de acción prolongada a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, polipéptidos quiméricos de factor VIII que comprenden Fc, polipéptidos quiméricos de factor VIII que comprenden XTEN y polipéptidos quiméricos de factor VIII que comprenden albúmina. Los polipéptidos factor VIII de acción prolongada adicionales a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, factor VIII pegilado.
El polipéptido de "referencia", en el caso de un polipéptido quimérico del factor VIII de acción prolongada, es un polipéptido que consiste esencialmente en la porción de factor VIII del polipéptido quimérico, por ejemplo, la misma porción de factor VIII sin la porción Fc, sin la porción XTEN, o sin la porción de albúmina. Asimismo, el polipéptido de referencia en el caso de un factor VIII modificado es el mismo factor VIII sin la modificación, por ejemplo, un factor VIII sin la pegilación.
En algunas realizaciones, el factor VIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a un sujeto:
un tiempo de residencia medio (MRT) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 14-41,3 horas; una depuración (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,22-5,19 ml/hora/kg o menos;
una t1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 11 -26,4 horas;
una recuperación incremental (valor K) (actividad; observada) en dicho sujeto de aproximadamente 1,38­ 2,88 UI/dl por UI/kg;
un Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 37,7-79,4 ml/kg; y
un ABC/dosis en dicho sujeto de aproximadamente 19,2-81,7 UI*h/dL por UI/kg.
En algunas realizaciones, el factor VIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) superior a 1,38 UI/dl por UI/kg;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) de al menos aproximadamente 1,5, al menos aproximadamente 1,85, o al menos aproximadamente 2,46 UI/dl por UI/kg.
una depuración media (CL) (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 2,33 ± 1,08 ml/hora/kg o menos;
una depuración media (CL) (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 1,8-2,69 ml/hora/kg; una depuración media (CL) (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente el 65 % de la depuración de un polipéptido que comprende dicho factor VIII sin modificación;
un tiempo de residencia medio (MRT) (actividad) en dicha población de pacientes de al menos aproximadamente 26,3 ± 8,33 horas;
un MRT medio (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 25,9 - 26,5 horas;
un MRT medio (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente 1,5 veces más largo que el MRT medio de un polipéptido que comprende dicho factor VIII sin modificación;
una t1/2beta media (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 18,3 ± 5,79 horas; una t1/2beta media (actividad)in dicha población de pacientes que es aproximadamente 18 - 18,4 horas; una t1/2beta media (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente 1,5 veces más larga que la t1/2beta media de un polipéptido que comprende dicho factor VIII sin modificación;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes de aproximadamente 2,01 ± 0,44 UI/dl por UI/kg;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes de aproximadamente 1,85 - 2,46 UI/dl por UI/kg;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes que es aproximadamente el 90 % de la recuperación incremental media de un polipéptido que comprende dicho factor VIII sin modificación;
un Vss medio (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 55,1 ± 12,3 ml/kg;
un Vss medio (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 45,3 - 56,1 ml/kg;
un ABC media/dosis (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 49,9 ± 18,2 UI*h/dL por UI/kg;
un ABC media/dosis (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 44,8 - 57,6 UI*h/dL por UI/kg.
"Tratamiento a voluntad", como se usa en el presente documento, significa el tratamiento que pretende tener lugar durante un corto transcurso de tiempo y es en respuesta a una condición existente, tal como un episodio hemorrágico, o una necesidad percibida, tal como cirugía planeada. Las condiciones que puede requerir tratamiento a voluntad incluyen, por ejemplo, un episodio hemorrágico, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo de cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intrabdominal, hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, o sangrado en la cubierta del ilipsoas. El sujeto puede estar en necesidad de profilaxis quirúrgica, tratamiento perioperatorio o tratamiento para cirugía. Dichas cirugías incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, extracción dental, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, artroplastia total de la rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía para traumatismo, cirugía intracraneal, cirugía intrabdominal, cirugía intratorácica o cirugía para reemplazo articular.
Preferentemente, tratamiento a voluntad resuelve más del 80 % (más del 80 %, más del 81 %, más del 82 %, más del 83 %, más del 84 %, más del 85 %, más del 86 %, más del 87 %, más del 88 %, más del 89 %, más del 90 %, más del 91 %, más del 92 %, más del 93 %, más del 94 %, más del 95 %, más del 96 %, más del 97 %, más del 98 %, más del 99 % o el 100 %) u 80-100 %, 80-90 %, 85-90 %, 90-100 %, 90-95 % o 95-100 % de los sangrados (por ejemplo, sangrados espontáneos) en una dosis única. Preferentemente, más del 80 % (más del 81 %, más del 82 %, más del 83 %, más del 84 %, más del 85 %, más del 86 %, más del 87 %, más del 88 %, más del 89 %, más del 90 %, más del 91 %, más del 92 %, más del 93 %, más del 94 %, más del 95 %, más del 96 %, más del 97 %, más del 98 % o el 100 %) u 80-100 %, 80-90 %, 85-90 %, 90-100 %, 90-95 % o 95-100 % de los episodios hemorrágicos se clasifican como excelentes o buenos por los médicos después del tratamiento a voluntad. Preferentemente, más del 5 %, (más del 6 %, más del 7 %, más del 8 %, más del 9 %, más del 10 %, más del 11 %, más del 12 %, más del 13 %, más del 14 %, más del 15 %, más del 16 %, más del 17 %, más del 18 %, más del 19 %, más del 20 %), o 5-20 %, 5-15 %, 5­ 10 %, 10-20 % o 10-15 %, de los episodios hemorrágicos se clasifican como justos por los médicos después del tratamiento a voluntad.
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico comprendido en restos de aminoácidos covalentemente unidos.
"Polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico comprendido en restos de nucleótidos covalentemente unidos. Los polinucleótidos pueden ser ADN, ADNc, ARN, monocatenario, o bicatenario, vectores, plásmidos, fago o virus. Los polinucleótidos incluyen, por ejemplo, aquellos en la Tabla 1, que codifican los polipéptidos de la Tabla 2 (véase la Tabla 1). Los polinucleótidos también incluyen, por ejemplo, fragmentos de los polinucleótidos de la Tabla 1, por ejemplo, los que codifican fragmentos de los polipéptidos de la Tabla 2, tales como el factor VIII, Fc, secuencia señal, 6His y otros fragmentos de los polipéptidos de la Tabla 2.
"Tratamiento profiláctico", como se usa en el presente documento, significa administrar un polipéptido de factor VIII en dosis múltiples a un sujeto durante un tiempo para aumentar el nivel de actividad del factor VIII en el plasma de un sujeto. Preferentemente, el aumento de nivel es suficiente para reducir la incidencia de sangrado espontáneo o para prevenir el sangrado, por ejemplo, en el caso de una lesión imprevista. Preferentemente, durante el tratamiento profiláctico, el nivel de proteína plasmática en el sujeto no se encuentra por debajo del nivel basal para ese sujeto, o por debajo del nivel de factor VIII que caracteriza una fuerte hemofilia (<1 UI/dl [1 %]).
Preferentemente, la pauta profiláctica se "adapta" al paciente individual, preferentemente determinando los datos FC para cada paciente y administrando el factor VIII de la divulgación en un intervalo de administración que mantiene un nivel valle del 1-3 % de actividad de FVIII. Los ajustes se pueden hacer cuando un sujeto sufre episodios hemorrágicos inaceptables definidos como >2 episodios hemorrágicos espontáneos durante un periodo consecutivo de dos meses. En este caso, el ajuste se dirigirá a niveles valle del 3-5 %. Preferentemente, el tratamiento profiláctico produce la prevención y el control del sangrado, el control sostenido del sangrado, la protección sostenida del sangrado y/o el beneficio sostenido. La profilaxis, por ejemplo, la protección sostenida, se puede demostrar por un aumento de ABC hasta el último momento de tiempo medido (ABC-ÚLTIMO) y la depuración reducida, que da como resultado un aumento de t1/2 terminal en comparación con FVIII de acción corta. Preferentemente, la profilaxis se demuestra por mejor Cmáx, mejor Tmáx y/o mayor tiempo de residencia medio frente al FVIII de acción corta. Preferentemente, la profilaxis da como resultado episodios hemorrágicos no espontáneos en aproximadamente 24, 36, 48, 72 o 96 horas (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, o 96 horas, preferentemente en 72 horas), después de la inyección (por ejemplo, la última inyección). Preferentemente, la profilaxis da como resultado más del 30 % (por ejemplo, más del 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, o 90%, preferentemente más del 50 %), de reducción media en episodios hemorrágicos anualizados con una administración de una vez a la semana (por ejemplo, de 65 UI/kg).
"Sujeto", como se usa en el presente documento, significa un mamífero humano o no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, ratones, perros, primates, monos, gatos, caballos, vacas, cerdos y otros animales domésticos y animales pequeños.
"Dosis terapéutica", como se usa en el presente documento, significa una dosis que logra un objetivo terapéutico, como se describe en el presente documento. El cálculo de la dosis requerida de factor VIII se basa en el hallazgo empírico de que, en promedio, 1 UI de factor VIII por kg de peso corporal eleva la actividad del factor VIII plasmático en aproximadamente 2 UI/dl. La dosis requerida se determina usando la siguiente fórmula:
Unidades requeridas = peso corporal (kg) x aumento de factor VIII deseado (UI/dl o % de la normalidad) x 0,5
(UI/kg por UI/dl)
Las dosis terapéuticas que se pueden usar en los métodos de la divulgación son aproximadamente 10-100 UI/kg, más específicamente, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 UI/kg, y más específicamente, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 UI/kg.
Las dosis terapéuticas adicionales que se pueden usar en los métodos de la divulgación son aproximadamente 10 a aproximadamente 150 UI/kg, más específicamente, aproximadamente 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140­ 150 UI/kg, y más específicamente, aproximadamente 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 UI/kg.
"Variante", como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se diferencia del polinucleótido o polipéptido original, pero que retiene propiedades esenciales del mismo, por ejemplo, actividad coagulante del factor VIII o actividad de Fc (de unión a FcRn). En general, las variantes son en general estrechamente similares y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido original. Las variantes incluyen, por ejemplo, fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos, deleciones, inserciones y versiones modificadas de los polipéptidos originales.
Los polinucleótidos de variante pueden comprender, o alternativamente consistir en, una secuencia de nucleótidos que es al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia codificante de nucleótidos en SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9 u 11 (la porción de factor VIII, la porción Fc, individualmente o juntas) o la hebra complementaria a la misma, la secuencia codificante de nucleótidos del factor VIII mutante y recombinante conocido o Fc, tales como los desvelados en las publicaciones y patentes citadas en el presente documento, o la hebra complementaria a la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 o 12 (la porción de factor VIII, la porción Fc, individualmente o juntas) y/o fragmentos de polinucleótidos de cualquiera de estas moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, los fragmentos descritos en el presente documento). Los polinucleótidos que se hibridan con estas moléculas de ácidos nucleicos en condiciones de hibridación rigurosas o condiciones de rigurosidad más bajas también se incluyen como variantes, ya que son polipéptidos codificados por estos polinucleótidos, en tanto que sean funcionales.
Los polipéptidos de variante pueden comprender, o alternativamente consistir en, una secuencia de aminoácidos que es al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia de polipéptidos mostrada en SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 o 12 (la porción de factor VIII, la porción Fc, individualmente o juntas) y/o fragmentos de polipéptidos de cualquiera de estos polipéptidos (por ejemplo, los fragmentos descritos en el presente documento).
Por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, el 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de nucleótidos pueda incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos el 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser delecionados o sustituidos con otro nucleótido, o varios nucleótidos hasta el 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. La secuencia problema puede ser, por ejemplo, la secuencia entera mostrada en SEQ ID NO:1 o 3, el ORF (marco de lectura abierto), o cualquier fragmento especificado como se describe en el presente documento.
Como una cuestión práctica, si cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos o polipéptido de la presente divulgación, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar el mejor apareamiento global entre una secuencia problema (secuencia de referencia u original) y una secuencia objetivo, también denominado un alineamiento global de secuencias, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En un alineamiento de secuencias, las secuencias problema y objetivo son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN se puede comparar convirtiendo U en T. El resultado de dicho alineamiento global de secuencias es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria, k-tuple=4, penalización por desapareamientos=1, penalización por unión=30, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 o longitud de la secuencia de nucleótidos objetivo, sea cual sea más corto.
Si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia problema debido a deleciones en 5' o 3', no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no tiene en cuenta las truncaciones de 5' y 3' de la secuencia objetivo cuando calcula el porcentaje de identidad. Para las secuencias objetivo truncadas en los extremos 5' o 3’, con respecto a la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia problema que están en 5' y 3' de la secuencia objetivo, que no están apareadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Si un nucleótido se aparea/alinea, se determina por resultados del alineamiento de FASTDB de secuencias. Este porcentaje se resta entonces del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a un porcentaje final de puntuación de identidad. Esta puntuación corregida es lo que se usa para los fines de la presente invención. Solo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia objetivo, como se presentan por el alineamiento de FASTDB, que no se aparean/alinean con la secuencia problema, se calculan a efectos de ajustar manualmente el porcentaje de puntuación de identidad.
Por ejemplo, una secuencia objetivo de 90 bases se alinea con una secuencia problema de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones ocurren en el extremo 5' de la secuencia objetivo y, por lo tanto, el alineamiento de FASTDB no muestra un apareamiento/alineamiento de las 10 primeras bases en el extremo 5'. Las 10 bases sin aparear representan el 10 % de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no apareadas/número total de bases en la secuencia problema) por lo que se resta el 10 % del porcentaje de puntuación de identidad calculado por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes se aparearon perfectamente, el porcentaje de identidad final sería del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia objetivo de 90 bases se compara con una secuencia problema de 100 bases. Esta vez, las deleciones son deleciones internas, de manera que no hay bases en 5' o 3' de la secuencia objetivo que no estén apareadas/alineadas con el problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo las bases en 5' y 3' de la secuencia objetivo que no están apareadas/alineadas con la secuencia problema se corrigen manualmente. No se hacen otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, el 95 % "idéntica" a una secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objetivo sea idéntica a la secuencia problema, excepto que la secuencia objetivo de polipéptidos pueda incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia problema de aminoácidos. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a una secuencia problema de aminoácidos, hasta el 5 % de los restos de aminoácidos en la secuencia objetivo se pueden insertar, delecionar, (indel) o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones de extremo amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre las posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como una cuestión práctica, si cualquier polipéptido particular es al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % idéntico a, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (la porción de factor VIII, la porción Fc, individualmente o juntas) o 4, o una secuencia de polipéptidos de factor VIII o Fc conocido, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar el mejor apareamiento global entre una secuencia problema (secuencia de referencia u original) y una secuencia objetivo, también denominado un alineamiento de secuencias global, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990). En un alineamiento de secuencias, las secuencias problema y objetivo son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicho alineamiento de secuencias global es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en un alineamiento de aminoácidos de FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, penalización por desapareamientos=1, penalización por unión=20, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, tamaño de ventana=longitud de secuencia, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia objetivo de aminoácidos, sea cual sea más corto.
Si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia problema debido a deleciones del extremo N o C, no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no tiene en cuenta las truncaciones del extremo N y C de la secuencia objetivo cuando calcula porcentaje de identidad global. Para las secuencias objetivo truncadas en los extremos N y C, con respecto a la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de restos de la secuencia problema que están en el extremo N y C de la secuencia objetivo, que no están apareadas/alineadas con un resto objeto correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Si un resto se aparea/alinea, se determina por resultados del alineamiento FASTDB de secuencias. Este porcentaje se resta entonces del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a un porcentaje final de puntuación de identidad. Este porcentaje final de puntuación de identidad es lo que se usa para los fines de la presente invención. Solo los restos de los extremos N y C de la secuencia objetivo, que no están apareados/alienados con la secuencia problema, se consideran a efectos del ajuste manual del porcentaje de puntuación de identidad. Es decir, solo las posiciones de de restos problema fuera de los restos más alejados del extremo N y C de la secuencia objetivo.
Por ejemplo, una secuencia objetivo de 90 restos de aminoácidos se alinea con una secuencia problema de 100 restos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción ocurre en el extremo N de la secuencia objetivo y, por lo tanto, el alineamiento de FASTDB no muestra un apareamiento/alineamiento de los 10 primeros restos en el extremo N. Los 10 restos sin aparear representan el 10 % de la secuencia (número de restos en los extremos N y C no apareados/número total de restos en la secuencia problema), por lo que el 10 % se resta del porcentaje de puntuación de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes se aparearan perfectamente, el porcentaje final de identidad sería del 90 %. En otro ejemplo, se compara una secuencia objetivo de 90 restos con una secuencia problema de 100 restos. Esta vez, las deleciones son deleciones internas, por lo que no existen restos en los extremos N o C de la secuencia objetivo que no estén apareados/alineados con el problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo se corrigen manualmente las posiciones de restos fuera de los extremos N y C de la secuencia objetivo, como se presenta en el alineamiento de FASTDB, que no están apareadas/alineadas con la secuencia problema. No se tienen que hacer otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas. Se prefieren especialmente variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones silenciosas, adiciones, o deleciones, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren las variantes de nucleótidos producidas por las sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Además, también se prefieren variantes en las que 5-10, 1-5 o 1-2 aminoácidos están sustituidos, delecionados, o añadidos, en cualquier combinación. Las variantes de polinucleótidos se pueden producir por una variedad de motivos, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (cambio de codones en el ARNm humano por los preferidos por un hospedador bacteriano, tal como E. coli).
Las variantes que existen de forma natural se denominan "variantes alélicas" y se refieren a una de varias formas alternas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar en cualquiera del nivel de polinucleótido y/o de polipéptido y están incluidas en la presente invención. Alternativamente, las variantes que no existen de forma natural se pueden producir por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.
Usando métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser delecionados del extremo N o extremo C de la proteína secretada sin pérdida sustancial de la función biológica. Los autores de Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993) informaron de proteínas KGF de variante que tenían actividad de unión a heparina incluso después de la deleción de 3, 8 o 27 restos de aminoácidos del extremo amino. Similarmente, el interferón gamma presentó una actividad hasta diez veces más alta después de la deleción de 8-10 restos de aminoácidos del extremo carboxi de esta proteína (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).
Además, pruebas de sobra demuestran que las variantes retienen frecuentemente una actividad biológica similar a la de la proteína que existe de forma natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) realizaron amplios análisis mutacionales de la citocina IL-1 a humana. Usaron mutagénesis al azar para generar más de 3.500 mutantes de IL-1 a individuales que promediaron 2,5 cambios de aminoácidos por variante a lo largo de la longitud completa de la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posible posición de aminoácido. Los investigadores encontraron que "la mayor parte de la molécula se podría alterar con poco efecto sobre cualquiera [actividad de unión o biológica]." (véase el resumen.) En realidad, solo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3.500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que difirió significativamente en actividad de la natural.
Como se ha establecido anteriormente, las variantes de polipéptidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos modificados. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de un resto hemo, fijación covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o derivado de lípido, fijación covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación (Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)), procesamiento proteolítico , fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas, tales como arginilación, y ubiquitinación. En algunas realizaciones, el factor VIII se modifica, por ejemplo, pegila, en cualquier localización conveniente. En algunas realizaciones, el factor VIII se pegila en un aminoácido expuesto en la superficie del factor VIII, preferentemente una cisteína expuesta en la superficie, que puede ser una cisteína manipulada. Mei et al. (2010). En algunas realizaciones, el factor VIII modificado, por ejemplo, el factor VIII pegilado, es un factor VIII de acción prolongada.
"Volumen de distribución en el estado estacionario (Vss)", como se usa en el presente documento, tiene el mismo significado que el término usado en la farmacología, que es el espacio aparente (volumen) en el que un fármaco se distribuye. Vss = la cantidad de fármaco en el cuerpo dividida entre la concentración plasmática en estado estacionario.
"Aproximadamente", como se usa en el presente documento para un intervalo, modifica a ambos extremos del intervalo. Así, "aproximadamente 10-20" significa "aproximadamente 10 a aproximadamente 20".
Habiendo ahora descrito la presente invención con detalle, lo mismo será más claramente entendido como referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen con la presente para los fines de ilustración solo y que no pretenden ser limitantes de la invención.
Ejemplo 1
Resumen
Se creó una proteína de fusión recombinante de factor VIII de dominio B delecionado-Fc (rFVIIIFc) para prolongar la semivida de FVIII. Se estudió rFVIIIFc en modelos de ratón y perro de hemofilia A grave y se comparó con rFVIII (ReFacto®). Se corrigió el tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) en ratones con hemofilia A aproximadamente dos a tres veces más y la semivida de eliminación en plasma fue casi dos veces más larga para rFVIIIFc en comparación con ReFacto®. En perros con hemofilia A, una dosis intravenosa de rFVIIIFc (125 UI/kg) corrigió el WBCT a la normalidad. El WBCT siguió siendo inferior a 20 min, el tiempo de acuerdo con FVIII:C > 1 %, hasta aproximadamente 96 h, en comparación con 48 h para perros tratados con ReFacto®. La semivida de eliminación de rFVIIIFc en plasma de perro, cuando se midió usando ELISA o ensayos de actividad cromogénica, fue 15,7 ± 1,7 h y 15,4 ± 0,3 h, respectivamente. ReFacto® corrigió WBCT en aproximadamente la mitad, en tanto que rFVIIIFc y la semivida en plasma fueran 7,0 h. Así, la fusión de FVIII con Fc produjo una molécula con un aumento de semivida en plasma y la capacidad de proporcionar protección prolongada del sangrado.
Introducción
Una mortalidad reducida, la prevención del daño articular y una calidad de vida mejorada han sido logros importantes debido al desarrollo de FVIII derivado de plasma y recombinante. La protección prolongada del sangrado representaría otro avance clave en el tratamiento de los pacientes con hemofilia A. Los inventores han creado una proteína quimérica recombinante de factor VIII-Fc (rFVIIIFc) e híbrido como enfoque para prolongar la semivida de FVIII.
rFVIIIFc es una proteína híbrida heterodimérica que comprende FVIII de dominio B delecionado fusionado recombinantemente con el dominio Fc de inmunoglobulina humana G1 (IgG1) (Fig. 1, SEQ ID NO:2; Tabla 2A) (Esta proteína también se denomina en el presente documento proteína de fusión de FVIIIFc-Fc monomérico, híbrido de monómero de FVIIIFc, híbrido de FVIIIIFc monomérico y monómero-dímero de FVIIIFc). El Fc permite la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la protección de IgG de la degradación y confiere a la IgG la semivida observada de tres semanas en seres humanos (Ghetie V, y Ward ES., Annu. Rev. Immunol. 2000;18:739-766; Roopenian DC, y Akilesh S., Nature Rev. Immunol. 2007;7:715-725).
El dominio Fc de IgG1 se ha fusionado con factores de crecimiento, citocinas, enzimas y regiones de unión a ligando de receptores (Ashkanazi A, et al., Int. Rev. Immunol. 1993:10:219-27; Chamow SM, y Ashkanazi A, Trends Biotechnol.
1996:14:52-60; Fisher et al., N. Engl. J. Med. 1996:334(26):1697-702). Varios de estos han llegado a ser moléculas terapéuticas importantes (por ejemplo, etanercept, alefacept, abatacept). En estas proteínas de fusión, dos moléculas efectoras se conectan con dos moléculas de Fc. En este ejemplo, rFVIIIFc se ha construido como una proteína de fusión de Fc monomérico (una copia de un polipéptido que consiste en la secuencia en la Tabla 2A(i) (SEQ ID NO:2) con o sin la secuencia señal y una copia de un polipéptido que consiste en la secuencia en la Tabla 2A(ii) (SEQ ID NO:4) con o sin la secuencia señal), es decir, con solo una copia de la molécula efectora (véase la Figura 1), y los estudios presentados en el presente documento comparan la farmacodinámica y la farmacocinética de esta proteína novedosa con rFVIII en modelos de ratón y de perro de hemofilia A. La secuencia señal se escinde durante la secreción. Esta construcción de proteína se denomina en el presente documento proteína de fusión de FVIIIFc-Fc monomérico, híbrido de monómero de FVIIIFc, híbrido de FVIIIIFc monomérico y monómero-dímero de FVIIIFc. Véase el Ejemplo 1, la Fig. 1, Tabla 2A; y las patentes de EE. UU. N.° 7.404.956 y 7.348.004 para la estructura y la producción de esta proteína.
Métodos y materiales
Preparaciones de FVIII
FVIIIFc recombinante
Se obtuvo la secuencia codificante de FVIII recombinante humano de dominio B delecionado por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) de ARN de poli(A) de hígado humano (Clontech) usando cebadores específicos de FVIII. La secuencia de FVIII incluye la secuencia señal nativa para FVIII. La deleción del dominio B fue de serina 743 (S743; 2287 pb) a glutamina 1638 (Q1638; 4969 pb) para una deleción total de 2682 pb. Véase el Ejemplo 1, la Fig. 1, Tabla 2A; y las patente de EE. Uu . N.° 7.404.956 y 7.348.004 para la estructura y la producción de esta proteína.
La secuencia codificante para Fc recombinante humano se obtuvo por RT-PCR de una biblioteca de ADNc de leucocitos humanos (Clontech) usando cebadores específicos de Fc. Los cebadores se diseñaron de forma que la secuencia de FVIII de dominio B delecionado se fusionó directamente con el extremo N de la secuencia de Fc sin conector intermedio. La secuencia de ADN de FVIIIFc se clonó en el vector de expresión doble de mamífero pBUDCE4.1 (Invitrogen) bajo control del promotor del CMV. Una segunda secuencia de Fc idéntica, que incluye la secuencia señal de Igk de ratón, se obtuvo por RT-PCR y se clonó en la dirección del segundo promotor, EF1 a, en el vector de expresión pBUDCE4.1.
Se transfectó el vector de expresión de rFVIIIFc en células 293 de riñón embrionario humano (HEK293H; Invitrogen) usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se generaron estirpes celulares clonales estables por selección con zeocina (Invitrogen). Se usó una estirpe celular clonal, 3C4-22, para generar FVIIIFc para la caracterización in vivo. Se produjo FVIIIFc recombinante y se purificó (McCue et al. 2009, 7824-7830) en Biogen Idec (Cambridge, MA). Se esperó que la estrategia de transfección descrita anteriormente diera tres productos, es decir, híbrido de rFVIIIFc monomérico, híbrido de rFVIIIFc dimérico y Fc dimérico. Sin embargo, no se detectó esencialmente rFVIIIFc dimérico en el medio acondicionado de estas células. Más bien, el medio acondicionado contuvo Fc y rFVIIIFc monomérico. Es posible que el tamaño de rFVIIIFc dimérico fuera demasiado grande y previniera la secreción eficiente de la célula. Este resultado fue beneficioso, puesto que hizo menos complicada la purificación del monómero que si hubieran estado presentes las tres proteínas. El material usado en estos estudios tuvo una actividad específica de aproximadamente 9000 UI/mg. Además, estas células humanas produjeron un mayor nivel de proteína que otras células que se probaron en este experimento.
FVIII recombinante
Se compró FVIII recombinante de dominio B delecionado (ReFacto®) de Novis Pharmaceuticals y se preparó según las instrucciones del fabricante. ReFacto® (FVIII recombinante de dominio B delecionado) tiene la misma secuencia de aminoácidos que los aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO:2.
Animales con hemofilia A
Los ratones con hemofilia A son inactivaciones del exón 16 de FVIII en un acervo 129 x B6 que se obtuvieron del Dr. Kazazian de la Universidad de Pennsilvania (Bi L, et al., Nat. Genet. 1995;10(1): 119-121) y se criaron en Syntonix. Estos ratones presentan tiempos de coagulación de sangre completa prolongados (>60 min) y, por consiguiente, son un buen modelo de hemofilia A grave.
Los perros con hemofilia A fueron de la colonia endógama mantenida en el Laboratorio de investigación de sangre Francis Owen de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill (Graham, JB, et al., J. Exp. Med. 1949;90:97-111). Estos perros tienen un fenotipo hemófilo grave comparable a la forma grave de la enfermedad humana (Graham, JB, et al., J. Exp. Med. 1949;90:97-111; Lozier, JN, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2002;99:12991 -12996).
Diseños del estudio
Estudios en ratones con hemofilia A
Se estudió el efecto de rFVIIIFc y ReFacto® sobre el tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) en ratones deficientes en FVIII. Cada proteína se administró por vía intravenosa en 50 UI/kg y se recogió sangre de la vena de la cola de cada ratón antes de la administración y en diversos momentos de tiempo después de la administración. Las muestras de sangre se incubaron en microtubos a 37 °C y se examinaron visualmente una vez por minuto para la presencia de un coágulo. Se registró el tiempo de formación de coágulos. Si no se formó coágulo en 60 min, el tiempo de coagulación se registró como >60 min. La sangre de ratones normales coagula en aproximadamente 4 min (intervalo 2-7 min, n = 10 ratones) en el ensayo de WBCT.
En un segundo conjunto de estudios, se administró ratones con hemofilia A con una dosis intravenosa única de 50 UI/kg de rFVIIIFc, ReFacto® o Advate® (4 ratones por momento de tiempo). Se recogió sangre por punción cardíaca en un décimo de volumen de 3,2 % de citrato de sodio 0,25, 8, 24, 48 y 72 h después de la administración. Se preparó el plasma y se guardó a -80 °C hasta el análisis para actividad de FVIII usando un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII.
Estudios en perros con hemofilia A
En un estudio FC/FD de dosis única de rFVIIIFc, se administró dos perros con hemofilia A de la colonia de Chape1Hill con una dosis intravenosa única de 125 UI/kg y se recogió muestras de sangre antes de la administración y después de la administración en momentos de tiempo seleccionados para WBCT, tiempo activado de tromboplastina parcial (aPTT), concentración plasmática de FVIIIFc, hematología y bioquímica sérica. Los momentos de tiempo para WBCT incluyeron antes de la administración, 5 y 30 min y 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96, 144 y 168 h después de la administración. Las extracciones de sangre para la actividad de coagulación (aPTT) y la concentración plasmática de FVIIIFc incluyeron los momentos de tiempo enumerados anteriormente para WBCT, así como 15 min y 3, 6, 12 horas después de la administración.
Se hizo un segundo estudio en el que se administró ReFacto® (114 UI/kg para el perro M12 y 120 UI/kg para el perro M38) por vía intravenosa. Se midió WBCT hasta que los tiempos de coagulación fueron > 20 min (de acuerdo con FVIII:C > 1 %), y luego se administró 125 UI/kg de rFVIIIFc por vía intravenosa a los mismos perros y se recogió muestras de sangre para WBCT, aPTT, concentración plasmática de FVIIIFc, hematología y bioquímica sérica. Los momentos de tiempo para WBCT incluyeron antes de la administración, 5 y 30 min y 1,2, 4, 8, 24, 32, 48, 72 h después de la administración. También se recogió sangre 96, 120, 144, y 168 h después de la administración de FVIIIFc. Las extracciones de sangre para la actividad de coagulación y la concentración plasmática de FVIIIFc incluyeron los momentos de tiempo enumerados anteriormente para WBCT, así como 15 min y 3, 6, 12 horas después de la administración.
El procedimiento de WBCT en perros con hemofilia A fue ligeramente diferente de aquél en ratones con hemofilia A. Después de la administración de rFVIIIFc o ReFacto®, se recogió un ml de sangre en diversos momentos de tiempo y se distribuyó 0,5 ml en dos tubos de vidrio siliconizados que se dispusieron posteriormente en un baño de agua a 28 °C. Empezando en un minuto, se inclinó un tubo cada 30 s, el segundo se dejó quito. Cuando se formó un coágulo en el tubo inclinado, entonces se inclinó el segundo tubo cada 30 s hasta que se formó un coágulo. Se registró el tiempo para un coágulo completamente gelificado en el segundo tubo como el WBCT.
Actividad de FVIII en plasma
Medición de la actividad de FVIII en plasma por ensayo cromogénico específico de FVIII
Se probaron muestras de plasma para la actividad de FVIII por un método cromogénico automatizado usando un instrumento Sysmex CA1500 y los reactivos fueron de Siemans Healthcare Diagnostics (Dallas, TX, kit N.° B4238-40). La actividad de rFVIIIFc se determinó usando una curva patrón creada usando el 7° patrón internacional para concentrado de factor FVIII (código de NIBSC 99/678) enriquecido en plasma humano de FVIII reducido (Stago EE. UU.) en concentraciones que variaban desde 1,5 - 0,016 UI/ml.
Medición de rFVIIIFc o FVIII por ELISA
FVIIIFc en plasma de perro por ELISA
Se recubrió un anticuerpo contra FVIII específico para el dominio A1 (Green Mountain Antibodies: GMA-8002) sobre placas de 96 pocillos y se incubó durante 1 h a 37 °C. Se bloqueó las placas recubiertas con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20, CaCl2 y albúmina de suero bovino durante 1 h a temperatura ambiente y se diluyó 1:10 los patrones, los controles y las muestras que se prepararon en plasma normal de perro y luego se añadieron a las placas y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Se lavó las placas y luego se añadió Fc-HRP anti-humano (F(ab)'2) de burro (Jackson: 709-036-098) y se incubó durante 1 h a 37 °C. Después de lavar, se añadió TMB (sustrato supersensible BioFx: TMBS-0100-01) a las placas, se inactivó el sustrato de reacción con ácido y se midió la absorbancia en un lector de placas SpectraMax Plus (Molecular Devices) a 450 nm.
ReFacto® en plasma de perro por ELISA
Se recubrió un anticuerpo anti-FVIII específico para el dominio A1 en la cadena pesada (Green Mountain Antibodies: GMA-8002) sobre placas de 96 pocillos y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Se bloqueó las placas recubiertas durante 1 h a 37 °C y después de lavar, se prepararon los patrones, los controles y las muestras en plasma normal de perro, luego se diluyeron 1:10, se añadieron a las placas y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó las placas, luego se trataron con el anticuerpo de detección, un conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-FVIII previamente diluido (Affinity Biologicals: F8C-EIA-D) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar, se añadió TMB (sustrato supersensible BioFx: TMBS-0100-01 a las placas durante 10 min. El sustrato reacción se inactivó con ácido y la señal se midió en un lector de placas SpectraMax Plus (Molecular Devices) a una longitud de onda de 450 nm.
Medición de fibrinógeno
Se midió la concentración de fibrinógeno en plasma en Esoterix (Research Triangle Park, NC) usando un kit que contenía el reactivo HemosIL™ PT-Fibrinogen-HS (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, catálogo N.° 0008468210) y un analizador de la coagulación ACL 7000 (Beckman Coulter), según las instrucciones del fabricante.
Medición de plaquetas
Se contó las plaquetas en sangre completa anticoagulada con EDTA por métodos automáticos usando el analizador hematológico Vet-ABC-Dif programado con una tarjeta inteligente específica de especie (SCIL Animal Care Co., Gurnee, IL).
Análisis farmacocinético
Se calculó los parámetros farmacocinéticos por análisis no compartimental usando el software WinNonlin de Pharsight, versión 5.2 (Mountain View, Ca). Los parámetros FC incluyeron la concentración máxima en plasma (Cmáx), área bajo la curva de la concentración plasmática frente al tiempo (ABC), semivida de eliminación (t1/2), volumen de distribución (Vss) y depuración (Cl).
Resultados
FVIII-Fc recombinante
rFVIIIFc es una fusión recombinante de FVIII humano de dominio B delecionado con Fc de IgG1 humana, sin secuencia conectora intermedia (rFVIIIFc; Figura 1).
El rFVIIIFc purificado tuvo una actividad específica de aproximadamente 9000 UI/mg como se determinó usando un ensayo de actividad cromogénica. El FVIII de dominio B delecionado recombinante (ReFacto®) tuvo una actividad específica informada de 9110 - 13700 UI/mg. La conversión de actividad específica en UI/nmol para tener en cuenta la diferencia de tamaño entre FVIIIFc y ReFacto® (216 kDa y 170 kDa, respectivamente), indica que las dos proteínas tienen actividades específicas aproximadamente equivalentes (1970 UI/nmol para rFVIIIFc y 1521 - 2287 UI/nmol para ReFacto®). Así, la actividad de FVIII de rFVIIIFc no es afectada por la fusión del extremo C de FVIII humano con el extremo N de Fc humano.
Administración a ratones con hemofilia A
Se administró una dosis única de 50 UI/kg de rFVIIIFc o ReFacto® por vía intravenosa a ratones deficientes en FVIII (n = 6/grupo). Se recogió muestras de sangre antes de la administración y después de la administración hasta 120 h y se determinó WBCT como se describe en Materiales y métodos. WBCT basal fue superior a 60 min. Los datos de un experimento representativo se muestran en la Figura 2 y la Tabla 3. Inmediatamente después de la administración con rFVIIIFc o ReFacto®, se corrigió WBCT para 2-17 minutos. La sangre de ratones tratados con ReFacto® perdió la capacidad de coagular durante 42 h, mientras que la sangre de todos los ratones tratados con rFVIIIFc todavía coaguló a las 96 h, la sangre de uno de seis coaguló a las 113 h, pero todos perdieron la capacidad de coagular en 120 h. Estos datos sugieren que la duración del efecto para rFVIIIFc es aproximadamente dos a tres veces más larga que para ReFacto®.
Se estudió la actividad cromogénica de rFVIIIFc, ReFacto® o Advate® (FVIII recombinante de longitud completa) en los ratones deficientes en FVIII después de una dosis intravenosa única de 50 UI/kg. Se recogió sangre antes de la administración y después de la administración a las 8, 24, 48, y 72 h. La actividad se midió usando un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII y se muestra en la Figura 3. Los parámetros farmacocinéticos se informan en la Tabla 4. La semivida en circulación para rFVIIIFc fue aproximadamente 1,6 a 2 veces más larga (11,1 h) en comparación con Advate® (7 h) y ReFacto® (5 h). La Cmáx fue 1,6 ± 0,36 UI/ml para rFVIIIFc en comparación con 0,47 ± 0,30 UI/ml para Advate® y 0,67 ± 0,44 UI/ml para ReFacto®. La exposición sistémica de rFVIIIFc fue notablemente mayor para rFVIIIFc (22,6 h UI/ml) en comparación con ReFacto® (6,94 h UI/ml) y Advate® (3,90 h UI/ml) y la depuración para rFIIIFc fue en particular más baja (2,09 ml/h/kg) en comparación con tanto ReFacto® (7,2 ml/h/kg) como Advate® (12,8 h/ml/kg) en los ratones con hemofilia A.
Administración a perros con hemofilia A
Se estudió la farmacodinámica (FD) y la farmacocinética (FC) de rFVIIIFc en la colonia Chape1Hill de perros con hemofilia A. Se administró una dosis intravenosa única de 125 UI/kg de rFVIIIFc a cada uno de cuatro perros con hemofilia A y se corrigió inmediatamente el WBCT a la normalidad (Figura 4). El intervalo de WBCT en perros normales es 8-12 min. El WBCT siguió siendo inferior a 20 min, el tiempo de acuerdo con FVIII:C >1 %, hasta aproximadamente 96 h, con la excepción de un perro que tuvo WBCT <20 min hasta 72 h. Además, aPTT también se corrigió inmediatamente a la normalidad (Tabla 6). La concentración de rFVIIIFc en plasma se midió usando un ELISA específico que se diseñó para detectar tanto las porciones de FVIII como de Fc de la molécula. Las curvas de concentración plasmática frente al tiempo se muestran en la Figura 5. El análisis FC de los datos mostró que el t1/2 fue 15,7 ± 1,7 h (Tabla 5). Se obtuvieron resultados similares cuando rFVIIIFc se midió usando un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII (t1/2 = 15,4 ± 0,3 h, Tabla 5) y las curvas de concentración plasmática frente al tiempo fueron similares usando ambos métodos (Figuras 5 y 6). Cuando los datos de actividad se convirtieron de UI/ml a ng/ml usando la actividad específica para rFVIIIFc, hubo una buena correlación con los datos de ELISA, demostrando así que la proteína que se midió por ELISA era completamente activa.
Dos de los perros tratados con rFVIIIFc también recibieron una dosis única de ReFacto®, 114 UI/kg para el perro M12 y 120 UI/kg para el perro M38, 72 h antes de la administración de rFVIIIFc. WBCT y aPTT se corrigieron a la normalidad inmediatamente después de la administración de ReFacto®. Sin embargo, la normalización de WBCT después de la dosis única de rFVIIIFc duró aproximadamente el doble en comparación con ReFacto® (Figura 4). Además, la semivida plasmática de rFVIIIFc (15,7 ± 1,7 h) fue aproximadamente el doble para rFVIIIFc en comparación con ReFacto® (7,0 y 6,7 h) cuando la concentración de las proteínas en plasma se midieron por ELISA (Tabla 5). Se obtuvieron resultados similares cuando se midieron las dos moléculas por actividad cromogénica específica de FVIII.
Para evaluar el posible riesgo de trombogenicidad, se midió plaquetas y fibrinógeno. Después de la administración de rFVIIIFc o ReFacto®, no cambiaron los números de plaquetas ni la concentración de fibrinógeno plasmático de los valores de antes de la administración (datos no mostrados).
Discusión
Se produjo FVIIIFc recombinante en células 293 de riñón embrionario humano (HEK 293) de una estirpe celular establemente transfectada y se purificó del medio de cultivo celular. La producción en una estirpe celular humana representa un cambio significativo en la fabricación en comparación con los productos de rFVIII actualmente comercializados que se producen o en células de ovario de hámster chino o en células de riñón de cría de hámster. El fundamento de este cambio era que se esperaba que las células humanas se equiparan mejor para realizar las modificaciones postraduccionales necesarias para la porción de FVIII de esta molécula.
La conversión de la actividad específica en UI/nmol para tener en cuenta la diferencia en los pesos moleculares para rFVIIIFc y FVIII recombinante de dominio B delecionado (ReFacto®) indicó que las actividades específicas son similares para ambas proteínas (1970 UI/nmol para rFVIIIFc y 1521 - 2287 UI/nmol para ReFacto®). Es algo sorprendente que la actividad específica para rFVIIIFc no sea afectada por la fusión del extremo C de FVIII con el extremo N de Fc puesto que el dominio C1 y C2 de FVIII participan en la unión a fosfolípidos, que es esencial para la actividad completa de FVIII (Fay, PJ, J. Hematology 83:103-8 (2006) y Raut, S, et al., Br. J. Haematol. 107:323 (1999)).
El tratamiento de la hemofilia A es a voluntad en el momento de un episodio hemorrágico o por profilaxis para la prevención de sangrado. Aunque el tratamiento a voluntad se usa todavía frecuentemente, existe una tendencia hacia la profilaxis y la prevención de daño articular (Blanchette P, et al., Haemophilia 2004: 10;679-683, Manco-Johnson, MJ, et al., N. Engl. J. Med. 2007;357:535-544). Los actuales productos de FVIII se administran cada dos a tres días para la profilaxis debido a la semivida relativamente corta de 10-12 h para mantener un FVIII:C por encima del 1 % en los pacientes (Morfini, M, Haemophilia 2003;9 (supl 1):94-99; discusión 100, White GC, et al., Thromb. Haemost.
1997:77:660-7, Blanchette, P, et al., J. Thromb. Haemost. 2008 Aug;6(8): 1319-26). Las terapias con FVIII de acción prolongada que proporcionan protección prolongada del sangrado representarían una mejora importante en la calidad de vida de los pacientes con hemofilia A. Las estrategias para prolongar la semivida de los factores de coagulación incluyen las que han sido satisfactorias para otras moléculas, que incluyen pegilación (Rostin J, et al., Bioconj. Chem.
2000;11:387-96), glucopegilación (Stennicke HR, et al., Thromb. Haemost. 2008;100:920-8), formulación con liposomas pegilados (Spira J, et al., Blood 2006;108:3668-3673, Pan J, et al., Blood 2009;114:2802-2811) y conjugación con albúmina (Schulte S., Thromb. Res. 2008;122 Suppl 4:S14-9). La pegilación representa un enfoque para reducir la depuración, sin embargo, el efecto de la modificación in vivo es actualmente desconocido. El resultado de la pegilación directa de FVIII in vivo es actualmente desconocido, aunque el FVIII formulado con liposomas pegilados se ha estudiado clínicamente y mostró un efecto de modesto a ningún efecto sobre los episodios hemorrágicos (Spira J, et al., Blood 2006;108:3668-3673, Spira J, et al., Thromb. Haemost. 2008 Sep;100(3):429-34).
El presente enfoque para prolongar la semivida de FVIII fue fusionar recombinantemente FVIII con el dominio Fc de IgG1. Fc se une con el receptor que existe de forma natural, FcRn, cuya función normal es la protección de IgG de la degradación. Los resultados descritos en el presente documento representan la caracterización inicial de la farmacocinética y la eficacia de rFVIIIFc en comparación con un producto de rFVIII en ratones con hemofilia A y perros con hemofilia A. En ambas especies, la semivida de rFVIIIFc fue aproximadamente el doble que la de rFVIII cuando se midió por actividad de FVIII o ELISA (perros solo). Estos datos también se correlacionaron bien con los resultados de WBCT de ambos modelos animales, es decir, la duración del efecto de rFVIIIFc sobre WBCT fue aproximadamente el doble de larga en comparación con ReFacto®. En perros, la Cmáx y la depuración fueron similares para rFVIIIFc y ReFacto®, pero el ABC y el volumen de distribución en estado estacionario fueron aproximadamente 1,5 veces y 2 veces mayores para rFVIIIFc en comparación con ReFacto®, respectivamente. Los parámetros FC para ReFacto® en este modelo animal están de acuerdo con los valores informados en la bibliografía (Brinkhous K, et al., Sem. Thromb. Haemost. 2002;28:269-272).
Si estos hallazgos se traducen en la misma prolongación de la semivida en seres humanos, esto podría representar un avance significativo en el tratamiento de pacientes con hemofilia A.
Referencias adicionales
Berkner K., Methods Enzymol. 1993;222:450-477.
Bitonti AJ, and Dumont JA., Adv. Drug Del. Rev. 2006;58:1106-1118.
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Manco-Johnson, M., Haemophilia 2007;13 Suppl;2: 4-9.
Mannucci, PM, and Tuddenham, EGD., N. Engl. J. Med. 2001 ;344:1773-1779.
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Rodriguez-Merchan, EC., Semin. Thromb. Hemost. 2003;29:87-96.
Srour MA, et al., Ann. Hematol. 2008; 87:107-12.
Ejemplo 2
El objetivo del estudio era determinar la farmacocinética y la farmacodinámica de rFVIIIFc y BDD-rFVIII (Xyntha®) en macacos cangrejeros después de una dosis intravenosa única.
Materiales y métodos
rFVIIIFc (Biogen Idec), suministrado como un líquido congelado a una concentración de 1,2 mg/ml, y 9882 UI/ml. La actividad específica es 8235 UI/mg. El almacenamiento fue a -70 °C. Se diluyó antes de la inyección.
Nombre: Xyntha (Novis Pharmaceuticals), suministrado como un polvo liofilizado que se reconstituyó según las instrucciones del fabricante para producir una disolución con una concentración nominal de 525 UI/ml. El almacenamiento fue según las recomendaciones del fabricante.
Animales
Se usaron macacos cangrejeros de la colonia del New Iberia Research Center (NIRC), y el estudio (estudio de NIRC N.° 8733-0903) se realizó con un protocolo autorizado por IACUC de NIRC (ApS 2008-8733-058) en NIRC en New Iberia, LA.
Se usó en el estudio seis macacos cangrejeros no sometidos previamente a experimentación (tres machos, tres hembras) que se determinó que gozaban de buena salud.
El estudio se realizó en cumplimiento del protocolo y los procedimientos normalizados de trabajo de UL Lafayette-NIRC.
Diseño del estudio
Se administró rFVIIIFc por vía intravenosa en 125 UI/kg a cada uno de seis monos (tres machos, tres hembras). Se administró Xyntha (BDD-rFVIII) por vía intravenosa a los mismos animales en 125 UI/kg en un diseño de grupos cruzados. Los animales del grupo 1 (n = 3) recibieron Xyntha en el día 0 y rFVIIIFc en el día 3, mientras que los animales del grupo 2 (n = 3) recibieron rFVIIIFc en el día 0, seguido por Xyntha en el día 4. El día de más entre las dosis para el grupo 2 fue para garantizar que el rFVIIIFc tuviera tiempo suficiente para disminuir por debajo de los niveles basales proyectados. Se recogió sangre para el plasma en un volumen de un décimo de 3,2 % de citrato de sodio de cada animal antes de la administración y después de la administración 0,25, 4, 12, 24, 36, 48 y 72 h para la medición de rFVIIIFc o Xyntha por ELISA y un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII.
ELISA para medir rFVIIIFc y FVIII en plasma
Método de medición de rFVIIIFc en plasma de mono
Este enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) se diseña para cuantificar rFVIIIFc en plasma de mono. En este método de ELISA, se diluye anticuerpo anti-IgG-(H+L) humano de cabra (absorbido por el mono) de Bethyl Laboratories (Cat N.° A80-319A) en tampón de recubrimiento y se inmoviliza sobre una placa de microtitulación de muestras de 96 pocillos. Se aspira la placa, y todos los sitios sin adsorber se bloquean con la adición de tampón de bloqueo (3 % de BSA/1xTris) durante aproximadamente 2 horas a 37 °C. Se diluye 1:20 las muestras de plasma con tampón de dilución de muestra de alto calcio (3 % de leche desnatada en polvo/TBST con CaCl2 30 mM) y se dispensan sobre la placa de muestras. Se incuban las placas durante aproximadamente 2 horas a 37 °C. La placa se lava posteriormente y se añade anticuerpo anti-factor VIII (dominio A1) de dominio B delecionado (a.BDDA1) de ratón de Green Mountain Antibodies (Cat N.° GMA-8002) a la placa y se incuba durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. Después de lavar la placa, se añade anticuerpo anti-IgG2a de ratón de cabra conjugado con HRP de Southern Biotech (Cat N.° 1080-05) a la placa y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lava otra vez y se añade una disolución de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (TMB) y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene mediante la adición de una disolución de parada no ácida. El color se desarrolla en proporción a la cantidad de rFVIIIFc en la muestra. Las placas se leen en un lector de placas de absorbancia usando una única longitud de onda de detección, 650 nm. Las concentraciones de rFVIIIFc se determinan en una curva patrón obtenida representando la densidad óptica (DO) frente a la concentración usando un programa de ajuste a curva logística de cuatro parámetros. El intervalo de la curva de calibración de este método es 0,400 ng/ml - 51,2 ng/ml en 5 % de plasma de mono (8,00 ng/ml - 1024 ng/ml en 100 % de plasma de mono). Se puede incluir un calibrador fuera del intervalo considerado del ensayo en 0,200 ng/ml en 5 % de plasma de mono para que sirva de punto de anclaje para facilitar el ajuste a la curva. El punto de anclaje se elimina o se retiene basándose en el mejor ajuste de la curva (es decir, el mayor número de patrones leídos dentro de la exactitud definida, % de RE).
Método de medición de FVIII en plasma de mono
Este enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) se diseña para cuantificar FVIII en plasma de mono. En este método de ELISA, se diluye anticuerpo contra FVIII aBDDAI de ratón de Green Mountain Antibodies (Cat N.° GMA-8002) en tampón de recubrimiento y se inmoviliza sobre una placa de microtitulación de muestras de 96 pocillos. La placa se aspira, y se bloquean todos los sitios no adsorbidos con la adición de tampón de bloqueo (3 % de BST/1xTris) durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. Se diluye 1:20 las muestras de plasma con tampón de dilución de muestra de alto calcio (tampón de bloqueo con CaCl2 100 mM) y se dispensan sobre la placa de muestras. Las placas se incuban durante aproximadamente 2 horas a 37 °C. Después de lavar la placa, se diluye adicionalmente un anticuerpo de detección del kit de Affinity Biologicals, un anticuerpo policlonal marcado con HRP (Cat N.° F8C-EIA-D), en TBS/0,05 % de Tween 20, y se añade a la placa y se incuba durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava otra vez y se añade una disolución de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (TMB) y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene mediante la adición de disolución de parada ácida. El color se desarrolla en proporción a la cantidad de FVIIIFc en la muestra. Las placas se leen en un lector de placas de absorbancia usando una única longitud de onda de detección, 450 nm. Las concentraciones de FVIII se determinan en una curva patrón obtenida representando la densidad óptica (DO) frente a la concentración usando un programa de ajuste a curva logística de cuatro parámetros. El intervalo de la curva de calibración de este método es 0,625 ng/ml - 20 ng/ml en 5 % de plasma de mono (12,5 ng/ml - 400 ng/ml en 100 % de plasma de mono). Se pueden incluir dos calibradores fuera del intervalo considerado del ensayo en 0,313 y 0,156 ng/ml en 5 % de plasma de mono para servir de puntos de anclaje para facilitar el ajuste a la curva. Los puntos de anclaje se pueden eliminar 0 retener basándose en el mejor ajuste de la curva (es decir, el mayor número de patrones leídos dentro de la exactitud definida, % de RE).
Ensayo cromogénico específico de FVIII
Se estimó la actividad de FVIII en muestras de plasma de macaco cangrejero basándose en la dosis administrada, y luego se diluyeron hasta aproximadamente 0,25 - 1 UI/ml en plasma humano de FVIII reducido (Diagnostica Stago). Las muestras se analizaron en un Sysmex CA1500 (Siemens Diagnostic Healthcare) usando un kit cromogénico de FVIII (Siemens). En este ensayo cromogénico, el rFVIIIFc en las muestras de plasma se activa por trombina. El factor VIII activado (FVIIIa) acelera entonces la conversión del factor X (FX) en el factor Xa (FXa) en presencia de factor IX activado (FIXa), fosfolípidos (PL) e iones calcio. La actividad de FXa se evalúa por hidrólisis de un sustrato de pnitroanilida específico para FXa. La tasa inicial de liberación de p-nitroanilina (pNA) medida a 405 nm es proporcional a la actividad de FXa, y así a la actividad de FVIII en la muestra. El límite de cuantificación de la actividad de FVIII debido a rFVIIIFc en este ensayo es ~ 0,3 UI/ml. El ensayo puede medir la actividad total de FVIII hasta un límite inferior de aproximadamente 0,06 UI/ml con una exactitud de ± 20 %. La actividad calculada de la muestra antes de la administración para animales individuales se restó del valor en cada momento de tiempo para generar las curvas para FD (actividad de FVIII frente al tiempo).
Se generó una curva patrón a partir del concentrado de FVIII del 7° patrón internacional de NIBSC diluido hasta 1 1 UI/ml en plasma deficiente en FVIII humano. Las curvas patrón se diluyeron sucesivamente en el instrumento de Sysmex para dar concentraciones de 0,15, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0053 y 0,0026 UI/ml. Puesto que el instrumento diluye todas las muestras 1:10 internamente, las concentraciones del patrón de FVIII corresponden a concentraciones plasmáticas de 1,5 - 0,026 UI/ml, que es el intervalo de actividades de FVIII que se puede medir.
Análisis FC
Se evaluó los perfiles de concentración-tiempo usando el módulo de análisis no compartimental en el programa de software WinNonlin (versión 5.2, Pharsight Corporation, Mountain View, CA).
RESULTADOS
Se midió la concentración de rFVIIIFc en plasma de mono usando un formato de ELISA de tipo sandwich que midió tanto las porciones de FVIII como de Fc de la molécula y los datos se informan en la Tabla 7. Todas las muestras previas a la administración estuvieron por debajo del límite de cuantificación. La Figura 7 ilustra las concentraciones plasmáticas medias de rFVIIIFc y Xyntha por grupo con el tiempo y las curvas de concentración plasmática individual frente al tiempo se muestran en la Figura 8. Un resumen de los parámetros FC para rFVIIIFc y Xyntha se muestra en las Tablas 9 y 10, respectivamente. La t1/2 media para rFVIIIFc fue 11,9 ± 1,7 h (intervalo 9,3 a 14,1 h) y para Xyntha la eliminación media t1/2 fue 12,7 ± 4,4 h (intervalo 9,2 a 19,9 h).
Se midió la actividad de FVIII usando un ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII y los datos se informan en la Tabla 8. Se restó la actividad previa a la administración debida a FVIII endógeno de todas las muestras. Se muestra un gráfico de los datos medios por grupo en la Figura 9 y las curvas de concentración plasmática individual frente al tiempo se muestran en la Figura 10. Un resumen de los parámetros FC se informa para rFVIIIFc y Xyntha en las Tablas 9 y 10, respectivamente. La t1/2 de eliminación media fue 16,1 ± 6,9 h (intervalo 11,6 a 29,4 h) para rFVIIIFc y 12,5 ± 1,7 h (intervalo 10,4 a 14,3 h) para Xyntha.
Discusión y conclusiones
Las semividas de eliminación fueron similares para rFVIIIFc y Xyntha después de una dosis intravenosa única de 125 UI/kg, independientemente de si el producto experimental se midió por ELISA o un ensayo de actividad cromogénica.
Ejemplo 3
Será un estudio de fase I/IIa, sin ocultación, de grupos cruzados, de aumento de dosis, multicéntrico y el primero en el ser humano diseñado para evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la farmacocinética de una dosis única de rFVIIIFc en sujetos con hemofilia A grave (definida como <1 UI/dl [1 %] de factor VIII endógeno [FVIII]). Se reclutará un total de aproximadamente 12 pacientes previamente tratados y se administrará rFVIIIFc en 25 o 65 UI/kg. Después de la selección (programada 28 días antes de la primera administración de Advate® [rFVIII], el agente comparador de referencia) y un mínimo de 4 días (96 horas) que transcurren sin tratamiento con FVIII antes de la primera inyección, aproximadamente 6 sujetos recibirán un dosis única de 25 UI/kg de Advate® seguido por un perfil farmacocinético (FC) de 3 días (72 horas), luego se cruzan y reciben una dosis única sin ocultación de 25 UI/kg de rFVIIIFc para un perfil FC de 7 días (168 horas). Los 3 primeros sujetos serán administrados sucesivamente. Para los primeros (3) sujetos administrados con 25 UI/kg de rFVIIIFc, cada sujeto se someterá a una evaluación de inhibidor a los 14 días (336 horas) después de la inyección de rFVIIIFc. La administración del siguiente sujeto (para los tres primeros sujetos solo) ocurrirá una vez se haya completado la prueba del inhibidor. Después de que el 3° sujeto haya completado la evaluación de inhibidor de 14 días, los tres sujetos restantes en 25 UI/kg y los seis sujetos en 65 UI/kg empezarán el reclutamiento secuencialmente separados al menos 1 día en cada grupo de dosis.
Una semana después de que el último sujeto reciba la dosis de 25 UI/kg de rFVIIIFc, se reclutará aproximadamente 6 sujetos únicos para la cohorte de 65 UI/kg. Cada sujeto en la cohorte de 65 UI/kg recibirá una dosis única de 65 UI/kg de Advate®, seguido por un perfil FC de 4 días (96 horas), luego se cruzarán y recibirán una dosis única sin ocultación de 65 UI/kg de rFVIIIFc para un perfil de 10 días (240 horas). Si ocurre un episodio hemorrágico antes de la primera inyección de rFVIIIFc en cualquier cohorte, se debe usar el producto de FVIII previo al estudio del sujeto para el tratamiento y luego debe pasar un intervalo de al menos 4 días antes de recibir la primera inyección de rFVIIIFc para el perfil FC.
Todos los sujetos serán seguidos durante un periodo de evaluación para seguridad de 14 días (336 horas) y 28 días después de la administración de rFVIIIFc de 25 UI/kg o 65 UI/kg para seguridad. Todos los sujetos serán sometidos a muestreos farmacocinéticos antes y después de la administración, junto con muestras de sangre para el análisis de la actividad de FVIII en los momentos de tiempo designados.
Ejemplo 4
Actividad en el complejo de Xasa
Para investigar la unión de las proteínas FVIII (rFVIII BDD y rFVIIIFc) con FIXa, y medir la capacidad de estas proteínas para activar FX, se realizaron estudios cinéticos que examinaban estas interacciones en el contexto del complejo de Xasa. Este ensayo implicó la formación del complejo de Xasa con FIX activado y rFVIII BDD activado o proteína rFVIIIFc sobre una superficie de fosfolípido en presencia de calcio, y el seguimiento de la conversión de FX en FXa como se mide por escisión de un sustrato cromogénico o fluorogénico.
Brevemente, FVIII se activa en primer lugar con a-trombina durante 5 min, luego se mezcla con FIXa en presencia de Ca2+, y vesículas sintéticas de fosfolípido (25 % de fosfatidilserina (PS)/75 % de fosfatidilcolina (PC)) o plaquetas. En las condiciones descritas a continuación, FVIIIa y FIXa interactúan en presencia de una superficie de fosfolípido e iones calcio para formar un complejo activo de Xasa que media en la conversión de FX en FXa mediante el procesamiento proteolítico. A su vez, FXa escinde un sustrato cromogénico o fluorogénico específico de FXa. El sustrato escindido es cromogénico y, por lo tanto, la cantidad de sustrato escindido en una disolución es indicativa de la cantidad de FXa generado. Esto se cuantifica midiendo la absorbancia de la disolución a 405 nm.
A. Activación del factor X
Se estudió la capacidad de rFVIII BDD y rFVIIIFc para activar FX en el contexto del complejo de Xasa como se ha descrito anteriormente. Se incubó proteínas FVIII activadas por trombina con FIXa y fosfolípidos en presencia de calcio, luego se añadieron a diferentes concentraciones de FX en presencia de un sustrato específico de FX y se determinó las velocidades de generación de FXa (Figura 11).
Basándose en estos datos, se calcularon Km y Vmáx para las diferentes proteínas FVIII en el contexto del complejo de Xasa (Chang 1997) (Tabla 11). Los datos se expresan como la media de seis análisis (3 experimentos que contienen series duplicadas) ± la desviación estándar correspondiente. Basándose en estos datos, se encontró que estas proteínas (rFVIII BDD y rFVIIIFc) tenían valores comparables de Km y Vmáx, dentro de la variación del ensayo. Por lo tanto, el complejo de Xasa formado con rFVIIIFc se comporta similarmente al complejo de Xasa formado con el producto autorizado rFVIII BDD (ReFacto) con respecto a las interacciones con fosfolípidos y la capacidad para activar FX. Obsérvese que estos datos comparables también demuestran que rFVIIIFc se activa hasta un grado comparable como rFVIII BDD después de una corta incubación con trombina.
B. Interacción con FIXa
La interacción entre rFVIII BDD y rFVIIIFc con FIXa también se examinó en el contexto del complejo de Xasa. Se ensambló el complejo de Xasa como antes, usando una cantidad fija de FX y niveles variables de FIXa, y se determinó las velocidades de generación de FXa (Figura 12). A partir de estos datos, se determinó el valor de Kd para el complejo de Xasa formado con ambas de las proteínas FVIII con respecto FIXa (Chang 1997). Los datos se expresan como la media de seis análisis (3 experimentos que contienen series duplicadas) ± la desviación estándar correspondiente (Tabla 12). Se encontró que ambas proteínas tenían valores similares de Kd y Vmáx, que indica que rFVIIIFc tiene interacciones comparables con FIXa como el producto autorizado de rFVIII BDD.
Ejemplo 5
Datos farmacocinéticos intermedios del ensayo clínico de fase I/IIa tratados en el Ejemplo 3 mostraron los siguientes resultados para FVIIIFc. FVIIIFc tuvo aproximadamente un aumento del 50 % en la exposición sistémica (ABCinf), aproximadamente el 50 % de reducción en la depuración (Cl) y aproximadamente el 50-70 % de aumento en la semivida de eliminación y MRT en comparación con ADVATE (rFVIII de longitud completa). Además, FVIIIFc mostró valores elevados de C168, TBLP1, TBLP3 y TBLP5 en comparación con ADVATE.
ABCinf Área bajo la curva de la concentración-tiempo desde cero hasta el infinito
Beta HL Semivida de la fase de eliminación; también denominada t1/2p
C168 Actividad estimada de FVIIIFc por encima del nivel basal aproximadamente 168 h después de la administración
Cl Depuración
MRT Tiempo de residencia medio
TBLP1 Tiempo predicho por el modelo después de la administración cuando la actividad de FVIIIFc ha disminuido hasta aproximadamente 1 Ul/dl por encima del nivel basal
TBLP3 Tiempo predicho por el modelo después de la administración cuando la actividad de FVIIIFc ha disminuido hasta aproximadamente 3 Ul/dl por encima del nivel basal
TBLP5 Tiempo predicho por el modelo después de la administración cuando la actividad de FVIIIFc ha disminuido hasta aproximadamente 5 Ul/dl por encima del nivel basal
Ejemplo 6
Se ha creado una proteína de fusión recombinante de factor VIII de dominio B delecionado-Fc (rFVIIIFc) como un enfoque para prolongar la semivida de FVIII. Se comparó la farmacocinética (FC) de rFVIIIFc con rFVIII en ratones con hemofilia A. Los presentes inventores encontraron que la semivida terminal fue el doble de larga para rFVIIIFc en comparación con rFVIII. Para confirmar que el mecanismo subyacente para la prolongación de la semivida fue debido a la protección de rFVIIIFc por FcRn, se evaluó la FC en ratones inactivados en FcRn y transgénicos para FcRn humano. Se administró una dosis intravenosa única (125 Ul/kg) y se midió la concentración plasmática usando un ensayo de actividad cromogénica. La Cmáx fue similar entre rFVIIIFc y rFVIII (XYNTHA®) en ambas razas de ratón. Sin embargo, mientras que la semivida para rFVIIIFc fue comparable a la de rFVIII en los inactivados en FcRn, la semivida para rFVIIIFc se prolongó hasta aproximadamente el doble que para rFVIII en los ratones transgénicos para hFcRn. Estos resultados confirman que FcRn media en o es responsable de la prolongada semivida de rFVIIIFc en comparación con rFVIII. Puesto que se ha mostrado que la hemostasia en la sangre completa medida por tromboelastometría de rotación (ROTEM) se correlaciona con la eficacia de los factores de coagulación en modelos de hemorragia de ratones con hemofilia, así como en aplicaciones clínicas, los presentes inventores buscaron evaluar la eficacia ex vivo de rFVIIIFc en los ratones con hemofilia A usando ROTEM. Se administró a los ratones con hemofilia A una dosis intravenosa única de 50 Ul/kg de rFVIIIFc, XYNTHA® (FVIII) o ADVATE® (FVIII). 5 minutos después de la administración, la formación de coágulos fue similar con respecto al tiempo de coagulación (CT), el tiempo de formación de coágulos (CFT) y el ángulo a. Sin embargo, rFVIIIFc mostró un CT significativamente mejorado 72 y 96 h después de la administración, y CFT y el ángulo a también mejoraron a las 96 h en comparación con tanto XYNTHA® (FVIII) como ADVATE® (FVIII), de acuerdo con la FC prolongada de rFVIIIFc. Por lo tanto, la construcción de una fusión con Fc de FVIII produce una molécula con un mecanismo de acción definido que tiene una semivida elevada y el potencial de proporcionar protección prolongada del sangrado.
Ejemplo 7
Este ejemplo presenta los resultados del análisis final para la actividad de FVIII de 16 pacientes tratados con 25 y 65 Ul/kg de productos de FVIII. Véanse los Ejemplos 3 y 5.
En este ejemplo, rFVIIIFc es una proteína de fusión recombinante que comprende una única molécula de FVIII recombinante de dominio B delecionado humano (rFVIII-BDD) fusionada con el dominio Fc dimérico de la IgG1 humana, sin secuencia conectora intermedia. Esta construcción de proteína también se denomina en el presente documento proteína híbrida heterodimérica rFVIIIFc, proteína de fusión de FVIIIFc-Fc monomérico, híbrido de FVIIIFc monomérico, híbrido de FVIIIIFc monomérico y monómero-dímero de FVIIIFc. Véase el Ejemplo 1, la Fig. 1 y la Tabla 2A.
Los estudios preclínicos con rFVIIIFc han mostrado una prolongación de aproximadamente el doble de la semivida de la actividad de FVIII en comparación con productos de rFVIII comercialmente disponibles. El fundamento de este estudio era evaluar la seguridad y la tolerabilidad de una dosis única de rFVIIIFc en una formulación líquida congelada y proporcionar datos sobre la FC en sujetos con hemofilia A grave. Para este estudio, estuvieron disponibles 16 sujetos evaluables para la evaluación FC. Se infundió una administración única de dos dosis de tanto rFVIIIFc como Advate en dosis nominales de 25 (n=6) y 65 UI/kg de peso corporal (n=10) por vía intravenosa durante aproximadamente 10 minutos. Se obtuvieron muestras de sangre para las evaluaciones FC del plasma antes de la infusión, así como hasta 10 días después de la administración. La FC de la actividad de FVIII para tanto Advate como rFVIIIFc se caracterizó en este estudio usando un método dependiente del modelo.
OBJETIVOS
El objetivo principal de este estudio fue evaluar la seguridad y la tolerabilidad de la administración única de dos dosis de rFVIIIFc (25 y 65 UI/kg) en pacientes previamente tratados (PTP) de 12 años de edad y mayores con hemofilia A grave.
Los objetivos secundarios fueron determinar los parámetros de farmacocinética (FC) determinados por la actividad farmacodinámica (FD) de FVIII con el tiempo después de una administración única de 25 o 65 UI/kg de rFVIIIFc en comparación con Advate en los ensayos de coagulación de una etapa y cromogénicos.
Diseño del estudio (véase el Ejemplo 3)
Se recogieron muestras de sangre para las evaluaciones FC de la actividad de FVIII en la visita de selección (28 días antes de la administración de Advate); en el día 0 (inyección de Advate) antes de la inyección y 10 y 30 minutos y 1, 3, 6 y 9 horas después de la inyección; en el día 124 horas después de la inyección de Advate; en el día 248 horas después de la inyección de Advate; en el día 372 horas después de la inyección de Advate; y en el día 496 horas después de la inyección de alta dosis de Advate (cohorte B solo).
Se recogieron muestras de sangre para las evaluaciones FC de la actividad de FVIII el día de la inyección de rFVIIIFc justo antes de la administración de rFVIIIFc, 10 y 30 minutos y 1, 3, 6 y 9 horas después de la inyección de rFVIIIFc; en el día 124 horas después de la inyección de rFVIIIFc; en los días 2 a 548, 72, 96 y 120 horas después de la inyección de rFVIIIFc; en el día 7168 horas después de la inyección de rFVIIIFc; en los días 8, 9 y 10192, 216 y 240 horas después de la inyección de alta dosis de rFVIIIFc (cohorte B solo). La actividad de FVIII también se midió en la visita final del estudio (28 días después de la inyección de rFVIIIFc) 672 horas después de la inyección de rFVIIIFc.
Modelado farmacocinético y cálculos
Abreviaturas
TBLP1 Tiempo predicho por el modelo después de la administración cuando la actividad de FVIII ha disminuido hasta aproximadamente 1 UI/dl por encima del nivel basal
TBLP3 Tiempo predicho por el modelo después de la administración cuando la actividad de FVIII ha disminuido hasta aproximadamente 3 UI/dl por encima del nivel basal
KV_M = Cmáx_M/Dosis real (UI/kg)
KV_OB = Cmáx_OB/Dosis real (UI/kg)
IVR_M = 100 x Cmáx_M x Volumen de plasma (dl) / Dosis total en UI;
donde el volumen de plasma en ml = (23,7 x Altura en cm) (9,0 x Peso en kg) - 1709.
IVR_OB = 100 x Cmáx_OB x Volumen de plasma (dl) / Dosis total en UI;
donde el volumen de plasma en ml = (23,7 x Altura en cm) (9,0 x Peso en kg) - 1709.
RESULTADOS
Figura 13. Perfiles de actividad de FVIII media observada por grupo (+EE) frente al tiempo, clasificados por nivel de dosis, agrupados por compuesto (ensayo de una etapa, 25 UI/kg (A) y 65 UI/kg (B)) y (ensayo cromogénico, 25 UI/kg (C) y 65 UI/kg (D)).
Figura 14. Perfiles de actividad de FVIII media observada por grupo (+EE) frente al tiempo, clasificados por nivel de dosis y compuesto (ensayo de una etapa; A) (ensayo cromogénico; B).
Farmacocinética de dosis única (ensayo de una etapa)
La actividad de FVIII observada aumentó bruscamente después de la infusión IV corta de o Advate o rFVIIIFc, con valores medios de Cmáx (±DE) predichos por el modelo de 56,6 ± 4,74 y 121 ± 28,2 UI/dl para Advate y 55,6 ± 8,18 y 108 ± 16,9 UI/dl para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Todos los pacientes tratados con Advate y rFVIIIFc tuvieron aumentos relacionados con la dosis en la actividad de FVIII. Los aumentos observados en tanto Cmáx como ABC inf fueron ligeramente inferiores a proporcionales a la dosis durante el intervalo de dosis evaluado.
Después de la finalización de la infusión, la disminución de la actividad de FVIII observada presentó características de disminución monoexponencial hasta que se alcanzó el nivel basal. La tasa de disminución en la actividad de FVIII fue más lenta para rFVIIIFc que para Advate con valores medios de la semivida de eliminación (±DE) predichos por el modelo de 11,9 ± 2,98 y 10,4 ± 3,03 h para Advate y 18,0 ± 3,88 y 18,4 ± 6,99 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Pareció que los valores de semivida de eliminación eran independientes de la dosis con respecto al intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
La exposición total sistémica de FVIII (evaluada por ABC inf) fue ~ 48 % y 61 % mayor después de la administración de rFVIIIFc que de Advate en niveles de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios de ABC inf (±DE) predichos por el modelo fueron 974 ± 259 y 1810 ± 606 h*UI/dl para Advate y 1440 ± 316 y 2910 ± 1320 h*UI/dl para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Similar a la semivida de eliminación, el MRT fue prolongado para rFVIIIFc con respecto a Advate. Los valores medios de MRT (±DE) predichos por el modelo fueron 17,1 ± 4,29 y 14,9 ± 4,38 h para Advate y 25,9 ± 5,60 y 26,5 ± 10,1 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Pareció que los valores de MRT eran independientes de la dosis con respecto al intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
Además, se determinaron los valores de los parámetros FC principales para CL y V. Los valores de CL para rFVIIIFc solo representaron ~ 66 % de los observados para Advate en dosis equivalentes. Los valores medios de CL (±DE) predichos por el modelo CL fueron 2,70 ± 0,729 y 4,08 ± 1,69 ml/h/kg para Advate y 1,80 ± 0,409 y 2,69 ± 1,25 ml/h/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de V fueron comparables entre Advate y rFVIIIFc, con valores medios de V (±DE) predichos por el modelo de 43,9 ± 4,27 y 56,1 ± 13,4 ml/kg para Advate y 45,3 ± 7,23 y 61,6 ± 10,6 ml/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Se observaron ligeros aumentos en los valores medios de CL y V al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc; sin embargo, el aumento en las desviaciones estándar en la dosis de 65 UI/kg acoplado con niveles limitados de dosis frustró una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros. Por ejemplo, el % de CV del valor de CL medio geométrico para el grupo de tratamiento con rFVIIIFc aumentó del 23,0 % (25 UI/kg) al 48,6 % (65 UI/kg).
Además de los parámetros principales de FC, se determinaron los parámetros FC secundarios (por ejemplo, valores de K, IVR, etc.) para evaluar la duración del efecto de FVIII. La evidencia de diferencia FC también se observó con rFVIIIFc, que mostró un aumento de los valores de TBLP y TBLP3 en comparación con Advate en dosis equivalentes. Pareció que los valores de IVR y de K para Advate y rFVIIIFc eran comparables. Se observó un ligero aumento en los valores de TBLP1 y TBLP3 al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc. A diferencia, se observó una ligera disminución en los valores medios de IVR y de K al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc. Como se indicó previamente, una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros se frustra por niveles de dosis limitados.
TBLP1 media (±DE) observada fue 2,88 ± 0,733 y 2,93 ± 0,848 UI/dl por UI/kg para Advate y 4,28 ± 0,873 y 5,16 ± 2,02 UI/dl por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. TBLP3 media (±DE) observada fue 2,06 ± 0,527 y 2,26 ± 0,666 UI/dl por UI/kg para Advate y 3,09 ± 0,623 y 3,93 ± 1,59 UI/dl por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Los valores medios de IVR y de K calculados usando valores observados de Cmáx (restados del nivel basal y el fármaco residual dentro del modelo) fueron, en general, superiores a los valores determinados usando valores de Cmáx predichos por el modelo; de acuerdo con una ligera subestimación de la actividad pico observada usando el modelo de un compartimento. Los valores medios de K (±DE) observados fueron 2,57 ± 0,198 y 2,13 ± 0,598 UI/dl por UI/kg para Advate y 2,46 ± 0,330 y 1,85 ± 0,332 UI/dl por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios de IVR (±DE) observados fueron 94,1 ± 15,6 y 85,8 ± 16,5 % para Advate y 89,5 ± 11,9 y 74,8 ± 6,72 % para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Farmacocinética de dosis única (ensayo cromogénico)
La actividad de FVIII observada aumentó bruscamente después de la infusión IV corta de o Advate o rFVIIIFc, con valores medios de Cmáx (±DE) predichos por el modelo de 70,2 ± 9,60 y 157 ± 38,6 UI/dl para Advate y 70,3 ± 10,0 y 158 ± 34,7 UI/dl para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Todos los pacientes tratados con Advate y rFVIIIFc tuvieron aumentos relacionados con la dosis en la actividad de FVIII. Los aumentos observados en tanto Cmáx como ABCInf fueron ligeramente inferiores a proporcionales a la dosis durante el intervalo de dosis evaluado.
Después de la finalización de la infusión, la disminución de la actividad de FVIII observada presentó características de disminución monoexponencial hasta que se alcanzó el nivel basal. La tasa de disminución en la actividad de FVIII fue más lenta para rFVIIIFc que para Advate con valores medios de la semivida de eliminación (±DE) predichos por el modelo de 10,7 ± 1,98 y 10,3 ± 3,27 h para Advate y 16,2 ± 2,92 y 19,0 ± 7,94 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Pareció que los valores de semivida de eliminación eran independientes de la dosis con respecto al intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
La exposición total sistémica de FVIII (evaluada por ABC inf) fue ~ 53 % y 84 % mayor después de la administración de rFVIIIFc que de Advate en niveles de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios de ABC inf (±DE) predichos por el modelo fueron 1080 ± 236 y 2320 ± 784 h*UI/dl para Advate y 1650 ± 408 y 4280 ± 1860 h*UI/dl para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Similar a la semivida de eliminación, el MRT fue prolongado para rFVIIIFc con respecto a Advate. Los valores medios de MRT (±DE) predichos por el modelo fueron 15,3 ± 2,86 y 14,8 ± 4,72 h para Advate y 23,4 ± 4,22 y 27,3 ± 11,4 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Pareció que los valores de MRT eran independientes de la dosis con respecto al intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
Además, se determinaron los valores de los parámetros FC principales para CL y V. Los valores de CL para rFVIIIFc solo representaron ~ 58-66 % de los observados para Advate en dosis equivalentes. Los valores de CL medios (±DE) predichos por el modelo CL fueron 2,39 ± 0,527 y 3,21 ± 1,40 ml/h/kg para Advate y 1,57 ± 0,349 y 1,86 ± 0,970 ml/h/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de V fueron comparables entre Advate y rFVIIIFc con valores medios de V (±DE) predichos por el modelo de 35,8 ± 5,52 y 43,6 ± 11,2 ml/kg para Advate y 35,9 ± 6,65 y 42,7 ± 8,91 ml/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Se observaron aumentos en los valores medios de CL y V al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc; sin embargo, el aumento en las desviaciones estándar a 65 UI/kg acoplado con niveles limitados de dosis frustró una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros.
Además de los parámetros FC principales, se determinaron los parámetros FC secundarios (por ejemplo, valores de K, IVR, etc.) para evaluar la duración del efecto de FVIII. La evidencia de diferencia FC también se observó con rFVIIIFc, que mostró un aumento de los valores de TBLP y TBLP3 en comparación con Advate en dosis equivalentes. Pareció que los valores de IVR y de K para Advate y rFVIIIFc eran comparables.
Se observó un ligero aumento en los valores de TBLP1 y TBLP3 al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc. A diferencia, se observó una ligera disminución en los valores medios de IVR y de K al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc. Como se indicó previamente, una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros se frustra por niveles de dosis limitados.
TBLP1 media (±DE) observada fue 2,70 ± 0,511 y 3,09 ± 0,978 Ul/dl por UI/kg para Advate y 4,06 ± 0,798 y 5,66 ± 2,38 Ul/dl por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. TBLP3 media (±DE) observada fue 1,98 ± 0,377 y 2,39 ± 0,718 Ul/dl por UI/kg para Advate y 3,04 ± 0,598 y 4,44 ± 1,84 Ul/dl por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Los valores medios de IVR y de K calculados usando valores observados de Cmáx (restados con el nivel basal y el fármaco residual dentro del modelo) fueron, en general, superiores a los valores determinados usando valores de Cmáx predichos por el modelo; de acuerdo con una ligera subestimación de la actividad pico observada usando el modelo de un compartimento. Los valores medios de K (±DE) observados fueron 3,08 ± 0,429 y 2,85 ± 0,721 Ul/dl por UI/kg para Advate y 3,12 ± 0,451 y 2,92 ± 0,985 Ul/dl por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios de IVR (±DE) observados fueron 112 ± 14,5 y 116 ± 26,9 % para Advate y 113 ± 16,3 y 117 ± 33,6 % para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
CONCLUSIONES
Todos los pacientes tratados con Advate y rFVIIIFc tuvieron aumentos relacionados con las dosis comparables en Cmáx y ABC inf durante el intervalo de administración evaluado. Se observaron, en general, niveles en plasma pico de la actividad de Advate y rFVIIIFc en la primera hora después de la finalización de la infusión y siguieron siendo detectables durante varios días después de la administración. Después de la finalización de la infusión, la disminución en la actividad de FVIII corregida basal presentó una disminución monoexponencial hasta que se alcanzó el nivel basal para ambos productos. Pareció que los valores de los parámetros para la semivida de eliminación y MRT eran independientes de la dosis durante el intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII. Se observaron ligeros aumentos en los valores medios de CL y de V al aumentar la dosis de Advate y rFVIIIFc; sin embargo, la elevada variabilidad interindividual a 65 UI/kg acoplada con niveles de dosis limitados frustró una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros.
La comparación de la FC de la actividad de rFVIIIFc y de Advate reveló un aumento aproximado del 48-61 % (ensayo de una etapa) o del 53-84 % (ensayo cromogénico) en la exposición sistémica, una reducción aproximada del 30-40 % en la depuración y un aumento aproximado del 50-80 % en tanto la semivida de eliminación como MRT para rFVIIIFc con respecto a Advate en dosis comparables. La evidencia de la diferencia FC también se observó con rFVIIIFc, que mostró valores elevados de TBLP1 y TBLP3 en comparación con Advate en dosis equivalentes. Pareció que los valores de IVR y de K para Advate y rFVIIIFc eran comparables.
Los parámetros FC obtenidos de los resultados de los ensayos cromogénicos estuvieron de acuerdo, en general, con los del ensayo de una etapa, excepto que el ensayo cromogénico dio una mayor estimación de los parámetros de exposición (por ejemplo, Cmáx, ABCinf, etc.).
Con las mejoras observadas en FC, rFVIIIFc puede proporcionar una protección prolongada del sangrado, lo que permite inyecciones menos frecuentes para individuos con hemofilia A.
Ejemplo 8
Basándose en los análisis FC intermedios del primer estudio en humanos de rFVIII:Fc (Ejemplo 3), se diseñó el estudio A-LONG. A-LONG es un evaluación multicéntrica sin ocultación de la seguridad, farmacocinética y eficacia de la fusión recombinante de factor VIII-Fc (FVIII:Fc) en la prevención y el tratamiento del sangrado en sujetos previamente tratados con hemofilia A grave (definida como <1 Ul/dl [<1 %] de FVIII endógeno).
Se reclutará a aproximadamente 106 sujetos en uno de los tres regímenes: un régimen de profilaxis personalizado (brazo 1), una pauta posológica semanal (brazo 2) y un régimen a voluntad (brazo 3).
Brazo 1: Régimen de profilaxis personalizado
El brazo 1 incluirá un grupo global y un subgrupo FC. Se reclutará a aproximadamente 66 sujetos. El régimen inicial será dos veces a la semana en 25 Ul/kg el primer día, seguido de 50 Ul/kg en el cuarto día de la semana. Los sujetos recibirán rFVIIIFc en este régimen de profilaxis semanal hasta que estén disponibles los resultados FC para rFVIIIFc. Basándose en estos resultados, se establecerá un régimen de profilaxis personalizado para cada individuo, en el que la dosis y el intervalo serán determinados para mantener un nivel valle del 1-3 % de actividad de FVIII. Cada sujeto recibirá entonces su régimen de profilaxis personalizado individualmente durante todo el estudio.
Se hará un seguimiento de los sujetos durante todo el estudio y se harán ajustes de las dosis e intervalos en curso. Los ajustes solo se harán cuando un sujeto sufra episodios hemorrágicos inaceptables definidos como >2 episodios hemorrágicos espontáneos durante un periodo consecutivo de dos meses. En este caso, el ajuste se dirigirá a los niveles valle del 3-5 %.
Brazo 2: Pauta posológica semanal
Se enrolará/aleatorizará a aproximadamente 20 sujetos y se someterán al perfil FC abreviado de rFVIIIFc del siguiente modo: Reposo farmacológico de al menos 96 horas; una dosis única de rFVIIIFc 65 Ul/kg; muestreo abreviado que empieza el día 0 de rFVIIIFc, que incluye preinyección y 10 (±2) minutos, 3 horas (± 15 minutos), 72 (± 2) horas [día 3] y 96 (± 2) horas [día 4] desde el comienzo de la inyección. Después del perfilado FC abreviado, a los sujetos se les administrará una dosis fija de 65 Ul/kg de rFVIIIFc cada 7 días.
Brazo 3: Régimen a voluntad
Se evaluará en el estudio un mínimo de 10 cirugías mayores en al menos 5 sujetos. La cirugía mayor se define como cualquier procedimiento quirúrgico (electivo o emergente) que implica anestesia general y/o ayuda respiratoria en el que la cavidad principal del cuerpo es penetrada y expuesta, o durante la que se produce una alteración sustancial de las funciones físicas o fisiológicas (por ejemplo, laparotomía, toracotomía, craneotomía, artroplastia y amputación de extremidades).
Para la profilaxis durante la cirugía, se tratará a los sujetos con 35 a 50 Ul/kg de rFVIIIFc cada 12 a 24 horas. Antes de la cirugía, el médico revisará el perfil FC de rFVIIIFc del sujeto y evaluará la pauta posológica de la sustitución de factor VIII requerida, en general, para el tipo de cirugía planeada y el estado clínico del sujeto. La recomendación de administración apropiada de rFVIIIFc en el periodo de tratamiento quirúrgico, que incluye cualquier tiempo de rehabilitación, tendrá en cuenta estos factores.
Los objetivos principales de este estudio son (a) evaluar la seguridad y la tolerabilidad de rFVIIIFc administrado como profilaxis, a voluntad y las pautas de tratamiento quirúrgico; y (b) evaluar la eficacia de rFVIIIFc administrado como profilaxis, a voluntad y las pautas de tratamiento quirúrgico. Los objetivos secundarios de este estudio son (a) caracterizar el perfil FC de rFVIIIFc y comparar la FC de FVIIIFc con el producto actualmente comercializado, ADVATE; (b) evaluar las respuestas individuales con FVIIIFc; y (c) evaluar el consumo de FVIIIFc.
Objetivos principales
• Evaluar la seguridad y la tolerabilidad de rFVIIIFc administrado como profilaxis, semanalmente, a voluntad y pautas de tratamiento quirúrgicas
• Evaluar la eficacia de rFVIIIFc administrado como profilaxis personalizada, a voluntad y pautas de tratamiento quirúrgicas
Objetivos secundarios
• Caracterizar el perfil FC de rFVIIIFc y comparar la FC de rFVIIIFc con el producto actualmente comercializado, Advate®
• Evaluar respuestas individuales con rFVIIIFc
• Caracterizar el intervalo de dosis y los programas requeridos para prevenir suficientemente el sangrado en un régimen de profilaxis; mantener la homeostasis en un ámbito quirúrgico; o tratar episodios hemorrágicos en un tratamiento semanal a voluntad, o ámbito de profilaxis
• Evaluar el consumo de rFVIIIFc (por ejemplo, consumo de rFVIIIFc anualizado total por sujeto)
Ejemplo 9
Evaluación clínica de ROTEM
En el estudio en el Ejemplo 8, además de la medición de la actividad plasmática de FVIII por el ensayo de una etapa de tiempo activado de tromboplastina parcial (aPTT), también se ha explorado la tromboelastometría rotacional de sangre completa (ROTEM) para evaluar la mejora en la hemostasia global por rFVIIIFc y Advate en 2 sujetos, en concreto, 1 en la cohorte de baja dosis y 1 en la cohorte de alta dosis.
Parece que rFVIIIFc y Advate son comparablemente activos en la formación de coágulos cuando se añaden a la sangre de sujetos antes del tratamiento con rFVIIIFc. El tiempo de coagulación (CT) fue lineal con respecto a la dosis de rFVIIIFc y Advate en el intervalo de aproximadamente del 1 % al 100 % del normal, y la respuesta a la dosis fue comparable entre rFVIIIFc y Advate en el mismo sujeto.
Después de la administración con Advate y posteriormente rFVIIIFc, se muestreó sangre completa citrada en diversos momentos de tiempo y se hizo un seguimiento de la formación de coágulos después de la recalcificación por ROTEM. A pesar del CT basal variable debido a niveles residuales de FVIII antes de la administración de Advate o rFVIIIFc, ambos productos corrigieron eficazmente el CT con niveles comparables 30 minutos después de la inyección. Además, la mejora en CT fue mejor sostenida a las 3 horas y después, después de la inyección de 25 UI/kg de rFVIIIFc con respecto a Advate en el sujeto administrado en esta dosis baja. Sin embargo, la mejora diferencial de rFVIIIFc frente a Advate fue mucho menos apreciable en la dosis de 65 UI/kg.
Tablas
Tabla 1: Secuencias de polinucleótidos
A. FVIIIFc de dominio B delecionado
(i) Secuencia de ADN de la cadena de FVIIIFc de dominio B delecionado (péptido señal de FVIII subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID NO:1, que codifica SEQ ID NO:2)
661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC
721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC
781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC
841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG
901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC
961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG
1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG
1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG
1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC
1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC
1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT
1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA
1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC
1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT
1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG
1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA
1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA
1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG
1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG
1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC
1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG
1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT
1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA
2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT
2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC
2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC
2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA
2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT
2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC
2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA
2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC
2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA
2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC
2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT
2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC
2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT
2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG
2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA
2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC
3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG
3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC
3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC
3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA
3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC
3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG A. FVIIIFc de dominio B delecionado
(i) Secuencia de ADN de la cadena de FVIIIFc de dominio B delecionado (péptido señal de FVIII subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID NO:1, que codifica SEQ ID NO:2)
3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT 3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA 3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG 3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG 4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC 4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG 4141 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT 4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG 4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA 4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA 4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT 4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG 4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT 4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT 4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT 4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC 4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC 4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC 4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA 4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC 4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT 5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCAGAAC 5101 TCCTGGGCGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT 5161 CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA 5221 AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG 5281 AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 5341 TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 5401 AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT 5461 CCCGGGATGA GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC 5521 CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA 5581 CGCCTCCCGT GTTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA 5641 AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 5701 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A
(ii) Secuencia de ADN de Fc (péptido señal de IgK de ratón subrayado) (SEQ ID NO:3, que codifica SEQ ID NO:4)
7981 ATGGA GACAGACACA 8041 CTCCTGCTAT GGGTACTGCT GCTCTGGGTT CCAGGTTCCA CTGGTGACAA AACTCACACA 8101 TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGAGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA 8161 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC 8221 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT 8281 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC 8341 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 8401 AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA 8461 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGC GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG 8521 ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 8581 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC 8641 CTCTACAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
8701 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCG 8761 GGTAAA
B. FVIIIFc de longitud completa
(i) Secuencia de ADN de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID NO:5, que codifica SEQ ID NO:6)
661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG 721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC 781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG 841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC 901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT 961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA 1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC 1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT 1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC 1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA 1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC 1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA 1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC 1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA 1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT 1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC 1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT 1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG 1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA 1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT 1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA 1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG 1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT 2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT 2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC 2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG 2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT 2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT 2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG 2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA 2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA 2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA 2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT 2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT 2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC 2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT 2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC 2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA 2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC 3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC 3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA 3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA 3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT 3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC 3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT 3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT 3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT 3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA B. FVIIIFc de longitud completa
(i) Secuencia de ADN de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID NO:5, que codifica SEQ ID NO:6)
3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG 3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC 3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC 37B1 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG 3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG 3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC 3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC 4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT 4001 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT 4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA 4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC 4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA 4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT 4301 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT 4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA 4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC 4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA 4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA 4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA 4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC 4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC 4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC 4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT 4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA 5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC 5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC 5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC 5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA 5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC 5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT 5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA 5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA 5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC 5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA 5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA 5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATO 5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG 5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA 5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA 5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG 6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA 6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT 6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC 6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA 6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC 6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG 6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG 6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA 6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT 6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG 6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA 6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT 6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG 6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC 6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA 6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC 6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC 7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG 7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA B. FVIIIFc de longitud completa
(i) Secuencia de ADN de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID NO:5, que codifica SEQ ID NO:6)
7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT 7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG 7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA 7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG 7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG 7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA 7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA 7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC 7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA 7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA 7741 GGACCTCTAC GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCAGAAC TCCTGGGCGG 7801 ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC 7861 TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG 7921 GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA 7981 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA 8041 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC 8101 CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA 8161 GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT 8221 CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 8281 GTTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 8341 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC 8401 GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A
(ii) Fc (misma secuencia que A (ii) (SEQ ID NO:3))1
C.
(i) Secuencia de ADN de Fc de la cadena pesada (HC)-Fc (sin conector entre HC y Fc) (péptido señal subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID NO:7, que codifica SEQ ID NO:8)
1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTGCC 61 ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG ACTATATGCA AAGTGATCTC 121 GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC 181 ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC 241 GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT 301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT 361 GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG ATGATCAGAC CAGTCAAAGG 421 GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG 481 AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT 541 GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA 601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT TTTTGCTGTA 661 TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT CCTTGATGCA GGATAGGGAT 721 GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT 781 CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC 841 ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT 901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATG 961 GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC ACCAACATGA TGGCATGGAA 1021 GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA 1081 GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT 1141 GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT 1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT AGTCCTCGCC 1261 CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG GCCCTCAGCG GATTGGTAGG 1321 AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT 1381 ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG B. FVIIIFc de longitud completa
(i) Secuencia de ADN de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal del FVIII subrayado. Re­ gión Fe en negrita) (SEQ ID NO:5, que codifica SEQ ID NO:6)
1441 TTGATTATAT TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT GAAGGATTTT 1561 CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG TGACTGTAGA AGATGGGCCA 1621 ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA 1681 GATCTAGCTT CAGGACTCAT TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA 1741 AGAGGAAACC AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC AGCTGGAGTG 1861 CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC ACAGCATCAA TGGCTATGTT 1921 TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC 1981 ATTGGAGCAC AGACTGACTT CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA 2041 ATGGTCTATG AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG GAACAGAGGC 2161 ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA CTGGTGATTA TTACGAGGAC 2221 AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAGAC 2281 AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCT CCAGAACTCC TGGGCGGACC GTCAGTCTTC 2341 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC 2401 GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 2461 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT 2521 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC 2581 AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG 2641 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGATGAGCT GACCAAGAAC 2701 CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 2761 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGTT GGACTCCGAC 2821 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC 2881 GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC 2941 TCCCTGTCTC CGGGTAAA
C.
(ii) Secuencia de ADN de la cadena pesada (HC)-Fc (conector de 5 aminoácidos entre HC y Fc) (péptido señal subrayado. Región Fc en negrita. El conector de 5 aminoácidos está en doble subrayado) (SEQ ID NO:9, que codifica SEQ ID NO:10)
1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTGCC 61 ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG ACTATATGCA AAGTGATCTC 121 GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC 181 ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC 241 GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT 301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT 361 GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG ATGATCAGAC CAGTCAAAGG 421 GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG 481 AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT 541 GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA 601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT TTTTGCTGTA 661 TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT CCTTGATGCA GGATAGGGAT 721 GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT 781 CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC 841 ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT 901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATG 961 GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC ACCAACATGA TGGCATGGAA 1021 GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA 1081 GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT 1141 GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT 1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT AGTCCTCGCC 1261 CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG GCCCTCAGCG GATTGGTAGG 1321 AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT C.
(ii) Secuencia de ADN de la cadena pesada (HC)-Fc (conector de 5 aminoácidos entre HC y Fc) (péptido señal subrayado. Región Fc en negrita. El conector de 5 aminoácidos está en doble subrayado) (SEQ ID NO:9, que codifica SEQ ID NO:10)
1381 ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG 1441 TTGATTATAT TTAAGAATCA AGCAAGCAGACCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTACCAAAAGGTG TAAAACATTT GAAGGATTTT 1561 CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG TGACTGTAGA AGATGGGCCA 1621 ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA 1681 GATCTAGCTT CAGGACTCAT TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA 1741 AGAGGAAACC AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATACAACGCTTTC TCCCCAATCC AGCTGGAGTG 1861 CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC ACAGCATCAA TGGCTATGTT 1921 TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC 1981 ATTGGAGCAC AGACTGACTT CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA 2041 ATGGTCTATG AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG GAACAGAGGC 2161 ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA CTGGTGATTA TTACGAGGAC 2221 AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTGAGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC 2281 TTCTCCCAGA ATGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCTCCAGA ACTCCTGGGC 2341 GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC 2401 CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC 2461 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 2521 AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC 2581 AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC 2641 TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT 2701 GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC 2761 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC 2821 GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG 2881 TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC 2941 ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA
C.
(iii) Secuencia de ADN de Fc de la cadena ligera (LC) (péptido señal subrayado. Región Fc en negrita) (SEQ ID N O :!!, que codifica SEQ ID NO:12)
1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACTGGT 61 GAAATAACTC GTACTACTCT TCAGTCAGAT CAAGAGGAAA TTGACTATGA TGATACCATA 121 TCAGTTGAAA TGAAGAAGGA AGATTTTGAC ATTTATGATG AGGATGAAAA TCAGAGCCCC 181 CGCAGCTTTC AAAAGAAAAC ACGACACTAT TTTATTGCTG CAGTGGAGAG GCTCTGGGAT 241 TATGGGATGA GTAGCTCCCC ACATGTTCTA AGAAACAGGG CTCAGAGTGG CAGTGTCCCT 301 CAGTTCAAGA AAGTTGTTTT CCAGGAATTT ACTGATGGCT CCTTTACTCA GCCCTTATAC 361 CGTGGAGAAC TAAATGAACA TTTGGGACTC CTGGGGCCAT ATATAAGAGC AGAAGTTGAA 421 GATAATATCA TGGTAACTTT CAGAAATCAG GCCTCTCGTC CCTATTCCTT CTATTCTAGC 481 CTTATTTCTT ATGAGGAAGA TCAGAGGCAA GGAGCAGAAC CTAGAAAAAA CTTTGTCAAG 541 CCTAATGAAA CCAAAACTTA CTTTTGGAAA GTGCAACATC ATATGGCACC CACTAAAGAT 601 GAGTTTGACT GCAAAGCCTG GGCTTATTTC TCTGATGTTG ACCTGGAAAA AGATGTGCAC 661 TCAGGCCTGA TTGGACCCCT TCTGGTCTGC CACACTAACA CACTGAACCC TGCTCATGGG 721 AGACAAGTGA CAGTACAGGA ATTTGCTCTG TTTTTCACCA TCTTTGATGA GACCAAAAGC 781 TGGTACTTCA CTGAAAATAT GGAAAGAAAC TGCAGGGCTC CCTGCAATAT CCAGATGGAA 841 GATCCCACTT TTAAAGAGAA TTATCGCTTC CATGCAATCA ATGGCTACAT AATGGATACA 901 CTACCTGGCT TAGTAATGGC TCAGGATCAA AGGATTCGAT GGTATCTGCT CAGCATGGGC 961 AGCAATGAAA ACATCCATTC TATTCATTTC AGTGGACATG TGTTCACTGT ACGAAAAAAA 1021 GAGGAGTATA AAATGGCACT GTACAATCTC TATCCAGGTG TTTTTGAGAC AGTGGAAATG 1081 TTACCATCCA AAGCTGGAAT TTGGCGGGTG GAATGCCTTA TTGGCGAGCA TCTACATGCT 1141 GGGATGAGCA CACTTTTTCT GGTGTACAGC AATAAGTGTC AGACTCCCCT GGGAATGGCT 1201 TCTGGACACA TTAGAGATTT TCAGATTACA GCTTCAGGAC AATATGGACA GTGGGCCCCA 1261 AAGCTGGCCA GACTTCATTA TTCCGGATCA ATCAATGCCT GGAGCACCAA GGAGCCCTTT 1321 TCTTGGATCA AGGTGGATCT GTTGGCACCA ATGATTATTC ACGGCATCAA GACCCAGGGT (ii) Secuencia de la cadena pesada (HC)-Fc (conector de 5 aminoácidos entre HC y Fc) (péptido señal subrayado. Región Fc en negrita. El conector de 5 aminoácidos está en doble subrayado) (SEQ ID NO:9, que codifica SEQ ID NO: 10)
1381 GCCCGTCAGA AGTTCTCCAG CCTCTACATC TCTCAGTTTA TCATCATGTA TAGTCTTGAT 1441 GGGAAGAAGT GGCAGACTTA TCGAGGAAAT TCCACTGGAA CCTTAATGGT CTTCTTTGGC 1501 AATGTGGATT CATCTGGGAT AAAACACAAT ATTTTTAACC CTCCAATTAT TGCTCGATAC 1561 ATCCGTTTGC ACCCAACTCA TTATAGCATT CGCAGCACTC TTCGCATGGA GTTGATGGGC 1621 TGTGATTTAA ATAGTTGCAG CATGCCATTG GGAATGGAGA GTAAAGCAAT ATCAGATGCA 1681 CAGATTACTG CTTCATCCTA CTTTACCAAT ATGTTTGCCA CCTGGTCTCC TTCAAAAGCT 1741 CGACTTCACC TCCAAGGGAG GAGTAATGCC TGGAGACCTC AGGTGAATAA TCCAAAAGAG 1801 TGGCTGCAAG TGGACTTCCA GAAGACAATG AAAGTCACAG GAGTAACTAC TCAGGGAGTA 1861 AAATCTCTGC TTACCAGCAT GTATGTGAAG GAGTTCCTCA TCTCCAGCAG TCAAGATGGC 1921 CATCAGTGGA CTCTCTTTTT TCAGAATGGC AAAGTAAAGG TTTTTCAGGG AAATCAAGAC 1981 TCCTTCACAC CTGTGGTGAA CTCTCTAGAC CCACCGTTAC TGACTCGCTA CCTTCGAATT 2041 CACCCCCAGA GTTGGGTGCA CCAGATTGCC CTGAGGATGG AGGTTCTGGG CTGCGAGGCA 2101 CAGGACCTCT ACGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCTCCAGA ACTCCTGGGC 2161 GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC 2221 CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC 2281 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 2341 AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC 2401 AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC 2461 TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT 2521 GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC 2581 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC 2641 GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG 2701 TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC 2761 ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA
Tabla 2: Secuencias de polipéptidos
A. Híbrido de monómero de FVIII de dominio B delecionado-Fc (monómero-dímero de FVIII BDDFc): creado por coexpresión de cadenas de FVIII BDDFc y Fc.
Construcción = fusión HC-LC-Fc. Un casete de expresión de Fc se cotransfecta con BDDFVIII-Fc para generar el monómero de FVIII BDDFc. Para la cadena de FVIII BDDFc, se muestra la secuencia Fc en negrita; se muestra la secuencia de HC en doble subrayado; la secuencia del dominio B restante se muestra en cursiva. Los péptidos señal están subrayados.
i) Cadena de FVIII con dominio B delecionado-Fc (secuencia señal de 19 aminoácidos subrayada) (SEQ ID NO:2)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPR PPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKF ILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGM GTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVK VDSCPEEPOLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEE EDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYG EVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDG PTKSDPRCLTRYYSSFVMMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSW YLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKK EDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFT DGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRK NFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGR QVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVM AQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVE CLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWST KEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGN VDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASS YFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKE FLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVL GCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVD GVEVHNAKTKPRE EQYNS TYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHY TQKSLS LSPGK
ii) Fc cadena (péptido señal heterólogo de 20 aminoácidos de la cadena de IgK de ratón subrayado) (SEQ ID NO:4)
METDTLLLWYLLLWVPGSTG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
B. Híbrido de monómero de FVIIIFc de longitud completa (monómero-dímero de FVIIIFc de longitud completa): creado por expresión conjunta de cadenas de FVIIIFc y Fc.
Construcción = fusión HC-B-LC-Fc. Un casete de expresión de Fc se cotransfecta con FVIII-Fc de longitud completa para generar el monómero de FVIIIFc de longitud completa. Para la cadena de FVIIIFc, la secuencia de Fc se muestra en negrita; la secuencia de HC se muestra en doble subrayado; la secuencia del dominio B se muestra en cursiva. Los péptidos señal están subrayados.
i) Cadena de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado (SEQ ID NO:6)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPR PPWMGLLGPTIOAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSOREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKF ILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGM GTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVK VDSCPEEPOLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEE EDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYG EVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDG PTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSW YLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIE PRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMP KIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDFSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSG DMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMP VHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKIWSSTESGRLFKG KRAHGPALLPKDNALFKVSISLLKPNK'PSNNSA'PNRKTHIÜGPSLLIENSPSVWQNILESDPEFK KVTFLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPFDAQNPDMSFFKMLFLPES ARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNK^/WGKGEFTKDVGLKEMVFPS SRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENWLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQN VEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPN TSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAI TQSPLSDCLTRSPÍSIPQANP.SPLPIAKVS SFPSIRPIYLTRVLFQDNS SPÍLPAASYRKKDSGVQE SSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELL PKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGATRONEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSK LLDPLAWDNHYCTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNFIAIAAINEGQNKPEIEVT WAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRS FQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEH LGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQ HHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDE TKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSN ENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFL VYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMI IHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARL HLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFF
QNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF S CSVMHEALHNHY TQKS LSLSPGK
ii) Cadena Fc (péptido señal heterólogo de 20 aminoácidos de cadena de IgK de ratón subrayado) (SEQ ID NO:4)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
C. Híbrido de heterodímero de FVIII-Fc
Se hace por cotransfección de las construcciones de HC-Fc y LC-Fc. Se han hecho dos construcciones de HC-Fc. Una no tiene conector entre HC y Fc (HC-Fc) mientras que la otra tiene un conector de 5 aminoácidos entre HC y Fc (HC+5-Fc). Se usó el péptido señal FVIII para las construcciones HC-Fc, mientras que la secuencia señal de IgK de ratón se usó para la construcción de LC-Fc.
(i) HC-Fc (la secuencia de Fc se muestra en negrita, péptido señal subrayado) (SEQ ID NO:8)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPR PPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKF ILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGM GTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVK VDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEE EDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVREMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYG EVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDG PTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSW YLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYE DISAYLLS KNNAIEPRDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVT C V W D V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY R W SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(ii) HC+5-Fc (la secuencia de Fc se muestra en negrita. La secuencia conectora de 5 aminoácidos (del dominio B de FVIII) se muestra en cursiva, péptido señal subrayado.)(SEQ ID NO:10)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPR PPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKF ILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGM GTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVK VDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEE EDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYG EVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDG PTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSW YLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQMDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTC VWD V SHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNS TY R W SVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (iii) LC-Fc6His (la secuencia de Fc se muestra en negrita, péptido señal subrayado.) (SEQ ID NO:12)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
EITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMS S
SPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQ
ASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDL
EKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQME
DPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNEN1HSIHFSGHVFTVRKKEEYKM
ALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQIT
ASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMI1HGIKTQGARQKFSSLYISQFII
MYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMG
CDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVD
FQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLD
PPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL
MI SRTPEVTC VWDV SHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYN STYRWSVLTVLHQDWLN G
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
Tabla 3. Determinación del tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) en ratones con hemofilia A después de una dosis intravenosa única de 50 UI/kg de rFVIIIFc o ReFacto®.
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Tabla 4. Parámetros FC después de una dosis intravenosa única en ratones con hemofilia A (50 Ul/kg)
Tratamiento Cmáx (Ul/ml) ABC (h-UI/ml) T1/2 (h) CL (ml/h/kg) Vss (ml/kg) rFVIIIFc 156 226 TT3 209 28,4 ReFacto® 0,67 6,94 5,0 7,2 438 Advate® 0,47 3,90 7,1 12,8 103
Tabla 5. Parámetros FC después de una dosis intravenosa única en perros con hemofilia A (125 UI/kg de rFVIIIFc,
114 y 120 UI/kg de ReFacto®)
A. FC determinada de los datos de actividad cromogénica
Tratamiento Cmáx (UI/ml) ABC (h-UI/ml) T1/2 (h) CL (ml/h/kg) Vz (ml/kg) rFVIIIFc 2,0 ± 0,54 25,9 ± 6,47 15,4 ± 0,3 5,1 ± 1,4 113 ± 29 ReFacto®®* 2,0 18,2 7,4 6,5 68,7 B. FC determinada de los datos de ELISA
Tratamiento Cmáx (ng/ml) ABC (h-ng/ml T1/2 (h) CL (ml/h/kg) Vz (ml/kg) rFVIIIFc 210 ± 33 2481 ± 970 15,7 ± 1,7 6,2 ± 3,0 144 ± 83 ReFacto®®* 21 1545 6,9 8,7 85 Media ± de, n = 4 para rFVIIIFc, n = 2 para ReFacto®
*de no informada para ReFacto® puesto que solo hubo dos perros
Tabla 6. Actividad de coagulación medida por aPTT en perros con hemofilia A después de una dosis intravenosa única con rFVIIIFc o ReFacto®.
aPTT, s
Perro ID Tratamiento Previo a la dosis 5 min después de la dosis M10 rFVIIIFc 86,5 53,6
M11 rFVIIIFc 99,8 56,4
M12 rFVIIIFc 119 68,7
ReFacto® 108 60,7
M38 rFVIIIFc 115 76,6
ReFacto® 118 68,0
Tabla 7. Concentración plasmática de rFVIIIFc o Xyntha en monos administrados con una dosis intravenosa única de 125 UI/kg medida por ELISA.
A. Concentración de rFVIIIFc en plasma (pg/ml)
Figure imgf000043_0002
B. Concentración de Xyntha en plasma (pg/ml)
Figure imgf000043_0001
Tabla 8. Concentración plasmática de rFVIIIFc o Xyntha en monos administrados con una dosis intravenosa única de 125 UI/kg medida por el ensayo de actividad cromogénica específica de FVIII (dada en UI/ml).
A. Xyntha
Figure imgf000044_0002
B. rFVIIIFc
Figure imgf000044_0003
Tabla 9. Parámetros FC de rFVIIIFc después de una dosis única de 125 UI/kg
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Tabla 10. Parámetros FC de Xyntha después de una dosis IV única (125 Ul/kg)
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000045_0003

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido quimérico y un segundo polipéptido, en donde el polipéptido quimérico comprende un factor VIII (FVIII) y un primer Fc, en donde el FVIII está fusionado directamente con el primer
Fc, y en donde el segundo polipéptido comprende un segundo Fc, para su uso en el tratamiento profiláctico de hemofilia A en un sujeto humano, en donde el polipéptido híbrido se va a administrar en una dosis de 25 UI/kg a
65 UI/kg en un intervalo de administración de 3 a 8 días entre dos dosis.
2. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 1, en donde la dosis del polipéptido híbrido es 25 UI/kg,
26 UI/k 27 UI/k 28 UI/k 29 UI/k 30 UI/k 31 UI/k 32 UI/k 33 UI/k 34 UI/k 35 UI/k 36 UI/kg g
Figure imgf000094_0001
g
3. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el intervalo de administración es 3-5 días,
3-6 días, 3-7 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días u 8 días.
4. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 3, en donde el intervalo de administración es 3-5 días.
5. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 3, en donde el intervalo de administración es 6 días.
6. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 3, en donde el intervalo de administración es 7 días.
7. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 3, en donde el intervalo de administración es 8 días.
8. El polipéptido híbrido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada dosis es
65 UI/kg y el intervalo de administración es 6-7 días.
9. El polipéptido híbrido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el FVIII comprende un FVIII con una deleción completa o parcial del dominio B.
10. El polipéptido híbrido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el polipéptido quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(i) sin la secuencia señal.
11. El polipéptido híbrido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el FVIII comprende los aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO: 2.
12. El polipéptido híbrido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el primer Fc comprende el fragmento Fc de IgG1 humana.
13. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 12, en donde el primer Fc comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a los aminoácidos 1439 a 1665 de SEQ ID NO: 2.
14. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 13, en donde el primer Fc comprende los aminoácidos
1439 a 1664 de SEQ ID NO: 2.
15. El polipéptido híbrido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el FVIII está fusionado directamente con el extremo N del primer Fc.
16. El polipéptido híbrido para su uso según la reivindicación 12, en donde el segundo Fc comprende el fragmento Fc de IgG1 humana.
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