RS56957B1 - Himerni i hibridni polipeptidi faktora viii-fc, i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Himerni i hibridni polipeptidi faktora viii-fc, i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS56957B1
RS56957B1 RS20180182A RSP20180182A RS56957B1 RS 56957 B1 RS56957 B1 RS 56957B1 RS 20180182 A RS20180182 A RS 20180182A RS P20180182 A RSP20180182 A RS P20180182A RS 56957 B1 RS56957 B1 RS 56957B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
factor viii
rfviiifc
fviii
dose
sequence
Prior art date
Application number
RS20180182A
Other languages
English (en)
Inventor
Jennifer A Dumont
Susan Low
Alan J Bitonti
Glenn Pierce
Alvin Luk
Haiyan Jiang
Byron Mckinney
Matt Ottmer
Jurg Sommer
Karen Nugent
Lian Li
Robert Peters
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of RS56957B1 publication Critical patent/RS56957B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na oblast lekova za hemostatske poremećaje.
Osnova pronalaska
[0002] Hemofilija A je poremećaj krvarenja povezan sa X hromozomom uzrokovan mutacijama i/ili delecijama u genu za faktor VIII (FVIII) koje rezultuju u deficijenciji aktivnosti FVIII (Peyvandi et al. 2006). Bolest je okarakterisana spontanim krvarenjem i prekomernim krvarenjem posle traume. Tokom vremena, ponovljeno krvarenje u mišićima i zglobovima, koje često počinje u ranom detinjstvu, rezultuje u hemofiličnoj artropatiji i ireverzibilnom oštećenju zglobova. Ovo oštećenje je progresivno i može dovesti do teško ograničene pokretljivosti zglobova, mišićne atrofije i hroničnog bola (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost.29:87-96 (2003)).
[0003] A2 domen je neophodan za prokoagulantnu aktivnost molekula faktora VIII. Studije pokazuju da svinjski faktor VIII ima šet puta veću prokoagulantnu aktivnost od humanog faktora VIII (Lollar, P., and E. T. Parker, J. Biol. Chem. 266:12481-12486 (1991)), i da je razlika u koagulantnoj aktivnosti između humanog i svinjskog faktora VIII izgleda zasnovana na razlici u aminokiselinskoj sekvenci između jednog ili više ostataka u humanim i svinjskim A2 domenima (Lollar, P., et al., J. Biol. Chem.267:23652-23657 (1992)).
[0004] Lečenje hemofilije A je pomoću zamenske terapije koja ciljno deluje na ponovno uspostavljanje aktivnosti FVIII do 1 do 5 % od normalnih nivoa da bi se prečilo spontano krvarenje (Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med.344:1773-1779 (2001)). Postoje proizvodi poreklom iz plazme i rekombinantnog FVIII dostupni za lečenje epizoda krvarenja na zahtev ili za sprečavanje pojave epizoda krvarenja profilaktičkim tretmanom. Na osnovu polu-života ovih proizvoda režimi lečenja zahtevaju čestu intravensku primenu. Takva česta primena je bolna i neugodna.
[0005] Smanjen mortalitet, prevencija oštećenja zglobova i poboljšani kvalitet života su važna postignuća zahvaljujući razvoju FVIII poreklom iz plazme i rekombinantnog FVIII. Produžena zaštita od krvarenja bi predstavljala sledeće ključno unapređenje u lečenju pacijenata sa hemofilijom A. Međutim, do danas, nisu razvijeni nikakvi proizvodi koji bi omogućavali produženu zaštitu. Prema tome, tu ostaje potreba za poboljšanim postupcima za lečenje hemofilije kao posledice deficijencije faktora VIII koji su tolerabilniji i efikasniji od trenutnih terapija.
KRATAK REZIME PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazak daje postupke primene faktora VIII; postupke primene himernih polipeptida koji sadrže faktor VIII i hibrida takvih himernih polipeptida; himerne polipeptide koji sadrže faktor VIII i hibride takvih himernih polipeptida; polinukleotide koji kodiraju takve himerne i hibridne polipeptide; ćelije koje sadrže takve polinukleotide; i postupke za proizvodnju takvih himernih i hibridnih polipeptida upotrebom takvih ćelija.
[0007] Predmetni pronalazak daje postupak za primenu faktora VIII na subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži primenu na subjekta terapeutske doze himernog polipeptida faktora VIII, npr., himernog polipeptida faktora VIII-Fc, u intervalu doziranja najmanje oko jedan i jednu polovinu puta dužem od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., bez Fc dela.
[0008] Interval doziranja može biti najmanje jedan i jednu polovinu do šest puta duži, jedan i jednu polovinu do pet puta duži, jedan i jednu polovinu do četiri puta duži, jedan i jednu polovinu do tri puta duži, ili jedan i jednu polovinu do dva puta duži, od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., Fc deo. Interval doziranja može biti najmanje jedan i jednu polovinu, dva, dva i jednu polovinu, tri, tri i jednu polovinu, četiri, četiri i jednu polovinu, pet, pet i jednu polovinu ili šet puta duži od intervala doziranja za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., Fc deo. Interval doziranja može biti oko svakih pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, ili četrnaest dana ili duži.
[0009] Interval doziranja može biti najmanje oko jedan do jednu polovinu do 5, jedan i jednu polovinu, 2, 3, 4 ili 5 dana ili duži.
[0010] Predmetni pronalazak takođe daje postupak za primenu faktora VIII na subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži primenu na subjekta terapeutske doze himernog polipeptida faktora VIII, npr., himernog polipeptida faktora VIII-Fc, za dobijanje površine ispod krive koncentracije u plazmi naspram vremena (AUC) najmanje oko jedan i jednu četvrtinu puta veće od AUC dobijene pomoću ekvivalentne količine navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., bez Fc dela.
[0011] Predmetni pronalazak takođe daje postupak za primenu faktora VIII na subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži primenu na subjekta terapeutske doze polipeptida koji sadrži faktor VIII i Fc u intervalu doziranja od oko svakih pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, ili četrnaest dana ili duži.
[0012] Postupci prema pronalasku mogu biti izvođeni na subjektu kod koga postoji potreba za profilaktičkim tretmanom ili tretmanom na zahtev.
[0013] Tretman na zahtev obuhvata tretman za epizodu krvarenja, hemartrozu, krvarenje mišćića, oralno krvarenje, krvarenje, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, traumu, traumu capitis (traumu glave), gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intraabdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, frakturu kosti, krvarenje centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofarignealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, ili krvarenje u ovojnici mišića iliopsoas. Kod subjekta može da postoji potreba za hirurškom profilaksom, peri-operativnim menadžmentom ili tretmanom za operaciju. Takve operacije obuhvataju, npr., manju operaciju, veliku operaciju, vađenje zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovektomiju, kompletnu zamenu kolena, kraniotomiju, osteosintezu, operaciju traume, intrakranijalnu operaciju, intra-abdominalnu operaciju, intratorakalnu operaciju ili operaciju zamene zgloba.
[0014] Za tretman na zahtev, interval doziranja navedenog himernog polipeptida je oko jednom svakih 24-36, 24-48, 24-72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, ili 72 časa ili duže.
[0015] Terapeutske doze koje mogu biti korišćene u postupcima pronalaska su oko 10 do oko 100 IU/kg, specifičnije, oko 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ili 90-100 IU/kg, i specifičnije, oko 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100 IU/kg.
[0016] Terapeutske doze koje mogu biti korišćene u postupcima pronalaska su oko 10 do oko 150 IU/kg, specifičnije, oko 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150 IU/kg, i specifičnije, oko 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, ili 150 IU/kg.
[0017] Subjekat u postupcima prema pronalasku može biti humani subjekat ili može biti nehumani sisar. Nehumani sisari obuhvataju, npr., miševe, pse, primate, majmune, mačke, konje, krave, svinje, i druge domaće životinje i male životinje. Određivanje intervala doziranja i AUC može se izvesti kod jednog subjekta ili u populaciji subjekata.
[0018] Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti humani faktor VIII, ili nehumani faktor VIII, kao što je svinjski, mišji ili pseći faktor VIII. Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može imati potpunu ili delimičnu deleciju B domena.
[0019] Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 1 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline 1 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline 1 do 684 od SEQ ID NO:12). Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 1 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline 1 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline 1 do 684 od SEQ ID NO:12).
[0020] Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline -19 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline -19 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline -19 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline -20 do 684 od SEQ ID NO:12). Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline -19 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline -19 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline -19 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline -20 do 684 od SEQ ID NO:12).
[0021] Fc deo (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sa aminokiselinskom sekvencom Fc prikazanom u Tabeli 2 (aminokiseline 1439 do 1665 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 741 do 967 od SEQ ID NO:8; aminokiseline 746 do 972 od SEQ ID NO:10; aminokiseline 685 do 924 od SEQ ID NO:12). Fc deo (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti identičan sa aminokiselinskom sekvencom Fc prikazanom u Tabeli 2 (aminokiseline 1439 do 1665 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 741 do 967 od SEQ ID NO:8; aminokiseline 746 do 972 od SEQ ID NO:10; aminokiseline 685 do 924 od SEQ ID NO:12).
[0022] Himerni polipeptid može da sadrži sekvencu najmanje 90% ili 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1665 od SEQ ID NO:2) ili najmanje 90% ili 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1665 od SEQ ID NO:2). Himerni polipeptid može da sadrži sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1665 od SEQ ID NO:2) ili identičnu aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1665 od SEQ ID NO:2).
[0023] Himerni polipeptid može biti u obliku hibrida koji sadrži drugi polipeptid u vezi sa navedenim himernim polipeptidom, pri čemu navedeni drugi polipeptid sadrži ili se uglavnom sastoji od Fc.
[0024] Drugi polipeptid može da sadrži ili se uglavnom sastoji od sekvence koja je najmanje 90% ili 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 227 od SEQ ID NO:4) ili najmanje 90% ili 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -20 do 227 od SEQ ID NO:4). Drugi polipeptid može da sadrži ili se uglavnom sastoji od sekvence koja je identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 227 od SEQ ID NO:4) ili identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -20 do 227 od SEQ ID NO:4).
[0025] Himerni polipeptid ili hibrid može biti primenjen kao deo farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan ekscipijens.
[0026] Pronalazak takođe daje gore opisane same himerne i hibridne polipeptide, polinukleotide koji ih kodiraju, kultivisane humane embrionalne ćelije koje sadrže polinukleotide i postupke za proizvodnju takvih himernih i hibridnih polipeptida, i polipeptide proizvedene pomoću takvih postupaka.
[0027] Na osnovu pronalaska koji je ovde sadržan, predmetni pronalazak daje himerni polipeptid koji sadrži deo faktor VIII i deo koji nije faktor VIII, za upotrebu u prevenciji ili lečenju epizode krvarenja kod humanog subjekta, pri čemu se himerni polipeptid primenjuje u dozi od 25 IU/kg do 65 IU/kg u intervalu doziranja od jednom svakih 3 ili više dana, pri čemu deo koji nije faktor VIII je vezujući partner FcRn (FcRn BP). Ovaj pronalazak i njegovi poželjni primeri izvođenja su navedeni u priloženim patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
Sl. 1. Šematski prikaz rFVIIIFc monomera.
Sl. 2. WBCT od rFVIIIFc u poređenju sa ReFacto® kod miševa sa hemofilijom A posle 50 IU/kg intravenske doze (n = 6 miševa po grupi).
Sl. 3. Hromogena aktivnost u plazmi od miševa sa hemofilijom A posle jedne IV doze od 50 IU/kg rFVIIIFc, ReFacto® i Advate®.
Sl. 4. WBCT od rFVIIIFc i ReFacto® kod pasa sa hemofilijom A (A) rFVIIIFc. (B) ReFacto®, a zatim rFVIIIFc u „Crossover“ studiji.
Sl. 5. Farmakokinetika intravenskog rFVIIIIFc i ReFacto® kod pasa sa hemofilijom A (merena pomoću ELISA).
Sl. 6. Aktivnost rFVIII i ReFacto® posle jedne intravenske doze kod pasa sa hemofilijom A (merena pomoću analize hromogene aktivnosti specifične za FVIII).
Sl. 7. Srednja koncentracija u plazmi grupe u vremenu za rFVIIIFc i Xyntha posle jedne intravenske doze (125 IU/kg) kod makaki majmuna (n = 6, srednja vrednost ± SD). Koncentracije u plazmi su merene pomoću ELISA.
Sl. 8. krive pojedinačnih koncentracija u plazmi naspram vremena za rFVIIIFc i Xyntha posle jedne intravenske doze (125 IU/kg) kod makaki majmuna (n = 6, srednja vrednost ± SD). Koncentracije u plazmi su merene pomoću ELISA. (A) rFVIIIFc pomoću ELISA. (B) Xyntha pomoću ELISA.
Sl. 9. Srednja hromogena aktivnost u plazmi grupe posle jedne intravenske doze (125 IU/kg) za rFVIIIFc i Xyntha kod makaki majmuna (n = 6, srednja vrednost ± SD). Aktivnost FVIII je merena upotrebnom analize hromogene aktivnosti specifične za FVIII.
Sl. 10. Krive pojedinačne hromogene aktivnosti u plazmi naspram vremena posle jedne intravenske doze (125 IU/kg) rFVIIIFc i Xyntha kod makaki majmuna (n = 6, srednja vrednost ± SD). Aktivnost FVIII je merena upotrebom analize hromogene aktivnosti specifične za FVIII. (A) Hromogena aktivnost rFVIIIFc. (B) Hromogena aktivnost Xyntha. Sl. 11. Biohemijska karakterizacija rFVIII-Fc: Aktivacija faktora X kao funkcija koncentracije faktora X.
Sl. 12. Biohemijska karakterizacija rFVIII-Fc: Aktivacija faktora X kao funkcija koncentracije faktora IXa.
Sl. 13. Zabeležena srednja aktivnost FVIII grupe (±SE) (analiza jednog stadijuma, 25 IU/kg (A) ili 65 IU/kg (B); i hromogena analiza, 25 IU/kg (C) ili 65 IU/kg (D)) naspram vremena.
Sl. 14. Zabeležena srednja aktivnost FVIII grupe (±SE) (analiza jednog stadijuma (A) ili hromogena analiza (B)) naspram vremena.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0029] Predmetni pronalazak daje postupak za lečenje hemofilije A faktorom VIII upotrebom dužeg intervala doziranja i/ili veće AUC nego što je moguća sa trenutno poznatim proizvodima faktora VIII. Predmetni pronalazak takođe daje poboljšane himerne polipeptide faktora VIII, himerne polinukleotide faktora VIII i postupke za proizvodnju.
[0030] Lečenje hemofilije A je zamenska terapija koja ciljno deluje na ponovno uspostavljanje aktivnosti FVIII do 1 do 5 % od normalnih nivoa da bi se sprečilo spontano krvarenje (Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-9 (2001)). Postoje proizvodi poreklom iz plazme i rekombinantni proizvodi FVIII dostupni za lečenje epizoda krvarenja na zahtev ili za sprečavanje pojave epizoda krvarenja profilaktičkim tretmanom. Na osnovu polu-života ovih proizvoda (10-12 časova) (White G.C., et al., Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (suppl 1):94-99; discussion 100 (2003)), režimi lečenja zahtevaju čestu intravensku primenu, uobičajeno dva do tri puta nedeljno za profilaksu i jedan do tri puta na dan za tretman na zahtev (Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med.
357:535-544 (2007)). Takva česta primena je bolna i neprijatna.
[0031] Predmetni pronalazak daje postupak za primenu faktora VIII na subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži primenu na subjekta terapeutske doze himernog polipeptida faktora VIII, npr., himernog polipeptida faktora VIII-Fc, ili hibrida takvog polipeptida u intervalu doziranja najmanje oko jedan i jednu polovinu puta dužem od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., bez Fc dela.
[0032] Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu do šest puta duži, jedan i jednu polovinu do pet puta duži, jedan i jednu polovinu do četiri puta duži, jedan i jednu polovinu do tri puta duži, ili jedan i jednu polovinu do dva puta duži, od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., bez Fc dela. Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu, dva, dva i jednu polovinu, tri, tri i jednu polovinu, četiri, četiri i jednu polovinu, pet, pet i jednu polovinu ili šest puta duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., bez Fc dela. Interval doziranja može biti oko svakih pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, ili četrnaest dana ili duži.
[0033] Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu do 5, jedan i jednu polovinu do, 2, 3, 4 ili 5 dana ili duži.
[0034] Predmetni pronalazak takođe daje postupak za primenu faktora VIII na subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži primenu na subjekta terapeutske doze himernog polipeptida faktora VIII, npr., himernog polipeptida faktora VIII-Fc ili hibrida takvog polipeptida za dobijanje površine ispod krive koncentracije u plazmi naspram vremena (AUC) najmanje oko jedan i jednu četvrtinu puta veće od AUC dobijene pomoću ekvivalentne količine navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktor VIII dela), npr., bez Fc dela.
[0035] Predmetni pronalazak takođe daje postupak za primenu faktora VIII na subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži primenu na subjekta terapeutske doze polipeptida koji sadrži faktor VIII i Fc ili hibrida takvog polipeptida u intervalu doziranja od oko svakih pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, ili četrnaest dana ili duži.
[0036] Postupci prema pronalasku mogu biti izvođeni na subjektu kod koga postoji potreba za profilaktičkim tretmanom ili tretmanom na zahtev.
[0037] "Primena," kao što je ovde korišćena, ozačava davanje farmaceutski prihvatljivog polipeptida faktora VIII prema pronalasku subjektu preko farmaceutski prihvatljivog puta. Poželjni putevi primene su intravenski, npr., intravenska injekcija i intravenska infuzija. Dodatni putevi primene obuhvataju, npr., subkutanu, intramuskularnu, oralnu, nazalnu i plućnu primenu. Himerni polipeptidi i hibridni proteini mogu biti primenjivani kao deo farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan ekscipijens.
[0038] "Površina ispod krive koncentracije u plazmi naspram vremena (AUC)," kao što je ovde korišćena, je ista kao termin iz stanja tehnike farmakologije, i zasnovan je na stopi i veličini asporpcije faktora VIII posle primene. AUC je određena u naznačenom vremenskom periodu, kao što je 12, 18, 24, 36, 48 ili 72 časova, ili za beskonačnost upotrebom ekstrapolacije na bazi nagiba krive. Osim ukoliko je ovde naznačeno drugačije, AUC je određena za beskonačnost. Određivanje AUC se može izvesti kod jednog subjekta, ili u populaciji subjekata za koje je izračunata srednja vrednost.
[0039] "B domen" faktora VIII, kao što je ovde korišćen, je isti kao B domen poznat u stanju tehnike koji je definisan unutrašnjoj identičnosti aminokiselinske sekvence i mesta proteolotičkog cepanja pomoću trombina, npr., ostataka Ser741-Arg1648 humanog faktora VIII pune dužine. Drugi domeni humanog faktora VIII su definisani sledećim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Ile2032; C1, ostaci Arg2033-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 sekvenca obuhvata ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glul649-Arg1689, je obično označena kao aktivacioni peptid lakog članca faktora VIII. Lokacije granica za sve domene, uključujući B domene, za svinjski, mišji i pseći faktor VIII su takođe poznate u stanju tehnike. Poželjno, B domen faktora VIII je deletiran ("faktor VIII sa deletiranim B domenom" ili "BDD FVIII"). Primer BDD FVIII je REFACTO (rekombinantni BDD FVIII), koji ima istu sekvencu kao sekvenca faktor VIII dela u Tabeli 2A(i) (aminokiseline -19 do 1438 ili 1 do 1438 od SEQ ID NO:2).
[0040] "Faktor VIII sa deletiranim domenom B" može imati potpune ili delimične delecije navedene u SAD patentima br. 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112 i 6,458,563. U nekim primerima izvođenja, sekvenca faktora VIII sa deletiranim domenom B prema predmetnom pronalasku sadrži bilo koju od delecija navedenih u kol. 4, red 4 do kol. 5, red 28 i primerima 1-5 iz SAD patenta br. 6,316,226 (takođe u SAD 6,346,513). U nekim primerima izvođenja, faktor VIII sa deletiranim domenom B prema predmetnom pronalasku ima deleciju navedenu u kol.2, redovi 26-51 i primerima 5-8 iz SAD patenta br. 5,789,203 (takođe SAD 6,060,447, SAD 5,595,886, i SAD 6,228,620). U nekim primerima izvođenja, faktor VIII sa deletiranim B domenom ima deleciju opisanu u kol. 1, redovi 25 do kol. 2, red 40 iz SAD patenta br. 5,972,885; kol. 6, redovi 1-22 i primeru 1 iz SAD patenta br.6,048,720; kol.2, redovi 17-46 iz SAD patenta br. 5,543,502; kol. 4, red 22 do kol.5, red 36 iz SAD patenta br.5,171,844; kol.2, redovi 55-68, slika 2, i primer 1 iz SAD patenta br.5,112,950; kol. 2, red 2 do kol.19, red 21 i tabela 2 iz SAD patenta br. 4,868,112; kol. 2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol. 8, red 26, i kol. 11, red 5 do kol.13, red 39 iz SAD patenta br.7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53, iz SAD patenta br. 6,458,563. U nekim primerima izvođenja, faktor VIII sa deletiranim B domenom ima deleciju većine B domena, ali još uvek sadrži amino-terminalne sekvence B domena koje su esencijalne za in vivo proteolitičku obradu primarnog translacionog proizvoda u dva polipeptidna lanca, kao što je navedeno u WO 91/09122. U nekim primerima izvođenja, faktor VIII sa deletiranim B domenom je konstruisan sa delecijom aminokiselina 747-1638, tj., skoro potpunom delecijom B domena. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Faktor VIII sa deletiranim B domenom takođe može da sadrži deleciju aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 faktora VIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Dodatne delecije B domena koje su deo pronalaska obuhvataju, npr.,: deleciju aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT objavljena prijava br. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNK (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava br. 88/00831)), 816 do 1598 ili 741 do 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). Svaka od gore navedenih delecija može biti pripremljena u bilo kojoj sekvenci faktora VIII.
[0041] "Himerni polipeptid," kao što je ovde korišćen, označava polipeptid koji obuhvata unutar sebe najmanje dva polipeptida (ili podsekvenci ili peptida) iz različitih izvora. Himerni polipeptidi mogu da obuhvataju, npr., dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili više polipeptida iz različitih izvora, kao što su različiti geni, različite cDNK, ili različite životinjske ili druge vrste. Himerni polipeptidi mogu da obuhvataju, npr., jedan ili više linkera koji spajaju različite podsekvence. Na taj način, podsekvence mogu biti spojene direktno ili mogu biti spojene indirektno, preko linkera, ili oba, unutar jednog himernog plipeptida. Himerni polipeptidi mogu da obuhvataju, npr., dodatne peptide kao što su signalne sekvence i sekvence kao što su 6His i FLAG koje pomažu u prečišćavanju ili detekciji proteina. Pored toga, himerni polipeptidi mogu imati aminokiselinske ili peptidne adicije na N- i/ili C-terminusima.
[0042] U nekim primerima izvođenja, himerni polipeptid sadrži faktor VIII deo i deo koji nije faktor VIII. Primeri delova koji nisu faktor VIII obuhvataju, npr., Fc, XTEN i albumin. Primeri himernih polipeptida prema pronalasku obuhvataju, npr., himerne polipeptide faktora VIII-Fc, himerne polipeptide faktora VIII-XTEN i himerne polipeptide faktora VIII-albumina.
[0043] Primeri himernih polipeptida faktora VIII-Fc obuhvataju, npr., SEQ ID NOs:2, 6, 8, 10, i 12 (Tabela 2), sa ili bez njihovih signalnih sekvenci i himerni polipeptid Fc od SEQ ID NO:4 (Tabela 2).
[0044] Himerni polipeptid može da sadrži sekvencu najmanje 90% ili 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1665 od SEQ ID NO:2) ili najmanje 90% ili 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1665 od SEQ ID NO:2). Himerni polipeptid može da sadrži sekvencu identičnu sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1665 od SEQ ID NO:2) ili identičnu sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 2A(i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1665 od SEQ ID NO:2).
[0045] Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, primeri himernih polipetida obuhvataju faktor VIII fuzionisan sa jednim ili više XTEN polipeptida. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009). Faktor VIII može biti fuzionisan sa N-terminalnim krajem XTEN polipeptida ili sa C-terminalnim krajem XTEN polipeptida, uz uslov da faktor VIII komponenta fuzionog proteina faktora VIII-XTEN može biti obrađen pomoću proteaze da bi se proizveo polipeptid koji sadrži obrađeni faktor VIII. Mesto proteaze može biti obuhvaćeno između XTEN dela i faktor VIII dela da bi se omoguća takva obrada. XTEN polipeptidi obuhvataju, npr., one navedene u WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, SAD 2010/0189682 i SAD 2009/0092582.
[0046] Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, primeri himernih polipeptida takođe obuhvataju faktor VIII fuzionisan sa jednim ili više polipeptida albumina. Poželjno albumin je humani albumin. Faktor VIII može biti fuzionisan sa N-terminalnim krajem albumina ili sa C-terminalnim krajem albumina, uz uslov da faktor VIII komponenta fuzionog proteina faktora VIII-albumina može biti obrađena enzimatski-aktivnom proprotein konvertazom da bi se proizveo polipeptid koji sadrži obrađeni faktor VIII. Poznati su primeri albumina, npr., njegovi fragmenti, koji mogu biti korišćeni u predmetnom pronalasku. npr., SAD patent br.
7,592,010; SAD patent br.6,686,179; i Schulte, Thrombosis Res.124 Suppl.2:S6-S8 (2009).
[0047] U nekim primerima izvođenja, himerni polipeptid koji sadrži faktor VIII deo ima povećani polu-život (t1/2) u odnosu na polipeptid koji se sastoji od od istog faktor VIII dela bez dela koji nije faktor VIII. Himerni polipeptid faktora VIII sa povećanim t1/2 može biti označen ovde kao faktor VIII sa dugotrajnim dejstvom. Himerni polipeptidi faktora VIII sa dugotrajnim dejstvom obuhvataju, npr., faktor VIII fuzionisan sa Fc (uključujući, npr., himerne polipeptide faktora VIII u obliku hibrida kao što je FVIIIFc monomer-dimer hibrid; videti Primer 1, Sl. 1, i Tabelu 2A; i SAD patente br. 7,404,956 i 7,348,004), faktor VIII fuzionisan sa XTEN, i faktor VIII fuzionisan sa albuminom.
[0048] "Kultura," "kultivisati" i "kultivacija," kao što su ovde korišćeni, označava inkubiranje ćelija pod in vitro uslovima koji omogućavaju ćelijski rast ili deobu ili za održavanje ćelija u živom stanju. "Kultivisane ćelije," kao što su korišćene ovde, označavaju ćelije koje su umnožavane in vitro.
[0049] "Faktor VIII," kao što je ovde korišćen, označava funkcionalni polipeptid faktora VIII u njegovoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Na taj način, termin faktor VIII obuhvata varijante polipeptida koji su funkcionalni. Poželjni proteini faktora VIII su humani, svinjski, pseći i mišji proteini faktora VIII. Kao što je opisano u delu Osnova pronalaska, poznati su polipeptid pune dužine i polinukleotidne sekvence, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Primeri sekvenci humanog faktora VIII su prikazane kao podsekvence u SEQ ID NOs:2, 6, 8, 10 i 12 (Tabela 2). Polipeptidi faktora VIII obuhvataju, npr., faktor VIII pune dužine, faktor VIII pune dužine minus Met na N-terminusu, zreli faktor VIII (minus signalna sekvenca), zreli faktor VIII sa dodatnim Met na N-terminusu, i/ili faktor VIII sa punom ili delimičnom delecijom B domena.
Poželjne varijante faktora VIII obuhvataju delecije B domena, bilo delimične ili potpune delecije.
[0050] Poznato je veoma mnogo funkcionalnih varijanti faktora VIII, kao što je razmatrano u prethodnom i daljem tekstu. Pored toga, stotine nefunkcionalnih mutacija u faktoru VIII je identifikovano kod pacijenata sa hemofilijom, i određeno je da je efekat ovih mutacija na funkciju faktora VIII posledica više toga gde se one nalaze unutar 3-dimenzionalne strukture faktora VIII nego od prirode supstitucije (Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)). Pored toga, poređenja između faktora VIII od ljudi i drugih vrsta identifikovala su konzervativne ostatke koji su verovatno potrebni za funkciju (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); SAD 6,251,632).
[0051] Gen humanog faktora VIII je izolovan i eksprimiran u sisarskim ćelijama (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; SAD pat. br. 4,757,006), i aminokiselinska sekvenca je izvedena iz cDNK. Capon et al., SAD pat. br. 4,965,199 opisuje postupak rekombinantne DNK za proizvodnju faktora VIII u sisarskim ćelijama domaćinima i prečišćavanje humanog faktora VIII. Objavljena je ekspresija humanog faktora VIII u CHO (jajnik kineskog hrčka) ćelijama i BHKC (ćelije bubrega bebe hrčka). Humani faktor VIII je modifikovan tako da se deletira deo ili ceo B domen (SAD pat. br. 4,994,371 i 4,868,112), i izvedena je zamena B domena humanog faktora VIII sa B domenom humanog faktora V (SAD pat. br. 5,004,803). cDNK sekvenca koja kodira humani faktor VIII i predviđena aminokiselinska sekvenca su prikazane u SEQ ID NOs:1 i 2, respektivno, SAD objave prijave br. 2005/0100990.
[0052] SAD pat. br.5,859,204, Lollar, J. S. objavljuje funkcionalne mutante faktora VIII koji imaju smanjenu antigenost i smanjenu imunoreaktivnost. SAD pat. br. 6,376,463, Lollar, J. S. takođe objavljuje mutante faktora VIII koji imaju smanjenu imunoreaktivnost. SAD objava prijave br. 2005/0100990, Saenko et al. objavljuju funkcionalne mutacije u A2 domenu faktora VIII.
[0053] Određeni broj funkcionalnih molekula faktora VIII, uključujući delecije B-domena, su navedeni u sledećim patentima SAD 6,316,226 i SAD 6,346,513, oba preneti na Baxter; SAD 7,041,635 prenet na In2Gen; SAD 5,789,203, SAD 6,060,447, SAD 5,595,886, i SAD 6,228,620 prenet na Chiron; SAD 5,972,885 i SAD 6,048,720 prenet na Biovitrum, SAD 5,543,502 i SAD 5,610,278 prenet na Novo Nordisk; SAD 5,171,844 prenet na Immuno Ag; SAD 5,112,950 prenet na Transgene S.A.; SAD 4,868,112 prenet na Genetics Institute.
[0054] Objavljena je sekvenca svinjskog faktora VIII, (Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)), i objavljena je kompletna svinjska cDNK sekvenca dobijena iz PCR amplifikacije sekvenci faktora VIII iz biblioteke cDNK slezine svinje (Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996). Hibridni humani/svinjski faktor VIII koji ima supstitucije svih domena, svih podjedinica i specifičnih aminokiselinskih sekvenci su navedeni u SAD pat. br. 5,364,771 od Lollar i Runge, i u WO 93/20093. Skorije, nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence A1 i A2 domena svinjskog faktora VIII i himernog faktora VIII sa svinjskim A1 i/ili A2 domenima supstituisanim za odgovarajuće humane domene su objavljene u WO 94/11503. SAD pat. br. 5,859,204, Lollar, J. S., takođe navodi svinjsku cDNK i izvedene aminokiselinske sekvence. 6,458,563, prenet na Emory opisuje svinjski faktor VIII sa deletiranim B-domenom.
[0055] Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 1 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline 1 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline 1 do 684 od SEQ ID NO:12). Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 1 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline 1 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline 1 do 684 od SEQ ID NO:12).
[0056] Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti najmanje najmanje 90% ili 95% identičan sa aminokiselinskom sekvencom faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline -19 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline -19 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline -19 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline -20 do 684 od SEQ ID NO:12). Faktor VIII (ili faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci faktora VIII prikazanom u Tabeli 2 sa signalnom sekvencom (aminokiseline -19 do 1438 od SEQ ID NO:2; aminokiseline -19 do 2332 od SEQ ID NO:6; aminokiseline -19 do 740 od SEQ ID NO:8; aminokiseline -19 do 745 od SEQ ID NO:10; ili aminokiseline -20 do 684 od SEQ ID NO:12).
[0057] "Ekvivalentna količina," kao što je ovde korišćena, označava istu količinu aktivnosti faktora VIII kao što je izražena u međunarodnim jedinicama, koja je nezavisna od molekulske težine dotičnog polipeptida. Jedna međunarodna jedinica (IU) aktivnosti faktora VIII odgovora približno količini faktora VIII u jednom mililitru normalne humane plazme. Nekoliko analiza je dostupno za merenje aktivnosti faktora VIII, uključujući analizu hromogenog supstrata i analizu zgrušavanja od jednog stadijuma iz evropske farmakopeje.
[0058] "Fc," kao što je ovde korišćen, označava funkcionalne neonatalne vezujuće partnere za receptor za Fc (FcRn), osim ukoliko je drugačije naznačeno. Vezujući partner FcRn je bilo koji molekul koji može biti specifično vezan sa FcRn receptorom sa posledičnim aktivnim transportom od strane FcRn receptora vezujućeg partnera FcRn. Na taj način, termin Fc obuhvata sve varijante IgG Fc koje su funkcionalne. Region Fc dela IgG koji se vezuje za FcRn receptor je opisan na osnovu rentgenske kristalografije (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Glavna kontaktna površina Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog teškog lanca Ig. Vezujući partneri FcRn obuhvataju, npr., ceo IgG, Fc fragment Igk, i druge fragmente IgG koji obuhvataju kompletan vezujući region FcRn. Glvna mesta kontakta obuhvataju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, i 314 od CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena. Reference na aminokiselinsku numeraciju imunoglobulina ili fragmenata imunoglobulina, ili regiona, su sve zasnovane na Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. (FcRn receptor je izolovan iz nekoliko sisarskih vrsta uključujući ljude. Sekvence humanog FcRn, pacovskog FcRn i mišjeg FcRn su poznate (Story et al.1994, J. Exp. Med.180: 2377). Fc može da sadrži CH2 i CH3 domene imunoglobulina sa ili bez zglobnog regiona imunoglobulina. Primeri Fc varijanti su dati u WO 2004/101740 i WO 2006/074199.
[0059] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može da sadrži jednu ili više mutacija, i kombinacije mutacija.
[0060] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može da sadrži mutacije koje pružaju povećani polu-život kao što je M252Y, S254T, T256E, i njihove kombinacije, kao što je navedeno u Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46:1750 (2009), H433K, N434F, i njihove kombinacije, kao što je navedeno u Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005); mutanti navedeni na stranicama 1-2, pasus [0012], i Primeri 9 i 10 iz SAD 2009/0264627 A1; i mutanti navedeni na stranici 2, pasusi [0014] do [0021] iz SAD 20090163699 A1.
[0061] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može takođe da obuhvata, npr., sledeće mutacije: Fc region IgG može biti modifikovan prema dobro poznatim postupcima kao što je mutageneza usmerena na mesto i slično za proizvodnju modifikovanih IgG ili Fc fragmenata ili njihovih delova koji će biti vezani sa FcRn. Takve modifikacije obuhvataju, npr., modifikacije udaljene od mesta kontakta FcRn kao i modifikacije unutar kontaktnih mesta koji čuvaju ili čak pojačavaju vezivanje za FcRn. Na primer sledeći pojedinačni aminokiselinskih ostaci u humanom IgG1 Fc (Fcy1) mogu biti supstituisani bez značajnog gubitka Fc vezujuće aktivnosti za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A. H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, i K447A, gde na primer P238A predstavlja divlji tip prolina supstituisan alaninom na položaju broj 238. Pored alanina druge aminokiseline mogu biti supstituisane za divlji tip aminokiselina na položajima naznačenim u prethodnom tekstu. Mutacije mogu biti uvedene pojedinačno u Fc dajući više od jedne stotine vezujućih partnera FcRn koji se razlikuju od nativnog Fc. Pored toga, kombinacije od dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu biti uvedene zajedno, dajući još stotine vezujućih partnera FcRn. Određene od ovih mutacija mogu da pruže novu funkcionalnost vezujućem partneru FcRn. Na primer, jedan primer izvođenja inkorporiše N297A, uklanjajući visoko konzervativno N-glikozilaciono mesto. Efekat ove mutacije je smanjenje imunogenosti, na taj način povećavajući polu-život vezujućeg partnera FcRn u cirkulaciji, i čineći vezujućeg partnera FcRn nesposobnim za vezivanje za FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, i FcyRIIIA, bez ugrožavanja afiniteta za FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847, Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Pored toga, najmanje tri humana Fc gama receptora izgleda da prepoznaju vezujuće mesto na IgG unutar donjeg zglobnog regiona, generalno aminokiselinama 234-237. Prema tome, sledeći primer nove funkcionalnosti i potencijalno smanjene imunogenosti može da se javi od mutacija ovog regiona, kao na primer zamenom aminokiselina 233-236 humanog IgG1 "ELLG" za odgovarajuću sekvencu iz IgG2 "PVA" (sa jednom aminokiselinskom delecijom). Pokazano je da FcyRI, FcyRII, i FcyRIII koji posreduju u različitim efektornim funkcijama neće se vezati za IgG1 kada su takve mutacije uvedene (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77, and Armour et al.1999, Eur. J. Immunol. 29:2613,). Kao sledeći primer nove funkcionalnosti koja nastaje od mutacija opisanih u prethodnom tekstu afinitet za FcRn može biti povećan više od onog kod divljeg tipa u nekim slučajevima. Ovaj povećani afinitet može da reflektuje povećanu stopu asocijacije, smanjenu stopu disocijacije ili oba povećanu stopu asocijacije i smanjenu stopu disocijacije. Mutacije za koje se veruje da pružaju povećani afinitet za FcRn obuhvataju, npr., T256A, T307A, E380A i N434A (Shields et al.2001, J. Biol. Chem.276:6591,).
[0062] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti najmanje 90% ili 95% identičan sa aminokiselinskom sekvencom Fc prikazanom u Tabeli 2 (aminokiseline 1439 do 1665 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 741 do 967 od SEQ ID aminokiseline 746 do 972 od SEQ ID NO:10; aminokiseline 685 do 924 od SEQ ID NO:12). Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti identičan sa aminokiselinskom sekvencom Fc prikazanom u Tabeli 2 (aminokiseline 1439 do 1665 od SEQ ID NO:2; aminokiseline 2333 do 2559 od SEQ ID NO:6; aminokiseline 741 do 967 od SEQ ID aminokiseline 746 do 972 od SEQ ID NO:10; aminokiseline 685 do 924 od SEQ ID NO:12).
[0063] "Hibridni" polipeptidi i proteini, kao što su ovde korišćeni, označavaju kombinaciju himernog polipeptida sa drugim polipeptidom. Himerni polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu biti povezani međusobno preko protein-protein interakcija, kao što su elektrostatičke ili hidrofobne interakcije. Himerni polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu biti vezani međusobno preko disulfidne ili druge kovalentne veze (veza). Hibridi su opisani u WO 2004/101740 i WO 2006/074199. Videti takođe SAD patente br. 7,404,956 i 7,348,004. Drugi polipeptid može biti druga kopija istog himernog polipeptida ili može biti ne-identičan himerni polipeptid. Videti, npr., Sliku 1, Primer 1, i Tabelu 2. U poželjnim primerima izvođenja, drugi polipeptid je polipeptid koji sadrži Fc. U poželjnim primerima izvođenja, himerni polipeptid je himerni polipeptid faktora VIII-Fc i drugi polipeptid se uglavnom sastoji od Fc, npr, hibridni polipeptid iz Primera 1, koji je rFVIIIFc rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od jednog molekula rekombinantnog humanog FVIII sa deletiranim domenom B (BDD-rFVIII) fuzionisanog sa fimernim Fc domenom humanog IgG1, bez linker sekvenci između. Ovaj hibridni polipeptid je ovde označen kao FVIIIFc monomerni Fc fuzioni protein, FVIIIFc monomerni hibrid, monomerni FVIIIIFc hibrid, i FVIIIFc monomer-dimer. Videti Primer 1, Sl. 1, i Tabelu 2A. Primeri daju prekliničke i kliničke podatke za ovaj hibridni polipeptid.
[0064] Drugi polipeptid u hibridu može da sadrži ili se sastoji uglavnom od sekvence koja je najmanje 90% ili 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 227 od SEQ ID NO:4) ili najmanje 90% ili 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -20 do 227 od SEQ ID NO:4). Drugi polipeptid može da sadrži ili se uglavnom sastoji od sekvence identične sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 1 do 227 od SEQ ID NO:4) ili identične sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 2A(ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline -20 do 227 od SEQ ID NO:4).
[0065] Slika 1 je šematski prikaz koji prikazuje strukturu himernog polipeptida faktora VIII sa deletiranim B domenom i Fc sa, i njegovu vezu sa drugim polipeptidom koji je Fc polipeptid. Da bi se dobio ovaj hibrid, kodirajuća sekvenca humanog rekombinantnog FVIII sa deletiranim B domenom je dobijena pomoću reverzne transkripcije-reakcije lanca polimeraze (RT-PCR) iz humane poli A RNK jetre (Clontech) upotrebom prajmera specifičnih za FVIII. Sekvenca FVIII obuhvata nativnu signalnu sekvencu za FVIII. Delecija B-domena je iz serina 743 (S743; 2287 bp) u glutamin 1638 (Q1638; 4969 bp) za potpunu deleciju od 2682 bp. Zatim, kodirajuća sekvenca za humani rekombinantni Fc je dobijena pomoću RT-PCR iz biblioteke cDNK humanih leukocita (Clontech) upotrebom prajmera specifičnih za Fc. Prajmeri su dizajnirani tako da je sekvenca FVIII sa deletiranim B domenom fuzionisana direktno sa N-terminusom Fc sekvence bez linkera između. DNK sekvenca FVIIIFc je klonirana u sisarski dvostruki ekspresioni vektor pBUDCE4.1 (Invitrogen) pod kontrolom CMV promotora. Druga identična Fc sekvenca uključujući mišju signalnu sekvencu Igk dobijena je pomoću RT-PCR i klonirana nishodno od drugog promotora, EF1α, u ekspresionom vektoru pBUDCE4.1.
[0066] Ekspresioni vektor rFVIIIFc je transficiran u humane embrionalne ćelije bubrega 293 (HEK293H; Invitrogen) upotrebom Lipofectamine 2000 transfekcionog reagensa (Invitrogen). Stabilne klonalne ćelijske linije su generisane selekcijom sa Zeocinom (Invitrogen). Jedna klonalna ćelijska linija, 3C4-22 je korišćena za generisanje FVIIIFc za karakterizaciju in vivo. Rekombinantni FVIIIFc je proizveden i prečišćen (McCue et al.2009) u Biogen Idec (Cambridge, MA). Transfekciona strategija opisana u prethodnom tekstu očekuje se da proizvodi tri proizvoda, tj., monomerne rFVIIIFc hibride, dimerne rFVIIIFc hibride i dimerni Fc. Međutim, uglavnom nije detektovan dimerni rFVIIIFc u kondicioniranom medijumu iz ovih ćelija. Radije, kondicionirani medijum je sadržao Fc i monomerni rFVIIIFc. Moguće je da je veličina dimernog rFVIIIFc bila prevelika i da je sprečila efikasno izlučivanje iz ćelije. Ovaj rezultat je bio koristan s obzirom na to da je pružio prečišćavanje monomera koje je manje komplikovano nego kada su prisutna tri proteina. Materijal korišćen u ovim studijama imao je specifičnu aktivnost od približno 9000 IU/mg.
[0067] "Interval doziranja," kao što je ovde korišćen, označava količinu vremena koje prođe između primene na subjekta višestrukih doza. Poređenje intervala doziranja može se izvesti u jednom subjektu ili u populaciji subjekata i zatim se može izračunati srednja vrednost dobijena u populaciji.
[0068] Interval doziranja kada se primenjuje himerni polipeptid faktora VIII, npr., himerni polipeptid faktora VIII-Fc (polipeptid koji sadrži faktor VIII ili hibrid) prema pronalasku može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII, npr., bez Fc dela (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktora VIII). Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu do šest puta duži, jedan i jednu polovinu do pet puta duži, jedan i jednu polovinu do četiri puta duži, jedan i jednu polovinu do tri puta duži, ili jedan i jednu polovinu do dva puta duži, od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII, npr., bez Fc dela (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktora VIII). Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu, dva, dva i jednu polovinu, tri, tri i jednu polovinu, četiri, četiri i jednu polovinu, pet, pet i jednu polovinu ili šest puta duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu navedenog faktora VIII bez dela koji nije faktor VIII, npr., bez Fc dela (polipeptid koji se sastoji od navedenog faktora VIII). Interval doziranja može biti oko svakih pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, ili četrnaest dana ili duži. Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i jednu polovinu do 5, jedan i jednu polovinu, 2, 3, 4, ili 5 dana ili duži. Za tretman na zahtev, interval doziranja navedenog himernog polipeptida ili hibrida je oko jednom svakih 24-36, 24-48, 24-72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 ili 72 časa ili duži.
[0069] Poželjno, efikasna doza je 25-65 IU/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64 ili 65 IU/kg) i interval doziranja je jednom svakih 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 ili više dana, ili tri puta nedeljno, ili ne više od tri puta nedeljno. Poželjno, efikasna doza je 65 IU/kg i interval doziranja je jednom nedeljno, ili jednom svakih 6-7 dana.
[0070] "Faktor VIII sa dugotrajnim dejstvom" je faktor VIII koji ima povećani polu-život (takođe označen ovde kao t1/2, t1/2 beta, polu-život eliminacije i HL) u odnosu na referentni faktor VIII. Povećani polu-život faktora VIII sa dugotrajnim dejstvom može biti posledica fuzije sa jednim ili više polipeptida koji ne sadrže faktor VIII kao što su, npr., Fc, XTEN ili albumin. Povećani polu-život može biti posledica jedne ili više modifikacija, kao što je, npr., pegilacija. Primeri polipeptida faktora VIII sa dugotrajnim dejstvom obuhvataju, npr., himerne polipeptide faktora VIII koji sadrže Fc, himerne polipetide faktora VIII koji sadrže XTEN i himerne polipeptide faktora VIII koji sadrže albumin. Dodatni primeri polipeptida faktora VIII sa dugotrajnim dejstvom obuhvataju, npr., pegilovani faktor VIII.
[0071] "Referentni" polipeptid, u slučaju himernog polipeptida faktora VIII sa dugotrajnim dejstvom, je polipeptid koji se uglavnom sastoji od faktor VIII dela himernog polipeptida, npr., isti faktor VIII deo bez Fc dela, bez XTEN dela ili bez albumin dela. Slično, referentni polipeptid u slučaju modifikovanog faktora VIII je isti faktor VIII bez modifikacije, npr., faktor VIII bez pegilacije.
[0072] U nekim primerima izvođenja, faktor VIII sa dugotrajnim dejstvom ima jednu ili više od sledećih osobina kada je primenjen na subjekta:
srednje vreme boravka (MRT) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 14-41.3 časova; klirens (CL) (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 1.22-5.19 mL/čas/kg ili manje; t1/2beta (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 11-26.4 časova;
inkremetalni oporavak (K vrednost) (aktivnost; zabeležena) u navedenom subjektu od oko 1.38-2.88 IU/dL po IU/kg;
Vss (aktivnost) u navedenom subjektu od oko 37.7-79.4 mL/kg; i
AUC/dozi u navedenom subjektu od oko 19.2-81.7 IU*h/dL po IU/kg.
[0073] U nekim primerima izvođenja, faktor VIII sa dugotrajnim dejstvom ima jednu ili više od sledećih osobina kada je primenjen na populaciju pacijenata:
srednja vrednost inkremetalnog oporavka (K-vrednost) (aktivnost; zabeležena) veća od 1.38 IU/dL po IU/kg;
srednja vrednost inkremetalnog oporavka (K-vrednost) (aktivnost; zabeležena) najmanje oko 1.5, najmanje oko 1.85, ili najmanje oko 2.46 IU/dL po IU/kg.
srednja vrednost klirensa (CL) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.33 ± 1.08 mL/čas/kg ili manje;
srednja vrednost klirensa (CL) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 1.8-2.69 mL/čas/kg;
srednja vrednost klirensa (CL) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata koja je oko 65% od klirensa polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije;
srednja vrednost vremena boravka (MRT) (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od najmanje oko 2.33 ± 8.33 časova;
srednja vrednost MRT (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 25.9 - 26.5 časova;
srednja vrednost MRT (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata koja je oko 1.5 puta duža od srednje vrednosti MRT polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije; srednja vrednost t1/2beta (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.33 ± 5.79 časova;
srednja vrednost t1/2beta (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata koja je oko 18 - 18.4 časova;
srednja vrednost t1/2beta (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata koja je oko 1.5 puta duža od srednje vrednosti t1/2beta polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije;
srednja vrednost inkremetalnog oporavka (K vrednost) (aktivnost; zabeležena) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.33 ± 0.44 IU/dL po IU/kg;
srednja vrednost inkremetalnog oporavka (K vrednost) (aktivnost; zabeležena) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 1.85 - 2.46 IU/dL po IU/kg;
srednja vrednost inkremetalnog oporavka (K vrednost) (aktivnost; zabeležena) u navedenoj populaciji pacijenata koja je oko 90 % od srednje vrednosti inkremetalnog oporavka polipeptida koji sadrži navedeni faktor VIII bez modifikacije;
srednja vrednost Vss (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.33 ± 12.3 mL/kg; srednja vrednost Vss (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 45.3 - 56.1 mL/kg; srednja vrednost AUC/dozi (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 2.33 ± 18.2 IU*h/dL po IU/kg;
srednja vrednost AUC/dozi (aktivnost) u navedenoj populaciji pacijenata od oko 44.8 - 57.6 IU*h/dL po IU/kg.
[0074] "Tretman na zahtev," kao što je ovde korišćen, označava tretman koji je namenjen da se odigra tokom kratkog vremena i to je odgovor na postojeće stanje, kao što je epizoda krvarenja, ili zabeležena potreba kao što je planirana operacija. Stanja koja mogu da zahtevaju tretman na zahtev obuhvataju, npr., epizodu krvarenja, hemartrozu, krvarenje mišića, oralno krvarenje, krvarenje, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, traumu, traumu capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, frakturu kosti, krvarenje centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, ili krvarenje u ovojnici mišića illiopsoas. Kod subjekta može da postoji potreba za hirurškom profilaksom, perioperativnim menadžmentom, ili tretmanom za operaciju. Takve operacije obuhvataju, npr., manju operaciju, veliku operaciju, vađenje zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovektomiju, kompletnu zamenu kolena, kraniotomiju, osteosintezu, operaciju traume, intrakranijalnu operaciju, intra-abdominalnu operaciju, intratorakalnu operaciju ili operaciju zamene zgloba.
[0075] Poželjno, tretman na zahtev rešava više od 80% (više od 80%, više od 81%, više od 82%, više od 83%, više od 84%, više od 85%, više od 86%, više od 87%, više od 88%, više od 89%, više od 90%, više od 91%, više od 92%, više od 93%, više od 94%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98%, više od 99%, ili 100%) ili 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, ili 95-100% krvarenja (npr., spontanih krvarenja) u jednoj dozi. Poželjno, više od 80% (više od 81%, više od 82%, više od 83%, više od 84%, više od 85%, više od 86%, više od 87%, više od 88%, više od 89%, više od 90%, više od 91%, više od 92%, više od 93%, više od 94%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98% ili 100%) ili 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, ili 95-100% epizoda krvarenja su ocenjene kao odlične ili dobre od strane lekara posle tretmana na zahtev. Poželjno, više od 5%, (više od 6%, više od 7%, više od 8%, više od 9%, više od 10%, više od 11%, više od 12%, više od 13%, više od 14%, više od 15%, više od 16%, više od 17%, više od 18%, više od 19%, više od 20%), ili 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-20%, ili 10-15% epizoda krvarenja su ocenjene kao povoljne od strane lekara posle tretmana na zahtev.
[0076] "Polipeptid," "peptid" i "protein" su korišćeni naizmenično i označavaju polimerno jedinjenje koje se sastoji od kovalentno vezanih aminokiselinskih ostataka.
[0077] "Polinukleotid" i "nukleinska kiselina" su korišćeni naizmenično i označavaju polimerno jedinjenje koje se sastoji od kovalentno vezanih nukleotidnih ostataka. Polinukleotidi mogu biti DNK, cDNK, RNK, jednolančani, ili dvolančani, vektori, plazmidi, fag ili virusi. Polinukleotidi obuhvataju, npr., one u Tabeli 1, koji kodiraju polipeptide iz Tabele 2 (videti Tabelu 1). Polinukleotidi takođe obuhvataju, npr., fragmente polinukleotida iz Tabele 1, npr., one koji kodiraju fragmente polipeptida iz Tabele 2, kao što je faktor VIII, Fc, signalna sekvenca, 6His i drugi fragmenti polipeptida iz Tabele 2.
[0078] "Profilaktički tretman," kao što je ovde korišćen, označava primenu polipeptida faktora VIII u višestrukim dozama na subjekta tokom određenog vremena da bi se povećao nivo aktivnosti faktora VIII u plazmi subjekta. Poželjno, povećani nivo je dovoljan za smanjenje incidence spontanog krvarenja ili za sprečavanje krvarenja, npr., u slučaju nepredviđene povrede. Poželjno, u toku profilaktičkog tretmana, nivo proteina u plazmi u subjektu ne pada ispod polaznog nivoa za tog subjekta, ili ispod nivoa faktora VIII koji karakteriše tešku hemofiliju (<1 IU/d1 [1%]).
[0079] Poželjno, režim profilakse je "prilagođen" za individualnog pacijenta, poželjno određivanjem PK podataka za svakog pacijenta i primenom faktora VIII prema pronalasku u intervalu doziranja koji održava nizak nivo od 1-3% aktivnosti FVIII. Podešavanja mogu biti napravljena kada subjekat ima neprihvatljive epizode krvarenja definisane kao ≥2 spontane epizode krvarenja tokom diskontinuiranog perioda od dva mesea. U ovom slučaju, podešavanje će se postići preko nivoa od 3-5%. Poželjno, profilaktički tretman rezultuje u prevenciji i kontroli krvarenja, produženoj kontroli krvarenja, produženoj zaštiti od krvarenja, i/ili produženoj koristi. Profilaksa, npr., produžena zaštita može biti pokazana preko povećane AUC do poslednje merene vremenske tačke (AUC-LAST) i smanjenog klirensa, rezultujući u povećanom terminalnom t1/2 u poređenju sa FVIII sa kratkim dejstvom. Poželjno, profilaksa je demonstrirana boljim Cmax, boljim Tmax, i/ili većom srednjom vrednošću vremena boravka naspram FVIII sa kratkim dejstvom. Poželjno, profilaksa rezultuje u tome da nema epizoda spontanog krvarenja u roku od oko 24, 36, 48, 72, ili 96 časova (npr., 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ili 96 časova, poželjno u roku od 72 časova), posle injekcije (npr., poslednje injekcije). Poželjno, profilaksa rezultuje u više od 30% (npr., više od 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89 ili 90%, poželjno više od 50%), srednjeg smanjenja u godišnjim epizodama krvarenja sa doziranjem od jednom nedeljno (npr., u 65 IU/kg).
[0080] "Subjekat," kao što je ovde korišćen označava čoveka ili nehumanog sisara. Nehumani sisari obuhvataju, npr., miševe, pse, primate, majmune, mačke, konje, krave, svinje, i druge domaće životinje i male životinje.
[0081] "Terapeutska doza," kao što je ovde korišćena, označava dozu koja postiže terapeutski cilj, kao što je ovde korišćen. Izračunavanje potrebne doze faktora VIII je zasnovano na empirijskom nalazu da, u proseku, 1 IU faktora VIII po kg telesne težine podiže aktivnost faktora VIII u plazmi za približno 2 IU/dL. Potrebna doza je određena upotrebom sledeće formule:
Potrebne jedinice = telesna težina (kg) x željeno povećanje faktora VIII (IU/dL ili % od normalnog) x 0.5 (IU/kg po IU/dL)
[0082] Terpauetske doze koje mogu biti korišćene u postupcima pronalaska su oko 10-100 IU/kg, specifičnije, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ili 90-100 IU/kg, i specifičnije, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100 IU/kg.
[0083] Dodatne terapeutske doze koje mogu biti korišćene u postupcima pronalaska su oko 10 do oko 150 IU/kg, specifičnije, oko 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150 IU/kg, i specifičnije, oko 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ili 150 IU/kg.
[0084] "Varijanta," kao što je ovde korišćena, označava polinukleotid ili polipeptid koji se razlikuje od originalnog polinukleotida ili polipeptida, ali koji zadržava njegove esencijalne osobine, npr., koagulantnu aktivnost faktora VIII ili aktivnost Fc (vezivanje FcRn). Generalno, varijante su ukupno veoma slične, i, u mnogim regionima, identične originalnom polinukleotidu ili polipeptidu. Varijante obuhvataju, npr., fragmente polipeptida i polinukleotida, delecije, insercije i modifikovane verzije originalnih polipeptida.
[0085] Varijante polinukleotida mogu da sadrže, ili se alternativno sastoje od, nukleotidne sekvence koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa, na primer, nukleotidnom kodirajućom sekvencom u SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9 ili 11 (faktor VIII deo, Fc deo, pojedinačno ili zajedno) ili njenim komplementarnim lancem, nukleotidnom kodirajućom sekvencom poznatog mutanta i rekombinantnog faktora VIII ili Fc kao što su one navedene u publikacijama i patentima koji su ovde citirani ili njihovim komplementarnim lancima, nukleotidnom kodirajućom sekvencom koja kodira polipeptid od SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 ili 12 (faktor VIII deo, Fc deo, pojedinačno ili zajedno), i/ili polinukleotidnim fragmentima bilo kog od ovih molekula nukleinskih kiselina (npr., oni fragmenti opisani ovde). Polinukleotidi koji se hibridizuju do ovih molekula nukleinskih kiselina pod strogim uslovima hibridizacije ili manje strogim uslovima hibridizacije su takođe uključeni kao varijante, kao što su polipeptidi kodirani ovim polinukleotidima sve dok su oni funkcionalni.
[0086] Varijante polipeptida mogu da sadrže, ili se alternativno sastoje od, aminokiselinske sekvence koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identična sa, na primer, polipeptidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 ili 12 (faktor VIII deo, Fc deo, pojedinačno ili zajedno), i/ili polipeptidnim fragmentima bilo kog od ovih polipeptida (npr., oni fragmenti koji su ovde opisani).
[0087] Nukleinska kiselina koja ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje, na primer, 95% "identična" sa referentnom nukleotidnom sekvencom, određena tako da označava nukleotidnu sekvencu nukleinske kiseline koja je identična sa referentnom sekvencom osim što nukleotidna sekvenca može da obuhvata do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobila nukleinska kiselina koja ima nukleotidnu sekvencu najmanje 95% identičnu sa referentnom nukleotidnom sekvencom, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti deletirano ili supstituisano sa drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% od ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti inserirano u referentnoj sekvenci. Korišćena sekvenca može biti, na primer, cela sekvenca prikazana u SEQ ID NO:1 ili 3, ORF (otvoreni okvir čitanja), ili bilo koji fragment naznačen kao opisan ovde.
[0088] Kao što je praktično, da li je bilo koji određeni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa nukleotidnom sekvencom ili polipeptidom prema predmetnom pronalasku može se odrediti konvencionalno upotrebom poznatih kompjuterskih programa. Poželjan postupak za određivanje najboljeg ukupnog poklapanja između korišćene sekvence (referentna ili originalna sekvenca) i predmetne sekvence, takođe označeno kao globalno poravnanje sekvenci, može se odrediti upotrebom FASTDB kompjuterskog programa na osnovu algoritma od Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). U poravnanju sekvenci korišćene i predmetne sekvence su obe DNK sekvence. RNK sekvenca može biti upoređivana prevođenjem U u T. Rezultat navedenog globalnog poravnanja sekvenci je u procentima identičnosti. Poželjni parametri korišćeni u FASTDB poravnanju DNK sekvenci za izračunavanje procenta identičnosti su: matrica=jedinična, „k-tuple“=4, kazna nepoklapanja =1, kazna spajanja=30, Dužina grupe randomizacije =0, granična ocena=1, kazna za prazninu=5, kazna za veličinu praznine 0.05, veličina prozora=500 ili dužina predmetne nukleotidne sekvence, šta god je kraće.
[0089] Ako je predmetna sekvenca kraća od korišćene sekvence zbog 5' ili 3' delecija, ne zbog unutrašnjih delecija, mora se napraviti ručna ispravka rezultata. Ovo je zbog toga što FASTDB program ne uračunava skraćenja na 5' i 3' predmetne sekvence prilikom izračunavanja procenta identičnosti. Za predmetne sekvence skraćene na 5' ili 3' krajevima, u odnosu na korišćenu sekvencu, procenat identičnosti je ispravljen izračunavanjem broja baza korišćene sekvence koje su 5' i 3' od predmetne sekvence, koje nisu poklopljene/poravnate, kao procenat od ukupnih baza korišćene sekvence. Da li je nukleotid poklopljen/poravnat određuje se pomoću rezultata FASTDB poravnanja sekvenci. Ovaj procenat je zatim oduzet od procenta identičnosti, izračunatog pomoću gore navedenog FASTDB programa upotrebom naznačenih parametara, da bi se došlo do krajnje ocene procenta identičnosti. Ova ispravljena ocena je ono šta se koristi za svrhe predmetnog pronalaska. Samo baze izvan 5' i 3' baza predmetne sekvence, kao što je prikazano pomoću FASTDB poravnanja, koje nisu poklopljene/poravnate sa korišćenom sekvencom, su izračunate za svrhe ručnog podešavanja ocene procenta identičnosti.
[0090] Na primer, predmetna sekvenca od 90 baza je poravnata sa korišćenom sekvencom od 100 baza da bi se odredio procenat identičnosti. Delecije se javljaju na 5' kraju predmetne sekvence i prema tome, FASTDB poravnanje ne pokazuje poklapanje/poravnanje prvih 10 baza na 5' kraju. 10 nesparenih baza predstavljaju 10% sekvence (broj baza na 5' i 3' krajevima koje nisu poklopljene/ukupan broj baza u korišćenoj sekvenci) tako da se 10% oduzima od ocene procenta identičnosti izračunate pomoću FASTDB programa. Ako su preostalih 90 baza savršeno poklopljene krajnji procenat identičnosti bi bio 90%. U sledećem primeru, predmetna sekvenca od 90 baza je upoređivana sa korišćenom sekvencom od 100 baza. Ovog puta delecije su unutrašnje tako da nema baza na 5' ili 3' predmetne sekvence koje nisu poklopljene/portavnate sa korišćenom sekvencom. U ovom slučaju procenat identičnosti koji se izračunava pomoću FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, samo baze 5' i 3' predmetne sekvence koje nisu poklopljene/poravnate sa korišćenom sekvencom su ručno ispravljene. Za svrhe predmetnog pronalaska ne prave se dodatne ručne ispravke.
[0091] Polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje, na primer, 95% "identičnu" sa korišćenom aminokiselinskom sekvencom predmetnog pronalaska, određeno je da je aminokiselinska sekvenca predmetnog polipeptida identična korišćenoj sekvenci osim što predmetna polipeptidna sekvenca može da obuhvata do pet aminokiselinskih promena na svakih 100 aminokiselina korišćene aminokiselinske sekvence. Drugim rečima, za dobijanje polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu sa korišćenom aminokiselinskom sekvencom, do 5% aminokiselinskih ostataka u predmetnoj sekvenci može biti inserirano, deletirano, (umetnuto) ili supstituisano sa drugom aminokiselinom. Ove promene referentne sekvence mogu da se jave na amino ili karboksi terminalnim položajima referentne aminokiselinske sekvence ili bilo gde između tih terminalnih položaja, razasute bilo pojedinačno među ostacima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više kontinuiranih grupa unutar referentne sekvence.
[0092] Kao što je praktično, da li je bilo koji određeni polipeptid najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa, na primer, aminokiselinskim sekvencama od SEQ ID NO:2 (faktor VIII deo, Fc deo, pojedinačno ili zajedno) ili 4, ili poznatom polipeptidnom sekvencom faktora VIII ili Fc, može se odrediti konvencionalno upotrebom poznatih kompjuterskih programa. Poželjan postupak za određivanje najboljeg ukupnog poklapanja između korišćene sekvence (referentne ili originalne sekvence) i predmetne sekvence, takođe označeno kao globalno poravnanje sekvenci, može se odrediti upotrebom FASTDB kompjuterskog programa na bazi algoritma od Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990). U poravnanju sekvenci korišćena i predmetna sekvenca su ili obe nukleotidne sekvence ili obe aminokiselinske sekvence. Rezultat navedenog globalnog poravnanja sekvenci je u procentima identičnosti. Poželjni parametri korišćeni u FASTDB aminokiselinskom poravnanju su: Matrica=PAM 0, „k-tuple“=2, kazna nepoklapanja =1, kazna spajanja=20, Dužina grupe randomizacije =0, granična ocena=1, veličina prozora=dužina sekvence, kazna za prazninu=5, kazna za veličinu praznine 0.05, veličina prozora=500 ili dužina predmetne nukleotidne sekvence, šta god je kraće
[0093] Ako je predmetna sekvenca kraća od korišćene sekvence zbog N- ili C-terminalnih delecija, ne zbog unutrašnjih delecija, rezultati moraju biti ručno ispravljeni. Ovo je zbog toga što FASTDB program ne uračunava N- i C-terminalno skraćenje predmetne sekvence prilikom izračunavanja globalnog procenta identičnosti. Za predmetne sekvence skraćene na N- ili C- terminusima, u odnosu na korišćenu sekvencu, procenat identičnosti je ispravljen izračunavanjem broja ostataka korišćene sekvence koje su N- i C-terminalno od predmetne sekvence, koji nisu poklopljeni/poravnati sa odgovarajućim predmetnim ostatkom, kao procenat od ukupnih baza korišćene sekvence. Da li je ostatak poklopljen/poravnat određuje se pomoću rezultata FASTDB poravnanja sekvenci. Ovaj procenat je zatim oduzet od procenta identičnosti, izračunatog pomoću gore navedenog FASTDB programa upotrebom naznačenih parametara, da bi se došlo do krajnje ocene procenta identičnosti. Ova ispravljena ocena procenta identičnosti je ono šta se koristi za svrhe predmetnog pronalaska. Samo ostaci do N- i C-terminusa predmetne sekvence, koji nisu poklopljeni/poravnati sa korišćenom sekvencom razmatraju se za svrhe ručnog podešavanja ocene procenta identičnosti. To jest, samo položaji korišćenih ostataka izvan najdaljih N- i C-terminalnih ostataka predmetne sekvence.
[0094] Na primer, predmetna sekvenca od 90 aminokiselinskih ostataka je poravnata sa korišćenom sekvencom od 100 ostataka da bi se odredio procenat identičnosti. Delecija se javlja na N-terminusu predmetne sekvence i prema tome, FASTDB poravnanje ne pokazuje poklapanje/poravnanje prvih 10 ostataka na N-terminu. 10 nesparenih ostataka predstavljaju 10% sekvence (broj ostataka na N- i C-terminusima koji nisu poklopljeni/ukupan broj ostataka u korišćenoj sekvenci) tako da se 10% oduzima od ocene procenta identičnosti izračunate pomoću FASTDB programa. Ako su preostalih 90 ostataka savršeno poklopljeni krajnji procenat identičnosti bi bio 90%. U sledećem primeru, predmetna sekvenca od 90 ostataka je upoređivana sa korišćenom sekvencom od 100 ostataka. Ovog puta delecije su unutrašnje delecije tako da nema ostataka na N- ili C-terminusima predmetne sekvence koji nisu poklopljeni/poravnati sa korišćenom sekvencom. U ovom slučaju procenat identičnosti koji se izračunava pomoću FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, samo položaji ostataka izvan N- i C-terminalnih krajeva predmetne sekvencem kao što su prikazani u FASTDB poravnanju, koji nisu poklopljeni/poravnati sa korišćenom sekvencom su ručno ispravljeni. Za svrhe predmetnog pronalaska ne prave se dodatne ručne ispravke.
[0095] Polinukleotidne varijante mogu da sadrže promene u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oba. Naročito su poželjne polinukleotidne varijante koje sadrže promene koje proizvode tihe supstitucije, adicije ili delecije, ali ne menjaju osobine ili aktivnosti kodiranog polipeptida. Poželjne su nukleotidne varijante proizvedene tihim supstitucijama zbog degeneracije genetičkog koda. Pored toga varijante u kojima je 5-10, 1-5 ili 1-2 aminokiselina supstituisano, deletirano ili dodato u bilo kojoj kombinaciji su takođe poželjne. Polinukleotidne varijante mogu biti proizvedene zbog različitih razloga, npr., za optimizaciju ekspresije kodona za određenog domaćina (promena kodona u humanoj iRNK za one poželjne pomoću bakterijskog domaćina kao što je E. coli).
[0096] Prirodne varijante su označene "alelske varijante," i označavaju jedan od nekoliko alternativnih oblika gena koji zauzima dati lokus na hromozomu organizma (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Ove alelske varijante mogu da variraju na polinukleotidnom i/ili polipeptidnom nivou i obuhvaćene su u predmetni pronalazak. Alternativno, varijante koje se ne javljaju u prirodi mogu biti proizvedene pomoću tehnika mutageneze ili pomoću direktne sinteze.
[0097] Upotrebom poznatih postupaka konstrukcije proteina i rekombinantne DNK tehnologije, varijante mogu biti generisane za poboljšanje ili promenu karakteristika polipeptida. Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu biti deletirane sa N-terminusa ili C-terminusa izlučenog proteina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Autori Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), objavili su varijante KGF proteina koje imaju aktivnost vezivanja heparina čak posle delecije 3, 8 ili 27 amino-terminalnih aminokiselinskih ostataka. Slično, Interferon gama je ispoljio do deset puta višu aktivnost posle delecije 8-10 aminokiselinskih ostataka sa karboksi terminusa ovog proteian. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).
[0098] Pored toga, obimni dokazi pokazuju da varijante često zadržavaju biološku aktivnost sličnu onoj od prirodnog proteina. Na primer, Gayle i saradnici (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)), izveli su ekstenzivnu mutacionu analizu humanog citokina IL-1a. Oni su koristili slučajnu mutagenezu za generisanje preko 3,500 pojedinačnih IL-la mutanata sa prosekom od 2.5 aminokiselinskih promena po varijanti duž cele dužine molekula. Višestruke mutacije su ispitivane na svakom mogućem aminokiselinskom položaju. Istraživači su našli da "[većina molekula bi mogla biti promenjena sa malim efektom na jedno od [vezivanje ili biološku aktivnost]." (Videti apstrakt.) Ustvari, samo 23 jednistvene aminokiselinske sekvence, od više od 3,500 ispitianih nukleotidnih sekvenci, je proizvelo protein koji se značajno razlikovao u aktivnosti od divljeg tipa.
[0099] Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, polipeptidne varijante obuhvataju, npr., modifikovane polipeptide. Modifikacije obuhvataju, npr., acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hem grupe, kovalentno vezivanje nukleotida ili nukleotidnog derivata, kovalentno vezivanje lipida ili lipidnog derivata, kovalentno vezivanje fosfatidilinozitola, unakrsno vezivanje, ciklizaciju, formiranje disulfidne veze, demetilaciju, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cisteina, formiranje piroglutamata, formilaciju, gama-karboksilaciju, glikozilaciju, formiranje GPI sidra, hidroksilaciju, jodinaciju, metilaciju, miristoilaciju, oksidaciju, pegilaciju (Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)), proteolitičku obradu, fosforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, selenoilaciju, sulfataciju, adiciju aminokiseline proteinima kao što je arginilacija posredovana preko transfer-RNK i ubikvitinaciju. U nekim primerima izvođenja, faktor VIII je modifikovan, npr., pegilovan, na bilo kojoj pogodnoj lokaciji. U nekim primerima izvođenja, faktor VIII je pegilovan na aminokiselini izloženoj na površini faktora VIII, poželjno cisteinu izloženom na površini, koji može biti konstruisani cistein. Mei et al. (2010). U nekim primerima izvođenja, modifikovani faktor VIII, npr., pegilovani faktor VIII, je faktor VIII sa dugotrajnim dejstvom.
[0100] "Zapremina raspodele u stanju mirovanja (Vss)," kao što je ovde korišćena, ima isto značenje kao termin korišćen u farmakologiji, koja je vidljiv prostor (zapremina) u kome se raspodeljuje lek. VSS= količina leka u telu podeljena koncentracijom u plazmi u stanju mirovanja.
[0101] "Oko," kao što je ovde korišćen za opseg, modifikuje oba kraja opsega. Na taj način, "oko 10-20" označava "oko 10 do oko 20."
[0102] Kako sada imamo opisan predmetni pronalazak detaljno, isti će biti jasnije shvaćen u vezi sa sledećim primerima, koji su ovde obuhvaćeni samo za svrhe ilustrovanja, i nije bila namera da budu ograničavajući za pronalazak.
Primer 1
Apstrakt
[0103] Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII-Fc (rFVIIIFc) sa deletiranim B domenom je stvoren za produženje polu-života FVIII. rFVIIIFc je ispitivan u mišjim i psećim modelima teške hemofilije A i upoređivan sa rFVIII (ReFacto®). Ukupno vreme zgrušavanja krvi (WBCT) kod miševa sa hemofilijom A je ispravljeno za približno dva do tri puta duže i poluživot eliminacije u plazmi je bio skoro dva puta duži za rFVIIIFc u poređenju sa ReFacto®. Kod pasa sa hemofilijom A, intravenska doza rFVIIIFc (125 IU/kg) ispravila je WBCT do normale. WBCT je ostao ispod 20 min, vreme u skladu sa FVIII:C > 1%, do približno 96 časova, u poređenju sa 48 časova za pse tretirane sa ReFacto®. Polu-život eliminacije rFVIIIFc u plazmi pasa, kada je meren upotrebom ELISA ili analiza hromogene aktivnosti, bio je 2.33 ± 1.7 časova i 2.33 ± 0.3 časova, respektivno. ReFacto® ispravljeni WBCT za približno jednu polovinu sve dok je rFVIIIFc i poluživot u plazmi bio 7.0 časova. Na taj način, fuzija FVIII sa Fc proizvela je molekul sa povećanim polu-životom u plazmi i sposobnošću da se obezbedi produžena zaštita od krvarenja.
Uvod
[0104] Snižen mortalitet, prevencija oštećenja zgloba i poboljšani kvalitet života su bili važna postignuća zahvaljujući razvoju FVIII poreklom iz plazme i rekombinantnog FVIII. Produžena zaštita od krvarenja bi predstavljala drugo ključno unapređenje u lečenju pacijenata sa hemofilijom A. Pronalazači su stvorili himerni protein i hibrid rekombinantnog faktora VIII-Fc (rFVIIIFc) kao pristup produženju polu-života FVIII.
[0105] rFVIIIFc je heterodimerni hibridni protein koji se sastoji od FVIII sa deletiranim faktorom B fuzionisanim rekombinantno za Fc domen humanog imunoglobulina G1 (IgG1) (Sl. 1, SEQ ID NO:2; Tabela 2A) (Ovaj protein je takođe označen ovde kao fuzioni protein FVIIIFc i monomernog Fc, monomerni hibrid FVIIIFc, hibrid monomernog FVIIIIFc, i FVIIIFc monomer-dimer.). Fc omogućava vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za zaštitu IgG od degradacije i pruža IgG polu-život od tri nedelje zabeležen kod ljudi (Ghetie V, and Ward ES., Annu. Rev. Immunol. 2000;18:739-766; Roopenian DC, and Akilesh S., Nature Rev. Immunol.2007;7:715-725).
[0106] Fc domen IgG1 je fuzionisan sa faktorima rasta, citokinima, enzimima i ligandvezujućim regionima receptora (Ashkanazi A, et al., Int. Rev. Immunol. 1993:10:219-27; Chamow SM, and Ashkanazi A, Trends Biotechnol. 1996:14:52-60; Fisher et al., N. Engl. J. Med. 1996:334(26): 1697-702). Nekoliko od ovih su postali važni terapeutski molekuli (npr. etanercept, alefacept, abatacept). U ovim fuzionim proteinima, dva efektorna molekula su povezana sa dva Fc molekula. U ovom primeru, rFVIIIFc je konstruisan kao fuzioni protein monomernog Fc (jedna kopija polipeptida koji se sastoji od sekvence u Tabeli 2A(i) (SEQ ID NO:2) sa ili bez signalne sekvence i jedna kopija polipeptida koja se sastoji od sekvence u Tabeli 2A(ii) (SEQ ID NO:4) sa ili bez signalne sekvence), tj., samo sa jednom kopijom efektornog molekula (videti Sliku 1), i studije predstavljene ovde upoređuju farmakodinamiku i farmakokinetiku ovog novog proteina sa rFVIII u mišjim i psećim modelima hemofilije A. Signalna sekvenca je cepana u toku izlučivanja. Ovaj proteinski konstrukt je ovde označen kao fuzioni protein FVIIIFc i monomernog Fc, monomerni hibrid FVIIIFc, hibrid monomernog FVIIIIFc i FVIIIFc monomer-dimer. Videti Primer 1, Sl. 1, Tabela 2A; i SAD patenti br.7,404,956 i 7,348.004, za strukturu i proizvodnju ovog proteina.
Postupci i materijali
Pripreme FVIII
Rekombinantni FVIIIFc
[0107] Kodirajuća sekvenca humanog rekombinantnog FVIII sa deletiranim B domenom je dobijena pomoću reverzne transkripcije-reakcije lanca polimeraze (RT-PCR) iz poli A RNK humane jetre (Clontech) upotrebom FVIII-specifičnih prajmera. Sekvenca FVIII obuhvata nativnu signalnu sekvencu za FVIII. Delecija B-domena je od serina 743 (S743; 2287 bp) do glutamina 1638 (Q1638; 4969 bp) za kompletnu deleciju od 2682 bp videti Primer 1, Sl. 1, Tabela 2A; i SAD patenti br.7,404,956 i 7,348,004, za strukturu i proizvodnju ovog proteina.
[0108] Kodirajuća sekvenca za humani rekombinantni Fc je dobijena pomoću RT-PCR iz biblioteke cDNK humanih leukocita (Clontech) upotrebom prajmera specifičnih za Fc. Prajmeri su dizajnirani tako da je sekvenca FVIII sa deletiranim B-domenom fuzionisana direktno sa N-terminusom Fc sekvence bez linkera između. DNK sekvenca FVIIIFc je klonirana u sisarski dvostruki ekspresioni vektor pBUDCE4.1 (Invitrogen) pod kontrolom CMV promotora. Druga identična Fc sekvenca uključujući mišju Igk signalnu sekvencu je dobijena pomoću RT-PCR i klonirana nishodno od drugog promotora, EF1α, u ekspresionom vektoru pBUDCE4.1.
[0109] rFVIIIFc ekspresioni vektor je transficiran u humane embrionalne ćelije bubrega 293 (HEK293H; Invitrogen) upotrebom Lipofectamine 2000 transfekcionog reagensa (Invitrogen). Stabilne klonalne ćelijske linije su generisane selekcijom sa Zeocinom (Invitrogen). Jedna klonalna ćelijska linija, 3C4-22 je korišćena za generisanje FVIIIFc za karakterizaciju in vivo. Rekombinantni FVIIIIFc je proizveden i prečišćen (McCue JT, et al., J. Chromatogr. A 2009;7824-7830) u Biogen Idec (Cambridge, MA). Strategija transfekcije koja je opisana u prethodnom tekstu očekuje se da proizvodi tri proizvoda, tj., hibrid monomernog rFVIIIFc, hibrid dimernog rFVIIIFc i dimerni Fc. Međutim, uglavnom nije detektovan dimerni rFVIIIFc u kondicioniranom medijumu iz ovih ćelija. Radije, kondicionirani medijum je sadržao Fc i monomerni rFVIIIFc. Moguće je da je veličina dimernog rFVIIIFc bila prevelika i sprečila je efikasno izlučivanje iz ćelija. Ovaj rezultat je bio koristan s obzirom na to da je pružio prečišćavanje monomera koje je manje komplikovano nego kada su prisutna sva tri proteina. Materijal koji je korišćen u ovim studijama imao je specifičnu akivnost od približno 9000 IU/mg. Pored toga, ove humane ćelije proizvele su viši nivo proteina od drugih ćelija koje su korišćene u ovom eksperimentu.
Rekombinantni FVIII
[0110] Rekombinantni FVIII sa deletiranim B domenom (ReFacto®) je kupljen iz Novis Pharmaceuticals i pripremljen je prema uputstvima proizvođača. ReFacto® (rekombinantni FVIII sa deletiranim B domenom) ima istu aminokiselinsku sekvencu kao aminokiseline 1 do 1438 od SEQ ID NO:2.
Životinje sa hemofilijom A
[0111] Miševi sa hemofilijom A su bili nokauti po egzonu 16 gena FVIII naa 129 x B6 osnovi koji su dobijeni od Dr. Kazazian iz University of Pennsylvania (Bi L, et al., Nat. Genet. 1995;10(1):119-121) i gajeni na Syntonix. Ovi miševi su ispoljili produžena vremena zgrušavanja cele krvi (>60 min), i na taj način su dobar model teške hemofilije A.
[0112] Psi sa hemofilijom A bili su iz kolonije koja je rezultat ukršanja u bliskom srodstvu, održavane u Francis Owen Blood Research Laboratory na University of North Carolina, Chapel Hill (Graham, JB, et al., J. Exp. Med. 1949;90:97-111). Ovi psi imaju težak hemifiličan fenotip sličan teškom obliku humane bolesti (Graham, JB, et al., J. Exp. Med.
1949;90:97-111; Lozier, JN, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.2002;99:12991-12996).
Dizajni studije
Studije hemofilije A kod miševa
[0113] Efekat rFVIIIFc i ReFacto® na vreme zgrušavanja cele krvi (WBCT) je ispitivan kod miševa sa deficijencijom FVIII. Svaki protein je primenjivan intravenski u 50 IU/kg i krv je sakupljana iz repne vene svakog miša pre doze i u različitim vremenskim tačkama posle doziranja. Uzorci krvi su inkubirani u mikro-epruvetama na 37°C i vizuelno pregledani jednom u minuti za prisustvo ugruška. Vreme formiranja ugruška je beleženo. Ako se ugrušak nije formirao za 60 min, vreme zgrušavanja je beleženo kao >60min. Krv iz normalnih miševa se zgrušava za približno 4 min (opseg 2-7 min, n = 10 miševa) u analizi WBCT.
[0114] U drugoj grupi studija, miševi sa hemofilijom A su primali jednu intravensku dozu od 50 IU/kg rFVIIIFc, ReFacto® ili Advate® (4 miša po vremenskoj tački). Krv je sakupljana kardijačnom punkturom u jednoj desetini zapremine 3.2% natrijum citrata na 0.25, 8, 24, 48 i 72 časa posle doziranja. Plazma je pripremljena i čuvana na -80°C do analize za aktivnost FVIII upotrebom FVIII-specifične analize hromogene aktivnosti.
Studije hemofilije A kod pasa
[0115] U studiji PK/PD jedne doze rFVIIIFc, dva psa sa hemofilijom A iz Chapel Hill kolonije su primili jednu intravensku dozu od 125 IU/kg i uzorci krvi su sakupljeni pre doze i posle doziranja u izabranim vremenskim tačkama za WBCT, aktivirano delimično tromboplastinovo vreme (aPTT), koncentraciju FVIIIFc u plazmi, hematologiju i hemijsku analizu seruma. Vremenske tačke za WBCT obuhvatale su pre doze, 5 i 30 min i 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96, 144, i 168 časova posle doziranja. Sakupljanje krvi za aktivnost zgrušavanja (aPTT) i koncentraciju FVIIIFc u plazmi obuhvatalo je vremenske tačke navedene u prethodnom tekstu za WBCT kao i 15 min i 3, 6, 12 časova posle doziranja.
[0116] Izvedena je druga studija u kojoj je ReFacto® (114 IU/kg za psa M12 i 120 IU/kg za psa M38) primenjivan intravenski. WBCT je meren dok vremena zgrušavanja nisu bila ≥ 20 min (u skladu sa FVIII:C > 1%), i zatim 125 IU/kg rFVIIIFc je primenjeno intravenski na iste pse i uzorci krvi su sakupljeni za WBCT, aPTT, koncentraciju FVIIIFc u plazmi, hematologiju i hemijsku analizu seruma. Vremenske tačke za WBCT obuhvatale su pre doze, 5 i 30 min i 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72 časa posle doziranja. Krv je takođe sakupljana na 96, 120, 144, i 168 časova posle doziranja sa FVIIIFc. Sakupljanje krvi za aktivnost zgrušavanja i koncentraciju FVIIIFc u plazmi obuhvatalo je vremenske tačke navedene u prethodnom tekstu za WBCT kao i 15 min i 3, 6, 12 časova posle doziranja.
[0117] Postupak WBCT kod pasa sa hemofilijom A je malo različit od onog kod miševa sa hemofilijom A. Posle doziranja sa rFVIIIFc ili ReFacto®, jedan mL krvi je sakupljan u različitim vremenskim tačkama i 0.5 mL je postavljeno u dve silikonizovane staklene epruvete koje su zatim postavljene u 28°C vodeno kupatilo. Počevši na jednom minutu, jedna epruveta je iskošena na svakih 30 sek, druga je ostavljena nepomerena. Kada je formiran ugrušak u epruveti koja je iskošavana, druga epruveta je zatim iskošena na svakih 30 sek sve dok se nije formirao ugrušak. Vreme za potpuno gelirani ugrušak u drugoj epruveti je beleženo kao WBCT.
Aktivnost FVIII u plazmi
Merenje aktivnosti FVIII u plazmi pomoću FVIII-specifične hromogene analize
[0118] Uzorci plazme su testirani za aktivnost FVIII pomoću automatskog hromogenog postupka upotrebom Sysmex CA1500 instrumenta i reagensi su bili iz Siemans Healthcare Diagnostics (Dallas, TX, kit #B4238-40). Aktivnost rFVIIIFc je određivana upotrebom standardne krive stvorene upotrebom koncentrata 7. međunarodnog standarda faktora FVIII (NIBSC kod 99/678) sipanog u humanu plazmu osiromašenu u FVIII (Stago USA) u koncentracijama u opsegu od 1.5 - 0.016 IU/mL.
Merenje rFVIIIFc ili FVIII pomoću ELISA
FVIIIFc u plazmi pasa pomoću ELISA
[0119] Antitela protiv FVIII speicifična za A1 domen (Green Mountain Antibodies: GMA-8002) obložena su na 96-komorne ploče i inkubirana u trajanju od 1 časa na 37°C. Obložene ploče su blokirane sa Tris-puferisanim slanim rastvorom koji sadrži Tween 20, CaCl2i goveđi serum albumin u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi i zatim standardi, kontrole i uzoci koji su pripremljeni u plazmi normalnog psa, su razblaženi 1:10 i zatim dodati u ploče i inkubirani u trajanju od 1 časa na 37°C. Ploče su isprane i zatim je dodato antitelo magarca (F(ab)'2) protiv humanog Fc-HRP (Jackson: 709-036-098) i inkubirano u trajanju od 1 časa na 37°C. Posle ispiranja, TMB (BioFx superosetljivi supstrat: TMB-0100-01) je dodat u ploče, reakcija supstrata je ugašena kiselinom i apsorbanca je merena na SpectraMax Plus uređaju za očitavanje ploče (Molecular Devices) na 450 nm.
ReFacto® u plazmi pasa pomoću ELISA
[0120] Anti-FVIII antitelo specifično za A1 domen na teškom lancu (Green Mountain antitela: GMA-8002) je obloženo na 96-komornim pločama i inkubirano u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Obložene ploče su blokirane u trajanju od 1 časa na 37°C i posle ispiranja, standardi, kontrole i uzorci su pripremljeni u plazmi normalnog psa, zatim razblaženi 1:10 dodati su u ploče i inkubirani u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, zatim tretirane detekcionim antitelom, prethodno razblaženim konjugatom antiFVIII renove peroksidaze (Affinity Biologicals: F8C-EIA-D), i inkubirani na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa. Posle ispiranja TMB (BioFx superosetljivi supstrat: TMBS-0100-01) je dodat u ploče za 10 min. Reakcija supstrata je ugašena kiselinom i signal je meren na SpectraMax Plus uređaju za očitavanje ploče (Molecular Devices) na talasnoj dužini od 450 nm.
Merenje fibrinogena
[0121] Koncentracija fibrinogena u plazmi je merena na Esoterix (Research Triangle Park, NC) upotrebom kompleta koji sadrži HemosIL™ PT-Fibrinogen-HS reagens (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, Catalog #0008468210) i ACL 7000 Coagulation Analyzer (Beckman Coulter), prema uputstvima proizvođača.
Merenje trombocita
[0122] Trombociti su brojani u EDTA anti-koagulisanoj celoj krvi pomoću automatskih postupaka upotrebom Vet-ABC-Diff Hematology Analyzer programiranog pametnom karticom spcifičnom za vrstu (SCIL Animal Care Co., Gurnee, IL).
Farmakokinetička analiza
[0123] Farmakokinetički parametri su izračunati pomoću nekompartmentalne analize upotrebom WinNonlin softvera iz Pharsight, verzije 5.2 (Mountain View, Ca). PK parametri su obuhvatali maksimalnu koncentraciju u plazmi (Cmax), površinu ispod krive koncentracije u plazmi naspram vremena (AUC), polu-život eliminacije (t1/2), zapreminu raspodele (Vss), i klirens (Cl).
Rezultati
Rekombinantni FVIII-Fc
[0124] rFVIIIFc je rekombinantna fuzija humanog FVIII sa deletiranim B domenom sa Fc iz humanog IgG1, bez linkerske sekvence između (rFVIIIFc; Slika 1).
[0125] Prečišćeni rFVIIIFc je imao specifičnu aktivnost od približno 9000 IU/mg kao što je određeno upotrebom analize hromogene aktivnosti. Rekombinantni FVIII sa deletiranim B domenom (ReFacto®) ima zabeleženu secifičnu aktivnost od 9110 - 13700 IU/mg. Prevođenje specifične aktivnosti u IU/nmol radi uzimanja u obzir razlike u veličini između FVIIIFc i ReFacto® (216 kDa i 170 kDa respektivno), označava da dva proteina imaju približno iste specifične aktivnosti (1970 IU/nmol za rFVIIIFc i 1521 - 2287 IU/nmol za ReFacto®). Na taj način FVIII aktivnost od rFVIIIFc nije pogođena fuzijom C-terminusa humanog FVIII sa N-terminusom humanog Fc.
Primena na miševe sa hemofilijom A
[0126] Jedna 50 IU/kg doza rFVIIIFc ili ReFacto® je primenjena intravenski na miševe sa deficijencijom FVIII (n = 6/grupi). Uzorci krvi su sakupljeni pre doze i posle doziranja do 120 časova i WBCT je određivano kao što je opisano u delu Materijal i metode. Polazno WBCT bilo je veće od 60 min. Podaci iz reprezentativnog eksperimenta su prikazani na Slici 2 i Tabeli 3. Neposredno posle doziranja sa rFVIIIFc ili ReFacto®, WBCT je ispravljeno do 2-17 minuta. Krv iz miševa tretiranih sa ReFacto® izgubili su sposobnost za zgrušavanje za 42 časa, dok se krv iz svih miševa tretiranih sa rFVIIIFc i dalje zgrušavala na 96 časova, krv od jednog od šest se zgrušavala na 113 časova, ali su svi izgubili sposobnost za zgrušavanje za 120 časova. Ovi podaci sugerišu da je trajanje efekta za rFVIIIFc približno dva do tri puta duže nego za ReFacto®.
[0127] Hromogena aktivnost rFVIIIFc, ReFacto® ili Advate® (rekombinantni FVIII pune dužine) je ispitivana kod miševa sa deficijencijom FVIII posle jedne intravenske doze od 50 IU/kg. Krv je sakupljana pre doze i posle doziranja na 8, 24, 48 i 72 časa. Aktivnost je merena upotrebom analize hromogene aktivnosti specifične za FVIII i prikazana je na Slici 3. Farmakokinetički parametri su zabeleženi u Tabeli 4. Polu-život u cirkulaciji za rFVIIIFc bio je približno 1.6 do 2 puta duži (11.1 časova) u poređenju sa Advate® (7 časova) i ReFacto® (5 časova). Cmax je bila 2.33 ± 0.36 IU/mL za rFVIIIFc u poređenju sa 0.47 ± 0.30 IU/mL za Advate® i ± 0.44 IU/mL za ReFacto®. Sistemsko izlaganje rFVIIIFc je izrazito bilo veće za rFVIIIFc (22.6 čas·IU/mL) u poređenju sa ReFacto® (6.94 čas·IU/mL) i Advate® (3.90 čas·IU/mL) i klirens za rFIIIFc bio je naročito niži (2.09 mL/čas/kg) u poređenju sa oba ReFacto® (7.2 mL/čas/kg) i Advate® (12.8 čas/mL/kg) kod miševa sa hemofilijom A.
Primena na pse sa hemofilijom A
[0128] Farmakodinamika (PD) i farmakokinetika (PK) rFVIIIFc su ispitivani u Chapel Hill koloniji pasa sa hemofilijom A. Jedna intravenska doza od 125 IU/kg rFVIIIFc je primenjivana na svakog od četiri psa sa hemofilijom A i WBCT je neposredno ispravljeno na normalno (Slika 4). Opseg WBCT kod normalnih pasa je 8-12 min. WBCT je ostalo ispod 20 min, vreme u skladu sa FVIII:C >1%, do približno 96 časova sa izuzetkom jednog psa koji je imao WBCT <20 min do 72 časa. Pored toga, aPTT je takođe neposredno ispravljen do normalnog (Tabela 6). Koncentracija rFVIIIFc u plazmi je merena upotrebom specifične ELISA koja je dizajnirana za detekciju oba FVIII i Fc delova molekula. Krive koncentracije u plazmi naspram vremena su prikazane na Slici 5. PK analiza podataka pokazala je da je t1/2bilo ± 1.7 časova (Tabela 5). Slični rezultati su dobijeni kada je rFVIIIFc meren upotrebom FVIII-specifične analize hromogene aktivnosti (t1/2= ± 0.3 časova, Tabela 5) i krive koncentracije u plazmi naspram vremena su bile slične upotrebom oba postupka (Slike 5 i 6). Kada su podaci o aktivnosti prevedeni iz IU/mL u ng/mL upotrebom specifične aktivnosti za rFVIIIFc, postojala je dobra korelacija sa ELISA podacima, na taj način demonstrirajući da je protein koji je meren pomoću ELISA bio potpuno aktivan.
[0129] Dva od pasa tretiranih sa rFVIIIFc takođe su primili jednu dozu ReFacto® 114 IU/kg za psa M12 i 120 IU/kg za psa M38, 72 časa pre doziranja sa rFVIIIFc. WBCT i aPTT su ispravljeni do normalnih neposredno psole doziranja sa ReFacto®. Međutim, normalizacija WBCT posle jedne doze rFVIIIFc trajala je približno dva puta duže u poređenju sa ReFacto® (slika 4). Pored toga, polu-život rFVIIIFc u plazmi (15.7 ± 1.7 časova) bio je približno dva puta duži za rFVIIIFc u poređenju sa ReFacto® (7.0 i 6.7 časova) kada je koncentracija proteina u plazmi merena pomoću ELISA (Tabela 5). Slični rezultati su dobijeni kada su dva molekula merena pomoću FVIII-specifične hromogene aktivnosti.
[0130] Da bi se procenio potencijalni rizik trombogenosti, mereni su trombociti i fibrinogen. Posle doziranja rFVIIIFc ili ReFacto®, brojevi trombocita i koncentracija fibrinogena u plazmi se nisu menjali od vrednosti pre doze (podaci nisu prikazani).
Diskusija
[0131] Rekombinantni FVIIIFc je proizveden u humanim embrionalnim ćelijama 293 bubrega (HEK 293) iz stabilno transficirane ćelijske linije i prečišćen je iz medijuma za kulturu ćelija. Proizvodnja u humanoj ćelijskoj liniji predstavlja značajnu promenu u proizvodnji u poređenju sa proizvodima rFVIII koji se trenutno prodaju koji su proizvedeni u ćelijama jajnika kineskog hrčka ili ćelijama bubrega bebe hrčka. Obrazloženje za ovu promenu je to da je očekivano da su humane ćelije najbolje opremljene za izvođenje neophodnih post-translacionih modifikacija za FVIII deo ovog molekula.
[0132] Prevođenje specifične aktivnosti u IU/nmol da bi se uzela u obzir razlika u molekularnim težinama za rFVIIIFc i rekombinantni FVIII sa deletiranim B domenom (ReFacto®) pokazalo je da su specifične aktivnosti slične za oba proteina (1970 IU/nmol za rFVIIIFc i 1521 - 2287 IU/nmol za ReFacto®). Donekle je iznenađujuće da specifična aktivnost za rFVIIIFc nije pogođena fuzijom C terminusa FVIII sa N-terminusom Fc s obzirom na to da su C1 i C2 domen FVIII uključeni u fosfolipidno vezivanje koje je esencijalno za aktivnost celog FVIII (Fay, PJ, J. Hematology 83:103-8 (2006) i Raut, S, et al., Br. J. Haematol.107:323 (1999)).
[0133] Tretman hemofilije A je na zahtev u vreme epizode krvarenja ili profilaksom za prevenciju krvarenja. Iako je tretman na zahtev još uvek često korišćen, postoji trend prema profilaksi i prevenciji oštećenja zgloba (Blanchette P, et al., Haemophilia 2004: 10;679-683, Manco-Johnson, MJ, et al., N. Engl. J. Med. 2007;357:535-544). Trenutni proizvodi FVIII su primenjivani svaka dva do tri dana za profilaksu zbog relativno kratkog polu-života od 10-12 časova u cilju održavanja FVIII:C iznad 1 % kod pacijenata (Morfini, M, Haemophilia 2003;9 (suppl 1):94-99;discussion 100, White GC, et al., Thromb. Haemost.
1997:77:660-7, Blanchette, P, et al., J. Thromb. Haemost. 2008 Aug;6(8): 1319-26). Terapije sa FVIII sa dugotrajnim dejstvom koje obezbeđuju produženu zaštitu od krvarenja bi predstavljale izrazito poboljšanje u kvalitetu života za pacijente sa hemofilijom A. Strategije za produženje polu-života faktora zgrušavanja obuhvataju one koje su bile uspešne za druge molekule, uključujući pegilaciju (Rostin J, et al., Bioconj. Chem. 2000;11:387-96), glikopegilaciju (Stennicke HR, et al., Thromb. Haemost. 2008;100:920-8), formulaciju sa pegilovanim lipozomima (Spira J, et al., Blood 2006;108:3668-3673, Pan J, et al., Blood 2009;114:2802-2811) i konjugaciju sa albuminom (Schulte S., Thromb. Res. 2008;122 Suppl 4:S14-9). Pegilacija predstavlja pristup za smanjenje klirensa, međutim, efekat modifikacije in vivo je trenutno nepoznat. Ishod direktne pegilacije FVIII na in vivo je trenutno nepoznat, dok FVIII formulisan sa pegilovanim lipozomima klinički je ispitivan i pokazao je umeren do nula efekat na periode krvarenja (Spira J, et al., Blood 2006;108:3668-3673, Spira J, et al., Thromb. Haemost. 2008 Sep;100(3):429-34).
[0134] Predmetni pristup za produženje polu-života FVIII je bio rekombinantno fuzionisani FVIII sa Fc domenom IgG1. Fc se vezuje za prirodni receptor, FcRn, čija je normalna funkcija zaštita IgG od degradacije. Rezultati koji su ovde dobijeni predstavljaju karakterizaciju početne farmakokinetike i efikasnosti rFVIIIFc u poređenju sa proizvodom rFVIII kod miševa sa hemofilijom A i pasa sa hemofilijom A. Kod obe vrste, polu-život rFVIIIFc je bio približno dva puta veći od rFVIII prilikom merenja pomoću aktivnosti FVIII ili ELISA (samo psi). Ovi podaci su takođe bili u dobroj korelaciji sa WBCT rezultatima iz oba životinjska modela, tj. trajanje efekta rFVIIIFc na WBCT bilo je približno dva puta veće u poređenju sa ReFacto®. Kod pasa, Cmaxi klirens su bili slični za rFVIIIFc i ReFacto®, ali AUC i zapremina raspodele u stanju mirovanja bili su približno 1.5 puta i 2 puta veći za rFVIIIFc u poređenju sa ReFacto®, respektivno. PK parametri za ReFacto® u ovom životinjskom modelu su u skladu sa vrednostima zabeleženim u literaturi (Brinkhous K, et al., Sem. Thromb. Haemost.2002;28:269-272).
[0135] Ako se ovi nalazi prevode u isto produženje polu-života kod ljudi, ovo bi moglo da predstavlja značajno unapređenje u lečenju pacijenata sa hemofilijom A.
Dodatne reference
[0136] Berkner K., Methods Enzymol.1993;222:450-477.
[0137] Bitonti AJ, and Dumont JA., Adv. Drug Del. Rev.2006;58:1106-1118.
[0138] Dumont JA, et al., J. Aerosol Med.2005;18:294-303.
[0139] Dumont JA, et al., BioDrugs 2006:20:151-160.
[0140] Ellis CN, and Krueger GG., N. Engl. J. Med.2001;345:248-55.
[0141] Low SC, et al., Hum Reprod.2005:7:1805-1813.
[0142] Manco-Johnson, M., Haemophilia 2007;13 Suppl;2: 4-9.
[0143] Mannucci, PM, and Tuddenham, EGD., N. Engl. J. Med.2001;344:1773-1779.
[0144] Peyvandi F, et al., Haemophilia 2006;12(Suppl 3):82-89.
[0145] Rodriguez-Merchan, EC., Semin. Thromb. Hemost. 2003;29:87-96.
[0146] Srour MA, et al., Ann. Hematol. 2008; 87:107-12.
Primer 2
[0147] Cilj studije je bio odrediti farmakinetiku i farmakidinamiku rFVIIIFc i BDD-rFVIII (Xyntha®) kod makaki majmuna posle jedne intravenske doze.
Materijal i metode
[0148] rFVIIIFc (Biogen Idec), nabavljen kao zamrznuta tečnost u koncentraciji od 1.2 mg/mL i 9882 IU/mL. Specifična aktivnost je 8235 IU/mg. Čuvanje je bilo na -70°C. Razblažen je pre injekcije.
[0149] Naziv: Xyntha (Novis Pharmaceuticals), nabavljen kao liofilizovani prah koji je rekonstituisan prema upustvima proizvođača za proizvodnju rastvora sa nominalnom koncentracijom od 525 IU/mL. Čuvanje je izvedeno prema preporukama proizvođača.
Životinje
[0150] Korišćeni su makaki majmuni iz New Iberia Research Center (NIRC) kolonije, i studija (NIRC studija # 8733-0903) je izvedena pod odobrenim NIRC IACUC protokolom (APS 2008-8733-058) u NIRC u New Iberia, LA.
[0151] U studiji je korišćeno šest naivnih makaki majmuna (tri mužjaka, tri ženke) za koje je određeno da su dobrog zdravlja.
[0152] Studija je izvedena u skladu sa protokolom i UL Lafayette-NIRC standardnim operativnim postupcima.
Dizajn studije
[0153] rFVIIIFc je primenjen istravenski u 125 IU/kg na svakog od šest majmuna (tri mužjaka, tri ženke). Xyntha (BDD-rFVIII) je primenjivan intravenski na iste životinje u 125 IU/kg u dizajnu unakrsnog ispitivanja. Grupa 1 životinja (n = 3) primila je Xyntha na dan 0 i rFVIIIFc na dan 3, dok je grupa 2 životinja (n = 3) primila rFVIIIFc na dan 0, a zatim Xyntha na dan 4. Dodatni dan između doza za grupu 2 je bio za osiguravanje da je rFVIIIFc imao dovoljno vremena za smanjenje ispod projektovanih polaznih nivoa. Krv je sakupljana za plazmu u jednoj desetini zapremine 3.2 % natrijum citrata iz svake životinje pre doze i posle doziranja na 0.25, 4, 12, 24, 36, 48 i 72 časa za merenje rFVIIIFc ili Xyntha pomoću ELISA i FVIII-specifične analize hromogene aktivnosti.
ELISA za merenje rFVIIIFc i FVIII u plazmi
Postupak za merenje rFVIIIFc u plazmi majmuna
[0154] Ova enzimski vezana imunosorbent analiza (ELISA) je dizajnirana za kvantitativno određivanje rFVIIIFc u plazmi majmuna. U ovom ELISA postupku, kozje anti-humano IgG-(H+L) antitelo (posle apsorpcije antitelima majmuna) iz Bethyl Laboratories (Cat#A80-319A) je razblaženo u puferu za oblaganje i imobilizovano na 96-komornu mikrotitarsku ploču za uzorke. Ploča je aspirirana, i sva neadsorbovana mesta su blokirana dodavanjem pufera za blokadu (3% BSA/1xTris) u trajanju od približno 2 časa na 37°C. Uzorci plazme su razblaženi 1:20 sa puferom za razblaživanje uzorka sa visokom koncentracijom kalcijuma (3% nemasno mleko u prahu/TBST sa 30 mM CaC12) i sipani na ploču za uzorke. Ploče su inkubirane približno 2 časa na 37°C. Ploča je zatim isprana i mišje antitelo protiv faktora VIII sa deletiranim B domenom (α.BDDA1) (A1 domen) iz Green Mountain Antibodies (Cat#GMA-8002) je dodato u ploču i inkubirano približno 1 čas na 37°C. Posle ispiranja ploče, HRP-konjugovano kozje anti-mišje IgG2a antitelo iz Southern Biotech (Cat#1080-05) je dodato u ploču i inkubirano približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana i dodat je rastvor supstrata tetrametilbenzidin (TMB) peroksidaze i inkubirana približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodavanjem nekiselog Stop rastvora. Boja se razvija proporcionalno količini rFVIIIFc u uzorku. Ploče su očitavane na uređaju za očitavanje apsrobance ploče upotrebom jedne detekcione talasne dužine, 650 nm. Koncentracije rFVIIIFc su određene na standardnoj krivnoj dobijenom preko grafikona optičke gustine (OD) naspram koncentracije upotrebom programa za aproksimaciju četvoroparametarske logističke krive. Kalibracioni opseg krive ovog postupka je 0.400 ng/mL - 51.2 ng/mL u 5% plazme majmuna (8.00 ng/mL - 1024 ng/mL u 100% plazme majmuna). Jedan kalibrator izvan kvalifikovanog opsega analize na 0.200 ng/mL u 5% plazme majmuna može biti uključen tako da služi kao tačka sidra za olakšavanje aproksimacije krive. Tačka sidra je uklonjena ili zadržavana na osnovu najbolje aproksimacije krive (tj., najvećeg broja standarda očitavanih unutar definisane tačnosti, %RE).
Postupak za merenje FVIII u plazmi majmuna
[0155] Ova enzimski vezana imunosorbent analiza (ELISA) je dizajnirana za kvantitativno određivanje FVIII u plazmi majmuna. U ovom ELISA postupku, mišje αBDDA1 antitelo FVIII iz Green Mountain Antibodies (Cat# GMA-8002) je razblaženo u puferu za oblaganje i imobilizovano na 96-komornoj mikrotitarskoj ploči za analizu. Ploča je aspirirana, i sva neadsorbovana mesta su blokirana dodavanjem pufera za blokiranje (3% BST/1xTris) u trajanju od približno 1 časa na 37°C. Uzorci plazme su razblaženi 1:20 sa puferom za razblaženje uzorka sa visokom koncentracijom kalcijuma (pufer za blokiranje sa 100 mM CaCl2) i sipani na ploču za uzorke. Ploče su inkubirane približno 2 časa na 37°C. Posle ispiranja ploče, detekciono antitelo iz Affinity Biologicals Kit, HRP obeleženo poliklonsko antitelo (Cat#F8C-EIA-D), je dalje razblaženo u TBS/0.05% Tween 20, i dodato u ploču i inkubirano približno 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploča je ponovo isprana i dodat je rastvor supstrata tetrametilbenzidin (TMB) peroksidaze i inkubiran u trajanju od približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodavanjem kiselog Stop rastvora. Boja se razvija proporcionalno količini FVIIIFc u uzorku. Ploče su očitavane na uređaju za očitavanje apsorbance ploče upotrebom jedne detekcione talasne dužine, 450 nm. Koncentracije FVIII su određene na standardnoj krivoj dobijenoj preko grafikona optičke gustine (OD) naspram koncentracije upotrebom programa za aproksimaciju četvroro-parametarske logističke krive. Opseg kalibracione krive ovog postupka je 0.625 ng/mL - 20 ng/mL u 5% plazme majmuna (12.5 ng/mL - 400 ng/mL u 100% plazme majmuna). Dva kalibratora izvan kvalifikovanog opsega analize na 0.313 i 0.156 ng/mL u 5% plazme majmuna mogu biti obuhvaćeni da služe kao tačke sidra za olakšavanje aproksimacije krive. Tačke sidra mogu biti uklonjene ili zadržane na osnovu najbolje aproksimacije krive (tj., naveći broj standarda očitavanih unutar definisane tačnosti, %RE).
FVIII-specifična hromogena analiza
[0156] Aktivnost FVIII u uzorcima plazme makaki majmuna je procenjivana na osnovu primenjene doze, i zatim razblažena do približno 0.25 - 1 IU/ml u humanoj plazmi osiromašenoj u FVIII (Diagnostica Stago). Uzorci su analizirani u Sysmex CA1500 (Siemens Diagnostic Healthcare) upotrebom FVIII hromogenog kompleta (Siemens). U ovoj hromogenoj analizi, rFVIIIFc u uzorcima plazme je aktiviran trombinom. Aktivirani faktor VIII (FVIIIa) zatim ubrzava prevođenje faktora X (FX) u faktor Xa (FXa) u prisustvu aktiviranog faktora IX (FIXa), fosfolipida (PL) i jona kalcijuma. Aktivnost FXa je procenjivana hidrolizom p-nitroanilid supstrata specifičnog za FXa. Početna stopa oslobađanja p-nitroanilina (pNA) merena na 405 nm je proporcionalna aktivnosti FXa, i na taj način aktivnosti FVIII u uzorku. Granica kvantitativnog određivanja aktivnosti FVIII zbog rFVIIIFc u ovoj analizi je ~0.3 IU/ml. Analiza može da meri ukupnu aktivnost FVIII do donje granice od približno 0.06 IU/ml sa tačnosti od ± 20%. Izračunata aktivnost uzorka pre doze za pojedinačne životinje je oduzeta od vrednosti na svakoj vremenskoj tački da bi se generisale PD krive (aktivnost FVIII naspram vremena).
[0157] Standardna kriva je generisana od koncentrata 7. međunarodnog standarda faktora FVIII, NIBSC, razblaženog do 1 1U/ml u humanoj plazmi deficijentnoj u FVIII. Uzorci za standardne krive su serijski razblaženi u Sysmex instrumentu da bi se proizvele koncentracije od 0.15, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0053 i 0.0026 IU/ml. S obzirom na to da instrument razblažuje sve uzorke 1:10 interno, standardne koncentracije FVIII odgovaraju koncentracijama u plazmi od 1.5 - 0.026 IU/ml, što je opseg aktivnosti FVIII koji se može meriti.
PK analiza
[0158] Profili zavisnosti koncentracije od vremena su procenjivani upotrebom nekompartmentalnog modula za analizu u WinNonlin softverskom programu (verzija 5.2, Pharsight Corporation, Mountain View, CA).
REZULTATI
[0159] Koncentracija rFVIIIFc u plazmi majmuna je merena upotrebom sendvič ELISA formata koji je merio oba, FVIII i Fc delove molekula i podaci su zabeleženi u Tabeli 7. Svi uzorci pre doze su bili ispod granice kvantitativnog određivanja. Slika 7 islustruje srednju vrednost grupe za koncentracije rFVIIIFc i Xyntha u plazmi u vremenu i krive pojedinačnih koncentracija u plazmi naspram vremena su prikazane na Slici 8. Rezime PK parametara za rFVIIIFc i Xyntha prikazan je u Tabelama 9 i 10, respektivno. Srednja vrednost t1/2 za rFVIIIFc bila je 11.9 ± 1.7 časova (opseg 9.3 do 14.1 časova) i za Xyntha, srednja vrednost eliminacije t1/2 bila je 12.7 ± 4.4 časova (opseg 9.2 do 19.9 časova).
[0160] Aktivnost FVIII je merena upotrebom FVIII-specifične analize hromogene aktivnosti i podaci su zabeleženi u Tabeli 8. Aktivnost pre doze zbog endogenog FVIII oduzeta je od svih uzoraka. Grafikon srednje vrenosti podatka grupe je prikazan na Slici 9 i krive pojedinačnih koncentracija u plazmi naspram vremena su prikazane na Slici 10. Rezime PK parametara je objavljen za rFVIIIFc i Xyntha u Tabelama 9 i 10, respektivno. Srednja vrednost eliminacije t1/2 bila je 16.1 ± 6.9 časova (opseg 11.6 do 29.4 časova) za rFVIIIFc i 12.5 ± 1.7 časova (opseg 10.4 do 14.3 časova) za Xyntha.
Diskusija i zaključci
[0161] Polu-životi eliminacije su bili slični za rFVIIIFc i Xyntha posle jedne intravenske doze od 125 IU/kg. Bilo da je test artikl meren pomoću ELISA ili analize hromogene aktivnosti.
Primer 3
[0162] Ovo će biti otvorena, unakrsna studija faze I/IIa, sa povećanjem doze, multi-centrična, i prva kod ljudi dizajnirana za procenu bezbednosti, tolerabilnosti, i farmakokinetike jedne doze rFVIIIFc kod subjekata sa teškom (definisana kao <1 IU/dL [1%] endogenog faktora VIII [FVIII]) hemofilijom A. Ukupno približno 12 prethodno tretiranih pacijenata biće uključeno u studiju i dozirano sa rFVIIIFc u 25 ili 65 IU/kg. Posle skrininga (planirano u roku od 28 dana pre prve doze Advate® [rFVIII], referentno komparator sredstvo) i minimalno od 4-dana (96 časova) bez FVIII tretmana pre prve injekcije, približno 6 subjekata će primiti jednu 25 IU/kg dozu Advate, nakon čega slede 3-dana (72 časa) farmakokinetičkog (PK) profila zatim prelazak na drugi preparat, i subjekti su primali 25 IU/kg jednu, otvorenu dozu rFVIIIFc u trajanju od 7-dana (168 časova) profilisanja PK. Prva 3 subjekta će biti dozirana uzastopno. Za prva tri (3) subjekta dozirana sa 25 IU/kg rFVIIIFc, svaki subjekat će biti podvrgnut proceni inhibitora na 14-dana (336 časova) posle injekcije rFVIIIFc. Doziranje sledećeg subjekta (samo za prva tri subjekta) će se izvesti pošto je testiranje inhibitora završeno. Pošto je 3. subjekat završio procenu inhibitora od 14 dana, preostala tri subjekta na 25 IU/kg i šest subjekata na 65 IU/kg počeće uključenje u studiju uzastopno sa razmakom od najmanje 1 dana unutar grupe za svaku dozu.
[0163] Jednu nedelju pošto je poslednji subjekat primio 25 IU/kg dozu rFVIIIFc, približno 6 jedinstvenih subjekata biće regrutovani za 65 IU/kg kohortu. Svaki subjekat u 65 IU/kg kohorti primaće jednu 65 IU/kg dozu Advate®, nakon čega sledi 4-dnevno (96 časova) profilisanje PK zatim prelazak na drugi preparat i primanje 65 IU/kg jedne, otvorene doze rFVIIIFc tokom 10-dnevnog (240 časova) profilisanja. Ako se epizoda krvarenja javi pre prve injekcije rFVIIIFc u bilo kojoj kohorti, za tretman bi trebalo koristiti subjektov proizvod FVIII od pre studije i interval od najmanje 4 dana mora tada da prođe pre primanja prve injekcije rFVIIIFc za PK profil.
[0164] Svi subjekti biće praćeni tokom 14-dana (336 časova) i 28 dana perioda procene bezbednosti posle primene rFVIIIFc 25 IU/kg ili 65 IU/kg za bezbednost. Svi subjekti će biti podvrgnuti farmakokinetičkom uzorkovanju pre i posle doziranja zajedno sa uzorcima krvi za analizu aktivnosti FVIII na naznačenim vremenskim tačkama.
Primer 4
Aktivnost unutar kompleksa Xaze
[0165] Da bi se ispitalo vezivanje FVIII proteina (rBDD FVIII i rFVIIIFc) sa FIXa, i merila sposobnost ovih proteina da aktiviraju FX, izvedene su kinetičke studije koje ispituju ove interakcije u kontekstu kompleksa Xaze. Ova analiza je obuhvatala formiranje kompleksa Xaze sa aktiviranim FIX i aktiviranim rBDD FVIII ili rFVIIIFc proteinom na površini fosfolipidne membrane u prisustvu kalcijuma, i praćenje prevođenja FX u FXa kao što je mereno preko cepanja hromogenog ili fluorogenog supstrata.
[0166] Ukratko, FVIII je prvo aktiviran sa α-trombinom za 5 min, zatim mešan sa FIXa u prisustvu Ca2+, i sintetičkih fosfolipidnih vezikula (25% fosfatidilserin (PS)/75% fosfatidilholin (PC)) ili trombociti. Pod uslovima opisanim u daljem tekstu, FVIIIa i FIXa interaguju u prisustvu površine fosfolipidne membrane i kalcijumovih jona da bi se formirao aktivni kompleks Xaze koji posreduje u prevođenju FX u FXa preko proteolitičke obrade. Zauzvrat, FXa cepa FXa-specifičan hromogeni ili fluorogeni supstrat. Odcepljeni supstrat je hromogeni i prema tome količina odcepljenog supstrata u rastvoru je indikativna za količinu generisanog FXa. Ovo je kvantitativno određeno merenjem apsorbance rastvora na 405 nm.
A. Aktivacija faktora X
[0167] Sposobnost rBDD FVIII i rFVIIIFc da aktiviraju FX ispitivana je u kontekstu kompleksa Xaze kao što je opisano u prehtodnom tekstu. Trombinom-aktivirani FVIII proteini su inkubirani sa FIXa i fosfolipidima u prisustvu kalcijuma, zatim dodati u različite koncentracije FX u prisustvu FX-specifičnog supstrata i određene su stope generisanja FXa (Slika 11).
[0168] Na osnovu ovih podataka, izračunavani su Km i Vmax za različite FVIII proteine u kontekstu kompleksa Xaze (Chang 1997) (Tabela 11). Podaci su izraženi kao srednja vrednost šest analiza (3 eksperimenta koja sadrže dva ponavljanja) ± odgovarajuća standardna devijacija. Na osnovu ovih podataka, nađeno je da ovi proteini (rBDD FVIII i rFVIIIFc) imaju slične vrednosti Km i Vmax, unutar varijacije analize. Prema tome, kompleks Xaze formiran sa rFVIIIFc ponaša se slično kompleksu Xaze formiranom sa licenciranim proizvodom rBDD FVIII (ReFacto) u vezi sa interakcijama sa fosfolipidima i sposnošću da aktivira FX. Zapaziti da ovi slični podaci takođe pokazuju da je rFVIIIFc aktiviran do sličnog stepena kao rBDD FVIII posle kratke inkubacije sa trombinom.
B. Interakcija sa FIXa
[0169] Interakcija između rBDD FVIII i rFVIIIFc sa FIXa takođe je ispitivana u kontekstu kompleksa Xaze. Kompleks Xaze je sklopljen kao u prethodnom tekstu, upotrebom fiksne količine FX i različitih nivoa FIXa, i određene su stope generisanja FXa (Slika 12). Iz ovih podataka, određivana je Kd vrednost za kompleks Xaze formiran sa oba od FVIII proteina sa FIXa (Chang 1997). Podaci su izraženi kao srednja vrednost od šest analiza (3 eksperimenta koja sadrže po dva ponavljanja) ± odgovarajuća standardna devijacija (Tabela 12). Nađeno je da oba proteina imaju slične Kd i Vmax vrednosti, što ukazuje da rFVIIIFc ima slične interakcije sa FIXa kao licencirani rBDD FVIII proizvod.
Primer 5
[0170] Privremeni farmakokinetički podaci za kliničko ispitivanje faze I/IIa razmatrani u Primeru 3 pokazali su sledeće rezultate za FVIIIFc. FVIIIFc je imao oko 50% povećanje u sistemskom izlaganju (AUCINF), oko 50% redukciju u klirensu (Cl), i oko 50-70% povećanje u polu-životu eliminacije i MRT u poređenju sa ADVATE (rFVIII pune dužine). Pored toga, FVIIIFc je pokazao povećane vrednosti C168, TBLP1, TBLP3, i TBLP5 u poređenju sa ADVATE.
AUCINFpovršina ispod krive koncentracije naspram vremena od nula do beskonačnosti Beta HL polu-život faze eliminacije; takođe označen kao t1/2β
C168 Procenjena aktivnost FVIIIFc iznad polazne vrednosti na približno 168 časova posle doze
Cl klirens
MRT Srednje vreme boravka
TBLP1 Modelom predviđeno vreme posle doze kada je aktivnost FVIIIFc opala do približno 1 IU/dL iznad polazne vrednosti
TBLP3 Modelom-predviđeno vreme posle doze kada je aktivnost FVIIIFc opala do približno 3 IU/dL iznad polazne vrednosti
TBLP5 Modelom-predviđeno vreme posle doze kada je aktivnsot FVIIIFc opala do približno 5 IU/dL iznad polazne vrednosti
Primer 6
[0171] Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII-Fc (rFVIIIFc) sa deletiranim B domenom stvoren je kao pristup produženom polu-životu FVIII. Farmakokinetika (PK) rFVIIIFc je upoređivana sa rFVIII kod miševa sa hemofilijom A. Našli smo da je terminalni polu-život bio dva puta duži za rFVIIIFc u poređenju sa rFVIII. U cilju potvrde da je mehanizam koji je u osnovi za produženje polu-života posledica zaštite rFVIIIFc pomoću FcRn, PK je procenjivana kod FcRn nokaut i transgenih miševa sa humanim FcRn. Jedna intravenska doza (125 IU/kg) je primenjena i koncentracija u plazmi je merena upotrebom analize hromogene aktivnosti. Cmax je bila slična između rFVIIIFc i rFVIII (XYNTHA®) kod oba mišja soja. Međutim, dok je polu-život za rFVIIIFc bio sličan onome od rFVIII u FcRn nokaut miševima, polu-život za rFVIIIFc je produžen do približno dva puta duže od onog za rFVIII u hFcRn transgenim miševima. Ovi rezultati potvrđuju da FcRn posreduje ili je odgovoran za produženi polu-život rFVIIIFc u poređenju sa rFVIII. S obzirom da je pokazano da je hemostaza u celoj krvi merena rotacionom tromboelastometrijom (ROTEM) u korelaciji sa efikasnošću faktora koagulacije u modelima krvarenja miševa sa hemofilijom kao i u kliničkim primenama, tražili smo procenu ex vivo efikasnosti rFVIIIFc kod miševa sa hemofilijom A upotrebom ROTEM. Miševi sa hemofilijom A su primali jednu intravensku dozu od 50 IU/kg rFVIIIFc, XYNTHA® (FVIII) ili ADVATE® (FVIII).5 minuta posle doze, formiranje ugruška bilo je slično u vezi sa vremenom zgrušavanja (CT), vremenom formiranja ugruška (CFT) i α-uglom. Međutim, rFVIIIFc je pokazao značajno poboljšan CT na 72 i 96 časova posle doze, i CFT i α-ugao su takođe bili poboljšani na 96 časova u poređenju sa oba XYNTHA® (FVIII) i ADVATE® (FVIII), u skladu sa produženim PK od rFVIIIFc. Prema tome konstrukcija Fc fuzije FVIII proizvodi molekul sa definisanim mehanizmom delovanja koji ima povećani polu-život i potencijal za obezbeđivanje produžene zaštite od krvarenja.
Primer 7
[0172] Ovaj Primer predstavlja krajnje rezultate analiza za aktivnost FVIII od 16 pacijenata tretiranih sa 25 i 65 IU/kg FVIII proizvoda. Videti Primere 3 i 5.
[0173] U ovom Primeru, rFVIIIFc je rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od jednog molekula rekombinantnog humanog FVIII (BDD-rFVIII) sa deletiranim B domenom fuzionisanog sa dimernim Fc domenom humanog IgG1, bez linker sekvenci između. Ovaj proteinski konstrukt je ovde takođe označen kao heterodimerni hibridni protein rFVIIIFc, fuzioni protein FVIIIFc i monomernog Fc, monomerni hibrid FVIIIFc, hibrid monomernog FVIIIIFc, i FVIIIFc monomer-dimer. Videti Primer 1, Sl.1, i Tabelu 2A.
[0174] Preklinička ispitivanja sa rFVIIIFc pokazala su približno 2-struko produženje poluživota aktivnosti rFVIII u poređenju sa komercijalno dostupnim proizvodima rFVIII. Obrazloženje za ovu studiju bilo je proceniti bezbednost i tolerabilnost jedne doze rFVIIIFc u zamrznutoj tečnoj formulaciji i obezbediti podatke o PK kod subjekata sa teškom hemofilijom A. Za ovu studiju, 16 subjekata koji se mogu procenjivati bili su dostupni za procenu PK. Jedna primena dve doze oba, rFVIIIFc i Advate u normalnoj dozi od 25 (n=6) i 65 IU/kg telesne težine (n=10) primenjena je preko intravenske infuzije tokom približno 10 minuta. Uzorci krvi za procene PK u plazmi su dobijeni pre infuzije, kao i do 10 dana posle doziranja. PK aktivnosti FVIII za oba Advate i rFVIIIFc su okarakterisane u ovoj studiji upotrebom model-zavisnog postupka.
CILJEVI
[0175] Primarni cilj ove studije bio je proceniti bezbednost i tolerabilnost jedne primene dve doze rFVIIIFc (25 i 65 IU/kg) u prethodno tretiranim pacijentima (PTPs) starosti 12 i starijim sa teškom hemofilijom A.
[0176] Sekundarni ciljevi su bili odrediti farmakokinetičke (PK) parametre određene pomoću farmakodinamičke (PD) aktivnosti FVIII u vremenu posle jedne primene od 25 ili 65 IU/kg rFVIIIFc u poređenju sa Advate u analizama zgrušavanja od jednog stadijuma i hromogene aktivnosti.
Dizajn studije (videti Primer 3)
[0177] Uzorci krvi su sakupljeni za PK procene aktivnosti FVIII prilikom posete za skrining (u roku od 28 dana pre doziranja Advate); na dan 0 (injekcija Advate) pre injekcije i na 10 i 30 minuta i 1, 3, 6 i 9 časova posle injekcije; na dan 1 na 24 časa posle injekcije Advate; na dan 2 na 48 časa posle injekcije Advate; na dan 3 na 72 časa posle injekcije Advate; i na dan 4 na 96 časova posle injekcije visoke doze Advate (samo kohorta B).
[0178] Uzorci krvi su sakupljeni za procene PK aktivnosti FVIII na dan injekcije rFVIIIFc neposredno pre primene rFVIIIFc, na 10 i 30 minuta i 1, 3, 6, i 9 časova posle injekcije rFVIIIFc; na dan 1 na 24 časa posle injekcije rFVIIIFc; na dane 2 do 5 na 48, 72, 96, i 120 časova posle injekcije rFVIIIFc; na dan 7 na 168 časova posle injekcije rFVIIIFc; na dane 8, 9, i 10 na 192, 216, i 240 časova posle injekcije visoke doze rFVIIIFc (samo kohorta B). Aktivnost FVIII je takođe merena prilikom poslednje posete u studiji (28 dana posle injkekcije rFVIIIFc) na 672 časova posle injekcije rFVIIIFc.
Farmakokinetičko modeliranje i izračunavanja
Skraćenice
[0179]
TBLP1 = Modelom-predviđeno vreme posle doze kada je aktivnost FVIII opala do približno 1 IU/dL iznad polazne vrednosti.
TBLP3 = Modelom-predviđeno vreme posle doze kada je aktivnost FVIII opala do približno 3 IU/dL iznad polazne vrednosti
KV_M = Cmax_M/stvarna doza (IU/kg)
KV_OB = Cmax_OB/stvarna doza (IU/kg)
IVR_M = 100 x Cmax_M x zapremina plazme (dL) / ukupna doza u IU; gde je zapremina plazme u mL = (23.7 x visina u cm) (9.0 x težina u kg) – 1709.
IVR_OB = 100 x Cmax_OB x zapremina plazme (dL) / ukupna doza u IU; gde je zapremina plazme u mL = (23.7 x visina u cm) (9.0 x težina u kg) – 1709.
REZULTATI
[0180] Slika 13. Zabeleženi profili srednje vrednosti grupe (+standardna greška) za aktivnost FVIII naspram vremena, sortirani prema nivou doze, grupisani prema jedinjenju (analiza od jednog stadijuma, 25 IU/kg (A) i 65 IU/kg (B)) i (hromogena analiza, 25 IU/kg (C) i 65 IU/kg (D)).
[0181] Slika 14. Zabeleženi profili srednje vrednosti grupe (+standardna greška) za aktivnost FVIII naspram vremena, grupisani prema nivou doze i jedinjenju (analiza od jednog stadijuma; A) (hromogena analiza; B).
Farmakokinetička jedne doze (analiza od jednog stadijuma)
[0182] Zabeležena aktivnost FVIII oštro je porasla posle kratke IV infuzije Advate ili rFVIIIFc, sa srednjim vrednostima (±SD) modelom-predviđenih vrednosti Cmax od 56.6 ± 4.74 i 121 ± 28.2 IU/dL za Advate i 56.6 ± 8.18 i 108 ± 16.9 IU/dL za rFVIIIFc za grupe za dozu 25 i 65 IU/kg, respektivno. Svi pacijenti tretirani sa Advate- i rFVIIIFc imali su povećanja u aktivnosti FVIII povezana sa dozom. Zabeleženo povećanje u Cmax i AUCINF bilo je malo manje od proporcionalnog sa dozom u opsegu procenjivanih doza.
[0183] Posle završetka infuzije, opadanje zebeležene aktivnosti FVIII ispoljilo je karakteristike monoeksponencijalnog opadanja sve dok se nije dostigao polazni nivo. Stopa opadanja u aktivnosti FVIII bila je sporija za rFVIIIFc nego za Advate sa srednjom vrednošću (±SD) modelom-predviđenih vrednosti polu-života eliminacije od 11.9 ± 2.98 i 10.4 ± 3.03 časova za Advate i 18.0 ± 3.88 i 18.4 ± 6.99 časova za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Vrednosti polu-života eliminacije izgleda da su nezavisne od doze u opsegu doza procenjivanom za oba proizvoda FVIII.
[0184] Ukupno sistemsko izlaganje FVIII (procenjeno pomoću AUCINF) bilo je ~ 48% i 61% veće posle primene rFVIIIFc nego kod Advate u 25 i 65 IU/kg nivoima doze, respektivno. Srednja vrednost (±SD) modelom-predviđenih vrednosti AUCINF bila je 974 ± 259 i 1810 ± 606 časova*IU/dL za Advate i 1440 ± 316 i 2910 ± 1320 časova*IU/dL za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
[0185] Slično polu-životu eliminacije, MRT je produženo za rFVIIIFc u odnosu na Advate. Srednja vrednost (±SD) modelom-predviđenih vrednosti MRT bila je 17.1 ± 4.29 i 14.9 ± 4.38 časova za Advate i 25.9 ± 5.60 i 26.5 ± 10.1 časova za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Vrednosti MRT izgleda da su nezavisne od doze u opsegu doza procenjivanom za oba proizvoda FVIII.
[0186] Pored toga, određene su vrednosti primarnih PK parametara za CL i V. CL vrednosti za rFVIIIFc samo su uračunale ~ 66% onih zabeleženih za Advate na ekvivalentnim dozama. Srednja vrednost (±SD) modelom-predviđenih vrednosti CL bila je 2.70 ± 0.729 i 4.08 ± 1.69 mL/čas/kg za Advate i 1.80 ± 0.409 i 2.69 ± 1.25 mL/čas/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. V vrednosti su bile slične između Advate i rFVIIIFc sa srednjim vrednostima (±SD) modelom-predviđenih V vrednosti od 43.9 ± 4.27 i 56.1 ± 13.4 mL/kg za Advate i 45.3 ± 7.23 i 61.6 ± 10.6 mL/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Mala povećanja u srednjim vrednostima CL i V vrednosti zabeležena su sa rastućom dozom Advate i rFVIIIFc; međutim, povećanje u standardnim devijacijama u dozi od 65 IU/kg zajedno sa ograničenim nivoima doze otežalo je procenu zavisnosti od doze ovih parametara. Na primer, CV% geometrijske sredine CL vrednosti za grupu za tretman sa rFVIIIFc povećala se od 23.0% (25 IU/kg) do 48.6% (65 IU/kg).
[0187] Pored toga primarni PK parametri, sekundarni PK parametri (npr. K-vrednosti, IVR, itd.) određeni su radi procene trajanja efekta FVIII. Dokaz o razlici PK je takođe zabeležen sa rFVIIIFc demonstrirajući povećane vrednosti TBLP1 i TBLP3 u poređenju sa Advate u ekvivalentnim dozama. IVR i K-vrednosti za Advate i rFVIIIFc izgleda da su slične. Malo povećanje u TBLP1 i TBLP3 vrednostima zabeleženo je da rastućom dozom Advate i rFVIIIFc. Nasuprot tome, mala smanjenja u srednjim vrednostima IVR i K-vrednosti zabeležena su sa rastućom dozom Advate i rFVIIIFc. Kao što je prethodno naznačeno, procena zavisnosti od doze ovih parametara je otežana ograničenim nivoima doze.
[0188] Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih TBLP1 bile su 2.88 ± 0.733 i 2.93 ± 0.848 IU/dL po IU/kg za Advate i 4.28 ± 0.873 i 5.16 ± 2.02 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih TBLP3 bile su 2.06 ± 0.527 i 2.26 ± 0.666 IU/dL po IU/kg za Advate i 3.09 ± 0.623 i 3.93 ± 1.59 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
[0189] Srednje vrednosti IVR i K-vrednosti izračunate upotrebom zabeleženih vrednosti Cmax (sa oduzetom polaznom vrednošću i rezidualnim lekom unutar modela) generalno su bile veće od vrednosti određenih upotrebom modelom-predviđenih Cmax vrednosti; u skladu sa procenom malo ispod prave vrednosti zabeležene aktivnosti na piku upotrebom jednokompartmentalnog modela. Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih K-vrednosti bile su 2.57 ± 0.198 i 2.13 ± 0.598 IU/dL po IU/kg za Advate i 2.46 ± 0.330 i 1.85 ± 0.332 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih IVR vrednosti bile su 94.1 ± 15.6 i 85.8 ± 16.5 % za Advate i 89.5 ± 11.9 i 74.8 ± 6.72 % za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
Farmakokinetika jedne doze (Hromogena analiza)
[0190] Zabeležena aktivnost FVIII je ošto povećana posle kratke IV infuzije Advate ili rFVIIIFc, sa srednjom vrednošću (±SD) modelom-predviđenih Cmax vrednosti od 70.2 ± 9.60 i 157 ± 38.6 IU/dL za Advate i 70.3 ± 10.0 i 158 ± 34.7 IU/dL za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
[0191] Svi pacijenti tretirani sa Advate- i rFVIIIFc imali su povećanja u aktivnosti FVIII povezana sa dozom. Zabeleženo povećanje u Cmax i AUCINF bilo je malo manje od proporcionalnog sa dozom u opsegu procenjivanih doza.
[0192] Posle završetka infuzije, opadanje zabeležene aktivnosti FVIII pokazalo je karakteristike monoeksponencijalnog opadanja sve dok se nije dostigao polazni nivo. Stopa opadanja u aktivnosti FVIII bila je sporija za rFVIIIFc nego za Advate sa srednjom vrednošću (±SD) modelom-predviđenih vrednosti polu-života eliminacije od 10.7 ± 1.98 i 10.3 ± 3.27 časova za Advate i 16.2 ± 2.92 i 19.0 ± 7.94 časova za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Vrednosti polu-života eliminacije izgleda da je zavisno od doze u odnosu na opseg doza procenjivan za oba proizvoda FVIII.
[0193] Ukupno sistemsko izlaganje FVIII (procenjeno pomoću AUCINF) bilo je ~ 53% i 84% veće posle primene rFVIIIFc nego za Advate u 25 i 65 IU/kg nivoima doze, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) modelom-predviđenih vrednosti AUCINF bile su 1080 ± 236 i 2320 ± 784 časova*IU/dL za Advate i 1650 ± 408 i 4280 ± 1860 časova*IU/dL za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
[0194] Slično polu-životu eliminacije, MRT je produženo za rFVIIIFc u odnosu na Advate. Srednje vrednosti (±SD) modelom-predviđenih vrednosti MRT bile su 15.3 ± 2.86 i 56.1 ± 4.72 časova za Advate i 56.1 ± 4.22 i 56.1 ± 11.4 časova za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Vrednosti MRT izgleda da su nezavisne od doze u odnosu na opseg doza za oba proizvoda FVIII.
[0195] Pored toga, određene su vrednosti primarnog PK parametra za CL i V. CL vrednosti za rFVIIIFc su samo uračunavale ~ 58-66% onih zabeleženih za Advate u ekvivalentnim dozama. Srednje vrednosti (±SD) modelom-predviđenih CL vrednosti bile su 56.1 ± 0.527 i 56.1 ± 1.40 mL/čas/kg za Advate i 56.1 ± 0.349 i 56.1 ± 0.970 mL/čas/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. V vrednosti su slične između Advate i rFVIIIFc sa srednjom vrednošću (±SD) modelom-predviđenih V vrednosti od 56.1 ± 5.52 i 43.656.1 ± 11.2 mL/kg za Advate i 56.1 ± 6.65 i 56.1 ± 8.91 mL/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Povećanja u srednjim vrednostima CL i V vrednosti su zabeležena sa rastućom dozom Advate i rFVIIIFc; međutim, povećanje u standardnim devijacijama u 65 IU/kg zajedno sa ograničinim nivoima doze otežavalo je procenu zavisnosti od doze ovih parametara.
[0196] Pored primarnih PK parametara, sekundarni PK parametri (npr. K-vrednosti, IVR, itd.) su određeni za procenu trajanja efekta FVIII. Dokaz razlike PK je takođe zabeležen sa rFVIIIFc koji pokazuje povećane TBLP1 i TBLP3 vrednosti u poređenju sa Advate u ekvivalentnim dozama. IVR i K-vrednosti za Advate i rFVIIIFc izgleda da su slične.
[0197] Malo povećanje u TBLP1 i TBLP3 vrednostima je zabeleženo sa rastućom dozom Advate i rFVIIIFc. Nasuprot tome, mala smanjenja u srednjim vrednostima IVR i K-vrednosti zabeležena su sa rastućom dozom Advate i rFVIIIFc. Kao što je prethodno naznačeno, procena zavisnosti od doze ovih parametara je otežana ograničenim nivoima doze.
[0198] Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih TBLP1 su bile 56.1 ± 0.511 i 56.1 ± 0.978 IU/dL po IU/kg za Advate i 56.1 ± 0.798 i 56.1 ± 2.38 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih TBLP3 bile su 56.1 ± 0.377 i 2.39 ± 0.718 IU/dL po IU/kg za Advate i 3.04 ± 0.598 i 4.44 ± 1.84 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
[0199] Srednje vrednosti IVR i K-vrednosti izračunate upotrebom zabeleženih vrednosti Cmax (oduzete od polazne vrednosti i sa preostalim lekom unutar modela) bile su generalno više od vrednosti određenih upotrebom modelom-predviđenih vrednosti Cmax; u skladu sa procenom malo ispod prave vrednosti zabeležene aktivnosti pika upotrebom jednokompartmentnog modela. Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih K-vrednosti bile su 56.1 ± 0.429 i 56.1 ± 0.721 IU/dL po IU/kg za Advate i 56.1 ± 0.451 i 56.1 ± 0.985 IU/dL po IU/kg za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno. Srednje vrednosti (±SD) zabeleženih IVR vrednosti bile su 56.1 ± 14.5 i 56.1 ± 26.9 % za Advate i 56.1 ± 16.3 i 56.1 ± 33.6 % za rFVIIIFc za grupe za dozu od 25 i 65 IU/kg, respektivno.
ZAKLJUČCI
[0200] Svi pacijenti tretirani sa Advate- i rFVIIIFc imali su slična povećanja u Cmax i AUCINF povezana sa dozom u odnosu na procenjeni opseg doza. Maksimalni nivoi aktivnosti Advate i rFVIIIFc u plazmi su generalno zabeleženi unutar prvog časa posle kraja infuzije i ostali su detektabilni nekoliko dana posle doziranja. Posle kraja infuzije, opadanje u polaznoj vrednosti ispravljene aktivnosti FVIII pokazalo je monoeksponencijalno opadanje dok se nije dostigla polazna vrednost za oba proizvoda. Vrednosti parametara za polu-život eliminacije i MRT izgleda da su zavisne od doze u odnosu na opseg doza procenjen za oba proizvoda FVIII. Mala povećanja u srednjim vrednostima CL i V vrednosti su zabeležena sa povećanjem doze Advate i rFVIIIFc; međutim, povećana varijabilnost među subjektima u 65 IU/kg zajedno sa ograničenim nivoima doze otežavala je procenu zavisnosti od doze ovih parametara.
[0201] Poređenje aktivnosti PK za rFVIIIFc i Advate otkrilo je približno 48-61% (analiza od jednog stadijuma) ili 53-84% (hromogena analiza) povećanje u sistemskom izlaganju, približno 30-40% smanjenje u klirensu, i približno 50-80% povećanje u polu-životu eliminacije i MRT za rFVIIIFc u odnosu na Advate u sličnim dozama. Dokaz za PK razliku zabeležen je sa rFVIIIFc pokazujući povećane TBLP1 i TBLP3 vrednosti u poređenju sa Advate u ekvivalentnim dozama. IVR i K-vrednosti za Advate i rFVIIIFc izgleda da su slične.
[0202] PK parametri dobijeni iz rezultata hromogene analize generalno su u skladu sa onima iz analize jednog stadijuma, osim što je hromogena analiza proizvela veću procenu parametara izlaganja (npr. Cmax, AUCINF, itd.).
[0203] Sa zabeleženim poboljšanjima u PK, rFVIIIFc može da obezbedi produženu zaštitu od krvarenja, omogućavajući ređe injekcije za individue sa hemofilijom A.
Primer 8
[0204] Na osnovu privremene analize PK iz studije rFVIII:Fc prvi put izvedene na ljudima (Primer 3), dizajnirana je A-LONG studija. A-LONG je otvorena, multi-centrična procena bezbednosti, farmakokinetike i efikasnosti fuzionog proteina rekombinantnog faktora VIII sa Fc (FVIII:Fc) u prevenciji i lečenju krvarenja kod subjekata sa teškom hemofilijom A koji su prethodno tretirani (definisani kao <1 IU/dL [<1%] endogenog FVIII).
[0205] Približno 106 subjekata će biti uključeni u jedan od tri režima: režim prilagođene profilakse (grana 1), nedeljni režim doziranja (grana 2), i režim na zahtev (grana 3).
Grana 1: Režim prilagođene profilakse
[0206] Grana 1 će obuhvatati ukupnu grupu i PK podgrupu. Približno 66 subjekata će biti uključeno. Početni režim biće dva puta nedeljno u 25 IU/kg prvog dana, a zatim 50 IU/kg četvrtog dana nedelje. Subjekti će primiti rFVIIIFc po ovom nedeljenom režimu profilakse sve dok PK rezultati za rFVIIIFc ne budu dostupni. Na osnovu ovih rezultata, režim prilagođene profilakse biće ustanovljen za svaku individuu, u kome će doza i interval biti određeni za održavanje preko nivoa od 1-3% aktivnosti FVIII. Svaki subjekat će zatim primati svoj individualno prilagođen režim profilakse tokom studije.
[0207] Subjekti će biti praćeni tokom studije i napraviće se podešavanja tekuće doze i intervala. Podešavanja će biti napravljena samo kada subjekat ima neprihvatljive epizode krvarenja definisane kao ≥2 epizode spontanog krvarenja tokom kontinuiranog perioda od dva meseca. U ovom slučaju, podešavanje će se postići preko nivoa od 3-5%.
Grana 2: Režim nedeljnog doziranja
[0208] Približno 20 subjekata biće obuhvaćeno/randomizovano i biće podvrgnuti skraćenom PK profilisanju rFVIIIFc kao što sledi: Ispiranje od najmanje 96 časova; jedna doza rFVIIIFc 65 IU/kg; Skraćeno uzorkovanje koje počinje na na dan 0 uvođenja rFVIIIFc, uključujući preinjekciju i 10 (±2) minuta, 3 hours 56.1 ± 15 minuta), 7256.1 ± 2) časa [dan 3], i 9656.1 ± 2) časova [dan 4] od početka injektiranja. Posle skraćenog profilisanja PK, subjekti će zatim primati fiksnu dozu od 65 IU/kg rFVIIIFc svakih 7 dana.
Grana 3: Režim na zahtev
[0209] Minimalno 10 velikih operacija kod najmanje 5 subjekata biće procenjivane u studiji. Velika operacija je definisana kao bilo koja hirurška procedura (elektivna ili hitna) koja obuhvata opštu anesteziju i/ili pomoć u disanju gde se prodire u glavnu telesnu šupljinu i ona se izlaže, ili za koju je proizvedeno značajno pogoršanje fizičkih ili psihičkih funkcija (npr., laparotomija, torakotomija, kraniotomija, zamena zgloba i amputacija uda).
[0210] Za profilaksu u toku operacije, subjekti će biti tretirani sa 35 do 50 IU/kg rFVIIIFc svakih 12 do 24 časa. Pre operacije, lekar će pregledati subjektov PK profil rFVIIIFc i proceniti režim doziranja zamene faktora VIII generalno potrebnog za tip planirane operacije i klinički status subjekta. Preporuke odgovarajućeg doziranja rFVIIIFc u periodu hirurškog tretmana, uključujući bilo koje vreme rehabilitacije, uzeće ove faktore u razmatranje.
[0211] Primarni ciljevi ove studije su (a) proceniti bezbednost i tolerabilnost rFVIIIFc primenjenog kao režimi profilakse, na zahtev i hirurškog tretmana; i (b) proceniti efikasnost rFVIIIFc primenjenog kao režimi profilakse, na zahtev i hirurškog tretmana. Sekundarni ciljevi ove studije su (a) okarakterisati PK profil rFVIIIFc i upoređivati PK od FVIIIFc sa proizvodom koji se trenutno prodaje, ADVATE; (b) proceniti pojedinačne odgovore sa FVIIIFc; i (c) proceniti potrošnju FVIIIFc.
Primarni ciljevi
[0212]
● Proceniti bezbednost i tolerabilnost rFVIIIFc primenjenog kao režim profilakse, nedeljni režim, režim na zahtev i režim hirurškog tretmana
● Proceniti efikasnost rFVIIIFc primenjenog kao režim prilagođene profilakse, režim na zahtev i režim hirurškog tretmana
Sekundarni ciljevi
[0213]
● Okarakterisati PK profil rFVIIIFc i uporediti PK od rFVIIIFc sa proizvodom koji se trenutno prodaje, Advate®
● Proceniti pojedinačne odgovore sa rFVIIIFc
● Okarakterisati opseg doze i režima potrebnih za adekvatnu prevenciju krvarenja u režimu profilakse; održavati homeostazu u hirurškoj postavci; ili lečiti epizode krvarenja u postavci na zahtev, nedeljnog tretmana ili profilakse
● Proceniti potrošnju rFVIIIFc (npr., ukupna godišnja potrošnja rFVIIIFc po subjektu)
Primer 9
Klinička procena ROTEM
[0214] U studiji u Primeru 8, pored merenja aktivnosti FVIII u plazmi pomoću analize od jednog stadijuma aktiviranog delimičnog tromboplastinovog vremena (aPTT), rotaciona tromboelastometrija (ROTEM) cele krvi je takođe ispitivana za procenu poboljšanja u globalnoj homeostazi pomoću rFVIIIFc i Advate kod 2 subjekta, specifično, 1 u kohorti niske doze i 1 u kohorti visoke doze.
[0215] rFVIIIFc i Advate izgleda da su slično aktivni u formiranju ugruška kada su dodati u krv subjekta pre tretmana sa rFVIIIFc. Vreme zgrušavanja (CT) je bilo linearno u odnosu na dozu rFVIIIFc i Advate u opsegu od približno 1% od 100% od normalnog, i odgovor na dozu je bio sličan između rFVIIIFc i Advate u istom subjektu.
[0216] Posle doziranja sa Advate i zatim sa rFVIIIFc, citratna cela krv je uzorkovana na različitim vremenskim tačkama i formiranje ugruška posle rekalcifikacije je praćeno pomoću ROTEM. Uprkos varijabilnoj polaznoj vrednosti CT zbog rezidualnih nivoa FVIII pre doziranja sa Advate ili rFVIIIFc, oba proizvoda su efikasno ispravila CT do sličnih nivoa 30 minuta posle injekcije. Pored toga, poboljšanje u CT bilo je bolje produžavano na 3 časa i posle 3 časa i posle injekcije od 25 IU/kg rFVIIIFc u odnosu na Advate kod subjekta doziranog u ovoj niskoj dozi. Međutim, diferencijalno poboljšanje rFVIIIFc naspram Advate bilo je mnogo manje primetno na dozi od 65 IU/kg.
Tabele
Tabela 1: Polinukleotidne sekvence
C
Ċ Tabela 2: Polipeptidne sekvence
Tabela 3. Određivanje vremena zgrušavanja cele krvi (WBCT) kod miševa sa hemofilijom A posle jedne intravenske doze od 50 IU/kg rFVIIIFc ili ReFacto®.
Tabela 4. Parametri PK posle jedne intravenske doze kod miševa sa hemofilijom A (50 IU/kg)
Tabela 6. Aktivnost zgrušavanja merena pomoću aPTT kod pasa sa hemofilijom A posle jedne intravenske doze sa rFVIIIFc ili ReFacto®.
Tabela 7. Koncentracija rFVIIIFc ili Xyntha u plazmi majmuna primenjenih kao jedna intravenska doza od 125 IU/kg merena pomoću ELISA.
Tabela 8. Koncentracija rFVIIIFc ili Xyntha u plazmi majmuna primenjenih kao jedna intravenska doza od 125 IU/kg merena pomoću hromogene analize aktivnosti specifične za FVIII (prikazana u IU/mL).
Tabela 9. Parametri rFVIIIFc posle jedne doze od 125 IU/kg
Tabela 10. Parametri PK Xyntha posle jedne IV doze od 125 IU/kg
Tabela 11. Aktivacija faktora X
LISTING SEKVENCI
[0217]

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Himerni polipeptid koji sadrži faktor VIII deo i deo koji nije faktor VIII, za upotrebu u prevenciji ili lečenju epizode krvarenja kod humanog subjekta, pri čemu je himerni polipeptid za primenu u dozi od 25 IU/kg do 65 IU/kg u intervalu doziranja jednom svaka 3 ili više dana, pri čemu, deo koji nije faktor VIII je vezujući partner FcRn (FcRn BP).
2. Himerni polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što subjekat ima hemofiliju A.
3. Himerni polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time što je interval doziranja jednom svakih 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 dana.
4. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što doza himernog polipeptida je 25 IU/kg, 26 IU/kg, 27 IU/kg, 28 IU/kg, 29 IU/kg, 30 IU/kg, 31 IU/kg, 32 IU/kg, 33 IU/kg, 34 IU/kg, 35 IU/kg, 36 IU/kg, 37 IU/kg, 38 IU/kg, 39 IU/kg, 40 IU/kg, 41 IU/kg, 42 IU/kg, 43 IU/kg, 44 IU/kg, 45 IU/kg, 46 IU/kg, 47 IU/kg, 48 IU/kg, 49 IU/kg, 50 IU/kg, 51 IU/kg, 52 IU/kg, 53 IU/kg, 54 IU/kg, 55 IU/kg, 56 IU/kg, 57 IU/kg, 58 IU/kg, 59 IU/kg, 60 IU/kg, 61 IU/kg, 62 IU/kg, 63 IU/kg, 64 IU/kg, ili 65 IU/kg.
5. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što doza himernog polipeptida je 65 IU/kg i interval doziranja je jednom svakih 6-7 dana.
6. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što FcRn BP sadrži ceo IgG, Fc fragment IgG, ili fragment IgG koji obuhvata kompletan vezujući region FcRn.
7. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što himerni polipeptid je FVIIIFc-monomer-dimer hibrid.
8. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što faktor VIII deo sadrži faktor VIII pune dužine, zreo faktor VIII, ili faktor VIII sa potpunom ili delimičnom delecijom B domena.
9. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, za upotrebu u profilaksi.
10. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, za upotrebu u prilagođenoj profilaksi.
11. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, za upotrebu u tretmanu na zahtev.
12. Himerni polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačen time što himerni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je (a) najmanje 90%, 95%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 1665 od SEQ ID NO: 2 ili (b) najmanje 90%, 95% ili 100% identična sa aminokiselinama -19 do 1665 od SEQ ID NO: 2
RS20180182A 2009-12-06 2010-12-06 Himerni i hibridni polipeptidi faktora viii-fc, i postupci za njihovu upotrebu RS56957B1 (sr)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26707009P 2009-12-06 2009-12-06
US28505409P 2009-12-09 2009-12-09
US30159210P 2010-02-04 2010-02-04
US36306510P 2010-07-09 2010-07-09
US37311310P 2010-08-12 2010-08-12
US41092910P 2010-11-07 2010-11-07
US41967610P 2010-12-03 2010-12-03
EP10835255.0A EP2506868B1 (en) 2009-12-06 2010-12-06 Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
PCT/US2010/059136 WO2011069164A2 (en) 2009-12-06 2010-12-06 Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56957B1 true RS56957B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=44115536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180182A RS56957B1 (sr) 2009-12-06 2010-12-06 Himerni i hibridni polipeptidi faktora viii-fc, i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (30)

Country Link
US (5) US9050318B2 (sr)
EP (4) EP4382170A3 (sr)
JP (8) JP5903048B2 (sr)
KR (1) KR101770849B1 (sr)
CN (1) CN102791285A (sr)
AU (6) AU2010325787B2 (sr)
BR (1) BR112012013502A2 (sr)
CA (2) CA2782424C (sr)
CO (1) CO6561782A2 (sr)
CY (2) CY1119919T1 (sr)
DK (1) DK2506868T3 (sr)
EA (2) EA025416B1 (sr)
ES (2) ES2880038T3 (sr)
HR (2) HRP20180135T1 (sr)
HU (1) HUE036233T2 (sr)
IL (2) IL220204B (sr)
LT (1) LT2506868T (sr)
ME (1) ME02964B (sr)
MX (3) MX336830B (sr)
MY (1) MY159135A (sr)
NO (1) NO2506868T3 (sr)
NZ (2) NZ703153A (sr)
PL (2) PL2506868T3 (sr)
PT (2) PT3326643T (sr)
RS (1) RS56957B1 (sr)
SG (3) SG10201408049SA (sr)
SI (1) SI2506868T1 (sr)
SM (1) SMT201800099T1 (sr)
WO (1) WO2011069164A2 (sr)
ZA (1) ZA201204874B (sr)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6263355A (ja) * 1985-09-13 1987-03-20 Hitachi Ltd バツテリバツクアツプｒａｍのチエツク方法
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
CN108530543B (zh) 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
CN102741275B (zh) 2009-08-24 2016-08-03 阿穆尼克斯运营公司 凝血因子ix组合物及其制备和使用方法
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HRP20191305T1 (hr) 2010-07-09 2019-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Preradive jednolančane molekule i polipeptidi izrađeni koristeći iste
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
ES3005233T3 (en) 2010-10-01 2025-03-14 Modernatx Inc Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CA2930801C (en) 2010-11-05 2019-05-28 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
AU2012282875B2 (en) * 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2013016454A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-31 Biogen Idec Hemophilia Inc. Assays to monitor bleeding disorders
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2763701B1 (en) 2011-10-03 2018-12-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
SMT201800586T1 (it) * 2012-01-12 2019-01-11 Bioverativ Therapeutics Inc Riduzione dell'immunogenicita' contro il fattore viii negli individui che si sottopongono alla terapia con fattore viii
EP2804623B1 (en) * 2012-01-12 2019-08-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
LT3564260T (lt) * 2012-02-15 2023-01-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Viii faktoriaus kompozicijos ir jų gamybos bei panaudojimo būdai
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151663A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US10317376B2 (en) 2012-04-11 2019-06-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc Chimeric clotting factors
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
CN110054699A (zh) * 2012-07-11 2019-07-26 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP3446700A1 (en) * 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
ES2921623T3 (es) 2012-11-26 2022-08-30 Modernatx Inc ARN modificado terminalmente
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
FI3889173T3 (fi) * 2013-02-15 2023-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Optimoitu tekijä viii:n geeni
ES2926798T3 (es) * 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US9090697B2 (en) * 2013-03-15 2015-07-28 Bayer Healthcare Llc Methods for treating bleeding disorders
WO2014190305A2 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Anti-gpiib/iiia antibodies or uses thereof
TW201536811A (zh) * 2013-05-31 2015-10-01 Biogen Idec Inc 嵌合ｆｖｉｉ－ｘｔｅｎ分子及其用途
WO2017180807A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Baxalta Incorporated Method and apparatus for providing a pharmacokinetic drug dosing regiment
GEP20196990B (en) * 2013-06-20 2019-07-10 GmbH Baxalta Method and system for providing a pharmacokinetic drug dosing regime
EP3013359A4 (en) * 2013-06-28 2017-01-25 Biogen MA Inc. Thrombin cleavable linker
MX2015016567A (es) * 2013-06-28 2016-03-31 Biogen Ma Inc Enlazador escindible por trombina con xten y usos del mismo.
EP3027224B1 (en) 2013-07-31 2020-06-03 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates using transglutaminase
US20160311885A1 (en) 2013-08-14 2016-10-27 Biogen Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
EP3048899B1 (en) 2013-09-25 2021-09-08 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
EP3082848B1 (en) * 2013-12-06 2023-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
JP2017500017A (ja) 2013-12-20 2017-01-05 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 生物薬剤フェドバッチ生産能力及び生産物品質を改善するための灌流シード培養の使用
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
EP3102589A1 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Biogen MA Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
WO2015148454A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Optimized and modified factor viii genes for gene therapy
CN106456798B (zh) 2014-04-25 2021-02-12 瑞纳神经科学公司 具有高药物负载的抗体-药物缀合物
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
BR112017007765B1 (pt) 2014-10-14 2023-10-03 Halozyme, Inc Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
IL257231B (en) 2015-08-03 2022-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
KR20180118659A (ko) 2016-02-01 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 viii 인자 유전자
TW201739448A (zh) * 2016-05-06 2017-11-16 安成生物科技股份有限公司 用於治療及/或預防血液相關疾病之方法及配方
JP6877469B2 (ja) * 2016-06-24 2021-05-26 モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチＭｏｇａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｖｉｉｉおよびｖｗｆ因子を含むキメラタンパク質、ならびにそれらの使用
AU2017306709A1 (en) 2016-08-05 2019-03-14 Humabs, BioMed SA Anti-o2 antibodies and uses thereof
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
CN106279437B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
SG11201903063UA (en) 2016-10-19 2019-05-30 Medimmune Llc Anti-o1 antibodies and uses thereof
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
JP2019536794A (ja) * 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
CN108239151B (zh) * 2016-12-23 2020-07-03 海门晟斯生物制药有限公司 重组单链人FVIII-Fc融合蛋白及其应用
US10896749B2 (en) 2017-01-27 2021-01-19 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Drug monitoring tool
WO2018144623A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
SI3793588T1 (sl) 2018-05-18 2025-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Postopki zdravljenja hemofilije A
AU2019282264A1 (en) 2018-06-05 2020-11-26 Amgen Inc. Modulating antibody dependent cellular phagocytosis
AU2019339895A1 (en) 2018-09-11 2021-03-11 Amgen Inc. Methods of modulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
WO2020086408A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess
BR112021010047A2 (pt) 2018-12-06 2021-08-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Uso de vetores lentivirais expressando o fator ix
BR112021025426A2 (pt) 2019-06-19 2022-06-21 Bioverativ Therapeutics Inc Fator recombinante viii-fc para tratamento de hemofilia e baixa densidade mineral óssea
US12403164B2 (en) 2019-09-30 2025-09-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
KR20230074703A (ko) 2020-06-24 2023-05-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 유리 인자 viii을 상기 단백질이 발현되도록 변형된 렌티바이러스 벡터의 제제로부터 제거하는 방법
PE20251064A1 (es) * 2022-04-28 2025-04-09 Biocad Joint Stock Co Acido nucleico aislado que codifica una proteina de fusion basada en fviii-bdd y en un peptido senal heterologo, y uso de la misma
CN114989307B (zh) * 2022-05-11 2023-08-01 华兰生物工程股份有限公司 一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白及制备方法

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235881A (en) * 1978-12-04 1980-11-25 Cort Joseph H Method for producing high potency factor VIII
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
AU5772886A (en) 1985-04-12 1986-11-05 Genetics Institute Inc. Novel procoagulant proteins
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
JP2525022B2 (ja) 1986-01-03 1996-08-14 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド ▲ＶＩＩＩ▼：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US5004803A (en) 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
CA2078721A1 (en) 1991-09-24 1993-03-25 Hiroshi Yonemura Process for preparing human coagulation factor viii protein complex
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US5859204A (en) 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5563045A (en) 1992-11-13 1996-10-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric procoagulant proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
EP1274720A4 (en) 2000-04-12 2004-08-18 Human Genome Sciences Inc FUSION PROTEINS CONTAINING ALBUMIN
EP1359935A1 (en) * 2001-02-05 2003-11-12 Novo Nordisk Health Care AG Combined use of factor vii polypeptides and factor ix polypeptides
PT1463751E (pt) 2001-12-21 2013-08-26 Human Genome Sciences Inc Proteínas de fusão de albumina
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
EP1444986A1 (en) * 2003-02-07 2004-08-11 Aventis Behring GmbH Pharmaceutical preparation for the improved treatment of blood-clotting disorders
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2333598T5 (es) 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
MXPA05013789A (es) * 2003-06-19 2006-06-27 Tanox Inc Composiciones y metodos para tratar los desordenes relacionados con la coagulacion.
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
DK2402754T4 (da) 2006-03-06 2023-08-28 Amunix Operating Inc Ustrukturerede rekombinante polymerer og anvendelser deraf
KR20080108147A (ko) * 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
CA2673459C (en) 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
MX2010001684A (es) 2007-08-15 2010-04-21 Amunix Inc Composiciones y metodos para modificar propiedades de polipeptidos biologicamente activos.
DK2257311T3 (da) * 2008-02-27 2014-06-30 Novo Nordisk As Konjugerede Faktor VIII-Molekyler
US8800831B2 (en) 2009-08-19 2014-08-12 Larry A. Gray Multi-purpose rack and method thereof
CN108530543B (zh) 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
CN102427823A (zh) * 2009-03-24 2012-04-25 拜耳医药保健有限公司 因子viii变体及使用方法
GB0908515D0 (en) 2009-05-18 2009-06-24 Apitope Technology Bristol Ltd Peptide
WO2011069164A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
AU2012282875B2 (en) * 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
SMT201800586T1 (it) * 2012-01-12 2019-01-11 Bioverativ Therapeutics Inc Riduzione dell'immunogenicita' contro il fattore viii negli individui che si sottopongono alla terapia con fattore viii
ES2926798T3 (es) * 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
JP6083911B2 (ja) 2014-12-19 2017-02-22 花王株式会社 吸収性物品

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201204874B (en) 2016-06-29
CA3121739A1 (en) 2011-06-09
US20190262429A1 (en) 2019-08-29
JP2023071969A (ja) 2023-05-23
WO2011069164A3 (en) 2011-07-28
NO2506868T3 (sr) 2018-04-14
US20130108629A1 (en) 2013-05-02
JP2020019821A (ja) 2020-02-06
AU2010325787A8 (en) 2012-07-19
JP2025083451A (ja) 2025-05-30
US9050318B2 (en) 2015-06-09
EA038618B1 (ru) 2021-09-23
ES2880038T3 (es) 2021-11-23
EP2506868A2 (en) 2012-10-10
CY1124888T1 (el) 2023-01-05
AU2010325787A1 (en) 2012-07-12
MY159135A (en) 2016-12-15
JP7244688B2 (ja) 2023-03-22
EP2506868B1 (en) 2017-11-15
PT3326643T (pt) 2021-07-12
US20220265780A1 (en) 2022-08-25
AU2019202969A1 (en) 2019-05-16
AU2016213822B2 (en) 2017-08-31
PT2506868T (pt) 2018-02-23
CA2782424A1 (en) 2011-06-09
JP6385410B2 (ja) 2018-09-05
MX382693B (es) 2025-03-13
PL3326643T3 (pl) 2021-10-25
JP2018024706A (ja) 2018-02-15
US20130274194A1 (en) 2013-10-17
SG10201408049SA (en) 2015-02-27
ME02964B (me) 2018-07-20
JP6641340B2 (ja) 2020-02-05
EP4382170A3 (en) 2024-09-04
JP2022051964A (ja) 2022-04-01
EP3326643A1 (en) 2018-05-30
AU2017268648A1 (en) 2017-12-21
MX353233B (es) 2018-01-08
US11266720B2 (en) 2022-03-08
NZ703153A (en) 2015-02-27
SG10201907152YA (en) 2019-09-27
DK2506868T3 (da) 2018-01-29
KR20120129882A (ko) 2012-11-28
CO6561782A2 (es) 2012-11-15
PL2506868T3 (pl) 2018-06-29
LT2506868T (lt) 2018-02-26
EA201691109A1 (ru) 2017-01-30
AU2017268648B2 (en) 2019-01-31
JP2013512678A (ja) 2013-04-18
SMT201800099T1 (it) 2018-03-08
AU2016213822A1 (en) 2016-09-01
AU2021202912B2 (en) 2024-08-01
EP2506868A4 (en) 2013-07-24
EP3326643B1 (en) 2021-04-07
EA201290443A1 (ru) 2013-06-28
AU2021202912A1 (en) 2021-06-03
AU2010325787B2 (en) 2016-05-12
MX336830B (es) 2016-02-03
EA025416B1 (ru) 2016-12-30
HUE036233T2 (hu) 2018-06-28
IL220204A0 (en) 2012-07-31
BR112012013502A2 (pt) 2017-01-10
WO2011069164A2 (en) 2011-06-09
EP4382170A2 (en) 2024-06-12
JP6062459B2 (ja) 2017-01-18
CA2782424C (en) 2021-07-27
SG181130A1 (en) 2012-07-30
NZ600709A (en) 2015-01-30
EP3906937A1 (en) 2021-11-10
CY1119919T1 (el) 2018-06-27
JP5903048B2 (ja) 2016-04-13
CN102791285A (zh) 2012-11-21
ES2659888T3 (es) 2018-03-19
AU2024227757A1 (en) 2024-11-21
AU2010325787A2 (en) 2013-06-06
IL220204B (en) 2018-08-30
JP2015083608A (ja) 2015-04-30
US20160199455A1 (en) 2016-07-14
JP2017025098A (ja) 2017-02-02
HRP20180135T1 (hr) 2018-04-06
MX2012006347A (es) 2012-10-03
IL260769B (en) 2020-03-31
HK1253887A1 (en) 2019-07-05
SI2506868T1 (en) 2018-04-30
HRP20211010T1 (hr) 2021-09-17
US9241978B2 (en) 2016-01-26
KR101770849B1 (ko) 2017-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7244688B2 (ja) 第ＶＩＩＩ－Ｆｃ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP7273487B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
EP2737311B1 (en) Assays to monitor bleeding disorders
HK40112150A (en) Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40062720A (en) Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1253887B (en) Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1176878A (en) Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1176878B (en) Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40091851A (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40011493B (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK40011493A (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1197805B (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HK1197805A (en) Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof