ES2885191T3 - Métodos y composiciones para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra de ácidos nucleicos de baja calidad; y (b) cizallar selectivamente la pluralidad de ácidos nucleicos, que comprende: (i) obtener una primera fracción que comprende ácidos nucleicos más largos de la pluralidad de ácidos nucleicos, y una segunda fracción que comprende ácidos nucleicos más cortos de la pluralidad de ácidos nucleicos, (ii) cizallar los ácidos nucleicos de la primera fracción, y (iii) combinar la primera fracción cizallada y la segunda fracción, preparando así la biblioteca de ácidos nucleicos.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos
Campo de la invención
Las realizaciones proporcionadas en este documento se refieren a métodos para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos a partir de ácidos nucleicos obtenidos de muestras de ácidos nucleicos de baja calidad, tales como muestras antiguas y muestras fijadas.
Antecedentes de la invención
La secuenciación del genoma completo, la genotipificación, la resecuenciación dirigida y los análisis de expresión génica de muestras de tejido pueden ser de gran importancia para la identificación de biomarcadores de enfermedades, para el diagnóstico y pronóstico precisos de la enfermedad y para la selección del tratamiento de un paciente. Por ejemplo, el análisis de la secuencia de ácidos nucleicos del tejido tumoral extirpado de un paciente puede usarse para determinar la presencia o ausencia de biomarcadores genéticos particulares, por ejemplo, variantes somáticas, trasposiciones estructurales, mutaciones puntuales, deleciones e inserciones, y/o la presencia de ausencia de genes particulares. Además, el análisis de ácidos nucleicos antiguos puede proporcionar una gran cantidad de información, incluida la evolución de genes y organismos, y la migración y ascendencia de poblaciones e individuos.
A menudo se preparan muestras de tejido fijadas, como las muestras patológicas fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE), a partir de pacientes para el análisis histológico y el almacenamiento en archivos. Los ácidos nucleicos en tales muestras de FFPE son a menudo de baja calidad con una fragmentación significativa, una mayor proporción de ADN monocatenario y una variedad de lesiones de ADN inducidas químicamente que incluyen rotura de cadenas, sitios abásicos y bases modificadas químicamente. A menudo, la cantidad de ADN que se puede extraer de las muestras FFPE y luego analizar es pequeña. De manera similar, las muestras de ácidos nucleicos antiguos suelen ser de baja calidad y factores como el tiempo, la temperatura y la presencia de agua degradan los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos antiguos pueden contener una gran cantidad de mutaciones que aumentan con el tiempo, como sustituciones procedentes de la desaminación de residuos.
La calidad y las pequeñas cantidades de ADN que se pueden preparar a partir de muestras de ácido nucleico de baja calidad hacen que tales muestras sean difíciles de usar en la preparación de bibliotecas de secuenciación de suficiente rendimiento, complejidad y cobertura genómica. Por tanto, son deseables métodos y composiciones para el enriquecimiento de ácidos nucleicos obtenidos a partir de muestras de ácidos nucleicos de baja calidad que son adecuadas para el análisis de secuencias de ácidos nucleicos.
Compendio de la invención
La invención se refiere a un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad, que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra de ácidos nucleicos de baja calidad; y (b) cizallar selectivamente la pluralidad de ácidos nucleicos, que comprende: (i) obtener una primera fracción que comprende los ácidos nucleicos más largos de la pluralidad de ácidos nucleicos, y una segunda fracción que comprende los ácidos nucleicos más cortos de la pluralidad de ácidos nucleicos, (ii) cizallar los ácidos nucleicos de la primera fracción, y (iii) combinar la primera fracción y la segunda fracción, preparando así la biblioteca de ácidos nucleicos.
En algunas realizaciones, la etapa (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 100 pb se unen selectivamente a la matriz. En algunas realizaciones, la etapa (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 550 pb se unen selectivamente a la matriz.
En algunas realizaciones, la matriz comprende una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI). En algunas realizaciones, la solución de perlas SPRI se selecciona del grupo que consiste en AMPURE XP, SPRISELECT, AXYPREP MAG FRAGMENTSELECT y MAGJET Magnetic Beads.
En algunas realizaciones, el cizallamiento de los ácidos nucleicos comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste en sonicación, cizalladura acústica, nebulización, cizalladura con aguja y fragmentación enzimática.
En algunas realizaciones, la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb. En algunas realizaciones, la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 100 pb. En algunas realizaciones, la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb. En algunas realizaciones, la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 100 pb.
Algunas realizaciones también incluyen la repetición de (i) y (ii).
Algunas realizaciones también incluyen la etapa (c) retirar los ácidos nucleicos monocatenarios de las fracciones combinadas. Algunas realizaciones también incluyen retirar la porción monocatenaria de un ácido nucleico que comprende
una porción monocatenaria y una porción bicatenaria. En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una exonucleasa monocatenaria. En algunas realizaciones, la exonucleasa monocatenaria es una exonucleasa 5'-3'. En algunas realizaciones, la exonucleasa monocatenaria se selecciona del grupo que consiste en RecJ, exonucleasa I, exonucleasa T, exonucleasa VII, exonucleasa VIII y exonucleasa de frijol mungo.
Algunas realizaciones también incluyen la etapa (d) reparar los ácidos nucleicos de las fracciones combinadas. En algunas realizaciones, la etapa (d) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una enzima seleccionada del grupo que consiste en uracilo N-glicosilasa (UNG), uracilo ADN glicosilasa (UDG), endonucleasa IV, endonucleasa VIII, formamidopirimidina-ADN glicosilasa (FPG), ADN-(sitio apurínico o apirimidínico) liasa y Pol p.
Algunas realizaciones también incluyen una etapa de reparación final. La etapa de reparación de los extremos puede comprender, por ejemplo, tratar el ADN bicatenario con una ADN polimerasa para generar fragmentos de ADN de extremos romos. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa puede ser una polimerasa que tiene actividad polimerasa 5'-3' y actividad exonucleasa 3'-5'. En algunas realizaciones, la etapa de reparación final puede comprender tratar fragmentos de ADN bicatenarios con una polinucleótido quinasa para generar fragmentos con fosfatos 5' para permitir la ligación de adaptadores. En algunas realizaciones, el método también comprende ligar adaptadores a los ácidos nucleicos de la biblioteca preparada.
En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en ADN, ADN genómico, ADNc, ARN y A d N tumoral circulante (ADNtc).
En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico de baja calidad comprende una muestra fijada. En algunos aspectos, la muestra fijada se fija con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en formalina, glutaraldehído, alcohol, ácido ósmico y paraformaldehído. En algunas realizaciones, la muestra está incluida en parafina. En algunos aspectos, la muestra es una muestra incluida en parafina y fijada con formalina seleccionada del grupo que consiste en un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia de núcleo y una biopsia con aguja.
En algunos aspectos, la muestra de ácido nucleico de baja calidad comprende ácidos nucleicos antiguos.
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad, que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra de ácidos nucleicos de baja calidad; (b) cizallar selectivamente la pluralidad de ácidos nucleicos, que comprende: (i) obtener una primera fracción que comprende los ácidos nucleicos más largos de la pluralidad de ácidos nucleicos, y una segunda fracción que comprende los ácidos nucleicos más cortos de la pluralidad de ácidos nucleicos, (ii) cizallar los ácidos nucleicos de la primera fracción y (iii) combinar la primera fracción y la segunda fracción; y (c) reparar los ácidos nucleicos de las fracciones combinadas, preparando así la biblioteca de ácidos nucleicos.
En algunos aspectos, la etapa (c) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una enzima seleccionada del grupo que consiste en uracilo N-glicosilasa (UNG), uracilo ADN glicosilasa (UDG), endonucleasa IV, endonucleasa VIII, formamidopirimidina-ADN glicosilasa (FPG) , ADN-(sitio apurínico o apirimidínico) liasa y Pol p.
En algunos aspectos, la etapa (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 100 pb se unen selectivamente a la matriz. En algunos aspectos, la etapa (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 550 pb se unen selectivamente a la matriz.
En algunos aspectos, la matriz comprende una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI). En algunos aspectos, la solución de perlas SPRI se selecciona del grupo que consta de AMPURE XP, SPRISELECT, AXYPREP MAG FRAGMENTSELECT y MAGJET Magnetic Beads.
En algunos aspectos, la cizalladura de los ácidos nucleicos comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste en sonicación, cizalladura acústica, nebulización, cizalladura con aguja y fragmentación enzimática.
En algunos aspectos, la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb. En algunos aspectos, la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 100 pb. En algunos aspectos, la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb. En algunos aspectos, la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 100 pb.
Algunos aspectos también incluyen la repetición de (i) y (ii).
Algunos aspectos también incluyen la etapa (d) retirar los ácidos nucleicos monocatenarios de las fracciones combinadas. Algunos aspectos también incluyen retirar la porción monocatenaria de un ácido nucleico que comprende una porción monocatenaria y una porción bicatenaria. En algunos aspectos, la etapa (d) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una exonucleasa monocatenaria. En algunos aspectos, la exonucleasa monocatenaria es una exonucleasa 5'-3'. En algunos aspectos, la exonucleasa monocatenaria se selecciona del grupo que consiste en RecJ, exonucleasa I, exonucleasa T, exonucleasa VII, exonucleasa VIII y exonucleasa de frijol mungo. En algunos
aspectos, se incluye una etapa opcional de detener la reacción de exonucleasa. Por ejemplo, se puede añadir EDTA a la mezcla de reacción para inactivar la exonucleasa.
Algunos aspectos también incluyen ligar adaptadores a los ácidos nucleicos de la biblioteca preparada.
En algunos aspectos, la pluralidad de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en ADN, ADN genómico, ADNc, ARN y ADN tumoral circulante (ADNtc).
En algunos aspectos, la muestra de ácido nucleico de baja calidad comprende una muestra fijada. En algunos aspectos, la muestra fijada se fija con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en formalina, glutaraldehído, alcohol, ácido ósmico y paraformaldehído. En algunos aspectos, la muestra está incluida en parafina. En algunos aspectos, la muestra es una muestra incluida en parafina y fijada con formalina seleccionada del grupo que consiste en un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia de núcleo y una biopsia con aguja.
En algunos aspectos, la muestra de ácido nucleico de baja calidad comprende ácidos nucleicos antiguos.
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra de ácidos nucleicos de baja calidad; (b) retirar los ácidos nucleicos monocatenarios de la pluralidad de ácidos nucleicos; y (c) reparar los ácidos nucleicos de la pluralidad de ácidos nucleicos, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos.
En algunos aspectos, la etapa (b) se realiza antes de la etapa (c).
En algunos aspectos, la etapa (c) se realiza antes de la etapa (b).
En algunos aspectos, la etapa (b) comprende retirar la porción monocatenaria de un ácido nucleico que comprende una porción monocatenaria y una porción bicatenaria. En algunos aspectos, la etapa (b) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una exonucleasa monocatenaria. En algunos aspectos, la exonucleasa monocatenaria es una exonucleasa 5'-3'. En algunos aspectos, la exonucleasa monocatenaria se selecciona del grupo que consiste en RecJ, exonucleasa I, exonucleasa T, exonucleasa VII, exonucleasa VIII y exonucleasa de frijol mungo. En algunos aspectos, se incluye una etapa opcional de detener la reacción de exonucleasa. Por ejemplo, se puede añadir EDTA a la mezcla de reacción para inactivar la exonucleasa.
En algunos aspectos, la etapa (c) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una enzima seleccionada del grupo que consiste en uracilo N-glicosilasa (UNG), uracilo ADN glicosilasa (UDG), endonucleasa IV, endonucleasa VIII, formamidopirimidina-ADN glicosilasa (FPG) , ADN-(sitio apurínico o apirimidínico) liasa y Pol p.
En algunos aspectos, la etapa (a) comprende además cizallar la pluralidad de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, la cizalladura comprende cizallar selectivamente la pluralidad de ácidos nucleicos, que comprende: (i) obtener una primera fracción que comprende ácidos nucleicos más largos de la pluralidad de ácidos nucleicos, y una segunda fracción que comprende ácidos nucleicos más cortos de la pluralidad de ácidos nucleicos, (ii) cizallar los ácidos nucleicos de la primera fracción y (iii) combinar la primera fracción y la segunda fracción, preparando así la biblioteca de ácidos nucleicos.
En algunos aspectos, la etapa (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 100 pb se unen selectivamente a la matriz. En algunos aspectos, la etapa (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 550 pb se unen selectivamente a la matriz.
En algunos aspectos, la matriz comprende una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI). En algunas realizaciones, la solución de perlas SPRI se selecciona del grupo que consiste en AMPURE XP, SPRISELECT, AXYPREP MAG FRAGMENTSELECT y MAGJET Magnetic Beads.
En algunos aspectos, la cizalladura de la pluralidad de ácidos nucleicos comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste en sonicación, cizalladura acústica, nebulización, cizalladura con aguja y fragmentación enzimática.
En algunos aspectos, la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb. En algunos aspectos, la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 100 pb. En algunos aspectos, la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb. En algunos aspectos, la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 100 pb.
Algunos métodos también incluyen repetir (i) y (ii).
Algunos métodos también incluyen la ligación de adaptadores a los ácidos nucleicos de la biblioteca preparada.
En algunos aspectos, la pluralidad de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en ADN, ADN genómico, ADNc, ARN y ADN tumoral circulante (ADNtc).
En algunos aspectos, la muestra de ácido nucleico de baja calidad comprende una muestra fijada. En algunos aspectos, la muestra fijada se fija con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en formalina, glutaraldehído, alcohol, ácido ósmico y paraformaldehído. En algunos aspectos, la muestra está incluida en parafina. En algunos aspectos, la muestra es una muestra incluida en parafina fijada con formalina seleccionada del grupo que consiste en un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia de núcleo y una biopsia con aguja.
También se proporciona en este documento un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad que comprende ADN monocatenario, comprendiendo el método: (a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra de ácidos nucleicos de baja calidad, comprendiendo los ácidos nucleicos ADN monocatenario; (b) hibridar cebadores aleatorios con el ADN monocatenario y extender los cebadores para formar ADN bicatenario; y (c) tratar el ADN bicatenario para retirar los salientes monocatenarios para formar ADN de extremos romos, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos. Cebadores aleatorios En algunos aspectos, la etapa (c) comprende tratar el ADN bicatenario con una ADN polimerasa para generar fragmentos de ADN de extremos romos. En algunos aspectos, la etapa (c) comprende tratar fragmentos de ADN bicatenario con una polinucleótido quinasa para generar fragmentos con fosfatos 5' para permitir la ligación de adaptadores. En algunos aspectos, el método puede comprender además una etapa de reparación del ADN que comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una enzima seleccionada del grupo que consiste en uracilo N-glicosilasa (UNG), uracilo ADN glicosilasa (UDG), endonucleasa IV, endonucleasa VIII, formamidopirimidina- ADN glicosilasa (FPG), ADN-(sitio apurínico o apirimidínico) liasa y Pol p. En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza antes de la etapa (b). En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza después de la etapa (b). En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza antes de la etapa (c). En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza después de la etapa (c).
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen una biblioteca de ácidos nucleicos preparada mediante el método de uno cualquiera de los métodos anteriores.
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen un método para secuenciar un ácido nucleico, que comprende: obtener una biblioteca de ácidos nucleicos preparada según cualquiera de los métodos anteriores; y secuenciar al menos una parte de la biblioteca de ácidos nucleicos, secuenciando así el ácido nucleico.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un gráfico que muestra la distribución del tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos para muestras de ADN cizallado acústicamente, ADN no fragmentado extraído de una línea celular recién congelada, ADN FFPE altamente degradado y ADN relativamente intacto, extraídas a partir de diferentes muestras de tejido FFPE.
La FIG. 2 describe un mecanismo por el cual las especies monocatenarias pueden introducir artefactos en una biblioteca de ácidos nucleicos. Durante la construcción de la biblioteca, cada uno de los ADN monocatenarios puede formar un bucle que puede repararse en los extremos con la ADN polimerasa de T4 durante la construcción de la biblioteca, los adaptadores ejemplificados como Lectura1 y Lectura2 pueden ligarse a los extremos de cada estructura en bucle. Las lecturas posteriores de bibliotecas con tales estructuras en bucle tienen tasas elevadas de emparejamientos incorrectos y tasas de alineamiento porcentuales más bajas.
La FIG. 3 representa un ejemplo de flujo de trabajo para la cizalladura selectiva de ácidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra biológica FFPE de la que se separan inicialmente los fragmentos de ADN más pequeños (<550 bp), y se cortan los fragmentos de ADN más grandes (> 550 bp) para obtener una población con el tamaño deseado.
La FIG. 4 representa un ejemplo de un flujo de trabajo extendido para cizallar selectivamente ácidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra biológica FFPE.
La FIG. 5 es un gráfico que representa los niveles estimados de diversidad de ácidos nucleicos en diversas muestras de ácidos nucleicos preparadas en condiciones de cizalladura TRUSEQ o en condiciones de cizalladura selectiva. La diversidad de ácidos nucleicos se puede estimar a partir del número de fragmentos de ADN únicos que se calcula que estarán presentes dentro de la muestra a partir de la información de la secuencia.
La FIG. 6 muestra las tasas porcentuales de emparejamientos incorrectos (eje y; 0% -20%) con el aumento del número de ciclos de secuenciación (eje x; 0-200 ciclos) obtenidos a partir de la secuenciación de una biblioteca de ADN derivada de FFPE antes (panel izquierdo) y después (panel derecha) del tratamiento del ADN con una exonucleasa monocatenaria
La FIG. 7 muestra una serie de gráficos para el número de llamadas de bases particulares en ciertos loci en una secuencia de ácido nucleico en la que el ácido nucleico molde FFPE o no se ha reparado (panel A), o se ha reparado con la mezcla de reparación PreCR (panel B), o se ha reparado con una mezcla de escisión de uracilo-ADN (UDEM) (panel C). En cada panel, cada columna representa los siguientes cambios de base/tipos de mutación: (columna más a la izquierda) A>C; A>G; A>T; C>A; C>G; C>T; G>A; G>C; G>T; T>A; T>C; y T>G (columna más a la derecha). El panel A muestra una mayor incidencia de bases incorrectamente asignadas a ciertos loci; Los paneles B y C ilustran la disminución de la incidencia de bases incorrectamente asignadas en ciertos loci en la muestra de ADN FFPE reparada. PreCR mejora las transiciones C-T/G-A, y UDEM las mejora aún más.
La FIG. 8 describe un mecanismo por el cual las especies monocatenarias pueden introducir pares quiméricos que dan como resultado emparejamientos incorrectos durante la secuenciación de extremos emparejados.
FIG. 9 muestra una serie de gráficos que representan los resultados de un análisis comparativo de varios flujos de trabajo y que demuestran que realizar la reparación del ADN y la eliminación del ADNmc produce mejoras significativas en las siguientes métricas: % de pares quiméricos, % de tasa de errores y % de alineamientos.
Descripción detallada
La invención se refiere a un método para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos a partir de ácidos nucleicos obtenidos a partir de muestras de ácidos nucleicos de baja calidad, tales como muestras fijadass y muestras antiguas.
Los ácidos nucleicos en muestras fijadas pueden fragmentarse mucho y modificarse químicamente debido a los métodos de fijación e inclusión utilizados. Tal fragmentación y modificación puede aumentar con el tiempo. Por tanto, los ácidos nucleicos aislados de muestras fijadas suelen tener un peso molecular más bajo que los obtenidos a partir de muestras frescas o congeladas. Las muestras de ácido nucleico fijadas, como el ADN f Fp E, a menudo se degradan y son un sustrato pobre para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos para el análisis de secuencias. La FIG. 1 muestra un ejemplo de distribución de tamaños de fragmentos de ácidos nucleicos para ADN cortado acústicamente, ADN genómico sin tratar extraído de una línea celular recién congelada y ADN sin tratar de dos muestras de tejido FFPE diferentes en las que las muestras respectivas están muy fragmentadas o relativamente intactas. La fragmentación de algo de ADN FFPE da como resultado la pérdida de una proporción sustancial del material cuando se preparan bibliotecas utilizando métodos conocidos. Esta pérdida da como resultado bibliotecas con baja diversidad o complejidad (definida como el número de fragmentos de ADN únicos en la muestra), que no son adecuadas para su uso en aplicaciones como la secuenciación profunda de genomas complejos.
Además, el ADN FFPE puede incluir niveles significativos de especies monocatenarias que surgen tanto de los duros métodos de extracción empleados como del hecho de que el ADN está fragmentado en dúplex cortos que pueden ser térmicamente inestables. Dichas especies monocatenarias también pueden ser problemáticas en los métodos de preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en los métodos que incluyen reparación de extremos y ligación bicatenaria, los adaptadores pueden ligarse en extremos bicatenarios de moléculas de ADN monocatenarias parcialmente autocomplementarias. La FIG. 2 muestra un ejemplo en el que dos ADN monocatenarios forman cada uno un bucle que puede repararse en los extremos, y adaptadores designados como Lectura 1 y Lectura 2 ligados al bucle. Tales estructuras en bucle pueden conducir a lecturas de artefactos con mayores tasas de emparejamientos incorrectos y menor porcentaje de alineamientos. El ADN FFPE también puede contener niveles más altos de bases modificadas, por ejemplo, sustituciones de C a T y G a A que pueden conducir a falsas asignaciones de variantes y niveles reducidos de alineamientos entre una serie de ácidos nucleicos secuenciados, y también hacen que el ADN no sea amplificable por ciertas ADN polimerasas.
Al igual que las muestras de ácido nucleico fijadas, las muestras nucleicas antiguas pueden ser de baja calidad. Las muestras antiguas pueden incluir poblaciones de ácidos nucleicos con una fracción significativa de ácidos nucleicos más cortos y una fracción significativa de especies monocatenarias. Además, los ácidos nucleicos antiguos pueden contener una gran cantidad de mutaciones que aumentan con el tiempo, como sustituciones a partir de la desaminación de restos.
Algunas variantes de los métodos y composiciones proporcionados en este documento se enriquecen en ácidos nucleicos útiles para la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos. Algunas de estas variantes incluyen la cizalladura selectiva de ácidos nucleicos obtenidos a partir de muestras de ácidos nucleicos de baja calidad, tal como una muestra fijada, tal como una muestra FFPE. La cizalladura selectivo incluye aislar el ácido nucleico más corto de una muestra antes de la cizalladura deliberada de los ácidos nucleicos más largos que quedan en la muestra. En tales métodos, los ácidos nucleicos más cortos no se pierden si se cortan a un tamaño que no es útil para la preparación de bibliotecas. A continuación, tanto los ácidos nucleicos más cortos como los ácidos nucleicos cortados se pueden volver a combinar para producir una muestra que contiene un rendimiento sustancialmente mayor de fragmentos del tamaño deseado. La FIG. 3 representa un ejemplo de flujo de trabajo para la cizalladura selectiva de ácidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra biológica FFPE de la que se eliminan inicialmente los fragmentos de ADN más pequeños (<550 bp) y se cortan los fragmentos de ADN más grandes (> 550 bp) para obtener una población con el tamaño deseado. Ventajosamente, la cizalladura selectiva aumenta la diversidad de especies de ácidos nucleicos en una biblioteca de ácidos nucleicos preparada. Los ácidos nucleicos más cortos se capturan antes de cortar fragmentos de ácido nucleico más largos en una muestra de ácidos nucleicos. Los fragmentos más cortos capturados se vuelven a combinar luego con los ácidos nucleicos cizallados. La cizalladura selectiva mejora la diversidad de la biblioteca y puede permitir un aumento de al menos treinta veces en el número de construcciones del genoma a partir de una biblioteca de ácidos nucleicos preparada. La FIG. 4 representa un ejemplo de flujo de trabajo extendido de cizalladura selectiva de ácidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra biológica FPE. FIG. 5 es un gráfico que representa el número de fragmentos de ADN únicos (diversidad) en varias muestras de ácidos nucleicos preparados en condiciones de cizalladura TRUSEQ o condiciones de cizalladura selectiva. Las muestras de ácidos nucleicos obtenidas a partir de muestras FFPE y preparadas adicionalmente utilizando ciertos protocolos patentados se sometieron a condiciones de cizalladura TRUSEQ o condiciones de cizalladura selectiva. Las poblaciones de ácidos nucleicos que se sometieron a condiciones de cizalladura selectiva incluyeron aquellas con una diversidad suficiente para construcciones
genómicas a partir de una biblioteca de ácidos nucleicos preparada. En algunas variantes, la cizalladura se realiza en una muestra que incluye fragmentos de ADN tanto más pequeños como más grandes. Se contempla que la cizalladura de la muestra puede ayudar a revertir la reticulación de los fragmentos de ADN en una muestra FFPE.
Además de la cizalladura selectiva, algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento para enriquecer ácidos nucleicos útiles para la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos incluyen separar las especies monocatenarias de ácidos nucleicos y los salientes 5' de ácidos nucleicos de las muestras de ácidos nucleicos de baja calidad, tales como como una muestra fijada, tal como una muestra FFPE. Por ejemplo, la separación de ADN monocatenario y especies colgantes 5' formadas del ADN monocatenario autocomplementario mediante el tratamiento con exonucleasa puede mejorar el porcentaje de una población de ácidos nucleicos en una biblioteca de ácidos nucleicos preparada para ser alineada, mejorar la diversidad de la biblioteca preparada y reducir los artefactos de emparejamientos de lectura. La FIG. 6 representa gráficos del nivel antes del tratamiento de ADN FFPE con una exonucleasa de cadena única (panel izquierdo) y después del tratamiento de ADN FFPE con una exonucleasa de cadena única (panel derecho).
Además dela cizalladura selectiva, algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento para enriquecer ácidos nucleicos útiles para la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos incluyen la reparación de ácidos nucleicos de muestras de ácidos nucleicos de baja calidad, tal como una muestra fijada, tal como una muestra FFPE. La FIG. 7 es una serie de gráficos que muestran los niveles de bases particulares en un locus derivado de la secuenciación de varios ácidos nucleicos, donde el panel A muestra una mayor incidencia de emparejamientos incorrectos de bases en una muestra de ADN FFPE, y en donde los paneles B y C representan una disminución de la incidencia de emparejamientos incorrectos de bases en el locus en la muestra de ADN FFPE reparada. Por ejemplo, durante el procesamiento de muestras FFPE, el ADN puede dañarse, lo que da como resultado un emparejamiento de bases incorrecto durante la secuenciación. Durante la experimentación se determinó que, además de la cizalladura selectiva, el tratamiento de la muestra con un cóctel de enzimas, por ejemplo, la mezcla PRECR (NEB) y/o UDEM (Epicenter) podría ayudar a corregir el ADN dañado para una secuenciación más precisa.
Como se usa en este documento, "ácido nucleico" puede referirse a un polímero que comprende ribonucleósidos y/o desoxirribonucleósidos que están unidos covalentemente, típicamente por enlaces fosfodiéster entre subunidades, pero en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen ADN genómico; ADN circular; ADN de bajo peso molecular, ADN plasmídico; ADN circulante, ADN tumoral circulante (ADNtc); ARNhn ARNm; ARN no codificante que incluye ARNr, ARNt, microARN, ARN interferente pequeño, ARN nucleolar pequeño, ARN nuclear pequeño y ARN temporal pequeño; ácidos nucleicos fragmentados o degradados; ANP; ácido nucleico obtenido de orgánulos subcelulares como mitocondrias o cloroplastos; y ácido nucleico obtenido de microorganismos, parásitos o virus de ADN o ARN que pueden estar presentes en una muestra biológica. También se contemplan secuencias sintéticas de ácido nucleico que pueden incluir o no análogos de nucleótidos que se añaden o "enriquecen" en una muestra biológica.
Muestras
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen la preparación de bibliotecas a partir de ácidos nucleicos obtenidos a partir de muestras. Como se usa en este documento, "muestra" incluye una variedad de fuentes y composiciones que contienen ácidos nucleicos. La muestra puede ser una muestra biológica, pero el término también incluye otras, p. ej. muestras artificiales que comprenden ácidos nucleicos tales como productos de PCR o composiciones que comprenden ácidos nucleicos ya purificados que pueden concentrarse y/o purificarse adicionalmente. Las muestras biológicas incluyen partículas virales, células, tejidos, órganos y cualquier parte de un organismo. Los ejemplos de muestras incluyen muestras fijadas. Las muestras fijadas incluyen muestras que han sido tratadas con compuestos o agentes de fijación/reticulación. Ejemplos de agentes y compuestos de fijación/reticulación incluyen formalina, glutaraldehído, alcohol, ácido ósmico y paraformaldehído, y fuentes de radiación, tales como exposición a un haz de electrones, radiación gamma y luz ultravioleta. Las muestras se pueden tratar además incrustando la muestra en una cera, como cera de parafina. Las muestras pueden incluir un aspirado con aguja fina, una biopsia de núcleo y una biopsia con aguja. Las muestras preferidas incluyen muestras fijadas, como muestras FFPE y muestras antiguas. Las muestras antiguas pueden incluir ácidos nucleicos de muestras antiguas, incluidos los ácidos nucleicos recuperados de muestras biológicas que no se han conservado específicamente para análisis de ADN posteriores. Ejemplos de ácidos nucleicos antiguos incluyen ácidos nucleicos recuperados de material arqueológico, material esquelético histórico, tejidos momificados, colecciones de archivo de muestras médicas no congeladas, restos de plantas conservados, núcleos de hielo y permafrost, plancton del Holoceno, sedimentos marinos y lacustres. Los ácidos nucleicos antiguos incluyen ácidos nucleicos de una muestra que tiene al menos aproximadamente 1 año, 5 años, 10 años, 20 años, 50 años, 100 años, 500 años, 1000 años y un rango entre dos cualesquiera de las edades anteriores.
En algunas realizaciones, una muestra incluye ácidos nucleicos de baja calidad. Los ácidos nucleicos de baja calidad incluyen una población de ácidos nucleicos que es un sustrato potencialmente pobre para los métodos típicos de preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos. Los ejemplos de sustratos pobres para la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos incluyen poblaciones de ácidos nucleicos en las que una fracción sustancial de la población es monocatenaria, está mellada, mutada y/o fragmentada. Una fracción sustancial puede incluir al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 95%, y un intervalo entre dos cualesquiera de
los parámetros anteriores. Ventajosamente, los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen la preparación de poblaciones de ácidos nucleicos de baja calidad para la preparación adicional de bibliotecas de ácidos nucleicos. Además, las muestras de ácidos nucleicos de baja calidad, como el ADN FFPE o el ADN antiguo, a menudo tienen cantidades limitadas de material, lo que limita la cantidad y la calidad de las bibliotecas de secuenciación. Los métodos presentados en este documento son sorprendentemente eficaces para generar bibliotecas de secuenciación a partir de bajas cantidades de material de entrada. Por ejemplo, en algunos aspectos, el material de entrada comprende no más de 100 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng, 2 ng, 1 ng o no más de 0,5 ng de ácido nucleico de entrada.
En algunos aspectos, las muestras incluyen materiales obtenidos a partir de entornos clínicos o forenses que contienen ácidos nucleicos. Preferiblemente, la muestra es una muestra biológica obtenida a partir de un ser humano, animal, vegetal, bacteria u hongo. Preferiblemente, la muestra se selecciona del grupo que consiste en células, tejido, bacterias, virus y fluidos corporales como, por ejemplo, sangre, productos sanguíneos como capa leucocitaria, plasma y suero, orina, licor, esputo, heces, LCR y esperma, hisopos epiteliales, biopsias, muestras de médula ósea y muestras de tejido, preferiblemente muestras de tejido de órganos tales como pulmón, riñón o hígado. Además, el experto en la materia apreciará que los lisados, extractos o materiales procesados o porciones obtenidas a partir de cualquiera de las muestras ilustrativas anteriores también están dentro del alcance del término "muestra". Esto en particular incluye, pero no se limita a, lisados de muestra, lisados aclarados, porciones de muestra preextraídas que están p. ej. enriquecidas en un cierto tipo de ácido nucleico diana como p. ej. el caso durante una extracción con fenol/cloroformo en lal que los ácidos nucleicos tales como el ARN se concentran en la fase acuosa, ácidos nucleicos purificados que se supone que se purifican y/o concentran adicionalmente y similares.
Método de preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen la preparación de bibliotecas a partir de ácidos nucleicos obtenidos a partir de muestras que comprenden ácidos nucleicos de baja calidad, tales como muestras fijadas. Algunas de tales realizaciones incluyen la obtención de una muestra de ácido nucleico a partir de una muestra fijada. Los métodos para obtener ácidos nucleicos a partir de una muestra fijada son bien conocidos en la técnica. En algunos aspectos, una muestra, tal como una muestra incluida en parafina, puede someterse a desparafinización. La desparafinización retira la mayor parte de la parafina de una muestra incluida en parafina. En algunos aspectos, una muestra se lava con un disolvente orgánico para disolver la parafina. Dichos disolventes pueden retirar la parafina de forma eficaz de una muestra sin afectar negativamente al aislamiento del ácido nucleico. Los disolventes adecuados se pueden elegir entre disolventes tales como benceno, tolueno, etilbenceno, xilenos y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos se pueden recuperar adicionalmente usando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos y composiciones descritos en este documento no se limitan al método en el que los ácidos nucleicos se extraen de muestras fijadas.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento, los ácidos nucleicos se cortan. Los métodos para cortar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen sonicación, nebulización, cizalladura mecánica tal como la cizalladura con agujas, y digestión enzimática limitada. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos se cizallan para proporcionar una población de ácidos nucleicos con una longitud promedio de menos de aproximadamente 5000 pb, 1000 pb, 900 pb, 800 pb, 700 pb, 600 pb, 550 pb, 500 pb, 450 pb, 400 pb, 350 pb, 300 pb, 250 pb, 200 pb, 150 pb, 100 pb, 50 pb, 25 pb y 10 pb, y un intervalo entre dos cualesquiera de los parámetros anteriores.
En algunos aspectos, la cizalladura de los ácidos nucleicos comprende la cizalladura selectiva de los ácidos nucleicos. Ventajosamente, la cizalladura selectiva retiene ácidos nucleicos más cortos que pueden descartarse en otros métodos de preparación. La cizalladura selectiva se puede realizar en ácidos nucleicos de baja calidad que incluyen una porción significativa de ácidos nucleicos más cortos que normalmente se descartarían en otros métodos de preparación. La cizalladura selectiva de ácidos nucleicos incluye fraccionar y/o enriquecer una población de ácidos nucleicos para obtener una porción que comprende ácidos nucleicos más cortos y una porción que comprende ácidos nucleicos más largos. En algunos aspectos, la porción que comprende ácidos nucleicos más cortos puede incluir ácidos nucleicos con una longitud menor que aproximadamente 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 550 bp, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 pb, 250 pb, 200 pb, 150 pb, 100 pb, 50 pb, 25 pb y 10 pb, y un intervalo entre dos cualesquiera de los parámetros anteriores. En algunos aspectos, la porción que comprende ácidos nucleicos más cortos puede incluir ácidos nucleicos con una longitud promedio menor que aproximadamente 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 550 bp, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp , 300 pb, 250 pb, 200 pb, 150 pb, 100 pb, 50 pb, 25 pb y 10 pb y un intervalo entre dos cualesquiera de los parámetros anteriores. En algunos aspectos, la porción que comprende ácidos nucleicos más largos puede incluir ácidos nucleicos con una longitud mayor que aproximadamente 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 550 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 pb, 1 kb y 5 kb, y un intervalo entre dos de los parámetros anteriores. En algunos aspectos, la porción que comprende ácidos nucleicos más cortos puede incluir ácidos nucleicos con una longitud promedio superior a aproximadamente 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 550 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb , 1000 pb, 1 kb y 5 kb, y un intervalo entre dos de los parámetros anteriores. Los métodos para fraccionar y/o enriquecer ácidos nucleicos por longitud de los ácidos nucleicos incluyen, entre otros, electroforesis en gel, técnicas cromatográficas y el uso de una matriz para unir selectivamente ácidos nucleicos, como perlas para la inmovilización reversible en fase sólida (SPRI), por ejemplo una solución de perlas SPRI. Véase, por ejemplo, DeAngelis M.M. et al. (1995) N.A. Res. 25: 4742-3. Ejemplos de perlas SPRI incluyen
AMPURE XP (Beckman), SPRISELECT (Beckman Coulter), AXYPREP MAG FRAGMENTSELECT (Aygen Biosciences) y Perlas Magnéticas MAGJET (Thermo Scientific).
En algunos aspectos, las etapas de fraccionar y/o enriquecer una población de ácidos nucleicos por longitud y cizallar una porción de los ácidos nucleicos fraccionados/enriquecidos que comprende ácidos nucleicos más largos pueden repetirse dos veces o más. En algunos aspectos, las porciones de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos más cortos y los ácidos nucleicos cizallados (por ejemplo, resultantes de la cizalladura de ácidos nucleicos más largos) se combinan para proporcionar un sustrato para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento, las especies de ácidos nucleicos monocatenarios se eliminan de una población de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, los salientes monocatenarios u otras porciones monocatenarias de ácidos nucleicos que comprenden una porción monocatenaria se eliminan de una población de ácidos nucleicos. Los métodos para eliminar especies monocatenarias y/o cadenas monocatenarias de una población de ácidos nucleicos incluyen, entre otros, el uso de enzimas específicas, como exonucleasas monocatenarias, RecJ, exonucleasa I y exonucleasa T, exonucleasa VIII, exonucleasa VII, nucleasa de frijol mungo; e hibridación selectiva de especies monocatenarias. En algunos aspectos, se incluye una etapa opcional que consiste en detener la reacción de exonucleasa. Por ejemplo, se puede añadir EDTA a la mezcla de reacción para inactivar la exonucleasa.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento, se reparan los ácidos nucleicos de una población de ácidos nucleicos para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las mellas se pueden rellenar y reparar; los salientes se pueden copiar para formar segmentos de doble hebra de un ácido nucleico. Los métodos para reparar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, como se ejemplifica en la divulgación de WO 2007/120627. En algunos aspectos, la reparación de ácidos nucleicos puede incluir la escisión de bases modificadas o dañadas, la eliminación de sitios abásicos, el relleno de mellas, ligación de mellas, ligación, eliminación de grupos bloqueadores 3' y reversión de enlaces cruzados tales como los dímeros de pirimidina.
En algunos aspectos, la reparación de ácidos nucleicos puede incluir poner en contacto los ácidos nucleicos con una ADN glicosilasa. Las ADN glicosilasas son una familia de enzimas involucradas en la reparación de bases por escisión, mediante las cuales las bases dañadas en el ADN se eliminan y reemplazan. En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico pueden tratarse con una uracilo ADN glicosilasa dando como resultado una pluralidad de restos abásicos en lugar de restos de uracilo. Los expertos en la técnica apreciarán que se puede usar cualquier ADN glicosilasa adecuada, incluidas, pero sin limitarse a, uracil ADN glicosilasas, para convertir los restos uracilo en restos abásicos. Por ejemplo, se puede usar UNG (uracilo-ADN glicosilasa humana), o sus ortólogos en organismos distintos de los seres humanos. Otras enzimas de escisión de polinucleótidos adecuadas adecuadas para su uso en los métodos de reparación de ácidos nucleicos establecidos en este documento pueden incluir, por ejemplo, los siguientes tipos de enzimas obtenidas a partir de, pero sin limitarse a, cualquier organismo o virus en particular: 1) endonucleasas AP, como endonucleasa IV de E. coli, Tth endonucleasa IV y endonucleasa AP humana; 2) glicosilasas, tales como UDG, 3-metiladenina ADN glicosilasa de E. coli (AlkA) y Aag humana; 3) glicosilasa/liasas, tales como endonucleasa III de E. coli, endonucleasa VIII de E. coli, Fpg de E. coli, OGG1 humana y PDG de T4; y 4) liasas. En ciertos aspectos típicos, se pueden utilizar una o más de las siguientes ADN glicosilasas, que incluyen uracil N-glicosilasa (UNG), uracil ADN glicosilasa (UDG) y formamidopirimidina-ADN glicosilasa (FPG). En algunos aspectos, la reparación de ácidos nucleicos puede incluir la eliminación de sitios abásicos. Un sitio abásico, también conocido como sitio AP (sitio apurínico/apirimidínico), es una ubicación en el ADN que no tiene ni una base de purina ni de pirimidina. Los sitios básicos pueden repararse poniendo en contacto un ácido nucleico con enzimas que incluyen, por ejemplo, una polimerasa, como una polimerasa de la familia X, como Pol p, que se requiere para la reparación por escisión de la base de parche corto, una vía de reparación del ADN que es esencial para reparar bases alquiladas u oxidadas, así como sitios abásicos (Yamtich J, et al (2010). Biochim. Biophys. Acta 1804: 1136-50); una endonucleasas AP de Clase II tales como ADN-(sitio apurínico o apirimidínico) liasa codificada por el gen APEX1; y endonucleasa IV, que es un tipo de desoxirribonucleasa.
En algunos aspectos proporcionados en el presente documento, se corta una población de ácidos nucleicos de una muestra fijada, se eliminan las especies monocatenarias y los salientes de la población de ácidos nucleicos y se reparan los ácidos nucleicos. En algunos aspectos, la cizalladura es una cizalladura selectiva. En algunos aspectos, una población de ácidos nucleicos de una muestra fijada se puede procesar realizando dos o más de cizalladura selectiva, eliminación de especies monocatenarias, eliminación del saliente de ácido nucleico y reparación de ácido nucleico antes de la preparación de la biblioteca. Algunos de estos aspectos pueden proporcionar un sustrato para la preparación adicional de bibliotecas de ácidos nucleicos. Los métodos para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen la ligación de adaptadores a los ácidos nucleicos en una población de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, los fragmentos de ácidos nucleicos puede hacerse que tengan extremos romos, fosforilarse, acoplarse a colas A y/o acoplarse a adaptadores para producir una biblioteca de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, la biblioteca de ácidos nucleicos puede amplificarse aún más. Ejemplos de protocolos de preparación de bibliotecas incluyen, entre otros, métodos para el kit de preparación de muestras de ADN Nextera ™ (Epicentre® Biotechnologies, Madison WI), el kit de preparación de bibliotecas de GL FLX Titanium(454 Life Sciences, Branford CT) y similares. La muestra, como se describe en el presente documento, puede amplificarse adicionalmente para secuenciación o ensayos de micromatrices mediante, por ejemplo, técnicas de amplificación por desplazamiento de soporte múltiple (MDA). Para la secuenciación después de MDA, una biblioteca de muestras
amplificada se prepara, por ejemplo, creando una biblioteca de ADN como se describe en el kit Mate Pair Library Prep, los kits de preparación de muestras de ADN genómico o los kits de preparación de muestras o enriquecimiento de exomas TruSeq ™ (Illumina®, Inc., San Diego CA). Otro método útil para amplificar ácidos nucleicos es la amplificación de círculo rodante (RCA), por ejemplo, como se describe en Lizardi y col., Nat. Gineta. 19: 225-232 (1998) y US 2007/0099208. Los métodos de PCR en emulsión también son métodos ilustrativos útiles que se describen en Dressman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 100: 8817-8822 (2003), WO 05/010145, o las Publicaciones de Patentes de e E. UU. Nos. 2005/0130173 o 2005/0064460. Los métodos de la presente divulgación no están limitados por ningún método de amplificación o preparación de biblioteca particular.
En un aspecto ilustrativo para la preparación de bibliotecas a partir de ADN FFPE, el método puede comprender los siguientes pasos. Primero, el ADN se corta de forma no selectiva. La cizalladura puede utilizar condiciones de cizalladura menos agresivas o más agresivas, según la calidad de la muestra y las aplicaciones posteriores. A continuación, se realiza la reparación del ADN, que comprende (i) la escisión de uracilo usando una mezcla de escisión de ADN de uracilo (UDEM) y (ii) la eliminación del ADN monocatenario usando una exonucleasa como RecJ. La escisión de uracilo y la eliminación del ADNmc pueden ocurrir en cualquier orden. A continuación, se realiza la reparación de los extremos para generar fragmentos de extremos romos para la ligación. La reacción de reparación de los extremos se puede realizar, por ejemplo, utilizando una ADN polimerasa, tal como, por ejemplo, utilizando la ADN polimerasa de T4. La reacción de reparación de los extremos también puede comprender además una polinucleótido quinasa, tal como, por ejemplo, polinucleótido quinasa T4. En algunos aspectos, las reacciones de la polimerasa y de la quinasa se combinan y la mezcla de reacción contiene dNTP y ATP. A continuación, se puede realizar la selección de tamaños. En algunos aspectos, se utiliza una relación de perlas a ADN de 1,2 a 1, pero se puede variar según la calidad de la muestra y las aplicaciones posteriores. El método puede comprender además una etapa de formación de una cola de A, seguida de la ligación de adaptadores que tienen un saliente en T 3 '. Se puede realizar una etapa de limpieza opcional para separar los dímeros del adaptador y los fragmentos no ligados. Los fragmentos de ADN ligados pueden enriquecerse opcionalmente mediante PCR para amplificar fragmentos con adaptadores en ambos extremos. Este ejemplo es solo una de las diversas formas de realizar los métodos descritos en este documento.
Preparación de ADNmc
También se proporcionan en este documento métodos para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad que comprende ADN monocatenario. El ADN monocatenario suele estar presente como resultado de los métodos asociados con la conservación de muestras FFPE y la extracción de ácidos nucleicos de muestras FFPE. En algunos aspectos, uno o más cebadores se hibridan con el ADN monocatenario y los cebadores se extienden usando una polimerasa para formar ADN bicatenario. Los cebadores pueden ser, por ejemplo, de una o más secuencias conocidas. En algunos aspectos, los cebadores son cebadores aleatorios. Cualquier número de composiciones de cebadores aleatorios y métodos de uso de los mismos que se conocen en la técnica pueden usarse en los métodos presentados en este documento, como se ejemplifica mediante los métodos y composiciones descritos en WO 2014/018093. El término "aleatorio", tal como se utiliza en la presente descripción con respecto a cebadores, oligonucleótidos, polinucleótidos y similares, debe entenderse que se refiere a la degeneración en una o más posiciones de un nucleótido. Por tanto, en ciertos aspectos, el término aleatorio puede referirse a una distribución puramente aleatoria en todas las posiciones, donde es igualmente probable que cada posición sea cualquiera de los cuatro nucleótidos estándar. En ciertos aspectos, el término aleatorio puede referirse a una distribución aleatoria en menos de todas las posiciones de nucleótidos en el polinucleótido. En algunos aspectos, el término aleatorio puede referirse a una distribución aleatoria ponderada en una o más posiciones, o todas las posiciones de un polinucleótido, donde la degeneración no se distribuye por igual entre los cuatro nucleótidos estándar en cada posición definida como aleatoria. En algunos aspectos, el término aleatorio puede referirse a una distribución sesgada de los cuatro nucleótidos estándar en una o más posiciones. También se puede entender que los polinucleótidos aleatorios incluyen uno o más análogos de bases como parte de los nucleótidos disponibles para distribución en una o más posiciones. Por tanto, en algunos aspectos, la pluralidad de cebadores aleatorios puede ser completamente aleatoria en cada posición del cebador. En algunos aspectos, la secuencia aleatoria de un cebador aleatorio puede incluir posiciones intercaladas que tienen un nucleótido fijo o regiones que tienen una secuencia fija de dos o más nucleótidos, si se desea.
En ciertos aspectos, se puede seleccionar la composición de bases general de la mezcla de cebadores, por ejemplo, para optimizar la amplificación a través de los ácidos nucleicos de la muestra. En algunos aspectos, la mezcla de cebadores comprende una mezcla equilibrada que tiene aproximadamente un 50% de distribución de AT/GC. En otros aspectos, la mezcla de cebadores comprende una mezcla rica en AT. Se puede usar cualquier número de mezclas de cebadores, o combinaciones de las mismas, en los métodos proporcionados en este documento, y la composición de las mezclas de cebadores equilibradas y ricas en AT se describe con más detalle en los materiales de WO 2014/018093.
En ciertos aspectos, la longitud de los cebadores en la mezcla de cebadores puede seleccionarse para optimizar la amplificación a través de los ácidos nucleicos de la muestra. En algunos otros aspectos, el conjunto de cebadores de amplificación aleatorios tienen aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21., 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o más de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, o una combinación de los mismos. Se apreciará que la longitud exacta, la composición de cada base en una mezcla de n-meros se puede ajustar según sea necesario para generar un nivel deseado de uniformidad de amplificación a través de una diana de ácido nucleico tal
como el ADN genómico, como se describe en los materiales de WO 2014/018093. Como ejemplo específico, el método puede utilizar una mezcla equilibrada (AT/GC) de cebadores aleatorios de 9 meros para la amplificación de ADNmc.
En ciertos aspectos, el ADN bicatenario se puede tratar adicionalmente para retirar los salientes de una sola hebra para formar ADN de extremos romos, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, el método puede comprender además una etapa de reparación del ADN que comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una enzima seleccionada del grupo que consiste en uracilo N-glicosilasa (UNG), uracilo ADN glicosilasa (UDG), endonucleasa IV, endonucleasa VIII, formamidopirimidina-ADN glicosilasa (FPG), ADN-(sitio apurínico o apirimidínico)liasa y Pol p. En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza antes que la etapa de extensión del cebador. En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza después de la etapa de extensión del cebador. En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza antes de retirar los salientes. En algunos aspectos, la etapa de reparación del ADN se realiza después de retirar los salientes.
Un ejemplo de tales métodos se expone con mayor detalle a continuación en el Ejemplo 2. En un aspecto ilustrativo para la preparación de bibliotecas a partir de ADNmc, el método puede comprender las siguientes etapas. Se realiza la reparación del ADN, que comprende la escisión de uracilo utilizando una mezcla de escisión de ADN de uracilo (UDEM). A continuación, todo el ADN se convierte en ADNmc por desnaturalización. Se añaden cebadores aleatorios y se realiza la reparación de los extremos para extender los cebadores y generar fragmentos de extremos romos para la ligación. La reacción de reparación del extremo se puede realizar, por ejemplo, utilizando una ADN polimerasa, tal como, por ejemplo, utilizando la ADN polimerasa de T4. La reacción de reparación de los extremos también puede comprender además una polinucleótido quinasa, tal como, por ejemplo, polinucleótido quinasa T4. En algunos aspectos, las reacciones de la polimerasa y quinasa se combinan y la mezcla de reacción contiene dNTP y ATP. A continuación, se puede realizar la selección de tamaño. En algunos aspectos, se utiliza una relación de perlas a ADN de 1,2 a 1, pero se puede variar según la calidad de la muestra y las aplicaciones posteriores. El método puede comprender además una etapa de formación de una cola de A, seguida de la ligación de adaptadores que tienen un saliente en T 3 '. Se puede realizar una etapa de limpieza opcional para retirar los dímeros del adaptador y los fragmentos no ligados. Los fragmentos de ADN ligados pueden enriquecerse opcionalmente mediante PCR para amplificar fragmentos con adaptadores en ambos extremos. Este ejemplo es solo una de las diversas formas de realizar los métodos descritos en este documento.
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos.
Algunos de los métodos y composiciones proporcionados en este documento incluyen secuenciar una biblioteca de ácidos nucleicos. En la técnica se conocen varias técnicas de secuenciación de ADN, incluidas las metodologías de secuenciación basadas en fluorescencia (véase, por ejemplo, Birren et al., Genome Analysis Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, Nueva York.). En algunos aspectos, se utilizan técnicas de secuenciación automatizada comprendidas en esa técnica. En algunos aspectos, se puede utilizar la secuenciación paralela de amplicones divididos (Publicación PCT núm. WO2006084132). En algunos aspectos, la secuenciación del ADN se logra mediante la extensión paralela de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. n° 5,750,341; patente de EE.UU. n° 6,306,597). Ejemplos adicionales de técnicas de secuenciación incluyen la tecnología Polony (contracción de Polymerase colony) de Church (Mitra et al., 2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65; Shendure et al., 2005 Science 309, 1728-1732; patente de EE.UU. n° 6,432,360, patente de EE.UU. n° 6,485,944, patente de EE.UU. n° 6,511,803), la tecnología de pirosecuenciación de 454 picotítulos (Margulies y col., 2005 Nature 437, 376-380; US 20050130173), la tecnología de adición de base única de Solexa (Bennett et al., 2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382; patente de EE.UU. n° 6,787,308; patente de EE.UU. n° 6,833,246), la tecnología de secuenciación de firmas masivamente paralelas Lynx (Brenner y col. (2000). Nat. Biotechnol. 18: 630-634; patente de EE.UU. n° 5,695,934; patente de EE.UU. n° 5,714,330) y la tecnología de colonias de PCR de Adessi (Adessi y col. (2000). Nucleic Acid Res. 28, E87; WO 00018957).
Los métodos de secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés) comparten la característica común de estrategias masivamente paralelas y de alto rendimiento, con el objetivo de reducir los costos en comparación con los métodos de secuenciación más antiguos (véase, por ejemplo, Voelkerding y col., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean y col., Nature Rev. Microbiol, 7-287-296.). Los métodos de NGS se pueden dividir en términos generales en los que normalmente utilizan amplificación de plantilla y los que no. Los métodos que requieren amplificación incluyen la pirosecuenciación comercializada por Roche como las plataformas de tecnología 454 (por ejemplo, GS 20 y GS FLX), la plataforma Solexa comercializada por Illumina y la plataforma de detección y ligación de oligonucleótidos compatibles (SOLiD) comercializada por Applied Biosystems. Los enfoques de no amplificación, también conocidos como secuenciación de una sola molécula, están ejemplificados por la plataforma HeliScope comercializada por Helicos Biosciences y las plataformas emergentes comercializadas por VisiGen, Oxford Nanopore Technologies Ltd., Life Technologies/Ion Torrent y Pacific Biosciences, respectivamente.
En la pirosecuenciación (patente de EE.UU. n° 6,210,891; patente de EE.UU. n° 6,258,568), el ADN molde se fragmenta, se repara en los extremos, se liga a adaptadores y se amplifica clonalmente in situ mediante la captura de moléculas de molde único con perlas que llevan oligonucleótidos complementarios a los adaptadores. Cada perla que lleva un solo tipo de molde se compartimenta en una microvesícula de agua en aceite, y el molde se amplifica clonalmente utilizando una técnica denominada PCR en emulsión. La emulsión se rompe después de la amplificación y las perlas se depositan en pocillos individuales de una placa de picotitulación que funciona como una celda de flujo durante las reacciones de secuenciación. La introducción ordenada e iterativa de cada uno de los cuatro reactivos
dNTP se produce en la celda de flujo en presencia de enzimas de secuenciación y un indicador luminiscente como la luciferasa. En el caso de que se añada un dNTP apropiado al extremo 3' del cebador de secuenciación, la producción resultante de ATP provoca un estallido de luminiscencia dentro del pocillo, que se registra usando una cámara CCD. Es posible lograr longitudes de lectura mayores o iguales a 400 bases, y se pueden lograr 106 lecturas de secuencia, lo que da como resultado hasta 500 millones de pares de bases (Mb) de secuencia.
En la plataforma Solexa/Illumina (Voelkerding y col., Clinical Chem., 55-641-658, 2009; MacLean y col., Nature Rev. Microbiol, 7 '287-296; patente de EE.UU. n° 6,833,246; patente de EE.UU. n° 7,115,400; patente de EE.UU. n° 6,969,488), los datos de secuenciación se producen en forma de lecturas de menor longitud. En este método, el ADN fragmentado monocatenario se repara en los extremos para generar extremos romos fosforilados en 5', seguido de la adición mediada por Klenow de una base A única al extremo 3' de los fragmentos. La adición de A facilita la adición de oligonucleótidos adaptadores de proyección en T, que se utilizan posteriormente para capturar las moléculas adaptadoras de molde en la superficie de una celda de flujo que está tachonada con anclajes de oligonucleótidos. El ancla se usa como cebador de PCR, pero debido a la longitud del molde y su proximidad a otros oligonucleótidos de ancla cercanos, la extensión por PCR da como resultado el "arqueamiento" de la molécula para hibridarse con un oligonucleótido de ancla adyacente para formar una estructura puente en la superficie de la celda de flujo. Estos bucles de ADN se desnaturalizan y escinden. A continuación, las cadenas directas se secuencian con terminadores de colorante reversibles. La secuencia de nucleótidos incorporados se determina mediante la detección de fluorescencia posterior a la incorporación, separándose cada fluoróforo y bloque antes del siguiente ciclo de adición de dNTP. La longitud de lectura de la secuencia varía de 36 nucleótidos a más de 50 nucleótidos, con una producción total que supera los mil millones de pares de nucleótidos por ejecución analítica.
La secuenciación de moléculas de ácidos nucleicos utilizando tecnología SOLiD (Voelkerding y col., Clinical Chem., 55 641-658, 2009; patente de EE.UU. n° 5,912,148; patente de EE.UU. n° 6,130,073) también implica la fragmentación del molde, la ligación a adaptadores de oligonucleótidos, la unión a perlas y la amplificación clonal mediante PCR en emulsión. A continuación, se inmovilizan perlas que llevan el molde sobre una superficie modificada de una celda de flujo de vidrio y se hibrida un cebador complementario al oligonucleótido adaptador. Sin embargo, en lugar de utilizar este cebador para la extensión 3', se utiliza para proporcionar un grupo fosfato 5' para la unión a sondas de interrogación que contienen dos bases específicas de sonda seguidas de 6 bases degeneradas y uno de cuatro marcadores fluorescentes. En el sistema SOLiD, las sondas de interrogación tienen 16 combinaciones posibles de las dos bases en el extremo 3' de cada sonda y una de cuatro fluoros en el extremo 5'. El color del flúor, y por lo tanto la identidad de cada sonda, corresponde a esquemas de codificación de espacio de color especificados. Múltiples rondas (generalmente 7) de hibridación de sondas, ligación y detección de flúor son seguidas por desnaturalización y después por una segunda ronda de secuenciación usando un cebador que está compensado por una base con respecto al cebador inicial. De esta manera, la secuencia del molde se puede reconstruir computacionalmente y las bases del molde se interrogan dos veces, lo que da como resultado una mayor precisión. La longitud de lectura de la secuencia tiene un promedio de 35 nucleótidos y la producción total supera los 4 mil millones de bases por ejecución de secuenciación. En ciertas realizaciones, se emplea la secuenciación de nanoporos (véase, por ejemplo, Astier y col., J. Am. Chem. Soc. 8 de febrero de 2006; 128 (5): 1705-10). La teoría detrás de la secuenciación de nanoporos tiene que ver con lo que ocurre cuando un nanoporo se sumerge en un fluido conductor y se aplica un potencial (voltaje) a través de él. En estas condiciones, se puede observar una ligera corriente eléctrica debida a la conducción de iones a través del nanoporo, y la cantidad de corriente es excesivamente sensible al tamaño del nanoporo. A medida que cada base de un ácido nucleico pasa a través del nanoporo, esto provoca un cambio en la magnitud de la corriente a través del nanoporo que es distinto para cada una de las cuatro bases, lo que permite determinar la secuencia de la molécula de ADN.
La tecnología Ion Torrent es un método de secuenciación del ADN basado en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN (véase, por ejemplo, Science 327 (5970): 1190 (2010); Solicitudes de patentes de EE.UU. núms. de publicación 20090026082, 20090127589, 20100301398, 20100197507, 20100188073, y 20100137143). Un micropocillo contiene una hebra de ADN molde que se va a secuenciar. Debajo de la capa de micropocillos hay un sensor de iones ISFET hipersensible. Todas las capas están contenidas dentro de un chip semiconductor CMOS, similar al que se usa en la industria electrónica. Cuando se incorpora un dNTP en la cadena complementaria en crecimiento, se libera un ión de hidrógeno, que activa un sensor de iones hipersensible. Si hay repeticiones de homopolímeros presentes en la secuencia de la plantilla, se incorporarán múltiples moléculas de dNTP en un solo ciclo. Esto conduce a un número correspondiente de hidrógenos liberados y una señal electrónica proporcionalmente más alta. Esta tecnología se diferencia de otras tecnologías de secuenciación en que no se utilizan nucleótidos u ópticos modificados. La precisión por base del secuenciador Ion Torrent es de aprox. 99,6% para 50 lecturas de base, con aprox. 100 Mb generados por ejecución. La longitud de lectura es de 100 pares de bases. La precisión para repeticiones de homopolímeros de 5 repeticiones de longitud es de aprox. 98%. Los beneficios de la secuenciación de semiconductores de iones son la rápida velocidad de secuenciación y los bajos costos iniciales y operativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de la biblioteca a partir de una muestra de ADN FFPE
La cantidad de ADN obtenido a partir de una muestra FFPE que se utiliza en la preparación de un ácido nucleico se puede ajustar de acuerdo con el nivel de degradación del ADN FFPE. Se puede utilizar cualquier método conocido para determinar el nivel de degradación, tal como el uso de un bioanalizador Agilent 2100 o qPCR. El nivel de fragmentación
se utilizó para determinar si se requería una cizalladura selectiva. La cizalladura selectiva se realizó en muestras de ADN de baja calidad para evitar que los fragmentos más cortos se hicieran aún más cortos después de la cizalladura. Las muestras que contenían niveles más bajos de fragmentación se cortaron sin retirar los fragmentos más cortos.
Cizalladura selectiva
La cizalladura selectiva se realizó en muestras de ADN de baja calidad para evitar que los fragmentos más cortos se hicieran aún más cortos después dla cizalladura. Las cadenas de ADN más grandes en la muestra FFPE se fragmentaron mediante cizalladura selectiva. Dependiendo del nivel de degradación del ADN FFPE, se añadieron de 100 ng a aproximadamente 1 pg de ADN FFPE al tampón de resuspensión (RSB; TruSeq DNA Sample Prep Kit, Illumina, Inc.) hasta un volumen total de 12,5 pl. Se preparó una mezcla de perlas diluyendo perlas AMPURE XP 1:1 (v/v) en agua y se añadieron 20 pl de la mezcla de perlas al ADN FFPE. A continuación, la muestra se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se capturaron magnéticamente y se retiraron y almacenaron para uso posterior 30 pl del sobrenadante (S1) que contenía fragmentos de ADN más cortos no unidos (<550 pb). Las perlas capturadas, que contenían fragmentos >550 pb, se resuspendieron en 50 pl de RSB, se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y las perlas se capturaron magnéticamente. El sobrenadante (S2) se transfirió a un tubo de sonicación COVARIS y la cizalladura se realizó usando configuraciones optimizadas para fragmentar el ADN con un tamaño medio de inserto de 350 pb, con 45 segundos en el ciclo de trabajo: 10%; intensidad 5; ráfagas/segundo: 200; y frecuencia de modo: barrido. Esta configuración varía según la plataforma Covaris utilizada. Las condiciones de cizalladura se optimizaron en el Covaris S2 que parecen dañar menos el ADN durante el proceso de fragmentación: duración 110 segundos, ciclo de trabajo: 5%; intensidad 5; ráfaga/segundo: 200 y frecuencia de modo: barrido. La muestra cortada (S2; 50 pl) se combinó con el sobrenadante S1 (30 pl) para las etapas posteriores.
El sobrenadante combinado se añadió a 118 pl de perlas para capturar todos los fragmentos de ADN en las perlas. Después, la solución se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y las perlas se capturaron magnéticamente. El sobrenadante se separó y descartó, las perlas se lavaron con 200 pl de etanol al 80%, se incubaron y se lavaron repetidamente descartando todos los sobrenadantes de lavado. Las perlas se secaron a temperatura ambiente, se resuspendieron, se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente, se aclararon magnéticamente y el sobrenadante se transfirió al tubo de muestra final o al pocillo de la placa, que contenía fragmentos de ADN de la muestra original de FFPE con la distribución de tamaño de fragmento deseada. En lo anterior, la proporción de perlas: ADN se puede optimizar para obtener diferentes tamaños de inserto dependiendo de la aplicación.
Reparación de ADN opcional
Tras la cizalladura selectiva del ADN de la muestra de FFPE, se reparó el ADN. El ADN se reparó utilizando una mezcla de reparación PreCR (NEB), que incluye un cóctel de enzimas para reparar el ADN mellado dañado antes de los procesos de amplificación. La solución se mezcló bien, se selló con un sello adhesivo Microseal "B" y se incubó a 37°C durante 20 minutos. Se añadieron perlas AMPURE XP a los pocillos en una proporción de perlas:ADN de 1,6:1 (v: v), se mezclaron y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, las perlas se capturaron magnéticamente hasta que el líquido se volvió transparente. El sobrenadante se descartó y las perlas se lavaron dos veces con etanol al 80%. Las perlas se secaron, luego se resuspendieron en 42 pl de RSB y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante que contenía 40 pl de ADN reparado se recuperó para las etapas posteriores. El ADN cortado y reparado se puede almacenar a -20°C durante un máximo de 7 días antes de continuar con el protocolo de la biblioteca.
Un método alternativo de reparación de ADN incluyó el uso de la mezcla de escisión Uracil-DNA (UDEM) de Epicentre, que contenía dos enzimas, HK™-UNG (uracilo N-glicosilasa destruible por calor [UNG]) y endonucleasa IV con o sin FPG. HK-UNG escinde la base uracilo de un desoxinucleótido de uracilo en cualquier a Dn , creando un sitio abásico en el lugar de incorporación de dUTP. La endonucleasa IV luego escinde el enlace fosfodiéster en este sitio abásico generando una serie de fragmentos de digestión. La Fpg (formamidopirimidina [fapy] -DNA glicosilasa) (también conocida como 8-oxoguanina ADN glicosilasa) actúa como N-glicosilasa y AP-liasa. La actividad N-glicosilasa libera purinas dañadas del ADN bicatenario, generando un sitio apurínico (sitio AP). La actividad de AP-liasa escinde tanto en 3' como en 5' en el sitio AP eliminando así el sitio AP y dejando un espacio de 1 base. La reparación del ADN usando UDEM se realizó de acuerdo con la descripción dada en el Ejemplo 2 a continuación.
Un método alternativo de reparación del ADN incluyó el uso de un tratamiento USER con o sin FPG. USER Enzyme (New England Biolabs) incluye una mezcla de uracilo ADN glicosilasa (UDG) y endonucleasa VIII. UDG cataliza la escisión de una base uracilo, formando un sitio abásico (apirimidínico) mientras deja intacta la estructura del fosfodiéster. La actividad de la endonucleasa VIII rompe el esqueleto del fosfodiéster en los lados 3' y 5' del sitio abásico de modo que se libera desoxirribosa libre de bases. FPG (formamidopirimidina [fapy]-ADN glicosilasa) (también conocida como 8-oxoguanina ADN glicosilasa) (Epicentre) actúa como N-glicosilasa y como AP-liasa. La actividad N-glicosilasa libera purinas dañadas del ADN bicatenario, generando un sitio apurínico (sitio AP). La actividad de AP-liasa escinde tanto en 3' como en 5' en el sitio AP eliminando así el sitio AP y dejando un espacio de 1 base. A 70 pl de ADN cortado selectivamente, se añadieron 10 pl de tampón de reacción ThermoPol® (10X) (NEB), 10 pl de USER (1 U/pl) y 10 pl de FPG (8 U/pl). La solución se mezcló bien, se selló con un sello adhesivo Microseal "B" y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Se añadieron perlas AMPURE XP a los pocillos en una proporción de perlas:ADN de 1,6:1 (v:v), se mezclaron y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las perlas se capturaron
magnéticamente hasta que el líquido se volvió transparente. El sobrenadante se descartó y las perlas se lavaron dos veces con etanol al 80%. Las perlas se secaron, luego se resuspendieron en 42 gl de RSB y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se recupera el sobrenadante que contiene 40 gl de ADN reparado para las etapas siguientes. El ADN cortado y reparado se puede almacenar a -20 ° C durante un máximo de 7 días antes de continuar con el protocolo de la biblioteca.
Tratamiento con exonucleasa Rec 1
Después de la cizalladura de la muestra de FFPE, y antes o después de la etapa opcional de reparación del ADN, se realizó la separación de ADNmc y de los salientes de ADNmc, usando tratamiento con exonucleasa RecJ. A 40 gl de la muestra de ADN, se añadieron 5 gl de tampón de reacción de exonucleasa RecJ 10 X y 5 gl de exonucleasa RecJ (10 U/gl) y la muestra se incubó a 37°C durante 30 minutos seguido de la adición de 5 gl de EDTA (0,5 M) para inactivar la exonucleasa RecJ. Se agregaron perlas AMPURE XP a la solución en una proporción 1,6:1 (v:v) perlas: ADN, se mezclaron e incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de la captura de perlas hasta que la solución se aclarara. Se eliminó el sobrenadante, se desechó y las perlas se lavaron dos veces con etanol al 80%. Las perlas se secaron, se resuspendieron en 62,5 gl de RSB, se mezclaron y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente, se capturaron hasta que el sobrenadante fue transparente y el sobrenadante se transfirió a un nuevo pocillo de tubo/placa. La muestra puede almacenarse entre -15°C y -25°C antes de continuar con la preparación de la biblioteca.
Reparación de los extremos y selección de tamaño
La reparación de los extremos del ADNmc fragmentado se realizó añadiendo 40 gl de tampón End Repair Mix al sobrenadante de la muestra tratada con Rec J capturada (60 gl). La solución se mezcló y se incubó a 30°C durante 30 minutos. Se seleccionó un protocolo para la selección del tamaño de acuerdo con la calidad de la muestra FFPE. Para una muestra de FFPE de alta calidad, se realizó una selección de tamaño doble para alcanzar el tamaño medio del inserto de 350 pb (Véase p.ej.., Guía de preparación de muestras de ADN TruSeq Nano, Illumina, San Diego). Para retirar los fragmentos más grandes, se preparó una mezcla de perlas diluidas mezclando 95 gl de perlas con 65 gl de agua de calidad para PCR por muestra. Se añadieron ciento sesenta microlitros de perlas AMPURE XP diluidas a 100 gl de muestra reparada en el extremo. Después de mezclar, la solución se incubó durante 5 minutos de incubación a temperatura ambiente. La solución se aclaró magnéticamente y el sobrenadante que contenía fragmentos <550 pb se transfirió (no se descartó) a un nuevo pocillo de tubo/placa. Para retirar los pequeños fragmentos de ADN (<120 pb), se añadieron 30 gl de perlas sin diluir a los 250 gl de sobrenadante. La solución se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se aclaró magnéticamente. Este sobrenadante se descartó y las perlas se enjuagaron dos veces con etanol al 80% y luego se secaron. El sedimento de perlas secas se resuspendió en 20 gl de RSB, las perlas se capturaron magnéticamente y el sobrenadante (17,5 gl) se transfirió a un nuevo pozo de tubo/placa Eppendorf de 0,3 ml. Una vez reparados los extremos del ADNmc fragmentado, se adenilan. La muestra puede almacenarse entre -15°C y -25°C antes de continuar con la preparación de la biblioteca.
Adenilación y ligación del adaptador
Una vez que se repararon los extremos del ADN dañado, se adenilaron y se ligaron con el adaptador para el posterior procesamiento de la biblioteca. A los 17,5 gl de fragmentos de ADN con sus extremos reparados, se les añadió 12,5 gl de mezcla de cola de A (véase, por ejemplo, Guía de preparación de muestras de ADN TruSeq Nano, Illumina, San Diego). La muestra se mezcló y se incubó a 37°C durante 30 minutos seguido de una inactivación por calor a 70°C durante 5 minutos y se enfrió a 4°C durante 5 minutos. A la reacción de adenilación, se añadieron 2,5 gl de RSB, 2,5 gl de mezcla de ligasa y 2,5 gl de adaptadores. La mezcla de ligación se incubó a 30°C durante 10 minutos y la reacción se detuvo mediante la adición de 5 gl de tampón de parada de ligación. Se añadieron perlas AMPURE XP a los fragmentos de ADN ligados en una relación 1:1 (v:v), seguido de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las perlas se capturaron magnéticamente, se lavaron dos veces con etanol al 80% y se secaron como se describió anteriormente. Las perlas secas se resuspendieron en 52,5 gl de RSB, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 minutos y se capturaron magnéticamente con transferencia de sobrenadante a un nuevo pozo de tubo/placa Eppendorf de 1,7 ml. Se llevó a cabo otra ronda de captura de perlas AMPURE XP con una proporción de 1:1 (v:v), sin embargo, se agregaron 27,5 gl de RSB a las perlas secas, las perlas se capturaron magnéticamente y se transfirieron 25 gl de sobrenadante transparente a una placa de pocillos para PCR. Después de la ligación del adaptador, el ADN ligado al adaptador se cuantificó mediante qPCR. Se pueden usar cebadores específicos para los adaptadores ligados en una reacción de PCR si se desea amplificación.
Ejemplo 2: preparación de ADNmc por extensión de cebadores aleatorios y reparación de extremos
Este ejemplo ilustra la preparación de un sustrato para la secuenciación de ácidos nucleicos a partir de ácidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra FFPE. Primero, se cuantificó y cortó el ADN de una muestra FFPE. Brevemente, el ADN se cuantificó usando un sistema de cuantificación fluorométrica. Ejemplos de sistemas incluyen los sistemas Qubit, QuantiFlu- or y Picogreen. El ADN cuantificado se resuspendió a 10 ng/gl en 52,5 gl y luego se cortó en un tubo Covaris utilizando TruSeq Nano v2 en condiciones de corte de 350 pb con un protocolo de ciclo de trabajo (intensidad: 5,0%; 200 ráfagas/seg; duración: 110 seg; modo: barrido de frecuencia y temperatura: 7°C). El ADN cizallado se capturó transfiriendo una alícuota de 50 gl de la muestra cizallada a un pocillo de la placa de muestra,
añadiendo 80 gl de perlas AMPure XP (perlas SPB). El pocilio de la muestra se selló, se agitó a 1800 rpm durante 2 minutos, se incubó a temperatura ambiente durante 3 minutos y se centrifugó a 280 g durante 1 minuto. Las perlas se capturaron en un soporte magnético durante 5 minutos y se descartaron 125 gl de sobrenadante. Las perlas se lavaron dos veces en 200 gl de ETOH al 80% y se secaron al aire durante 5 minutos. El ADN capturado se eluyó de las perlas añadiendo 82,5 gl de RSB, sellando bien la muestra, agitando las perlas a 1800 rpm durante 2 minutos, incubando a temperatura ambiente durante 2 minutos, haciendo girar las perlas a 280 g durante 1 minuto y realizando una captura magnética de las perlas durante 5 minutos. Se transfirió una alícuota de 80 gl de la muestra de ADN eluida a un pocillo de placa de muestra limpio.
La reparación del ADN se realizó en el ADN cortado. Brevemente, se usó una mezcla de escisión Uracil DNA "UDEM" (Epicenter Technologies) para reparar el ADN cortado. Se preparó un volumen de reacción en el pocillo de muestra que incluía 10 gl de tampón de mezcla de escisión de uracilo 10X, 10 gl de UDEM y 80 gl de ADN cortado. El pocillo de la muestra se selló, se agitó a 1800 rpm durante 1 minuto, se centrifugó a 280 g durante 1 minuto, se incubó a 37°C durante 30 minutos y luego la reacción se detuvo añadiendo 5 gl de EDTA 0,5 M. Se añadió un volumen de 168 gl de SPB al volumen de reacción. Las perlas se lavaron y secaron al aire. Se añadió un volumen de 17,5 gl de RSB a las perlas, se agitó la muestra y se eluyó el ADN. Se transfirió una alícuota de 15 gl de muestra eluida con reparación de extremos a un nuevo pocillo de la placa de muestras.
Se amplió la muestra de ADN reparada. En resumen, un volumen de reacción inicial incluía 15 gl de muestra de ADN, 5 gl de aleatorizador de 9 meros equilibrado con Infinium 1 mM (N/P 11246567 Illumina, Inc.). El volumen de reacción se selló en el pocillo de la placa de muestra, se agitó a 1200 rpm durante 1 minuto y se centrifugó brevemente a 280 g, se incubó a 98°C durante 5 minutos y luego se enfrió en hielo durante 5 minutos. Al volumen de reacción inicial se le añadieron 20 gl de End Repair Mix y 10 gl de RSB. El volumen de reacción se selló en el pocillo de la placa de muestra, se centrifugó brevemente a 280 g y se incubó durante 30 minutos a 30°C.
El ADN extendido se seleccionó por tamaño. Al volumen de reacción, se le añadieron 50 gl de SPB. El volumen de reacción se selló en el pocillo de la placa de muestra, se agitó y se centrifugó. Se capturaron las perlas magnéticas, se descartaron 95 gl de sobrenadante y las perlas se lavaron dos veces y se secaron al aire durante 5 minutos. Después del secado al aire, se añadieron 20 gl de RSB y las perlas se agitaron, se incubaron durante 5 minutos y se capturaron durante 5 minutos en el soporte magnético. Se transfirió una alícuota de 17,5 gl de muestra eluida a un nuevo pocillo de la placa de muestras para la formación de la cola de A.
El ADN seleccionado por tamaño tenía cola de A. En resumen, se preparó un volumen de reacción de 17,5 gl de muestra, 12,5 gl de una mezcla de ligación y formación de colas, se selló el pocillo, se agitó, se centrifugó rápidamente y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Luego, la muestra se incubó a 70°C durante minutos y luego se colocó en hielo. A la muestra se le añadieron 2,5 gl de RSB, 2,5 gl de ligasa y 2,5 gl de adaptador, el pocillo se selló, se agitó, se centrifugó rápidamente y se incubó a 30°C durante diez minutos. Después de la incubación, se añadieron 5 gl de tampón de ligación de parada al volumen de reacción y el pocillo se selló, se agitó, se centrifugó rápidamente y luego se añadieron 42,5 gl de perlas de SPB al volumen de reacción. El volumen de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, se lavó dos veces y se secó al aire durante 5 minutos. Una vez seco, se añadieron 52,5 gl de RSB al volumen de reacción, se selló el pocillo, se agitó mientras se incubaba y se transfirieron 50 gl del volumen de reacción a un nuevo pocillo de placa de muestra. La muestra se capturó con perlas y se lavó, se añadieron 27,5 gl de RSB para eluir el ADN de las perlas y se transfirieron 25 gl de sobrenadante de la muestra a un pocillo en una placa de PCR.
El ADN seleccionado por tamaño se amplificó mediante PCR. Brevemente, el volumen de reacción incluyó: 25 gl de sobrenadante de muestra, 5 gl de mezcla de cóctel de cebadores de PCR, 20 gl de mezcla de PCR mejorada, hasta un volumen total de 50 gl. El volumen de reacción se agitó y el programa PCR TruSeq™ Nano se ejecutó durante 8 ciclos (95°C durante 3 minutos y el siguiente programa se realizó durante 8 ciclos: 98°C durante 20 segundos, 60°C durante 15 segundos, 72°C durante 30 segundos, 72°C durante 5 min, y mantener a 4°C hasta su posterior procesamiento o almacenar a -20°C). Después de la amplificación, la muestra se centrifugó y todo el contenido (50 gl) se transfirió a un pocillo en otra placa (por ejemplo, una placa MIDI). Se añadieron perlas de SPB (50 gl) a la muestra y el pocillo de la muestra se selló, se agitó y se centrifugó rápidamente, las perlas se capturaron y lavaron. Después de secar al aire la muestra, se añadieron 32,5 gl de RSB a la muestra para eluir el ADN y se transfirieron 30 gl de sobrenadante a un nuevo pocillo de la placa de muestras. El ADN de la biblioteca de muestras se cuantificó utilizando un sistema de cuantificación fluorométrica o mediante PCR cuantitativa. Después de la cuantificación, se secuenció la biblioteca.
Los resultados de la secuenciación con ácidos nucleicos preparados mediante el método anterior fueron comparables a los resultados obtenidos cuando se utilizó la preparación de muestra de ADNbc del Ejemplo 1.
Ejemplo 3-análisis comparativo
Este ejemplo describe una comparación de tres métodos de preparación de bibliotecas para determinar el efecto de incluir la reparación del ADN y la separación de ADNmc. Los métodos de extracción agresivos, como los que se utilizan para extraer ADN FFPE, pueden dar como resultado la presencia de ADNmc. La presencia de ADNmc hace que un fragmento sea inaccesible para la ligación del adaptador bicatenario. Además, el ADNmc puede hibridarse consigo mismo (véase Fig. 2) o con otro ADNmc de una ubicación genómica diferente, lo que da como resultado la formación de quimeras,
como se muestra en la Fig. 8. Los pares quiméricos se alinean dentro de una longitud de fragmento normal entre sí, lo que da como resultado un alineamiento incorrecto y provoca variantes de un solo nucleótido (SNV) falsos positivos.
Un ejemplo se ilustra en la Fig. 8. Una gran parte del genoma humano (aproximadamente el 6%) son elementos intercalados largos L1P (LINE), que son 97% idénticos. En un grupo fragmentado de ADNmc, pueden hibridarse elementos L1P similares de diferentes ubicaciones genómicas. Sin tratamiento con exonucleasa, tal como sin tratamiento con Rec J, se formará un fragmento de ADNbc quimérico durante la extensión de la reparación de los extremos. Sin embargo, con el tratamiento Rec J, el ADNmc se degrada produciendo fragmentos cortos de ADNbc. Durante el alineamiento después de la secuenciación de extremos emparejados, los fragmentos tratados con Rec J se alinean como lecturas superpuestas. Sin embargo, los fragmentos que no se tratan con Rec J se alinean entre ellos dentro de una longitud de fragmento normal.
Se comparó un método realizado de acuerdo con los métodos descritos en este documento (flujo de trabajo "A") con dos métodos de preparación de bibliotecas disponibles comercialmente: 1) kit de hiperpreparación KAPA (Kapa Biosystems, Inc.) y 2) kit de biblioteca de ADN Accel-NGS ™ 2S (Swift Biosciences, Inc.). Para cada flujo de trabajo, se utilizaron 500 ng de ADN de muestra de calidad media como entrada en los tres flujos de trabajo. Los flujos de trabajo de KAPA y Swift se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que no incluyen la reparación del ADN y la escisión del ADNmc como se establece en este documento. En contraste, con los flujos de trabajo de KAPA y Swift, el flujo de trabajo "A" comprende la reparación del ADN de UDEM seguida de la degradación del ADNmc de Rec J. Las etapas de reparación de UDEM y RecJ se realizaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Las bibliotecas preparadas por cada uno de los tres flujos de trabajo se secuenciaron luego en un instrumento Illumina HiSeq 2500 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos de secuenciación se analizaron para calcular el porcentaje de pares quiméricos, que es el porcentaje de pares alineados donde las lecturas se alinean con diferentes cromosomas. Los datos de secuenciación también se analizaron para calcular el porcentaje alineado, que es el porcentaje de lecturas que pasan el filtro que están alineadas. Los datos de secuenciación también se analizaron para calcular la tasa de error HiQ, que es el porcentaje de bases de alta calidad en lecturas con una puntuación de cartografiado alta que son diferentes de la referencia (este cálculo incluye inherentemente SNP, por lo que siempre es mayor que cero).
Como se muestra en la Fig.9, las bibliotecas preparadas con reparación de ADN (tratamiento UDEM) y escisión de ADNmc (tratamiento Rec J) dieron como resultado disminuciones significativas en % de pares quiméricos, % de tasas de error y un aumento significativo en el % de fragmentos alineados, en comparación con los otros dos flujos de trabajo.
El término "que comprende", como se usa en el presente documento, es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por" y es inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de método adicionales no citados.
Todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc. utilizados en la memoria deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en este documento son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretendan obtener. Como mínimo, cada parámetro numérico debe interpretarse a la luz del número de dígitos significativos y los métodos de redondeo ordinarios.
La descripción anterior da a conocer varios métodos y materiales de la presente invención. Esta invención es susceptible de modificaciones en los métodos y materiales, así como alteraciones en los métodos y equipos de fabricación. Tales modificaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de esta descripción o la práctica de la invención descrita en el presente documento. En consecuencia, no se pretende que esta invención se limite a las realizaciones específicas descritas en el presente documento.
Claims (15)
1. Un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra de ácidos nucleicos de baja calidad que comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra de ácidos nucleicos de baja calidad; y
(b) cizallar selectivamente la pluralidad de ácidos nucleicos, que comprende:
(i) obtener una primera fracción que comprende ácidos nucleicos más largos de la pluralidad de ácidos nucleicos, y una segunda fracción que comprende ácidos nucleicos más cortos de la pluralidad de ácidos nucleicos, (ii) cizallar los ácidos nucleicos de la primera fracción, y
(iii) combinar la primera fracción cizallada y la segunda fracción, preparando así la biblioteca de ácidos nucleicos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que (i) comprende poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos con una matriz en condiciones en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 100 pb se unen selectivamente a la matriz, preferiblemente en las que los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 550 pb se unen selectivamente a la matriz.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la matriz comprende una solución de perlas de inmovilización reversible en fase sólida, preferiblemente una solución de perlas magnéticas.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que la cizalladura de los ácidos nucleicos comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste en sonicación, cizalladura acústica, nebulización, cizalladura con aguja y fragmentación enzimática.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la segunda fracción comprende ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb, preferiblemente menos de aproximadamente 100 pb.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la segunda fracción consiste esencialmente en ácidos nucleicos de menos de aproximadamente 550 pb, preferiblemente menos de aproximadamente 100 pb.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además repetir (i) y (ii).
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además (c) retirar los ácidos nucleicos monocatenarios de las fracciones combinadas.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende además retirar la porción monocatenaria de un ácido nucleico que comprende una porción monocatenaria y una porción bicatenaria.
10. El método de la reivindicación 8 o 9, en el que (c) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una exonucleasa monocatenaria, preferiblemente la exonucleasa monocatenaria es (A) una exonucleasa 5'-3', o (B) seleccionada del grupo que consta de RecJ, exonucleasa I, exonucleasa T, exonucleasa VII, exonucleasa VIII y exonucleasa de frijol mungo.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además (d) reparar los ácidos nucleicos de las fracciones combinadas.
12. El método de la reivindicación 11, en el que (d) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos con una enzima seleccionada del grupo que consiste en uracil N-glicosilasa (UNG), uracil ADN glicosilasa (UDG), endonucleasa IV, endonucleasa VIII, formamidopirimidina-ADN glicosilasa (FPG), ADN-(sitio apurínico o apirimidínico) liasa y Pol p.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además ligar adaptadores a los ácidos nucleicos de la biblioteca preparada.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la pluralidad de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en ADN, ADN genómico, ADNc, ARN y ADN tumoral circulante (ADNtc).
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la muestra de ácido nucleico de baja calidad comprende una muestra seleccionada de una muestra fija, una muestra incluida en parafina y una muestra de ácido nucleico antigua.
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