ES2898655T3 - Métodos de reparación y regeneración de tejidos - Google Patents

Abstract

Un oligoelemento para su uso en un método para inducir la reparación tisular en un tejido cerebral de un individuo que tiene una lesión en el tejido cerebral, comprendiendo el método administrar directamente en el lugar de la lesión una cantidad eficaz del oligoelemento, en donde el oligoelemento es cobre.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de reparación y regeneración de tejidos

Campo técnico

La presente invención se refiere a oligoelementos tales como cobre para su uso en métodos de reparación y regeneración de tejidos mediante la administración del oligoelemento.

Antecedentes

La medicina regenerativa es un enfoque terapéutico importante que implica el proceso de crear tejidos vivos y funcionales para reparar o reemplazar la función de los tejido u órganos perdidos debido al envejecimiento, enfermedad, daños o defectos congénitos. El sistema biológico está equipado con un mecanismo de autorreparación que se materializa a través del sistema de señalización de lesiones tisulares para garantizar que se produzca el rescate cuando se produce una lesión en un órgano del cuerpo. Cuando un tejido se lesiona, hay diferentes tipos de señales, tales como la señalización de quimiocinas y citocinas que se inicia de manera instantánea desde el lugar de la lesión para comunicar la lesión con el mecanismo de reparación consiguiente del cuerpo. Esta comunicación está mediada por una serie de sistemas de transducción, tales como el sistema de transporte vascular. Una vez que el mecanismo de reparación detecta la señal de lesión, se movilizan los materiales de reparación que implican células madre, citocinas, factores de crecimiento y/o quimiocinas y, a continuación, se dirigen hasta el lugar de la lesión. Por lo tanto, los sistemas de transporte vascular y/o linfático en buen estado no solo garantizan la comunicación entre el lugar de la lesión y el mecanismo de reparación, sino que también sirven como conducto esencial para la administración de los materiales de reparación en el lugar de la lesión. La extensión de la lesión tisular y la cantidad de factores de migración liberados a la circulación actúan como orientadores para el transporte de materiales de reparación. Después de migrar al lugar de la lesión, las células madre o las células progenitoras se diferenciarán en células "diana". Múltiples reguladores, citocinas, factores de crecimiento y quimiocinas activadas por el mecanismo de reparación crean un ambiente amigable para facilitar la diferenciación celular, la regeneración de tejidos y la integración del tejido regenerado en el tejido existente. Por lo tanto, esta serie de transducciones de señales y de mecanismos de autorreparación, o autorrenovación como se denominan, son el "sistema de señalización de lesiones tisulares". Véase, por ejemplo, Kang et al., 2013, Regen Med Res, 1, 7. Este sistema requiere una red bien conectada y el daño a cualquiera de los procesos de generación de señales, transducción de señales, recepción de señales, reclutamiento de materiales de reparación, transporte dirigido a lesiones, migración, diferenciación y regeneración darían como resultado la supresión de la autorreparación del órgano lesionado. Véase, por ejemplo, Kang et al., 2013, Regen Med Res, 1, 7. Algunos órganos (tales como el hígado, hueso, músculo esquelético y páncreas) muestran una fuerte capacidad de autorregeneración cuando se lesionan. Sin embargo, durante el envejecimiento y en condiciones de lesiones crónicas, la capacidad de autorreparación disminuye debido a la disfunción del sistema de señalización de lesiones tisulares.

El infarto de miocardio (IM) es un tipo de cardiopatía isquémica (CI) que resulta de un desequilibrio entre el suministro y la demanda de oxígeno del miocardio debido a un suministro inadecuado de sangre. Las principales causas del IM son la aterosclerosis, la trombosis o la embolia en las arterias coronarias que conducen a poca perfusión en la región irrigada por el vaso culpable. Si persiste la alteración del flujo sanguíneo al corazón, las células del corazón en el territorio de la arteria coronaria ocluida mueren, la función cardíaca se ve alterada y en su lugar se forma una cicatriz de colágeno, lo que pone al paciente en riesgo de arritmias potencialmente mortales y puede dar como resultado la formación de un aneurisma ventricular que puede romperse con consecuencias catastróficas.

Durante la contracción del corazón, la bomba cardíaca consume una gran cantidad de energía generada por el metabolismo aerobio para mantener la circulación, y el riego sanguíneo suficiente a los tejidos cardíacos es esencial para mantener las funciones cardíacas. Véase, por ejemplo, Essop, 2007, J Physiol, 584, 715-726; Dyson et al., 2007, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 293, H526-533. La isquemia miocárdica es una de las principales causas de disfunción cardíaca. La influencia perjudicial de la rotura de una arteria coronaria local en el miocardio no es solo el inicio de la lesión por isquemia en el territorio de la arteria coronaria ocluida, sino también el bloqueo del camino de los materiales que migran a la zona de la isquemia para la autorrestauración que está motivada por el mecanismo consiguiente de reparación de tejidos del cuerpo humano. La solución para promover la recuperación del riego sanguíneo es fundamental en la regeneración del miocardio.

En condición de isquemia, la respuesta molecular inicial y primaria a la reducción del riego sanguíneo es la acumulación de factores inducibles por hipoxia. Los factores inducibles por hipoxia (HIF-1, HIF-2 y HIF-3) juegan un papel clave en la respuesta transcripcional a la hipoxia. Los HIF son heterodímeros, que comprenden una subunidad a dependiente de oxígeno única y una subunidad p común expresada de manera constitutiva. Hay tres HIF en seres humanos y mamíferos. La señalización hipóxica juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis del oxígeno y la supervivencia celular. Los factores de transcripción inducibles por hipoxia HIF-1 y HIF-2 son mediadores centrales de la respuesta celular a la hipoxia mediante la regulación de la expresión de genes que controlan la adaptación metabólica, la administración de oxígeno y la supervivencia en respuesta a la privación de oxígeno.

El factor de transcripción HIF-1 se compone de HIF-1a y HIF-1p o ARNT (translocador nuclear de hidrocarburos arilo). Véase, por ejemplo, Wang et al., 1995, PNAS, 92, 5510-5514. La acumulación de HIF-1a es una etapa limitante de la velocidad de activación de HIF-1; por lo tanto, la principal regulación de1 HIF-1a se encuentra en el nivel postraduccional. Véase, por ejemplo, Wang et al., 1993, PNAS, 90, 4304-4308; Huang et al., 1998, PNAS, 95, 7987­ 7992. El nivel de expresión del HlF-1a es indetectable en la mayoría de los tipos de células en condiciones normóxicas debido a su degradación por la vía ubiquitina-proteasoma. En este proceso, uno o ambos de los dos restos de prolina conservados (Pro402 y Pro564) en el HIF-1a son reconocidos por miembros de las proteínas que contienen el dominio de la prolil hidroxilasa (PHD), que catalizan la reacción de hidroxilación de prolina. Véase, por ejemplo, Huang et al., 1998, PNAS, 95, 7987-7992; Jaakkola et al., 2001, Science, 292, 468-472; Ivan et al., 2001, Science, 292, 464-468. El HIF-1a hidroxilado es reconocido por una proteína de von Hippel-Lindau (pVHL), que es un componente de un complejo de ubiquitina ligasa, que se dirige a la subunidad HIF-1a para la degradación mediante el proteasoma en el citosol. Véase, por ejemplo, Maxwell et al., 1999, Nature, 399, 271-275; Masson et al., 2001, EMBO J, 20, 5197-5206; Ohh et al., 2000, Nat Cell Biol, 2, 423-427; Tanimoto et al., 2000, EMBO J, 19, 4298-4309. En condiciones de hipoxia, el HIF-1a escapa de la vía de degradación, se acumula y se traslada al núcleo, donde se dimeriza con HIF-1p e interactúa con cofactores para ensamblar el complejo transcripcional HIF-1, que conduce a la regulación positiva de múltiples genes implicados en la respuesta a la lesión. Véase, por ejemplo, Shohet et al., 2007, J Mol Med (Berl), 85, 1309-1315; Kim et al., 2006, Cell Metab, 3, 177-185. Entre los genes regulados por e1HIF se encuentran los implicados en la vasculogénesis, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, del inglés "vascular endothelial growth factor"), el factor citoblástico (SCF, del inglés "stem cell factor"), el factor 1 procedente de células estromales (SDF-1, del inglés "stromal cell-derived factor-1"), el receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-1, del inglés "vascular endothelial growth factor receptor 1"), el factor de crecimiento placentario (PLGF, del inglés "placental growth factor"), la angiopoyetina 1 (ANGPT1) y la 2 (ANGPT2), y el factor de crecimiento B procedente de plaquetas (PDGFB, del inglés "platelet-derived growth factor B"). Véase, por ejemplo, Rey et al., 2010, Cardiovasc Res, 86, 236-242. En condiciones de isquemia aguda, la angiogénesis inducida por e1 HIF-1 mejora de manera significativa. La activación del HIF-1 tiene un papel importante en la angiogénesis y armoniza la adaptación del tejido isquémico a la condición de hipoxia. Véase, por ejemplo, Lee et al., 2000, N Engl J Med, 342, 626-633.

Sin embargo, en condición de isquémica crónica, el miocardio lesionado se caracteriza comúnmente por una disminución de la densidad capilar y una angiogénesis deprimida, en lugar de mejorada. La acción de defensa activada por el HIF-1a acumulado en el ataque de isquemia aguda no funciona, incluso los niveles de1HIF-1a aumentaron de manera persistente en muestras de miocardio isquémico de pacientes con miocardiopatía isquémica crónica. Sin embargo, la expresión del gen posterior, tal como VEGF, estaba deprimido. Véase, por ejemplo, Lee et al., 2000, N Engl J Med, 342, 626-33; Moslehi et al., 2010, Circulation, 122, 1004-1016.

Han et al. (Revista del American College of Cardiology Suplemento 66.16 (2015): C74) se refiere a una mejor recuperación después de un infarto isquémico de miocardio mediante la complementación con cobre.

Zheng et al., (The FASEB Journal suplemento 29.1 (2015): 670-3) se refiere a la recuperación de células madre mesenquimatosas que migran a la zona de infarto isquémico de miocardio de conejo mediante un tratamiento con microburbujas de Cu.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona un oligoelemento para su uso en un método para inducir la reparación de tejido en un tejido cerebral de un individuo que tiene una lesión en el tejido cerebral, comprendiendo el método administrar directamente en el lugar de la lesión una cantidad eficaz del oligoelemento, en donde el oligoelemento es cobre.

También se proporciona un oligoelemento de acuerdo con el uso de la presente invención, en donde se inducen al menos dos acontecimientos de reparación tisular.

Se proporciona además un oligoelemento de acuerdo con el uso de la presente invención, en donde la reparación tisular comprende inducir el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión cerebral.

En el presente documento se describe un método para inducir al menos dos acontecimientos de reparación de tejidos en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir la migración de células madre mesenquimatosas de la médula ósea al lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir la diferenciación de células madre en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración tisular. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende revertir el daño en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende restaurar y/o mejorar la señal de lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende transducir la señal y/o recibir la señal de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende restaurar y/o mejorar el reclutamiento de un material de reparación en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende restaurar y/o mejorar el transporte dirigido a la lesión y/o la migración de un material de reparación. El material de reparación puede comprender una célula tal como una célula madre, una citocina, un factor de crecimiento y/o una quimiocina. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende restaurar y/o mejorar la diferenciación de una célula madre o una célula progenitora y la regeneración del tejido en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido.

También se describe en el presente documento un método para inducir la migración de células madre (tales como células madre mesenquimatosas, por ejemplo, células madre mesenquimatosas de la médula ósea) a un lugar de lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido.

En el presente documento se describe además un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende: a) administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento y b) administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como células madre mesenquimatosas, tales como células madre mesenquimatosas de la médula ósea). En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido.

En el presente documento se describe además un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.

En algunas realizaciones de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en donde el individuo tiene una lesión tisular crónica. En algunas realizaciones, el individuo tiene al menos 60 años de edad. En algunas realizaciones, el individuo tiene deficiencia de células madre mesenquimatosas de la médula ósea.

En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (tal como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión.

En el presente documento se describe un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente al lugar de la lesión. También se describe en el presente documento un método para inducir el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el oligoelemento se administra mediante inyección y permanece concentrado en el lugar de la inyección tras la inyección (por ejemplo, inyección a través de un catéter). En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de un implante que contiene el oligoelemento (por ejemplo, un implante recubierto con el oligoelemento, por ejemplo, un implante seleccionado del grupo que consiste en una endoprótesis vascular, un lugar y una membrana).

En algunas realizaciones de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre. En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de un inductor de células madre.

En alguna realización de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el individuo tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido. En algunas realizaciones, el individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido es un individuo que tiene una lesión tisular crónica o una lesión tisular aguda. En algunas realizaciones, el individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido es una persona que tiene al menos 60 años de edad. En algunas realizaciones, la persona que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido es una persona que tiene deficiencia de células madre.

También se describen en el presente documento kits y artículos de fabricación útiles para los métodos descritos en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A a 1D muestran los resultados del tratamiento con Cu y MB del infarto de miocardio crónico en el modelo de conejo de Nueva Zelanda. La figura 1A muestra una disminución de la zona del infarto de miocardio. La figura 1B muestra una disminución de la zona del infarto de miocardio. La figura 1C muestra una mejor fracción de expulsión del ventrículo izquierdo. La figura 1D muestra un aumento de la densidad capilar en la zona del infarto. La figura 2 muestra que las BMSC migran a la mayor parte de la zona del infarto en la condición de infarto agudo de miocardio.

La figura 3 muestra las BMSC que migran en la zona del infarto, pero no en la zona no infartada.

La figura 4 muestra fuertes señales de migración de las BMSC en la zona del infarto agudo de miocardio.

La figura 5 no muestra ninguna señal de migración de las BMSC detectada en la condición de infarto de miocardio crónico.

La figura 6 muestra que sin infarto de miocardio, el tratamiento con Cu y MB por sí solo no puede movilizar la migración de las BMSC.

La figura 7 muestra la reaparición de señales de migración de las BMSC después del tratamiento con Cu y MB del infarto de miocardio crónico.

La figura 8 muestra la reaparición de la migración de las BMSC después del tratamiento con Cu y MB de un infarto de miocardio crónico.

La figura 9 muestra la cuantificación de las señales de migración del infarto agudo de miocardio, del infarto de miocardio crónico y de los grupos de infarto de miocardio crónico tratados con Cu y MB.

La figura 10 muestra una disminución significativa de las señales de migración de las BMSC después del tratamiento con AMD3100 dentro de un mes después del infarto agudo de miocardio.

La figura 11 no muestra ninguna señal de migración de las BMSC de las BMSC tratadas con AMD3100 en el infarto agudo de miocardio.

La figura 12 muestra la cuantificación de las señales de migración del infarto agudo de miocardio y las señales de migración de las BMSC tratadas con AMD3100 en el infarto agudo de miocardio.

La figura 13 no muestra ninguna señal de migración de las BMSC después de tratar las BMSC con AMD3100 en el grupo de infarto de miocardio crónico tratado con Cu y MB.

La figura 14 no muestra ninguna señal de migración de las BMSC después de tratar las BMSC con AMD3100 en un infarto agudo de miocardio, y ninguna señal de migración de las BMSC después de tratar las BMSC con AMD3100 en el grupo de infarto de miocardio crónico tratado con Cu y MB.

La figura 15 muestra la cuantificación de las señales de migración de las BMSC del infarto de miocardio crónico, del infarto de miocardio crónico tratado con Cu y MB y del grupo de infarto de miocardio crónico tratado con Cu y MB tratado con AMD3100.

La figura 16A muestra cambios detectados mediante ecocardiografía en la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB.

La figura 16B muestra cambios detectados mediante MRI en la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB.

La figura 17 muestra cambios detectados mediante ecocardiografía en el volumen telesistólico del ventrículo izquierdo de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB.

La figura 18A muestra el dP/dt máximo detectado mediante una medición hemodinámica cardíaca invasiva de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB. El aumento máximo de dP/dt refleja la mejora de la función sistólica cardíaca.

La figura 18B muestra el dP/dt mínimo detectado mediante una medición hemodinámica cardíaca invasiva de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB. El valor absoluto del aumento del dP/dt mínimo refleja la mejora de la función diastólica cardíaca.

La figura 19 muestra la presión de desarrollo del ventrículo izquierdo (LVDP, del inglés "left ventricular development pressure") detectada mediante una medición hemodinámica cardíaca invasiva de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB. El aumento de la LVDP refleja la mejora de la función sistólica cardíaca.

La figura 20 muestra los cambios detectados mediante MRI en el tamaño del infarto de macacos de la India después del tratamiento con Cu y MB

La figura 21 muestra la densidad capilar marcada con CD31 en el borde de la zona del infarto.

La figura 22 muestra la densidad capilar marcada con CD31 en la zona del infarto de macacos de la India.

La figura 23 muestra el marcaje con Ki67 de células proliferativas en la zona del infarto después del tratamiento de macacos de la India con terapia dirigida con microburbujas de albúmina y cobre mediante contraste por ultrasonidos.

La figura 24 muestra el aumento de los niveles de proteína HIF-1a en la zona del infarto, con tinción inmunohistoquímica que muestra la expresión de HIF-1a en el citoplasma y el núcleo de las células miocárdicas y en el citoplasma de las células endoteliales.

La figura 25 muestra la transferencia Western que muestra la expresión de la proteína HIF-1a en diferentes zonas cardíacas de diferentes grupos.

La figura 26 muestra la transferencia Western que muestra la expresión de la proteína HIF-1a en la zona del infarto en diferentes grupos.

La figura 27 muestra los resultados de una RT-PCR que muestra cambios en los niveles de ARNm del VEGF cardíaco en diferentes zonas cardíacas de diferentes grupos.

La figura 28 muestra los resultados de una RT-PCR que muestra cambios en los niveles de ARNm del VEGF cardíaco en la zona del infarto de diferentes grupos.

La figura 29 muestra los resultados de una RT-PCR que muestra cambios en los niveles de ARNm del VEGFR1 cardíaco en diferentes zonas cardíacas de diferentes grupos.

La figura 30 muestra los resultados de una RT-PCR que muestra cambios en los niveles de ARNm del VEGFR1 cardíaco en la zona del infarto de diferentes grupos.

La figura 31 muestra los resultados de una RT-PCR que muestra cambios en los niveles de ARNm de1HIF-1a cardíaco en diferentes zonas cardíacas de diferentes grupos.

La figura 32 muestra los resultados de una RT-PCR que muestra cambios en los niveles de ARNm de1HIF-1a cardíaco en la zona del infarto de diferentes grupos.

La figura 33 muestra el contenido de cobre en la zona remota sin infarto y en la zona del infarto en diferentes grupos tratados.

La figura 34 muestra un mecanismo de la pérdida de cobre que induce la disminución de la actividad de1HIF-1. La figura 35 muestra el análisis cuantitativo de la puntuación de la función nerviosa en ratas con isquemia cerebral, 14 días después del tratamiento con nanomateriales de cobre.

La figura 36 muestra la tinción con TTC que indica cambios en el tamaño del infarto cerebral (Figura 36A) y la comparación del tamaño del infarto cerebral en diferentes grupos (Figura 36B).

La figura 37 muestra la observación general de todo el cerebro y la atrofia cerebral (Figura 37A), y la comparación de la atrofia cerebral en ratas con isquemia cerebral de diferentes grupos a los 14 días después del tratamiento (Figura 37B).

La figura 38 muestra la tinción con hematoxilina y eosina en la zona normal, en el centro del infarto y en el borde de la zona infartada en el cerebro.

La figura 39 muestra la zona de detección de la angiogénesis, mostrando el recuadro la zona del borde de la isquemia.

La figura 40 muestra un análisis inmunohistoquímico que muestra células marcadas con CD31 en la zona del borde de la isquemia.

La figura 41 muestra el análisis cuantitativo de la puntuación de lesión de la función nerviosa en el infarto cerebral de macacos de la India, mostrando una mejora de la función nerviosa a los 7 días después del tratamiento en el grupo tratado con compuesto de cobre, en comparación con el grupo no tratado.

La figura 42 muestra los efectos de concentraciones variables de sulfuro de cobre en la angiogénesis de los anillos aórticos de rata aislados cultivados en EBM-2 con FBS al 1 %.

La figura 43 muestra el efecto del quelante de cobre TEPA en la promoción del cobre de la angiogénesis.

La figura 44 muestra el análisis de transferencia Western de los niveles de proteína VEGF en los anillos aórticos de rata aislados. La figura 44A muestra los efectos de concentraciones variables de cobre en los niveles de proteína VEGF. La figura 44B muestra el efecto de TEPA en los niveles de proteína VEGF.

La figura 45 muestra el efecto del anticuerpo anti-VEGF en la promoción del cobre de la angiogénesis.

La figura 46 muestra el efecto del anticuerpo anti-VEGF en los niveles de proteína VEGF en anillos aórticos de rata aislados.

La figura 47 muestra un aumento significativo de la concentración de cobre en sangre después de la inyección de microburbujas de cobre.

La figura 48 muestra un aumento significativo en la relación entre la concentración de cobre en el corazón y la concentración de cobre en la sangre en el grupo de tratamiento con microburbujas de cobre mediadas por ultrasonidos en comparación con el grupo tratado con microburbujas de cobre sin ultrasonidos.

Descripción detallada de la invención

Se mostró previamente que la actividad transcripcional del HIF-1 requiere la participación de oligoelementos de cobre. Véanse, por ejemplo, Jiang et al., 2007, J. Exp. Med., 04, 657-666; Feng et al., 2009, Mol Pharmacol, 75, 174-182; Qiu et al., J Pharmacol 2012, Exp Ther, 342, 561-567. La privación de cobre de las células redujo la unión de HIF-1a a la secuencia HRE de los genes diana y a P300, un componente del complejo transcripciona1HIF-1 y la expresión suprimida de VEGF y otros genes regulados por el HIF-1, aunque la producción y la estabilización de1HIF-la no se vieron afectadas. Es importante destacar que, la concentración de cobre fue menor en el corazón de las personas que murieron por una enfermedad cardíaca crónica. Se sabía que la movilización del cobre desde el miocardio se desencadenaba por la prolongación de la isquemia. Véase, por ejemplo, Chevion et al., PNAS, 90, 1102-1106. La pérdida de cobre se correlacionó bien con el grado de disfunción cardíaca.

Por lo tanto, se cree que la salida drástica de cobre miocárdico es la causa principal de la disminución de la actividad transcripcional acumulada del HIF-1a acompañada de isquemia miocárdica prolongada. Por consiguiente, incluso en la condición de elevación de los niveles de proteína HIF-1, la sobrerregulación de los genes controlados por e1HIF-1 no se produjo debido a la pérdida de cobre cardíaco. Por lo tanto, se espera que la administración de cobre al lugar de la lesión restablezca de manera eficaz la actividad de transcripción de1HIF-1 y, de hecho, invierta el infarto isquémico de miocardio. Los oligoelementos tales como el cobre, cuando se administran al lugar de la lesión de un tejido para activar la actividad de transcripción del HIF-1, serían particularmente eficaces para inducir la reparación tisular y la autorregeneración.

En el presente documento se describe un método para inducir al menos dos acontecimientos de reparación de tejidos en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. Esto se basa en la percepción de los inventores de que la administración de un oligoelemento tal como el cobre a un lugar de lesión tisular desencadena el mecanismo consiguiente de reparación tisular del cuerpo, compuesto por una serie de acontecimientos que conducen a la reparación tisular. Se cree que la administración local de cobre al lugar de la lesión a través de microburbujas induciría la migración (es decir, el retorno) de células madre mesenquimatosas de la médula ósea (BMSC, del inglés "bone marrow mesenchymal stem cells") al lugar de la lesión, incluso después de que el tejido del individuo haya perdido de otro modo la capacidad consiguiente de reclutar de manera espontánea células BMSC. La administración local de cobre al lugar de la lesión también desencadenaría una serie de otros acontecimientos que conducen a la reparación tisular, incluyendo, por ejemplo, inducir la diferenciación de células madre en el lugar de la lesión, inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración de tejidos, inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, revertir el daño en el lugar de la lesión y reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión. Se cree que el cobre y otros oligoelementos tienen un papel central en la reparación de tejidos, y la presente divulgación abre nuevas oportunidades terapéuticas para el tratamiento eficaz de enfermedades que implican daño tisular.

En el presente documento también se describen métodos para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. Esto se basa en la percepción del inventor de que los oligoelementos, tales como el cobre, cuando se administran directamente al lugar de la lesión de un tejido, son particularmente eficaces para inducir la reparación tisular. Por ejemplo, se cree que los oligoelementos presentes en el lugar de la lesión pueden atraer el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión, facilitando así la regeneración del entorno de los microvasos sanguíneos en el lugar de la lesión y, en consecuencia, la regeneración del tejido. Se cree además que el efecto del cobre (u otros oligoelementos) en la reparación de tejidos y la formación de vasos sanguíneos depende de una concentración específica de cobre (u otros oligoelementos) en el lugar de la lesión local. La administración directa de cobre (u otros oligoelementos) al lugar de la lesión puede proporcionar un mejor control de la concentración de cobre deseada en el lugar de la lesión local, permitiendo así una intervención y un tratamiento más precisos.

En el presente documento se describe además un método para inducir al menos dos acontecimientos de reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento.

En el presente documento se describe además un método para inducir la migración de una célula madre (tal como una célula madre mesenquimatosa (MSC, del inglés "mesenchymal stem cell"), por ejemplo, una célula mesenquimatosa de la médula ósea (BMSC) en un lugar de lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento.

En el presente documento se describe además un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento y una cantidad eficaz de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) o un inductor de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC).

En el presente documento se describe además un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento.

En el presente documento se describe además un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En el presente documento se describe además un método para inducir el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En el presente documento se describen además kits y artículos de fabricación útiles para los métodos descritos en el presente documento.

Se entiende que las realizaciones de la divulgación descrita en el presente documento incluyen realizaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en".

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, una descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

El término "aproximadamente X-Y" utilizado en el presente documento tiene el mismo significado que "aproximadamente X a aproximadamente Y".

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/uno/una", "o", y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

Como es evidente para un experto en la materia, un individuo evaluado, seleccionado y/o que recibe tratamiento es un individuo que necesita dichas actividades.

Métodos para inducir uno o más acontecimientos de reparación tisular

En el presente documento se describe un método para inducir al menos un (que incluye, por ejemplo, al menos cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6 o más) acontecimiento de reparación tisular en un individuo que tiene una lesión de tejido, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (tal como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

Un "individuo" descrito en el presente documento se refiere a un mamífero tal como ratones, ratas, conejos, gatos, perros, cerdos, vacas, bueyes, ovejas, cabras, caballos, monos y otros primates no humanos, y seres humanos, un vertebrado tal como un pez y un pájaro tal como un pollo. Los mamíferos pueden incluir animales de granja, animales para el deporte, roedores y mascotas. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.

En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir la migración de células madre al lugar de la lesión, incluidas, pero sin limitación, células madre mesenquimatosas (MSC), células madre mesenquimatosas de la médula ósea (BMSC), células madre multipotentes, células madre pluripotentes inducidas (iPS, del inglés "induced pluripotent stem") o diversas células madre procedentes de tejidos. La célula madre procedente de tejido puede ser una célula madre procedente de tejido adiposo, una célula madre procedente de tejido cardíaco o una célula madre procedente de tejido del cordón umbilical. En otras realizaciones, la célula madre divulgada en el presente documento es una célula madre adulta. La célula madre adulta puede ser una célula madre hematopoyética, una célula madre mamaria, una célula madre intestinal, una célula madre mesenquimatosa en la placenta, tejido adiposo, pulmón, médula ósea, sangre, gelatina de Wharton del cordón umbilical o dientes (tal como el nicho perivascular de la pulpa dental y el ligamento periodontal), una célula madre endotelial, una célula madre neural, una célula madre olfativa adulta, una célula madre de la cresta neural o una célula madre de la línea germinal (por ejemplo, una célula madre en el testículo).

En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir la diferenciación de células madre en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración tisular. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende revertir el daño en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

Un individuo que tiene una lesión tisular descrita en el presente documento incluye, pero sin limitación, individuos que tienen uno o más de: lesión del miocardio, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, lesión muscular, lesión esquelética, necrosis tubular aguda, lesión intestinal, lesión pulmonar, lesión hepática, lesión renal, lesión ósea, lesión en la piel, reparación de hernias, anastomosis vasculares, una placa aterosclerótica, hemangioma y después de una lesión traumática contusa o penetrante.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración (es decir, el retorno) de células madre a un lugar de lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante el estallido dirigido al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (tal como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, la célula madre es una célula madre mesenquimatosa (MSC), una célula madre mesenquimatosa de la médula ósea (BMSC), una célula madre multipotente, una célula madre pluripotente inducida (iPS) o una célula madre procedente de tejido. La célula madre procedente de tejido puede ser una célula madre procedente de tejido adiposo, una célula madre procedente de tejido cardíaco o una célula madre procedente de tejido del cordón umbilical. En otras realizaciones, la célula madre es una célula madre adulta. La célula madre adulta puede ser una célula madre hematopoyética, una célula madre mamaria, una célula madre intestinal, una célula madre mesenquimatosa en la placenta, tejido adiposo, pulmón, médula ósea, sangre, gelatina de Wharton del cordón umbilical o dientes (tal como el nicho perivascular de la pulpa dental y el ligamento periodontal), una célula madre endotelial, una célula madre neural, una célula madre olfativa adulta, una célula madre de la cresta neural o una célula madre de la línea germinal (por ejemplo, una célula madre en el testículo).

En algunas realizaciones, las células madre migran in vivo desde un compartimento de tejido u órgano a un lugar de lesión en otro compartimento de tejido u órgano de un individuo que tiene una lesión de tejido. Por ejemplo, las MSC pueden migrar desde la médula ósea (MO), la sangre del cordón umbilical (SCU), el estroma del cordón umbilical (gelatina de Wharton), la placenta y el tejido adiposo (TA). En otras realizaciones, las MSC se pueden aislar de un compartimento de tejido u órgano, enriquecido y/o tratado in vitro, y después se utiliza in vivo para la migración al lugar de la lesión de tejido u órgano.

En otras realizaciones, los ensayos de migración celular utilizados en el presente documento incluyen biomarcadores, bioluminiscencia, fluorescencia, tomografía por emisión de positrones (PET, del inglés "positron emission tomography")/CT e imágenes por resonancia magnética (MRI, del inglés "magnetic resonance imaging") in vivo. Los ensayos in vivo se pueden validar y corroborar con otros métodos, por ejemplo, IHC en secciones de tejido.

Las técnicas de obtención de imágenes in vivo no invasivas para analizar la migración de células madre incluyen la obtención de imágenes de partículas recubiertas de oro y dextrano que se cargan en las MSC, que se pueden visualizar mediante modalidades de rayos X, espectroscopía de Raman, modalidades de tomografía computarizada (TC) o ultrasonidos (US). En algunas realizaciones, las construcciones de nanopartículas biocompatibles, los marcadores o las partículas superparamagnéticas se cargan en células madre tales como las MSC con propiedades para permitir la visualización celular mediante rayos X, TC, US, PET o MRI. En algunas realizaciones, la migración de células madre puede analizarse utilizando técnicas tales como la ligadura y punción cecal (CLP, del inglés "cecal ligation and puncture"). Por ejemplo, la realización de la CLP en un ratón quimérico GFP permite observar el comportamiento de las BMSC en el contexto de la sepsis abdominal. La FACS, la citometría de flujo y la inmunohistoquímica se pueden utilizar para seguir la migración de las BMSC a la sangre periférica, pulmón, hígado, la herida cutánea y el lugar principal de la lesión. El comportamiento de las BMSC se puede correlacionar con el momento de la lesión, así como con los niveles locales (utilizando RT-PCR) y sistémicos de citocinas y quimiocinas. El seguimiento de la migración de las células madre puede ayudar a dilucidar la contribución de las BMSC a la reparación y regeneración local y distante de órganos y tejidos después de una lesión tisular.

En algunas realizaciones, la migración de las células madre se puede controlar utilizando células marcadas administradas a un individuo. Se utilizan enfoques tales como el marcaje y teñido isotópicos para marcar las células madre. En algunas realizaciones, los enfoques de marcaje incluyen: inyectar células madre de animales machos a la hembra, por lo que el cromosoma Y podría ser el marcador; inyectar células madre de una especie A a una especie B, por lo que los genes específicos de la especie A podrían ser el marcador celular; marcar las células madre con pKH26, BrdU u otros colorantes, por lo que las células madre podrían seguirse mediante los colorantes o reacciones enzimáticas específicas al marcador.

El enfoque más común de seguimiento in vivo es el marcaje isotópico. Las células madre podrían seguirse por los isótopos que marcan las células. Pero vale la pena señalar que deben tenerse en cuenta las cuestiones de seguridad y la semivida radiactiva. Otros enfoques de seguimiento in vivo de las células madre incluyen: teñido celular mediante colorantes celulares tales como DID, imágenes en vivo de las células de la superficie corporal mediante microscopía de fluorescencia excitada por dos fotones, imágenes en vivo de células específicas de la superficie corporal de animales transgénicos mediante microscopía de fluorescencia excitada de dos fotones, marcaje de células con SPIO y seguimiento del marcador mediante resonancia magnética, etc. Las células madre podrían marcarse con múltiples colorantes fluorescentes y después inyectarse en animales. Al llegar al punto de control, los órganos diana podrían congelarse en cortes y observarse directamente a través de microscopía de barrido láser confocal. Este enfoque de seguimiento no requiere demasiadas células marcadas (106 células/conejo), por lo que las células autólogas podrían utilizarse como marcadores en el estado natural de los órganos y las células.

Se puede lograr el marcaje de las células madre, por ejemplo, mediante un único marcador tal como pKH26. pKH26 es un colorante liposoluble, cuyo marcaje no penetra la membrana celular, por lo que se adapta al seguimiento de células vivas. El proceso de seguimiento mencionado en el presente documento es el marcaje múltiple con 2 o 3 colorantes. Un enfoque de marcaje seleccionado es a través del marcador de núcleos (DAPI, Hoechst) más el marcador de membranas. El marcador de núcleos afirma el núcleo de las células y se hace eco del marcador de membrana pKH26 al mismo tiempo. Otro enfoque es el marcaje múltiple mediante 2 marcadores de membrana, por ejemplo, Dio (3) y pKH26. Estos marcadores marcan las células a través de mecanismos similares, pero tienen diferentes longitudes de onda de excitación y emisión. Por lo tanto, las señales de migración incluyen 2 señales fluorescentes diferentes, las cuales prueban la migración de las BMSC de manera simultánea. En este método de seguimiento, solo las señales superpuestas de diferentes longitudes de onda (tales como las señales roja y verde) se consideran señales de migración.

Muchos tipos de tejidos animales son autofluorescentes y la autofluorescencia más común en los tejidos naturales es la fluorescencia verde. Los corazones son relativamente menos fluorescentes, pero son lo suficientemente fluorescentes como para interferir en la observación. El borde cortado de los cortes es siempre el más fuertemente fluorescente. Para hacer frente a la perturbación, solo las señales superpuestas verde y roja podrían reconocerse como señales de seguimiento. La fluorescencia roja es más adecuada para el análisis estadístico con un valor IOD por su especificidad (excepto por inexactitudes obvias en las señales fluorescentes rojas).

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células madre y/o inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (tal como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. La célula madre puede ser capaz de diferenciarse en un tipo de célula mesenquimatosa, incluidos los osteoblastos, adipocitos, condrocitos, células endoteliales, células epiteliales, enterocitos, osteocitos, neuronas, hepatocitos, nefrocitos, miocitos (músculo esquelético y músculo liso) y cardiomiocitos. La célula madre puede ser capaz de diferenciarse en células de origen no mesodérmico, incluidas las células p, los hepatocitos y las neuronas.

Se pueden utilizar ensayos conocidos en la materia para dilucidar el proceso de diferenciación de las células madre y los fenotipos de las células madre diferenciadas (tales como MSC, por ejemplo, BMSC), incluyendo tinción con fosfatasa alcalina y rojo de alizarina S para osteoblastos, tinción con aceite rojo O para adipocitos y tinción con azul alcián para condrogénesis. La diferenciación de las células madre tales como las MSC en varios tipos de células también puede analizarse mediante el perfil de expresión génica. Por ejemplo, el perfil de transcripción ha identificado genes específicos implicados en la diferenciación osteogénica (FHL2, ITGA5, Fgf18), la condrogénesis (FOXOIA) y la tenogénesis (Smad8). En algunas realizaciones, las MSC pueden dar lugar a un número elevado de células mediante una expansión a gran escala. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión en un individuo, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (tal como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el método induce la proliferación celular en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el método induce angiogénesis en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el método induce la maduración de los vasos sanguíneos en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el método da como resultado dos o más de los efectos descritos anteriormente.

La regeneración tisular divulgada en el presente documento se puede analizar, por ejemplo, en un organismo en el que una parte de un tejido se daña o se extrae. A continuación, se administra al organismo un oligoelemento con o sin una célula madre como se describe en el presente documento y se determina la velocidad de regeneración del tejido. La velocidad de regeneración tisular se puede comparar con la velocidad observada cuando a un organismo se le administra un control o no se trata. Otros parámetros que se pueden determinar durante un ensayo de regeneración tisular incluyen, pero sin limitación, síntomas o resultados tales como dolor o causantes del dolor, signos o síntomas de inflamación, grado final de la regeneración y calidad de la regeneración. En otras realizaciones, un ensayo de regeneración tisular en el presente documento comprende evaluar uno o más parámetros funcionales de órganos, tales como uno o más marcadores funcionales del corazón, uno o más marcadores funcionales renales y uno o más marcadores funcionales hepáticos.

En algunas realizaciones, uno o más de los siguientes parámetros en el análisis de la regeneración y reparación cardíacas se pueden utilizar para la evaluación de los métodos descritos en el presente documento: (1) cantidad de tejido o masa de miocardio y vasculatura coronaria reconstituida; (2) número y tamaño de miocitos y vasos restaurados; (3) integración de miocitos y vasos recién formados en el miocardio circundante; y (4) origen de las estructuras miocárdicas regeneradas. Se puede realizar una toma de imágenes por resonancia magnética (MRI) para estudiar la zona de la cicatriz, la función global del ventrículo izquierdo, la función regional (movimiento y engrosamiento de la pared) y la perfusión ventricular regional. La MRI se puede utilizar para detectar y/o confirmar la presencia de vasos, tejido o células nuevas que mejoran la función ventricular. Se puede realizar histopatología para determinar la zona de la cicatriz y la identificación y cuantificación de células madre cardíacas positivas para c-kit. La histopatología también proporciona datos sobre la distribución, tamaño y densidad de nuevos vasos y cardiomiocitos. La histopatología permite documentar el proceso de reparación a nivel tisular y celular. Por ejemplo, se realizan pruebas para evaluar, dentro de las secciones del infarto, la densidad de los microvasos (vasos positivos para vWF/mm2), las células positivas para BrdU y las células positivas para c-kit. La cuantificación de la densidad de los microvasos mediante el factor von Willebrand (vWF, del inglés "von Willebrand factor") permite determinar la cantidad de nuevos vasos sanguíneos creados en la zona de infarto. Las células positivas para BrdU representan la proliferación de las células, incluidas las células cardíacas. Las pruebas de células positivas para c-kit muestran la cantidad de células madre dentro de las secciones del infarto seleccionadas.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración tisular en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante el estallido dirigido al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

Las moléculas de señalización adecuadas descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, HIF-1, VEGF, SDF-1, CXCR4, CXCL12 (también denominado SDF-1a), MMP, HGF/c-met, TGF-p1, IL-1p, TNF-a, CCR1, CCR4, CCR7, CCR10, CCR9, CXCR5, CXCR6, CD44, CD54, CD56, CD106, E-cadherina, P-selectina, integrinas tales como la integrina-pl y CD49a, b, c, e, f (integrinas a i, 2, 3, 4, 6) y ligandos de integrinas tales como VCAM e ICAM.

El eje SDF-1/CXCR4 es uno de los mecanismos más importantes de migración de las células madre. SDF-1 (factor 1 procedente de células estromales o CXCL12), perteneciente a la familia de quimiocinas CXC, es una especie de proteína secretada de pequeño tamaño molecular. La expresión de SDF-1 está regulada por e1HIF-1 (factor 1 inducible por hipoxia). El HIF-1 está compuesto de HIF-1a y HIF-1p/ARNT (translocador nuclear de hidrocarburo de arilo, ARNT). HIF-1p es estable en el citoplasma, por lo que la expresión y acumulación de HIF-1a está determinada por la actividad del HIF-1. En normoxia, la proteína HIF-1a se sintetiza y degrada rápidamente por el sistema ubiquitina-proteasoma. Las prolil hidroxilasas (PHD) hidroxilan HIF-1a y el HIF-1a hidroxilado es reconocido por la proteína supresora de tumores von Hippel-Lindau (pVHL), que constituye una ubiquitina-proteína ligasa que se dirige a la degradación de la proteína HIF-1a. Cuando se lesiona, la región dañada es hipóxica, lo que inhibe la actividad de las PHD, permitiendo la acumulación y translocación del HIF-1a al núcleo, donde se dimeriza con HIF-1p para formar HIF-1, y se combina con otros factores e inicia la transcripción del gen diana. Los tejidos lesionados expresan un nivel elevado de SDF-1 y lo liberan a la circulación, construyendo un gradiente de concentración desde la región lesionada hasta el extremo más alejado de la circulación. El gradiente atrae así células madre expresadas en CXCR4, incluyendo BMSC, a los tejidos lesionados.

Cuando el corazón está en hipoxia crónica, la sangre que las arterias coronarias no pueden satisfacer la demanda del miocardio. Entonces la isquemia crónica induciría la fibrosis miocárdica, disminución de las microarterias, daño al bombeo de sangre y finalmente el infarto de miocardio isquémico. En isquemia crónica, la actividad de1HIF-1 es limitada, lo que da como resultado la inhibición de la expresión de factores angiogénicos que están regulados por el HIF-1. Por lo tanto, el suministro de sangre no podría reconstruirse y aparecería el infarto.

Normalmente, la actividad del HIF-1 en los tejidos lesionados está temporalmente limitada. Tanto los experimentos con animales como los ensayos clínicos han demostrado que, en isquemia cardíaca, e1HIF-1a en los tejidos lesionados se acumula de manera instantánea después de la lesión, pero después disminuye de manera gradual. La actividad del HIF-1 cae incluso más rápido que el contenido, lo que provoca la caída de la expresión de factores regulados por el HIF-1, tales como VEGF y SDF-1, después del aumento transitorio. Debido a la regulación de1HIF-1, la expresión del SDF-1 alcanza su punto máximo en el primer o segundo día después del infarto de miocardio. Después, disminuye de manera gradual y se reduce a los valores iniciales en aproximadamente un mes. Porque el SDF-1 es uno de los movilizadores de la migración de las células madre, la disminución del SDF-1 conduce al retroceso e incluso a la desaparición de la migración de las células madre.

Es importante destacar que, la acción defensiva inducida por el HIF-1a cuando se activa en la condición de isquemia aguda funciona de manera diferente a las condiciones de isquemia prolongada. En una condición de isquemia a largo plazo, los niveles de proteína HIF aumentan en el miocardio isquémico, mientras que, los genes regulados por e1HIF (tales como VEGF) están suprimidos, lo que conduce a una revascularización disminuida y una regeneración deteriorada. La privación de cobre reduce la unión de HIF-1a a la secuencia HRE de los genes diana y a P300, un componente del complejo transcripcional HIF-1. Asimismo, el cobre se moviliza de manera sustancial desde el miocardio a la sangre inmediatamente después de una isquemia prolongada. Esta movilización de cobre en el flujo coronario sigue con sensibilidad a una isquemia cardíaca prolongada, pero no corta. La pérdida de cobre del miocardio se correlaciona con el grado de pérdida de la función cardíaca. Por lo tanto, incluso en la condición de un nivel elevado de la proteína HIF, la regulación positiva de los genes controlados por e1HIF no ocurre debido a la pérdida de cobre del miocardio. Los oligoelementos tales como el cobre pueden conducir a la activación de1HIF-1, incluida la síntesis, estabilización, translocación de HIF-1a desde el citosol al núcleo, la unión a la secuencia HRE de genes diana y la formación del complejo transcripcional HIF-1. Los métodos descritos en el presente documento son útiles para inducir una o más moléculas de señalización, tales como HIF-1a.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para revertir el daño en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

La reversión del daño tisular puede analizarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, detección de marcadores celulares de homeostasis tisular normal y/o de daño tisular persistente (por ejemplo, mediante inmunohistoquímica o mediante la medición de los niveles de ADN y transcripción), medición de la zona del daño o el volumen del daño, o evaluación de cualquier indicador clínicamente relevante. Por ejemplo, se puede medir la reversión del daño del tejido cardíaco del tejido infartado mediante la cuantificación del número de células, tal como el número de miocitos, fibroblastos, o la cantidad de cicatrización, o con ensayos funcionales para la producción o aspectos estructurales de la función cardíaca, que incluyen, LVEDP, LVDP, dp/dt máx., dp/dt mín., peso del VI, volumen de la cámara y tensión diastólica de la pared. En general, se dice que un método divulgado en el presente documento revierte el daño en el tejido dañado si da como resultado un cambio significativo (por ejemplo, al menos 2 veces) en cualquiera de dicha evaluación clínica o en cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el método revierte la fibrosis en el lugar de la lesión en el tejido. La fibrosis es la acumulación anormal de tejido fibroso que puede ocurrir como parte del proceso de curación de heridas en el tejido dañado. Dicho daño tisular puede resultar de una lesión física, inflamación, infección, exposición a toxinas y otras causas. La fibrosis en el hígado (hepática), por ejemplo, ocurre como parte de la respuesta de curación de heridas a una lesión hepática crónica. La fibrosis ocurre como una complicación de la hemocromatosis, enfermedad de Wilson, alcoholismo, esquistosomiasis, hepatitis vírica, obstrucción del conducto biliar, exposición a toxinas y trastornos metabólicos. Se cree que esta formación de tejido cicatricial representa un intento del cuerpo de encapsular el tejido lesionado. La fibrosis hepática se caracteriza por la acumulación de matriz extracelular que se puede distinguir de manera cualitativa de la del hígado normal. Si no se controla, la fibrosis hepática progresa a cirrosis (definida por la presencia de nódulos encapsulados), insuficiencia hepática y muerte. Como resumen Li y Friedman (Gastroenterol. Hepatol. 14:618-633, 1999), las estrategias terapéuticas actuales y propuestas para la fibrosis hepática incluyen la eliminación de la causa subyacente (por ejemplo, una toxina o un agente infeccioso), la supresión de la inflamación (utilizando, por ejemplo, corticoesteroides, antagonistas del receptor de la IL-1 u otros agentes), la regulación a la baja de la activación de células estrelladas utilizando, por ejemplo, interferón y o antioxidantes), la promoción de la degradación de la matriz o la promoción de la apoptosis de células estrelladas.

Los tejidos fibróticos se acumulan en el corazón y los vasos sanguíneos como resultado de la hipertensión, una cardiopatía hipertensiva, aterosclerosis e infarto de miocardio. La presión arterial elevada o hipertensión, puede deberse a una variedad de factores y, a menudo, conduce al desarrollo de cardiopatía hipertensiva (HHD, del inglés "Hypertensive Heart Disease") con progresión a paro cardíaco e infarto de miocardio. De manera similar, la aterosclerosis y otras cardiopatías isquémicas a menudo también provocan un paro cardíaco. Todas estas enfermedades cardiovasculares presentan una acumulación de la matriz extracelular o deposición fibrótica que da como resultado el endurecimiento de la vasculatura y el endurecimiento del propio tejido cardíaco. Esta deposición de material fibrótico es una respuesta al daño inducido por el estado hipertensivo y/o esclerótico, pero los efectos de esta respuesta también dan como resultado los efectos negativos del endurecimiento vascular y cardíaco, así como el agrandamiento del ventrículo. En algunos casos, el aumento de la fibrosis cardíaca en las enfermedades cardiovasculares interrumpe o altera las señales transmitidas a los cardiomiocitos a través del andamiaje tisular del corazón, además, conduce a la interrupción de la función cardíaca eficaz y promueve el paro cardíaco y el infarto de miocardio.

De acuerdo con la presente divulgación, los perfiles de expresión de genes regulados de manera diferencial durante el daño tisular se pueden utilizar para evaluar la reversión del daño tisular en un método de tratamiento divulgado en el presente documento. Por ejemplo, el análisis de la expresión génica basado en micromatrices se puede basar en el análisis de células humanas (tales como fibroblastos y cardiomiocitos) sujetas a estímulos seleccionados que dan como resultado cambios en la acumulación y proliferación de colágeno extracelular, las señas de identidad de la fibrosis. Los estímulos se pueden seleccionar para imitar los del proceso de fibrosis específico de tejido. Se pueden utilizar archivos de expresión génica asociados con la fibrosis (por ejemplo, fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, fibrosis del tejido cardíaco, nefropatía diabética y fibrosis renal) para analizar la fibrosis y la reversión de los daños fibróticos en el tejido. En otras realizaciones, los archivos de expresión génica asociados con la reversión de la fibrosis (por ejemplo, en un tratamiento conocido por al menos revertir parcialmente la fibrosis) se pueden utilizar para analizar la fibrosis y la reversión de los daños fibróticos en el tejido.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

El microambiente es una intrincada red de células tanto estructurales como inflamatorias, citocinas, proteínas y factores de crecimiento. En el caso de enfermedades o afecciones fibróticas del corazón, el corazón comprende células estructurales residentes tales como cardiomiocitos, células epiteliales, fibroblastos y progenitores de cardiomiocitos residentes y células secretoras de citocinas. Estas células interactúan con los factores fibróticos durante la patogenia de la fibrosis. Los fibroblastos y los miofibroblastos pueden desempeñar un papel importante en la creación de un entorno fibrótico, ya que secretan un exceso de colágeno y materiales de matriz que provocan cicatrices irreversibles. Las moléculas de adhesión de célula a célula y los ligandos de la matriz extracelular son factores importantes en el microambiente fibrótico y promueven la fibrosis y la diferenciación de fibroblastos. En algunas realizaciones, la señalización mediada por adhesión se analiza en el microambiente tisular. Por ejemplo, la diferenciación y migración celular ocurre en respuesta a señales mecánicas del microambiente, tales como la rigidez de la matriz circundante. La elasticidad del tejido o de las matrices de cultivo de las células madre mesenquimatosas (MSC) puede analizarse y modularse para promover la migración de las células madre en el tejido lesionado, la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, la reparación tisular y/o la reversión de los daños tisulares. En una realización, las matrices blandas dan como resultado la diferenciación de las MSC en células similares a neuronas, mientras que las matrices rígidas dan como resultado la diferenciación de las MSC en miógenas. La matriz extracelular y sus componentes del lugar de la lesión pueden analizarse para indicar si el microambiente promueve la migración de células madre al lugar, la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, la reparación tisular y/o la reversión de los daños tisulares.

En algunas realizaciones, los cambios en las células en el contexto de su ambiente natural se miden para indicar la eficacia y/o toxicidad de un método terapéutico divulgado en el presente documento. El microambiente de células madre de un tejido u órgano de un donante (tal como la médula ósea) y de un lugar de lesión se puede analizar y/o modular para promover la migración de las células madre al lugar, la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, la reparación tisular y/o la reversión de los daños tisulares. El microambiente tisular local puede analizarse mediante tinciones de proteínas (IHC e IF) y tinción de ARN con ISH cromogénico y fluorescente. Por ejemplo, el microambiente hipóxico puede estar indicado por la tinción del marcador hipóxico, la tinción de marcadores de células endoteliales, el análisis de la densidad de los microvasos y el análisis de proximidad. El microambiente tisular también se puede estudiar utilizando cultivos de órganos o cultivos organotípicos como se divulga en Benbrook, 2006, Drug Discovery Today: Disease Models, 3(2): 143-148.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir al menos dos (incluyendo, por ejemplo, al menos cualquiera de 3, 4, 5, 6 o más) acontecimientos de reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, en donde los al menos dos acontecimientos de reparación tisular se seleccionan del grupo que consiste en: inducir la migración de las células madre, tales como las células madre mesenquimatosas de la médula ósea, al lugar de la lesión, inducir la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración de tejidos, revertir el daño en el lugar de la lesión y reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión e inducir la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión e inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión, inducir la diferenciación de las células madreen el lugar de la lesión e inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

Métodos para inducir la reparación tisular y el crecimiento de los vasos sanguíneos mediante administración directa

En el presente documento se describe un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular sin aumentar la expresión del VEGF en el lugar de la inyección, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular sin aumentar la expresión del VEGF en el lugar de la inyección, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

La formación y el crecimiento de los vasos sanguíneos dentro de un tejido pueden ocurrir mediante angiogénesis y/o vasculogénesis. Los vasos sanguíneos pueden incluir estructuras capilares que son completamente funcionales para apoyar el transporte de la sangre. En algunas realizaciones, la angiogénesis incluye un proceso que implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes previamente, el brote de la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante el brote de los existentes, o la división de la angiogénesis (invaginación), la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante la escisión de los existentes. En algunas realizaciones, la vasculogénesis incluye un proceso que implica la producción de novo de nuevos vasos sanguíneos mediante la proliferación de células madre endoteliales, tal como la formación de nuevos vasos sanguíneos cuando no los había preexistentes.

En algunas realizaciones, la formación y el crecimiento de los vasos sanguíneos requieren señales de factores de crecimiento y otras proteínas que controlan directamente el proceso, tales como angiopoyetinas (como Ang-1 y Ang-2), efrina (Eph), factores de crecimiento del endotelio vascular (como VEGF-A y v Eg F-C), factor de crecimiento procedente de plaquetas (PDGF'), factores de crecimiento de fibroblastos (como f GF-1 y FGF-2), factor a de necrosis tumoral (TNF-a, del inglés "tumor necrosis factor-a"), interleucina (IL), proteína 1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1, del inglés "monocyte chemotactic protein-1") (también conocida como CCL-2), factor a de crecimiento transformante (TGF-a), factor p de crecimiento transformante (como TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3 y TGF-p4), endostatina, vasohibina, quimiocinas, trombospondina, angiostatina, moléculas de adhesión de células vasculares (como VCAM-1), metaloproteinasas de matriz (como MMP-2 y MPP-9), integrinas, cadherinas, activadores del plasminógeno e inhibidores del activador del plasminógeno.

En algunas realizaciones, el crecimiento de los vasos sanguíneos se analiza mediante la medición de la proliferación de células endoteliales, que se necesita para desarrollar capilares en el animal inalterado. En algunas realizaciones, la acción de un oligoelemento administrado directamente en el lugar de la lesión en la proliferación endotelial puede evaluarse mediante recuentos celulares directos, síntesis de ADN y/o actividad metabólica. Por ejemplo, las células endoteliales se pueden aislar del lugar de la lesión y analizar su velocidad de proliferación después del tratamiento con un oligoelemento. En otras realizaciones, la proliferación de las células endoteliales en el lugar de la lesión se puede controlar mediante el marcaje de las células y la medición de los recuentos de células, la síntesis de ADN y/o la actividad metabólica in situ. En otras realizaciones, se pueden administrar células endoteliales marcadas a un sujeto, y se puede controlar la proliferación de las células endoteliales marcadas en el lugar de la lesión in situ. En algunas realizaciones, las células endoteliales están marcadas con un radioisótopo, una fracción fluorescente o un marcador que se puede detectar de manera específica, por ejemplo, mediante un anticuerpo. En realizaciones específicas, las células están marcadas con [3H]timidina o bromodesoxiuridina (BrdU).

En algunas realizaciones, el crecimiento de los vasos sanguíneos se analiza mediante la medición de la migración de las células endoteliales, que degradan la membrana basal y migran a lo largo de gradientes químicos establecidos por factores de crecimiento proangiogénicos, por ejemplo, durante el brote de la angiogénesis. En determinadas realizaciones, se marcan las células endoteliales en el lugar de la lesión y se controla la migración celular in vivo. Se pueden administrar células endoteliales marcadas a un sujeto y se controla su migración hacia el lugar de la lesión in vivo. Las células endoteliales en el lugar de la lesión pueden aislarse y sus propiedades migratorias se pueden evaluar mediante varios ensayos in vitro que incluyen el ensayo de cámara de Boyden, el ensayo de subagarosa, el ensayo de cicatrización de heridas, el ensayo de valla de teflón, el ensayo de seguimiento fagocinético y ensayos similares.

En algunas realizaciones, el crecimiento de los vasos sanguíneos se analiza mediante la medición de las células endoteliales que forman tubos con lúmenes para conducir el flujo de sangre, es decir, tubulogénesis. En algunas realizaciones, el crecimiento de los vasos sanguíneos se analiza mediante un ensayo de anillo aórtico. Un ensayo de anillo aórtico para analizar el crecimiento de los vasos sanguíneos se divulga en Li et al., "Copper promotion of angiogenesis in isolated rat aortic ring: role of vascular endothelial growth factor", Journal of Nutritional Biochemistry 25(2014) 44-49. Los microvasos que brotan del anillo aórtico interactúan estrechamente con los macrófagos residentes, pericitos y fibroblastos en una secuencia ordenada que emula la angiogénesis en el animal inalterado. Es posible que las células endoteliales no se hayan seleccionado previamente mediante pases y, por lo tanto, se encuentren en un estado de reposo similar al del animal inalterado. Otros ensayos de angiogénesis que incorporan funciones angiogénicas (tales como degradación de la matriz, migración, proliferación y formación de tubos) incluyen el ensayo de embrioides, el ensayo de metatarso de ratón y ensayos similares.

En algunas realizaciones, un ensayo in vivo se utiliza para medir el crecimiento de los vasos sanguíneos después de que se administre un oligoelemento directamente al lugar de la lesión. Estos ensayos incluyen, pero sin limitación, el ensayo de angiogénesis corneal, el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo y el ensayo de tapón de Matrigel. Por ejemplo, la córnea es el único tejido del cuerpo que es avascular y transparente, haciéndolo ideal para la observación de la angiogénesis. Los gránulos o esponjas que contienen moléculas proangiogénicas (por ejemplo, un oligoelemento como se divulga en el presente documento) pueden implantarse en bolsas estromales creadas quirúrgicamente. El crecimiento de nuevos vasos de la vasculatura limbal periférica se puede controlar diariamente, permitiendo determinar las velocidades de la angiogénesis. En un ensayo de tapón de Matrigel, un Matrigel que contiene un oligoelemento como se divulga en el presente documento puede implantarse en un sujeto en o cerca del lugar de la lesión, y el tapón de Matrigel se retira posteriormente para la visualización de los vasos sanguíneos. En algunas realizaciones, las células endoteliales están marcadas con uno o más marcadores, y su proliferación, migración, tubulogénesis, formación de vasos sanguíneos y/o crecimiento de vasos sanguíneos se analizan en el lugar de la lesión in vivo, por ejemplo, utilizando una técnica de imagen adecuada.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración (es decir, el retorno) de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo BMSC), a un lugar de lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células madre y/o inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión en un individuo, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para revertir el daño en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir al menos dos (incluyendo, por ejemplo, al menos cualquiera de 3, 4, 5, 6 o más) acontecimientos de reparación tisular en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión, en donde los al menos dos acontecimientos de reparación tisular se seleccionan del grupo que consiste en: inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión, inducir la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración de tejidos, revertir el daño en el lugar de la lesión y reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión e inducir la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión e inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de las células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión, inducir la diferenciación de las células madreen el lugar de la lesión e inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión.

Terapia combinada con células madre o inductores

En el presente documento se describe un método para inducir la reparación tisular (o mejorar la función del tejido) en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende: a) administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento; y b) administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como células madre mesenquimatosas (MSC), por ejemplo, células madre mesenquimatosas de la médula ósea (BMSC) o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC). En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de inductor de células madre. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, la célula madre divulgada en el presente documento es una célula madre mesenquimatosa (MSC), una célula madre mesenquimatosa de la médula ósea (BMSC), una célula madre multipotente, una célula madre pluripotente inducida (iPS) o una célula madre procedente de tejido. En algunas realizaciones, la célula madre procedente de tejido es una célula madre procedente de tejido adiposo, una célula madre procedente de tejido cardíaco o una célula madre procedente de tejido del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula madre es in inductor de una célula madre adulta. En algunas realizaciones, la célula madre adulta es una célula madre hematopoyética, una célula madre mamaria, una célula madre intestinal, una célula madre mesenquimatosa en la placenta, tejido adiposo, pulmón, médula ósea, sangre, gelatina de Wharton del cordón umbilical o dientes (tal como el nicho perivascular de la pulpa dental y el ligamento periodontal), una célula madre endotelial, una célula madre neural, una célula madre olfativa adulta, una célula madre de la cresta neural o una célula madre de la línea germinal (por ejemplo, una célula madre en el testículo).

En algunas realizaciones, el inductor de la célula madre divulgado en el presente documento es un inductor de una célula madre mesenquimatosa (MSC), una célula madre mesenquimatosa de la médula ósea (BMSC), una célula madre multipotente, una célula madre pluripotente inducida (iPS) o una célula madre procedente de tejido, tal como una célula madre procedente del tejido adiposo, una célula madre procedente de tejido cardíaco o una célula madre procedente de tejido del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el inductor de la célula madre es un inductor de una célula madre adulta, tal como una célula madre hematopoyética, una célula madre mamaria, una célula madre intestinal, una célula madre mesenquimatosa en la placenta, tejido adiposo, pulmón, médula ósea, sangre, gelatina de Wharton del cordón umbilical o dientes (tal como el nicho perivascular de la pulpa dental y el ligamento periodontal), una célula madre endotelial, una célula madre neural, una célula madre olfativa adulta, una célula madre de la cresta neural o una célula madre de la línea germinal (por ejemplo, una célula madre en el testículo).

En algunas realizaciones, un inductor de células madre mesenquimatosas de la presente divulgación es un agente que induce la formación de células madre mesenquimatosas en un tejido, por ejemplo, en la médula ósea. Un inductor de células madre mesenquimatosas puede inducir la formación de células madre mesenquimatosas a partir de una célula madre indiferenciada o una célula madre pluripotente. La célula madre puede ser una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida (iPS). La célula madre puede ser in vivo, in vitro o ex vivo. La célula madre puede ser una célula madre embrionaria humana o una célula madre pluripotente inducida humana.

Un inductor de células madre mesenquimatosas de la presente divulgación puede seleccionarse del grupo que consiste en una proteína BMP, factor básico de crecimiento de los fibroblastos (bFGF, del inglés "basic fibroblast growth factor"), BMP 4, BMP 2, activina A, un antagonista de BMP 4, nogina, cordina, Tsg, un receptor soluble de BMP, BMPRIA, BMPRIB, una pequeña molécula que actúa o funciona como antagonista de BMP, dorsomorfina, un inhibidor de la vía de señalización del ácido retinoico, un antagonista del receptor del ácido pan-retinoico, un antagonista del ácido retinoico, un antagonista del receptor del ácido retinoico, un antagonista del receptor X retinoico, Wnt-3a, homólogo 1 de Dickkopf (DKK1) y una pequeña molécula que actúa o funciona como Wnt-3a, tal como Bio o CHIR99021. Un inductor de células madre mesenquimatosas puede comprender uno o más inductores divulgados en el presente documento. Un inductor de células madre mesenquimatosas aumenta las células madre mesenquimatosas en la sangre.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la reparación tisular (o mejorar la función del tejido) en un individuo que tiene una lesión tisular y se administra con células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC), que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, en donde las células madre se administran al individuo. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) en el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, en donde las células madre se administran al individuo. En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de inductor de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC). En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la reparación tisular (o mejorar la función del tejido) en un individuo que tiene una lesión tisular y se administra con un inductor de una célula madre (tal como MSC, por ejemplo, BMSC), que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, en donde se administra al individuo un inductor de las células madre. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) en el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, en donde se administra al individuo un inductor de las células madre. En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC). En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

Los métodos descritos en el presente documento son en general adecuados para inducir la migración de las células madre a un lugar de lesión, que puede incluir la migración de células madre endógenas al lugar de la lesión, la migración de células madre exógenas al lugar de la lesión o ambos.

En algunas realizaciones, la célula madre utilizada en el presente documento se modifica para mejorar su respuesta de migración. En una realización, las células madre migran al lugar de la lesión a través de un vaso sanguíneo y/o mediante migración local. Por ejemplo, las células madre (tales como las MSC) se pueden modificar de manera química, enzimática y/o genética para mejorar sus respuestas de migración y retorno. La fracción Sialyl Lewisx (SLeX), un ligando rodante celular, puede acoplarse de manera covalente a la superficie de las células madre mediante modificaciones químicas de biotina y estreptavidina. En algunas realizaciones, las MSC genomanipuladas mediante SLeX presentan una respuesta rodante in vitro en sustratos recubiertos con P-selectina. Sarkar et al., 2008, Bioconjugate Chemistry 19, 2105-2109. Debe entenderse que se pueden utilizar otras modificaciones químicas, enzimáticas y/o genéticas adecuadas para mejorar la migración de células madre y la localización en lugares de tejidos lesionados.

En algunas realizaciones, las células madre son de múltiples tejidos diferentes con diferencias en el fenotipo de las células. Estas diferencias pueden deberse en parte a diferencias en el microambiente natural del que se aíslan. Aparte de la fuente de las células madre, los métodos de cultivo influyen en gran medida en las características de las células madre, incluido su posible migración. En determinadas realizaciones, las células madre recién aisladas se comportan mejor que sus contrapartes cultivadas. El receptor de quimiocina CXCR4 que reconoce el SDF-1a puede estar altamente expresado en las BMSC, pero se pierde en el cultivo. En algunas realizaciones, las células madre se cultivan con citocinas (tales como HGF, SCF, IL-3 e IL-6) y/o en condiciones hipóxicas, dando como resultado el restablecimiento de la expresión de CXCR4. En otras realizaciones, la señalización de la metaloproteasa de matriz (MMP, del inglés "matrix metalloprotease") se regula utilizando un método divulgado en el presente documento para regular la migración celular. La expresión de las MMP en las MSC está influenciada por factores tales como la hipoxia y el aumento de la confluencia de cultivos. Asimismo, las citocinas inflamatorias TGF-p1, IL-1p y TNF-a también mejoran la migración mediante la regulación positiva de las MMP (MMP) que afectan a la migración de las MSC.

Se puede evaluar la reparación tisular, por ejemplo, mediante la zona del daño o el volumen del daño. La reparación de tejido dañado en un paciente se puede evaluar utilizando cualquier patrón clínicamente relevante. Por ejemplo, la reparación de tejido infartado se puede medir mediante la cuantificación del número de células, tal como el número de miocitos, fibroblastos, o la cantidad de cicatrización, o con ensayos funcionales para la producción o aspectos estructurales de la función cardíaca, que incluyen, LVEDP, LVDP, dp/dt máx., dp/dt mín., peso del VI, volumen de la cámara y tensión diastólica de la pared. En general, se dice que un método divulgado en el presente documento repara el tejido dañado si da como resultado un cambio significativo (por ejemplo, al menos 2 veces) en cualquiera de dicha evaluación clínica o en cualquier combinación de las mismas.

Se puede realizar cualquier método o métodos adecuados para analizar la reparación tisular. Por ejemplo, se pueden realizar métodos para evaluar la cicatrización del tejido, para evaluar la funcionalidad del tejido reparado y para evaluar el crecimiento celular en el tejido. Para determinar el grado de curación del tejido, se pueden realizar histología y tinción celular para detectar la propagación de las células sembradas y/o una apariencia histológica mejorada. En algunos casos, las porciones de tejido se pueden recoger y tratar con un fijador tal como, por ejemplo, formalina tamponada neutra. Dichas porciones de tejido se pueden deshidratar, embeber en parafina y seccionar con un micrótomo para análisis histológico. Las secciones se pueden teñir con hematoxilina y eosina (H&E) y después montarse en portaobjetos de vidrio para la evaluación microscópica de la morfología y celularidad. En algunos casos, se pueden realizar pruebas fisiológicas para evaluar el movimiento y la funcionalidad de los tejidos después del tratamiento de acuerdo con los métodos y materiales proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos mecánicos in vitro para medir el trabajo de flexión (WOF, del inglés "work of flexion") o el ángulo de flexión de un tejido tendinoso reparado o de una articulación reparada. Los ensayos in vivo pueden incluir la evaluación funcional de los órganos, la evaluación de los síntomas o técnicas de imagen.

En algunas realizaciones, la función de los tejidos y/o órganos antes, durante o después de la administración de un método terapéutico divulgado en el presente documento se puede evaluar mediante uno o más de los siguientes métodos: análisis bioquímico de al menos un biomarcador indicativo de una función tisular mejorada mediante métodos tales como citometría de flujo, inmunofluorescencia, ELISA, marcaje de fósforo, hibridación, amplificación de ácido nucleico o transferencia Western; ensayos de función celular, tales como ensayos de apoptosis celular, ensayos de necrosis y ensayos de viabilidad celular, incluida la tinción con anexina V mediante inmunofluorescencia o citometría de flujo, detección de la actividad de la caspasa, ensayos de hipoxia, ensayo TUNEL, escalera de ADN celular, número de células en forma de bastón en respuesta a H²O² , evaluación de qPCR de la expresión génica y medición de la zona necrótica mediante tinción con H&E; ensayos de formación de cicatrices, incluida la medición del número de células fibroblásticas en una zona dañada o infartada, medición de la deposición de colágeno y el nivel de otras proteínas de la matriz asociadas con la formación de cicatrices; migración de las células madre o células progenitoras a la zona dañada; y cualquier otra prueba de función orgánica clínicamente relevante.

En algunas realizaciones, la función cardíaca se puede evaluar mediante uno o más de los siguientes parámetros: mecánica de miocitos y fusión celular, por ejemplo, frecuencia de distribución del tamaño de los miocitos, acortamiento del máximo, velocidad de acortamiento y re-alargamiento y evaluación de la fusión celular (número de cromosomas X); aspectos de producción o estructurales de la función cardíaca, incluidos, LVEDP, LVDP, dp/dT, peso del VI, volumen de la cámara, tensión diastólica de la pared y comparación de sujetos con IM tratados y con IM sin tratamiento; regeneración miocárdica, tal como la composición del miocardio regenerado, evaluación de células positivas para BrdU en la zona del infarto en sujetos tratados frente a no tratados, y células positivas para miosina en la zona del infarto en sujetos tratados frente a no tratados; estructura cardíaca, tal como el tamaño del infarto, la cantidad de fibrosis y la hipertrofia de cardiomiocitos. En determinadas realizaciones, un método divulgado en el presente documento comprende además medir uno o más indicios de la función cardíaca, en donde dichos indicios de la función cardíaca son gasto cardíaco (GC) torácico, índice cardíaco (IC), presión de enclavamiento de la arteria pulmonar (PEAP), índice cardíaco (IC), % de acortamiento fraccional (% AF), fracción de expulsión (FE), fracción de expulsión del ventrículo izquierdo (FEVI); diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (DDFVI), diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (DSFVI), contractilidad (dP/dt), una disminución en el funcionamiento auricular o ventricular, un aumento en la eficacia de bombeo, una disminución en la velocidad de pérdida de eficiencia de bombeo, una disminución de la pérdida del funcionamiento hemodinámico o una disminución de las complicaciones asociadas con la miocardiopatía, en comparación con un control.

En algunas realizaciones, la función cerebral antes, durante o después de la administración de un método terapéutico divulgado en el presente documento se puede evaluar mediante una prueba neurológica o de manera electrofisiológica, por ejemplo, mediante una disminución de la relación señal a ruido, o de manera bioquímica, por ejemplo, mediante el análisis de al menos un biomarcador indicativo de la función del órgano, la función tisular y/o la función celular del sistema nervioso central o periférico. Las técnicas electrofisiológicas ilustrativas incluyen electroencefalografía (EEG), electrocardiografía (ECG), electromiografía (EMG), potenciales relacionados con acontecimientos (PRE), potenciales evocados (PE), magnetoencefalografía (MEG) y estudio de conducción nerviosa (ECN). En otras realizaciones, la función cerebral se puede evaluar mediante uno o más de los siguientes métodos o parámetros: función intelectual general, tal como la escala de inteligencia abreviada de Wechsler y la escala de inteligencia III de Wechsler para adultos; atención básica, tal como las subpruebas de retención de dígitos y de retención espacial de la escala de memoria Wechsler III; atención compleja (memoria de trabajo), tal como las subpruebas de retención de dígitos, secuenciación de letras y números y aritmética de la escala de inteligencia para adultos III de Wechsler; funciones ejecutivas, tales como la prueba de clasificación de tarjetas de Wisconsin, la prueba de trazabilidad B, la prueba de Stroop, la prueba de la Torre de Londres, la prueba de juego, la escala de comportamiento del sistema frontal y escalas de Iowa de función del lóbulo frontal; memoria (visual y verbal), tal como las escalas de memoria Wechsler III, auditivo de Rey, prueba de aprendizaje verbal, verbal de California, prueba de aprendizaje II, la prueba de memoria visual breve revisada; regulación de los afectos, tal como el inventario de personalidad multifásico de Minnesota 2, la prueba de Stroop afectiva, la escala de comportamiento del sistema frontal y escalas de Iowa de función del lóbulo frontal; interpretación de estímulos emocionales, tal como DANVA (Análisis diagnóstico de la conducta no verbal); velocidad de procesamiento, tal como el índice de velocidad de procesamiento (búsqueda de símbolos, codificación) de la escala de inteligencia III de Wechsler para adultos, prueba de trazabilidad y prueba de modalidades de dígitos y símbolos; idioma, tal como la prueba de denominación de Boston; prueba de asociación de palabras oral controlada; prueba de fluidez de palabras semánticas; y examen de afasia multilingüe; pruebas oculoconstructivas, tales como la prueba de figuras complejas de Rey-Osterrieth, subpruebas de diseño de bloques y de ensamblaje de objetos de la escala de inteligencia III de Wechsler para adultos; y pruebas oculoespaciales, tales como el razonamiento matricial del WAIS-III y la prueba de juicio de orientación de línea.

En algunas realizaciones, se analiza la salud del músculo esquelético antes, durante o después de la administración de un método terapéutico divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, la salud del músculo esquelético incluye dolor muscular, daño muscular, cambios metabólicos al ejercicio y reorganización citoesquelética. La función del músculo esquelético puede ser la fuerza muscular, resistencia muscular, adaptación de entrenamiento, un estado normal del músculo que permitirá el movimiento de las articulaciones o el metabolismo fisiológico estándar y la función del músculo esquelético en un mamífero sano. Se puede medir cualquier variable funcional del músculo esquelético, incluida la fuerza muscular (fuerza máxima generada en un movimiento específico), la resistencia muscular (el número máximo de contracciones que se pueden realizar a una frecuencia y fuerza determinadas) y la potencia muscular (fuerza/tiempo, el efecto máximo generado por el músculo). Aunque no son exhaustivas, las funciones normales específicas de los músculos incluyen la diferenciación de mioblastos, determinación de mioblastos, desarrollo muscular, contracción muscular, cambios sarcoméricos, fusión de mioblastos, desarrollo muscular somático y miogénesis.

En determinadas realizaciones, se evalúa la fibrosis del músculo esquelético de un paciente. Hay varios métodos disponibles para determinar el estado de la fibrosis del músculo esquelético, incluida la obtención de una biopsia de tejido muscular del paciente y la evaluación de la biopsia con tinciones histoquímicas o inmunohistoquímicas sensibles para detectar la existencia de tejido fibrótico. Los ejemplos de tinciones histoquímicas incluyen, por ejemplo, hematoxilina y eosina (H&E), tricrómico y ATPasa (por ejemplo, a pH 4,3, 4,65 y 10,4). Los anticuerpos representativos que se pueden utilizar para marcar las fibras musculares para la tinción inmunohistoquímica incluyen, por ejemplo, miosina, colágeno de tipo IV, laminina, fibronectina y distrofina. De manera alternativa, se puede emplear un método funcional para determinar el grado en que la fibrosis invade el músculo esquelético de un paciente. El método funcional implica someter al paciente a una o más de una batería de pruebas y mediciones físicas. Dichas pruebas y medidas suelen incluir pruebas de fuerza neurológica, fuerza muscular, equilibrio, marcha, postura, evaluaciones de coordinación sensorial y pruebas de función pulmonar, por ejemplo, capacidad vital y capacidad espiratoria forzada, todas ellas se pueden llevar a cabo mediante métodos conocidos en la materia. En algunas realizaciones, la reparación de tejidos se puede evaluar basándose en el nivel o niveles de expresión de una o más moléculas de señalización descritas en el presente documento. Los biomarcadores adecuados como indicadores de reparación de tejidos incluyen, pero sin limitación, un biomarcador de daño del ADN, un biomarcador de respuesta inflamatoria, un biomarcador de daño tisular, un biomarcador de reparación de daño tisular o un marcador hemático sustituido, tal como p53, p21, GADD45a, ATM, histona H2AX fosforilada, IL-6, CRP, SAA, IL-1, IL-5, IL-10, KC/GRO, IFN, IL-2, IL-4, TNF-a, IL-12, IL-3, IL-7, IL-6, p-amilasa salival, proteínas citrulinadas, S100B, SP-D, BPI, TSP, CA15-3, CDBB, CKMB, CKMM, FABP2, GFAP, NSE, CD5, CD-16b, CD20, CD177, CD26, CD27, CD40, CD45, Flt-3L, G-CSF, KFG, EPO, TPO, GM-CSF o SDF-1a.

En algunas realizaciones, un oligoelemento divulgado en el presente documento es un regulador de uno o más factores (por ejemplo, factores de transcripción) implicados en la reparación del daño tisular y/o en la regeneración tisular. Los factores regulados por el cobre incluyen, pero sin limitación: proteínas de la homeostasis del Cu, tales como Ctr 1, Ctr 3, DMT1, Atox 1, ATP7A/7B, Cox 17, Cc S, Sco 1/2, Cox 11, receptores glutamatérgicos de N-metil D-aspartato (NMDAR), proteína precursora de amiloide (PPA), dominio MURR1 del gen del metabolismo del cobre (Co Mm D1), inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X (XIAP), homocisteína (Hcy), subunidad II de la citocromo c oxidasa (COX II), subunidad I de la citocromo c oxidasa (COX I), FGF-1, VEGF, angiopoyetina (tal como ANG1 o ANG2), fibronectina, colagenasa, MMP-TIMP, elastina, PDGF y eNOS; proteínas de unión a Cu intracelular, tales como la citocromo C oxidasa (CCO), superóxido dismutasa (SOD), metalotioneína (MT), glutatión (GSH), dopamina-pmonooxigenasa (DBH), peptidilglicina-a-amidación monooxigenasa (PAM), tirosinasa, fenilalanina hidroxilasa, diamina oxidasa, hefestina y glucoproteína de matriz de cartílago; proteínas de unión a Cu extracelulares, tales como ceruloplasmina (CP), lisil oxidasa (LOX), albúmina (ALB), transcupreína, amina oxidasa, factores de coagulación sanguínea V y VIII, ferroxidasa II, superóxido dismutasa extracelular y metalotioneína extracelular. Los factores regulados por cobre se divulgan en Zheng etal., Role of copper in regression of cardiac hypertrophy, Pharmacol. Ther. doi:10.1016/j.pharmthera.2014.11.014 (2014). El oligoelemento puede regular la actividad transcripcional de uno o más de HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1, y las redes de señalización reguladas por estos factores de transcripción.

El nivel y/o la actividad de uno o más factores regulados por un oligoelemento divulgado en el presente documento puede analizarse en un individuo después del tratamiento con una composición terapéutica o preventiva divulgada en el presente documento. El nivel y/o actividad de uno o más de HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1 puede determinarse y, a continuación, correlacionarse con una respuesta del individuo a la composición terapéutica o preventiva. La respuesta puede detectarse mediante la medición de marcadores celulares de la homeostasis tisular normal y/o del daño tisular persistente (por ejemplo, mediante inmunohistoquímica o medición de los niveles de ADN y transcripción), medición de la zona del daño o el volumen del daño, o evaluación de cualquier indicador clínicamente relevante. Por lo tanto, el nivel y/o la actividad de uno o más factores regulados por un oligoelemento (tal como HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1) pueden utilizarse como un biomarcador del criterio de valoración de la respuesta de un individuo a un régimen terapéutico o preventivo divulgado en el presente documento.

En algunas realizaciones, se pueden utilizar uno o más factores regulados por un oligoelemento divulgado en el presente documento para analizar y predecir una respuesta a una composición o tratamiento o método preventivo divulgado en el presente documento. Por ejemplo, el nivel y/o actividad de uno o más de HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1 pueden indicar una probabilidad de que un individuo responderá de manera positiva a un tratamiento o composición preventiva divulgada en el presente documento, el tratamiento o la composición preventiva se pueden administrar al individuo. Por el contrario, si el nivel y/o la actividad de uno o más de HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1 indican que es probable que un individuo no responda o responda de manera negativa al tratamiento o composición preventiva, se puede prescribir un ciclo alternativo de tratamiento. Una respuesta negativa puede definirse como la ausencia de una respuesta eficaz o la presencia de efectos secundarios tóxicos. La respuesta a un tratamiento terapéutico o preventivo se puede predecir en un estudio de antecedentes en el que se genotipifican sujetos de cualquiera de las siguientes poblaciones: una población que responde de manera favorable a un régimen de tratamiento, una población que no responde de manera significativa a un régimen de tratamiento y una población que responde de manera negativa a un régimen de tratamiento (por ejemplo, presenta uno o más efectos secundarios). Estas poblaciones se proporcionan como ejemplos y se pueden analizar otras poblaciones y subpoblaciones. Según los resultados de estos análisis, se genotipa un sujeto para predecir si responderá de manera favorable a un régimen de tratamiento, no responderá de manera significativa a un régimen de tratamiento o responderá de manera negativa a un régimen de tratamiento. Por lo tanto, el nivel y/o actividad de uno o más de HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1 pueden utilizarse como indicadores de respuesta de un individuo a un régimen terapéutico o preventivo divulgado en el presente documento. Los indicadores de respuesta se pueden evaluar antes, durante y/o después de la administración del régimen terapéutico o preventivo. Por ejemplo, se pueden evaluar uno o más indicadores de respuesta durante los intervalos entre dosis de una administración continua, para evaluar si es probable que el sujeto se beneficie del tratamiento continuo o si se necesita un tratamiento alternativo.

Las pruebas de pronóstico descritas en el presente documento también son aplicables a los ensayos clínicos. Uno o más indicadores de respuesta (tales como HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS y COMMD1) pueden identificarse utilizando los métodos descritos en el presente documento. Después de eso, los posibles participantes en ensayos clínicos de una composición de oligoelementos se pueden evaluar para identificar a aquellos individuos con más probabilidades de responder de manera favorable a la composición y excluir a aquellos que probablemente experimenten efectos secundarios. De esa manera, la eficacia del tratamiento puede medirse en individuos que responden de manera positiva a la composición de oligoelementos, sin reducir la medición como resultado de la inclusión de individuos que probablemente no responderán de manera positiva en el estudio y sin correr el riesgo de problemas de seguridad indeseables.

En algunas realizaciones, las células madre o el inductor de células madre se administran por vía sistémica. En algunas realizaciones, las células madre o el inductor de células madre se administran localmente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, las células madre o el inductor de células madre se administran localmente en un lugar diferente al lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, las células madre (o inductor de las células madre) y el oligoelemento se administran de manera simultánea. En algunas realizaciones, una célula madre divulgada en el presente documento (o inductor de las células madre) y el oligoelemento se administran de manera secuencial en cualquier orden adecuado.

En realizaciones específicas, las células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) se administran con otras células madre (tales como células madre que no son BMSC), mioblastos, miocitos, cardiomioblastos, cardiomiocitos o progenitores de mioblastos, miocitos, cardiomioblastos y/o cardiomiocitos.

Una vez que las células madre (o inductor de células madre) y los oligoelementos descritos en el presente documento se administran a un mamífero (por ejemplo, un ser humano), la presencia y/o la actividad biológica de las células puede controlarse mediante cualquiera de varios métodos conocidos. En otras realizaciones, las células migran in vivo a partir de un tejido de un sujeto, y se controla y/o regula la presencia y/o la actividad biológica de las células en ruta hacia un lugar de daño tisular.

En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra directamente al lugar de la lesión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la reparación tisular (o mejorar la función del tejido) en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende: a) administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión y b) administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) o un inductor de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC). En algunas realizaciones, la célula madre divulgada en el presente documento es una célula madre mesenquimatosa (MSC), una célula madre multipotente o una célula madre procedente de tejido. La célula madre procedente de tejido puede ser una célula madre procedente de tejido adiposo, una célula madre procedente de tejido cardíaco o una célula madre procedente de tejido del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el inductor de células madre es un inductor de células madre mesenquimatosas (MSC), células madre mesenquimatosas de la médula ósea (BMSC), células madre multipotentes o células madre procedentes de tejidos, incluidas, pero sin limitación, células madre procedentes del tejido adiposo, células madre procedentes del tejido cardíaco y células madre procedentes del tejido del cordón umbilical. En otras realizaciones, el inductor de células madre es un inductor de una célula madre adulta. La célula madre adulta puede ser una célula madre hematopoyética, una célula madre mamaria, una célula madre intestinal, una célula madre mesenquimatosa en la placenta, tejido adiposo, pulmón, médula ósea, sangre, gelatina de Wharton del cordón umbilical o dientes (tal como el nicho perivascular de la pulpa dental y el ligamento periodontal), una célula madre endotelial, una célula madre neural, una célula madre olfativa adulta, una célula madre de la cresta neural o una célula madre de la línea germinal (por ejemplo, una célula madre en el testículo). En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como las MSC, por ejemplo, BMSC). En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inductor de células madre mesenquimatosas de la médula ósea. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la reparación tisular (o mejorar la función del tejido) en un individuo que tiene una lesión tisular y se administra con células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC), que comprende administrar una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) al lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión, en donde las células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) se administran al individuo. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) en el lugar de la lesión en un individuo que tiene una lesión tisular, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un oligoelemento directamente en el lugar de la lesión, en donde las células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) se administran al individuo. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inductor de células madre mesenquimatosas de la médula ósea. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón.

Si bien los métodos descritos en el presente documento son en general aplicables a todos los aspectos de la reparación de tejidos, debe entenderse que los métodos de terapia de combinación se pueden utilizar con el propósito de uno cualquiera o más de los siguientes: inducir la migración de células madre mesenquimatosas de la médula ósea al lugar de la lesión, inducir la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración de tejidos, revertir el daño en el lugar de la lesión y reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión.

Asimismo, mientras que los métodos descritos en el presente documento se centran en la terapia de combinación, debe entenderse que las discusiones sobre la reparación de tejidos son igualmente aplicables a otras secciones en la presente solicitud (por ejemplo, las secciones inmediatamente a continuación).

Métodos para tratar a un individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido

En el presente documento se describe un método para inducir la reparación tisular (o mejorar la función del tejido) en un individuo que tiene un sistema de reparación tisular comprometido, que comprende administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, el individuo tiene más de aproximadamente 30 años, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85 o aproximadamente 90 años. En otras realizaciones, el individuo es más joven de aproximadamente 30 años de edad. En algunas realizaciones, el individuo tiene al menos aproximadamente 60 años (incluyendo, por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de 65, 70, 75, 80, 85, 90 o más). En algunas realizaciones, el individuo tiene una lesión tisular crónica, es decir, ha tenido una lesión tisular durante al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 o 24 meses. En algunas realizaciones, el individuo tiene deficiencia de células madre. En algunas realizaciones, el individuo tiene un sistema de reparación de tejidos defectuoso. En algunas realizaciones, el individuo tiene dos o más de las características descritas anteriormente. El individuo puede padecer uno o más de los siguientes síntomas o afecciones: pérdida de memoria, capacidad locomotora baja o reducida (incluida, pero sin limitación, capacidad de fuerza, resistencia a la velocidad, flexibilidad y movilidad articular), hipoestesia, debilidad muscular, pérdida de audición y tensión crónica.

Cuando se lesiona un sistema biológico, se activa un conjunto de sistema de autorreparación. Los diferentes órganos poseen una capacidad de autorreparación diferente: el hígado y los músculos desencadenan una mejor reparación que el corazón y el sistema nervioso; los más jóvenes se reparan mejor que los mayores. Pero todos los tejidos biológicos poseen el sistema de autorreparación. Véanse, por ejemplo, Kikuchi et al., Annu Rev Cell Dev Biol, 2012, 28:719-41; Garrett et al., J Hand Surg Am, 1984, 9(5):683-92; Porrello et al., Science, 2011, 331(6020): 1078-80; Lin et al., PNAS, 2010, 107(9):4194-9; Greco et al., Cell Stem Cell, 2009, 4(2): 155-69; Kajstura et al., Circulation, 2012, 126(15): 1869-81; Haubner et al., 2012, 4(12):966-77; J Neurol Sci, 1988, 87(1):67-74; y Friedewald et al., Am J Cardiol, 2012, 110(6):807-16. Uno de los componentes más importantes es la migración de células madre. La migración de células madre es la migración orientada a los tejidos diana y la supervivencia de las células madre endógenas o exógenas en circunstancias complejas pero organizadas. La migración es vital para que las células madre protejan los tejidos lesionados.

En un período corto de isquemia cardíaca, los tejidos lesionados inician la migración de varios tipos de células madre (incluidas las células madre mesenquimatosas de la médula ósea, BMSC). Las células madre reparan y protegen los tejidos después de su migración. Se toma como ejemplo las BMSC, las BMSC migradas podrían proliferar y diferenciarse en miocardio o reparar a las lesionadas mediante paracrina. Algunos casos han demostrado que, el bloqueo de la migración de las células madre disminuyó la protección del pretratamiento del corazón. Cai et al., Cardiovasc Res, 2008, 77(3): 463-70. Comparado con los heridos agudos, los tejidos con enfermedades crónicas necesitan la capacidad de reparación con mayor urgencia. Sin embargo, su capacidad de autorreparación se reduce o incluso se pierde. Como la isquemia cardíaca, la isquemia crónica da como resultado un infarto de miocardio. Tanto la función cardíaca como el suministro de sangre disminuyen constantemente, conduciendo al deterioro de la enfermedad y finalmente a la insuficiencia cardíaca. La progresión de la enfermedad se acompaña de la degeneración de las estructuras tisulares y de las funciones fisiológicas. Es obvio que los corazones isquémicos crónicos requieren reparación estructural y funcional. No obstante, con el alargamiento de la isquemia, la migración espontánea de las células madre disminuye y el corazón pierde su capacidad de autorreparación.

Salida de cobre del corazón cuando el corazón está en isquemia. Chevion et al., PNAS, 1993, 90(3): 1102-6; Jiang et al., J. Exp. Med., 2007, 204(3):657-6. El cobre inhibe el FIH-1 (factor inhibidor de HIF-1) dentro del núcleo, por lo tanto, es indispensable para la actividad transcripcional del HIF-1. Cuando falta el cobre, e1HIF-1 no puede formar complejos de transcripción funcionales, perdiendo la capacidad de iniciar la expresión de genes regulados por e1HIF-1, tales como la quimiocina SDF-1 relacionada con la migración. Feng et al., Mol Pharmacol, 2009, 75(1):174-82; Xie et al., Curr Med Chem, 2009, 16(10):1304-14; Ceradini et al., Nat Med, 2004, 10(8):858-64; Ceradini et al., Trends Cardiovasc Med, 2005, 15(2):57-63. La presente divulgación conecta la migración de las células madre con la salida del cobre, mostrando que la disminución de la migración de células madre se debe a la salida de cobre durante la isquemia cardíaca crónica. La reposición de cobre puede revertir la insuficiencia cardíaca. Jiang et al., J. Exp. Med., 2007, 204(3):657-6; Zhou et al., J Mol Cell Cardiol, 2008, 45(1):106-17. El complemento de cobre al corazón puede traer de vuelta a las células madre al corazón isquémico, ya que el cobre eleva la actividad de1HIF-1 y, por lo tanto, promueve la expresión de SDF-1.

Para dirigir el complemento de cobre a un tejido lesionado, pueden diseñarse y utilizarse microburbujas de Cu y albúmina. Después de localizarse e irradiarlo con ultrasonido, el cobre podría liberarse de la burbuja a la zona diana del corazón, aumentando la concentración de cobre en la región isquémica. Como se muestra en la presente divulgación, el tratamiento del corazón con microburbujas de Cu y albúmina puede aliviar los síntomas provocados por la isquemia cardíaca crónica (Figura 1): el tamaño del infarto se redujo (Figura 1A, Figura 1B), la FE (fracción de expulsión) aumentó (Figura 1C) y la densidad vascular también se elevó (Figura 1D).

Los métodos para evaluar la reparación tisular se describen en la sección anterior y no se repiten únicamente por brevedad.

Cualquiera de los métodos o métodos de terapia combinada descritos en la sección anterior son en general aplicables a un individuo que tiene un sistema de reparación de tejido comprometido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la reparación tisular en un individuo que tiene una lesión de tejido y que tiene un sistema de reparación de tejido comprometido, que comprende: a) administrar en el lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento y b) administrar al individuo una cantidad eficaz de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la migración de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) a un lugar de lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión en el tejido y que tiene un sistema de reparación de tejido comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre (tales como MSC, por ejemplo, BMSC) o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células madre en el lugar de la lesión, inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión y que tiene un sistema de reparación tisular comprometido, en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular y que tiene un sistema de reparación tisular comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre tales como BMSC o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular y que tiene un sistema de reparación tisular comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre tales como BMSC o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración tisular en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular y que tiene un sistema de reparación tisular comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre tales como BMSC o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante el estallido dirigido al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para revertir el daño en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión en el tejido y que tiene un sistema de reparación de tejido comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre tales como BMSC o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y neurosecretoras en el lugar de la lesión en un tejido de un individuo que tiene una lesión tisular y que tiene un sistema de reparación tisular comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre tales como BMSC o un inductor de células madre. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir al menos dos (que incluyen, por ejemplo, al menos cualquiera de 3, 4, 5, 6 o más) acontecimientos de reparación tisular en un individuo que tiene una lesión de tejido y que tiene un sistema de reparación de tejido comprometido, que comprende administrar al lugar de la lesión una cantidad eficaz de un oligoelemento, opcionalmente en combinación con la administración de una cantidad eficaz de células madre tales como BMSC o un inductor de células madre, en donde los al menos dos acontecimientos de reparación tisular se seleccionan del grupo que consiste en: inducir la migración de las células madre al lugar de la lesión, inducir la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión, inducir la regeneración tisular en el lugar de la lesión, inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración de tejidos, revertir el daño en el lugar de la lesión y reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante el estallido dirigido al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento y/o un complejo del mismo se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (como CuSO4 o CuCh). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

Métodos de prevención y uso profiláctico

También se proporcionan en el presente documento métodos para prevenir lesiones tisulares en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un oligoelemento. En algunas realizaciones, el tejido es corazón, hígado, cerebro, pulmón, riñón, piel, tubo digestivo, órganos reproductivos, hueso o músculo esquelético. En algunas realizaciones, el tejido es corazón. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de una microburbuja. En algunas realizaciones, la microburbuja que comprende el oligoelemento se administra por vía intravenosa, y el oligoelemento se libera mediante la explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el estallido de la microburbuja dirigido al lugar es mediante ultrasonido. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante la administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en cobre, hierro, zinc y selenio. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (tal como CuSO4). En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un complejo con una molécula que se une al oligoelemento. En algunas realizaciones, el oligoelemento no forma complejo con ninguna molécula que se une al oligoelemento.

También se proporcionan en el presente documento métodos para prevenir una lesión tisular en un individuo mediante la inyección directa de un oligoelemento en el lugar donde se debe prevenir la lesión tisular.

"Que previene", como se usa en el presente documento, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad. En algunas realizaciones, las células y composiciones proporcionadas se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para frenar la progresión de una enfermedad tal como una lesión tisular.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada o la vía de administración depende del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, la intensidad y la evolución de la enfermedad, de si las células se administran con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, los antecedentes del sujeto y la respuesta a las composiciones y/o las células, y el juicio del médico tratante. En algunas realizaciones, las composiciones de oligoelementos y las células se administran de manera adecuada al sujeto de una vez o durante una serie de tratamientos.

El daño tisular puede provocarse por el agotamiento de las células potencialmente mitóticas (por ejemplo, el agotamiento de las células madre), lesión vascular que provoca hipoxia y otros efectos, respuestas normales de reparación del hospedador, incluida la inducción de genes tempranos inmediatos tales como Jun y EGR1, inducción de citocinas proinflamatorias tales como interleucinas y TNF, inducción de citocinas inflamatorias tales como TGFp, PDGF, BFGF e inducción de cascada(s) de citocinas secundarias, efectos de las respuestas inflamatorias y/o interacciones entre múltiples tipos de células, tales como células inflamatorias, células funcionales estromales y fibroblastos. Puede ocurrir daño al tejido normal como consecuencia de la exposición a agentes citotóxicos, tales como radiación y quimioterápicos. La radiación puede ser una exposición accidental, ambiental, ocupacional, diagnóstica y terapéutica a la radiación. El daño tisular también es un efecto secundario común del tratamiento del cáncer, tal como la radioterapia, la quimioterapia y una combinación de radioterapia y quimioterapia. En el presente documento se describen composiciones y métodos para tratar y prevenir el daño tisular. En algunas realizaciones, las composiciones de oligoelementos y/o las células divulgadas en el presente documento se administran antes de, durante y/o después de un tratamiento que causará o probablemente causará daño tisular en un sujeto, y la administración previene o reduce el daño tisular asociado con el tratamiento, tal como radioterapia y quimioterapia contra el cáncer.

Una composición o método divulgado en el presente documento puede prevenir un daño tisular o reducir la zona, volumen o duración de un daño tisular, mediante la inducción de la migración (por ejemplo, localización) de una célula madre al lugar del tejido, incluso después de que el tejido del individuo haya perdido de otro modo la capacidad consiguiente de reclutar células madre de manera espontánea. La administración de una composición y/o célula de la presente divulgación puede desencadenar una serie de otros acontecimientos que conducen a una mayor resistencia al daño tisular, incluyendo, por ejemplo, inducir la diferenciación de las células madre en el lugar del tejido, inducir la regeneración del tejido en el lugar del tejido, inducir una molécula de señalización que desencadena la regeneración de tejidos, revertir el daño en el lugar de una lesión inicial antes de que se produzca un daño adicional y/o reconstruir el microambiente de las células neurofibrilares y las células neurosecretoras en el lugar del tejido.

Por ejemplo, la isquemia o el infarto de miocardio pueden provocar una pérdida irreversible del tejido cardíaco funcional con un posible deterioro de la función de la bomba y la muerte. La oclusión de un vaso coronario conduce a la interrupción del suministro de sangre del sistema capilar dependiente. Sin nutrición y sin oxígeno, los cardiomiocitos mueren y sufren necrosis. Se produce una inflamación del tejido circundante con invasión de células inflamatorias y fagocitosis de restos celulares. Se produce una cicatrización fibrótica y se pierde la contribución anterior de esta parte del corazón a la fuerza contráctil. Sin intervención, la única forma que tiene el músculo cardíaco de compensar la pérdida de tejido es la hipertrofia de los cardiomiocitos restantes (acumulación de proteína celular y elementos contráctiles dentro de la célula). Los agentes endocrinos, metabólicos (alcohol) o infecciosos (miocarditis vírica) y los agentes para el tratamiento del cáncer también conducen a la muerte celular, con la consiguiente reducción de la función miocárdica. Una composición o método divulgado en el presente documento puede prevenir el daño del tejido cardíaco o reducir la zona, volumen o duración del daño al tejido cardíaco. La composición de oligoelementos divulgada en el presente documento puede inducir la migración (por ejemplo, localización) y/o la retención de células madre mesenquimatosas (por ejemplo, BMSC) en el tejido cardíaco. En casos de isquemia o infarto de miocardio, el músculo cardíaco puede compensar la pérdida de tejido mediante la diferenciación de las células madre en cardiomiocitos, evitando o reduciendo así la hipertrofia cardíaca y el daño adicional del tejido cardíaco.

Administración de oligoelementos

"Oligoelemento" utilizado en el presente documento se refiere a un elemento químico que se encuentra en pequeñas cantidades en las plantas, animales y/o la tierra y que se utiliza por organismos, incluyendo plantas y animales, y es esencial, o beneficioso, para su fisiología. "Oligoelementos metálicos", "oligoelementos" y "oligocompuestos" se utilizan indistintamente. Aunque en muchos casos, el oligoelemento de interés estará presente como un ion complejo, incluye las diversas especies de iones que resultan de la introducción del oligoelemento en una célula, tejido u organismo de acuerdo con la presente divulgación. Cada uno de estos términos incluye los productos de reacción resultantes de su uso en una célula, tejido u organismo de acuerdo con la presente divulgación. Los oligoelementos adecuados incluyen, pero sin limitación, B, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Mg, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Br, Al, Si, P, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Rb, Ce, Ag, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Sb, F, Te, Au, Pt, Bi, Ir, Os, Re, W, Ta y Hf. En algunas realizaciones, el oligoelemento se selecciona del grupo que consiste en Al, Cd, Rb, Zr, Co, Sn, Cr, Ni, F, Mn, Mg, Mo, Ge, V, Br, I, Ba, Ag, Ti, Se, Cu y Zn. En algunas realizaciones, el oligoelemento es el cobre (por ejemplo, en forma de CuSO4 o CuCb). En algunas realizaciones, el oligoelemento está en forma de sal. En otras realizaciones, el oligoelemento forma un compuesto o complejo con una proteína, péptido, aminoácido, o mono-, di- o polisacárido. En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un compuesto o complejo con uno o más polímeros. En otras realizaciones, el oligoelemento está en un compuesto organometálico, tal como un compuesto organometálico de molécula pequeña. En una realización, un oligoelemento divulgado en el presente documento regula la actividad transcripcional del HIF-1. Un oligoelemento, tal como el cobre, puede ser un inductor de la actividad transcripcional del HIF-1. Un inductor de la actividad transcripcional del HIF-1 divulgado en el presente documento puede comprender uno o más elementos metálicos que incluyen un oligoelemento.

En algunas realizaciones, el oligoelemento se puede administrar a través de microburbujas. El uso de agentes de contraste de ultrasonidos que sirven también como vehículos de fármacos se ha descrito para liposomas llenos de gas en la patente de EE. UU. 5.580.575. Se administra una cantidad de liposomas que contienen fármaco en el sistema circulatorio de un paciente y se controla con energía ultrasónica a niveles de diagnóstico hasta que se detecta la presencia de los liposomas en la región de interés. A continuación, se aplica energía ultrasónica a la región que es suficiente para romper los liposomas y liberar los fármacos de manera local con fines terapéuticos. La energía ultrasónica se describe en la patente de EE. UU. 5.558.082 para ser aplicada por un transductor que aplica de manera simultánea ondas ultrasónicas de diagnóstico y terapéuticas desde elementos transductores terapéuticos ubicados centralmente a los elementos transductores de diagnóstico.

El uso de microcápsulas llenas de gas (o microburbujas como se usa en el presente documento) para controlar la administración de fármacos a una región del cuerpo también se ha descrito en la patente de EE. UU. 5.190.766 en la que la frecuencia de resonancia acústica del vehículo de fármacos se mide en la región en cuál se va a liberar el fármaco y después la región se irradia con la onda de sonido adecuada para controlar la liberación del fármaco. Se describen transductores de ultrasonido separados para la formación de imágenes y la activación de la liberación de fármacos en la región diana. El documento CN 102302507 B divulga composiciones para la liberación controlada direccional de oligoelementos y un método de preparación y aplicación, incluyendo composiciones que comprenden microburbujas.

Las microburbujas ilustrativas utilizadas en el presente documento incluyen, por ejemplo, microburbujas estabilizadas, albúmina sonicada, microesferas llenas de gas, liposomas llenos de gas y emulsiones formadoras de gas. Se han desarrollado una variedad de métodos para su fabricación. Estos métodos generalmente implican secado por aspersión, emulsión o técnicas de polimerización interfacial. Normalmente, el resultado es una población de microburbujas que tiene un intervalo de diámetros con un espesor de pared fijo o variable de manera arbitraria. Un agente de contraste ultrasónico producido por una metodología, por ejemplo, puede contener microburbujas donde cada una tiene una pared de carcasa del mismo grosor, independientemente de su diámetro. De manera alternativa, un método de producción diferente puede dar como resultado una población de microburbujas con un grosor de pared que varíe incluso entre las microburbujas que tienen el mismo diámetro. Las microburbujas se pueden preparar mediante cualquiera de los siguientes métodos farmacéuticos: vibración acústica por ultrasonidos, liofilización, método de secado por aspersión, polimerización radical "viva"/controlada, polimerización por precipitación, polimerización en suspensión, polimerización en emulsión, polimerización de semillas, polimerización por dispersión y polimerización por precipitación, sistema de polimerización heterogéneo, reticulación de iones, gel emulsionado de iones, precipitación de iones y reticulación química, reticulación química en emulsión, emulsificación junto con reticulación duplicada, reticulación térmica, coacervación, emulsificación-evaporación del disolvente, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la microburbuja divulgada en el presente documento es un vehículo para agentes terapéuticos y se carga de manera interna con un fármaco. Las microburbujas se inyectan después por vía intravenosa y se dejan circular de manera sistémica. Se aplica una señal de ultrasonido de energía suficiente para romper las microburbujas que contienen el fármaco en una región donde se desea la administración del fármaco. El haz insonante destruye las microburbujas y, por lo tanto, libera su carga útil.

En algunas realizaciones, la microburbuja divulgada en el presente documento tiene una fragilidad controlada, es decir, es rompible solo cuando se expone a una energía acústica igual o superior a una intensidad predeterminada. Es decir, por debajo de este umbral de intensidad acústica, sustancialmente todas las microburbujas permanecen inalteradas mientras que por encima del umbral de intensidad acústica las microburbujas se rompen. Mientras está en el estado inalterado, los agentes de burbujas aún se pueden ver por ultrasonidos en la reserva de sangre más grande para que el ecografista pueda colocar y enfocar el transductor del escáner en la región de interés antes de aumentar la intensidad del ultrasonido para iniciar la ruptura del agente y la administración simultánea del fármaco. Por lo tanto, el agente se puede encender o apagar mediante el control de la intensidad de la señal insonante.

En una realización, se puede producir una microburbuja mediante un proceso de evaporación del disolvente en emulsión. En primer lugar, se preparan dos soluciones. Una es una solución acuosa que contiene un material tensioactivo adecuado que puede ser un biopolímero anfifílico tal como gelatina, colágeno, albúmina o globulinas. Pueden incluirse adicionalmente potenciadores de la viscosidad. Esta se convierte en la fase continua externa del sistema de emulsión. La segunda se hace a partir de la disolución de un polímero formador de paredes en una mezcla de dos líquidos orgánicos inmiscibles en agua. Uno de los líquidos orgánicos es un disolvente relativamente volátil para el polímero y el otro es un no disolvente relativamente no volátil para el polímero. El no disolvente relativamente no volátil es normalmente un hidrocarburo C6-C20 tal como decano, undecano, ciclohexano, ciclooctano y similares. El disolvente relativamente volátil es normalmente un éster C5-C7 tal como acetato de isopropilo. Otros disolventes poliméricos, cloruro de metileno por ejemplo, pueden utilizarse siempre que sean miscibles con el no disolvente adjunto. Normalmente, se añaden aproximadamente tres partes de la solución de polímero orgánico que tiene una concentración de aproximadamente el 0,5 al 10 por ciento del polímero a una parte de la solución acuosa de biomaterial que tiene una concentración de aproximadamente el 1 al 20 por ciento del biomaterial. El polímero formador de paredes puede seleccionarse por su módulo de elasticidad y alargamiento que definen las propiedades mecánicas del polímero. Los polímeros preferidos útiles en la fabricación de agentes de contraste de ultrasonidos de microburbujas portadoras de fármacos serían polímeros biodegradables tales como alcohol polivinílico (PVA), policaprolactona, ácido poliláctico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, copolímeros de lactidas y lactonas tales como £-caprolactona, 8 valerolactona, poliamidas, polihidroxibutiratos, polidioxanonas, poli-p aminocetonas, polianhídridos, poli(orto)ésteres y poliaminoácidos, tales como ácidos poliglutámico y poliaspártico o ésteres de los mismos, y cualquier combinación adecuada de los mismos. La solución de polímero (fase orgánica interna) se añade a la solución acuosa (fase externa) con agitación para formar una emulsión. Se puede utilizar una variedad de dispositivos para producir la emulsión, por ejemplo, molinos coloidales, homogeneizadores de rotor y estator, homogeneizadores de alta presión y homogeneizadores de sonicación. La etapa de emulsificación se lleva a cabo hasta que las gotitas de la fase interna se encuentran en el espectro de tamaño deseado. Es este tamaño de gota el que determinará el tamaño de la microburbuja.

Se podría incorporar un oligoelemento (por ejemplo, cobre) al agente de microburbujas mediante varias técnicas. En un método, por ejemplo, el fármaco se disuelve o se incorpora de otro modo a la solución de polímero orgánico durante la fabricación de las microburbujas. De manera alternativa, el fármaco puede incorporarse a las microburbujas a través de una serie de etapas secundarias en las que el producto terminado se reconstituye con una solución que contiene el fármaco, las microburbujas suspendidas se inundan con la solución que contiene el fármaco y el resultado se seca, normalmente mediante liofilización. Finalmente, el fármaco puede fijarse por medios químicos a la superficie de la microburbuja. Los métodos de incorporación preferidos producen una microburbuja portadora de fármacos que, al romperse con la insonación, permite la fácil disolución del agente activo en la sangre u otros líquidos corporales según se requiera. También pueden ser útiles aquellos métodos que incorporan el fármaco en la estructura de la pared de la microburbuja o proporcionan unión a la superficie. En este caso, se prevé que las propiedades mecánicas de la pared serán tales que la ruptura de las microburbujas darán como resultado fragmentos de pared ultrapequeños que después llevarán el fármaco al lugar local. Se pueden encontrar divulgaciones adicionales con respecto a la administración de fármacos activada por ultrasonidos utilizando microburbujas huecas en la patente de EE. UU. 6.896.659.

En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra a través de nanopartículas basadas en péptidos que comprenden cobre. En algunas realizaciones, una nanopartícula basada en péptidos divulgada en el presente documento comprende péptidos autoensamblados (por ejemplo, dipéptidos aromáticos). Los péptidos se ensamblan en nanopartículas, tales como nanopartículas de hidrogel, que se puede utilizar de manera eficaz, por ejemplo, como vehículos para la administración de agentes bioactivos para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Las sustancias bioactivas hidrófilas e hidrófobas, las pequeñas moléculas de fármacos, los agentes de formación de imágenes tales como nanopartículas magnéticas o de oro, así como biomoléculas de alto peso molecular tales como péptidos, proteínas, ARNip y ADN, se pueden administrar a través de nanopartículas basadas en péptidos de acuerdo con la presente divulgación. Las nanopartículas se pueden modificar con una molécula biológica o sintética para mejorar la estabilidad, la eficiencia y/o la biodisponibilidad. En determinadas realizaciones, el diámetro medio de las nanopartículas varía de 10 nm a 1000 nm, o de 10 nm a 500 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula comprende una ultraestructura con focalización mejorada y estabilidad prolongada in vivo y/u otras funcionalidades. Se pueden encontrar divulgaciones adicionales de nanopartículas basadas en péptidos en el documento WO 2014132262 A1.

Un vehículo (tal como nanopartículas) que contiene un oligoelemento puede ser dirigido (por ejemplo, interacciones químicas específicas tales como la unión antígeno y anticuerpo, etc.) o entregado en el lugar de la lesión. El tratamiento del tejido puede lograrse mediante administración no dirigida, por ejemplo, mediante el baño del tejido en un material de nanopartículas, con una pipeta o micropipeta para aplicar un material de nanopartículas al tejido, la inyección de un material de nanopartículas en el tejido, el pintado de un material de nanopartículas sobre tejidos, o la combinación de nanopartículas con otros ingredientes tales como uno o más polímeros y/o una o más proteínas o combinaciones de las mismas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, albúmina, fibrinógeno, colágeno, elastina, fibronectina, laminina, quitosano, factor de crecimiento de fibroblastos básico o factor de crecimiento de células endoteliales vasculares, factor de crecimiento procedente de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico o factor de crecimiento similar a la insulina. Puede utilizarse una o más de otras entidades o fracciones químicas junto con las nanopartículas que contienen un oligoelemento. Estas especies pueden tener una utilidad terapéutica o diagnóstica complementaria o adicional. Las nanopartículas pueden unirse de manera química a estos otros componentes o pueden administrarse como una simple mezcla con ellos. Por ejemplo, las nanopartículas pueden unirse al anticuerpo. El método de reparación puede implicar solo un tipo de nanopartícula o puede implicar más de un tipo de nanopartícula. Las nanopartículas pueden contener uno o más oligoelementos.

El direccionamiento o la administración pasiva se puede realizar mediante un efecto físico que induce la liberación o administración en el lugar de la lesión a través de una nanopartícula (o microesfera). Por ejemplo, las microesferas magnéticas de albúmina se pueden sintetizar envolviendo tanto los oligoelementos como la sustancia magnética en microesferas cubiertas de albúmina. Después de inyectarse en el cuerpo, las microesferas magnéticas de albúmina se pueden guiar al lugar de la lesión mediante fuerzas externas del campo magnético. Se puede lograr la liberación sostenida dirigida de oligoelementos para aumentar el efecto terapéutico y evitar efectos secundarios tóxicos. El direccionamiento o la administración positivos pueden realizarse mediante vehículos de síntesis con capacidad de reconocimiento automático de células de tejidos u órganos diana. Por ejemplo, la reacción de antígeno y anticuerpo medió el reconocimiento automático de microesferas de albúmina. Dicha superficie de microesferas se puede equipar con un anticuerpo o polipéptido específico, que tiene la capacidad de unirse con determinadas células para la administración de los oligoelementos. Además de la microesfera, los liposomas y las nanopartículas mediadas por la administración pasiva de la diana, y la estructura de polipéptidos o receptores inducidos por la administración positiva de la diana también se pueden utilizar para transportar oligoelementos para alcanzar la concentración eficaz. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra mediante administración directa del oligoelemento en el lugar de la lesión. Otros métodos adecuados incluyen métodos de administración in vitro, ex vivo o in vivo. Una composición de oligoelementos divulgada en el presente documento puede administrarse por vía oral en el lugar de una lesión tisular. En algunas realizaciones, un oligoelemento o un compuesto que contiene el oligoelemento (por ejemplo, un ion de cobre, un átomo de cobre o cobre quelado) se absorbe a través de la vía digestiva. El oligoelemento absorbido puede dirigirse (mediante el direccionamiento activo o pasivo) al lugar de la lesión y se libera localmente en el lugar de la lesión para proporcionar una concentración local eficaz del oligoelemento para la reparación tisular. En algunas realizaciones, el oligoelemento administrado por vía oral forma un compuesto o complejo con una proteína, péptido, aminoácido, o mono-, di- o polisacárido. En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un compuesto o complejo con uno o más polímeros. En otras realizaciones, el oligoelemento está en un compuesto organometálico, tal como un compuesto organometálico de molécula pequeña.

En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra en el lugar de la lesión mediante el uso de un implante recubierto, endoprótesis, placa o implante impregnado con el oligoelemento. En una realización, el oligoelemento se administra en el lugar de la lesión mediante la liberación lenta del oligoelemento de una endoprótesis vascular unida al oligoelemento. En otras realizaciones, el oligoelemento se administra en el lugar de la lesión mediante un liposoma de direccionamiento positivo o un complejo de donante y aceptor. El oligoelemento se puede administrar en el lugar de la lesión utilizando fisioterapéuticos, ultrasonidos, iontoforesis, mejora de la penetración del ultrasonido, electroporación y/o aplicación con esponja. La aplicación de la composición y/o las células en el lugar de la lesión puede ser tópica (por ejemplo, a través de la piel), puede ser en algún lugar del tejido lesionado que está dentro de la superficie del cuerpo, o en ambos. Por ejemplo, el oligoelemento puede administrarse por iontoforesis a través del vaso sanguíneo, una capa de células endoteliales u otros tejidos interiores, en el lugar de la lesión para proporcionar una concentración local eficaz del oligoelemento para la reparación tisular.

En el presente documento se divulga un aplicador para administrar una composición de oligoelementos y/o células divulgadas en el presente documento a un lugar de lesión. El aplicador puede ser cualquier dispositivo adecuado para administrar composiciones de la variedad divulgada en el presente documento. El aplicador puede configurarse para poner en contacto la superficie del cuerpo con una composición mediante pulverización, goteo, pintado, propulsión, brumización, atomización o inyección, o puede configurarse para aplicar la composición y/o las células mediante cualquier combinación de dichos métodos. La aplicación de la composición y/o las células en el lugar de la lesión puede ser tópica, puede estar en algún lugar del tejido lesionado que está dentro de la superficie del cuerpo, o en ambos, y el aplicador puede configurarse en consecuencia. En algunas realizaciones, el aplicador está configurado para administrar una composición que es un líquido en el lugar de la lesión. Las boquillas para goteo, brumización, atomización o pulverización con chorro (por ejemplo, en chorro plano o redondo) de un fluido son bien conocidas en la materia. El aplicador puede configurarse para "pintar" una composición sobre la superficie del cuerpo, por ejemplo, como un pincel, rodillo o bola de rodillo. Los aplicadores para inyectar una composición en el lugar de la lesión incluyen agujas, tales como agujas de nano o microinyección. El aplicador puede configurarse para aplicar una composición mediante iontoforesis, mejora de la penetración del ultrasonido, electroporación, aplicación con esponja o mediante cualquier otro proceso adecuado. Preferentemente, el aplicador está configurado de modo que la administración de la composición en la ubicación del lugar de la lesión sea espacialmente precisa dentro de un margen de error terapéuticamente aceptable.

Una composición de oligoelementos divulgada en el presente documento puede administrarse por vía oral en el lugar de una lesión tisular. En algunas realizaciones, un oligoelemento o un compuesto que contiene el oligoelemento (por ejemplo, un ion de cobre, un átomo de cobre o cobre quelado) se absorbe a través de la vía digestiva. El oligoelemento absorbido puede dirigirse (mediante el direccionamiento activo o el direccionamiento pasivo) a un lugar de lesión para proporcionar una concentración local eficaz del oligoelemento para la reparación tisular. En algunas realizaciones, el oligoelemento administrado por vía oral forma un compuesto o complejo con una proteína, péptido, aminoácido, o mono-, di- o polisacárido. En algunas realizaciones, el oligoelemento forma un compuesto o complejo con uno o más polímeros. En otras realizaciones, el oligoelemento está en un compuesto organometálico, tal como un compuesto organometálico de molécula pequeña.

Cuando se utiliza in vivo para terapia, la composición de oligoelementos y/o las células se administran al sujeto en cantidades eficaces (es decir, cantidades que tienen el efecto terapéutico y/o profiláctico deseado). La dosis y el régimen de dosificación dependerán del grado de lesión en el sujeto, las características de la composición particular de oligoelementos y/o células utilizadas, por ejemplo, su índice terapéutico, el sujeto y los antecedentes del sujeto.

La cantidad eficaz puede determinarse durante los ensayos preclínicos y los ensayos clínicos mediante métodos familiares para médicos y clínicos. Se puede administrar una cantidad eficaz de una composición de oligoelementos y/o células útil en los métodos a un mamífero que lo necesite mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos para administrar compuestos farmacéuticos, ya sea por vía sistémica o por vía local.

Administración de oligoelementos directamente en el lugar de la lesión

Los oligoelementos pueden administrarse directamente en el lugar de la lesión, ya sea mediante inyección directa en el tejido lesionado o mediante un implante recubierto colocado en contacto físico con el lugar de la lesión. Esto permite que el oligoelemento permanezca en el lugar de la administración durante un largo período de tiempo, creando un gradiente del oligoelemento con la concentración más elevada en el lugar de la lesión. Dicho gradiente del oligoelemento permite el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión, facilitando así la regeneración del entorno de los microvasos sanguíneos en el lugar de la lesión y, en consecuencia, la regeneración del tejido. En una realización, un oligoelemento divulgado en el presente documento regula la actividad transcripcional de1HIF-1. Un oligoelemento, tal como el cobre, puede ser un inductor de la actividad transcripcional de1HIF-1. Un inductor de la actividad transcripcional del HIF-1 divulgado en el presente documento puede comprender uno o más elementos metálicos que incluyen un oligoelemento.

En algunas realizaciones, la administración directa de un oligoelemento en el tejido lesionado evita o reduce los efectos secundarios adversos asociados con la administración sistémica. La administración directa en el lugar de la lesión puede evitar la toxicidad sistémica asociada con el fármaco o agente y/o la inducción de respuestas inflamatorias sistémicas tales como una tormenta de citocinas.

En algunas realizaciones, se administra un oligoelemento en el lugar de la lesión mediante el uso de un implante recubierto, endoprótesis, placa o implante impregnado con el oligoelemento. La administración directa en el lugar de la lesión puede comprender la administración localizada en un lugar de tratamiento dentro de un vaso sanguíneo o tejido. Los sistemas de administración adecuados incluyen, pero sin limitación, sistemas de administración de globo doble que tienen globos proximales y distales que se inflan simultáneamente para aislar un espacio de tratamiento dentro de un lumen arterial. En este caso, un catéter se extiende entre los dos globos para administrar localmente un agente terapéutico. Otros sistemas de administración localizados basados en globos incluyen sistemas de globos porosos, globos recubiertos de hidrogel y globos porosos que tienen una endoprótesis metálica interior. Otros sistemas incluyen endoprótesis metálicas recubiertas con fármaco colocadas localmente y endoprótesis de polímero rellenas con fármaco. Wilensky et al., Methods and Devices for Local Drag Delivery in Coronary and Peripheral Arteries, Trend Cardiovasc Med, vol. 3 (1993).

La administración sostenida de un oligoelemento en el lugar de la lesión puede proporcionar cantidades relativamente pequeñas del agente administrado durante un período de tiempo prolongado al tejido lesionado. En una realización, el tratamiento prolongado logra resultados no disponibles con el tratamiento agudo con dosis elevadas del agente, con dosis más pequeñas y menos tóxicas. La administración sostenida de un oligoelemento en el lugar de la lesión puede liberar el agente durante más de aproximadamente 12 horas, aproximadamente un día, aproximadamente dos días, aproximadamente una semana, aproximadamente dos semanas, aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente seis meses, aproximadamente nueve meses, aproximadamente un año, aproximadamente un año y medio o aproximadamente dos años.

En algunas realizaciones, una composición de administración sostenida divulgada en el presente documento incluye inyectables de acción prolongada (por ejemplo, inyecciones a base de aceite, suspensiones inyectables, microesferas inyectables y sistemas inyectables in situ) que contienen un oligoelemento, agentes y polímeros para inyecciones de depósito, inyecciones de depósito disponibles comercialmente y sistemas de administración sostenida inyectables. En determinadas realizaciones, una composición de administración sostenida divulgada en el presente documento comprende una matriz polimérica de la que se libera un agente mediante difusión y/o degradación de la matriz polimérica. Por tanto, el patrón de liberación del agente está determinado principalmente por la matriz polimérica, así como por el porcentaje de carga y el método de fabricación. En algunas realizaciones, las preparaciones de liberación sostenida utilizan un polímero biodegradable. En este caso, las preparaciones de liberación sostenida no requieren la extracción quirúrgica de las preparaciones del sujeto. Normalmente, dichas preparaciones se degradan y absorben lentamente por el cuerpo del paciente y finalmente se eliminan junto con otros productos de desecho metabólicos solubles.

Se puede utilizar un sistema de depósito inyectable polimérico para administrar un implante que se forma in situ que contiene un oligoelemento en el lugar de la lesión. Los sistemas de implantes que se forman in situ suelen estar hechos de productos biodegradables, que se pueden inyectar a través de una jeringa en el cuerpo, y una vez inyectados, se congelan para formar un implante biodegradable sólido. En algunas realizaciones, el implante está formado por pastas termoplásticas, polímeros reticulados in situ, precipitación de polímeros in situ, gelificación inducida de manera térmica u organogeles solidificantes in situ. El mecanismo de formación de depósitos de pastas termoplásticas es formar un semisólido al enfriarse a la temperatura corporal después de la inyección en el cuerpo en forma fundida. Se pueden lograr redes de polímeros reticulados in situ de varias maneras, que forman sistemas poliméricos sólidos o geles. Los métodos para los sistemas reticulados in situ incluyen reacciones de radicales libres, generalmente iniciadas por calor o absorción de fotones, o interacciones iónicas entre pequeños cationes y aniones poliméricos. Las formaciones in situ se pueden producir mediante la provocación de la precipitación del polímero a partir de la solución. Un polímero insoluble en agua y biodegradable se solubiliza en un disolvente orgánico biocompatible al que se le añade un fármaco que forma una solución o suspensión después de la mezcla. Cuando esta formulación se inyecta en el cuerpo, el disolvente orgánico miscible en agua se disipa y el agua penetra en la fase orgánica. Esto conduce a la separación de fases y la precipitación del polímero que forma un depósito en el lugar de la inyección. Los sistemas de gelificación inducidos de manera térmica muestran transiciones sol/gel termorreversibles y se caracterizan por una temperatura de solución crítica más baja. Son líquidos a temperatura ambiente y producen un gel a la temperatura de solución crítica más baja y por encima de ella. Los organogeles solidificantes in situ comprenden lípidos anfifílicos insolubles en agua, que se hinchan en agua y forman varios tipos de cristales líquidos liotrópicos.

En algunas realizaciones, una composición de liberación sostenida divulgada en el presente documento comprende un polímero biodegradable para la administración controlada de un oligoelemento. Los polímeros biodegradables adecuados incluyen normalmente polilactidas (PLA), poliglicólidos (PGA), poli(lactida-co-glicólido) (PLGA), poli(£-caprolactona) (PCL), poligliconato, polianhídridos, poliortoésteres, poli(dioxanona) y polialquilcianoacrilatos. En algunas realizaciones, la composición de liberación sostenida comprende microesferas biodegradables inyectables tales como microesferas de PLGA, microesferas de PCL, microesferas de polianhídrido, microesferas de poliortoésteres y microesferas de polialquilcianoacrilato.

En algunas realizaciones, la administración directa se realiza mediante la inyección de materiales de nanopartículas que contienen cobre (u otros oligoelementos) en el lugar de la lesión. Un material de nanopartículas divulgado en el presente documento puede comprender una partícula que tiene dimensiones de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 nanómetros. Las dimensiones de las nanopartículas pueden variar ampliamente, con dimensiones más grandes (por ejemplo, el diámetro de una esfera, el ancho de una placa, la longitud de un bastón, etc.) que varían desde 1 a 1000 nm, y dimensiones más pequeñas (por ejemplo, el diámetro de un bastón, el grosor de una placa, etc.) que varían entre 0,1 y 100 nm.

Las nanopartículas pueden tener cualquier forma o morfología. Por ejemplo, pueden ser coloides metálicos tales como un coloide de oro o un coloide de plata. Las nanopartículas pueden ser fullerenos que están disponibles en estructuras tanto de nanoesferas como de nanotubos. En algunas realizaciones, la nanopartícula puede tener una estructura de núcleo/cubierta, tal como una nanocubierta. En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden ser esferas, placas planas o dobladas, y partículas alargadas lineales o dobladas que pueden ser de cualquier sección transversal, incluidas la circular, anular, poligonal, irregular, etc. (por ejemplo, cilindros alargados, tubos, formas columnares con secciones transversales poligonales, partículas en forma de cinta, etc.), así como otras geometrías regulares o irregulares.

Los materiales de nanopartículas que contienen un oligoelemento pueden dirigirse (por ejemplo, interacciones químicas específicas tales como la unión de antígeno y anticuerpo, etc.) o administrarse directamente en el lugar de la lesión. El tratamiento de las superficies de los tejidos se puede lograr mediante administración no dirigida, por ejemplo, mediante el baño del tejido en un material de nanopartículas, con una pipeta o micropipeta para aplicar un material de nanopartículas al tejido, la inyección de un material de nanopartículas en el tejido, el pintado de un material de nanopartículas sobre tejidos, o la combinación de nanopartículas con otros ingredientes tales como uno o más polímeros y/o una o más proteínas o combinaciones de las mismas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, albúmina, fibrinógeno, colágeno, elastina, fibronectina, laminina, quitosano, factor de crecimiento de fibroblastos básico o factor de crecimiento de células endoteliales vasculares, factor de crecimiento procedente de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico o factor de crecimiento similar a la insulina. Puede utilizarse una o más de otras entidades o fracciones químicas junto con las nanopartículas que contienen un oligoelemento. Estas especies pueden tener una utilidad terapéutica o diagnóstica complementaria o adicional. Las nanopartículas pueden unirse de manera química a estos otros componentes o pueden administrarse como una simple mezcla con ellos. Por ejemplo, las nanopartículas pueden unirse al anticuerpo. El método de reparación puede implicar solo un tipo de nanopartícula o puede implicar más de un tipo de nanopartícula. Las nanopartículas pueden contener uno o más oligoelementos.

Los polímeros a partir de los cuales se pueden formar las nanopartículas incluyen polímeros que son naturales y sintéticos, biodegradables o no biodegradables, homopoliméricos o copoliméricos, termoplásticos o no termoplásticos, etc. Se pueden seleccionar polímeros adecuados para formar las nanopartículas, por ejemplo, entre los siguientes: polímeros y copolímeros de ácido policarboxílico que incluyen ácidos poliacrílicos; polímeros y copolímeros de acetal; polímeros y copolímeros de acrilato y metacrilato (por ejemplo, metacrilato de n-butilo); polímeros y copolímeros celulósicos, incluidos acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, propionatos de celulosa, butirato acetatos de celulosa, celofán, rayón, triacetatos de rayón y éteres de celulosa tales como carboximetilcelulosas e hidroxialquilcelulosas; polímeros y copolímeros de polioximetileno; polímeros y copolímeros de poliimida tales como imidas en bloque de poliéter, poliamidimidas, poliesterimidas y polieterimidas; polímeros y copolímeros de polisulfonas que incluyen poliarilsulfonas y polietersulfonas; polímeros y copolímeros de poliamida que incluyen policaprolactamas y poliacrilamidas; resinas, incluidas las resinas alquídicas, resinas fenólicas, resinas de urea, resinas de melamina, resinas epoxídicas, resinas alílicas y resinas epoxi; policarbonatos; poliacrilonitrilos; polivinilpirrolidonas (reticuladas y de otro tipo); polímeros y copolímeros de monómeros vinílicos, incluidos alcoholes polivinílicos, haluros de polivinilo tales como cloruros de polivinilo, copolímeros de etileno y acetato de vinilo (EVA), cloruros de polivinilideno, éteres de polivinilo tales como éteres de polivinilmetilo, poliestirenos, copolímeros de estireno y anhídrido maleico, copolímeros de estireno y butadieno, copolímeros de estirenetilenobutileno (por ejemplo, un copolímero de poliestireno y polietileno/butileno y poliestireno (SEBS), copolímeros de estireno e isopreno (por ejemplo, poliestireno, poliisopreno y poliestireno), copolímeros de acrilonitrilo y estireno, copolímeros de acrilonitrilobutadieno y estireno, copolímeros de estireno y butadieno y copolímeros de estireno e isobutileno (por ejemplo, copolímeros en bloque de poliisobutilenopoliestireno tales como SIBS), cetonas de polivinilo, polivinilcarbazoles y ésteres de polivinilo tales como acetatos de polivinilo; polibencimidazoles; ionómeros; polímeros y copolímeros de poli(óxido de alquilo) que incluyen óxidos de polietileno (PEO); glucosaminoglicanos; poliésteres que incluyen tereftalatos de polietileno y poliésteres alifáticos tales como polímeros y copolímeros de lactida, £-caprolactona, glicólido (incluido ácido glicólico), hidroxibutirato, hidroxivalerato, para-dioxanona, carbonato de trimetileno (y sus derivados de alquilo); polímeros y copolímeros de poliéter que incluyen poliariléteres tales como éteres de polifenileno, poliéter cetonas, poliéter éter cetonas; sulfuros de polifenileno; poliisocianatos; polímeros y copolímeros de poliolefinas; elastómeros de poliolefina (por ejemplo, santopreno), cauchos de monómero de etileno propileno dieno (EPDM), polímeros y copolímeros fluorados, incluyendo politetrafluoroetilenos (PTFE), poli(tetrafluoroetileno-co-hexafluoropropeno) (FEP), copolímeros de etileno y tetrafluoroetileno modificados (ETFE) y fluoruros de polivinilideno (PVDF); polímeros y copolímeros de silicona; poliuretanos; polímeros de p-xilileno; poliiminocarbonatos; copoli(éter-ésteres) tales como copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(ácido láctico); polifosfazinas; oxalatos de polialquileno; polioxaamidas y polioxaésteres (incluidos los que contienen grupos amido y/o aminas); poliortoésteres; biopolímeros, tales como polipéptidos, proteínas, polisacáridos y ácidos grasos (y sus ésteres), incluida fibrina, fibrinógeno, colágeno, elastina, quitosano, gelatina, almidón, glucosaminoglicanos tales como ácido hialurónico; así como mezclas y otros copolímeros de los anteriores.

En otras realizaciones, las nanopartículas se pueden formar a partir de uno o más metales, por ejemplo, seleccionados entre los siguientes: metales sustancialmente puros, tales como plata, oro, platino, paladio, iridio, osmio, rodio, titanio, tungsteno y rutenio, así como aleaciones metálicas tales como aleaciones de cobalto y cromo, aleaciones de níquel y titanio, aleaciones de hierro y cromo, aleaciones de cobalto, cromo y hierro y aleaciones de níquel y cromo, entre otros. Las nanopartículas se pueden formar a partir de un oligoelemento como se divulga en el presente documento, y se pueden utilizar para administrar el mismo oligoelemento u otro diferente directamente al lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, las nanopartículas se pueden formar a partir de uno o más materiales inorgánicos no metálicos adecuados, por ejemplo, seleccionados entre los siguientes: cerámicas de fosfato de calcio (por ejemplo, hidroxiapatita); vidrios de fosfato de calcio, a veces denominado vitrocerámica (por ejemplo, biovidrio); óxidos metálicos, incluidos los óxidos de metales que no son de transición (por ejemplo, óxidos de metales de los grupos 13, 14 y 15 de la tabla periódica, entre los que se incluyen, por ejemplo, óxido de aluminio) y óxidos de metales de transición (por ejemplo, óxidos de metales de los grupos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 de la tabla periódica, entre los que se incluyen, por ejemplo, óxidos de titanio, circonio, hafnio, tantalio, molibdeno, tungsteno, renio, iridio, etc.); materiales a base de carbono tales como carbono puro y dopado (por ejemplo, fullerenos, nanofibras de carbono, nanotubos de carbono de pared simple denominados de "pocas paredes" y de varias paredes), carburos de silicio y nitruros de carbono; sílice; silicatos sintéticos o naturales, incluido silicato de aluminio, silicatos monoméricos tales como silsequioxanos oligoméricos poliédricos (POSS), que incluyen varios POSS funcionalizados y POSS polimerizados, y filosilicatos que incluyen arcillas y micas (que opcionalmente pueden estar intercaladas y/o exfoliadas) tales como montmorillonita, hectorita, hidrotalcita, vermiculita y laponita.

En algunas realizaciones, un material de nanopartículas divulgado en el presente documento comprende uno o más polímeros, uno o más metales o aleaciones, y/o uno o más materiales inorgánicos no metálicos adecuados.

En realizaciones particulares, se puede utilizar una variedad de tipos de compuestos que contienen cobre para la administración localizada directamente en el lugar de la lesión. Los ejemplos de soluciones adecuadas que contienen iones de cobre son cloruro de cobre (I), cloruro de cobre (II), acetato de cobre y soluciones de sulfato de cobre. En otras realizaciones, se utilizan soluciones adecuadas que contienen zinc, tales como soluciones de cloruro de zinc, acetato de zinc y sulfato de zinc. En otras realizaciones, el cobre o el zinc forman un compuesto o complejo con una proteína, péptido, aminoácido, mono-, di- o polisacárido, uno o más polímeros, o una molécula pequeña, y el compuesto o complejo se utiliza para la administración localizada directa en el lugar de la lesión. En algunas realizaciones, se utiliza un compuesto organometálico que contiene un oligoelemento para la administración localizada directamente en el lugar de la lesión.

En algunas realizaciones, la concentración de iones de cobre en la composición de cobre utilizada para la administración localizada directamente en el lugar de la lesión es de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 60 pM, de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 80 pM, de aproximadamente 80 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 600 pM, de aproximadamente 600 pM a aproximadamente 800 pM, de aproximadamente 800 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM. Las concentraciones adecuadas de iones zinc serán del mismo orden que las concentraciones de las composiciones de cobre descritas anteriormente. La concentración de un oligoelemento se puede determinar durante los ensayos preclínicos y los ensayos clínicos mediante métodos familiares para médicos y clínicos.

En otra realización, el oligoelemento se inyecta en el lugar de la lesión, por ejemplo, mediante punción percutánea directa, mediante un catéter intervencionista o mediante inyección intravertebral. En algunas realizaciones, el oligoelemento se administra directamente en el lugar de la lesión mediante el uso de un implante recubierto, endoprótesis, placa o implante impregnado con el oligoelemento. En una realización, el oligoelemento se administra directamente en el lugar de la lesión mediante la liberación lenta del oligoelemento de una endoprótesis vascular unida con el oligoelemento. En el presente documento se divulga un aplicador para administrar una composición de oligoelementos y/o células divulgadas en el presente documento directamente a un lugar de lesión.

Lesión tisular y enfermedades asociadas

"Lesión tisular" descrita en el presente documento se refiere a una lesión de un tejido, que incluye, por ejemplo, cardiovascular, hígado, cerebro, músculo esquelético y similares. En algunas realizaciones, la lesión tisular es isquemia cardiovascular. En algunas realizaciones, la lesión tisular es fibrosis hepática. En algunas realizaciones, la lesión tisular es un derrame cerebral. En algunas realizaciones, la lesión tisular es isquemia de miembros inferiores. En algunas realizaciones, la lesión tisular está asociada con la diabetes, úlceras del pie diabético, enterocolitis necrosante, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enteropatía inflamatoria, reestenosis (postangioplastia o implantación de endoprótesis), herida incisional, herida por escisión, cirugía, trauma accidental, úlcera de decúbito, úlcera de estasis, ruptura de tendón, fonotrauma de las cuerdas vocales, otitis media o pancreatitis.

En algunas realizaciones, la lesión tisular está asociada con la diabetes. La lesión tisular puede estar asociada con el pie diabético. El pie diabético generalmente está causado por complicaciones vasculares y neurológicas de la diabetes, en combinación con infecciones oportunistas persistentes y cicatrización deficiente de heridas. La lesión tisular puede ser una úlcera del pie diabético. La lesión tisular puede ser una úlcera cutánea diabética.

Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento son generalmente aplicables a muchas enfermedades que implican lesión tisular. Estas incluyen, pero sin limitación: infarto de miocardio, miocardiopatía, aneurisma, angina de pecho, estenosis aórtica, aortitis, arritmias, arteriesclerosis, arteritis, hipertrofia septal asimétrica (ASH), ateroesclerosis, fibrilación auricular y aleteo, endocarditis bacteriana, síndrome de Barlow (prolapso de la válvula mitral), bradicardia, enfermedad de Buerger (tromboangitis obliterante), cardiomegalia, carditis, arteriopatía de carótida, coartación de la aorta, defectos cardíacos congénitos, insuficiencia cardíaca congestiva, arteriopatía coronaria, síndrome de Eisenmenger, embolia, endocarditis, eritromelalgia, fibrilación, displasia fibromuscular, bloqueo cardíaco, soplo cardíaco, hipertensión, hipotensión, calcificación arterial infantil idiopática, enfermedad de Kawasaki (síndrome de los ganglios linfáticos mucocutáneos, enfermedad de los ganglios linfáticos mucocutáneos, poliarteritis infantil), síndrome metabólico, angina microvascular, miocarditis, taquicardia auricular paroxística (PAT), periarteritis nodosa (poliarteritis, poliarteritis nodosa), pericarditis, vasculopatía periférica, isquemia de la extremidad crítica, flebitis, estenosis de la válvula pulmonar (estenosis pulmonar), enfermedad de Raynaud, estenosis en la arteria renal, hipertensión renovascular, cardiopatía reumática, vasculopatía diabética, defectos del tabique, isquemia silenciosa, síndrome X, taquicardia, arteritis de Takayasu, tetralogía de Fallot, transposición de los vasos grandes, atresia tricuspídea, tronco arterial, cardiopatía valvular, úlceras varicosas, varices, vasculitis, comunicación interventricular, síndrome de Wolff-Parkinson-White, defecto del relieve endocárdico, fiebre reumática aguda, pericarditis reumática aguda, endocarditis reumática aguda, miocarditis reumática aguda, enfermedades cardíacas reumáticas crónicas, enfermedades de la válvula mitral, estenosis mitral, insuficiencia mitral reumática, enfermedades de la válvula aórtica, enfermedades de otras estructuras endocárdicas, cardiopatía isquémica (aguda y subaguda), angina de pecho, cardiopatía pulmonar aguda, embolia pulmonar, cardiopatía pulmonar crónica, cardiopatía cifoescoliótica, miocarditis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibroelastosis endocárdica, bloqueo auriculoventricular, disritmias cardíacas, degeneración del miocardio, enfermedad cerebrovascular, una enfermedad de las arterias, arteriolas y capilares, o una enfermedad de las venas y vasos linfáticos; una lesión cerebral adquirida, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular (que incluye isquémico, hemorrágico intracerebral, hemorrágico subaracnoidal), lesiones anóxicas, trastornos metabólicos, encefalitis y lesiones cerebrales debidas a infecciones. En determinadas realizaciones, las enfermedades que implican lesiones tisulares incluyen sarcoidosis sistémica, una enfermedad o afección cutánea, síndrome de Lofgren, una enfermedad o afección pulmonar, una enfermedad o afección cardíaca, una enfermedad o afección ocular, una enfermedad o afección hepática, una enfermedad o afección musculoesquelética y una enfermedad o afección renal. Por lo tanto, la presente solicitud también comprende el tratamiento de cualquiera de las enfermedades utilizando métodos descritos en el presente documento.

Kits, composiciones y artículos de fabricación

En otra realización, se proporcionan en el presente documento kits que comprenden al menos una célula madre y/o un oligoelemento divulgado en el presente documento, y una composición celular terapéutica de los mismos, que se puede preparar en una forma farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, mediante la mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un aplicador, junto con instrucciones de uso. Los kits pueden comprender un recipiente separado del contenido restante del kit. En determinadas realizaciones, las composiciones y kits pueden comprender uno o más de una BMSC, un oligoelemento, un inductor de células madre y un agente terapéutico adicional como se divulga en el presente documento.

En determinadas realizaciones, los kits comprenden uno o más componentes que facilitan la administración de la BMSC, el oligoelemento, el inductor de células madre y/o el agente terapéutico adicional al individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el kit comprende componentes que facilitan la administración intralesional de una BMSC y/o un oligoelemento y/o un inductor de células madre al individuo. En dichas realizaciones, el kit puede comprender, por ejemplo, jeringas y agujas adecuadas para la administración de células al individuo, y similares. En dichas realizaciones, la célula madre u oligoelemento o inductor de células madre puede estar contenido en el kit en una bolsa o en uno o más frascos. En otras realizaciones determinadas, el kit comprende componentes que facilitan la administración intravenosa o intraarterial de la célula madre u oligoelemento o inductor de células madre al individuo. En dichas realizaciones, la célula madre u oligoelemento o inductor de células madre puede estar contenido, por ejemplo, dentro de una botella o bolsa (por ejemplo, una bolsa de sangre o bolsa similar capaz de contener hasta aproximadamente 1,5 l de solución que comprenda las células), y el kit comprende además tubos y agujas adecuados para la administración de la célula madre u oligoelemento o inductor de células madre al individuo.

Además, el kit puede comprender uno o más compuestos que reducen el dolor o la inflamación en el individuo (por ejemplo, un analgésico, compuesto antiinflamatorio esteroideo o no esteroideo, o similares. El kit también puede comprender un compuesto antibacteriano o antivírico (por ejemplo, uno o más antibióticos), un compuesto para reducir la ansiedad en el individuo, un compuesto que reduce la respuesta inmunitaria en el individuo (por ejemplo, ciclosporina A) y/o un antihistamínico (difenhidramina, loratadina, desloratadina, quetiapina, fexofenadina, cetirizina, prometazina, clorofeniramina, levocetirizina, cimetidina, famotidina, ranitidina, nizatidina, roxatidina, lafutidina o similares).

Además, el kit puede incluir desechables, por ejemplo, toallitas estériles, artículos de papel desechables, guantes o similares, que facilitan la preparación del individuo para la administración, o que reducen la probabilidad de infección en el individuo como resultado de la administración de la célula madre y/u oligoelemento y/o inductor de células madre.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente las composiciones y los métodos de la presente divulgación. La invención se describirá ahora con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Uso de microburbujas de Cu y albúmina mediadas por ultrasonido para mejorar la migración de las BMSC en el corazón isquémico crónico.

Para orientar el complemento de cobre, este experimento utilizó microburbujas de Cu y albúmina. Se liberó cobre localizado e irradiado con ultrasonido de la burbuja a la zona diana del corazón, aumentando la concentración de cobre en la región isquémica. Los experimentos piloto demostraron que el complemento de cobre orientado al corazón alivió los síntomas de la isquemia cardíaca crónica. Además, los métodos de cultivo de las BMSC in vitro se han establecido bien, y las BMSC son células de rastreo adecuadas ya que son células madre que migran normales. Los conejos blancos de Nueva Zelanda son uno de los animales modelo favorables en la zona de la investigación cardíaca. Asimismo, son ideales para el seguimiento de BMSC que migran autólogas. Las BMSC se cultivaron y marcaron, después se inyectaron en conejos con infarto de miocardio. Con tratamiento de microburbujas de Cu y albúmina, se observó la migración de las BMSC al corazón isquémico crónico a través de la fluorescencia marcada. Además, el bloqueador específico del eje SDF-1/CXCR4, AMD3100, se utilizó en este experimento para buscar los mecanismos de migración de las BMSC durante el tratamiento de isquemia cardíaca con microburbujas, exponiendo la patogenia del infarto de miocardio y proporcionando fundamentos teóricos para nuevas terapias del infarto de miocardio.

Métodos:

1. IM (infarto de miocardio) experimental y tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina

(1) Se mantuvieron en ayuno preoperatorio durante 12 horas conejos blancos de Nueva Zelanda machos adultos, y la sala de operaciones se esterilizó mediante radiación ultravioleta durante la noche antes de la cirugía. (2) Los conejos se anestesiaron con 3 ml/kg de hidrato de cloral mediante administración intraperitoneal y, a continuación, se colocaron en la mesa de operaciones en posición supina. Se afeitaron los pelos que cubrían el pecho y las extremidades en el lugar de colocación de los electrodos. La zona quirúrgica se lavó con povidona yodada 3 veces consecutivas. Se inyectó lidocaína en la zona subcutánea alrededor del lugar de la incisión. (3) Se colocaron electrodos en las extremidades y se registró el ECG (electrocardiograma) 30 minutos antes y después de la cirugía. (4) Los conejos se sometieron a una esternotomía media. Se cortó la piel y se disecó el tejido s.c. y el músculo. Después de ello, se retrajo el esternón y se disecó el pleuron, se abrió el espacio pleural y se expuso el pericardio. (5) Después de una incisión suave del pericardio, se expuso el corazón y se ligó la rama circunfleja izquierda (CI). El lugar de ligadura estaba en el nivel 75 de la CI (el extremo epicárdico de la CI se definió como nivel cero; el origen de la CI se definió como nivel 100). Se controló la condición cardíaca y la respiración hasta que se realizó la ligadura. (⁶ ) Se controlaron durante ² minutos los cambios de color de la pared ventricular anterior, la diferencia del movimiento de la pared del ventrículo izquierdo y las alteraciones que incluyen el segmento ST registrado por los electrodos II, III, y aVF en el ECG para asegurar que la ligadura fuera exitosa. (7) Control intensivo de la condición cardíaca durante 10 minutos, de modo que cuando se identificaran arritmias o respiración anormal, se pudiera liberar la ligadura y administrar reanimación cardiopulmonar si fuera necesario. El tórax se cerró cuando la hemodinámica cardíaca y los signos vitales se estabilizaron. Si la pleura se dañó durante la cirugía, el tórax se cerraría de inmediato y se evitaría el aerotórax mediante la extracción de aire. (⁸ ) El lugar de la incisión se limpió de manera estéril y después se dejó que los conejos se recuperaran. Los conejos recibieron 400000 unidades de penicilina durante 3 días para evitar una infección. (9) Los conejos supervivientes se dividieron en 3 grupos: Agudo (<1 mes después de la cirugía); Crónico ^{( 6} meses después de la cirugía); Crónico y microburbujas ^{( 6} meses después de la cirugía y tratados con microburbujas de Cu y albúmina). Se administraron i.v. microburbujas de Cu y albúmina a través de la vena de la oreja ⁶ meses después de la cirugía experimental del IM. Las microburbujas (5 ml/conejo/tratamiento) se irradiaron con ultrasonido en el ventrículo izquierdo del corazón mediante el sistema de ultrasonido de diagnóstico Color Doppler (frecuencia: 1,3 MHz, energía: 90~100 %, índice mecánico: 1,1-1,2, tiempo de radiación: 20 minutos/tratamiento (intervalo de 5 segundos de radiación-5 segundos)). Cada conejo se trató 3 veces; el tratamiento se administró de 2 a 3 días a la vez, y las 3 veces de tratamiento para un conejo se llevaron a cabo dentro de una semana.

2. Aislamiento y cultivo de BMSC de conejo

(1) Se mantuvieron en ayuno preoperatorio durante 12 horas conejos blancos de Nueva Zelanda machos adultos, y la sala de operaciones se esterilizó mediante radiación ultravioleta durante la noche antes de la cirugía. (2) Los conejos se anestesiaron con 3 ml/kg de hidrato de cloral mediante administración intraperitoneal y, a continuación, se colocaron en la mesa de operaciones en posición supina. Se afeitaron los pelos que cubrían las extremidades en el lugar de aspiración. La zona quirúrgica se lavó con povidona yodada 3 veces consecutivas, seguido de un lavado con alcohol al 75 % para la desyodación. El lugar de aspiración quedó expuesto mientras que la zona circundante se cubrió con paños de campo. (3) La(s) aguja(s) de biopsia ósea y la(s) jeringa(s) se heparinizaron de manera estéril. (4) Se aspiraron uno o ambos fémures de los conejos donantes utilizando la(s) aguja(s) heparinizada(s) y la(s) franja(s), y se tomaron 1 a 2 ml de aspirados de médula ósea por aspiración. (5) Los aspirados se transportaron inmediatamente a un tubo de 15 ml que contenía de 4 a 5 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (L-DMEM). La muestra se mezcló con el DMEM mediante agitación suave del tubo para evitar la coagulación. (⁶ ) La mezcla se colocó en capas sobre un volumen igual de solución de Percoll 1,077 g/ml en otro tubo cónico de 15 ml. La solución debe mantenerse a temperatura ambiente antes del aislamiento y la mezcla debe colocarse suavemente sobre la solución. (7) La solución de mezcla se centrifugó después a 400 * g durante 15 min a temperatura ambiente. (⁸ ) Se recogió la capa leucocitaria (células mononucleares) en la interfaz de gradiente, se enjuagó dos veces mediante DMEM con centrifugación a 300 * g. Las células se sembraron en L-DMEM complementado con FBS al 12 % a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO² al 5 %. (9) El primer cambio de medio se realizó 3 días después de la siembra. Posteriormente, el medio de cultivo se cambió cada 2 o 3 días. El cambio de medio podría realizarse a la mitad o de forma completa. Y la concentración de FBS en el medio se moduló de acuerdo con el estado de las células. Las células no adherentes se descartaron con el cambio de medio. A una confluencia del 80 al 90 %, las MSC se digirieron con tripsina-EDTA al 0,25 % y se transfirieron. Las células se cultivaron hasta un número de ⁸ a 10 x 106.

3. Mareaje de las BMSC de conejo

(1) Cuando proliferan en aproximadamente ⁸ a 10 x 106, las BMSC se recogieron y se lavaron con L-DMEM (sin suero) 2 veces, el último de los cuales requiere centrifugación a 400 * g para empaquetar las células. (2) Las BMSC recogidas se marcaron en primer lugar mediante pkH26, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. En resumen, el DMEM se eliminó en la mayor medida de las células empaquetadas. A continuación, las células se suspendieron en una parte de diluido-C (dividido igualmente en 2 partes) a la concentración de 1 * 107 células/2 ml. El colorante se mezcló en otra parte del diluido-C y se añadió a la suspensión celular (concentración del colorante: 5 pl/1 * 107 células). Después de eso, se realizó una mezcla suficiente y la incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 5 minutos, con agitación suave 1 o 2 veces en el proceso. A continuación, se añadió el mismo volumen de suero a la mezcla, se incubó durante 1 minuto para detener el marcaje. A continuación, las células se lavaron con 5 ml de DMEM (con suero) con centrifugación a 400 * g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de ello, las células se lavaron 2 o 3 veces con DMEM y se sembraron en L-DMEM complementado con FBS al 10 % a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO² al 5 % durante la noche. Las células marcadas con éxito eran de color rosa a rojo si se observaban a simple vista. (3) A continuación, las BMSC marcadas con pKH26 se analizaron mediante microscopía de barrido láser confocal, antes de lo cual se cambió el medio y se descartaron las células muertas. Se consideró que la proporción de marcaje de las células estaba calificada solo cuando era superior al 90 %, o debería repetirse la etapa (2) . (4) Antes del proceso de marcaje, se prepararon soluciones de trabajo de Dio(3) y Hoechst: Dio(3) se diluyó en agua destilada hasta la concentración de 1 pg/pl, se filtró para esterilizar y se almacenó a -20 °C; Hoechst se diluyó en dimetilsulfóxido a la concentración de 1 pg/pl y se almacenó a -20 °C. (5) Después de la prueba de fluorescencia roja (pKH26), se añadieron Dio(3) (10 pg/10 ml) y Hoechst (10 pg/10 ml) al medio de las BMSC marcadas con pKH26 calificadas y las células se incubaron durante la noche. (⁶ ) El marcaje final exitoso se consideró como señales fluorescentes rojas y verdes fuertes y azules débiles. (7) A continuación, se tomaron imágenes de las células marcadas y se realizó el análisis de la proporción de marcado de fluorescencia roja y verde. Se observaron señales fluorescentes azules como núcleo y la relación de marcaje se calculó como: Número de células fluorescentes rojas o verdes/Número de células fluorescentes azules en un campo aleatorio de ^{2 0 0} *. (⁸ ) Para el grupo tratado con AMD3100, se añadió AMD3100 estéril (concentración final: 1 * 107 ng/ml) a las células marcadas y se incubaron durante la noche. Cuando terminó la incubación, las células se digirieron, se lavaron, se suspendieron en 1 a 2 ml de L-DMEM (sin suero) antes de su uso. En cuanto a otros grupos, las células marcadas con éxito se digirieron, se lavaron, se suspendieron en 1 a 2 ml de L-DMEM (sin suero) antes de su uso. Las BMSC preparadas se inyectaron en el mismo conejo donante a través de la vena de la oreja.

4. Seguimiento de las BMSC de conejo que migran durante el infarto de miocardio y después del tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina

4.1 Seguimiento de las BMSC de conejo que migran durante un infarto agudo de miocardio, isquemia cardíaca crónica e isquemia cardíaca crónica con tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina

(1) Agudo (<1 mes después de la cirugía de IM, n = 3); Crónico ^{( 6} meses después de la cirugía de IM, n = 3); Crónico y microburbujas ^{( 6} meses después de la cirugía de IM y tratado con microburbujas de Cu y albúmina, n = 5). (2) Las BMSC se aislaron y cultivaron 1 mes antes (para el grupo Agudo) o 4 a 5 meses después (otros grupos Crónico y Crónico y microburbujas) de la cirugía de IM, y se marcaron con pKH26, Dio(3) y Hoechst antes de su uso. (3) Las BMSC preparadas (1 a 9 * 106 células/conejo) se inyectaron a través de la vena de la oreja a las 2 semanas (Agudo) o ⁶ meses (Crónico) después de la cirugía de IM en los conejos donantes. Los corazones se recogieron 24 horas después de la inyección de células. Para el grupo Crónico y microburbujas, los tratamientos con microburbujas se realizaron ⁶ meses después de la cirugía de IM. Se inyectaron las BMSC preparadas en los conejos donantes después de 3 tratamientos. Los corazones se recogieron 24 horas después de la inyección de células. Cada corazón cosechado se dividió en 4 partes con un grosor similar desde el ápice hasta la base a lo largo del eje largo. A continuación, cada parte se congeló en cortes (5 cortes/parte), también desde el ápice hasta la base a lo largo del eje largo, y se observó mediante microscopía de barrido láser confocal. Las imágenes de la migración se capturaron utilizando Nikon DXM1200/NIS-Elements. Posteriormente se fijaron los cortes y se prepararon para el análisis patológico. (4) Las imágenes se analizaron mediante Image-Pro Plus 6.0. Se calcularon los valores de IOD y las zonas fluorescentes (por píxel) de fluorescencia roja de cada imagen. A continuación, se calcularon las sumas de los valores de IOD y las zonas fluorescentes para cada corazón. Las estáticas se procesaron como: Suma de IOD (o zonas fluorescentes)/número de cortes fluorescentes.

4.2 Mecanismos de migración de las BMSC inducidos por microburbujas de Cu y albúmina

(I) Se dividieron los ratones en 3 grupos: Crónico ^{( 6} meses después de la cirugía de IM, n = 3), Crónico y microburbujas ^{( 6} meses después de la cirugía de IM y tratado con microburbujas de Cu y albúmina, n = 5), Crónico y microburbujas AMD3100 ^{( 6} meses después de la cirugía de IM, tratados con microburbujas de cobre y BMSC tratadas con AMD3100, n = 3). (2) Las BMSC se aislaron y cultivaron 4 a 5 meses después de la cirugía de IM y se marcaron con pKH26, Dio(3) y Hoechst antes de su uso. (3) Se inyectaron las BMSC preparadas a través de la vena de la oreja en los conejos donantes ⁶ meses después de la cirugía de IM con microburbujas tratadas (Crónico y Microburbujas) o sin ellas (Crónico). Los corazones se recogieron 24 horas después de la inyección de células. Para el grupo Crónico y microburbujas AMD3100, los tratamientos con microburbujas se realizaron ⁶ meses después de la cirugía de IM. Se inyectaron las BMSC marcadas con fluorescencia y tratadas con AMD3100 en los conejos donantes después de 3 tratamientos. Los corazones se recogieron 24 horas después de la inyección de células. Los corazones recogidos se congelaron en cortes. Los cortes se observaron y registraron utilizando microscopía de barrido láser confocal, sistema de imágenes: Nikon DXM1200/NIS-Elements. Posteriormente se fijaron los cortes y se prepararon para el análisis patológico. (4) Las imágenes se analizaron mediante Image-Pro Plus 6.0. Se calcularon los valores de IOD y las zonas fluorescentes (por píxel) de fluorescencia roja de cada imagen. A continuación, se calcularon las sumas de los valores de IOD y las zonas fluorescentes para cada corazón. Las estáticas se procesaron como: Suma de IOD (o zonas fluorescentes)/número de cortes fluorescentes.

5. Análisis de la patología

Se inyectó i.v. una sobredosis de hidrato de cloral para sacrificar al conejo. Después, los corazones se recogieron y se lavaron utilizando NS (solución salina normal). Después de ello, la solución salina se eliminó completamente y el corazón se congeló en cortes. Se secaron los cortes confocales observados, se fijaron en una solución de formaldehído al 4 %. A continuación, los cortes se deshidrataron y se tiñeron con HE: (1) Desparafinar los cortes con xileno, lavar los cortes con alcohol de concentraciones de gradiente disminuidas y finalmente agua: Xileno (I) 5 minutos ^ Xileno (II) 5 minutos ^ Alcohol al 100 % 2 minutos ^ Alcohol al 95 % 1 minuto ^ Alcohol al 80 % 1 minuto ^ Alcohol al 75 % 1 minuto ^ Agua destilada 2 minutos; (2) Teñir los cortes con hematoxilina durante 5 minutos, seguido de lavado con agua destilada; (3) Lavar con agua destilada y alcohol ácido al 1 % durante 30 segundos; (4) Remojar en agua corriente durante 15 minutos o en agua tibia (aproximadamente 50 °C) durante 5 minutos; (5) Teñir los cortes con eosina soluble en alcohol durante 2 minutos; (⁶ ) Deshidratación, transparencia y envoltura de los cortes: Alcohol (I) al 95 % 1 minuto ^ Alcohol (II) al 95 % 1 minuto ^ Alcohol (I) 100 % 1 minuto ^ Alcohol (II) al 100 % 1 minuto ^ Xileno (I) 1 minuto ^ Xileno (II) 1 minuto ^ envolver con resina neutra.

6. Análisis estadístico

Se utilizó SPSS14.0 (SPSS, Chicago, IL) para analizar los datos. Los valores de IOD y la zona fluorescente se expresaron como medio. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la suma de rangos, a = 0,05. Las proporciones de marcaje se expresaron como media ± DE (X ± DE). Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante pruebas t de muestras independientes. Se asumió significación estadística cuando los valores de P eran <0,05.

Resultados:

Durante la cirugía de IM, se observaron los cambios de color de la pared ventricular anterior, la desaceleración del movimiento del miocardio (que implica la pared ventricular izquierda, la pared lateral y el ápice) y el segmento ST elevado o bajado registrado por los electrodos II, III y aVF.

Se tomaron aspirados de médula ósea y se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad. Se recogió la capa leucocitaria (células mononucleares), se cultivaron y se transfirieron. Las células no adherentes se descartaron con el cambio de medio y las células adherentes proliferaron, con lo que se enriquecieron las BMSC. Las células adherentes desarrollaron un crecimiento clonal 3 a 5 días después de la siembra. Se observaron células tanto poliédricas como fusiformes en las colonias. Las células poliédricas fueron dominantes durante la primera semana después de la siembra, sin embargo gradualmente se sustituyeron por células fusiformes. Cuando las colonias eran grandes y densas (normalmente sucedía en ¹ a ² semanas después de la siembra), las células se podían transferir. Después del pasaje, las células fusiformes se convirtieron en células dominantes.

El marcaje fluorescente se realizó cuando las células proliferaron hasta aproximadamente ⁸ a 10 x 106. Para eso se requirió digestión y centrifugación en el proceso de marcaje de pKH26, el marcaje de pKH26 generalmente provoca la muerte celular de una parte de las células. Por lo tanto, el marcaje con Dio(3) y Hoechst se procesó después de pKH26, permitiendo que las células vivas y marcadas con pKH26 con éxito se adhieran y sobrevivieran. Se añadieron Dio(3) y Hoechst al medio de las BMSC marcadas con pKH26 calificadas y las células se incubaron durante la noche. Solo cuando se da la proporción de marcaje, las células se considerarán correctamente marcadas y adecuadas para los experimentos de seguimiento.

Tanto pKH26 como Dio(3) son colorantes liposolubles, cuyos mecanismos de mareaje son la inserción de fluoróforos en la membrana. Las señales de marcaje de estos dos colorantes fueron similares. Las células marcadas se observaron como puntos rojos o verdes uniformes en la membrana. La observación ha demostrado que, para una célula, algunas pueden estar marcadas con señales pKH26 más fuertes, pero algunas con señales Dio(3) más fuertes. Unas pocas células no pudieron marcarse ni con Dio(3) ni con pKH26.

A partir de los resultados que se observaron de la migración de las BMSC durante el infarto de miocardio y el tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina, la zona de infarto estaba inusualmente dentro de la 1a, 2a y 3a parte del corazón. La zona del infarto implica el ápice y la mayor parte de la pared del ventrículo izquierdo para ese IM experimental se logró mediante la ligadura de la CI. Los corazones recogidos se dividieron en 4 partes desde el ápice hasta la base a lo largo del eje largo. La 1a y 2a parte de todos los corazones contenían zona de infarto (18/18); la 3a parte de la mayoría de los corazones contenían zona de infarto (12/18); la 4a parte de algunos corazones contenían una pequeña parte de la zona de infarto (3/18).

Para el infarto de miocardio agudo, las señales de migración fueron abundantes e intensas en y alrededor de la zona de infarto. Dentro de 1 mes de la cirugía de IM, los conejos con IM experimentales establecidos con éxito se consideraron modelos de infarto de miocardio agudo (Agudo, n = 3). Durante un infarto agudo, los animales inician la autorreparación espontánea, se pueden observar fuertes señales de las BMSC que migran que se dirigen a la zona de infarto (Figuras 2 a 4). En este experimento, se observaron señales fluorescentes verdes y rojas superpuestas como señales de migración, que se vieron en y alrededor de la zona de infarto, en lugar de la zona sin infarto (Figuras 2 a 4). La figura 2 muestra que, durante el infarto agudo, se observaron señales de migración de las BMSC en una gran parte de la zona de infarto. A a C se tomaron en el mismo campo dentro de la transacción del ventrículo izquierdo. De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las líneas de puntos amarillas dividen la zona en la zona de infarto (arriba) y la zona sin infarto (abajo). Las imágenes se tomaron en un campo de 40x, regla = 500 pm. La figura 3 muestra que las señales de migración solo se vieron en la zona de infarto. A a C, D a F y G a I son del mismo corazón, A a C y D a F son imágenes del mismo campo dentro de la zona de infarto (2a parte), G a I son imágenes dentro de la zona sin infarto. D a F son regiones con líneas azules en A a C. Las líneas de puntos amarillas dividen la zona en la zona de infarto (izquierda) y la zona sin infarto (derecha). G a I son imágenes de una zona sin infarto. Se ven señales superpuestas de rojo y verde en la zona de infarto, mientras que pocos se pueden encontrar en los márgenes de la zona de infarto o en la zona alejada del infarto. De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. A a C, G a I se tomaron en un campo de 40x, regla = 500 pm; D a F se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm (D a E) o 200 pm (F). La figura 4 muestra que, durante el infarto agudo se observaron fuertes señales de migración de las BMSC. Dentro de 1 mes después de la cirugía de IM, se observaron intensas señales de migración en la zona de infarto. De arriba a abajo hay imágenes de la 1a (A a C), 2a (D a F), 3a (G a I) y 4a (J a L) parte. Se observaron señales fluorescentes en la zona de infarto (la 1a y la 2a parte, A a F); no se observó señal en la zona sin infarto (la 3a y la 4a parte, G a L). Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = ¹⁰⁰ pm.

Los resultados de este experimento han demostrado que la migración de las BMSC desapareció cuando el corazón estaba bajo isquemia crónica, pero el tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina inició de nuevo la migración de las BMSC. ⁶ meses después de la cirugía de IM, los animales de experimentación establecidos con éxito se consideraron con isquemia cardíaca crónica (Crónico, n = 3). La autorreparación espontánea, así como la migración de las BMSC de estos animales disminuyó considerablemente o incluso desapareció. No se pudieron encontrar señales superpuestas de verde y rojo (señales de migración de las BMSC) en las zonas de infarto y sin infarto (Figura 5). La figura 5 muestra que las señales de migración de las BMSC desaparecieron durante la isquemia cardíaca crónica. Después de ⁶ meses de la cirugía de IM, los corazones se cortaron y se fotografiaron. No se pudieron observar señales en la 1a (A a C), 2a (D a F), 3a (G a I) y 4a (J a L) parte. De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm.

El complemento de cobre orientado a la zona del infarto de miocardio se logró mediante la localización por ultrasonido y la irradiación de microburbujas de Cu y albúmina. El tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina no inicia la migración de las BMSC a corazones no infartados (Figura ⁶ ). La figura ⁶ muestra que, sin infarto, el tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina no inició la migración de las BMSC. De arriba a abajo hay imágenes de la 1a (A a C), 2a (D a F), 3a (G a I) y 4a (J a L) parte. No se pudieron encontrar señales fluorescentes en ninguna zona (la 1a y la 2a parte, A a F). De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm. El tratamiento de conejos que padecían isquemia cardíaca de ⁶ meses con microburbujas de Cu y albúmina dio como resultado la migración de nuevo de las BMSC (figura 7). Seis meses después de la cirugía de IM, el tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina inició la migración de nuevo de las BMSC en la zona del infarto. De arriba a abajo hay imágenes de la 1a (A a C), 2a (D a F), 3a (G a I) y 4a (J a L) parte. Se observaron señales fluorescentes en la zona de infarto (la 1a, 2a y 3a parte., A a I); no se observó señal en la zona sin infarto (la 4a parte, J a L). De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm. Aunque la abundancia, la intensidad y la región vista son mucho más pequeñas en comparación con las señales de migración durante el infarto agudo, las señales de migración iniciadas por el tratamiento con microburbujas evidentemente se eliminan en comparación con los animales con infarto crónico que no reciben tratamiento (Figuras ⁸ a 9). La figura ⁸ muestra que el tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina inició la migración de nuevo de las BMSC a la zona de infarto. Durante un infarto agudo, se observaron abundantes señales de migración de las BMSC en la zona de infarto (AC, a). Las señales de migración desaparecieron en los corazones isquémicos cardíacos crónicos (D a F, d). Después del tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina, las señales de migración desaparecidas reaparecieron en la zona cardíaca de infarto (G a I, g). Las imágenes son todas de cortes de la 2a parte. De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm (A a C, D a F, G a I) o 200 pm (a, d, g). La figura 9 muestra el análisis estadístico de señales fluorescentes del grupo Agudo, Crónico y Crónico y Microburbujas. Arriba está el análisis de los valores de IOD, abajo es de las zonas fluorescentes. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la suma de rangos. Las líneas cortas representan la media, * y # significa p <0,05.

Los resultados de este experimento han demostrado que la nueva migración de las BMSC estimuladas por microburbujas de Cu y albúmina depende del eje SDF-1/CXCR4. El eje SDF-1/CXCR4 es uno de los mecanismos importantes para la migración de células madre. SDF-1 se expresa en tejidos lesionados, atrayendo varias células madre, incluida la migración de las BMSC. El receptor específico CXCR4 expresado en la superficie de las células madre responde a SDF-1 e inicia la migración de la célula. Para bloquear de manera específica SDF-1/CXCR4, se eligió AMD3100, el bloqueador de CXCR4, para tratar las células.

Los resultados de este experimento han demostrado que las BMSC tratadas con AMD3100 no podían migrar a la zona de infarto de miocardio. Las células se marcaron con pKH26, Dio(3) y Hoechst, se incubaron con AMD3100 durante la noche y después se recogieron e inyectaron en el conejo. NO se observó una señal de migración abundante e intensa cuando se inyectaron las BMSC tratadas con AMD3100 en conejos con infarto agudo. Tanto la abundancia como la región vista de las señales de migración se redujeron de manera notable en comparación con la de los conejos con infarto agudo que recibieron BMSC no tratadas con AMD3100 (Figuras 10 a 12), lo que demuestra que AMD3100 inhibió la migración dependiente de SDF-1/CXCR4. La figura 10 muestra que las BMSC tratadas con AMD3100 no podían migrar a la zona de infarto agudo de corazón. Dentro de 1 mes después de la cirugía de IM, la capacidad de migración de las BMSC tratadas con AMD3100 a la zona de infarto evidentemente disminuyó (la 1a, 2a y 3a parte., A a I). De arriba a abajo hay imágenes de la 1a (A a C), 2a (D a F), 3a (G a I) y 4a (J a L) parte. Las señales fluorescentes fueron pocas en ambas partes. De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm. La figura 11 muestra que las BMSC tratadas con AMD3100 no podían migrar a la zona de infarto agudo de corazón. De arriba a abajo están las imágenes del grupo Agudo (A a C, a) y Agudo AMD3100 (D a F, d) (todas de la 2a parte). De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm (A a C, D a F) o 200 pm (a, d). La figura 12 muestra el análisis estadístico de señales fluorescentes del grupo Agudo y Agudo AMD3100. Arriba está el análisis de los valores de IOD, abajo es de las zonas fluorescentes. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la suma de rangos. Las líneas cortas representan la media, * y # significa p <0,05.

Los resultados de este experimento han demostrado que las BMSC tratadas con AMD3100 no pueden migrar a la zona cardiacoisquémica crónica. Seis meses después de la cirugía de IM, El tratamiento con microburbujas de Cu y albúmina inició la migración de nuevo de las BMSC a la zona del infarto. Sin embargo, cuando las células de seguimiento eran BMSC tratadas con AMD3100, no se pudieron observar señales de migración en la zona isquémica crónica tratada con microburbujas de Cu y albúmina. Si las células se trataron con AMD3100, las señales de migración estimuladas por microburbujas de Cu y albúmina no se pudieron encontrar en conejos infartados que sufrieron isquemia cardíaca durante ⁶ meses y recibieron tratamientos de microburbujas de Cu y albúmina. De arriba a abajo hay imágenes de la 1a (A a C), 2a (D a F), 3a (G a I) y 4a (J a L) parte. La 1a a la 3a parte (A a I) contienen una zona de infarto, pero se vio poca señal de migración en cualquier parte. De izquierda a derecha, se muestran los resultados de HE, señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de 100x, regla = 100 pm. La figura 14 muestra que las BMSC tratadas con AMD3100 no podían migrar en una zona de infarto de miocardio agudo o de isquemia cardíaca crónica. De arriba a abajo están las imágenes del grupo Agudo (A a C, a), Crónico (D a F, d), Crónico y microburbujas (G a I, g) y Crónico y microburbujas AMD3100 (J a L, j) (todos de la 2a parte). De izquierda a derecha, se muestran los resultados de He , señales verdes y rojas. Las imágenes se tomaron en un campo de ^{10 0} x, regla = 100 pm (A a C, D a F, G a I, J a L) o 200 pm (a, d, g, j). La figura 15 muestra el análisis estadístico de señales fluorescentes del grupo Crónico, Crónico y microburbujas y Crónico y microburbujas AMD3100. Arriba está el análisis de los valores de IOD, abajo es de las zonas fluorescentes. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la suma de rangos. Las líneas cortas representan la media, * y # significa p <0,05.

Como modelo de infarto de miocardio, los conejos blancos de Nueva Zelanda tienen un coste más bajo, son convenientes para la alimentación y el transporte, no requieren respiración mecánica durante la cirugía de IM y son fáciles de ligar de arterias coronales. La ligadura de las arterias coronales se logró principalmente mediante la ligadura LAD (descendente anterior izquierda) o LC en la bibliografía anterior. En este experimento, los resultados han demostrado que la ligadura lAd no podía establecer un modelo de infarto de miocardio estable. A través de la perfusión de tinta, se observó que la LAD de los conejos es claramente más corta que la de las ratas y los cerdos. Alcanza como máximo 1/3 de la pared anterior del ventrículo izquierdo, suministrando sangre para una zona bastante limitada: 10 % ~ 15 % del ventrículo izquierdo. Sin embargo, LC es relativamente más larga y más grande, alcanzando el ápice (en algunos casos, redondeando el ápice y llegando a las arterias coronarias derechas), suministrando sangre para la mayor parte de la zona del ventrículo izquierdo.

La ligadura de LC proporcionó modelos más exitosos y estables que la ligadura de LAD. Los resultados de la ecocardiografía y las medidas hemodinámicas han demostrado que la función cardíaca de los conejos con ligadura de LAD no cambió de manera evidente, mientras que los de la ligadura LC cambió drásticamente. El análisis patológico también ha demostrado que la zona de infarto de los conejos ligados con LC fue evidentemente mayor que la de los conejos ligados con LAD. Además, LC se desplaza a la superficie del miocardio, haciéndolo fácil de reconocer y operar.

Las microburbujas de ultrasonido son un tipo de agentes de contraste de ultrasonido favorables y vehículos de fármacos diana. Las microburbujas permanecen estables durante el transporte antes de ser irradiadas por ultrasonidos, que está controlado por el hombre. Por lo tanto, los medicamentos en microburbujas podrían orientarse a la destrucción de los tejidos diana. Además, la destrucción de microburbujas y la irradiación con ultrasonidos ayudan a que los fármacos ingresen a las células. La microburbuja de ultrasonido es fácil de operar, provoca poco daño a los animales y también promete un complemento de cobre localizado y oportuno. Por lo tanto, en este experimento, se eligió una microburbuja de Cu y albúmina mediada por ultrasonidos para reponer el cobre en el miocardio.

La migración de células madre es una reacción sistemática que implica a todo el cuerpo. La observación sistemática es más persuasiva que las simples pruebas de proteínas. Entonces, este experimento investigó los mecanismos de las BMSC estimuladas por microburbujas de Cu y albúmina a través del tratamiento con AMD3100, ilustrando que la migración estimulada dependía del eje SDF-1/CXCR4, lo que sugirió que el mecanismo puede ser que el Cu eleva la actividad del HIF-1 - HIF-1 estimula la expresión del SDF-1 - SDF-1 atrae la migración de las células madre.

La isquemia cardíaca da como resultado hipoxia, que permite al HIF-1a escapar de la degradación y acumularse en el citosol. Cuando se transporta al núcleo, HIF-1a se dimeriza con HIF-1p para formar HIF-1. Sin embargo, en el núcleo, HIF-1a es hidroxilado por el factor asparaginil hidroxilasa que inhibe HlF-1 (FIH-1) en su resto de asparagina N803 dentro de su extremo carboxilo, que conduce a la inhibición de HIF-1a de interactuar con los coactivadores CBP/p300 y formar complejos de transcripción funcionales. El cobre suprime la actividad del FIH-1, de modo que promueve la combinación de HIF-1 y otros factores para formar complejos de transcripción funcionales. E1HIF-1 podría no formar un complejo funcional e iniciar la expresión de genes posteriores cuando el cobre es insuficiente en el sistema. No obstante, la isquemia cardíaca que acumula el HIF-1a provoca un flujo de cobre desde el corazón, que conduce a la supresión de la actividad transcripcional del HIF-1 y a la inhibición de la expresión de genes regulados por el HIF-1, incluidas las quimiocinas que migran (por ejemplo, SDF-1). Por lo tanto, junto con el alargamiento del tiempo isquémico cardíaco, la migración de las BMSC disminuye hasta incluso desaparecer.

Los resultados de este experimento han demostrado que, durante un infarto de corazón agudo, las BMSC migraron a la zona de infarto. Con el tiempo de isquemia que se extiende a ⁶ meses, la migración de las BMSC desapareció. Se observó un complemento de cobre orientado al corazón por las microburbujas de Cu y albúmina y la migración de nuevo de las BMSC. En conclusión, la microburbuja de Cu y albúmina estimula la migración de las BMSC durante la isquemia cardíaca crónica, y el proceso de migración estimulada depende de HIF -1 y SDF-1.

Ejemplo 2: Terapia dirigida con microburbujas de contraste de ultrasonido de cobre para el modelo de infarto de miocardio por isquemia en macacos de la India.

Este experimento se realizó en macacos de la India. El modelo de infarto de miocardio por isquemia se estableció mediante una operación de ligadura de arterias coronarias. Cuatro semanas después de la operación, el tejido cardíaco isquémico se reemplazó completamente por fibra de colágeno y se convirtió en tejido infartado. A continuación, se realizó la terapia dirigida con microburbujas de cobre guiada por ultrasonido para tratar el infarto de miocardio para una evaluación terapéutica eficaz. El macaco de la India posee un corazón de orden superior parecido al de un ser humano con una estructura interna, actividad eléctrica, distribución de las arterias coronarias, circulación colateral coronaria, colocación y fijación en la cavidad torácica similares. Por lo tanto, el modelo de infarto de miocardio del macaco de la India proporcionaría un mejor sustituto para la afección de infarto de miocardio en seres humanos.

1.1 Establecimiento del modelo de infarto de miocardio por isquemia en macacos de la India

Antes del procedimiento quirúrgico, todos los sujetos recibieron una inyección intramuscular de 5 mg/kg de ketamina y 0,2 mg/kg de midazolam para inducir la sedación. Los pelos que cubrían el pecho y las extremidades en los lugares de colocación de los electrodos se afeitaron minuciosamente para la operación y un mejor registro del ECG. Se registraron las derivaciones estándar bipolares y unipolares de las extremidades. Los animales que mostraron un ECG anormal, tal como taquicardia (más de 200 latidos por minuto), arritmia y, evidentemente, los segmentos ST desviados de la línea de base fueron excluidos de este estudio.

Se controlaron de manera constante medidas estándar no invasivas que incluyen electrocardiografía, esfigmomanometría, oximetría de pulso y la capnografía (Dash3000, GE, EE. UU.), y se establecieron catéteres venosos. Todos los monos sometidos al procedimiento quirúrgico se intubaron en primer lugar después de la anestesia inducida mediante infusión intravenosa con fentanilo ^{( 10} pg/kg), midazolam (^{0 , 2} mg/kg), propofol ⁽¹ mg/kg) y vecuronio (0,1 mg/kg). La respiración asistida se realizó con ventilación controlada por presión para lograr CO² al final de la espiración entre 35 mmHg y 40 mmHg. La presión inspiratoria se estableció dentro de un intervalo de 12 a 20 cm H²O, la frecuencia respiratoria fue de 40/min y la relación inspiratoria/espiratoria fue de 1:2.

Para mantener la condición anestésica durante el procedimiento quirúrgico, se diluyeron 2 ml de fentanilo (0,1 mg) y 10 ml de propofol (100 mg) hasta 20 ml con solución salina. La mezcla se infundió de manera continua mediante una bomba de jeringa a una velocidad de 5 a 10 ml/h. La velocidad de la bomba se ajustó de acuerdo con el estado anestésico y el tiempo de duración de la operación. La canulación arterial se perforó en la arteria femoral con una aguja permanente y un tubo de control de la presión conectado para el control invasivo de la presión arterial durante la operación. Normalmente, la pulsación de la arteria femoral se puede palpar a medio camino entre la espina ilíaca anterosuperior y la sínfisis púbica. La zona operatoria se aisló de forma aséptica. El aislamiento se realiza con la ayuda de 4 piezas de una sábana estéril desechable.

La zona quirúrgica se cortó ligeramente medial a la línea del cuarto espacio intercostal izquierdo y se realizó una incisión transversal de 4 a 5 cm hacia afuera desde el lado izquierdo del preesternón. Se recomienda la diatermia monopolar ya que se puede utilizar tanto para el corte de tejidos como para la coagulación. El tejido s.c. y los planos musculares se disecaron hasta la pleura, entrando en el espacio pleural y, después, se ensanchó la incisión abriendo con pinzas. Se insertó un bastoncillo de algodón, barriendo el espacio pleural y empujando el pulmón lejos del orificio y, a continuación, se amplió la incisión intercostal para abrir el tórax y exponer el pericardio.

Se expuso el corazón a través de la cuarta incisión de toracotomía intercostal izquierda (4 a 5 cm) y se identificaron el ápice y la aurícula izquierda. El extremo epicárdico de la LAD se definió como nivel cero; el origen de la LAD en de la aurícula izquierda se definió como nivel 100. La ligadura se realizó en un lugar determinado. Además, la rama diagonal principal también se ligó de manera paralela al lugar de ligadura en la arteria LAD en algunos monos si el lugar de ramificación de la arteria diagonal estaba por encima del lugar de ligadura.

La arteria se ocluyó durante 1 min seguido de una reperfusión de 5 min, y esta oclusión-reperfusión se repitió 3 veces antes de la ligadura eventual. Después de la ligadura final, debe controlarse la diferencia de movimiento de la pared ventricular izquierda, los cambios de color de la pared ventricular anterior y las alteraciones en el electrocardiograma y la presión arterial para garantizar que la ligadura sea exitosa. Se inyecta azul de metileno (1 ml) en bolo en la aurícula izquierda con una jeringa de 1,0 ml después de la ligadura permanente. El defecto de llenado del azul de metileno indica la finalización de la ligadura, así como la predicción de la zona isquémica.

Antes de cerrar el pecho, la condición cardíaca se controló de manera intensa durante 45 min. Se infundió dobutamina (3 a 5 |jg kg^-1 min-1) para apoyar la función cardíaca y se utilizó un desfibrilador (HEARTSTART XL, Philips) si fue necesario. Se debe tener cuidado para evitar dañar el corazón durante el cierre del pericardio. Se debe infundir hialuronato de sodio en la cámara pericárdica para el tratamiento antiadherente. El pericardio y la pleura se cerraron con suturas de polietileno 4-0. La incisión intercostal se cerró con sutura de seda. Para evitar el neumotórax, se debe tener cuidado para evitar dañar el pulmón durante el cierre intercostal. Se vuelven a inflar los pulmones mientras se cierra la incisión intercostal para que el aire se pueda expulsar de la cavidad pleural. Después de cerrar la incisión intercostal, se deja caer solución salina al espacio subcutáneo y se vuelve a inflar el pulmón para asegurarse de que la incisión en el pecho esté bien cerrada. El músculo y la incisión cutánea se cerraron en capas con suturas de seda n.° 2-0 y se limpiaron de forma estéril. El tubo endotraqueal se retiró después de que se restableció la respiración espontánea. La incisión se cubrió con una gasa esterilizada y un vendaje. Se inyectó tramadol (2 mg/kg) por vía intramuscular para aliviar el dolor. El cambio de vendaje se realizó en días alternos y las suturas se eliminaron una semana después de la operación.

1.2 Control con ECG

Se registró un ECG de 12 derivaciones (MAC8000, GE, EE. UU.) en la posición supina de cada mono en el momento anterior, inmediatamente después de la operación (aproximadamente ² horas para todo el procedimiento quirúrgico), cuatro y ocho semanas después de la operación utilizando electrodos pediátricos a una velocidad del papel de 25 mm/s y una amplitud de 10 mm/mV. La pared torácica de un mono no era lo suficientemente ancha para permitir ⁶ derivaciones precordiales al mismo tiempo, incluso con los electrodos pediátricos. Por lo tanto, las ⁶ derivaciones precordiales se dividieron en dos grupos; V1, V3 y V5 se registraron en un grupo, y V2, V4 y V⁶ en otro grupo.

1.3 Ecocardiografía

Se realizaron mediciones ecocardiográficas bidimensionales en vistas apicales estándar de 2 y 4 cámaras durante tres ciclos cardíacos consecutivos. La velocidad de fotogramas se mantuvo entre 70 fps y 100 fps. Todos los monos se sometieron a evaluación ecocardiográfica transtorácica con el transductor de 10,3 MHz (PI0-4, Siemens ACUSON Antares System, Alemania) en la posición lateral izquierda en el momento anterior, cuatro y ocho semanas después de la operación.

La fracción de expulsión (FE) del ventrículo izquierdo se evaluó con el método de plano único de Simpson. Se registraron directamente el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV, del inglés "Left ventricular enddiastolic volume") y el volumen telesistólico (LVESV, del inglés "Left ventricular end-systolic volume"), y la FE = (LVEDV-LVESV)/LVEDV x 100 %. El volumen sistólico (VS) del ventrículo izquierdo se calculó como VS = LVEDV-LVESV.

1.4 Imágenes cardíacas por resonancia magnética (MRI)

Todos los monos se anestesiaron con una inyección intramuscular de 10 mg/kg de ketamina y 0,2 mg/kg de midazolam, se intubaron para ayudar a la respiración y se estudiaron en un escáner clínico 3.0-T (Siemens) en posición supina antes y después del tratamiento utilizando una bobina de matriz de fase dedicada cardíaca y activación de ECG. El ECG para la activación de la secuencia es fundamental para el examen de RM. Los exámenes funcionales (cine MRI) se realizaron utilizando una secuencia de precesión libre en estado estacionario, eje corto y apnea (cobertura completa del ventrículo izquierdo; 1 corte por apnea; TR/TE, intervalo de latidos/mínimo; grosor del corte, 10 mm; número de visualizaciones por segmento, ⁸ ). Se obtuvieron adquisiciones mejoradas con dimegluminio de gadopentetato a lo largo del eje corto ventricular utilizando una secuencia de pulso híbrida de gradiente-eco-eco-planar segmentada por saturación con muescas intercaladas para 50 latidos del corazón durante el primer pase del material de contraste (exploración de perfusión con cinco imágenes por latido; tiempo de inversión, 160 ms; bolo i.v. de 0,1 mmol/kg izquierdo administrado a 5 ml/s), seguido de una secuencia de eco de gradiente preparada con inversión y recuperación (un corte por apnea, cinco cortes para cada fase temprana y retrasada) a lo largo del eje corto del ventrículo izquierdo realizada ² y ¹⁰ minutos después de la administración de un segundo bolo de ^{0 , 1} mmol/kg para la obtención de imágenes de realce temprano y tardío, respectivamente (tiempo de inversión para anular el miocardio normal fijado en 200 y 250 ms para la obtención de imágenes con realce temprano y tardío, respectivamente). Se obtuvieron vistas adicionales (cuatro cámaras o eje largo) si era necesario. El tiempo total del estudio fue de aproximadamente 30 minutos.

Análisis de imágenes de MRI: Para el análisis, las imágenes se muestran en el monitor del ordenador con el programa informático generalmente aceptado, Syngo Argus, que mostraba de manera conveniente las imágenes de las diferentes fases del ciclo cardíaco en los mismos cortes en la misma fila, y alineaba las imágenes de la misma fase del ciclo cardíaco de diferentes cortes. Con el enfoque de la regla de Simpson, que se utiliza con más frecuencia en la MRI cardíaca, se puede analizar una serie dinámica de imágenes de cine m Ri para proporcionar una evaluación precisa de los volúmenes ventriculares. A partir de los contornos que se trazaron de manera manual para definir los bordes endocárdicos y epicárdicos del miocardio de cada corte, en los que se incluyeron los músculos papilares, el volumen ventricular y los parámetros de función global, incluidos los volúmenes telediastólico y telesistólico, podría determinarse de manera automática la fracción de expulsión y el volumen sistólico utilizando la regla de Simpson mediante el programa informático Syngo Argus.

Tamaño del infarto: Se analizaron imágenes aleatorias y anónimas utilizando programa informático de análisis cardíaco. Para estimar el tamaño del infarto, los bordes endocárdicos y epicárdicos se segmentaron en las imágenes de LGE de manera automática con ajustes manuales seguidos de la delineación automática del tejido del infarto utilizando una fracción de segmento incorporada. Se realizaron correcciones manuales cuando fue necesario. El tamaño del infarto, expresado como porcentaje de masa ventricular izquierda, se calculó como volumen de infarto/volumen ventricular izquierdo (a partir de datos de cine). Las medidas del tamaño del infarto crónico determinadas por la resonancia magnética con contraste mejorado se reprodujeron.

1.5 Tratamiento con microburbujas de cobre mediante ultrasonido

Antes del procedimiento quirúrgico, todos los sujetos recibieron una inyección intramuscular de 5 mg/kg de ketamina y 0,2 mg/kg de midazolam para inducir la sedación. Los pelos que cubrían el pecho y las extremidades en los lugares de colocación de los electrodos se afeitaron minuciosamente para el tratamiento con microburbujas y un mejor registro del ECG. Se estableció el catéter venoso. Se realizó la terapia guiada por ultrasonidos del infarto de miocardio. La microburbuja de cobre se infundió cada tres días, a través del acceso intravenoso establecido a través de la vena safena externa que recorre la parte posterior de la pierna. Durante cada tratamiento con microburbujas de cobre, la sonda de ultrasonido (Vivid 7, M3S, GE) se colocó en el precordio del tórax para que la onda de ultrasonido pudiera dirigirse a la zona del infarto del corazón. El índice mecánico se estableció en 1,2. Después de cada inyección, las microburbujas de cobre que llegaron al ventrículo a través del sistema de circulación explotaron mediante la activación de la energía del ultrasonido. En algún momento, la sonda de ultrasonido se movió ligeramente hacia adelante y hacia atrás a lo largo del eje corto entre el ápice y la válvula mitral del corazón. Después de explotar la microburbuja de cobre de cada inyección, se siguió la siguiente infusión hasta finalizar la dosis de cada tratamiento (2 ml/kg). El tratamiento se realizó cada tres días. Antes del tratamiento y dos semanas después de que cada mono recibiera ocho tratamientos, se evaluaron la función y la estructura cardíacas para evaluar el efecto terapéutico.

1.6 Medición hemodinámica invasiva

La metodología invasiva de presión y volumen permite la medición de la presión del funcionamiento del ventrículo izquierdo ofreciendo una ventaja sobre otras mediciones disponibles de la función cardíaca. Combinada con la detección de ecocardiografía, el rendimiento cardíaco se midió de forma exhaustiva. Este procedimiento solo se realizó antes de la obtención final del experimento.

El registrador powelab (16 canales, ADinstrument Inc.) se conectó al catéter 3F (Millar Instrument Inc, EE. UU.). La presión se calibró de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

La anestesia se indujo con inyección intramuscular de agentes anestésicos. La ketamina (10 mg/kg) en combinación con midazolam (0,2 mg/kg) se utiliza para la sedación continua y constante. Se limpió el cuello del mono y se afeitó el vello que lo cubría. A continuación, el animal se colocó en la mesa de operaciones en posición supina. El acceso intravenoso se estableció con una aguja permanente venosa de calibre 25 a través de la vena safena externa. La anestesia se mantuvo con ¹⁰ mg/kg de ketamina y ^{2 0} mg/kg de propofol, diluidos hasta un volumen final de ^{2 0} ml con suero fisiológico. La mezcla se infundió de forma continua mediante una bomba de jeringa a la velocidad de 1 ml (kgh)-1. Para lograr resultados razonables durante la recogida de índices hemodinámicos, se debe tener cuidado en el mantenimiento de la anestesia con el uso adecuado y la optimización cuidadosa de los fármacos. Incluso una dosis ligeramente irregular puede afectar profundamente la función cardíaca.

Se realizó una incisión quirúrgica de 3 a 4 cm de longitud en la parte izquierda del cuello; el tejido s.c. y el plano muscular se disecaron entre la cara cutánea y el cuello cutáneo. Se disecó el plano facial entre la tráquea y el esternomastoideo para palpar el pulso carotídeo y localizar la vaina carotídea. La disección quirúrgica y la canulación de la arteria carótida derecha proporcionan el acceso más directo, oportuno y fiable al ventricular izquierdo, que se confirma mediante TC y reconstrucción 3D de la arteria carótida.

La arteria carótida común se aisló mediante disección roma de 2 cm de longitud. La arteria distal se ligó según fue necesario para reducir la pérdida de sangre. El vaso proximal se controló con suturas de seda quirúrgica 0 y el proximal se ocluyó con pinza vascular. La arteria expuesta se bañó en lidocaína al 2 % para dilatar el vaso y facilitar el acceso.

Se abrió el vaso carotídeo con una incisión de vaso pequeño y se colocó un catéter 3F Millar en la arteria, después se retiró la pinza vascular.

El catéter se avanzó de manera gradual a lo largo de la arteria carótida izquierda hasta el ventrículo izquierdo. A continuación se apretó el control del vaso proximal.

Se estableció la posición del eje del catéter y se giró para lograr una ubicación óptima de la punta a lo largo del eje del ventrículo izquierdo para una medición y registro precisos, en la detección asistida por ultrasonido. Los segmentos proximales del electrodo de conductancia, fuera de la cámara ventricular izquierda que muestra un ocho o un bucle irregular, indican mediciones aórticas y debe excluirse el volumen detectado por esos segmentos proximales. De manera alternativa, el catéter debe avanzar más hacia el interior del ventrículo izquierdo. Hay que asegurarse de que la punta del catéter esté orientada hacia el ápice y que el catéter de conductancia se mantenga en una posición estable y recta aproximadamente en el medio de la cámara ventricular, evitando el contacto con la pared. Si fuese necesario, se debe ajustar la posición del catéter para obtener bucles de presión y volumen regulares.

Después de la estabilización durante un período de tiempo, la dobutamina se infundió con una bomba de infusión a una dosis inicial de 10 |jg kg^-1 min-1, seguido de dosis crecientes de 30, 50, 70 |jg kg^-1 min^-1 durante 3 minutos cada etapa. El rendimiento cardíaco bajo la estimulación de dobutamina se registró de forma continua y simultánea mediante un instrumento. Se recogieron y analizaron dP/dt máx., -dP/dt mín., LVDP a la frecuencia cardíaca (FC) básica, que se define como la frecuencia cardíaca antes de la infusión de dobutamina, y el 110 %, el 120 %, el 130 %, el 140 % de la frecuencia cardíaca básica de todos los monos.

1.7 Examen histopatológico

Los monos se sacrificaron mediante inyección intravenosa de cloruro de potasio (10 %, 10 ml) y se realizó una autopsia completa. Los corazones recogidos se lavaron e inspeccionaron de manera macroscópica en busca de lesiones visibles y se fijaron en una solución de formaldehído al 10 %. A continuación, el corazón se cortó en seis bloques desde el ápice hasta la base a lo largo del eje largo. El grosor de cada bloque se fija en 0,5 cm. Hay que asegurarse de que la superficie de cada sección sea lisa y uniforme durante la incisión, y las secciones deben estar marcadas por la ligadura con un marcador. Se cortaron secciones delgadas y se tiñeron con Masson y H/E para examen microscópico.

Anticuerpo: Anticuerpo monoclonal de ratón anti-HIF-1a humano: ab16066, Abcam; monoclonal de ratón anti-VEGFA humano: sc-57496, Santa Cruz; anticuerpo monoclonal de conejo anti-VEGFR1 humano: 1303-12, Epitomics; anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD31 humano: Maixin bio-tech company, Fuzhou. La recuperación de antígenos de HIF-1a fue una recuperación de antígenos inducida por calor a alta presión mediante e Dt A cuyo pH era 9.0, mientras que la de VEGF y VEGFR1 fue una recuperación de antígenos inducida por calor de microondas mediante una solución tampón de citrato cuyo pH era 6,0, y la de CD31 fue una recuperación de antígenos inducida por calor de microondas mediante EDTA. La concentración de trabajo de HIF-1a fue 1:800, la de VEGF fue 1:100 y la de VEGFR1 fue 1:100. En el proceso de detección inmunohistoquímica, se tomó PBS del primer anticuerpo como control negativo; y los portaobjetos identificaron la expresión de proteína exacta como control positivo. El marcador Ki-67 se sometió a examen de inmunofluorescencia por confocal.

Densidad capilar: Primero se determinó un campo visual de la distribución capilar máxima con un microscopio de luz de 100 veces, y después se recogieron 5 campos visuales aleatorizados con un microscopio de luz de 200 veces y se midió la densidad capilar. Se definió capilar como el diámetro de cada lumen menor que la suma de ⁸ diámetros de glóbulos rojos. La medición se realizó por dos técnicos independientes.

Análisis semicuantitativo de la expresión de proteínas: Se utilizó el programa informático de análisis de imágenes Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics) para analizar la expresión semicuantitativa de las proteínas. Se observaron los portaobjetos de inmunohistoquímica y se tomaron fotografías con un microscopio óptico. Los portaobjetos de diferentes grupos se evaluaron por dos técnicos independientes y no hubo diferencias significativas entre los dos técnicos. Se tomaron fotografías de 5 campos visuales aleatorizados de la zona del borde y de la zona remota del infarto de cada portaobjetos con un microscopio de luz de 400 veces.

1.8 Transferencia de Western

Preparación de tejidos: Se extrajo el corazón del pecho. Se examinó cuidadosamente la pared del ventrículo izquierdo y la zona del infarto, la zona del borde y la zona remota se separaron. La zona del infarto se puede distinguir de la zona sin infarto por su apariencia pálida. La zona del borde se define como una zona desde 1 mm dentro hasta 3 mm fuera de la zona del infarto. Las muestras se conservaron en nitrógeno líquido para el análisis de transferencia Western.

Transferencia de Western: Se obtuvieron extractos de proteínas después de moler cada tejido en nitrógeno líquido y lisar en el tampón de lisis RIPA (Beyotime, CN) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA completo al 1 % (Roche, DE) durante 40 min en hielo. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo SCIENTIFIC, 23227, EE. UU.). Se solubilizaron cantidades iguales de proteína (30 |jg) de cada uno en 5 x tampón de muestra SDS y se separaron en geles de poliacrilamida al ⁸ % y SDS al 10 %. A continuación, las proteínas se transfirieron de manera electroforética a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Bio-Rad, EE. UU.). Las membranas se bloquearon durante 1 hora en solución salina tamponada con Tris/Tween 20 (TBST) (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,1 %) que contenía un 5 % de leche en polvo descremada, y se incubaron durante la noche a 4 °C con los respectivos anticuerpos primarios, tales como anti-HIF-1a (Abcam, ab113642, EE. UU.), anti-VEGF (Santa Cruz, sc57496, EE. UU.) y anti-VEFGR-1 (Abcam, ab32152, EE. UU.), en solución de bloqueo de acuerdo con las recomendaciones del vendedor. Después del lavado con TBST, las membranas se incubaron durante 1 h a 37 °C con el anticuerpo secundario adecuado. Las proteínas diana se visualizaron utilizando un sustrato de HRP de quimioluminiscencia (Millipore, EE. UU.) y se analizaron mediante densitometría utilizando el programa informático Quantity One.

1.9 Niveles de ARNm de los genes diana del HIF-1

Para definir la actividad de transcripción del HIF-1 en el miocardio isquémico, se analizó el nivel de ARNm de los genes diana del HIF-1 VEGF y VEGFR-1 (Flt-1) mediante RT-PCR.

El ARN total se aisló utilizando Trizol (Invitrogen, 15596-026, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Se transcribió de forma inversa 1 jg de ARN total según el protocolo utilizando el kit de reactivos PrimeScript™ RT (TaKaRa, RR037A, Japón) a 37 °C durante 15 min seguido de 85 °C durante 5 s y 4 °C durante 5 min. Las reacciones de RT-PCR en tiempo real se realizaron utilizando SYBR Premix Ex Taq™ II (TaKaRa, RR820A, Japón). Para amplificar los fragmentos de ADNc de VEGF y VEGFR1, las muestras se procesaron utilizando un sistema en tiempo real BIO-RAD CFX96: se desnaturalizaron a 95 °C durante 30 s, seguido de 35 ciclos, cada uno con variaciones de temperatura de la siguiente manera: 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s. Se analizaron los resultados de la fase log-lineal de la curva de crecimiento y se realizó la cuantificación relativa utilizando el método 2-ACT. El nivel de expresión génica de VEGF y VEGFR1 se expresa en relación con la actina en cada muestra. Se realizaron al menos 3 réplicas para cada muestra. Las secuencias de cebadores se muestran en la tabla 1.

Tabla 1 Secuencias de cebadores

1.10 Concentración de Cu en el corazón

Las muestras de tejido se congelaron recientemente y se almacenaron a -80 °C antes de la liofilización. Después de la liofilización y la digestión de los tejidos con ácido nítrico, los digeridos eran incoloros o de color amarillo claro y transparentes sin precipitado ni residuo visible. Se añadió agua ultrapura a cada recipiente para diluir e1HNO³ al 2 % para los análisis posteriores de cobre. Las concentraciones de cobre se determinaron mediante espectrofotometría de absorción atómica en horno de grafito (ICE3500, Thermo) utilizando el programa que se muestra en la tabla 2.

T a l 2 Pr r m r f m rí r i n mi n h rn r fito

1.11 Análisis estadístico

Todos los datos se expresaron como medias ± DE. La variación de cada parámetro se comparó entre los cuatro grupos utilizando la homogeneidad de la prueba de Levene y el coeficiente de varianza (CV). Se utilizó el paquete estadístico SPSS 14.0 (SPSS, Chicago, IL) y se supuso una diferencia significativa cuando los valores de p eran <0,05.

2. Resultados

2.1 Función cardíaca y reserva cardíaca

El examen de ecocardiografía mostró que, después del tratamiento con microburbujas de cobre, la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo se incrementó significativamente. Sin embargo, en el grupo no tratado y el grupo de microburbujas, la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo disminuyó con el tiempo (Figura 16A). Y esta recuperación del rendimiento cardíaco se confirmó mediante un examen de MRI (Figura 16B). Investigaciones posteriores encontraron que la mejora de la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo era el resultado de la disminución significativa en el volumen telesistólico del ventricular izquierdo (p <0,05). Después de cada contracción del ventrículo izquierdo, la sangre residual se redujo notablemente en el grupo de tratamiento con microburbujas de cobre, lo que significa que la función sistólica del ventricular izquierdo mejoró significativamente (p <0,05) (Figura 17).

La medición hemodinámica invasiva se realizó en condiciones de estrés por fármacos. Con el aumento de la frecuencia cardíaca en respuesta al aumento de la dosis de dobutamina, los parámetros de reserva cardíaca se evaluaron a la elevación de la frecuencia cardíaca del 100 % al 140 % de la frecuencia inicial. Como valor absoluto de dP/dt máx., dP/dt mín. y de la presión de desarrollo del ventrículo izquierdo (LVPD) aumentó, mejoró el rendimiento de la reserva cardíaca. La medición hemodinámica invasiva mostró que, en comparación con el grupo tratado con microburbujas y sin tratar, el dP/dt máx. (Figura 18A), el dP/dt mín. (Figura 18B) y la LVPD (Figura 19) mejoraron significativamente en el grupo de tratamiento con microburbujas de cobre (p <0,05).

2.2 Tamaño del infarto

Se estimó el efecto del tratamiento en el volumen del infarto de miocardio medido por imágenes de resonancia magnética (MRI) antes del inicio del tratamiento y después de dos semanas de observación después del tratamiento. El análisis de comparación mostró que el tamaño del infarto en el grupo tratado con microburbujas de cobre-albúmina con contraste de ultrasonido (Cu+MB) se redujo evidentemente en comparación con el del pretratamiento (Figura 20). Sin embargo, en los grupos sin tratamiento y de tratamiento con microburbujas solas (MB), el tamaño del infarto no mostró cambios significativos. Los resultados confirmaron el efecto terapéutico del tratamiento con microburbujas de cobre y albúmina con contraste de ultrasonido (CAUCM, del inglés "copper-albumin ultrasound contrast microbubble") en la reducción del tamaño del infarto en corazones isquémicos en recuperación.

2.3 Inmunohistoquímica

Densidad capilar: CD31 fue un marcador de células endoteliales. En la zona del borde y la zona del infarto, el examen inmunohistoquímico mostró que había muchos capilares marcados con CD31 en el grupo de microburbujas de cobre (Figura 21 y figura 22), y mucho más que en el grupo de microburbujas y sin tratar (p <0,05). El gráfico estadístico de la densidad capilar mostró que la densidad capilar marcada con CD31 aumentó significativamente en la zona del borde y la zona del infarto después del tratamiento con microburbujas cargadas con cobre. ** significa p <0,01. El flujo sanguíneo local mejoró significativamente.

Las células positivas para Ki-67 fueron en nombre de la actividad de proliferación celular mediante confocal. Los datos mostraron que después del tratamiento con microburbujas cargadas con cobre, aparecieron muchas células de proliferación en la zona del infarto. Se detectó el HIF-1a en la zona del infarto mediante inmunohistoquímica. Los datos mostraron que el HIF-1a se localizó principalmente en el citosol y los núcleos de los cardiomiocitos residentes y las células endoteliales. Evidentemente, el nivel del HIF-1a se reguló positivamente en la zona del infarto (Figura 24). La figura 24 mostró que existía el HIF-1a en el citosol (flecha) y núcleos (punta de flecha) de cardiomiocitos y células endoteliales. La expresión del HIF-1a se reguló positivamente en la zona del infarto.

El nivel de proteínas del HIF-1a aumentó significativamente en la zona del infarto en comparación con otra zona como se muestra mediante el método de transferencia de Western. La figura 25 muestra el nivel de proteínas de1HIF-1a en diferentes partes de cada grupo, y la figura 26 muestra la expresión del HIF-1a en el miocardio infartado de cada grupo.

VEGF y VEGFR1 son genes controlados por HIF-1. El nivel de ARNm de VEGF y VEGFR1 se analizó mediante RT-PCR para revelar la actividad de transcripción del HIF-1. Como se muestra en la figura 27 y en la figura 29, el nivel de ARNm de estos dos genes se redujo notablemente en los grupos MB y no tratados, pero aumentó significativamente en el grupo tratado con Cu (Figura 28 y figura 30). Esto indica que la hipoxia crónica conduce a una actividad de transcripción del HIF-1 deprimida que puede recuperarse mediante el tratamiento con Cu.

La concentración de Cu en el miocardio se determinó mediante AAS. Como se muestra en la figura 33, la concentración de Cu aumenta después del tratamiento con Cu en el miocardio isquémico.

El mecanismo de acumulación del HIF-1a en la respuesta miocárdica al daño isquémico implica modulaciones de la PHD. La actividad enzimática de la PHD requiere oxígeno, hierro reducido y 2-oxoglutarato. Además, estas enzimas son sensibles a la disponibilidad de oxígeno afectada por muchos cambios metabólicos, incluidas las especies reactivas del oxígeno generadas por la cadena de transporte de electrones y la alteración del metabolismo y la función mitocondriales. Por lo tanto, las proteínas PHD actúan como sensores de oxígeno, acoplando cambios en la actividad transcripcional del HIF-1. Por lo tanto, la falta de oxígeno en el miocardio isquémico compromete la función de la PHD, que se acompaña de una mayor acumulación de productos génicos que responden a HIF-1a y HIF-1. La isquemia miocárdica aguda conduce a un aumento de la acumulación del HIF-1a y la expresión de genes regulados por e1HIF-1, entre los que se encuentran los implicados en la angiogénesis. Un estudio preliminar ha encontrado un aumento de ARNm y proteína de HIF-1a y VEGF en muestras de biopsia ventricular de pacientes sometidos a cirugía de derivación coronaria que tenían evidencia patológica de isquemia aguda. En estudios de modelos animales, también se encontró que una isquemia sistémica conducía a una elevación generalizada de HIF-1a y coronario.

Un estudio temprano que utilizó corazones de rata aislados perfundidos de manera ortógrada en la configuración de Langendorff ha producido evidencia directa de una movilización sustancial de cobre en el flujo coronario inmediatamente después de una prolongada, pero no corta, isquemia cardíaca. En la perfusión de Langendorff de corazones de rata aislados, el nivel de cobre fue de ⁸ a nueve veces mayor que el valor preisquémico en la primera fracción de flujo coronario (FFC) de reperfusión (0,15 ml) después de 35 min de isquemia. Los niveles en las FFC subsiguientes disminuyeron y alcanzaron el valor preisquémico, lo que indica que el cobre aparece en un estallido al reanudarse el flujo coronario. Después de 18 min de isquemia, el nivel de cobre en la primera FFC de reperfusión fue solo un 15 % por encima del valor preisquémico. La pérdida de cobre en la primera FFC se correlacionó bien con el grado de pérdida de la función cardíaca. Después de 18 min de isquemia, la función cardíaca era de aproximadamente un 50 % y el daño se consideró reversible, mientras que después de 35 min, la pérdida funcional superó el 80 % y se consideró irreversible. Por lo tanto, la pérdida de cobre después de una isquemia prolongada en el corazón resultaría directamente de la toxicidad isquémica.

El aumento de los niveles de homocisteína en la isquemia miocárdica se conoce desde hace mucho tiempo y se considera un factor de riesgo de patogenia miocárdica. Se ha observado que el cobre en sangre y la homocisteína estaban simultáneamente elevados en pacientes con enfermedad cardiovascular. Es razonable especular que la salida de cobre del corazón está relacionada con la homocisteína. Hay varias líneas de evidencia que indican la interacción entre el cobre y la homocisteína. En primer lugar, se ha observado de manera invariable que la hiperhomocisteinemia se asocia con concentraciones elevadas de cobre en sangre así como con ceruloplasmina. En segundo lugar, se han identificado complejos de cobre y homocisteína in vitro. En tercer lugar, la complementación con cobre restaura la actividad de la enzima dependiente del cobre en la condición de exposición a la homocisteína. Estas observaciones sugieren de manera colectiva que la interacción entre el cobre y la homocisteína puede ser responsable del flujo de cobre cardíaco.

El cobre es capaz de estabilizar el HIF-1a mediante un mecanismo que implica la inhibición de prolil hidroxilasas. Sin embargo, esta acción del cobre sería la misma que la de otros metales de transición tales como el cobalto y el níquel, que no son esenciales para la activación del HIF-1, pero mejoran la actividad de1HIF-1 cuando las células se exponen a una cantidad excesiva de estos metales de transición. Los presentes estudios han demostrado que el cobre es necesario para la actividad transcripcional del HIF-1. La quelación del cobre en células cultivadas bloquea la unión de HIF-1 inducida por IGF-1 al elemento sensible a la hipoxia (HRE, del inglés "hypoxia-responsive element") y la expresión de VEGF. Este efecto inhibidor puede aliviarse mediante la adición de un exceso de cobre en los cultivos. Además, se ha descubierto que esta acción del cobre depende de una chaperona del cobre para el Cu, Zn-superóxido dismutasa (CCS) y el silenciamiento del gen CCS bloquea la unión de HIF-1 y HRE inducida por IGF-1 y la expresión de VEGF, imitando el efecto de la quelación del cobre. Por otra parte, CCS interactúa directamente con HIF-1a, según lo revelado mediante un ensayo de inmunoprecipitación.

Hay varios lugares que potencialmente requieren cobre para la activación de1HIF-1, incluida la síntesis, estabilización, translocación de HIF-1a desde el citosol al núcleo, la unión a la secuencia HRE de genes diana y la formación del complejo transcripcional HIF-1. Se ha determinado de manera específica el mecanismo de acción del cobre en la regulación de la actividad transcripcional del HIF-1 en células HepG2 de hepatoma humano. El tratamiento de las células HepG2 con el quelante de cobre tetraetilenpentamina (TEPA) o ARNip dirigido a CCS suprimió la activación del HIF-1 inducida por la hipoxia. La adición de cobre en exceso alivió la supresión por TEPa , pero no por el silenciamiento del gen CCS. Este resultado de silenciamiento del gen CCS excluye un posible efecto de confusión sobre la quelación inespecífica por TEPA. Por lo tanto, los datos indicaron que se necesita cobre para la activación del HIF-1, pero la acción depende de CCS. La privación de cobre no afectó la producción ni la estabilidad de1HIF-1a, pero redujo la unión de HIF-1a a la secuencia HRE de los genes diana y a p300, un componente del complejo transcripcional HIF-1. El cobre probablemente inhibe FIH-1 para asegurar la formación del complejo transcripcional HIF-1. Por lo tanto, se concluyó que el cobre es necesario para la activación de1HIF-1 a través de la regulación de la unión de HIF-1a al HRE y la formación del complejo transcripcional HIF-1. Por tanto, la deficiencia de cobre suprime la actividad transcripcional del HIF-1 mediante la disminución de FIH-1.

Como prueba de concepto, se ha realizado un estudio utilizando complementos dietéticos con cobre para ratones con miocardiopatía hipertrófica. Los ratones se sometieron a sobrecarga de presión mediante constricción aórtica ascendente y se desarrolló hipertrofia cardíaca 4 semanas después del procedimiento. La complementación dietética con niveles fisiológicamente relevantes de cobre comenzó después de que se desarrolló la hipertrofia cardíaca. A las 4 semanas después de la complementación con cobre, se encontró que la miocardiopatía hipertrófica preestablecida se revirtió y esta reversión se produjo en presencia continua de sobrecarga de presión. La sobrecarga de presión sostenida condujo a una disminución de los niveles cardíacos de cobre y v Eg F junto con la supresión de la angiogénesis miocárdica. La complementación con cobre repone el cobre cardíaco, aumentó el VEGF y promovió la angiogénesis.

El HIF-1 está compuesto por un HIF-1p (ARNT) y un HIF-1p (o HIP-2p) expresados de manera constitutiva, que se somete a una regulación de hidroxilación en dos etapas (citosólica y nuclear) en condiciones aerobias. En el citosol, HIF-1p se somete a prolil hidroxilación por tres prolil hidroxilasas (PHD) principales, que utilizan O² como sustrato. El HIF-1p hidroxilizado se une a la proteína von Hipple-Lindau (pVHL), que se dirige a HIF-1p para ubiquitinación y degradación proteasomal. En el núcleo, HIF-1p interactúa con los cofactores SRC-1, CBP y p30o, que se inhibe por una asparagina hidroxilasa o factor inhibidor de HIF-1 (FIH-1). El FIH-1 también es una enzima dependiente de O². En condiciones de hipoxia, las PHD y el FIH-1 están inhibidos, conduciendo al escape de la degradación proteasomal de HIF-1p y la facilitación de la formación del complejo transcripcional HIF-1 y, por lo tanto, la activación del factor de transcripción. Se ha demostrado que el Co y el Ni inhiben las PHD, imitando así las condiciones de hipoxia, que conduce a la activación del HIF-1p. El exceso de Cu también inhibe las PHD y provoca el mismo efecto en e1HIF-1p que el Co y el Ni. Sin embargo, el Cu es necesario para la interacción entre HIF-1 y HRE, y actúa como inhibidor fisiológico del FIH-1 para asegurar la formación del complejo transcripcional del complejo HIF-1. Por lo tanto, la privación de Cu inhibe la actividad del HIF-1 (Figura 34).

La isquemia miocárdica produce acumulación del HIF-1a y el agotamiento del cobre. En esta condición, la acumulación del HIFa no se puede convertir en activación transcripcional del HIF porque es necesario el cobre para la formación del complejo transcripcional del HIF y para la interacción del HIF con la secuencia de HRE en los genes diana. Por lo tanto, aunque la acumulación del HIF tiene lugar en el miocardio isquémico, la deficiencia de cobre bloquea la expresión regulada por HIF de genes implicados en la angiogénesis, que conduce a la supresión de la angiogénesis miocárdica. Esto da como resultado un infarto de miocardio y progresa aún más a insuficiencia cardíaca.

Por lo tanto, el presente estudio se llevó a cabo mediante la administración dirigida de cobre a través de ultrasonido que desencadenó la explosión de una microburbuja de cobre para aumentar el contenido de cobre de la zona de isquemia local para el tratamiento del infarto de miocardio. Los resultados demostraron que, la actividad de transcripción del HIF se incrementó en la zona del infarto; la densidad capilar también se incrementó de manera significativa. Por otra parte, el examen de ecocardiografía mostró que la función cardíaca mejoró después del tratamiento con microburbujas de cobre. Además, la reserva cardíaca se incrementó de manera correspondiente en el grupo de tratamiento con cobre. Los resultados de este experimento proporcionaron una fuerte evidencia de que esta explosión de microburbujas de cobre inducida por ultrasonido será una estrategia novedosa para administrar cobre para el tratamiento del infarto de miocardio.

Ejemplo 3. T ratamiento de la lesión cerebral isquémica en ratas con materiales biológicos que contienen cobre

Con el fin de explorar un nuevo método para el tratamiento de la isquemia cerebral, este ejemplo utiliza nanomateriales de cobre para tratar un modelo de rata con isquemia para analizar el efecto terapéutico en la angiogénesis.

1. Métodos experimentales

1.1 Establecimiento del modelo de isquemia en ratas

Se criaron ratas macho sanas Sprague-Dawley (SD) con un peso corporal de 270 ± 15 g) en una habitación con temperatura y humedad constantes y 12 horas de alternancia de ciclo de luz y oscuridad. Las ratas se trataron con ayuno preoperatorio durante ¹² horas y suministro gratuito de agua potable.

1.2 Vías técnicas

Las ratas se dividieron en 5 grupos al azar: Grupo simulado, grupo IR, grupo IR Cu, grupo IR NM, grupo IR Cu-NM. A las ratas con isquemia cerebral se les inyectó respectivamente el mismo volumen de Cu, NM, material NM-Cu 10 mu (l) en el ventrículo estereotáxico 7 días después de la operación quirúrgica, y la puntuación de la función nerviosa y la tinción con TTC se realizaron en 14 días. A continuación, el tejido cerebral se fijó con paraformaldehído al 4 % para la detección inmunohistoquímica.

1.3 Las etapas de preparación del modelo de oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO)

La anestesia se indujo mediante una inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 10 % (0,35 ml/100 g), sin la cánula de tráquea y el respirador. Cuando las ratas no presentaron movimientos de las extremidades, con frecuencia respiratoria alrededor de 30 a 60 veces y los ojos mantenidos de cerca, se consideró que las ratas estaban anestesiadas con éxito. Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo como el método de Koizumi y Longa (Koizumi et al., 1986, Longa EZ, 1989), método de sutura ocluida, para hacer el modelo de oclusión de la arteria cerebral media con una sutura mejorada. El método tradicional se realizó con una sutura de monofilamento de nailon 4-0, cuya punta estaba redondeada mediante el calentamiento en una llama, con un diámetro de 0,20 a 0,25 mm. Debido a que la punta no era lo suficientemente grande, el vaso sanguíneo no se puede bloquear por completo, dando como resultado el reflujo. La sutura modificada, con un diámetro de 0,32 mm y una punta de 5 mm cubierta por gel de sílice, se marcó a 18 mm. La parte exterior de la sutura cubierta con silicona en la punta podría frotar contra la pared interna del vaso de manera compatible sin fugas. Por lo tanto, la tasa de reflujo se reduce para elevar la tasa de éxito del modelo.

Las ratas se colocaron en la mesa de operaciones después de la anestesia. La temperatura rectal se mantuvo a 37,0 °C con una almohadilla térmica durante el procedimiento quirúrgico. El pelo del cuello se afeitó, se desinfectó la zona quirúrgica con povidoneyodo y se desyodaron con alcohol etílico al 75 % y se prepararon paños quirúrgicos estériles. Después de cortar la piel del cuello a lo largo de la línea anterior media con unas tijeras para tejidos, 3 cm de longitud, el músculo del cuello y la glándula tiroides se separaron sin rodeos mediante una pinza de vaso, hasta exponer la arteria carótida primitiva (ACP), y después separar la arteria completamente hacia arriba a lo largo de la arteria carótida para revelar la arteria carótida externa (ACE) y la arteria carótida interna (ACI). La ligadura del extremo lejano de la ACE bloqueó el flujo sanguíneo de la arteria carótida con un plegador temporal y se realizó una pequeña incisión en la ACP. La sutura se insertó en la ACP a través de la pequeña incisión y después se avanzó suavemente a lo largo de la ACP y se bloqueó hasta alcanzar la obstrucción inducida por el plegador temporal. A continuación se abrió el plegador temporal, la sutura se empujó inmediatamente hacia la arteria carótida interna. Si se sintió resistencia durante el avance de la sutura, la punta de la sutura se introdujo en la arteria cerebral anterior y la pared lateral de la sutura ocluyó la arteria cerebral media, y la sutura debe detenerse para evitar que la sutura entre en la arteria pterigopalatina. La arteria pterigopalatina es la rama craneal externa de la ACI. La sutura no debe avanzarse a una profundidad de 10 mm si se ha insertado en la arteria pterigopalatina. Retirando la sutura y regulando la dirección correctamente, se podría insertar nuevamente en la ACI. A continuación se procedió a la sutura del músculo y de la incisión de la piel, a la desinfección con yodo y a la colocación de un vendaje estéril que cubrió a las ratas en una cámara húmeda a 33 °C para favorecer la recuperación de la anestesia. 90 min después de la MCAO, se volvió a realizar anestesia y se extrajo la sutura para la reperfusión sanguínea. Se dejó de tirar de la sutura cuando se sintió resistencia. La resistencia demuestra que la punta de la sutura ha llegado a la entrepierna de la arteria carótida primitiva, cortando entonces la sutura fuera de la piel. Es necesario mantener la temperatura corporal y un complemento de solución salina normal. Se inyectaron por vía intramuscular 400000 unidades de penicilina para prevenir una infección.

1.4 Evaluación de lesión cerebral posoperatoria

Puntuaciones de intensidad neurológica: La rata ideal MCAO mostró disfunción neurológica de diferente grado después de que la conciencia se recupera. La hemiplejía de las extremidades anteriores fue el síntoma principal, trasladar la cabeza al cuerpo contralateral, dar vueltas o volcar cuando trepan, doblar el cuerpo hacia un lado y doblar las extremidades posteriores cuando el modelo se dejó arriba también sucedió. La tasa de supervivencia se contó durante la observación.

La puntuación de disfunción neurológica se realiza después de que las ratas se despiertan. En este experimento se utilizó un criterio de puntuación de 18 puntos, Tabla 3. El sistema de puntuación MNSS (un total de 18 puntos) se dividió en: 1. Deportes ^{( 6} puntuaciones): observación del grado de flexión de la extremidad anterior contralateral cuando se levanta la cola. 2. Sensación (2 puntuaciones): sensación profunda y superficial. 3. Prueba de barra de equilibrio ^{( 6} puntuaciones): observación del estado del equilibrio después de la isquemia para ajustar el grado del defecto neurológico. 4. Reflexión (4 puntuaciones): incluido el reflejo del pabellón auricular, la córnea, el susto y la convulsión y así sucesivamente. '0' indica normal, '18' significa más grave. Lesión leve: 1-6; lesión moderada: 7-12; lesión grave: 13-18. Tras la isquemia y la reperfusión sin disfunción neurológica aparente, las ratas fueron excluidas del estudio después de 24 horas de reperfusión.

Tabla 3 Puntos de puntuación de intensidad neurológica modificada ______________________________________ Clasificación_______________________________________ Puntuación Pruebas motoras

Levantar la rata por la cola (3)

Flexión de la extremidad anterior 1 Flexión de la extremidad posterior 1 La cabeza se mueve >10° hacia el eje vertical en 30 s 1 Colocación de la rata en el suelo (normal = 0; máximo = 3) (3)

Paseo normal 0 Incapacidad para caminar derecho 1 Vueltas hacia el lado parético 2 Caída al lado parético 3 Pruebas sensoriales (2)

Prueba de colocación (prueba visual y táctil) Prueba propioceptiva (sensación profunda, empuje de

la pata

contra el borde de la mesa para

estimular los músculos de las extremidades) ¹ Pruebas de barra de equilibrio (normal = 0; máximo = ⁶ ) (⁶ )

Equilibrio con una postura estable 0 Agarra el lado de la barra 1 Abraza la barra y 1 extremidad se cae de la barra 2 Abraza la barra y 2 extremidades se caen de la barra o giran sobre la barra (>60 s) 3 Intenta mantener el equilibrio en la barra pero se cae (>40 s)) 4 Intenta mantener el equilibrio en la barra pero se cae (>20 s) 5 Cae; ningún intento de mantener el equilibrio o aferrarse a la barra (<20 s)_____________________________ ⁶ Ausencia de reflejos y movimientos anormales (4)

Reflejo del pabellón auricular (movimiento de la cabeza cuando se toca el conducto auditivo) 1 Reflejo de la córnea (parpadeo cuando la córnea se toca ligeramente con algodón) 1 Reflejo de sobresalto (respuesta motora a un ruido breve al romper un papel del portapapeles) 1 Convulsiones, mioclonía, miodistonía__________________________________________________________ 1_

Medición de la zona del infarto: Se utilizó la reacción de TTC (2,3,5-cloración trifenil tetrazolio) con las succinodeshidrogenasas de las mitocondrias para detectar la actividad de la célula. La tinción con TTC marcó los cortes de cerebro con lesión isquémica como blancos. La tinción con TTC (2 %) se realizó sin luz, en condiciones de 37 °C. Las muestras de cerebro se recogieron en diferentes momentos (18 por grupo) y se colocaron en el molde de corte de tejido, que se almacenó a -20 °C antes. El cerebro se cortó en ⁶ cortes desde el bulbo olfatorio hasta el lóbulo occipital en el molde de cortes después de 10 minutos de congelación, con un grosor de 2 mm por corte. A continuación, los cortes se sumergieron en TTC al 2 % y se colocaron en la incubadora a 37 °C durante 30 min, y después se fijaron durante la noche en el paraformaldehído al ¹⁰ %.

La tinción con TTC mostró qué parte de los cortes de tejido cerebral experimentaron hipoxia. Debido a esto, el alcance de la lesión cerebral marcado con TTC se utilizó ampliamente en la detección del tamaño de la isquemia del cerebro. Cada imagen de corte se recogió a través de una cámara digital (cámara digital Powershot 400, Canon Corp) y se procesó con el programa informático Image J para calcular la zona de la lesión cerebral. Al mismo tiempo, se utilizó la fórmula modificada para excluir la desviación resultante de los efectos del edema cerebral en el volumen real de la lesión cerebral: el (%) corregido = {[zona del hemisferio contralateral -(zona del hemisferio lesionado - zona de daño cerebral)]/zona del hemisferio contralateral} * ^{10 0} %.

Determinación del índice de la atrofia cerebral: este experimento se realizó para investigar el cambio del infarto cerebral en fase crónica, mostrando la zona del infarto cerebral diferentes grados de atrofia en ¹⁰ días, y siendo más evidente en 14 días. El cálculo del grado de la atrofia cerebral fue similar al cálculo de la zona del infarto cerebral. Índice de contracción del hemisferio cerebral infartado (%) = {(volumen del hemisferio - volumen del infarto del hemisferio contralateral)/volumen del hemisferio contralateral} * ^{10 0} %.

1.5 Preparación de materiales biológicos de cobre

Este ejemplo diseñó materiales de péptidos cortos con sitios de unión a Cu2+ (compuestos de histidina, arginina y glicina). El péptido corto se puede combinar con Cu2+ para formar muestras de hidrogel estables compuestas de materiales de nanofibras nanobiológicos (Cu-NM, que contienen 80 pM de CuSO⁴). Cu-NM tiene una función para liberar Cu2+ lentamente en una ubicación específica de los tejidos y órganos lesionados y promover la regeneración de los órganos y tejidos lesionados isquémicos mediante la utilización eficaz de la función biológica del cobre, al mismo tiempo, eliminar los efectos secundarios del ion cobre en los tejidos y órganos normales.

1.6 Inyección intraventricular de materiales nanométricos de cobre mediante técnica estereotáxica

Ubicación de los ventrículos laterales de la rata: El mapa de la anatomía del plano coronal mostró que los ventrículos laterales de la rata se ubicaron 0,8 mm detrás del bregma, 1,5 mm de manera lateral a la línea media, 4 a 4,5 mm de profundidad. Esta ubicación es el lugar óptimo para la inyección del medicamento.

7 días después de la isquemia/reperfusión cerebral, las ratas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 10 % (3,5 ml/kg). Las ratas se fijaron en el aparato estereotáxico después de la anestesia y se afeitó el pelo de la región parietal. Después de la esterilización común y la colocación de la toalla aséptica, se realizó una incisión de 1 cm en la piel a lo largo de la línea media para exponer el bregma. Se perforó un pequeño orificio de 1,5 mm de manera lateral a la línea media, 0,8 mm hacia atrás hasta el bregma en el cráneo, sin lesión del tejido cerebral. Se extrajeron 10 pl de material NM-Cu con una jeringa, que se fijó y reguló para ajustar la posición de la punta de la aguja. A continuación, se insertó la punta de la aguja de la jeringa en el pequeño orificio y se inyectó en el tejido cerebral, se detuvo a la profundidad de 4,5 mm. Se inyectó el material NM-Cu, 5 minutos después de que terminase la inyección, se retiró la jeringa y se selló el pequeño orificio con cera para huesos. Se suturó la incisión cutánea. Por otra parte, se inyectaron 10 pl de Cu en el grupo de terapia con Cu, y se inyectaron 10 pl de material nanométrico en el grupo de material, ningún tratamiento en el grupo simulado y el grupo de control. La puntuación de la función neurológica y la tinción con TTC se realizaron para medir el volumen de infarto y el grado de atrofia del cerebro 14 días después del tratamiento.

1.7 Detección de patología

Se inyectó Cu, NM y Cu-NM en el ventrículo cerebral una semana después de construir el modelo de isquemia/reperfusión cerebral. El tejido cerebral se recogió una semana después del tratamiento (cinco ratas en cada grupo). Después de la anestesia, se perfundió el corazón con solución salina al 0,9 % y paraformaldehído al 4 %, después se extrajo el tejido cerebral rápidamente y se fijó en paraformaldehído al 4 %. El corte de cerebro se seleccionó al nivel de la sección coronal del quiasma óptico, después se tiño de la siguiente manera.

Tinción con HE: las muestras se fijaron con formalina neutra al 10 %, se deshidrataron, y se embebieron en parafina. Los portaobjetos y cubreobjetos se remojaron con ácido nítrico durante la noche y se limpiaron con agua del grifo y agua destilada, a continuación, se limpiaron con alcohol anhidro y se colocaron en un lugar sin polvo. Después de secar a 37 °C, los portaobjetos se trataron con comprimidos de polilisina. La parafina de rutina de inclusión fue de 4 pm en sección seriada, después se secaron en horno a 60 °C. Las breves etapas de la tinción convenciona1H&E fueron: (1) retirar los cortes del tejido (4 pm) embebidos en parafina de la hidratación de parafina. (2) los cortes de tejido se diseminaron en hematoxilina de Harris durante 5 min y se lavaron con agua durante 1 min. (3) los cortes de tejido se diferenciaron con etanol de ácido clorhídrico al 75 % durante 30 s, se lavaron con agua durante 1 min. (4) los cortes de tejido se trataron con amoniaco durante 30 s y se lavaron con agua durante 1 min. (5) los cortes de tejido se tiñeron en eosina etanol ácida durante 12 min. (⁶ ) los cortes de tejido se lavaron con agua rápida. (7) se deshidrataron los cortes de tejido para hacerlos transparentes. (⁸ ) fijación de los cortes mediante goma neutra. A continuación se observaron cambios patológicos en la zona del infarto cerebral y se compararon con el tejido cerebral contralateral.

Inmunohistoquímica: se realizó para detectar angiogénesis. Las zonas detectadas incluyeron zonas de infarto, zonas circundantes de infarto y el tejido cerebral normal contralateral. Después de marcar los vasos sanguíneos con CD31, se inspeccionó la angiogénesis en la isquemia cerebral después de la intervención con nanomateriales de cobre. Las breves etapas de la inmunohistoquímica: (1) Los cortes de tejido (4 pm) se embebieron en parafina fuera de la cera de parafina. (2) Se enfrió la peroxidasa endógena con H²O² (peróxido de hidrógeno) al 3 % (3) Se bloqueó con suero de conejo al 10 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. (4) Se incubó en cabras al primer anticuerpo policlonal CD31 de rata (1:2000) a 4 °C durante la noche. (5) Después del lavado, el corte se incubó en cabras con el segundo anticuerpo policlonal CD31 de rata (1:2000) durante 1 hora. (⁶ ) Incubación en peroxidasa de rábano picante - avidina en enzima compuesta (1:200). (7) Tinción con diamino bifenil amoniaco (DAB).

1.8 Tratamiento estadístico

Los datos fueron analizados de manera estadística mediante el programa informático SPSS14.0 (SPSS, Chicago, IL) y el índice de medición en todos los resultados es la media ± desviación estándar (X ± DE), se comparan dos grupos mediante la prueba t. Se compararon varios grupos mediante análisis de varianza (ANOVA), prueba de LSD y varianza. No se asumió la misma varianza, se puede corregir con el método de Games-Howell. a = 0,05 para el nivel de inspección, P <0,05 para la diferencia estadística significativa.

2. Resultados experimentales

2.1 Observación posterior a la operación, la tasa de éxito del modelado y la tasa de supervivencia

La sutura se insertó a través de la arteria carótida interna y se retiró después de 90 minutos, para producir el modelo cerebral de isquemia/reperfusión. Cuando las ratas se recuperaron del estado de anestesia, mostraron el síntoma que incluía girar la cabeza hacia el cuerpo contralateral, extremidad anterior contralateral sin fuerza, vueltas en dirección contralateral o vuelco, extremidad anterior contralateral caída cuando se levanta la cola. Entre los 300 modelos MCAO, 210 modelos tuvieron éxito (una tasa de éxito del 70 %), 30 modelos no tuvieron éxito (10 %) y 60 ratas murieron (20 %), Tabla 4.

Tabla 4. Situación de los modelos de ratas

Análisis de las razones: 22 ratas no presentaban un defecto en la función de las extremidades y ⁸ ratas mostraban un síntoma de parálisis leve, recuperándose después de 24 a 48 horas. Las posibles razones fueron una profundidad de sutura insuficiente, lo que provocó la aparición de un hueco entre la pared lateral de la sutura y la pared interna del vaso, y que dio como resultado que la sangre fluyera hacia la arteria cerebral media. La segunda razón fue que la sutura se extrajo durante el cierre de la incisión cutánea, lo que condujo a una oclusión insuficiente. En tercer lugar, la mutación de los vasos sanguíneos contribuyó a una mejor tolerancia a la lesión por isquemia, con menor tiempo de recuperación de la función neurológica. La tinción con Tt C demostró que solo aparece algún infarto pequeño en la región de los ganglios basales en este tipo de ratas después de la MCAo . Los modelos fallidos se excluyen durante el experimento.

En cuarto lugar, hemorragia subaracnoidea: debido al exceso de profundidad de la sutura, la potencia excesiva para el avance de la sutura, el vaso fue perforado por la sutura, lo que provocó la hemorragia subaracnoidea. Mediante la autopsia, 18 ratas (30 % del total de ratas muertas) murieron a causa de la hemorragia subaracnoidea. Infarto cerebral grave: la excesiva profundidad de la sutura provocó una grave isquemia e infarto cerebral. La tinción con TTC mostró que 24 ratas (40 % del total de ratas muertas) murieron por el edema grave del cerebro, con el edema de todo el hemisferio cerebral. La tráquea y el vago resultaron dañados durante la operación: la lesión del vago provocó una masa de secreciones en el tracto respiratorio, que dio como resultado una hipoxia respiratoria. 10 ratas (el 16,7 % del total de ratas muertas) murieron por este motivo.

Muerte inexplicable: la muerte inexplicable en ratas apareció en el proceso de reproducción después de la cirugía. No se encontró una causa significativa de muerte mediante anatomía o tinción con TTC después de la muerte. Hubo ⁸ ratas en este grupo, que representa el 13,3 % de todas las muertes.

2.2 Puntuaciones de déficit neuronal

A los 14 días después de la isquemia cerebral, la puntuación de la función nerviosa mostró que el grupo simulado era normal, los grupos de control (IR), IR Cu, IR Nm , IR Cu-NM mostraron grados variables de lesión de la función nerviosa a los 14 días (Tabla 5). Pero la puntuación de función nerviosa del grupo IR Cu-NM a los 14 días fue significativamente más bajo que el grupo IR, el IR Cu y el IR NM (P <0,05); no hubo diferencia significativa entre el grupo (IR), IR Cu, IR NM (Figura 35).

Tabla 5. Puntuación neurológica de las ratas en el posoperatorio de 14 días (x± s ) Grupos Simulado IR IR Cu IR NM IR Cu-NM

NS ⁰ 6,94 ± 0,73 6,56 ± 1,20 6,22 ± 1,17 2,72 ± 0,89#

#, P <0,05 frente a IR, IR Cu, IR NM

2.3 Análisis del volumen del infarto cerebral

A los 14 días después de la isquemia cerebral, se realizó tinción con TTC para evaluar el volumen del infarto cerebral (Figura 36 A). Los resultados mostraron que no hubo infarto en el grupo simulado, pero IR Cu, IR NM, IR Cu-NM presentaron todos grados variables de infarto (Tabla ⁶ ). El volumen del infarto cerebral en el grupo IR Cu - NM fue significativamente inferior que en el grupo IR, el grupo IR Cu y el grupo IR NM (P <0,05); No hubo diferencia significativa entre los grupos (IR), IR Cu, IR NM (Figura 36 B).

Tabla ⁶. Comparación del volumen de ratas con infarto cerebral (x± s) Grupos Simulado IR IR Cu IR NM IR Cu-NM Volumen del infarto 0 34,14 ± 3,99 30,16 ± 3,96 31,57 ± 3,52 10,81 ± 2,98*

(%)

*, P <0,05 frente a IR, IR+Cu, IR NM

2.4 Análisis del índice de contracción cerebral

Después de la isquemia cerebral, el tejido cerebral local sufrió necrosis licuefactiva e infiltración de células inflamatorias, y el tejido necrótico se absorbió gradualmente, y finalmente se produjo una atrofia cerebral isquémica. Los resultados mostraron que la atrofia cerebral era evidente en los 14 días después del infarto cerebral, el índice de contracción del cerebro (9,93 ± 1,89 %) en ratas tratadas con Cu-NM fue significativamente inferior que el grupo IR (24,22 ± 3,39), el IR Cu NM (22,18 ± 2,93) y el grupo IR (22,11 ± 3,52) (Tabla 7); Y había más capilares en el tejido cerebral (Figura 37). No hay diferencia significativa entre los grupos (IR), IR Cu e IR NM. La figura 37A muestra que el tejido cerebral se contrae de manera evidente 14 días después del infarto cerebral. El cerebro en el grupo IR Cu-NM se contrajo ligeramente y aparecieron capilares más visibles. En la figura 37B: la comparación cuantitativa de la atrofia cerebral muestra que el grupo IR Cu-NM fue significativamente más bajo que el grupo IR, el IR Cu y el grupo IR NM (P <0,05).

Tabla 7. Indice de atrofia en el cerebro de rata (x± s )

Grupos Simulado IR IR+Cu IR NM IR Cu-NM Índice de atrofia

⁰ 24,22 ± 3,39 22,18 ± 2,93 22,11 ± 3,52 9,93 ± 1,89#

(%)

#, P <0,05 frente a IR, IR+Cu, IR NM

2.5 El cambio de morfología histopatológica tras el infarto cerebral

El tejido cerebral se procesó con tinción HE y se observó en microscopio: el número de neuronas era grande, el núcleo era evidente en los tejidos cerebrales normales; Las neuronas se redujeron de manera significativa en la zona del infarto, la disposición de las células era escasa y desordenada, había una amplia gama de necrosis celular, autólisis celular parcial, estructura difusa, nucleolo desaparecido, más burbuja libre de fibras nerviosas alrededor de las neuronas en la zona del infarto.

2.6 Detección de angiogénesis

La angiogénesis se detectó mediante tinción inmunohistoquímica con el marcador de células endoteliales vasculares CD31 para observar el número de vasos sanguíneos. Se observó principalmente la zona circundante de isquemia cerebral (zona límite isquémica, ZLI). La figura 39 mostró la zona de detección de la angiogénesis, como un cuadro pequeño que muestra la ZLI. A continuación, se calculó el número de vasos por mm cuadrado mediante el recuento vascular. De acuerdo con los resultados; había un gran número de nuevos vasos sanguíneos alrededor del infarto cerebral en el grupo IR Cu-NM y los vasos sanguíneos en este grupo eran evidentemente más que en otros grupos (Figura 40).

El infarto cerebral también denominado apoplejía cerebral isquémica (isquemia cerebral, IC), fue el resultado del trastorno del suministro de sangre al cerebro provocado por una estenosis o una oclusión vascular, conduciendo las partes correspondientes del tejido cerebral a la isquemia, anoxia y necrosis, la enfermedad de ablandamiento, que representa aproximadamente un 80 % de la apoplejía cerebral total. En la actualidad, el tratamiento de trombólisis superprecoz fue el único tratamiento eficaz para la IC, para restaurar el flujo sanguíneo de los tejidos isquémicos lo antes posible. Sin embargo, la franja de tiempo de la terapia de trombólisis tenía restricciones estrictas (<3 h). La franja de tiempo de la terapia de trombólisis para algunos pacientes se puede extender a 4,5 horas, pero menos del 5 % de los pacientes con trombólisis pueden recibir un tratamiento seguro y eficaz. El tratamiento de trombólisis después de la franja de tiempo dará lugar a una lesión grave por isquemia/reperfusión de isquemia/reperfusión (IR), aumento del riesgo de transformación hemorrágica y empeoramiento de la enfermedad. Ahora, incluso se ha demostrado que varios tipos de fármacos neuroprotectores son eficaces en modelos animales, pero se confirmó poco efecto sobre la aplicación clínica.

El daño cerebral isquémico, como una señal de daño tisular, inició mecanismos de reparación y regeneración de tejidos propios. Pero en la fase crónica de la lesión, la falta de señal de lesión tisular hizo que la capacidad de autorreparación y regeneración del cuerpo disminuyera o se perdiera de manera significativa, la regeneración endógena se limitó a recuperarse de la función cerebral lesionada. Entonces se activó el sistema consiguiente de regeneración y reparación de tejidos mediante medidas de intervención exógenas. El tratamiento exógeno activó la capacidad consiguiente de regeneración de tejidos y promovió la angiogénesis y la regeneración nerviosas. La combinación de regeneración nerviosa y vascular promovió la recuperación de la función neurológica.

La angiogénesis juega un papel importante en la recuperación de la función neural después de la isquemia cerebral. El periférico del recién nacido se localizó principalmente en la zona del infarto, la isquemia y la media banda oscura (penumbra isquémica, PI). Influenciadas por la circulación colateral, la isquemia y el istmo de media banda oscura proporcionaron un determinado flujo sanguíneo compensatorio. La isquemia medio oscura con muerte ocurrirá dentro de las células sin ningún tratamiento. Por lo tanto, la intervención exógena promovió la angiogénesis en media banda oscura isquémica, para salvar las células nerviosas dañadas mediante la estimulación del crecimiento capilar alrededor de la zona de isquemia y la formación de circulación colateral. Finalmente, se produjo la angiogénesis de la zona isquémica, que conduce a la recuperación de la función neural.

El cobre es una parte importante de la regulación de la actividad del factor 1 inductor de hipoxia (factor 1 inducible por hipoxia, HIF-1). El cobre puede activar el HIF-1 a través del complejo de transcripción HIF-1 y promover la expresión de VEGF, angiopoyetina-1 y otros factores, para promover la angiogénesis. El complemento de cobre en el tejido miocárdico isquémico puede restaurar de manera eficaz el suministro de sangre a la microcirculación, finalmente lograr la regeneración del tejido miocárdico y la restauración de la función neuronal.

Debido a que cantidades excesivas de cobre pueden provocar estrés oxidativo y producir efectos secundarios graves en el cuerpo, el sistema de administración controlable de cobre es una herramienta ideal para el uso clínico del cobre. El cargador de cobre ideal debe ser rico en cobre y permanecer más tiempo en el lugar específico de la lesión. A través de la liberación lenta del sistema de cobre, se activó la regeneración de tejido consiguiente para promover la mejora de la función nerviosa; y el cúprico debe tener una buena biocompatibilidad y ningún rechazo. Este ejemplo combinó iones de cobre con nanomateriales (nanobiomaterial, NM) juntos. Este nuevo tipo de nanomateriales de cobre (Cu-NM) tenía una muy buena compatibilidad biológica, puede promover la absorción eficaz de cobre a través de iones de cobre de liberación lenta en zonas isquémicas, para promover la angiogénesis en la zona de isquemia y aumentar el suministro de sangre mediante la mejora de la microcirculación del tejido cerebral dañado, para reparar el tejido enfermo y restaurar la función cerebral dañada.

Este tratamiento se realizó mediante la inyección de materiales nanométricos de cobre en el ventrículo cerebral de ratas en el 7.° día después de la isquemia/reperfusión.

Tanto el volumen del infarto como la atrofia cerebral disminuyeron de manera significativa en los 14 días. Evidentemente, se mejoró la función nerviosa. El material Cu-NM promovió el infarto cerebral y la regeneración vascular periférica, lo que sería útil para la recuperación de la función neural. El primer día después de la lesión isquémica cerebral, el tamaño del infarto cerebral y la puntuación de la función nerviosa fueron los más graves, y después el tamaño del infarto se redujo de manera gradual, la disfunción de la rata también mejoró de manera gradual. El tamaño del infarto se modificó poco hasta los 14 días. Con la persistencia de la lesión isquémica/de reperfusión, se suprimió el sistema de reparación consiguiente. Sin embargo, este tratamiento activó el mecanismo de reparación consiguiente del cuerpo para movilizar las células madre que fueron reclutadas a la zona del infarto, y finalmente se convirtieron en células maduras y reemplazaron a las células necróticas. Este ejemplo proporcionó una fuerte evidencia de la función de reparación consiguiente al tejido motivada por el complemento de cobre.

El cobre controló la expresión de varios factores de crecimiento vascular tales como el VEGF mediante la regulación del HIF-1. Estos factores fueron responsables de la angiogénesis. Los resultados mostraron que la densidad capilar aumentó de manera significativa alrededor de la zona del infarto cerebral. VEGF solo puede promover la formación de nuevos vasos sanguíneos, pero también requiere la participación de varios factores para hacer madurar los vasos sanguíneos. El cobre no solo indujo la formación de nuevos vasos sanguíneos, sino también promovió la maduración de los nuevos vasos sanguíneos. Estos efectos múltiples fueron más eficaces que el simple VEGF. Este ejemplo mostró que el cobre promovió la regeneración del vascular periférico del infarto y mejoró la recuperación de la función neural.

Este ejemplo mostró que el tratamiento con cobre redujo de manera evidente la atrofia cerebral. Después de un infarto cerebral, se produjeron necrosis y atrofia de neuronas y células gliales en zonas del infarto, pero el tratamiento con cobre podría revertir de manera parcial la atrofia cerebral. La investigación mostró que el cerebro infartado tenía la capacidad de regenerarse después de un daño cerebral. En el sistema nervioso central, la regeneración de las células nerviosas se produjo en dos zonas específicas: la zona subependimaria (zona subventricular, ZSV) y la circunvolución dentada del hipocampo de la zona del grano (zona subgranular, ZSG). En condiciones fisiológicas, las células nerviosas se originaron en la zona ZSV y migraron a lo largo de la corriente de migración rostral (la corriente migratoria rostral, CMR) hasta el bulbo olfatorio para complementar la apoptosis de las células nerviosas. Sin embargo, en condiciones de isquemia cerebral, la regeneración nerviosa de la zona ZSV aumentó de manera significativa; las nuevas células nerviosas cambiaron las vías tradicionales de migración de la CMR a la zona de la lesión y mejoraron la recuperación del tejido circundante. Estos estudios mostraron que el sistema nervioso central responde a las lesiones mediante la proliferación de células nerviosas y la migración celular en la zona de la lesión. Entonces, el cobre puede ser responsable de promover la regeneración nerviosa. Debido a que la regeneración nerviosa se basó en la base de la regeneración vascular, y ambos efectos promovieron la recuperación de la función neural. El cobre puede promover la expresión de varios factores de crecimiento vascular, y estos factores también tienen un papel importante en la regeneración nerviosa. Los estudios in vivo e in vitro confirmaron que VEGF aumentó la expresión del marcador de proliferación celular BrdU en las zonas ZSV de isquemia cerebral de los ratones, lo que indicó que VEGF actuó como un papel de la regeneración nerviosa a través de varios factores neurotróficos.

Ejemplo 4. Tratamiento del infarto cerebral en el macaco de la India con material de cobre

Este ejemplo usó 9 macacos de la India: 4 en el grupo no tratado y 5 en el grupo de tratamiento con cobre

1. El establecimiento del modelo de infarto cerebral en el macaco de la India

Se realizó abrosia durante ⁸ horas antes de la cirugía y todos los sujetos recibieron una inyección intramuscular de 10 mg/kg de ketamina y 0,2 mg/kg de midazolam para inducir la sedación. El animal se colocó en la mesa de operaciones después de la anestesia. Se afeitó a fondo el pelo que cubre el cerebro, las extremidades en los lugares de fijación de los electrodos y la placa negativa de los lugares del cuchillo endotérmico para un mejor registro y funcionamiento del ECG. Se estableció la galería de venas y se conectó el monitor después de afeitarse la piel. Se realizó una medición estándar no invasiva durante la cirugía, incluyendo el ritmo cardíaco, presión sanguínea, saturación de oxígeno, presión parcial de dióxido de carbono y temperatura. A continuación, los sujetos recibieron una inyección intramuscular de bromuro de vecuronio para la cánula de tráquea. Se insertó un catéter traqueal de 3,5 a 4,5 en la tráquea con la ayuda de un laringoscopio. La ubicación de la cánula de la tráquea debe confirmarse para asegurarse de que esté en la tráquea en lugar de en el esófago. Se ajustó el parámetro del respirador, adoptando el modelo de control de presión, P = 12 a 20 mmHg, 40/min de frecuencia respiratoria, 10 a 15 ml/kg de volumen corriente, 30 a 40 mmHg de presión de dióxido de carbono. El estado de la anestesia se mantuvo mediante la inhalación del isoflurano (0 % al 1,5 %), microinyección venosa de fentanilo (2 pg/kg), bromuro de vecuronio (0,05 mg/kg). Con el resultado satisfactorio, el animal se colocó en la mesa de operaciones, fijando la cabeza en el fijador con 15° hacia arriba, para exponer el frontotemporal derecho. La región de la operación se esterilizó mediante el yodóforo, colocando la toalla aséptica. La craneotomía frontotemporal comenzó en el arco cigomático derecho y terminó en la línea media.

El procedimiento de la operación comprende cortar la piel, tejido subcutáneo y temporal y exponer el cráneo frontotemporal. La perforación abrasiva perfora el cráneo frontotemporal para producir un pequeño orificio, y se formó una comunicación ósea de 3 * 5 cm con pinzas gubias. Se corta el endocráneo, se fija en el temporal, para exponer el lóbulo temporal. El tejido cerebral se cubrió con un tejido de algodón para reducir la lesión del mismo. La parte inferior del lóbulo frontal y la zona de la silla se expusieron de manera prudente con una espátula cerebral. Cuando se pudo ver el nervio óptico, la aracnoides debe estar separada por el separador, liberando el líquido cefalorraquídeo, para reducir la presión del tejido cerebral. Una vez que el tejido cerebral disminuyó, el lóbulo temporal frontal debe ser empujado hacia un lado por el retractor de movimiento automático para exponer el espacio de la operación. Cuando la carótida interna está expuesta desde el extremo cercano al extremo lejano, se ven dos ramas de la arteria en la entrepierna de la ACI, incluyendo la arteria cerebral media (ACM) y la arteria cerebral anterior (ACA). Se separa la ACM desde el extremo cercano hasta el extremo lejano para exponer la primera sección (sección M1) de la misma. La sección de inicio de la ACM se liga con una sutura 6-0, y la sección M1, de 5 mm de longitud, se coagula con electricidad por el polo gemelo. Se corta la sección coagulada por electricidad para bloquear la circulación sanguínea de la ACM. La región de la operación se limpió con solución salina normal, se limpió la duramadre, el músculo y la piel. Se esteriliza la herida y se utiliza un apósito esterilizado para cubrirla.

El cuidado posoperatorio consistió en mantener la temperatura corporal con manta eléctrica después de la anestesia, mantener el tracto respiratorio desbloqueado y sacar el catéter traqueal cuando se restableció el reflejo de deglución. El animal fue devuelto a la sala de cría hasta que pudiera darse la vuelta o ponerse de pie. Se utilizaron 100 mg de tramadol para aliviar el dolor mediante inyección intramuscular y ² mg de granisetrón para prevenir las náuseas y los vómitos mediante la misma forma de inyección. Se observó al animal 1 a 2 veces al día después de la operación para asegurar si había ocurrido un síndrome u otra anomalía en la región de la cirugía.

2. Puntuación de la función nerviosa del modelo de infarto cerebral en macaco de la India

La puntuación de la función nerviosa adoptó principalmente la escala de calificación de accidente cerebrovascular de primates no humanos (Escala de accidente cerebrovascular de primates no humanos, NHPSS) (Tabla ⁸ ) y la escala de calificación de accidente cerebrovascular de mono revisada (Escala de puntuación neurológica modificada para accidente cerebrovascular de mono, mNSS) (Tabla 9), para la evaluación completa de la función de los nervios craneales de los macacos de la India en muchos aspectos, tales como la conciencia, el reflejo muscular y nervioso, y el equilibrio. La puntuación de la función nerviosa más elevada representó la peor función nerviosa.

_______________ Tabla ⁸. Escala de accidente cerebrovascular de primates no humanos, NHPSS_______________ 1. Estado de conciencia (0-2)

⁰ - normal

¹ - somnoliento a apático

² - inconsciente

2. Reacción de defensa (0-2)

⁰ -normal

¹ - disminuida

² - ninguna

3. Reflejo de agarre (derecha/izquierda) (0-1X2): 0-presente; 1-ausente

4. Movimiento de las extremidades (superior/inferior, derecha/izquierda) (0-4x4)

⁰ - normal

¹ - uso o fuerza asimétrica observada

² - debilidad clara y marcada

3- movimiento mínimo, debilidad profunda

4- no hay uso voluntario y no hay uso en respuesta a la estimulación

5. Marcha (0-3)

⁰ -normal; ¹ -cojeando

2-gravemente discapacitado; 3-no camina (pero puede gatear)

⁶. Dando vueltas (0-2)

⁰ - comportamiento normal

¹ - preferencia notable por girar hacia un lado_______________________________________________________ ___________________________________________(continuación)__________________________________________ ² -rotación constante

7. Bradicinesia (0-2)

⁰ -ninguna; ¹ -leve; ² -intensa

⁸. Equilibrio (0-2)

⁰ - normal

¹ - levemente deteriorado

² -profundamente deteriorado, incapaz de pararse sobre los pies

9. Heminatención (derecha/izquierda) (0-2x2)

⁰ -sin heminatención

¹ - extinción del estímulo hacia un lado cuando se presenta con estímulos simultáneos

² - heminatención total de todos los estímulos, visual, auditivo y táctil______________________________ 10. Corte del campo visual/hemianopsia (derecha/izquierda) (0-1x2)

⁰ - ninguno

1- no hay respuesta a los estímulos visuales en el campo afectado. Se diferencia de la heminatención por la ausencia de reflejo de parpadeo (no diferencia la lesión cortical, pero diagnostica la lesión óptica o por radiación óptica en contraposición al problema cortical.

11. Debilidad facial (derecha/izquierda) (0-2x2)

⁰ - sin debilidad

leve

2- profundo (si es 7o central: babeo constante, ángulo de la boca colgante___________________________

_____ Tabla 9. Escala de puntuación neurológica modificada para accidente cerebrovascular en mono, mNSS Categoría____________________________________________________________________ Puntuación Conciencia (0-8)

Normal, siempre alerta y agresivo 0 Consciente y mínimamente agresivo 1 Consciente y evasivo 2 Consciente pero tolerante 3 Somnolencia, se excita con la estimulación 4

Letargia, ojos abiertos por estimulación intensa 5 Estuporoso, se excita con estimulación persistente ⁶

Coma ligero, solo movimiento reflejo 7

Coma profundo, sin movimiento ⁸

Sistema motor (ipso-/contra-) (0-14x2)

1. Mano (fuerza motriz/movimiento, ipso-/contra-)

Normal 0

Uso de asimetría: favorece la extremidad opuesta (capaz de agarrar ¹

las barras de la jaula con la mano afectada)

Hemiparesia leve (capaz de levantar la mano afectada) 2 Hemiparesia moderada (debilidad clara y marcada, solo capaz de ³

sostener el cuerpo)

Hemiparesia intensa (movimiento mínimo, debilidad profunda) 4

No hay uso voluntario y no hay movimiento en respuesta a la ⁵ estimulación

2. Pierna (fuerza motriz/movimiento, ipso-/contra-)

Normal 0

Cojera mínima (capaz de caminar y saltar con la pierna afectada) 1 Hemiparesia leve (capaz de estar de pie con la pierna afectada) 2 Hemiparesia moderada (levantada con flexión de la rodilla contra la ³

gravedad)

Hemiparesia intensa (movimiento posible, pero no contra la gravedad) 4 Completamente paralizado e inútil 5

3. Debilidad facial (fuerza motriz/movimiento, ipso-/contra-)

Normal 0

Debilidad leve 1

Debilidad profunda 2

4. Reflejo de agarre (ipso-/contra-0-1 x2)

Presente 0 Disminuido 1

Ninguno 2

Sistema sensorial (ipso-/contra-) (0-4x2)

1. Sensación facial

Reacciona constantemente al tacto en cualquier zona de la cara 0

Ausente, no reacciona al tacto en ninguna zona de la cara 1

2. Reflejo del pabellón auricular___________________________________________________________ ___________________________________________ (continuación)_______________________________

Categoría____________________________________________________________________ Puntuación

Contracción de la oreja en respuesta a la estimulación del cabello o

externo/interno

Ausente, no mueve la oreja r en respuesta al tacto 1

3. Reflejo del dolor

Retirada fuerte, rápida y completa al pellizcar el dedo del pie 0

Retirada débil, lenta, incompleta o inconsistente al pellizcar el dedo del ¹

pie

Ausente, no hay retirada al pellizcar el dedo del pie 2

Coordinación músculo esquelético (0-6)

Normal, camina de manera normal 0

Descoordinación mínima, camina con alguna discapacidad en la ¹

marcha

Descoordinado, pero capaz de trepar por una red de alambre 2

Se para de forma independiente, se cae a los pocos pasos 3

Sentado, solo capaz de dar vueltas 4

Posado en posición decúbito lateral o dorsal 5

Sin movimiento ⁶

Corte del campo visual/hemianopsia (ipso-/contra-) (0-2x2)

Normal 0

Hemianópico (ciego en la mitad del campo visual) 1

Ceguera completa 2

Trastorno de la bolsa de las mejillas (ipso-/contra-) (0-3x2)

Ausente 0

Presente

Pequeño (5 cm) 1

Moderado (5 a 10 cm) 2

_____ Grande (>10 cm)_____________________________________________________________ 3

Total: 60 puntuaciones___________________________________________________________________

3. Resultados de la puntuación neurológica

El infarto cerebral se ha formado a los 7 días después de la isquemia cerebral, tratada mediante la inyección de nanomateriales de cobre que transportan, se realizó una evaluación neurológica posoperatoria. Se encontró que la disfunción neural en el grupo del complejo de cobre se redujo de manera significativa (P <0,05). Con el paso del tiempo, la recuperación funcional neuronal pareció más significativa. Los resultados mostraron que los complejos de cobre pueden promover de manera eficaz la recuperación funcional neural después del infarto cerebral en el macaco de la India y mejorar la función nerviosa (Figura 41, cuanto más baja es la puntuación representa el daño es más leve y hay mejor función nerviosa). La figura 41 es la evaluación del grado de disfunción nerviosa en el modelo de infarto cerebral en macaco de la India. Comparado con el grupo no tratado, los resultados mostraron que el tratamiento con el complejo de cobre mejoró de manera significativa la función nerviosa.

Ejemplo 5: El cobre promueve la angiogénesis en el anillo aórtico aislado de rata

Este ejemplo demuestra que el VEGF es esencial para la angiogénesis, pero el efecto proangiogénesis del cobre no actúa mediante una producción mejorada del VEGF. La estimulación con cobre de la angiogénesis a nivel del sistema de órganos depende del VEGF, pero la estimulación con cobre de la proliferación de células endoteliales vasculares en cultivos es independiente del VEGF. En este ejemplo, se utilizaron anillos aórticos aislados de rata. La aorta torácica se aisló de ratas Sprague Dawley (de ⁸ a 10 semanas) y se seccionó en anillos vasculares de 1,0 mm de espesor para su cultivo. Se añadió sulfuro de cobre a una concentración final de 5, 25, 50 o 100 pM a los cultivos y se mantuvieron durante ⁸ días. Un quelante de cobre, la tetraetilenpentamina (TEPA), a una concentración final de 25 pM, se añadió a algunos cultivos para bloquear el efecto del cobre. Se utilizó un anticuerpo anti-VEGF para determinar el papel del VEGF en la promoción con cobre de la angiogénesis. Los datos obtenidos mostraron que el cobre a 5 pM en cultivos estimulaba la formación vascular; un efecto que fue bloqueado por TEPA. El cobre a concentraciones superiores a 50 pM perdió el efecto proangiogénesis. Sin embargo, el cobre a 5 pM no mejoró la producción del VEGF y las concentraciones por encima de 50 pM aumentaron de manera significativa la producción del VEGF. Por otra parte, el tratamiento con anticuerpo anti-VEGF bloqueó completamente el efecto proangiogénesis del cobre 5 pM.

1. Métodos

1.1 Anillo aórtico aislado de rata y condiciones de tratamiento

Se extrajeron las aortas torácicas de ratas Sprague Dawley (SD) macho de ⁸ a 10 semanas de edad (292 a 307 g) y se transfirieron inmediatamente a una placa de cultivo que contenía medio basal endotelial sin suero helado-2 (EBM-2, Lonza Cologne AG). El tejido fibroadiposo periaórtico se extrajo con cuidado con unas pinzas de microdisección finas y unas tijeras de iridectomía; prestando especial atención a no dañar la pared aórtica. Se seccionaron anillos aórticos de un milímetro de largo y se enjuagaron extensamente en cinco lavados consecutivos con EBM-2.

1.2 Ensayo para angiogénesis

Se cubrieron placas de grado de cultivo de tejidos de cuarenta y ocho pocillos con 100 j l de matrigel (GFR, BD) y se dejaron gelificar durante 45 min a 37 °C, CO² al 5 %. Se colocaron los anillos aórticos en los pocillos recubiertos de matrigel, se cubrieron con 100 j l de matrigel adicional y se dejaron gelificar nuevamente durante 45 min a 37 °C, CO² al 5 %. A continuación, se añadieron al cultivo 250 j l de EBM-2 que contenía suero bovino fetal (FBS) al 1 %. Se añadió solución de sulfuro de cobre al cultivo a una concentración final de 5, 25, 50 o 100 pM de elemento de cobre. Los medios de cultivo se eliminaron y se reemplazaron cada 2 días. Los anillos aórticos se fotografiaron el día ⁸.

1.3 Análisis de las imágenes

La zona de brote angiogénica se calculó utilizando el programa informático Image J (NIH, Bethesda, MD). Las densidades de los microvasos se expresan en píxeles cuadrados.

1.4 Análisis de transferencia de Western del VEGF

Los extractos de proteínas se obtuvieron después de lisar los anillos aórticos de rata con matrigel en el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Beyotime, Jiangsu, CN) que contenía cóctel inhibidor de proteasa sin ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) completo al 1 % (Roche, Mannhein, DE) durante 30 min en hielo. La misma carga de proteína se aseguró mediante cuantificación previa utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo, Rockford, EE. UU.). Se resolvió una cantidad adecuada de proteína en los lisados totales en un gel de electroforesis de dodecilsulfato de sodio (SDS) y poliacrilamida y se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Bio-rad, EE. UU.). Las membranas se bloquearon durante 1 h en solución salina tamponada con Tris/Tween 20 (TBST) (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0.1 %) que contenía leche desnatada en polvo al 5 % y se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario de ratón anti-VEGF (Santa Cruz, CA, e E. UU.) y el anticuerpo de ratón anti-p-actina (ZSGB-BIO, Beijing, CN) diluidos en el tampón de bloqueo. Después del lavado con TBST, las membranas se incubaron con un anticuerpo antiinmunoglobulina G (IgG) de ratón ligado a peroxidasa de rábano picante (HRP) (ZSGB-BIO, Beijing, CN) diluido en TBST durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas diana se visualizaron utilizando un sustrato HRP de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, EE. UU.).

1.5 Neutralización del VEGF

Los anillos aórticos se cultivaron en placas de 48 pocillos en 250 j l de medio EBM-2 (FBS al 1 %) que contenía anticuerpo anti-VEGF (Santa Cruz, CA, EE. UU.) a una concentración final de 2 ng/ml. El tratamiento y el ensayo de angiogénesis fueron los mismos que los anteriores.

1.6 Análisis estadístico

Los datos se obtuvieron de tres experimentos independientes y se expresaron como medias ± EEM. Los resultados presentados en la figura 42 y la figura 44A se analizaron inicialmente mediante análisis de varianza unidireccional y se analizaron adicionalmente mediante la prueba T3 de Dunnett para la comparación entre múltiples grupos. Se aplicó un diseño factorial 2 * 2 a los datos presentados en la figura 43, la figura 44B y la figura 45. Después de que se detectó una interacción significativa, se determinó además la significación de los efectos principales. El nivel de significación se estableció en P <0,05.

2. Resultados

2.1 El efecto del cobre en la angiogénesis del anillo aórtico aislado de rata

La figura 42 muestra los efectos de concentraciones variables de sulfuro de cobre en la angiogénesis de los anillos aórticos de rata aislados cultivados en EBM-2 con FBS al 1 %. Se añadió sulfuro de cobre directamente a los cultivos a la concentración final del elemento cobre de 0 (control), 5, 25, 50 o 100 jM y se mantuvo durante ⁸ días. Los datos cuantitativos se obtuvieron de tres experimentos separados; cada uno contenía tres muestras para cada tratamiento, y los datos se presentaron como media ± EEM; 'significativamente diferente del grupo de control (P <0,05) (barra = 500 jm ).

Se observó que el cobre a 5 jM tenía el efecto de promoción más fuerte sobre la angiogénesis. Las concentraciones por encima de este nivel no solo no mostraron un efecto proangiogénesis sino que también mostraron un efecto inhibidor significativo a concentraciones por encima de 50 jM . Las concentraciones finales de cobre, incluidas las contribuciones del medio, FBS (1 %) y el cobre añadido fueron 26,9, 344,4, 1614,4, 3201,9 o 6416,9 jg /l en cultivos a los que se añadió 0, 5, 25, 50 o 100 jM de cobre, respectivamente. Por consiguiente, las concentraciones de cobre en los anillos aórticos después del cultivo durante ⁸ días en concentraciones variables de cobre añadido fueron, respectivamente, 5,9, 26, 63, 106 o 162 pg/g de tejido, que fue proporcional a las concentraciones de cobre en los cultivos.

Un quelante de cobre, la tetraetilenpentamina (TEPA), se añadió solo como control o de manera simultánea con el cobre a una concentración final de 25 pM al cultivo durante ⁸ días. Mediante este tratamiento, la propia TEPA provocó una inhibición de la angiogénesis y suprimió por completo el efecto de promoción angiogénica del cobre 5 pM, como se muestra en la figura 43. Los anillos aórticos aislados de rata cultivados en EBM-2 con FBS al 1 % se trataron con sulfuro de cobre 5 pM, TEPA 25 pM o ambos durante ⁸ días. Los datos cuantitativos se obtuvieron de tres experimentos separados; cada uno contenía tres muestras para cada tratamiento, y los datos se presentaron como media ± EEM; 'significativamente diferente del grupo de control (P <0,05) (barra = 50o pm).

2.2 El efecto del cobre sobre la producción del VEGF en el anillo aórtico aislado

Los resultados presentados en la figura 44 muestran que, a 5 pM en el cultivo, el cobre no mejoró la producción del VEGF en el tejido vascular aislado, pero a concentraciones superiores a 50 pM, que causó una supresión de la angiogénesis, el cobre aumentó de manera significativa la producción del VEGF. La TEPA a una concentración final de 25 pM disminuyó de manera significativa los niveles del VEGF en el tejido del anillo aórtico aislado de rata tratado con o sin cobre 5 pM en cultivos (Figura 44). La figura 44 muestra el análisis de transferencia Western de los niveles de proteína VEGF en los anillos aórticos de rata aislados. La figura 44A muestra los efectos de concentraciones variables de cobre en los niveles de proteína VEGF. El protocolo de tratamiento fue el mismo que se presenta en la figura 42. La figura 44B muestra el efecto de la TEPA en los niveles de proteína VEGF. El protocolo de tratamiento fue el mismo que se presenta en la figura 43. Todos los datos cuantitativos se obtuvieron de tres experimentos independientes y se presentaron como media ± EEM; *significativamente diferente del grupo de control (P <0,05).

2.3 El efecto del anticuerpo anti-VEGF en la promoción con cobre de la angiogénesis

Los resultados presentados en la figura 45 muestran que una concentración final de 2 ng/ml de anticuerpo anti-VEGF en el cultivo solo suprimió de manera significativa la angiogénesis y su combinación con cobre 5 pM bloqueó por completo el efecto de la promoción angiogénica del cobre. La figura 45 muestra el efecto del anticuerpo anti-VEGF en la promoción con cobre de la angiogénesis. Los anillos aórticos aislados de rata cultivados en EBM-2 con FBS al 1 % se trataron con sulfuro de cobre 5 pM, 2 ng/ml de anticuerpo anti-VEGF o ambos durante ⁸ días. Los datos cuantitativos se obtuvieron de tres experimentos independientes y se presentaron como media ± EEM; 'significativamente diferente del grupo de control (P <0,05) (barra = 500 pm).

Sin embargo, el anticuerpo anti-VEGF solo o su combinación con cobre 5 pM no afectó a la producción del VEGF (Figura 46). La figura 46 muestra el efecto del anticuerpo anti-VEGF en los niveles de proteína VEGF en anillos aórticos de rata aislados. Se aplicó el mismo protocolo de tratamiento descrito para la figura 45. Todos los datos cuantitativos se obtuvieron de tres experimentos independientes y se presentaron como media ± EEM; 'significativamente diferente del grupo de control (P <0,05).

Ejemplo 6. Tratamiento con complementos de zinc para la lesión hepática

Las células estrelladas hepáticas secretan una gran cantidad de colágeno después de un estímulo persistente de alcohol, virus y sustancia química. Se produjo fibrosis y daño hepático debido a la deposición excesiva de matriz extracelular. Debido a la función específica del zinc para revertir la fibrosis, este ejemplo utiliza la terapia con complemento de zinc dirigida para activar la autorreparación consiguiente del tejido hepático, movilizar células madre (por ejemplo, células madre mesenquimatosas de la médula ósea) que migran al lugar de la lesión del hígado, se diferencian en células hepáticas y regeneran el tejido lesionado. El complemento de zinc dirigido se logra mediante una explosión de microburbujas cargadas de zinc mediada por ultrasonido para administrar el zinc al tejido hepático lesionado. Después de un tratamiento dirigido con complementos de zinc, la fibrosis hepática se revierte, se recupera la función hepática.

Este experimento se llevó a cabo para evaluar el efecto terapéutico de la explosión de microburbujas cargadas con zinc medicadas con ultrasonidos sobre la fibrosis hepática y la enfermedad del hígado graso. El modelo de fibrosis hepática de rata Wister se indujo mediante la inyección de 100 mg/kg de tiacetamida (TAA) en días alternativos hasta la aparición de síntomas de la fibrosis hepática. A continuación, los modelos se dividieron en dos grupos, el grupo tratado y el grupo no tratado. En el grupo tratado, el tratamiento con explosión de microburbujas cargadas con zinc medicada por ultrasonidos se llevó a cabo cada tres días. Después del tratamiento, se tomó una muestra de sangre para los marcadores relacionados con la lesión hepática, grasa en la sangre, lípido hepático, colágeno, actividad de enzimas antioxidantes y examen de metabolitos de sobreoxidación de lípidos. El estado de lesión hepática se juzgó de acuerdo con la detección de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST). TNF-a e IL-p se secretan después de una lesión hepática, que a su vez aceleran el daño hepático. Por lo tanto, los niveles de TNF-a e IL-p son indicadores para evaluar el grado de daño hepático. Además, el reverso de la fibrosis hepática también puede evaluarse mediante un corte de tejido hepático y una biopsia.

Este experimento se lleva a cabo para evaluar el efecto terapéutico de la explosión de microburbujas cargadas con

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un oligoelemento para su uso en un método para inducir la reparación tisular en un tejido cerebral de un individuo que tiene una lesión en el tejido cerebral, comprendiendo el método administrar directamente en el lugar de la lesión una cantidad eficaz del oligoelemento, en donde el oligoelemento es cobre.

2. El oligoelemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se inducen al menos dos acontecimientos de reparación tisular.

3. El oligoelemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende inducir (a) la migración de células madre mesenquimatosas de la médula ósea al lugar de la lesión, y/o (b) la diferenciación de las células madre en el lugar de la lesión.

4. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos un acontecimiento de la reparación tisular comprende revertir el daño en el lugar de la lesión.

5. El oligoelemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la reparación tisular comprende inducir el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el lugar de la lesión cerebral.

⁶. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el individuo tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido.

7. El oligoelemento para su uso de acuerdo con la reivindicación ⁶ , en donde el individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido es un individuo que tiene una lesión tisular crónica.

⁸. El oligoelemento para su uso de acuerdo con la reivindicación ⁶ o 7, en donde el individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido es un individuo que tiene deficiencia de células madre.

9. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones ⁶ a ⁸ , en donde el individuo que tiene un sistema de reparación de tejidos comprometido es un individuo que tiene al menos 60 años de edad.

10. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el método comprende además administrar una cantidad eficaz de células madre.

11. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la lesión es un accidente cerebrovascular, opcionalmente en donde el accidente cerebrovascular es isquémico.

12. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el oligoelemento está compuesto por una microburbuja, opcionalmente, en donde la microburbuja se formula para la administración intravenosa, y en donde el oligoelemento se libera a través de una explosión dirigida al lugar de la microburbuja en el lugar de la lesión, opcionalmente, en donde la explosión dirigida al lugar de la microburbuja es por ultrasonidos.

13. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el oligoelemento se formula para inyección a través de un catéter y permanece concentrado en el lugar de la inyección tras la inyección.

14. El oligoelemento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el oligoelemento está compuesto por un implante, opcionalmente en donde:

(a) el implante está recubierto con el oligoelemento, o

(b) el implante se selecciona del grupo que consiste en una endoprótesis, una placa y una membrana.