ES2900381T3 - Composiciones y anticuerpos anti-tim-3 - Google Patents

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Torben Gjetting
Gunther Roland Galler
Monika Gad
Michael Monrad Grandal
Klaus Koefoed
Michael Kragh
Ivan David Horak
Thomas Bouquin
Mikkel Wandahl Pedersen
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Abstract

Un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, en donde dicho anticuerpo comprende las secuencia de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de las SEQ ID NO: 7-12, respectivamente, y en donde dicho anticuerpo o porción de unión al antígeno de este aumenta la secreción de IFN-γ y de TNF-α en un ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y anticuerpos anti-tim-3
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
TIM-3 (proteína 3 que contiene inmunoglobulina de linfocitos T y el dominio de mucina), también conocido como HAVCR2 (receptor celular 2 del virus de la hepatitis A) o CD366, es un miembro de la familia de proteína de dominio de mucina e inmunoglobulina de linfocitos T. TIM-3 está codificada en los humanos por el gen Havcr2 y es una glicoproteína de tipo I 33 kDA con un dominio IgV distal de membrana y un dominio de mucina proximal de membrana. Contiene una región conservada de cinco residuos Tyr en el dominio intracelular, que se fosforilan tras la unión al ligando. TIM-3 se expresa mediante un rango de diferentes células que se originan de ambos grupos adaptativos e innatos del sistema inmunitario, que incluyen linfocitos T, células dendríticas, macrófagos y células citotóxicas naturales (NK, por sus siglas en inglés). La expresión de TIM-3 es baja en linfocitos T sin tratamiento previo pero es regulada por aumento tras la activación de los linfocitos T. Contrario a los linfocitos T, las células innatas como las células dendríticas, células NK y monocitos tienen una alta expresión basal de TIM-3. TIM-3 se ha asociado con diversos ligandos, en general promiscuos, que incluyen galectina-9, fosfatidilserina, CEACAM-1 y HMGB-1, pero actualmente se desconocen las funciones exactas de estos ligandos.
Si bien se ha sugerido que TIM-3 es un inhibidor del punto de control, hay relativamente poca evidencia que respalde la idea que TIM-3 media directamente la supresión de la activación de los linfocitos T o la secreción de citocina de una manera similar a, por ejemplo, PD-1. Además, y contrario a PD-1, TIM-3 parecería cumplir una función en la regulación de las células del sistema innato y, en particular, las células dendríticas. En la publicación de patente PCT WO 2013/006490 y Kikushige y Miyamoto (Int J Hematol. 98:627-33 (2013)) se hace referencia a anticuerpos murinos anti-TIM-3 y se contempla su uso para la detección y/o el tratamiento del cáncer. La mayoría de los datos funcionales relacionados con TIM-3 y su función en la inmunología tumoral deriva de estudios in vivo mediante el uso de diversos anticuerpos. En la mayoría de estos estudios, debido a la deficiente validación de anticuerpos, no queda claro si los efectos de los anticuerpos TIM-3 son mediados por la inhibición de la unión al ligando o por un efecto agonista en el objetivo.
En vista de sus propiedades regulatorias de la respuesta inmunitaria, se ha investigado a TIM-3 como un posible objetivo para la inmunoterapia, incluso para el tratamiento de cáncer y enfermedades autoinmunitarias. Un único anticuerpo anti-TIM-3 está actualmente en desarrollo clínico, pero no hay actualmente anticuerpos anti-TIM-3 aprobados.
En vista de la función fundamental de TIM-3 como un modulador inmunitario, existe una necesidad de nuevas y mejoradas terapias inmunitarias que se dirijan a TIM-3 para tratar cánceres y determinados trastornos del sistema inmunitario.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos recombinantes novedosos que se dirigen a TIM-3, como se define en las reivindicaciones, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de estos anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo anti-TIM-3 que, mediante actividad en TIM-3, activa diversas células inmunitarias, tales como las células presentadoras de antígeno profesionales (por ejemplo, células dendríticas y macrófagos) y linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T colaboradores y linfocitos T citotóxicos). La presente invención también se refiere al uso de los anticuerpos y composiciones farmacéuticas para mejorar la inmunidad en un paciente y para el tratamiento de cánceres que se originan en tejidos como la piel, los pulmones, los intestinos, los ovarios, el cerebro, la próstata, los riñones, los tejidos blandos, el sistema hematopoyético, la cabeza y el cuello, el hígado, la vejiga, las mamas, el estómago, el útero y el páncreas. En comparación con los tratamientos actualmente disponibles para dichos cánceres, incluso los tratamientos con anticuerpos, se contempla que los anticuerpos de la invención pueden proporcionar una respuesta clínica superior tanto solos como en combinación con otro agente terapéutico para el cáncer, como un anticuerpo que se dirija a otra proteína del punto de control inmunitario.
Los anticuerpos de la presente invención comprenden las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de las SEQ ID NO: 7-12, respectivamente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, en donde el anticuerpo anti-TIM-3 es el anticuerpo que se menciona en la presente como anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086 o 17144.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, en donde el anticuerpo anti-TIM-3 es el anticuerpo que se menciona en la presente como anticuerpo 20131, 20293, 15105, 15107, 15109, 15174, 15175, 15260, 15284, 15299, 15353, 15354, 17244, 17245, 19324, 19416, 19568, 20185, 20300, 20362 o 20621, o una variante de cualquiera de estos, donde la variante puede, por ejemplo, contener determinados cambios mínimos de aminoácidos con respecto a dicho anticuerpo (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cambios de aminoácidos, que pueden estar, por ejemplo, en las regiones marco) sin perder la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que compite para la unión a TIM-3 de humano, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano, con cualquiera de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, 20131,20293, 15105, 15107, 15109, 15174, 15175, 15260, 15284, 15299, 15353, 15354, 17244, 17245, 19324, 19416, 19568, 20185, 20300, 20362 y 20621.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de H-CDR3 de la SEQ ID NO: 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222 o 232.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una H-CDR1-3 que comprende las secuencias de H-CDR1-3, respectivamente, de las SEQ ID NO: 30-32, 40-42, 50-52, 60-62, 70-72, 80-82, 90-92, 100­ 102, 110-112, 120-122, 130-132, 140-142, 150-152, 160-162, 170-172, 180-182, 190-192, 200-202, 210-212, 220-222 o 230-232.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90 % (por ejemplo, al menos 92 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntico en la secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 3, 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un VH que comprende la SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228 y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada (CH) de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 23, 24 o 25.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de L-CDR3 de la SEQ ID NO: 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175, 185, 195, 205, 215 o 225.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una L-CDR1-3 que comprende las secuencias de L-CDR1-3, respectivamente, de las SEQ ID NO: 33-35, 43-45, 53-55, 63-65, 73-75, 83-85, 93-95, 103­ 105, 113-115, 123-125, 133-135, 143-145, 153-155, 163-165, 173-175, 183-185, 193-195, 203-205, 213-215, 223-225 o 233-235.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90 % (por ejemplo, al menos 92 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntico en la secuencia a la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene una cadena ligera (LC) que comprende la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229 y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada anteriores y cualquiera de las secuencias de cadena ligera anteriores.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una H-CDR3 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de H-CDR3 y L-CDR3, respectivamente, de las SEQ ID NO: 32 y 35, 42 y 45, 52 y 55, 62 y 65, 72 y 75, 82 y 85, 92 y 95, 102 y 105, 112 y 115, 122 y 125, 132 y 135, 142 y 145, 152 y 155, 162 y 165, 172 y 175, 182 y 185, 192 y 195, 202 y 205, 212 y 215, 222 y 225, y 232 y 235.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una H-CDR1-3 y L-CDR1-3 que comprenden las secuencias de H-CDR1 -3 y L-CDR1 -3, respectivamente, de las SEQ ID NO: 30-35, 40-45, 50-55, 60­ 65, 70-75, 80-85, 90-95, 100-105, 110-115, 120-125, 130-135, 140-145, 150-155, 160-165, 170-175, 180-185, 190­ 195, 200-205, 210-215, 220-225 o 230-235.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un VH que es al menos 90 % (por ejemplo, al menos 92 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntico en la secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228, y un VL que es al menos 90 % (por ejemplo, al menos 92 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntico en la secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228, y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un VH tiene una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y una HC que comprende (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, o (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228 y la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID n O: 23, 24 o 25.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de:
a) SEQ ID NO 30-35, respectivamente;
b) SEQ ID NO 40-45, respectivamente;
c) SEQ ID NO 50-55, respectivamente;
d) SEQ ID NO 60-65, respectivamente;
e) SEQ ID NO 70-75, respectivamente;
f) SEQ ID NO 80-85, respectivamente;
g) SEQ ID NO 90-95, respectivamente;
h) SEQ ID NO 100-105, respectivamente
i) SEQ ID NO 110-115, respectivamente
j) SEQ ID NO 120-125, respectivamente
k) SEQ ID NO 130-135, respectivamente
l) SEQ ID NO 140-145, respectivamente
m) SEQ ID NO 150-155, respectivamente
n) SEQ ID NO 160-165, respectivamente
o) SEQ ID NO 170-175, respectivamente
p) SEQ ID NO 180-185, respectivamente
q) SEQ ID NO 190-195, respectivamente
r) SEQ ID NO 200-205, respectivamente;
s) SEQ ID NO 210-215, respectivamente
t) SEQ ID NO 220-225, respectivamente;
u) SEQ ID NO 230-235, respectivamente
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno que compite para la unión a TIM-3 de humano con, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que, un anticuerpo cuyos dominios variables de cadena pesada y ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de:
a) SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente;
b) SEQ ID NO: 15 y 4, respectivamente;
c) SEQ ID NO: 28 y 29, respectivamente;
d) SEQ ID NO: 38 y 39, respectivamente;
e) SEQ ID NO: 48 y 49, respectivamente;
f) SEQ ID NO: 58 y 59, respectivamente;
g) SEQ ID NO: 68 y 69, respectivamente;
h) SEQ ID NO: 78 y 79, respectivamente;
i) SEQ ID NO: 88 y 89, respectivamente;
j) SEQ ID NO: 98 y 99, respectivamente;
k) SEQ ID NO: 108 y 109, respectivamente
l) SEQ ID NO: 118 y 119, respectivamente
m) SEQ ID NO: 128 y 129, respectivamente
n) SEQ ID NO: 138 y 139, respectivamente
o) SEQ ID NO: 148 y 149, respectivamente
p) SEQ ID NO: 158 y 159, respectivamente
q) SEQ ID NO: 168 y 169, respectivamente
r) SEQ ID NO: 178 y 179, respectivamente
s) SEQ ID NO: 188 y 189, respectivamente
t) SEQ ID NO: 198 y 199, respectivamente;
u) SEQ ID NO: 208 y 209, respectivamente;
v) SEQ ID NO: 218 y 219, respectivamente; o
w) SEQ ID NO: 228 y 229, respectivamente.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de:
a) SEQ ID NO 3 y 4, respectivamente;
b) SEQ ID NO 15 y 4, respectivamente;
c) SEQ ID NO 28 y 29, respectivamente;
d) SEQ ID NO 38 y 39, respectivamente;
e) SEQ ID NO 48 y 49, respectivamente;
f) SEQ ID NO 58 y 59, respectivamente;
g) SEQ ID NO 68 y 69, respectivamente;
h) SEQ ID NO 78 y 79, respectivamente;
i) SEQ ID NO 88 y 89, respectivamente;
j) SEQ ID NO 98 y 99, respectivamente;
k) SEQ ID NO 108 y 109, respectivamente
l) SEQ ID NO 118 y 119, respectivamente
m) SEQ ID NO 128 y 129, respectivamente
n) SEQ ID NO 138 y 139, respectivamente
o) SEQ ID NO 148 y 149, respectivamente
p) SEQ ID NO 158 y 159, respectivamente
q) SEQ ID NO 168 y 169, respectivamente
r) SEQ ID NO 178 y 179, respectivamente
s) SEQ ID NO 188 y 189, respectivamente
t) SEQ ID NO 198 y 199, respectivamente
u) SEQ ID NO 208 y 209, respectivamente
v) SEQ ID NO 218 y 219, respectivamente
w) SEQ ID NO 228 y 229, respectivamente
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno que comprende una cadena pesada y una cadena ligera cuyos dominios variables tienen las secuencias de aminoácidos de:
a) SEQ ID NO 3 y 4, respectivamente;
b) SEQ ID NO 28 y 29, respectivamente;
c) SEQ ID NO 38 y 39, respectivamente;
d) SEQ ID NO 48 y 49, respectivamente;
e) SEQ ID NO 58 y 59, respectivamente;
f) SEQ ID NO 68 y 69, respectivamente;
g) SEQ ID NO 78 y 79, respectivamente;
h) SEQ ID NO 88 y 89, respectivamente;
i) SEQ ID NO 98 y 99, respectivamente;
j) SEQ ID NO 108 y 109, respectivamente
k) SEQ ID NO 118 y 119, respectivamente
l) SEQ ID NO 128 y 129, respectivamente
m) SEQ ID NO 138 y 139, respectivamente
n) SEQ ID NO 148 y 149, respectivamente
o) SEQ ID NO 158 y 159, respectivamente
p) SEQ ID NO 168 y 169, respectivamente
q) SEQ ID NO 178 y 179, respectivamente
r) SEQ ID NO 188 y 189, respectivamente
s) SEQ ID NO 198 y 199, respectivamente
t) SEQ ID NO 208 y 209, respectivamente
u) SEQ ID NO 218 y 219, respectivamente
v) SEQ ID NO 228 y 229, respectivamente
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende:
a) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 29 y 6;
b) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 38 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 39 y 6;
c) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 48 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 y 6;
d) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 58 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59 y 6;
e) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 68 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 y 6;
f) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 78 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 79 y 6;
g) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89 y 6;
h) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 98 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 99 y 6;
i) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 108 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 109 y 6;
j) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 118 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 119 y 6;
k) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 128 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 129 y 6;
l) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 138 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 139 y 6;
m) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 148 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 149 y 6;
n) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 158 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 159 y 6;
o) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 168 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 y 6;
p) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 178 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 y 6;
q) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 188 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189 y 6;
r) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 198 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199 y 6;
s) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 208 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 209 y 6;
t) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 218 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 219 y 6; o
u) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 228 y 5 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 229 y
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende:
a) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 29 y 6;
b) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 38 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 39 y 6;
c) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 48 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 y 6;
d) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 58 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59 y 6;
e) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 68 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 y 6;
f) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 78 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 79 y 6;
g) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89 y 6;
h) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 98 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 99 y 6;
i) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 108 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 109 y 6;
j) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 118 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 119 y 6;
k) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 128 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 129 y 6;
l) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 138 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 139 y 6;
m) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 148 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 149 y 6;
n) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 158 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 159 y 6;
o) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 168 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 y 6;
p) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 178 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 y 6;
q) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 188 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189 y 6;
r) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 198 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199 y 6;
s) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 208 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 209 y 6;
t) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 218 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 219 y 6; o
u) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 228 y 23 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 229 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende:
a) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 29 y 6;
b) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 38 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 39 y 6;
c) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 48 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 y 6;
d) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 58 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59 y 6;
e) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 68 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 y 6;
f) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 78 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 79 y 6;
g) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89 y 6;
h) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 98 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 99 y 6;
i) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 108 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 109 y 6;
j) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 118 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 119 y 6;
k) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 128 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 129 y 6;
l) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 138 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 139 y 6;
m) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 148 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 149 y 6;
n) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 158 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 159 y 6;
o) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 168 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 y 6;
p) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 178 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 y 6;
q) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 188 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189 y 6;
r) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 198 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199 y 6;
s) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 208 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 209 y 6;
t) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 218 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 219 y 6; o
u) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 228 y 24 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 229 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende:
a) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 29 y 6;
b) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 38 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 39 y 6;
c) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 48 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 y 6;
d) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 58 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59 y 6;
e) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 68 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 y 6;
f) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 78 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 79 y 6;
g) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89 y 6;
h) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 98 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 99 y 6;
i) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 108 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 109 y 6;
j) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 118 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 119 y 6;
k) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 128 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 129 y 6;
l) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 138 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 139 y 6;
m) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 148 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 149 y 6;
n) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 158 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 159 y 6;
o) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 168 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 y 6;
p) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 178 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 y 6;
q) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 188 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189 y 6;
r) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 198 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199 y 6;
s) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 208 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 209 y 6;
t) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 218 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 219 y 6; o
u) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 228 y 25 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 229 y 6.
La invención proporciona un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, en donde dicho anticuerpo comprende H-CDR1-3 y L-CDR1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7­ 12, respectivamente.
En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, en donde dicho anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
En modalidades particulares, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 15 y 25 y una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este que se une a un epítopo de TIM-3 que comprende los residuos de aminoácidos F61 y 1117 de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, 20293 o 20131). El epítopo puede comprender además el residuo de aminoácidos R69 (por ejemplo, anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 o 20293). El epítopo puede comprender además P50, E62, M118 y D120 (por ejemplo, anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 o 20131) y puede comprender además los residuos de aminoácidos R69, V60 y G64 (por ejemplo, anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 o 15086.17144).
El anticuerpo o porción puede unirse a un epítopo de TIM-3 que comprende los residuos de aminoácidos P50, V60, F61, E62, G64, R69, I117, M118 y D120 de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, o 15086.17144), residuos de aminoácidos F61, R69 y 1117 de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpo 20293), residuos de aminoácidos P50, F61, E62, 1117, M118 y D120 de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpo 20131).
La invención proporciona un anticuerpo monoclonal o una porción de unión al antígeno de este que se une a un epítopo de TIM-3 que comprende los residuos de aminoácidos 62-67 de la SEQ ID NO: 236 (es decir, anticuerpo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 o 20293). En el presente documento se describe un anticuerpo monoclonal o una porción de unión al antígeno de este que se une a un epítopo de TIM-3 que comprende los residuos de aminoácidos 114-117 de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpo 20131)
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 es un anticuerpo IgG, por ejemplo, un anticuerpo IgG humano. En determinadas modalidades, el anticuerpo comprende al menos una mutación en la región Fc . En modalidades particulares, el anticuerpo comprende una mutación en una o más de las posiciones de aminoácidos de cadena pesada 228, 233, 234 y 235, que se numeran de acuerdo con el esquema de numeración IMGT. Por ejemplo, uno o ambos de los residuos de aminoácidos en las posiciones 234 y 235 pueden mutarse a Ala y/o el residuo de aminoácido en la posición 228 puede mutarse a Pro.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención tiene al menos una de las siguientes propiedades:
a) se une a TIM-3 de humano con un Kd de 23 nM o menos según se mide mediante resonancia de plasmones de superficie;
b) se une a TIM-3 de cynomolgus con un Kd de 22 nM o menos según se mide mediante resonancia de plasmones de superficie;
c) se une a TIM-3 de humano con un EC50 de 1,2 nM o menos según se mide mediante ELISA;
d) se une a TIM-3 de cynomolgus con un EC50 de 46 nM o menos según se mide mediante ELISA;
e) aumenta la secreción de IFN-y en un ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito;
f) aumenta la secreción de IFN-y en un ensayo bilateral mixto de reacción de linfocito;
g) aumenta la secreción de TNF-a en un ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito;
h) aumenta la secreción de TNF-a de células dendríticas; y
i) inhibe la interacción de TIM-3 con fosfatidilserina.
Los ejemplos de dicho anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, anticuerpo 15086.15086 (que tiene al menos las propiedades a, c, d, e, g y h); anticuerpo 15086.17145 (que tiene al menos las propiedades a, c, d, e, g, h e i), y anticuerpo 15086.16837 o 15086.17144 (que tienen al menos las propiedades a, c y d. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención tiene todas las propiedades mencionadas. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tiene al menos las propiedades a, c, d, e, g y h. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tiene al menos las propiedades a, c, d, e, g, h, e i. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tiene al menos las propiedades a, c y d. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tiene al menos las propiedades a, b, c, d, e, f y h. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tiene al menos las propiedades c, e, f y h. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tiene al menos las propiedades c, d, e, f y h.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención aumenta la actividad de las células NK. En algunas modalidades, esta actividad puede mediar la ADCC.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención no compite respecto a la unión a TIM-3 con ABTIM3 (de la publicación PCT WO 2015/117002) y/o mAb15 (de la publicación PCT WO 2016/111947). En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención no se une al mismo epítopo que ABTIM3 y/o mAB15; por ejemplo, el anticuerpo o porción de la invención se une a uno o más residuos en TIM-3 que no se unen a ABTIM3 y/o mAb15.
En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este tal como se define en las reivindicaciones y un excipiente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un agente terapéutico adicional, tal como un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico, un agente antiangiogénico, un inhibidor de la tirosina cinasa o un inhibidor de la vía TIM-3.
La presente invención proporciona además moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de esta, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión al antígeno de esta, o ambas, de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención también proporciona vectores que comprenden dicha molécula de ácido nucleico aislada, en donde dicho vector comprende además una secuencia de control de expresión.
La presente invención también proporciona células huésped que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de esta, y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión al antígeno de esta de un anticuerpo anti-TIM-3 tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este tal como se define en las reivindicaciones, que comprende proporcionar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de esta y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión al antígeno de esta de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno tal como se define en las reivindicaciones, cultivar dicha célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o porción y aislar el anticuerpo o porción resultantes.
La presente invención también proporciona una molécula de unión biespecífica que tiene una porción de unión al antígeno de un anticuerpo anti-TIM-3 tal como define en las reivindicaciones y una porción de unión al antígeno de otro anticuerpo diferente, tal como otro anticuerpo anti-TIM-3 (por ejemplo, otro anticuerpo anti-TIM-3 descrito en la presente) o un anticuerpo que se dirige a una proteína diferente, tal como otra proteína del punto de control inmunitario, un antígeno de cáncer u otra molécula de superficie celular cuya actividad medie una afección o enfermedad como cáncer.
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este o una molécula de unión biespecífica) tal como se define en las reivindicaciones para su uso en la mejora de la inmunidad en un paciente que lo necesita.
La presente invención proporciona además un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este o una molécula de unión biespecífica) tal como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita. En algunas modalidades, el cáncer se origina en un tejido seleccionado del grupo que consiste en la piel, los pulmones, los intestinos, los ovarios, el cerebro, la próstata, los riñones, los tejidos blandos, el sistema hematopoyético, la cabeza y el cuello, el hígado, la vejiga, las mamas, el estómago, el útero y el páncreas. En algunas modalidades, el paciente tiene leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide aguda), linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin. En algunas modalidades, el paciente tiene un tumor sólido (por ejemplo, un tumor sólido metastásico o avanzado). En algunas modalidades, el paciente tiene melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal o carcinoma de células renales. En determinadas modalidades, el método comprende además administrar un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico, un agente antiangiogénico, un inhibidor de la tirosina cinasa y/o un inhibidor de la vía TIM-3.
La presente invención proporciona además anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno o moléculas de unión biespecíficas tal como se describe en la presente para su uso en los tratamientos mencionados anteriormente; es decir, el tratamiento de un paciente humano que lo necesita para mejorar su sistema inmunitario y el tratamiento de un paciente humano que padece cáncer, tal como uno de los cánceres mencionados anteriormente. La presente invención también proporciona artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno o moléculas de unión multiespecíficas (por ejemplo, biespecíficas) que se describen en la presente, así como métodos para fabricar dichos artículos de fabricación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra curvas de dosis-respuesta de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144 para la producción de IFN-y en un ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito (MLR, por sus siglas en inglés).
La Figura 2 muestra curvas de dosis-respuesta de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144 para la producción de TNF-a en un ensayo unilateral MLR.
La Figura 3 muestra el efecto en subconjuntos de células dendríticas purificadas de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144, medido como los niveles de TNF-a mediante el uso del ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala de citocina.
La Figura 4 muestra la unión de TIM-3-Fc a células (apoptóticas) fosfatidilserina (PtdS) positivas en presencia de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención, así como un anticuerpo anti-TIM-3 de control positivo y dos anticuerpos de control negativo. A: Anticuerpo anti-TIM-3 de la invención [15086.17145]; B: anticuerpo anti-TIM-3 sin bloqueo de control negativo [15338.15338]; C: anticuerpo anti-TIM-3 de referencia [18571.18571]; D: anticuerpo anti-PD-1 de control negativo Keytruda® (pembrolizumab).
La Figura 5 muestra curvas dosis-respuesta de nueve anticuerpos anti-TIM-3 para la producción de I FN-y en un ensayo unilateral MLR.
La Figura 6 muestra curvas dosis-respuesta de diez anticuerpos anti-TIM-3 respecto a la producción de I FN-y en un ensayo bilateral MLR. El anticuerpo 15086.17145 se muestra como “15086”.
La Figura 7 muestra curvas dosis-respuesta de nueve anticuerpos anti-TIM-3 respecto a la producción de TNF-a en células dendríticas derivadas de monocitos de dos donantes independientes.
La Figura 8 muestra un resumen de los grupos de epítopo (conjuntos de epítopos) identificados por el análisis de competición de unión de un panel de dieciocho anticuerpos anti-TIM-3. Los anticuerpos circulares conectados por líneas negras indican la actividad de bloqueo cruzado en ambas orientaciones. Los anticuerpos cuadrados indican el bloqueo unidireccional cuando el anticuerpo se analiza únicamente en solución. Las líneas punteadas indican el bloqueo unidireccional cuando los anticuerpos únicamente se inmovilizan. Los anticuerpos se agrupan de acuerdo con los patrones de competición con otros anticuerpos anti-TIM-3. El anticuerpo 15086.17145 se muestra como “15086”.
La Figura 9 muestra las ubicaciones de los epítopos de anticuerpo en la estructura del dominio IgV de TIM-3 de humano (PDB 5F71). Se muestra una representación gráfica del dominio IgV de TIM-3 de humano en tres orientaciones diferentes y se indica la ubicación del sitio de unión a fosfatidilserina. Las ubicaciones de los epítopos mapeados se presentan en colores oscuros en un modelo de relleno de espacio TIM-3 para cada anticuerpo. El fragmento Fab 15086 se muestra como “15086” y el fragmento Fab 20293 se muestra como “20293”.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos anti-TIM-3 de humano que pueden utilizarse para mejorar el sistema inmunitario en un paciente humano, tal como un paciente de cáncer. Salvo que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, “TIM-3” se refiere a TIM-3 de humano. Una secuencia polipeptídica de TIM-3 de humano está disponible con el número de acceso a Uniprot Q8TDQ0 (HAVR2_HUMAN), que se muestra en la presente como la SEQ ID NO: 236.
El término “anticuerpo” (Ab) o “inmunoglobulina” (Ig), tal como se usan en la presente, se refieren a un tetrámero que comprende dos cadenas pesadas (H) (alrededor de 50-70 kDa) y dos cadenas ligeras (L) (alrededor de 25 kDa) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera está compuesta por un dominio variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Los dominios VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones marco” (FR, por sus siglas en inglés). Cada VH y VL está compuesto por tres CDR (H-CDR en la presente designa una CDR de la cadena pesada; y L-CDR en la presente designa una CDR de la cadena ligera) y cuatro FR, dispuestas desde el extremo animo al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de los números de aminoácidos en la cadena pesada o ligera puede realizarse de acuerdo con las definiciones IMGT® (Lefranc et ál., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)); o las definiciones de Kabat, Sequences o f Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 y 1991)); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987); o Chothia et ál., Nature 342:878-883 (1989).
El término “anticuerpo recombinante” se refiere a un anticuerpo que se expresa desde una célula o línea celular que comprende la o las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo, en donde dichas secuencias de nucleótidos no se asocian naturalmente con la célula.
Los términos “proteína aislada”, “polipéptido aislado” o “anticuerpo aislado” se refieren a una proteína, polipéptido o anticuerpo que, debido a su origen o fuente de derivación, (1) no se asocia con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado original, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente y/o (4) no ocurre en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula del cual se origina naturalmente se “aislará” de sus componentes asociados naturalmente. Una proteína también se puede dejar sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, con el uso de técnicas de purificación de proteínas que se conocen en la técnica.
Tal como se usa en la presente, el término “línea germinal” se refiere a las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los genes de anticuerpo y segmentos génicos tal como fueron trasmitidos de padres a la progenie mediante células germinales. Las secuencias de línea germinal se distinguen de las secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos en linfocitos B maduros, que han sido alterados por eventos de recombinación e hipermutación durante el transcurso de la maduración de linfocitos B. Un anticuerpo que “utiliza” una secuencia de línea germinal particular tiene una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que se alinea con la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de línea germinal que especifica de forma más estrecha que con cualquier otra secuencia de aminoácidos o nucleótidos de línea germinal.
El término “afinidad” se refiere a una medición de la atracción entre un antígeno y un anticuerpo. La atracción intrínseca del anticuerpo hacia el antígeno se expresa típicamente como la constante de equilibrio de afinidad de unión (Kd) de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se afirma que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la Kd es < 1 mM, preferentemente < 100 nM. Una constante de afinidad de unión Kd puede medirse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmones de superficie (BIAcore™) o interferometría de biocapa, por ejemplo utilizando el sistema ProteOn™ XPR36 SPR de Bio-Rad o el sistema Octet™.
El término “koff” se refiere a una constante de velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Una constante de velocidad de disociación koff puede medirse mediante interferometría de biocapa, por ejemplo, mediante el uso del sistema Octet™.
El término “epítopo” tal como se usa en la presente se refiere a una porción (determinante) de un antígeno que se une específicamente a un anticuerpo o a una molécula relacionada, tal como una molécula de unión biespecífica. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser “lineal” o “conformacional”. En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre una proteína (por ejemplo, un antígeno) y una molécula que interactúa (tal como un anticuerpo) ocurre de forma lineal a lo largo de la secuencia de aminoácidos principal de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción ocurren a través de los residuos de aminoácidos en la proteína que están separados entre sí en la secuencia de aminoácidos principal. Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos de ese epítopo mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo de un epítopo lineal, por ejemplo, al inmunizar un animal con un péptido que tenga los residuos de aminoácidos del epítopo lineal. Se puede generar un anticuerpo de un epítopo conformacional, por ejemplo, al inmunizar un animal con un minidominio que contenga los residuos de aminoácidos pertinentes del epítopo conformacional. También se puede generar un anticuerpo de un epítopo particular, por ejemplo, al inmunizar un animal con la molécula objetivo de interés o una porción pertinente de esta (por ejemplo, ECD de TIM-3) y luego evaluar respecto a la unión al epítopo.
Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, incluso, de modo no taxativo, ensayos de competición, clasificación de epítopos y barrido de alanina. El anticuerpo de prueba y un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención pueden unirse a al menos un residuo común (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve residuos comunes) en TIM-3. Los residuos de contacto en TIM-3 pueden ser totalmente idénticos entre el anticuerpo de prueba y el anticuerpo anti-TIM-3 de la invención. Se puede permitir que el anticuerpo anti-TIM-3 de la invención se una a TIM-3 en condiciones de saturación y luego se mide la capacidad del anticuerpo de prueba de unirse a TIM-3. Si el anticuerpo de prueba puede unirse a TIM-3 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-TIM-3 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente que el anticuerpo anti-TIM-3 de referencia. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a TIM-3 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo, un epítopo superpuesto o un epítopo que se encuentra cerca del epítopo unido al anticuerpo anti-TIM-3 de la invención. Este experimento se puede realizar mediante el uso de, por ejemplo, ELISA, RIA, BIACORE™, interferometría de biocapa o citometría de flujo. Para evaluar si un anticuerpo anti-TIM-3 lleva a cabo una competencia cruzada con otro anticuerpo anti-TIM-3, se puede utilizar el método de competencia descrito anteriormente en dos direcciones, es decir, determinar si el anticuerpo conocido bloquea el anticuerpo de prueba y viceversa. Dichos experimentos de competencia cruzada pueden llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el uso de un instrumento IBIS MX96 SPR o el sistema Octet™.
En determinados casos, puede ser conveniente alterar uno o más residuos de aminoácidos de CDR para mejorar la afinidad de unión al epítopo diana. Esto se conoce como “maduración de afinidad”. Se conocen diversos métodos de maduración de afinidad en la técnica, por ejemplo, el método de mutagénesis de saturación por barrido in vitro descrito por Burks et ál., ProcNatlAcadSciEUA, 94 :412-417 (1997), y el método de maduración de afinidad in vitro escalonado de Wu et ál., Proc Natl Acad Sci EUA 95:6037-6042 (1998).
El término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo”), tal como se usa en la presente, se refiere a una o más porciones o fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, TIM-3 de humano o una porción de este). Se ha demostrado que determinados fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden llevar a cabo la función de unión al antígeno del anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión que se abarcan en el término “porción de unión al antígeno” incluyen (i) un fragmento Fab: un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2: un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único grupo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada capaz de unirse específicamente a un antígeno. Además, si bien los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes distintos, se pueden unir, con el uso de métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permita elaborarse como una única cadena proteica en la cual los dominios Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocida como Fv de cadena sencilla (scFv)). En la invención también se encuentran las moléculas de unión al antígeno que comprenden un Vh y/o un Vl. En el caso de Vh, la molécula también puede comprender uno o más de entre región CH1, bisagra, CH2 o CH3. También se pretende que dichos anticuerpos de cadena sencilla estén abarcados por el término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo. También se abarcan otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos, bivalentes, en los cuales los dominios Vh y Vl se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizan un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a que los dominios se emparejen con dominios de complementariedad de otra cadena y creen dos sitios de unión al antígeno.
Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos mediante el uso de técnicas convencionales, tales como la digestión de papaína o pepsina de anticuerpos completos. Asimismo, los anticuerpos, porciones de anticuerpos y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse mediante el uso de técnicas de ADN recombinante estándares, por ejemplo, tal como se describe en la presente.
La clase (isotipo) y subclase de los anticuerpos anti-TIM-3 pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo pueden determinarse mediante el uso de anticuerpos que son específicos para una clase o subclase particular de anticuerpo. Dichos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase pueden determinarse mediante ELISA, Western Blot, así como otras técnicas. De manera alternativa, la clase y subclase pueden determinarse mediante la secuenciación de la totalidad o una porción de las regiones constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, la comparación de sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de las diversas clases y subclases de inmunoglobulinas y la determinación de la clase y subclase de los anticuerpos.
Al referirse a residuos de aminoácidos particulares en una determinada posición de una secuencia de anticuerpo, una indicación de, por ejemplo, “35S” se refiere a la posición y residuo, es decir, en este caso indica que un residuo serina (S) está presente en la posición 35 de la secuencia. De manera similar, una indicación de, por ejemplo, “13Q+35S” se refiere a los dos residuos en las respectivas posiciones.
Salvo que se indique lo contrario, todos los números de residuo de aminoácidos de anticuerpos mencionados en la presente descripción son de acuerdo con el esquema de numeración IMGT®.
Anticuerpos anti-TIM-3
La presente invención proporciona anticuerpos dirigidos a TIM-3 y porciones de unión al antígeno de estos, tal como se define en las reivindicaciones. En una modalidad particular, los anticuerpos descritos en la presente son anticuerpos humanos generados a partir de ratas transgénicas que pueden generar anticuerpos con idiotipos humanos.
Un beneficio de los anticuerpos anti-TIM-3 novedosos de la invención es que pueden activar de forma potente las células dendríticas (ver, por ejemplo, el Ejemplo 4). Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se considera que los anticuerpos anti-TIM-3 de la invención pueden estimular los linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T específicos a tumores) mediante la activación de células dendríticas. Además, la presente solicitud demuestra, por primera vez, que los anticuerpos anti-TIM-3 de isotipo IgG1 o IgG2 poseen niveles elevados de actividad, mientras que los anticuerpos de isotipo IgG4 o IgG1-LALA no cumplen función o son poco funcionales (ver, por ejemplo, los Ejemplos 3 y 4). Sin limitarse a ninguna teoría en particular, los datos de los inventores sugieren que un anticuerpo anti-TIM-3 que puede reticular TIM-3 mediante los receptores Fc es un activador particularmente potente del sistema inmunitario. Por ejemplo, un anticuerpo IgG2 anti-TIM-3 de la invención puede unirse a FcyR2A que se encuentra en células dendríticas y se considera que activa las células dendríticas mediante la reticulación de las moléculas TIM-3 en ellas.
Se puede hacer referencia a los anticuerpos anti-TIM-3 descritos en la presente mediante un número de 5 dígitos, por ejemplo, “20131 ”, o un número de 10 dígitos, por ejemplo, “15086.16837”. Los números de 10 dígitos con los mismos primeros cinco dígitos derivan del mismo anticuerpo original, tal como en el caso de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144. Se espera que dichos anticuerpos, que comparten las mismas seis CDR, tengan las mismas, o sustancialmente las mismas, propiedades de unión objetivo. Tal como será evidente a partir de las secuencias de ADN y proteína proporcionadas en la presente, las variantes 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144 tienen solo una única diferencia de aminoácido en la secuencia de VH en comparación con el anticuerpo 15086 original (“15086.15086”), a saber, E en lugar de Q en la posición 6, mientras que las secuencias de aminoácidos de VL son idénticas. También será evidente que estas variantes difieren principalmente en su formato/subclase de anticuerpo, es decir:
15086.15086: IgG1
15086.16837: IgG1 LALA
15086.17145: IgG2
15086.17144: IgG4
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-9, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3 y 5;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10-12, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
g) un anticuerpo cuya VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6; i) un anticuerpo cuya VH es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y cuya VL es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TIM-3 se selecciona del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
7-12, respectivamente;
b) un anticuerpo cuya VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y cuya VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y
c) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3 y 5, y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-9, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o 24;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10-12, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
g) un anticuerpo cuya VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6; i) un anticuerpo cuya VH es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y cuya VL es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
En algunas modalidades el anticuerpo anti-TIM-3 se selecciona del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-12, respectivamente;
b) un anticuerpo cuya VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y cuya LC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, y;
c) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 15 y 25; y cuya LC comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1 -3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-9, respectivamente; b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;
c) un anticuerpo cuya VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 23° 24;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10-12, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
g) un anticuerpo cuya VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6; j) un anticuerpo cuya VH es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y cuya VL es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 ;
En algunas modalidades el anticuerpo anti-TIM-3 se selecciona del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-12, respectivamente;
b) un anticuerpo cuya VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y cuya VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, y;
c) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 23 o 24; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos NO: 30-32, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
c) un anticuerpo cuya VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 33-35, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29;
g) un anticuerpo cuya VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 29 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 30­ 35, respectivamente;
j) un anticuerpo cuya VH es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 y cuya VL es al menos 90 % idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29;
k) un anticuerpo cuya VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 y cuya VL comprende lcia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 y la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 29 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 40-42, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43-45, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 39 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
40-45, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 39 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 53-55, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
50-55, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 60-62, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63-65, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
60-65, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 70-72, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 73-75, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
70-75, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80-82, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 83-85, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 79 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
80-85, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 79 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 90-92, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-95, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
90-95, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100-102, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 103-105, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 99 y 6; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
100-105, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 99 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 110-112, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 113-115, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 109 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
110-115, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 109 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120-122, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123-125, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 119 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
120-125, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 119 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 130-132, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133-135, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 129 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
130-135, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 129 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140-142, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 143-145, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 139 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
140-145, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 139 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 150-152, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 153-155, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 149 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
150-155, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 149 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 160-162, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 163-165, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 159 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
160-165, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 159 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 170-172, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 173-175, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 169;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 169;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 170-175, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y cuyo Vl es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 169;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 169; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 180-182, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 183-185, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
180-185, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178 y cuyo Vl es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 190-192, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 193-195, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 189;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 189;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
190-195, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188 y cuyo Vl es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 189;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 189; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 200-202, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 203-205, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 199;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 199;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
200-205, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 199;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 199; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 210-212, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 208;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 208;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 213-215, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 209;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 209;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 209 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
210-215, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 208 y cuyo VL es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 209;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 208 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 209; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 208 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 209 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 220-222, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 223-225, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 219 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
220-225, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218 y cuyo Vl es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 219 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 230-232, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228 y SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 233-235, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 229 y 6;
i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:
230-235, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228 y cuyo Vl es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, 23, 24 o 25; y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 229 y 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3, o una porción de unión al antígeno de este, que compite por la unión a TIM-3 de humano con, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que, el anticuerpo 15086.15086 que tiene el formato IgG1, el anticuerpo 15086.16837 que tiene el formato IgG1 LALA, el anticuerpo 15086.17145 que tiene el formato IgG2 o el anticuerpo 15086.17144 que tiene el formato IgG4. En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención es una IgG. En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención tiene un formato IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3, o una porción de unión al antígeno de este, que compite para la unión a TIM-3 de humano con, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que, el anticuerpo 20131, 20293, 15105, 15107, 15109, 15174, 15175, 15260, 15284, 15299, 15353, 15354, 17244, 17245, 19324, 19416, 19568, 20185, 20300, 20362 o 20621. En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención tiene un formato IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
El anticuerpo anti-TIM-3 de la invención, o una porción de unión al antígeno de este, no compite para la unión a TIM-3 de humano con, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que, cualquiera o todos los anticuerpos del conjunto de epítopos 1 (anticuerpo de referencia mAb 15), conjunto 2 (por ejemplo, anticuerpos 15105 y 15107) y conjunto 8 (por ejemplo, anticuerpos 15174 y 15175) tal como se definen en el Ejemplo 12 más adelante.
El anticuerpo anti-TIM-3 de la invención, o una porción de unión al antígeno de este, no compite para la unión a TIM-3 de humano con, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que, cualquiera o todos los anticuerpos del conjunto de epítopos 2 (por ejemplo, anticuerpos 15105 y 15107) y conjunto 8 (por ejemplo, anticuerpos 15174 y 15175) tal como se definen en el Ejemplo 12 más adelante.
El anticuerpo anti-TIM-3 de la invención, o una porción de unión al antígeno de este, no compite para la unión a TIM-3 de humano con, o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que, cualquiera o todos los anticuerpos del conjunto de epítopos 2 (por ejemplo, anticuerpos 15105 y 15107) tal como se definen en el Ejemplo 12 más adelante.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que compite para la unión a TIM-3 de humano o se une al mismo epítopo de TIM-3 de humano que un anticuerpo cuyas CDR1-3 de cadena pesada (H) y CDR1-3 de cadena ligera (L) comprenden, respectivamente, las SEQ ID NO: 7-12, 30-35, 40-45, 50-55, 60-65, 70-75, 80-85, 90­ 95, 100-105, 110-115, 120-125, 130-135, 140-145, 150-155, 160-165, 170-175, 180-185, 190-195, 200-205, 210-215, 220-225 o 230-235.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno que tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90 % idéntico en secuencia a la SEQ ID NO: 3, 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228, por ejemplo, al menos 95 % idéntico, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a dicha secuencia.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90 % idéntico en secuencia a la SEQ ID NO: 3, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228, por ejemplo, al menos 95 % idéntico, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a dicha secuencia; y una región constante de cadena pesada (CH) que es al menos 90 % idéntica en secuencia a la SEQ ID NO: 5, por ejemplo, al menos 95 % idéntica, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 5.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 3, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228 y la secuencia de aminoácidos de CH de la SEQ iD NO: 5.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90 % idéntico en secuencia a la SEQ ID NO: 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228, por ejemplo, al menos 95 % idéntico, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a dicha secuencia; y una región constante de cadena pesada (CH) que es al menos 90 % idéntica en secuencia a la SEQ ID NO: 23, 24 o 25, por ejemplo, al menos 95 % idéntica, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 23, 24 o 25. En modalidades particulares, la CH es al menos 90 % idéntica en secuencia a la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, al menos 95 % idéntica, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 25
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 o 228 y la secuencia de aminoácidos de Ch de la SEQ ID NO: 23, 24 o 25. La cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de CH de la SEQ ID NO: 25.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229, por ejemplo, al menos 95 % idéntico, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a dicha secuencia.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229, por ejemplo, al menos 95 % idéntico, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a dicha secuencia; y una región constante de cadena ligera (CL) que es al menos 90 % idéntica en secuencia a la SEQ ID NO: 6, por ejemplo, al menos 95 % idéntica, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que tiene una cadena ligera (LC) que comprende la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219 o 229 y la secuencia de aminoácidos de CL de la SEQ iD NO: 6.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3 que comprende cualquiera de las cadenas pesadas descritas anteriormente y cualquiera de las cadenas ligeras descritas anteriormente.
Cualquiera de los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno descritos en la presente pueden inhibir la unión de ligandos, como galectina-9, CEACAM1, HMGB-1 y fosfatidilserina, a TIM-3.
En una modalidad, la administración de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención o una porción de unión al antígeno de este puede activar las células dendríticas, lo que provoca su maduración y por tanto su capacidad para estimular a los linfocitos T. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se considera que los anticuerpos anti-TIM-3 de la invención funcionan como activadores de células dendríticas TIM-3, mediante lo cual su efecto en las células dendríticas funciona para estimular los linfocitos T. Por tanto, en una configuración relacionada a tumores, los anticuerpos anti-TIM-3 provocarían la maduración y activación de las células dendríticas asociadas al tumor, lo que resulta en la activación de los linfocitos T específicos a tumores.
En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno tal y como se define en las reivindicaciones pueden unirse a TIM-3 de humano con una Kd de al menos 100, al menos 50, al menos 40, al menos 30, al menos 25, al menos 20, al menos 15, al menos 10, al menos 9, al menos 8, al menos 7 o al menos 6 nM. En determinadas modalidades, la Kd se determina mediante resonancia de plasmones de superficie.
En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno tal y como se define en las reivindicaciones pueden unirse a TIM-3 de cynomolgus con una Kd de al menos 100, al menos 50, al menos 40, al menos 30, al menos 25, al menos 24, al menos 23, al menos 22, al menos 21 o al menos 20 nM. En determinadas modalidades, la Kd se determina mediante resonancia de plasmones de superficie.
En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno tal y como se define en las reivindicaciones pueden tener una avidez respecto a TIM-3 de humano de EC50 < 2, 1,5, 1,0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,15 nM. En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno tal y como se define en las reivindicaciones pueden tener una avidez respecto a TIM-3 de cynomolgus de EC50 < 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1,5, 1,0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,15 nM.
En una modalidad, la administración de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención o una porción de unión al antígeno de este puede activar directamente los linfocitos T.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3, o una porción de unión al antígeno de este, se une a un epítopo de TIM-3 que incluye al menos uno (por ejemplo, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve) de los siguientes residuos de la SeQ ID NO: 236: P50, V60, F61, E62, G64, R69, 1117, M118 y D120. Un epítopo con cualquier combinación de lo anterior.
Un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención, o una porción de unión a antígeno de este, se une a un epítopo de TIM-3 que incluye los siguientes residuos de SEQ ID n O: 236: P50, V60, F61, E62, G64, R69, I117, M118 y D120.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TIM-3, o una porción de unión al antígeno de este, que se une a un epítopo de TIM-3 que comprende los residuos 62-67 y/o 114-117 de la SEQ ID NO: 236. El anticuerpo o porción se une a los residuos 62-67 (o un fragmento de estos, tal como un fragmento de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos) de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 y 20293). En el presente documento se describe un anticuerpo o porción que se une a los residuos 114-117 (o un fragmento de estos, tal como un fragmento de uno, dos o tres residuos) de la SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, anticuerpo 20131). También se contempla un epítopo con cualquier combinación de los residuos anteriores.
Un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención, o una porción de unión al antígeno de este, se une a un epítopo de TIM-3 que comprende los residuos 62-67 de SEQ ID NO: 236. El anticuerpo o porción se une a los residuos 62-67 de SEQ ID NO: 236 (por ejemplo, los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 y 20293).
La clase de un anticuerpo anti-TIM-3 obtenido mediante los métodos descritos en la presente puede cambiarse o intercambiarse con otra clase o subclase. En un aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH se aísla mediante métodos conocidos en la técnica de modo que no incluya secuencias de ácidos nucleicos que codifican CL o CH. Luego, las moléculas de ácido nucleico que codifican VL o VH se enlazan de manera operativa a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica CL o CH, respectivamente, de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto puede lograrse mediante el uso de un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-TIM-3 que era originalmente IgM puede cambiarse de clase a IgG. Además, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase IgG en otra, por ejemplo, de IgG 1 a IgG2. Una región constante de cadena ligera k puede cambiarse a una región constante de cadena ligera A. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención con un isotipo Ig deseado comprende las etapas de aislar una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-TIM-3 y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TIM-3, obtener el dominio variable de la cadena pesada, ligar el dominio variable de la cadena pesada a la región constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una célula y recolectar el anticuerpo anti-TIM-3 con el isotipo deseado.
El anticuerpo anti-TIM-3 de la invención puede ser una molécula IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, pero es típicamente del isotipo IgG, por ejemplo, subclase de IgG, IgG1, IgG2a o IgG2b, IgG3 o IgG4. En una modalidad, el anticuerpo es una IgG1. En otra modalidad, el anticuerpo es una IgG2.
En una modalidad, el anticuerpo anti-TIM-3 puede comprender al menos una mutación en la región Fc. Se conoce una variedad de diferentes mutaciones de Fc, donde estas mutaciones proporcionan una función efectora alterada. Por ejemplo, en muchos casos, será conveniente reducir o eliminar la función efectora, por ejemplo, cuando no se desean las interacciones ligando/receptor o en el caso de conjugados anticuerpo-fármaco. Las posiciones de aminoácidos de la región Fc que pueden ser beneficiosas para mutar para reducir la función efectora incluyen una o más de entre las posiciones, 228, 233, 234 y 235, donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el esquema de numeración IMGT®.
En una modalidad, se pueden mutar uno o ambos de los residuos de aminoácidos en las posiciones 234 y 235, por ejemplo, de Leu a Ala (L234A/L235A). Estas mutaciones reducen la función efectora de la región Fc de los anticuerpos IgG1. De manera adicional o alternativa, se puede mutar el residuo de aminoácido en la posición 228, por ejemplo, a Pro. En otra modalidad, se puede mutar el residuo de aminoácido en la posición 233, por ejemplo, a Pro, se puede mutar el residuo de aminoácido en la posición 234, por ejemplo, a Val y/o se puede mutar el residuo de aminoácido en la posición 235, por ejemplo, a Ala. Las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el esquema de numeración IMGT®.
En otra modalidad, cuando el anticuerpo es de la subclase IgG4, puede comprender la mutación S228P, es decir, una prolina en la posición 228, donde la posición de aminoácido se numera de acuerdo con el esquema de numeración Eu IMGT®. Se conoce que esta mutación reduce el intercambio de grupo Fc no deseado (Angal et ál., Mol Immunol.
30:105-8 (1993)).
En determinadas modalidades, un anticuerpo o porción de unión al antígeno de este de la invención puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión más grande, formada por una asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con uno o más de otros péptidos o proteínas. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región núcleo de estreptavidina para conformar una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et ál., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta polihistidina de extremo C para conformar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et ál., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Otros ejemplos incluyen cuando las CDR de un anticuerpo se incorporan en una molécula de forma covalente o no covalente para convertirla en una inmunoadhesina que se une específicamente a un antígeno de interés. En dichas modalidades, la o las CDR pueden incorporarse como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede enlazarse de forma covalente a otra cadena polipeptídica o puede incorporarse de forma no covalente.
En otra modalidad, un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina puede formarse de modo que comprenda la totalidad o una porción de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención enlazado a otro polipéptido. En determinadas modalidades, únicamente los dominios variables del anticuerpo anti-TIM-3 se enlazan al polipéptido. En determinadas modalidades, el dominio VH de un anticuerpo anti-TIM-3 se enlaza a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-TIM-3 se enlaza a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de tal manera que los dominios VH y VL puedan interactuar entre sí para formar un sitio de unión al antígeno. En otra modalidad preferida, el dominio VH se separa del dominio VL mediante un enlazador de modo que los dominios VH y VL puedan interactuar entre sí (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla). El anticuerpo VH-enlazador-VL se enlaza luego al polipéptido de interés. Además, los anticuerpos de fusión pueden crearse de modo que dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla se enlacen entre sí. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una única cadena polipeptídica, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.
Para crear un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen de manera operativa a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4 - Ser)3 (SEQ ID NO: 240), de modo que las secuencias de VH y VL puedan expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua; los dominios de VL y VH unidos por el enlazador flexible. Ver, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883 (1988); y McCafferty et ál., Nature 348:552-554 (1990). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente si solo se utiliza un único VH y VL; bivalente, si se utilizan dos VH y VL; o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL. Se pueden generar anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unan específicamente a TIM-3 de humano y a otra molécula, por ejemplo.
En otras modalidades, se pueden preparar otros anticuerpos modificados utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-TIM-3. Por ejemplos, se pueden preparar “cuerpos kappa” (Ill et ál., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), “minicuerpos” (Martin et ál., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), “diacuerpos” (Holliger et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993)), o “Janusins” (Traunecker et ál., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et ál., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) mediante el uso de técnicas biológicas moleculares estándares según las indicaciones de la memoria descriptiva.
Un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención puede derivatizarse o enlazarse a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o porciones de estos se derivatizan de modo que la unión a TIM-3 no se vea afectada de forma adversa por la derivatización o etiquetado. Por consiguiente, se pretende que los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la invención incluyan tanto formas intactas como modificadas de los anticuerpos anti-TIM-3 humanos tal como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede enlazarse de forma funcional (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (como una región núcleo de estreptavidina o una etiqueta polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce mediante reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticulantes adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos distintos separados por un espaciador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles, por ejemplo, de Pierce Chemical Company, Rockford, Il.
Un anticuerpo anti-TIM-3 también puede derivatizarse con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida en suero.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención también puede etiquetarse. Tal como se usa en la presente, los términos “etiqueta” o “etiquetado” se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una modalidad, la etiqueta es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido radioetiquetado o acoplamiento a un polipéptido de restos biotinilados que pueden ser detectados por una avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En otra modalidad, la etiqueta o marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, una toxina o conjugado de fármaco. Diversos métodos para etiquetar los polipéptidos y glucoproteínas son conocidos en la técnica y pueden utilizarse. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, de modo no taxativo, los siguientes: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35s , 90Y, 99Tc, 111 In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias par de zipper de leucina, sitios de unión de anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, etiquetas de epítopo), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas, como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitocina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de estos. En algunas modalidades, las etiquetas se unen mediante grupos de espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.
En determinadas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden estar presentes en una forma neutral (incluso formas iónicas zwitteriónicas) o como especies cargadas positiva o negativamente. En algunas modalidades, se pueden formar complejos de los anticuerpos con un contraión para formar una sal farmacéuticamente aceptable.
El término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a un complejo que comprende uno o más anticuerpos y uno o más contraiones, en donde los contraiones derivan de bases y ácidos orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptable.
Moléculas de unión biespecíficas
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión biespecífica que tiene la especificidad de unión de un anticuerpo anti-TIM-3 tal como se define en las reivindicaciones y la especificidad de unión de otro anticuerpo anti-TIM-3 (por ejemplo, otro anticuerpo anti-TIM-3 descrito en la presente) o un anticuerpo que se dirige a una proteína diferente, tal como otra proteína del punto de control inmunitario, un antígeno de cáncer u otra molécula de superficie celular cuya actividad medie una afección o enfermedad como cáncer. Dichas moléculas de unión biespecíficas son conocidas en la técnica y en otra parte en la presente se proporcionan ejemplos de diferentes tipos de moléculas de unión biespecíficas.
Vectores y moléculas de ácido nucleico
La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico y secuencias que codifican anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno de estos como se define en las reivindicaciones En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico diferentes codifican las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este. En otras modalidades, la misma molécula de ácido nucleico codifica las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este.
Una referencia a una secuencia de nucleótidos abarca su complemento, salvo que se indique lo contrario. Por tanto, una referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular debería comprenderse que abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. El término “polinucleótido”, según se refiere en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena sencilla y doble.
En el presente documento se describen secuencias de nucleótidos que son al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a una o más secuencias de nucleótidos mencionadas en la presente, por ejemplo, a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 4, 7-12, 15, 28-35, 38-45, 48-55, 58-65, 68-75, 78-85, 88-95, 98-105, 108-115, 118-125, 128-135, 138-145, 148-155, 158-165, 168-175, 178-185, 188-195, 198-205, 208-215, 218-225 y 228-235. El término “porcentaje de identidad de secuencia” en el contexto de secuencias de ácidos nucleicos se refiere a los residuos en dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para su máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser en una extensión de al menos nueve nucleótidos, generalmente, al menos alrededor de 18 nucleótidos, más generalmente, al menos alrededor de 24 nucleótidos, típicamente al menos alrededor de 28 nucleótidos, más típicamente al menos alrededor de 32 nucleótidos y, preferentemente, al menos alrededor de 36, 48 o más nucleótidos. Existe una variedad de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse mediante el uso de FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones con mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda (ver, por ejemplo, Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); y Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998). Salvo que se indique lo contrario, se utilizan los parámetros predeterminados de un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de ácidos nucleicos puede determinarse mediante el uso de FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntaje) o mediante el uso de Gap con sus parámetros predeterminados según se proporciona en GCG Versión 6.1, que se incorporan a la presente mediante referencia.
En el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 27, 36, 37, 46, 47, 56, 57, 66, 67, 76, 77, 86, 87, 96, 97, 106, 107, 116, 117, 126, 127, 136, 137, 146, 147, 156, 157, 166, 167, 176, 177, 186, 187, 196, 197, 206, 207, 216, 217, 226 y 227. En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a cualquiera de las secuencias de nucleótidos mencionadas.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1,2, 13 y 14.
En cualquiera de las modalidades que anteceden, se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este de la invención puede aislarse de cualquier fuente que produzca dicho anticuerpo o porción. En diversas modalidades, las moléculas de ácido nucleico se aíslan de los linfocitos B que expresan un anticuerpo anti-TIM-3 aislado de un animal inmunizado con un antígeno de TIM-3 de humano, o de una célula inmortalizada producida a partir de dicho linfocito B. Los métodos para aislar los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo son conocidos en la técnica. El ARNm puede aislarse y utilizarse para producir ADNc para uso en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) o clonación de ADNc de los genes de anticuerpo. En determinadas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención puede sintetizarse en lugar de aislarse.
En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención unido en el marco a una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena pesada de cualquier fuente. De manera similar, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la invención unido dentro del marco a una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena ligera de cualquier fuente.
En otro aspecto de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio variable de las cadenas pesada (VH) y/o ligera (VL) pueden “convertirse” en genes de anticuerpo de longitud completa. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios de VH o VL se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa mediante la inserción en un vector de expresión que ya codifique los dominios constantes de cadena pesada (CH) o cadena ligera (CL), respectivamente, de modo que el segmento VH esté enlazado de manera operativa al o los segmentos CH en el vector, y/o el segmento VL esté enlazado de manera operativa al segmento CL en el vector. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios de VH y/o VL se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa al enlazar, por ejemplo, ligar, una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VH y/o VL a una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio CH y/o CL mediante el uso de técnicas biológicas moleculares estándar. Luego, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa pueden expresarse desde una célula en la cual se han introducido y aislado el anticuerpo anti-TIM-3.
Las moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse para expresar de manera recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-TIM-3. Las moléculas de ácido nucleico también pueden usarse para producir, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, tal como se describe en la presente.
En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención se utiliza como una sonda o un cebador de PCR para una secuencia de anticuerpo específica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede utilizarse como una sonda en métodos de diagnóstico o como un cebador de PCR para amplificar regiones de ADN que podrían utilizarse, entre otros, para aislar moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican dominios variables de anticuerpos anti-TIM-3. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos son de dominios extremadamente variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo de interés. En algunas modalidades, los oligonucleótidos codifican la totalidad de las CDR de los anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión al antígeno de estos de la invención tal como se describe en la presente.
Las moléculas de ácido nucleico y vectores pueden utilizarse para formar anticuerpos anti-TIM-3 mutados. Los anticuerpos pueden mutarse en los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, una mutación puede realizarse en una o más de las CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo anti-TIM-3, para aumentar o disminuir la koff, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Pueden realizarse una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se conoce que cambia en comparación con la línea germinal en un anticuerpo monoclonal de la invención. Las mutaciones pueden realizarse en una CDR o región marco de un dominio variable o en una región constante. Las mutaciones pueden realizarse en un dominio variable. Pueden realizarse una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se conoce que cambia en comparación con la línea germinal en una CDR o región marco de un dominio variable de un anticuerpo o porción de unión al antígeno de este de la invención.
En otra modalidad, la o las regiones marco puede(n) mutarse de modo que las regiones marco resultantes tengan la secuencia de aminoácidos del correspondiente gen de línea germinal. Una mutación puede realizarse en una región marco o región constante para aumentar la semivida del anticuerpo anti-TIM-3. Ver, por ejemplo, la publicación PCT WO 00/09560. Una mutación en una región marco o región constante también puede realizarse para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo y/o para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula. En el presente documento se describe un único anticuerpo que puede tener mutaciones en cualquiera o varias de las CDR o regiones marco del dominio variable o en la región constante.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector adecuado para expresar una o ambas de las cadenas de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este tal como se define en las reivindicaciones. El término “vector”, tal como se usa en la presente, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se enlazó. En algunas modalidades, el vector es un plásmido, es decir, un segmento circular de cadena doble de ADN en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. En algunas modalidades, el vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en el cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). En otras modalidades, los vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma huésped. Asimismo, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales están unidos de manera operativa. Se hace referencia a dichos vectores en la presente como “vectores de expresión recombinantes” (o, simplemente, “vectores de expresión”).
La invención proporciona vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención o una porción de unión al antígeno de este, la cadena ligera de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención o una porción de unión al antígeno de este, o ambas cadenas pesada y ligera de un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención o una porción de unión al antígeno de este. La invención proporciona además vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de estos.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-TIM-3 de la invención o porciones de unión al antígeno de estos se expresan al insertar ADN que codifican las cadenas pesada y ligera parciales o de longitud completa, obtenidas tal como se describe anteriormente, en vectores de expresión de modo que los genes estén unidos de manera operativa a las secuencias de control de expresión necesarias, como las secuencias de control de transcripción y traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus vegetales como el virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares. La secuencia codificadora del anticuerpo puede ligarse a un vector de modo que las secuencias de control de transcripción y traducción en el vector cumplan su función pretendida de regular la transcripción y traducción de la secuencia codificadora del anticuerpo. Las secuencias de control de expresión y vector de expresión pueden seleccionarse para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. La secuencia codificadora de cadena ligera del anticuerpo y la secuencia codificadora de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados y pueden enlazarse de manera operativa a las mismas o diferentes secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores). En una modalidad, ambas secuencias codificadoras se insertan en el mismo vector de expresión y pueden enlazarse de manera operativa a las mismas secuencias de control de expresión (por ejemplo, un promotor común), para separar secuencias de control de expresión idénticas (por ejemplo, promotores) o diferentes secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores). Las secuencias codificadoras del anticuerpo pueden insertarse en el vector de expresión mediante métodos estándares (por ejemplo, ligación de los sitios de restricción complementarios en el vector y fragmento génico del anticuerpo o ligación del extremo romo si no hay sitios de restricción presentes).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina de CH y CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción adecuados modificados genéticamente de modo que la secuencia de VH o VL pueda insertarse y expresarse fácilmente, tal como se describe anteriormente. Los genes que codifican HC y LC en dichos vectores pueden contener secuencias intrónicas que pueden resultar en rendimientos de proteína de anticuerpo generales mejorados al estabilizar el ARNm relacionado. Las secuencias intrónicas están flanqueadas por sitios aceptor de empalme y donador de empalme, que determinan en dónde ocurrirá el corte y empalme de ARN. La ubicación de las secuencias intrónicas puede ser en regiones variables o constantes de las cadenas de anticuerpo o tanto en regiones variables como constantes cuando se utilizan múltiples intrones. La terminación de la transcripción y poliadenilación puede suceder en sitios cromosómicos nativos corriente abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal se enlace en el marco al extremo amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína de no inmunoglobulina).
Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención transportan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluso la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de célula huésped de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador CMV), virus del simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)), promotores fuertes de mamíferos y polioma, como promotores de actina e inmunoglobulina nativos. Para una mayor descripción de los elementos reguladores virales, y las secuencias de estos, ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5,168,062, 4,510,245 y 4,968,615. Los métodos para expresar anticuerpos en plantas, incluso una descripción de promotores y vectores, así como transformación de plantas, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense 6,517,529. Los métodos para expresar los polipéptidos en células bacterianas o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura, también son conocidos en la técnica.
Además de los genes de cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden transportar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las cuales se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual se ha introducido el vector. Por ejemplo, los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped-dhfr con selección/amplificación de metotrexato), el gen neo (para selección de G418) y el gen de la glutamato sintetasa.
El término “secuencia de control de expresión”, tal como se usa en la presente, significa secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y procesar las secuencias codificantes a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de promotor y potenciador, iniciación, terminación de transcripción adecuadas; señales de procesamiento de ARN eficaces, tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficacia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de proteína; y, cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción de proteína. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en función del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen secuencia de terminación de transcripción, sitio de unión ribosómico, promotoras; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen secuencia de terminación de transcripción y promotores. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión y procesamiento y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañeros de fusión.
Células huésped y métodos para producir anticuerpo y composición de anticuerpos
Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para producir las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión al antígeno de estos de la invención. Una modalidad de este aspecto de la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones, que comprende proporcionar una célula huésped recombinante capaz de expresar el anticuerpo, cultivar dicha célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y aislar el anticuerpo resultante. Los anticuerpos producidos por dicha expresión en tales células huésped recombinantes se mencionan en la presente como “anticuerpos recombinantes”. La invención también proporciona células progenie de dichas células huésped y anticuerpos producidos por estas.
El término “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”), tal como se usa en la presente, significa una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. La invención proporciona células huésped que comprenden un vector de acuerdo con la invención que se describió anteriormente. La invención también proporciona células huésped que comprenden, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de esta, y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión al antígeno de esta de un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este de la invención. Debe comprenderse que la “célula huésped recombinante” y “célula huésped” no solo significa la célula sujeto particular, sino también la progenie de dicha célula. Dado que pueden suceder determinadas modificaciones en generaciones posteriores debido a la mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, pero de todas formas se incluyen dentro del alcance del término “célula huésped” tal como se usa en la presente.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-TIM-3 y los vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse para la transfección de una célula huésped de levadura, bacteriana, vegetal o de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en el núcleo. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamíferos mediante vectores virales. Los métodos para transformar las células son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455. Los métodos para transformar células vegetales son conocidos en la técnica, incluso, por ejemplo, la transformación mediada por agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Los métodos para transformar las células de levadura y bacterianas también son conocidos en la técnica.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas de célula inmortalizada disponibles de American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, células SP2, células HEK-293T, células 293 Freestyle (Invitrogen), células NIH-3T3, células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549 y una variedad de otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia en particular se seleccionan mediante la determinación de cuáles líneas celulares tienen niveles elevados de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insectos, tales como células Sf9 o Sf21. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican los genes de anticuerpos se introducen en células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo mediante el uso de métodos de purificación de proteína estándares. Las células huésped vegetales incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentejas de agua, maíz, trigo, patata, etc. Las células huésped bacterianas incluyen las especies E. coli y Streptomyces. Las células huésped de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.
Además, la expresión de los anticuerpos de la invención o las porciones de unión al antígeno de estos de líneas celulares de producción puede mejorarse mediante el uso de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para potenciar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza en su totalidad o parcialmente en conexión con las patentes EP 0216 846, 0256 055, 0323 997 y 0338 841.
Es posible que los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos tengan diferentes patrones de glucosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionados en la presente, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente, son parte de la presente invención, independientemente del estado de glucosilación de los anticuerpos y, más generalmente, independientemente de la presencia o ausencia de modificaciones postraduccionales.
Composiciones farmacéuticas
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo (o como el único ingrediente activo), un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, molécula de unión biespecífica o una composición de anticuerpo anti-TIM-3 de la invención. La composición farmacéutica puede comprender cualquier composición de anticuerpo anti-TIM-3, molécula de unión biespecífica o anticuerpo o porción de unión al antígeno de este tal como se define en las reivindicaciones. En algunas modalidades, las composiciones se dirigen a la mejora, prevención y/o el tratamiento de un trastorno relacionado con TIM-3 (por ejemplo, un trastorno caracterizado por la sobreexpresión o sobreactividad de TIM-3 o cualquiera de sus ligandos) y/o cáncer. En algunas modalidades, las composiciones se dirigen a la activación del sistema inmunitario. En determinadas modalidades, las composiciones se dirigen a la mejora, prevención y/o el tratamiento del cáncer que se origina en tejidos tales como la piel, los pulmones, los intestinos, los ovarios, el cerebro, la próstata, los riñones, los tejidos blandos, el sistema hematopoyético, la cabeza y el cuello, el hígado, la vejiga, las mamas, el estómago, el útero y el páncreas.
En general, los anticuerpos de la invención o las porciones de unión al antígeno de estos o las moléculas de unión biespecíficas de la invención son adecuados para administrarse como una formulación junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, tal como se describe más adelante.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán uno o más anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión, o moléculas de unión biespecíficas, de la invención, por ejemplo, uno o dos anticuerpos anti-TIM-3 o porciones de unión o moléculas de unión biespecíficas. En una modalidad, la composición comprende un único anticuerpo anti-TIM-3 de la invención o porción de unión de este.
La composición farmacéutica comprende al menos un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este, por ejemplo, un anticuerpo anti-TIM-3 o porción, o una molécula de unión biespecífica, y uno o más anticuerpos adicionales que se dirijan a uno o más receptores de superficie celular pertinentes, por ejemplo, uno o más receptores pertinentes al cáncer.
El término “excipiente” se usa en la presente para describir cualquier ingrediente que no sean los compuestos de la invención. La selección de excipientes dependerá, en gran medida, en factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente en la solubilidad y estabilidad y la naturaleza de la forma de dosificación. Tal como se usa en la presente, el “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier y todo solvente, medio de dispersión, recubrimiento, agente antibacteriano y antifúngico, agente que retarda la absorción e isotónico y similares que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similar, así como combinaciones de estos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o menores cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes emulsionantes o humectantes, conservadores o amortiguadores, que mejoran la vida útil o eficacia del anticuerpo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y los métodos para su preparación serán evidentes para los expertos en la técnica. Dichas composiciones y métodos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edición (Mack Publishing Company, 1995). Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP (buenas prácticas de fabricación).
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, empaquetarse o venderse a granel, como una única dosis unitaria o como múltiples dosis unitarias. Tal como se usa en la presente, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación.
Cualquier método para administrar péptidos, proteínas o anticuerpos aceptado en la técnica puede utilizarse de manera adecuada para los anticuerpos y porciones de unión al antígeno de la invención.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son típicamente adecuadas para la administración parenteral. Tal como se usa en la presente, la “administración parenteral” de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por una entrada física en un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la entrada en el tejido, por tanto, generalmente resulta en la administración directa en el flujo sanguíneo, en el músculo o en un órgano interno. Por lo tanto, la administración parenteral incluye, de modo no taxativo, la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica penetrante del tejido y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluye, de modo no taxativo, infusiones o inyecciones subcutáneas, intraperitoneales, intramusculares, intrasternales, intravenosas, intraarteriales, intratecales, intraventriculares, intrauretrales, intracraniales e intrasinoviales; y técnicas de infusión dialítica de riñón. También se contempla la perfusión regional. Modalidades particulares incluyen las vías intravenosas y subcutáneas.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral típicamente comprenden el ingrediente activo combinado con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua esterilizada o solución salina estéril. Dichas formulaciones pueden prepararse, empaquetarse o comercializarse en una forma adecuada para la administración en bolo o para administración continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, empaquetarse o comercializarse en una forma de dosificación unitaria, tal como en ampollas o en contenedores de dosis múltiples que contienen un conservante. Las formulaciones para administración parenteral incluyen, de modo no taxativo, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos acuosos o aceitosos, pastas y similares. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales, que incluyen, de modo no taxativo, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una modalidad de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (es decir, polvo o gránulo) para rehidratación con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua esterilizada libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición rehidratada. Las formulaciones parenterales también incluyen soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y amortiguadores (preferentemente a un pH de 3 a 9) pero, en algunas aplicaciones, pueden formularse de manera más adecuada como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para utilizarse junto con un vehículo adecuado, tal como agua esterilizada libre de pirógenos. Las formas de administración parenteral ilustrativas incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas de propilenglicol o dextrosa. Dichas formas de dosificación pueden amortiguarse de manera adecuada, de así desearse. Otras formulaciones administrables por vía parental que son útiles incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina o en una preparación liposómica. Las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retrasada, sostenida, pulsátil, controlada, dirigida y programada.
Por ejemplo, en un aspecto, las soluciones estériles inyectables pueden prepararse mediante la incorporación del anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este, la molécula de unión biespecífica o la composición de anticuerpo anti-TIM-3 en la cantidad necesaria en un solvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por la esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo además de cualquier otro ingrediente deseado de una solución previamente estéril por filtración de esta. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede provocarse al incluir en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina y/o al usar recubrimientos de liberación modificada (por ejemplo, recubrimientos de liberación lenta).
Los anticuerpos de la invención también pueden administrarse de forma intranasal o por inhalación, típicamente en forma de un polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, o como una partícula de componente mixto, por ejemplo, mezclada con un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado) desde un inhalador de polvo seco, como un aerosol desde un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente un atomizador que utiliza la electrohidrodinámica para producir gotas finas) o nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado, o como gotas nasales.
El recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador generalmente contienen una solución o suspensión de un anticuerpo de la invención que comprende, por ejemplo, un agente adecuado para dispersar, solubilizar o prolongar la liberación del activo, uno o más propelentes como solvente.
Antes del uso en una formulación en suspensión o polvo seco, el producto farmacéutico generalmente se microniza a un tamaño adecuado para suministro mediante inhalación (típicamente menos de 5 micrómetros). Esto puede lograrse mediante cualquier método de trituración adecuado, tal como pulverización con chorro en espiral, pulverización con chorro en cama de fluidos, procesamiento de fluido supercrítico para formar nanopartículas, homogenización de presión alta o secado por pulverización.
Las cápsulas, blísteres y cartuchos para uso en un inhalación o insuflador pueden formularse para contener una mezcla en polvo del compuesto de la invención, una base en polvo adecuada y un modificador de rendimiento.
Una formulación en solución adecuada para uso en un atomizador mediante el uso de electrohidrodinámica para producir gotas finas puede contener una dosis adecuada del anticuerpo de la invención por actuación y el volumen de actuación puede variar, por ejemplo, de 1 pL a 100 pL.
Se pueden agregar sabores, como mentol y levomentol, o endulzantes, como sacarina o sodio de sacarina, adecuados a las formulaciones de la invención que se dirigen a la administración intranasal/por inhalación.
Las formulaciones para administración intranasal/por inhalación pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retrasada, sostenida, pulsátil, controlada, dirigida y programada.
En el caso de aerosoles e inhaladores de polvo seco, la unidad de dosificación se determina mediante una válvula que suministra una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con la invención se disponen típicamente para administrar una dosis medida o “bocanada” de un anticuerpo de la invención. La dosis diaria general se administrará típicamente en una dosis única o, más generalmente, se dividirá en dosis a lo largo del día.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención también pueden formularse para una administración por vía oral. La administración oral puede implicar deglución, de modo que el compuesto ingrese al tracto gastrointestinal, y/o administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto ingresa al flujo sanguíneo directamente desde la boca.
Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen sistemas sólidos, semisólidos y líquidos tales como comprimidos; cápsulas duras o blandas que contienen multiparticulados o nanoparticulados, líquidos o polvos; grageas (incluso rellenas de líquido); masticables; geles; formas de dosificación de rápida dispersión; películas; óvulos; aerosoles; y parches bucales/mucoadhesivos.
Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, soluciones, jarabes y elíxires. Dichas formulaciones pueden emplearse como rellenadores en cápsulas duras o blandas (fabricadas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) y típicamente comprenden un portador, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa o un aceite adecuado y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. También pueden prepararse formulaciones líquidas mediante rehidratación de un sólido, por ejemplo, de un sobre.
Usos terapéuticos de anticuerpos y composiciones de la invención
En un aspecto, los anticuerpos anti-TIM-3 y porciones de unión al antígeno de estos, composiciones anti-TIM-3 y moléculas de unión biespecíficas de la invención son para su uso para mejorar o activar el sistema inmunitario en un humano que lo necesita. En algunas modalidades, el paciente tiene una afección caracterizada por la sobreexpresión o sobreactividad de TIM-3 o cualquiera de sus ligandos. En algunas modalidades, el paciente tiene supresión inmunitaria. En determinadas modalidades, el anticuerpo o porción de unión al antígeno de este, composición o molécula de unión biespecífica es para uso en el tratamiento de cáncer, por ejemplo, cánceres que se originan en tejidos como la piel, los pulmones, los intestinos, los ovarios, el cerebro, la próstata, los riñones, los tejidos blandos, el sistema hematopoyético, la cabeza y el cuello, el hígado, la vejiga, las mamas, el estómago, el útero y el páncreas, y todo cáncer u otra afección que se base en la actividad de TIM-3 y/o en el cual el paciente expresa o sobreexpresa galectina-9, fosfatidilserina, CEACAM-1 y/o HMGB-1. Los cánceres tratados por los anticuerpos anti-TIM-3, porciones de unión al antígeno de estos, composiciones de anticuerpo anti-TIM-3 y/o moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden incluir, por ejemplo, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide aguda) y tumores sólidos (por ejemplo, tumores sólidos metastásicos o avanzados).
En algunas modalidades, los cánceres tratados por los anticuerpos anti-TIM-3, porciones de unión al antígeno, composiciones anti-TIM-3 y/o moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden incluir, por ejemplo, melanoma (por ejemplo, melanoma metastásico o avanzado), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de las células escamosas de la cabeza y el cuello, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, glioblastoma, glioma, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma hepatocelular, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario superior, cáncer de esófago, cáncer de la unión gastroesofágica, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de colon, carcinoma colorrectal, múltiple mieloma, sarcomas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, síndrome mielodisplásico, cáncer nasofaríngeo, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma linfocítico pequeño, cáncer de ovarios, cáncer gastrointestinal, cáncer peritoneal primario, cáncer de las trompas de falopio, cáncer urotelial, linfoma/leucemia de linfocitos T asociada a HTLV, cáncer de próstata, cáncer genitourinario, meningioma, cáncer adrenocortical, gliosarcoma, fibrosarcoma, cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de piel de células basales, cáncer del apéndice, cáncer de tracto biliar, cáncer de glándulas salivales, cáncer de células de Merkel avanzado, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, mesotelioma y tumores sólidos.
El anticuerpo o porción de unión al antígeno de este, composición o molécula de unión biespecífica pueden ser para uso en el tratamiento de infecciones virales y/o parasíticas, por ejemplo, cuando los patógenos inhiben la respuesta inmunitaria del huésped.
“Tratar” y “tratamiento” se refieren a un método para aliviar o anular un trastorno biológico y/o al menos uno de sus síntomas correspondientes. Tal como se usa en la presente, “aliviar” una enfermedad, trastorno o afección significa reducir la gravedad y/o frecuencia de aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. Además, las referencias en la presente al “tratamiento” incluyen referencias a tratamiento curativo, paliativo y profiláctico.
La “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del agente terapéutico que se administra que aliviará en alguna medida uno o más de los síntomas del trastorno que se trata. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico anticancerígeno, por ejemplo, puede resultar en el encogimiento del tumor, aumento de la supervivencia, eliminación de las células cancerosas, disminución de la progresión de la enfermedad, revertir la metástasis u otros criterios de valoración clínicos deseados por profesionales de la salud.
Las composiciones de anticuerpo o anticuerpos o porciones de unión al antígeno de estos de la invención pueden administrarse solas o en combinación con uno o más fármacos o anticuerpos (o como cualquier combinación de estos).
Las composiciones farmacéuticas, métodos y usos de la invención, por tanto, también abarcan las modalidades de combinaciones (coadministración) con otros agentes activos, tal como se detalla más adelante.
Tal como se usa en la presente, se pretende que los términos “coadministración”, “coadministrados” o “en combinación con”, en referencia a las composiciones de anticuerpo, anticuerpos o porciones de unión al antígeno de estos y moléculas de unión biespecíficas de la invención con otro u otros agentes terapéuticos, signifiquen y se refieran e incluyan lo siguiente:
- la administración simultánea de dicha combinación de composición de anticuerpo / anticuerpo / porción de unión al antígeno / molécula de unión biespecífica de la invención y el o los agentes terapéuticos a un paciente que necesita un tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma de dosificación única que libera dichos componentes sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente,
- la administración sustancialmente simultánea de dicha combinación de composición de anticuerpo / anticuerpo / porción de unión al antígeno / molécula de unión biespecífica de la invención y el o los agentes terapéuticos a un paciente que necesita un tratamiento, cuando dichos componentes se formulan separados entre sí en formas de dosificación separadas que son tomadas sustancialmente al mismo tiempo por dicho paciente, con lo cual dichos compuestos se liberan sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente,
- la administración secuencial de dicha combinación de composición de anticuerpo / anticuerpo / porción de unión al antígeno / molécula de unión biespecífica de la invención y el o los agentes terapéuticos a un paciente que necesita un tratamiento, cuando dichos componentes se formulan separados entre sí en formas de dosificación separadas que son tomadas en momentos consecutivos por dicho paciente con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, con lo cual dichos componentes se liberan sustancialmente en momentos diferentes a dicho paciente, y
- la administración secuencial de dicha combinación de composición de anticuerpo / anticuerpo / porción de unión al antígeno / molécula de unión biespecífica de la invención y el o los agentes terapéuticos a un paciente que necesita un tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma de dosificación única que libera dichos componentes de manera controlada, con lo cual se liberan de manera simultánea, consecutiva y/o superpuesta en el mismo momento y/o en momentos diferentes a dicho paciente, donde cada parte puede administrarse mediante la misma vía o una vía diferente.
Las composiciones de anticuerpo, anticuerpos y porciones de unión al antígeno de estos y moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden administrarse sin tratamientos terapéuticos adicionales, es decir, como una terapia independiente. De manera alternativa, el tratamiento con las composiciones de anticuerpo y anticuerpos y porciones de unión al antígeno de estos de la invención puede incluir al menos un tratamiento terapéutico adicional (terapia de combinación). En algunas modalidades, la composición de anticuerpo o anticuerpo o porción de unión al antígeno de este puede coadministrarse o formularse con otro medicamento/fármaco para el tratamiento de cáncer. El tratamiento terapéutico adicional puede comprender, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, antineoplásico o antiangiogénico, un diferente anticuerpo anticancerígeno y/o radioterapia.
Se puede mejorar aún más el efecto al combinar las composiciones de anticuerpo, anticuerpos o porciones de unión al antígeno o moléculas de unión biespecíficas de la invención con agentes que se conoce que inducen la diferenciación terminal de células cancerosas. Dichos compuestos pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en ácido retinoico, ácidos transretinoicos, ácidos cisretinoicos, fenilbutirato, factor de crecimiento nervioso, sulfóxido de dimetilo, forma activa de vitamina D3, receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma, 12-O-tetradecanoilforbol 13-acetato, hexametilen-bis-acetamida, factor de crecimiento transformante beta, ácido butírico, AMP cíclico y vesnarinona. En algunas modalidades, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácido retinoico, fenilbutirato, ácido transretinoico total y forma activa de vitamina D.
Los artículos farmacéuticos que comprenden una composición de anticuerpo anti-TIM-3, anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este, o molécula de unión biespecífica de la invención y al menos otro agente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, antineoplásico o antiangiogénico) pueden utilizarse como un tratamiento de combinación para la administración simultánea, independiente o sucesiva en la terapia del cáncer. El otro agente puede ser cualquier agente adecuado para el tratamiento del cáncer particular en cuestión, por ejemplo, un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes alquilantes, por ejemplo, derivados de platino como cisplatina, carboplatina y/u oxaliplatina; alcoides vegetales, por ejemplo, paclitaxel, docetaxel y/o irinotecán; antibióticos antitumorales, por ejemplo, doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina mitoxantrona, dactinomicina, bleomicina, actinomicina, luteomicina y/o mitomicina; inhibidores de la topoisomerasa como topotecán; y/o antimetabolitos, por ejemplo, fluorouracilo y/u otras fluoropirimidinas.
Un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este, molécula de unión biespecífica o composición de anticuerpo anti-TIM-3 de la invención también pueden utilizarse en combinación con otras terapias anticancerígenas como vacunas, citocinas, inhibidores de enzima y terapias de linfocitos T. En el caso de una vacuna, puede ser, por ejemplo, una vacuna de proteína, péptido o ADN que contenga uno o más antígenos pertinentes para el cáncer que se trata, o una vacuna que comprende células dendríticas junto con un antígeno. Las citocinas adecuadas incluyen, por ejemplo, IL-2, IFN-gamma y GM-CSF. Un ejemplo de un tipo de inhibidor de enzima que tiene actividad anticancerígena es un inhibidor de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), por ejemplo, 1-metil-D-triptófano (1-D-MT). La terapia adoptiva de linfocitos T se refiere a diversas técnicas de inmunoterapia que implican expandir o modificar genéticamente los linfocitos T de los propios pacientes para reconocer y atacar sus tumores.
También se contempla que un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de este, molécula de unión biespecífica o composición de anticuerpo anti-TIM-3 de la invención pueden utilizarse en terapia adyuvante en conexión con los inhibidores de la tirosina cinasa. Estas son moléculas sintéticas, principalmente derivadas de quinazolina, de peso molecular bajo que interactúan con el dominio de la tirosina cinasa intracelular de los receptores e inhiben la fosforilación del receptor inducido por el ligando al competir por el sitio de unión Mg-ATP intracelular.
En algunas modalidades, la composición de anticuerpo, molécula de unión biespecífica o anticuerpo o porción de unión al antígeno de este pueden utilizarse en combinación con otro medicamento/fármaco que medie la activación del sistema inmunitario, que incluyen, de modo no taxativo, un agente que medie la expresión o actividad de A2AR, BLTA, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, CD27, CD28, CD39, CD40, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1 y/o CEACAM-5), galectina-9, GITR, HVEM, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, LAG-3, NKG2A, OX40, PD-1/PD-L1/PD-L2, TIGIT, TGFR-beta, TNFR2, VISTA y/o 2B4. En determinadas modalidades, el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que se une a una de las moléculas anteriores.
En determinados aspectos, los anticuerpos y porciones de unión al antígeno, composiciones y moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden administrarse en combinación con otro inhibidor de la vía TIM-3, que puede dirigirse a TIM-3 o uno o más de sus ligandos. Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen otros anticuerpos anti-TIM-3 y anticuerpos que se dirigen a los ligandos y/o correceptores de TIM-3 como galectina-9, HMGB-1, lípidos de fosfatidilserina, CEACAM1, LILRA1 -6 o LILRB1 -5.
Se comprende que las composiciones de anticuerpo, moléculas de unión biespecíficas y anticuerpos y porciones de unión al antígeno de estos de la invención pueden utilizarse en un método de tratamiento tal como se describe en la presente, pueden ser para su uso en un tratamiento tal como se describe en la presente.
Dosis y vía de administración
Las composiciones de anticuerpo de la invención se administrarán en una cantidad eficaz para el tratamiento de la afección en cuestión, es decir, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para lograr un resultado deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores como la afección en particular que se trata, la edad, sexo y peso del paciente, y si los anticuerpos se administran como tratamiento independiente o en combinación con uno o más tratamientos anticancerígenos adicionales.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar diversas dosis divididas en el transcurso del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente beneficioso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para la facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria, tal como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente independientes preparadas como dosificaciones unitarias para los pacientes/sujetos que se tratan; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico necesario. Las características para las formas de dosificación unitaria de la invención son generalmente determinadas y directamente dependientes de (a) las características únicas del agente quimioterapéutico y el efecto terapéutico o profiláctico particular a lograrse y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de fabricar dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Por lo tanto, el experto en la técnica apreciaría, en función de la descripción proporcionada en la presente, que la dosis y el régimen de dosificación se ajustan de acuerdo con los métodos conocidos en las técnicas terapéuticas. Es decir, se puede establecer fácilmente la dosis tolerable máxima y también se puede determinar la cantidad eficaz que proporciona un beneficio terapéutico detectable, así como los requisitos temporales para administrar dicho agente de modo de proporcionar un beneficio terapéutico detectable al paciente. Por consiguiente, si bien se ilustran determinados regímenes de administración y dosis en la presente, estos ejemplos de ningún modo limitan el régimen de administración y dosis que puede proporcionársele a un paciente al llevar a la práctica la presente invención.
Se debe observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviarse y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Se debe comprender además que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse en el transcurso del tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación determinados en la presente son únicamente ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance o práctica de la composición de las modalidades. Además, el régimen de dosificación con las composiciones de la presente invención puede basarse en una variedad de factores, incluso el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo y afección del paciente, la gravedad de la afección, la vía de administración y el anticuerpo particular utilizado. Por tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero puede determinarse de manera rutinaria mediante el uso de métodos estándares. Por ejemplo, se pueden ajustar las dosis en función de los parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir los efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. Por tanto, la presente invención abarca el incremento de la dosis intrapacientes tal como determine el experto en la técnica. Los regímenes y dosificaciones adecuados determinantes son conocidos en la técnica pertinente y los expertos en la técnica comprenderán que están abarcados una vez hayan sido proporcionados con las indicaciones descritas en la presente.
Se contempla que una dosis adecuada de una composición de anticuerpo de la invención estará en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, tal como alrededor de 0,5-50 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 1-20 mg/kg. La composición de anticuerpo puede administrarse, por ejemplo, en una dosificación de al menos 0,25 mg/kg, por ejemplo, al menos 0,5 mg/kg, tal como al menos 1 mg/kg, por ejemplo, al menos 1,5 mg/kg, tal como al menos 2 mg/kg, por ejemplo, al menos 3 mg/kg, tal como al menos 4 mg/kg, por ejemplo, al menos 5 mg/kg; y por ejemplo, hasta un máximo de 50 mg/kg, tal como hasta un máximo de 30 mg/kg, por ejemplo, hasta un máximo de 20 mg/kg, tal como hasta un máximo de 15 mg/kg. La administración se repetirá normalmente en intervalos adecuados, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas y durante el tiempo que el médico responsable considere adecuado, quien podrá aumentar o disminuir opcionalmente la dosificación según sea necesario.
Una cantidad eficaz para la terapia tumoral puede medirse por su capacidad para estabilizar la progresión de la enfermedad y/o mejorar los síntomas en un paciente y, preferentemente, para revertir la progresión de la enfermedad, por ejemplo, al reducir el tamaño del tumor. La capacidad de un anticuerpo, porción de unión al antígeno, molécula de unión biespecífica o composición de la invención para inhibir el cáncer puede evaluarse mediante ensayos in vitro, por ejemplo, según se describe en los ejemplos, así como en modelos animales adecuados que predicen la eficacia en tumores humanos. Los regímenes de dosificación adecuados se seleccionarán para proporcionar una respuesta terapéutica óptima en cada situación particular, por ejemplo, administrada como un único bolo o como una infusión continua y con un posible ajuste de la dosificación según indiquen las exigencias de cada caso.
Composiciones y usos diagnósticos
Los anticuerpos y porciones de unión al antígeno de la presente invención también son útiles en los procesos de diagnósticos (por ejemplo, in vitro, ex vivo). Por ejemplo, los anticuerpos y porciones pueden usarse para detectar y/o medir el nivel de TIM-3 en una muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido de intestino, saliva u orina). Los métodos adecuados de detección y medición incluyen métodos inmunológicos tales como citometría de flujo, ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos quimioluminiscentes, radioinmunoensayos e inmunohistología. La invención abarca además kits (por ejemplo, kits de diagnóstico) que comprenden los anticuerpos y porciones de unión al antígeno descritos en la presente.
Salvo que se defina lo contrario en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención tendrán los significados normalmente comprendidos por los expertos en la técnica. Más adelante se describen los métodos y materiales de ejemplo, si bien también se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente al llevar a la práctica o evaluar la presente invención. En caso de conflicto, regirá la presente memoria descriptiva, incluso las definiciones.
En general, la nomenclatura utilizada en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química analítica, química orgánica sintética, química medicinal y farmacéutica y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación que se describen en la presente son conocidas y normalmente utilizadas en la técnica. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, tal como se realizan normalmente en la técnica o como se describen en la presente.
Además, salvo que el contexto exija lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. A lo largo de la presente memoria descriptiva y las modalidades, se comprenderá que las palabras “tener” y “comprender”, o variaciones como “tiene”, “tienen”, “comprende” o “comprenden” implican la inclusión de un número entero determinado o un grupo de números enteros, pero no excluyen ningún otro número entero o grupo de números enteros.
Si bien una variedad de documentos se citan en la presente, estas citas no constituyen una admisión de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general normal en la técnica.
Para que la presente invención pueda comprenderse mejor, se establecen los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Clonación de anticuerpos anti-TIM-3 a partir de linfocitos B de rata
Este ejemplo describe el método utilizado para generar los anticuerpos anti-TIM-3 de humano de la invención. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos y ADN de los anticuerpos.
Materiales y métodos
Los anticuerpos anti-TIM-3 de la invención se aislaron de un repertorio de anticuerpos derivado de ratas OmniRat® (Osborn et ál., J Immunol. 190(4):1481-90 (2013)), una cepa de rata de OMT (Open Monoclonal Technology, Inc.) que produce anticuerpos con idiotipos completamente humanos. La clonación de los genes de anticuerpo derivados de rata de linfocitos B secretores de anticuerpo (ASC, por sus siglas en inglés) clasificados en una única célula se llevó a cabo mediante la tecnología de descubrimiento de anticuerpo Symplex™ (Meijer et ál., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)).
Se preparó una biblioteca de anticuerpos Symplex™ a partir de los linfocitos B clasificados en una única célula a partir de ratas OmniRat® inmunizadas; la biblioteca contenía pares codificantes de VH y VL cognados para cada linfocito B clasificado. Las construcciones del repertorio de anticuerpos que codificaban las inmunoglobulinas completamente humanas en formato IgG1 o IgG2 se transfectaron en células Expi293 y los sobrenadantes celulares se evaluaron respecto a las propiedades de unión en un formato de alto rendimiento. Los resultados de la evaluación se analizaron mediante secuenciación del ADN y se extrajeron las secuencias de ADN codificantes de anticuerpo. Los clones de anticuerpo seleccionados se expresaron y analizaron funcionalmente tal como se describe más adelante. La Tabla 1 muestra las secuencias de ácidos nucleicos del dominio variable de cadena pesada y ligera del clon de anticuerpo 15086.15086. La Tabla 2 muestra las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera para dicho clon de anticuerpo y la Tabla 4 muestra las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera. La Tabla 3 muestra las secuencias de aminoácidos de la región constante de cadena pesada IgG1 y la región constante de cadena ligera kappa.
Debido al uso de cebadores degenerados en la clonación Symplex™ de fragmentos de ADNc que codifican el anticuerpo, se corrigió una variedad de mutaciones de sentido erróneo en los extremos amino de las cadenas pesada y ligera para determinados anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144). La Tabla 5 muestra las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera en el nivel de ADN del anticuerpo optimizado designado 15086.16837, 15086.17145 o 15086.17144 (estas tres variantes difieren en el subtipo de isotipo pero tienen secuencias idénticas de dominio variable de cadena pesada y ligera). El proceso de optimización incluye coincidir la corrección de extremo terminal a la línea germinal, así como la optimización de uso de codones. Los objetivos para hacer coincidir las secuencias de línea germinal humana fueron IGHV4-31 para los dominios variables de cadena pesada e IGKV3-11 para los dominios variables de cadena ligera.
Se identificaron anticuerpos adicionales que definían diferentes conjuntos de epítopos. Las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 9 y en la Tabla 10. Se identificaron anticuerpos funcionales adicionales y las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de estos se muestran en la Tabla 12 y en la Tabla 13.
Resultados
La Tabla 1 muestra las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo clonado mediante Symplex TM 15086.15086.
Ta ™
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La Tabla 2 muestra las secuencias de proteína deducidas del anticuerpo clonado mediante Symplex™ original 15086.15086. Las CDR se muestran en negrita y cursiva.
Tabla 2: Secuencias de proteína de dom inios variables del anticuerpo clonado mediante Sym plex™
15086.15086
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La
Tabla 3 muestra las regiones constantes de cadena pesada y ligera.
Tabla 3: Secuencias de roteína de re iones constantes
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La
Tabla 4 muestra las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera compartidas por los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144. Las secuencias de CDR en la presente se determinaron de acuerdo con las definiciones de IMGT® para CDR1 y CDR2. Para la CDR3 de cadena pesada y ligera, las definiciones en la presente incluyen un residuo de aminoácido adicional corriente arriba de IMGT-CDR3 (Cys) y un residuo de aminoácido adicional corriente abajo (Trp para CDR3 de VH, Phe para CDR3 de VL).
Ta l 4 n i r ín DR n i r 1 1 1 1 1 1 14 y 15086.17144
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La
Tabla 5 muestra las secuencias de ADN optimizadas que codifican los dominios variables de cadena pesada y ligera compartidas por los anticuerpos 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144.
Tabla 5: Secuencias de ADN optimizadas que codifican los dom inios variables de los anticuerpos
15086.16837 15086.17145 15086.17144
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La Tabla 6 muestra las secuencias de proteína de dominio variable de cadena pesada y ligera deducidas compartidas por los anticuerpos 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144. Las CDR se muestran en negrita y cursiva. Obsérvese que la secuencia de proteína de VL es la misma que la secuencia de proteína de VL no optimizada.
Tabla 6: Secuencias de proteína optimizadas de los dominios variables de los anticuerpos optimizados
15086.16837 15086.17145 15086.17144
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La Tabla 7 muestra las secuencias de ADN que codifican las regiones constantes de anticuerpo en diferentes formatos de isotipo.
Tabla 7: Secuencias de ADN que codifican las regiones constantes de anticuerpo en diferentes form atos de isoti o
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La Tabla 8 muestra las secuencias de proteína de las regiones constantes de anticuerpo en diferentes formatos de isotipo.
Ta l n i r ín l r i n n n ni r n if r n f rm i i
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La Tabla 9 muestra las secuencias de ADN que codifican los dominios variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-TIM-3 utilizados para la clasificación de epítopos.
Tabla 9: Secuencias de ADN de dom inios variables de anticuer os de clasificación anti-TIM-3
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La Tabla 10 muestra las secuencias de proteína de dominios variables de cadena pesada y ligera deducidas de los anticuerpos anti-TIM-3 utilizados para la clasificación de epítopos. Las CDR se muestran en negrita y cursiva.
T l 1 n i r ín m ini ri l ni r l ifi i n ni-TIM-
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La Tabla 11 muestra las CDR de los anticuerpos de clasificación anti-TIM-3. Las SEQ ID NO de las CDR se muestran en cada secuencia. Las secuencias de CDR en la presente se determinaron de acuerdo con las definiciones de IMGT® para CDR1 y CDR2. Para la CDR3 de cadena pesada y ligera, las definiciones en la presente incluyen un residuo de aminoácido adicional corriente arriba de IMGT-CDR3 (Cys) y un residuo de aminoácido adicional corriente abajo (Trp para CDR3 de VH, Phe para CDR3 de VL).
- -
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La Tabla 12 muestra las secuencias de ADN que codifican los dominios variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-TIM-3 adicionales identificados como anticuerpos funcionales. Las secuencias de los anticuerpos funcionales 20131 y 20293 se muestran en la Tabla 9 que antecede.
Tabla 12: Secuencias de ADN de dom inios variables de anticuer os anti-TIM-3 funcionales adicionales
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La Tabla 13 muestra las secuencias de proteína deducidas de los dominios variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-TIM-3 adicionales identificados como anticuerpos funcionales. Las CDR se muestran en negrita y cursiva. Las secuencias de los anticuerpos funcionales 20131 y 20293 se muestran en la Tabla 10 que antecede.
T - - es
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La Tabla 14 muestra las CDR de anticuerpos anti-TIM-3 funcionales adicionales. Las SEQ ID NO de las CDR se muestran en cada secuencia. Las secuencias de CDR en la presente se determinaron de acuerdo con las definiciones de IMGT® para CDR1 y CDR2. Para la CDR3 de cadena pesada y ligera, las definiciones en la presente incluyen un residuo de aminoácido adicional corriente arriba de IMGT-CDR3 (Cys) y un residuo de aminoácido adicional corriente abajo (Trp para CDR3 de VH, Phe para CDR3 de VL). Las secuencias de los anticuerpos funcionales 20131 y 20293 se muestran en la Tabla 11 que antecede.
- -
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Ejemplo 2: Análisis de unión cinética de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144
Este ejemplo demuestra que la afinidad de unión de los anticuerpos 15086.15086 (IgG1), 15086.16837 (IgG1 LALA), 15086.17145 (IgG2) y 15086.17144 (IgG4 (S228P)) mostraron afinidades de unión muy similares con valores Kd de alrededor de 19-23 nM. “IgG1 LALA” se refiere a la presencia de las mutaciones “LALA” en la cadena pesada (L234A/L235A, numerado de acuerdo con el esquema de numeración Eu (Edelman et ál., Proc. Natl. Acad. EUA 63:78-85 (1969)) que se conoce que reducen la función efectora de la región Fc de los anticuerpos IgG 1 (Armour et ál., Eur J Immunol. 29(8):2613-24 (1999); Hezareh et ál., J Virol. 75(24):12161 -68 (2001); y Hessel et ál., Nature 449(7158):101-104 (2007)).
Materiales y métodos
El análisis de unión cinética se llevó a cabo mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR), mediante el uso de un Continuous Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, EE. UU.) en combinación con un instrumento Ibis MX96 SPR (IBIS Technologies, Países Bajos). El análisis de imagenología de resonancia de plasmones de superficie se llevó a cabo en sensores SPR G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Países Bajos). Los anticuerpos anti-TI M-3 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144 se diluyeron en 0,15 gg/ml en PBS-T (1x PBS con Tween 20 al 0,05 %, pH 7,4). Los anticuerpos se colocaron en un G-a-hu-IgG Fc SensEye® durante 15 minutos mediante el uso de un Continuous Flow Microspotter. Después, el SensEye® se colocó en el biosensor IBIS MX96 y el análisis cinético se llevó a cabo al aplicar una serie de titulaciones denominadas cinéticas (Karlsson et ál., Anal Biochem. 349(1):136-47 (2006)), donde el antígeno de ECD de TIM-3 de humano monomérico (Acro Biosystems) se inyectó en concentraciones en aumento de 2 nM a 100 nM sin aplicar etapas de regeneración de superficie después de cada inyección de antígeno. La asociación al antígeno se llevó a cabo durante 5 minutos y la disociación al antígeno se llevó a cabo durante 45 minutos. Las respuestas de unión registradas se ajustaron a un modelo de unión Langmuir 1:1 simple con software Scrubber 2 para el cálculo de las constantes de asociación (kon o ka), disociación (koff o kd) y afinidad (KD).
Resultados
Las mediciones cinéticas llevadas a cabo en el sistema IBIS mostraron que los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144, en cuatro formatos de isotipos diferentes, tuvieron cinéticas de unión muy similares con valores KD en el intervalo de 19-23 nM (Tabla 15).
Tabla 15: Cinética de unión de anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.1714 a ECD de TIM-3 de humano se ún se m idió mediante resonancia de lasmones de su erficie SPR
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Ejemplo 3: Evaluación funcional in vitro del anticuerpo anti-TIM-3
Un panel de mAb únicos en la subclase IgG1 fue clonado tal como se describió anteriormente (Ejemplo 1) y se evaluó respecto a la actividad funcional a una única concentración (25 ug/ml) en el ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito (MLR). El anticuerpo anti-TIM-3 más funcional (15086.15086) se volvió a formatear en las subclases IgG1 LALA (15086.16837), IgG2 (15086.17145) e IgG4 (15086.17144).
Este ejemplo demuestra la actividad funcional in vitro de las diversas subclases de IgG del anticuerpo anti-TIM-3 al inducir la secreción de citocinas dependientes a la dosis en un ensayo unilateral MLR.
Materiales y métodos
En el ensayo unilateral MLR, las células dendríticas (DC) y los linfocitos T CD4-positivos (CD4+) se aislaron a partir de dos diferentes donantes saludables y se cultivaron juntas para inducir una reacción específica al aloantígeno, lo que resultó en la producción de citocina y la proliferación/activación de linfocitos T. Las células dendríticas se diferenciaron de los monocitos CD14+ en 6 días de cultivo con 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 20 ng/ml de interleucina 4 (IL-4) y se mezclaron en una relación 1:10 con linfocitos T CD4+ aislados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de material de donante saludable. Después de 5 días de cultivo, se cosecharon los sobrenadantes y se determinaron los niveles de IFN-y y TNF-a mediante el uso del ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala de citocina. Este ensayo utiliza etiquetas electroquimioluminiscentes (SULFO-TAG) que se conjugan para la detección de anticuerpos. Cuando se aplica corriente a los electrodos de placa, la etiqueta SULFO-TAG emite luz y la intensidad de la luz se mide para cuantificar las citocinas en las muestras.
Resultados
Se muestran curvas dosis-respuesta en el ensayo unilateral MLR de los anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144 en las Figuras 1 y 2. Las curvas dosis-respuesta fueron generadas mediante una titulación de dos veces de los anticuerpos, con una concentración inicial de 50 ug/ml. Cada punto en el gráfico representa el promedio de tres réplicas; las barras de error representan SEM.
Los anticuerpos 15086.15086 y 15086.17145 (variantes IgG1 e IgG2) mostraron una funcionalidad similar e indujeron un aumento dependiente de la dosis tanto en IFN-y como en TNF-a en el ensayo unilateral MLR. El anticuerpo 15086.17144 (variante IgG4) indujo únicamente una respuesta en las dos mayores concentraciones, mientras que no se observó funcionalidad del anticuerpo 15086.16837 (variante IgG 1 LALA).
Ejemplo 4: Efecto del anticuerpo anti-TIM-3 en subconjuntos de células purificadas
Se indicó primero que TIM-3 se expresaba de manera selectiva por linfocitos T citotóxicos CD8+ (CD8 positivos) y linfocitos T colaboradores CD4+ que producen IFN-y, y se demostró que era un regulador negativo de la respuesta de los linfocitos T. Posteriormente, se descubrió que TIM-3 se expresa extremadamente de forma endógena en células dendríticas, monocitos y células citotóxicas naturales (NK) (Freeman et ál., Immunol Rev 235:172-89 (2010); Kuchroo et ál., Nat Rev Immunol 8:577-580 (2008); Anderson et ál., Science 318:1141-1143 (2007); y Da Silva et ál., Cáncer Immunol Res 2:410-422 (2014)). Este ejemplo muestra cómo la ligación de TIM-3 por los anticuerpos anti-TIM-3 tiene un efecto directo en las células dendríticas, lo que conduce a un aumento de la secreción de TNF-a.
Materiales y métodos
Se aislaron PBMC, linfocitos T CD4+ sin tratamiento previo y células CD8+ sin tratamiento previo de material de un donante saludable. Se generaron células dendríticas a partir de tres donantes saludables individuales tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. Los subconjuntos de células aisladas se incubaron durante 5 días con 10 ug/ml de los anticuerpos indicados y se determinaron los niveles de TNF-a mediante el uso del ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala de citocina.
Resultados
El efecto directo en los subconjuntos de células purificadas de anticuerpos 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 y 15086.17144 se representa en la Figura 3, donde cada barra representa el promedio de cinco réplicas y las barras de error representan SEM. Los resultados demuestran que la presencia de la variante IgG1 (15086.15086) o IgG2 (15086.17145) del anticuerpo anti-TIM-3 resultó en un aumento de la secreción de TNF-a de células dendríticas de los tres donantes. Se observó un efecto similar en la población de PBMC que contenía múltiples subconjuntos de células que expresan TIM-3 (por ejemplo, monocitos y células NK). Las variantes IgG 1 LALA (15086.16837) e IgG4 (15086.17144) tuvieron solamente un efecto mínimo sobre la secreción de TNF-a. Ninguno de los anticuerpos evaluados tuvo un efecto sobre los linfocitos T CD4+ sin tratamiento previo o linfocitos T CD8+ sin tratamiento previo.
Ejemplo 5: Análisis por citometría de flu jo de anticuerpos anti-TIM-3 respecto a la actividad de bloqueo de fosfatidilserina
Este ejemplo ilustra cómo un anticuerpo anti-TIM-3 de la invención [15086.17145] se evaluó respecto a la actividad de bloqueo de fosfatidilserina (PtdS) al llevar a cabo un ensayo de competición de citometría de flujo mediante el uso de células apoptóticas superficiales fosfatidilserina positivas y TIM-3 soluble con etiqueta de fluorocromo.
Materiales y métodos
Se investigó la actividad de bloqueo de fosfatidilserina en un ensayo a base de células, en el cual se inducen los linfocitos T Jurkat para someterse a apóptosis mediante tratamiento con Estaurosporina (de Streptomyces sp., Sigma-Aldrich, EUA). Durante la apóptosis, PtdS se traslada de la cara citoplasmática de la membrana de plasma a la superficie celular y permite la unión de la proteína quimérica TIM-3 de humano-Fc etiquetada con R-PE para analizarse mediante citometría de flujo. La proteína quimérica TIM-3-Fc recombinante comercialmente disponible (R&D Systems, EUA) se conjugó con R-PE mediante el uso del kit de conjugación R-Ficoeritrina Lightning-Link® (Innova Biosciences, Reino Unido). Para cada concentración de anticuerpo a analizarse, 25 pl de dilución de TIM-3-PE (correspondiente a aproximadamente 0,33 pg de TIM-3-Fc) se mezcló con 25 pl de anticuerpo (inicio a 20 pg/ml final) en amortiguador de unión de Anexina V (BD Pharmingen™, EUA) y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos antes de agregarse a las células. Los linfocitos T Jurkat se cultivaron en presencia de Estaurosporina 1 pM durante 2 h, se lavaron una vez en amortiguador de unión a RT y, para cada evaluación, se combinaron 2x105 células en 50 pl de amortiguador de unión con la mezcla de anticuerpo/TIM-3-PE. Después de 15 minutos de incubación a RT, se agregaron 100 pl de amortiguador de unión, las células se centrifugaron y los pellets se volvieron a suspender en 100 de amortiguador de unión para su adquisición. Se cuantificó la unión de TIM-3-PE a células apoptóticas mediante citometría de flujo que detecta la fluorescencia PE (MFI). En paralelo, la exposición superficial de PtdS en células tratadas con Estaurosporina se confirmó mediante tinción con Anexina V-PE (Kit de detección de apóptosis de Anexina V PE I, BD Pharmingen™). El anticuerpo anti-PD-1 Keytruda® (pembrolizumab; Merck & Co., Inc.) se utilizó como control negativo para la unión a TIM-3 / bloqueo de PtdS, y un anticuerpo de referencia anti-TIM-3 ABTIM3 [18571.18571] (WO 2015/117002 A1; Novartis AG) se utilizó como control positivo para la unión a TIM-3 / bloqueo de PtdS. Además, también se utilizó un anticuerpo anti-TIM-3 diferente [15338.15338], que se identificó anteriormente como un anticuerpo sin bloqueo, como control negativo para el bloqueo de PtdS.
Resultados
Los resultados del experimento de competición se presentan en la Figura 4. El anticuerpo anti-TIM-3 [15086.17145] es capaz de inhibir la interacción de TIM-3-Fc soluble con PtdS presentada en células en una manera dependiente de la dosis (Figura 4A). A 3.125 pg/ml, bloquea la unión de TIM-3-Fc a células PtdS positivas a 2 % de la unión detectada en presencia de un anticuerpo anti-TIM-3 sin bloqueo [15338.15338] (Figura 4B). El anticuerpo anti-TIM-3 de referencia [18571.18571] fue capaz de bloquear la unión a 3,2 % en la misma concentración (Figura 4C). Los resultados para el anticuerpo anti-PD-1 Keytruda® de control negativo se muestran en la Figura 4D.
Ejemplo 6: Clonación de análogos de anticuerpo de referencia anti-TIM-3
Los análogos de referencia de los anticuerpos anti-TIM-3 ABTIM3 y mAb15 se utilizan en diversos de los ejemplos en la presente. Los análogos de referencia se generaron tal como se describe más adelante.
Las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada y ligera de ABTIM3 y mAb15 se obtuvieron a partir de las solicitudes de patente que se muestran en la Tabla 16 más adelante. Las secuencias de aminoácidos de fragmentos de cadena pesada (VH) variable y cadena ligera (VL) variable fueron traducidos de forma inversa a secuencias de ADN con uso de codones humanos. Luego, los fragmentos de ADN correspondiente se sintetizaron y clonaron en vectores de expresión que contenían regiones constantes de cadena pesada humana (cualquiera de los cuatro formatos diferentes de isotipo: IgG1, IgG1-LALA, IgG2 o IgG4) o regiones constantes de cadena ligera kappa, lo que resultó en las secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpo de longitud completa. Para impedir el intercambio de grupos Fab en la variante IgG4, el residuo de serina en la posición 228 (numeración EU) fue sustituido con prolina (Angal et ál., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993)). Se transfectaron células CHO con los plásmidos de expresión resultantes mediante el uso de un sistema de expresión de proteína estándar. Después de la expresión del anticuerpo, los sobrenadantes de anticuerpo correspondientes fueron purificados mediante el uso de cromatografía en columna de purificación de proteína A estándar.
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Ejemplo 7: Evaluación funcional in vitro de anticuerpos anti-TIM-3 adicionales en un ensayo unilateral MLR
Este ejemplo demuestra la actividad funcional in vitro de nueve anticuerpos anti-TIM-3 adicionales al inducir la secreción de IFN-y dependiente de la dosis en un ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito (MLR).
Materiales y métodos
El ensayo unilateral MLR se configuró tal como se describe en el Ejemplo 3. En resumen, se cultivaron en conjunto células dendríticas (DC) y linfocitos T CD4+ durante 5 días en presencia de los anticuerpos indicados. Después de 5 días de cultivo, se cosecharon los sobrenadantes y se determinaron los niveles de IFN-y mediante el uso del ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala de IFN-y.
Resultados
Las curvas dependientes de la dosis para los nueve anticuerpos anti-TIM-3 adicionales se muestran en la Figura 5.
Todos los nueve anticuerpos indujeron un aumento dependiente de la dosis de los niveles de IFN-y en este ensayo. Cabe destacar que no se observó efecto de los anticuerpos de referencia ABTIM3 y mAb15. Las curvas dosisrespuesta fueron generadas mediante una titulación de dos veces de los anticuerpos, con una concentración inicial de 100 ug/ml. Cada punto en el gráfico representa el promedio de tres réplicas y las barras de error representan SEM.
Ejemplo 8: Evaluación funcional in vitro de anticuerpos anti-TIM-3 adicionales en un ensayo bilateral MLR
Este ejemplo demuestra la actividad funcional in vitro de diez anticuerpos anti-TIM-3 al inducir la secreción de IFN-y dependiente de la dosis en un ensayo bilateral mixto de reacción de linfocito (MLR).
Materiales y métodos
En el ensayo bilateral MLR, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de dos diferentes donantes saludables y se cultivaron en conjunto para inducir una reacción específica al aloantígeno, lo que resultó en la producción de citocina y la proliferación/activación de linfocitos T. Las PBMC de los dos donantes diferentes se mezclaron en una relación 1:1. Después de 5 días de cultivo, se cosecharon los sobrenadantes y se determinaron los niveles de IFN-y mediante el uso del ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala de citocina.
Resultados
Las curvas dependientes de la dosis para los diez anticuerpos anti-TIM-3 se muestran en la Figura 6 para un par donante. Todos los anticuerpos anti-TIM-3 indujeron un aumento dependiente de la dosis de los niveles de IFN-y en este ensayo. Cabe destacar que no se observó efecto de los anticuerpos de referencia ABTIM3 y mAb15. Las curvas dosis-respuesta fueron generadas mediante una titulación de dos veces de los anticuerpos, con una concentración inicial de 100 ug/ml. Cada punto en el gráfico representa el promedio de tres réplicas y las barras de error representan SEM.
Ejemplo 9: Evaluación funcional in vitro de anticuerpos anti-TIM-3 adicionales en un ensayo de células dendríticas
Este ejemplo demuestra la actividad funcional in vitro de nueve anticuerpos anti-TIM-3 al inducir la secreción de TNF-a dependiente de la dosis de células dendríticas derivadas de monocitos.
Materiales y métodos
Los monocitos CD14+ se aislaron de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de material de donante saludable. Las células dendríticas (DC) se diferenciaron de los monocitos CD14+ en 6 días de cultivo con 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 20 ng/ml de interleucina 4 (IL-4). Las células dendríticas derivadas de monocitos se cosecharon y cultivaron durante 5 días en presencia de los anticuerpos indicados. Después de 5 días de cultivo, se cosecharon los sobrenadantes y se determinaron los niveles de TNF-a mediante el uso del ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala de TNF-a.
Resultados
Las curvas dependientes de la dosis para los nueve anticuerpos anti-TIM-3 adicionales se muestran en la Figura 7. Todos los nueve anticuerpos anti-TIM-3 indujeron un aumento dependiente de la dosis de los niveles de TNF-a de células dendríticas derivadas de monocitos en dos donantes independientes. Cabe destacar que no se observó efecto de los anticuerpos de referencia ABTIM3 y mAb15. Las curvas dosis-respuesta fueron generadas mediante una titulación de dos veces de los anticuerpos, con una concentración inicial de 100 ug/ml. Cada punto en el gráfico representa el promedio de tres réplicas y las barras de error representan SEM.
Ejemplo 10: Medición de afinidades de anticuerpo para TIM-3 de humano y de cynomolgus
Este ejemplo demuestra las afinidades de unión de fragmentos Fab anti-TIM-3 de dominios extracelulares de TIM-3 de humano y de cynomolgus según se mide mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR).
Materiales y métodos
El análisis de unión cinética se llevó a cabo mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR), mediante el uso de un Continuous Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, EE. UU.) en combinación con un instrumento IBIS MX96 SPR (iBlS Technologies, Países Bajos).
Los fragmentos Fab anti-TlM-3 se generaron a partir de las variantes de secuencias corregidas de anticuerpos seleccionados en formato lgG1 LALA mediante el uso de kits de escisión enzimática estándares (Genovis, Suecia). Los fragmentos Fab se etiquetaron como Fab [número de anticuerpo]. La secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada utilizada para Fab 15086 es la secuencia corregida que se muestra en la SEQ ID NO: 7.
La codificación de ADNc TIM-3 para el dominio extracelular de TIM-3 de humano y de cynomolgus se sintetizó y clonó en un vector que contenía un promotor CMV y una secuencia Fc de IgG1 humana (AA P101-K330), lo que resultó en la fusión de extremo C de IgG1 Fc al ECD de TIM-3 clonado. Las construcciones de fusión de TIM-3 Fc se generaron mediante PCR estándar y técnicas de modificación genética y la proteína se expresó de forma transiente en un cultivo de 2 ml mediante el uso de un sistema de expresión ExpiCHO™. Las construcciones de fusión Fc de TIM-3 de humano se cosecharon después de 9 días y los sobrenadantes fueron evaluados respecto a su afinidad de unión a los fragmentos Fab anti-TIM-3 mediante SPR. Los antígenos fueron purificados mediante procedimientos estándares y se capturaron en un G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Países Bajos) durante 15 minutos mediante el uso de un Continuos Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, EE. UU.). Después de la colocación, el SensEye® se colocó en el biosensor IBIS MX96, los restantes sitios de captura se bloquearon y las proteínas capturadas se fijaron a la superficie mediante el uso del kit FixIT (Ssens BV, Países Bajos). El análisis cinético se llevó a cabo al aplicar una serie de titulación denominada cinética (Karlsson R. 2006), donde los fragmentos Fab monoméricos de los anticuerpos de la invención se inyectaron en concentraciones en aumento de 1 nM a 100 nM sin aplicar etapas de regeneración de superficie después de cada inyección de Fab. La asociación a Fab se llevó a cabo durante 15 minutos y la disociación al antígeno se llevó a cabo durante 15 minutos. Las respuestas de unión registradas se ajustaron a un modelo de unión Langmuir 1:1 simple con software Scrubber 2 para el cálculo de las constantes de asociación (kon o ka), disociación (koff o kd) y afinidad (KD).
Resultados
Los resultados de la medición de afinidad demuestra que Fab 15086, Fab 20293 y Fab 20131 y los dos anticuerpos de referencia se unen a TIM-3 de humano y de cynomolgus con diferentes afinidades. La cinética de unión detallada se muestra en la Tabla 17 a continuación.
Tabla 17: Cinética de unión de los fragmentos Fab anti-TIM-3 a ECD de TIM-3 de humano o de cynomolgus se ún se mide mediante SPR.
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Ejemplo 11: Determinación de ELISA de la unión de anticuerpo a ECD de TIM-3 de humano y cynomolgus
Este ejemplo demuestra las avideces de unión de los anticuerpos anti-TIM-3 para ECD de TIM-3 de humano y de cynomolgus según se mide mediante ELISA.
Materiales y métodos
La unión anticuerpo-antígeno se midió mediante ELISA con antígenos de fusión TIM-3 Fc recubiertos en 1 gg/ml. Los antígenos humanos y de cynomolgus se obtuvieron de Sino Biologicals. Los anticuerpos anti-TIM-3 se incubaron con los antígenos recubiertos a diferentes concentraciones que comenzaron en 150 gg/ml (1000 nM) en titulaciones en serie en 2 veces. Después del lavado, se detectaron los anticuerpos unidos mediante anticuerpos secundarios conjugados con HRP (peroxidasa de rábano).
Resultados
ELISA demostró que todos los anticuerpos evaluados son capaces de unión a ECD de TIM-3 tanto de humano como de cynomolgus. Se indica la concentración de los anticuerpos anti-TIM-3 que proporcionaron la unión máxima media (EC50). Todos los anticuerpos evaluados se unieron a TIM-3 de humano con valores EC50 alrededor de 1 nM o menores, mientras que se observó una variación mucho mayor en la unión a TIM-3 de cynomolgus (Tabla 18). Algunos anticuerpos como 20131,20185, 20293 y ABTIM3 mostraron una unión idéntica a TIM-3 de humano y de cynomolgus. Otros anticuerpos como 19324, 19416, 19568 y 20300 mostraron una unión intermedia a TIM-3 de cynomolgus, mientras que los anticuerpos 20362, 20621 y 15086.17145 mostraron una reactividad cruzada débil a TIM-3 de cynomolgus (una reducción de EC50 de más de 100 veces). Las curvas de unión para los anticuerpos que presentaron la menor reactividad cruzada de TIM-3 de cynomolgus mostraron claramente la unión saturada al antígeno cuando se evaluaron en la mayor concentración en la evaluación de ELISA.
Tabla 18: Avideces de unión (EC50) de anticuerpos anti-TIM-3 a TIM-3 de humano o de cynomolgus según se mide mediante ELISA
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Ejemplo 12: Clasificación de epítopos de anticuerpos anti-TIM-3
Este ejemplo ilustra cómo los anticuerpos anti-TIM-3 de la invención pueden agruparse en conjuntos de epítopos en función de los patrones de competición emparejados. Los anticuerpos que pertenecen a diferentes conjuntos de epítopos reconocen diferentes epítopos en el dominio extracelular (ECD) de TIM-3.
Materiales y métodos
La investigación de competición de anticuerpos emparejados se llevó a cabo mediante análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) mediante el uso de un Continuous Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, EE. UU.) en combinación con un instrumento IBIS MX96 SPR (IBIS Technologies, Países Bajos). El análisis de imagenología de resonancia de plasmones de superficie se llevó a cabo en un sensor SPR G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Países Bajos). Se diluyeron un total de dieciséis anticuerpos IgG2 anti-TIM-3 de humano y dos anticuerpos de referencia IgG4 (ABTIM3 y mAb15) a 15 pg/ml en amortiguador PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBS-T), pH 7,0. Los anticuerpos se capturaron en la superficie del sensor anti-Fc en la colocación durante 15 minutos mediante el uso de un Continuous Flow Microspotter. Después de la colocación, el SensEye® se colocó en el biosensor IBIS MX96 y los sitios anti-Fc residuales se bloquearon mediante inyección de 30 pg/ml de IgG1 humana no específica. Los anticuerpos capturados se conjugaron en la superficie mediante el uso de un kit FixIt (Ssens BV, Países Bajos). Después de la preparación del sensor, el análisis de competición de anticuerpo se llevó a cabo mediante el uso de un ensayo clásico sándwich en donde los anticuerpos inmovilizados se unieron a 200 nM del antígeno TIM-3 monovalente soluble (Acro Biosystems, China), seguido por el sondeo respecto a la unión con otro anticuerpo anti-TIM-3. A continuación, se llevaron a cabo inyecciones individuales de cada uno de los anticuerpos anti-TIM-3 diluidos a 15 pg/ml en amortiguador PBS-T para establecer los patrones de competición de anticuerpo. Después de cada ciclo de competición, la superficie de sensor se regeneró con amortiguador H3PO4 100 mM, pH 3,0.
Resultados
El patrón de competición de dieciocho anticuerpos anti-TIM-3 se presenta en la Figura 8. Los anticuerpos mAb15 (conjunto 1), 15105 y 15107 (conjunto 2), 15260 y ABTIM3 (conjunto 3), 17244 (conjunto 7) y 15174 y 15175 (conjunto 8) no mostraron actividad funcional en los ensayos MLR basados en células descritos en la presente, pero se incluyeron dado que reconocieron diferentes epítopos. Los anticuerpos del conjunto 8 se analizaron únicamente en solución, dado que la unión a TIM-3 se redujo significativamente cuando estos anticuerpos se capturaron en la superficie del sensor (bloqueo unidireccional). Por lo tanto, estos anticuerpos se representan en cuadrados. Se descubrió que los anticuerpos anti-TIM-3 funcionales se unen a tres conjuntos de epítopos con competencia cruzada (conjuntos 4, 5 y 6). Los anticuerpos funcionales que pertenecían al conjunto de epítopos 4 incluyeron los anticuerpos 20621,20293, 19568, 20362, 15086.17145 y 19416. Estos anticuerpos se bloquearon de forma cruzada entre sí y con los anticuerpos de los conjuntos de epítopos 3, 5, 6 y 7. Los anticuerpos funcionales que pertenecían al conjunto de epítopos 5 incluyeron los anticuerpos 20131 y 20185. Estos anticuerpos se bloquearon de forma cruzada entre sí y con los anticuerpos de los conjuntos de epítopos 3, 4, 6 y 7. De manera adicional, 20131 y 20185 también impidieron la unión de mAb15 cuando se capturaron en la superficie del sensor únicamente (bloqueo unidireccional, líneas punteadas). En último lugar, los anticuerpos funcionales que pertenecían al conjunto de epítopos 6 incluyeron los anticuerpos 19324 y 20300. Estos anticuerpos se bloquearon de forma cruzada entre sí y con todos los otros anticuerpos excepto los anticuerpos del conjunto 2.
Se puede deducir de los resultados presentados anteriormente que los anticuerpos funcionales de los conjuntos de epítopos 4, 5 y 6 son epítopos de unión diferentes de los anticuerpos de referencia ABTIM3 (conjunto 3) y mAb15 (conjunto 1) (Figura 1), dado que cada grupo de clasificación tiene patrones de competición únicos en comparación con los otros anticuerpos anti-TIM-3 en el panel.
Ejemplo 13: Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TIM-3 mediante mutagénesis de TIM-3
Los epítopos de anticuerpo pueden caracterizarse generalmente como epítopos lineales (también denominados epítopos continuos) o epítopos conformacionales (también denominados epítopos discontinuos). Si bien los epítopos lineales se definen en función de una única secuencia de aminoácidos continua, los epítopos conformaciones pueden consistir en muchas secuencias lineales discontinuas más pequeñas o residuos de contacto único. Una recopilación de residuos de contacto que se agrupan en la interfaz de la proteína intermolecular entre el anticuerpo y el antígeno también se denomina un punto de interés (Moreira et. ál., Proteins 68(4):803-12 (2007)). En la actualidad se reconoce ampliamente que la mayoría de los epítopos de linfocitos B son discontinuos en la naturaleza (Sivalingam y Shepherd, Mol Immunol. 51(3-4):304-9 (2012)), Kringelum et ál., Mol Immunol. 53(1-2):24-34 (2013)); el epítopo promedio se extiende de 15-22 residuos de aminoácidos de los cuales 2-5 aminoácidos contribuyen a la mayor parte de la unión (Sivalingam y Shepherd, supra).
Al clasificar la afinidad de unión en 129 mutantes de TIM-3 diferentes, este ejemplo ilustra cómo los epítopos de unión de Fab 15086, Fab 20293 y Fab 20131 pueden dividirse en epítopos lineales y puntos de interés que son diferentes de los epítopos reconocidos por los anticuerpos de referencia ABTIM3 y mAb15.
Materiales y métodos
El receptor de TIM-3 de humano consiste en un dominio extracelular (ECD) de 181 aminoácidos (residuos 22-202) seguido por un dominio de transmembrana (residuos 203-223) y un dominio citoplasmítico (residuos 224-301). TIM-3 pertenece a la superfamilia de la inmunoglobulina y el ECD está compuesto por dos dominios - un dominio de mucina y un dominio IgV. El dominio IgV contiene una fase de dos capas b elaborada a partir de las interacciones de 7 cadenas b antiparalelas dispuestas en dos láminas b con cadenas b GFCC’ en un lado y cadenas b BED en el lado opuesto. Las dos láminas b se estabilizan mediante un enlace disulfuro entre los residuos C54 - C123. Una estructura cristalina está disponible para IgV de TIM-3 de humano (PDB 5F71). El dominio IgV de TIM-3 no tiene una cadena A como otros dominios IgV, pero posee dos enlaces disulfuro adicionales (C58-C63 y C52-C110) que colocan los bucles CC’ y FG cerca, lo que forma una hendidura única para la unión al ligando de fosfatidilserina (PS). Existe una estructura cristalina de TIM-3 murina en complejo con el ligando PS (3KAA), lo que demuestra que la unión al ligando entra en contacto con los bucles CC’ y FG.
Se han identificado diversos ligandos y/o correceptores de TIM-3, incluso HMGB-1, galectina-9, CEACAM-1 y fosfatidilserina (Chiba et ál., Nat. Immunology 13(9):832-42 (2012), Li et ál., Hepatology56(4):1342-51 (2012), DeKruyff et ál., J Immunology 184(4):1918-30 (2010), Das et ál., Immunol Rev. 276(1):97-111 (2017)).
Las secuencias de proteína de TIM-3 de humano y ortólogos se descargaron de UniProt; humana (Q8TDQ0; SEQ ID NO: 236), de mono cynomolgus (Macaca fascicularis, G7P6Q7; SEQ ID NO: 237), ratón (Mus musculus, Q8VIM0; SEQ ID NO: 238) y rata (Rattus norvegicus, P0C0K5; SEQ ID NO: 239). Estas secuencias se muestran en la Tabla 23. La identidad de secuencia entre las diferentes secuencias de aminoácidos TIM-3 extracelulares se muestra en la Tabla 19 a continuación.
Tabla 19: Diferencias de aminoácidos e identidad de secuencia al dominio extracelular de TIM-3 de humano.
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A partir de las estructuras cristalinas y las secuencias de aminoácidos, se identificaron los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie y se diseñaron 82 sustituciones individuales de alanina en el ECD de TIM-3 de humano (barrido de alanina).
Para mapear los epítopos lineales en el contexto de la estructura de TIM-3 de humano original, se generaron 47 proteínas quiméricas, donde 10 aminoácidos en la secuencia de ECD de TIM-3 de humano se intercambiaron de forma secuencial a la secuencia de ratón en segmentos que se superponían en 5 aminoácidos, y se complementó con versiones de rata y cynomolgus en bucles críticos. Los intercambios de secuencia se llevaron a cabo en el dominio extracelular de los aminoácidos 22-199 de barrido de TIM-3 de humano.
La codificación de ADNc para el dominio extracelular de TIM-3 de humano se sintetizó y clonó en un vector que contenía el promotor CMV y la secuencia Fc de IgG1 humana (AA P101-K330), lo que resultó en la fusión de extremo C de IgG1 Fc al ECD de TIM-3 clonado. Las construcciones de fusión de TIM-3 de humano Fc mutadas se generaron mediante PCR estándar y técnicas de modificación genética y la proteína se expresó de forma transiente en un cultivo de 2 ml mediante el uso de un sistema de expresión ExpiCHO™. Las construcciones de fusión Fc de TIM-3 de humano se cosecharon, purificaron y evaluaron respecto a su afinidad de unión a los fragmentos Fab anti-TIM-3 mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR). Las proteínas de fusión TIM-3 se inmovilizaron en un G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Países Bajos) durante 15 minutos mediante el uso de un Continuous Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, EE. UU.). Después de la colocación, el SensEye® se colocó en un biosensor IBIS MX96 y las proteínas capturadas se fijaron a la superficie mediante el uso del kit FixIT (Ssens BV, Países Bajos). El análisis cinético se llevó a cabo al aplicar una serie de titulación denominada cinética (Karlsson R. 2006), donde los fragmentos Fab monoméricos de los anticuerpos de la invención se inyectaron en concentraciones en aumento de 1 nM a 100 nM sin aplicar etapas de regeneración de superficie después de cada inyección de Fab. La asociación a Fab se llevó a cabo durante 15 minutos y la disociación al antígeno se llevó a cabo durante 15 minutos. Las respuestas de unión registradas se ajustaron a un modelo de unión Langmuir 1:1 simple con software Scrubber 2 para el cálculo de las constantes de asociación (kon o ka), disociación (koff o kd) y afinidad (KD).
Resultados
La afinidad de unión de Fabs 15086, 20293, 20131 anti-TIM-3 y los análogos de referencia ABTIM3 y mAb15 se evaluó con respecto a la unión alterada a las construcciones mutantes de TIM-3.
Las afinidades de unión de los fragmentos Fab para las construcciones de TIM-3 mutadas se expresaron como la relación en la KD mutante / KD de tipo salvaje (afinidad de unión normalizada). Las Tablas 20 y 21 muestran las proteínas quiméricas y los mutantes de alanina que proporcionaron resultados diferenciados. Se utilizó una reducción de afinidad de al menos 5 veces como criterios de valor límite para detectar la afinidad de unión reducida a construcciones de TIM-3 mutadas. En algunos casos, no se pudo detectar unión a Fabs específicos. Estas construcciones se enumeran como NB (sin unión).
El análisis mostró que los epítopos de unión de Fabs 15086, 20293 y 20131 anti-TIM-3 fueron claramente diferentes en comparación con los anticuerpos de referencia ABTIM3 y mAb15. 15086 y 20293 no unieron la proteína quimérica con la secuencia de ratón insertada en las posiciones 62-67, cerca de los bucles de unión al ligando CC’ y FG, mientras que ABTIM3 de referencia sí unió (Tabla 20). El epítopo de 15086 en TIM-3 se extendió más allá de este tramo de aminoácido que incluye P50, V60, F61, E62, G64, r 69 y los residuos de bucle FG I117, M118, D120 tal como se comprueba a partir del barrido de alanina (Tabla 21). Fab 20293 tenía un epítopo muy similar a 15086, excepto que los residuos M118 y D120 únicamente afectaban la unión a 15086 cuando se mutaban a alanina. Se descubrió que Fab 20131 se unía a diferentes epítopos presentes en el bucle FG en los residuos 114-117, y esto fue extendido por el barrido de alanina para incluir los residuos 118, 120 y también los residuos CC’ F61 y E62. La sensibilidad para una mutación de alanina fue común a 15086, 20293 y 20131 en la posición F61, en la cual ninguno de los dos anticuerpos de referencia mostraron sensibilidad. Si bien el anticuerpo de referencia mAb15 no unió la secuencia mutada en las posiciones 62-67, análogo a 15086 y 20293, el epítopo de mAb15 fue claramente distinto dado que este anticuerpo no se unió a dos construcciones adicionales en donde la secuencia de la posición 74-85 se intercambió a ratón. El anticuerpo ABTIM3 mostró claramente un epítopo diferente definido por las construcciones lineales mutadas en las posiciones 22-28, 107-144 y 123-128, tal como se comprueba por la afinidad de unión cambiada a estas proteínas (Tabla 20). Un resumen de los descubrimientos del mapeo de epítopo se muestra en la Tabla 22 a continuación y un modelo molecular de cómo los epítopos se mapean en la superficie del dominio IgV de TIM-3 se presenta en la Figura 9.
En resumen, se demostró, en un nivel molecular mediante el análisis de la unión a un panel de 129 mutantes de TIM-3, que los tres Fabs 15086, 20293 y 20131 reconocen epítopos únicos pero parcialmente superpuestos en la parte superior del dominio IgV de TIM-3. Este descubrimiento coincide con el análisis de la clasificación de epítopos (Ejemplo 12) que muestra que los tres anticuerpos se unen a epítopos superpuestos que compiten de forma cruzada que juntos constituyen una superficie funcional en el dominio IgV de TIM-3. Estos epítopos claramente se superponen con el sitio de unión de fosfatidilserina, así como el aminoácido E62 que es esencial para la unión de HMGB-1 y CEACAM1 (Chiba et ál., Nat. Immunology 13(9):832-42 (2012), Das et ál., Immunol Rev. 276(1):97-111 (2017)), mientras que los dos anticuerpos de referencia tienen epítopos situados más sobre la parte media del dominio IgV (mAb15) y en el otro lado del dominio IgV (ABTIM3). Los resultados son coherentes con los datos de la clasificación de epítopos, lo que muestra que mAb15 y ABTIM3 pueden unirse simultáneamente a TIM-3 (Ejemplo 12). En función de la ubicación del epítopo de 15086, 20293 y 20131, se predice que cada anticuerpo es capaz de bloquear la unión de los ligandos de TIM3 (fosfatidilserina, CEACAM-1 y Hm GB-1.
Figure imgf000060_0001
Tabla 21: Resumen de análisis de afinidad de unión para los anticuerpos Fab que se unen a mutantes de ECD de TIM-3 de humano de barrido de alanina. Unión normalizada expresada como KD mutante / KD de tipo
Figure imgf000061_0001
> cambio KD de 5 veces
Mutantes de alanina______
Sin unión de mutantes de
a alanina__________________
T l 22 R m n l í ni n i nifi r l ni r ni-TIM- n liz
Figure imgf000061_0003
T l 2 n i r ín TIM-
Figure imgf000061_0002
Figure imgf000062_0001
Tabla 24: Secuencias de anticuer o anti-TIM-3
Figure imgf000062_0002
Tabla 25: Secuencias de TIM-3 re ión constante
Figure imgf000062_0003

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, en donde dicho anticuerpo comprende las secuencia de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de las SEQ ID NO: 7-12, respectivamente, y en donde dicho anticuerpo o porción de unión al antígeno de este aumenta la secreción de IFN-y y de TNF-a en un ensayo unilateral mixto de reacción de linfocito.
2. El anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una HC y una LC cuyos dominios variables tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 15 y 4, respectivamente.
3. El anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de la reivindicación 2, en donde dicha HC y dicha LC comprenden adicionalmente las secuencias de:
i) las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente; o
ii) las SEQ ID n O: 25 y 6, respectivamente.
4. El anticuerpo anti-TIM-3 de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 15 y 25 y una LC
que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 y 6.
5. El anticuerpo anti-TIM-3 de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende al menos una mutación en la región Fc, en donde la mutación está opcionalmente en una o más de las posiciones de aminoácidos de cadena pesada 228, 233, 234 y 235, que se numeran de acuerdo con el esquema de numeración IMGT, y en donde uno o los dos residuos de aminoácidos en las posiciones 234 y 235 están opcionalmente mutados a Ala y/o en donde el residuo de aminoácido en la posición 228 esta opcionalmente mutado a Pro.
6. El anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el anticuerpo o porción tiene al menos una de las siguientes propiedades:
a) se une a TIM-3 de humano con un Kd de 23 nM o menos según se mide mediante resonancia de plasmones de superficie;
b) se une a TIM-3 de cynomolgus con un Kd de 22 nM o menos según se mide mediante resonancia de plasmones de superficie;
c) se une a TIM-3 de humano con un EC50 de 1,2 nM o menos según se mide mediante ELISA;
d) se une a TIM-3 de cynomolgus con un EC50 de 46 nM o menos según se mide mediante ELISA;
e) aumenta la secreción de IFN-y en un ensayo bilateral mixto de reacción de linfocito;
f) aumenta la secreción de TNF-a de células dendríticas; y
g) inhibe la interacción de TIM-3 con fosfatidilserina.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de esta y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión al antígeno de esta del anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7, en donde dicho vector comprende además una secuencia de control de expresión.
9. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de esta y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión al antígeno de esta del anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6.
10. Un método para producir un anticuerpo anti-TIM-3 o una porción de unión al antígeno de este, que comprende proporcionar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9, cultivar dicha célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o porción y aislar el anticuerpo o porción resultantes.
11. Una molécula de unión biespecífica que tiene una porción de unión al antígeno de un anticuerpo anti-TIM-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 y una porción de unión al antígeno de otro anticuerpo diferente.
12. Un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, o una molécula de unión biespecífica de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en la mejora de la inmunidad en un paciente que lo necesita.
13. Un anticuerpo anti-TIM-3 o porción de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, o una molécula de unión biespecífica de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita.
14. El anticuerpo, la porción de unión al antígeno o la molécula de unión biespecífica para el uso de la reivindicación 13, en donde el paciente tiene un cáncer que se origina en la piel, los pulmones, los intestinos, los ovarios, el cerebro, la próstata, los riñones, los tejidos blandos, el sistema hematopoyético, la cabeza y el cuello, el hígado, la vejiga, las mamas, el estómago, el útero o el páncreas.
15. El anticuerpo, la porción de unión al antígeno o la molécula de unión biespecífica para el uso de la reivindicación 13, en donde el paciente tiene leucemia, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, un tumor sólido, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal o carcinoma de células renales.
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