RS62736B1 - Anti-tim-3 antitela i kompozicije - Google Patents

Anti-tim-3 antitela i kompozicije

Info

Publication number
RS62736B1
RS62736B1 RS20211517A RSP20211517A RS62736B1 RS 62736 B1 RS62736 B1 RS 62736B1 RS 20211517 A RS20211517 A RS 20211517A RS P20211517 A RSP20211517 A RS P20211517A RS 62736 B1 RS62736 B1 RS 62736B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
tim
acid sequences
Prior art date
Application number
RS20211517A
Other languages
English (en)
Inventor
Trine Lindsted
Torben Gjetting
Gunther Roland Galler
Monika Gad
Michael Monrad Grandal
Klaus Koefoed
Michael Kragh
Ivan David Horak
Thomas Bouquin
Mikkel Wandahl Pedersen
Original Assignee
Symphogen As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Symphogen As filed Critical Symphogen As
Publication of RS62736B1 publication Critical patent/RS62736B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
[0001] TIM-3 (T-ćelijski imunoglobulin sa domenom mucina 3), poznat i kao HAVCR2 (ćelijski receptor 2 virusa hepatitisa A) ili CD366, član je familije proteina T-ćelijskih imunoglobulina sa domenom mucina. Kod ljudi, TIM-3 je kodiran genom Havcr2 i predstavlja glikoprotein tipa I od 33 kDa sa membranskim distalnim domenom IgV i membranskim proksimalnim domenom mucina. On sadrži očuvani region pet ostataka Tyr u intracelularnom domenu, koji su fosforilovani nakon vezivanja liganda. TIM-3 je eksprimiran od strane niza različitih ćelija koje potiču od stečene i urođene komponente imunskog sistema, uključujući T-ćelije, dendritske ćelije, makrofage i ćelije prirodne ubice (NK). Ekspresija TIM-3 je mala na naivnim T-ćelijama, ali se veoma povećava nakon aktiviranja T-ćelija. Nasuprot T-ćelijama, urođene ćelije kao što su dendritske ćelije, NK ćelije i monociti imaju veliku bazalnu ekspresiju TIM-3. TIM-3 je povezan sa nekoliko uglavnom promiskuitetnih liganada, uključujući galektin-9, fosfatidil serin, CEACAM-1 i HMGB-1, ali tačne uloge ovih liganada trenutno nisu poznate.
[0002] Mada je predloženo da je TIM-3 inhibitor imunske kontrolne tačke, postoji relativno malo dokaza da TIM-3 direktno posreduje u supresiji aktivacije T ćelija ili sekreciji citokina, npr., na način sličan kao PD-1. Nadalje, i nasuprot PD-1, izgleda da TIM-3 ima ulogu u regulaciji ćelija urođenog sistema, konkretno dendritskih ćelija. PCT patentna publikacija WO 2013/006490, i Kikushige i Miyamoto (Int J Hematol. 98:627-33 (2013)) upućuju na mišja anti-TIM-3 antitela i razmatraju njihovu primenu za detekciju i/ili lečenje raka. Većina funkcionalnih podataka vezanih za TIM-3 i njegovu ulogu u imunologiji tumora potiče iz in vivo studija u kojima se koriste različita antitela. U većini tih studija, usled loše validacije antitela, nije jasno da li su efekti TIM-3 antitela posredovani inhibicijom vezivanja liganda ili agonističkim efektom na cilj.
[0003] U pogledu svojstva regulisanja imunskog odgovora, TIM-3 je ispitivan kao potencijalni cilj imunoterapije, uključujući lečenje raka i autoimunih bolesti. Jedno anti-TIM-3 antitelo je trenutno u fazi kliničkog razvoja, ali trenutno nema odobrenih anti-TIM-3 antitela.
[0004] U pogledu ključne uloge TIM-3 kao imunomodulatora, postoji potreba za novim i poboljšanim imunskim terapijama koje ciljaju na TIM-3, za lečenje raka i nekih poremećaja imunskog sistema.
REZIME PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak je usmeren na nova rekombinantna antitela, kako je definisano u zahtevima, koja ciljaju na TIM-3, kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže jedno ili više od ovih antitela, npr., anti-TIM-3 antitelo koje putem aktivnosti na TIM-3 aktivira različite imunske ćelije, kao što su profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (npr., dendritske ćelije i makrofagi) i T ćelije (npr., pomoćne T ćelije i citotoksične T ćelije). Predmetni pronalazak je takođe usmeren na upotrebu antitela i farmaceutskih kompozicija za povećanje imuniteta pacijenta, i za lečenje malignih tumora koji potiču od tkiva kao što je koža, pluća, creva, jajnik, mozak, prostata, bubreg, meka tkiva, hematopoetski sistem, glava i vrat, jetra, bešika, dojka, želudac, materica i pankreas. U poređenju sa trenutno dostupnim lečenjem za takve maligne tumore, uključujući lečenje antitelima, razmatra se da antitela iz pronalaska mogu da obezbede bolji klinički odgovor, bilo sama ili u kombinaciji sa drugim terapijama za rak, kao što je antitelo koje cilja na drugi protein imunske kontrolne tačke.
[0006] Antitela iz predmetnog pronalaska obuhvataju H-CDR1-3 i L-CDR1-3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7–12, redom. U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time što anti-TIM-3 antitelo je antitelo koje se ovde pominje kao antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086 ili 17144.
[0007] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time što anti-TIM-3 antitelo je antitelo koje se ovde pominje kao antitelo 20131, 20293, 15105, 15107, 15109, 15174, 15175, 15260, 15284, 15299, 15353, 15354, 17244, 17245, 19324, 19416, 19568, 20185, 20300, 20362, ili 20621 ili varijanta bilo koga od njih, gde varijanta može, npr., da sadrži neke minimalne izmene aminokiselina u odnosu na pomenuto antitelo (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 izmena aminokiselina, koje mogu biti, npr., u regionima okvira) a da se ne izgubi antigen-vezujuća specifičnost antitela.
[0008] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje se takmiči u vezivanju za humani TIM-3 sa bilo kojim od sledećih antitela odnosno koje se vezuje za isti epitop humanog TIM-3 kao bilo koje od sledećih antitela: 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, 20131, 20293, 15105, 15107, 15109, 15174, 15175, 15260, 15284, 15299, 15353, 15354, 17244, 17245, 19324, 19416, 19568, 20185, 20300, 20362, i 20621.
[0009] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži H-CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu H-CDR3 SEQ ID NO: 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162,172, 182, 192, 202, 212, 222, ili 232.
[0010] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži H-CDR1-3 koji sadrži sekvence H-CDR1-3, redom, SEQ ID NOs: 30-32, 40-42, 50-52, 60-62, 70-72, 80-82, 90-92, 100-102, 110-112, 120-122, 130-132, 140-142, 150-152, 160-162, 170-172, 180-182, 190-192, 200-202, 210-212, 220-222, ili 230-232.
[0011] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je najmanje 90% (npr., najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa SEQ ID NO: 3, 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228.
[0012] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima VH koji sadrži SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218 ili 228.
[0013] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima teški lanac (HC) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH SEQ ID NO:28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca (CH) SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 23, 24 ili 25.
[0014] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži L-CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu L-CDR3 SEQ ID NO: 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155165,175, 185, 195, 205, 215, 225,
[0015] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži L-CDR1-3 koji sadrži sekvence L-CDR1-3, redom, SEQ ID NOs: 33-35, 43-45, 53-55, 63-65, 73-75, 83-85, 93-95, 103-105, 113-115, 123-125, 133-135, 143-145, 153-155, 163-165, 173-175, 183-185, 193-195, 203-205, 213-215, 223-225, ili 233-235.
[0016] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90% (npr., najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom VL SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229.
[0017] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VL SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229.
[0018] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima laki lanac (LC) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VL SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 6.
[0019] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži bilo koju od gornjih sekvenci teškog lanca i bilo koju od gornjih sekvenci lakog lanca.
[0020] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži H-CDR3 i L-CDR3 koji sadrži aminokiselinske sekvence H-CDR3, odnosno L-CDR3, SEQ ID NOs: 32 i 35, 42 i 45, 52 i 55, 62 i 65, 72 i 75, 82 i 85, 92 i 95, 102 i 105, 112 i 115, 122 i 125, 132 i 135, 142 i 145, 152 i 155, 162 i 165, 172 i 175, 182 i 185, 192 i 195, 202 i 205, 212 i 215, 222 i 225, i 232 i 235.
[0021] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži H-CDR1-3 i L-CDR1-3 koji sadrži sekvence H-CDR1-3, odnosno L-CDR1-3, SEQ ID NOs: 30-35, 40-45, 50-55, 60-65, 70-75, 80-85, 90-95, 100-105, 110-115, 120-125, 130-135, 140-145, 150-155, 160-165, 170-175, 180-185, 190-195, 200-205, 210-215, 220-225, ili 230-235.
[0022] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima VH koji je najmanje 90% (npr., najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3, 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228, i VL koji je najmanje 90% (npr., najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229.
[0023] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228, i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229.
[0024] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima LC koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; i HC koji sadrži (i) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; ili (ii) aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23, 24 ili 25.
[0025] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo koji sadrži aminokiselinske sekvence H-CDR1-3 i L-CDR1-3:
a) SEQ ID NO: 30–35, redom;
b) SEQ ID NO: 40–45, redom;
c) SEQ ID NO: 50–55, redom;
d) SEQ ID NO: 60–65, redom; e) SEQ ID NO: 70–75, redom;
f) SEQ ID NO: 80–85, redom; g) SEQ ID NO: 90–95, redom; h) SEQ ID NO: 100–105, redom; i) SEQ ID NO: 110–115, redom; j) SEQ ID NO: 120–125, redom; k) SEQ ID NO: 130–135, redom; l) SEQ ID NO: 140–145, redom; m) SEQ ID NO: 150–155, redom; n) SEQ ID NO: 160–165, redom; o) SEQ ID NO: 170–175, redom; p) SEQ ID NO: 180–185, redom; q) SEQ ID NO: 190–195, redom; r) SEQ ID NO: 200–205, redom; s) SEQ ID NO: 210–215, redom; t) SEQ ID NO: 220–225, redom; ili u) SEQ ID NO: 230–235, redom.
[0026] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo koji se takmiče u vezivanju za humani TIM-3 sa antitelom čiji varijabilni domeni teškog i lakog lanca sadrže sledeće aminokiselinske sekvence, odnosno koji se vezuju za isti epitop humanog TIM-3 kao antitelo čiji varijabilni domeni teškog i lakog lanca sadrže sledeće aminokiselinske sekvence:
a) SEQ ID NO: 3 i 4, redom;
b) SEQ ID NO: 15 i 4, redom;
c) SEQ ID NO: 28 i 29, redom;
d) SEQ ID NO: 38 i 39, redom;
e) SEQ ID NO: 48 i 49, redom;
f) SEQ ID NO: 58 i 59, redom;
g) SEQ ID NO: 68 i 69, redom;
h) SEQ ID NO: 78 i 79, redom;
i) SEQ ID NO: 88 i 89, redom;
j) SEQ ID NO: 98 i 99, redom;
k) SEQ ID NO: 108 i 109, redom;
l) SEQ ID NO: 118 i 119, redom;
m) SEQ ID NO: 128 i 129, redom;
n) SEQ ID NO: 138 i 139, redom;
o) SEQ ID NO: 148 i 149, redom;
p) SEQ ID NO: 158 i 159, redom;
q) SEQ ID NO: 168 i 169, redom;
r) SEQ ID NO: 178 i 179, redom;
s) SEQ ID NO: 188 i 189, redom;
t) SEQ ID NO: 198 i 199, redom;
u) SEQ ID NO: 208 i 209, redom;
v) SEQ ID NO: 218 i 219, redom; ili
w) SEQ ID NO: 228 i 229, redom.
[0027] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo koji sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama koje su najmanje 90% identične aminokiselinskoj sekvenci:
a) SEQ ID NO: 3 i 4, redom;
b) SEQ ID NO: 15 i 4, redom;
c) SEQ ID NO: 28 i 29, redom;
d) SEQ ID NO: 38 i 39, redom;
e) SEQ ID NO: 48 i 49, redom;
f) SEQ ID NO: 58 i 59, redom;
g) SEQ ID NO: 68 i 69, redom; h) SEQ ID NO: 78 i 79, redom;
i) SEQ ID NO: 88 i 89, redom;
j) SEQ ID NO: 98 i 99, redom;
k) SEQ ID NO: 108 i 109, redom; l) SEQ ID NO: 118 i 119, redom; m) SEQ ID NO: 128 i 129, redom; n) SEQ ID NO: 138 i 139, redom; o) SEQ ID NO: 148 i 149, redom; p) SEQ ID NO: 158 i 159, redom; q) SEQ ID NO: 168 i 169, redom; r) SEQ ID NO: 178 i 179, redom; s) SEQ ID NO: 188 i 189, redom; t) SEQ ID NO: 198 i 199, redom; u) SEQ ID NO: 208 i 209, redom; v) SEQ ID NO: 218 i 219, redom; ili w) SEQ ID NO: 228 i 229, redom.
1
[0028] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo koji sadrži teški lanac i laki lanac čiji varijabilni domeni imaju aminokiselinske sekvence:
a) SEQ ID NO: 3 i 4, redom;
b) SEQ ID NO: 28 i 29, redom;
c) SEQ ID NO: 38 i 39, redom;
d) e)- SEQ ID NO: 48 i 49, redom;
e) SEQ ID NO: 58 i 59, redom;
f) SEQ ID NO: 68 i 69, redom;
g) SEQ ID NO: 78 i 79, redom;
h) SEQ ID NO: 88 i 89, redom;
i) SEQ ID NO: 98 i 99, redom;
j) SEQ ID NO: 108 i 109, redom;
k) SEQ ID NO: 118 i 119, redom;
l) SEQ ID NO: 128 i 129, redom;
m) SEQ ID NO: 138 i 139, redom;
n) SEQ ID NO: 148 i 149, redom;
o) SEQ ID NO: 158 i 159, redom;
p) SEQ ID NO: 168 i 169, redom;
q) SEQ ID NO: 178 i 179, redom;
r) SEQ ID NO: 188 i 189, redom;
s) SEQ ID NO: 198 i 199, redom;
t) SEQ ID NO: 208 i 209, redom;
u) SEQ ID NO: 218 i 219, redom; ili
v) SEQ ID NO: 228 i 229, redom.
[0029] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži:
a) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 i 6;
b) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 38 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 i 6;
c) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 48 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 49 i 6;
d) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 59 i 6;
e) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i 6;
f) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79 i 6;
g) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89 i 6;
h) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99 i 6;
i) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 108 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 109 i 6;
j) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 119 i 6;
k) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129 i 6;
l) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 138 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i 6;
m) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 148 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i 6;
n) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 159 i 6;
o) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 168 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 169 i 6;
p) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 178 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 179 i 6;
q) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 188 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 189 i 6;
1
r) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 198 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 199 i 6;
s) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 208 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 209 i 6;
t) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 218 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 219 i 6; ili
u) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 228 i 5 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 229 i
[0030] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži:
a) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 i 6;
b) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 38 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 i 6;
c) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 48 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 49 i 6;
d) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 59 i 6;
e) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i 6;
f) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79 i 6;
g) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89 i 6;
h) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99 i 6;
i) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 108 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 109 i 6;
j) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 119 i 6;
k) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129 i 6;
l) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 138 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i 6;
m) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 148 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i 6;
n) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 159 i 6;
o) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 168 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 169 i 6;
p) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 178 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 179 i 6;
q) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 188 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 189 i 6;
r) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 198 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 199 i 6;
1
s) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 208 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 209 i 6;
t) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 218 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 219 i 6; ili
u) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 228 i 23 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 229 i 6.
[0031] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži:
a) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 i 6;
b) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 38 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 i 6;
c) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 48 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 49 i 6;
d) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 59 i 6;
e) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i 6;
f) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79 i 6;
g) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89 i 6;
h) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99 i 6;
1
i) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 108 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 109 i 6;
j) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 119 i 6;
k) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129 i 6;
l) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 138 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i 6;
m) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 148 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i 6;
n) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 159 i 6;
o) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 168 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 169 i 6;
p) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 178 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 179 i 6;
q) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 188 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 189 i 6;
r) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 198 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 199 i 6;
s) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 208 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 209 i 6;
1
t) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 218 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 219 i 6; ili
u) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 228 i 24 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 229 i 6.
[0032] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje sadrži:
a) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 i 6;
b) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 38 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 i 6;
c) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 48 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 49 i 6;
d) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 59 i 6;
e) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i 6;
f) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79 i 6;
g) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89 i 6;
h) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99 i 6;
i) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 108 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 109 i 6;
1
j) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 119 i 6;
k) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129 i 6;
l) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 138 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i 6;
m) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 148 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i 6;
n) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 159 i 6;
o) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 168 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 169 i 6;
p) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 178 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 179 i 6;
q) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 188 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 189 i 6;
r) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 198 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 199 i 6;
s) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 208 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 209 i 6;
t) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 218 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 219 i 6; ili
1
u) HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 228 i 25 i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 229 i 6.
[0033] Pronalazak obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži H-CDR1-3 i L-CDR1-3 koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7–12, redom.
[0034] U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4.
[0035] U posebnim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i 25 i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6.
[0036] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za epitop TIM-3 koji sadrži aminokiselinske ostatke F61 i 1117 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, 20293 ili 20131). Epitop može dalje da sadrži aminokiselinski ostatak R69 (npr., antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 ili 20293). Epitop može dalje da sadrži P50, E62, M118 i D120 (npr., antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144 ili 20131) i može dalje da sadrži aminokiselinske ostatke R69, V60 i G64 (npr., antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 ili 15086.17144).
[0037] Antitelo ili njegov deo može da se veže za epitop TIM-3 koji sadrži aminokiselinske ostatke P50, V60, F61, E62, G64, R69, I117, M118 i D120 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 ili 15086.17144), aminokiselinske ostatke F61, R69 i 1117 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 20293), ili aminokiselinske ostatke P50, F61, E62, 1117, M118 i D120 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 20131).
[0038] Pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za epitop TIM-3 koji sadrži aminokiselinske ostatke 62–67 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, ili 20293). Ovde je
2
opisano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za epitop TIM-3 koji sadrži aminokiselinske ostatke 114–117 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 20131).
[0039] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo je antitelo IgG, npr. antitelo humanog IgG. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jednu mutaciju u FCregionu. U posebnim otelotvorenjima, antitelo sadrži mutaciju na jednoj ili više pozicija 228, 233, 234 i 235 aminokiselina teškog lanca, koje su numerisane prema IMGT šemi za numeraciju. Na primer, jedan ili oba aminokiselinska ostatka na pozicijama 234 i 235 mogu biti mutirani u Ala, i/ili aminokiselinski ostatak na poziciji 228 može biti mutiran u Pro.
[0040] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima najmanje jedno od sledećih svojstava:
a) vezuje se za humani TIM-3 sa KDod 23 nM ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom;
b) vezuje se za TIM-3 cinomolgusa sa KDod 22 nM ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom;
c) vezuje se za humani TIM-3 sa EC50 od 1,2 nM ili manje, mereno ELISA testom;
d) vezuje se za TIM-3 cinomolgusa sa EC50 od 46 nM ili manje, mereno ELISA testom;
e) povećava sekreciju IFN-γ na testu jednosmerne mešane limfocitne reakcije;
f) povećava sekreciju IFN-γ na testu dvosmerne mešane limfocitne reakcije;
g) povećava sekreciju TNF-α na testu jednosmerne mešane limfocitne reakcije;
h) povećava sekreciju TNF-α iz dendritskih ćelija; i
i) inhibira interakciju TIM-3 sa fosfatidil serinom.
Primeri za takva antitela uključuju, bez ograničenja, antitelo 15086.15086 (koje ima barem svojstva a, c, d, e, g i h); antitelo 15086.17145 (koje ima barem svojstva a, c, d, e, g, h i i), i antitelo 15086.16837 ili 15086.17144 (koje ima barem svojstva a, c i d). U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima sva pomenuta svojstva. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima barem svojstva a, c, d, e, g i h. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima barem svojstva a, c, d, e, g, h i i. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima barem svojstva a, c i d. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigenvezujući deo iz pronalaska ima barem svojstva a, b, c, d, e, f i h. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima barem svojstva c, e, f i h. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz pronalaska ima barem svojstva c, d, e, f i h.
[0041] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo iz pronalaska povećava aktivnost NK ćelija. U nekim otelotvorenjima, ova aktivnost može da posreduje ADCC.
[0042] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo iz pronalaska se ne takmiči u vezivanju za TIM-3 sa ABTIM3 (iz PCT publikacije WO 2015/117002) i/ili mAb15 (iz PCT publikacije WO 2016/111947). U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo iz pronalaska se ne vezuje za isti epitop kao ABTIM3 i/ili mAB15; na primer, antitelo ili deo iz pronalaska se vezuje za jedan ili više ostataka na TIM-3 koji nisu vezani od strane ABTIM3 i/ili mAb15.
[0043] U drugim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže najmanje jedno anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo kako je definisano u zahtevima, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, opciono sa dodatnim terapeutikom, kao što je hemioterapeutski agens, antineoplastični agens, antiangiogeni agens, inhibitor tirozin kinaze ili inhibitor TIM-3 puta.
[0044] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje molekule izolovane nukleinske kiseline koji sadrže sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac ili njegov antigen vezujući deo, sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac ili njegov antigen vezujući deo, ili oba, anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela kako je definisano u zahtevima.
[0045] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektore koji sadrže takav molekul izolovane nukleinske kiseline, naznačeno time što pomenuti vektor dalje sadrži sekvencu za kontrolu ekspresije.
[0046] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćelije domaćine koje sadrže sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac ili njegov antigen vezujući deo, i sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac ili njegov antigen vezujući deo, anti-TIM-3 antitela kako je definisano u zahtevima.
[0047] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela kako je definisano u zahtevima, koji uključuje obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac ili njegov antigen vezujući deo, i sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac ili njegov antigen vezujući deo, anti-TIM-3 antitela ili antigen vezujućeg dela kako je definisano u zahtevima, uzgajanje pomenute ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela ili dela, i izolovanje dobijenog antitela ili dela.
[0048] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bispecifični vezujući molekul koji ima antigen vezujući deo anti-TIM-3 antitela kako je definisano u zahtevima, i antigen vezujući deo drugog, različitog antitela, kao što je drugo anti-TIM-3 antitelo (npr., ovde opisano drugo anti-TIM-3 antitelo) ili antitelo koje cilja različiti protein, kao što je drugi protein imunske kontrolne tačke, antigen karcinoma, ili drugi molekul ćelijske površine čija aktivnost posreduje stanje bolesti kao što je rak.
[0049] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen vezujući deo ili bispecifični vezujući molekul kao što je definisan u zahtevima, za upotrebu u povećanju imuniteta kod pacijenta kome je to potrebno.
[0050] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen vezujući deo ili bispecifični vezujući molekul kao što je definisan u zahtevima, za upotrebu u lečenju raka kod pacijenta kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, rak nastaje u tkivu
2
odabranom iz grupe koja se sastoji od kože, pluća, creva, jajnika, mozga, prostate, bubrega, mekih tkiva, hematopoetskog sistema, glave i vrata, jetre, bešike, dojke, želuca, materice i pankreasa. U nekim otelotvorenjima, pacijent ima leukemiju (npr., akutnu mijeloidnu leukemiju), Hodžkinov limfom ili non-Hodžkinov limfom. U nekim otelotvorenjima, pacijent ima solidni tumor (npr., uznapredovali ili metatstatski solidni tumor). U nekim otelotvorenjima, pacijent ima melanom, nemikrocelularni karcinom pluća, kolorektalni karcinom ili karcinom bubrežnih ćelija. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu hemioterapeutskog agensa, antineoplastičnog agensa, antiangiogenog agensa, inhibitora tirozin kinaze i/ili inhibitora TIM-3 puta.
[0051] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje anti-TIM-3 antitela ili antigen vezujuće delove ili bispecifične vezujuće molekule kao što je ovde opisano, za upotrebu u prethodno opisanim lečenjima, tj., lečenje humanog pacijenta kome je to potrebno za pojačavanje njegovog imunskog sistema, i lečenje humanog pacijenta koji ima maligni tumor, kao što je jedan od gorepomenutih malignih tumora. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje proizvod koji sadrži anti-TIM-3 antitela ili antigen vezujuće delove ili multispecifične (npr., bispecifične) vezujuće molekule kao što je ovde opisano, kao i postupke za proizvodnju pomenutih proizvoda.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0052]
Slika 1 prikazuje krive zavisnosti doze i odgovora antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144 za proizvodnju IFN-γ u testu jednosmerne mešane limfocitne reakcije (MLR).
Slika 2 prikazuje krive zavisnosti doze i odgovora antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144 za proizvodnju TNF-α u testu jednosmerne MLR.
Slika 3 prikazuje efekat prečišćenih dendritskih ćelija podskupova antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144, izmeren preko nivoa TNF-α koristeći test citokina na mezo skali postupkom elektrohemiluminescencije.
Slika 4 prikazuje vezivanje TIM-3-Fc za ćelije pozitivne na fosfatidil serin (PtdS) (apoptotske) u prisustvu anti-TIM-3 antitela iz pronalaska, kao i anti-TIM-3 antitelo za pozitivnu kontrolu, i dve negativne kontrole. A: Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska [15086.17145]; B: negativna kontrola neblokirajuće anti-TIM-3 antitelo [15338.15338]; C: referentno anti-TIM-3 antitelo [18571.18571]; D: negativna kontrola anti-PD-1 antitelo Keytruda® (pembrolizumab).
Slika 5 prikazuje krive zavisnosti doze i odgovora devet anti-TIM-3 antitela za proizvodnju IFN-γ u testu jednosmerne MLR.
Slika 6 prikazuje krive zavisnosti doze i odgovora deset anti-TIM-3 antitela za proizvodnju IFN-γ u testu dvosmerne MLR. Antitelo 15086.17145 je prikazano kao „15086“.
Slika 7 prikazuje krive zavisnosti doze i odgovora devet anti-TIM-3 antitela za proizvodnju TNF-α u dendritskim ćelijama dobijenim od monocita dva nezavisna donora.
Slika 8 prikazuje pregled grupa epitopa (binovi epitopa) identifikovanih analizom kompetitivnog vezivanja panela od osamnaest anti-TIM-3 antitela. Zaokružena antitela povezana crnim linijama označavaju unakrsnu blokirajuću aktivnost u oba smera. Antitela označena kvadratima označavaju jednosmerno blokiranje kada se antitelo ispituje samo u rastvoru. Isprekidane linije označavaju jednosmerno blokiranje kada su antitela samo imobilisana. Antitela su grupisana prema obrascima kompeticije sa drugim anti-TIM-3 antitelima. Antitelo 15086.17145 je prikazano kao „15086“.
Slika 9 prikazuje lokacije epitopa antitela na strukturi IgV domena humanog TIM-3 (PDB 5F71). Skica IgV domena humanog TIM-3 je prikazana u tri različite orijentacije, i naznačena je lokacija mesta vezivanja fosfatidil serina. Lokacije mapiranih epitopa su prikazane tamnim bojama na prostornom modelu TIM-3 za svako antitelo. Fab fragment 15086 je prikazan kao „15086“, a Fab fragment 20293 je prikazan kao „20293“.
2
DETALJAN OPIS CRTEŽA
[0053] Predmetni pronalazak obezbeđuje nova antihumana TIM-3 antitela koja se mogu koristiti za pojačavanje imunskog sistema kod humanog pacijenta, kao što je pacijent sa rakom. Ako nije naglašeno drugačije, „TIM-3“ kao što se ovde koristi, odnosi se na humani TIM-3. Sekvenca polipeptida humanog TIM-3 dostupna je pod pristupnim brojem Uniprot Q8TDQ0 (HAVR2_HUMAN), ovde prikazana kao SEQ ID NO: 236.
[0054] Termin „antitelo“ (Ab) ili „imunoglobulin“ (Ig), kao što se ovde koristi, odnosi se na tetramer koji sadrži dva teška (H) lanca (oko 50–70 kDa) i dva laka (L) lanca (oko 25 kDa) međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog domena lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). VH i VL domeni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane „regioni za određivanje komplementarnosti“ (CDR), koji su prošarani očuvanijim regionima, nazvanim „regioni okvira“ (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a (H-CDR ovde označava CDR iz teškog lanca; a L-CDR ovde označava CDR iz lakog lanca) i četiri FR-a, raspoređenih od amino kraja do karboksi kraja prema sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dodela broja aminokiselinama u teškom ili lakom lancu može biti u skladu sa definicijama IMGT® (Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)); ili definicijama koje je dao Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); ili Chothia i sar., Nature 342:878-883 (1989).
[0055] Termin „rekombinantno antitelo“ odnosi se na antitelo koje je eksprimirano iz ćelije ili ćelijske linije koja sadrži sekvence nukleotida koji kodira antitelo, naznačeno time što pomenute sekvence nukleotida nisu prirodno povezane sa ćelijom.
[0056] Termin „izolovani protein“, „izolovani polipeptid“ ili „izolovano antitelo“ odnosi se na protein, polipeptid ili antitelo koje na osnovu svog porekla ili izvora dobijanja (1) nije povezano sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u nativnom stanju, (2) nema drugih proteina iz iste vrste, (3) eksprimira ga ćelija iz različite vrste, i/ili (4) ne javlja se u prirodi. Tako, polipeptid koji je hemijski sintetisan ili sintetisan u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče biće „izolovan“ od svojih prirodno vezanih komponenata. Protein takođe može suštinski da se oslobodi od prirodno vezanih komponenata putem izolacije, koristeći tehnike za prečišćavanje proteina dobro poznate u struci.
2
[0057] Kao što se ovde koristi, termin „germinativna linija“ odnosi se na sekvence nukleotida i aminokiselina gena i genskih segmenata antitela kada se propuštaju od roditelja do potomstva preko germinativnih ćelija. Sekvence germinativne linije se razlikuju od sekvenci nukleotida koje kodiraju antitela u zrelim B ćelijama, koje su izmenjene događajima rekombinacije i hipermutacije tokom sazrevanja B ćelija. Antitelo koje „koristi“ konkretnu sekvencu germinativne linije ima sekvencu nukleotida ili aminokiselina koja je usklađena sa sekvencom nukleotida germinativne linije ili sa aminokiselinskom sekvencom koju opisuje više nego sa bilo kojom drugom sekvencom germinativne linije nukleotida ili aminokiselina.
[0058] Termin „afinitet“ odnosi se na meru privlačenja između antigena i antitela. Svojstvena privlačnost antitela prema antigenu se obično izražava kao konstanta ravnoteže afiniteta vezivanja (KD) konkretne interakcije antitelo-antigen. Kaže se da se antitelo specifično vezuje za antigen kada je KD≤ 1 mM, poželjno ≤ 100 nM. Konstanta afiniteta vezivanja KDmože da se odredi, npr. putem površinske plazmonske rezonance (BIAcore™) ili interferometrije biosloja, na primer, koristeći sistem ProteOn™ XPR36 SPR kompanije Bio-Rad ili sistem Octet™.
[0059] Termin „koff“ odnosi se na konstantu brzine disocijacije konkretne interakcije antiteloantigen. Konstanta brzine disocijacije „koff“ može da se odredi pomoću interferometrije biosloja, na primer, koristeći sistem Octet™.
[0060] Termin „epitop“, kao što se ovde koristi, odnosi se na deo (determinantu) antigena koji se specifično vezuje za antitelo ili povezani molekul, kao što je bispecifični vezujući molekul. Epitopske determinante se generalno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su bočni lanci aminokiselina ili ugljenih hidrata ili šećera, i generalno imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti „linearni“ ili „konformacioni“. Kod linearnog epitopa, sve tačke interakcije između proteina (npr., antigena) i interagujućeg molekula (kao što je antitelo) nalaze se linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina. Kod konformacionog epitopa, tačke interakcije se nalaze na aminokiselinskim ostacima na proteinu koji su međusobno razdvojeni u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci proteina. Kada se odredi željeni epitop na antigenu, mogu se generisati antitela za taj epitop koristeći tehnike dobro poznate u struci. Na primer, antitelo za linearni epitop se može generisati, npr., imunizacijom životinje
2
peptidom koji ima aminokiselinske ostatke linearnog epitopa. Antitelo za konformacioni epitop se može generisati, npr., imunizacijom životinje mini-domenom koji ima relevantne aminokiselinske ostatke konformacionog epitopa. Takođe može da se generiše antitelo za konkretni epitop, npr., imunizacijom životinje ciljnim molekulom od interesa ili njegovim relevantnim delom (npr., ECD iz TIM-3), a zatim pretraživanjem za vezivanje epitopa.
[0061] Može se odrediti da li se antitelo vezuje za isti epitop kao anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska, ili se takmiči u vezivanju sa anti-TIM-3 antitelom iz pronalaska pomoću postupaka poznatih u struci, uključujući, bez ograničenja, kompetitivne testove, vezivanje epitopa, i pretraživanje na alanin. Ispitivano antitelo i anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska mogu da se vežu najmanje za jedan zajednički ostatak (npr., najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili devet zajedničkih ostataka) na TIM-3. Kontaktni ostaci na TIM-3 mogu biti sasvim identični kod ispitivanog antitela i anti-TIM-3 antitela iz pronalaska. Može se dopustiti da se anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska veže za TIM-3 pod uslovima zasićenja, i zatim se meri sposobnost ispitivanog antitela da se veže za TIM-3. Ako ispitivano antitelo može da se veže za TIM-3 u isto vreme kao referentno anti-TIM-3 antitelo, onda se ispitivano antitelo vezuje za različit epitop od referentnog anti-TIM-3 antitela. Međutim, ako ispitivano antitelo ne može da se veže za TIM-3 u isto vreme, ispitivano antitelo se vezuje za isti epitop, preklapajući epitop, ili epitop koji je u neposrednoj blizini epitopa koji vezuje anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska. Ovaj eksperiment može da se izvede koristeći, npr., ELISA, RIA, BIACORE™, interferometriju biosloja ili protočnu citometriju. Da bi se ispitalo da li se anti-TIM-3 antitelo unakrsno takmiči sa drugim anti-TIM-3 antitelom, može se koristiti kompetitivni postupak opisan iznad, u dva smera, tj., određivanje da li poznato antitelo blokira ispitivano antitelo, i obrnuto. Takvi eksperimenti unakrsne kompeticije mogu da se izvedu, npr., koristeći instrument IBIS MX96 SPR ili sistem Octet™.
[0062] U nekim slučajevima, može biti poželjno da se izmeni jedan ili više aminokiselinskih ostataka CDR da bi se poboljšao afinitet vezivanja za ciljni epitop. To je poznato kao „afinitetno sazrevanje“. U struci su poznati različiti postupci za afinitetno sazrevanje, na primer, postupak in vitro skenirajuće saturacione mutageneze, koji su opisali Burks i sar., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), i postepeni postupak in vitro afinitetnog sazrevanja koji su dali Wu i sar., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998).
2
[0063] Termin „antigen-vezujući deo“ antitela (ili samo „deo antitela“), kao što se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više delova ili fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen (npr., humani TIM-3, ili njegov deo). Pokazalo se da neki fragmenti antitela kompletne dužine mogu da vrše antigen-vezujuću funkciju antitela. Primeri za vezujuće fragmente obuhvaćene terminom „antigen-vezujući deo“ uključuju: (i) fragment Fab: jednovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena; (ii) fragment F(ab')2: dvovalentni fragment koji se sastoji od dva fragmenta Fab povezana disulfidnim mostom u regionu šarke; (iii) fragment Fd koji se sastoji od domena VHi CH1; (iv) fragment Fv koji se sastoji od domena VLi VHjednog kraka antitela, (v) fragment dAb koji se sastoji od domena VH; i (vi) izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji može specifično da se vezuje za antigen. Nadalje, mada dva domena fragmenta Fv, VLi VH, kodiraju odvojeni geni, oni se mogu spojiti, koristeći postupke rekombinacije, sintetičkim linkerom koji omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se domeni VLi VHsparuju dajući jednovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv)). Takođe, u obim pronalaska ulaze antigen vezujući molekuli koji sadrže VHi VL. U slučaju VH, molekul takođe može da sadrži jedan ili više regiona CH1, šarke, CH2 ili CH3. Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena terminom „antigen-vezujući deo“ antitela. Ostali oblici jednolančanih antitela, kao što su dijatela, takođe su obuhvaćeni. Dijatela su dvovalentna, bispecifična antitela kod kojih su VLi VHdomen eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali se koristi linker koji je suviše kratak da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu, i tako prisiljava domene da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigen vezujuća mesta.
[0064] Delovi antitela, kao što su fragmenti Fab i F(ab')2, mogu se pripremiti iz celih antitela koristeći klasične tehnike, kao što je digestija papainom ili pepsinom celih antitela. Pored toga, antitela, delovi antitela i imunoadhezioni molekuli se mogu dobiti koristeći standardne tehnike rekombinacije DNK, npr., kao što je ovde opisano.
[0065] Klasa (izotip) i potklasa anti-TIM-3 antitela može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u struci. Generalno, klasa i potklasa antitela može da se odredi koristeći antitela koja su specifična za konkretnu klasu i potklasu antitela. Takva antitela su komercijalno dostupna. Klasa i potklasa mogu da se odrede pomoću ELISA, vestern blota, i drugih tehnika. Alternativno, klasa i potklasa mogu da se odrede pomoću sekvenciranja celog konstantnog regiona teškog i/ili lakog lanca antitela, ili njegovog dela, poredeći njihove aminokiselinske
2
sekvence sa poznatim aminokiselinskim sekvencama različitih klasa i potklasa imunoglobulina, i određivanjem klase i potklase antitela.
[0066] Kada se pominju konkretni aminokiselinski ostaci na datoj poziciji sekvence antitela, naznaka, npr., „35S“ odnosi se na poziciju i ostatak, tj., u ovom slučaju ukazuje da postoji ostatak serina (S) na poziciji 35 sekvence. Slično, naznaka, npr., „13Q+35S“ ukazuje na dva ostatka na odgovarajućim pozicijama.
[0067] Ako nije drugačije naznačeno, svi brojevi aminokiselinskih ostataka antitela pomenuti u ovoj objavi su prema IMGT® šemi numeracije.
Anti-TIM-3 antitela
[0068] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela na TIM-3, i njihove antigen-vezujuće delove, kao što je definisano u zahtevima. U konkretnom otelotvorenju, antitela su humana antitela generisana od transgenih miševa koji mogu da generišu antitela sa humanim idiotipovima.
[0069] Prednost novih anti-TIM-3 antitela iz pronalaska je ta što ona mogu potentno da aktiviraju dendritske ćelije (vidite, npr., primer 4). Ne želeći da se vežemo za određenu teoriju, pretpostavlja se da anti-TIM-3 antitela iz pronalaska mogu da stimulišu T ćelije (npr., T ćelije specifične za tumor) putem aktiviranja dendritskih ćelija. Nadalje, predmetna primena po prvi put pokazuje da anti-TIM-3 antitela izotipa IgG1 ili IgG2 imaju visok nivo aktivnosti, dok antitela izotipa IgG4 ili IgG1-LALA nisu funkcionalna, ili su slabo funkcionalna (vidite, npr., primere 3 i 4). Ne želeći da se vežemo za određenu teoriju, podaci pronalazača nagoveštavaju da je anti-TIM-3 antitelo koje može da umreži TIM-3 putem Fc receptora posebno potentan aktivator imunskog sistema. Na primer, anti-TIM-3 IgG2 antitelo iz pronalaska može da se veže za FcyR2A koji se nalazi u dendritskim ćelijama, i pretpostavlja se da aktivira dendritske ćelije umrežavanjem TIM-3 molekula na njima.
[0070] Ovde objavljena anti-TIM-3 antitela mogu da se navode bilo prema petocifrenom broju, npr. „20131“, ili prema desetocifrenom broju, npr. „15086.16837“. Desetocifreni brojevi sa istih prvih pet cifara dobijeni su od istog matičnog antitela, kao što je slučaj sa antitelima 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144. Takva antitela, koja dele istih šest CDR-a, treba da imaju ista ili suštinski ista svojstva vezivanja cilja. Kao što će biti očigledno iz ovde datih sekvenci proteina i DNK, varijante 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144 razlikuju se samo po jednoj aminokiselini u VH sekvenci u poređenju sa matičnim antitelom 15086 („15086.15086“), naime E a ne Q na poziciji 6, dok su aminokiselinske sekvence VL identične. Takođe je očigledno da se ove varijante prvenstveno razlikuju po svom formatu/potklasi antitela, tj.:
15086.15086: IgG1
15086.16837: IgG1 LALA
15086.17145: IgG2
15086.17144: IgG4
[0071] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7–9, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 i 5;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10–12, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6;
1
i) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
[0072] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
a) antitela čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7– 12, redom;
b) antitela čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; i
c) antitela čiji HC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 i 5; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6.
[0073] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7–9, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10–12, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6;
2
i) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
[0074] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
a) antitela čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7– 12, redom;
b) antitela čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; i
c) antitela čiji HC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6.
[0075] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7–9, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 ili 24;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10–12, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
[0076] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
a) antitela čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7– 12, redom;
b) antitela čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; i
c) antitela čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 ili 24; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6.
[0077] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 30–32, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 33–35, redom;
4
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 30– 35, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 i 6.
[0078] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40–42, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 38;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 43–45, redom; f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 39;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40– 45, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 38, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 39;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 i 6.
[0079] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 50–52, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 48;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 48 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 53–55, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 49;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 49 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 50– 55, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 48, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 49;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 49 i 6.
[0080] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 60–62, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 63–65, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 59;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 59 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 60– 65, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 59;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 59 i 6.
[0081] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 70–72, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 68;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 73–75, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 69;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 70– 75, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 68, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 69;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i 6.
[0082] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 80–82, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 78;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 83–85, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 79;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 80– 85, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 78, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 79;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79 i 6.
[0083] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 90–92, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 88;
4
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 93–95, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 89;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 90– 95, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 88, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 89;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89 i 6.
[0084] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100–102, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 98;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 103–105, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 99;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100– 105, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 98, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 99;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99 i 6.
[0085] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 110–112, redom; b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 108;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 113–115, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 109;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 109;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 109 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 110– 115, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 108, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 109;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 109; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 109 i 6.
[0086] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 120–122, redom;
4
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 118;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 123–125, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 119;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 119 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 120– 125, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 118, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 119;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 119 i 6.
[0087] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg: a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 130–132, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 128;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 133–135, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 129;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 130– 135, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 128, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 129;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129 i 6.
[0088] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
4
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 140–142, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 138;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 138 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 143–145, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 139;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 140– 145, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 138, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 139;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 139 i 6.
4
[0089] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 150–152, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 148;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 148 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 153–155, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 149;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 149;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 150– 155, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 148, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 149;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 149; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 149 i 6.
4
[0090] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 160–162, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 158;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 163–165, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 159;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 159 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 160– 165, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 158, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 159;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; i
4
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 159 i 6.
[0091] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 170–172, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 168;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 168 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 173–175, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 169;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 169 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 170– 175, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 168, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 169;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169; i
4
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 169 i 6.
[0092] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 180–182, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 178;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 178 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 183–185, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 179;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 179 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 180– 185, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 178, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 179;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 179 i 6.
[0093] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 190–192, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 188;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 188;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 188 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 193–195, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 189;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 189;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 189 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 190– 195, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 188, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 189;
1
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 188, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 189; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 188 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 189 i 6.
[0094] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 200–202, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 198;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 198 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 203–205, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 199;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 199 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 200– 205, redom;
2
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 198, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 199;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 199 i 6.
[0095] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 210–212, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 208;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 213–215, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 209;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 209 i 6;
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 210– 215, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 208, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 209;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 209 i 6.
[0096] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 220–222, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 218;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 218;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 218 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 223–225, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 219;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 219;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 219 i 6;
4
i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 220– 225, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 218, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 219;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 218, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 219; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 218 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 219 i 6.
[0097] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
a) antitelo čiji H-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 230–232, redom;
b) antitelo čiji varijabilni domen teškog lanca (VH) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 228;
c) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 228;
d) antitelo čiji teški lanac (HC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 228 i SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25;
e) antitelo čiji L-CDR1-3 sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 233–235, redom;
f) antitelo čiji varijabilni domen lakog lanca (VL) je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 229;
g) antitelo čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 229;
h) antitelo čiji laki lanac (LC) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 229 i 6; i) antitelo čiji H-CDR1-3 i L-CDR1-3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 230– 235, redom;
j) antitelo čiji VH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 228, i čiji VL je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 229;
k) antitelo čiji VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 228, i čiji VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 229; i
l) antitelo čiji HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 228 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 23, 24 ili 25; i čiji LC sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 229 i 6.
[0098] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji se takmiče u vezivanju za humani TIM-3 sa sledećim antitelom, odnosno koji se vezuju za isti epitop humanog TIM-3 kao sledeće antitelo: antitelo 15086.15086 sa formatom IgG1, antitelo 15086.16837 sa IgG1 LALA formatom, antitelo 15086.17145 sa formatom IgG2 ili antitelo 15086.17144 sa formatom IgG4. U nekim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska je IgG. U nekim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska ima format IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
[0099] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji se takmiče u vezivanju za humani TIM-3 sa sledećim antitelom, odnosno koji se vezuju za isti epitop humanog TIM-3 kao sledeće antitelo: antitelo 20131, 20293, 15105, 15107, 15109, 15174, 15175, 15260, 15284, 15299, 15353, 15354, 17244, 17245, 19324, 19416, 19568, 20185, 20300, 20362, ili 20621. U nekim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska ima format IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
[0100] Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, ne takmiči se u vezivanju za humani TIM-3 sa bilo kojim ili svim od sledećih antitela, odnosno ne vezuje se za isti epitop humanog TIM-3 kao bilo koje ili sva od sledećih antitela: antitela iz bina epitopa 1 (referentno antitelo mAb 15), bina 2 (npr., antitela 15105 i 15107), i bina 8 (npr., antitela 15174 i 15175) kao što je definisano u primeru 12 u nastavku.
[0101] Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, ne takmiči se u vezivanju za humani TIM-3 sa bilo kojim ili svim od sledećih antitela, odnosno ne vezuje se za isti epitop humanog TIM-3 kao bilo koje ili sva od sledećih antitela: antitela iz bina epitopa 2 (npr., antitela 15105 i 15107), i bina 8 (npr., antitela 15174 i 15175) kao što je definisano u primeru 12 u nastavku.
[0102] Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, ne takmiči se u vezivanju za humani TIM-3 sa bilo kojim ili svim od sledećih antitela, odnosno ne vezuje se za isti epitop humanog TIM-3 kao bilo koje ili sva od sledećih antitela: antitela iz bina epitopa 2 (npr., antitela 15105 i 15107), kao što je definisano u primeru 12 u nastavku.
[0103] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje se takmiči u vezivanju za humani TIM-3 odnosno vezuje se za isti epitop humanog TIM-3 kao antitelo čiji CDR1-3 teškog lanca (H) i CDR1-3 lakog lanca (L) uključuju redom, SEQ ID NOs: 7-12, 30-35, 40-45, 50-55, 60-65, 70-75, 80-85, 90-95, 100-105, 110-115, 120-125, 130-135, 140-145, 150-155, 160-165, 170-175, 180-185, 190-195, 200-205, 210-215, 220-225, ili 230-235.
[0104] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji ima varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 3, 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa pomenutom sekvencom.
[0105] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 3, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa pomenutom sekvencom; i konstantni region teškog lanca (CH) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 5, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 5.
[0106] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima teški lanac (HC) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH SEQ ID NO: 3, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228 i aminokiselinsku sekvencu CH SEQ ID NO: 5.
[0107] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa pomenutom sekvencom; i konstantni region teškog lanca (CH) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 23, 24 ili 25, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 23, 24 ili 25. U posebnim otelotvorenjima, CH je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 25, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 25
[0108] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima teški lanac (HC) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH SEQ ID NO: 15, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, ili 228 i aminokiselinsku sekvencu CH SEQ ID NO: 23, 24 ili 25. Teški lanac može da sadrži aminokiselinsku sekvencu CH SEQ ID NO: 25.
[0109] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom VL SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa pomenutom sekvencom.
[0110] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca (VL) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom VL SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa pomenutom sekvencom; i konstantni region lakog lanca (CL) koji je najmanje 90% identičan po sekvenci sa SEQ ID NO: 6, npr., najmanje 95% identičan, kao što je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 6.
[0111] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje ima laki lanac (LC) koji uključuje aminokiselinsku sekvencu VL SEQ ID NO: 4, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, ili 229 i aminokiselinsku sekvencu CL SEQ ID NO: 6.
[0112] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo koje uključuje bilo koji od gornjih teških lanaca i bilo koji od gornjih lakih lanaca.
[0113] Bilo koje od ovde opisanih anti-TIM-3 antitela ili njegovih antigen-vezujućih delova može da inhibira vezivanje liganada kao što je galektin-9, CEACAM1, HMGB-1 i fosfatidil serin za TIM-3.
[0114] U jednom otelotvorenju, primena anti-TIM-3 antitela iz pronalaska ili njegovog antigen-vezujućeg dela može da aktivira dendritske ćelije, izazivajući njihovo sazrevanje i time njihovu sposobnost da stimulišu T-ćelije. Ne želeći da se vežemo za određenu teoriju, pretpostavlja se da anti-TIM-3 antitela iz pronalaska funkcionišu kao aktivatori dendritskih ćelija TIM-3, pri čemu njihovo dejstvo na dendritske ćelije služi za stimulaciju T-ćelija. U okruženju tumora, anti-TIM-3 antitela bi tako izazvala sazrevanje i aktiviranje dendritskih ćelija vezanih za tumor, dovodeći do aktiviranja T-ćelija specifičnih za tumor.
[0115] U nekim otelotvorenjima, bilo koje anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo, kao što je definisano u zahtevima, može da se veže za humani TIM-3 sa KDod najmanje 100, najmanje 50, najmanje 40, najmanje 30, najmanje 25, najmanje 20, najmanje 15, najmanje 10, najmanje 9, najmanje 8, najmanje 7 ili najmanje 6 nM. U nekim otelotvorenjima, KDse određuje putem površinske plazmonske rezonance.
[0116] U nekim otelotvorenjima, bilo koje anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo, kao što je definisano u zahtevima, može da se veže za TIM-3 cinomolgusa sa KDod najmanje 100, najmanje 50, najmanje 40, najmanje 30, najmanje 25, najmanje 24, najmanje 23, najmanje 22, najmanje 21 ili najmanje 20 nM. U nekim otelotvorenjima, KDse određuje putem površinske plazmonske rezonance.
[0117] U nekim otelotvorenjima, bilo koje anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo, kao što je definisano u zahtevima, može da ima aviditet prema humanom TIM-3 od EC50 ≤ 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ili 0,15 nM. U nekim otelotvorenjima, bilo koje anti-TIM-3 antitelo ili antigenvezujući deo, kao što je definisano u zahtevima, može da ima aviditet prema TIM-3 cinomolgusa od EC50 ≤ 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ili 0,15 nM.
[0118] U jednom otelotvorenju, primena anti-TIM-3 antitela iz pronalaska ili njegovog antigen-vezujućeg dela može direktno da aktivira T-ćelije.
[0119] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji se vezuje za epitop TIM-3 koji sadrži najmanje jedan (npr., najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam ili najmanje devet) od sledećih ostataka sekvence SEQ ID NO: 236: P50, V60, F61, E62, G64, R69, 1117, M118 i D120. Epitop sa bilo kojom kombinacijom gorepomenutog.
[0120] Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, vezuje se za epitop TIM-3 koji sadrži sledeće ostatke sekvence SEQ ID NO: 236: P50, V60, F61, E62, G64, R69, I117, M118 i D120.
[0121] Ovde je opisano anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za epitop TIM-3 koji sadrži ostatke 62–67 i/ili 114–117 sekvence SEQ ID NO: 236. Antitelo ili deo se vezuje za ostatke 62–67 (ili njihov fragment, kao što je jedan, dva, tri, četiri ili pet fragmenata ostatka) sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, i 20293). Ovde je opisano antitelo ili deo koji se vezuje za ostatke 114–117 (ili njihov fragment, kao što je jedan, dva, tri, četiri ili pet fragmenata ostatka) sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitelo 20131). Takođe se razmatra epitop sa bilo kojom kombinacijom gorepomenutog.
[0122] Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, vezuje se za epitop TIM-3 koji sadrži ostatke 62–67 sekvence SEQ ID NO: 236. Antitelo ili deo se vezuje za ostatke 62–67 sekvence SEQ ID NO: 236 (npr., antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145, 15086.17144, i 20293).
[0123] Klasa anti-TIM-3 antitela dobijena ovde opisanim postupcima može da se promeni ili zameni drugom klasom ili potklasom. U jednom aspektu pronalaska, molekul nukleinske kiseline koji kodira VL ili VH se izoluje pomoću postupaka dobro poznatih u struci tako da ne sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju CL ili CH. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VL ili VH se zatim operativno vezuju za sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CL, odnosno CH, iz različite klase molekula imunoglobulina. To se može postići pomoću vektora ili molekula nukleinske kiseline koji sadrži lanac CL ili CH, kao što je gore opisano. Na primer, anti-TIM-3 antitelo koje je prvobitno bilo IgM može da se prebaci na klasu IgG. Nadalje, zamena klase može da se koristi za prevođenje jedne potklase IgG u drugu, npr., od IgG1 u IgG2. Konstantni region κ lakog lanca može da se promeni u konstantni region λ lakog lanca. Poželjni postupak za proizvodnju antitela iz pronalaska sa željenim izotipom Ig uključuje korake izolovanja molekula nukleinske kiseline koji kodira teški lanac anti-TIM-3 antitela, i molekula nukleinske kiseline koji kodira laki lanac anti-TIM-3 antitela, dobijanje varijabilnog domena teškog lanca, ligiranje varijabilnog domena teškog lanca sa konstantnim regionom teškog lanca željenog izotipa, ekspresiju lakog lanca i ligiranog teškog lanca u ćeliji, kao i prikupljanje anti-TIM-3 antitela sa željenim izotipom.
[0124] Anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska može biti molekul IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD, ali je tipično IgG izotipa, npr. IgG potklase IgG1, IgG2a ili IgG2b, IgG3 ili IgG4. U jednom otelotvorenju, antitelo je IgG1. U drugom otelotvorenju, antitelo je IgG2.
[0125] U jednom otelotvorenju, anti-TIM-3 antitelo može da sadrži najmanje jednu mutaciju u Fc regionu. Poznato je više različitih mutacija Fc, gde te mutacije obezbeđuju izmenjenu efektorsku funkciju. Na primer, u mnogim slučajevima će biti poželjno da se smanji ili eliminiše efektorska funkcija, npr., tamo gde su nepoželjne interakcije ligand/receptor, ili u slučaju konjugata antitelo-lek. Pozicije aminokiselina Fc regiona koje mogu biti povoljne za mutaciju kako bi se smanjila efektorska funkcija uključuju jednu ili više od pozicija 228, 233, 234 i 235, gde su pozicije aminokiselina numerisane prema šemi numeracije IMGT®.
[0126] U jednom otelotvorenju, jedan ili oba aminokiselinska ostatka na pozicijama 234 i 235 mogu da mutiraju, na primer, iz Leu u Ala (L234A/L235A). Ove mutacije smanjuju efektorsku funkciju Fc regiona antitela IgG1. Dodatno ili alternativno, aminokiselinski ostatak na poziciji 228 može da mutira, na primer, u Pro. U drugom otelotvorenju, aminokiselinski ostatak na poziciji 233 može da mutira, npr., u Pro, aminokiselinski ostatak na poziciji 234 može da mutira, npr., u Val, i/ili aminokiselinski ostatak na poziciji 235 može da mutira, npr., u Ala. Pozicije aminokiselina su numerisane prema šemi numeracije IMGT®.
1
[0127] U drugom otelotvorenju, kada je antitelo potklase IgG4, ono može da sadrži mutaciju S228P, tj., da ima prolin na poziciji 228, gde je pozicija aminokiseline numerisana prema Eu šemi numeracije IMGT®. Poznato je da mutacija smanjuje neželjenu izmenu kraka Fab (Angal et al., Mol Immunol. 30:105-8 (1993)).
[0128] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući deo iz pronalaska može biti deo većeg imunoadhezionog molekula, formiranog kovalentnim ili nekovalentnim povezivanjem antitela ili dela antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri za takve imunoadhezione molekule uključuju primenu regiona jezgra streptavidina za dobijanje tetramernog molekula scFv (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) i primenu cisteinskog ostatka, peptidnog markera i C-terminalne polihistidinske oznake za dobijanje dvovalentnih i biotinilovanih molekula scFv (Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Ostali primeri uključuju one gde su CDR-i iz antitela inkorporisani u molekul bilo kovalentno ili nekovalentno, da se dobije imunoadhezin koji se specifično vezuje za željeni antigen. U takvim otelotvorenjima, CDR(-i) mogu biti inkorporisani kao deo većeg polipeptidnog lanca, mogu biti kovalentno vezani za drugi polipeptidni lanac, ili mogu biti inkorporisani nekovalentno.
[0129] U drugom otelotvorenju, može se napraviti fuziono antitelo ili imunoadhezin koje sadrži celo anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska ili njegov deo, vezane za drugi polipeptid. U nekim otelotvorenjima, samo varijabilni domeni anti-TIM-3 antitela su vezani za polipeptid. U nekim otelotvorenjima, VH domen anti-TIM-3 antitela je vezan za prvi polipeptid, dok je VL domen anti-TIM-3 antitela vezan za drugi polipeptid koji se povezuje sa prvim polipeptidom na takav način da VH i VL domen mogu međusobno da interaguju i formiraju antigen-vezujuće mesto. U drugom poželjnom otelotvorenju, VH domen je razdvojen od VL domena linkerom tako da VH i VL domen mogu međusobno da interaguju (npr. jednolančana antitela). VH-linker-VL antitelo se zatim vezuje za željeni polipeptid. Pored toga, mogu da se stvore fuziona antitela kod kojih su dva jednolančana antitela (ili više njih) međusobno povezana. To je korisno ako neko želi da napravi dvovalentno ili polivalentno antitelo na jednom polipeptidnom lancu, ili ako neko želi da napravi bispecifično antitelo.
[0130] Da bi se dobilo jednolančano antitelo (scFv), fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL su operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., koji kodira
2
aminokiselinsku sekvencu (Gly4 -Ser)3 (SEQ ID NO: 240), tako da sekvence VH i VL mogu da se eksprimiraju kao susedni jednolančani protein, sa VL i VH domenima koji su povezani fleksibilnim linkerom. Vidite, npr., Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); i McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Jednolančano antitelo može biti jednovalentno, ako se koristi samo jedan VH i VL; dvovalentno, ako se koriste dva VH i VL; ili polivalentno, ako se koristi više od dva VH i VL. Mogu da se dobiju bispecifična ili polivalentna antitela koja se, na primer, specifično vezuju za humani TIM-3 i za drugi molekul.
[0131] U drugim otelotvorenjima, mogu da se dobiju druga modifikovana antitela korišćenjem molekula nukleinske kiseline koji kodiraju anti-TIM-3 antitelo. Na primer, „kapa tela“ (Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), „minitela“ (Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), „dijatela“ (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)) ili „janusini“ (Traunecker et al., EMBO J.10:3655-3659 (1991) i Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) mogu da se dobiju korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije prema poukama specifikacije.
[0132] Anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo iz pronalaska može da se derivatizuje ili veže za drugi molekul (npr., drugi peptid ili protein). Generalno, antitela ili njihovi antigenvezujući delovi su derivatizovani tako da nema negativnog efekta na vezivanje TIM-3 putem derivatizacije ili označavanja. Prema tome, antitela i antigen-vezujući delovi iz pronalaska treba da uključuju i netaknute i modifikovane oblike humanih anti-TIM-3 antitela kao što je definisano u zahtevima. Na primer, antitelo ili antigen-vezujući deo iz pronalaska može da bude funkcionalno vezan (hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili na drugi način) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo ili dijatelo), detekcioni agens, farmaceutski agens, i/ili protein ili peptid koji može da posreduje u povezivanju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je region jezgra streptavidina ili polihistidinska oznaka).
[0133] Jedan tip derivatizovanog antitela je proizveden umrežavanjem dva ili više antitela (istog ili različitog tipa, npr., da se dobiju bispecifična antitela). Pogodni umreživači obuhvataju one koji su heterobifunkcionalni, i imaju dve različite reaktivne grupe razdvojene odgovarajućim spejserom (npr., m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar) ili homobifunkcionalni (npr., disukcinimidil suberat). Takvi linkeri mogu da se nabave, npr., od Pierce Chemical Company, Rockford, II.
[0134] Anti-TIM-3 antitelo takođe može biti derivatizovano hemijskom grupom kao što je polietilen glikol (PEG), metil ili etil grupa, ili ugljovodonična grupa. Te grupe mogu biti korisne za poboljšanje bioloških karakteristika antitela, npr., da bi se povećao poluživot u serumu.
[0135] Antitelo prema predmetnom pronalasku takođe može biti označeno. Kao što se ovde koriste, termini „oznaka“ ili „označen“ odnose se na inkorporisanje drugog molekula u antitelo. U jednom otelotvorenju, oznaka je detektabilni marker, npr., inkorporisanje radiološki obeležene aminokiseline ili vezivanje za polipeptid biotinil ostataka koji se mogu detektovati označenim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U drugom otelotvorenju, oznaka ili marker mogu biti terapeutski agens, npr., konjugat leka ili toksin. U struci su poznati, i mogu da se koriste, različiti postupci za označavanje polipeptida i glikoproteina. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, bez ograničenja, sledeće: radioizotopi ili radionuklidi (npr., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluorescentne oznake (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfori), enzimske oznake (npr., peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentni markeri, biotinil grupe, prethodno definisani polipeptidni epitopi koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., sekvence para leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopske oznake), magnetni agensi, kao što su gadolinijum helati, toksini kao što je toksin velikog kašlja, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidium bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, i njihovi analozi ili homolozi. U nekim otelotvorenjima, oznake su vezane krakovima spejsera različite dužine da bi se smanjile moguće sterne smetnje.
[0136] U nekim otelotvorenjima, antitela iz pronalaska mogu biti prisutna u neutralnom obliku (uključujući oblik cviter jona) ili kao pozitivno ili negativno naelektrisane vrste. U nekim otelotvorenjima, antitela mogu biti kompleksirana sa kontrajonom dajući farmaceutski prihvatljivu so.
4
[0137] Termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na kompleks koji sadrži jedno ili više antitela i jedan ili više kontrajona, naznačeno time što se kontrajoni dobijaju od farmaceutski prihvatljivih neorganskih i organskih kiselina i baza.
Bispecifični vezujući molekuli
[0138] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični vezujući molekul koji ima specifičnost vezivanja anti-TIM-3 antitela kako je definisano u zahtevima i specifičnost vezivanja drugog anti-TIM-3 antitela (npr., ovde opisano drugo anti-TIM-3 antitelo) ili antitelo koje cilja različiti protein, kao što je drugi protein imunske kontrolne tačke, antigen karcinoma, ili drugi molekul ćelijske površine čija aktivnost posreduje stanje bolesti kao što je rak. Takvi bispecifični vezujući molekuli su poznati u struci, i primeri za različite vrste bispecifičnih vezujućih molekula dati su ovde na drugom mestu.
Molekuli nukleinskih kiselina i vektori
[0139] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline i sekvence koje kodiraju anti-TIM-3 antitela ili njihove antigen-vezujuće delove kako je definisano u zahtevima. U nekim otelotvorenjima, različiti molekuli nukleinske kiseline kodiraju aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela. U drugim otelotvorenjima, isti molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela.
[0140] Upućivanje na sekvencu nukleotida obuhvata i njegov komplement, ako nije drugačije naznačeno. Tako, upućivanje na nukleinsku kiselinu koja ima konkretnu sekvencu podrazumeva njen komplementarni lanac, sa komplementarnom sekvencom. Termin „polinukleotid“, kako se ovde pominje, označava polimerni oblik nukleotida dužine od najmanje 10 baza, bilo ribonukleotida ili dezoksinukleotida, ili modifikovanog oblika bilo kog tipa nukleotida. Termin uključuje oblike sa jednim i dva lanca.
[0141] Ovde su opisane sekvence nukleotida koje su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identične sa jednom ili više sekvenci nukleotida koje su ovde nabrojane, npr., sa sekvencom nukleotida koja kodira aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 3, 4, 7-12, 15, 28-35, 38-45, 48-55, 58-65, 68-75, 78-85, 88-95, 98-105, 108-115, 118-125, 128-135, 138-145, 148-155, 158-165, 168-175, 178-185, 188-195, 198-205, 208-215, 218-225, i 228-235. Termin „procenat identičnosti sekvence“ u kontekstu sekvenci nukleinske kiseline ukazuje na ostatke u dve sekvence koji su isti kada se poravnaju radi maksimalnog poklapanja. Dužina poređenja identičnosti sekvence može biti na delu od najmanje oko devet nukleotida, obično najmanje oko 18 nukleotida, češće najmanje oko 24 nukleotida, uobičajeno najmanje oko 28 nukleotida, još uobičajenije najmanje oko 32 nukleotida, i poželjno najmanje oko 36, 48 ili više nukleotida. Postoji više različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti da se odredi identičnost sekvence nukleotida. Na primer, sekvence polinukleotida se mogu porediti koristeći FASTA, Gap ili Bestfit, programe paketa Wisconsin verzija 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Viskonsin. FASTA, koji uključuje, npr., programe FASTA2 i FASTA3, obezbeđuje poravnavanje i procenat identičnosti sekvence regiona najboljeg preklapanja između upita i tražene sekvence (vidite, npr., Pearson, Methods Enzymol.183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol.132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); i Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)). Ako nije drugačije naznačeno, koriste se podrazumevani parametri za konkretni program ili algoritam. Na primer, procenat identičnosti sekvence između sekvenci nukleinske kiseline može da se odredi koristeći FASTA sa podrazumevanim parametrima (veličina reči 6 i NOPAM faktor za matricu rezultata) ili koristeći Gap sa podrazumevanim parametrima, kao što je dato u GCG verzija 6.1, koja je ovde obuhvaćena putem reference.
[0142] Ovde je opisan molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleotida odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 26, 27, 36, 37, 46, 47, 56, 57, 66, 67, 76, 77, 86, 87, 96, 97, 106, 107, 116, 117, 126, 127, 136, 137, 146, 147156, 157, 166,167, 176, 177, 186, 187, 196, 197, 206, 207, 216, 217, 226, i 227. Ovde su opisani molekuli nukleinske kiseline koji sadrže sekvence nukleotida koje su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identične sa bilo kojom od pomenutih sekvenci nukleotida.
[0143] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji sadrže sekvencu nukleotida odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, 13 i 14.
[0144] U bilo kom od gornjih otelotvorenja, molekuli nukleinske kiseline mogu da se izoluju. Molekul nukleinske kiseline koji kodira teški i/ili laki lanac anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz pronalaska može da se izoluje iz bilo kog izvora koji proizvodi takvo antitelo ili deo. U različitim otelotvorenjima, molekuli nukleinske kiseline se izoluju iz B ćelija koje eksprimiraju anti-TIM-3 antitelo izolovano iz životinje imunizovane humanim TIM-3 antigenom, ili iz imortalizovane ćelije proizvedene iz takve B ćelije. Postupci za izolaciju nukleinske kiseline koja kodira antitelo dobro su poznati u struci. mRNK može da se izoluje i koristi za proizvodnju cDNK za upotrebu u lančanoj reakciji polimeraze (PCR) ili kloniranju cDNK gena antitela. U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska može da bude sintetisan umesto izolovan.
[0145] U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska može da sadrži sekvencu nukleotida koja kodira VH domen iz anti-TIM-3 antitela ili antigen-vezujućeg dela iz pronalaska spojen unutar okvira sa sekvencom nukleotida koja kodira konstantni region teškog lanca iz bilo kog izvora. Slično tome, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska može da sadrži sekvencu nukleotida koja kodira VL domen iz anti-TIM-3 antitela ili antigenvezujućeg dela iz pronalaska spojen unutar okvira sa sekvencom nukleotida koja kodira konstantni region lakog lanca iz bilo kog izvora.
[0146] U daljem aspektu pronalaska, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilni domen teškog (VH) i/ili lakog (VL) lanca mogu da se „konvertuju“ u gene antitela kompletne dužine. U jednom otelotvorenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VH ili VL domen konvertuju se u gene antitela kompletne dužine ubacivanjem u ekspresioni vektor koji već kodira konstantni domen teškog lanca (CH), odnosno lakog lanca (CL), tako da je segment VH operativno vezan za CH segment(e) u vektoru, i/ili je segment VL operativno vezan za CL segment u vektoru. U drugom otelotvorenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VH i/ili VL domen konvertuju se u gene antitela kompletne dužine vezivanjem, npr. ligacijom, molekula nukleinske kiseline koji kodira VH i/ili VL domen sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira CH i/ili CL domen koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju teški i/ili laki lanac kompletne dužine onda mogu da se eksprimiraju iz ćelije u koju su uvedeni, i anti-TIM-3 antitelo izolovano.
[0147] Molekuli nukleinske kiseline mogu da se koriste za rekombinantnu ekspresiju velikih količina anti-TIM-3 antitela. Molekuli nukleinske kiseline takođe mogu da se koriste za proizvodnju, npr., himernih antitela, bispecifičnih antitela, jednolančanih antitela, imunoadhezina, dijatela, mutiranih antitela i derivata antitela, kao što je ovde opisano.
[0148] U drugom otelotvorenju, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska se koristi kao sonda ili PCR prajmer za sekvencu specifičnog antitela. Na primer, nukleinska kiselina može da se koristi kao sonda u dijagnostičkim postupcima ili kao PCR prajmer za amplifikaciju regiona DNK koji se mogu koristiti, između ostalog, za izolovanje dodatnih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilne domene anti-TIM-3 antitela. U nekim otelotvorenjima, molekuli nukleinske kiseline su oligonukleotidi. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi su od veoma varijabilnih domena teškog i lakog lanca antitela od interesa. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi kodiraju sve CDR-e anti-TIM-3 antitela ili njihovih antigenvezujućih delova iz pronalaska, kao što je ovde opisano.
[0149] Molekuli nukleinske kiseline i vektori mogu da se koriste za dobijanje mutiranih anti-TIM-3 antitela. Antitela mogu da mutiraju u varijabilnim domenima teškog i/ili lakog lanca, npr., da se izmene vezujuća svojstva antitela. Na primer, može da se napravi mutacija u jednom ili više CDR-a da se poveća ili smanji KDanti-TIM-3 antitela, da se poveća ili smanji koff, ili da se izmeni specifičnost vezivanja antitela. Može da se napravi jedna ili više mutacija na aminokiselinskom ostatku za koji se zna da je promenjen u poređenju sa germinativnom linijom u monoklonskom antitelu iz pronalaska. Mogu da se naprave mutacije u CDR-u ili regionu okvira varijabilnog domena, ili u konstantnom regionu. Mogu da se naprave mutacije u varijabilnom domenu. Može da se napravi jedna ili više mutacija na aminokiselinskom ostatku za koji se zna da je promenjen u poređenju sa germinativnom linijom u CDR-u ili u regionu okvira varijabilnog domena antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz pronalaska.
[0150] Region(i) okvira mogu da mutiraju tako da dobijeni region(i) okvira imaju aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg gena germinativne linije. Može da se napravi mutacija u regionu okvira ili konstantnom regionu da se produži poluživot anti-TIM-3 antitela. Vidite, npr., PCT publikaciju WO 00/09560. Mutacija u regionu okvira ili konstantnom regionu takođe može da se napravi da bi se izmenila imunogenost antitela, i/ili da bi se obezbedilo mesto za kovalentno ili nekovalentno vezivanje za drugi molekul. Ovde je opisano jedno antitelo koje može da ima mutacije u bilo kom ili u više CDR-a ili regiona okvira varijabilnog domena ili u konstantnom regionu.
[0151] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor pogodan za ekspresiju jednog ili oba lanca anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, kako je definisano u zahtevima. Termin „vektor“, kao što se ovde koristi, označava molekul nukleinske kiseline koji može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. U nekim otelotvorenjima, vektor je plazmid, tj., kružni dvolančani deo DNK u koji mogu da budu ligirani dodatni segmenti DNK. U nekim otelotvorenjima, vektor je virusni vektor, naznačeno time što dodatni segmenti DNK mogu biti ligirani u genom virusa. U nekim otelotvorenjima, vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko mesto početka replikacije i epizomni vektori sisara). U drugim otelotvorenjima, vektori (npr. ne-epizomni vektori sisara) mogu da budu integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i time se replikuju uz genom domaćina. Pored toga, neki vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „vektori rekombinantne ekspresije“ (ili samo „ekspresioni vektori“).
[0152] Pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju teški lanac anti-TIM-3 antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo, laki lanac anti-TIM-3 antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo, ili i teški i laki lanac anti-TIM-3 antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo. Pronalazak dalje obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju fuzione proteine, modifikovana antitela, fragmente antitela, i njihove sonde.
[0153] U nekim otelotvorenjima, anti-TIM-3 antitela iz pronalaska ili njihovi antigen-vezujući delovi su eksprimirani insercijom DNK koje kodiraju laki i teški lanac delimične ili kompletne dužine, dobijene kako je gore opisano, u ekspresione vektore takve da su geni operativno vezani za sekvence za neophodnu kontrolu ekspresije, kao što su sekvence za kontrolu transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, adenoviruse, adenoasocirane viruse (AAV), viruse biljaka, kao što je mozaik virus karfiola, mozaik virus duvana, kozmide, YAC, epizome dobijene od EBV, i slično. Kodirajuće sekvence antitela mogu da se ligiraju u vektor takav da sekvence za kontrolu transkripcije i translacije u vektoru služe svojoj nameravanoj funkciji regulacije transkripcije i translacije kodirajuće sekvence antitela. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije mogu biti izabrani tako da budu kompatibilni sa ekspresijom upotrebljene ćelije domaćina. Kodirajuće sekvence lakog lanca antitela i kodirajuće sekvence teškog lanca antitela mogu da se ubace u odvojene vektore, i mogu biti operativno vezane za iste ili različite sekvence za kontrolu ekspresije (npr., promoteri). U jednom otelotvorenju, obe kodirajuće sekvence su insertovane u isti ekspresioni vektor, i mogu biti operativno vezane za iste sekvence za kontrolu ekspresije (npr., zajednički promoter), za odvojene identične sekvence za kontrolu ekspresije (npr., promoteri), ili za različite sekvence za kontrolu ekspresije (npr., promoteri). Kodirajuće sekvence antitela mogu da se insertuju u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr., ligacija komplementarnih restriktivnih mesta na fragmentu i vektoru gena antitela, ili ligacija tupog kraja ako nema restriktivnih mesta).
[0154] Pogodni vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu sekvencu CH ili CL humanog imunoglobulina, gde su prikladna restriktivna mesta konstruisana tako da svaka sekvenca VH ili VL može lako da se insertuje i eksprimira, kao što je gore opisano. Geni koji kodiraju HC i LC u takvim vektorima mogu da sadrže sekvence introna koje će dovesti do povećanog ukupnog prinosa proteina antitela stabilizacijom povezane mRNK. Pored sekvenci introna nalaze se mesto donora i akceptora splajsovanja, koja određuju gde će se desiti splajsovanje RNK. Lokacija sekvenci introna može biti u varijabilnom ili konstantnom regionu lanca antitela, ili i u varijabilnom i u konstantnom regionu lanca antitela, kada se koristi više introna. Završetak poliadenilacije i transkripcije može da se desi na nativnim mestima hromozoma nishodno od kodirajućih regiona. Vektori rekombinantne ekspresije takođe mogu da kodiraju signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor takav da je signalni peptid vezan unutar okvira za amino kraj lanca imunoglobulina. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid iz proteina koji nije imunoglobulin).
[0155] Pored gena lanca antitela, vektori rekombinantne ekspresije iz pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Stručnjaci će shvatiti da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju u ćeliji domaćinu sisara uključuju elemente virusa koji regulišu visoke nivoe ekspresije proteina u ćeliji sisara, kao što su promoteri i/ili pojačavači dobijeni od LTR retrovirusa, citomegalovirusa (CMV) (kao što je promoter/pojačavač CMV), simijan virusa 40 (SV40) (kao što je promoter/pojačavač SV40), adenovirusa (npr., glavni kasni promoter adenovirusa (AdMLP)), polioma jakih promotera sisara, kao što su promoteri nativnog imunoglobulina i promoteri aktina. Za dodatni opis regulatornih elemenata virusa, i njihovih sekvenci, vidite npr., US patente 5,168,062, 4,510,245 i 4,968,615. Postupci za ekspresiju antitela u biljkama, uključujući opis promotera i vektora, kao i transformaciju biljaka, poznati su u struci. Vidite npr., US patent 6,517,529. Postupci za ekspresiju antitela u ćelijama bakterija ili gljivica, npr., ćelijama kvasca, takođe su dobro poznati u struci.
[0156] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, vektori rekombinantne ekspresije iz pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji domaćinu (npr., mesto početka replikacije) i selektabilni marker geni. Selektabilni marker gen olakšava izbor ćelija domaćina u koje se uvodi vektor (vidite npr., US patente 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Na primer, selektabilni marker gen obično daje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je uveden vektor. Na primer, selektabilni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za primenu u dhfr-ćelijama domaćinima sa izborom/amplifikacijom metotreksata), neo gen (za selekciju G418) i gen glutamat sintetaze.
[0157] Termin „sekvenca za kontrolu ekspresije“ ko što se ovde koristi podrazumeva sekvence polinukleotida koje su potrebne da deluju na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su ligirani. Sekvence za kontrolu ekspresije obuhvataju odgovarajuće sekvence za aktiviranje transkripcije, zaustavljanje, promotere i pojačavače; signale za delotvornu obradu RNK, kao što su signali za splajsovanje i poliadenilaciju; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNK; sekvence koje pojačavaju delotvornost translacije (tj., sekvenca Kozakovog konsenzusa); sekvence koje povećavaju stabilnost proteina; i, po želji, sekvence koje povećavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina; kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno obuhvataju promoter, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za prekid transkripcije; kod eukariota, generalno, takve kontrolne sekvence uključuju promotere i sekvencu za prekid transkripcije. Termin „ kontrolne sekvence“ podrazumevano uključuje najmanje sve komponente čije prisustvo je ključno za ekspresiju i obradu, i takođe može da uključuje dodatne komponente čije prisustvo je pogodno, na primer, vodeće sekvence i sekvence fuzionog partnera.
Ćelije domaćini i postupci za proizvodnju antitela i kompozicije antitela
[0158] Dodatni aspekt pronalaska odnosi se na postupke za proizvodnju kompozicija antitela i antitela i njihovih antigen-vezujućih delova iz pronalaska. Jedno otelotvorenje ovog aspekta pronalaska odnosi se na postupak za proizvodnju antitela, kako je definisano u zahtevima, koji obuhvata obezbeđivanje rekombinantne ćelije domaćina koja može da eksprimira antitelo,
1
uzgajanje pomenute ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela, i izolovanje dobijenog antitela. Antitela proizvedena takvom ekspresijom u takvim rekombinantnim ćelijama domaćinima ovde se pominju kao „rekombinantna antitela“. Pronalazak takođe obezbeđuje ćelije potomke takvih ćelija domaćina, i antitela koja one proizvode.
[0159] Termin „rekombinantna ćelija domaćin“ (ili samo „ćelija domaćin“), kako se ovde koristi, označava ćeliju u koju je uveden vektor rekombinantne ekspresije. Pronalazak obezbeđuje ćelije domaćine koje sadrže vektor prema gore opisanom pronalasku. Pronalazak takođe obezbeđuje ćelije domaćine koje sadrže sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac ili njegov antigen vezujući deo, i sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac ili njegov antigen vezujući deo, anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela iz pronalaska. Podrazumeva se da se „rekombinantna ćelija domaćin“ i „ćelija domaćin“ ne odnose samo na konkretnu ćeliju ispitanika, nego i potomstvo takve ćelije. Pošto se u narednim generacijama mogu javiti određene mutacije bilo usled mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora biti identično sa matičnom ćelijom, ali je i dalje obuhvaćeno terminom „ćelija domaćin“, kao što se ovde koristi.
[0160] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju anti-TIM-3 antitela i vektori koji sadrže te molekule nukleinske kiseline mogu se koristiti za transfekciju pogodne ćelije domaćina sisara, biljaka, bakterija ili kvasca. Transformacija može biti bilo kojim poznatim postupkom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćeliju sisara dobro su poznati u struci, i obuhvataju transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozomima i direktno mikroinjektovanje DNK u jedra. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline mogu da se uvedu u ćelije sisara putem virusnih vektora. Postupci za transformaciju ćelija su dobro poznati u struci. Vidite, npr., US patente 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455. Postupci za transformaciju ćelija biljaka su dobro poznati u struci, uključujući, na primer, transformacije koje posreduje Agrobacterium, biolističku transformaciju, direktno injektovanje, elektroporaciju i virusnu transformaciju. Postupci za transformaciju ćelija bakterija i kvasca takođe su dobro poznati u struci.
[0161] Ćelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u struci, i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne od ATCC (American Type Culture
2
Collection). One, između ostalog, uključuju, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), NS0 ćelije, SP2 ćelije, HEK-293T ćelije, 293 Freestyle ćelije (Invitrogen), NIH-3T3 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije, i niz drugih ćelijskih linija. Posebno poželjne ćelijske linije se biraju tako što se odredi koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije. Druge ćelijske linije koje mogu da se koriste su ćelijske linije insekata, kao što su ćelije Sf9 ili Sf21. Kada se vektori rekombinantne ekspresije koji kodiraju gene antitela uvedu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode uzgajanjem ćelija domaćina u periodu dovoljnom da se omogući ekspresija antitela u ćelijama domaćinima ili, poželjnije, sekrecija antitela u medijum za uzgajanje u kome se uzgajaju ćelije domaćini. Antitela se mogu rekuperovati iz medijuma za uzgajanje korišćenjem standardnih postupaka za prečišćavanje proteina. Biljne ćelije domaćini uključuju, npr., ćelije Nicotiana, Arabidopsis, sočivice, kukuruza, pšenice, krompira, itd. Bakterijske ćelije domaćini uključuju ćelije vrsta E. coli i Streptomyces. Ćelije domaćini kvasca uključuju ćelije Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris.
[0162] Nadalje, ekspresija antitela iz pronalaska ili njihovih antigen-vezujućih delova iz proizvodnje ćelijskih linija se može povećati većim brojem poznatih tehnika. Na primer, sistem za ekspresiju gena glutamin sintetaze (GS sistem) predstavlja uobičajeni pristup povećanju ekspresije pod izvesnim uslovima. O GS sistemu se raspravlja u celini ili delimično u vezi sa EP patentima 0216 846, 0256 055, 0323 997 i 0338 841.
[0163] Antitela eksprimirana različitim ćelijskim linijama ili u transgenim životinjama verovatno će imati različite obrasce glikozilacije. Međutim, sva antitela koja kodiraju ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline, ili koja sadrže ovde obezbeđene aminokiselinske sekvence, predstavljaju deo trenutnog pronalaska, nezavisno od stanja glikozilacije antitela, i uopštenije, nezavisno od prisustva ili odsustva posttranslacionih modifikacija.
Farmaceutske kompozicije
[0164] Drugi aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija koja kao aktivni sastojak (ili kao jedini aktivni sastojak) sadrži anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen vezujući deo, bispecifični vezujući molekul, ili kompoziciju anti-TIM-3 antitela iz pronalaska. Farmaceutska kompozicija može da sadrži bilo koju kompoziciju anti-TIM-3 antitela, bispecifični vezujući molekul, ili antitelo ili njegov antigen vezujući deo, kao što je definisano u zahtevima. U nekim otelotvorenjima, kompozicije su namenjene za poboljšavanje, prevenciju i/ili lečenje poremećaja vezanog za TIM-3 (npr. poremećaj okarakterisan prekomernom ekspresijom ili prekomernom aktivnošću TIM-3 ili bilo kog od njegovih liganada) i/ili raka. U nekim otelotvorenjima, kompozicije su namenjene za aktiviranje imunskog sistema. U nekim otelotvorenjima, kompozicije su namenjene za poboljšavanje, prevenciju i/ili lečenje malignog tumora koji potiče od tkiva kao što je koža, pluća, creva, jajnik, mozak, prostata, bubreg, meka tkiva, hematopoetski sistem, glava i vrat, jetra, bešika, dojka, želudac, materica i pankreas.
[0165] Generalno, antitela iz pronalaska ili njihovi antigen-vezujući delovi ili bispecifični vezujući molekul iz pronalaska, pogodni su da budu primenjeni kao formulacija povezana sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, npr., kao što je opisano ispod.
[0166] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska sadržaće jedno ili više anti-TIM-3 antitela ili vezujućih delova, ili bispecifičnih vezujućih molekula, iz pronalaska, npr., jedno ili dva anti-TIM-3 antitela ili vezujuća dela, ili bispecifična vezujuća molekula. U jednom otelotvorenju, kompozicija sadrži jedno anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska ili njegov vezujućih deo.
[0167] Farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedno anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, npr., jedno anti-TIM-3 antitelo ili deo, ili jedan bispecifični vezujući molekul, i jedno ili više dodatnih antitela koja ciljaju jedan ili više relevantnih receptora ćelijske površine, npr., jedan ili više relevantnih receptora karcinoma.
[0168] Termin „ekscipijens“ ovde se koristi da opiše bilo koji sastojak koji nije jedinjenje iz pronalaska. Izbor ekscipijenasa će u velikoj meri zavisiti od činilaca kao što je konkretni način primene, efekat ekscipijensa na rastvorljivost i stabilnost, i priroda doznog oblika. Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ uključuje sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Neki od primera za farmaceutski prihvatljive ekscipijense su voda, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, dekstroza, glicerol, etanol, i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Dodatni primeri za farmaceutski prihvatljive supstance
4
su kvašljivci ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su kvašljivci ili emulgatori, konzervansi ili puferi, koji produžavaju rok trajanja ili delotvornost antitela.
[0169] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska i postupci za njihovu pripremu biće očigledni stručnjacima. Takve kompozicije i postupci za njihovu pripremu mogu se naći, na primer, u publikaciji Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. izdanje (Mack Publishing Company, 1995). Farmaceutske kompozicije su poželjeno proizvedene prema uslovima DPP-a (dobre proizvođačke prakse).
[0170] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može da se pripremi, pakuje, ili prodaje u rasutom stanju, kao jedinična doza, ili kao više jediničnih doza. Kako se ovde koristi, „jedinična doza“ je diskretna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka je generalno jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi bila data ispitaniku ili pogodna frakcija takve doze kao što je, na primer, jedna polovina ili jedna trećina takve doze.
[0171] Bilo koji postupak za primenu peptida, proteina ili antitela prihvaćen u struci može pogodno da se upotrebi za antitela i antigen-vezujuće delove iz pronalaska.
[0172] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska su tipično pogodne za parenteralnu primenu. Kao što se ovde koristi, „parenteralna primena“ farmaceutske kompozicije uključuje svaki način primene okarakterisan fizičkim probijanjem tkiva ispitanika i primenom farmaceutske kompozicije kroz pukotinu u tkivu, tako generalno dovodeći do direktne primene u krvotok, u mišić, ili u unutrašnji organ. Parenteralna primena tako uključuje, ali nije ograničena na primenu farmaceutske kompozicije putem injektovanja kompozicije, primenom kompozicije kroz hirurški rez, primenom kompozicije kroz nehiruršku ranu koja prodire u tkivo, i slično. Konkretno, smatra se da parenteralna primena uključuje, ali nije ograničena na, supkutanu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intrasternalnu, intravensku, intraarterijsku, intratekalnu, intraventrikularnu, intrauretralnu, intrakranijalnu i intrasinovijalnu injekciju ili infuziju; i tehnike dijalitičke bubrežne infuzije. Takođe je razmatrana regionalna perfuzija. Konkretna otelotvorenja uključuju intravenski i supkutani način primene.
[0173] Formulacije farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže aktivni sastojak kombinovan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao što je sterilna voda ili sterilni izotonični fiziološki rastvor. Takve formulacije mogu da se pripreme, pakuju ili prodaju u obliku pogodnom za bolusnu primenu ili za kontinualnu primenu. Injektabilne formulacije mogu da se pripreme, pakuju ili prodaju u jediničnom doznom obliku, kao što je u ampulama ili višedoznim kontejnerima koji sadrže konzervans. Formulacije za parenteralnu primenu uključuju, bez ograničenja, suspenzije, rastvore, emulzije u uljanom ili vodenom vehikulumu, paste, i slično. Takve formulacije mogu dalje da sadrže jedan ili više dodatnih sastojaka uključujući, bez ograničenja, agense za suspendovanje, stabilizaciju ili dispergovanje. U jednom otelotvorenju formulacije za parenteralnu primenu, aktivni sastojak je obezbeđen u suvom obliku (tj. prašak ili granule) za rekonstituciju pogodnim vehikulumom (npr. sterilna voda bez pirogena) pre parenteralne primene rekonstituisane kompozicije. Parenteralne formulacije takođe uključuju vodene rastvore koji mogu da sadrže ekscipijense kao što su soli, ugljeni hidrati i sredstva za puferovanje (poželjno do pH od 3 do 9), ali, za neke primene, mogu biti pogodnije formulisani kao sterilni nevodeni rastvor ili kao suvi oblik koji se koristi u kombinaciji sa pogodnim vehikulumom, kao što je sterilna voda bez pirogena. Primeri oblika za parenteralnu primenu uključuju rastvore ili suspenzije u sterilnim vodenim rastvorima, na primer, vodeni propilen glikol ili rastvore dekstroze. Takvi dozni oblici mogu biti po želji pogodno puferovani. Druge korisne formulacije za parenteralnu primenu uključuju one koje sadrže aktivni sastojak u mikrokristalnom obliku, ili u lipozomskom preparatu. Formulacije za parenteralnu primenu mogu biti formulisane da budu sa trenutnim i/ili modifikovanim oslobađanjem. Formulacije sa modifikovanim oslobađanjem uključuju odloženo, produženo, impulsno, kontrolisano, ciljano i programirano oslobađanje.
[0174] Na primer, u jednom aspektu, sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme inkorporisanjem anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, bispecifičnog vezujućeg molekula, ili kompozicije anti-TIM-3 antitela u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač, sa jednim sastojkom ili kombinacijom sastojaka nabrojanih iznad, po potrebi, a zatim sterilnom filtracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuum sušenje i liofilizacija, koji daju prah aktivnog sastojka i svakog dodatnog željenog sastojka iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Odgovarajuća fluidnost rastvora može, na primer, da se održi upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanta. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se postigne uključivanjem u kompoziciju sredstva koje usporava apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina, i/ili primenom obloga za modifikovano oslobađanje (npr., obloga za usporeno oslobađanje).
[0175] Antitela iz pronalaska mogu da se primene intranazalno ili inhalacijom, obično u obliku suvog praška (bilo sama, kao smeša, ili kao čestica mešanih komponenata, na primer, pomešana sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom) iz inhalatora za suvi prašak, kao aerosol sprej iz kontejnera pod pritiskom, pumpe, raspršivača, atomizera (poželjno atomizera koji koristi elektrohidrodinamiku za dobijanje fine izmaglice), ili nebulizatora, uz upotrebu odgovarajućeg propelanta ili bez njega, ili kao kapi za nos.
[0176] Kontejner pod pritiskom, pumpa, raspršivač, atomizer ili nebulizator generalno sadrže rastvor ili suspenziju antitela iz pronalaska koja sadrži, na primer, pogodno sredstvo za dispergovanje, solubilizaciju, ili produženo oslobađanje aktivne, propelanta kao rastvarač.
[0177] Pre primene u formulaciji suvog praška ili suspenzije, lekoviti proizvod se generalno mikronizuje do veličine pogodne za isporuku inhalacijom (obično manje od 5 mikrona). To se može postići bilo kojim pogodnim postupkom usitnjavanja, kao što je mlevenje spiralnim mlazom, mlevenje mlazom u fluidizovanom sloju, obrada superkritičnog fluida za dobijanje nanočestica, homogenizacija pod visokim pritiskom, ili sušenje raspršivanjem.
[0178] Kapsule, blisteri i patrone koji se koriste u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisani da sadrže smešu praška jedinjenja iz pronalaska, pogodnu praškastu bazu i modifikator svojstava.
[0179] Pogodna formulacija rastvora za upotrebu u atomizeru koristeći elektrohidrodinamiku za proizvodnju fine izmaglice može da sadrži pogodnu dozu antitela iz pronalaska po aktiviranju, a zapremina po aktiviranju može, na primer, da varira od 1 µl do 100 µl.
[0180] U formulacije iz pronalaska namenjene za inhalaciju/intranazalnu primenu, mogu se dodati pogodne arome, kao što je mentol i levomentol, ili zaslađivači, kao što je saharin ili saharin natrijum.
[0181] Formulacije za inhalaciju/intranazalnu primenu mogu da se formulišu da budu sa trenutnim i/ili modifikovanim oslobađanjem. Formulacije sa modifikovanim oslobađanjem uključuju odloženo, produženo, impulsno, kontrolisano, ciljano i programirano oslobađanje.
[0182] U slučaju inhalatora suvog praška i aerosola, jedinična doza se određuje pomoću ventila koji isporučuje odmerenu količinu. Uređaj prema pronalasku se obično podesi da isporuči odmerenu dozu ili „udisaj“ antitela iz pronalaska. Ukupna dnevna doza će obično da se daje u jednoj dozi ili, češće, kao podeljena doza tokom dana.
[0183] Antitela i delovi antitela iz pronalaska takođe mogu biti formulisani za oralni način primene. Oralna primena može da obuhvati gutanje, tako da jedinjenje uđe u gastrointestinalni trakt, i/ili bukalnu, lingvalnu, ili sublingvalnu primenu kojom jedinjenje ulazi u krvotok direktno iz usta.
[0184] Formulacije pogodne za oralnu primenu uključuju čvrste, polučvrste i tečne sisteme, kao što su tablete; meke ili tvrde kapsule koje sadrže multi- ili nanočestice, tečnosti, ili praškove; lozenge (uključujući one ispunjene tečnošću); tablete za žvakanje; gelove; brzo dispergujuće dozne oblike; filmove; ovule; sprejeve; i bukalne/mukoadhezivne flastere.
[0185] Tečne formulacije uključuju suspenzije, rastvore, sirupe i eliksire. Takve formulacije mogu da se upotrebe kao punioci u mekim ili tvrdim kapsulama (napravljenim, na primer, od želatina ili hidroksipropil metil celuloze) i obično sadrže nosač, na primer, vodu, etanol, polietilan glikol, propilen glikol, metil celulozu ili pogodno ulje, i jedan ili više emulgatora i/ili agenasa za suspendovanje. Tečne formulacije takođe mogu da se pripreme rekonstitucijom čvrste supstance, na primer, iz kesice.
Terapeutska primena antitela i kompozicija iz pronalaska
[0186] U jednom aspektu, anti-TIM-3 antitela i njihovi antigen-vezujući delovi, anti-TIM-3 kompozicije, i bispecifični vezujući molekuli iz pronalaska se upotrebljavaju za pojačavanje ili aktiviranje imunskog sistema kod čoveka kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, pacijent ima stanje okarakterisano prekomernom ekspresijom ili prekomernom aktivnošću TIM-3 ili bilo kog od njegovih liganada. U nekim otelotvorenjima, pacijent ima imunosupresiju. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kompozicija ili bispecifični vezujući molekul se upotrebljavaju u lečenju raka, npr., malignih tumora koji potiču od tkiva kao što je koža, pluća, creva, jajnik, mozak, prostata, bubreg, meka tkiva, hematopoetski sistem, glava i vrat, jetra, bešika, dojka, želudac, materica i pankreas, i svih malignih tumora ili drugih stanja koja se oslanjaju na aktivnost TIM-3 i/ili kod kojih pacijent eksprimira ili prekomerno eksprimira galektin-9, fosfatidil serin, CEACAM-1 i/ili HMGB-1. Maligni tumori lečeni anti-TIM-3 antitelima, njihovim antigen-vezujućim delovima, kompozicijama anti-TIM-3 antitela i/ili bispecifičnim vezujućim molekulima iz pronalaska mogu da uključuju, npr., melanom, nemikrocelularni karcinom pluća, kolorektalni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, leukemiju (npr., akutnu mijeloidnu leukemiju), i solidne tumore (npr., uznapredovali ili metastatski solidni tumor).
[0187] U nekim otelotvorenjima, maligni tumori lečeni anti-TIM-3 antitelima, antigenvezujućim delovima, kompozicijama anti-TIM-3, i/ili bispecifičnim vezujućim molekulima iz pronalaska mogu da uključuju, npr., melanom (npr., uznapredovali ili metastatski melanom), nemikrocelularni karcinom pluća, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, karcinom bubrežnih ćelija, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom, glioblastom, gliom, karcinom skvamoznih ćelija pluća, mikrocelularni karcinom pluća, hepatocelularni karcinom, karcinom bešike, karcinom gornjeg urinarnog trakta, karcinom ezofagusa, karcinom gastroezofagealnog spoja, karcinom želuca, karcinom jetre, karcinom kolona, kolorektalni karcinom, multipli mijelom, sarkome, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, mijelodisplastični sindrom, karcinom nazofarinksa, hroničnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, limfom malih limfocita, karcinom jajnika, gastrointestinalni karcinom, primarni peritonealni karcinom, karcinom jajovoda, karcinom mokraćne bešike, leukemiju/limfom T-ćelija povezan sa HTLV, karcinom prostate, genitourinarni karcinom, meningiom, karcinom adrenalnog korteksa, gliosarkom, fibrosarkom, karcinom bubrega, karcinom dojke, karcinom pankreasa, karcinom endometrijuma, karcinom bazalnih ćelija kože, karcinom apendiksa, karcinom bilijarnog trakta, karcinom pljuvačne žlezde, uznapredovali karcinom Merkelovih ćelija, difuzni B- krupnoćelijski limfom, folikularni limfom, mezoteliom, i solidne tumore.
[0188] Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kompozicija ili bispecifični vezujući molekul može da se upotrebljava u lečenju virusnih i/ili parazitskih infekcija, npr., kada patogeni inhibiraju imunski odgovor domaćina.
[0189] „Lečiti“, „lečenje“ i „tretman“ odnosi se na postupak ublažavanja ili otklanjanja biološkog poremećaja i/ili barem jednog od njegovih pratećih simptoma. Kao što se ovde koristi, „ublažiti“ bolest, poremećaj ili stanje znači umanjiti ozbiljnost i/ii učestalost javljanja simptoma bolesti, poremećaja ili stanja. Nadalje, ovde pominjanje „lečenja“ upućuje na kurativno, palijativno i profilaktičko lečenje.
[0190] „Terapeutski delotvorna količina“ odnosi se na količinu terapeutskog agensa koja se daje, a koja će u određenoj meri olakšati jedan ili više simptoma poremećaja koji se leči. Terapeutski delotvorna količina leka protiv raka može, na primer, da utiče na smanjenje tumora, povećano preživljavanje, uklanjanje ćelija raka, smanjeno napredovanje bolesti, preokretanje metastaza, ili druge kliničke krajnje tačke koje žele zdravstveni stručnjaci.
[0191] Kompozicije antitela ili antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi iz pronalaska mogu da se primenjuju sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova ili antitela (ili kao bilo koja njihova kombinacija). Farmaceutske kompozicije, postupci i primene iz pronalaska tako mogu da obuhvate otelotvorenja kombinacija (zajedničku primenu) sa drugim aktivnim agensima, kao što je dole detaljno objašnjeno.
[0192] Kao što se ovde koriste, termini „zajednička primena“, „zajednički primenjen“ i „u kombinaciji sa“, koji upućuju na kompozicije antitela, antitela i njihove antigen-vezujuće delove, i bispecifične vezujuće molekule iz pronalaska sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa, znače, odnose se na, i uključuju sledeće:
• istovremenu primenu takve kombinacije kompozicije antitela / antitela / antigenvezujućeg dela / bispecifičnog vezujućeg molekula iz pronalaska sa terapeutskim agensom (agensima) na pacijentu kome je potrebno lečenje, kada su takve komponente formulisane zajedno u jedan dozni oblik koji oslobađa pomenute komponente suštinski u isto vreme kod tog pomenutog pacijenta,
• suštinski istovremenu primenu takve kombinacije kompozicije antitela / antitela / antigen-vezujućeg dela / bispecifičnog vezujućeg molekula iz pronalaska sa terapeutskim agensom (agensima) na pacijentu kome je potrebno lečenje, kada su takve komponente formulisane odvojeno jedna od druge u posebne dozne oblike koje pomenuti pacijent uzima suštinski u isto vreme, pri čemu se pomenute komponente oslobađaju suštinski u isto vreme kod tog pomenutog pacijenta,
• rednu primenu takve kombinacije kompozicije antitela / antitela / antigen-vezujućeg dela / bispecifičnog vezujućeg molekula iz pronalaska sa terapeutskim agensom (agensima) na pacijentu kome je potrebno lečenje, kada su takve komponente formulisane odvojeno jedna od druge u posebne dozne oblike koje pomenuti pacijent uzima u uzastopnim terminima sa značajnim intervalom između svake primene, pri čemu se pomenute komponente oslobađaju suštinski u različito vreme kod pomenutog pacijenta; i
• rednu primenu takve kombinacije kompozicije antitela / antitela / antigen-vezujućeg dela / bispecifičnog vezujućeg molekula iz pronalaska sa terapeutskim agensom (agensima) na pacijentu kome je potrebno lečenje, kada su takve komponente formulisane zajedno u jedan dozni oblik koji kontrolisano oslobađa pomenute komponente, pri čemu se one oslobađaju istovremeno, uzastopno i/ili sa preklapanjem termina kod pomenutog pacijenta, pri čemu svaki deo može da se primeni istim ili različitim načinom primene.
[0193] Kompozicije antitela, antitela i njihovi antigen-vezujući delovi, i bispecifični vezujući molekuli iz pronalaska mogu da se primenjuju bez dodatnih terapeutskih tretmana, tj., kao samostalna terapija. Alternativno, lečenje kompozicijama antitela i antitelima i njihovim antigen-vezujućim delovima iz pronalaska može da uključuje najmanje jedan dodatni terapeutski tretman (kombinovana terapija). U nekim otelotvorenjima, kompozicija antitela ili antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može da se primeni zajedno sa drugim medikamentom/lekom za lečenje raka, ili da se sa njim formuliše. Dodatni terapeutski tretman može da obuhvata, npr., hemioterapeutik, antineoplastični ili antiangiogeni agens, različito antitumorsko antitelo i/ili terapiju zračenjem.
[0194] Kombinovanjem kompozicija antitela, antitela ili antigen-vezujućih delova, ili bispecifičnih vezujućih molekula iz pronalaska sa agensima za koje se zna da indukuju terminalnu diferencijaciju ćelija raka, efekat može dodatno da se poboljša. Takva jedinjenja mogu, na primer, da se odaberu iz grupe koja se sastoji od retinolne kiseline, trans-retinolne kiseline, cis-retinolne kiseline, fenil butirata, faktora rasta nerva, dimetil sulfoksida, aktivnog
1
oblika vitamina D3, gama receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma, 12-O-tetradekanoilforbol 13-acetata, heksametilen-bis-acetamida, transformišućeg faktora rasta-beta, buterne kiseline, cikličnog AMP i vesnarinona. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od retinolne kiseline, fenil butirata, sve-trans-retinolne kiseline i aktivnog oblika vitamina D.
[0195] Farmaceutski proizvodi koji sadrže kompoziciju anti-TIM-3 antitela, anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, ili bispecifični vezujući molekul iz pronalaska i najmanje jedan drugi agens (npr., hemioterapeutski, antineoplastični ili antiangiogeni agens) mogu da se koriste kao kombinovano lečenje za istovremenu, odvojenu ili sukcesivnu primenu u terapiji raka. Drugi agens može biti bilo koji agens pogodan za lečenje konkretnog raka o kome se radi, na primer, agens odabran iz grupe koja se sastoji od alkilujućih agenasa, npr., derivata platine kao što je cisplatin, karboplatin i/ili oksaliplatin; biljnih alkaloida, npr., paklitaksela, docetaksela i/ili irinotekana; antitumorskih antibiotika, npr., doksorubicina (adrijamicin), daunorubicina, epirubicina, idarubicina mitoksantrona, daktinomicina, bleomicina, aktinomicina, luteomicina i/ili mitomicina; inhibitora topoizomeraze kao što je topotekan; i/ili antimetabolita, npr., fluorouracila i/ili drugih fluoropirimidina.
[0196] Anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, bispecifični vezujući molekul, ili kompozicija anti-TIM-3 antitela iz pronalaska takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim antitumorskim terapijama, kao što su vakcine, citokini, inhibitori enzima i terapija T ćelijama. U slučaju vakcina, to može biti, npr., proteinska, peptidna ili DNK vakcina koja sadrži jedan ili više antigena relevantnih za lečenje raka, ili vakcina koja uz antigen sadrži dendritske ćelije. Pogodni citokini, na primer, uključuju IL-2, IFN-gama i GM-CSF. Primer za vrstu inhibitora enzima koji ima antitumorsku aktivnost je inhibitor indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO), na primer, 1-metil-D-triptofan (1-D-MT). Adoptivna terapija T ćelijama upućuje na razne tehnike imunoterapije koje uključuju širenje ili inženjerstvo pacijentovih sopstvenih T ćelija kako bi prepoznale i napale svoje tumore.
[0197] Takođe je razmatrano da anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, bispecifični vezujući molekul, ili kompozicija anti-TIM-3 antitela iz pronalaska mogu da se koriste u pomoćnoj terapiji u vezi sa inhibitorima tirozin kinaze. Postoje sintetički molekuli male molekulske mase, uglavnom dobijeni od hinazolina, koji interaguju sa intracelularnim
2
domenom tirozin kinaze receptora i inhibiraju fosforilaciju indukovanu receptorom, takmičeći se za intracelularno mesto vezivanja Mg-ATP.
[0198] U nekim otelotvorenjima, kompozicija antitela, bispecifični vezujući molekul, ili antitelo ili njegov antigen-vezujući deo mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim medikamentom/lekom koji posreduje u aktivaciji imunskog sistema, uključujući, bez ograničenja, agens koji posreduje u ekspresiji ili aktivaciji A2AR, BLTA, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, CD27, CD28, CD39, CD40, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM (npr., CEACAM-1 i/ili CEACAM-5), galektina-9, GITR, HVEM, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, LAG-3, NKG2A, OX40, PD-1/PD-L1/PD-L2, TIGIT, TGFR-beta, TNFR2, VISTA i/ili 2B4. U nekim otelotvorenjima, agens je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za jedan od gornjih molekula.
[0199] U nekim aspektima, antitela i antigen-vezujući delovi, kompozicije, i bispecifični vezujući molekuli iz pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim inhibitorom TIM-3 puta, koji može da cilja TIM-3 ili jedan ili više od njegovih liganada. Primeri za takve inhibitore uključuju druga anti-TIM-3 antitela i antitela koja ciljaju ligande TIM-3 i/ili koreceptore, kao što je galektin-9, HMGB-1, fosfatidil serin lipidi, CEACAM1, LILRA1-6 ili LILRB1-5.
[0200] Podrazumeva se da kompozicije antitela, bispecifični vezujući molekuli, i antitela i njihovi antigen-vezujući delovi iz pronalaska mogu da se koriste za lečenje kao što je ovde opisano.
Doziranje i način primene
[0201] Kompozicije antitela iz pronalaska primenjivaće se u delotvornoj količini za lečenje stanja o kome je reč, tj., u dozi i periodima potrebnim da se dobije željeni rezultat. Terapeutski delotvorna količina može da varira u zavisnosti od faktora kao što je konkretno stanje koje se leči, starost, pol i težina pacijenta, i od toga da li se antitela primenjuju kao samostalno lečenje ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih antitumorskih lečenja.
[0202] Dozni režimi mogu da se podese da bi se obezbedio optimalan željeni odgovor. Na primer, može se dati jedan bolus, više podeljenih doza se može dati tokom vremena, ili se doza može srazmerno smanjiti ili povećati, kako je naznačeno potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno da se formulišu parenteralne kompozicije u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i ravnomernog doziranja. Jedinični dozni oblik, kao što se ovde koristi, upućuje na fizički diskretne jedinice pogodne za pojedinačne doze za pacijente/ispitanike koje treba lečiti; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da proizvede željeni terapeutski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jedinične dozne oblike generalno su uslovljene i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika hemioterapeutskog agensa i konkretnog terapeutskog ili profilaktičkog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja vezanih za struku izrade jedinjenja, kao što je aktivno jedinjenje za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0203] Tako, vešt stručnjak će znati, na osnovu ovde objavljenih otkrića, da se doza i dozni režim podešavaju prema postupcima dobro poznatim u oblasti terapeutike. Odnosno, lako može da se odredi maksimalna podnošljiva doza, i takođe može da se odredi delotvorna količina koja pacijentu obezbeđuje primetnu terapeutsku korist, kao i vremenski zahtevi za primenu svakog agensa koji pacijentu obezbeđuju primetnu terapeutsku korist. Prema tome, mada su ovde navedeni primeri za neke doze i načine primene, ti primeri ni na koji način ne ograničavaju dozu i način primene koji se mogu obezbediti pacijentu tokom primene predmetnog pronalaska.
[0204] Treba zapaziti da vrednosti doze mogu da variraju u zavisnosti od vrste i ozbiljnosti stanja koje se ublažava, i mogu da uključuju pojedinačne i višestruke doze. Nadalje, podrazumeva se da za bilo kog konkretnog ispitanika treba podesiti specifični dozni režim tokom vremena u skladu sa individualnim potrebama i stručnom procenom osobe koja daje ili nadgleda davanje kompozicija, i da ovde prikazani dozni opsezi predstavljaju samo primer, i ne treba da ograniče obim ili primenu kompozicije iz otelotvorenja. Nadalje, dozni režim sa kompozicijama iz pronalaska može da bude na bazi raznih faktora, uključujući vrstu bolesti, starost, težinu, pol, medicinsko stanje pacijenta, ozbiljnost stanja, način primene i konkretno upotrebljeno antitelo. Tako, dozni režim može mnogo da varira, ali se može rutinski odrediti standardnim postupcima. Na primer, doze mogu da se prilagode na osnovu farmakokinetičkih ili farmakodinamičkih parametara, koji mogu da uključuju kliničke efekte, kao što su toksični efekti i/ili laboratorijske vrednosti. Tako predmetni pronalazak obuhvata dozu eskalacije za jednog pacijenta koju određuje vešt stručnjak. Određivanje odgovarajućih doza i režima je dobro poznato u relevantnoj struci, i podrazumeva se da ih usvaja vešt stručnjak nakon ovde objavljenih pouka.
4
[0205] Razmatra se da je pogodna doza kompozicije antitela iz pronalaska u opsegu od 0,1– 100 mg/kg, kao oko 0,5–50 mg/kg, npr., oko 1–20 mg/kg. Kompozicija antitela može, na primer, da se primeni u dozi od najmanje 0,25 mg/kg, npr., najmanje 0,5 mg/kg, kao što je najmanje 1 mg/kg, npr., najmanje 1,5 mg/kg, kao što je najmanje 2 mg/kg, npr., najmanje 3 mg/kg, kao što je najmanje 4 mg/kg, npr., najmanje 5 mg/kg; i npr., najviše do 50 mg/kg, kao što je najviše do 30 mg/kg, npr., najviše do 20 mg/kg, kao što je najviše do 15 mg/kg. Primena će se normalno ponavljati u pogodnim intervalima, npr. jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, ili jednom u četiri nedelje, i onoliko dugo koliko nadležni lekar proceni da je prikladno, pri čemu on opciono može da poveća ili smanji dozu po potrebi.
[0206] Delotvorna količina za terapiju tumora može da se odredi preko sposobnosti da stabilizuje napredovanje bolesti i/ili poboljša simptome kod pacijenta, i poželjno da preokrene napredovanje bolesti, npr., smanjenjem veličine tumora. Sposobnost antitela, antigenvezujućeg dela, bispecifičnog vezujućeg molekula ili kompozicije antitela iz pronalaska da inhibira rak može se proceniti in vitro testovima, npr., kao što je opisano u primerima, kao i na pogodnim životinjskim modelima koji predviđaju efikasnost tumora kod čoveka. Pogodni dozni režimi će biti odabrani da bi se obezbedio optimalni terapeutski odgovor u svakoj konkretnoj situaciji, na primer, primenjeno kao jedan bolus ili kao kontinualna infuzija, i sa mogućim podešavanjem doze, kako je naznačeno potrebama svakog slučaja.
Dijagnostička upotreba i kompozicije
[0207] Antitela i antigen vezujući delovi iz predmetnog pronalaska takođe su korisni u dijagnostičkim procesima (npr., in vitro, ex vivo). Na primer, antitela i delovi mogu da se koriste da se detektuje i/ili izmeri nivo TIM-3 u uzorku pacijenta (npr., uzorak tkiva, ili uzorak telesne tečnosti kao što je inflamatorni eksudat, krv, serum, tečnost iz creva, pljuvačka ili urin). Pogodni postupci za detekciju i merenje uključuju imunološke postupke, kao što je protočna citometrija, test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), hemiluminescentni testovi, radioimunološki testovi i imunohistologija. Pronalazak dalje obuhvata komplete (npr., komplete za dijagnostiku) koji sadrže antitela i antigen-vezujuće delove koji su ovde opisani.
[0208] Ako ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom imaće značenja koja obično podrazumevaju stručnjaci sa prosečnim znanjem u oblasti. Primeri za metode i materijale su opisani u nastavku, mada u praktičnoj primeni ili testovima predmetnog pronalaska takođe mogu da se koriste metodi i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani. U slučaju neusaglašenosti, prednost ima predmetna specifikacija, uključujući definicije.
[0209] Generalno, ovde opisana nomenklatura i tehnike koji se koriste u vezi sa kulturama ćelija i tkiva, molekulskom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom, analitičkom hemijom, sintetskom organskom hemijom, medicinskom i farmaceutskom hemijom, i hemijom proteina i nukleinskih kiselina i hibridizacijom, dobro su poznate i uobičajeno se koriste u struci. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prema specifikacijama proizvođača, kao što se to obično radi u struci ili kao što je ovde opisano.
[0210] Nadalje, ako kontekst ne nalaže drugačije, termini u jednini uključuju množinu, i termini u množini uključuju jedninu. U specifikaciji i otelotvorenjima, podrazumeva se da reči „imati“ i „sadržati“, ili njihove varijacije, kao „ima“, „koji ima“, „sadrži“ ili „koji sadrži“ ukazuju na uključivanje navedenog celog broja ili grupe celih brojeva, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili grupe celih brojeva.
[0211] Mada je ovde navedeno više dokumenata, ovaj citat ne predstavlja priznanje da bilo koji od ovih dokumenata čini deo opšteg znanja u struci.
[0212] Kako bi se pronalazak bolje razumeo, dati su sledeći primeri.
PRIMERI
Primer 1: Kloniranje anti-TIM-3 antitela iz B ćelija pacova
[0213] Ovaj primer opisuje postupak korišćen za dobijanje anti-humanih TIM-3 antitela iz pronalaska. Takođe su obezbeđene DNK i aminokiselinske sekvence antitela.
Materijali i metode
[0214] Anti-TIM-3 antitela iz pronalaska su izolovana iz repertoara antitela dobijenog od pacova OmniRat® (Osborn et al., J Immunol.190(4):1481-90 (2013)), soja pacova kompanije OMT (Open Monoclonal Technology, Inc.) koji proizvodi antitela sa kompletno humanim idiotipovima. Kloniranje gena antitela dobijenih od pacova iz B ćelija koje luče antitelo (ASC) sortiranih iz jedne ćelije izvedeno je pomoću tehnologije za otkrivanje antitela Symplex™ (Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)).
[0215] Biblioteka antitela Symplex™ pripremljena je iz B ćelija sortiranih iz jedne ćelije, od imunizovanih pacova OmniRat®, pri čemu biblioteka sadrži srodne parove koji kodiraju VH i VL za svaku sortiranu B ćeliju. Konstrukti repertoara antitela koji kodiraju kompletno humane imunoglobuline u formatu IgG1 ili IgG2 transficirani su u Expi293 ćelije, i ćelijski supernatanti su skrinirani na vezujuća svojstva u visokoprotočnom formatu. Pogoci dobijeni skriningom analizirani su sekvenciranjem DNK, i ekstrahovane su sekvence DNK koje kodiraju antitelo. Odabrani klonovi antitela su eksprimirani i funkcionalno ispitani kako je opisano u nastavku. U tabeli 1 prikazani su varijabilni domeni teškog i lakog lanca sekvence nukleinske kiseline klona antitela 15086.15086. U tabeli 2 prikazane su aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca za pomenuti klon antitela, a u tabeli 4 prikazane su aminokiselinske sekvence CDR-a teškog i lakog lanca. U tabeli 3 prikazane su aminokiselinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca IgG1 i konstantnog regiona kapa lakog lanca.
[0216] Usled upotrebe degenerisanih prajmera u Symplex™ kloniranju fragmenata cDNK koji kodiraju antitelo, ispravljen je niz besmislenih mutacija na amino terminusima teškog i lakog lanca za neka antitela (npr., antitela 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144). U tabeli 5 prikazane su sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca na nivou DNK iz optimizovanog antitela označenog sa 15086.16837, 15086.17145 ili 15086.17144 (te tri varijante se razlikuju po podtipu izotipa, ali imaju identične sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca). Proces optimizacije uključuje uklapanje korekcije amino terminusa sa germinativnom linijom, kao i optimizaciju upotrebe kodona. Ciljevi za uklapanje sa sekvencama humane germinativne linije su IGHV4-31 za varijabilne domene teškog lanca i IGKV3-11 za varijabilne domene lakog lanca.
[0217] Identifikovana su dodatna antitela koja definišu različite binove epitopa. Sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca ovih antitela prikazane su u tabeli 9 i tabeli 10. Identifikovana su dodatna funkcionalna antitela, i njihove sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca prikazane su u tabeli 12 i tabeli 13.
Rezultati
[0218] U tabeli 1 prikazane su sekvence DNK koje kodiraju antitelo 15086.15086 klonirano tehnologijom Symplex™.
Tabela 1: Sekvence DNK varijabilnih domena antitela 15086.15086 kloniranog tehnologijom Symplex™
[0219] U tabeli 2 prikazane su sekvence proteina izvedene iz originalnog antitela 15086.15086 kloniranog tehnologijom Symplex™. CDR-i su prikazani podebljano i u kurzivu.
Tabela 2: Sekvence proteina varijabilnih domena antitela 15086.15086 kloniranog tehnologijom Symplex™
[0220] U tabeli 3 prikazani su konstantni regioni teškog i lakog lanca.
Tabela 3: Sekvence proteina konstantnog regiona
[0221] U tabeli 4 prikazani su regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) teškog i lakog lanca koje dele antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144. Ovde su sekvence CDR određene prema IMGT® definicijama za CDR1 i CDR2. Za CDR3 teškog i lakog lanca, definicije ovde uključuju jedan dodatni aminokiselinski ostatak ushodno od IMGT-CDR3 (Cys) i jedan dodatni aminokiselinski ostatak nishodno (Trp za VH CDR3, Phe za VL CDR3).
Tabela 4: Sekvence proteina CDR-a antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144
[0222] U tabeli 5 prikazane su optimizovane sekvence DNK koje kodiraju varijabilne domene teškog i lakog lanca koje dele antitela 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144.
Tabela 5: Optimizovane sekvence DNK koje kodiraju varijabilne domene antitela 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144
[0223] U tabeli 6 prikazane su izvedene sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca proteina koje dele antitela 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144. CDR-i su prikazani podebljano i u kurzivu. Zapazićete da je sekvenca VL proteina ista kao sekvenca neoptimizovanog VL proteina.
Tabela 6: Proteinske sekvence varijabilnih domena optimizovanih antitela 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144
[0224] U tabeli 7 prikazane su sekvence DNK koje kodiraju konstantne regione antitela u različitim formatima izotipa.
Tabela 7: Sekvence DNK koje kodiraju konstantne regione antitela u različitim formatima izotipa
1
2
[0225] U tabeli 8 prikazane su sekvence proteina konstantnih regiona antitela u različitim formatima izotipa.
Tabela 8: Sekvence proteina konstantnih regiona antitela u različitim formatima izotipa
4
[0226] U tabeli 9 prikazane su sekvence DNK koje kodiraju varijabilne domene teškog i lakog lanca anti-TIM-3 antitela korišćenih za binovanje epitopa.
Tabela 9: Sekvence DNK varijabilnih domena anti-TIM-3 antitela za binovanje
SEQ ID
Ab Sekvenca (5' do 3')
NO:
SEQ ID
Ab Sekvenca (5' do 3')
NO:
SEQ ID
Ab Sekvenca (5' do 3')
NO:
[0227] U tabeli 10 prikazane su izvedene sekvence proteina varijabilnog domena teškog i lakog lanca anti-TIM-3 antitela korišćenih za binovanje epitopa. CDR-i su prikazani podebljano i u kurzivu.
Tabela 10: Sekvence proteina varijabilnih domena anti-TIM-3 antitela za binovanje SEQ ID
Ab Sekvenca (od N-terminusa do C-terminusa)
NO:
SEQ ID
Ab Sekvenca (od N-terminusa do C-terminusa)
NO:
1
[0228] U tabeli 11 prikazani su CDR-i anti-TIM-3 antitela za binovanje. SEQ ID NO za CDR-e prikazane su ispod svake sekvence. Ovde su sekvence CDR određene prema IMGT® definicijama za CDR1 i CDR2. Za CDR3 teškog i lakog lanca, definicije ovde uključuju jedan dodatni aminokiselinski ostatak ushodno od IMGT-CDR3 (Cys) i jedan dodatni aminokiselinski ostatak nishodno (Trp za VH CDR3, Phe za VL CDR3).
1 1
[0229] U tabeli 12 prikazane su sekvence DNK koje kodiraju varijabilne domene teškog i lakog lanca dodatnih anti-TIM-3 antitela identifikovanih kao funkcionalna antitela. Sekvence za funkcionalna antitela 20131 i 20293 prikazane su u tabeli 9 iznad.
Tabela 12: Sekvence DNK varijabilnih domena dodatnih funkcionalnih anti-TIM-3 antitela
1 2
SEQ ID
Ab Sekvenca (5' do 3')
NO:
1 SEQ ID
Ab Sekvenca (5' do 3')
NO:
[0230] U tabeli 13 prikazane su izvedene sekvence proteina varijabilnih domena teškog i lakog lanca dodatnih anti-TIM-3 antitela identifikovanih kao funkcionalna antitela. CDR-i su prikazani podebljano i u kurzivu. Sekvence za funkcionalna antitela 20131 i 20293 prikazane su u tabeli 10 iznad.
Tabela 13: Sekvence proteina varijabilnih domena dodatnih funkcionalnih anti-TIM-3 antitela
1 4
SEQ
Ab Sekvenca (od N-terminusa do C-terminusa)
ID NO:
[0231] U tabeli 14 prikazani su CDR-i dodatnih funkcionalnih anti-TIM-3 antitela. SEQ ID NO za CDR-e prikazane su ispod svake sekvence. Ovde su sekvence CDR određene prema IMGT® definicijama za CDR1 i CDR2. Za CDR3 teškog i lakog lanca, definicije ovde uključuju jedan dodatni aminokiselinski ostatak ushodno od IMGT-CDR3 (Cys) i jedan dodatni aminokiselinski ostatak nishodno (Trp za VH CDR3, Phe za VL CDR3). Sekvence za funkcionalna antitela 20131 i 20293 prikazane su u tabeli 11 iznad.
1
Primer 2: Analiza kinetičkog vezivanja antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144
[0232] Ovaj primer pokazuje da afinitet vezivanja antitela 15086.15086 (IgG1), 15086.16837 (IgG1 LALA), 15086.17145 (IgG2) i 15086.17144 (IgG4 (S228P)) pokazuje veoma sličan afinitet vezivanja sa vrednostima KDoko 19–23 nM. „IgG1 LALA“ upućuje na prisustvo „LALA“ mutacija u teškom lancu (L234A/L235A, numeracija prema Eu šemi numeracije (Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA 63:78-85 (1969)) za koje se zna da smanjuju efektorsku funkciju Fc regiona IgG1 antitela (Armour et al., Eur J Immunol. 29(8):2613-24 (1999); Hezareh et al., J Virol. 75(24):12161-68 (2001); i Hessel et al., Nature 449(7158):101-104 (2007)).
Materijali i metode
[0233] Analiza kinetičkog vezivanja izvedena je pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, SAD) u kombinaciji sa Ibis MX96 SPR instrumentom (IBIS Technologies, Holandija). Analiza površinske plazmonske rezonance izvedena je na G-a-hu-IgG Fc
1
SensEye® SPR senzorima (Ssens BV, Holandija). Anti-TIM-3 antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144 razblažena su do 0,15 µg/ml u PBS-T (1x PBS sa 0,05% Tween 20, pH 7,4). Antitela su istačkana na G-a-hu-IgG Fc SensEye® tokom 15 minuta koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter. Nakon istačkavanja, SensEye® je pozicioniran na IBIS MX96 biosenzoru, i kinetička analiza je izvedena primenom takozvane serije kinetičke titracije (Karlsson et al., Anal Biochem. 349(1):136-47 (2006)), u kojoj se monomerni humani TIM-3 ECD antigen (Acro Biosystems) injektuje u rastućoj koncentraciji od 2 nM do 100 nM bez primene koraka površinske regeneracije nakon svakog injektovanja antigena. Asocijacija antigena je izvršena tokom 5 minuta, a disocijacija je izvršena tokom 45 minuta. Zabeleženi odgovori vezivanja uklopljeni su u jednostavni Lengmirov model vezivanja 1:1 pomoću softvera Scrubber 2 radi izračunavanja konstanti brzine asocijacije (kon ili ka), brzine disocijacije (koff ili kd) i afiniteta (KD).
Rezultati
[0234] Kinetička merenja izvršena na sistemu IBIS pokazuju da sva antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144, u četiri različita formata izotipa, imaju veoma sličnu kinetiku vezivanja sa vrednostima KD u opsegu od 19–23 nM (tabela 15).
Tabela 15: Kinetika vezivanja antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.1714 za humani TIM-3 ECD određena površinskom plazmonskom rezonancom (SPR)
1
Primer 3: In vitro funkcionalna procena anti-TIM-3 antitela
[0235] Panel jedinstvenih mAb u potklasi IgG1 kloniran je kao što je opisano iznad (primer 1) i skriniran na funkcionalnu aktivnosti pri jednoj koncentraciji (25 ug/ml) u testu jednosmerne mešane limfocitne reakcije (MLR). Najfunkcionalnije anti-TIM-3 antitelo (15086.15086) preformatirano je u potklasu IgG1 LALA (15086.16837), IgG2 (15086.17145) i IgG4 (15086.17144).
[0236] U ovom primeru prikazana je in vitro funkcionalna aktivnost različitih potklasa IgG anti-TIM-3 antitela indukovanjem sekrecije citokina zavisne od doze u jednosmernom MLR testu.
Materijali i metode
[0237] U jednosmernom MLR testu, dendritske ćelije (DC) i CD4-pozitivne (CD4+) T-ćelije izolovane iz dva različita zdrava donora zajedno su uzgajane da indukuju specifičnu reakciju aloantigena, što dovodi do proizvodnje citokina i aktivacije/proliferacije T-ćelija. Dendritske ćelije su diferencirane od CD14+ monocita putem 6-dnevnog uzgajanja sa 20 ng/ml faktora stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i 20 ng/ml interleukina-4 (IL-4) i pomešane u odnosu 1:10 sa CD4+ T-ćelijama izolovanim iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz materijala od zdravog donora. Nakon 5 dana uzgajanja, sakupljeni su supernatanti, i nivoi IFN-γ i TNF-α su određeni koristeći test citokina na mezo skali postupkom elektrohemiluminescencije. U ovom testu se koriste elektrohemiluminescentne oznake (SULFO-TAG) koje su konjugovane sa detektujućim antitelima. Kada se dovede struja na pločaste elektrode, SULFO-TAG oznake emituju svetlost, i intenzitet svetlosti se meri radi kvantifikacije citokina u uzorcima.
Rezultati
[0238] Krive zavisnosti doze i odgovora u jednosmernom MLR testu antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144 prikazane su na slikama 1 i 2. Krive zavisnosti doze i odgovora su dobijene dvostrukom titracijom antitela sa početnom koncentracijom od 50 ug/ml. Svaka tačka na dijagramu predstavlja prosečnu vrednost od tri ponavljanja, a interval greške predstavlja SEM.
1
[0239] Antitela 15086.15086 i 15086.17145 (varijante IgG1 i IgG2 ) pokazuju sličnu funkcionalnost i indukuju dozno zavisan porast IFN-γ i TNF-α u jednosmernom MLR testu. Antitelo 15086.17144 (varijanta IgG4) indukovalo je samo odgovor kod dve najviše koncentracije, a nije primećena funkcionalnost antitela 15086.16837 (varijanta IgG1 LALA).
Primer 4: Efekat anti-TIM-3 antitela na podskupove prečišćenih ćelija
[0240] Prvo je prijavljeno da se TIM-3 selektivno eksprimira putem CD4+ T pomoćnih ćelija i CD8+ (CD8-pozitivnih) T citotoksičnih ćelija koje proizvode IFN-γ, i pokazano je da je negativan regulator odgovora T ćelija. Zatim je otkriveno da je TIM-3 endogeno veoma eksprimiran na dendritskim ćelijama, monocitima i ćelijama prirodnim ubicama (NK) (Freeman et al., Immunol Rev 235:172-89 (2010); Kuchroo et al., Nat Rev Immunol 8:577-580 (2008); Anderson et al., Science 318:1141-1143 (2007); i Da Silva et al., Cancer Immunol Res 2:410-422 (2014)). Ovaj primer pokazuje kako ligacija TIM-3 od strane anti-TIM-3 antitela ima direktan efekat na dendritske ćelije, dovodeći do povećanja sekrecije TNF-α.
Materijali i metode
[0241] PBMC, naivne CD4+ T-ćelije i naivne CD8+ ćelije izolovane su iz materijala zdravog donora. Dendritske ćelije tri posebna zdrava donora su dobijene kako je prethodno opisano u primeru 3. Podskupovi izolovanih ćelija su inkubirani 5 dana sa 10 ug/ml navedenih antitela, i određeni su nivoi TNF-α koristeći test citokina na mezo skali postupkom elektrohemiluminescencije.
Rezultati
[0242] Direktan efekat na podskupove prečišćenih ćelija antitela 15086.15086, 15086.16837, 15086.17145 i 15086.17144 prikazan je na slici 3, gde svaki stubić predstavlja srednju vrednost od pet ponavljanja, a interval greške predstavlja SEM. Rezultati pokazuju da prisustvo IgG1 (15086.15086) ili IgG2 (15086.17145) varijante anti-TIM-3 antitela dovodi do povećanja sekrecije TNF-α iz dendritskih ćelija sva tri donora. Sličan efekat je primećen na populaciji PBMC koja sadrži više podskupova ćelija koje eksprimiraju TIM-3 (npr., monociti i NK ćelije). Varijante IgG1 LALA (15086.16837) i IgG4 (15086.17144) imaju samo minimalan efekat na
1
sekreciju TNF-α. Nijedno od ispitanih antitela nije delovalo na naivne CD4+ T-ćelije ni naivne CD8+ ćelije.
Primer 5: Protočna citometrijska analiza anti-TIM-3 antitela za blokirajuću aktivnost fosfatidil serina
[0243] Ovaj primer ilustruje kako je anti-TIM-3 antitelo iz pronalaska [15086.17145] ispitano na blokirajuću aktivnost fosfatidil serina (PtdS) izvođenjem kompetitivnog testa protočne citometrije koristeći apoptotske ćelije pozitivne na površinski fosfatidil serin i rastvorljivi TIM-3 obeležen fluorohromom.
Materijali i metode
[0244] Blokirajuća aktivnost fosfatidil serina je istražena u testu na bazi ćelija, u kome su Jurkatove T ćelije indukovane da pretrpe apoptozu putem tretmana staurosporinom (iz Streptomyces sp., Sigma-Aldrich, SAD). Tokom apoptoze, PtdS je translociran sa prednje strane citoplazme plazma membrane na ćelijsku površinu, i omogućava vezivanje proteina himere humani TIM-3-Fc obeleženog pomoću R-PE radi analize protočnom citometrijom. Komercijalno dostupni rekombinantni protein himera TIM-3-Fc (R&D Systems, SAD) konjugovan je sa R-PE koristeći komplet za konjugaciju Lightning-Link® R-fikoeritrin (Innova Biosciences, UK). Za svaku ispitivanu koncentraciju antitela, 25 µl razblaženog TIM-3-PE (odgovara oko 0,33 µg TIM-3-Fc) pomešano je sa 25 µl antitela (polazeći od 20 µg/ml finalno) u vezujućem puferu Annexin V (BD Pharmingen™, SAD) i inkubirano na sobnoj temperaturi (RT) tokom 20 minuta pre dodavanja ćelijama. Jurkatove T ćelije su uzgajane u prisustvu 1 µM staurosporina tokom 2 h, jednom isprane u vezujućem puferu na RT, i za svaki test je 2x10<5>ćelija u 50 µl vezujućeg pufera kombinovano sa smešom antitelo/TIM-3-PE. Nakon 15 min inkubacije na RT, dodato je 100 µl vezujućeg pufera, ćelije su istaložene centrifugiranjem, i peleti su ponovo suspendovani u 100 µl vezujućeg pufera radi snimanja. Vezivanje TIM-3-PE za apoptotske ćelije kvantifikovano je protočnom citometrijom detektovanjem fluorescencije PE (MFI). Paralelno, površinsko izlaganje PtdS ćelijama tretiranim staurosporinom potvrđeno je bojenjem pomoću Annexin V-PE (PE Annexin V komplet za detektovanje apoptoze I, BD Pharmingen™). Anti-PD-1 antitelo Keytruda® (pembrolizumab; Merck & Co., Inc.) korišćeno je kao negativna kontrola za vezivanje TIM-3 / blokiranje PtdS, a anti-TIM-3 referentno antitelo ABTIM3 [18571.18571] (WO 2015/117002
11
A1; Novartis AG) korišćeno je kao pozitivna kontrola za vezivanje TIM-3 / blokiranje PtdS. Pored toga, različito anti-TIM-3 antitelo [15338.15338], koje je prethodno identifikovano kao neblokirajuće antitelo, takođe je korišćeno kao negativna kontrola za blokiranje PtdS.
Rezultati
[0245] Rezultati eksperimenta kompeticije prikazani su na slici 4. Anti-TIM-3 antitelo [15086.17145] može da inhibira interakciju rastvorljivog TIM-3-Fc putem PtdS izloženog na ćeliji, na način zavisan od doze (slika 4A). Pri 3,125 µg/ml, ono blokira vezivanje TIM-3-Fc za PtdS-pozitivne ćelije na 2% vezivanja detektovanog u prisustvu neblokirajućeg anti-TIM-3 antitela [15338.15338] (slika 4B). Referentno anti-TIM-3 antitelo [18571.18571] moglo je da blokira vezivanje na 3,2% pri istoj koncentraciji (slika 4C). Rezultat za negativnu kontrolu anti-PD-1 antitelo Keytruda® prikazani su na slici 4D.
Primer 6: Kloniranje referentnih analoga anti-TIM-3 antitela
[0246] Referentni analozi anti-TIM-3 antitela ABTIM3 i mAb15 ovde se koriste u nekoliko primera. Referentni analozi su dobijeni kao što je opisano u nastavku.
[0247] Aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca ABTIM3 i mAb15 dobijene su iz patentnih prijava prikazanih u tabeli 16 u nastavku. Aminokiselinske sekvence fragmenata varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) reverzno su prevedene u sekvence DNK korišćenjem humanog kodona. Odgovarajući fragmenti DNK su onda sintetisani i klonirani u ekspresione vektore koji sadrže konstantne regione humanog teškog lanca (bilo koji od četiri različita formata izotipa: IgG1, IgG1-LALA, IgG2 ili IgG4) ili konstantne regione humanog kapa lakog lanca, što dovodi do sekvenci teškog i lakog lanca antitela kompletne dužine. Da bi se sprečila izmena Fab kraka u varijanti IgG4, serinski ostatak na poziciji 228 (EU numeracija) zamenjen je prolinom (Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993)). CHO ćelije su transficirane rezultujućim ekspresionim plazmidima koristeći standardni sistem za ekspresiju proteina. Nakon ekspresije antitela, odgovarajući supernatanti antitela su prečišćeni koristeći standardno prečišćavanje pomoću proteina A na hromatografskoj koloni.
Tabela 16: Genski sintetisani analozi antitela i odgovarajući format antitela
Primer 7: In vitro funkcionalna procena dodatnih anti-TIM-3 antitela u jednosmernom MLR testu
[0248] Ovaj primer pokazuje in vitro funkcionalnu aktivnost devet dodatnih anti-TIM-3 antitela indukovanjem dozno zavisne sekrecije IFN-γ u testu jednosmerne mešane limfocitne reakcije (MLR).
Materijali i metode
[0249] Jednosmerni MLR test je postavljen kao što je opisano iznad u primeru 3. Ukratko, dendritske ćelije (DC) i CD4+ T-ćelije su zajedno uzgajane tokom 5 dana u prisustvu navedenih antitela. Nakon 5 dana uzgajanja, sakupljeni su supernatanti, i nivoi IFN-γ su određeni koristeći test IFN-γ na mezo skali postupkom elektrohemiluminescencije.
Rezultati
[0250] Krive doze i odgovora za devet dodatnih anti-TIM-3 antitela prikazane su na slici 5. Svih devet antitela je indukovalo dozno zavisno povećanje nivoa IFN-γ u ovom testu. Kao napomena, nije primećen efekat referentnih antitela ABTIM3 i mAb15. Krive doze i odgovora su dobijene dvostrukom titracijom antitela sa početnom koncentracijom od 100 µg/ml. Svaka tačka na dijagramu predstavlja prosečnu vrednost od tri ponavljanja, a interval greške predstavlja SEM.
Primer 8: In vitro funkcionalna procena dodatnih anti-TIM-3 antitela u dvosmernom MLR testu
[0251] Ovaj primer pokazuje in vitro funkcionalnu aktivnost deset anti-TIM-3 antitela indukovanjem dozno zavisne sekrecije IFN-γ u testu dvosmerne mešane limfocitne reakcije (MLR).
Materijali i metode
[0252] U dvosmernom MLR testu, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) od dva različita zdrava donora zajedno su uzgajane da indukuju specifičnu reakciju aloantigena, što dovodi do proizvodnje citokina i aktivacije/proliferacije T-ćelija. PBMC od dva različita donora pomešane su u odnosu 1:1. Nakon 5 dana uzgajanja, sakupljeni su supernatanti, i nivoi IFN-γ su određeni koristeći test citokina na mezo skali postupkom elektrohemiluminescencije.
Rezultati
[0253] Krive doze i odgovora za deset anti-TIM-3 antitela prikazane su na slici 6 za jedan donorski par. Sva anti-TIM-3 antitela su indukovala dozno zavisno povećanje nivoa IFN-γ u ovom testu. Kao napomena, nije primećen efekat referentnih antitela ABTIM3 i mAb15. Krive doze i odgovora su dobijene dvostrukom titracijom antitela sa početnom koncentracijom od 100 µg/ml. Svaka tačka na dijagramu predstavlja prosečnu vrednost od tri ponavljanja, a interval greške predstavlja SEM.
Primer 9: In vitro funkcionalna procena dodatnih anti-TIM-3 antitela u testu dendritskih ćelija
[0254] Ovaj primer pokazuje in vitro funkcionalnu aktivnost devet anti-TIM-3 antitela indukovanjem dozno zavisne sekrecije TNF-α u dendritskim ćelijama dobijenim od monocita.
11
Materijali i metode
[0255] CD14+ monociti su izolovani iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz materijala zdravog donora. Dendritske ćelije (DC) diferencirane su od CD14+ monocita putem 6-dnevnog uzgajanja sa 20 ng/ml faktora stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i 20 ng/ml interleukina-4 (IL-4). Dendritske ćelije dobijene od monocita su sakupljene i uzgajane tokom 5 dana u prisustvu navedenih antitela. Nakon 5 dana uzgajanja, sakupljeni su supernatanti, i nivoi TNF-α su određeni koristeći test TNF-α na mezo skali postupkom elektrohemiluminescencije.
Rezultati
[0256] Krive doze i odgovora za devet dodatnih anti-TIM-3 antitela prikazane su na slici 7. Svih devet anti-TIM-3 antitela je indukovalo dozno zavisno povećanje nivoa TNF-α iz dendritskih ćelija dobijenih od monocita kod dva nezavisna donora. Kao napomena, nije primećen efekat referentnih antitela ABTIM3 i mAb15. Krive doze i odgovora su dobijene dvostrukom titracijom antitela sa početnom koncentracijom od 100 µg/ml. Svaka tačka na dijagramu predstavlja prosečnu vrednost od tri ponavljanja, a interval greške predstavlja SEM.
Primer 10: Merenje afiniteta antitela prema TIM-3 čoveka i cinomolgusa
[0257] Ovaj primer pokazuje afinitet vezivanja Fab fragmenata anti-TIM-3 za ekstracelularne domene TIM-3 čoveka i cinomolgusa, mereno površinskom plazmonskom rezonancom (SPR).
Materijali i metode
[0258] Analiza kinetičkog vezivanja izvedena je pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, SAD) u kombinaciji sa IBIS MX96 SPR instrumentom (IBIS Technologies, Holandija).
[0259] Fab fragmenti anti-TIM-3 su generisani iz korigovanih varijanti sekvence odabranih antitela u formatu IgG1 LALA koristeći standardne komplete za enzimsko cepanje (Genovis, Švedska). Fab fragmenti su označeni kao Fab [broj antitela]. Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca korišćena za Fab 15086 je korigovana sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 7. Kodiranje cDNK TIM-3 za ekstracelularni domen TIM-3 čoveka i cinomolgusa sintetisano je i klonirano u vektor koji sadrži CMV promoter i Fc sekvencu (AA P101-K330) humanog IgG1, što dovodi do C-terminalne fuzije Fc IgG1 sa kloniranim ECD TIM-3. Fuzioni konstrukti Fc TIM-3 su generisani standardnim tehnikama PCR i inženjeringa, i protein je prolazno eksprimiran u 2 ml kulture koristeći ekspresioni sistem ExpiCHO™. Fuzioni konstrukti Fc TIM-3 su sakupljeni nakon 9 dana, i supernatanti su ispitani na afinitet vezivanja za Fab fragmente anti-TIM-3 pomoću SPR. Antigeni su prečišćeni standardnim postupcima i hvatani na G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Holandija) tokom 15 minuta koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, SAD). Nakon istačkavanja, SensEye® je pozicioniran na IBIS MX96 biosenzoru, blokirani su preostali položaji za hvatanje, i uhvaćeni proteini su fiksirani za površinu koristeći komplet FixIT (Ssens BV, Holandija). Izvedena je kinetička analiza primenom takozvane serije kinetičke titracije (Karlsson R. 2006), u kojoj se monomerni Fab fragmenti antitela iz pronalaska injektuju u rastućoj koncentraciji od 1 nM do 100 nM bez primene koraka površinske regeneracije nakon svakog injektovanja Fab. Asocijacija Fab je izvršena tokom 15 minuta, i disocijacija antigena je izvršena tokom 15 minuta. Zabeleženi odgovori vezivanja uklopljeni su u jednostavni Lengmirov model vezivanja 1:1 pomoću softvera Scrubber 2 radi izračunavanja konstante brzine asocijacije (kon ili ka), brzine disocijacije (koff ili kd), i afiniteta (KD).
Rezultati
[0260] Rezultati merenja afiniteta pokazuju da Fab 15086, Fab 20293, i Fab 20131 i dva referentna antitela vezuju TIM-3 čoveka i cinomolgusa različitim afinitetom. Detaljna kinetika vezivanja je prikazana u tabeli 17 u nastavku.
Tabela 17: Kinetika vezivanja Fab fragmenata anti-TIM-3 za ECD TIM-3 čoveka ili cinomolgusa određena putem SPR.
11
Primer 11: Određivanje vezivanje antitela za ECD TIM-3 čoveka i cinomolgusa pomoću ELISA
[0261] Ovaj primer pokazuje aviditet vezivanja anti-TIM-3 antitela za ECD TIM-3 čoveka i cinomolgusa, mereno putem ELISA.
Materijali i metode
[0262] Vezivanje antitelo-antigen mereno je putem ELISA sa Fc fuzionim antigenima TIM-3 obloženim pri 1 µg/ml. Antigeni čoveka i cinomolgusa dobijeni su od Sino Biologicals. Anti-TIM-3 antitela su inkubirana sa obloženim antigenima pri različitim koncentracijama, polazeći od 150 µg/ml (1000 nM) u dvostrukim serijskim titracijama. Nakon ispiranja, vezana antitela su detektovana pomoću sekundarnih antitela konjugovanih sa HRP (peroksidazom rena).
Rezultati
[0263] ELISA test je pokazao da su sva procenjivana antitela sposobna da se vežu za ECD TIM-3 čoveka i cinomolgusa. Objavljena je koncentracija anti-TIM-3 antitela koja daje polovinu maksimalnog vezivanja (EC50). Sva ispitana antitela su vezivala humani TIM-3 sa vrednostima EC50 oko 1 nM ili manje, dok su kod vezivanja TIM-3 cinomolgusa primećene
11
mnogo veće varijacije (tabela 18). Neka antitela, kao što je 20131, 20185, 20293 i ABTIM3, pokazala su identično vezivanje za ECD TIM-3 čoveka i cinomolgusa. Ostala antitela, kao što je 19324, 19416, 19568 i 20300, pokazala su umereno vezivanje za ECD TIM-3 i cinomolgusa, dok su antitela 20362, 20621 i 15086.17145 pokazala slabu unakrsnu reaktivnost prema TIM-3 cinomolgusa (smanjenje EC50 za više od 100 puta). Krive vezivanja za antitela koja su prikazala najnižu unakrsnu reaktivnost prema TIM-3 cinomolgusa jasno su pokazale zasićeno vezivanje za antigen kada su ispitivana u najvišim koncentracijama u ELISA testu.
Tabela 18: Aviditeti vezivanja (EC50) anti-TIM-3 antitela za TIM-3 čoveka ili cinomolgusa određena putem ELISA
Primer 12: Binovanje epitopa anti-TIM-3 antitela
11
[0264] Ovaj primer ilustruje kako anti-TIM-3 antitela iz pronalaska mogu da se grupišu u binove epitopa na osnovu obrazaca uparene kompeticije. Antitela koja pripadaju različitim binovima epitopa prepoznaju različite epitope na ekstracelularnom domenu (ECD) TIM-3.
Materijali i metode
[0265] Ispitivanje kompeticije uparenih antitela izvedeno je pomoću analize površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter (CFM) (Wasatch Microfluidics, SAD) u kombinaciji sa IBIS MX96 SPR instrumentom (IBIS Technologies, Holandija). Analiza površinske plazmonske rezonance izvedena je na G-a-hu-IgG Fc SensEye® SPR senzoru (Ssens BV, Holandija). Ukupno šesnaest anti-TIM-3 antitela humanog IgG2 i dva referentna antitela IgG4 (ABTIM3 i mAb15) razblažena su do 15 µg/ml u PBS puferu sa 0,05% Tween 20 (PBS-T), pH 7,0. Antitela su hvatana na površini anti-Fc senzora istačkavanjem tokom 15 minuta koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter. Nakon istačkavanja, SensEye® je pozicioniran na IBIS MX96 biosenzoru, i preostala anti-Fc mesta su blokirana injektovanjem 30 µg/ml nespecifičnog humanog IgG1. Uhvaćena antitela su konjugovana za površinu koristeći komplet FixIT (Ssens BV, Holandija). Nakon pripreme senzora, izvedena je analiza kompeticije antitela koristeći klasični sendvič test u kome su imobilisana antitela vezivala 200 nM rastvorljivog jednovalentnog TIM-3 antigena (Acro Biosystems, Kina), a zatim je vezivanje ispitano sa drugim anti-TIM-3 antitelom. Zatim su primenjena pojedinačna injektovanja svakog od osamnaest anti-TIM-3 antitela razblaženih na 15 µg/ml u PBS-T puferu, da bi se utvrdili obrasci kompeticije antitela. Nakon svakog ciklusa kompeticije, površina senzora je regenerisana pomoću 100 mM H3PO4 pufera, pH 3,0.
Rezultati
[0266] Obrazac kompeticije svakog od osamnaest anti-TIM-3 antitela prikazan je na slici 8. Antitela mAb15 (bin1), 15105 i 15107 (bin 2), 15260 i ABTIM3 (bin 3), 17244 (bin 7), i 15174 i 15175 (bin 8) ne pokazuju funkcionalnu aktivnost u MLR testovima na bazi ćelija koji su ovde opisani, ali su uključena jer prepoznaju različite epitope. Antitela iz bina 8 ispitana su samo u rastvoru, jer je vezivanje TIM-3 znatno smanjeno kada su ova antitela uhvaćena na površini senzora (jednosmerno blokiranje). Zato su ta antitela naznačena kvadratima. Nađeno je da funkcionalna anti-TIM-3 antitela vezuju tri unakrsno kompetitivna bina epitopa (binovi 4, 5 i 6). Funkcionalna antitela koja pripadaju binu epitopa 4 uključuju antitela 20621, 20293,
11
19568, 20362, 15086.17145 i 19416. Ova antitela se unakrsno blokiraju međusobno i sa antitelima iz binova epitopa 3, 5, 6 i 7. Funkcionalna antitela koja pripadaju binu epitopa 5 uključuju antitela 20131 i 20185. Ova antitela se unakrsno blokiraju međusobno i sa antitelima iz binova epitopa 3, 4, 6 i 7. Pored toga, 20131 i 20185 takođe sprečavaju vezivanje mAb15 kada su uhvaćena samo na površini senzora (jednosmerno blokiranje, isprekidanje linije). Najzad, funkcionalna antitela koja pripadaju binu epitopa 6 uključuju antitela 19324 i 20300. Ova antitela se unakrsno blokiraju međusobno i sa svim ostalim antitelima osim antitela iz bina 2.
[0267] Iz gornjih rezultata se može zaključiti da funkcionalna antitela iz binova epitopa 4, 5 i 6 vezuju epitope koji se razlikuju od referentnih antitela ABTIM3 (bin 3) i mAb15 (bin 1) (slika 1), jer svaka grupa za binovanje ima jedinstveni obrazac kompeticije u poređenju sa drugim anti-TIM-3 antitelima u panelu.
Primer 13: Mapiranje epitopa anti-TIM-3 antitela mutagenezom TIM-3
[0268] Epitopi antitela generalno mogu da se okarakterišu kao linearni epitopi (takođe se nazivaju kontinualnim epitopima) ili konformacioni epitopi (takođe se nazivaju diskontinualnim epitopima). Dok su linearni epitopi definisani na bazi jedne kontinualne aminokiselinske sekvence, konformacioni epitopi mogu da se sastoje od mnogo manjih diskontinualnih linearnih sekvenci ili ostataka sa jednim kontaktom. Kolekcija kontaktnih ostataka koji se okupljaju na intermolekulskoj površini proteina između antitela i antigena takođe se naziva vruća tačka (Moreira et. al., Proteins 68(4):803-12 (2007)). Sada je opšte priznato da su većina epitopa B-ćelija po prirodi diskontinualni (Sivalingam i Shepherd, Mol Immunol. 51(3-4):304-9 (2012)), Kringelum et al., Mol Immunol. 53(1-2):24-34 (2013)) sa prosečnim rasponom epitopa od 15–22 aminokiselinskih ostataka, od kojih 2–5 aminokiselina najviše doprinose vezivanju (Sivalingam i Shepherd, gore).
[0269] Rangiranjem afiniteta vezivanja za 129 različitih mutanta TIM-3, ovaj primer ilustruje kako vezivanje epitopa Fab 15086, Fab 20293 i Fab 20131 može da se podeli na linearne epitope i vruće tačke koji se razlikuju od epitopa koje prepoznaju referentna antitela ABTIM3 i mAb15.
11
Materijali i metode
[0270] Receptor humanog TIM-3 sastoji se od ekstracelularnog domena (ECD) od 181 aminokiseline (ostaci 22–202) nakon koga sledi transmembranski domen (ostaci 203–223) i citoplazmatski domen (ostaci 224–301). TIM-3 pripada super familiji imunoglobulina, a ECD je sastavljen od dva domena – domena mucina i domena IgV. Domen IgV sadrži dvoslojni βsendvič nastao interakcijama 7 antiparalelnih β-lanaca raspoređenih u dve β-ravni sa β-lancima GFCC' sa jedne strane i β-lancima BED sa suprotne strane. Dve β-ravni su stabilizovane disulfidnom vezom između ostataka C54–C123. Dostupna je kristalna struktura za TIM-3 humanog IgV (PDB 5F71). Domen IgV TIM-3 nema A lanac kao drugi domeni IgV, nego ima dve dodatne disulfidne veze (C58–C63 i C52–C110) koje pozicioniraju petlje CC' i FG u neposrednu blizinu, formirajući jedinstveni procep za vezivanje liganda fosfatidil serina (PS). Postoji kristalna struktura mišjeg TIM-3 u kompleksu sa PS ligandom (3KAA), koja pokazuje kontakte za vezivanje liganda za petlje CC' i FG.
[0271] Identifikovano je nekoliko liganada i/ili koreceptora za TIM-3, uključujući HMGB-1, galektin-9, CEACAM-1 i fosfatidil serin (Chiba et al., Nat. Immunology 13(9):832-42 (2012), Li et al., Hepatology 56(4):1342-51 (2012), DeKruyff et al., J Immunology 184(4):1918-30 (2010), Das et al., Immunol Rev.276(1):97-111 (2017)).
[0272] Sekvence proteina humanog TIM-3 i ortologa preuzete su od UniProt; humane (Q8TDQ0; SEQ ID NO: 236), majmuna cinomolgus (Macaca fascicularis, G7P6Q7; SEQ ID NO: 237), miša (Mus musculus, Q8VIM0; SEQ ID NO: 238) i pacova (Rattus norvegicus, P0C0K5; SEQ ID NO: 239). Ove sekvence su prikazane u tabeli 23. Identičnost sekvenci između različitih aminokiselinskih sekvenci ekstracelularnog TIM-3 prikazana je u tabeli 19 u nastavku.
Tabela 19: Razlike aminokiselina u odnosu na humani ekstracelularni domen TIM-3 i identičnost sekvence sa njim.
12
[0273] Iz kristalnih struktura i aminokiselinskih sekvenci, identifikovani su površinski izloženi aminokiselinski ostaci, i 82 pojedinačne supstitucije alaninom su dizajnirane na humanom ECD TIM-3 (pretraživanje na alanin).
[0274] Da bi se mapirali linearni epitopi u kontekstu nativne strukture humanog TIM-3, generisano je 47 himernih proteina kod kojih je 10 aminokiselina u sekvenci humanog ECD TIM-3 redom zamenjeno u mišju sekvencu u segmentima preklopljenim od strane 5 aminokiselina, i dodate su verzije pacova i cinomolgusa u kritičnim petljama. Izmene sekvence su izvedene u ekstracelularnom domenu humanog TIM-3 koji obuhvata aminokiseline 22–199.
[0275] Kodiranje cDNK za ekstracelularni domen humanog TIM-3 sintetisano je i klonirano u vektor koji sadrži CMV promoter i Fc sekvencu (AA P101-K330) humanog IgG1, što dovodi do C-terminalne fuzije Fc IgG1 sa kloniranim ECD TIM-3. Mutirani humani fuzioni konstrukti Fc TIM-3 su generisani standardnim tehnikama PCR i inženjeringa, i protein je prolazno eksprimiran u 2 ml kulture koristeći ekspresioni sistem ExpiCHO™. Fuzioni konstrukti Fc TIM-3 su sakupljeni, prečišćeni i ispitani na afinitet vezivanja za Fab fragmente anti-TIM-3 pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR). Fuzioni proteini TIM-3 su imobilisani na G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Holandija) tokom 15 minuta koristeći uređaj sa konstantnim protokom Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, SAD). Nakon istačkavanja, SensEye® je pozicioniran na IBIS MX96 biosenzoru, i uhvaćeni proteini su fiksirani za površinu koristeći komplet FixIT (Ssens BV, Holandija). Izvedena je kinetička analiza primenom takozvane serije kinetičke titracije (Karlsson R.2006), u kojoj se monomerni Fab fragmenti antitela iz pronalaska injektuju u rastućoj koncentraciji od 1 nM do 100 nM bez primene koraka površinske regeneracije nakon svakog injektovanja Fab. Asocijacija Fab je izvršena tokom 15 minuta, i disocijacija antigena je izvršena tokom 15 minuta. Zabeleženi odgovori vezivanja uklopljeni su u jednostavni Lengmirov model vezivanja 1:1 pomoću softvera Scrubber 2 radi izračunavanja konstanti brzine asocijacije (kon ili ka), brzine disocijacije (koff ili kd) i afiniteta (KD).
Rezultati
[0276] Afinitet vezivanja anti-TIM-3 Fab 15086, 20293, 20131 i referentnih analoga ABTIM3 i mAb15 ocenjen je u pogledu izmenjenog vezivanja za konstrukte TIM-3 mutanta.
[0277] Afinitet vezivanja fragmenata Fab za mutirane konstrukte TIM-3 izražen je kao odnos KD mutanta / KD divljeg tipa (normalizovani afinitet vezivanja). Tabele 20 i 21 pokazuju himerne proteine i alaninske mutante koji su dali diferencirajuće rezultate. Kao granični kriterijum za detektovanje smanjenog afiniteta vezivanja za konstrukt mutiranog TIM-3 korišćeno je najmanje petostruko smanjenje afiniteta. U nekim slučajevima, nije moglo da se detektuje vezivanje za specifične Fab. Ti konstrukti su navedeni kao NB (ne vezuju se).
[0278] Analiza je pokazala da su vezujući epitopi anti-TIM-3 Fab 15086, 20293 i 20131 izrazito različiti u poređenju sa referentnim antitelima ABTIM3 i mAb15. 15086 i 20293 ne vezuju himerni protein sa mišjom sekvencom ubačenom na pozicijama 62–67, blizu vezujućih petlji liganda CC' i FG, dok se referentni ABTIM3 vezuje (tabela 20). Epitop 15086 na TIM-3 pruža se izvan ovog dela aminokiselina uključujući P50, V60, F61, E62, G64, R69 i FG ostatke petlje I117, M118, D120 kao što se vidi iz pretraživanja na alanin (tabela 21). Fab 20293 ima vrlo sličan epitop kao 15086, osim što ostaci M118 i D120 utiču samo na vezivanje za 15086 kada su mutirani u alanin. Nađeno je da Fab 20131 vezuje različit epitop prisutan u FG petlji na ostacima 114–117, i to je pretraživanjem na alanin prošireno tako da uključuje ostatke 118, 120 i takođe CC' ostatke F61 i E62. Za 15086, 20293 i 20131 bila je zajednička osetljivost na mutaciju alanina na poziciji F61, na koju nijedno od dva referentnih antitela nije bilo osetljivo. Mada referentno antitelo mAb15 nije vezivalo mutiranu sekvencu na pozicijama 62–67, analogno sa 15086 i 20293, epitop mAb15 je izrazito različit jer se ovo antitelo nije vezalo za dva dodatna konstrukta tamo gde je sekvenca sa pozicija 74–85 zamenjena mišjom. Antitelo ABTIM3 jasno je pokazalo novi epitop definisan linearnim konstruktom mutiranim na pozicijama 22–28, 107–144 i 123–128, kao što dokazuje izmenjeni afinitet vezivanja za te proteine (tabela 20). Rezime nalaza mapiranja epitopa je prikazan u tabeli 22 u nastavku, a molekulski model koji pokazuje kako se epitopi mapiraju na površini IgV domena TIM-3 prikazan je na slici 9.
[0279] Kao rezime, na molekulskom nivou, analizirajući vezivanje za panel 129 TIM-3 mutanta, pokazali smo da tri Fab 15086, 20293 i 20131 prepoznaju jedinstvene ali delimično preklapajuće epitope na gornjoj površini IgV domena TIM-3. Nalaz je usklađen sa analizom binovanja epitopa (primer 12) koja pokazuje da sva tri antitela vezuju preklapajuće unakrsno kompetitivne epitope koji zajedno čine funkcionalnu površinu IgV domena TIM-3. Ti epitopi se izrazito preklapaju sa mestom vezivanja fosfatidil serina, kao i aminokiseline E62 koja je ključna za vezivanje HMGB-1 i CEACAM1 (Chiba et al., Nat. Immunology 13(9):832-42 (2012), Das et al., Immunol Rev. 276(1):97-111 (2017)), dok dva referentna antitela imaju epitope koji se nalaze više na središnjem delu IgV domena (mAb15) i sa druge strane IgV domena (ABTIM3). Rezultati su u skladu sa podacima binovanja epitopa, koji pokazuju da mAb15 i ABTIM3 mogu istovremeno da vežu TIM-3 (primer 12). Na bazi lokacije epitopa 15086, 20293 i 20131, predviđa se da će svako antitelo moći da blokira vezivanje liganada TIM3 (fosfatidil serin, CEACAM-1 i HMGB-1).
12
12 Tabela 23: Proteinske sekvence TIM-3
Protein Aminokiselinske sekvence
Tabela 24: Sekvence anti-TIM-3 antitela
12
Tabela 25: Konstantni region i sekvence TIM-3
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži aminokiselinske sekvence H-CDR1-3 i L-CDR1-3 SEQ ID NO: 7–12, redom, i naznačeno time što pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući deo povećava sekreciju IFN-γ i TNF-α na testu jednosmerne mešane limfocitne reakcije.
2. Anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz zahteva 1, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži HC i LC čiji varijabilni domeni imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15, odnosno 4.
3. Anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz zahteva 2, naznačeno time što pomenuti HC i pomenuti LC dalje sadrže aminokiselinske sekvence:
i) SEQ ID NO: 5, odnosno 6; ili
ii) SEQ ID NO: 25, odnosno 6.
4. Anti-TIM-3 antitelo iz zahteva 1, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži HC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i 25, i LC koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 i 6.
5. Anti-TIM-3 antitelo iz zahteva 1 ili 2, naznačeno time što antitelo sadrži najmanje jednu mutaciju u FCregionu, naznačeno time što je mutacija opciono na jednoj ili više pozicija aminokiselina 228, 233, 234 i 235 teškog lanca, koje su numerisane prema šemi numeracije IMGT, i naznačeno time što su jedan ili oba aminokiselinska ostatka na pozicijama 234 i 235 opciono mutirani u Ala, i/ili naznačeno time što je aminokiselinski ostatak na poziciji 228 opciono mutiran u Pro.
6. Anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz bilo kog od zahteva 1–5, naznačeno time što antitelo ili deo ima najmanje jedno od sledećih svojstava:
a) vezuje se za humani TIM-3 sa KDod 23 nM ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom;
b) vezuje se za TIM-3 cinomolgusa sa KDod 22 nM ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom;
c) vezuje se za humani TIM-3 sa EC50 od 1,2 nM ili manje, mereno ELISA testom;
22
d) vezuje se za TIM-3 cinomolgusa sa EC50 od 46 nM ili manje, mereno ELISA testom; e) povećava sekreciju IFN-γ na testu dvosmerne mešane limfocitne reakcije;
f) povećava sekreciju TNF-α iz dendritskih ćelija; i
g) inhibira interakciju TIM-3 sa fosfatidil serinom.
7. Molekul izolovane nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac ili njegov antigen vezujući deo, i sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac ili njegov antigen vezujući deo, anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela iz bilo kog od zahteva 1–6.
8. Vektor koji sadrži molekul izolovane nukleinske kiseline iz zahteva 7, naznačeno time što pomenuti vektor dalje sadrži sekvencu za kontrolu ekspresije.
9. Ćelija domaćin koja sadrži sekvencu nukleotida koja kodira teški lanac ili njegov antigen vezujući deo, i sekvencu nukleotida koja kodira laki lanac ili njegov antigen vezujući deo, anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela iz bilo kog od zahteva 1–6.
10. Postupak za proizvodnju anti-TIM-3 antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela, koji obuhvata dobijanje ćelije domaćina prema zahtevu 9, uzgajanje pomenute ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela ili dela, i izolovanje dobijenog antitela ili dela.
11. Bispecifični vezujući molekul koji ima antigen-vezujući deo anti-TIM-3 antitela prema bilo kom od zahteva 1–6 i antigen-vezujući deo drugog, različitog antitela.
12. Anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1–6, ili bispecifični vezujući molekul prema zahtevu 11, za primenu za povećanje imuniteta kod pacijenta kome je to potrebno.
13. Anti-TIM-3 antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1–6, ili bispecifični vezujući molekul prema zahtevu 11, za primenu za lečenje raka kod pacijenta kome je to potrebno.
14. Antitelo, antigen-vezujući deo ili bispecifični vezujući molekul za upotrebu iz zahteva 13, naznačeno time što pacijent ima maligni tumor koji potiče iz kože, pluća, creva, jajnika, mozga, prostate, bubrega, mekog tkiva, hematopoetskog sistema, glave i vrata, jetre, bešike, dojke, želuca, materice ili pankreasa.
15. Antitelo, antigen-vezujući deo ili bispecifični vezujući molekul za upotrebu iz zahteva 13, naznačeno time što pacijent ima leukemiju, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom, solidni tumor, melanom, nemikrocelularni karcinom pluća, kolorektalni karcinom ili karcinom bubrežnih ćelija.
22
RS20211517A 2016-04-12 2017-04-11 Anti-tim-3 antitela i kompozicije RS62736B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662321476P 2016-04-12 2016-04-12
PCT/EP2017/058696 WO2017178493A1 (en) 2016-04-12 2017-04-11 Anti-tim-3 antibodies and compositions
EP17717393.7A EP3443009B1 (en) 2016-04-12 2017-04-11 Anti-tim-3 antibodies and compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62736B1 true RS62736B1 (sr) 2022-01-31

Family

ID=58547516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211517A RS62736B1 (sr) 2016-04-12 2017-04-11 Anti-tim-3 antitela i kompozicije

Country Status (35)

Country Link
US (2) US11390674B2 (sr)
EP (2) EP3443009B1 (sr)
JP (2) JP7123804B2 (sr)
KR (1) KR102473028B1 (sr)
CN (2) CN116693685A (sr)
AU (1) AU2017251250B2 (sr)
CA (1) CA3020647A1 (sr)
CL (1) CL2018002878A1 (sr)
CO (1) CO2018010458A2 (sr)
CY (1) CY1125440T1 (sr)
DK (1) DK3443009T3 (sr)
EA (1) EA039020B1 (sr)
ES (1) ES2900381T3 (sr)
HR (1) HRP20211820T1 (sr)
HU (1) HUE056677T2 (sr)
IL (1) IL262176B2 (sr)
LT (1) LT3443009T (sr)
MA (1) MA44659B1 (sr)
MD (1) MD3443009T2 (sr)
MX (1) MX2018012076A (sr)
MY (1) MY199098A (sr)
NZ (1) NZ746755A (sr)
PE (1) PE20181805A1 (sr)
PH (1) PH12018502112B1 (sr)
PL (1) PL3443009T3 (sr)
PT (1) PT3443009T (sr)
RS (1) RS62736B1 (sr)
SA (1) SA518400222B1 (sr)
SG (2) SG11201808724SA (sr)
SI (1) SI3443009T1 (sr)
TN (1) TN2018000333A1 (sr)
TW (1) TWI752950B (sr)
UA (1) UA126854C2 (sr)
WO (1) WO2017178493A1 (sr)
ZA (1) ZA201806429B (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20171790A1 (es) 2015-03-23 2017-12-28 Bayer Pharma AG Anticuerpos anti-ceacam6 y sus usos
CN109757103B (zh) 2016-07-14 2024-01-02 百时美施贵宝公司 针对tim3的抗体及其用途
UA129904C2 (uk) 2017-04-05 2025-09-10 Ле Лаборатуар Сервьє Комбінація антитіла до tim-3 й антитіла до pd-1 для лікування раку
BR112020003362A2 (pt) 2017-08-28 2020-08-18 Bristol-Myers Squibb Company antagonistas de tim-3 para o tratamento e diagnóstico de cânceres
EP3737700A1 (en) * 2018-01-12 2020-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against tim3 and uses thereof
US12202894B2 (en) 2018-03-20 2025-01-21 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-TIM-3 antibodies
EP3768715A1 (en) 2018-03-23 2021-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against mica and/or micb and uses thereof
US11807683B2 (en) 2018-04-12 2023-11-07 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibody binding TIM-3 and use thereof
AU2019258468B2 (en) * 2018-04-24 2023-06-29 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Antibody against TIM-3 and application thereof
CN112566936B (zh) 2018-08-21 2024-07-12 阿尔伯特爱因斯坦医学院 针对人tim-3的单克隆抗体
CN111253485A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 上海开拓者生物医药有限公司 抗人tim-3单克隆抗体及其应用
EP3897844B1 (en) 2018-12-19 2023-11-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Pharmaceutical combination of anti ceacam6 and tim3 antibodies
US20220363760A1 (en) 2019-05-30 2022-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signature for suitability to immuno-oncology therapy
WO2020243570A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
WO2021053490A1 (en) * 2019-09-16 2021-03-25 Novartis Ag Use of high-affinity, ligand-blocking, humanized anti-t-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (tim-3) igg4 antibody for the treatment of myelofibrosis
KR102536302B1 (ko) * 2020-02-25 2023-05-26 국립암센터 Tim-3 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
US11807688B2 (en) * 2020-02-28 2023-11-07 Les Laboratoires Servier Anti-AXL antibodies and compositions
CN114057874B (zh) * 2020-07-31 2023-05-05 北京市神经外科研究所 抗cd44的单链抗体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途
CN113214396B (zh) * 2020-07-31 2022-04-19 北京市神经外科研究所 抗tim3的单链抗体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途
AU2021334361A1 (en) 2020-08-31 2023-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and immunotherapy
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
US20220233693A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibody Compositions and Methods of Use Thereof
JP2024501029A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｐｄ１／ｐｄ－ｌ１抗体の皮下投与
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
EP4326773A4 (en) 2021-04-23 2025-09-24 Suzhou Neologics Bioscience Co Ltd ANTIBODIES TARGETING TIM-3 AND THEIR USES
WO2022253805A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 Symphogen A/S Anti-nkg2a antibodies and compositions
EP4372006A4 (en) * 2021-07-16 2025-10-08 Brightpath Biotherapeutics Co Ltd ANTIBODY OR ANTIBODY DERIVATIVE TO TIM-3 ANTIGEN, AND USE THEREOF
CN118043352A (zh) 2021-09-02 2024-05-14 德国癌症研究中心公共法律基金会 副作用减少的抗cecam6抗体
KR20240050375A (ko) 2021-09-03 2024-04-18 온코원 리서치 앤드 디벨롭먼트 게엠베하 감소된 응집 가능성과 감소된 소수성을 갖는 개선된 Fc 침묵형 항-oxMIF 항체
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
KR20250022071A (ko) 2022-06-02 2025-02-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항체 조성물 및 이의 이용 방법
GB2644480A (en) 2023-04-24 2026-04-15 King Abdullah Univ Of Science Of Technology Compositions, systems and methods for multiplex detection of target biomarkers in a sample
WO2025038763A1 (en) 2023-08-15 2025-02-20 Bristol-Myers Squibb Company Ceramic hydroxyapatite chromatography flow through method
WO2025145207A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg-depleting agent
CN118373913B (zh) * 2024-05-08 2024-11-01 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗人Tim-3单克隆抗体及其制备方法
CN118165111B (zh) * 2024-05-15 2024-08-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 针对Tim-3的抗体

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
WO2009097394A2 (en) 2008-01-29 2009-08-06 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for modulating a population of myeloid-derived suppressor cells and uses thereof
WO2010084999A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Protegene, Inc. Immunosuppressive agents and prophylactic and therapeutic agents for autoimmune diseases
JP5748653B2 (ja) 2009-04-10 2015-07-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ−３抗体を用いた血液腫瘍治療法
AU2011262758B8 (en) 2010-06-11 2014-09-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
WO2013006490A2 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
AU2014212014A1 (en) 2013-02-01 2015-08-27 Amgen Inc. Administration of an anti-activin-A compound to a subject
WO2015048312A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
CN103936853B (zh) 2014-01-26 2016-08-17 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种检测tim-3试剂盒及其使用方法
HUE045065T2 (hu) 2014-01-31 2019-12-30 Novartis Ag TIM-3 antitest molekulák és felhasználásaik
CA2942245C (en) 2014-03-12 2021-11-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns
ES2851451T3 (es) 2014-05-13 2021-09-07 Bavarian Nordic As Terapia de combinación para tratar cáncer con un poxvirus que expresa un antígeno de tumor y un anticuerpo monoclonal contra TIM-3
WO2016111947A2 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3265486A4 (en) * 2015-03-06 2018-11-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind tim3
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
EP3337826A1 (en) 2015-08-20 2018-06-27 Sutro Biopharma, Inc. Anti-tim-3 antibodies, compositions comprising anti-tim-3 antibodies and methods of making and using anti-tim-3 antibodies
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
CN109757103B (zh) 2016-07-14 2024-01-02 百时美施贵宝公司 针对tim3的抗体及其用途
JOP20190013A1 (ar) 2016-08-25 2019-01-31 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ (تي آي ام -3)
JOP20190133A1 (ar) 2016-12-08 2019-06-02 Innovent Biologics Suzhou Co Ltd أجسام مضادة لـ Tim-3 لمزجها بأجسام مضادة لـ PD-1
UA129904C2 (uk) 2017-04-05 2025-09-10 Ле Лаборатуар Сервьє Комбінація антитіла до tim-3 й антитіла до pd-1 для лікування раку
JOP20190222A1 (ar) 2017-04-11 2019-09-24 Zymeworks Inc الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لـ pd-l1 والمضادة لـ tim-3

Also Published As

Publication number Publication date
TW201736397A (zh) 2017-10-16
SI3443009T1 (sl) 2022-04-29
EA039020B1 (ru) 2021-11-23
EP3978531A1 (en) 2022-04-06
ES2900381T3 (es) 2022-03-16
IL262176B2 (en) 2023-03-01
IL262176A (en) 2018-11-29
MY199098A (en) 2023-10-12
PH12018502112A1 (en) 2019-09-23
PL3443009T3 (pl) 2022-01-31
TN2018000333A1 (en) 2020-01-16
ZA201806429B (en) 2023-02-22
SA518400222B1 (ar) 2022-03-14
MA44659A (fr) 2021-04-14
WO2017178493A1 (en) 2017-10-19
CN109451741B (zh) 2023-07-28
HUE056677T2 (hu) 2022-02-28
MA44659B1 (fr) 2021-12-31
BR112018070919A2 (pt) 2019-01-29
DK3443009T3 (da) 2021-12-13
EA201892294A1 (ru) 2019-04-30
CN109451741A (zh) 2019-03-08
US11390674B2 (en) 2022-07-19
EP3443009A1 (en) 2019-02-20
CL2018002878A1 (es) 2019-04-26
MX2018012076A (es) 2019-02-20
JP2022172142A (ja) 2022-11-15
PE20181805A1 (es) 2018-11-19
SG11201808724SA (en) 2018-11-29
CO2018010458A2 (es) 2018-10-10
KR20180133482A (ko) 2018-12-14
NZ746755A (en) 2025-11-28
JP7123804B2 (ja) 2022-08-23
TWI752950B (zh) 2022-01-21
JP2019519199A (ja) 2019-07-11
CY1125440T1 (el) 2023-03-24
KR102473028B1 (ko) 2022-11-30
US20190276531A1 (en) 2019-09-12
US20230105714A1 (en) 2023-04-06
HRP20211820T1 (hr) 2022-03-04
EP3443009B1 (en) 2021-09-08
IL262176B (en) 2022-11-01
PH12018502112B1 (en) 2024-03-27
UA126854C2 (uk) 2023-02-15
MD3443009T2 (ro) 2022-02-28
CA3020647A1 (en) 2017-10-19
CN116693685A (zh) 2023-09-05
PT3443009T (pt) 2021-12-10
AU2017251250A1 (en) 2018-10-18
SG10201912937SA (en) 2020-02-27
US12577302B2 (en) 2026-03-17
AU2017251250B2 (en) 2024-03-21
LT3443009T (lt) 2021-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12577302B2 (en) Anti-TIM-3 antibodies and compositions
JP7488323B2 (ja) 抗ｌａｇ－３抗体および組成物
EP3368572B2 (en) Anti-pd-1 antibodies and compositions
US12030942B2 (en) Anti-PD-1 antibodies and compositions
HK40073034A (en) Anti-tim-3 antibodies and compositions
CA3000564C (en) Anti-pd-1 antibodies and compositions
HK40085294A (en) Anti-pd-1 antibodies and compositions
HK40000742B (en) Anti-tim-3 antibodies and compositions
BR112018070919B1 (pt) Anticorpo anti-tim-3, seu método de produção, seus usos, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada e vetor
HK1256846B (en) Anti-pd-1 antibodies and compositions
HK1256846A1 (en) Anti-pd-1 antibodies and compositions
BR112018006257B1 (pt) Anticorpo anti-pd-1 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, seu método de produção, seu uso, composição farmacêutica, moléculas de ácido nucleico isoladas, vetor, molécula de ligação biespecífica e seu uso