ES2904314T3

ES2904314T3 - Leucocidinas de Staphylococcus aureus, composiciones terapéuticas, y sus usos

Info

Publication number: ES2904314T3
Application number: ES18196549T
Authority: ES
Inventors: Victor J Torres; Ashley L Dumont
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2010-05-05
Filing date: 2011-05-05
Publication date: 2022-04-04
Anticipated expiration: 2031-05-05
Also published as: IL222874B; JP2018076324A; EP3121191A1; CN107286224A; AU2016262661A1; EP3444268A1; ZA201208455B; US20180099998A1; US11584782B2; AU2015200901B2; MX2019005156A; HRP20220068T1; MX364642B; LT3444268T; EP2566519A4; CA3088918A1; US20110274693A1; HUE058787T2; MX386545B; CN103025352B

Abstract

Una composición que comprende un análogo de polipéptido de leucocidina A (LukA) que comprende: una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 10, y no comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 342-351 de la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 5, y no comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 342-350 de la SEQ ID NO: 5; o, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 2, y no comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 342-351 de la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Leucocidinas de Staphylococcus aureus, composiciones terapéuticas, y sus usos

Antecedentes de la invención

Las bacterias Staphylococcus aureus o "staph" se encuentran normalmente en la piel o en la nariz de personas y animales. Las bacterias staph son generalmente inofensivas, a menos que entren en el cuerpo a través de un corte u otra lesión. Por lo general, las infecciones por staph son problemas menores de la piel en personas sanas. Históricamente, las infecciones por staph fueron tratadas con antibióticos de amplio espectro, como la meticilina. Ahora, sin embargo, han surgido ciertas cepas de staph que son resistentes a la meticilina y a otros antibióticos de beta-lactama tales como penicilina y cefalosporinas. Se les conoce como Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (también conocidos como Staphylococcus aureus resistente a múltiples fármacos, o "MRSA").

Las infecciones por staph, incluyendo MRSA, generalmente comienzan como pequeñas protuberancias rojas que se asemejan a espinillas, hervir o picaduras de araña. Estas protuberancias o manchas pueden convertirse rápidamente en abscesos profundos y dolorosos que requieren drenaje quirúrgico. A veces las bacterias permanecen confinadas en la piel. En ocasiones, pueden penetrar profundamente en el cuerpo, causando infecciones potencialmente mortales en una amplia gama de tejidos humanos, incluyendo piel, tejidos blandos, huesos, articulaciones, heridas quirúrgicas, torrente sanguíneo, válvulas cardíacas, pulmones u otros órganos. Por lo tanto, las infecciones por S. aureus pueden provocar enfermedades potencialmente mortales tales como fascitis necrotizante, neumonía, endocarditis, sepsis, síndrome de choque tóxico y diversas formas de neumonía. La infección por MRSA es especialmente problemática en hospitales o en el hogar donde los pacientes son propensos a heridas abiertas, dispositivos invasivos y sistemas inmunológicos debilitados y, por lo tanto, corren mayor riesgo de infección que el público en general. Los trabajadores que no siguen procedimientos sanitarios adecuados pueden transferir bacterias MRSA de un paciente a otro.

S. aureus produce un conjunto diverso de factores de virulencia y toxinas que le permiten a esta bacteria neutralizar y soportar el ataque de diferentes tipos de células inmunes, específicamente subpoblaciones de glóbulos blancos que constituyen el sistema de defensa primario del cuerpo. La producción de estos factores de virulencia y toxinas le permiten a S. aureus mantener un estado infeccioso. Véase, Nizet, J. Allergy Clin. Immunol. 120: 13 - 22 (2007). Entre estos factores de virulencia, S. aureus produce varias leucotoxinas de dos componentes, que dañan las membranas de las células de defensa del huésped y los eritrocitos por la acción sinérgica de dos proteínas o subunidades no asociadas. Véase Supersac, y colaboradores, Infect. Immun. 61: 580 - 7 (1993). Entre estas leucotoxinas de dos componentes, la gamma-hemolisina (HlgAB y HlgCB) y la Leucocidina de Pantone-Valentine (PVL) son las más caracterizadas.

La toxicidad de las leucocidinas hacia las células de mamífero implica la acción de dos componentes. La primera subunidad se denomina subunidad de clase S (es decir, "eluida lentamente"), y la segunda subunidad se denomina subunidad de clase F (es decir, "eluida rápidamente"). Las subunidades S y F actúan sinérgicamente para formar poros en glóbulos blancos incluyendo monocitos, macrófagos, células dendríticas y neutrófilos (colectivamente conocidos como fagocitos). Véase, Menestrina, y colaboradores, Toxicol. 39: 1661 - 1672 (2001). El mecanismo por el cual las toxinas de dos componentes forman poros en las membranas de células objetivo no se entiende completamente. El mecanismo de acción propuesto de estas toxinas implica la unión de la subunidad S a la membrana celular objetivo, muy probablemente a través de un receptor, seguido por la unión de la subunidad F a la subunidad S, formando de este modo un oligómero que a su vez forma un poro previo que se inserta en la membrana celular objetivo (Jayasinghe, y colaboradores, Protein. Sci. 14: 2550-2561 (2005)). Los poros formados por las leucotoxinas de dos componentes son típicamente selectivos de cationes. La formación de poros causa la muerte celular a través de lisis, que en el caso de los glóbulos blancos objetivo se ha descrito como resultado de un desequilibrio osmótico debido a la afluencia de cationes (Miles, y colaboradores, Biochemistry 40: 8514-8522 (2001)).

Además de la PVL (conocida también como leucocidina S/F-PV o LukSF-PV) y gamma-hemolisina (HlgAB y HlgCB), se sabe que el repertorio de leucotoxinas de dos componentes producidas por S. aureus incluye leucocidina E/D (LukED) y leucocidina M/F' (LukMF'). Por lo tanto, las subunidades de clase S de estas leucocidinas de dos componentes incluyen HlgA, HlgC, LukE, LukS-PV y LukM, y las subunidades de clase F incluyen HlgB, LukD, LukF-PV y LukF'-PV (Menestrina, y colaboradores, citado más arriba). Las subunidades S y F de S. aureus no son específicas de la leucocidina. Es decir, son intercambiables de tal manera que otras combinaciones de dos componentes podrían formar un poro funcional en un glóbulo blanco, aumentando en gran medida el repertorio de leucotoxinas (Meyer, y colaboradores, Infect. Immun 77: 266-273 (2009)).

El diseño de una terapia eficaz para tratar la infección por MRSA ha sido especialmente desafiante. Además de la resistencia anteriormente mencionada a la meticilina y antibióticos relacionados, se ha encontrado que MRSA tiene también niveles significativos de resistencia a macrólidos (por ejemplo, eritromicina), combinaciones de inhibidores de beta-lactamasa (por ejemplo, Unasyn, Augmentin) y fluoroquinolonas (por ejemplo ciprofloxacina), así como a clindamicina, trimetoprima/sulfametoxasol (Bactrim) y rifampina. En el caso de infección grave por S. aureus, los médico han recurrido a la vancomicina por vía intravenosa. Sin embargo, ha habido informes de resistencia de S. aureus a la vancomicina. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos fármacos antibióticos que combatan eficazmente la infección por S. aureus.

Nariya et al; FEBS Letters, Elsevier, Ámsterdam; agosto de 1993; Volumen 329, número 1, 2: 219-22, divulgan una variante de truncamiento de C-terminal de 17 aminoácidos de una proteína de subunidad S de leucocidina de Staphylococcus.

Dumont et al: Microbiología Molecular; 2011 febrero; 79(3): 814-825, divulgan Luk A/B y su importancia en la toxicidad de la infección por Staphylococcus.

El documento WO 2007/145689 divulga una composición de vacuna que comprende antígenos estafilocócicos, que incluyen alfa-toxina y leucocidinas.

Breve resumen de la invención

Los solicitantes han descubierto y caracterizado otro miembro de dos componentes del sistema de defensa nativo de Staphylococcus aureus. El componente polipeptídico de la subunidad S nativa recién caracterizado se denomina aquí "LukA", que abarca los polipéptidos nativos y sus análogos que tienen una similitud de secuencia de al menos el 70% con las secuencias de los polipéptidos nativos. Por tanto, se divulga una LukA aislada y/o purificada. También se divulgan un polinucleótido aislado y/o purificado que codifica LukA, un huésped transformado (por ejemplo, una célula) que contiene el polinucleótido y métodos para la preparación de LukA recombinante a través de la expresión del polinucleótido en el huésped transformado.

El componente polipeptídico de la subunidad F recientemente caracterizado se denomina aquí como "LukB", que abarca los polipéptidos nativos y sus análogos que tienen una similitud de secuencia de al menos 70% con las secuencias de los polipéptidos nativos. Por lo tanto, se divulga un LukB aislado y/o purificado. También se divulgan un polinucleótido aislado y/o purificado que codifica LukB, un huésped transformado (por ejemplo, una célula) que contiene el polinucleótido y métodos para la preparación de LukB recombinante a través de la expresión del polinucleótido en el huésped transformado.

Un aspecto de la presente solicitud se refiere a composiciones terapéuticas útiles para inhibir el inicio o el tratamiento de una infección por Staphylococcus aureus que contiene cantidades terapéuticamente eficaces de LukA y LukB formuladas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. De este modo, en una realización, la composición contiene un análogo de LukA que carece de los 10 residuos C-terminales y que es no tóxico (denominado en este documento LukAA10C o rLukAA10C). Estas composiciones tienen múltiples usos terapéuticos. En algunas realizaciones, las composiciones se denominan composiciones antiinflamatorias y pueden usarse para tratar afecciones o trastornos inflamatorios agudos, particularmente afecciones inflamatorias agudas localizadas.

Estos usos explotan descubrimientos adicionales de los Solicitantes que en condiciones fisiológicas (es decir, LukAB producido directamente por S. aureus), el complejo LukAB tiene una especificidad exquisita por los fagocitos, pero no para otras células nucleadas tales como células epiteliales y células endoteliales. Es decir, el complejo forma poros en las membranas de este tipo de células, causando así la muerte celular, a la que se denomina en la presente memoria como "citotoxicidad mediada por LukAB". Por otra parte, LukAB tiene una especificidad relativamente pequeña o insignificante con respecto a otras células de mamífero nucleadas. De este modo, las composiciones antiinflamatorias de la presente invención explotan la especificidad de LukAB por fagocitos humanos, con el fin de tratar afecciones inflamatorias agudas, que se caracterizan por la infiltración masiva de fagocitos al sitio de inflamación.

En otras realizaciones, las composiciones terapéuticas pueden denominarse como una composición de vacuna (activa). Las composiciones pueden usarse para inducir la producción de anticuerpos neutralizantes anti-LukA y anti-LukB en un sujeto en riesgo de infección por S. aureus o un sujeto diagnosticado con infección por S. aureus tal como MRSA.

También se divulgan anticuerpos que se unen específicamente a LukA, anticuerpos que se unen específicamente a LukB, composiciones terapéuticas que contienen los anticuerpos LukA y/o LukB y sus usos para tratar estados infecciosos causados por S. aureus. Estas composiciones terapéuticas pueden denominarse composiciones de vacunas pasivas. Por lo tanto, en una parte de la divulgación, la composición terapéutica contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpos anti-LukA. En otra parte de la divulgación, la composición terapéutica contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpos anti-LukB. En aún otra parte de la divulgación, la composición terapéutica contiene cantidades terapéuticamente eficaces tanto de anticuerpos anti-LukA como anti-LukB.

Las composiciones de vacuna pasivas y las composiciones de vacuna activas de la presenbte invencion explotan el descubrimiento adicional de los Solicitantes de que cepas infecciosas, virulentas de S. aureus tales como MRSA, expresan LukA y LukB. La conservación de LukA y LukB a través de un amplio espectro de cepas de S. aureus permite a las vacunas de la presente invención proporcionar eficacia terapéutica de espectro completo. LukA, LukB, anticuerpos anti-LukA y anticuerpos anti-LukB también se denominan en la presente memoria como agentes activos.

También se divulgan métodos de utilización de LukAB, de LukA y/o LukB para identificar inhibidores potenciales de citotoxicidad mediada por LukAB. Estos métodos pueden utilizar el complejo LukAB, por sí mismo, en combinación con un fagocito, o una porción del mismo que se une a la membrana del fagocito. Los inhibidores así identificados pueden ser candidatos para terapia con el propósito de tratar una infección por S. aureus.

También se divulga un método para predecir o evaluar la gravedad de una infección por S. aureus que implica detectar la presencia o cantidad de LukA y/o LukB, o detectar los genes correspondientes de LukA y/o LukB, en una muestra biológica obtenida de un sujeto infectado. Esto se basa en el descubrimiento adicional de los solicitantes de que entre las muchas citotoxinas producidas por S. aureus, LukAB exhibe una toxicidad potente hacia fagocitos humanos. Por lo tanto, la detección de presencia o de cantidades relativamente elevadas de LukA y/o LukB, o sus genes correspondientes (por ejemplo, como la exhibida por la cepa Newman de S. aureus, 4645 y cepas de MRSA, USA300 y USA500) con respecto a un control (por ejemplo, cepas USA100 y USA400 de S. Aureus) que produce cantidades pequeñas o indetectables de LukA y/o LukB, es indicativa de una infección severa por S. aureus.

Estos y otros aspectos de la presente invención se describen más completamente a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una alineación que contiene la secuencia de aminoácidos de una secuencia mayoritaria de LukA (designada como SEQ ID NO: 1) y los polipéptidos LukA de trece (13) cepas diferentes de S. aureus a las que corresponde (designadas como SEQ ID NOS: 2 -14).

La Figura 2 es una alineación que contiene la secuencia de aminoácidos de una secuencia mayoritaria de LukB (denominada SEQ ID NO: 15), y los polipéptidos LukB de doce (12) cepas diferentes de S. aureus a las que corresponde (designadas como SEQ ID NOS: 16 - 27).

Figura 3. LukAB es una potente citotoxina estafilocócica que ataca y mata fagocitos humanos primarios.

(a) Intoxicación de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) primarias con un filtrado de cultivo (2,5% v/v) de la cepa Newman de S. aureus (TS) y las cepas mutantes isogénicas indicadas. La viabilidad celular se controló usando CellTiter, donde las células tratadas con medio se tomaron como el 100%. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado desviación estándar (DE). (b) Intoxicación de monocitos humanos primarios, macrófagos y células dendríticas (CD) con un filtrado de cultivo (2,5% v/v) de la cepa Newman de S. aureus (TS) y las cepas mutantes isogénicas indicadas. La viabilidad celular se controló como se describió anteriormente. Los resultados representan la media de dos donantes, donde las células de cada donante fueron intoxicadas con tres preparaciones independientes de exoproteína, S.E.M. (c) Intoxicación de PMN primarios humanos con diversas diluciones de filtrados de cultivo de la cepa Newman de S. aureus (TS) y las cepas mutantes isogénicas indicadas. La viabilidad celular se controló como se describió anteriormente. Los resultados representan la media de los PMN aislados de cuatro donantes ± S.E.M.

(d) Intoxicación de PMN primarios humanos con rLukA, rLukB purificados, o una combinación de rLukA y rLukB a las concentraciones indicadas. * Indica significancia estadística tanto de rLukA como de rLukB, P < 0,05. Para los paneles (a-c) * indica significancia estadística de TS, ** indica significancia estadística de ALukAB/p, P <0,05 (prueba t de Student p <0,05).

Figura 4. LukAB se dirige preferentemente a las células fagocíticas humanas. Intoxicación de células PMN-HL60 (a, c y d) o (b) THP1 con diversas diluciones de filtrado de cultivo de la cepa Newman de S. aureus de TS, cepas mutantes isogénicas que carecen de los genes/toxinas indicados, (c) filtrado de cultivo de S Aureus TS que contiene un plásmido vacío (TS/p), una cepa que carece de LukAB con un plásmido vacío (ALukAB/p) y una cepa que carece de LukAB con un plásmido de complementación LukAB (ALukAB/pLukAB), o (d) con LukA (rLukA), LukB (rLukB) recombinante purificado, o una combinación de rLukA y rLukB (rLukA+rLukB) a las concentraciones indicadas. Para las intoxicaciones tanto con rLukA como con rLukB, la concentración total de proteína se compone de cantidades iguales de rLukA y rLukB (por ejemplo, 2,8 |jg de proteína total es igual a 1,4 |jg de rLukA y 1,4 |jg de rLukB). (e) Intoxicación de las líneas celulares humanas indicadas con 10 pg/ml de rLukAB. La viabilidad celular se controló usando CellTiter, donde las células tratadas con medio se tomaron como el 100%. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado ± DE. El asterisco (*) denota diferencia estadísticamente significativa en comparación con TS (ANOVA de un solo factor).

Figura 5 . LukAB es una toxina importante en diferentes cepas estafilocócicas. (A) Expresión de LukB por varias cepas de S. aureus según se determinó mediante análisis de transferencia tipo Western usando sueros policlonales anti-LukB. (B) Intoxicación de PMN-HL60 con diluciones de exoproteínas de diferentes cepas de S. aureus. La viabilidad celular se controló usando CellTiter, donde las células tratadas con medio se tomaron como 100% viables. (C) Expresión de LukB y toxina a por cepas isogénicas TS y LukAB según se determinó por análisis de transferencia tipo ^{Western usando sueros específicos de la toxina. (D) Intoxicación de PMN-HL60 con exoproteínas de cepas}Ts Newman (New.) y 4645, y las cepas isogénicas LukAB. La viabilidad celular se controló como en el Panel B. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado DE. * Denota diferencia estadísticamente significativa en comparación con Newman (C) o con TS (E) (prueba t de Student p <0,05).

Figura 6. LukAB rompe las membranas plasmáticas de las células objetivo. (a) Imágenes de microscopía óptica de células PMN-HL60 intoxicadas con filtrado de cultivo de la cepa de S. aureus TS y la cepa isogénica carente de LukAB (ALukAB). (b-c) Intoxicación de células PMN-HL60 con filtrados de cultivo de la cepa TS (TS/p), la cepa isogénica carente de LukAB (ALukAB/p), la cepa complementada (ALukAB/pLukAB) o intoxicada en forma simulada con medio. Las células con membranas comprometidas se tiñeron con SYTOX Green, se obtuvieron imágenes mediante microscopía de fluorescencia (c), y se midió la intensidad de fluorescencia verde (b). (d) Los PMN se infectaron ex vivo con la cepa Newman de S. aureus (MSSA) o la cepa LAC USA300 (MRSA) y los mutantes isogénicos indicados con diversas multiplicidades de infección (MOI). El daño a la membrana se controló con verde SYTOX. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado ± DE. Los asteriscos (*) indican una diferencia estadísticamente significativa en comparación con TS (prueba t de Student p <0,05).

Figura 7. LukAB protege a S. aureus de la muerte mediada por el huésped atacando y matando fagocitos. (a) Infección de células PMN-HL60 con S. aureus TS, una cepa que carece de lukAB, y la cepa que carece de lukAB con un plásmido de complementación lukAB (AlukAB/plukAB) en diversas multiplicidades de infección (MOI). Las células de mamífero con membranas comprometidas se controlaron con SYTOX Green como se describe en la Figura 6. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado DE. (b) Viabilidad de las cepas de S. aureus indicadas tras la infección ex vivo de sangre entera humana. Los resultados representan la media de la sangre entera aislada de 12 donantes S.E.M. (c) Viabilidad de las cepas Newman de S. aureus indicadas tras la infección de neutrófilos humanos primarios (PMN). Los resultados representan la media de los PMN aislados de 12 donantes S.E.M. (d) Intoxicación de PMN humanos primarios con diversas diluciones de filtrado de cultivo a partir de las cepas TS/p, OlukAB/p, y AlukAB/plukAB. La liberación de LDH se midió como un indicador de lisis celular. Los resultados representan la media de PMN aislados de 6 donantes S.E.M. Los asteriscos (*) indican diferencia estadísticamente significativa en comparación con la cepa TS de Newman (prueba t de Student p <0,05).

Figura 8. LukAB es importante para la patogénesis de S. aureus in vivo. (a) Imágenes bioluminiscentes de riñones de ratones infectados con la cepa LAC de S. aureus TS que contiene pXenl o pLukAB.Xenl. Se muestran los riñones de dos ratones representativos por grupo. (b) Carga bacteriana recuperada de los riñones de ratones infectados retroorbitalmente con las cepas LAC de S. aureus. Cada punto de datos representa el número de bacterias (CFU) por mililitro de homogeneizado de tejidos en un solo animal. La línea discontinua indica el límite de detección. Para los paneles (A-C y E) * indica significancia estadística de TS, ** indica significancia estadística de ALukAB/p, P < 0,05.

Figura 9. LukAB mata a los fagocitos humanos que forman poros en las membranas celulares. (a) las células PMN-HL60 fueron intoxicadas con rLukA+rLukB y la unión a la toxina se controló mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando anticuerpos específicos para LukA o LukB. (b) Se incubaron PMN-HL60 con rLukAB y se determinó la unión de la toxina por FACS usando un anticuerpo anti-His de conejo. (c) Las células PMN-HL60 fueron intoxicadas con rLukAB y la formación de oligómeros LukAB en la membrana plasmática se determinó por SDS-PAGE e inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-LukB. (d) PMN-HL60 intoxicadas con rLukAB o tratadas con saponina en presencia o ausencia de PEG-400. Los poros LukAB se detectaron con bromuro de etidio. (e) Viabilidad de PMN-HL60 tratadas como en panel determinado con CellTiter, donde las células tratadas con medio se tomaron como 100%. Los resultados en los paneles d y e representan el promedio de las muestras por triplicado / SEM. * Denota diferencia estadísticamente significativa para -PEG (panel d-e) (prueba t de Student p <0,05).

Figura 10. La citotoxicidad de LukAB puede neutralizarse mediante un anticuerpo policlonal a-LukA. La intoxicación de las PMN-HL60 con un filtrado de cultivo al 5% (v/v) de la cepa Newman de S. aureus que se había incubado con las cantidades indicadas de anticuerpos policlonales a-LukA o suero previamente inmune de diversos sangrados de producción de dos conejos diferentes. La viabilidad celular se controló usando CellTiter, donde las células tratadas con medio se tomaron como el 100%. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado ± desviación estándar (DE).

Figura 11. La extensión del C-terminal de LukA es necesaria para el efecto citotóxico de LukAB pero no es necesaria para el reconocimiento por un anticuerpo policlonal a-LukA. (a) Alineación de secuencias de aminoácidos de las diversas subunidades S de leucotoxina de S. aureus (designadas como SEQ ID NOS: 44-49) llevada a cabo usando el método MegAlign Clustal W a partir del software Lasergene. Las extensiones del N-terminal y del C-terminal sólo presentes en la secuencia de LukA se enfatizan con cajones. (b) Tinción con azul de Coomassie de 2 |jg de LukA recombinante (rLukA), LukB (rLukB), careciendo LukA de la extensión C-terminal (rLukAA10C) y LukA que carece de la extensión N-terminal (rA33NLukA) purificada a partir de E. coli y separada por SDS-PAGE acompañada por intoxicación de las PMN-HL60 con diversas cantidades de rLukA, rLukAA10C y rA33NLukA apareadas con rLukB. La concentración final de proteína representa cantidades iguales de rLukA, rLukAA10C o rA33NLukA y rLukB. Los resultados representan el promedio de muestras por triplicado ± DE. (c) Inmunotransferencia que muestra un reconocimiento equivalente de rLukAA10C marcado con 6 x His por ambos anticuerpos policlonales a-LukA y a-His.

Descripción detallada

La siguiente divulgación está dirigida, en orden sucesivo, a polipéptidos LukA, polipéptidos LukB, polinucleótidos LukA y LukB, anticuerpos anti-LukA y anti-LukB, composiciones terapéuticas que contienen LukA y/o LukB, o anticuerpos anti-LukA y/o anti-LukB, métodos para usar las composiciones terapéuticas, métodos para identificar inhibidores de la citotoxicidad mediada por LukAB y métodos para predecir o evaluar la gravedad de una infección por S. aureus.

Polipéptidos LukA

Los polipéptidos nativos de Staphylococcus aureus han sido ahora aislados e identificados por los solicitantes porque presentan el perfil de actividad de las leucocidinas conocidas de la subunidad S (por ejemplo, LukS-PVL, LukE y HlgC).

Estos polipéptidos que se designan colectivamente en este documento como LukA, se dirigen y unen específicamente a fagocitos humanos (pero no a las células epiteliales humanas o células endoteliales humanas o células murinas), y una vez unidos a la membrana del fagocito, LukA se oligomeriza con una leucocidina de la subunidad F de S. aureus (por ejemplo, LukF-PVL, LukD y HlgB, y LukB como se describe en la presente memoria), y después de la oligomerización forma un poro transmembrana (denominado colectivamente como actividad de LukA). La alineación ilustrada en la Fig. 1 contiene las secuencias de aminoácidos de una secuencia mayoría de LukA (designada en el presente documento como SEQ ID NO: 1) y los polipéptidos LukA de 13 cepas diferentes de S. aureus a las que corresponde (designadas en la presente memoria como SEQ ID NOS: 2-14).

Los residuos de 27 aminoácidos N-terminales en cada una de las SEQ ID NOS: 1-14 representan la secuencia nativa de secreción/señal. Por lo tanto, la forma segregada madura de LukA, que está representada por los residuos de aminoácidos 28-351 en cada una de las SEQ ID NOS: 1-14, se puede denominar en la presente memoria "LukA (28 351)" o "LukA madura". Correspondientemente, la forma inmadura de LukA se puede denominar en la presente memoria como "LukA (1-351)".

Una secuencia de consenso de LukA, con base en las SEQ ID NOS: 2-14 (que no son exhaustivas con respecto a LukA nativo de S. aureus) incluiría por lo tanto variabilidad en un mínimo de 64 posiciones de LukA (en donde las posiciones consecutivas de variabilidad se denotan como X1 -X64), designado como sigue: 8 (X1 = L o F), 16 (X2 = A o V), 17 (X3 = I o L), 24 (X4 = T o N), 26 (X5 = Q o E), 31 (X6 = H o N), 38 (X7 = N o T), 46 (X8 = S o A), 50 (X9 = E o D), 55 (X10 = T o N) , 56 (X11 = N o D) , 61 (X12 = S o T) , 62 (X13 = T o P), 63 (X14 = A, G o V) , 73 (X15 = I o V), 78 (X16 = E o V), 77 (X17 = T o S), 80 (X18 = V o E), 83 (X19 = E o K), 84 (X20 = E o K), 105 (X21 = V o I), 124 (X22 = K o R), 125 (X23 = E o N), 127 (X24 = K, T o N), 129 (X25 = S o A), 130 (X26 = N o S), 135 (X2'7 = K o Q), 146 (X28 = R o S), 148 (X29 = R o P), 173 (X30 = S o N), 174 (X31 = S o L), 181 (X32 = T o V), 184 (X33 = I o V), 195 (X34 = T o S), 202 (X35 = N o K), 208 (X36 = S o I), 214 (X37 = W o R), 221 (X38 = I o V), 229 (X39 = G o N), 231 (X40 = V o I), 237 (X41 = E o D), 239 (X42 = L o F), 243 (X43 = N o T), 246 (X44 = I o L), 247 (X45 = A o S), 278 (X46 = L o I), 283 (X47 = S o T), 285 (X48 = E o D), 288 (X49 = Q o R), 299 (X50 = I o V), 303 (X51 = R o K), 309 (X52 = A o G), 310 (X53 = P o Q), 315 (X54 = K o Q), 318 (X55 = D o E), 322 (X56 = L o F), 325 (X57 = T o V), 338 (X58 = V o I), 339 (X59 = D o E), 342 (X60 = S o T), 344 (X61 = D, E o Q), 347 (X62 = P o S), 348 (X63 = Y o F), y 349 (X64 = K o R).

Polipéptidos LukB.

Los solicitantes han identificado ahora los polipéptidos nativos de Staphylococcus aureus que exhiben el perfil de actividad de las leucocidinas conocidas de la subunidad F (por ejemplo, LukF-PVL, LukD y HlgB). Estos polipéptidos que se designan colectivamente en este documento como LukB, se oligomerizan específicamente con una leucocidina de la subunidad S de S. aureus (por ejemplo, LukS-PVL, LukE y HlgC, y LukA como se describe en el presente documento) que está unida a un fagocito humano; y después de la oligomerización forman un poro transmembrana en el fagocito (denominado colectivamente actividad de LukB). La alineación ilustrada en la Fig. 2 contiene las secuencias de aminoácidos de la mayoría de las secuencias de LukB (designadas en la presente memoria como SEQ ID NO: 15) y los polipéptidos LukB de las 12 cepas diferentes de S. aureus a las que corresponden (designadas aquí como SEQ ID NO: 16-27).

Los 29 residuos de aminoácidos N-terminales en cada una de las SEQ ID NOS: 15-27 representan la secuencia de secreción/señal. Por lo tanto, la forma segregada madura de LukB, que está representada por los residuos de aminoácidos 30-339 en cada una de las SEQ ID NO: 16-27, se puede denominar en la presente memoria "LukB (30 339)" o "LukB madura". Correspondientemente, la forma inmadura de LukB puede denominarse en la presente memoria como "LukA (1-339)".

Una secuencia consenso de LukB, con base en las SEQ ID NOS: 15-28 (que no son exhaustivas con respecto a LukB nativo de S. aureus) incluiría por lo tanto variabilidad en un mínimo de 49 posiciones de LukB (en donde las posiciones consecutivas de variabilidad se denotan X1 - X49), designado como sigue: 5 (X1 = L o V), 6 (X2 = C o Y), 13 (X3 = S o T), 15 (X4 = A o T), 16 (X5 = L o I), 19 (X6 = A o T), 20 (X7 = L o F), 23 (X8 = F o L), 26 (X9 = S o T), 28 (X10 = Y o F), 34 (X11 = E o K), 36 (X12 = K o T), 37 (X13 = Q, T o A), 46 (X14 = D o E), 59 (X15 = S o T), 60 (X16 = Q o E), 62 (X17 = N o K), 64 (X18 = T o S), 75 (X19 = P o K), 95 (X20 = K o R), 98 (X21 = N, d o E), 126 (X22 = S o una supresión), 159 (X23 = R o Q), 163 (X24 = T o P), 170 (X25 = S o K), 187 (X26 = L o I), 190 (X27 = S o P), 192 (X28 = S o T), 193 (X29 = S o T), 193 (X29 = H o N), 197 (X30 = G o A), 204 (X31 = S o L), 222 (X32 = D o N), 224 (X33 = T o V), 247 (X34 = N o D), 270 (X35 = N o K), 272 (X36 = K o E), 276 (X37 = R, Q o K), 287 (X38 = D o E), 290 (X39 = L o I), 294 (X40 = K o R), 309 (X41 = Q o K0, 327 (X42 = D o N), 329 (X43 = L o F), 330 (X44 = I o V), 332 (X45 = t o V), 333 (X46 = f, I o L), 336 (X47 = K o N), y 338 (X48 = K o Q).

Las leucocidinas LukA y LukB pueden diferir de los polipéptidos nativos designados como SEQ ID NOS: 2-14 y 16-27 respectivamente, en términos de una o más inserciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos adicionales, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos en las SEQ ID NOS: 2-14 o 16-27 pueden estar sustituidos por otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Es decir, el cambio relativo a la secuencia nativa no disminuiría apreciablemente las propiedades básicas de LukA y LukB nativos. Los ejemplos incluyen las SEQ ID NOS: 1 y 15. Cualquiera de dichos análogos de LukA o LukB puede ser rastreado de acuerdo con los protocolos descritos en la presente memoria (por ejemplo, el ensayo de toxicidad celular y el ensayo de daño de la membrana) para determinar si mantiene la actividad LukA o LukB nativo.

Las sustituciones dentro de estas leucocidinas pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

En otras realizaciones, se pueden realizar alteraciones no conservadoras (por ejemplo, una o sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos) con el fin de inactivar o desintoxicar LukA y LukB. En una realización, el análogo no tóxico de LukA difiere de los polipéptidos nativos en que se eliminan los aminoácidos C-terminales en las posiciones 342-351. Con la excepción de las SEQ ID NO: 4-6 (que contienen 9 aminoácidos en estas posiciones), el análogo carece de los 10 residuos de aminoácidos C-terminales. Colectivamente, estos análogos se denominan LukAA10C. Los LukA y LukB desintoxicados se pueden usar en las composiciones de vacunas activas descritas en la presente memoria. Las alteraciones moleculares pueden realizarse por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la extensión del cebador en una plantilla de plásmido usando plantillas de cadena sencilla (Kunkel, Proc. Acad. Sci., USA 82: 488-492 (1985)), plantillas de ADN de cadena doble (Papworth y colaboradores, Strategies 9 (3): 3-4 (1996)), y mediante clonación por PCR (Braman, J. (ed.),, IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2a ed. Humana Press, Totowa, NJ (2002). Los métodos para determinar si una alteración molecular dada en LukA o LukB reduce la citotoxicidad de LukAB se describen en la presente memoria.

Por lo tanto, en vista de lo anterior y para los propósitos de la presente invención, LukA se puede describir más ampliamente en términos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-14 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, que es el polipéptido LukA nativo de la cepa Newman de S. aureus), o un polipéptido (nativo o no nativo) que tiene al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de similitud de secuencia con la misma.

Del mismo modo, en vista de lo anterior y para los propósitos de la presente invención, LukB puede describirse más ampliamente en términos de cualquiera de las s Eq ID NOS: 15-27 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 27, que es el polipéptido de LukB nativo de la cepa Newman de S. aureus), o un polipéptido (nativo o no nativo) que tiene al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de similitud de secuencia con la misma.

Por lo tanto, a menos que se indique lo contrario, tanto las formas inmaduras como las maduras de LukA y LukB nativos, y las secuencias que tienen menos del 100% de similitud con LukA nativo (es decir, secuencias nativas y análogos por igual, denominados colectivamente aquí "LukA" y "LukB") se pueden usar en las composiciones de la presente invención, y en los métodos, y para elaborar los anticuerpos anti-LukA y anti-LukB descritos en el presente documento.

Polinucleótidos que codifican LukA y LukA y métodos de síntesis o aislamiento de LukA y LukB

Las leucocidinas LukA y LukB pueden sintetizarse a través de metodologías de ADN recombinante que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se expone a continuación una secuencia de nucleótidos (denominada SEQ ID NO: 28) que codifica el polipéptido LukA de S. aureus (Newman) (SEQ ID NO: 2). Las secuencias degeneradas (por ejemplo, que pueden ser útiles en vista de las preferencias de codón en huéspedes de elección para fines de expresión recombinante) que codifican este polipéptido y los polinucleótidos que codifican otros polipéptidos LukA son conocidos en la técnica o pueden ser diseñados por personas expertas en la técnica.

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A continuación se expone una secuencia de nucleótidos (designada aquí como SEQ ID NO: 29) que codifica el polipéptido de LukB de S. aureus (Newman), (SEQ ID NO: 27). Las secuencias degeneradas (por ejemplo, que pueden ser útiles en vista de las preferencias de codón en huéspedes de elección para fines de expresión recombinante) que codifican este polipéptido, y los polinucleótidos que codifican otros polipéptidos LukB son conocidos en la técnica o pueden ser diseñados por personas expertas en la técnica.

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Los polinucleótidos que codifican LukA y LukB pueden expresarse en un huésped tal como bacterias (E. coli), plantas y/o levadura y luego aislarse y purificarse. Alternativamente, las leucocidinas LukA y LukB pueden aislarse de bacterias S. aureus (por ejemplo, la cepa Newman) de acuerdo con técnicas estándar. Por lo tanto, estas leucocidinas pueden aislarse (de un entorno nativo o no nativo). También pueden purificarse porque están sustancialmente libres de otras proteínas y componentes celulares con los que LukA y LukB de S. aureus están asociados en su estado nativo (es decir, proteínas y componentes celulares presentes en células de S. aureus) o un estado no nativo (es decir, proteínas y componentes celulares de un huésped celular recombinante). Esquemas de purificación adecuados, que típicamente implican una combinación de al menos dos procedimientos sucesivos, son conocidos en la técnica. Véase, Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Springer-Verlag, N.Y. (1982), utilizando una o una combinación de dos o más técnicas estándar tales como cromatografía en columna de afinidad y cromatografía líquida de intercambio catiónico.

Anticuerpo anti-LukA y anticuerpos anti-LukB

También se divulgan los anticuerpos anti-Luka que se unen específicamente a Luka, y los anticuerpos anti-LukB que se unen específicamente a LukB, las composiciones terapéuticas que contienen los anticuerpos, y los métodos de uso de los mismos. El término anticuerpo incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos y formas genéticamente modificadas de los anticuerpos, y combinaciones de los mismos. Más específicamente, el término "anticuerpo", que se utiliza de forma intercambiable con el término "inmunoglobulina", incluye moléculas de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formadas por los procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normal) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) y fragmentos inmunológicamente activos de los mismos (es decir, incluyendo la porción de unión específica de la molécula de inmunoglobulina de longitud completa), que de nuevo puede ser de naturaleza natural o de naturaleza sintética. Por consiguiente, el término "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo de longitud completa, y se une específicamente a Luka, LukB o un complejo LukAB. Los métodos de elaboración y cribado de fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

En alguna parte de la divulgación, los anticuerpos anti-LukA pueden tener cierto grado de reactividad cruzada con otras subunidades S de leucocidina de Staphylococcus tales como HlgC, LukS-PVL, HlgA, LukS-I, LukE, LukEv y LukM. Del mismo modo, en alguna parte de la divulgación, los anticuerpos anti-LukB pueden tener cierto grado de reactividad cruzada con otras subunidades F de leucocidina de Staphylococcus tales como LukF'-PV, LukF-PV, LukDv, LukD, LukF-I y HlgB. Los anticuerpos anti-LukA y/o anti-LukB pueden inhibir o reducir la actividad de LukA y la actividad de LukB, respectivamente. En alguna parte de la divulgación, los anticuerpos anti-LukA y/o anti-LukB neutralizan (por ejemplo, eliminar sustancialmente) la actividad de LukA y LukB, respectivamente.

Los anticuerpos de origen natural tienen típicamente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, con cada cadena ligera unida covalentemente a una cadena pesada por un enlace disulfuro entre cadenas y múltiples enlaces disulfuro enlazan además las dos cadenas pesadas entre sí. Las cadenas individuales pueden plegarse en dominios que tienen tamaños (110-125 aminoácidos) y estructuras similares, pero diferentes funciones. La cadena ligera puede comprender un dominio variable (VL) y/o un dominio constante (CL). La cadena pesada puede comprender también un dominio variable (VH) y/o, dependiendo de la clase o isotipo del anticuerpo, tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4). En humanos, los isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, con IgA e IgG subdivididas en subclases o subtipos (IgA1-2 e IgG1-4).

Generalmente, los dominios variables muestran una considerable variabilidad de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo al siguiente, particularmente en la ubicación del sitio de unión al antígeno. Tres regiones, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) o hipervariables, se encuentran en cada una de VL y VH, que están soportadas por regiones menos variables denominadas regiones variables marco. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos monoclonales IgG, pero los anticuerpos también incluyen fragmentos de anticuerpos o formas manipuladas genéticamente. Estos son, por ejemplo, fragmentos Fv, o proteínas en las que las CDR y/o los dominios variables de los anticuerpos ejemplificados se manipulan genéticamente como proteínas de unión al antígeno de cadena sencilla.

La porción de un anticuerpo que consiste en los dominios VL y VH se designa como Fv (fragmento variable) y constituye el sitio de unión al antígeno. Un Fv de cadena sencilla (scFv o SCA) es un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio VL y un dominio VH en una cadena polipeptídica, en donde el terminal N de un dominio y el terminal C del otro dominio están unidos por un enlazador flexible. Los enlazadores peptídicos utilizados para producir los anticuerpos de cadena sencilla son típicamente péptidos flexibles, seleccionados para asegurar que se produzca un plegamiento tridimensional apropiado de los dominios VL y VH. El enlazador es generalmente de 10 a 50 residuos de aminoácidos, y en algunos casos es más corto, por ejemplo, de aproximadamente 10 a 30 residuos de aminoácidos, o de 12 a 30 residuos de aminoácidos, o incluso de 15 a 25 residuos de aminoácidos. Un ejemplo de tales péptidos enlazadores incluye repeticiones de cuatro residuos de glicina seguidos de un residuo de serina.

Los anticuerpos de cadena sencilla carecen de algunos o todos los dominios constantes de los anticuerpos completos de los que se derivan. Por lo tanto, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos enteros. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla tienden a estar libres de ciertas interacciones no deseadas entre regiones constantes de cadena pesada y otras moléculas biológicas. Además, los anticuerpos monocatenarios son considerablemente más pequeños que los anticuerpos enteros y pueden tener una permeabilidad mayor que los anticuerpos completos, permitiendo que los anticuerpos de cadena sencilla se localicen y se unan a los sitios objetivo de unión al antígeno de manera más eficiente. Además, el tamaño relativamente pequeño de los anticuerpos monocatenarios hace menos probable que provoquen una respuesta inmune no deseada en un receptor que los anticuerpos enteros.

Fab (Fragmento, unión al antígeno) se refiere a los fragmentos del anticuerpo que consisten en los dominios VL, CL, VH y CH1. Los generados después de la digestión con papaína simplemente se denominan Fab y no retienen la región de bisagra de cadena pesada. Después de la digestión con pepsina, se generan varios Fab que retiene la bisagra de cadena pesada. Aquellos fragmentos con los enlaces disulfuro entre cadenas intactos se denominan F(ab')², mientras que un único Fab' resulta cuando los enlaces disulfuro no se mantienen. Los fragmentos F(ab')²tienen una mayor avidez para el antígeno que los fragmentos Fab monovalentes.

Fc (fragmento de cristalización) es la designación de la porción o fragmento de un anticuerpo que comprende dominios constantes de cadena pesada emparejados. En un anticuerpo IgG, por ejemplo, el Fc comprende los dominios CH2 y CH3. El Fc de un anticuerpo IgA o IgM comprende además un dominio CH4. El Fc está asociado con la unión al receptor Fc, la activación de la citotoxicidad mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Para anticuerpos tales como IgA e IgM, que son complejos de múltiples proteínas similares a IgG, la formación del complejo requiere dominios constantes de Fc.

Finalmente, la región bisagra separa las porciones Fab y Fc del anticuerpo, permitiendo la movilidad de los Fab con relación a los otros y con relación a Fc, así como incluyendo múltiples enlaces disulfuro para el enlace covalente de las dos cadenas pesadas.

La "especificidad" del anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo por un epítopo particular de un antígeno. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T o bien interactuar con una molécula. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activa de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o carbohidratos o azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional". En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula que interactúa (tal como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen a través de residuos de aminoácidos sobre la proteína que están separados entre sí, es decir, aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos son típicamente retenidos por exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden verificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser murinos, humanos, humanizados o quiméricos. Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie, por ejemplo, un anticuerpo de roedor, conejo, perro, cabra, caballo o pollo (o cualquier otro anticuerpo animal adecuado), se transfieren de las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo de roedor a dominios variables ligero y pesado humanos. Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de aquellos de un anticuerpo humano. Los métodos para elaborar anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos quiméricos tienen preferiblemente regiones constantes derivadas sustancialmente o exclusivamente de regiones constantes de anticuerpo humano y regiones variables derivadas sustancialmente o exclusivamente de la secuencia de la región variable de un mamífero distinto de un ser humano. El proceso de quimerización puede hacerse más eficaz reemplazando también las regiones variables - distintas de las regiones hipervariables o de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo murino (u otro mamífero no humano) con las correspondientes secuencias humanas. Las regiones variables distintas de las CDR también se conocen como las regiones marco variables (FR). Sin embargo, otros anticuerpos monoclonales son biespecíficos, en el sentido de que tienen especificidad tanto por LukA como por LukB. Los anticuerpos biespecíficos son preferentemente humanos o humanizados.

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden obtener de acuerdo con técnicas convencionales. Por ejemplo, LukA, LukB (que como se utilizan aquí estos términos, incluyen análogos no tóxicos de los mismos tales como LukAA10C) o un fragmento inmunológicamente activo de LukA o LukB, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un mamífero tal como un humano o un ratón). Las leucocidinas se pueden usar por sí mismas como inmunógenos o pueden unirse a una proteína portadora u otros objetos, tales como perlas, tales como perlas de Sefarosa. Una vez que el mamífero ha producido anticuerpos, se aíslan una mezcla de células productoras de anticuerpos, tales como esplenocitos, a partir de las cuales se pueden obtener anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse aislando células individuales productoras de anticuerpos de la mezcla e inmortalizándolas, por ejemplo, fusionándolas con células tumorales, tales como células de mieloma. Los hibridomas resultantes se conservan en cultivo y los anticuerpos monoclonales se recogen del medio de cultivo.

Las técnicas para elaborar anticuerpos monoclonales recombinantes son bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos policlonales recombinantes pueden producirse mediante métodos análogos a los descritos en la publicación de la solicitud de patente estadounidense No. 2002/0009453, utilizando LukA, LukB o LukAB como el(los) inmunógeno(s).

Composiciones terapéuticas

LukA y LukB pueden formularse en una composición terapéutica para uso como un agente antiinflamatorio en el tratamiento de afecciones inflamatorias agudas, incluyendo afecciones inflamatorias agudas localizadas. LukA y LukB también pueden formularse en una composición terapéutica para uso como una vacuna activa. Los anticuerpos anti-LukA y anti-LukB pueden formularse en una composición terapéutica para uso como vacuna pasiva. Las vacunas pasivas y activas pueden usarse en forma profiláctica para inhibir la aparición de una infección por S. aureus, o terapéuticamente para tratar la infección por S. aureus, particularmente infecciones por S. aureus tales como MRSA que se sabe que son refractarias o en el caso del sujeto específico, han demostrado ser refractarias al tratamiento con otros antibióticos convencionales.

En las realizaciones en las que la composición terapéutica está destinada para su uso como vacuna activa, el LukA y/o el LukB pueden alterarse de modo que muestren una toxicidad reducida. Las alteraciones moleculares se describieron anteriormente. Por lo tanto, pueden usarse análogos no tóxicos de los mismos tales como LukAA10C. Los solicitantes creen que los anticuerpos producidos en respuesta al inmunógeno no tóxico neutralizarán el LukA o LukAB nativo, tóxico. Otras alteraciones con el fin de reducir la toxicidad de LukA y LukB incluyen tratamiento químico (por ejemplo, modificación de residuos de aminoácidos específicos) o conjugación con otra unidad estructural (por ejemplo, con otro antígeno bacteriano, tal como un polisacárido bacteriano o una glicoproteína bacteriana). Se conocen alteraciones químicas de otras toxinas de S. aureus con fines de inactivación o desintoxicación (o reducción de la toxicidad). Los métodos para determinar si una alteración dada reduce la toxicidad de LukA o LukB se conocen en la técnica y/o se describen en la presente memoria.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención se preparan formulando LukA y LukB con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en la presente memoria, los términos "vehículo farmacéuticamente aceptable" y "excipiente farmacéuticamente aceptable" (por ejemplo, aditivos tales como agentes diluyentes, inmunoestimulantes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y solubilizantes) no son tóxicos para la célula o mamífero que son expuestos a los mismos en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua, por ejemplo, regulada con fosfato, citrato y otro ácido orgánico. Ejemplos representativos de excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden ser útiles en la presente invención incluyen antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; adyuvantes (seleccionados para evitar la toxicidad inducida por el adyuvante, tal como un p-glucano como se describe en la patente estadounidense No. 6.355.625, o un factor de estimulación de colonias de granulocitos (GCSF)); polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS®.

Como se describe en otra parte de esta memoria, las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden contener además al menos un agente activo adicional.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden prepararse para almacenamiento mezclando el ingrediente o ingredientes activos que tienen el grado deseado de pureza con el vehículo farmacéuticamente aceptable y el excipiente opcional y/o agente activo adicional, en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

Usos de las composiciones terapéuticas - Indicaciones de condiciones inflamatorias agudas

La inflamación se entiende generalmente como la respuesta biológica protectora para eliminar estímulos invasores dañinos tales como patógenos (por ejemplo, bacterias y virus), células dañadas e irritantes e iniciar la cicatrización. La inflamación se entiende más específicamente como la reacción del tejido vivo vascularizado a la lesión. Como tal, la inflamación es un complejo estereotipado fundamental de reacciones citológicas y químicas de los vasos sanguíneos afectados y tejidos adyacentes en respuesta a una lesión o estimulación anormal causada por un agente físico, químico o biológico. La inflamación por lo general conduce a la acumulación de fluido y células sanguíneas en el sitio de la lesión, y usualmente es un proceso de curación. Sin el proceso inflamatorio, las heridas e infecciones no sanarían, y la destrucción progresiva del tejido pondría en peligro la vida. La inflamación aguda se refiere a la respuesta inicial del cuerpo a estímulos invasores e implica el reclutamiento de plasma y glóbulos blancos (leucocitos) a los tejidos lesionados o infectados. La inflamación prolongada, también conocida como inflamación crónica, implica un cambio progresivo en el tipo de células inmunes que están presentes en el sitio de la inflamación y se caracteriza por la destrucción simultánea y la curación del tejido del proceso inflamatorio.

Sin embargo, la inflamación a veces causa daño, usualmente a través de una disfunción del progreso normal de la inflamación. Enfermedades inflamatorias son aquellas pertenecientes a, caracterizadas por, causantes, resultantes de, o que se ven afectadas por la inflamación. Las "afecciones inflamatorias agudas" tal como se utiliza el término en este documento, y de acuerdo con el lenguaje médico normal, se refieren a estados inflamatorios que tienen un inicio rápido y síntomas severos. La duración del inicio, desde un estado normal del paciente hasta uno en el que los síntomas de inflamación se manifiestan seriamente, generalmente dura hasta aproximadamente 72 horas. Las afecciones inflamatorias agudas deben contrastarse con afecciones inflamatorias crónicas, que son afecciones inflamatorias de larga duración, que denotan una enfermedad que muestra poco cambio o de lenta progresión. La distinción entre condiciones agudas y crónicas es bien conocida por los profesionales médicos.

Las células inmunitarias principales implicadas en la fase aguda de la inflamación, así como en los trastornos inflamatorios agudos, incluyen células mononucleares (por ejemplo, monocitos, que en respuesta a la inflamación se diferencian en macrófagos), células dendríticas y neutrófilos (que migran al sitio inflamatorio). Estas células inmunitarias ayudan en la respuesta inflamatoria liberando mediadores inflamatorios tales como histamina, interferón gamma, interleucina 8, Ieucotrieno B4, óxido nítrico, etc., y mediante la ingesta de bacterias, virus y desechos celulares (un proceso conocido como fagocitosis). Estas células se conocen en la técnica colectivamente como fagocitos.

Los solicitantes han descubierto que LukAB ataca y mata fagocitos humanos y que esta citotoxicidad mediada por LukAB es sustancialmente específica para estas células pero no para otras células de mamífero nucleadas. Sin pretender estar sujetos a ninguna teoría particular de operación, los solicitantes creen que el complejo LukA/LukB forma poros en la membrana plasmática de los fagocitos infiltrantes, causando la muerte celular, reduciendo así la inflamación. Por lo tanto, las composiciones antiinflamatorias de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de afecciones inflamatorias agudas en mamíferos tales como seres humanos, independientemente de la causa, por ejemplo, cualquier infección bacteriana o viral, y en realizaciones preferidas, condiciones inflamatorias agudas localizadas. Otros ejemplos de estas afecciones incluyen dermatitis alérgica de contacto, hipersensibilidad aguda, lesión inflamatoria neurológica aguda (por ejemplo, causada por infección aguda), infarto agudo de miocardio, lesión neuronal aguda resultante de la cirugía de derivación cardiopulmonar y afecciones antiinflamatorias agudas localizadas causadas por bacterias o infección viral.

En realizaciones preferidas, la afección inflamatoria aguda es una herida infectada en la piel o tejido blando. Las heridas susceptibles de tratamiento con la invención pueden estar en forma de perforaciones, cortes o rasgaduras de los tejidos vivos. Las heridas de la piel pueden penetrar en la epidermis, la dermis o en el caso de las heridas de grosor completo, el tejido subcutáneo. Por lo tanto, las heridas tratables con las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen heridas profundas del esternón, por ejemplo, después de una cirugía a corazón abierto y heridas postoperatorias después de cirugía abdominal y cualquier otro tipo de cirugía. Otras heridas son aquellas que resultan de traumatismos tales como disparos de armas, cuchillos, o cualquier otro objeto capaz de causar un corte o desgarro en la piel. Heridas que surgen como un efecto secundario de la medicación o como un síntoma de diversas patologías (por ejemplo, llagas asociadas con el sarcoma de Kaposi), así como heridas internas (por ejemplo, fisuras anales y heridas o lesiones en el tracto gastrointestinal, como úlceras en el estómago o los intestinos) también pueden ser susceptibles de tratamiento con la presente invención.

Otras afecciones inflamatorias agudas que pueden ser susceptibles de tratamiento con las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen conjuntivitis, iritis, uveítis, retinitis central, otitis externa, otitis media supurativa aguda, mastoiditis, laberintitis, rinitis crónica, rinitis aguda, sinusitis, faringitis, amigdalitis, dermatitis de contacto, dermonecrosis, polineuritis diabética, polimiositis, miositis osificante, artritis degenerativa, artritis reumatoide, periartritis escapulohumeral y osteítis deformante.

Infecciones por S. aureus

También se divulga un método para inhibir el inicio o el tratamiento de la infección por S. aureus mediante la administración de las composiciones de anticuerpos a un sujeto mamífero que lo necesite. La población de sujetos objetivo incluye mamíferos, tales como seres humanos, que están infectados con, o están en riesgo de ser infectados por S. aureus. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar está infectado con S. aureus incluyendo MRSA, y/o ya ha sido tratado con antibióticos u otros agentes terapéuticos, pero el tratamiento ha fracasado.

Cantidades terapéuticamente efectivas

En el contexto del tratamiento de estados inflamatorios agudos, las cantidades de LukA y LukB son terapéuticamente eficaces en el sentido de que el tratamiento puede lograr una o más de una reducción del número de síntomas, una disminución de la gravedad de al menos un síntoma, o un retraso en el progreso adicional de al menos un síntoma, o incluso un alivio total de la afección inflamatoria aguda.

En el contexto del uso de las composiciones terapéuticas como vacunas pasivas o activas en relación con la infección por S. aureus, las cantidades terapéuticamente eficaces de anticuerpos LukA y LukB, o anti-LukA y anti-LukB, son también profilácticamente eficaces en el sentido de que la administración de la composición es capaz de conseguir cualquier entre uno o más de la inhibición o prevención de una infección por S. aureus en aquellos que están en riesgo, y en términos de sujetos mamíferos infectados con S. aureus, una reducción en el número de síntomas, una disminución en la gravedad de al menos un síntoma, o un retraso en la progresión adicional de al menos un síntoma, o incluso un alivio total de la infección.

En términos generales, las cantidades terapéuticamente eficaces de anticuerpos LukA y LukB, y anti-LukA y anti-LukB pueden determinarse de acuerdo con procedimientos estándar, que tienen en cuenta numerosos factores, incluyendo, por ejemplo, las concentraciones de estos agentes activos en la composición, el modo y la frecuencia de administración, la gravedad de la afección inflamatoria aguda o la infección por S. aureus a ser tratada (o prevenida), y los detalles del sujeto, tales como la edad, el peso y el estado de salud general y la condición inmunológica. Los lineamientos generales pueden encontrase, por ejemplo, en las publicaciones de la Conferencia Internacional de Armonización y en REMINGTON'S PHARMACEu T icAl SCIENc Es (Mack Publishing Company, 1990). Un médico puede administrar anticuerpos LukA y LukB, o anti-LukA y anti-LukB hasta que se alcance una dosis que proporcione el efecto profiláctico o terapéutico deseado o requerido. El progreso de esta terapia puede monitorearse fácilmente mediante ensayos convencionales.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de LukA y LukB oscilan típicamente entre 1-400 |jg de LukA y LukB, por dosis o diariamente. Preferentemente, las cantidades de LukA y LukB son sustancialmente las mismas. Las cantidades terapéuticamente eficaces de las composiciones de anticuerpos son típicamente al menos de 50 mg de composición por kilogramo de peso corporal (mg/kg), incluyendo al menos 100 mg/kg, al menos 150 mg/kg, al menos 200 mg/kg, al menos 250 mg/kg, al menos 500 mg/kg, al menos 750 mg/kg y al menos 1000 mg/kg, por dosis o diariamente. Las dosis para las composiciones de anticuerpos monoclonales podrían tender a ser más bajas, tal como aproximadamente una décima parte de las composiciones de anticuerpos no monoclonales, tales como al menos aproximadamente 5 mg/kg, al menos aproximadamente 10 mg/kg, al menos aproximadamente 15 mg/kg, al menos aproximadamente 20 mg/kg, o al menos aproximadamente 25 mg/kg.

Modos de Administración

Antes de la administración, las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden esterilizarse, lo cual puede realizarse fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas se pueden colocar en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica.

La composición antiinflamatoria se puede administrar por cualquier número de rutas de acuerdo con la práctica médica aceptada. Los modos preferidos incluyen la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea y percutánea, usando técnicas que son conocidas en la técnica. Pueden preverse otras vías de administración. En el caso de tratamiento de afecciones inflamatorias agudas que están localizadas, se puede preferir la administración no sistémica, en cuyo caso la administración de la composición terapéutica se realiza en o alrededor del sitio de la inflamación aguda.

Terapia de combinación

En algunas realizaciones, la composición terapéutica se administra como parte de una terapia de combinación junto con otro agente activo, dependiendo de la naturaleza de la afección inflamatoria aguda o de la infección por S. aureus que se está tratando. Tales agentes activos adicionales incluyen agentes antiinfecciosos, agentes antibióticos y agentes antimicrobianos. Los agentes antiinfecciosos representativos que pueden ser útiles en la presente invención incluyen vancomicina y lisostafina. Los agentes antibióticos representativos y los agentes antimicrobianos que pueden ser útiles en la presente invención incluyen penicilinas resistentes a penicilinasa, cefalosporinas y carbapenemasas, incluyendo vancomicina, lisostafina, penicilina G, ampicilina, oxacilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, cefalotina, cefazolina, cefalexina, cefradina, cefamandol, cefoxitina, imipenem, meropenem, gentamicina, teicoplanina, lincomicina y clindamicina. Las dosificaciones de estos antibióticos son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, MANUAL DE DIAGNÓSTICO Y TERAPIA DE MERCK, Sección 13, cap. 157, 100a Ed. (Beers & Berkow, eds., 2004). Los agentes antiinflamatorios, antiinfecciosos, antibióticos y/o antimicrobianos se pueden combinar antes de la administración, o administrarse simultáneamente (como parte de la misma composición o por medio de una composición diferente) o secuencialmente con las composiciones terapéuticas de la presente invención.

La composición de anticuerpo anti-LukA y/o anti-LukB divulgada en el presente documento puede ser multivalente ya que contiene también un anticuerpo que se une específicamente a otro antígeno bacteriano (y que opcionalmente neutraliza el otro antígeno bacteriano). Los anticuerpos pueden unirse específicamente a cualquiera de los antígenos descritos en el presente documento en el contexto de las composiciones de vacuna. De este modo, por ejemplo, el otro anticuerpo puede unirse específicamente a polisacáridos o glicoproteínas, incluyendo S. aureus Tipo 5, S. aureus Tipo 8, S. aureus 336, componentes de leucocidina tales como PVL (incluyendo las subunidades pVl individuales, LukS-PV y LukF-PV), subunidades de gamma-hemolisina (HlgA, HlgB y HlgC), LukE o LukD de S. aureus, LukM o LukF'-PV de S. aureus, ácido lipoteicóico (LTA) y componentes de la superficie microbiana que reconocen proteínas de la molécula de matriz adhesiva (MSCRAMM).

Regímenes de tratamiento

Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden administrarse en una dosis única, o de acuerdo con un protocolo de dosificación múltiple. Por ejemplo, se administran relativamente pocas dosis de la composición terapéutica, tal como una o dos dosis. En las realizaciones que incluyen terapia antibiótica convencional, que generalmente implica múltiples dosis durante un período de días o semanas, los antibióticos se pueden tomar una, dos o tres o más veces diariamente durante un período de tiempo, tal como durante al menos 5 días, 10 días o incluso 14 o más días, mientras que la composición de anticuerpos se administra generalmente sólo una o dos veces. Sin embargo, las diferentes dosificaciones, tiempos de dosificación y cantidades relativas de la composición terapéutica y los antibióticos pueden ser seleccionados y ajustados por un experto en la técnica.

Métodos de identificación de inhibidores de la citotoxicidad mediada por LukAB y formas alteradas de LukA y LukB que tienen menos toxicidad

Los anticuerpos anti-LukA y anti-LukB, y fragmentos de los mismos, así como otras fracciones terapéuticas potenciales (por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas) pueden usarse en diversos métodos (incluyendo formatos de ensayo o cribados) para evaluar su capacidad para inhibir la citotoxicidad mediada por LukAB. Como se describe más adelante, estos métodos están diseñados para identificar agentes que inhiben algún aspecto de la cascada de eventos que conduce a la citotoxicidad mediada por LukAB y la lisis de fagocitos humanos. Los métodos también están diseñados para identificar formas alteradas de LukA y LukB que poseen toxicidad reducida en relación con sus contrapartes nativas. Los eventos objetivo que forman parte de la cascada incluyen, por ejemplo, la unión de LukA a membranas de fagocito, la unión de LukB a LukA (oligomerización de LukAB) y bloqueo del poro de membrana formado por el oligómero LukAB. Los formatos de ensayo generalmente requieren fagocitos humanos (o porción de los mismos de unión a la membrana de LukAB), medio de cultivo adecuado y LukA purificado o LukA y LukB purificados.

La persona experta apreciará que los siguientes protocolos son meramente ilustrativos y que se pueden variar diversos parámetros operativos tales como condiciones de reacción, elección de la etiqueta detectable y los aparatos (por ejemplo, la instrumentación para detección y cuantificación) según se considere apropiado.

Los siguientes métodos están en general dirigidos a identificar agentes que inhiben la citotoxicidad de LukAB, sin revelar necesariamente el evento exacto que se ve afectado en la cascada.

Para identificar los inhibidores de la citotoxicidad de LukAB, se pueden sembrar en placa fagocitos humanos (por ejemplo, células PMN-HL60) en placas tratadas de cultivo de tejidos de color negro de fondo claro de 384 pozos (Corning) a razón de 5 x 103 células/pozo en un volumen final de 50 pl de RPMI (Gibco) suplementado con l0% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS). Las células pueden ser entonces puestas en contacto/mezcladas/ reaccionar/tratadas con el compuesto de ensayo/molécula (~ 5 pl/concentraciones diferentes) y luego intoxicadas con LukA y LukB, que en las realizaciones preferidas están sustancialmente purificadas (5 pl de una solución de ~0,001-2 pM), preferiblemente agregados juntos, en condiciones de cultivo para permitir la intoxicación de los fagocitos por LukA y LukB, por ejemplo, durante 1 hora a 37°C, CO2 al 5%. Como controles, las células pueden tratarse con medio de cultivo (100% viable) y con 0,1% v/v de Triton X-100 (100% de muerte).

Las células tratadas como se ha descrito anteriormente pueden incubarse después con un colorante para controlar la viabilidad celular tal como CellTiter (Promega) (que permite la determinación de la viabilidad celular a través de la absorbancia midiendo el número de células viables en un cultivo por cuantificación de la actividad metabólica de las células) y se incuba durante un período de tiempo adicional (por ejemplo, aproximadamente 2 horas a 37°C, CO2 al 5%). La viabilidad celular puede determinarse, por ejemplo, midiendo la reacción colorimétrica a 492 nm usando un lector de placas, por ejemplo, un lector de múltiples etiquetas Envision 2103 (Perkin-Elmer). Se puede calcular el porcentaje de células viables, por ejemplo utilizando la siguiente ecuación:% Viabilidad = 100 x [(Ab492Muestra -Ab492Triton X) / (Ab492Medio de cultivo del tejido). Un aumento en la viabilidad del 100% sugiere la inhibición de la citotoxicidad de LukAB.

Una variación de este ensayo se denomina ensayo de daño a la membrana. En estas realizaciones, las células tratadas como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, hasta e incluyendo el tratamiento de las células con el compuesto/ molécula de ensayo y luego intoxicando las células con LukA purificado), pueden incubarse después con un colorante fluorescente impermeable a las células tal como verde SYTOX (0,1 pM; Invitrogen) (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se incuba, por ejemplo, durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente en la oscuridad. La fluorescencia, como un indicador de daños en la membrana, puede entonces medirse usando un lector de placas tal como el lector de múltiples etiquetas Envision 2103 (Perkin-Elmer) a 485 nm de excitación, 535 nm de emisión. Una disminución en la fluorescencia sugiere la inhibición de la citotoxicidad LukAB.

Juntos, estos ensayos facilitan la identificación de compuestos que inhiben o reducen los efectos citotóxicos de LukAB frente a las células de fagocitos humanos.

Pueden usarse métodos adicionales, independientemente o conjuntamente, con los métodos descritos anteriormente, particularmente si los métodos anteriores revelan actividad inhibidora, lo que permitirá a una persona experta en el campo determinar con mayor precisión qué evento en la cascada bioquímica está siendo afectando o atacado por el agente. Estos eventos incluyen la unión de LukA a membranas de fagocitos, unión de LukB a LukA (oligomerización de LukAB) y bloqueo del poro de membrana formado por el oligómero LukAB.

Cribado de inhibidores de LukA que se unen a las células objetivo

Para cribar inhibidores que bloquean o reducen la unión de LukA a las células objetivo, que se cree que es el primer paso en el proceso de intoxicación, se pueden sembrar en placa fagocitos humanos (por ejemplo, células PMN-HL60) en placas tratadas para cultivo de tejidos de fondo plano de 384 pozos (Corning) a razón de 2,5 x 103 células/pozo en un volumen final de 50 pl de RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS). Las células pueden ser luego tratadas con el compuesto/molécula de ensayo (~ 5 pl/concentraciones diferentes) e intoxicadas con 5 pl de LukA purificado, marcado en forma fluorescente (por ejemplo, FITC, Cy3, Cy5, APC, PE) de una solución de ~ 0,01-2 pM durante 1 h a 37°C, CO2 al 5%. Para evaluar la eficacia de los compuestos/moléculas ensayados, se puede medir la fluorescencia asociada a las células como un indicador de la unión de LukA a las células, por ejemplo, utilizando un sistema automatizado de formación de imágenes microscópicas de fluorescencia diseñado para un análisis de alto contenido y cribado de alto contenido (por ejemplo, un lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific) (Excitación a 485 nm, Emisión a 535 nm)).

Cribado para inhibidores de oligomerización/interacción de LukA-LukB

Para cribar inhibidores que bloquean o reducen la interacción de LukA/LukB que se cree que es el segundo paso en el proceso de intoxicación, se pueden sembrar en placa fagocitos humanos (por ejemplo, células PMN-HL60) en placas tratadas para cultivo de tejidos de fondo plano de 384 pozos (Corning) a razón de 2,5 x 103 células/pozo en un volumen final de 50 pl de RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS). Las células pueden ser luego tratadas con el compuesto/molécula de ensayo y luego intoxicadas con una mezcla de LukA purificado y LukB purificado donde LukB está marcado en forma fluorescente con una molécula fluorescente tal como FITC, Cy3, Cy5, APC, PE, y se deja reposar hasta completar el proceso de intoxicación (por ejemplo, durante 1 hora a 37°C, CO2 al 5%). Para evaluar la eficacia de los compuestos/moléculas ensayados, se puede medir la fluorescencia de LukB-FITC asociada a las células como un indicador de la unión de la interacción LukA/LukB-FITC, usando por ejemplo, un sistema automatizado de formación de imágenes microscópicas de fluorescencia diseñado para un análisis de alto contenido y cribado de alto contenido (por ejemplo, un lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific) (Excitación a 485 nm, Emisión a 535 nm)).

Cribado para inhibidores de la formación de poros de LukAB

Para cribar inhibidores que bloquean o inhiben la formación del poro de LukAB, la molécula efectora que conduce a la lisis celular, se pueden sembrar en placa fagocitos humanos (por ejemplo, células PMN-HL60) en placas tratadas para cultivo de tejidos color negro de fondo claro de 384 pozos (Corning) a razón de 2,5 x 103 células/pozo en un volumen final de 50 pl de RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS). Las células pueden ser luego tratadas con el compuesto/molécula de ensayo (~ 5 pl que contienen diferentes concentraciones) y luego se intoxican con LukAB purificado (~ 0,001-2 pM) durante 10 minutos a 37°C, CO2 al 5%. Como controles, se pueden tratar las células PMN-HL60 con medio de cultivo (control negativo) y con Triton X100 al 0,1% v/v (control positivo).

Para evaluar directamente los poros de LukAB en la superficie de las células huésped, se puede usar un ensayo de afluencia de bromuro de etidio (EB). EB es un colorante catiónico pequeño que es impermeable en células huésped sanas. Tras la formación de poros catiónicos por LukAB, EB entra en las células y se une al ADN, lo que da lugar a la fluorescencia. La célula tratada de esta manera puede entonces incubarse con EB (5 pM) durante 5 minutos adicionales a temperatura ambiente en la oscuridad. Para evaluar la eficacia de los compuestos/moléculas ensayados en la inhibición de la formación de poros de LukAB, puede medirse la fluorescencia como un indicador de la formación de poros, usando un lector de placas tal como el lector de múltiples etiquetas Envision 2103 (Perkin-Elmer) a una excitación de 530nm, emisión de 590 nm. Este ensayo facilita la identificación de moléculas que pueden bloquear o inhibir el poro de LukAB, que aliviará la toxicidad mediada por LukAB.

Método para determinar la producción de LukAB por aislados clínicos de S. aureus para predecir la gravedad de la infección

También se divulga un método para predecir o evaluar la gravedad de una infección por S. aureus que implica detectar la presencia o cantidad de LukA y/o LukB, o sus genes correspondientes, en una muestra biológica obtenida de un sujeto infectado. Por lo tanto, la detección de la presencia o de cantidades relativamente elevadas de LukA y/o LukB, o la detección de sus genes correspondientes (por ejemplo, como se muestra en la cepa Newman de S. aureus, 4645, y en cepas de MRSA USA300 y USA500) con relación a un control (por ejemplo, las cepas USA100 y USA400 de S. aureus) que produce cantidades pequeñas o indetectables de LukA y/o LukB, es indicativa de una infección grave. Con respecto a la detección o presencia de cantidades relativas de LukA y/o LukB, se puede hacer referencia a las ilustraciones de la Fig. 4A. A continuación se describen realizaciones representativas del método.

Análisis de inmunotransferencias para determinar los niveles de LukA y LukB

Para determinar los niveles de LukAB (es decir, la producción de LukAB), se obtiene la muestra biológica, por ejemplo, una muestra de fluido (por ejemplo, sangre) o de tejido del sujeto infectado, seguido por la exposición del cultivo a condiciones de cultivo adecuadas para permitir el crecimiento de S. aureus, obteniendo el sobrenadante de cultivo, separando las proteínas bacterianas del mismo, identificando LukA y/o LukB, y luego cuantificando LukA y/o LukB.

Más específicamente, las cepas clínicas aisladas pueden seleccionarse y crecer en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, medio de cultivo 1640 (RPMI, Invitrogen) del Royal Park Memorial Institute suplementado con ácidos Casamino (RPMI CAS) al 1% bajo condiciones de cultivo adecuadas, por ejemplo, durante 12-18 horas a 37°C con agitación a 180 rpm. Las bacterias pueden ser luego precipitadas por centrifugación y se recolectan los sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes de cultivo (~ 30 j l ) se pueden mezclar luego con 10 j l de regulador SDS - Laemmli y se calienta a 95°C durante 10 minutos. Luego se pueden separar las proteínas, por ejemplo, utilizando geles de SDS-PAGE al 15% y luego transferirlas a un soporte sólido, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa. Las membranas pueden incubarse luego con anticuerpos dirigidos contra LukA o LukB (por ejemplo, anticuerpos policlonales de conejo), y se puede visualizar la presencia de LukA o LukB mediante la detección de los complejos anticuerpo-LukA/anticuerpo-LukB con un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo (por ejemplo, anticuerpo anticonejo conjugado con AlexaFluor-680, Invitrogen). Luego se pueden secar y escanear las membranas, por ejemplo, utilizando un sistema de formación de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Biosciences) para determinar las cantidades de LukA y LukB.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar la presencia de los genes de LukA y/o LukB.

Para determinar la presencia de los genes que codifican para LukAB, se obtiene la muestra biológica del sujeto infectado, seguido por la exposición del cultivo a condiciones de cultivo adecuadas para permitir el crecimiento del S. aureus, extraer el ácido nucleico del S Aureus y, a continuación, realizar al menos una ronda de amplificación del ácido nucleico utilizando PCR u otro protocolo de amplificación adecuado, utilizando cebadores específicos para LukA y/o LukB, y detectar LukA y/o LukB. Por tanto, en una realización representativa, después de la preparación inicial de la muestra, las cepas clínicas aisladas pueden crecer en un medio sólido, por ejemplo, caldo de soja tríptico (TSB) solidificado con agar al 1,5% a 37°C. Se pueden seleccionar entonces las colonias de S. aureus y digerir enzimáticamente, por ejemplo, con 2 mg/ml de lisostafina (AMBI PRODUCTS LLC) en regulador TSM (TRIS 100 mM pH 7, sacarosa 500 mM, MgCh 10 mM)] durante 10 minutos a 37°C. Las muestras pueden ser luego centrifugadas, el sobrenadante descartado y el sedimento resuspendido con 100 j l de agua estéril, seguido por ebullición durante cinco minutos a 100°C y centrifugación. El sobrenadante proporciona el material de partida y el molde de ADN para una reacción de amplificación tal como PCR usando cebadores específicos para LukA y/o LukB.

Ejemplos de trabajo

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. A menos que se especifique lo contrario, todas las partes son en peso.

Ejemplo 1: Expresión y purificación de LukA y LukB recombinantes bajo condiciones nativas: sistema de expresión pMAL

Los genes para Luka y LukB fueron amplificados a partir del ADN de S. aureus con Taq polimerasa en la configuración estándar de PCR con una temperatura de 55°C utilizando los siguientes cebadores: 5'-ccc-GTCGAC-tta-TCCTTCTTTAT AAGGTTTATTGTC-3' (SEQ ID NO: 30) y 5'-ccc-GAAGGATTTCACATCATCATCATCATCACAATTCAGCTCATAAAGAC TCTC-3' (SEQ ID NO: 31) para Luka y 5'-CCCCGAAGGATTTCaCATCATCATCATCATCACAAGATTAATTCTGAAATC AAACAAG-3' (SEQ ID NO: 32) y 5'-ccc-GTCGAC-tta-TTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTT-3' (SEQ ID NO: 33) para LukB. Los productos génicos de LukA y LukB se digirieron con Nde1 y Sal1 (New England BioLabs) y se ligaron en el vector pMAL-c4X (New England BioLabs). Los constructos se transformaron en la cepa DH5a de E. coli y los insertos del plásmido se confirmaron mediante secuenciación. Los transformantes se cultivaron en Caldo Terrific con 100 jg/m l de ampicilina y 0,2% de glucosa a 37°C hasta que los cultivos alcanzaron una A600 de ~0,5. La expresión de MBP-LukA etiquetado con 6-his o MBP-LukB etiquetado con 6-his se indujo con isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido 0,3 mM (IPTG) a 16°C, durante la noche, con agitación a 180 rpm.

Después de la inducción, se recogieron las células a través de centrifugación a 4000 rpm a 4°C durante 20 min y se resuspendieron en regulador de columna enfriado con hielo (Tris-HCl 20 mM, NaCl 200 mM, y EDTA 1 mM) suplementado con inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche). Las células bacterianas se sonicaron sobre hielo durante 1 minuto (pulsos de 10 segundos). Las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm a 4°C durante 30 min y se recogió el sobrenadante y se lo aplicó a una columna de resina de amilosa. Las columnas se lavaron dos veces con regulador de columna y se eluyeron MBP-LukA etiquetado con 6-his o MBP-LukB etiquetado con 6-his purificados en 10 fracciones con regulador de columna suplementado con maltosa 10 mM.

Ejemplo 2: Expresión y purificación de las toxinas LukA, LukAA10C, A33NLukA y LukB activas recombinantes: sistema de expresión pET14b

Los genes para LukA, LukAA10C, A33NLukA y LukB fueron amplificados a partir del ADN de S. aureus con polimerasa Vent (New England Biolabs) bajo configuraciones estándar de PCR con una temperatura de 55°C usando los ^{siguientes cebadores: 5'-cccc-CTCGAG-AATTCAGCTCATAAAGACTCTCAAG-3'}(S^eQ ^{ID NO: 34) y 5'-cccc-}GGATCC-tta-TCCTT CTTTATAAGGTTTATTGTC-3' (SEQ ID NO: 35) para Luka; 5'-cccc-CTCGAG-AATTCAGCTCATAAAGACTCTCAAG (SEQ ID NO: 34) y 5'-cccc-GGATCC-tta-ATATTTATCAACGACTTTAACTG (SEQ ID NO: 36) para LukAA10C; 5'-cccc-CTCGAG-TCAACAGCACCGGATGATATTG (SEQ ID NO: 37) y 5'-ccccGGATCC-tta-TCCTTCTTTATAAGGTTTAT TGTC (SEQ ID NO: 35) para A33NLukA; 5'-cccc-CTCGAG-AAGATTAATTCTGAAATCAAACAAG-3' (SEQ ID NO: 38) y 5'-cccc-GGATCC-tta-TTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTTT-3' (Se Q ID NO: 39) para LukB. Los productos génicos se digirieron con Xho1 y BamH1 (New England BioLabs) y se ligaron al vector pET14b (Novagen) fusionando la secuencia codificante de una etiqueta de histidina a la región 5' de los genes. Los plásmidos de expresión se transformaron en la cepa DH5a de E. coli y los insertos plasmídicos se confirmaron mediante secuenciación. Los plásmidos se purificaron y transformaron en la expresión de la cepa T7 lysY/lq de E. coli (New England BioLabs).

Para la purificación en condiciones desnaturalizantes, se cultivaron los transformantes en Caldo Terrific con 100 pg/ml de ampicilina a 37°C hasta que los cultivos alcanzaron una A600 de ~0,5. La expresión de LukA etiquetado con 6-his o LukB etiquetado con 6-his fue inducida con IPTG 0,4 mM a 37°C, durante 3 h, con agitación a 180 rpm. Después de la inducción, se recolectaron las células a través de centrifugación a 4000 rpm a 4°C durante 15 min y luego se resuspendieron en TBS 1X (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Las células bacterianas se sonicaron en hielo durante 2 min (pulsos de 10 segundos). Las bacterias sonicadas se ultracentrifugaron durante 30 min a 50.000 rpm. Los sedimentos se resuspendieron en regulador de lisis (NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM, urea 8 M, pH 8,0) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min con movimiento tipo asador. Las muestras se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min y se aplicaron los sobrenadantes en una columna que contenía resina Ni-NTA (Qiagen). La columna se lavó dos veces con regulador de lavado (NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM, urea 8 M, pH 6,3) y se eluyó la proteína de la columna usando regulador de elución (NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM, urea 8 M) a pH 5,9 ya pH 4,5. Se reunieron las fracciones que contenían proteína purificada, determinada por SDS-PAGE, se diluyeron 1:1 en solución salina regulada con Tris (TBS, Tris 500 mM, NaCl 1,5 M, pH 7,5) y se dializaron en TBS a 4°C durante una noche para eliminar la urea y permitir el nuevo plegamiento. Se cuantificaron LukA etiquetado con 6-his y LukB etiquetado con 6-his purificados usando el kit de ensayo de proteínas BCA de Thermo Scientific Pierce.

Para purificación bajo condiciones nativas, se cultivaron los transformantes en caldo Luria-Bertani con 100 pg/ml de ampicilina a 37°C hasta que los cultivos alcanzaron una A600 de ~0,5. Se indujo la expresión de LukA etiquetado con 6-his, LukAA10C etiquetado con 6-his, A33NLukA etiquetado con 6-his o LukB etiquetado con 6-his, con IPTG 0,05 0,1 mM a 25-30°C, durante 3 horas, con agitación a 220 rpm. Después de la inducción, se recolectaron las células a través de centrifugación a 4000 rpm a 4°C durante 15 min y después se resuspendieron en 1X TBS (Tris 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5) con imidazol 10 mM y un cóctel HALT de inhibidor de proteasa libre de EDTA (Thermo Scientific). Se sonicaron las células bacterianas sobre hielo. Las bacterias sonicadas se centrifugaron durante 20 minutos a 20.000 rpm. Los sobrenadantes se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 1 hora a 4°C con un movimiento tipo asador. Las muestras se aplicaron a una columna y se lavó la columna con regulador de lavado 1X TBS (Tris 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5) con imidazol 25 mM. Se eluyó la proteína de la columna usando imidazol 50-500 mM en regulador de elución 1X TBS (Tris 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5). Se reunieron las fracciones que contenían proteína purificada, como se determinó por SDS-PAGE, se diluyeron 1:1 en 1X TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) y se dializaron en 1X TBS a 4°C durante la noche. Se cuantificaron LukA y LukB etiquetados con 6-his purificados usando el kit de ensayo de proteínas BCA de Thermo Scientific Pierce.

Ejemplo 3: Expresión y purificación de LukA y LukB recombinantes desnaturalizados

Los genes para LukA y LukB se amplificaron a partir del ADN de S. aureus con la polimerasa Vent (New England BioLabs) en condiciones estándar de PCR con una temperatura de hibridación de 55°C usando los cebadores siguientes: 5'-ggg-CATATG-AATTCAGCTCATAAAGACTCTCAA-3' (SEQ ID NO: 40) y 5'-ccc-GTCGAC-TCCTTCTTTAT AAGGTTTATTGTC-3' (SEQ ID NO: 41) para LukA y 5'-ggg-CATATG-AAGATTAATTCTGAAATCAAACAAG-3' (SEQ ID NO: 42) 5'-ccc-GTCGAC-TTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTT-3' (SEQ ID NO: 43) para LukB. Los productos génicos de LukA y LukB se digirieron con Nde1 y Sal1 (New England BioLabs) y se ligaron en el vector pET41b (Novagen). Se transformaron primero los constructos en células DH5a y luego se transformaron en la cepa de expresión ER2566 de E. coli (New England BioLabs). Los transformantes se cultivaron en Caldo Terrific con kanamicina, 25 pg/ml, durante 2,5 horas a 37°C y se indujo la expresión de LukA y LukB con IPTG 0,3 mM a 37°C durante 2 horas con agitación a 180 rpm. Las células se sedimentaron y resuspendieron en 1X TBS (Tris 500 mM, NaCl 1,5 M, pH 7,5) y se sonicaron en hielo durante 1 minuto (impulsos de 10 segundos). Las bacterias sonificadas se centrifugaron durante 30 minutos a 50.000 rpm.

Con el fin de purificar el LukA y el LukB etiquetados con 6-his en el extremo C-terminal en condiciones desnaturalizantes, se resuspendieron los sedimentos en regulador de lisis (NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM, urea 8 M, pH 8,0) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con movimiento tipo asador. Las muestras se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min y se aplicaron los sobrenadantes a una columna de Ni-NTA. Las columnas se lavaron dos veces con regulador de lavado (NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM, pH 6,3) y se eluyeron LukA y LukB de las columnas usando regulador de elución (NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, urea 8 M) a pH 5,9 y a pH 4,5. Se cuantificaron los LukA y el LukB etiquetados con 6-his purificados usando el ensayo de proteínas DC de BioRad.

Ejemplo 4: Producción de anticuerpos policlonales anti-LukA y anti-LukB

Se inyectó LukA recombinante desnaturalizado (250 pg) emulsionado en adyuvante completo de Freund (FCA) en conejos blancos de Nueva Zelanda. Los animales fueron reforzados con LukB recombinante (125 pg) emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (FCA) al día veintiuno (21) y al día cuarentainueve (49).

Se inyectó LukB recombinante desnaturalizado (250 pg) emulsionado en adyuvante completo de Freund (FCA) en conejos blancos de Nueva Zelanda. Los animales fueron reforzados con LukA recombinante (125 pg) emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (FCA) al día veintiuno (21) y al día cuarentainueve (49).

Ejemplo 5: La leucocidina A/B es predominantemente responsable de la muerte mediada por citotoxina de fagocitos humanos a través de la ruptura de la membrana

Líneas celulares utilizadas

Como modelo para estudiar cómo LukAB ataca y mata fagocitos humanos, se usaron células HL-60 (ATCC CCL-240, una línea celular promielocítica humana). Las células HL-60 se cultivaron en medio RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) a 37°C con CO²al 5%. Para diferenciar las células HL-60 en células semejantes a neutrófilos (PMN-HL60), los cultivos fueron suplementados con dimetilsulfóxido (DMSO) al 1,5% (v/v) y se desarrollaron durante 4 días.

Métodos/ensayos utilizados

Ensayo de toxicidad celular

Para evaluar la viabilidad de células de mamífero después de la intoxicación con leucocidina AB (LukAB) de Staphylococcus aureus, se sembraron células PMN-HL60 en placas tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Corning) a razón de 1 x 10⁵células/pozo en un volumen final de 100 pl de RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS). Las células se intoxicaron durante 2 horas a 37°C, CO²al 5% con diluciones en serie de 2 veces del filtrado de cultivo de la cepa Newman de Staphylococcus aureus en un intervalo de 20% a 0,16% v/v por triplicado. Los experimentos se realizaron utilizando exoproteínas de una cepa de tipo silvestre y exoproteínas de una cepa carente de LukAB (cepa mutante). Los controles para viabilidad del 100% incluyeron medio de cultivo de tejidos al 20% v/v (RPMI 10% de suero fetal bovino inactivado por calor) y medio de cultivo de S. aureus al 20% v/v (aminoácidos RPMI Cas). Se utilizó 0,1% v/v de Triton X-100 como control para la muerte celular al 100%. Después de la intoxicación, se añadieron 10 pl de CellTiter (Promega) a cada pozo y se incubaron las células durante 3 horas adicionales a 37°C, CO²al 5%, CellTiter controla las células metabólicamente activas (cambio de color), una propiedad perdida en células muertas. La reacción colorimétrica se midió a 492 nm usando un lector de múltiples etiquetas Envision 2103 de Perkin Elmer. El porcentaje de células viables se calculó usando la siguiente ecuación:% de Viabilidad = 100 x [(Ab⁴⁹²Muestra - Ab⁴⁹²Triton X) / (Ab⁴⁹²Medio de cultivo de tejidos).

Ensayo de daño a la membrana

Un ensayo alternativo para medir la citotoxicidad mediada por LukAB es evaluar la integridad de las membranas de las células huésped. Para ello, se empleó un ensayo de permeabilidad con verde SYTOX (Invitrogen). Las células sanas son impermeables al verde SYTOX, pero se vuelven permeables al tinte una vez que se ha comprometido la integridad de la membrana celular. Dentro de las células, el verde SYTOX se une al ADN y exhibe una fuerte fluorescencia.

Para evaluar la integridad de las membranas de las células huésped después de la intoxicación con LukAB o infección ex vivo con cepas de S. aureus, se sembraron células PMN-HL60 en placas tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Corning) a razón de 1 x 10⁵células/pozo en un volumen final de 100 pl de RPMI (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS). Las células fueron intoxicadas con diluciones del filtrado del cultivo de la cepa Newman de S. aureus en el intervalo entre el 20% y el 0,16% v/v o infectadas con MOI en el intervalo de 1-100 por triplicado durante 2 horas a 37°C, CO²al 5%. Los experimentos se realizaron utilizando una cepa de tipo silvestre y una cepa carente de LukAB (cepa mutante). Los controles para la fluorescencia de fondo incluyeron medio de cultivo de tejidos al 20% v/v (RPMI 10% de suero fetal bovino inactivado por calor) y medio de cultivo de S. aureus al 20% v/v (aminoácidos RPMI Cas). Después de la intoxicación o infección, se transfirieron las células a una placa de fondo en v de 96 pozos (Corning) y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. El sobrenadante se descartó y los sedimentos se resuspendieron en 100 pl de PBS verde SYTOX (0,1 pM, Invitrogen). Luego se transfirieron las células a una placa tratada con cultivo de tejidos de color negro de fondo claro de 96 pozos (Corning) y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. La fluorescencia se midió usando un lector de múltiples etiquetas Envision 2103 de Perkin Elmer (excitación a 485 nm, emisión a 535 nm).

Resultados

LukAB ataca y mata fagocitos primarios humanos

La intoxicación de células mononucleares periféricas humanas primarias (PBMC) (Figura 3a), monocitos, macrófagos, células dendríticas (Figura 3b) y células polimorfonucleares (PMN) (Figura 3c) con sobrenadantes de cultivo filtrados de la cepa Newman de S. aureus dio como resultado una muerte celular potente según se examinó mediante el ensayo de toxicidad celular (Figuras 3a-c). La intoxicación de estas células con sobrenadantes de cultivo filtrados de la cepa Newman de S. aureus que carece de hemolisina (hla), Y-hemolisina (hlg), leucocidina E/D (LukED) o leucocidina A/B (LukAB) reveló que las exoproteínas de cepas negativas para hla , hlg y LukED son tan citotóxicas como la cepa Newman de tipo silvestre (TS) (tal como se examinó mediante el ensayo de toxicidad celular), lo que indica que ninguna de las leucotoxinas anteriormente descritas producidas por Newman contribuye a la muerte de estas mediada por citotoxinas (Figuras 3a-c). Por el contrario, se observó muy poca muerte celular cuando las células estaban intoxicadas con exoproteínas de la cepa Newman que carecía de LukAB (AlukAB). La falta de actividad citotóxica por la cepa Newman que carece de LukAB fue rescatada proporcionando los genes para lukAB en trans en un plásmido (AlukAB/ pLukAB) (Figura 3c). Es importante destacar que este fenotipo es totalmente dependiente de LukAB según lo determinado mediante la intoxicación de PMN con LukA y LukB recombinantes purificados. Las subunidades individuales no mostraron ninguna citotoxicidad detectable hacia los PMN (Fig. 3d). Por el contrario, la combinación de ambas subunidades dio lugar a una potente citotoxicidad hacia estas células de una manera dependiente de la dosis (Figura 3d). En conjunto, estos resultados demuestran que LukAB es responsable de la capacidad de S. aureus para atacar y matar fagocitos humanos primarios, células inmunitarias clave necesarias para proteger al huésped contra agentes infecciosos.

LukAB mata preferentemente las células fagocíticas humanas

La intoxicación de la línea celular de tipo neutrófilo (PMN-HL60) y la línea celular de tipo macrófago (THP1 PMA) con sobrenadantes de cultivo filtrados de la cepa Newman de S. aureus resultó en una muerte celular potente según se examinó mediante el ensayo de toxicidad celular (Figura 3). La intoxicación de estas células con sobrenadantes de cultivo filtrados de S. aureus de TS y las cepas mutantes de citotoxinas isogénicas (hla, hlgABC, LukED y LukAB) reveló que LukAB es responsable de la capacidad de S. aureus para matar estas células según lo determinado por el ensayo de toxicidad celular (Figuras 4a y 4b). La falta de actividad citotóxica por la cepa Newman que carece de LukAB fue rescatada mediante la transformación de la cepa Newman que carece de LukAB con un plásmido que expresa lukAB (AlukAB/pLukAB) (Figura 4c). Las exoproteínas de esta cepa fueron extremadamente citotóxicas tanto paras las células PMN-HL60 como para las células t HP-1 PMA, proporcionando una fuerte evidencia de que LukAB es una potente toxina estafilocócica que ataca y mata células humanas.

Para descartar además la contribución de otros factores presentes en el sobrenadante del cultivo de S. aureus, se intoxicaron las células PMN-HL60 con LukA o LukB recombinante purificado. Las subunidades individuales no mostraron ninguna citotoxicidad detectable hacia PMN-HL60 (Fig. 3d). Por el contrario, la combinación de ambas subunidades dio lugar a una potente citotoxicidad hacia estas células de una forma dependiente de la dosis (Figura 3d). Además de las células PMN-HL60 y THP-1 PMA, varias otras líneas celulares humanas que incluyen el progenitor mieloide a partir de las cuales se diferencian las PMN-HL60 (HL60), el progenitor de monocitos a partir del cual se diferencian THP-1 PMA (THP-1), linfocitos (células HuT y Jurkat) y células epiteliales (293T y HepG2) también se intoxicaron con LukAB recombinante (Figura 4e). Estos resultados demuestran que LukAB preferiblemente ataca y mata células fagocíticas humanas y no tiene ningún efecto sobre linfocitos humanos o células epiteliales. Juntos estos resultados demuestran que LukAB desempeña un papel significativo en la muerte mediada por S. aureus de los fagocitos.

LukAB es producido por cepas clínicamente relevantes de S. aureus

Los análisis de inmunotransferencias con un anticuerpo policlonal producido contra LukB revelaron que LukB es producido por una serie de cepas estafilocócicas incluyendo cepas de MRSA asociadas con infecciones adquiridas en el hospital y en la comunidad (USA300, 400 y 500, Figura 5a). Es importante destacar que los niveles de LukB están asociados con el fenotipo citotóxico de estas cepas (Figuras 5a y 5b). Las cepas que producen altos niveles de LukB (por ejemplo, Newman, 4645, USA 500 y USA 300) eran más citotóxicas hacia las células PMN-HL60 que las cepas que producen LukB en forma baja o indetectable (por ejemplo, USA100 y USA400) (Figura 5b). Para investigar el papel de LukAB en cepas de MRSA, se creó un mutante isogénico de LukAB en el clon aislado clínico USA tipo 300 LA (Figura 5c). Como se observó con la cepa Newman, las exoproteínas de la cepa USA300 que carecían de LukAB eran notablemente menos citotóxicas que las exoproteínas de la cepa parental (Figura 5d). Estos datos demuestran que LukAB es una citotoxina importante producida por cepas de MRSA.

LukAB daña las membranas de los fagocitos humanos

La intoxicación de PMN-HL60 con exoproteínas de S. aureus dio como resultado el redondeo e hinchamiento nuclear de las células, un fenotipo dependiente de LukAB (Figura 6a). Este fenotipo de redondeo e hinchamiento de la célula se asoció con una mayor permeabilidad de la membrana según se determinó mediante el ensayo de daño a la membrana (Figuras 6b y 6c). Es importante destacar que las exoproteínas de la cepa negativa para LukAB mostraron poco o ningún efecto sobre la permeabilidad de la membrana, un fenotipo que fue rescatado produciendo LukAB a partir de un plásmido (Figura 6b) y LukAB recombinante, pero las subunidades individuales de toxina no causan daño a la membrana en una forma dependiente de la dosis (Figura 6c). Además, la infección de PMN primarios humanos tanto con una cepa de S. aureus sensible a la meticilina (MSSA) como con una cepa USA300 de S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) dio como resultado un daño a la membrana dependiente de LukAB (Figura 6d). Estos resultados demuestran que LukAB daña la membrana plasmática de las células huésped durante la infección ex vivo.

LukAB protege a S. aureus de la muerte mediada por el huésped, atacando y matando fagocitos.

La infección de células PMN-HL60 con S. aureus TS, AlukAB y el AlukAB que albergaba el plásmido de expresión lukAB (AlukAB/pLukAB) reveló que se requiere LukAB para que la capacidad de S. aureus rompa la membrana de los fagocitos durante la interacción estafilococo-fagocito (Fig. 7a), como se determina por el ensayo de daño a la membrana. Es importante destacar que S. aureus que produce un exceso de LukAB (AlukAB/plukAB) exhibió más daño a la membrana que la cepa de TS (Figura 7a) demostrando que LukAB daña potentemente las membranas de las células huésped. La infección de sangre entera humana (Figura 7b) y los neutrófilos humanos primarios purificados (PMN, Figura 7c) reveló que el estafilococo negativo para lukAB mataba más eficientemente en comparación con la cepa de TS (Figuras 7b y 7c). Es importante destacar que el fenotipo atenuado exhibido por el estafilococo negativo para AlukAB fue rescatado con el plásmido de expresión lukAB (Figuras 7b y 7c). La intoxicación de los PMN primarios humanos con el filtrado del cultivo de S. aureus de TS, AlukAB, y la cepa mutante AlukAB que contiene el plásmido de expresión lukAB reveló que LukAB ataca y mata PMN primarios humanos (Figura 7d). Estos datos indican fuertemente que LukAB es una potente citotoxina estafilocócica que ataca y mata PMN a través de la ruptura de la membrana, protegiendo así a S. aureus de la muerte mediada por PMN.

LukAB contribuye a la patogénesis de S. aureus in vivo

Los ratones infectados en forma retro-orbital con S. aureus que contenían un constructo informador de luciferasa con el promotor de LukAB fusionado a él (pLukAB-Xenl) mostraron actividad del promotor de LukAB en abscesos de riñón, donde como informador sin promotor (pXenl) no mostró actividad (Fig. 8a). Estos datos demuestran que LukAB se expresa in vivo en un modelo de absceso renal de la infección. Además, los ratones infectados en forma retro-orbital con S. aureus de TS pero no una cepa de S. aureus carente de LukAB mostraron una colonización extensa de los riñones. El defecto de colonización observado en la cepa negativa para LukAB se restableció a los niveles de TS proporcionando LukAB en trans (Figura 8b). Juntos, estos datos muestran que LukAB es una importante citotoxina estafilocócica que contribuye a la patogénesis de la bacteria.

LukAB forma poros en la membrana celular objetivo que pueden ser bloqueados con polietilenglicol

La intoxicación de células PMN-HL60 con LukAB recombinante (rLukAB) reveló que tanto rLukA como rLukB se unen a células objetivo según se determinó mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos LukA y LukB (Figura 9a). También se confirmó la unión de rLukAB etiquetado con 6-His a PMN-HL60 usando clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y un anticuerpo específico de His (Figura 9b). Los oligómeros de rLukAB también se detectaron mediante inmunotransferencia en membranas de PMN-HL60 después de intoxicación con la toxina recombinante, lo que indica que LukAB forma estructuras de orden superior en las membranas de células objetivo (Figura 9c). Es importante destacar que la intoxicación de PMN-HL60 con rLukAB demostró que LukAB forma poros permeables al bromuro de etidio en las membranas de células objetivo que pueden bloquearse usando moléculas de polietilenglicol (PEG) (Figura 9d), y que el bloqueo de los poros de LukAB aumenta la viabilidad de las células (Figura 9e). Además, los PEG bloquean específicamente los poros de LukAB, ya que los poros formados en las membranas de PMN-HL60 por la saponina no fueron bloqueados por los PEG y como resultado estas células no estaban protegidas de la muerte mediada por los poros. Estos datos demuestran que los poros de LukAB pueden ser bloqueados por moléculas pequeñas y el bloqueo de los poros de LukAB protege a las células de la muerte mediada por LukAB.

Neutralización de la citotoxicidad del filtrado del cultivo de S. aureus con un anticuerpo policlonal a-LukA.

La intoxicación de PMN-HL60 con el filtrado de cultivo de S. aureus incubado previamente con diversas cantidades de anticuerpos policlonales a-LukA generada en dos conejos diferentes dio como resultado una toxicidad disminuida del filtrado del cultivo en una forma dependiente de la dosis (Figura 10). Este efecto neutralizante no se observó cuando el filtrado del cultivo se incubó previamente con suero preinmune. Es importante destacar que los anticuerpos generados en los dos conejos diferentes se comportaron de manera muy similar y las capacidades de neutralización de los anticuerpos aumentaron con la madurez como se observó comparando el efecto neutralizante del anticuerpo de los sangrados tardíos con el efecto neutralizante del anticuerpo de los sangrados tempranos (Figura 10). Estos datos muestran que la citotoxicidad observada con el filtrado de cultivo de S. aureus puede neutralizarse con anticuerpos policlonales a-LukA.

Identificación de un mutante de truncamiento de LukA no citotóxico que todavía es reconocido por el anticuerpo policlonal a-LukA.

LukA difiere de las otras subunidades S de leucotoxina estafilocócica en que tiene una extensión tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal. Esta extensión consta de 33 aminoácidos en el extremo N-terminal y 10 aminoácidos en el extremo C-terminal (Figura 11a). La intoxicación de PMN-HL60 con LukA recombinante purificado que carecía de la extensión del N-terminal (rA33NLukA) en combinación con rLukB purificado dio como resultado una potente citotoxicidad hacia las células comparable a la de rLukA rLukB purificado (Figura 11b). Sin embargo, la intoxicación de PMN-HL60 con LukA recombinante purificado carente de la extensión C-terminal (rLukAA10C) en combinación con rLukB dio como resultado un efecto no citotóxico (Figura 11b). Estos datos demuestran que la extensión N-terminal es dispensable para el efecto citotóxico de LukA, pero la extensión C-terminal es necesaria para la toxicidad. Es importante destacar que el anticuerpo policlonal a-LukA que neutraliza el efecto de LukAB (Figura 10) todavía reconoce al mutante rLukAA10C no citotóxico etiquetado con 6xHis, así como al anticuerpo policlonal a-His (Figura 11c). Estos datos sugieren que rLukAA10C puede explotarse para generar anticuerpos policlonales a-LukA in vivo que son anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, rLukAA10C puede usarse en una composición de vacuna activa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un análogo de polipéptido de leucocidina A (LukA) que comprende:

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 10, y no comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 342-351 de la SEQ ID NO: 10;

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 5, y no comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 342-350 de la SEQ ID NO: 5; o,

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 2, y no comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 342-351 de la SEQ ID NO: 2.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 10 y comprende además una deleción de residuos de aminoácidos correspondientes a residuos en las posiciones 342-351 de la SEQ ID NO: 10.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 10.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 10.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 5 y comprende además una deleción de residuos de aminoácidos correspondientes a residuos en las posiciones 342-350 de la SEQ ID NO: 5.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 5.

7. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 5.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 2 y comprende además una deleción de residuos de aminoácidos correspondientes a residuos en las posiciones 342-351 de la SEQ ID NO: 2.

9. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 28-341 de la SEQ ID NO: 2.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el análogo de polipéptido de LukA comprende uno o más epítopos neutralizantes.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende además un polipéptido de LukB maduro aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30-339 de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 16, 19, y 21, o al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30-338 de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 15, 18, 20, y 22-27.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que el polipéptido de LukB maduro aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30-339 de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 16, 19, y 21, o al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30-338 de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 15, 18, 20, y 22-27.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende además un adyuvante.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para uso en un método para inhibir la aparición de o tratar una infección por Staphyloccocus aureus, comprendiendo el método administrar la composición a un sujeto mamífero que lo necesite.