ES2906261T3 - Composición biocida que comprende un extracto de olea europaea soluble en agua para el control de plagas que afecta a abejas melíferas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se dirige a proveer una composición biocida que comprende un extracto natural comercial de hojas de olivo (Olea europea) y un vehículo que permita administrar el extracto vegetal en la colmena, de preferencia jarabe (disolución de sacarosa al 50% p/v) para inhibir el crecimiento de la bacteria Paenibacillus larvae, en todas las fases de su ciclo biológico, tanto en su estado vegetativo como de espora, Melissococcus plutomius y/o Nosema spp. logrando un tratamiento curativo o la profilaxis de la enfermedad en las larvas y abejas adultas de Apis melifera. El principio activo corresponde preferentemente a oleuropeína, un glucósido secoiridoide naturalmente presente en plantas de la familia Oleaceae, aunque en menor concentración.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición biocida que comprende un extracto de olea europaea soluble en agua para el control de plagas que afecta a abejas melíferas
Esta invención se refiere a una composición biocida para inhibir el crecimiento de la bacteria P. larvae, tanto las células vegetativas como las esporas, Nosema sp y/o la bacteria de Melisococcus plutonius. Esta composición consiste en la combinación de un extracto comercial de hoja de olivo (Olea europaea), cuyo componente principal (40%) es un glucósido secoiridoide, oleuropeína, en un vehículo biocompatible, no siendo necesaria la adición de otros componentes.
De acuerdo con los méritos de la presente invención, la composición puede producirse a nivel industrial y comercializarse como un reactivo a ser usado para los siguientes fines:
1. Suplemento alimenticio de larvas y abejas adultas A. Mellifera.
2. Control preventivo y curativo de la infección de larvas de A. Mellifera por P. larvae y M. plutonius, además del control preventivo y curativo de la infección de abejas adultas A. Mellifera por Nosema spp.
3. Desinfección del material de la colmena.
ESTADO DEL ARTE
La abeja melífera Europea (Apis mellifera) junto con la abeja del Este (Apis cerana) son la base de la industria apícola (Ellis y Munn 2005). Los dos principales ejes de sustentación económica de la cría de abejas son la polinización y la producción de miel (Reynaldi et al. 2008). Crecientemente se están comercializando otros productos de las colmenas, entre ellos polen, propóleo, abejas reinas (Genersch 2010, Genersch et al. 2010).
Uno de los mayores desafíos de la apicultura es que las abejas, en sus distintos estadios de desarrollo, están expuestas a una amplia gama de patógenos (virus, bacterias, hongos, microsporidios, parásitos artrópodos, etc.) que debilitan las poblaciones de las colmenas (Gilliam et al. 1977). Una de las enfermedades bacterianas que causa mayor preocupación a apicultores y entidades gubernamentales en todo el mundo es la Loque Americana (Lindstrom et al.
2008). Su agente causal es Paenibacillus larvae, subespecie larvae, una bacteria Gram positiva formadora de esporas perteneciente al grupo Bacillus (Genersch et al. 2006, Bailey 1962). Las esporas (consideradas como la fase infectiva de P. larvae), son altamente resistentes al calor y la deshidratación, pueden permanecer inactivas durante décadas (Haseman 1961), tanto en equipos de apicultura como en las celdillas de los marcos de la colmena. La enfermedad ataca a las larvas de las abejas que se infectan al ingerir las esporas y les provoca la muerte.
Actualmente, los procedimientos disponibles para tratar la enfermedad van desde lo más drástico, como la eliminación de las colmenas enfermas y del equipo asociado a su manejo por incineración, a la esterilización de las colmenas y sus contenidos usando productos químicos (formalina, cloro, óxido de etileno), y el uso profiláctico y terapéutico de antibióticos. Todos estos tratamientos tienen limitaciones asociadas a su uso, entre ellos: i) pérdidas económicas por la destrucción de las colonias quemadas; ii) generación de cepas resistentes, los antibióticos han mostrado una limitada eficacia en terreno (Hansen y Broadsgaard 1999). En Argentina y Estados Unidos, se ha reportado la aparición de cepas de P. larvae resistentes a tetraciclina, oxitetraciclina y sulfatiazol (Alippi 1996, Miyagi et al. 2000). Esto sucede fundamentalmente porque las esporas de P. larvae son resistentes a ellos y pueden permanecer en la colmena y los equipos diseminando la infección; iii) efectos adversos asociados a la acumulación de químicos tóxicos y de residuos de antibióticos en las colmenas (miel y polen), que afectan la calidad de la miel producida (Jiménez et al. 2006) y provocan alteraciones de la conducta de las abejas, incluido el abandono de las colmenas, y disminución de la población total de la colonia (Bastos et al. 2008). Este último efecto se explica por una elevada mortalidad en crías. En contraposición, la presente invención, detallada más adelante: i) inhibe el crecimiento de las bacterias Paenibacillus larvae y Melissococcus plutonius y la germinación de esporas de P. larvae; ii) inhibe el crecimiento, proliferación del hongo Nosema ceranae; iii) la composición es estable durante el periodo que debe ser usada; iv) la composición stock no sufre modificaciones mayores en el tiempo; v) es efectivo para el tratamiento curativo o la profilaxis de la enfermedad; vi) es selectivo; vii) es inocuo para las larvas y abejas adultas; viii) su administración va acorde con la actividad de búsqueda de alimento de la colonia; ix) puede ser administrado a cualquier componente de la colmena (por ejemplo, panales ocupados o desocupados) o al propio grupo de abejas. Es decir, la invención presenta ventajas evidentes comparadas con los tratamientos usados actualmente, tanto respecto de su uso como de su efectividad e inocuidad.
La presente invención está dirigida a una composición que comprende extracto de hoja de olivo (Olea europaea) disponible comercialmente, que incluye como principio activo principal Oleuropeína, un componente de origen natural glucósido secoiridoide, para inhibir el crecimiento de patógenos que afectan tanto a larvas como abejas melíferas adultas dado que:
- el extracto de hojas de olivo ha mostrado tener fuertes propiedades antimicrobianas in vitro contra virus, bacterias gram negativas y positivas, levaduras y parásitos, tanto en animales como en humanos. También se ha demostrado que altera la germinación de esporas bacterianas retrasando el crecimiento del organismo. - el extracto de hojas de olivo posee componentes fenólicos: el mayor componente fenólico activo en la hoja de olivo es Oleuropeína y sus derivados, tal como hiroxitirosol y tirosol, los cuales dan al extracto sus propiedades antimicrobianas.
- ha mostrado no ser tóxico en animales de experimentación (en dosis altas (1 g/Kg peso corporal) por una semana de tratamiento), ni en cultivos de líneas celulares humanas (a 1 mg/ml de extracto).
- es consumido como suplemento alimenticio en humanos por poseer numerosos beneficios cardiovasculares, actividad hipoglicemiante y antioxidante.
- la Oleuropeína se encuentra en altas cantidades en todas las partes del árbol de olivo, especialmente en las hojas (6-9% p/p hoja seca).
- un metabolito Hidroxitirosol de Oleuropeína ha probado recientemente ser efectivo frente a patógenos humanos Hemofilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio parahaemolyticus y Staphilococcus aureus.
- la Oleuropeína y sus derivados han demostrado eficacia antimicrobiana in vitro y, por ello, podrían tener aplicación en el tratamiento de infecciones de larvas de Apis Mellifera.
Los dos únicos documentos actualmente disponibles relacionados con a) la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de olivo comercial y b) la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de olivo (obtenido con solventes orgánicos) frente P. larvae se presentan y discuten a continuación:
"Antimicrobial activity of comercial Olea europaea (Olive) leaf extract'. Aurelia N. Sudjana et al. 2009: Se investigó in vitro la actividad antimicrobiana de un extracto comercial líquido de hojas de olivo, con mínimo contenido de oleuropeína garantizado (4,4 mg/ml) frente a un amplio rango de microorganismos, no se consideró P. larvae. Se muestra que el extracto no tiene un amplio espectro de acción, mostrando sólo ser efectivo frente a C. Jejuni, H. Pylori y Staphylococcus spp. Para mayor abundamiento, en la presente tabla se compara en forma detallada lo descrito en el referido artículo científico versus la presente invención.
Figure imgf000003_0001
"ln vitro growth-inhibitory effect of plant-derived extracts and compounds against Paenibacillus larvae and their acute oral toxicity to adult honey bees". Jaroslav Flesar et al. 2010: Se probó in vitro por el método de microdilución la actividad antibacteriana del extracto crudo de hojas de Olea europaea, el extracto fue realizado usando metanol:diclorometano 1:1 y disuelto en DMSO a una concentración de 25,6 mg/ml. Se definió la CMI como la dilución más baja que inhibe el 80% del crecimiento comparado con el control. La CMI del extracto de hojas de olivo frente a P. larvae fue de 256 pg/ml; uno de los valores más altos comparado con otros 16 extractos probados. El extracto de hojas de olivo no se incluyó en las pruebas de toxicidad por consumo oral en abejas adultas. Es aquí donde lo referido en dicho trabajo difiere con la presente invención en términos de su obtención y composición, no se utiliza un extracto acuoso y tampoco un extracto comercial. Tampoco se prueba su toxicidad ni en larvas ni abejas adultas de A. Mellifera. Para mayor abundamiento, en la siguiente tabla se compara en forma detallada lo descrito en el referido artículo científico versus la presente invención.
Figure imgf000004_0001
"Compositions and methods for inhibiting a honey bee pathogen infection or controlling a hive ¡nfestation", patente WO2008060591: Se divulga una composición que previene o trata la infección o infestación de la colmena por patógenos utilizando un derivado (un ácido orgánico) de la planta del lúpulo (Humulus lupulus), un alfa ácido, un beta ácido o combinación de ambos. La concentración efectiva de este derivado inhibe el crecimiento, proliferación de bacterias u hongos. En ensayos in vitro la composición inhibió Melissococcus plutonius, Paenibacillus larvae, o el hongo Ascosphaera apis. Además, mata esporas de bacterias y hongos. El componente no altera la función biológica de la abeja. De los compuestos mencionados, ninguno es compartido con la presente invención para inhibir el crecimiento de M. Plutonius, P. larvae y Nosema spp.
"Tratamiento contra la enfermedad de las larvas de las abejas", patente ES2215412T3: El documento trata de procedimientos y composiciones para el tratamiento curativo y la prevención de enfermedades en abejas melíferas. La composición corresponde a un inóculo que comprende uno o más microorganismos bacterianos y un vehículo de administración. El procedimiento comprende la inoculación en la colmena con la composición antes mencionada. En consecuencia, en dicha patente se propone usar una mezcla de microorganismos, de los cuales ninguno es compartido con esta invención.
"Method forthe control of infestations of honeybee colonies", patente WO1997047193: La presente invención se refiere a un método para el control de varias enfermedades en colmenas, mediante la aplicación a las mismas, de una cantidad efectiva de un aceite esencial en una formulación de liberación lenta, según lo cual el término aceite abarca, pero no está limitado a aceites extraíbles de plantas, o el componente esencial de los mismos, monoterpenos tales como mentol, geraniol, timol, mirceno, citral, limoneno, careno, alcanfor, eugenol o cineol (eucaliptol), aceites naturales tales como aceite de limón, aceite de eucalipto o aceite de amargosa, o ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético o ácido oxálico; más preferidos son los monoterpenos tales como el timol o mentol, muy preferido es el timol. En consecuencia, en dicha patente se propone usar compuestos, de los cuales ninguno es compartido por esta invención. Además, no hace explícito su efectividad frente a P. larvae, M. Plutonius y Nosema spp. El término peste se refiere a cualquier organismo que infecte la colonia de abejas.
"Novel apiary composition", patente WO2008132524: La composición comprende sustancias de origen natural, extracto alcohólico acuoso de hierbas ( Thymus vulgaris, Organum vulgare, Junglandis folium, Organum majoranna) más la adición de aceites como timol, canela y anís. En consecuencia, en esta patente se propone usar compuestos, de los cuales ninguno es compartido por esta invención.
"Compositions and methods for prevention and treatment of deseases associated with honeybees", patente WO1997008954: Las composiciones de esta invención son soluciones acuosas que comprenden ácidos orgánicos e inorgánicos y un ion clorito. Opcionalmente, las composiciones pueden comprender, además, un agente gelificante, un colorante y un conservante. En consecuencia en dicha patente se propone usar compuestos, de los cuales ninguno es compartido por esta invención.
"Method, apparatus and compositions for the prophylaxis and treatment of colony collapse disordef, patente WO2013030854 A1 : La invención está relacionada con un método para prevenir y tratar el Trastorno del Colapso de las Colonias (CCD, por sus siglas en inglés). Se refiere a un dispositivo que dispensa, de una forma automática, una dieta en sustitución o como alimento natural cuya composición contempla soluciones acuosas que comprenden aceites esenciales, de los cuales ninguno es compartido por esta invención.
Existe un artículo relacionado a un extracto de hojas de Olea europaea comercial, sin embargo, no se prueba su actividad antimicrobiana frente a ningún patógeno de A. Mellifera. "Antimicrobial activity of comercial Olea europaea (olive) leaf extract'. Aurelia N. Sudjana et al. 2009. Otros artículos describen la actividad antimicrobiana de extractos acuosos y aceites esenciales de plantas frente a P. larvae, M. Plutonius y Nosema ceranae. En ninguno de ellos se considera Olea europaea. Algunos de estos artículos se mencionan a continuación.
"Laurel leaf extracts for honeybee pest and disease management: antimicrobial, microsporicidal, and acaricidal activity '. N. Damiani et al. 2013.
"Antimicrobial activity of Scutia buxifolia against the honey bee pathogen Paenibacillus larvae". A. A Bolignon et al.
2013.
"Antimicrobial activity of Amazonian oils against Paenibacillus especies". R. C. Santos et al. 2012.
"In vivo evaluation of antiparasitic activity of plant extracts on Nosema ceranae (Microsporidia)’’. M. Porrini et al. 2011.
"Antibacterial activity of water extracts and essential oils of various aromatic plants against Paenibacillus larvae, the causative agent of American Folubrood '. M. J. González, J. M. Marioli 2010.
"In vitro antibacterial effect of exotic plants essential oils on the honeybee pathogen Paenibacillus larvae, causal agent of American foulbrood'. S. R. Fuselli et al. 2010.
"Screening of natural compounds for the control of nosema disease in honeybees (Apis mellifera)’’. L. Maistrello et al.
2008.
"Short communication. Inhibition of Paenibacillus larvae subsp larvae by the essential oils of two wild plants and their emulsifying agents" S. R. Fuselli 2005.
El estado del arte hasta aquí descrito reporta composiciones de extractos de hierbas y aceites esenciales que no incluyen el extracto de hojas de olivo, con oleuropeína como principio activo, para el control de patógenos apícolas. Por otro lado, de las patentes mencionadas sólo una de ellas propone esos extractos específicamente para uso en el control de la Loque americana y/o Loque europea, por lo que la presente invención es novedosa. Además, los datos reportados no son suficientes para que un experto en la materia le resulte obvio que el uso de extracto de hojas de olivo rico en oleuropeína logre el control de enfermedades bacterianas y de las esporas de P. larvae. Por ende, la presente invención tiene alto nivel inventivo. Por último, los autores de la presente invención han observado que el uso de la composición que comprende extracto de hojas de olivo rico en oleuropeína controla el crecimiento de Melissococcus plutonius, Paenibacillus alvei, (patógeno secundario a la infección por M. Plutonius) y Nosema spp.
DIBUJOS
Las figuras que a continuación se describen se proponen con el ánimo de mostrar antecedentes que respalden y sirvan de ejemplo para la descripción de la composición, por tanto, no buscan restringir y de ninguna manera deben ser consideradas como limitantes del alcance del desarrollo propuesto.
FIGURA 1, la invención inhibe el crecimiento de la célula vegetativa de P. larvae. Las células vegetativas fueron crecidas en ausencia (A) y en presencia (B) de extracto agregado en disco de difusión. A los 5 días, por inspección visual y bajo microscopio, se analizó el crecimiento bacteriano alrededor del disco de papel en las placas de cultivo (n=6).
FIGURA 2, la invención inhibe el crecimiento de las esporas de P. larvae. Las esporas de P. larvae fueron expuestas a medio sin extracto (A), o a medio suplementado con extracto (B). A los 5 días, se analizó el crecimiento de colonias por inspección visual en las placas de cultivo (n=6).
FIGURA 3, la invención no es tóxica para las larvas de Apis Mellifera, a distintas concentraciones. Las larvas fueron expuestas a alimento sin extracto (dieta A) y alimento suplementado con extracto (dietas B, C y D). A los 5 días de incubación, se analizaron las larvas por inspección visual y observación bajo microscopio óptico (n=2).
FIGURA 4, la invención inhibe el crecimiento de otras bacterias patógenas de A. Mellifera. Las bacterias Melissococcus plutonius y Paenibacillus alvei fueron expuestas a medio sin extracto y con extracto. A los 1, 2 y 5 días de incubación, se analizó el crecimiento de colonias en las placas de cultivo por inspección visual y observación bajo microscopio óptico (n=2).
FIGURA 5, la invención no inhibe el crecimiento de otros Bacillus y Paenibacillus presentes en las colmenas. Las bacterias B. megaterium, B. Subtilis, P. Polymyxa, B. pumilus, fueron expuestas a medio sin extracto y con extracto. A los 1, 2 y 5 días, se analizó el crecimiento de colonias por inspección visual y observación bajo microscopio óptico en las placas de cultivo (n=2).
FIGURA 6, la invención inhibe la proliferación y multiplicación de Nosema ceranae. Las colmenas infectadas naturalmente con N. Ceranae fueron expuestas al extracto. Se analizó la tasa de infección de esporas purificadas a partir de estómagos de abejas adultas por observación bajo microscopio óptico a los 7, 14, 21 , 28 y 35 días post aplicación (n=1) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención está relacionada con una composición biocida para el control de plagas que afectan a abejas melíferas. La composición comprende un extracto de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 2 a 20 mg/ml y un jarabe como vehículo. Preferentemente, el rango de concentración del extracto en la composición biocida es de 2 a 10 mg/ml. Los rangos de concentración que presenta la composición biocida son importantes, ya que abarcan distintos usos para el control de plagas que afectan a las abejas. Algunos de estos rangos pueden ser utilizados para el control del plagas en su estado vegetativo, Paenibacillus larvae o Melissococcus plutonius. Otros, en cambio, pueden ser utilizados en el control de los estados de esporas, P. larvae o Nosema spp. Más aun, la composición biocida de la presente invención comprende un rango de concentración de extracto para uso como desinfectante. Las concentraciones de inhibición del crecimiento en el estado de esporas es de vital importancia para el control de las enfermedades. Las esporas son la fase infectiva más agresiva de la enfermedad Loque americana o Nosemosis y por ende afectan directamente la dinámica de la población de abejas dentro de la colmena, lo que ocasiona pérdidas en la fase productiva de la miel. Como no existe un tratamiento efectivo, fuera de la temporada de producción de miel, tanto los marcos y los cajones de alza de la colmena contaminados con esporas y sin desinfectar quedan almacenados hasta la próxima temporada, convirtiéndose en el foco de infección en el inicio de la nueva temporada productiva, de ahí lo relevante del tratamiento biocida con una composición con un rango de concentración capaz de eliminar esporas de bacterias y hongos.
El rango de concentración presente en la composición también puede ser expresado no en referencia al extracto sino que en referencia al metabolito principal, Oleuropeína. En ese caso la composición tiene un rango de concentración para la Oleuropeína de 0,8 a 4 mg/ml, 0,8 a 8 mg/ml. A pesar de estos cálculos de la concentración de la composición en base al metabolito principal del extracto Olea europaea soluble en agua, es importante destacar la posible importancia sinérgica y de actividad biocida dentro de la composición de la invención con el extracto acuoso de la hojas de Olea europaea, que puedan tener los otros metabolitos presentes en menor proporción dentro del extracto.
La composición biocida de la invención tiene la capacidad de controlar plagas causadas por Paenibacillus larvae (Loque americana) ya sea en su estado vegetativo como en el estado de espora. La composición, adicionalmente, es capaz de controlar Melissococcus plutonius (Loque europea). Además, se ha demostrado que la composición biocida de la invención es capaz de controlar al hongo Nosema spp.
La composición biocida de la invención comprende un vehículo con las propiedades necesarias que le otorga a la composición la capacidad de ser administrada en la colmena, en los marcos de la colmena, en el estampado del marco de la colmena y/o en el alimentador de la colmena. Este vehículo de la composición es un jarabe. Este jarabe comprende sacarosa a una concentración en los rangos seleccionados de 10 - 600 % p/v, 10 - 500 % p/v, 20 - 400 % p/v, 30 - 400 % p/v, 30 - 200 % p/v, 50 - 100 % p/v.
La composición biocida puede comprender, opcionalmente, otros biocidas seleccionados de uno o más biocidas del grupo de: un biocida orgánico sintético, un biocida orgánico natural y un biocida inorgánico, presentes en menor proporción dentro del extracto.
Dentro de los biocidas adicionales, se seleccionan de uno o más biocidas del grupo de: aceite esencial de soja, aceite esencial de artemisia, aceite esencial de eucalipto, aceite esencial de limón, aceite esencial de anís, aceite esencial de canela, aceite esencial de pimienta negra, aceite esencial de quillay, aceite esencial de romero, aceite esencial de tomillo, aceite esencial de ajedrea, aceite esencial de apio, aceite esencial de albahaca, aceite esencial de bergamota, aceite esencial cebolla, aceite esencial cardamomo, aceite esencial de cilantro, aceite esencial de ciprés, aceite esencial de clavo, aceite esencial de comino, aceite esencial de cúrcuma, aceite esencial de enebro, aceite esencial de estragón, aceite esencial de geranio, aceite esencial de hinojo, aceite esencial de incienso, aceite esencial de jazmín, aceite esencial de laurel, aceite esencial de mandarina, aceite esencial de melisa, aceite esencial de menta, aceite esencial de orégano, aceite esencial de romero, aceite esencial de salvia, aceite esencial de sándalo, aceite esencial de tomillo, aceite esencial de trementina, aceite esencial de vainilla, aceite esencial de valeriana, aceite esencial de verbena, aceite esencial de zanahoria, aceite esencial de ajo y combinaciones de los mismos.
Los biocidas adicionales presentes en la composición utilizada se seleccionan de uno o más biocidas del grupo de: extracto de soja, extracto de artemisa, extracto de eucalipto, extracto de limón, extracto de anís, extracto de canela, extracto de pimienta negra, extracto de quillay, extracto de romero, extracto de tomillo, extracto de ajedrea, extracto de apio, extracto de albahaca, extracto de bergamota, extracto de cebolla, extracto de cardamomo, extracto de cilantro, extracto de ciprés, extracto de clavo, extracto de comino, extracto de cúrcuma, extracto de enebro, extracto de estragón, extracto de geranio, extracto de hinojo, extracto de incienso, extracto de jazmín, extracto de laurel, extracto de mandarina, extracto de melisa, extracto de menta, extracto de orégano, extracto de romero, extracto de salvia, extracto de sándalo, extracto de tomillo, extracto de trementina, extracto de vainilla, extracto de valeriana, extracto de verbena, extracto de zanahoria, extracto de ajo y combinaciones de los mismos.
El biocida adicional presente en la composición puede ser escogido de uno o más, que controla pestes de abejas melíferas seleccionadas de los siguientes ectoparásitos y endoparásitos: ácaros, tales como Varroa, Aethina túmida, Acarapis woodi, Tropilaelaps clareae, T. koenigerum, hongos como Ascosphaera apis, Aspergillus, protozoos como Malpighamoeba mellificae, bacterias como Pseudomonas auriginosa, virus tales como Virus de la Cría Saciforme (Sacbrood Bee Virus, SBV), Virus de las Alas Deformadas (Deformed Wing Virus, DWV), Virus de Kashemira (KBV), Virus de la Parálisis Aguda (Acute Bee Paralysis Virus, ABPV), Virus de la celdilla Negra de la Reina (Black Queen Cell Virus, BQCV), Virus de la Parálisis Crónica (Chronic Bee Paralysis Virus, CBPV) o el Virus Israelí de la Parálisis Aguda (Israelí Acute Paralysis Virus, IAPV).
Una de las ventajas de la presente invención es que la composición biocida presenta selectividad ya que no inhibe el crecimiento, proliferación o sobrevivencia de otras bacterias propias de la colmena. La solución propuesta no inhibe el crecimiento, proliferación o sobrevivencia de Bacillus Megaterium, Bacillus Subtilis, Bacillus Pumilus y Paenibacillus Polymyxa.
Otra de las grandes ventajas es que la composición de la invención contiene concentraciones de biocida que no presentan efectos adversos durante cualquiera de los estados de desarrollo de la abeja.
La invención no presenta efectos adversos durante el desarrollo larval, ni sobre la abeja adulta. La solución propuesta comprende el uso de un extracto de hojas de Olea europaea soluble en agua en un rango de concentración de 2 a 10 mg/ml, 2 a 20 mg/ml y un jarabe como vehículo. El rango de concentración presente en la composición utilizada también puede ser expresado no en referencia al extracto sino que en referencia al metabolito principal Oleuropeína. Preferentemente, la invención se relaciona con el uso de la composición biocida que comprende como metabolito principal Oleuropeína en un rango de concentración que va desde 0,8 a 4 mg/ml, 0,8 a 8 mg/ml. Algunos de estos rangos pueden ser utilizados para el control del plagas en su estado vegetativo, Paenibacillus larvae o Melissococcus plutonius. Otros, en cambio, pueden ser utilizados en el control de los estados de esporas, P. larvae o Nosema spp. Más aun, la invención propone el uso de la composición biocida de la presente invención como desinfectante.
La invención también se relaciona con uso de la composición biocida con las características anteriormente descritas que comprende un vehículo con las propiedades necesarias que le otorga a la composición la utilidad de ser administrada en la colmena, en los marcos de la colmena, en el estampado del marco de la colmena y/o en el alimentador de la colmena. Este vehículo de la composición utilizada es un jarabe. Este jarabe comprende sacarosa a una concentración en los rangos seleccionados de 10 - 600 % p/v, 10 - 500 % p/v, 20 - 400 % p/v, 30 - 400 % p/v, 30 - 200 % p/v, 50 - 100 % p/v.
El uso de la invención puede comprender adicionalmente a la composición biocida que comprende Olea europaea soluble en agua y un vehículo, otro u otros biocidas seleccionados de uno o más biocidas del grupo de: un biocida orgánico sintético, un biocida orgánico natural y un biocida inorgánico, presentes en menor proporción dentro del extracto. Los biocidas adicionales presentes en la composición utilizada se seleccionan de uno o más biocidas del grupo de: aceite esencial de soja, aceite esencial de artemisia, aceite esencial de eucalipto, aceite esencial de limón, aceite esencial de anís, aceite esencial de canela, aceite esencial de pimienta negra, aceite esencial de quillay, aceite esencial de romero, aceite esencial de tomillo, aceite esencial de ajedrea, aceite esencial de apio, aceite esencial de albahaca, aceite esencial de bergamota, aceite esencial cebolla, aceite esencial cardamomo, aceite esencial de cilantro, aceite esencial de ciprés, aceite esencial de clavo, aceite esencial de comino, aceite esencial de cúrcuma, aceite esencial de enebro, aceite esencial de estragón, aceite esencial de geranio, aceite esencial de hinojo, aceite esencial de incienso, aceite esencial de jazmín, aceite esencial de laurel, aceite esencial de mandarina, aceite esencial de melisa, aceite esencial de menta, aceite esencial de orégano, aceite esencial de romero, aceite esencial de salvia, aceite esencial de sándalo, aceite esencial de tomillo, aceite esencial de trementina, aceite esencial de vainilla, aceite esencial de valeriana, aceite esencial de verbena, aceite esencial de zanahoria, aceite esencial de ajo y combinaciones de los mismos.
Los biocidas adicionales presentes en la composición utilizada se seleccionan de uno o más biocidas del grupo de: extracto de soja, extracto de artemisa, extracto de eucalipto, extracto de limón, extracto de anís, extracto de canela, extracto de pimienta negra, extracto de quillay, extracto de romero, extracto de tomillo, extracto de ajedrea, extracto de apio, extracto de albahaca, extracto de bergamota, extracto de cebolla, extracto de cardamomo, extracto de cilantro, extracto de ciprés, extracto de clavo, extracto de comino, extracto de cúrcuma, extracto de enebro, extracto de estragón, extracto de geranio, extracto de hinojo, extracto de incienso, extracto de jazmín, extracto de laurel, extracto de mandarina, extracto de melisa, extracto de menta, extracto de orégano, extracto de romero, extracto de salvia, extracto de sándalo, extracto de tomillo, extracto de trementina, extracto de vainilla, extracto de valeriana, extracto de verbena, extracto de zanahoria, extracto de ajo y combinaciones de los mismos.
La invención incluye el uso de un biocida adicional que controla enfermedades de abejas melíferas, seleccionadas de los siguientes ectoparásitos y endoparásitos: ácaros, tales como Varroa, Aethina túmida, Acarapis woodi, Tropilaelaps clareae, T. koenigerum, hongos como Ascosphaera apis, Aspergillus, protozoos como Malpighamoeba mellificae, bacterias como Pseudomonas auriginosa, virus tales como Virus de la Cría Saciforme (Sacbrood Bee Virus, SBV), Virus de las Alas Deformadas (Deformed Wing Virus, DWV), Virus de Kashemira (KBV), Virus de la Parálisis Aguda (Acute Bee Paralysis Virus, ABPV), Virus de la celdilla Negra de la Reina (Black Queen Cell Virus, BQCV), Virus de la Parálisis Crónica (Chronic Bee Paralysis Virus, CBPV) o el Virus Israelí de la Parálisis Aguda (Israelí Acute Paralysis Virus, IAPV).
El uso propuesto en la invención tiene la ventaja de presentar selectividad en su efecto biocida, no inhibir el crecimiento, proliferación o sobrevivencia de las bacterias propias de la colmena. La solución propuesta no inhibe el crecimiento, proliferación o sobrevivencia de Bacillus Megaterium, Bacillus Subtilis, Bacillus Pumilus y Paenibacillus Polymyxa. La invención puede servir para asperjar, bañar e impregnar marcos estampados con la composición biocida en la colmena, en los marcos de la colmena, en el estampado del marco y/o en el alimentador de la colmena.
La invención consiste en disponer o preparar una composición biocida que comprende un extracto de Olea europaea en agua en un rango de concentración de 2 -20 mg/ml y un jarabe como vehículo.
La solicitud también está relacionada con un método para controlar plagas que afectan a abejas que comprende las etapas de:
i) Preparar o disponer una composición biocida que comprende un extracto de Olea europaea soluble en agua en un rango de concentración de 2 -20 mg/ml y un jarabe como vehículo.
ii) Incorporar el extracto de Olea europaea al alimentador de la cámara de crías de la colmena, a la colmena, al estampado del marco de la colmena y/o al marco de la colmena.
Preferentemente, la etapa ii) se hace por aspersión, inmersión, impregnación o dentro del proceso de estampado de marcos.
La solución propuesta comprende incorporar el extracto de Olea europaea al alimentador de la cámara de crías de la colmena y/o en el estampado del marco de la colmena. La solución propuesta se incorpora por aspersión, inmersión e impregnación.
El motivo de la presente invención contempla un aparato que tiene impregnado la composición biocida. El aparato de la invención es una colmena, es un marco de una colmena, es el estampado del marco de la colmena, es el alimentador de la cámara de crías de la colmena.
El invento propuesto además incorpora un kit que comprende la composición biocida, como también otros componentes tales como otros biocidas o instrucciones para su uso. Preferentemente, además de la composición biocida, el kit comprende instrucciones de uso de la composición biocida del presente invento para el control de infecciones de abejas melíferas.
La invención contempla la composición biocida como parte de un kit. La solución propuesta comprende, adicionalmente como parte del kit, instrucciones para el uso de la composición biocida.
EJEMPLOS
Los ejemplos que a continuación se señalan se incorporan a título exclusivamente ilustrativo para favorecer la comprensión del pliego y no significan que limiten en modo alguno los alcances de las reivindicaciones que se solicitan.
EJEMPLO 1. Inhibición del crecimiento de células vegetativas de P. larvae.
Las células vegetativas de P. larvae fueron sembradas a una densidad de 4 x106 en medio de cultivo J sólido, se colocó un disco de papel (disco de difusión) en la zona central de cada placa de cultivo sobre la siembra de P. larvae con 10 |jl de vehículo (sin extracto) o 10 |jl de extracto (50 mg/ml) y se mantuvieron en condiciones de microaerofilia, O2/CO2 5%/5-10% a 37°C. Se consideró inhibición del crecimiento la observación directa de un halo de inhibición alrededor del disco de difusión. El halo de inhibición también fue observado bajo microscopio. A los 5 días, se evaluó el crecimiento de P. larvae. Se observó halo de inhibición en la placa que contenía extracto (Figura 1 ). Por contraposición, en la placa que no contenía extracto no se inhibió el crecimiento de P. larvae. Por lo tanto, se demostró que la invención inhibe el crecimiento de las células vegetativas de P. larvae.
EJEMPLO 2. Inhibición del crecimiento de las esporas de P. larvae.
Las esporas de P. larvae fueron sembradas a una densidad de 200 esporas por placa de cultivo en medio de cultivo J sólido sin extracto y en medio J con extracto 6 mg/ml y se mantuvieron en condiciones de microaerofilia O2/CO2 5%/5-10% a 37°C. Se consideró inhibición del crecimiento la observación directa de la ausencia o reducción del número de colonias de P. larvae en la placa con extracto comparada con la placa sin extracto. A los 5 días, se evalúo el crecimiento de P. larvae. Se observó ausencia de colonias en la placa con extracto (Figura 2). Por contraposición, en la placa que no contenía extracto se observaron colonias de P. larvae. Por tanto, la invención muestra ser efectiva al inhibir el crecimiento de las esporas de P. larvae.
EJEMPLO 3. Alimentación in vitro de larvas de Apis mellifera usando distintas concentraciones de extracto.
Larvas de 12 a 24 h de haber nacido fueron alimentadas con 10 j l de dieta artificial, dieta A (glucosa 12-18%, sacarosa 12-18%, extracto de levadura 2-4%, jalea real 50%) o con 10 j l de dieta artificial suplementada con extracto a un rango de concentración final de 3 mg/ml (dieta B), 5 mg/ml (dieta C) y 10 mg/ml (dieta D) . Veinticuatro larvas en cada condición fueron usadas para calcular el % de sobrevida desde el día 1 al 6 de incubación (Figura 3). Las larvas muertas fueron identificadas en función de los siguientes tres criterios: elasticidad, tamaño, color, consumo de alimento y descomposición
EJEMPLO 4. Inhibición del crecimiento de otras bacterias, propias de la colmena, en presencia de diferentes concentraciones de extracto.
Las bacterias P. larvae, M. Plutonius, Paenibacillus alvei, Bacillus Megaterium, Bacillus Subtilis, Bacillus Pumilus y Paenibacillus polymyxa fueron sembradas a una densidad de 1 x106 bacterias por placa de cultivo y esporas de P. larvae a una densidad de 200 esporas por placa de cultivo en medio de cultivo J o LB sólido con extracto y sin extracto en un rango de concentración comprendido entre 0,01 mg/ml y 25 mg/ml (placas 1 a 12, Figura 4) y entre 0,01 mg/ml a 5 mg/ml (placas 1 a 8, Figura 5) en condiciones semejantes al Ejemplo 2 o en anaerofilia 10% CO2 a 35°C. Entre los días 1 y 5 de incubación se evaluó si el extracto inhibía el crecimiento bacteriano. Todas las bacterias crecieron en medio sin extracto. Sólo se observó ausencia de colonias de P. larvae, M. plutonius y P. alvei en placas con extracto. La invención muestra ser efectiva en un rango de concentraciones (Figura 4 y 5). Estos resultados permiten concluir que la invención tiene aplicación para otras enfermedades que también ataca las larvas de A. Mellifera, como la Loque europea cuyo agente causal es M. Plutonius y P. alvei como patógeno secundario a la infección por M. Plutonius.
EJEMPLO 5. La administración del extracto resuelve la infección por Nosema ceranae en abejas melíferas adultas.
Se administró el extracto (10 mg/ml) a colmenas infectadas naturalmente con esporas de N. Ceranae a una tasa de infección de 7 x 106 esporas/abeja. La administración se realizó una vez cada 10 días. Se determinó la tasa de infección cada 7 días. Se observó que a los 7 días posteriores a la primera administración, la tasa de infección se redujo en un 71% (2 x 106 esporas/abeja), llegando a reducirse en un 99% (5 x 103 esporas/abeja) a los 35 días post administración (Figura 6).
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una composición biocida para el control de plagas que afectan a abejas melíferas causadas por esporas de Paenibacillus larvae y esporas de Nosema ceranae, que comprende un extracto acuoso de hoja de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 2 a 20 mg/ml y un jarabe como vehículo.
2. La composición biocida de la reivindicación 1, en donde para controlar plagas que afectan a abejas melíferas causadas por esporas de Paenibacillus larvae, la composición comprende un extracto acuoso de hoja de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 6 mg/ml.
3. La composición biocida de la reivindicación 1, en donde para controlar plagas que afectan a abejas melíferas causadas por esporas de Nosema ceranae, la composición comprende un extracto acuoso de hoja de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 10 mg/ml.
4. Una composición biocida que comprende un extracto acuoso de hoja de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 2 a 20 mg/ml y un jarabe como vehículo, para su uso en el método para controlar plagas que afectan a abejas melíferas causadas por esporas de Paenibacillus larvae y esporas de Nosema ceranae.
5. La composición biocida de la reivindicación 4, que comprende el extracto acuoso de hoja de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 6 mg/ml, para su uso en el método para controlar plagas que afectan a abejas melíferas causadas por esporas de Paenibacillus larvae.
6. La composición biocida de la reivindicación 4, que comprende el extracto acuoso de hoja de Olea europaea soluble en agua en una concentración de 10 mg/ml, para su uso en el método para controlar plagas que afectan a abejas melíferas causadas por esporas de Nosema ceranae.
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