ES2908373T3 - Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos - Google Patents

Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2908373T3
ES2908373T3 ES16757633T ES16757633T ES2908373T3 ES 2908373 T3 ES2908373 T3 ES 2908373T3 ES 16757633 T ES16757633 T ES 16757633T ES 16757633 T ES16757633 T ES 16757633T ES 2908373 T3 ES2908373 T3 ES 2908373T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
desb30
human insulin
insulin
eps
analog
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16757633T
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Madsen
Anthony Murray
Martin Münzel
Claudia Ulrich Hjørringgaard
Susanne Hostrup
Tine Glendorf
Mathias Norrman
Christian Fledelius
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2908373T3 publication Critical patent/ES2908373T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immunology (AREA)

Abstract

Un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys, B3aar1] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q) o Asp (D); y uno, dos o tres de los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones B26, B27 y/o B28 se sustituyen de la siguiente manera: el residuo de aminoácido ubicado en la posición B26 se sustituye por Glu (E) o Asp (D); y/o el residuo de aminoácido ubicado en la posición B27 se sustituye por Glu (E) Asp (D) o Pro (P); y/o el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); sin embargo, siempre que; si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B27 se sustituye por Pro (P); entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 no se sustituye, entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Arg (R), o si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E) o Asp (D), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Pro (P) o B29Arg (R), y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 es Pro (P), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B30 se sustituye por B30Arg (R); y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Arg (R), entonces los residuos de aminoácido ubicados en las posiciones B29 y B30 se han eliminado (es decir, desB29, desB30); y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por Arg (R), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B30 se ha eliminado (es decir, desB30); y cuyo análogo puede comprender adicionalmente una sustitución A8Arg (R) y/o A14Glu (E); y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II [Acil]-[Enlazador]- en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG; en donde gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico; OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-); cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y en donde el grupo Acilo es un residuo de un ácido α,ω-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14- tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos
Campo técnico
La presente invención se encuentra en los campos terapéuticos de los fármacos para afecciones médicas relacionadas con la diabetes. Más específicamente, la invención se refiere a nuevos derivados acilados de análogos de insulina humana. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden tales análogos de insulina derivatizados, y se refiere al uso de tales derivados para el tratamiento o prevención de afecciones médicas relacionadas con la diabetes.
Antecedentes de la invención
La terapia con insulina para el tratamiento de la diabetes se ha usado durante décadas. La terapia con insulina suele implicar la administración de varias inyecciones de insulina al día. Dicha terapia normalmente implica la administración de una inyección basal de acción prolongada una o dos veces al día, y una inyección de una insulina de acción rápida a la hora de la comida (es decir, uso prandial). Una de las mejoras claves en la terapia con insulina fue la introducción de análogos de insulina de acción rápida. Sin embargo, incluso con los análogos de insulina de acción rápida, los niveles máximos de insulina típicamente no ocurren hasta 50 a 70 minutos después de la inyección.
Por lo tanto, las inyecciones de insulina no replican el perfil de acción-tiempo natural de la insulina. En particular, el pico natural de la liberación de insulina de la primera fase en una persona sin diabetes da lugar a un aumento de los niveles de insulina en sangre a los pocos minutos de la entrada de glucosa en la sangre a partir de una comida. Por el contrario, la insulina inyectada se introduce en la sangre lentamente, con niveles máximos de insulina que ocurren dentro de 80 y 100 minutos después de la inyección de insulina humana normal.
Debido a que los análogos de insulina de acción rápida no imitan adecuadamente la liberación de primera fase de la insulina, los diabéticos que utilizan la terapia de insulina continúan con niveles inadecuados de insulina al inicio de una comida y demasiada insulina presente entre comidas. Este retraso en la administración de insulina puede provocar hiperglucemia poco después del inicio de la comida.
La insulina posee propiedades de autoasociación y su concentración representa un factor importante de autoasociación. A altas concentraciones, especialmente en formulaciones farmacéuticas, la insulina se autoasociará en dímero, hexámero, dodecámero y cristal. Sin embargo, la forma fisiológicamente activa de la insulina es el monómero, que se une al receptor de insulina y desencadena una respuesta biológica.
La rapidez de la acción de la insulina depende de la rapidez con que se absorba la insulina desde el tejido subcutáneo. Cuando la insulina humana regular se inyecta por vía subcutánea, la formulación se compone principalmente de hexámeros que contienen dos iones de zinc. Debido a su tamaño, la insulina hexamérica tiene una menor velocidad de difusión y, por consiguiente, la velocidad de absorción es más lenta que la de especies más pequeñas.
Dentro del hexámero hay dos átomos de zinc que estabilizan la molécula ante la degradación química y física. Después de la inyección, se produce un equilibrio dinámico impulsado por la concentración en el tejido subcutáneo, lo que hace que los hexámeros se disocien en dímeros y luego en monómeros. Históricamente, estas formulaciones de insulina humana regular requieren aproximadamente 120 minutos para alcanzar los niveles de concentración plasmática máxima. Se comercializan preparaciones de zinc-insulina, que se absorben más rápidamente que la insulina humana regular, por ejemplo, insulina aspart e insulina lispro.
Las formulaciones de insulina que no contienen zinc permiten una absorción subcutánea más rápida, pero para las insulinas en general, la estabilidad química y física de las formulaciones que no contienen zinc es un desafío.
Se han sugerido varios derivados de la insulina para diferentes usos:
El documento WO 1998 042749 describe cristales de insulina que no contienen zinc para la administración pulmonar.
El documento US 6960561 describe preparaciones de insulina que no contienen zinc y bajas en zinc que tienen una estabilidad mejorada.
El documento WO 2007/096431 describe ciertos derivados de insulina humana, que incluyen análogos que en la posición A22 contienen un residuo de lisina acilado, en la posición B29 contienen un residuo de arginina, y que son desB30, cuyos derivados son solubles a valores de pH fisiológicos y tienen un perfil de acción prolongado, y están destinados para su uso como insulinas de acción prolongada.
El documento WO 2009/022013 describe ciertos análogos de insulina adiados, que incluyen análogos que en la posición A22 contienen un residuo de lisina acilado, en la posición B29 contienen un residuo de arginina, y que son desB30, que poseen mayores afinidades de unión al receptor de insulina, y están destinados para su uso como insulinas de acción prolongada.
El documento WO 2009/112583 describe ciertos análogos de insulina, que incluyen análogos que en la posición A22 contienen un residuo de lisina, en la posición B29 contienen un residuo de arginina, y que son desB30, que muestran una estabilidad mejorada frente a proteasas.
El documento WO 2011/161124 describe ciertos análogos de insulina acilados que contienen enlaces disulfuro adicionales para mejorar la estabilidad, que incluyen análogos que en la posición A22 contienen un residuo de lisina, en la posición B29 contienen un residuo de arginina, y que son desB30.
El documento WO 2012/171994 (D2) describe cierto derivado de insulina que comprende dos o más sustituciones, que incluyen análogos que en la posición A22 contienen un residuo de lisina acilado, en la posición B29 contienen un residuo de arginina, y que son desB30, para una actividad in vivo prolongada.
El documento WO 2013 063572 (D4) describe formulaciones de análogos de insulina de acción rápida ultraconcentradas opcionalmente desprovistas de zinc.
El documento WO 2009/022005 describe análogos de insulina con un resto de acilo y de alquilenglicol.
Hahr AJ y otros, describe la optimización de la Terapia con Insulina en Pacientes con Diabetes Mellitus Tipo 1 y Tipo 2.
Además, la acilación de péptidos y proteínas con porciones de unión a albúmina se ha usado para prolongar la duración de la acción de los péptidos y las proteínas.
Sin embargo, los derivados de insulina de acuerdo con la presente invención no se han informado, y su uso como derivados de insulina de acción rápida para uso prandial nunca se ha sugerido.
Objetivos de la invención
Es un objetivo de la invención proporcionar análogos de insulina que tengan un perfil prandial después de la administración subcutánea.
Otro objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean químicamente estables en la formulación.
Un tercer objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean químicamente estables en formulación sin zinc añadido.
Un cuarto objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean físicamente estables en formulación.
Un quinto objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean físicamente estables en formulación sin zinc añadido.
Un sexto objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean química y físicamente estables en formulación.
Un séptimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean química y físicamente estables en formulación sin zinc añadido.
Un octavo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean hepatopreferentes con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea.
Un noveno objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean hepatoselectivos con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea.
Un décimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean menos propensos a inducir hipoglucemia con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea prandial.
Un undécimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean menos propensos a inducir el aumento de peso con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea prandial.
Un duodécimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean menos propensos a inducir hipoglucemia y aumento de peso con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea prandial.
Un decimotercer objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que tengan menos acción en el tejido muscular y/o graso en relación con las insulinas prandiales actualmente comercializadas después de la administración subcutánea.
Los objetivos adicionales de esta invención se basan en combinaciones de uno o más de los objetivos mencionados anteriormente, y en particular sobre la provisión de análogos de insulina que muestren un perfil prandial después de la administración subcutánea, y que sean químicamente estables en formulaciones, y en particular en formulaciones que no contienen zinc añadido.
Resumen de la invención
Descubrimos que los derivados de insulina acilados A22K de la presente invención tienen propiedades significativamente mejoradas con relación a derivados de insulina similares de la técnica anterior. En particular, descubrimos que los derivados de insulina de la invención, en formulaciones que no contienen iones de zinc añadidos y cuando se comparan con derivados similares de la técnica anterior, se asocian con un tamaño menor de agregados moleculares. Se conoce que las especies más pequeñas difunden más rápidamente que las más grandes, por lo que se espera una absorción más rápida. El tamaño de estos agregados moleculares puede, por ejemplo, medirse como se describe en la presente descripción mediante Dispersión de Rayos X de Ángulo Pequeño (SAXS), como se describe en la sección de ejemplos.
Además, descubrimos que los derivados de insulina de la invención, con relación a derivados similares de la técnica anterior, en formulaciones que no contienen iones de zinc añadidos, se absorben más rápidamente después de la administración subcutánea en cerdos y/o ratas, y de esta manera se demostró una posible utilidad clínica como insulinas para uso prandial. Descubrimos que los derivados de insulina de la invención, con relación a derivados similares de la técnica anterior, en formulaciones que no contienen iones de zinc añadidos se asocian con menos “retraso” después de la administración subcutánea en cerdos. Por menos retraso se entiende que el depósito subcutáneo de insulina inyectada se absorbe más rápidamente que los análogos similares de la técnica anterior, de manera que el tiempo medio de residencia (MRT) después de la administración subcutánea es más corto para los derivados de insulina de la invención cuando se compara con derivados acilados similares de la técnica anterior. Las formulaciones que no contienen zinc permiten una absorción subcutánea más rápida, pero para las insulinas en general, la estabilidad química y física de las formulaciones que no contienen zinc es un reto, y hasta ahora solo se ha demostrado que es posible con insulina glulisina (Apidra®; B3K, insulina humana B29E), y solo en presencia de surfactantes cuando se dispensan en viales.
Ahora hemos descubierto que los derivados de insulina acilada A22K de la invención, con sustituciones en la posición B3, muy inesperadamente y sin precedentes, son tanto química como físicamente estables en formulaciones sin iones de zinc añadidos y sin surfactantes añadidos.
La velocidad de absorción de la insulina después de la administración subcutánea se correlaciona en gran medida con la velocidad de difusión. Por lo tanto, las especies más pequeñas tienen velocidades de difusión más rápidas y velocidades de absorción concomitantes más rápidas que las especies más grandes.
Las preparaciones de insulina que contienen zinc se absorben más lentamente que las formulaciones sin zinc, ya que los hexámeros de zinc de la formulación deben disociarse en dímeros y/o monómeros antes de que pueda tener lugar la absorción.
La estabilidad química y física de las formulaciones de insulina requiere la presencia de zinc, y se requiere la ausencia de zinc para una rápida absorción. En la presente invención se proporciona una solución a este problema. Dado que la insulina necesita ser estable en la formulación para ser clínicamente útil, la propiedad de las insulinas de la invención de ser estables en la formulación libre de zinc da como resultado propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas superiores a las de las insulinas de la técnica anterior. Esto se debe a que las insulinas de la técnica anterior necesitan formularse con iones de zinc para que sean estables en la formulación. La comparación adecuada con respecto a las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas es, por lo tanto, comparar formulaciones estables y, en consecuencia, comparar formulaciones de insulinas estables libres de zinc de la invención con formulaciones de insulinas que contienen zinc de la técnica anterior.
Una ventaja del uso de derivados de insulina acilados como terapia de insulina prandial es lograr concentraciones plasmáticas de insulina más altas que las que se alcanzan con el tratamiento con insulinas prandiales no aciladas, como insulina aspart, insulina lispro o insulina glulisina.
Los derivados de insulina acilados A22K de acuerdo con la invención tienen un perfil de acción en el tiempo de tipo prandial después de la administración subcutánea.
Los derivados de insulina acilados A22K con ácido tetradecanodioico, ácido pentadecanodioico, o aglutinantes de albúmina basados en ácido hexadecanodioico de acuerdo con la invención demostraron conferir afinidades muy altas de unión al receptor de insulina, afinidades que se reducen en presencia de 1,5 % de albúmina sérica humana (HSA).
Los derivados de insulina acilados A22K de acuerdo con la invención no tienen solubilidad reducida a concentraciones fisiológicas de sal.
En consecuencia, en su primer aspecto, la invención proporciona un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys, B3aar1] con relación a la insulina humana; en donde
aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y
uno, dos o tres de los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones B26, B27 y/o B28 se sustituyen de la siguiente manera:
el residuo de aminoácido ubicado en la posición B26 se sustituye por Glu (E) o Asp (D); y/o
el residuo de aminoácido ubicado en la posición B27 se sustituye por Glu (E) Asp (D) o Pro (P); y/o el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); sin embargo, siempre que;
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B27 se sustituye por Pro (P); entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); y
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 no se sustituye, entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Arg (R), o
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E) o Asp (D), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Pro (P) o B29Arg (R), y
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 es Pro (P), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B30 se sustituye por B30Arg (R); y
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Arg (R), entonces los residuos de aminoácido ubicados en las posiciones B29 y B30 se han eliminado (es decir, desB29, desB30); y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por Arg (R), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B30 se ha eliminado (es decir, desB30); y
cuyo análogo puede comprender adicionalmente una sustitución A8Arg (R) y/o A14Glu (E); y
cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG; en donde
gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico;
OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);
cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y
cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y
en donde el grupo Acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14-tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el derivado de insulina de la invención y uno o más excipientes aceptables farmacéuticamente.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del derivado de insulina de la invención como un medicamento.
En otro aspecto adicional, la invención proporciona métodos para el tratamiento, la prevención o el alivio de enfermedades, trastornos o afecciones que se relacionan con la diabetes, diabetes tipo 1 , diabetes tipo 2 , alteraciones de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina) hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia o úlceras gástricas, cuyos métodos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del derivado de insulina de la invención a un sujeto que lo necesita.
Otros objetivos de la invención serán evidentes para el experto en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y los ejemplos.
Descripción detallada de la invención
Derivados de insulina
En su primer aspecto, la presente invención proporciona nuevos derivados de insulina, cuyos derivados de insulina son análogos acilados de insulina humana.
El derivado de insulina de la invención se puede caracterizar en particular como un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys, B3aar1] con relación a la insulina humana; y en donde
aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y
uno, dos o tres de los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones B26, B27 y/o B28 se sustituyen de la siguiente manera:
el residuo de aminoácido (es decir, Tyr) ubicado en la posición B26 se sustituye por Glu (E) o Asp (D); y/o el residuo de aminoácido (es decir, Thr) ubicado en la posición B27 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Pro (P); y/o
el residuo de aminoácido (es decir, Pro) ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); sin embargo, siempre que;
si el residuo de aminoácido (es decir, Thr) ubicado en la posición B27 se sustituye por Pro (P); entonces el residuo de aminoácido (es decir, Pro) ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); y
si el residuo de aminoácido (es decir, Pro) ubicado en la posición B28 no se sustituye, entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Arg (R), o
si el residuo de aminoácido (es decir, Pro) ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E) o Asp (D), entonces el residuo de aminoácido (es decir, Lys) ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Pro (P) o B29Arg (R), y
si el residuo de aminoácido (es decir, Lys) ubicado en la posición B29 es Pro (P), entonces el residuo de aminoácido (es decir, Thr) ubicado en la posición B30 se sustituye por B30Arg (R); y
si el residuo de aminoácido (es decir, Pro) ubicado en la posición B28 se sustituye por Arg (R), entonces los residuos de aminoácidos (es decir, Lys y Thr) ubicados en las posiciones B29 y B30 se han eliminado (es decir, desB29, desB30); y
si el residuo de aminoácido (es decir, Lys) ubicado en la posición B29 se sustituye por Arg (R), entonces el residuo de aminoácido (es decir, Thr) ubicado en la posición B30 se ha eliminado (es decir, desB30); y cuyo análogo puede comprender adicionalmente una sustitución A8Arg (R) y/o A14Glu (E); y
cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG; en donde
gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico;
OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);
cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y
cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y
en donde el grupo Acilo es un residuo de un ácido a,ui-d¡carboxíl¡co seleccionado del ácido 1,14-tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico.
Características preferidas de la invención
El análogo acilado de la insulina humana de la invención se puede caracterizar adicionalmente por referencia a una o más de las siguientes cláusulas:
1. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde
aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y
uno, dos o tres de los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones B26, B27 y/o B28 están sustituidos con Glu (E) o Asp (D).
2. Un análogo acilado de la invención, en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D), Gly (G).
3. Un análogo acilado de la invención, en donde aar1 representa Glu (E) o Gln (Q).
4. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
5. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E) o Gln (Q); y aar2 representa Glu (E). 6. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar2 representa Glu (E).
7. El análogo acilado de la cláusula 4, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] es insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-4xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-6xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30.
8. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
9. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar3 representa Glu (E).
10. El análogo acilado de la cláusula 8, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B29Arg; desB30] es insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30.
11. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
12. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
13. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E). 14. El análogo acilado de la cláusula 12, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30.
15. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
16. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
17. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar4 representa Asp (D).
18. El análogo acilado de la cláusula 16, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] es insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30.
19. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
20. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
21. El análogo acilado de la cláusula 19, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Pro; B30Arg] es insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28E, B29P, B30R.
22. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
23. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
24. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
25. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
26. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
27. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar2 representa Glu (E).
28. El análogo acilado de la cláusula 26, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30.
29. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
30. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E) o Gln (Q); aar2 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
31. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
32. El análogo acilado de la cláusula 29, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28D, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B28E, B29R, desB30.
33. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
34. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
35. El análogo acilado de la cláusula 33, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Pro; B30Arg] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29P, B30R.
36. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
37. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
38. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar3 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
39. El análogo acilado de la cláusula 37, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30.
40. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
41. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar3 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
42. El análogo acilado de la cláusula 40, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Pro; B30Arg] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29P, B30R.
43. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
44. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar3 representa Glu (E). 45. El análogo acilado de la cláusula 43, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30.
46. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
47. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
48. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
49. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
50. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E); aar3 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
51. El análogo acilado de la cláusula 49, en donde el análogo de insulina [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28E, B29R, desB30.
52. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
53. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; BSaar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E); y aar3 representa Glu (E).
54. El análogo acilado de la cláusula 52, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30.
55. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
56. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
57. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
58. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E); y aar3 representa Glu (E).
59. El análogo acilado de la cláusula 57, en donde el análogo [A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Pro; B30Arg] es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B29P, B30R.
60. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
61. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar2 representa Glu (E). 62. El análogo acilado de la cláusula 60, en donde el análogo [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] es
A8R, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30.
63. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
64. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
65. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
66. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D). 67. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
68. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
69. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
70. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a con la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
71. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
72. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
73. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D) ; y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
74. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar2 representa Glu (E).
75. El análogo acilado de la cláusula 73, en donde el análogo [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] es
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30. 76. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
77. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E) ; y aar4 representa Glu (E).
78. El análogo acilado de la cláusula 76, en donde el análogo [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30.
79. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
80. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
81. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
82. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar3 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
83. El análogo acilado de la cláusula 81, en donde el análogo [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30.
84. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
85. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
86. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); y aar3 representa Glu (E).
87. El análogo acilado de la cláusula 85, en donde el análogo [A8Arg; A22Lys; BSaar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] es
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30.
88. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
89. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
90. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D). 91. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
92. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
93. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E); aar2 representa Glu (E); y aar3 representa Glu (E).
94. El análogo acilado de la cláusula 92, en donde el análogo [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] es
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30. 95. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
96. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
97. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
98. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
99. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
100. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
101. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D). 102. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
103. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Gln (Q); y aar4 representa Asp (D). 104. El análogo acilado de la cláusula 102, en donde el análogo [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B28D, B29R, desB30.
105. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
106. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
107. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
108. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
109. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
110. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
111. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
112. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
113. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
114. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
115. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E) o Gln (Q); aar3 representa Glu (E); y aar4 representa Glu (E).
116. El análogo acilado de la cláusula 114, en donde el análogo [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] es
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; o insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B27E, B28E, B29R, desB30.
117. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
118. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
119. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
120. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
121. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D). 122. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
123. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
124. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
125. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
126. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
127. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
128. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
129. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
130. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
131. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
132. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
133. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D). 134. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
135. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
136. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
137. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
138. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
139. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
140. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
141. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
142. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
143. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
144. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
145. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
146. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B27Pro; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D).
147. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); aar3 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
148. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27aar3; B28Arg; desB29; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar3 representa Glu (E) o Asp (D).
149. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
150. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es [A8Arg; A14Glu; A22Lys; B3aar1; B26aar2; B27Pro; B28aar4; B29Pro; B30Arg] con relación a la insulina humana; en donde aar1 representa Glu (E), Gln (Q), Asp (D); aar2 representa Glu (E) o Asp (D); y aar4 representa Glu (E) o Asp (D).
151. Un análogo acilado de la insulina humana, cuyo análogo es
[A8R, A22K, B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B26E, B28E, B29R, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B26E, B29R, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A14E, A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A14E, A22K, B3Q, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A14E, A22K, B3Q, B28D, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B27E, B29P, B30R];
[A22K, B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B28E, B29P, B30R];
[A22K, B3E, B26E, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B28D, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B27E, B28E, B29P, B30R];
[A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A22K, B3E, B27E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B27P, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B28D, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B28E, B29P, B30R];
[A22K, B3Q, B26E, B28E, B29R, desB30]; o
[A22K, B3Q, B26E, B29R, desB30];
con relación a la insulina humana.
El análogo de insulina de la invención se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG; en donde
gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico;
OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);
cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y
cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y
en donde el grupo Acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14-tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico.
152. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG.
153. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 6 residuos de aminoácidos.
154. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 5 residuos de aminoácidos.
155. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 4 residuos de aminoácidos.
156. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 2 a 6 residuos de aminoácidos.
157. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta por 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos.
158. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta por 3 o 4 residuos de aminoácidos.
159. Un análogo acilado de insulina humana, en donde el análogo de insulina acilado de la invención comprende al menos un residuo gGlu.
160. Un análogo acilado de insulina humana, en donde el análogo de insulina acilado de la invención comprende de 1 a 10 residuos gGlu.
161. Un análogo acilado de insulina humana en donde el análogo de insulina acilado de la invención comprende de 1 a 8 residuos gGlu.
162. Un análogo acilado de insulina humana; en donde el análogo de insulina acilado de la invención comprende de 1 a 6 residuos gGlu.
163. Un análogo acilado de insulina humana; en donde el análogo de insulina acilado de la invención comprende 1, 2, 3, 4 o 5 residuos gGlu.
164. Un análogo acilado de insulina humana, en donde el grupo acilo del análogo de insulina acilado de la invención es un resto de un ácido a,w-dicarboxílico seleccionado entre ácido 1,14-tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y ácido 1,16-hexadecanodioico.
165. Un análogo acilado de insulina humana, en donde el grupo acilo del análogo de insulina acilado de la invención es un residuo de ácido 1,14-tetradecanodioico.
166. Un análogo acilado de insulina humana, en donde el grupo acilo del análogo de insulina acilado de la invención es un residuo de ácido 1,15-pentadecanodioico.
167. Un análogo acilado de insulina humana, en donde el grupo acilo del análogo de insulina acilado de la invención es un residuo de ácido 1,16-hexadecanodioico.
168. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es
tetradecanodioil-4xgGlu;
tetradecanodioil-gGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-4xgGlu;
hexadecanodioil-4xgGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-gGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-gGlu-4xOEG; o
hexadecanodioil-gGlu-6xOEG.
169. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es
tetradecanodioil-4xgGlu;
tetradecanodioil-gGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-4xgGlu; o
hexadecanodioil-gGlu-2xOEG.
170. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es tetradecanodioil-4xgGlu.
71. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es tetradecanodioil-gGluxOEG.
72. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es hexadecanodioil-4xgGlu.
73. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es hexadecanodioil-4xgGluxOEG.
74. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es hexadecanodioil-gGluxOEG.
75. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es hexadecanodioil-gGluxOEG.
76. Un análogo acilado de la insulina humana, en donde el grupo de Fórmula II es hexadecanodioil-gGluxOEG.
77. Un análogo acilado de la insulina humana, que es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28E, B29P, B30R;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29P, B30R;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29P, B30R;
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B29P, B30R;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-4xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-6xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30.
Cualquier combinación de dos o más de las modalidades descritas en la presente descripción se considera dentro del alcance de la presente invención.
Definiciones
Nomenclatura
En la presente descripción, la denominación de las insulinas se hace de acuerdo con los siguientes principios:
El término "análogo" se usa frecuentemente para la proteína de insulina o péptido en cuestión antes de que se someta a una posterior modificación química (derivatización), y en particular acilación. El producto resultante de una modificación química de este tipo (derivatización) se suele denominar “derivado” o “análogo acilado”. Sin embargo, en el contexto de esta solicitud, el término “análogo” designa análogos de insulina humana así como también derivados (los acilados) de tales análogos de insulina humana.
Los nombres se dan como análogos, derivados y modificaciones (acilaciones) con relación a la insulina humana. Para la nomenclatura de la porción acilo (es decir, el grupo [Acil]-[Enlazador]- de la fórmula II), en algunos casos la nomenclatura se realiza de acuerdo con la nomenclatura IUPAC, y en otros casos la nomenclatura se realiza como nomenclatura de péptidos.
Como ejemplo, la porción acilo de la siguiente estructura (Quím. 1):
Figure imgf000019_0001
puede denominarse “tetradecanodioil-4xgGlu”, “tetradecanodioil-4xyGlu” o, “1,14-tetradecanodioil-4xgGlu” o similares, en donde yGlu (y gGlu) es una notación abreviada del aminoácido ácido gamma glutámico en la configuración L, y “4x” significa que el residuo siguiente se repite 4 veces.
De manera similar, la porción acilo de la siguiente estructura (Quím. 2):
Figure imgf000019_0002
puede por ejemplo denominarse “hexadecanodioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “hexadecanodioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “hexadecanodioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”, “1,16-hexadecanodioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “1,16-hexadecanodioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “1,16-hexadecanodioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”, “hexadecanodioil-(yGlu-OEG)3-yGlu)”, “hexadecanodioil-(yGlu-OEG)3-yGlu)”, o “hexadecanodioil-3x(yGlu-OEG)-yGlu)”;
en donde la porción de la siguiente estructura (Quím. 3):
Figure imgf000019_0003
puede denominarse por ejemplo tetradecanodioil, 1,14-tetradecanodioil o (notación abreviada) diácido C14. Se aplican notaciones similares para residuos similares con 15 y 16 átomos de carbono, pentadecanodioil, diácido C15 y hexadecanodioil, diácido C16, respectivamente.
yGlu (y gGlu) son anotaciones cortas para el aminoácido ácido gamma glutámico, H2N-CH(CO2H)-CH2CH2-CO2H (conectado a través del grupo alfa amino y a través del grupo carboxi gamma (cadena lateral)), en la configuración L. OEG es una notación abreviada para el residuo de aminoácido ácido 8-amino-3,6-dioxa-octanoico, NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H.
“2x” y “3x” significa que los residuos siguientes se repiten respectivamente 2 y 3 veces.
Por ejemplo, el derivado de insulina del Ejemplo 1 se denomina "insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioilgGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30" para indicar que la cadena A, que contiene 21 residuos de aminoácidos en la insulina humana, se ha ampliado en 1 aminoácido (posición A22), con una lisina (K), que además se modifica por acilación en el nitrógeno épsilon en el residuo de lisina de A22, denotado IN (o N(eps)) por el resto tetradecanodioil-gGlu-2xOEG, el aminoácido en la posición B3, N en la insulina humana, se ha sustituido por E (ácido glutámico), el aminoácido en la posición B27, T en la insulina humana, se ha sustituido con E (ácido glutámico), el aminoácido en la posición B28, P en la insulina humana, se ha sustituido por E, ácido glutámico, el aminoácido en la posición B29, K en la insulina humana, se ha sustituido por R, arginina, el aminoácido en la posición B30, la treonina, T, en la insulina humana, se ha eliminado. Los asteriscos en las fórmulas a continuación indican que el residuo en cuestión es diferente (es decir, sustituido) en comparación con la insulina humana.
A lo largo de esta solicitud, se dan tanto las fórmulas como los nombres de las insulinas preferidas de la invención.
Además, las insulinas de la invención también se denominan de acuerdo con la nomenclatura IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC). De acuerdo con esta nomenclatura, al derivado de insulina del Ejemplo 1 se le asigna el siguiente nombre: N{Alfa}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Se debe señalar que las fórmulas pueden escribirse con el residuo de lisina (que se modifica por acilación) ya sea que se muestre con el residuo de lisina expandido (como se muestra por ejemplo en el Ejemplo 8) o se muestre con el residuo de lisina contraído (como se muestra por ejemplo en el Ejemplo 1). En todos los casos, el grupo acilo se une al nitrógeno épsilon del residuo de lisina.
Estabilidad física
El término "estabilidad física" de la preparación de insulina como se usa en la presente descripción se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína como resultado de la exposición de la proteína a estrés termomecánico y/o su interacción con interfaces y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies e interfaces hidrófobas. La estabilidad física de las preparaciones acuosas de proteínas se evalúa por medio de inspección visual y/o mediciones de turbidez después de exponer recipientes adecuados (por ejemplo, cartuchos o frascos) llenos con la preparación a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante varios períodos de tiempo. La inspección visual de las preparaciones se realiza con una luz enfocada nítida con un fondo oscuro. Una preparación se clasifica como físicamente inestable con respecto a la agregación de proteínas, cuando muestra turbidez visual a la luz del día. Alternativamente, la turbidez de la preparación puede evaluarse mediante simples mediciones de turbidez bien conocidas por el experto. La estabilidad física de las preparaciones acuosas de proteínas también puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional de la proteína. La sonda es preferentemente una molécula pequeña que se une preferentemente a un confórmero no nativo de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular pequeña de la estructura proteica es la tioflavina T. La tioflavina T es un colorante fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En presencia de fibrillas, y quizás también de otras configuraciones proteicas, la tioflavina T da lugar a un nuevo máximo de excitación a aproximadamente 450 nm y una emisión mejorada a aproximadamente 482 nm cuando se une a una proteína en forma de fibrilla. La tioflavina T libre es esencialmente no fluorescente en las longitudes de onda.
Estabilidad química
El término "estabilidad química" de la preparación de proteína, como se usa en la presente descripción, se refiere a cambios en la estructura covalente de la proteína que conducen a la formación de productos de degradación química con una posible potencia biológica menor y/o posibles propiedades inmunogénicas incrementadas en comparación con la estructura de la proteína nativa. Se pueden formar varios productos de degradación química en dependencia del tipo y la naturaleza de la proteína nativa y del entorno al que se expone la proteína. Frecuentemente se observan cantidades crecientes de productos de degradación química durante el almacenamiento y uso de la preparación de proteína. La mayoría de las proteínas tienden a la desamidación, un proceso en donde el grupo amida de la cadena lateral en los residuos de glutaminilo o asparaginilo se hidroliza para formar un ácido carboxílico libre o los residuos de asparaginilo para formar un derivado isoAsp. Otras rutas de degradación involucran la formación de productos de alto peso molecular donde dos o más moléculas de proteína se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de productos de degradación de dímeros, oligómeros y polímeros unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern TJ & Manning MG, Plenum Press, Nueva York 1992). La oxidación (por ejemplo, de residuos de metionina) puede mencionarse como otra variante de degradación química. La estabilidad química de la preparación de proteína puede evaluarse por medición de la cantidad de productos de degradación química en varios puntos de tiempo después de la exposición a diferentes condiciones ambientales (frecuentemente, la formación de productos de degradación puede acelerarse, por ejemplo, por aumento de la temperatura). Frecuentemente, la cantidad de cada producto de degradación individual se determina mediante la separación de los productos de degradación en dependencia del tamaño de la molécula, su hidrofobicidad y/o carga mediante el uso de varias técnicas cromatográficas (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC). Dado que los productos HMWP son potencialmente inmunogénicos y no son biológicamente activos, los niveles bajos de HMWP son ventajosos.
Métodos de Síntesis
Los derivados de insulina de la invención pueden obtenerse mediante métodos convencionales para la preparación de insulina, análogos de insulina y derivados de insulina, y en particular, mediante los métodos descritos en los ejemplos de trabajo.
Actividad Biológica
En otro aspecto, la invención proporciona nuevos derivados de insulina para su uso como medicamentos, o para su uso en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas.
Los derivados de insulina de la invención se encuentran como derivados de insulina de acción corta y rápida que se consideran adecuados para su uso prandial.
Todos los derivados de insulina de la invención poseen afinidades al receptor de insulina adecuadas para activar el receptor de insulina y de esta manera dar la respuesta glucémica necesaria, es decir, ser capaz de disminuir la glucosa en sangre en animales y humanos. Como medida de la actividad funcional (agonista) de las insulinas de la invención, se demuestra la actividad de lipogénesis en adipocitos de rata.
Se encontró que los derivados de insulina de la invención tienen un receptor de insulina (IR) equilibrado con el receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1R) en la relación de afinidad (IR / IGF-1R).
En un aspecto, la insulina acilada A22K de la invención tiene una relación IR / IGF-1R de más de 0,3; más de 0,4; más de 0,5; más de 0,6; más de 0,7; más de 0,8; más de 0,9; más de 1; más de 1,5; o de más de 2.
En otro aspecto, el análogo de insulina acilada A22K es un compuesto de la invención, en donde el grupo acilo de Fórmula II es derivado del ácido 1,14-tetradecanodioico, y cuyo análogo de insulina acilada tiene un tiempo de residencia medio (MRT) de menos de 250 minutos; menos de 200 minutos; menos de 175 minutos; menos de 150 minutos; menos de 125 minutos; o de menos de 100 minutos; después de la inyección subcutánea en cerdos de una formulación del análogo de insulina acilada de la invención de 600 pM (aproximadamente), que contiene 1,6 % (p/v, aproximadamente) de glicerol y 30 mM de fenol/m-cresol, a pH 7,4.
En otra aspecto, el análogo de insulina acilada A22K es un compuesto de la invención, en donde el grupo Acilo de Fórmula II es derivado del ácido 1,16-hexadecanodioico, y cuyo análogo de insulina acilada tiene un tiempo de residencia medio (MRT) de menos de 700 minutos; menos de 600 minutos; menos de 500 minutos; menos de 400 minutos; menos de 300 minutos; o menos de 250 minutos; después de la inyección subcutánea en cerdos de una formulación del análogo de insulina acilada de la invención de 600 pM (aproximadamente), que contiene 1,6 % (p/v, aproximadamente) de glicerol y 30 mM de fenol/m-cresol, a pH 7,4.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso médico del análogo de insulina acilado de la invención, y en particular al uso de tales derivados de insulina para el tratamiento, la prevención o el alivio de enfermedades, trastornos o afecciones que se relacionan con la diabetes, diabetes tipo 1 , diabetes tipo 2 , alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina) hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, infarto cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia o úlceras gástricas, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del derivado de insulina a un sujeto que lo necesite.
En otra modalidad, la invención se refiere al uso de tales derivados de insulina para el tratamiento, prevención o alivio de enfermedades, trastornos o afecciones que se relacionan con la diabetes, diabetes tipo 1 , diabetes tipo 2 , o alteración de la tolerancia a la glucosa, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del derivado de insulina a un sujeto que lo necesite.
En una tercera modalidad, la invención se refiere al uso de tales derivados de insulina para el tratamiento, prevención o alivio de enfermedades, trastornos o afecciones relacionados con la diabetes, y en particular diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2.
Composiciones Farmacéuticas
La presente invención se refiere a análogos de insulina útiles como medicamentos o para la fabricación de una composición farmacéutica/medicamento.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de acuerdo con la presente invención.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende opcionalmente uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además otros excipientes comúnmente usados en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, conservadores, agentes quelantes, agentes de tonicidad, potenciadores de la absorción, estabilizadores, antioxidantes, polímeros, surfactantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos y proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina o proteínas).
En una modalidad de la invención, la composición farmacéutica de la invención es una preparación acuosa, es decir, una preparación que comprende agua. Tal composición es típicamente una solución o una suspensión. En una modalidad de la invención adicional, la composición farmacéutica es una solución acuosa.
El término "preparación acuosa" se define como una preparación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, el término “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua. Las suspensiones acuosas pueden contener los compuestos activos en una mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas.
En una modalidad de la invención, la preparación de insulina comprende una solución acuosa de un derivado de insulina de la presente invención, en donde dicho compuesto de insulina está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20,0 mM; más particularmente de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 4,0 mM; de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 2,0 mM; o de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 1,2 mM.
En otra modalidad de la invención, la preparación de insulina comprende una solución acuosa de un derivado de insulina de la presente invención, en donde dicho compuesto de insulina está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM; de aproximadamente 0,3 mM; de aproximadamente 0,4 mM; de aproximadamente 0,6 mM; de aproximadamente 0,9 mM; de aproximadamente 1,2 mM; de aproximadamente 1,5 mM; o de aproximadamente 1,8 mM
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender, además, un sistema tampón. El tampón se puede seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limita a, acetato de sodio, carbonato de sodio, fosfato dihidrógeno de sodio, fosfato hidrógeno de disodio, fosfato de sodio, y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, glicilglicina, etilendiamina, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o sus mezclas. Cada uno de estos tampones específicos constituye una modalidad de la invención alternativa.
En una modalidad, el tampón es un tampón de fosfato. En otra modalidad, la concentración de dicho tampón de fosfato está en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM a 20 mM; en otra modalidad adicional la concentración de dicho tampón de fosfato está en el intervalo de 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 8 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 8 mM, o de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 8 mM, o de 6 mM a aproximadamente 8 mM.
El pH de la composición farmacéutica inyectable de la invención está en el intervalo de 3 a 8,5. Preferentemente, la composición farmacéutica inyectable de acuerdo con la invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,8.
En una modalidad el pH está en el intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,8, o de 7,2 a 7,6.
Las preparaciones de insulina de la presente invención pueden comprender, además, un agente de tonicidad. El agente de tonicidad puede seleccionarse del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o azúcar alcohólico, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) o sus mezclas. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, que incluyen por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, almidón hidroxietílico y carboximetilcelulosa de Na. En una modalidad el aditivo de azúcar es sacarosa. Los azúcares alcohólicos incluyen, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el aditivo de azúcar alcohólico es manitol. Los azúcares o azúcares alcohólicos mencionados anteriormente pueden usarse individualmente o en combinación. Cada uno de estos agentes de tonicidad específicos o sus mezclas constituyen una modalidad de la invención alternativa.
En una modalidad de la invención, el glicerol y/o manitol y/o cloruro de sodio pueden estar presentes en una cantidad correspondiente a una concentración de 0 a 250 mM, de 0 a 200 mM, o de 0 a 100 mM.
Las preparaciones de insulina de la presente invención pueden comprender, además, un conservante farmacéuticamente aceptable. El conservante puede estar presente en una cantidad suficiente para obtener un efecto conservante. La cantidad de conservante en una composición farmacéutica de la invención puede determinarse, por ejemplo, a partir de la bibliografía en el campo y/o la cantidad(es) conocida(s) de conservante en, por ejemplo, productos comerciales. Cada uno de estos conservantes específicos o sus mezclas constituyen una modalidad de la invención alternativa. El uso de un conservante en preparaciones farmacéuticas se describe, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.
En una modalidad, la composición farmacéutica inyectable comprende al menos un compuesto fenólico como agente conservante.
En otra modalidad el compuesto fenólico para su uso de acuerdo con la invención puede estar presente en hasta aproximadamente 6 mg/ml en la composición farmacéutica inyectable final, en particular de hasta aproximadamente 4 mg/ml de composición farmacéutica inyectable final.
En otra modalidad el compuesto fenólico para su uso de acuerdo con la invención puede estar presente en una cantidad de hasta aproximadamente 4,0 mg/ml de la composición farmacéutica inyectable final; en particular de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 4,0 mg/ml; o de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 4,0 mg/ml.
En otra modalidad el conservante es fenol.
En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable comprende una mezcla de fenol y m-cresol como agente conservante.
En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable comprende aproximadamente 16 mM de fenol (1,5 mg/ml) y aproximadamente 16 mM de m-cresol (1,72 mg/mL).
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender, además, un agente quelante. El experto en la técnica conoce bien el uso de un agente quelante en preparaciones farmacéuticas. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender, además, un potenciador de la absorción. El grupo de potenciadores de la absorción puede incluir, pero no se limita a, compuestos nicotínicos. El término compuesto nicotínico incluye nicotinamida, ácido nicotínico, niacina, niacina amida y vitamina B3 y/o sus sales y/o sus combinaciones.
En una modalidad, el compuesto nicotínico es nicotinamida, y/o ácido nicotínico, y/o una sal del mismo. En otra modalidad, el compuesto nicotínico es nicotinamida. El compuesto nicotínico para su uso de acuerdo con la invención puede ser en particular N-metil nicotinamida, N,N-dietilnicotinamida, N-etilnicotinamida, N,N-dimetilnicotinamida, N-propilnicotinamida o N-butilnicotinamida.
En otra modalidad, el compuesto nicotínico está presente en la cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM; en particular en la cantidad de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM; en la cantidad de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 170 mM; o en la cantidad de aproximadamente 130 mM a aproximadamente 170 mM, tal como aproximadamente 130 mM, aproximadamente 140 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 160 mM, o aproximadamente 170 mM.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un estabilizador. El término “estabilizador” como se usa en la presente descripción se refiere a productos químicos añadidos a preparaciones farmacéuticas que contienen polipéptidos para estabilizar el péptido, es decir, para aumentar la vida útil y/o el tiempo de uso de tales preparaciones. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.
La composición farmacéutica de la invención puede comprender, además, una cantidad de una base aminoacídica suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido o proteína durante el almacenamiento de la composición. El término "base aminoacídica" se refiere a un aminoácido o una combinación de aminoácidos, en donde cualquier aminoácido dado está presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Los aminoácidos pueden en particular ser arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, aminoguanidina, ornitina o N-monoetil L-arginina, etionina o buthionina, o S-metil-L cisteína. En una modalidad de la invención la base aminoacídica puede estar presente en una cantidad correspondiente a una concentración de 1 a 100 mM; de 1 a 50 mM; o de 1 a 30 mM. En una modalidad, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un surfactante. El término “surfactante” como se usa en la presente descripción se refiere a cualesquiera moléculas o iones que comprenden una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófila). Los surfactantes se acumulan preferentemente en las interfaces, en las que la parte hidrófila se orienta hacia el agua (fase hidrofílica) y la parte lipófila hacia la fase oleosa o hidrofóbica (es decir, vidrio, aire, aceite, etcétera). La concentración a la que los surfactantes comienzan a formar micelas se conoce como la concentración micelar crítica o CMC. Además, los surfactantes reducen la tensión superficial de un líquido. Los surfactantes también se conocen como compuestos anfipáticos. El uso de un surfactante en preparaciones farmacéuticas se conoce bien por los expertos. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.
La invención se refiere, además, a un método para la preparación de tales preparaciones de insulina. Las preparaciones de insulina de esta invención pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de los diversos métodos reconocidos. Por ejemplo, las preparaciones pueden prepararse al mezclar una solución acuosa de excipientes con una solución acuosa del derivado de insulina, después de lo cual el pH se ajusta a un nivel deseado y la mezcla se lleva hasta el volumen final con agua, seguido de filtración estéril.
Composiciones Farmacéuticas Libres de Zinc
Las preparaciones de insulina comprenden tradicionalmente zinc añadido, por ejemplo, como sal de cloruro o acetato para obtener una estabilidad aceptable de la preparación farmacéutica. Sin embargo, se descubrió sorprendentemente que ciertos derivados de insulina de la invención, mientras mantienen una estabilidad química y física suficiente, pueden formularse en composiciones farmacéuticas sin la adición de zinc, lo que proporciona un inicio de acción más rápido que los análogos de insulina comparables que necesitan iones Zn2+ para mantener suficiente estabilidad química y física. Las formulaciones que no contienen zinc se absorben más rápidamente del tejido subcutáneo, lo que permite su uso prandial.
Con respecto a esto es necesario mencionar que una composición farmacéutica de insulina que no contiene zinc es realmente difícil de obtener, debido a que trazas de zinc, en una mayor o menor medida, pueden estar presentes en los excipientes usados convencionalmente para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y en particular en los materiales de goma usados en recipientes médicos.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de insulina de la invención, formulado como una composición baja en zinc, es decir, sin iones de zinc añadidos. Tales composiciones farmacéuticas se denominan generalmente como “composiciones libres de zinc”, aunque de hecho pueden considerarse “composiciones bajas en zinc”.
Sin embargo, siempre que se puedan proporcionar excipientes libres de zinc, los derivados de insulina de la presente invención de hecho permiten la preparación de composiciones farmacéuticas libres de zinc. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas libres de zinc que comprenden el derivado de insulina de la invención y uno o más portadores o diluyentes aceptables farmacéuticamente, desprovistos de zinc. Hemos descubierto además que los derivados de insulina acilados A22K de la invención, al tener una sustitución en la posición B3, mejora la estabilidad tanto química como física en composiciones farmacéuticas formuladas sin añadir iones de zinc y sin surfactantes añadidos. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica baja en zinc o libre de zinc como se describió anteriormente, que comprende un derivado de insulina de la invención que contiene una sustitución adicional en la posición B3 (es decir, b3e o B3Q), y uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en cuya composición farmacéutica, sin embargo, no se ha agregado surfactante.
En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica baja en zinc como se describió anteriormente, en donde los iones de zinc pueden estar presentes en una cantidad que corresponde a una concentración de menos de 0,2 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,15 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,12 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; 0,1 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,09 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,08 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,07 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,06 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,05 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,04 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,03 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,02 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; o de menos de 0,01 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina.
En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica formulada como una composición con bajo contenido de zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un derivado de insulina y uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
En una modalidad adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica formulada como una composición con bajo contenido de zinc como se describió anteriormente, y en la que no se añadió ningún surfactante.
Incluso en una modalidad adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica formulada como una composición con bajo contenido de zinc como se describió anteriormente, y en donde no se añadió ningún surfactante, y que comprende un compuesto nicotínico, y en particular nicotinamida, como se describió anteriormente.
Métodos de Administración
La composición farmacéutica de la invención puede administrarse mediante métodos convencionales.
La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma. Alternativamente, la administración parenteral puede realizarse por medio de una bomba de infusión. Como opción adicional, las preparaciones de insulina que contienen el compuesto de insulina de la invención también pueden adaptarse a la administración transdérmica, por ejemplo, mediante inyección sin aguja o desde un parche de microagujas, opcionalmente un parche iontoforético, o administración transmucosal, por ejemplo, bucal.
La composición farmacéutica de la invención puede administrarse a un paciente que necesite de tratamiento en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos tales como la piel o mucosa; en sitios donde no se produce absorción tales como en una arteria, en una vena, o en el corazón; y en sitios que implican la absorción, tales como en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.
La composición farmacéutica de la invención puede usarse en el tratamiento de la diabetes por administración parenteral. La dosis real depende de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se trata y queda a criterio del médico y puede variarse mediante el ajuste de la dosis a las circunstancias particulares de esta invención para producir el efecto terapéutico deseado.
Sin embargo, se contempla que el derivado de insulina de acuerdo con la invención debe estar presente en la composición farmacéutica final en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20,0 mM; más particularmente de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 4,0 mM; de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 2,0 mM; o de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 1,2 mM.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden prepararse para su uso en varios dispositivos médicos normalmente usados para la administración de insulina, que incluyen los dispositivos tipo pluma usados para la terapia con insulina por inyección, la terapia de infusión de insulina subcutánea continua mediante el uso de bombas, y/o para la aplicación en la terapia de insulina basal.
En una modalidad, la composición farmacéutica de la invención se formula en un dispositivo tipo pluma para su uso en la terapia con insulina por inyección.
En otra modalidad, la composición farmacéutica de la invención se formula en una bomba externa para la administración de insulina.
Métodos de Terapia
La presente invención se refiere a fármacos para su uso terapéutico. Más específicamente la invención se refiere al uso de los derivados acilados de análogos de insulina humana de la invención para el tratamiento o prevención de afecciones médicas relacionadas con la diabetes.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección que se relaciona con diabetes, diabetes tipo 1 , diabetes tipo 2 , alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina), hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia, o úlceras gástricas, cuyo método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo acilado de insulina humana de la invención a un sujeto que lo necesite.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección que se relaciona con diabetes, diabetes tipo 1 , diabetes tipo 2 , alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina), hipertensión, desórdenes cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, desórdenes cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia, o úlceras gástricas, cuyo método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo acilado de insulina humana de la invención a un sujeto que lo necesite.
En una tercera modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 , alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, o síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina).
En una cuarta modalidad la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la diabetes, en particular diabetes tipo 1, o diabetes tipo 2.
Breve descripción de las figuras
La presente invención se ilustra adicionalmente con referencia a las figuras adjuntas, en donde:
Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran una ilustración esquemática del proceso de fibrilación cuando se mide en el "ensayo de fibrilación ThT" descrito en la presente descripción;
Las Figuras 2A y 2B muestran perfiles PK de análogos basados en C14 de la invención (Ejemplos 11 y 12, y Ejemplos 4 y 10, respectivamente), y de análogos basados en C14 de la técnica anterior (Análogos 2 y 3 de la técnica anterior y Análogos 2 y 3 de la técnica anterior), respectivamente, después de la inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley;
La Figura 2C muestra perfiles PK de análogos basados en C16 de la invención (Ejemplo 33), y de análogos basados en C16 de la técnica anterior (Análogo 1 de la técnica anterior), después de la inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley;
Las Figuras 2D1 (0-180 minutos), 2D2 (0-30 minutos), 2E1 (0-180 minutos) y 2E2 (0-30 minutos) muestran perfiles de PD (resultantes de los perfiles de PK que se muestran en las Figuras 2A y 2B) de análogos basados en diácido C14 de la invención y de análogos basados en diácido C14 de la técnica anterior después de la inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley;
Las Figuras 2F1 (0-180 minutos) y 2F2 (0-60 minutos) muestran perfiles de PD (resultantes de los perfiles PK que se muestran en la Figura 2C) de análogos basados en diácido C16 de la invención y análogos basados en diácido C16 de la técnica anterior después de inyección subcutánea a las ratas Sprague Dawley;
Las Figuras 3A y 3B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina de la técnica anterior (Análogo 1 de la técnica anterior), es decir, insulina humana A22K(W(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg) después de inyección subcutánea a cerdos LYD;
Las Figuras 4A y 4B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del Análogo 2 de la técnica anterior, un análogo diácido C14 de un derivado de insulina representativo de la técnica anterior, es decir, insulina humana A22K(A/(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, Análogo 1 de la técnica anterior), formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (72 nmol/animal), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (72 nmol/animal) después de inyección subcutánea a cerdos LYD;
Las Figuras 5A y 5B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del derivado de insulina del Ejemplo 12, es decir, insulina humana A22K(W(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30, formulada con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg) después de inyección subcutánea a cerdos LYD;
Las Figuras 6A y 6B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina del Ejemplo 1, es decir, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30, formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg) después de inyección subcutánea a cerdos LYD;
Las Figuras 7A y 7B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del derivado de insulina del Ejemplo 7, es decir, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30, formulada con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg) después de inyección subcutánea a cerdos LYD; y
Las Figuras 8A y 8B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del derivado de insulina del Ejemplo 10, es decir, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30, formulada con 0 moléculas zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg) después de inyección subcutánea a cerdos LYD.
EJEMPLOS
La invención se ilustra adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención reivindicada.
Expresión y purificación del análogo de insulina
Expresión de análogos de insulina
El análogo de insulina, es decir, los análogos de insulina no acilados de dos cadenas, para su uso de acuerdo con la invención se producen de forma recombinante mediante la expresión de una secuencia de ADN que codifica el análogo de insulina en cuestión en una célula huésped adecuada mediante técnicas bien conocidas, por ejemplo, como se describe en el documento US 6500645 [5930.500-US]. El análogo de insulina se expresa directamente o como una molécula precursora que puede tener una extensión N-terminal en la cadena B y/o un péptido enlazador (péptido C) entre la cadena B y la cadena A. Esta extensión N-terminal y el péptido C se escinden in vitro con una proteasa adecuada, por ejemplo, la proteasa de Achromobacter lyticus (ALP) o tripsina y, por lo tanto, tendrán un sitio de escisión junto a la posición B1 y A1, respectivamente. Las extensiones N-terminales y los péptidos C del tipo adecuado para su uso de acuerdo con esta invención se describen, por ejemplo, en los documentos US 5395922, EP 765395 y WO 9828429.
La secuencia polinucleotídica que codifica el precursor del análogo de insulina para su uso de acuerdo con la invención puede prepararse por síntesis mediante métodos establecidos, por ejemplo, el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y otros (1981) Tetrahedron Letters 22 1859-1869, o el método descrito por Matthes y otros (1984) EMBO Journal 3801-805. De acuerdo con el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se hibridan y se ligan para formar la construcción de ADN sintético. Una forma actualmente preferida de preparar la construcción de ADN es por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El método recombinante hará uso típicamente de un vector que es capaz de replicarse en el microorganismo o célula huésped seleccionados y que porta una secuencia polinucleotídica que codifica el precursor del análogo de insulina para su uso de acuerdo con la presente invención. El vector recombinante puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. Además, puede usarse un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o puede usarse un transposón. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado y preferentemente contendrá un(os) elemento(s) que permita(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma. El vector de expresión recombinante puede ser uno capaz de replicarse en levadura. Ejemplos de secuencias que permiten que el vector se replique en levadura son los genes de replicación de 2 pm de plásmido de levadura REP 1-3 y el origen de replicación.
El vector puede contener uno o más marcadores de selección, que permitan una fácil selección de las células transformadas. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofías a los auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores de selección bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los marcadores de selección para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa) y trpC (antranilato sintasa). Los marcadores adecuados para las células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y UrA3. Un marcador de selección muy adecuado para levadura es el gen TPI de Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40 125-130).
En el vector, la secuencia polinucleotídica está conectada operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección, incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, homólogos o heterólogos de la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, del gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), del gen de levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB), del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) y del gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP). Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción en una célula hospedero fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, neutral alfa-amilasa de Aspergillus niger, y la alfa amilasa ácido-estable de Aspergillus niger. En un huésped de levadura, los promotores útiles son los promotores de Ma1, TPI, ADH, TDH3 o PGK de Saccharomyces cerevisiae.
Típicamente, la secuencia polinucleotídica que codifica la cadena principal del péptido de insulina para su uso de acuerdo con la invención también estará conectada operativamente a un terminador adecuado. En levadura, un terminador adecuado es el terminador de TPI (Alber y otros (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1419-434).
Los procedimientos usados para combinar la secuencia polinucleotídica que codifica el análogo de insulina para su uso de acuerdo con la invención, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlos en un vector adecuado que contiene la información necesaria para la replicación en el huésped seleccionado, se conocen bien por los expertos en la técnica. Se debe entender que el vector puede construirse ya sea mediante la preparación, primero, de un constructo de ADN que contiene la secuencia de ADN completa que codifica las cadenas principales de insulina para su uso de acuerdo con la invención, y subsecuentemente la inserción de este fragmento en un vector de expresión adecuado, o mediante la inserción secuencial de fragmentos de ADN que contienen información genética para los elementos individuales (tales como la señal y el propéptido (extensión N-terminal de la cadena B), péptido C, cadenas A y B), seguido de la ligadura.
El vector que comprende la secuencia polinucleotídica que codifica el análogo de insulina para su uso de acuerdo con la invención se introduce en una célula huésped, de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota. Las células unicelulares útiles son células bacterianas como bacterias gram positivas, incluidas, pero no limitadas a, células de Bacillus, células de Streptomyces, o bacterias gram negativas como E. coli y Pseudomonas sp. Las células eucariotas pueden ser células de mamíferos, insectos, plantas u hongos.
En particular, la célula huésped puede ser una célula de levadura. El organismo de levadura puede ser cualquier organismo de levadura adecuado que, al cultivarlo, secrete al medio de cultivo la cadena principal del péptido de insulina o su precursor. Los ejemplos de organismos de levadura adecuados incluyen cepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., y Geotrichum fermentans.
La transformación de las células de levadura puede realizarse, por ejemplo, mediante la formación de protoplastos seguida por transformación por métodos conocidos. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de organismos de levadura.
Purificación de análogos de insulina
El análogo de insulina secretado o su precursor puede recuperarse del medio mediante procedimientos convencionales que incluyen la separación de las células de levadura del medio por centrifugación, filtración o por captura o adsorción del análogo de insulina o su precursor en una matriz de intercambio iónico o en una matriz de absorción de fase inversa, la precipitación de los componentes proteicos del sobrenadante, o por filtración por medio de una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, seguido de purificación mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc.
La purificación y digestión de las cadenas principales de péptidos de insulina de esta invención se lleva a cabo de la siguiente manera:
El precursor del análogo de insulina de cadena sencilla, que puede contener una extensión N-terminal de la cadena B y un péptido C modificado entre la cadena B y la cadena A, se purifica y concentra a partir del sobrenadante de cultivo de levadura mediante intercambio catiónico. (Kjeldsen y otros (1998) Prot. Expr. Pur. 14309-316).
El precursor del análogo de insulina de cadena sencilla se madura en forma de una cadena principal del péptido de insulina de dos cadenas por digestión con ALP inmovilizada específica de lisina (Kristensen y otros (1997) J. Biol. Chem. 2012978-12983) o mediante el uso de tripsina para escindir la extensión N-terminal de la cadena B, si está presente, y el péptido C.
Digestión con tripsina
El eluato de la etapa de cromatografía de intercambio catiónico que contiene el precursor análogo de insulina, se diluye con agua hasta una concentración de etanol de 15-20 %. Se añade glicina hasta una concentración de 50 mM y el pH se ajusta a 9,0-9,5 con NaOH. Se añade tripsina en una proporción de 1:300 (p:p) y se permite que ocurra la digestión a 4 grados. La digestión se monitorea analíticamente cada 20 minutos hasta que se completa la digestión. La digestión termina con adición de ácido cítrico 1 M en una proporción de 3:100 (v:v).
La reacción de digestión se analiza mediante cromatografía líquida analítica LC en un sistema Waters Acquity Ultra-Performance Liquid Chromatography mediante el uso de una columna C18 y el peso molecular se confirma por espectrometría de masa MS MAlDi-TOF (Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF).
El análogo de insulina de dos cadenas se purifica mediante HPLC de fase inversa (sistema Waters 600) en una columna C18 mediante el uso de un gradiente de acetonitrilo. El análogo de insulina deseado se recupera mediante liofilización.
La pureza se determina mediante LC analítica en un sistema Waters Acquity Ultra-Performance Liquid Chromatography mediante el uso de una columna C18, y el peso molecular se confirma mediante MS MALDI-TOF. Abreviaturas
ALP - proteasa de Achromobacter lyticus
Péptido C - péptido enlazador
HPLC - cromatografía líquida de alto rendimiento
IR - receptor de insulina
IGF-1R - receptor del factor de crecimiento 1 similar a insulina
LC - cromatografía líquida
MALDI-TOF - desorción/ionización láser asistida por matriz con detector de tiempo de vuelo
MS - espectrometría de masas
PD - farmacodinámica (efecto de reducción de la glucosa en sangre/plasma)
PK - farmacodinámica (perfil de concentraciones de insulina en sangre/plasma vs. tiempo)
tBu es terc-butilo;
DCM es diclorometano;
DIPEA = DIEA es W,A/-diisopropiletilamina;
DMF es A/,A/-dimetilformamida;
DMSO es dimetilsulfóxido;
Fmoc es 9-fluorenilmetiloxicarbonilo;
yGlu (gGlu) es gamma L-glutamil;
HCl es ácido clorhídrico;
NMP es W-metilpirrolidona;
OtBu es éster terc-butílico;
OEG es [2-(2-aminoetoxi)etoxi]etilcarbonilo;
OSu es succinimidil-1-iloxi = 2,5-dioxo-pirrolidin-l-iloxi;
RT es temperatura ambiente;
TFA es ácido trifluoroacético;
TRIS es Tris(hidroximetil)aminometano; y
TSTU es tetrafluoroborato de 0-(A/-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio.
Parámetros farmacocinéticos (PK)
T1^ es vida media terminal;
MRT es tiempo de residencia medio;
F es biodisponibilidad (fracción absorbida);
Tmáx es tiempo de exposición máxima al plasma;
Cmáx es concentración plasmática máxima;
D es dosis;
Cmáx/D concentración plasmática máxima normalizada por la dosis;
AUC es área bajo la curva;
AUC/D es área bajo la curva normalizada por la dosis;
%extrap es porcentaje de perfil extrapolado.
Observaciones generales
Los siguientes ejemplos y procedimientos generales se refieren a compuestos intermediarios y productos finales identificados en la especificación y en los esquemas de síntesis. La preparación de los compuestos de la presente invención se describe en detalle mediante el uso de los siguientes ejemplos, pero las reacciones químicas descritas se describen en términos de su aplicabilidad general para la preparación de compuestos de la invención.
Ocasionalmente, la reacción puede no ser aplicable como se describió para cada compuesto incluido dentro del alcance descrito de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente los compuestos para los que esto ocurre. En estos casos, las reacciones se pueden realizar con éxito mediante modificaciones convencionales conocidas por los expertos en la técnica, es decir, mediante la protección adecuada de grupos interferentes, mediante el cambio hacia otros reactivos convencionales, o mediante modificación rutinaria de las condiciones de reacción.
Alternativamente, otras reacciones descritas en la presente descripción o de otro modo convencionales serán aplicables a la preparación de los compuestos correspondientes de la invención. En todos los métodos de preparación, se conocen todos los materiales de partida o estos pueden prepararse fácilmente a partir de materiales de partida conocidos. Todas las temperaturas se establecen en grados Celsius y, a menos que se indique de otra forma, todas las partes y porcentajes son por peso cuando se refieren a rendimientos y todas las partes son por volumen cuando se refieren a solventes y eluyentes.
Los compuestos de la invención pueden purificarse mediante el uso de uno o más de los siguientes procedimientos que son típicos dentro de la técnica. Estos procedimientos pueden, si es necesario, modificarse con respecto a gradientes, pH, sales, concentraciones, flujos, columnas, etcétera. En dependencia de factores tales como el perfil de impureza, la solubilidad de las insulinas en cuestión, etcétera, estas modificaciones pueden reconocerse fácilmente y hacerse por un experto en la técnica.
Después de la HPLC ácida o el desalado, los compuestos se aíslan mediante liofilización de las fracciones puras. Después de la HPLC neutra o la cromatografía de intercambio aniónico, los compuestos se desalan, se precipitan a pH isoeléctrico o se purifican mediante HPLC ácida.
Procedimientos típicos de purificación
Sistema RP-HPLC:
El sistema Gilson consta de lo siguiente: Manipulador de líquidos modelo 215, Bomba modelo 322-H2 y Detector UV modelo 155 (UV 215 nm y 280 nm).
Sistema de intercambio aniónico y desalado:
El sistema Ákta Explorer consta de lo siguiente: Bomba modelo P-900, Detector UV modelo UV-900 (UV 214, 254 y 280 nm), Detector de pH y conductividad modelo pH/C-900, Colector de Fracciones modelo Frac-950.
RP-HPLC ácida:
Columna: Phenomenex Gemini, 5 pM 5u C18110 A, 30x250 mm
Flujo: 20 ml/min
Tampón A: TFA 0,1 % en agua
Tampón B: TFA 0,1 % en acetonitrilo
RP-HPLC neutra:
Columna: Phenomenex Gemini, 5 pM 5u C18110 A, 30x250 mm
Flujo: 20 ml/min
Tampón A: 10 mM Tris, 15 mM (NH^SO4, pH = 7,3, 20 % de acetonitrilo en milliQ Tampón B: 20 % milliQ en acetonitrilo
Cromatografía de intercambio aniónico:
Columna: Poros50HQ o Source30Q
Flujo: dependiente de la columna
Tampón A: 15 mM Tris, 25 mM NH4OAc, 50 % EtOH, pH = 7,5.
Tampón B: 15 mM Tris, 500 mM NH4OAc, 50 % EtOH, pH = 7,5.
Desalado:
Columna: HiPrep 26/10
Flujo: 20 ml/min
Tampón A: TFA 0,1 % en agua
Tampón B: TFA 0,1 % en acetonitrilo
Los reactivos de acilación se sintetizaron en solución o en fase sólida de manera similar a como se describió en, por ejemplo, el documento WO 2009/115469.
Procedimiento general para la síntesis en fase sólida de reactivos de acilación de la Fórmula general III
[Acil]-[Enlazador]-Act
en donde los grupos Acil y Enlazador son como se definieron anteriormente, y Act es el grupo saliente de un éster activo, tal como N-hidroxisuccinimida (OSu), o 1-hidroxibenzotriazol, y en donde los ácidos carboxílicos dentro de los restos Acil y Enlazador del resto acilo están protegidos como ésteres de ferc-butilo.
Los compuestos de la Fórmula general III pueden sintetizarse sobre un soporte sólido mediante el uso de procedimientos en la técnica de síntesis de péptidos en fase sólida conocidos por los expertos.
Uno de estos procedimientos comprende la unión de un aminoácido protegido con Fmoc a una resina de poliestireno 2-clorotritil cloruro. La unión puede lograrse mediante el uso del aminoácido N-protegido libre en presencia de una amina terciaria, tal como trietilamina o N,N-diisopropiletilamina (ver referencias más abajo). El extremo C-terminal (que se une a la resina) de este aminoácido está en el extremo de la secuencia sintética que se acopla a las insulinas parentales de la invención.
Después de la unión del aminoácido Fmoc a la resina, el grupo Fmoc se desprotege mediante el uso, por ejemplo, de aminas secundarias, como piperidina o dietilamina, seguido por el acoplamiento de otro aminoácido (o el mismo) protegido por Fmoc y desprotección. La secuencia sintética se termina mediante el acoplamiento de diácidos grasos protegidos con mono-ferc-butilo (a, o), tales como ésteres mono-ferc-butilo del ácido hexadecanodioico, pentadecanodioico o tetradecanoico.
La escisión de los compuestos unidos a la resina se logra mediante el uso de ácido diluido como TFA/DCM al 0,5-5 % (ácido trifluoroacético en diclorometano), ácido acético (por ejemplo, 10 % en DCM, o HOAc/triflouro-etanol/DCM 1:1:8), o hecafluoroisopropanol en DCM (ver por ejemplo F.Z. Dorwald: Organic Synfhesis on Solid Phase; Wiley-VCH 2000, ISBN 3-527-29950-5; N. Sewald & H.-D. Jakubke: Pepfides: Chemisfry and Biology Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3; o The Combinaforial Cheemisfry Cafalog, 1999, Novabiochem AG, y las referencias allí citadas). Esto asegura que los ésteres de ferc-butilo presentes en los compuestos como grupos protectores de ácido carboxílico no estén desprotegidos.
Finalmente, el grupo carboxi C-terminal (liberado de la resina) se activa, por ejemplo, como éster de N-hidroxisuccinimida (OSu). Este éster activado se desprotege, por ejemplo, mediante el uso de TFA puro, y se usa ya sea directamente o después de la purificación (cristalización) como reactivo de acoplamiento en la unión a las insulinas parentales de la invención. Este procedimiento se ilustra a continuación.
Procedimiento general para la síntesis en fase sólida de reactivos de acilación:
Síntesis de tetradecanodioil-4xgGlu-OSu (Quím.4)
Figure imgf000031_0001
La resina de 2-clorotritilo de malla 100-200 a 1,5 mmol/g (15,79 g, 23,69 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (150 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de Fmoc-Glu-OtBu (6,72 g, 15,79 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (10,46 ml, 60,01 mmol) en diclorometano seco (120 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Después la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) en N,N-dimetilformamida (120 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) en N,N-dimetilformamida (120 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Después la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N,N,-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) en N,N-dimetilformamida (120 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Después la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de ácido tetradecanodioico monoterc-butil éster (7,45 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N,N,-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (7,43 ml, 42,64 mmol) en la mezcla de N,N-dimetilformamida (40 ml) y diclorometano (80 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (2 x 150 ml), N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), metanol (2 x 150 ml) y diclorometano (10 x 150 ml).
El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con trifluoroetanol (150 ml) durante la noche. La resina se filtró y se lavó con diclorometano (3 x 100 ml). El disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (elución en gradiente de diclorometano/metanol 100:0 a 95:5) lo que brindó el compuesto del título como un sólido blanco.
El producto se secó al vacío para producir ácido (S)-2-((S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-{(S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-(13-ferc-butoxicarbonil-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanodioico 1-ferc-butil éster.
Rendimiento: 14,77 g (89 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCla, 6H): 7,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 6,97 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 6,72 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 6,41 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 4,59-4,43 (m, 4 H); 2,49-2,13 (m, 16 H); 2,06-1,72 (m, 4 H); 1,70-1,52 (m, 4 H); 1,52-1,38 (m, 45 H); 1,35-1,21 (m, 16 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 7,39 min.
LC-MS m/z: 1055,0 (M+H)+.
El tetradecanodioil-4xgGlu-OH terc-butil protegido obtenido (ácido (S)-2-((S)-4-terc-butoxicarbonil-4-{(S)-4-tercbutoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(13-terc-butoxicarbonil-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanodioico 1 -terc-butil éster) fue disuelto en tetrahidrofurano. Se añadió DIPEA seguido de TSTU disuelto en acetonitrilo. La mezcla de reacción se agitó durante 3 h y luego se evaporó al vacío, se volvió a disolver en acetato de etilo, se lavó con HCl 0,1 M (ac), se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío. LC-MS (electropulverización): m/z = 1174,7 (M+Na+). Cálculo: 1175,4.
El compuesto protegido y activado con OSu se disolvió en 10 ml de TFA y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió éter dietílico y el precipitado formado se filtró y se secó al vacío durante la noche para obtener ácido (S)-2-((S)-4-carboxi-4-{(S)-4-carboxi-4-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxi-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanodioico 5-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) éster (tetradecanodioil-4xgGlu-OSu).
LC-MS (electropulverización): m/z = 872,2 (M+H+). Cálculo: 871,9.
Procedimiento general para la síntesis en fase sólida de reactivos de acilación: Síntesis de tetradecanodioil-gGlu-2xOEG-OSu (Quim.5)
Figure imgf000033_0001
ácido 13-{(S)-1-terc-butoxicarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-carboximetoxi-etoxi)-etilcarbamoil]-metoxi}-etoxi)-etilcarbamoil]-propilcarbamoil}-tridecanoico terc-butil éster
La resina de 2-clorotritilo de malla 100-200 a 1,7 mmol/g (79,8 g, 135,6 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (450 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 34,9 g, 90,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (59,9 mL, 343,6 mmol) en diclorometano seco (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 4 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (31,5 ml, 180,8 mmol) en mezcla de metanol/diclorometano (4:1, 150 ml, 2 x 5 min). Después la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 300 ml), diclorometano (2 x 300 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 300 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 300 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (350 ml, 2 x 300 ml).
Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 52,3 g, 135,6 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (42,5 mL, 244,1 mmol) en N,N-dimetilformamida (250 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 2 horas. Dado que la prueba de ninhidrina se mantuvo positiva, la resina se filtró y se trató con las mismas cantidades de reactivos durante otros 30 minutos. La resina se filtró y se lavó con N, N-dimetilformamida (2 x 300 ml), diclorometano (2 x 300 ml) y N, N-dimetilformamida (3 x 300 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 300 ml). La resina se lavó con N, N-dimetilformamida (3 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (350 ml, 2 x 300 ml).
Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1 -terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 57,7 g, 135,6 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N, N, N’, N'-tetrametiluronio (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) y N, N-diisopropiletilamina (42,5 mL, 244,1 mmol) en N, N-dimetilformamida (250 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N, N-dimetilformamida (2 x 300 ml), diclorometano (2 x 300 ml) y N, N-dimetilformamida (2 x 300 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 300 ml). La resina se lavó con N, N-dimetilformamida (3 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (350 ml, 2 x 300 ml).
Se añadió a la resina una solución de ácido tetradecanodioico mono-terc-butil éster (C14(OtBu)-OH, 42,7 g, 135,6 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N, N, N', N'-tetrametiluronio (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) y N, N-diisopropiletilamina (42,5 mL, 244,1 mmol) en la mezcla diclorometano/N, N-dimetilformamida (4:1, 300 mL) y la mezcla se agitó durante 1,5 horas. La resina se filtró y se lavó con N, N-dimetilformamida (6 x 300 ml), diclorometano (4 x 300 ml), metanol (4 x 300 ml) y diclorometano (7 x 600 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con 2,2,2-trifluoroetanol (600 ml) durante 18 horas. La resina se filtró y se lavó con diclorometano (4 x 300 ml), mezcla de diclorometano/2-propanol (1:1, 4 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (6 x 300 ml). Las soluciones se combinaron; el solvente se evaporó y el producto crudo se purificó por cromatografía en columna (Silicagel 60A, 0,060-0,200 mm; eluyente: diclorometano/metanol 1:0-9:1).
El ácido 13-{(S)-1-terc-butoxicarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-carboximetoxi-etoxi)-etilcarbamoil]-metoxi}-etoxi)-etilcarbamoil]-propilcarbamoil}-tridecanoico terc-butil éster puro se secó al vacío y se obtuvo un aceite naranja.
Rendimiento: 55,2 g (77 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,35.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCI3, 5H): 7,37 (bs, 1 H); 7,02 (bs, 1 H); 6,53 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 4,54-4,38 (m, 1 H); 4,17 (s, 2 H); 4,02 (s, 2 H); 3,82-3,40 (m, 16 H); 2,37-2,12 (m, 7 H); 2,02-1,82 (m, 1 H); 1,71-1,51 (m, 4 H); 1,47 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,25 (bs, 16 H).
Pureza por LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitrilo/agua 70:30 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,93 min.
LC-MS m/z: 791,0 (M+H) .
El ácido 13-{(S)-1-terc-butoxicarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-carboximetoxi-etoxi)-etilcarbamoil]-metoxi}-etoxi)-etilcarbamoil]-propilcarbamoil}- terc-butil éster (tetradecanodioil-gGlu-2xOEG-OH, 8,89 g, 11,3 mmol)) se disolvió en 100 ml de acetonitrilo, y se añadió a la solución agitada TSTU (4,07 g, 13,5 mmol) y DIPEA (2,35 mL, 13,5 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. El solvente se evaporó y el residuo se disolvió en diclorometano y se lavó dos veces con HCl 0,05 M.
La fase orgánica se secó (MgSO4) y se evaporó al vacío. Esto proporcionó 9,98 g (100 %) de ácido 13-((S)-1-tercbutoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-tridecanoico terc-butil éster como un aceite.
El ácido 13-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-tridecanoico terc-butil éster (4g) se disolvió en ácido trifluoroacético (10 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1 hora y se evaporó al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (10 ml) y evaporó al vacío. La adición de éter dietílico frío (10 ml) dio lugar a la precipitación de un sólido blanco graso. Esto se aisló por decantación y se secó al vacío. Esto proporcionó 3,4 g (cuant.) de ácido 14-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) oxi-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxobutil]amino]-14-oxotetradecanoico (tetradecanodioil-gGlu-2xOEG-OSu), que se almacenó a -18 °C.
LC-MS (electropulverización): m/z = 775,33; cálculo: 774,8.
Procedimiento general (A) para acilación de insulinas y purificación de análogos acilados
Un procedimiento general (A) para la acilación y purificación de los derivados de insulina de la invención se describe en detalle el Ejemplo 1, más abajo, y se aplicó a la síntesis de compuestos adicionales como se indica más abajo. La purificación mediante el uso de otros métodos (como se describió anteriormente) también se ha realizado para algunos de estos derivados.
Los análogos acilados de la invención se producen mediante acilación de análogos de insulina recombinantes mediante acilación en medio acuoso a un pH alto, tal como pH 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 o 13. El reactivo de acilación puede disolverse en agua o en un solvente polar no acuoso, como DMF o NMP, y añadirse a la solución de insulina con agitación vigorosa. Después de la adición del reactivo de acilación, se analiza la conversión por HPLC y, si es necesario, se añade más reactivo de acilación. La purificación se realiza como se describió anteriormente. Procedimiento general (B) para la síntesis en fase sólida y la purificación de análogos acilados
Un procedimiento general (B) para la síntesis en fase sólida y la purificación de los derivados de insulina de la invención se describe en detalle más abajo, y se aplicó a la síntesis de compuestos adicionales como se indica más abajo. La purificación mediante el uso de otros métodos (como se describió anteriormente) también se realizó para algunos de estos derivados.
Las cadenas A y B de la insulina se prepararon en un sintetizador de péptidos Prelude mediante el uso de un método general de acoplamiento de péptidos en fase sólida basado en Fmoc.
Resinas usadas:
Fmoc-Lys(Mtt)-Wang; y Fmoc-Arg-Pbf-Wang.
Los aminoácidos (enumerados más abajo) y la oxima se disolvieron en DMF a una concentración de 0,3 M:
Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Glu(OtBu)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; y Fmoc-Val-OH.
Aminoácidos especiales/no naturales: Boc-Phe-OH; Boc-Gly-OH; y Fmoc-Cys(Acm)-OH.
Procedimiento
Las condiciones de acoplamiento estándar usadas en las resinas fueron: 8 eq de aminoácidos, DIC, colidina y oxima (etil (hidroxiimino) cianoacetato) en NMP durante 1 hora, en el caso de Fmoc-Arg(Pbf)-OH, se usó un protocolo de doble acoplamiento (2x1 h).
Las condiciones de desprotección estándar usadas fueron: piperidina al 20 % en NMP (2x 5,5 ml durante 2x 7,5 min o 2x 10 min), seguido de lavado con NMP y DCM.
Para la acilación en Lys antes de la escisión de la resina, se usa el siguiente protocolo (en este caso, el aminoácido N-terminal está protegido con Boc).
Desprotección de la cadena A del grupo Mtt en A22K y acilación con reactivo de acilación activado protegido tBu ([Acil]-[Enlazador]-OSu, por ejemplo, tetradecanodioil-gGlu-2xOEG-OSu y tetradecanodioil-gGlu-2xOEG-OSu (ambos protegidos como tBu ésteres en los grupos carboxilo terminal y alfa)
Etapa 1: Se añadió a la resina HFIP (12 ml), y se agitó durante 20 min. Después de eliminar el solvente por filtración, la resina se lavó con DCM (4x15 ml) y se secó en corriente de nitrógeno
Etapa 2: A la resina anterior se le añadió DMF (8 ml) y DIPEA (1,5 ml). Luego se añadió una solución de reactivo de acilación activado (0,75 g en 2 ml de DMF) y la reacción se agitó durante 15 h, se drenó y se lavó con DCM (3x15 ml).
Desprotección del grupo Mtt y preparación secuencial de la cadena lateral
Se añadió HFIP (6 ml) a la resina y la reacción se incubó durante 20 min. Después de eliminar el solvente, la resina se lavó con DCM (6 ml). Se añadió HFIP (6 ml) a la resina y la reacción se incubó durante 20 min. La resina se lavó con DCM (2x 7,5 ml) y colidina (2x 7,5 ml), seguido de lavados adicionales con DCM (2x 7,5 ml).
La cadena lateral se construyó mediante acoplamientos secuenciales estándares mediante el uso de Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-OEG-OH y ácido 14-terc-butoxi-14-oxo-tetradecanoico o ácido 16-terc-butoxi-16-oxo-hexadecanoico.
Formación del disulfuro A6C-A11C
La resina se trató durante 15 min con una solución de yodo al 0,5 % en DCM/HFIP (30 ml de mezcla 1:1). Después de eliminar el solvente por filtración, la resina se lavó con DCM (3x20 ml) y se secó en corriente de nitrógeno.
Escisión de la cadena A de la resina y activación de A20-Cys como S-S-Piridilo
La resina se trató con una solución de TFA (30 ml), triisopropilsilano (1 ml), agua (0,75 ml) y ditiodipiridina (0,75 g) durante 3 h, y luego se recogió el filtrado y se añadió a 150 ml de éter (dividido en 6 tubos NUNC de plástico) para precipitar el péptido. Los tubos se centrifugaron a 3500 rpm durante 3 min, la capa de éter se decantó y esta etapa con éter se repitió 3 veces más. El material crudo se combinó y se dejó secar durante la noche a RT para obtener el péptido de cadena A deseado.
Escisión de la cadena B de la resina
La resina se trató con una solución de TFA (30 ml), triisopropilsilano (1 ml), agua (0,75 ml) y ditiotreitol (0,5 g) durante 3 h, y luego se recogió el filtrado y se añadió a éter (150 ml, dividido en 6 tubos NUNC de plástico) para precipitar el péptido. Los tubos se centrifugaron a 3500 rpm durante 3 min, la capa de éter se decantó y esta etapa con éter se repitió 3 veces más. Se dejó secar el material crudo durante la noche a RT para obtener el péptido de cadena B deseado.
Formación del disulfuro A20C-B19C
A una mezcla de cadena A (0,33 g) y cadena B (0,33 g) se le añadió DMSO (8 ml) y DIPEA (1 ml) y la mezcla se agitó durante 20 min, luego se añadió gota a gota con agitación a 140 ml de solución tampón neutra (agua, TRIS (10 mM), sulfato de amonio (15 mM), acetonitrilo al 20 %) hasta un volumen total de aproximadamente 150 ml.
Luego la mezcla se purificó por cromatografía de fase inversa mediante el uso de la siguiente configuración
• Columna Phenomenex Gemini 5 pM 5u C18110 A 30x250 mm, que funciona a 20 ml/min, de 10 % B a 60 %
B durante 40 min
• Eluyente A=TRIS 10 mM, sulfato de amonio 15 mM, pH=7,3, ACN al 20 % en agua milliQ
• Eluyente B=agua milliQ al 20 % en acetonitrilo
Las fracciones puras se combinaron, se congelaron instantáneamente y se liofilizaron.
Formación del disulfuro A7C-B7C
El intermediario liofilizado de la etapa anterior se volvió a disolver en 5 ml de DMSO. Se añadió ácido acético (20 ml) y agua (4 ml), seguido de yodo en AcOH (3 ml de 40 mM)
Después de un tiempo total de reacción de 20 min, la reacción se inactivó con ascorbato de sodio 1 M y luego se añadió a una solución agitada de agua (90 ml).
Luego la mezcla se purificó por cromatografía de fase inversa mediante el uso de la siguiente configuración
• Columna Phenomenex Gemini 5 pM 5u C18110 A 30x250mm, que funciona a 20 ml/min de 10 % B a 45 % B durante 40 min
• Eluyente A=TFA al 0,1 % en agua milliQ
• Eluyente B=TFA al 0,1 % en acetonitrilo
Las fracciones puras se combinaron, se congelaron instantáneamente y se liofilizaron para obtener el producto deseado.
Ejemplo 1
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 16)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3, GluB27, GluB28, ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]-acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000036_0001
Se disolvió insulina humana A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30 (0,5 g, 0,084 mmol) en 7 ml 100 mM de solución ac. de Na2CO3. El pH se ajustó a 11,3 con la adición de solución ac. 1 N de NaOH. El ácido 14-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) oxi-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxobutil]amino]-14-oxotetradecanoico (tetradecanodioil-gGlu-2xOEG-OSu) (0,26 g, 0,336 mmol) se disolvió en una mezcla de 1 ml de acetonitrilo y 1 ml de NMP y se añadió a la solución de insulina con agitación vigorosa. 1 N ac. NaOH se añadió durante la adición para mantener el pH en el intervalo de 10,5-11,4. Se añadió agua (7 ml) a la mezcla y se añadió HCl 1 N para acidificar la mezcla de reacción (a pH 1,5) y se añadió acetonitrilo (1 ml). La mezcla se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Phenomenex Axiai, 5 pM C18 110 A, 30 x 250 mm mediante el uso de un gradiente de 10 % B a 40 % B durante 50 min, 20 ml/min. Tampón A: 0,1 % TFA en agua, Tampón B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo). Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron para proporcionar 106 mg (19 %) de la insulina del título.
LC-MS (electropulverización): m/z = 1650,4 (M+4)/4. Cálculo: 1650,4.
Ejemplo 2
Procedimiento general (A)
Insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 2 y 16)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): {Alfa}([GluA14, GluB3, GluB27, GluB28, ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etox¡]acetil]Lys, (B)-péptido.
Figure imgf000037_0001
NN -OH
LC-MS (electropulverización): m/z = 1641,9 (M+4) /4. Cálculo: 1641,3.
Ejemplo 3
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 2 y 16) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3, GluB27, GluB28, ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys, (B)-péptido.
Figure imgf000037_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1674,7 (M+4) /4. Cálculo: 1674,2.
Ejemplo 4
Procedimiento general (A)
Insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 2 y 16)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14, GluB3, GluB27, GluB28, ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys, (B)-péptido.
Figure imgf000038_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1665,7 (M+4) /4. Cálculo: 1666,1.
Ejemplo 5
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 17)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3, ProB27, GluB28, ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]-acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys, (B)-péptido.
Figure imgf000038_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1642,0 (M+4)/4. Cálculo: 1642,4.
Ejemplo 6
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 18) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3, GluB27, ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys, (B)-péptido.
Figure imgf000039_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1666,4 (M+4) /4. Cálculo: 1666,7.
Ejemplo 7
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 20) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]a iTi ino]etoxi]etoxi]acetil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000039_0002
E E
LC-MS (electropulverización): m/z = 1639,6 (M+4)/4. Cálculo: 1639,9.
Ejemplo 8
Procedimiento general (B)
Insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B28D, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 2 y 22) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,GlnB3,AspB28,ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000040_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1655,2. (M+4)/4. Cálculo: 1655,4.
Ejemplo 9
Procedimiento general (B)
Insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B27E, B28E, B29R,desB30; (SEQ ID NO: 2 y 19)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,GlnB3,GluB27,GluB28, ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000040_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1665,7 (M+4)/4. Cálculo: 1665,9.
Ejemplo 10
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 20) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000041_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1664,1 (M+4)/4. Cálculo: 1664,3.
Ejemplo 11
Procedimiento general (A y B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 10)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000041_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1658,8 (M+4)/4. Cálculo: 1658,0.
Ejemplo 12
Procedimiento general (A y B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30; (sec. con núm. de ident: 3 y 11) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000042_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1650,8 (M+4)/4. Cálculo: 1651,1.
Ejemplo 13
Procedimiento general (B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 7)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ProB27,ArgB28]-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B1-28)-péptido.
Figure imgf000042_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1625,7 (M+4)/4. Cálculo: 1625,7.
Ejemplo 14
Procedimiento general (B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 14) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB27,ArgB28]-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]-butanoil]Lys,(B1-B28)-péptido.
Figure imgf000043_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1642,2 (M+4)/4. Cálculo: 1642,3.
Ejemplo 15
Procedimiento general (B)
Insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 1 y 11)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa} ([ArgA8, GluB3, GluB26, ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys, (B)-péptido.
Figure imgf000043_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1664,6 (M+4)/4. Cálculo: 1664,9.
Ejemplo 16
Procedimiento general (B)
Insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30; (SEQ ID NO: 1 y 7)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgA8,GluB3,GluB27,ArgB28]-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B1-28)-péptido.
Figure imgf000044_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1639,4 (M+4)/4. Cálculo: 1639,6.
Ejemplo 17
Procedimiento general (B)
Insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30; (SEQ ID NO: 1 y 14)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgA8,GluB3,GluB27,ArgB28]-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B1-B28)-péptido.
Figure imgf000044_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1655,7 (M+4)/4. Cálculo: 1656,1.
Ejemplo 18
Procedimiento general (B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 5)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa} ([GluB3,GluB26,GluB27, ArgB28]-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B1-B28)-péptido.
Figure imgf000045_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1633,8 (M+4)/4. Cálculo: 1633,8.
Ejemplo 19
Procedimiento general (B)
Insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30; (SEQ ID NO: 1 y 5)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgA8,GluB3,GluB26,GluB27,ArgB28]-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-'[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B1-B28)-péptido.
Figure imgf000045_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1647,5 (M+4)/4. Cálculo: 1647,6.
Ejemplo 20
Procedimiento general (A y B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28E, B29P, B30R; (SEQ ID NO: 3 y 21) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{AlfaH[GluB3,GluB28,ProB29,ArgB30]-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000046_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1691,9 (M+4)/4. Cálculo: 1691,8.
Ejemplo 21
Procedimiento general (B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29P, B30R; (SEQ ID NO: 3 y 9) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,GluB28,ProB29, ArgB30]-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000046_0002
OH
LC-MS (electropulverización): m/z = 1683,3 (M+4)/4. Cálculo: 1683,4.
Ejemplo 22
Procedimiento general (B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29P, B30R; (SEQ ID NO: 3 y 15) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB27,GluB28,ProB29,ArgB30]-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000047_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1698,7 (M+4)/4. Cálculo: 1698,9.
Ejemplo 23
Procedimiento general (B)
Insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 1 y 10) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgA8,GluB3,GluB26,GluB28, ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000047_0002
N N '
LC-MS (electropulverización): m/z = 1672,6 (M+4)/4. Cálculo: 1672,9.
Ejemplo 24
Procedimiento general (B)
Insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 1 y 16) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgA8,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000048_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1688 (M+4)/4. Cálculo: 1688,3.
Ejemplo 25
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 18) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB27,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxy-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000048_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1649,3 (M+4)/4. Cálculo: 1649,4.
Ejemplo 26
Procedimiento general (A)
Insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 2 y 16)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,GluB3,GluB27,GluB28, ArgB29],des-ThrB30-Insulina(huir ianaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilaiT iino)-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetyl]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000049_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1648,7 (M+4)/4. Cálculo: 1647,8
Ejemplo 27
Procedimiento general (A)
Insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 2 y 16)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000049_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1672,7 (M+4)/4. Cálculo: 1672,0
Ejemplo 28
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 16) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino"]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000050_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1681,3 (M+4)/4. Cálculo: 1680,5.
Ejemplo 29
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 17)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ProB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000050_0002
OH
LC-MS (electropulverización): m/z = 1649,3 (M+4)/4. Cálculo: 1649,4.
Ejemplo 30
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 17) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ProB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]aminoÍbutanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000051_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1673,5 (M+4)/4. Cálculo: 1673,7.
Ejemplo 31
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 16)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000051_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1657,2 (M+4)/4. Cálculo: 1656,3.
Ejemplo 32
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 18) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB27,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000052_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1673,4 (M+4)/4. Cálculo: 1673,7.
Ejemplo 33
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 20) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000052_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1647,2 (M+4)/4. Cálculo: 1647,4.
Ejemplo 34
Puede prepararse de acuerdo con el procedimiento general (A o B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28D, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 8) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino] butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000053_0001
Ejemplo 35
Puede prepararse de acuerdo con el procedimiento general (A o B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B29P, B30R; (SEQ ID NO: 3 y 6) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,GluB27,GluB28,ProB29,ArgB30]-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000053_0002
Ejemplo 36
Procedimiento general (B)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 4) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,GluB27,GluB28,ArgB29], des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000054_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1666,0 (M+4)/4. Cálculo: 1666,1
Ejemplo 37
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 4) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]a iTi inoÍbutanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000054_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1671,1 (M+4)/4. Cálculo: 1671,1
Ejemplo 38
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 17) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ProB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000055_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1666,4 (M+4)/4. Cálculo: 1666,7
Ejemplo 39
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 12) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000055_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1650,9 (M+4)/4. Cálculo: 1650,8
Ejemplo 40
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B28E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 13) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,GluB26,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000056_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1658,7 (M+4)/4. Cálculo: 1658,9
Ejemplo 41
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 11)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)-butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000056_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1658,1 (M+4)/4. Cálculo: 1658,1
Ejemplo 42
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 11)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[Í(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]a iTi ino]-etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000057_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1633,9 (M+4)/4. Cálculo: 1633,9
Ejemplo 43
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-4xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 11)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]-etoxi]acetilÍamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000057_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1706,5 (M+4)/4. Cálculo: 1706,4
Ejemplo 44
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-6xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 11)
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]-acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]-acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000058_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1779,98 (M+4)/4. Cálculo: 1779,0
Ejemplo 45
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 11) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000059_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1730,9 (M+4)/4. Cálculo: 1730,7
Ejemplo 46
Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30; (SEQ ID NO: 3 y 12) Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-Insulina-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000059_0002
Análogo de la Técnica Anterior 1
Insulina humana A22K(N(eps)hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30: documento WO 2009022013; Ejemplo 45
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humanaHA)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000060_0001
Análogo de la Técnica Anterior 2
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30: Análogo de ácido tetradecanodioico del Análogo 1 de la técnica anterior
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000060_0002
Este análogo es el análogo de ácido tetradecanodioico del análogo de ácido hexadecanodioico (Análogo 1 de la Técnica Anterior) descrito, por ejemplo, en el documento WO 2009 022013, Ejemplo 45. Las sustituciones de insulina (= mutaciones) son las mismas que se describen en el documento WO 2009022013, y la única diferencia es la longitud del diácido graso y, en consecuencia, la afinidad de unión a la albúmina sérica asociada con el aumento de la longitud del diácido.
Análogo de la Técnica Anterior 3
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B28D, B29R, desB30: Análogo de tetradecanodioil-4xgGlu de un análogo de insulina descrito en el documento WO 2007096431
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([AspB28,ArgB29],des-ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)-butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000061_0001
La sustitución B28D en este análogo de insulina (A22K, B28D, B29R, desB30) se ha descrito en la técnica anterior. Sin embargo, en esta molécula de referencia, la cadena lateral se deriva del ácido tetradecanodioico conectado a través del enlazador 4xgGlu (como muchos de los análogos de la presente invención).
Esto es directamente para evaluar el efecto beneficioso e inesperado de cambiar B3N (en insulina humana y en la técnica anterior) a B3E.
Análogo de la Técnica Anterior 4
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B26E, B28E, B29R, desB30: Análogo de tetradecanodioil-gGlu-2xOEG de un análogo de insulina descrito en el documento WO 2009022013
Figure imgf000061_0002
La sustitución B28E se ha mencionado en la técnica anterior (en A22K, B28E, B29R, desB30, documento WO 2009 02213). Además, se ha sugerido que B26 sea Q, E, S o desB26 (documento WO 200902213). No se ha sugerido la combinación de B28E y B26E, y en esta molécula de referencia, la cadena lateral se deriva del ácido tetradecanodioico (conectado a través del enlazador gGlu-2xOEG (como muchos de los análogos de la presente invención). Esto es directamente para evaluar el efecto beneficioso e inesperado de cambiar B3N (en insulina humana y en la técnica anterior) a B3E.
Análogo de la Técnica Anterior 5
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B28E, B29R, desB30: Análogo de tetradecanodioil-4xgGlu de un análogo de insulina similar con una cadena lateral basada en ácido octadecanodioico (octadecanodioil-gGlu-2xOEG) descrito como Ejemplo 18 en el documento WO 2009022013
Figure imgf000062_0001
Las sustituciones en este análogo de insulina (A22K, B28E, B29R, desB30) se han descrito en la técnica anterior. Sin embargo, en esta molécula de referencia, la cadena lateral se deriva del ácido tetradecanodioico (no del ácido octadecanodioico como en la técnica anterior) conectado a través del enlazador 4xgGlu (como muchos de los análogos de la presente invención).
Esto es directamente para evaluar el efecto beneficioso e inesperado de cambiar B3N (en insulina humana y en la técnica anterior) a B3E.
Análogo de la Técnica Anterior 6
Insulina humana A22K(N(eps)tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B28E, B29R, desB30: Análogo de tetradecanodioilgGlu-2xOEG de un análogo de insulina similar con una cadena lateral basada en ácido octadecanodioico (octadecanodioil-gGlu-2xOEG) descrito como Ejemplo 18 en el documento WO 2009022013
Figure imgf000062_0002
Las sustituciones en este análogo de insulina (A22K, B28E, B29R, desB30) se han descrito en la técnica anterior. Sin embargo, en esta molécula de referencia, la cadena lateral se deriva del ácido tetradecanodioico (no del ácido octadecanodioico como en la técnica anterior) conectado a través del enlazador gGlu-2xOEG (como muchos de los análogos de la presente invención).
Esto es directamente para evaluar el efecto beneficioso e inesperado de cambiar B3N (en insulina humana y en la técnica anterior) a B3E.
Ejemplo 47
Afinidad por el receptor de insulina de derivados de insulina seleccionados de la invención, medidos en receptores solubilizados
La afinidad de unión relativa de los análogos de insulina de la invención para el receptor de insulina humano (IR) se determina mediante la unión competitiva en un ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (de acuerdo con Glendorf T y otros (2008) Biochemistry 474743-4751).
En resumen, las series de dilución de un estándar de insulina humana y el análogo de la insulina a probar se realizan en Optiplates de 96 pocillos (Perkin-Elmer Life Sciences) seguido de la adición de insulina humana-[125I-A14Y], anticuerpo de ratón anti-IR 83-7, IR-A humano solubilizado (semipurificado por cromatografía de aglutinina de germen de trigo a partir de células de riñón de hámster bebé (BHK) que sobreexpresan el holorreceptor IR-A) y perlas de SPA (Perlas de SPA Anti-Ratón Poliviniltolueno, GE Healthcare) en tampón de unión que consiste de HEPES 100 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM, MgSO4 10 mM y Tween 20 al 0,025 % (v/v). Las placas se incuban con agitación suave durante 22-24 h a 22 °C, se centrifugan a 2000 rpm durante 2 minutos y se cuenta con un TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences).
Los datos del SPA se analizan de acuerdo con el modelo logístico de cuatro parámetros (V0lund A (1978) Biometrics 34 357-365), y las afinidades de unión de los análogos se calculan con relación al estándar de insulina humana medido dentro de la misma placa.
Se usa además un ensayo relacionado en donde el tampón de unión contiene HSA al 1,5 % (p/v) (Sigma A1887) para imitar más las condiciones fisiológicas.
Las afinidades por el receptor de insulina y otros datos in vitro de los análogos de insulina seleccionados de la invención se presentan en la Tabla 1, más abajo.
Ejemplo 48
Afinidades por el receptor de insulina y el factor de crecimiento-1 similar a la insulina de derivados de insulina seleccionados de la invención, medidas en receptores asociados a la membrana
El IR humano asociado a membrana y el IGF-1R se purifican a partir de células BHK transfectadas de manera estable con el vector pZem219B que contiene el inserto de IR-A, IR-B o IGF-IR humano. Las células BHK se cultivan y homogeneizan en tampón helado (HEPES 25 mM pH 7,4, CaCl2 25 mM y MgCl2 1 mM, bacitracina 250 mg/L, Pefablock 0,1 mM). Los homogeneizados se extienden en forma de capa sobre un colchón de sacarosa al 41 % (p/v) y se centrifugan durante 75 minutos a 95000 g a 4 °C. Las membranas plasmáticas se recogen, se diluyen 1:5 con tampón (como antes) y se centrifugan de nuevo durante 45 minutos a 40 000 g a 4 °C. Los sedimentos se resuspenden en un volumen mínimo de tampón y se aspiran a través de una aguja (tamaño 23) tres veces antes de almacenarlos a -80 °C hasta su uso.
La afinidad de unión relativa por cualquiera de los IR-A, IR-B o IGF-1R humanos asociados a membrana se determina mediante unión competitiva en una configuración de SPA. Los ensayos de IR se realizan por duplicado en OptiPlates de 96 pocillos (Perkin-Elmer Life Sciences). La proteína de membrana se incuba con agitación suave durante 150 minutos a 25 °C con insulina humana-[125I-A14Y] 50 pM en un volumen total de 200 pl de tampón de ensayo (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgSO45 mM, Triton X-100 al 0,01 %, HSA (Sigma A1887) al 0,1 % (p/v), inhibidores de proteasa completos sin EDTA), 50 pg de microesferas de PVT recubiertas con aglutinato de germen de trigo (WGA) (GE Healthcare) y concentraciones crecientes de ligando. Los ensayos se terminan por centrifugación de la placa a 2000 rpm durante 2 minutos y la radioactividad unida se cuantifica por recuento en un instrumento TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences).
Los ensayos de IGF-1R se realizan esencialmente del mismo modo que para los ensayos de unión a IR, excepto que se empleó IGF-1R asociado a membrana e IGF-1 humano-[125I-Tyr31] 50 pM. Los datos del SPA se analizan de acuerdo con el modelo logístico de cuatro parámetros (V0lund A (1978) Biometrics 34357-365), y las afinidades de unión de los análogos a evaluar se calculan con relación al estándar de insulina humana medido dentro de la misma placa.
Los datos de unión a IR (isoforma A), IR (isoforma B) e IGF-1R de los análogos de insulina seleccionados de la invención se muestran en la Tabla 1, más abajo.
Tabla 1
(continuación)
Figure imgf000064_0001
Ejemplo 49
Lipogénesis en adipocitos de rata
Como una medida de la potencia in vitro de las insulinas de la invención, puede usarse la lipogénesis.
Los adipocitos primarios de rata se aíslan de las almohadillas de grasa epididimales y se incuban con glucosa 3H en tampón que contiene, por ejemplo, HSA libre de grasa al 0.1 % con insulina estándar (insulina humana, HI) o insulina de la invención. La glucosa marcada se convierte en lípidos extraíbles de forma dependiente de la dosis, lo que da como resultado curvas de respuesta a las dosis completas. El resultado se expresa como la potencia relativa (%), con límites de confianza del 95 %, de la insulina de la invención en comparación con la estándar (HI).
Los datos se muestran en la Tabla 1 mostrada anteriormente.
Ejemplo 50
Autoasociación medida mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)
Se utilizaron los datos de SAXS para calcular el estado de autoasociación de los análogos de insulina que se probarán después de la inyección subcutánea. Los datos de SAXS se recogieron de formulaciones libres de Zn que contenían 0,6 mM de análogo de insulina a analizar y 140 mM de NaCl a pH 7,4. Para cada análogo, las cantidades relativas de monómero, dímero y especies más grandes se calcularon gracias al hecho de que un perfil de dispersión SAXS tiene una contribución de intensidad de todos los componentes individuales en una mezcla multicomponente. Mediante el uso de las intensidades (factores de forma) de cada componente, es posible estimar la contribución de la fracción volumétrica de cada componente en la mezcla. Se usa un sistema de ecuaciones lineales que usa el algoritmo de mínimos cuadrados no negativos o no restringidos para minimizar la discrepancia entre las curvas de dispersión experimental y calculada. Los factores de forma se calculan a partir de las estructuras cristalinas de un monómero, dímero, hexámero, etc. Las fracciones volumétricas se expresan en porcentajes (%). Los resultados obtenidos de los derivados de la invención y de los derivados de la técnica anterior se muestran en la Tabla 2, más abajo.
Tabla 2
Figure imgf000065_0001
Con estos estudios puede concluirse que los derivados de la invención, en condiciones que imitan las condiciones en el tejido subcutáneo después de la inyección, son mucho más propensos a disociarse en monómeros y por lo tanto se absorberán mucho más rápidamente después de la inyección subcutánea que los análogos de la técnica anterior. El contenido monomérico y dimérico combinado está en el intervalo de 96-100 % para los análogos de la invención con muy poco contenido de especies mayores que los dímeros (4 % a lo máximo).
La mayoría de los análogos de la técnica anterior están compuestos por especies mucho más grandes que los análogos de la invención, con sólo una excepción (Análogo 4 de la técnica anterior). Sin embargo, este análogo no es estable en la formulación libre de zinc como se muestra en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 51
Elaboración de preparaciones farmacéuticas
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse como una solución acuosa. La solución acuosa se hace isotónica, por ejemplo, con cloruro de sodio y/o glicerol. Además, el medio acuoso puede contener tampones y conservantes. El valor de pH de la preparación se ajusta al valor deseado y puede estar entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8,5, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5, o aproximadamente 6,5, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,5, en dependencia del punto isoeléctrico, pI, del análogo de insulina en cuestión.
Preparación de formulaciones de insulina libres de zinc
Los análogos de insulina libres de zinc se disolvieron en solución acuosa, que en la formulación final contenía al análogo de insulina 0,6 mM, 16 mM de m-cresol, 16 mM de fenol y cantidades apropiadas de nicotinamida y glicerol, y el pH se ajustó a 7,3-7,5 (medido a temperatura ambiente) mediante el uso de ácido clorhídrico 1 N/NaOH 1 N. Se añadió agua al volumen final y la solución se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,2 pm. La formulación se llenó en viales de 2 ml y se selló con tapones de cierre.
Tabla 3
Figure imgf000066_0001
Ejemplo 52
Ensayo de fibrilación con ThT para la evaluación de la estabilidad física de las formulaciones de proteínas
La estabilidad física baja de un péptido puede conducir a la formación de fibrillas amiloides, que se observan como estructuras macromoleculares similares a hilos en la muestra, bien ordenadas, que eventualmente dan como resultado la formación de gel. La tioflavina T (ThT) tiene una señal de fluorescencia distinta cuando se une a las fibrillas [Naiki y otros (1989) Anal. Biochem. 177244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309274-284].
La formación de un intermediario parcialmente plegado del péptido se sugiere como un mecanismo de iniciación general para la formación de fibrillas. Algunos de esos intermediarios se nuclean para formar una plantilla sobre la cual los intermediarios posteriores pueden ensamblarse y se produce la fibrilación. El tiempo de retraso es el intervalo en el cual se construye la masa crítica de núcleos y la constante de velocidad aparente es la velocidad con la que se forma la propia fibrilla (Figura 1).
Preparación de la muestra
Las muestras se prepararon poco antes de cada ensayo. Las muestras de cada composición se mezclaron con una solución acuosa de ThT (0,1 mM ThT) en una relación volumétrica de 990:10 y se transfirieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos (Packard Opti-PlateTM-96, poliestireno blanco). Usualmente, se colocaron cuatro u ocho réplicas de cada muestra (que corresponden a una condición de prueba) en una columna de pocillos. La placa se selló con Scotch 15 Pad (Qiagen).
Incubación y medición de la fluorescencia
La incubación a una temperatura dada, la agitación y la medición de la emisión de fluorescencia de ThT se realizaron en un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan Ascent FL o un lector de placas Varioskan (Thermo Labsystems). La temperatura se ajustó a 37 °C. La agitación orbital se ajustó a 960 rpm con una amplitud de 1 mm en todos los datos presentados. La medición de la fluorescencia se realizó mediante el uso de excitación a través de un filtro de 444 nm y la medición de la emisión a través de un filtro de 485 nm. Cada serie se inició mediante la incubación de la placa a la temperatura del ensayo durante 10 minutos. La placa se midió cada 20 minutos durante un máximo de 45 horas. Entre cada medición, la placa se agitó y se calentó como se describió.
Manejo de los datos
Los gráficos de fluorescencia frente a tiempo se realizaron en Microsoft Excel y el tiempo de retraso se estimó como la intersección entre la aproximación lineal de la Zona de Retraso y la Zona de Fibrilación como se ilustra en las Figuras 1A, 1B y 1C. Un aumento del tiempo de retraso corresponde a una mayor estabilidad física. Los puntos de datos fueron típicamente un promedio de cuatro u ocho muestras.
Los resultados obtenidos para los análogos acilados de A22K de la invención, y de análogos acilados de A22K similares de la técnica anterior, se muestran en la Tabla 4, más abajo.
Tabla 4
Figure imgf000067_0001
Se concluye que los análogos de insulina acilados A22K de la invención muestran una estabilidad mejor o similar con respecto a la fibrilación (es decir, tienen una estabilidad física aumentada) en la formulación libre de zinc tanto con nicotinamida como sin nicotinamida añadida que análogos similares de la técnica anterior. Esto es muy sorprendente ya que los datos de SAXS indican que los análogos de insulina de la invención son de menor tamaño (es decir, compuestos de monómeros y dímeros) que el experto en la materia esperaría que condujera a una menor estabilidad física.
Ejemplo 53
Análisis de estabilidad química de la insulina
Cromatografía de Exclusión por Tamaño
Formulaciones utilizadas: Véase el ejemplo 52
La determinación cuantitativa de proteínas de alto peso molecular (HMWP) y análogos de insulina monómeros se realizó en la columna Waters Acquity BEH200 SEC (150 x 2,4 mm, núm. de pieza 186005225) con un eluyente que contenía acetonitrilo al 55 % (v/v), TFA al 0,05 %, una velocidad de flujo de 0,2 ml/min y una temperatura de columna de 40 °C. La detección se realizó con un detector de absorbancia ajustable (Waters Acquity TUV) a 215 nm. El volumen de inyección fue de 1,5 pl tanto para las formulaciones de análogos de insulina de 600 pM como para el estándar de insulina humana de 600 pM. Cada preparación análoga se incubó a 5, 25 y 37 °C en viales de 2 ml. En momentos definidos, se midieron HMWP y el contenido de las preparaciones.
Los resultados se muestran en la Tabla 5, más abajo.
Tabla 5
Figure imgf000068_0001
Se concluye que la formación de proteínas de alto peso molecular (HMWP) por almacenamiento en formulación libre de zinc a 37 °C es muy, muy baja y menor o similar a los derivados de insulina de la técnica anterior.
Cromatografía de fase inversa (UPLC)
La determinación de las impurezas relacionadas con la insulina se realizó en un sistema UPLC mediante el uso de una columna CSH Fenil-Hexilo (2,1 x 150 mm, 1,7 pm) (Núm. de pieza de Waters 186005408), con velocidad de flujo de 0,3 ml/min a 30 °C y detección UV a 215 nm. La elución se realizó con una fase móvil que consistía en lo siguiente: A: 10 % (v/v) de acetonitrilo, 100 mM de fosfato de hidrógeno di-amonio, pH 3,6, y B: 80 % (v/v) de acetonitrilo. Gradiente: cambio lineal de 0-3 min de 26 % B a 28,5 % B, cambio lineal de 3-34 min a 37 % B, cambio lineal de 34-36 minutos a 80 % B para lavado de columna, antes de volver a las condiciones iniciales a 39 min 26 % B. La cantidad de impurezas se determinó como área de absorbancia medida en por ciento del área de absorbancia total determinada después de la elución de los conservantes. Cada preparación análoga se incubó a 5, 25 y 37 °C en viales de 2 ml. En momentos definidos se midieron las impurezas relacionadas con la insulina de las preparaciones.
Los resultados se muestran en la Tabla 6, más abajo.
Tabla 6
Figure imgf000069_0001
Se concluye que los derivados de insulina de la invención son mucho más estables en la formulación libre de zinc que los análogos acilados A22K similares de la técnica anterior. Los análogos de la técnica anterior son tan inestables que se observa una pérdida de pureza (absoluta) del 7-12 % después de 2 semanas de almacenamiento y una pérdida de pureza de alrededor del 20 % después de 5 semanas de almacenamiento en formulación libre de zinc. Los análogos de la técnica anterior no son lo suficientemente estables para formularse sin zinc. Los análogos de la invención muestran una pérdida de pureza significativamente menor y, por lo tanto, son mucho más estables y adecuados para la formulación libre de zinc.
Ejemplo 54
Perfiles PK/PD subcutáneos en cerdos LYD
Los derivados de insulina de la invención pueden probarse mediante administración subcutánea a cerdos, por ejemplo, al compararlos con insulina aspart (NovoRapid) en la formulación comercial o al compararlos con análogos de insulina acilada A22K similares de la técnica anterior de acuerdo con este protocolo. Los derivados pueden probarse para los parámetros farmacocinéticos y/o farmacodinámicos.
Métodos generales usados
Ecografía y marcado de la zona de inyección
Durante la anestesia para la colocación de catéteres intravenosos permanentes, los cerdos se examinan por ultrasonido con un escáner de ultrasonido Esaote modelo "MyLabFive" y una sonda lineal tipo "LA4356-18 MHz". El cuello medio entre la oreja y la escápula, en el lado derecho o izquierdo (opuesto al catéter), una zona de 2 x 2 cm sin músculo subyacente (apta para inyección subcutánea) se identifica y se marca con un tatuaje.
Horario de alimentación
Los cerdos se mantienen en ayunas (sin desayuno) antes del experimento.
Los cerdos están en sus corrales habituales durante todo el experimento y no están anestesiados. Los cerdos se mantienen en ayunas hasta que se haya recogido la muestra de sangre de 12 horas, pero con libre acceso al agua. Después de la muestra de sangre de 12 horas, los cerdos se alimentan con comida y manzanas.
Dosificación
El Penfill se monta en un NovoPen®4. Se utiliza una aguja nueva para cada cerdo. Se utiliza un tapón de aguja para asegurar la penetración s.c. máxima a 5 mm por debajo de la epidermis. El volumen de dosis (volumen de UI) se calcula y se anota para cada cerdo.
Volumen de dosis (U) = ((Peso x dosis nmol/kg) / concentración nmol/ml) x 100 U/ml El cerdo se dosifica lateralmente en el subcutis en el lado derecho o izquierdo (opuesto al catéter) del cuello y la aguja se mantiene en el subcutis durante un mínimo de 10 segundos después de la inyección para garantizar la deposición del compuesto.
Tratamiento de la hipoglucemia
Después de la dosificación subcutánea, la solución de glucosa debe estar lista para la inyección i.v. para prevenir la hipoglucemia, es decir, 4-5 jeringas (20 ml) llenas de glucosa estéril al 20 %, listas para su uso. El diagnóstico de hipoglucemia se basa en los síntomas clínicos y las mediciones de glucosa en sangre en un glucómetro (Glucocard X-meter).
El tratamiento consiste en una inyección i.v. lenta de 50-100 ml de glucosa al 20 % (10-20 g de glucosa). La glucosa se administra en fracciones durante 5-10 minutos hasta que surta efecto.
Obtención de muestras de sangre
La permeabilidad de los catéteres yugulares se comprueba antes del experimento con NaCl al 0,9 % estéril sin adición de heparina a 10 UI/ml.
Antes y después de la dosificación, se tomarán muestras de sangre en el establo de un catéter venoso central en los siguientes puntos de tiempo:
Predosis (-10, 0), 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600 y 720 minutos Las muestras se toman con una llave de paso de 3 vías. Se extraen y desechan 4-5 ml de sangre residual antes de tomar la muestra.
Se recogen muestras de sangre de 0,8 ml en tubos recubiertos con EDTA para los análisis de glucosa e insulina. Después de cada muestra de sangre, el catéter se enjuaga con 5 ml de NaCl estéril al 0,9 % sin la adición de heparina a 10 UI/ml.
El tubo se inclina suavemente un mínimo de 10 veces para garantizar una mezcla suficiente de la sangre y el anticoagulante (EDTA) y después de un minuto se coloca en hielo húmedo. Los tubos se centrifugan durante 10 min a 3000 rpm y 4 °C dentro de 1 hora después del muestreo. Las muestras se almacenan en hielo húmedo hasta el pipeteo.
Se exige una técnica aséptica para evitar el crecimiento bacteriano en el catéter con aumento del riesgo de coagulación.
Cierre de los catéteres después del experimento
Si no se ha realizado la extracción de muestras de sangre con una técnica aséptica, se puede administrar lentamente un único tratamiento intravenoso con 1 ml por cada 10 kg de Pentrexyl® (1 g de ampicilina disuelta en 10 ml de NaCl al 0,9 %) a través del catéter que se ha usado para la extracción de muestras de sangre. Después de este tratamiento, el catéter se enjuaga con 10 ml de NaCl al 0,9 %.
Los catéteres se lavan con 5 ml de NaCl estéril al 0,9 % con heparina (10 lU/ml). Los catéteres se cierran con un nuevo conector luer-lock con membrana de inyección de látex y se inyectan 1,0 ml de TauroLockHep500 a través de la membrana como bloqueo del catéter.
Análisis de muestras de sangre
Glucosa en plasma: se pipetean 10 ul de plasma en 500 ul de solución tampón para medir la concentración de glucosa en plasma en el autoanalizador BIOSEN.
Insulina plasmática: 1 x 50 pl de plasma se pipetean en tubos Micronic® de 0,65 ml (configuración ELISA/LOCI/SPA) para su análisis, mediante el uso de ELISA o LC-MS.
El plasma se almacena congelado a -20 °C.
Ejemplo 55
Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 12 en cerdos LYD
Mediante el procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 12, insulina humana A22K(W(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30.
Formulaciones utilizadas
El ejemplo compuesto 12, 608,6 pM; 1,6% (p/v) de glicerol; fenol 16 mM; m-cresol 16 mM; fosfato 7 mM, cloruro de sodio 10 mM; pH=7,4 (0 Zn/hexámero), 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 5A y 5B adjuntas y en la Tabla ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia., más abajo.
Las Figuras 5A y 5B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del derivado de insulina del Ejemplo 12, es decir, insulina humana A22K(A/(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30, formulada con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg).
Tabla 1
Figure imgf000071_0001
Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 12, en una formulación sin zinc, se asocia con un perfil atractivo con un Tmáx temprano (45 minutos), y un MRT corto (91 minutos) así como también un T1^ corto (46 minutos). Esto hace que esta insulina sea muy útil para uso prandial.
Ejemplo 56
Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 1 en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, los siguientes perfiles de PK y PD se obtuvieron para el derivado de insulina del Ejemplo 1, insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30.
Formulaciones utilizadas
El compuesto del Ejemplo 1, 611,6 pM; 2 % (p/v) de glicerol; 16 mM de fenol; 16 mM de m-cresol; 7 mM de fosfato; pH=7,4 (0 Zn/hexámero), 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 6A y 6B adjuntas y en la Tabla ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia., más abajo.
Las Figuras 6A y 6B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina del Ejemplo 1, es decir, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30, formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg).
Tabla 2
Figure imgf000072_0001
Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 1, en una formulación sin zinc, se asocia a un perfil atractivo con un Tmáx temprano (30 minutos), y un MRT corto (113 minutos) así como también un T1^ corto (103 minutos). Esto hace que esta insulina sea muy útil para uso prandial.
Ejemplo 57
Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 7 en cerdos LYD
Mediante el procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 7, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30. Formulaciones utilizadas
El compuesto del Ejemplo 7, 610 pM; 2 % (p/v) de glicerol; 16 mM de fenol; 16 mM de m-cresol; 7 mM de fosfato, pH=7,4 (0 Zn/hexámero), 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 7A y 7B adjuntas y en la Tabla ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia., más abajo.
Las Figuras 7A y 7B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina del Ejemplo 7, es decir, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30, formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg).
Tabla 3
Figure imgf000072_0002
Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 7, en una formulación sin zinc, se asocia con un perfil atractivo con un Tmáx temprano (30 minutos), y un MRT corto (133 minutos) así como también un T ^ corto (86 minutos). Esto hace que esta insulina sea muy útil para uso prandial.
Ejemplo 58
Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 10 en cerdos LYD
Mediante el procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 10, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30.
Formulaciones utilizadas
El compuesto del Ejemplo 10, 610 pM; 2 % (p/v) de glicerol; 16 mM de fenol; 16 mM de m-cresol; 7 mM de fosfato, pH=7,4 (0 Zn/hexámero), 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 8A y 8B adjuntas y en la Tabla ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia., más abajo.
Las Figuras 8A y 8B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina del Ejemplo 10, es decir, insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30, formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg).
Tabla 4
Figure imgf000073_0002
Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 10, en una formulación sin zinc, se asocia con un perfil atractivo con un Tmáx temprano (25 minutos), y un MRT corto (118 minutos) así como también un T1^ corto (97 minutos). Esto hace que esta insulina sea muy útil para uso prandial.
Ejemplo 59
Perfil PK/PD subcutáneo de un derivado de insulina de la técnica anterior en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, los siguientes perfiles de PK y PD se obtuvieron para el derivado de insulina de la técnica anterior (Análogo 1 de la Técnica Anterior), insulina humana A22K(W(eps)hexadecanodioilgGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45.
Formulaciones utilizadas
El compuesto del Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, 588 pM; 1,6 % (p/v) de glicerol; 30 mM de fenol; 7 mM de tris, pH=7,4 (0 Zn/hexámero), 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 3A y 3B adjuntas y en la Tabla 11, más abajo. Las Figuras 3A y 3B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina de la técnica anterior, es decir, insulina humana A22K(W(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg).
Tabla 11
Figure imgf000073_0001
Se concluye que el derivado de insulina de la técnica anterior, documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, en una formulación sin zinc se asocia con una cola prolongada, que posiblemente se origina a partir de una absorción retardada de una parte del depósito subcutáneo. La concentración plasmática de esta insulina en el punto temporal de 24 horas (1440 minutos) es de 98 pM. Además, el efecto de reducción de la glucosa en sangre se prolonga para durar al menos 8 horas (480 minutos). El tiempo medio de residencia fue de 1287 minutos, casi 1 día. Esto hace que esta insulina de la técnica anterior sea inadecuada para el uso prandial.
Ejemplo 60
Perfil PK/PD subcutáneo de un análogo cercano de un derivado insulina de la técnica anterior en cerdos LYD Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el análogo diácido C14 (Análogo de la Técnica Anterior 2), insulina humana A22K(W(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30, representativa de la técnica anterior como se describió en el documento WO 2009/022013 (ver en particular el Ejemplo 45 (insulina humana A22K(W(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30).
Formulaciones utilizadas
Insulina humana A22K(W(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (el análogo de 1,14-tetradecanodioil (diácido C14) del análogo de 1,16-hexadecanodioil (diácido C l6) del documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), 588 |jM; 1,6 % (p/v) de glicerol, 30 mM de fenol, 7 mM de tris, pH = 7,4 (0 Zn/hexámero)
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Fig. 4A y 4B adjuntas y en la Tabla 12, más abajo. Las Figuras 4A y 4B muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del Análogo 2 de la Técnica Anterior, un análogo diácido C14 de un derivado de insulina representativo de la técnica anterior, es decir, insulina humana A22K(W(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, Análogo 1 de la Técnica Anterior), formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (72 nmol/animal), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (72 nmol/animal).
Tabla 12
Figure imgf000074_0001
Se concluye que el derivado de insulina versión diácido C14 de la técnica anterior, documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, en una formulación sin zinc se asocia con un retraso prolongado, que posiblemente se origina a partir de una absorción retardada de una parte del depósito subcutáneo. La concentración plasmática de esta insulina en el punto temporal de 10 horas (600 minutos) es de 24 pM. El tiempo de retención medio (MRT) de este análogo diácido C14 de la técnica anterior fue de 271 minutos.
Los resultados correspondientes obtenidos con los análogos diácido C14 de los Ejemplos 1 y 2 de la presente invención fueron 165 y 111 minutos, respectivamente. Además, el efecto de reducción de la glucosa en sangre se prolonga para durar al menos 11 horas (660 minutos).
Esto hace que esta insulina de la técnica anterior sea inadecuada para el uso prandial.
Ejemplo 61
Perfiles PK/PD subcutáneos de los análogos de insulina de la invención y de la técnica anterior en ratas Sprague Dawley
Los derivados de insulina de la invención pueden probarse mediante administración subcutánea a ratas, por ejemplo, al compararlos con insulina aspart (NovoRapid) en la formulación comercial o al compararlos con análogos de insulina acilada B29K similares de la técnica anterior de acuerdo con este protocolo. Los derivados pueden probarse para los parámetros farmacocinéticos y/o farmacodinámicos.
Los derivados de insulina de la técnica anterior solo son estables en formulación en presencia de iones de zinc, mientras que los derivados de insulina de la presente invención son estables en formulación sin zinc añadido. Para comparar los perfiles de los derivados de insulina de la invención con los perfiles de los análogos de la técnica anterior, los análogos de la invención se prueban en este protocolo mediante el uso de formulaciones libres de zinc, y los análogos de la técnica anterior se prueban mediante el uso de 3 iones de zinc por hexámero. Esto es para obtener los perfiles farmacocinéticos más rápidos que se puedan obtener en formulaciones clínicamente útiles (es decir, química y físicamente estables).
Protocolo in vivo
Para estos experimentos se usan ratas Sprague-Dawley machos, de ~ 400 gramos. Las ratas no están en ayunas antes de la prueba. Durante el período de estudio de tres horas, las ratas tienen libre acceso al agua pero no a los alimentos. Se extraen muestras de sangre (vena sublingual; 200 ul en tubos microvette®200 EDTA) y el plasma se recoge de los animales no anestesiados en los puntos de tiempo 0 (antes de la dosificación) y 3, 7, 15, 30, 60, 120 y 180 minutos después de la dosificación del derivado de insulina. Las ratas se dosifican por vía subcutánea (25 nmol/kg; 600 uM de formulación del derivado de insulina) en el cuello mediante el uso de un NovoPen Echo® con una aguja de 12 mm Softfine®. Las concentraciones plasmáticas de glucosa y derivados de insulina se cuantifican mediante el uso de un analizador BIOSEN y análisis de inmunoensayos/LCMS, respectivamente.
Los resultados de las pruebas de los análogos de la invención y de la técnica anterior se dan en las Tablas. ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. y ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. y en las siguientes figuras:
Las Figuras 2A y 2B muestran perfiles PK de análogos basados en C14 de la invención (Ejemplos 11 y 12, y Ejemplos 4 y 10, respectivamente), y de análogos basados en C14 de la técnica anterior (Análogos 2 y 3 de la técnica anterior y Análogos 2 y 3 de la técnica anterior), respectivamente, después de la inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley;
La Figura 2C muestra perfiles PK de análogos basados en C16 de la invención (Ejemplo 33), y de análogos basados en C16 de la técnica anterior (Análogo 1 de la técnica anterior), después de la inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley;
Las Figuras 2D1 y 2D2 muestran perfiles de PD (resultantes de los perfiles PK mostrados en la Figura 2A) de análogos basados en diácido C14 de la invención y análogos basados en diácido C14 de la técnica anterior después de inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley; y
Las Figuras 2E1 y 2E2 muestran perfiles Pd (resultantes de los perfiles PK mostrados en la Figura 2B) de análogos basados en diácido C14 de la invención y análogos basados en diácido C14 de la técnica anterior después de inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley; y
Las Figuras 2F1 y 2F2 muestran perfiles de PD (resultantes de los perfiles PK mostrados en la Figura 2C) de análogos basados en diácido C16 de la invención y análogos basados en diácido C16 de la técnica anterior después de inyección subcutánea a ratas Sprague Dawley.
Tabla 5
Figure imgf000075_0001
Se concluye que los análogos acilados de diácido C14 de la invención (en formulaciones sin zinc) se absorben más rápidamente que los análogos de la técnica anterior (en formulaciones con 3 iones de zinc por hexámero) como se observa para los datos de Tmáx. Los Tmáx de los análogos de la técnica anterior son de aproximadamente 30 minutos mientras que las insulinas de la invención tienen un Tmáx de alrededor de 15 minutos. La relación AUC15/AUC60 es una medida de la fracción absorbida durante los primeros 15 minutos en relación con la fracción absorbida después de 1 hora. Por lo tanto, cuanto mayor sea la relación, más insulina se absorberá durante los primeros 15 minutos. Se observa que las insulinas de la invención están asociadas con una relación más alta que los análogos similares de la técnica anterior y, por lo tanto, se absorben más rápidamente.
En consecuencia, los análogos de la invención son más adecuados para la administración prandial que las insulinas de la técnica anterior.
Tabla 6
Figure imgf000076_0001
Se concluye que los análogos acilados diácido C16 de la invención (en formulaciones sin zinc) se absorben más rápidamente que los análogos de la técnica anterior (en formulaciones con 3 iones de zinc por hexámero) como se observa para los datos de Tmáx. El Tmáx del análogo de la técnica anterior es de aproximadamente 60 minutos mientras que las insulinas de la invención tienen un Tmáx de alrededor de 30 minutos. La relación AUC15/AUC60 es una medida de la fracción absorbida durante los primeros 15 minutos en relación con la fracción absorbida después de 1 hora. Por lo tanto, cuanto mayor sea la relación, más insulina se absorberá durante los primeros 15 minutos. Se observa que las insulinas de la invención están asociadas con una relación más alta que los análogos similares de la técnica anterior y, por lo tanto, se absorben más rápidamente.
En consecuencia, los análogos de diácido C16 de la invención son más adecuados para la administración prandial que las insulinas diácido C16 de la técnica anterior.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22Lys, B3aar1] con relación a la insulina humana;
en donde
aar1 representa Glu (E), Gln (Q) o Asp (D); y
uno, dos o tres de los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones B26, B27 y/o B28 se sustituyen de la siguiente manera:
el residuo de aminoácido ubicado en la posición B26 se sustituye por Glu (E) o Asp (D); y/o el residuo de aminoácido ubicado en la posición B27 se sustituye por Glu (E) Asp (D) o Pro (P); y/o el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); sin embargo, siempre que;
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B27 se sustituye por Pro (P); entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E), Asp (D) o Arg (R); y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 no se sustituye, entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Arg (R), o
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Glu (E) o Asp (D), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por B29Pro (P) o B29Arg (R), y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 es Pro (P), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B30 se sustituye por B30Arg (R); y
si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B28 se sustituye por Arg (R), entonces los residuos de aminoácido ubicados en las posiciones B29 y B30 se han eliminado (es decir, desB29, desB30); y si el residuo de aminoácido ubicado en la posición B29 se sustituye por Arg (R), entonces el residuo de aminoácido ubicado en la posición B30 se ha eliminado (es decir, desB30); y
cuyo análogo puede comprender adicionalmente una sustitución A8Arg (R) y/o A14Glu (E); y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG; en donde
gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico;
OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH)2-O-CH2-CO-);
cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y en donde el grupo Acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14-tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico.
2. El análogo de insulina acilado de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B29Arg;
desB30] con relación a la insulina humana; en donde
aar1 representa Glu (E), Gln (Q) o Asp (D); y
uno, dos o tres de los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones B26, B27 y/o B28 están sustituidos con Glu (E) o Asp (D).
3. El análogo de insulina acilado de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo es [A22Lys; B3aar1; B26aar2;
B29Arg; desB30] con relación a la insulina humana; en donde
aar1 representa Glu (E), Gln (Q) o Asp (D); y
aar2 representa Glu (E) o Asp (D).
4. El análogo de insulina acilado de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo es
[A8R, A22K, B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B26E, B28E, B29R, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B26E, B29R, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A8R, A22K, B3E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A14E, A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A14E, A22K, B3Q, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A14E, A22K, B3Q, B28D, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B27E, B29P, B30R];
[A22K, B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B28E, B29P, B30R];
[A22K, B3E, B26E, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B28D, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B26E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B27E, B28E, B29P, B30R];
[A22K, B3E, B27E, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B27E, B28R, desB29, desB30];
[A22K, B3E, B27E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B27P, B28E, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B28D, B29R, desB30];
[A22K, B3E, B28E, B29P, B30R];
[A22K, B3Q, B26E, B28E, B29R, desB30]; o
[A22K, B3Q, B26E, B29R, desB30];
con relación a la insulina humana.
5. El análogo de insulina acilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde, en el grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de gGlu y/o OEG; cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un resto gGlu.
6. El análogo de insulina acilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde, en el grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-el grupo Acilo es un residuo de un ácido a,w-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14-tetradecanodioico; ácido 1,15-pentadecanodioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico.
7. El análogo de insulina acilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el grupo de Fórmula II es
tetradecanodioil-4xgGlu;
tetradecanodioil-gGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-4xgGlu;
hexadecanodioil-4xgGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-gGlu-2xOEG;
hexadecanodioil-gGlu-4xOEG; o
hexadecanodioil-gGlu-6xOEG.
8. El análogo de insulina acilado de acuerdo con la reivindicación 1, que es
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30;
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27P, B28R, desB29, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28R, desB29, desB30; insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B28E, B29P, B30R;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29P, B30R;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29P, B30R;
insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A8R, A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B27E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B29P, B30R;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B27E, B28E, B29R, desB30; insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B28D, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3E, B27P, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)tetradecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B28E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-4xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-gGlu-6xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30;
insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, B26E, B29R, desB30; o insulina humana A22K(N(eps)hexadecanodioil-4xgGlu), B3Q, B26E, B29R, desB30.
9. Una composición farmacéutica que comprende un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, formulada como una composición baja en zinc, que comprende menos de 0,2 iones de Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina.
12. La composición farmacéutica baja en zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en donde no se ha añadido surfactante.
13. La composición farmacéutica baja en zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende un compuesto nicotínico y en particular nicotinamida.
14. El análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como un medicamento.
15. El análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección del cuerpo de un animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la diabetes, en particular la diabetes tipo 1 o la diabetes tipo 2.
ES16757633T 2015-08-25 2016-08-24 Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos Active ES2908373T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15182282 2015-08-25
PCT/EP2016/069972 WO2017032798A1 (en) 2015-08-25 2016-08-24 Novel insulin derivatives and the medical uses hereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2908373T3 true ES2908373T3 (es) 2022-04-28

Family

ID=54007591

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16757633T Active ES2908373T3 (es) 2015-08-25 2016-08-24 Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos

Country Status (15)

Country Link
US (1) US11352406B2 (es)
EP (1) EP3341403B1 (es)
JP (2) JP2018531900A (es)
KR (1) KR20180038049A (es)
CN (1) CN108026157B (es)
AR (1) AR106364A1 (es)
AU (1) AU2016311283B2 (es)
BR (1) BR112018002416A2 (es)
CA (1) CA2996455A1 (es)
ES (1) ES2908373T3 (es)
IL (1) IL257173A (es)
MX (1) MX2018002223A (es)
RU (1) RU2018107727A (es)
TW (1) TW201717998A (es)
WO (1) WO2017032798A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2908373T3 (es) 2015-08-25 2022-04-28 Novo Nordisk As Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos
US10919949B2 (en) * 2017-08-17 2021-02-16 Novo Nordisk A/S Acylated insulin analogues and uses thereof
WO2020070276A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Novo Nordisk A/S Bifunctional compounds comprising insulin peptides and egf(a) peptides
JP7640462B2 (ja) 2019-03-29 2025-03-05 ノヴォ ノルディスク アー／エス グルコース感受性インスリン誘導体
KR20220112817A (ko) 2019-12-10 2022-08-11 사노피 설폰아미드 및 폴리펩티드의 콘주게이트를 형성하는 방법
DK4073097T3 (da) 2019-12-11 2024-08-19 Novo Nordisk As Nye insulinanaloger og anvendelser heraf
EP4086277A4 (en) * 2019-12-30 2024-02-14 Gan & Lee Pharmaceuticals Co., Ltd. Long-acting glp-1 compound
CN118754967A (zh) * 2019-12-30 2024-10-11 甘李药业股份有限公司 胰岛素衍生物
CN115385843A (zh) * 2021-05-24 2022-11-25 广东东阳光药业有限公司 一种新型的酰化胰岛素类似物
KR102802795B1 (ko) 2023-04-24 2025-05-08 노보 노르디스크 에이/에스 글루코스 민감성 인슐린 유도체
WO2025016992A1 (en) 2023-07-18 2025-01-23 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical compositions of insulin derivatives

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
JP3122128B2 (ja) * 1989-12-21 2001-01-09 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ペプチド製剤
EP1132404A3 (en) 1993-09-17 2002-03-27 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
IL114160A (en) 1994-06-17 2006-12-31 Novo Nordisk As Dna constructs encoding heterologous proteins and processes for the heterologous protein production in yeast
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
US5922678A (en) 1996-06-28 1999-07-13 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
ES2258797T3 (es) 1996-12-20 2006-09-01 Novo Nordisk A/S Proteinas con extension n-terminal expresadas en la levadura.
EP1005490B1 (en) 1997-03-20 2006-03-29 Novo Nordisk A/S Zinc free insulin crystals for use in pulmonary compositions
JP2001521006A (ja) 1997-10-24 2001-11-06 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 不溶性インシュリン組成物
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US7193035B2 (en) * 2002-10-29 2007-03-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Crystals of insulin analogs and processes for their preparation
EP1692168B1 (en) * 2003-12-03 2011-07-20 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin
JP2008533100A (ja) 2005-03-18 2008-08-21 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｐｅｇ化された単鎖インスリン
DE602007009496D1 (de) 2006-02-27 2010-11-11 Novo Nordisk As Insulinderivate
JP2009530243A (ja) 2006-03-13 2009-08-27 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アシル化単鎖インスリン
RU2352113C1 (ru) 2007-06-18 2009-04-20 Владимир Яковлевич Этин Ловушка для эктопаразитов
ITRG20070003A1 (it) 2007-07-17 2009-01-18 Salvatore Lucifora Metodo e sistema informatico per analizzare le prestazioni e dimensionare una cella underlay/overlay di un sistema di telecomunicazione cellulare
JP5710253B2 (ja) * 2007-08-13 2015-04-30 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 速効型インスリンアナログ
JP5721432B2 (ja) 2007-08-15 2015-05-20 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アミノ酸含有アルキレングリコール反復単位を含むアシル部を有するインスリン
US9150633B2 (en) * 2007-08-15 2015-10-06 Novo Nordisk A/S Insulin analogues with an acyl and alkylene glycol moiety
WO2009112583A2 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
HUE032284T2 (en) * 2008-03-18 2017-09-28 Novo Nordisk As Protease-stabilized, acylated insulin analogues
CN102065903B (zh) 2008-04-01 2015-02-18 诺沃-诺迪斯克有限公司 胰岛素清蛋白缀合物
EP2448962B1 (en) 2009-06-30 2016-10-19 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
ES2552401T3 (es) 2009-11-02 2015-11-27 Novo Nordisk A/S Solución farmacéutica de albúmina unida no covalentemente e insulina acilada
JP5973427B2 (ja) 2010-06-23 2016-08-23 ノヴォ ノルディスク アー／エス 追加のジスルフィド結合を含有するインスリン類似体
EP2598522A4 (en) 2010-07-28 2014-11-12 Smartcells Inc RECOMBINANT LKTINE, BINDING POINT MODIFIED LECTIN AND APPLICATIONS THEREOF
WO2012049307A2 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 Novo Nordisk A/S Novel n-terminally modified insulin derivatives
CN103596584B (zh) 2011-06-15 2016-12-14 诺沃—诺迪斯克有限公司 多取代的胰岛素
KR20150021011A (ko) 2011-10-27 2015-02-27 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 초고도 농축된, 속효성 인슐린 유사체 제형
KR20140104994A (ko) 2011-12-15 2014-08-29 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드 인간 인슐린 유사체 및 이의 아실화 유도체
JP6538645B2 (ja) 2013-03-14 2019-07-03 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ インスリン‐インクレチン複合物
KR20160065930A (ko) 2013-10-04 2016-06-09 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 글루코스-반응성 인슐린 접합체
AR099569A1 (es) 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
US20190010206A1 (en) 2015-08-25 2019-01-10 Novo Nordisk A/S Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof
ES2908373T3 (es) 2015-08-25 2022-04-28 Novo Nordisk As Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos
CN105440125B (zh) 2015-11-25 2019-09-24 华润昂德生物药业有限公司 地特胰岛素或其类似物的制备方法
US11413352B2 (en) 2017-12-18 2022-08-16 Merck, Sharp & Dohme LLC Conjugate based systems for controlled insulin delivery
DK4073097T3 (da) 2019-12-11 2024-08-19 Novo Nordisk As Nye insulinanaloger og anvendelser heraf

Also Published As

Publication number Publication date
EP3341403B1 (en) 2022-01-05
EP3341403A1 (en) 2018-07-04
WO2017032798A1 (en) 2017-03-02
US20180305431A1 (en) 2018-10-25
CA2996455A1 (en) 2017-03-02
KR20180038049A (ko) 2018-04-13
AU2016311283A1 (en) 2018-02-15
CN108026157A (zh) 2018-05-11
AR106364A1 (es) 2018-01-10
CN108026157B (zh) 2022-11-25
AU2016311283B2 (en) 2020-10-08
BR112018002416A2 (pt) 2018-09-18
MX2018002223A (es) 2018-03-23
US11352406B2 (en) 2022-06-07
TW201717998A (zh) 2017-06-01
RU2018107727A3 (es) 2019-11-28
JP2021177779A (ja) 2021-11-18
JP2018531900A (ja) 2018-11-01
IL257173A (en) 2018-06-28
RU2018107727A (ru) 2019-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2908373T3 (es) Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos
ES2831848T3 (es) Análogo de insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30, acilado en la posición épsilon de la lisina 22
ES2369895T3 (es) Insulina monocatenaria.
US20100222269A1 (en) Improved derivatives of amylin
US20200283493A1 (en) Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof
KR20230104118A (ko) Glp-1 전구약물 및 이의 용도
ES2985989T3 (es) Análogos de insulina novedosos y usos de estos
US20180244743A1 (en) Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof
EA049440B1 (ru) Новые аналоги инсулина и варианты их применения