ES2911185T3 - Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1) - Google Patents

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Abstract

Un virión o partícula vírica que comprende un vector vírico adeno-asociado recombinante (rAAV) que comprende al menos un primer polinucleótido que comprende un promotor de rodopsina quinasa humana específico de fotorreceptor unido de forma operable a al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos un primer polipéptido de guanilato ciclasa humana específica de la retina, biológicamente activo, que comprende al menos una primera región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos idéntica en aproximadamente 95% a una secuencia de al menos 120 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1, en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 5 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV5) o en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8).

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1)
Antecedentes de la invención
Referencia cruzada con aplicaciones relacionadas
La presente aplicación reivindica la prioridad a la Solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 61/327.521, presentada el 23 de abril de 2010.
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a los campos de la biología molecular y la virología, y en particular, a métodos para usar composiciones de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que expresan al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos un primer producto génico terapéutico, y particularmente aquellos productos útiles en la prevención, tratamiento o mejora de uno o más síntomas de enfermedades, trastornos, trauma, lesión o disfunción del ojo de mamífero. En realizaciones particulares, la invención proporciona composiciones que incluyen vectores rAAV que expresan un péptido, polipéptido o proteína de guanilato ciclasa biológicamente funcional para usar en uno o más regímenes investigativos, diagnósticos y/o terapéuticos, que incluyen, por ejemplo, el tratamiento de uno o más trastornos o enfermedades del ojo de mamífero, y en particular, para tratar la ceguera retiniana congénita, que incluye, distrofia retiniana tal como amaurosis congénita de Leber, tipo 1 (LCA1), en humanos. También se proporcionan métodos para preparar medicamentos de guanilato ciclasa basados en vectores rAAV para usar en terapias génicas basadas en vector vírico, que incluyen, por ejemplo vectores rAAV-LCA1 para tratar o mejorar uno o más síntomas de deficiencia de guanilato ciclasa en humanos.
Descripción de la técnica relacionada
La amaurosis congénita de Leber (LCA) (anteriormente “amaurosis congénita de Leber”), descrita primero como un tipo congénito de retinitis pigmentosa (RP) por el oftalmólogo alemán Dr. Theodor Leber en 1869, es la forma más temprana y más grave de retinopatía hereditaria, y explica aproximadamente el 6% de todas las distrofias retinianas hereditarias. LCA es un grupo de enfermedades degenerativas de la retina, y es la causa más común de ceguera congénita en los niños. Esta condición recesiva autosómica se reconoce normalmente en el nacimiento o durante los primeros meses de vida de un bebé con ceguera total o visión enormemente alterada, fondo normal y electrorretinograma (ERG) extinguido (véase p.ej., Perrault et al., 1996). A pesar de estos déficits funcionales, los pacientes de LCA1 retienen algunos fotorreceptores de bastones y conos en su retina tanto macular como periférica durante años. Los síntomas de la enfermedad incluyen disfunción retiniana, movimiento ocular involuntario (nistagmo), visión alterada, respuesta lenta de la pupila, y en última instancia, ceguera.
A través de análisis genéticos, se ha mostrado que las mutaciones en la guanilato ciclasa-1 (GUCY2D), asignada a la posición LCA1, explican el 20% de todos los casos presentados de LCA (véase p.ej., Milam et al., 2003; Perrault et al., 1996; Perrault et al., 2000). El número de pacientes afectados por LCA1 es aproximadamente dos veces el de pacientes afectados por defectos en la versión de la proteína de 65 kDa específica del epitelio del pigmento retiniano (RPE65) de la enfermedad (LCA2), que ha conseguido mucha atención en la comunidad de la terapia génica en años recientes.
Se estima que 200.000 americanos tienen la enfermedad de Leber tipo 1. GUCY2D codifica la guanilato ciclasa (retGC1) que se expresa en las membranas del segmento externo del fotorreceptor (véase p.ej., Dizhoor et al., 1994; Lui et al., 1994), y juega un papel en la fase de recuperación de la fototransducción. Se piensa que las mutaciones que reducen o abolen la actividad de esta enzima crean el equivalente bioquímico de la exposición crónica a la luz en los fotorreceptores de bastones y conos. LCA se considera normalmente como la consecuencia de o el desarrollo alterado de los fotorreceptores o la degeneración extremadamente temprana de células que se han desarrollado normalmente. La posición LCA1 (GUCY2D) se ha mapeado en el cromosoma humano 17p 13.1 (LCA1) por mapeo de homocigosidad.
Deficiencias en la técnica anterior
Actualmente no hay compuestos profilácticos o terapéuticos efectivos disponibles para prevenir o tratar la LCA1 en humanos.
Compendio de la invención
En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un virión o partícula vírica que comprende un vector vírico adeno-asociado recombinante (rAAV) que comprende al menos un primer polinucleótido que comprende un promotor de rodopsina quinasa humana específica del fotorreceptor unido de forma operable a al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos un primer polipéptido de guanilato ciclasa humana específico de la retina, biológicamente activo, que comprende al menos una primera región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos aproximadamente idéntico al 95% a una secuencia de al menos 120 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1, en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 5 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV5) o en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8).
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición que comprende:
(1) el virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y
(2) un tampón, transporte, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el virión o partícula vírica de la presente invención o la composición de la presente invención para usar en terapia.
También se proporciona el virión o partícula vírica de la presente invención o la composición de la presente invención para usar en el tratamiento de una distrofia, enfermedad o trastorno humano, que incluye la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1).
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un virión o partícula vírica de la presente invención o la composición de la presente invención para usar en diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, trastorno, disfunción o condición anormal de un ojo de mamífero, o uno o más síntomas del mismo.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona el virión o partícula vírica de la presente invención o la composición de la presente invención para usar en el tratamiento de una enfermedad, disfunción, trastorno, deficiencia o condición anormal en un mamífero, o uno o más síntomas de los mismos, donde el mamífero tiene, se sospecha que tiene, está en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con al menos un primer trastorno, enfermedad o distrofia retiniana.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona el virión o partícula vírica de la presente invención o la composición según la presente invención para usar en un método de tratamiento proporcionando a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de guanilato ciclasa humana específica de la retina, biológicamente activo, a un mamífero que lo necesita, que comprende introducir en células adecuadas de un mamífero que lo necesita, una cantidad efectiva del virión, partícula vírica o composición, opcionalmente en el que el mamífero que lo necesita tiene un defecto, deficiencia, o ausencia sustancial de la proteína retGC1 biológicamente activa en al menos un primer tejido del mamífero, cuando se compara con el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en un mamífero normal, opcionalmente en el que se proporciona a las células adecuadas el virión o partícula vírica o composición ex vivo o in vitro, y el método comprende además introducir las células provistas en al menos un primer sitio de tejido en o alrededor del cuerpo del mamífero o en el que las células provistas se introducen en al menos un primer sitio en uno o ambos ojos del mamífero por inyección directa en la retina o el tejido circundante.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el virión o partícula vírica de la presente invención o la composición según la presente invención para usar en un método de tratamiento aumentando el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en una o más células retinianas de un mamífero que tiene, se sospecha que tiene, está diagnosticado con, o está en riesgo de desarrollar, LCA1, que comprende introducir el virión o partícula vírica o composición en al menos una primera población de células retinianas del mamífero, en una cantidad y durante un tiempo efectivo para aumentar el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en una o más células retinianas del mamífero.
La presente descripción proporciona un vector vírico adeno-asociado recombinante (rAAV) que incluye al menos un primer polinucleótido que comprende un promotor unido de forma operable a al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos una primera proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero. Preferiblemente, el promotor es un promotor específico del fotorreceptor (tal como, por ejemplo, un promotor de rodopsina quinasa humana), o un promotor ubicuo (tal como, por ejemplo, un promotor de p-actina de pollo-CMV quimérico truncado). Preferiblemente el primer segmento de ácido nucleico codifica al menos una primera proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero que comprende, consiste esencialmente en, o de forma alternativa, consiste en, al menos una primera región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 85% o aproximadamente 90% o más en identidad con al menos una primera región de secuencia de al menos aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 o más aminoácidos contiguos de una secuencia como se describe en cualquiera de una o más de las proteínas guanilato ciclasa de mamífero representadas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.
En ciertas realizaciones descritas, el al menos primer segmento de ácido nucleico codifica preferiblemente al menos una primera proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero que incluye al menos una primer región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, o aproximadamente 95% o más de identidad en la secuencia de aminoácidos primaria con al menos una primera región de secuencia de al menos aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140 o aproximadamente 150 o más aminoácidos contiguos de una secuencia como se describe en cualquiera de una o más de las secuencias de proteína guanilato ciclasa de mamífero enumeradas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.
Preferiblemente, el al menos un primer segmento de ácido nucleico codificará al menos una o más proteínas, péptidos o polipéptidos de guanilato ciclasa de mamífero que cada una incluye preferiblemente al menos una primera secuencia de aminoácidos primarios contiguos que es al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a al menos una primera región de secuencia que incluye al menos aproximadamente 90, aproximadamente 110, aproximadamente 130, aproximadamente 150 o aproximadamente 170 o más aminoácidos contiguos de al menos una primera proteína guanilato ciclasa como se muestra en una o más de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.
Preferiblemente los vectores rAAV de la presente descripción incluyen al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos una primera proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero que comprende, consiste esencialmente en, o alternativamente, consiste en, la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una o más de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID nO:11, o una secuencia de polinucleótidos que es complementaria a, o específicamente hibrida con una o más de dichas secuencias bajo condiciones de hibridación de rigurosas a altamente rigurosas. Preferiblemente, la primera proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero poseerá actividad guanilato ciclasa in vitro e in vivo en células de mamífero transformadas, y preferiblemente, en células huésped humanas transformadas. En aspectos particulares, la proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa poseerá una significativa actividad guanilato ciclasa biológicamente activa in vitro e in vivo en células de mamífero transformadas, y preferiblemente, en células huésped humanas transformadas cuando el segmento de ácido nucleico que codifica el péptido, proteína o polipéptido está unido de forma operable a al menos un primer promotor capaz de expresar la secuencia en una célula huésped de mamífero, y preferiblemente, humana.
Aunque los vectores rAAV de la presente invención no están necesariamente limitados a un serotipo particular, en ciertas realizaciones, los inventores contemplan que pueden alcanzarse resultados beneficiosos utilizando un vector rAAV que es uno o más de los siguientes serotipos conocidos: vector de serotipo 1 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV1), serotipo 2 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV2), serotipo 3 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV3), serotipo 4 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV4), serotipo 5 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV5), serotipo 6 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV6), serotipo 7 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV7), serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8), o un serotipo 9 de virus adenoasociado recombinante (rAAV). En ciertas aplicaciones, los vectores rAAV de la presente invención pueden ser un vector rAAV auto-complementario (scAAV).
En realizaciones en que se desea un promotor específico de fotorreceptor, los vectores rAAV descritos en la presente memoria pueden incluir al menos un primer promotor de rodopsina quinasa específico de fotorreceptor. De forma ejemplar dichos promotores incluyen el promotor de rodopsina quinasa humana, que se ilustra en SEQ ID NO:12. En ciertos aspectos de la invención, el uso de una secuencia de promotor que incluye al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45 o al menos aproximadamente 50 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:12 se prefiere particularmente cuando se desea la expresión específica del tejido (y en particular, específica del fotorreceptor) del constructo terapéutico.
De forma similar, en las realizaciones en que se desea un promotor ubicuo, los vectores rAAV descritos en la presente memoria pueden incluir al menos un primer promotor de p-actina de pollo-CMV quimérico truncado. De forma ejemplar dichos promotores incluyen el promotor de p-actina de pollo-CMV quimérico truncado, que se ilustra en SEQ ID NO:13. En ciertos aspectos de la invención, el uso de una secuencia de promotor que incluye al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, o al menos aproximadamente 50 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:13 se prefiere particularmente cuando se desea la expresión no específica de tejido del gen terapéutico.
En algunas realizaciones, la secuencia de promotor empleada en los constructos génicos terapéuticos descritos pueden comprender, consistir esencialmente en, o alternativamente, consistir en, una secuencia de ácido nucleico que incluye al menos 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115 o aproximadamente 120 o más nucleótidos contiguos de las secuencias de promotor descritas o en SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13.
Los vectores de terapia génica descritos en la presente memoria también pueden incluir además opcionalmente una o más secuencias reguladoras “corriente arriba” o “corriente abajo”, tal como un primer potenciador unido de forma operable a el al menos un primer segmento nucleico, o una región reguladora de la transcripción tal como el elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de la marmota. Los constructos de la invención también pueden incluir además opcionalmente una o más secuencias de intrón unidas de forma operable a el al menos un primer segmento nucleico que codifica el agente terapéutico.
Los segmentos de ácido nucleico que codifican las proteínas, péptidos y polipéptidos de guanilato ciclasa de mamífero de la invención pueden derivarse de secuencias naturales, semi-sintéticas o totalmente sintéticas, pero serán preferiblemente de origen mamífero. Fuentes ejemplares de mamífero incluyen, sin limitación, humana, primates no humanos, murinos, felinos, caninos, porcinos, ovinos, bovinos, equinos, epinos, caprinos, lupinos y similares.
Los vectores rAAV descritos en la presente memoria pueden estar comprendidos opcionalmente en una partícula vírica adeno-asociada infecciosa, un virión, o en una o más de una pluralidad de partículas AAV infecciosas. Como tal, la invención también incluye viriones, partículas víricas, además de células huésped recombinantes aisladas que contienen uno o más de los constructos genéticos de rAAV descritos. Células huésped particularmente preferidas para la práctica de la invención incluyen, sin limitación, células huésped de mamífero aisladas que incluyen uno o más de: un vector rAAV, un virión de AAV, o una pluralidad de partículas víricas infecciosas.
En otros aspectos, la invención proporciona composiciones nuevas y útiles que incluyen uno o más de (a) un vector rAAV, un virión de rAAV, una partícula vírica infecciosa de rAAV, una pluralidad de dichos viriones o partículas infecciosas, o una célula huésped de mamífero aislada que comprende el vector, el virión, la partícula infecciosa o una pluralidad de los mismos. Preferiblemente, dichas composiciones incluirán además opcionalmente uno o más tampones, transportes, vehículos, diluyentes, y similares, farmacéuticamente aceptables, y pueden incluir además opcionalmente uno o más lípidos, liposomas, complejos lipídicos, etosomas, niosomas, nanopartículas, micropartículas, lipoesferas, nanocápsulas o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente dichas composiciones se formulan preferiblemente para la administración al ojo humano, y pueden usarse en terapia o profilaxis, y en la terapia o profilaxis de una distrofia, enfermedad o trastorno retiniano humano (tal como LCA1), en particular.
Como se anota a continuación, la invención también incluye kits diagnósticos, terapéuticos y profilácticos que incluyen uno o más de los constructos de vector rAAV descritos en la presente memoria. Dichos kits pueden incluir además opcionalmente uno o más protocolos, regímenes de dosificación o instrucciones para usar el componente en el diagnóstico, prevención, tratamiento o mejora de uno o más síntomas de una distrofia, enfermedad, trastorno o condición anormal retiniana en un humano. En ciertos aspectos, los kits terapéuticos para el tratamiento de pacientes humanos diagnosticados con amaurosis congénita de Leber 1 (LCA-1) se contemplan particularmente.
La presente invención también incluye el uso de una o más de las composiciones basadas en rAAV descritas en la terapia o en la profilaxis de enfermedades o trastornos de mamíferos. Asimismo, la invención incluye el uso de las composiciones descritas en la fabricación de un medicamento para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno, disfunción o condición anormal de un ojo de mamífero, y en particular, para tratar o mejorar uno o más síntomas de amaurosis congénita de Leber 1 (LCA-1) en un humano.
La descripción también proporciona un método para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, disfunción, trastorno, deficiencia o condición anormal en un mamífero. Dicho método generalmente implica administrar a un mamífero que lo necesita, una cantidad efectiva de una composición de rAAV descrita en la presente memoria durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o mejorar el uno o más síntomas de la enfermedad, disfunción, trastorno, deficiencia o condición anormal en el mamífero. Dicho mamífero preferiblemente tiene, se sospecha que tiene, está en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con al menos un primer trastorno, enfermedad o distrofia retiniana, que incluye, por ejemplo, amaurosis congénita de Leber 1 (LCA-1), o en el que el mamífero está en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con una o más deficiencias, defectos o ausencia de proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa funcional, biológicamente activa. El mamífero puede ser de cualquier edad, pero será más preferiblemente un neonato, recién nacido, bebé o joven que está en riesgo de desarrollar o se ha diagnosticado con una distrofia retiniana congénita tal como amaurosis congénita de Leber 1 (LCA-1).
La descripción también proporciona un método para proporcionar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido, polipéptido o proteína de guanilato ciclasa de mamífero biológicamente activo a un mamífero que lo necesita. Dicho método implica generalmente al menos la etapa de introducir en células adecuadas de un mamífero que lo necesita, una cantidad efectiva de uno o más de los vectores rAAV descritos en la presente memoria, durante un tiempo suficiente para producir un péptido, polipéptido o proteína de guanilato ciclasa biológicamente activo de ellos en al menos una primera población de células o al menos un primer tejido del mamífero en que el vector rAAV se ha introducido. En la práctica del método, el mamífero que lo necesita tendrá preferiblemente uno o más defectos, deficiencias o una sustancial o total ausencia de proteína retGC1 biológicamente activa, funcional, en uno o más tejidos en o alrededor del cuerpo del mamífero, cuando se compara con el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en un mamífero normal. En ciertas aplicaciones del método, se proporciona a una pluralidad de células del mamífero el vector rAAV ex vivo o in vitro, incluyendo además el método una etapa adicional de introducir posteriormente la pluralidad de células provistas en al menos un primer sitio del tejido en o alrededor del cuerpo del mamífero. Por ejemplo, la pluralidad de células obtenidas pueden introducirse en al menos un primer sitio en uno o ambos ojos del mamífero, incluyendo por ejemplo, por inyección directa en la retina, el espacio sub-retiniano, o a uno o más tejidos que rodean la retina, o al ojo entero, o a tejidos que rodean el ojo.
En aspectos particulares, la introducción del constructo génico de guanilato ciclasa vectorizado con rAAV en la célula, y su posterior expresión permite la traducción del péptido, proteína o polipéptido de guanilato ciclasa funcional, y como resultado, se conservan los fotorreceptores de los conos, y se restaura la función mediada por los conos. De forma importante, dicho método proporciona un regreso del comportamiento visual normal en el ojo del mamífero, y preferiblemente, un regreso de la visión.
La administración de los vectores rAAV de la invención puede ser parte de una terapia de una vez, o puede ser parte de un régimen terapéutico en proceso repetido dos o más veces durante la vida del sujeto a tratar. En ciertos aspectos, una única administración de los constructos de rAAV produce la formación sostenida de proteína guanilato ciclasa, con conservación de los fotorreceptores de los conos, y la restauración de la función mediada por los conos y el comportamiento visual durante un periodo de al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, o más después de la administración. Más preferiblemente, se consigue la terapia o profilaxis a largo plazo usando una o más administraciones posteriores de los constructos terapéuticos al ojo del mamífero durante periodos de varios meses a varios años. Preferiblemente, se conservan los fotorreceptores de los conos, y la función mediada por los conos y el comportamiento visual se restauran en el mamífero durante un periodo de al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, o más después de la administración. En ciertos aspectos, la conservación de los fotorreceptores, la función mediada por los conos y el comportamiento visual se restauran en el mamífero durante un periodo de al menos un año, al menos dos años, al menos tres años o al menos cuatro años o más después de la terminación de un régimen de tratamiento que incluye las composiciones descritas en la presente memoria. La invención proporciona además un método para aumentar el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en una o más células retinianas de un mamífero que tiene, se sospecha que tiene, está diagnosticado de, o está en riesgo de desarrollar, LCA1. Dicho método generalmente implica introducir en al menos una primera población de células retinianas de un mamífero que lo necesita, uno o más de los constructos de vector vírico de rAAV-guanilato ciclasa descritos, en una cantidad y durante un tiempo efectivo para aumentar el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en una o más células retiniana del mamífero. Dicho método se contempla particularmente para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de distrofia retiniana en un mamífero, y puede implicar preferiblemente administrar directamente o indirectamente a la retina, espacio sub-retiniano o al ojo del mamífero uno o más de los constructos terapéuticos descritos, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar uno o más síntomas de distrofia retiniana en el mamífero.
La descripción también proporciona composiciones y métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de deficiencia de proteína guanilato ciclasa en un mamífero, y particularmente para tratar o reducir la gravedad o extensión de la deficiencia en un humano que manifiesta uno o más de los trastornos unidos a una deficiencia de polipéptidos de guanilato ciclasa biológicamente activos. En un sentido general, el método implica la administración de al menos un primer constructo genético basado en rAAV que codifica uno o más péptidos, polipéptidos o proteínas de guanilato ciclasa en un vehículo farmacéuticamente aceptable al animal en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficiente para tratar o mejorar la deficiencia en el animal sospechoso de sufrir dicho trastorno, o uno o más síntomas del mismo. Polipéptidos de guanilato ciclasa ejemplares útiles en la práctica de la descripción incluyen, aunque no están limitados a péptidos, polipéptidos y proteínas que tienen actividad guanilato ciclasa, y que son sustancialmente idénticos en la secuencia primaria de aminoácidos a cualquiera de las secuencias descritas en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, y a equivalentes biológicamente funcionales, o derivados de los mismos. Péptidos, proteínas y polipéptidos de guanilato ciclasa ejemplares adicionales útiles en la práctica de Z de la invención incluyen, aunque no están limitados a aquellos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, una secuencia de aminoácidos que codifica una guanilato ciclasa de mamífero, y particularmente aquellas secuencias como se describen en SeQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID n O:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, y a equivalentes biológicamente funcionales, o derivados de los mismos.
Composiciones de vector rAAV-guanilato ciclasa
En una primera realización, la descripción proporciona un vector rAAV que comprende un polipéptido que comprende al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica una proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa, y en particular, una proteína, péptido o polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero (o un fragmento o derivado del mismo biológicamente activo), unido de forma operable a al menos un primer promotor capaz de expresar el segmento de ácido nucleico en una célula huésped adecuada transformada con dicho vector. En realizaciones preferidas, el segmento de ácido nucleico codifica un péptido, polipéptido o proteína de guanilato ciclasa de mamífero, y en particular, una humana, y en particular un péptido, polipéptido o proteína que comprende al menos una primera secuencia de aminoácidos contiguos que es homóloga al menos al 90% a al menos una primera secuencia de 30 aminoácidos contiguos de una o más de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:1, o un fragmento o variante biológicamente activo de las mismas.
Preferiblemente, el polipéptido comprende al menos una primera secuencia de aminoácidos contiguos que es homóloga en al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% a una secuencia de al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70 o al menos 80 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1, y más preferiblemente, el polipéptido comprende al menos una primera secuencia de aminoácidos contiguos que es homóloga en al menos 99% a una secuencia de al menos 90 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1.
De forma alternativa, los constructos terapéuticos de la descripción pueden incluir segmentos de ácido nucleico que codifican polipéptidos de guanilato ciclasa de cualquier origen mamífero, tal como por ejemplo ácidos nucleicos, péptidos y polipéptidos de origen murino, primate, ovino, porcino, bovino, equino, epino, caprino, canino, felino y/o lupino, o pueden incluir segmentos de ácido nucleico modificados o mutagenizados específicamente en el sitio que se obtuvieron inicialmente a partir de una o más especies de mamíferos, y modificados genéticamente para expresarse en células humanas de manera que se retiene su actividad guanilato ciclasa.
En otras realizaciones preferidas, los segmentos preferidos de ácido nucleico para usar en la práctica de la presente descripción, codifica un polipéptido de guanilato ciclasa de mamífero, y en particular, uno humano, o un fragmento o variante biológicamente activo del mismo.
Los polinucleótidos comprendidos en los vectores y partículas víricas de la presente descripción comprenden preferiblemente al menos un primer promotor constitutivo o inducible unido de forma operable a un segmento de ácido nucleico que codifica la guanilato ciclasa como se describe en la presente memoria. Dichos promotores pueden ser promotores homólogos o heterólogos, y pueden estar situados de forma operativa corriente arriba del segmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido de guanilato ciclasa, de manera que la expresión del segmento que codifica la guanilato ciclasa está bajo el control del promotor. El constructo puede comprender un único promotor, o de forma alternativa, dos o más promotores pueden usarse para facilitar la expresión de la secuencia de ADN que codifica la guanilato ciclasa.
Promotores ejemplares útiles en la práctica de la descripción incluyen, aunque no están de ninguna manera limitados a, las secuencias de promotor que son operables en células, tejidos y órganos huésped de mamífero, y en particular, humanos, tal como por ejemplo, promotores ubicuos, tal como un promotor de CMV, promotor, un promotor de pactina, un promotor de CMV híbrido, un promotor de CMV-p-actina híbrido, un promotor de CMV truncado, un promotor de p-actina truncado, un promotor de CMV-p-actina híbrido truncado, un promotor de EF1, un promotor de U1a o un promotor de U1b; o uno o más promotores específicos de células o tejido (que incluyen, por ejemplo, un promotor específico de fotorreceptor tal como un promotor de rodopsina quinasa [hGRKI]), o un promotor inducible tal como un promotor Tet-inducible o un promotor de VP16-LexA.
En realizaciones ilustrativas, un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico se puso bajo el control de un promotor de p-actina de pollo (CBA) híbrido truncado ubicuo, o bajo el control de un promotor de hGRK1 específico de la célula de fotorreceptor, y se usó para producir niveles terapéuticamente efectivos del polipéptido de guanilato ciclasa codificado cuando las células huésped adecuadas se transformaron con el constructo genético, y el ADN que codifica el polipéptido de guanilato ciclasa se expresó en dichas células. Un ejemplo de un promotor de hGRKI adecuado se muestra en SEQ ID NO:12, mientras que un promotor ubicuo adecuado, tal como el promotor de p-actina de pollo (CBA) híbrido truncado se muestra en SeQ ID nO:13.
Los polinucleótidos comprendidos en los vectores y partículas víricas de la presente descripción pueden también comprender además opcionalmente uno o más potenciadores nativos, sintéticos, homólogos, heterólogos o híbridos o elementos reguladores 5’, por ejemplo, un potenciador natural, tal como el potenciador de CMV, o de forma alternativa, un potenciador sintético. Los potenciadores específicos de células o tejido, que incluyen por ejemplo, los que aumentan la expresión de secuencias génicas unidas de forma operable también se contemplan por ser particularmente útiles en la práctica de la descripción.
Dichos potenciadores pueden incluir, aunque no están limitados a, potenciadores específicos de la retina, potenciadores específicos de los bastones, potenciadores específicos de los conos, y similares.
Los polinucleótidos y segmentos de ácido nucleico comprendidos en los vectores y partículas víricas de la presente descripción pueden también comprender además opcionalmente una o más secuencias de intrón. En dichos ejemplos, la(s) secuencia(s) de intrón será(n) preferiblemente mamíferas en origen, y más preferiblemente humanas en origen.
Las secuencias de ADN, segmentos de ácido nucleico, y polinucleótidos comprendidos en un vector, virión, partícula vírica, célula huésped o composición de la presente descripción pueden también comprender además opcionalmente uno o más elementos post-transcripcionales o 3’ reguladores nativos, sintéticos, homólogos, heterólogos o híbridos situados de forma operable respecto a los segmentos de ácido nucleico que codifican guanilato ciclasa descritos en la presente memoria para proporcionar mayor expresión, mayor estabilidad y/o traducción mejorada de los polipéptidos codificados. Uno de dichos ejemplos es el elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), situado de forma operable corriente abajo del gen de guanilato ciclasa. El uso de elementos tal como esos en dichas circunstancias se conoce bien por los expertos en las técnicas biológicas moleculares.
En realizaciones ilustrativas, la descripción afecta a la administración de una o más proteínas, péptidos o polipéptidos de guanilato ciclasa biológicamente activos que comprenden una secuencia de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 100 o más aminoácidos contiguos de las secuencias de polipéptido y péptido descritas a continuación, y particularmente aquellos polipéptidos como se enumeran en cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.
Asimismo, en realizaciones ilustrativas adicionales, la descripción afecta a la administración de una o más proteínas, péptidos o polipéptidos de guanilato ciclasa biológicamente activas que están codificadas por un segmento de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 110, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 130, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 170, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 190, o al menos aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750 o incluso aproximadamente 800 o más residuos de ácido nucleico contiguos de los segmentos de ácido nucleico descritos a continuación, y particularmente aquellas secuencias de ADN que codifican cualquiera de una o más proteínas de guanilato ciclasa de mamífero, que incluyen por ejemplo, aquellas que se enumeran en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEq ID n O:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.
Los constructos de vector vírico adeno-asociado ejemplares y polinucleótidos de la presente descripción incluyen aquellos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido que es idéntico en al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% a la secuencia de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, en las que el péptido o polipéptido tiene actividad guanilato ciclasa cuando se expresa en células y/o tejidos de mamífero seleccionados.
En ciertas realizaciones, los constructos de vector vírico y polinucleótidos de la presente descripción incluirán preferiblemente aquellos vectores y polinucleótidos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido que es idéntico en al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 92% o al menos aproximadamente 94% a una o más de las secuencias descritas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11. Dichos constructos codificarán preferiblemente uno o más péptidos o polipéptidos biológicamente activos que tienen actividad guanilato ciclasa cuando se expresan en células y/o tejidos de mamíferos seleccionados y en células y/o tejidos humanos en particular.
Los polinucleótidos ejemplares de la presente descripción también incluyen aquellas secuencias que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en al menos un primer segmento de ácido nucleico que es idéntico en al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% a una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, en la que el péptido o polipéptido codificado por el segmento de ácido nucleico tiene actividad guanilato ciclasa cuando se expresa en células y/o tejidos de mamíferos seleccionados.
Partículas víricas y viriones de rAAV, y células huésped que los comprenden
Otros aspectos de la descripción afectan a partículas y viriones de rAAV que comprenden los vectores rAAV-guanilato ciclasa de la presente descripción, pluralidades de dichas partículas y viriones, además de composiciones farmacéuticas y células huésped que comprenden uno o más de los vectores rAAV-guanilato ciclasa descritos en la presente memoria, tal como por ejemplo formulaciones farmacéuticas de los vectores o viriones de rAAV-guanilato ciclasa previstos para la administración a un mamífero a través de medios adecuados, tales como, por inyección intramuscular, intravenosa o directa a células, tejidos u órganos seleccionados del mamífero, por ejemplo, una o más regiones del ojo del mamífero seleccionado. Típicamente, dichas composiciones se formularán con excipientes, tampones, diluyentes, adyuvantes o transportes farmacéuticamente aceptables, como se describe a continuación, y pueden comprender además uno o más liposomas, lípidos, complejos lipídicos, microesferas, micropartículas, nanoesferas o formulaciones de nanopartículas para facilitar la administración a los órganos, tejidos y células seleccionados para los que se desea la terapia.
Aspectos adicionales de la descripción incluyen células huésped de mamífero, y pluralidades de las mismas que comprenden uno o más de los vectores, viriones o partículas víricas infecciosas de rAAV como se describe en la presente memoria. Las células particularmente preferidas son las células huésped humanas, y en particular, los tejidos oculares humanos, que incluyen, por ejemplo, células retinianas.
Kits terapéuticos y composiciones farmacéuticas
Los kits terapéuticos para tratar o mejorar los síntomas de una condición que resulta de una deficiencia de guanilato ciclasa en un mamífero son también parte de la presente descripción. Kits ejemplares son aquellos que comprenden preferiblemente uno o más de los constructos, viriones o composiciones farmacéuticas de vector AAV-guanilato ciclasa revelados descritos en la presente memoria, e instrucciones para usar el kit. El uso de dichos kits en métodos de tratamiento de deficiencia de guanilato ciclasa, y en particular, guanilato ciclasa 1 específica de la retina, es preferible en el tratamiento de defecto o deficiencia de retGCI y en el tratamiento de distrofias retinianas tales como LCA-1 en un mamífero afectado.
Otro aspecto importante de la presente descripción afecta al uso de los vectores, viriones, composiciones descritas y células huésped descritas en la presente memoria en la preparación de medicamentos para tratar o mejorar los síntomas de deficiencia de guanilato ciclasa en un mamífero, y en particular, un humano. El uso de dichas composiciones en la preparación de medicamentos y en métodos para el tratamiento de defectos neurológicos y/o del sistema nervioso central, que incluyen por ejemplo, condiciones que resultan de una deficiencia o defecto en GCI retiniana, tal como por ejemplo en distrofias retinianas tales como LCA-1, generalmente implican la administración a un mamífero, y particularmente a un humano que lo necesita, uno o más de los vectores, viriones, células huésped o composiciones descritas que comprenden uno o más de los mismos, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar los síntomas de dicha deficiencia en el mamífero afectado. Los métodos pueden incluir además el tratamiento profiláctico de animales sospechosos de tener dichas condiciones, o la administración de dichas composiciones a aquellos animales en riesgo de desarrollar dichas condiciones o bien después del diagnóstico, o antes del comienzo de los síntomas.
Otro aspecto de la descripción afecta a las composiciones que comprenden uno o más de los vectores víricos adenoasociados, viriones, partículas víricas y células huésped descritas como se describen en la presente memoria. Se contemplan particularmente composiciones farmacéuticas que los comprenden por ser útiles en terapia, y particularmente en la preparación de medicamentos para tratar a mamíferos afectados, y humanos en particular.
Métodos terapéuticos
La descripción también proporciona métodos para distribuir cantidades terapéuticamente efectivas de un polipéptido de guanilato ciclasa a un mamífero que lo necesita. Dichos métodos generalmente comprenden al menos la etapa de proporcionar o administrar a dicho mamífero, una o más de las composiciones de guanilato ciclasa descritas en la presente memoria. Por ejemplo, el método puede implicar proporcionar a dicho mamífero, uno o más de los vectores, viriones, partículas víricas, células huésped o composiciones farmacéuticas de rAAV como se describe en la presente memoria. Preferiblemente dicha provisión o dicha administración será en una cantidad y durante un tiempo efectivo para proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los polipéptidos de guanilato ciclasa descritos en la presente memoria a células, tejidos u órganos seleccionados del mamífero, y en particular, niveles terapéuticamente efectivos a las células del ojo de mamífero. Dichos métodos pueden incluir inyección(ones) sistémica(s) del compuesto terapéutico, o pueden incluso implicar la administración, inyección o introducción directa o indirecta de las composiciones terapéuticas a células, tejidos u órganos particulares del mamífero.
Por ejemplo, la composición terapéutica puede proporcionarse al mamífero por inyección directa a los tejidos del ojo o a la retina, o al espacio sub-retiniano, o a uno o más tipos de células en el ojo del mamífero.
La descripción también proporciona métodos de tratamiento, mejora de los síntomas y reducción de la gravedad de la deficiencia de guanilato ciclasa en un animal. Estos métodos implican generalmente al menos la etapa de proporcionar a un animal que lo necesita, una o más de las composiciones del vector rAAV guanilato ciclasa descritas en la presente memoria en una cantidad y durante un tiempo efectivo para tratar el defecto o deficiencia de polipéptido de retGCI, o para tratar una disfunción resultante de dicha acumulación, o resultante de una sub-expresión o ausencia de polipéptido de guanilato ciclasa biológicamente activo suficiente en el animal, que incluye distrofias retinianas tales como LCA1 y similares. Como se describe anteriormente, dichos métodos pueden implicar inyección(ones) sistémica(s) del compuesto terapéutico, o pueden incluso implicar la administración, inyección o introducción directa o indirecta de las composiciones terapéuticas a células, tejidos u órganos particulares del animal.
La descripción afecta además al uso de los vectores víricos adeno-asociados, viriones, partículas víricas, células huésped y/o las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria en la fabricación de un medicamento para tratar el defecto o deficiencia de guanilato ciclasa, distrofia retiniana, o LCA1 u otra enfermedad, trastorno o disfunción ocular relacionada con GC1 en un mamífero. Este uso puede implicar la inyección, infección o administración sistémica o localizada a una o más células, tejidos u órganos del mamífero. Dicho uso se contempla particularmente en humanos que tienen, se sospecha que tienen o están en riesgo de desarrollar una o más distrofias retinianas tales como LCA-1.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a la siguiente descripción tomadas en conjunto con los dibujos de acompañamiento, en que números de referencia similares identifican elementos similares, y en que:
La FIG. 1 muestra trazos de ERG mediados por conos (columna izquierda) y bastones (columna derecha) representativos de ratones /+ (ondas superiores), GC1KO no tratados (ondas intermedias) y tratados con AVV-mGC1 (ondas inferiores). Los trazos negros corresponden a ojos inyectados con hGRK1 -mGC1 (ondas inferiores) y sus ojos contralaterales no inyectados (ondas intermedias). Los trazos rojos corresponden a ojos inyectados con smCBA-mGC1 (ondas inferiores) y ojos contralaterales no inyectados (ondas intermedias). Las respuestas de los conos en ojos tratados con AAV-mGC1 se restauran a aproximadamente 45% de lo normal;
La FIG. 2A y FIG. 2B muestran las amplitudes máximas de ondas b fotópicas promedio en controles GC1KO, isogénicos /+, ratones GC1KO tratados con smCBA-mGCI (FIG. 2A) y tratados con hGRK1-mGC1 (FIG. 2B) en el tiempo. Las respuestas de los conos de ratones tratados tanto con smCBA-mGC1 como hGRKI-mGC1 son aproximadamente 45% de lo normal durante al menos 3 meses después de la inyección;
La FIG. 3A, FIG. 3B y FIG. 3C ilustran por análisis optomotor que el comportamiento obtenido visualmente se restauró en los ratones GC1 KO tratados con o bien smCBA-mGC1 o con hGRK1 -mGC1. M1 a M9 corresponden a los nueve ratones usados para las pruebas. Las agudezas fotópicas y las sensibilidades al contraste de los ratones de control /+ (M1, M2), GC1KO no tratados anteriormente (M3, M4), ratones tratados con smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) y con hGRK1 -mGC1 (M8, M9) revelan que los ratones tratados se comportan como ratones con vista normal (FIG. 3B y FIG.
3C). Se muestran los promedios de todos los ojos /+ (n = 4), ojos GC1 KO (n = 9) y ojos tratados con AAV-mGC1 (n = 5) (FIG. 3C). Las respuestas de ERG mediadas por conos de cada ratón (M1-M9) se muestran para comparación electrofisiológica (FIG. 3A);
La FIG. 4A, FIG. 4B, FIG. 4C, FIG. 4D, FIG. 4E y FIG. 4F muestran que AAV5-hGRK1-mGC1 conduce la expresión de GC1 en segmentos externos del fotorreceptor de ratones GC1 KO (FIG. 4A). No se ve expresión de GC1 en el ojo de control contralateral no tratado (FIG. 4B). AAV5-smCBA-mGC1 conduce la expresión de GC1 en segmentos externos del fotorreceptor (FIG. 4C) y ocasionalmente en cuerpos celulares del fotorreceptor (flechas blancas en la FIG. 4F). No se ve dicha expresión de GC1 en el ojo de control contralateral no tratado (FIG. 4D). Los niveles de expresión transgénica terapéutica en ojos tratados con AAV5-mGC1 son similares a los vistos en ojos de control /+ isógenicos (FIG. 4E). Todas las retinas se tomaron de los ratones después del tratamiento de 3 meses o controles no tratados emparejados por edad. Barras de escala en la FIG. 4A = 100 pm; en la FIG. 4F = 25 pm. OS = segmentos externos; IS = segmentos internos; ONL = capa nuclear externa;
La FIG. 5A, FIG. 5B, FIG. 5C y FIG. 5D muestran la expresión de arrestina de los conos en los fotorreceptores de los conos de ratones /+, GC1KO, tratados con AAV5-smCBA-mGC1 y tratados con AAV5-hGRK1-mGC1. Las retinas GC1KO no tratadas contienen segmentos externos de conos desorganizados, separados, característicos (FIG. 5B), mientras que los segmentos externos de los conos estaban intactos y la distribución de arrestina de los conos aparecía normal en las secciones retinianas de GC1 KO tratado (FIG. 5C y FIG. 5D) y /+ (FIG. 5A). Todas las retinas se tomaron de los ratones 3 meses después del tratamiento o de controles no tratados emparejados por edad. Barras de escala en la FIG. 5D = 100 pm. OS = segmentos externos, IS = segmentos internos, S = terminales sinápticas;
La FIG. 6A, FIG. 6B, FIG. 6C y FIG. 6D muestran que el tratamiento con AAV-mGC1 da por resultado la conservación de los fotorreceptores de los conos en los ojos tratados durante al menos tres meses después del tratamiento. Las preparaciones completas retinianas representativas del estudio de hGRK1 -mGC1 (FIG. 6A: “no TX” = no tratado; FIG.
6C: “TX” = tratado), y el estudio de smCBA-mGC1 (FIG. 6B: “no TX” = no tratado; FIG. 6D: “TX” = tratado) y los ojos no inyectados contralaterales teñidos para la arrestina de los conos revelan que los fotorreceptores de los conos se conservan en ratones GC1KO tratados con AAV-mGC1 durante al menos 3 meses después del tratamiento. Las densidades celulares de los conos se contaron en las retinas centrales e inferiores de ratones tratados y no tratados. Se encontraron diferencias significativas en ambas áreas después del tratamiento con cualquier vector vírico;
La FIG. 7 ilustra la cascada de fototransducción de vertebrados. Bajo estimulación con luz, los cambios conformacionales en la rodopsina (R) estimulan una cascada de sucesos que incluyen la activación de la transducina (T) y cGMP fosfodiesterasa (PDE) dando por resultado eventualmente la hidrólisis de cGMP. Esta disminución de cGMP intracelular provoca un cierre de los canales cerrados por nucleótidos cíclicos (CNG) en las membranas del segmento externo del fotorreceptor. El cierre de estos canales provoca la hiperpolarización de la célula y por lo tanto una caída dramática en el calcio intracelular. Cuando los niveles de calcio caen, la proteína que activa la guanilato ciclasa no unida (GCAP) está libre para estimular la guanilato ciclasa (GC). La GC juega un papel en la fase de recuperación de la fototransducción en que su propósito es producir cGMP. Cuando los niveles de cGMP están suficientemente elevados por la GC, los canales cerrados por cGMP se vuelven a abrir provocando la despolarización de la célula y una vuelta al estado adaptado a la oscuridad;
La FIG. 8 muestra la estructura predicha y la topología de retGC1 muestra la homología a otras guanilato ciclasas con una única región que atraviesa la transmembrana, un dominio intracelular y extracelular. El dominio intracelular se divide adicionalmente en una región “tipo quinasa” y el dominio catalítico. La regulación dependiente de calcio y
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GCAP1 de retGCI se regula a través de los dominios intracelulares (KHD). Cuando la concentración de calcio en la célula fotorreceptora es alta (en el estado oscuro/despolarizado), la GCAP1 unida al calcio evita la activación de retGC1. Tras la estimulación con luz, los niveles de calcio disminuyen. El calcio se separa de GCAP1, permitiendo así que GCAP1 active la retGC1. El papel de retGC1 es producir cGMP;
La FIG. 9 muestra fotorreceptores de conos en ratones normales (WT) frente a GC1KO. En los conos WT, GC1 funciona normalmente para producir cGMP que puede reabrir de forma efectiva los canales cerrados por CNG y devolver a la célula a su estado adaptado a la oscuridad/despolarizado. En los fotorreceptores de los conos del ratón GC1KO, GC1 falla al producir cGMP. Este fallo evita la reapertura de los canales cerrados por CNG. Estas células están en esencia, crónicamente híper-polarizadas (adaptadas a la luz). No transducen luz para la visión (como se evidencia por una carencia de ERG) y degenerarán eventualmente;
La FIG. 10 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos del GC1 bovino (bov GC1) y GC1 de ratón (mGC1) con secuencia de consenso incluida. La región variable situada en el área N-terminal está resaltada por el rectángulo rojo;
La FIG. 11 muestra mapas de los dos vectores ilustrativos. Uno contiene el promotor ubicuo smCBA, mientras que el otro utiliza el promotor específico del fotorreceptor, hGRK1;
La FIG. 12 muestra la sección retiniana representativa de un ojo GC1KO inyectado con AAV5-smCBA-mGC1 teñido por GC1 (rojo) y APN lectina (verde) revela la expresión de GC1 en segmentos externos de los conos (revestimiento amarillo) además de en los segmentos externos de los bastones (rojo solo). Los ojos inyectados con hGRK1-mGC1 revelaron el mismo patrón;
La FIG. 13A, FIG. 13B y FIG. 13C muestran la restauración mediada por AAV de la función retiniana en ratones GCIKO. FIG. 13A: trazos fotópicos representativos (mediados por los conos) grabados a partir de ojos de ratones GCIKO tratados a ~P14 con AAV5-hGRK1-mGC1 (rojo), AAV5-smCBA-mGC1 (verde) o AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 o controles GC1 /+ isogénicos, emparejados por edad. Los trazos se generaron a los 4 meses (izquierda), 7 meses (centro) y 9 meses (derecha) después de la inyección. FIG. 13B: amplitudes de onda b de los conos promedio generadas mensualmente con un estímulo 12cds/m2 en ratones GC1KO tratados, GC1KO no tratados y ratones de control GC1 /+ isogénicos emparejados por edad. FIG. 13C: respuestas escotópicas (mediadas por bastones) en ratones GC1KO tratados frente a no tratados en el tiempo. Los valores representan la relación de amplitudes de onda b de los bastones generadas a 5 cds/m2 en ojos tratados frente a no tratados. Los tres vectores confieren terapia estable a largo plazo a los ratones GC1KO, siendo AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 el más eficiente;
La FIG. 14 muestra que los ratones GC1KO tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 7 meses después de la inyección. Los ratones tratados con AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 9 meses después de la inyección. Estos ojos además de los de unos ratones GC1 /+ de ~11 meses de edad se seccionaron y las retinas se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra GC1 (verde, flecha superior) y arrestina de los conos (rojo, flecha inferior). Los tres vectores terapéuticos condujeron la expresión de GC1 exclusivamente en los fotorreceptores de ratones GC1KO. Se observó algo de adelgazamiento retiniano en los ratones tratados con AAV5-hGRK1-mGC1, un resultado probablemente debido al alto título de este vector. La expresión de GC1 y la densidad/morfología de los conos en ratones tratados con AAV8(Y773F) y AAV5-smCBA se parecieron a las vistas en controles GC1 /+ emparejados por edad. Por el contrario, las retinas de un ratón GC1KO emparejado por edad reveló una ausencia de expresión de GC1 y una reducción marcada en la densidad celular de los conos;
La FIG. 15 muestra que a 7,5 meses después de la inyección con AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1, un ratón GCIKO se sacrificó y sus retinas se usaron para electroinmunotransferencia de Western. Los anticuerpos dirigidos contra GC1 muestran que el nivel de expresión de GC1 mediada por AAV en el ojo GC1 KO tratado son similares a las vistas en el ojo de control GC1 /+ isogénico, emparejado por edad. Los niveles de expresión de proteína que activa la guanilato ciclasa 1 (GCAP1) (un compañero bioquímico de la guanilato ciclasa) se evaluó también en los ojos GC1 KO tratados y no tratados además de los de control GC1 /+. De acuerdo con los informes anteriores, la proteína GCAP1 se reguló a la baja en los ojos GC1KO no tratados. La expresión de GC1 mediada por AAV da por resultado la expresión aumentada de GCAP1, similar a los niveles vistos en el control GC1 /+ isogénico;
La FIG. 16A y FIG. 16B muestran los resultados a 11 meses después de la inyección con AAV5-smCBA-mGC1, un ratón GC1 KO se sacrificó, sus retinas se prepararon completamente y se tiñeron con un anticuerpo producido contra la arrestina de los conos. La inmunotinción reveló que los conos están ausentes en el ojo GC1KO no tratado (FIG.
16A) excepto en la retina superior. La expresión de GC1 mediada por AAV conserva los fotorreceptores de los conos en toda la retina del ojo tratado (FIG. 16B) durante al menos 11 meses (el último punto temporal estudiado);
La FIG. 17 ilustra los datos en que los ratones GC1 KO inyectados con AAV8(733)-hGRK1 -mGC1 se sacrificaron a los 4 meses y 7 meses después de la inyección. Los ratones GC1KO inyectados con AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 7 meses y 10 meses después de la inyección. Los ratones GC1KO no tratados anteriormente, emparejados por edad se usaron como controles. Los nervios ópticos de los ojos tratados y no tratados, y partes de los cerebros derechos e izquierdos que contenían las rutas visuales se aislaron y se usaron para la recuperación de los genomas de los vectores. Notar que AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se inyectó en los ojos izquierdos de los ratones GC1KO mientras que ambos vectores AAV5 se inyectaron en los ojos derechos de los ratones GC1KO. Los genomas de los vectores se recuperaron solo de los nervios ópticos de los ojos tratados en todos los casos. A los 10 meses después de la inyección de vectores AAV5, no se recuperaron genomas de vector del cerebro. El mayor número de genomas de vector se recuperaron de los ratones GCIKO inyectados con el fuerte vector AAV8(733) de rápida actuación;
La FIG. 18A y FIG. 18B ilustran los datos en que OCT y los ERG de bastones/conos de un ratón GCdko dos meses después de la inyección con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1;
La FIG. 19A y FIG. 19B ilustran los datos en que los ERG de bastones y conos representativos de un ratón GCdko un mes después de la inyección con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1;
La FIG. 20A y FIG. 20B muestra los estándares de RT-PCR en tiempo real. La fluorescencia (unidades log en el eje Y) se representa frente a los valores Ct umbral del ciclo (eje X). Cada panel representa las curvas estándar (generadas por una serie de dilución del ADNc de la retina total) para GC1 y tránscrito Gapdh usando ADNc retiniano de cada uno de ratón GC1 /+ de tipo salvaje (a) o un ratón GC1 KO tratado con AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1. Las curvas estándar generadas por conjuntos de cebador de GC1 y Gapdh fueron paralelas usando cualquier plantilla que indica cinéticas de amplificación similares. El valor del ciclo C t aumenta con la disminución de la cantidad de plantilla;
La FIG. 21A y FIG. 21B muestran la expresión de GC1 y arrestina del cono en retinas de ratones GC1 KO tratados y no tratados y controles GC1 /+. FIG. 21A: se usó la inmunohistoquímica de secciones transversales retinianas congeladas para localizar la expresión de GC1 (verde, flecha superior) y arrestina del cono (rojo, flecha inferior) en ratones GC1KO tratados con vectores AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (7 meses después de la inyección), AAV5-smCBA-mGC1 (10 meses después de la inyección) o AAV5-hGRK1-mGC1 (10 meses después de la inyección) además de retinas de ratones GC1 KO no tratados y de control GC1 /+ de 8 meses de edad. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Todas las secciones se captaron en imágenes a amplificación 20X y se expusieron a configuraciones idénticas. FIG. 21B: la inmunotinción de preparaciones completas retinianas de un ratón GC1KO 11 meses después del tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 (solo un ojo) con un anticuerpo contra la arrestina del cono reveló la conservación marcada de los fotorreceptores de los conos en el ojo tratado (abajo derecha) en comparación con el ojo de control contralateral no tratado (abajo izquierda). Las preparaciones completas retinianas se orientaron de forma similar, con sus partes temporales en la posición 12 en punto. Las partes de las preparaciones completas se captaron en imágenes con ampliación de 10X y se mezclaron para la presentación final. OS = segmentos externos; ONL = capa nuclear externa; INL = capa nuclear interna;
La FIG. 22A y FIG. 22B muestran electrorretinogramas (ERG) mediados por conos de ojos GC1KO tratados y no tratados y control GC1 /+. FIG. 22A: trazos mediados por conos representativos obtenidos por un estímulo de luz de 12 cds/m2 de ojos GC1KO tratados con AAV5-hGRK1-mGC1 (línea roja), AAV5-smCBA-mGCI (línea verde) o AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (línea negra) u ojos de control GC1 /+ emparejados por edad no tratados. Los trazos representativos generados entre 4 meses y 1 año después del tratamiento se muestran (panel superior). Escala: eje y = 50 |uV, eje x = 20 ms. FIG. 22B: amplitudes de onda b de conos máximas (las generadas a 12 cds/m2) se calcularon de cada ratón y se promediaron mensualmente en cada grupo de tratamiento además de los controles GC1KO no tratado y GC1 /+, emparejados por edad. Se hicieron comparaciones entre grupos de animales con una n > 3. Todos los grupos de tratamiento con AAV se compararon estadísticamente durante 6 meses después del tratamiento. Los ojos tratados con vector AAV5 se compararon estadísticamente durante 9 meses después del tratamiento;
La FIG. 23A y FIG. 23B ilustran los electrorretinogramas (ERG) mediados por bastones de ojos GC1 KO tratados y no tratados y de control GC1 /+. FIG. 23A: las amplitudes de onda b de bastones (superior izquierda) y amplitudes de onda a (superior derecha) obtenidas por un estímulo de 1 cds/m2 bajo condiciones escotópicas se determinaron en los ojos tratados y no tratados de ratones GC1 KO tratados con vector AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1 (círculos negros), AAV5-hGRK1-mGC1 (círculos rojos) o AAV5-smCBA-mGC1 (triángulos verdes). Las relaciones dentro del ratón de ojos tratados y no tratados se generaron dividiendo la amplitud de onda a o b máxima en los ojos tratados por la amplitud máxima en el ojo no tratado. Estas relaciones se promediaron mensualmente en todos los grupos de tratamiento. Se hicieron comparaciones entre grupos de animales con una n > 3. Todos los grupos de tratamiento con AAV se compararon estadísticamente durante 6 meses. Los vectores AAV5 también se compararon estadísticamente durante 9 meses. La mejora mediada por el vector se definió por una relación promedio >0,8. FIG. 23B: trazos de ERG mediados por bastones representativos de un ratón GC1 KO revelan que las respuestas de los bastones del ojo tratado con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (línea negra) fueron mayores que las grabadas del ojo de control contralateral no tratado (línea verde). Esta respuesta del bastón tratado se restauró a -50% de la respuesta del bastón GC1 /+ normal (línea roja); y
La FIG. 24A y FIG. 24B muestran los niveles de proteína y tránscrito en ratones GCIKO tratados y no tratados y controles GC1 /+. FIG. 24A: electroinmunotransferencia de lisatos retinianos de un ojo de ratón GCIKO a 10 meses después del tratamiento con AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1 y sondados con anticuerpos de anti-GC1 y anti-GCAP1. El anticuerpo de anti-p-actina se usó en un control de carga interno. FIG. 24B: RT-PCR a tiempo real semicuantitativo de varios tránscritos (GC1, GCAP1, GNAT2 y PDE6a en una retina GC1 KO tratada con AAV5-smCBA-mGC1, una retina GCIKO tratada con vector AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, y en retinas de control GC1KO no tratadas o GC1 /+ individuales. Las muestras se realizaron por triplicado usando cebadores específicos de Gapdh como un patrón. Los datos se presentan como el cambio múltiplo en los niveles de ARNm respecto al control GC1 /+.
Descripción de realizaciones ilustrativas
A continuación se describen realizaciones ilustrativas de la invención. Por el interés de la claridad, no todas las características de una implementación real se describen en esta memoria. Se apreciará por supuesto que en el desarrollo de cualquier realización real dicha, deben tomarse numerosas decisiones específicas de la implementación para alcanzar los objetivos específicos de los desarrolladores, tal como el cumplimiento con las restricciones relacionadas con el sistema y relacionadas con el negocio, que variarán de una implementación a otra. Además, se apreciará que dicho esfuerzo de desarrollo sería complejo y consumidor de tiempo, pero sería sin embargo una rutina emprendida por los expertos en la técnica que tiene el beneficio de esta descripción.
Virus adeno-asociado
El virus adeno-asociado 2 (AAV) es un parvovirus humano que puede propagarse tanto como un virus lítico o como un provirus (Cukor et al., 1984; Hoggan et al., 1972). El genoma vírico consiste en un ADN monocatenario lineal (Rose et al., 1969), 4679 bases de largo (Srivastava et al., 1983), flanqueado por repeticiones terminales invertidas de 145 bases (Lusby et al., 1982). Para el crecimiento lítico AAV necesita la co-infección con un virus ayudante. O bien adenovirus (Atchinson et al., 1965; Hoggan, 1965; Parks et al., 1967) o herpes simple (Buller et al., 1981) pueden suministrar la función ayudante. Sin ayudante, no hay evidencia de replicación específica de AAV o expresión génica (Rose y Koczot, 1972; Carter el al., 1983). Cuando no hay disponible un ayudante, el AAV puede seguir como un provirus integrado (Hoggan, 1965; Berns et al., 1975; Handa et al., 1977; Cheung et al., 1980; Berns et al., 1982).
La integración aparentemente implica la recombinación entre secuencias de los extremos de AAV y el huésped y la mayoría de las secuencias de AAV permanecen intactas en el provirus. La capacidad de AAV de integrarse en el ADN del huésped es aparentemente una estrategia inherente para asegurar la supervivencia de las secuencias de AAV en ausencia del virus ayudante. Cuando las células que portan un provirus de AAV se superinfectan posteriormente con un ayudante, el genoma de AAV integrado se rescata y se da un ciclo lítico productivo (Hoggan, 1965).
Las secuencias de AAV clonadas en plásmidos procarióticos son infecciosos (Samulski et al., 1982). Por ejemplo, cuando el plásmido AAV/pBR322 tipo salvaje, pSM620, se transfecta a células humanas en presencia de adenovirus, las secuencias de AAV se rescatan del plásmido y sigue un ciclo lítico de AAV normal (Samulski et al., 1982). Esto deja posible modificar las secuencias de AAV en el plásmido recombinante y, después, hacer crecer unas reservas víricas del mutante transfectando el plásmido en células humanas (Samulski et al., 1983; Hermonat et al., 1984). El AAV contiene al menos tres regiones fenotípicamente distintas (Hermonat et al., 1984). La región rep codifica una o más proteínas que se necesitan para la replicación del ADN y para el rescate del plásmido recombinante, mientras que las regiones cap y lip parecen codificar las proteínas de la cápside de AAV y los mutantes en estas regiones son capaces de la replicación de ADN (Hermonat et al., 1984). Se ha mostrado que los extremos de AAV se necesitan para la replicación de ADN (Samulski et al., 1983).
Laughlin et al. (1983) han descrito la construcción de dos plásmidos híbridos de E. coli, cada uno de los cuales contiene el genoma de ADN entero de AAV, y la transfección de los ADN recombinantes en líneas celulares humanas en presencia del adenovirus ayudante para rescatar con éxito y replicar el genoma de AAV (véase también Tratschin et al, 1984a; 1984b).
El virus adeno-asociado (AAV) es particularmente atractivo para la transferencia génica porque no induce ninguna respuesta patógena y puede integrarse en el cromosoma celular del huésped (Kotin et al., 1990). Las repeticiones terminales (TR) de AAV son los únicos componentes cis esenciales para la integración cromosómica (Muzyczka y McLaughin, 1988). Se presenta que estas TR tienen actividad promotora (Flotte et al., 1993). Pueden promover la transferencia génica eficiente del citoplasma al núcleo o aumentar la estabilidad del ADN del plásmido y permitir la expresión génica de mayor duración (Bartlett y Samulski, 1998). Los estudios que usan ADN de plásmido recombinante que contienen TR de AAV han atraído considerable interés. Se ha mostrado que los plásmidos basados en AAV realizan una mayor y más larga expresión transgénica que los plásmidos idénticos que carecen de las TR de AAV en la mayoría de tipos celulares (Philip et al., 1994; Shafron et al., 1998; Wang et al., 1998).
Hay varios factores que provocan que los investigadores estudien la posibilidad de usar rAAV como un vector de expresión. Uno es que los requisitos para distribuir un gen para integrarse en el cromosoma huésped son sorprendentemente pocos. Es necesario tener las ITR de 145 pb, que son solo el 6% del genoma de AAV. Esto deja espacio en el vector para montar una inserción de ADN de 4,5 kb. Aunque esta capacidad para la carga puede evitar que el AAV distribuya genes grandes, se ajusta ampliamente para la distribución de constructos antisentido de la presente invención.
AAV es también una buena elección para distribuir vehículos debido a su seguridad. Hay un mecanismo de rescate relativamente complicado: no solo el adenovirus de tipo salvaje sino también los genes de AAV se necesitan para movilizar el rAAV. Asimismo, el AAV no es patógeno y no se asocia con ninguna enfermedad. La eliminación de secuencias de codificación vírica minimiza las reacciones inmunes a la expresión del gen vírico, y por lo tanto, rAAV no evoca una respuesta inflamatoria. AAV por lo tanto, representa un candidato ideal para la distribución de los polinucleótidos que codifican la guanilato ciclasa de la presente invención.
Producción de vectores rAAV
Los protocolos tradicionales para producir vectores rAAV se han basado generalmente en un sistema de tres componentes. Un componente de este sistema es un plásmido provírico que codifica el ADN recombinante para empaquetarse como rAAV. Este ADN recombinante está situado entre las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV-2 de 145 pares de bases (pb) que son las secuencias de AAV-2 que actúan en cis mínimas que dirigen la replicación y el empaquetado del vector. Un segundo componente del sistema es un plásmido que codifica los genes de AAV-2, rep y cap. El gen rep de AAV-2 codifica cuatro proteínas Rep (Rep 78, 68, 52 y 40) que actúan en trans para replicar el genoma de rAAV, resuelven intermedios replicativos, y después empaquetan los genomas de rAAV monocatenarios. El gen cap de AAV-2 codifica las tres proteínas estructurales (VP1, VP2 y VP3) que comprenden la cápside del virus. Debido a que AAV-2 no replica correctamente por sí mismo, el tercer componente de un sistema de empaquetado de rAAV es un conjunto de funciones ayudantes de otro virus de ADN. Estas funciones ayudantes crean un medio celular en que la replicación de rAAV y el empaquetado puede darse de forma eficiente. Las funciones ayudantes proporcionadas por el adenovirus (Ad) se han usado casi exclusivamente para producir rAAV y se codifican por los genes E1a, E1b, E2a, E4orf6 y VA ARN. Aunque los dos primeros componentes del sistema se introducen generalmente en células en que la replicación y empaquetado va a ocurrir por transfección, las funciones del ayudante ad se introducen por superinfección con virus Ad de tipo salvaje.
Las técnicas de producción de rAAV tradicionales están limitadas en su capacidad para producir grandes cantidades de vector debido a las ineficiencias inherentes en la transfección. También se encuentran serias dificultades cuando la escala de transfección se aumenta. El requisito por Ad de tipo salvaje puede reducir también la cantidad de rAAV producido ya que Ad puede competir por los sustratos celulares y víricos que se necesitan para la replicación vírica pero están solo presentes en cantidades limitantes. Otro problema encontrado en los protocolos de producción tradicionales es que la superinfección con Ad necesita el desarrollo de procedimientos efectivos para la purificación de Ad a partir del rAAV producido. Aunque estos procesos de purificación generalmente tienen éxito eliminando la contaminación de Ad de los preparados de rAAV, también reducen los títulos de rAAV. Los ensayos rigurosos para la contaminación de Ad de rAAV también son necesarios.
Para producir rAAV, se usa un doble procedimiento de co-transfección para introducir un plásmido de vector de transferencia de rAAV junto con pDG (Grimm et al., 1998) plásmido ayudante de AAV que porta los genes rep y cap de AAV, además de genes ayudantes Ad necesarios para la replicación de rAAV y empaquetado en una relación molar 1:1. El ADN de plásmido usado en la transfección se purifica mediante un protocolo de lisis alcalina/gradiente de CsCl convencional. La transfección se realiza como sigue: 293 células se separan 1:2 el día antes del experimento, de manera que, cuando se transfectan, la confluencia de la célula es aproximadamente 75-80%. Diez platos de 15 cm se transfectan como un lote. Para hacer precipitado de CaPO4 se mezclan 0,7 mg de pDG con 180 pg de plásmido de vector de transferencia de rAAV en un volumen total de 12,5 mL de CaCl2 0,25 M. El medio viejo se elimina de las células y la formación del precipitado de CaPO4 se inicia añadiendo 12,5 ml de 2X HBS (pH 7,05) que se ha pre­ calentado a 37°C a la disolución de ADN-CaCl2. El ADN se incuba durante 1 min; y transferir la mezcla en 200 mL de DMEM- FBS al 10% pre-calentado detiene entonces la formación del precipitado. Veintidós mL del medio se distribuyen inmediatamente en cada plato y las células se incuban a 37°C durante 48 h. El precipitado de CaPO4 se deja estar en las células durante todo el periodo de incubación sin comprometer la viabilidad celular. Cuarenta y ocho horas después de la transfección las células se recogen por centrifugado a 1.140 x g durante 10 min. Las células se lisan entonces en 15 ml de MgCl 0,15 M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) mediante 3 ciclos de congelación/descongelación en hielo seco-etanol y baños a 37°C. Se añade benzonasa (Nycomed Pharma A/S, grado puro) a la mezcla (50 U/mL de concentración final) y el lisato se incuba durante 30 min a 37°C. El lisato se clarifica por centrifugado a 3.700 x g durante 20 min y el sobrenadante que contiene el virus se purifica adicionalmente usando un gradiente de densidad discontinua.
El gradiente de la etapa discontinua típico se forma creando una capa por debajo y desplazando el lisato celular menos denso con lodixanol, 5,5’’[(2-hidroxi-1 -3-propanodiil)-bis(acetilamino)]bis[N,N’bi,(2,3-dihidroxipropil-2-4,6-triyodo-1,3-bencenocarboxamida], preparado usando una disolución estéril al 60% (p/v) de OptiPrep (Nycomed). Específicamente, 15 mL del lisato clarificado se transfieren en un tubo centrífugo de 25 x 89 mm Quick-Seal Ultra-Clear (Beckman) usando una jeringa equipada con una aguja espinal de 1/27 x 89 mm. Se tiene cuidado para evitar las burbujas, que podrían interferir con el posterior llenado y sellado del tubo. Se usa una bomba peristáltica de velocidad variable, Modelo EP-1 (Bio-Rad), para poner capas debajo en el orden: 9 mL de iodixanol al 15% y NaCl 1 M en tampón PBS-MK que contiene Rojo de fenol (2,5 pL de una disolución madre al 0,5% por ml de la disolución de iodixanol); 5 mL de iodixanol al 40% en tampón PBS-MK; y finalmente, 5 mL de iodixanol al 60% en tampón de PBS-MK que contiene rojo de fenol (0,1 pL/L). Los tubos se sellan y se centrifugan en un rotor tipo 70 Ti (Beckman) a 350.000 x g durante 1 h a 18°C. Cuatro mL de la etapa al 40% clara se aspira después de pinchar el tubo en el lado con una jeringa equipada con una aguja de calibre 18 con el bisel en la parte superior. La fracción de iodixanol se purifica adicionalmente usando cromatografía de afinidad de heparina en agarosa convencional.
Para la cromatografía, típicamente, una columna tipo I de heparina en agarosa de 2,5 mL pre-empaquetada (Sigma) se equilibra con 20 mL de PBS-MK con gravedad. La fracción de rAAV iodixanol se aplica entonces a la columna pre­ equilibrada, y la columna se lava con 10 mL de PBS-MK. Se eluye el rAAV con el mismo tampón que contiene NaCI 1 M. Después de aplicar el tampón de elución, los primeros 2 ml del eluyente se descartan, y el virus se recoge en los 3,5 mL posteriores de tampón de elución.
El virus se concentra entonces y se desala por centrifugado a través del filtro BIOMAX® 100 K (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El tampón alto en sal se cambia diluyendo repetidamente el virus concentrado con disolución de Ringer lactato, y repitiendo el título tanto de partículas que contienen genoma como partículas de rAAV infecciosas. Un ensayo de transferencia en mancha convencional, ensayo de PCR cuantitativo competitivo (QC PCR) o más recientemente PCR en tiempo real cuantitativo (aRT-PCR) se usan para determinar los títulos de partícula física (Zolotukhin et al., 2002; Jacobson et al., 2006). Los títulos infecciosos se determinan por ensayo del centro infeccioso (ICA) y ensayo de células fluorescentes (FCA), que consigue la expresión de GFP (Zolotukhin et al., 2002).
El método QC PCR se basa en co-amplificado competitivo de una secuencia diana específica con plásmido patrón interno de concentración conocida en un tubo de reacción. Proporciona una cuantificación precisa y rápida de las partículas víricas. El patrón interno debe correr por los sitios de reconocimiento del cebador con la plantilla específica. Tanto la plantilla específica como el patrón interno deben amplificarse por PCR con la misma eficiencia y debe ser posible analizar los productos amplificados por PCR de forma separada. La forma más sencilla de distinguir entre la plantilla y el patrón interno es incorporar una diferencia de tamaño en los dos productos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, construyendo patrones que tengan la misma secuencia que la diana específica pero que contengan una eliminación. La cuantificación se realiza entonces comparando la señal de PCR de la plantilla específica con la señal de PCR obtenida con concentraciones conocidas del competidor (el patrón interno). La PCR a tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) es un método estándar para evaluar la concentración de ADN de una muestra desconocida por comparación de la formación de producto de PCR en tiempo real a un patrón de ADN conocido.
La reserva vírica purificada se trata primero con DNAseI para digerir cualquier ADN no empaquetado contaminante. Diez pL de una reserva de virus purificado se incuba con 10 U de DNAseI (Boehringer Ingelheim am Rhein, Alemania) en una mezcla de reacción de 100 pL, que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM durante 1 h a 37°C. Al final de la reacción, se añadieron 10 pL de tampón 10X Proteinasa K (Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 10 mM, SDS al 1% de concentración final), seguido por la adición de 1 pL de Proteinasa K (18,6 mg/mL, Boehringer). La mezcla se incubó a 37°C durante 1 h. El ADN vírico se purificó por extracción en fenol/cloroformo (dos veces), seguido por extracción en cloroformo y precipitación en etanol usando 10 pg de glucógeno como un transporte. El granulado de ADN se disolvió en 100 pL de agua. Las mezclas de reacción de QC PCR contenían cada una 1 pL del ADN vírico diluido y diluciones en serie dos veces del ADN plásmido patrón interno, tal como pdl-GFP. El intervalo más fiable de ADN estándar se encontró que estaba entre 1 y 100 pg. Una alícuota de cada reacción se analizó entonces mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, hasta que se resolvieron dos productos de PCR. La imagen análoga de gel teñido con bromuro de etidio se digitalizó usando un sistema ImageStore 7500 (UVP; Upland, CA, EE.UU.). Las densidades de las bandas diana y competidor en cada carril se midieron usando el Sistema de Análisis de Imagen ZERO-Dscan, versión 1.0 (Scanalytics, Rockville, MD, EE.UU.) y sus relaciones se representan como una función de la concentración de ADN estándar. Una relación de 1,0, a la que el número de moléculas de ADN vírico es igual al número de moléculas de ADN competidor se usó para determinar la concentración de ADN de la reserva de virus.
Una modificación del protocolo publicado anteriormente (McLaughlin et al., 1988) se usó para medir la capacidad del virus para infectar células C12, desempaquetar y replicar. Brevemente, las células C2 que contenían genes rep y cap de wtAAV integrados (Clark et al., 1995) se pusieron en platos en un plato de 96 pocillos a una confluencia de aproximadamente 75%, después se infectaron con Ad5 a un M.O.I. de 20. Un pL de rAAV-sCNTF diluido en serie se calificó visualmente usando un microscopio de fluorescencia. Se usó un filtro núm. 41012 HighQ FITC LP CHROMA de alta sensibilidad (Chroma Technology, Bellows Fall, VA, EE.UU.) para monitorizar la fluorescencia. Para calcular el título por hibridación, las células se recogieron y se procesaron esencialmente como se describe anteriormente (McLaughlin et al., 1988).
Composiciones farmacéuticas
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a la formulación de una o más de las composiciones de rAAV-guanilato ciclasa descritas en la presente invención en disoluciones farmacéuticamente aceptables para la administración a una célula o un animal, o bien solas, o en combinación con una o más modalidades distintas de terapia.
Se entenderá también que, si se desea, las composiciones de segmento de ácido nucleico, ARN, ADN o APN que expresan un producto génico terapéutico como se describe en la presente memoria pueden administrarse en combinación con otros agentes también, tales como, p.ej., proteínas o polipéptidos o varios agentes farmacéuticamente activos, que incluyen una o más administraciones sistémicas o tópicas de polipéptidos de guanilato ciclasa. De hecho, no hay virtualmente límite para otros componentes que pueden incluirse también, dado que los agentes adicionales no provocan un efecto adverso significativo tras el contacto con las células diana o tejidos huésped. Las composiciones de guanilato ciclasa vectorizados con rAAV pueden por consiguiente distribuirse junto con otros agentes diversos como se necesite en el ejemplo particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de las células huésped u otras fuentes biológicas, o de forma alternativa pueden sintetizarse químicamente como se describe en la presente memoria. Asimismo, dichas composiciones pueden comprender además composiciones de ARN, ADN o a Pn sustituidas o derivadas.
La formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y disoluciones de transporte se conoce bien por los expertos en la técnica, como lo es el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo p.ej., administración oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intramuscular y directa a uno o más tipos de células o tejidos en el animal, que incluye por ejemplo, inyección ocular, retiniana y sub-retiniana o similares.
Típicamente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente 0,1% del compuesto activo o más, aunque el porcentaje del (de los) ingrediente(s) activo(s) puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 1 o 2% y aproximadamente 60% o 70% o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de forma tal que una dosis adecuada se obtendrá en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, vida media biológica, ruta de administración, vida útil del producto, además de otras consideraciones farmacológicas se contemplarán por un experto en la técnica de preparación de dichas formulaciones farmacéuticas, y como tal, una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento puede ser deseable.
En ciertas circunstancias será deseable distribuir las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria de forma parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal como se describe (véase p.ej., Patente de EE.UU. núm. 5.543.158; Patente de EE.UU. núm. 5.641.515 y Patente de EE.UU. núm. 5.399.363). Las disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse también en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenaje y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles (véase p.ej., Patente de EE.UU. núm. 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado que se dé la fácil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenaje y debe conservarse frente a la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El transporte puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede provocarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución se tamponaría de forma adecuada si fuera necesario y el diluyente líquido se volvería primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, se conocerá un medio acuoso estéril que puede emplearse por un experto en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de disolución de NaCl isotónica y o bien añadirse a 1000 mL de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, p.ej., Remington’s Pharmaceutical Sciences 15a Ed., páginas 1035-1038 y 1570­ 1580). Alguna variación en la dosificación se dará necesariamente dependiendo de la condición del sujeto a tratar. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, los preparados deberían cumplir la esterilidad, pirogenicidad y los patrones de seguridad y pureza generales que se requieren por la Oficina de Estándares Biológicos de la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA).
Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos ingredientes distintos como se enumera en la presente memoria, según se necesite, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que dan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución filtrada en estéril previamente de los mismos.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como disoluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.
Como se usa en la presente memoria, “transporte” incluye cualquiera de todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, disoluciones de transporte, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la técnica. Salvo en el caso en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos complementarios en las composiciones.
La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o inadecuada similar cuando se administra a un humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo se entiende bien en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, o bien como disoluciones o suspensiones líquidas; puede prepararse también formas sólidas adecuadas para la disolución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación puede también emulsionarse.
Comparación de secuencia, identidad y homología
Para la comparación de la secuencia y determinación de la homología, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia a la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros de programa del algoritmo de la secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias puede usarse entonces para calcular el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros de programa designados.
La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, p.ej., mediante el algoritmo de homología local (véase p.ej., Smith y Waterman, 1981), mediante el algoritmo de alineación de homología (véase, p.ej., Needleman y Wunsch, 1970), mediante el método de comparación de similitudes de búsqueda (véase, p.ej., Pearson y Lipman, 1988), mediante implementaciones informatizadas de algoritmos tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programa Genético de Wisconsin, Grupo Informático de Genética, Madison, WI, EEUU, o mediante inspección visual. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990) y la matriz de evaluación BLOSUM62 (véase, p.ej., Henikoff y Henikoff, 1989). El programa para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p.ej., Karlin y Altschul, 1993). Otro ejemplo de un algoritmo de alineación de secuencia útil es el programa PILEUP, que crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones emparejadas, progresivas. También puede representar un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de comparación de alineación progresiva (véase p.ej., Feng y Doolittle, 1987), y emplea una matriz de alineación general similar a la descrita por Higgins y Sharp (1989).
Kits terapéuticos y diagnósticos
La invención también incluye una o más composiciones junto con uno o más excipientes, transportes, diluyentes, adyuvantes y/u otros componentes farmacéuticamente aceptables, como pueden emplearse en la formulación de formulaciones de rAAV-guanilato ciclasa particulares, y en la preparación de agentes terapéuticos para la administración a un mamífero, y particularmente, a un humano, para una o más de las condiciones deficientes en guanilato ciclasa, tal como una distrofia retiniana como LCA1, como se describe en la presente memoria. En particular, dichos kits pueden comprender una o más composiciones de guanilato ciclasa vectorizadas con rAAV en combinación con instrucciones para usar el vector vírico en el tratamiento de dichos trastornos en un mamífero, y típicamente pueden incluir además recipientes preparados para el conveniente envasado comercial.
Como tal, los animales preferidos para la administración de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen mamíferos, y particularmente humanos. Otros animales preferidos incluyen primates no humanos, murinos, epinos, bovinos, ovinos, equinos, hircinos, lupinos, leporinos, vulpinos, porcinos, caninos, felinos y similares. La composición puede incluir composiciones de rAAV-guanilato ciclasa purificadas parcialmente o significativamente, o bien solas, o en combinación con uno o más ingredientes activos adicionales, que pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o recombinantes, o que pueden ser obtenibles de forma natural o sintetizarse químicamente, o producirse alternativamente in vitro a partir de células huésped recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican dichos ingredientes activos adicionales.
También pueden prepararse kits terapéuticos que comprenden al menos una de las composiciones descritas en la presente memoria e instrucciones para usar la composición como un agente terapéutico. Los medios receptores para dichos kits pueden comprender típicamente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio receptor, en que puede(n) ponerse la(s) composición(ones) de rAAV descrita(s), y preferiblemente hacerse alícuotas de forma adecuada. Donde se proporciona también una segunda composición de guanilato ciclasa, el kit puede contener también un segundo medio receptor distinto en el que puede ponerse esta segunda composición. De forma alternativa, la pluralidad de composiciones de guanilato ciclasa puede prepararse en una única composición farmacéutica, y puede envasarse en un único medio receptor, tal como un vial, matraz, jeringa, botella u otro medio receptor único adecuado. Los kits de la presente invención incluirán también típicamente un medio para contener el(los) vial(es) en estrecho confinamiento para la venta comercial, tal como, p.ej., recipientes de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se retiene(n) el (los) vial(es) deseado(s).
Expresión en células animales
Los inventores contemplan que un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico contigua que codifica un polipéptido de guanilato ciclasa terapéutico de la presente invención puede utilizarse para tratar uno o más defectos celulares en una célula huésped transformada. Dichas células son preferiblemente células animales, que incluyen células de mamíferos tales como las obtenidas de un humano o un primate no humano, o de una o más especies de mamíferos que incluyen sin limitación, murinos, caninos, bovinos, equinos, epinos, felinos, ovinos, hircinos, lupinos, leporinos, porcinos y similares. El uso de dichos constructos para el tratamiento y/o mejora de uno o más síntomas de una distrofia retiniana tal como LCA1, o de una enfermedad, trastorno, condición o disfunción retiniana u ocular relacionada en un sujeto humano sospechoso de sufrir dicho trastorno, o en riesgo de desarrollar dicha condición se contempla particularmente por los presentes inventores.
Las células pueden transformarse con uno o más vectores rAAV que comprenden uno o más genes de guanilato ciclasa terapéuticos de interés, de manera que el constructo genético introducido y expresado en las células huésped del animal es suficiente para alterar, reducir, mejorar o prevenir la(s) condición(ones) nociva(s) o de enfermedad o uno o más síntomas de las mismas, o bien ex vivo, in vitro, ex situ, in situ y/o in vivo.
Guanilato ciclasa
La guanilato ciclasa (GC) (EC 4.6.1.2) es una liasa que cataliza la conversión de los guanosin trifosfatos (GTP) a 3’,5’-guanosin monofosfato cíclico (cGMP) y pirofosfato. Denominada alternativamente en la bibliografía como “guanil ciclasa” o “guanilil ciclasa”, existen las formas tanto unida a membrana (tipo 1) como soluble (tipo 2) de GC.
Amaurosis congénita de Leber
La amaurosis congénita de Leber (LCA) es un grupo de enfermedades recesivas autosómicas que representan la forma más temprana y más grave de todas las distrofias retinianas hereditarias. El primer gen implicado en el comienzo de esta enfermedad genéticamente y clínicamente heterogénea, y por lo tanto asignado a la posición LCA1 fue la guanilato ciclasa específica de la retina 1 (Gucy2d) (Perrault et al., 1996). Gucy2d codifica la proteína específica retiniana guanilato ciclasa (retGC1) que se expresa predominantemente en las membranas del segmento externo del fotorreceptor y juega un papel en la regulación de los niveles de cGMP y Ca2+ en estas células. Después de la estimulación por luz, los niveles de cGMP en los segmentos externos del fotorreceptor caen rápidamente debido a la hidrólisis por cGMP fosfodiesterasa (PDE). Esta reducción de cGMP lleva al cierre de los canales cerrados por cGMP, influjo reducido de Ca2+, e hiperpolarización de la célula. Esta disminución en Ca2+ intracelular estimula la recuperación de los fotorreceptores estimulados por la luz al estado de oscuridad por medio de su interacción con las proteínas que activan la guanilato ciclasa (GCAP), una familia de proteínas unidas al calcio que regulan la actividad de GC. En el fotorreceptor adaptado a la oscuridad, las GCAP unidas a Ca2+ inhiben la actividad de GC. Tras la estimulación con luz, sin embargo, las GCAP libres de Ca2+ estimulan la actividad de GC que produce un aumento en los niveles de cGMP, una reapertura de los canales cerrados por cGMP y una vuelta de la célula a un estado despolarizado. Las mutaciones que reducen o abolen la capacidad de GC para reponer la cGMP intracelular y reabrir los canales catiónicos cerrados por cGMP, como es el caso en LCA1, se piensa que crean el equivalente bioquímico a la exposición crónica a la luz en los fotorreceptores de los bastones y conos.
Las mutaciones en Gucy2d explican ~15% de todos los casos de LCA haciéndola una de las causas principales de esta enfermedad. El número de pacientes afectados por LCA1 es aproximadamente el doble de los afectados por la versión RPE65 bien conocida de la enfermedad (LCA2), una forma por la que los ensayos de terapia génica mediada por AAV exitosos han conseguido recientemente atención mundial. El diagnóstico de LCA1 se hace típicamente en los primeros meses de vida en un bebé con ceguera total o visión enormemente alterada, electrorretinograma (ERG) extinguido y nistagmo pendular (Perrault et al., 1999; Chung y Traboulsi, 2009). A pesar de estos déficits funcionales, los pacientes de LCA1 dan fondo normal (Perrault et al., 1999) y retienen algunos fotorreceptores de bastones y conos en su retina tanto macular como periférica durante años (Milam et al., 2003; Simonelli et al., 2007; Pasadhika et al., 2009). Usando una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SDOCT) para barrer las áreas macular central y perifoveal, un estudio reciente reveló que los pacientes de LCA1 (intervalo de edad, 20-53 años) retenían todas las 6 capas retinianas con la unión del segmento interno/externo del fotorreceptor visible. El mantenimiento de la estructura retiniana en LCA1 es diferente de otras formas de la enfermedad que muestran un adelgazamiento retiniano marcado que generalmente empeora con la edad (Pasadhika et al., 2009). Aunque la conservación de la estructura de la retina no va en paralelo con la mejor agudeza visual en los pacientes de LCA1, sugiere que están mejor adaptados para futuras estrategias terapéuticas.
Modelos animales
Se han usados dos modelos animales que portan mutaciones anuladoras en el gen de retGC1 para evaluar la terapia de sustitución génica, la de pollo GUCY1*B que se da de forma natural y la de ratón inactivo en guanilato ciclasa 1 (GC1) (véase p.ej., Williams et al., 2006; Haire et al., 2006). El pollo GUCY1*B es ciego al salir del cascarón, muestra ERG escotópico (mediado por bastones) y fotópico (mediado por conos) extinguido y degeneración retiniana (véase, p.ej., Ulshafer et al.; 1984; Huang, et al., 1998; Semple-Rowland et al., 1998). La transferencia mediada por lentivirales de Gucy2d a la retina GUCY1*B restauró la visión de estos animales como se evidencia por la prueba conductual y el ERG (véase, p.ej., Williams et al., 2006). A pesar del éxito terapéutico a corto plazo, esta terapia no alcanzó la conservación de la estructura retiniana o la función a largo plazo. La naturaleza temporal de este resultado, obtenido en una especie que no es mamífero con un vector vírico integrante distribuido in ovo sugirió la necesidad de estudios traduccionales más apropiados hacia el desarrollo de la aplicación clínica.
Un modelo de mamífero de LCA1, el ratón GC1KO, muestra degeneración de fotorreceptores de los conos (véase, p.ej., Yang et al., 1999; Coleman et al.; 2004). Como en los pacientes de LCA1, la pérdida de la función de los conos en este modelo de ratón precede la degeneración de los conos (Yang et al., 1999). Además, la translocación inducida por la luz de la arrestina de los conos se interrumpe. Los fotorreceptores de los bastones en este modelo no degeneran y continúan generando respuestas eléctricas a la luz (Yang et al., 1999), un resultado probablemente debido a la presencia de GC2, un pariente cercano de GC1 en estas células (véase p.ej., Lowe et al., 1995; Yang et al., 1995; Yang y Garbers, 1997; Karan et al., 2010). La transferencia mediada por a Av de Gucy2d a la retina GC1KO post-natal restauró la translocación conducida por la luz de la arrestina de los conos en las células transducidas, pero falló al restaurar las respuestas de ERG de los conos o evitar la degeneración de los conos (Haire et al., 2006). En los estudios tanto del pollo como del ratón, que se realizaron por los mismos investigadores, el ADNc terapéutico fue de origen bovino que es la especie de proteína usada históricamente en ensayos bioquímicos que evalúan la funcionalidad de GC1 (Otto-Bruc et al., 1997; Williams et al., 2006).
Definiciones ejemplares
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende normalmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y composición similar o equivalente a las descritas en la presente memoria puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y composiciones preferidos se describen en la presente memoria. Por propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación:
De acuerdo con la convención de la ley de patentes de mucho tiempo, las palabras “un” y “una” cuando se usan en esta memoria, incluyendo las reivindicaciones, denota “uno o más”.
Como se usa en la presente memoria, el término “aproximadamente” se entendería generalmente que se refiere a ambos números en un intervalo de números. Por ejemplo, “aproximadamente 1 a 10” se entendería como “aproximadamente 1 a aproximadamente 10”. Además, se entendería que todos los intervalos numéricos en la presente memoria incluyen cada número entero completo en el intervalo, además de cada décima. El término “aproximadamente”, como se usa en la presente memoria, se entendería generalmente que significa “aproximadamente”, y típicamente se refiere a números aproximadamente iguales a un número dado enumerado en un intervalo de números. Además, se entendería que todos los intervalos numéricos en la presente memoria incluyen cada número entero completo en el intervalo.
De acuerdo con la presente invención, polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico, y similares, incluyen, aunque no están limitados a, ADN (que incluyen y no están limitados a ADN genómico o extragenómico), genes, ácidos peptidonucleicos (APN), ARN (que incluyen, aunque no están limitados a, ARNr, ARNm y ARNt), nucleósidos y segmentos de ácido nucleico adecuados o bien obtenidos de fuentes naturales, sintetizados, modificados o preparados químicamente de otra forma o sintetizados en su totalidad o en parte por la mano del hombre.
Como se usa en la presente memoria, el término “ácido nucleico” incluye uno o más tipos de: polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y cualquier otro tipo de polinucleótido es decir un N-glucósido de una base de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas (que incluyen sitios abásicos). El término “ácido nucleico”, como se usa en la presente memoria, también incluye polímeros de ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos que están unidos de forma covalente, típicamente mediante uniones fosfodiéster entre subunidades, aunque en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. “Ácidos nucleicos” incluyen ADN mono y bicatenario, además de ARN mono y bicatenario. Ácidos nucleicos ejemplares incluyen, sin limitación, ADNg; ARNnh; ARNm; ARNr; ARNt, microARN (ARNmi), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN nucleolar pequeño (ARNnop), ARN nuclear pequeño (ARNnp) y ARN temporal pequeño (ARNtp), y similares, y cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en la presente memoria, el término “segmento de ADN” se refiere a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN obtenido de una muestra biológica que usa una de las composiciones descritas en la presente memoria se refiere a uno o más segmentos de ADN que se han aislado de, o purificado libre de, ADN genómico total de la especies particulares de las que se han obtenido. Incluido en el término “segmento de ADN” están los segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, además de vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus y similares.
De forma similar, el término “segmento de ARN” se refiere a una molécula de ARN que se ha aislado libre del ARN celular total de una especie particular. Por lo tanto, los segmentos de ARN pueden referirse a uno o más segmentos de ARN (o bien de origen nativo o sintético) que se han aislado de, o purificado libres de otros ARN. Incluido en el término “segmento de ARN” están los segmentos de ARN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos.
En el contexto de la invención el término “expresión” pretende incluir la combinación de procesos intracelulares, que incluyen transcripción y traducción experimentada por un polinucleótido tal como un gen estructural para sintetizar el péptido o polipéptido codificado.
El término “p.ej.”, como se usa en la presente memoria, se usa meramente por medio de ejemplo, sin limitación prevista, y no debería construirse como refiriéndose solo a esos puntos explícitamente enumerados en la memoria.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “promotor” describa generalmente la región o regiones de una secuencia de ácido nucleico que regula la transcripción.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “elemento regulador” describa generalmente la región o regiones de una secuencia de ácido nucleico que regula la transcripción. Elementos reguladores ejemplares incluyen, aunque no están limitados a potenciadores, elementos post-transcripcionales, secuencias de control transcripcional y similares.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “gen estructural” describa generalmente un polinucleótido, tal como un gen, que se expresa para producir un péptido, polipéptido, proteína, ribozima, molécula de ARN catalítica o molécula antisentido, codificada.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “transformación” generalmente describa un proceso para introducir una secuencia de polinucleótido exógena (p.ej., un vector vírico, un plásmido, o una molécula de ADN o ARN recombinante) en una célula huésped o protoplasto en que el polinucleótido exógeno se incorpora en al menos un primer cromosoma o es capaz de replicación autónoma en la célula huésped transformada. La transfección, electroporación y absorción de ácido nucleico “desnudo” representan todos ejemplos de técnicas usadas para transformar una célula huésped con uno o más polinucleótidos.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “célula transformada” signifique una célula huésped cuyo complemento de ácido nucleico se ha alterado por la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en esa célula.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “célula transgénica” generalmente signifique cualquier célula que se deriva o regenera de una célula transformada o derivada de otra célula transgénica, o de la progenie o descendencia de cualquier generación de dicha célula huésped transformada o transgénica.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “vector” generalmente signifique una molécula de ácido nucleico (típicamente comprendida de ADN) capaz de replicación en una célula huésped y/o a la que otro segmento de ácido nucleico puede unirse de forma operativa para provocar la replicación del segmento unido. Un plásmido, cósmido o un virus es un vector ejemplar.
Los términos “esencialmente corresponde a”, “esencialmente homólogo” o “identidad sustancial” como se usan en la presente memoria indica una característica de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, en los que una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos seleccionada tiene al menos aproximadamente 70 a aproximadamente 75 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de referencia seleccionada. Más típicamente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia tendrán al menos aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84 o incluso aproximadamente 85 por ciento de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 95% por ciento o más de identidad de secuencia. Más preferiblemente aún, las secuencias altamente homólogas a menudo comparten más de al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia a la que se comparó. El porcentaje de identidad de secuencia puede calcularse sobre la longitud entera de las secuencias a comparar, o puede calcularse excluyendo pequeñas eliminaciones o adiciones cuyo total es menor que aproximadamente 25 por ciento o así de la secuencia de referencia elegida. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, tal como una parte de un gen o secuencia de flanqueo o una parte repetitiva de un cromosoma.
Sin embargo, en el caso de homología de secuencia de dos o más secuencias de polinucleótidos, la secuencia de referencia y la secuencia diana comprenderán típicamente al menos aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos idénticos contiguos, más típicamente al menos aproximadamente 26 a aproximadamente 35 nucleótidos contiguos que son idénticos, e incluso más típicamente al menos aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o incluso aproximadamente 100 o así nucleótidos contiguos que son idénticos. De forma deseable, cuyos fragmentos altamente homólogos se desean, la extensión del porcentaje total de identidad de secuencia entre dos secuencias dadas será al menos aproximadamente idénticas al 80% preferiblemente al menos aproximadamente idénticas al 85%, y más preferiblemente aproximadamente idénticas al 90%, aproximadamente idénticas al 91%, aproximadamente idénticas al 92%, aproximadamente idénticas al 93%, aproximadamente idénticas al 94% o incluso aproximadamente idénticas al 95% o más, como se determina fácilmente por uno o más de los algoritmos de comparación de secuencias bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como, p.ej., el análisis por el programa FASTA descrito por Pearson y Lipman (1988).
Los términos “idéntico” o porcentaje “de identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (u otros algoritmos disponibles para expertos) o por inspección visual.
La frase “esencialmente idénticos” en el contexto de dos ácidos nucleicos se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 90%, preferiblemente 91%, lo más preferiblemente aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 98,5%, aproximadamente 99%, aproximadamente 99,1%, aproximadamente 99,2%, aproximadamente 99,3%, aproximadamente 99,4%, aproximadamente 99,5%, aproximadamente 99,6%, aproximadamente 99,7%, aproximadamente 99,8% o aproximadamente 99,9% o más de identidad de residuos de nucleótidos, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia, como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual. Dichas secuencias “esencialmente idénticas” se consideran típicamente “homólogas” sin referencia a ascendencia real.
El término “que se da de forma natural” como se usa en la presente memoria como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto pueden encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por la mano del hombre en un laboratorio se da de forma natural. Como se usa en la presente memoria, las cepas de laboratorio de roedores que pueden haberse criado de forma selectiva según la genética clásica se consideran animales que se dan de forma natural.
Como se usa en la presente memoria, un “heterólogo” se define en relación a una secuencia génica referenciada predeterminada. Por ejemplo, con respecto a una secuencia génica estructural, un promotor heterólogo se define como un promotor que no se da de forma natural adyacente al gen estructural referenciado, sino que se coloca por manipulación en laboratorio. Asimismo, un gen o segmento de ácido nucleico heterólogo se define como un gen o segmento que no se da de forma natural adyacente al promotor referenciado y/o elementos potenciadores.
Como se usa en la presente memoria, el término “homología” se refiere a un grado de complementariedad entre dos o más secuencias de polinucleótido o polipéptido. La palabra “identidad” puede sustituirse por la palabra “homología” cuando una primera secuencia de ácido nucleico o aminoácidos tiene la secuencia primaria exactamente igual que una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácidos. La homología de secuencia e identidad de secuencia puede determinarse analizando dos o más secuencias que usan algoritmos y programas informáticos conocidos en la técnica. Dichos métodos pueden usarse para evaluar si una secuencia dada es idéntica u homóloga a otra secuencia seleccionada.
Como se usa en la presente memoria, “homólogo” significa, cuando se refiere a polinucleótidos, secuencias que tienen la misma secuencia de nucleótidos esencial, a pesar de surgir de diferentes orígenes. Típicamente, las secuencias de ácido nucleico homólogas se derivan de genes relacionados estrechamente u organismos que poseen una o más secuencias genómicas esencialmente similares. En contraste, un polinucleótido “análogo” es uno que comparte la misma función con un polinucleótido de una especie u organismo diferente, pero tienen una secuencia de nucleótidos primaria significativamente diferente que codifica una o más proteínas o polipéptidos que cumplen funciones similares o poseen actividad biológica similar. Los polinucleótidos análogos pueden derivarse a menudo de dos o más organismos que no están estrechamente relacionados (p.ej., o bien genéticamente o filogenéticamente).
Como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido” pretende incluir un “polipéptido” singular además de “polipéptidos” en plural, e incluye cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos. Por consiguiente, como se usa en la presente memoria, los términos que incluyen, aunque no están limitados a “péptido”, “dipéptido”, “tripéptido”, “proteína”, “enzima”, “cadena de aminoácidos” y “secuencia de aminoácidos contiguos” se incluyen todos en la definición de un “polipéptido” y el término “polipéptido” puede usarse en vez de, o de forma intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término incluye además polipéptidos que han experimentado una o más modificación(ones) post-traduccional(es), que incluyen por ejemplo, aunque no están limitados a, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización, escisión proteolítica, procesado post-traducción, o modificación por inclusión de uno o más aminoácidos que se dan de forma no natural. Existe una nomenclatura convencional en la técnica para estructuras de polinucleótidos y polipéptidos. Por ejemplo, abreviaturas de una letra y tres letras se emplean ampliamente para describir aminoácidos: alanina (A; Ala), arginina (R; Arg), asparagina (N; Asn), ácido aspártico (D; Asp), cisteína (C; Cys), glutamina (Q; Gln); ácido glutámico (E; Glu), glicina (G; Gly), histidina (H; His), isoleucina (I; Ile), leucina (L; Leu), metionina (M; Met), fenilalanina (F, Phe), prolina (P; Pro), serina (S; Ser), treonina (T; Thr), triptófano (W; Trp), tirosina (Y; Tyr), valina (V; Val) y lisina (K; Lys). Los residuos de aminoácidos descritos en la presente memoria se prefiere que estén en la forma isomérica “L”. Sin embargo, los residuos en la forma isomérica “D” pueden sustituirse por cualquier residuo L-aminoácido con tal que se retengan las propiedades deseadas de los polipéptidos.
“Proteína” se usa en la presente memoria de forma intercambiable con “péptido” y “polipéptido” e incluye tanto péptidos como polipéptidos producidos de forma sintética, recombinante o in vitro y los péptidos y polipéptidos expresados in vivo después de las secuencias de ácido nucleico se administran en un animal o sujeto humano huésped. El término “polipéptido” pretende preferiblemente referirse a todas las longitudes de cadena de aminoácidos, incluyendo las de péptidos cortos de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 residuos de aminoácido de longitud, oligopéptidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido de longitud, y polipéptidos de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 o más residuos de aminoácidos de longitud. El término “secuencia”, cuando se refiere a aminoácidos, se refiere a toda o una parte del orden N-terminal a C-terminal lineal de aminoácidos con una cadena de aminoácidos dada, p.ej., polipéptido o proteína; “sub-secuencia” significa cualquier alargamiento consecutivo de aminoácidos en una secuencia, p.ej., al menos 3 aminoácidos consecutivos en una proteína o secuencia de polipéptido dada. Con referencia a cadenas de nucleótidos y polinucleótidos, “secuencia” y “sub-secuencia” tienen significados similares en relación con el orden 5’ a 3’ de nucleótidos.
Como se usa en la presente memoria, el término “esencialmente homólogo” incluye dos o más secuencias biomoleculares que son significativamente similares la una a la otra en el nivel de secuencia de nucleótidos primaria. Por ejemplo, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, “esencialmente homólogo” puede referirse a al menos aproximadamente 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 80% y más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente idénticas al 97%, más preferiblemente al menos aproximadamente idénticas al 98%, más preferiblemente al menos aproximadamente idénticas al 99%, e incluso más preferiblemente aún, enteramente idénticas (es decir, 100% o “invariante”).
Asimismo, como se usa en la presente memoria, el término “esencialmente idéntico” incluye dos o más secuencias biomoleculares (y en particular secuencias de polinucleótido) que muestran un alto grado de identidad la una con la otra al nivel de nucleótidos. Por ejemplo, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, “esencialmente idénticas” puede referirse a secuencias que son al menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 85% o al menos aproximadamente 90% idénticas la una a la otra, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente 97% idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 98% idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 99% idénticas, e incluso más preferiblemente aún, totalmente idénticas (es decir, 100% idénticas o “no degeneradas”).
El término “recombinante” indica que el material (p.ej., un polinucleótido o un polipéptido) se ha alterado artificialmente o sintéticamente (no de forma natural) por la intervención humana. La alteración puede realizarse en el material en o eliminado de, su medio o estado natural. Específicamente, p.ej., una secuencia promotora es “recombinante” cuando se produce por la expresión de un segmento de ácido nucleico manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, un “ácido nucleico recombinante” es uno que está hecho recombinando ácidos nucleicos, p.ej., durante la clonación, barajado de ADN u otros procedimientos, o mediante mutagénesis química u otra; un “polipéptido recombinante” o “proteína recombinante” es un polipéptido o proteína que se produce por expresión de un ácido nucleico recombinante; y un “virus recombinante”, p.ej., un virus AAV recombinante, se produce mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante.
Como se usa en la presente memoria, el término “unido de forma operable” se refiere a una unión de dos o más polinucleótidos o dos o más secuencias de ácido nucleico en una relación funcional. Un ácido nucleico se “une de forma operable” cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido de forma operable a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia de codificación. “Unido de forma operable” significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son típicamente contiguas, o esencialmente contiguas, y, donde es necesario unir dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en marco de lectura. Como los potenciadores generalmente funcionan cuando están separados del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables; sin embargo, algunos elementos de polinucleótido pueden estar unidos de forma operable aunque no sean contiguos.
“Elemento regulador transcripcional” se refiere a una secuencia de polinucleótidos que activa la transcripción solo o en combinación con una o más secuencias de ácidos nucleicos distintos. Un elemento regulador transcripcional puede, por ejemplo, comprender uno o más promotores, uno o más elementos de respuesta, uno o más elementos reguladores negativos, y/o uno o más potenciadores.
Como se usa en la presente memoria, un “sitio de reconocimiento del factor de transcripción” y un “sitio de unión al factor de transcripción” se refiere a una(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) o motivo(s) de secuencia que se identifican como que son sitios para la interacción específica con la secuencia de uno o más factores de transcripción, tomando frecuentemente la forma de unión de ADN-proteína directa. Típicamente, los sitios de unión al factor de transcripción pueden identificarse por la huella de ADN, ensayos de desplazamiento de movilidad en gel, y similares, y/o pueden predecirse en base a los motivos de secuencia de consenso conocidos, o por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.
“Unidad transcripcional” se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende al menos un primer gen estructural unido de forma operable a al menos una primera secuencia promotora que actúa en cis y opcionalmente unido de forma operable a una o más secuencias de ácido nucleico que actúan en cis distintas necesarias para la eficiente transcripción de las secuencias génicas estructurales, y al menos un primer elemento regulador distal como puede necesitarse para la transcripción específica de tejido y de desarrollo apropiada de la secuencia génica estructural situada de forma operable bajo el control del promotor y/o elementos potenciadores, además de cualquier secuencia en cis adicional que sean necesarias para la transcripción y traducción eficiente (p.ej., sitio(s) de poliadenilación, secuencia(s) de control de estabilidad del ARNm, etc.
El término “esencialmente complementario”, cuando se usa para definir las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, significa que una secuencia particular, por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos, es esencialmente complementaria a toda o una parte de la secuencia seleccionada, y por consiguiente se unirá específicamente a una parte de un ARNm que codifica la secuencia seleccionada. Como tal, típicamente las secuencias serán altamente complementarias a la secuencia “diana” de ARNm, y tendrán no más de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, o aproximadamente 10 o así desapareamientos de base a lo largo de la parte complementaria de la secuencia. En muchos ejemplos, puede ser deseable para las secuencias ser apareamientos exactos, es decir, ser completamente complementarios a la secuencia a la que el oligonucleótido se une específicamente, y por lo tanto no tener ningún desapareamiento a lo largo del alargamiento complementario. Como tal, las secuencias altamente complementarias se unirán típicamente bastante específicamente a la región de secuencia diana del ARNm y por lo tanto serán altamente eficientes en la reducción, y/o incluso inhibición de la traducción de la secuencia de ARNm diana en el producto polipeptídico.
Las secuencias de ácido nucleico esencialmente complementarias serán mayores que aproximadamente el 80 por ciento complementarias (o “% de apareamiento exacto”) a una secuencia diana de ácido nucleico correspondiente al que el ácido nucleico se une específicamente, y serán, más preferiblemente mayores que aproximadamente 85 por ciento complementarias a la secuencia diana correspondiente a la que el ácido nucleico se une específicamente. En ciertos aspectos, como se describe anteriormente, será deseable tener secuencias de ácido nucleico incluso más esencialmente complementarias para usar en la práctica de la invención, y en dichos ejemplos, las secuencias de ácido nucleico serán más que aproximadamente 90 por ciento complementarias a la secuencia diana correspondiente a la que el ácido nucleico se une específicamente, y puede en ciertas realizaciones ser mayor que aproximadamente 95 por ciento complementaria a la secuencia diana correspondiente a la que el ácido nucleico se une específicamente, e incluso hasta e incluyendo aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% e incluso aproximadamente 100% de apareamiento exacto complementario a toda o una parte de la secuencia diana a la que el ácido nucleico designado se une específicamente.
El porcentaje de similitud o porcentaje complementario de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas puede determinarse, por ejemplo, comparando información de la secuencia usando el programa informático GAP, versión 6.0, disponible del Grupo Informático de Genética de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (1970). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación pesada de Gribskov y Burgess (1986), (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos finales.
Como se usa en la presente memoria, los términos “proteína”, “polipéptido” y “péptido” se usan de forma intercambiable, e incluyen moléculas que incluyen al menos un enlace amida que une dos o más residuos de aminoácido. Aunque se usan de forma intercambiable, en general, un péptido es una molécula relativamente corta (p.ej., de 2 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido de longitud), mientras que una proteína o un polipéptido es un polímero relativamente más largo (p.ej., 100 o más residuos de longitud). Sin embargo, a menos que se defina específicamente por una longitud de cadena, los términos péptido, polipéptido y proteína se usan de forma intercambiable.
Como se usa en la presente memoria, el término “paciente” (también denominado de forma intercambiable como “huésped” o “sujeto”) se refiere a cualquier huésped que pueda servir como un receptor para una o más de las composiciones de guanilato ciclasa basada en rAAV como se trata en la presente memoria. En ciertos aspectos, el receptor será un animal vertebrado, que pretende indicar cualquier especie animal (y preferiblemente, una especie de mamífero tal como un ser humano). En ciertas realizaciones, un “paciente” se refiere a cualquier huésped animal, que incluyen aunque no están limitados a, humanos y primates no humanos, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, corvinos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, murinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos y similares, que incluyen, sin limitación, ganado doméstico, animales de pastoreo o migratorios, especímenes exóticos o zoológicos, además de animales de compañía, mascotas y cualquier animal bajo el cuidado de un veterinario.
Como se usa en la presente memoria, el término “transporte” pretende incluir cualquier disolvente(s), medio de dispersión, recubrimiento(s), diluyente(s), tampón(ones), agente(s) isotónico(s), disolución(ones), suspensión(ones), coloide(s), inerte(s) o similares, o una combinación de los mismos que es farmacéuticamente aceptable para la administración al animal relevante o aceptable para un propósito diagnóstico, como sea aplicable. El uso de uno o más vehículos de distribución para constructos de terapia génica, partículas víricas, vectores y similares, se conoce bien por los expertos en las técnicas farmacéutica y molecular. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en composiciones profilácticas y/o terapéuticas. Uno o más ingrediente(s) activo(s) complementario(s) puede también incorporarse, o administrarse en asociación con, una o más de las composiciones descritas.
Como se usa en la presente memoria, “una cantidad efectiva” se entendería por el experto en la técnica que proporciona un efecto terapéutico, profiláctico o beneficioso de otra forma a un paciente receptor.
Las frases “aislado” o “biológicamente puro” se refiere al material que está sustancialmente, o esencialmente, libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. Por consiguiente, los polinucleótidos aislados de acuerdo con la invención preferiblemente no contienen materiales asociados normalmente con los polinucleótidos en su medio natural, o in situ.
“Conectar” o “unir” se refiere a cualquier método conocido en la técnica para conectar de forma funcional una o más proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, o polinucleótidos, que incluyen, sin limitación, fusión recombinante, enlace covalente, enlace disulfuro, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace electrostático, y similares.
Como se usa en la presente memoria, el término “plásmido” o “vector” se refiere a un constructo genético que está compuesto de material genético (es decir, ácidos nucleicos). Típicamente, un plásmido o un vector contiene un origen de replicación que es funcional en células huésped bacterianas, p.ej., Escherichia coli, y marcadores seleccionables para detectar células huésped bacterianas que incluyen el plásmido. Los plásmidos y vectores de la presente invención pueden incluir uno o más elementos genéticos como se describen en la presente memoria, dispuestos de manera que una secuencia de codificación insertada puede transcribirse y traducirse en unas células de expresión adecuada. Además, el plásmido o vector puede incluir uno o más segmentos de ácido nucleico, genes, promotores, potenciadores, activadores, regiones de clonación múltiple, o cualquier combinación de los mismos, incluyendo segmentos que se obtienen a partir de o se derivan de una o más fuentes naturales y/o artificiales.
El término “una secuencia esencialmente como se presenta en la SEQ ID NO:X” significa que la secuencia corresponde esencialmente a una parte de SEQ ID NO:X y tiene relativamente pocos nucleótidos (o aminoácidos en el caso de secuencias de polipéptido) que no son idénticos a, o un equivalente biológicamente funcional de, los nucleótidos (o aminoácidos) de SEQ ID NO:X. El término “equivalente biológicamente funcional” se entiende bien en la técnica, y se define adicionalmente en detalle en la presente memoria. Por consiguiente, las secuencias que tienen aproximadamente 85% a aproximadamente 90%; o más preferiblemente, aproximadamente 91% a aproximadamente 95%; o incluso más preferiblemente, aproximadamente 96% a aproximadamente 99%; de nucleótidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a una o más de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria se contemplan particularmente que son útiles en la práctica de la invención.
Las condiciones de hibridación estándar adecuadas para la presente invención incluyen, por ejemplo, la hibridación en 50% de formamida, 5x de disolución de Denhardts, 5 x de SSC, fosfato sódico 25 mM, SDS al 0,1% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42°C durante 16 h seguido por 1 h de lavados secuenciales con 0,1x de SSC, disolución de SDS al 0,1% a 60°C para eliminar la cantidad deseada de señal de fondo. Las condiciones de hibridación de menor severidad para la presente invención incluyen, por ejemplo, hibridación en formamida al 35%, 5x de disolución de Denhardts, 5x de SSC, fosfato sódico 25 mM, SDS al 0,1% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado o ADN de E. coli a 42°C durante 16 h seguido por lavados secuenciales con 0,8x de SSC, SDS al 0,1% a 552C. Los expertos en la técnica reconocerán que las condiciones pueden ajustarse fácilmente para obtener el nivel deseado de severidad.
De forma natural, la presente invención también incluye segmentos de ácido nucleico que son complementarios, esencialmente complementarios y/o sustancialmente complementarios a al menos una o más de las secuencias de nucleótidos específicas presentadas de forma específica en la presente memoria. Las secuencias de ácido nucleico que son “complementarias” son aquellas que son capaces de apareamiento de bases según las reglas de complementariedad de Watson-Crick estándar. Como se usa en la presente memoria, el término “secuencias complementarias” significa secuencias de ácido nucleico que son esencialmente complementarias, como puede evaluarse por la misma comparación de nucleótidos presentada anteriormente, o como se define como que son capaces de hibridar con uno o más de los segmentos de ácido nucleico específico descritos en la presente memoria bajo condiciones relativamente severas tales como las descritas inmediatamente antes.
Como se describe anteriormente, las sondas y cebadores de la presente invención pueden ser de cualquier longitud. Asignando valores numéricos a una secuencia, por ejemplo, el primer residuo es 1, el segundo residuo es 2, etc., puede proponerse un algoritmo que define todas las sondas y cebadores contenidos en una secuencia dada:
n a n y, donde n es un número entero de 1 al último número de la secuencia e y es la longitud de la sonda o cebador menos uno, donde n y no excede el último número de la secuencia. Por consiguiente, para una sonda o cebador de 25 pares de bases (es decir, un “25-mer”), la colección de sondas y cebadores corresponden a las bases 1 a 25, bases 2 a 26, bases 3 a 27, bases 4 a 28, etcétera en la longitud entera de la secuencia. De forma similar, para una sonda o cebador de 35 pares de bases (es decir, un “35-mer”), la secuencia de cebador o sonda ejemplar incluye, sin limitación, secuencias que corresponden a las bases 1 a 35, bases 2 a 36, bases 3 a 37, bases 4 a 38, etcétera en la longitud completa de la secuencia. Asimismo, para 40-mer, dichas sondas y cebadores pueden corresponder a los nucleótidos del primer par de bases al pb 40, del segundo pb de la secuencia al pb 41, del tercer pb al pb 42, etcétera, mientras que para 50-mer, dichas sondas o cebadores pueden corresponder a una secuencia de nucleótidos que se extiende del pb 1 al pb 50, del pb 2 al pb 51, del pb 3 a pb 52, del pb 4 al pb 53, etcétera.
En ciertas realizaciones, será ventajoso emplear uno o más segmentos de ácido nucleico de la presente invención en combinación con un marcador detectable apropiado (es decir, una “etiqueta”), tal como en el caso de emplear sondas de polinucleótido marcadas en la determinación de la presencia de una secuencia diana dada en un ensayo de hibridación. Una amplia variedad de compuestos y composiciones indicadores apropiados se conocen en la técnica para marcar las sondas de oligonucleótido, que incluyen, sin limitación, ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, etc., que son capaces de detectarse en un ensayo adecuado. En realizaciones particulares, se puede emplear también una o más etiquetas fluorescentes o una marca enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en vez de reactivos radioactivos u otros reactivos medioambientalmente menos deseables. En el caso de marcas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos, cromogénicos o fluorigénicos que pueden emplearse para proporcionar un método para detectar la muestra que es visible al ojo humano, o por métodos analíticos tales como escintigrafía, fluorimetría, espectrofotometría, y similares, para identificar la hibridación específica con muestras que contienen una o más secuencias de ácido nucleico complementarias o sustancialmente complementarias. En el caso de los denominados ensayos “de multiplexación”, donde dos o más sondas etiquetadas se detectan o simultáneamente o secuencialmente, puede ser deseable etiquetar una primera sonda de oligonucleótidos con una primera etiqueta que tiene una primera propiedad o parámetro de detección (por ejemplo, un máximo espectral de emisión y/o excitación), que también etiquetó una segunda sonda de oligonucleótido con una segunda etiqueta que tiene una segunda propiedad o parámetro de detección que es diferente (es decir, discreto o discernible de la primera etiqueta). El uso de ensayos de multiplexación, particularmente en el contexto de protocolos de amplificación/detección genética se conoce bien por los expertos en las técnicas de genética molecular.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Se apreciaría por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y por consiguiente puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica.
Ejemplo 1 - La terapia génica mediada por AAV restaura la función visual y el comportamiento para un modelo de ratón de LCA1
En este ejemplo, los inventores evaluaron si la distribución de una versión de retGC1 específica para la especie (es decir, murino) a células del cono del ratón GC1KO post-natal podrían restaurar la función a estas células. Se usaron vectores AAV de serotipo 5 para distribuir mGC1 a los fotorreceptores de ratones GC1KO 14 días después del nacimiento (P14). Se usaron el electrorretinograma (ERG) y la prueba conductual para evaluar la función visual y se usó la inmunocitoquímica para examinar la expresión transgénica terapéutica, la localización de arrestina del cono y las densidades del fotorreceptor del cono en los ojos tratados y no tratados.
Este ejemplo demuestra que un vector AAV distribuido de forma sub-retiniana a un ojo de ratones GC1KO P14 facilitó la expresión de retGC1 tipo salvaje, la restauración de la función visual y el comportamiento y la conservación de los fotorreceptores del cono. Cuatro semanas después de la inyección, se analizó la función visual (ERG) en ojos tratados y no tratados. El ERG se realizó cada dos semanas a partir de ahí hasta 3 meses después de la inyección (el último punto temporal evaluado). Los ratones con respuestas al ERG positivas además de ratones de control tipo salvaje isogénicos y no inyectados se evaluaron para la restauración del comportamiento visual usando la prueba de reflejo optocinético. A los 3 meses después de la inyección, todos los animales se sacrificaron y sus retinas tratadas y no tratadas se evaluaron para la expresión de GC1 y la localización de arrestina del cono.
Los resultados también confirman que la función mediada por los conos se restauró en los ojos tratados de ratones GC1 KO (las amplitudes de ERG fueron ~60% de las normales). Además, el efecto del tratamiento fue estable durante al menos 3 meses después de la administración. La prueba conductual reveló fuertes mejoras en el comportamiento visual mediado por los conos, siendo las respuestas de los ratones tratados similares o idénticas a las de los ratones de tipo salvaje. La histología reveló la expresión de GC1 mediada por AAV en los fotorreceptores y una restauración de la translocación de arrestina en los conos en ratones tratados. Además, las densidades celulares en los conos fueron mayores en los ojos tratados que en los controles contralaterales no tratados. Este resultado sugiere que el tratamiento es capaz de conservar los fotorreceptores de los conos durante al menos de tres meses después del tratamiento. Esta es la primera demostración de que la terapia génica postnatal es capaz de restaurar la función visual y el comportamiento, y conservar la estructura retiniana en, un modelo mamífero de LCA1. De forma importante, se obtuvieron resultados usando un vector AAV bien caracterizado, clínicamente relevante; los datos del modelo animal in vivo así obtenidos proporcionan la fundación de un vector de terapia génica basado en AAV para el tratamiento de niños afectados con LCA1.
Materiales y métodos:
Animales experimentales:
Se sacaron embriones heterocigotos GC1 /- de una reserva crioconservada en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.). Los heterocigotos se aparearon en las instalaciones de los inventores para producir descendencia GC1 KO (-/-) y de control /+ isogénica. Todos los ratones se criaron y mantuvieron en una instalación centralizada en la institución de los inventores en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. La comida y el agua estuvieron disponibles ad libitum. Todos los estudios animales se aprobaron por el Comité de Cuidado y Uso Animal Institucional local y se realizaron de acuerdo con la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y las regulaciones NIH.
Construcción de vectores AAV:
Los vectores de virus adeno-asociados del serotipo 5 (AAV5) se usaron para distribuir GC1 murino (mGC1) ya que se ha mostrado que presentan fuerte eficiencia de transducción y un comienzo más rápido de la expresión en los fotorreceptores retinianos que de otros serotipos de AAV (Yang et al., 2002). Se seleccionaron tanto un promotor específico de la célula como uno ubicuo para conducir la expresión de mGC1. El receptor acoplado a proteína G quinasa 1 (GRK1), específico de la célula, también conocido como promotor de rodopsina quinasa, se eligió por su capacidad para dirigir específicamente una expresión transgénica fuerte en fotorreceptores de bastones y conos cuando se usa en conjunto con AAV (Khani et al., 2007). El promotor smCBA ubicuo que muestra un patrón de expresión similar a CBA de longitud completa en la retina se eligió por su capacidad de dirigir eficientemente la retina neural (Haire et al., 2006). La reacción de cadena polimerasa que utiliza el siguiente cebador directo:
5'-AAAAGCGGCCGCATGAGCGCTTGGCTCCTGCCAGCC-3' (SEQ ID NO:14) y el siguiente cebador inverso:
5'-AAAAGCGGCCGCTCACTTCCCAGTAAACTGGCCTGG-3' (SEQ ID NO:15) se usó para amplificar mGC1 desde un plásmido que contiene una fusión mGC1 -eGFP (Bhowmick et al., 2009). El fragmento resultante se clonó en el plásmido pCRblunt (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y la secuencia se verificó. El plásmido del vector AAV que contiene smCBA que conduce la expresión de mGC1 (pTR-smCBA-mGCI) se creó sustituyendo el CBA de longitud completa con smCBA en el plásmido pTR-CBSB-hRPE65 (Jacobson et al., 2006) por medio de digestión ecoRI y posterior ligado. Posteriormente, hRPE65 se sustituyó con mGC1 por medio de digestión Notí y ligado, dando por resultado la creación de pTR-smCBA-mGC1 (FIG. 11). Un plásmido de vector AAV que contiene promotor GRK1 humano que conduce la expresión de mGC1, pTR-GRK1 -mGC1 se creó eliminando hGFP de pTR-hGRKI-hGFP (Beltran et al., 2010) y sustituyéndolo con mGC1 por medio de digestión Not\ y ligado (FIG. 11). Los vectores AAV se empaquetaron según los métodos publicados previamente (Haire et al., 2006). Las partículas víricas se suspendieron de nuevo en la Solución Salina Equilibrada (Alcon, Fort Worth, TX, EE.UU.) y se titularon por PCR a tiempo real cuantitativa (Jacobson et al., 2006). Los títulos resultantes fueron 4,69 x 1012 genomas víricos por mL (vg/mL) y 4,12 x 1013 vg/mL para AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1 -mGC1, respectivamente.
Inyecciones sub-retinianas:
Un gL de AAV5-GRK1-mGC1 (4,12 x 1010 genomas de vector distribuidos) o AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 x 109 genomas de vector distribuidos) se distribuyeron de forma sub-retiniana en el día 14 después del nacimiento (P14) en el ojo derecho de cada ratón GC1KO, dejando el ojo izquierdo como un control contralateral. Las inyecciones subretinianas se realizaron como se describe anteriormente (Timmers et al., 2001; Pang et al., 2006). Se realizó un análisis adicional solo en animales que recibieron inyecciones comparables con éxito (>60% de desprendimiento de retina y complicaciones mínimas). Está bien establecido que el área de desprendimiento de retina corresponde al área de transducción vírica (Cideciyan et al., 2008; Timmers et al., 2001).
Análisis electrorretinográfico:
Los electrorretinogramas (ERG) de GC1KO tratados (n=14) y controles /+ isogénicos (n=2) se grabaron usando una unidad de control y grabación basada en PC (Toennies Multiliner Vision; Jaeger/Toennies, Hochberg, Alemania) según métodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Haire et al., 2006). Las medidas de ERG iniciales se grabaron a las 4 semanas después de la inyección, y cada 2 semanas posteriores a partir de ahí, hasta los 3 meses después de la inyección (el último punto temporal evaluado en el estudio). Los controles isogénicos /+ emparejados por edad se grabaron junto con los animales tratados en cada punto temporal. Los ratones se adaptaron a la oscuridad toda la noche (más de 12 horas) y se anestesiaron con una mezcla de 100 mg/kg de ketamina, 20 mg/kg de xilazina y solución salina en una relación 1:1:5, respectivamente. Las pupilas se dilataron con tropicamida al 1% e hidrocloruro de fenilefrina al 2,5%. Se usó un baño de agua circulante caliente para mantener la temperatura corporal a 38°C. Se aplicó hidroxipropilmetilcelulosa al 2,5% en cada ojo para evitar la deshidratación de la córnea. Se grabaron los ERG de campo completo usando electrodos de la córnea de bucle de alambre de oro, a medida. Se pusieron los electrodos de referencia y de tierra de forma subcutánea entre los ojos y en la cola, respectivamente. Las grabaciones de los bastones escotópicos se obtuvieron con una serie de destellos blancos de siete intensidades en aumento (0,01 mcds/m2 a 5 cds/m2). Los intervalos entre estímulos para los estímulos de baja intensidad fueron de 1,1 segundos. A las tres intensidades mayores (100 mcds/m2, 1 cds/m2 y 5 cds/m2), los intervalos entre estímulos fueron 2,5, 5,0 y 20,0 segundos, respectivamente. Se grabaron diez respuestas y se promediaron en cada intensidad. Los ratones se adaptaron después a la luz a un fondo blanco de 100 cds/m2 durante 2 min. Las respuestas de los conos fotópicas se obtuvieron con una serie de cinco intensidades de luz en aumento (100 mcds/m2 a 12 cds/m2). Se grabaron cincuenta respuestas y se promediaron en cada intensidad. Todos los estímulos se presentaron en presencia del fondo de 100 cds/m2. Las amplitudes de onda B se definieron como la diferencia entre los puntos mínimos de la onda a los picos positivos de cada onda.
Las amplitudes máximas de onda b fotópica (las generadas a 12 cds/m2) de todos los ratones GC1KO tratados con smCBA-mGC1 (n = 6) y tratados con hGRK1 -mGC1 (n = 8) (ojos tratados o no tratados) y de control /+ isogénico se promediaron y se usaron para general errores estándar. Estos cálculos se hicieron en cada punto temporal (4 semanas - 13 semanas después de la inyección). Estos datos se importaron a Sigma Plot para una presentación gráfica final. La prueba t apareada se usó para calcular los valores P entre los ojos tratados y no tratados en cada grupo de promotor (smCBA o hGRK1) y entre cada grupo promotor en el tiempo (4 semanas después de la inyección frente a 3 meses después de la inyección). La prueba t estándar se usó para calcular los valores P entre los ojos tratados con smCBA-mGC1 frente a hGRK1-mGC1. Se definió la diferencia significativa como un valor P <0,05. Debido a que algunos de los ratones de cada grupo tratado se quitaron temporalmente del estudio para análisis conductuales, el número total de ratones promediados y presentados en cada punto temporal en la FIG. 2A y la FIG. 2B difiere. Tres ratones del grupo tratado con smCBA-mGCI se enviaron para la prueba optomotora, dejando un “n” de 3 ratones usados para el análisis de ERG durante las medidas de 8, 10 y 12 semanas (FIG. 2A). Dos ratones del grupo tratado con hGRK1-mGC1 se enviaron para la prueba optomotora, dejando un “n” de 6 usados para el análisis de ERG durante las medidas de 6, 8, 10 y 12 semanas (FIG. 2B). Todos los ratones enviados para el análisis conductual se midieron a las 13 semanas después de la inyección tras su vuelta a los laboratorios de los inventores (smCBA-mGC1: n = 3, hGRK1-mGC1: n = 2) después de completar los análisis conductuales.
Prueba optomotora:
Las agudezas visuales fotópicas y las sensibilidades al contraste de ojos de ratón GC1KO tratados y no tratados se midieron usando un paradigma de elección forzada de dos alternativas como se describe anteriormente (véase p.ej., Umino et al., 2008; Alexander et al., 2007). Para probar la sensibilidad de los ojos individuales del mismo animal se aprovechó el hecho de que la visión del ratón tiene un mínimo solapamiento binocular y que el ojo izquierdo es más sensible a la rotación en el sentido de las agujas del reloj y el derecho a la rotación en contra del sentido de las agujas del reloj (Douglas et al., 2005). Por consiguiente en el protocolo optomotor “separado al azar” de los inventores, la agudeza de cada ojo y el umbral de sensibilidad al contraste se determinó de forma separada y de forma simultánea por medio de funciones escalonadas para corregir las respuestas en las direcciones tanto en el sentido de las agujas del reloj como en contra del sentido de las agujas del reloj. La detección correcta de los patrones que rotan en la dirección de las agujas del reloj se condujo principalmente mediante señales visuales que se originan en el ojo izquierdo y las respuestas correctas en la dirección contraria a las agujas del reloj se derivaron de las señales visuales que se originan en el ojo derecho. La agudeza se definió como la mayor frecuencia espacial (100% de contraste) que da una respuesta umbral, y la sensibilidad al contraste se definió como 100 dividido por el porcentaje más bajo de contraste que da una respuesta umbral. Para la agudeza fotópica, el estímulo inicial fue un patrón sinusoidal de 0,200 ciclos/grado con un contraste fijo al 100%. Para medidas de sensibilidad de contraste fotópico, el patrón inicial se presentó al 100% de contraste, con una frecuencia espacial fija de 0,128 ciclos/grado. La visión fotópica se midió a una luminancia media de 70 cd/m2. Las agudezas visuales y las sensibilidades al contraste se midieron para ambos ojos de cada ratón de cuatro a seis veces durante un periodo de 1 semana. Los animales de control /+ isogénicos, emparejados por edad (M1, M2) y los ratones GC1KO no tratados anteriormente (M3, M4) se presentan junto con los ratones tratados con smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) y tratados con hGRK1-mGC1 (M8, M9) en la FIG. 3. Las amplitudes de ERG mediadas por los conos generadas a partir de estímulos de 12 cds/m2 de todos los ratones (M1-M9) se presentan junto con los resultados conductuales. Las pruebas t desapareadas se realizaron en valores de agudeza y porcentaje de contraste para determinar la significancia de los resultados.
Preparación del tejido:
Tres meses después de la inyección, los ratones GC1KO tratado a P14 y los controles /+ isogénicos emparejados por edad se adaptaron a la oscuridad durante 2 h. Inmediatamente después de la adaptación a la oscuridad, los ratones se sacrificaron bajo luz roja tenue (>650 nm). El limbo de ojos inyectados y no inyectados se marcó con una aguja caliente en la posición 12:00, facilitando la orientación. La enucleación se realizó bajo luz roja tenue y los ojos se colocaron inmediatamente en paraformaldehído al 4%. Los ojos que se iban a usar para la criosección se prepararon según los métodos descritos anteriormente (Haire et al., 2006). Brevemente, las córneas se quitaron de cada ojo, dejando las lentes dentro de la copa ocular restante. Se hizo un pequeño corte en forma de “V” en la esclerótica adyacente al limbo quemado para mantener la orientación. Después de la fijación toda la noche, la lente y el vítreo se eliminaron. La copa ocular que contenía la retina/RPE restante se colocó en sacarosa al 30% en PBS durante al menos 1 h a 4°C. Las copas oculares se pusieron después en compuesto criostático (Tissue Tek OCT 4583; Sakura Finetek, Inc., Torrance, CA, EE.UU.) y se congelaron instantáneamente en un baño de hielo seco/etanol. Los ojos se seccionaron en serie a 10 gm con un criostato (Microtome HM550; Walldorf, Alemania). Los ojos que se iban a usar para el análisis de preparación completa se prepararon según los métodos descritos anteriormente (Pang et al., 2010). Se alcanzó la orientación como se menciona anteriormente. Después de la fijación toda la noche, la córnea, lente, vítreo y el epitelio pigmentario de la retina se eliminaron de cada ojo sin alterar la retina. Se hizo un corte en la parte superior (dorsal) de la retina adyacente al limbo original quemado para mantener la orientación.
Inmunohistoquímica y microscopía:
Las criosecciones retinianas y las preparaciones completas se lavaron 3 x en 1X PBS. Después de estos lavados, las muestras se incubaron en Triton X-100® al 0,5% durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Después, las muestras se bloquearon en una disolución de albúmina de suero bovino (ASB) al 1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones retinianas se incubaron toda la noche a 37°C con un anticuerpo GC1 policlonal de conejo (1:200, sc-50512, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA, EE.UU.) o anticuerpo de arrestina de conos policlonal de conejo (“Lumij” 1:1000, proporcionado por Dr. Cheryl Craft, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA, EE.UU.) diluido en Triton X-100® al 0,3%/ASB al 1%. Las preparaciones completas retinianas se incubaron toda la noche a temperatura ambiente con el mismo anticuerpo de arrestina de los conos, diluido al 1:1000 en Triton X-100® al 0,3%/ASB al 1%. Después de la incubación primaria, las secciones retinianas y las preparaciones completas se lavaron 3X con 1X PBS.
Las secciones retinianas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios de IgG marcados con fluoróforo Alexa-594 o Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.), diluido a 1:500 en 1X PBS. Después de la incubación con anticuerpos secundarios, las secciones y preparaciones completas se lavaron con 1X PBS. Las secciones retinianas se contratiñeron con 4’,6’-diamino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. Después de un enjuague final con 1X PBS y agua, las secciones se montaron en un medio con base acuosa (DAKO) y se pusieron en un portaobjetos. Las preparaciones completas retinianas se orientaron en portaobjetos con la parte superior (dorsal) de la retina colocada en la posición 12:00. Las muestras se montaron en DAKO y se pusieron en un portaobjetos.
Las secciones retinianas se analizaron con microscopía confocal (Microscopio confocal espectral TCS SP2 AOBS Leica equipado con el programa LCS versión 2.61, Build 1537, (Bannockburn, IL, EE.UU.). Todas las imágenes se tomaron con configuraciones de exposición idénticas con ampliación o 20x o 63x. Las longitudes de onda de excitación usadas para las tinciones DAPI, GC1 y de arrestina de los conos fueron a 405 nm, 488 nm y 594 nm, respectivamente. Los espectros de emisión fueron 440-470 nm, 500-535 nm y 605-660 nm, respectivamente. Las preparaciones completas retinianas se analizaron con un microscopio fluorescente de campo completo (Axioplan 2) (Zeiss, Thornwood, NY, EE.UU.) equipado con una Cámara QImaging Retiga 4000R y el programa QImaging QCapture Pro (QImaging, Inc., Surrey, BC, Canadá). Los cuadrantes de cada preparación completa se captaron en imágenes a 5x con configuraciones de exposición idénticas y después se juntaron en Photoshop® (Versión 7.0) (Adobe, San José, CA, EE.UU.).
Análisis de la imagen:
Las densidades de los fotorreceptores de los conos se analizaron en las preparaciones completas retinianas contando las células etiquetadas con fluoróforo secundario dirigido contra el anticuerpo de arrestina de los conos en la retina central e inferior usando el programa ImageJ® (Institutos nacionales de la salud, Bethesda, MD, EE.UU.). Estos valores se obtuvieron haciendo zoom en los archivos 5X TIFF mostrados en la FIG. 6. Se pusieron cinco cuadrados (500 gm2) sobre áreas idénticas en la retina central e inferior de los ojos GC1KO tanto tratados como no tratados. Para la retina central, los cuadrados se colocaron a una excentricidad igual alrededor de la cabeza del nervio óptico en todos los ojos (125 gm). Los fotorreceptores de los conos se contaron en cada área retiniana respectiva, los valores se promediaron y las desviaciones estándar se calcularon. La prueba t estándar se usó para calcular los valores P entre las muestras deseadas. La diferencia significativa se definió como un valor P <0,05.
Resultados
La función del fotorreceptor (ERG) se restauró en ratones GC1KO tratados con AAV:
Se presentó anteriormente que las respuestas de los conos en el ratón GC1KO son apenas detectables 1 al mes de edad. Aquí los inventores han mostrado que el tratamiento P14 de este ratón con un vector AAV que porta el gen GC1 de ratón bajo el control del promotor específico del fotorreceptor (hGRK1) o ubicuo (smCBA) llevó a la restauración sustancial de la función del fotorreceptor de los conos como se mide por el ERG. Las trazos de conos representativos (FIG. 1) (además de las amplitudes de onda b fotópicas promedio (FIG. 2A y FIG. 2B) de tratados con hGRK1 -mGC1, tratados con smCBA-mGCI, GC1KO y controles /+ isogénicos) mostraron que la función de los conos en los ojos tratados se restauró a aproximadamente el 45% de lo normal a las cuatro semanas después de la inyección. Similar a los informes anteriores, las respuestas de los conos en ojos contralaterales, no tratados, se extirparon en este punto temporal. A las 4 semanas después de la inyección, la amplitud de onda b mediada por los conos promedio en los ojos tratados con smCBA-mGCI (65,1 gV) fue significativamente mayor (P = 0,006) que la de los ojos no tratados (3,9 gV). La amplitud de onda b mediada por los conos promedio en ojos tratados con hGRK1-mGC1 (59,1 gV) fue significativamente mayor (P <0,001) que en los ojos no tratados (3,2 gV). El nivel de restauración alcanzado cuatro semanas después de la distribución del vector hGRK1-mGC1 específico del fotorreceptor no fue significativamente diferente del alcanzado con el vector smCBA-mGC1 que contiene promotor ubicuo (P = 0,604). A los 3 meses después de la inyección, la amplitud de onda b mediada por los conos promedio en ojos tratados con smCBA-mGC1 (53,3 gV) fue significativamente mayor (P < 0,001) que la de los ojos no tratados (2,8 gV). La amplitud de onda b mediada por conos promedio en ojos tratados con hGRK1-mGC1 (45,3 gV) fue significativamente mayor (P < 0,001) que la de los ojos no tratados (3,4 gV). El nivel de restauración alcanzado 3 meses después de la distribución del vector GRK1-mGC1 específico del fotorreceptor no fue significativamente diferente del alcanzado con el vector smCBA-mGC1 que contiene promotor ubicuo (P = 0,331). Ambos promotores dieron niveles similares de restauración funcional de los conos en los ojos tratados del ratón GC1 KO en el corto plazo. De forma importante, la restauración de la función del fotorreceptor de los conos permaneció estable durante 3 meses (el último punto temporal evaluado en este estudio (véase FIG. 1, FIG. 2A y FIG. 2B). No hubo una diferencia significativa en las amplitudes de onda b fotópicas de los ojos tratados con smCBA-mGC1 o tratados con hGRK1-mGC1 entre las 4 semanas y los 3 meses después del tratamiento (P = 0,174 y 0,125, respectivamente).
Los tiempos implícitos de ERG que son una característica importante en el diagnóstico de varios trastornos retinianos que incluyen otras formas de LCA (Sun et al., 2010) también se determinaron. Aunque no se puede obtener dicha medida de un ojo GC1 KO (no hay respuestas de ERG en estos ojos), fue posible comparar los tiempos implícitos de onda b de los conos en ratones tratados con AAV-mGC1 y de control /+ isogénicos. A las 4 semanas después de la inyección, no había diferencia significativa entre los tiempos implícitos de onda b de los conos en los ojos tratados y de control /+ (P=0,884); los valores promedio en los ojos tratados con AAV-mGC1 y /+ en este punto temporal fueron 50,8 ms y 50,4 ms, respectivamente. A los 3 meses después de la inyección, no hubo tampoco una diferencia significativa entre los dos grupos (P=0,697); los promedios de todos los tiempos implícitos de onda b de los conos en los ojos tratados y de control /+ fueron 59,7 ms y 58,3 ms, respectivamente. Las cinéticas de respuesta de los conos en la retina GC1 KO tratada (como se determina por medidas de tiempo implícito) parecieron ser normales y estables en el corto plazo.
Se presentó anteriormente que los ERG de bastones en el ratón GC1 KO muestran alteraciones 1 al mes de edad, con la onda a y la onda b de los bastones marcadamente reducidas (Yang et al.,1999). Esta reducción se estabiliza a los 5 meses de edad con respuestas aproximadamente al 50-70% de la del ratón tipo salvaje (WT). Aunque algunos ejemplos de mejoras mediadas por AAV-mGC1 se observaron en los ojos tratados de ratones GC1KO respecto a controles no tratados (ejemplo visto en la FIG. 1), este resultado no fue tan consistente como el visto en las respuestas mediadas por los conos.
El comportamiento visual se restauró en ratones GC1 KO tratados con AAV:
El análisis optomotor reveló que los ojos de ratones GC1KO tratados tanto con smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) como con hGRK1-mGC1 (M8, M9) respondieron significativamente mejor que los ojos no tratados bajo todas las condiciones mediadas por los conos, fotópicas. Los ojos GC1KO no tratados rindieron pobremente con una agudeza visual de 0,163 ± 0,040 ciclos por grado (FIG. 3B y FIG. 3C, barra, media ± de, n = 9 ojos). Los ojos de control GC1+/+ isogénicos (M1, M2) responden significativamente mejor, mostrando una agudeza promedio de 0,418 ± 0,046 ciclos por grado (n = 4 ojos). Los ojos tratados con AAV-mGC1 (M5-M9) tienen una agudeza promedio de 0,392 ± 0,077 ciclos por grado (n = 5 ojos), un nivel esencialmente idéntico a los ojos /+ de control y significativamente mejor que los ojos GC1 KO no tratados (P<0,0001). Las sensibilidades al contraste fotópicas (FIG. 3B y FIG. 3C) fueron en paralelo a los resultados de agudeza fotópica, mostrando los ojos tratados con AAV-mGC1 (sensibilidad al contraste de 11,9 ± 7,37, n= 5 ojos) umbrales de contraste casi idénticos a los ratones /+ (11,94 ± 3,03, n = 4 ojos). De nuevo, los ojos GC1 KO tratados a P14 con AAV-mGC1 rindieron significativamente mejor que los ojos no tratados, que mostraron una sensibilidad al contraste promedio de 1,27 ± 0,31 (n = 9, P< 0,0001). En todas las pruebas fotópicas, los ojos GC1KO no tratados rindieron de forma extremadamente pobre, esencialmente equivalente a ninguna función mediada por los conos. Las comparaciones estadísticas de estas medidas se muestran en la Tabla 1. Las trazos de ERG mediados por conos de todos los ratones GC1+/+ (M1, M2), GC1KO (M3, M4), tratados con smCBA-mGC1 (M5, M5, M7) y tratados con hGRK1-mGC1 (M8, M9) usados en el análisis conductual se muestran en la FIG. 3A para relacionar la función visual (comportamiento optomotor) con la función retiniana (electrofisiología).
La función retiniana de los bastones (ERG) se conserva parcialmente en el ratón GC1 KO. Los estudios han mostrado que incluso amplitudes de ERG muy pequeñas se traducen en fuertes comportamientos visuales (Williams et al., 2006). De hecho, se encontró que los pacientes de LCA2 que recibieron terapia de AAV-RPE65 muestran restauración conductual a pesar de la completa carencia de respuesta de ERG (Maguire et al., 2008). La prueba optomotora reveló que las agudezas visuales mediadas por los bastones, escotópicas, y las sensibilidades al contraste de los ojos GC1KO son muy similares a los controles /+. Por esta razón, fue imposible comparar la restauración visual de los ojos tratados frente a no tratados a un nivel conductual. Las comparaciones estadísticas de estas medidas se muestran en la Tabla 1:
Tabla 1
Comparación estadística de las funciones visuales fotópicas de ojos WT, CG1KO tratados con AAV-mGC1 y no tratados como se miden por el comportamiento optomotor
Agudeza fotópica Tipo salvaje (WT) Tratado No tratado Número de valores 4 5 9 Media 0,4183 0,3919 0,163 Desviación estándar 0,0456 0,07731 0,03954
Valor P
WT frente a tratado 0,5671 No significativo WT frente a no tratado <0,0001 * Tratado frente a no tratado <0,0001 * Sensibilidad al contraste WT Tratado No tratado fotópica
Número de valores 4 5 9 Media 11,94 11,16 1,27 Desviación estándar 3,03 7,37 0,31
Valor P
WT frente a tratado 0,4186 No significativo WT frente a no tratado <0,0001 * Tratado frente a no tratado <0,0001 *
*= p < 0,0001
Tanto los promotores específicos del fotorreceptor como ubicuos conducen la expresión transgénica de mGC1 en los bastones y conos de los ratones GC1 KO:
La deficiencia de GC1 afecta a los fotorreceptores tanto de los bastones como de los conos en pacientes de LCA1. El promotor RK humano específico de fotorreceptor y el promotor smCBA ubicuo se eligieron por tanto para este estudio como un medio de dirigir ambos tipos celulares. El promotor RK humano se eligió por su pequeño tamaño y capacidad para conducir de forma eficiente la expresión transgénica específicamente en las células del fotorreceptor. La inmunotinción de las retinas GC1KO 3 meses después del tratamiento con AAV-hGRK1-mGC1 reveló que este promotor condujo una fuerte expresión de GC1 en los segmentos externos del fotorreceptor. Una imagen representativa de una sección transversal de la retina a partir de un ojo inyectado con este vector terapéutico (FIG.
4A) muestra una intensa tinción de GC1 en la capa OS mientras el ojo no tratado contralateral del mismo ratón carece de ninguna expresión de GC1 (FIG. 4B). El promotor smCBA también condujo de forma eficiente la expresión de GC1 en las células fotorreceptoras. Los OS del fotorreceptor mostraron una fuerte expresión de GC1 mediada por smCBA en los ojos tratados (FIG. 4C), respecto al ojo no tratado contralateral (FIG. 4D). Los niveles de expresión de GC1 mediada por hGRK1 y smCBA se aproximaron a los vistos en los ojos de control /+ isogénicos (FIG. 4E). La expresión de GC1 en ojos tratados con hGRK1-mGC1 se restringió a los OS. En los ojos tratados con smCBA-mGC1, la expresión de GC1 se encontró ocasionalmente en los cuerpos celulares del fotorreceptor de la capa nuclear externa (véase p.ej., las flechas de la FIG. 4F). Notablemente sin embargo, ningún constructo promotor condujo la expresión de GC1 terapéutico fuera de las células del fotorreceptor. Esta falta de expresión fuera del objetivo es relevante para el desarrollo de futuras aplicaciones clínicas.
La translocación de arrestina de los conos se restauró en los ratones GC1 KO tratados con AAV-mGC1:
El tratamiento con AAV-mGC1 restauró la translocación de arrestina de los conos inducida por la luz a los fotorreceptores de los conos en la retina GC1KO tratada. Las secciones transversales de retina tratada, no tratada y /+ representativas inmunoteñidas con un anticuerpo generado contra la arrestina de los conos mostró que la arrestina de los conos estaba localizada en los segmentos externos, segmentos internos, axones y terminaciones sinápticas de los fotorreceptores de los conos /+, tratados con smCBA-mGCI y tratados con hGRK1-mGC1 (FIG. 5A, FIG. 5C y FIG. 5D, respectivamente). Por el contrario, la arrestina de los conos permaneció localizada principalmente en los segmentos externos de los conos en retina GC1 KO no tratadas (FIG. 5B). Este resultado fue coherente con la noción de que los conos de la retina del ratón GC1 KO están hiperpolarizados de forma crónica. No fue solo una restauración de la localización de la arrestina de los conos en las retinas tratadas, adaptadas a la oscuridad, observadas, sino que se vio una sobre-regulación aparente de la proteína en los ojos tratados respecto a controles no tratados. De forma significativa, las densidades celulares en los conos también parecieron mayores en los ojos tratados respecto a los controles no tratados (véase p.ej., FIG. 5A, FIG. 5B y FIG. 5C).
Los fotorreceptores de los conos se conservaron en ratones GC1 KO tratados con AAV-mGC1:
El análisis de preparaciones completas de retinas contralaterales tratadas con smCBA-mGC1 y hGRK-mGC1 y no inyectadas 3 meses después de la inyección con vector terapéutico que se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra la arrestina del cono reveló que los fotorreceptores del cono se conservaron como resultado del tratamiento con el vector terapéutico (FIG. 6). Los conteos de fotorreceptores de los conos en las retinas inferior y central de las preparaciones completas retinianas tanto tratadas como no tratadas revelaron que había una diferencia estadísticamente significativa en las densidades celulares de conos de los ojos tratados frente a no tratados. Este resultado fue coherente con la observación de que fue claramente evidente una restauración fuerte electrofisiológica y conductual. El tratamiento P14 de ratones GC1 KO con cualquier constructo terapéutico fue capaz de conservar la estructura de los fotorreceptores de los conos durante al menos tres meses.
Ejemplo 2 - El modelo animal que contiene una doble inactivación GC1/GC2
Es importante notar que aunque solo los fotorreceptores de los conos están afectados en el ratón GC1 KO (los bastones solo pierden la función parcial y no degeneran), los paciente de LCA1 muestran pérdida de función de los bastones y degeneración de los bastones. Se especula que la razón para esta diferencia es una diferencia específica de la especie en dependencia con GC2, un pariente cercano de GC1 que se expresa en los fotorreceptores de los bastones. Los bastones de ratón son capaces de funcionar en ausencia de GC1 presumiblemente porque GC2 es capaz de actividad reconstitutiva; sin embargo este no es el caso en humanos. Se necesita GC1para la función de los bastones, de ahí la degeneración de los bastones. Un modelo de ratón con doble inactivación GC1/GC2 se generó y se mostró que tenía pérdida de función de los bastones (además de la pérdida de función de los conos como se ve en el GC1 K/O) (Baehr et al., 2007). Se probó a través de estudios bioquímicos con este modelo que GC2 es el que proporciona la función a los bastones en ausencia de GC1. Habiendo dicho esto, es el ratón con doble inactivación GC1/GC2 el que imita de manera más fiable la condición humana (tanto conos como bastones afectados) (Karan et al., 2010). Para probar los vectores tanto rAAV-smCBA-mGCI como rAAV-hGRK1 -mGC1 en el ratón con doble inactivación GC1/GC2, los vectores rAAV se distribuyen precisamente de la misma manera y tiempo (día 14 después del nacimiento) que con el estudio de inactivación de GC1 mencionado anteriormente. El análisis de la restauración de la visión, tanto fisiológicamente como conductualmente, también se realiza de la misma manera a como se describe anteriormente para el estudio de inactivación de GC1. Se pone un énfasis particular a las respuestas escotópicas (es decir, bastones), ya que se espera una recuperación medible de la función de los bastones en los ratones con doble inactivación GC1/GC2 tratados con un constructo del vector GC1.
Ejemplo 3 - Modelo animal murino “humanizado” de LCA1
Este ejemplo describe la creación de un modelo animal murino “humanizado” de LCA1. En una realización, el modelo de ratón contiene una desactivación GC1/GC2/GCAP1. GCAP1 es la proteína que activa GC1. Para crear un sistema in vivo en que el GC1 humano expresado a partir de un vector rAAV de grado clínico diseñado para usar en humanos pueda evaluarse para la función, se utiliza un ratón transgénico hGCAP1 con triple desactivación GC1/GC2/GCAP1. En este ratón, la función visual se restaura mediante hGC1 mediado por rAAV que interactúa solo con hGCAP1 (es decir, no está presente GCAP1 murino endógeno). A partir de este estudio, es posible determinar si la proteína GCAP1 humana se necesita para estimular la actividad GC1 humana en el modelo de ratón, y si la función puede restaurarse a los conos y bastones cuando los dos polipéptidos humanos se reconstituyen y se expresan en el modelo no humano (es decir, murino) de la enfermedad. Para generar el ratón transgénico hGCAP1 con triple desactivación de GC1/GC2/GCAP1 el ratón con doble desactivación GC1/GC2 (Baehr et al., 2007) se cruza con el ratón con desactivación GCAP1 (Méndez et al., 2001). El GCAP1 humano se expresa entonces de forma transgénica en el modelo animal para generar un ratón transgénico hGCAP1 con triple inactivación GC1/GC2/GCAP1. Los estudios en que se proporciona hGC1 vectorizado con rAAV a estos animales se realiza de una manera esencialmente idéntica a los métodos usados en el estudio de inactivación de GC1. El análisis de restauración de la visión, tanto fisiológicamente como conductualmente, se realiza entonces de la misma manera que se llevó a cabo en el estudio de inactivación de GC1.
Ejemplo 4 - Constructos de vector ejemplares útiles en la práctica de la invención
Los mapas de los dos vectores ilustrativos se muestran en la FIG. 11. Uno contiene el promotor no específico smCBA y el otro tiene el promotor limitado a bastones/conos GRK1. Ambos se han empaquetado en AAV serotipo 5. Todas las dosis de vector probadas hasta la fecha son seguras en la retina del ratón. Cohortes de ratones GC1 -/- se inyectaron entonces de forma sub-retiniana el día 14 después del nacimiento (P14) y después se analizaron periódicamente por ERG y mediante el comportamiento optocinético fotópico (mediado por los conos). Como el ratón GC1-/- mantiene un ERG mediado por los bastones, la monitorización del rescate funcional se enfocó primeramente en la restauración de la función de los conos. Para el vector smCBA los ERG se evaluaron a las 4 semanas después del tratamiento y cada 2 semanas a partir de ahí hasta las 12-13 semanas después del tratamiento. Los 9 ojos tratados en 9 ratones respondieron al tratamiento. Los resultados, mostrados a continuación demuestran una restauración significativa de las amplitudes de ERG fotópicas a partir de esencialmente no grabables en ojos no tratados de control a aproximadamente 50% de lo normal en ojos tratados con vector compañero.
Cuatro ratones GC1-/- se analizaron entonces mediante el comportamiento optocinético escotópico para diferencias mediadas por ojos compañeros tratados frente a no tratados (mostrado a continuación). Los cuatro ojos tratados (289, 290, 294, 295, barras rojas) mostraron una mejora significativa en la agudeza visual sobre sus ojos de control, y tres de los cuatro mostraron sensibilidad al contraste significativamente mejorada. Los ratones 297 y 298 eran controles tipo salvaje, y el ratón 299 era un ratón GC1-/- no tratado. Los resultados demuestran que el vector consiguió la restauración funcional y conductual de la visión mediada por los conos en el modelo animal de LCA1.
Para el vector GRK1 que limita la expresión de los bastones y los conos, los ERG se evaluaron en 14 ratones GC1-/-tratados en un ojo a las 4 semanas después del tratamiento y cada 2 semanas a partir de ahí hasta las 12-13 semanas después del tratamiento. Doce de los 14 ojos tratados en 12 animales respondieron. Los resultados (mostrados a continuación) revelaron una significativa restauración de amplitudes de ERG fotópicas a partir de esencialmente no grabables en los ojos no tratados de control a aproximadamente 40% de lo normal en ojos tratados con vector compañero.
Un ratón GC1-/-(núm. 293) se analizó entonces por el comportamiento optocinético escotópico para las diferencias en ojos compañeros tratados frente a no tratados (mostrado anteriormente). Este ratón mostró una mejora significativa tanto en agudeza visual como sensibilidad al contraste en el ojo derecho tratado con vector (barra roja) respecto a su ojo izquierdo de control (barra azul). Las respuestas fueron casi equivalentes a los ratones tipo salvaje de control (297 y 298) y mejoradas significativamente sobre un ratón GC1 -/- no tratado (299). Se concluyó por lo tanto que el vector GRK1 también alcanza la restauración funcional y conductual de la visión mediada por los conos en este modelo de LCA1.
Ejemplo 5 - La fijación como objetivo del cono específico de wtGC1 mejora el rescate
Los datos presentados anteriormente demuestran claramente que la función del cono y el comportamiento mediado por los conos puede rescatarse con el promotor GRK1 limitado a bastones/conos. Como la LCA1 humana muestra déficits tanto de bastones como de conos (a diferencia del ratón GC1-/- que muestra principalmente déficits de conos), la expresión no necesita limitarse más para conseguir la especificidad del cono pura. Sin embargo, hay un fenotipo de cono final en el modelo de ratón que es importante estudiar: en condiciones adaptadas a la oscuridad, la arrestina del cono no se mueve normalmente desde los segmentos externos del cono a los segmentos internos, axones y terminaciones sinápticas como lo hace en la retina de tipo salvaje. Los estudios se realizaron por tanto para evaluar si el fenotipo biológico celular se corrigió también en ojos GC1-/- tratados con vector. En los resultados mostrados, un ratón GC1-/- se trató en un ojo con el vector GRK1, después a las 7 semanas después de la inyección el ratón se adaptó a la oscuridad. Las retinas tratada (panel inferior) y de control (panel superior) se analizaron entonces para la localización de la arrestina de los conos mediante inmunohistoquímica. En la retina GC1-/- no tratada (panel superior), la arrestina del cono permaneció en gran medida en los segmentos externos del cono (OS) y la capa sináptica (SL). En contraste, en la retina tratada contralateral (panel inferior) una fracción sustancial (~50%) ha translocado a los segmentos internos y las terminaciones sinápticas. Se concluyó, por lo tanto, que el tratamiento con vector también restauró la correcta translocación de la arrestina de los conos.
Ejemplo 6 - Terapia a largo plazo de LCA1 usando constructos genéticos vectorizados con rAAV
Los ejemplos anteriores han demostrado que la inyección sub-retiniana de vectores rAAV que contienen ADNc de GC1 murino (conducido por el promotor tanto de rodopsina quinasa [hGRK1] humana específica del fotorreceptor como ubicuo [smCBA]) fueron capaces de restaurar la función mediada por los conos y el comportamiento visual y conservar los fotorreceptores de los conos en el ratón GC1KO durante al menos tres meses.
En el presente ejemplo, los inventores evaluaron si la terapia a largo plazo era también alcanzable en el modelo de roedor de LCA1. Adicionalmente, los inventores examinaron si la distribución de GC1 a los fotorreceptores del ratón de doble inactivación GC1/GC2 (GCdko), un modelo que muestra pérdida de estructura y función tanto de bastones como de conos y se parece fenotípicamente a la LCA1 humana, daría terapia a estas células.
Métodos
Las inyecciones sub-retinianas de AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 o el mutante altamente eficiente de tirosina de la cápside AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se realizaron en un ojo de ratones GC1KO o GCdko entre el día 14 después del nacimiento (P14) y P25. La función del fotorreceptor de bastones y conos se evaluó electrorretinográficamente. La localización de la expresión de GC1 terapéutica y la extensión de la conservación del fotorreceptor de los conos se determinaron por inmunohistoquímica. Los estudios de biodistribución se usaron para evaluar la presencia de los genomas del vector en los nervios ópticos y los cerebros de los animales tratados.
Resultados
La función del fotorreceptor de los conos se restauró en los ratones GC1KO tratados con todos los vectores, siendo el AAV8(733) el más eficiente. Las respuestas fueron estables durante al menos 10 meses después del tratamiento. Se encontró GC1 terapéutico en los segmentos externos del fotorreceptor. Durante 10 meses después de la inyección, se detectaron genomas de vectores AAV5 y AAV8(733) solo en los nervios ópticos de los ojos tratados de los ratones GC1 KO. mGC1 vectorizado con AAV8(733) restauró la función tanto en bastones como en conos en ratones GCdko tratados.
Conclusión
La terapia a largo plazo se consigue en un modelo de mamífero de deficiencia de GC1, el ratón GC1 KO, usando los constructos de vector rAAV descritos en la presente memoria. De forma importante, la terapia es también alcanzable en el ratón GCdko que imita el fenotipo de bastones/conos de LCA1. Estos resultados proporcionan la evidencia para el uso de vectores en terapia génica basados en rAAV para el tratamiento de las distrofias retinianas, y LCA1 en particular.
Ejemplo 7 - Conservación a largo plazo de los fotorreceptores de los conos y la restauración de la función de los conos por terapia génica en el ratón GC1 KO
En ejemplos anteriores, se mostró que los vectores AAV5 sub-retinianos que contienen ADNc de GC1 murino conducidos por un promotor o específico de los fotorreceptores (hGRK1) o ubicuo (smCBA) fueron capaces de restaurar la función mediada por los conos y el comportamiento visual y conservar los fotorreceptores de los conos en el ratón GC1KO durante tres meses. En el presente ejemplo, la terapia a largo plazo se evalúa usando el mismo modelo murino. AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 o el mutante de tirosina de cápside altamente efectivo AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se distribuyeron de forma sub-retiniana a ratones GC1KO entre el día 14 después del nacimiento (P14) y el día después del nacimiento (P25). La función retiniana se ensayó por electrorretinogramas (ERG). La localización de la expresión de GC1 mediada por AAV y la supervivencia de los conos se ensayaron con inmunohistoquímica y la extensión de los genomas del vector más allá de la retina se cuantificó por PCR del nervio óptico y el tejido cerebral. La función de los conos se restauró con todos los vectores probados, siendo el AAV8(Y733F) el más eficiente. La expresión mediada por AAV de GC1 se encontró exclusivamente en los fotorreceptores. Durante 10 meses después de la inyección, los genomas de AAV se detectaron solo en el nervio óptico de los ojos tratados. Estos resultados demostraron por primera vez que la terapia a largo plazo es alcanzable en un modelo de mamífero de deficiencia de GC1.
La guanilato ciclasa-1 (GC1) retiniana codificada por GUCY2D sirve como función clave en la fototransducción de los vertebrados (Pugh et al., 1997). Después del estímulo de luz, el segundo mensajero GMP cíclico (cGMP) se hidroliza rápidamente por la fosfodiesterasa (PDE6) en las células del fotorreceptor llevando a un cierre de los canales catiónicos cerrados por cGMP y la hiperpolarización de la célula. Cuando la [Ca2+] citoplasmática cae por debajo de 50 nM, se activa GC1 mediante proteínas de unión a Ca2+ pequeñas, GCAP (proteínas que activan la guanilato ciclasa). La CG1 sintetiza cGMP que se une y reabre los canales cerrados por cGMP, devolviendo al fotorreceptor al estado despolarizado, “oscuro” (Pugh et al., 1997; Polans et al., 1996; Wensel, 2008; Lamb y Pugh, 2006; Arshavsky et al., 2002). Por consiguiente, GC1 juega un papel vital en los ciclos de luz-oscuridad y recuperación, anclando, por medio de cGMP, el bucle de retroalimentación que une los niveles de calcio intracelular y el estado de polarización de los fotorreceptores.
GC1 se expresa en los segmentos externos de los fotorreceptores de los bastones y los conos de las retinas humana, de mono y de ratón (Dizhoor et al., 1994; Liu et al., 1994; Haire et al., 2006). Como otras guanilato ciclasas de membrana, contiene una secuencia señal N’-terminal, un dominio extracelular (ECD), un dominio transmembrana sencillo, un dominio de homología tipo quinasa (KHD), un dominio de dimerización (DD) y un dominio catalítico C’-terminal (CCD), y está presente probablemente como dímeros homoméricos (Yang y Garbers, 1997). Las mutaciones en GUCY2D están asociadas con la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1) recesiva además de las formas dominante y recesiva de distrofia de conos-bastones, CORD6 y CORD, respectivamente (Perrault et al., 1996; Perrault et al., 2000; Kelsell et al., 1998; Perrault et al., 1998; Gregory-Evans et al., 2000; Weigell-Weber et al., 2000; Ugur et al., 2010). LCA1 es un grave trastorno de cegado recesivo autosómico, de comienzo temprano, caracterizado por electrorretinograma (ERG) extinguido que precede a la degeneración del fotorreceptor (Perrault et al., 1999; Chung y Traboulsi, 2009). CORD6 es un trastorno dominante caracterizado por la degeneración progresiva de los fotorreceptores que comienza con los conos provocando la pérdida temprana de la agudeza visual y visión del color seguido por la degeneración de los bastones llevando a ceguera nocturna progresiva y pérdida de campo visual periférico (Kelsell et al., 1998; Perrault et al., 1998). Las mutaciones CORD6 están restringidas al dominio de dimerización (DD) y generalmente provocan un aumento en la activación mediada por GCAP de GC1 (Payne et al., 2001; Downes et al., 2001; Wilkie et al., 2000). Una mutación que provoca CORD recesivo recientemente encontrada está situada en el dominio catalítico (CD) de GC1 y se piensa que reduce la función enzimática total (Ugur et al., 2010). Las mutaciones que provocan LCA1 se distribuyen a lo largo de los dominios ECD, KHD, DD y CCD de GC1 (Karan et al., 2010). Estas mutaciones alteran la estructura enzimática y la estabilidad, pueden impactar al transporte retrógrado de otras proteínas asociadas a la membrana periférica y son frecuentemente anuladoras.
El ratón GC1KO porta una mutación anuladora en Gucy2e, el homólogo murino de GUCY2D. Como en los pacientes de LCA1, la pérdida de función del cono en este modelo precede a la degeneración del cono (Timmers et al., 2001). Los bastones retienen el 30-50% de su función y no degeneran debido a la presencia de GC2, otra guanilato ciclasa funcional en los fotorreceptores murinos (Yang y Garberse, 1997; Jacobson et al., 2006; Timmers et al., 2001; Cideciyan et al., 2008; Song et al., 2002). En los ejemplos más tempranos, se mostró que la inyección sub-retiniana de vectores víricos adeno-asociados (AAV) de serotipo 5 que contienen el ADNc de GC1 murino conducido por el promotor de rodopsina quinasa humana específico de fotorreceptor (hGRK1) o el ubicuo (smCBA) fueron capaces de restaurar la función mediada por el cono y el comportamiento visual y conservar los fotorreceptores de los conos en el ratón GC1KO durante tres meses. En el presente estudio, la terapia de sustitución génica mediada por AAV se evaluó por su capacidad para proporcionar terapia al ratón GC1KO a largo plazo. Se distribuyeron AAV5-hGRK1-mGC1 y AAV5-smCBA-mGC1 y el vector mutante de tirosina de cápside altamente eficiente AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 de forma sub-retiniana a los ratones GC1KO entre el día 14 después del nacimiento (P14) y el día 25 después del nacimiento (P25). Estos descubrimientos demuestran por primera vez que la terapia a largo plazo es alcanzable en un modelo de mamífero de deficiencia de GC1. La biodistribución del genoma del vector se evaluó también para vectores basados en AAV5 y AAV8(733). Estos descubrimientos tienen relevancia directa en el desarrollo de un ensayo clínico para terapia génica basada en AAV para LCA1 (y posiblemente distrofias del cono-bastón), y ayudan a desarrollar un diseño de vector estandarizado para una amplia gama de degeneraciones retinianas recesivas mediadas por defectos en genes asociados con los fotorreceptores.
Materiales y métodos
Animales experimentales:
Los controles de GC1 KO y /+ congénicos derivados de cruces heterocigotos de ratones GC1 /- proporcionados por The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.) se criaron y mantuvieron en la instalación de cuidado animal institucional de los inventores en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. El alimento y el agua estuvieron disponibles ad libitum. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con la Declaración ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión y las regulaciones NIH.
Construcción de los vectores AAV:
Los plásmidos de vector del virus adeno-asociado de serotipo 5 (AAV5) que contenían o bien el promotor ubicuo (smCBA) o el de rodopsina quinasa humana específico del fotorreceptor (hGRK1) que conduce el ADNc de GC1 murino (mGC1) se generaron según los métodos descritos anteriormente (Boye et al, 2010). La mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de tirosina expuestos en la superficie en la cápside de AAV2 se han presentado (Zhong et al., 2008). Se usaron métodos similares para generar el mutante de cápside AAV8(Y733F) descrito en la presente memoria. Todos los vectores se empaquetaron, se purificaron y se titularon según los métodos descritos anteriormente (Zolotukhin et al., 2002; Jacobson et al., 2006). Los títulos resultantes para AAV5-smCBA-mGC1, AAV5-hGRK1 -mGC1 y AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 fueron 4,69 x 1012 genomas de vector por ml (vg/mL), 4,12 x 1013 vg/mL y 1,08 x 1013 vg/mL, respectivamente.
Inyecciones sub-retinianas:
Un gL de AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 x 109 genomas de vector), AAV5-hGRK1 -mGC1 (4,12 x 1010 genomas de vector) o AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (1,08 x 1010 genomas de vector) se inyectaron de forma sub-retiniana en un ojo de ratones GC1 KO entre el día 14 después del nacimiento (P14) y el día 25 posterior al nacimiento (P25). El ojo de control contralateral permaneció sin inyectar. Las inyecciones sub-retinianas se realizaron como se describe anteriormente (Timmers et al., 2001). Se realizó un análisis adicional solo en animales que recibieron inyecciones exitosas comparables (>60% de desprendimiento de retina con mínimas complicaciones). Aproximadamente el 75% de todas las cohortes recibieron inyecciones “exitosas”. Está bien establecido que el área de transducción del vector corresponde a al menos el área de desprendimiento de retina (Timmers et al., 2001; Cideciyan et al., 2008).
Análisis electrorretinográfico:
Los ERG de GC1KO tratados y controles congénicos (+/+), emparejados por edad, se grabaron usando una unidad de control y grabación basada en PC (Toennies Multiliner Vision; Jaeger/Toennies, Hochberg, Alemania) según los métodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Haire et al., 2006; Boye et al., 2010). Las grabaciones de ratones GC1 KO tratados con AAV5-smCBA-mGC1 (n = 10), ratones g C1 KO tratados con AAV5-hGRK1 -mGC1 (n = 6), ratones GC1KO tratados con AAV8(Y773F) (n = 6) y controles (+/+) congénicos (n = 8) comenzaron en fechas diferentes y por lo tanto cada subconjunto de ratones se monitorizó durante longitudes de tiempo ligeramente diferentes. Los ERG de los ratones GC1KO tratados se grabaron 4 semanas después de la inyección y cada mes a partir de ahí hasta 1 año después de la inyección (ratones tratados con AAV5) o 9 meses después de la inyección (ratones tratados con AAV8[Y773F]). Los ratones de control (+/+) congénicos, emparejados por edad, se siguieron durante 8 meses. Los ratones se quitaron del estudio a diferentes puntos temporales a lo largo del experimento por diversos estudios postmortem (estudios de biodistribución, análisis inmunohistoquímicos retinianos, RT-PCR a tiempo real del tejido de la retina) o enfermedad/muerte inesperada. Los datos de ERG se presentaron solo para grupos de animales con una n > 3. Por lo tanto, este estudio compara los descubrimientos a 9 meses después de la inyección para los ratones tratados con AAV5 y 6 meses después de la inyección para ratones tratados con AAV8(Y733F). Los ratones tratados continuaron mostrando respuestas de ERG más allá de estos puntos temporales, sin embargo los tamaños de muestra fueron suficientemente reducidos para que el análisis estadístico no fuera práctico más tiempo. Los trazos mediados por el cono representativos de ratones individuales 1 año después del tratamiento con vectores AAV5 y 9 meses después del tratamiento con AAV8(Y733F) se presentan para apoyar esta contención. Las grabaciones escotópicas (mediadas por bastones) y fotópicas (mediadas por conos) se obtuvieron usando parámetros de grabación descritos anteriormente (Boye et al., 2010). Las amplitudes de ondas b se definieron como la diferencia entre los puntos mínimos de la onda a y el pico positivo posterior de cada onda. Las repuestas de ERG mediadas por bastones en ratones GC1KO no tratados son variables de animal a animal. (Yang et al., 1999), por tanto, se observaron grandes desviaciones estándar cuando se promediaron las amplitudes de onda a y b escotópicas de diferentes animales. Los datos de ERG de los bastones se presentan en forma de relación (el promedio de amplitudes de onda a y b de bastones tratados frente a no tratados, dentro del individuo). Como tal, cualquier valor por encima de 1 indica que el tratamiento de AAV-mGC1 mejoró la respuesta de los bastones. Las relaciones se calcularon usando amplitudes generadas con un estímulo de 1 cds/m2. Las amplitudes máximas de onda b mediadas por conos, fotópicas, en ojos inyectados y no inyectados de todos los ratones GC1KO tratados y ratones de control (+/+) congénicos generadas a 12 cds/m2 se promediaron a cada punto temporal y se usaron para generar errores estándar. Todos los datos se importaron en Sigma Plot para una presentación gráfica final. La prueba t estándar se usó para calcular los valores P entre los conjuntos de datos. La diferencia significativa se definió como un valor P <0,05.
Biodistribución:
La extensión del ADN del vector en tejidos de los ratones GC1 KO tratados se determinó en muestras recogidas en el sacrificio según los métodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Jacobson et al., 2006). Los ratones tratados con vector se sacrificaron en los siguientes puntos temporales: ratones tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (4 meses después de la inyección: n =1, 7 meses después de la inyección: n= 1), AAV5-smCBA-mGC1 (7 meses después de la inyección: n = 1; 10 meses después de la inyección: n = 5), AAV5-hGRK1-mGC1 (7 meses después de la inyección; n = 1; 10 meses después de la inyección: n = 1). Los tejidos de control de los ratones GC1 KO emparejados por edad a los puntos temporales de 7 meses después de la inyección o 10 meses después de la inyección también se evaluaron junto a los animales experimentales. Después del sacrificio, se usaron diferentes fórceps nuevos para enuclear los ojos tratados y no tratados que retuvieron aproximadamente 0,5 cm del nervio óptico proximal. Nuevas tijeras de disección, diferentes, se usaron entonces para cortar los nervios ópticos de los globos oculares después de lo cual se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se transfirieron a -80°C donde permanecieron hasta el momento de la extracción de ADN. Los globos oculares se sumergieron en paraformaldehído al 4% (PAF) y se procesaron para inmunohistoquímica (véase a continuación).
Los cerebros se quitaron y se usó una matriz cerebral coronal de ratón de acero inoxidable (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EE.UU.) para aislar las regiones específicas visuales. Los núcleos geniculados laterales derechos e izquierdos se recogieron de un ratón por grupo de tratamiento (en el último punto temporal), se fijaron con formalina y se guardaron en el caso de que los genomas de vector se recuperaran del cerebro y la inmunohistoquímica fuera necesaria. Partes separadas del cerebro derecho e izquierdo que contenían las rutas visuales se recogieron, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se transfirieron a -80°C donde permanecieron hasta el momento de extracción de ADN. Se tomaron precauciones para evitar la contaminación cruzada mientras se recogían los tejidos. El ADN genómico se extrajo de los tejidos según el protocolo del fabricante (kit de tejido Qiagen DNeasy). Las concentraciones resultantes de ADN se determinaron usando un Biofotómetro Eppendorf (Modelo 6131; Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Los PCR cuantitativos se realizaron según los métodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Jacobson et al., 2006; Song et al., 2002; Poirier et al., 2004).
Los pares de cebador se designaron a la región de señal de poli-adenilación SV40 (SV40 polyA) en cada genoma de vector y se establecieron curvas estándar usando concentraciones conocidas de ADN de plásmido que contenían la misma secuencia diana SV40 polyA. Las muestras de ADN se ensayaron por triplicado. Para descartar falsos negativos debido a la inhibición de PCR, el tercer replicado se “pinchó” con ADN de plásmido que contenía la diana (SV40 polyA) en una relación de 100 copias/pg de ADN genómico. Si se detectaron >40 copias del ADN pinchado, la muestra se consideró aceptable para presentar copias del genoma de vector. En algunos casos las muestras que fallaron en “pinchar” se analizaron de nuevo usando menos de 1 pg de ADN genómico en las reacciones de PCR, diluyendo así los inhibidores de PCR que copurifican con ADN en el tejido extraído. El número de copias de pinchado se redujo proporcionalmente para mantener la relación de 100 copias/pg de ADN. Los criterios para presentar las copias de genoma de vector se establecieron según los métodos descritos anteriormente (Jacobson et al., 2006). Brevemente, más de 100 copias de genoma/pg se consideró positivo y el número de copias/pg medido se presentó. Menos de 100 copias/pg se consideró negativo.
Preparación de tejido, inmunohistoquímica y microscopía:
En el sacrificio, simultáneo con los estudios de biodistribución realizados a los 7 meses después de la inyección de [AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1] y 10 meses después de la inyección de (AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1), el limbo de los ratones GC1KO tratados, ratones GC1KO no tratados, emparejados por edad, además de ratones GC1+/+ congénicos emparejados por edad, se marcaron con una aguja caliente en la posición de 12 en punto, facilitando la orientación. Los controles CG1KO no tratados y GC1 /+ se emparejaron por edad a los ratones tratados con AAV8(Y733F) (8 meses de edad en el momento del sacrificio). Los ojos designados para la criosección se procesaron e inmunotiñeron según los métodos descritos anteriormente (Haire et al., 2006). Brevemente, secciones de retina de 10 pm se incubaron con anticuerpos dirigidos contra GC1 (policlonal de conejo 1:200, sc-50512 Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) o arrestina de conos de ratón (“LUMIj” policlonal de conejo, 1:1000, proporcionado por Dr. Cheryl Craft, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA, EE.UU.). Después de la incubación primaria, se aplicaron anticuerpos secundarios de IgG Alexa-488 o Alexa-594, respectivamente, durante 1 hora a temperatura ambiente (1:500 en 1X PBS). Las secciones se contratiñeron con 4’,6’-diamino-2-fenil-indol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. A los 11 meses después de la inyección, un ratón GC1 KO que recibió tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 en un ojo solo se sacrificó y las preparaciones completas retinianas de los ojos tratado y no tratado se procesaron según los métodos descritos anteriormente (Pang et al., 2010). Brevemente, las preparaciones completas se tiñeron con LUMIj (1:1000) seguido por Alexa-594 secundaria de IgG (1:500 en 1X PBS) y se pusieron en portaobjetos con la parte superior (dorsal) de la retina orientada a las 12 en punto. Las secciones retinianas se analizaron por microscopía confocal (microscopio Confocal Espectral TCS SP2 AOBS Leica equipado con el programa LCS versión 2.61, Build 1537). Las imágenes se tomaron con configuraciones de exposición idénticas con ampliación 20X. Las preparaciones completas retinianas se analizaron con un microscopio fluorescente de campo completo (Zeiss Axioplan 2) equipado con Cámara QImaging Retiga 4000R y el programa QImaging QCapture Pro. Los cuadrantes de cada preparación completa se tomaron en imágenes a 10X con configuraciones de exposición idénticas y después se mezclaron en Adobe Photoshop.
Electroinmunotransferencia
A los 7 meses después de la inyección, un ratón inyectado con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 y un ratón (control) GC1 /+ congénico, emparejado por edad, se sacrificaron, sus ojos se enuclearon y se pusieron en 1X PBS. Las retinas se diseccionaron inmediatamente y se procesaron como sigue. Las retinas individuales se solubilizaron en PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2 PO4 1,8 mM) con Tritón X-100 al 1% e inhibidor de proteasa completo (Roche) durante 1 hora a 4°C, seguido por centrifugado a 14000 rpm. La concentración de proteína del sobrenadante se determinó por BCA (Pierce) y se separaron 15 pg de cada muestra en un gel de poliacrilamida al 12% (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas Immobilon-FL durante 1 hora en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM) que contenía 15% de metanol. Las transferencias se trataron con tampón de bloqueo (Li-Cor) y se etiquetaron durante 1 hora con un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce GC1 (IS4, 1:3000, proporcionado por Dr. Kris Palcweski, Universidad Case Western, EE.UU.) y anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra GCAP1 (pAb UW14, 1:25.000, proporcionado por Dr. Wolfgang Baehr, Universidad de Utah) y p-actina (1:5000, Abcam). Los anticuerpos secundarios (Ig anti-ratón de cabra conjugado con CW800 y anti-conejo de cabra conjugado con IR680) se aplicaron durante 1 hora y las transferencias se tomaron en imágenes con un Sistema de Formación de Imágenes Infrarrojas Odyssey (Licor, Lincoln, NE, EE.UU.).
Cuantificación del ARNm por rtPCR, recuperación del genoma retiniano e IHC del Nervio Óptico
Los ojos individuales tratados con nervio óptico unido se recogieron de los ratones GC1KO 1 año después del tratamiento con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 o AAV5-smCBA-mGC1 y de un ratón GC1 /+ no tratado, emparejado por edad. Las retinas se diseccionaron del ojo inmediatamente y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los nervios ópticos se disociaron de los ojos, se fijaron en paraformaldehído al 4% toda la noche a 4°C, se sumergieron en sacarosa al 30% durante 2 horas a 4°C, y después se congelaron rápidamente en compuesto criostático (Tissue Tek® OCT 4583; Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA, EE.UU.) en un baño de hielo seco/etanol. Los nervios ópticos se seccionaron a 10 pm y se tiñeron según los métodos descritos anteriormente (Boye et al., 2010). Las retinas se homogeneizaron en 350 mL de Tampón RLT (Mini Kit de protección RNeasy®, Qiagen, Inc., Valencia, CA, EE.UU.) más BME durante 45 s. Las muestras se centrifugaron y el lisato se dividió por la mitad (una mitad designada para la recuperación de genoma y la otra mitad para la extracción de ARN) (Traint y Whitehead, 2009). La recuperación del genoma se realizó como se describe anteriormente. La extracción de ARN se realizó con un Mini Kit de Protección RNeasy® (Qiagen, Inc.). El ARN se transcribió de forma inversa (kit de síntesis de ADNc iScript®, Biorad Laboratories, Hércules, CA, EE.UU.) y se usó en PCR a tiempo real (Supermezcla verde iQ SYBR® y sistema de detección de PCR a tiempo real MyiQ adaptado con ciclador térmico iCycler®, Biorad Laboratories) para medir los siguientes ARNm específicos de la retina: guanilato ciclasa-1 (GC1), proteína que activa la guanilato ciclasa-1 (GCAP1), transducina a del cono (GNAT2), subunidad alfa de fosfodiesterasa 3’,5’ cíclica específica de cGMP de los bastones (PDE6a) y el gen de mantenimiento, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
Los pares de cebador para GCAP1, GNAT2, PDEa y GAPDH fueron idénticos a los usados por Baehr et al. (2007). Los cebadores para GC1 murino (cebador directo: 5'-GACCCTTCCTGCTGGTTCGATCCA-3' [SEQ ID NO:16], cebador inverso: 5"-CTGCATGTGTAGCAGCCTGTGCCTC-3' [SEQ ID NO:17]) se diseñaron para flanquear el exón 5, el sitio de interrupción génica en el ratón GC1KO (Yang et al., 1999) y generar un amplicón de 151 pb. El PCR produjo amplicones dimensionados apropiadamente en muestras de retina GC1 /+ y GC1 KO tratado con AAV-mGC1, pero no en la retina de GC1KO no tratada como se esperaba. La identidad del amplicón se verificó por digestión de restricción con StuI (NEB) que escinde en la secuencia diana para dar fragmentos de 56 pb y 95 pb. La rtPCR con cebadores de GC1 y GAPDH en series de dilución de ADN transcrito de forma inversa (de muestras de retina tanto de GC1 /+ como de CG1KO tratado con AAV-mGC1) dio por resultado pendientes similares, indicando la idoneidad de los cebadores de GC1 para cuantificar el mensaje de GC1 tanto endógeno como mediado por vector (FIG. 20A y FIG. 20B).
Los resultados son el promedio de 3 reacciones de replicación y se calcularon usando el método 2-ññCT (Livak y Schmittgen, 2001) con la señal de GAPDH usada para normalizar las muestras y la muestra GC1 /+ que sirve como el calibrador. Las desviaciones estándar se calcularon a partir de las 3 reacciones de replicación hechas para cada muestra. Los datos se presentan como el cambio múltiplo en los niveles de ARNm respecto a la muestra de GC1 /+.
Resultados
Expresión de GC1 específica del fotorreceptor, a largo plazo
La inmunotinción con un anticuerpo dirigido contra GC1 reveló que la expresión de proteína terapéutica vectorizada con AAV persistió exclusivamente en los fotorreceptores de los ratones GC1KO tratados durante una fracción significativa de la vida del animal; AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 durante al menos 7 meses, AAV5-smCBA-mGC1 durante al menos 10 meses y AAV5-hGRK1 -mGC1 durante al menos 10 meses (FIG. 21A y FIG. 21B). La expresión de GC1 se limitó a los segmentos externos de los bastones y conos tratados con vector AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1 mientras se encontró en ambos segmentos externos y más raramente en los cuerpos celulares del fotorreceptor de ojos tratados con AAV5-smCBA-mGCI, un resultado coherente con la fuerza de este promotor ubicuo respecto a hGRK1 específico del fotorreceptor (Beltran et al., 2010). Se observaron dos ejemplos de adelgazamiento de la retina. El primero fue una retina GC1KO tratada con AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 x 109 genomas de vector totales distribuidos). La capa nuclear externa (ONL) estaba adelgazada ligeramente respecto a la vista en retinas de control GC1KO no tratadas anteriormente o GC1 /+ (ambas de 8 meses de edad). Este puede ser un resultado de la sobre-expresión de GC1 mediada por el promotor smCBA (Beltran et al., 2010).
El segundo implicó una retina GC1KO tratada con el AAV5-hGRK1-mGC1 más concentrado y como antes mostró expresión de GC1 específica del fotorreceptor pero con profundo adelgazamiento de la capa nuclear externa. Debería notarse que este vector fue el más concentrado de los tres evaluados en este estudio (4,12 x 1010 genomas de vector distribuidos frente a 4,69 x 109 y 1,08 x 1010, para el preparado AAV5-smCBA-mGC1 y AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1, respectivamente), y de nuevo resalta que la sobre-expresión de GC1 puede ser la causa del adelgazamiento observado. Como mínimo, estos resultados sugieren que una toxicidad limitante de dosis puede ser observable en el ratón. La expresión de GC1 estuvo ausente de la retina GC1 KO no tratada (FIG. 21A y FiG. 21B).
La supervivencia del fotorreceptor de los conos a largo plazo se consigue mediante GC1 vectorizado con AAV
Los fotorreceptores de los conos en ratones GC1KO tratados y no tratados además de controles GC1 /+ se identificaron tiñendo por la arrestina de los conos de ratón. Las secciones transversales retinianas procedentes de ratones sacrificados para el estudio de biodistribución final y las preparaciones completas retinianas de un ratón GC1 KO 11 meses después del tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 (solo ojo derecho) se analizaron. Aquí se mostró que las densidades del fotorreceptor del cono se redujeron marcadamente en las retinas de GC1KO no tratadas de 10 meses de edad y confirman informes previos de que los conos se pierden de una manera topográficamente específica en este modelo de ratón (Coleman et al., 2004) (FIG. 21A y FIG. 21B). El análisis de la preparación completa reveló que la retina no tratada, de 11 meses de edad mostró una densidad de conos escasa, con conos residuales encontrados exclusivamente en las regiones retinianas superiores mientras que la retina tratada P14, compañera, conservó una densidad de conos mucho mayor por todas partes, con la excepción de un pequeño parche de la retina temporal que probablemente no estuvo expuesto al vector durante la inyección sub-retiniana y por lo tanto no contenía producto transgénico. Comparado con lo visto en las retinas tratadas con AAV5, las densidades de conos y la estructura en las secciones transversales retinianas de los ratones tratados con AAV8(Y733F) parecieron cualitativamente más similares a las vistas en la retina de GC1 /+ normal (FIG. 21A y FIG. 21B). Aunque sus densidades se aumentaron respecto a los controles no tratados, los conos en las retinas tratadas con AAV5 aparecieron ligeramente desorganizadas, un resultado debido probablemente al ligero trastorno/adelgazamiento total de las capas nucleares externas en estos ratones.
Restauración a largo plazo de la función del fotorreceptor (ERG) en ratones GC1 KO tratados con AAV
En los ejemplos anteriores, la función mediada por los conos podría restaurarse a los ratones GC1 KO durante 3 meses después de la distribución P14 de AAV5-smCBA-mGC1 o AAV5-hGRK1-mGC1 (Boye et al., 2010). Las amplitudes de onda b fotópica promedio en ratones tratados se restauraron parcialmente a las 4 semanas después de la inyección y permanecieron estables a lo largo de ese estudio. En el presente ejemplo, las respuestas mediadas por los conos a los 9 meses después del tratamiento se compararon en ratones GC1KO inyectados entre P14 y P25 con vectores idénticos a los usados en el estudio anterior. Todos los ratones que quedaban tratados con vector AAV5-mGC1 continuaron mostrando función mediada por los conos medible hasta al menos 1 año después del tratamiento. Trazos representativos obtenidos a 12 cds/m2 de un ratón individual tratado con AAV5-hGRK1-mGC1 se muestran en la FIG.
22A y FIG. 22B. Las respuestas de los conos fueron estables en el tiempo y fueron significativamente mayores que las respuestas generadas por controles contralaterales no tratados (p < 0,001), sugiriendo que la restauración de la función de los conos es posible durante la vida del animal (FIG. 22A). De acuerdo con el ejemplo anterior, el nivel de restauración alcanzado después de la distribución del vector que contenía promotor específico del fotorreceptor (hGRK1) no fue significativamente diferente del alcanzado con el vector que contenía promotor ubicuo (smCBA) en cualquier punto temporal después del tratamiento. Las trazos representativos revelan que las cinéticas del ERG de los conos restaurados parecieron normales a lo largo del estudio (FIG. 22B). Además, se mostraba en este ejemplo que la función del fotorreceptor de los conos se restauró de forma estable durante al menos 6 meses después de la inyección con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1.
Las amplitudes de onda b de los conos en ratones GC1KO inyectados con este fuerte mutante de cápside de tirosina AAV8 de rápida actuación fueron mayores que las vistas en ratones GC1 KO inyectados con cualquier vector AAV5 en cada punto temporal evaluado. A los 6 meses después del tratamiento, el último punto temporal en que todos los vectores podrían compararse en paralelo, había una diferencia significativa entre las amplitudes de onda b de los conos en ratones tratados con AAV8(Y733)-hGRK1 -mGC1 frente a AAV5-hGRK1 -mGC1 (p = 0,033) y ratones tratados con AVV(Y733F)-hGRK1-mGC1 frente a AAV5-smCBA-mGC1 (p = 0,025). Un trazo representativo grabado 9 meses después de la inyección con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (n = 1) fue visiblemente menor que el grabado a los 6 meses después de la inyección.
Debido a su variabilidad entre ratones en las respuestas de los bastones de GC1 KO no tratados (50-70% de WT a los 5 meses de edad (23), la comparación estadística de las respuestas de los bastones promedio de ojos tratados frente a no tratados es problemática. Sin embargo, en un animal, las amplitudes de ERG de los bastones son casi iguales entre ojos compañeros, por lo tanto se calculó las relaciones de amplitud de onda a y b en un ratón promedio para ojos tratados frente a no tratados y después se representaron estas relaciones con el tiempo (FIG. 23A y FIG. 23B). La restauración mediada por AAV de la función de los bastones se indica por las relaciones con un valor >1,0. Las FIG. 23A y FIG. 23B muestran que, con la excepción de un punto temporal (4 meses después del tratamiento), las relaciones promedio de las amplitudes de onda b de los bastones en ojos tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 frente a no tratados fueron todas >1,0. Las relaciones de ojos tratados con AAV5 frente a no tratados fueron solo ocasionalmente >1,0. De forma similar, las relaciones de onda a de los bastones fueron consistentemente mayores en ratones tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, mientras que a menudo declinaban después del tratamiento con cualquier vector AAV5 (FIG. 23B). Estos resultados sugieren que mientras los efectos terapéuticos en bastones fueron sutiles, AAV8(Y733F) dio la mejora funcional mediada por bastones más fuerte al ratón GC1KO (FIG. 23B). Los trazos ERG escotópicos mediados por bastones representativos obtenidos por un estímulo de 1 cds/m2 se demostraron en un ratón GC1 KO tratado con AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1 (6 meses después del tratamiento), el ojo de control contralateral no tratado y un control GC1 /+ emparejado por edad. Las mejoras mediadas por AAV8(Y733F) en las amplitudes de ERG de los bastones son claras en este ejemplo e indican que aparte de las amplitudes sub-tipo salvaje, las cinéticas de respuesta del ojo tratado se parecen a las vistas en el control de GC1 /+.
Biodistribución del vector:
Los estudios de biodistribución se realizaron en ratones GC1KO tratados con cada vector para establecer si los genomas del vector distribuido por AAV5 o AAV8(Y733F) podrían detectarse en los nervios ópticos y/o cerebros de ratones tratados después de un periodo de meses. Los ratones inyectados con vectores AAV5 se evaluaron a los 7 (n = 2) y 10 (n = 5) meses después del tratamiento y los ratones inyectados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se evaluaron a 4 (n = 1) y 7 (n = 1) meses después del tratamiento. Los nervios ópticos de los ojos inyectados y no inyectados se examinaron además de partes del cerebro izquierdo y derecho que contenían las rutas visuales. Los vectores AAV5 se inyectaron en los ojos derechos de ratones GC1KO. Por consiguiente, los genomas de vector se detectaron en el nervio óptico derecho de los ratones tratados con AAV5 tanto a los 7 como a los 10 meses después de la inyección. A los 7 meses después de la inyección, los genomas de vector se detectaron también en el cerebro izquierdo de un ratón inyectado con AAV5-hGRK1 -mGC1. No se detectaron genomas de vector del cerebro derecho de ese animal. La observación de que el nervio óptico derecho (inyectado) y el cerebro izquierdo fueran positivos es anatómicamente coherente ya que el hemisferio izquierdo está predominantemente “conectado” con el ojo derecho.
A los 10 meses después de la inyección, los genomas del vector distribuido con AAV5 se detectaban aún en el nervio óptico derecho (inyectado) pero estuvieron ausentes de ambos hemisferios cerebrales. El vector AAV8(Y733) se inyectó en los ojos izquierdos de ratones CG1KO. Por consiguiente, los genomas del vector distribuidos por AAV8(Y733F) se detectaron en los nervios ópticos izquierdos tanto a los 4 como a los 7 meses después de la inyección. En ningún punto temporal se detectaron genomas del vector en el ratón tratado con AAV8(733) en cualquier hemisferio cerebral. Un mayor número promedio de genomas de vector se detectaron en los nervios ópticos de los ojos inyectados con AAV5-GRK1-mGC1 en comparación con AAV5-smCBA-mGC1. Este resultado se debe probablemente al mayor título del primero (4,12 x 1013 vg/mL) en comparación con el último (4,69 x 1012 vg/mL).
Además, solo los genomas distribuidos por AAV5-hGRK1-mGC1 se detectaron en el tejido cerebral durante este estudio, otra observación debida probablemente al título relativamente alto de este vector. A pesar del hecho de que el título del vector AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1 usado (1,08 x 1013 vg/mL) fue menor que el del vector AAV5-hGRK1 -mGC1, un mayor número promedio de genomas de vector se detectó en los nervios ópticos de los ojos tratados con AAV8(Y733F). Aunque se sabe que AAV5 es ineficaz para transducir las células de los ganglios de la retina del ratón (Stieger et al., 2008), se mostró que AAV8 transduce este tipo de células (Jacobson et al., 2006). Alguna exposición del vector a las células de los ganglios de la retina se espera ya que la jeringa atraviesa la retina interna durante la inyección sub-retiniana y debido a que la relación del volumen de inyección al tamaño ocular total es alta en el ratón. El mayor número de genomas de vector detectados en los nervios ópticos de los ojos tratados con AAV8(Y733F) por lo tanto podría deberse a la afinidad aumentada de AAV8(Y733F), respecto a AAV5, por las células de los ganglios de la retina. Como se esperaba, no se recuperaron genomas de vector AAV de ningún tejido de los ratones de control GC1KO no tratados anteriormente.
El tratamiento de AAV-mGC1 restaura los niveles de tipo salvaje de GC1 y GCAP1 de la retina GC1 KO tratada
A los 7 meses después de la inyección con AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1, las retinas tratadas y no tratadas de un ratón GC1 KO además de un ratón de control GC1 /+ emparejados por edad se usaron para evaluar los niveles de expresión de proteína GC1 y GCAP1. El objetivo de este experimento no fue comparar los niveles de GC1 a través de los grupos de tratamiento sino más bien comparar los niveles de expresión de GC1 mediada por vector con los niveles de GC1 en un animal de tipo salvaje. De forma similar se evaluaron los efectos de GC1 distribuida por AAV en la expresión de GCAP1. Como se esperaba, la proteína GC1 estuvo ausente del ojo no tratado del ratón GC1KO. En contraste, los niveles de GC1 en el ojo tratado con AAV8(Y733F) se aproximaron a los vistos en el control GC1 /+ normal (Figura 4). De acuerdo con los informes anteriores de que GCAP1 se regula a la baja post-traduccionalmente en el ratón GC1 KO, mostramos que GCAP1 se reguló a la baja en la retina CG1 KO no tratada respecto al control GC1 /+ (39). Sin embargo, la distribución mediada por AAV8(Y733F) de GC1 lleva a una sobrerregulación en la expresión de GCAP1 en la retina del ratón GC1 KO tratado. Los niveles de expresión de GCAP1 fueron también comparables con los vistos en los controles GC1 /+.
En los ratones GC1 KO tratados, el ARNm de GC1 está presente y los niveles de ARNm de GNAT2 están aumentados respecto a los ratones GC1KO no tratados. Usando un par cebador de GC1 que flanquea la interrupción génica de neomicina situada en el Exón 5 del ratón GC1 KO (Timmers et al., 2001) fue posible medir el ARNm de GC1 en ratones tanto GC1 /+ como GC1 KO tratados con vector. De forma interesante, un segundo par cebador de GC1 dirigido al exón 18 y 19 de GC1, bien corriente abajo de la interrupción génica, produjo un producto de PCR en la muestra de ratón GC1 KO no tratado y por lo tanto estos cebadores no se usaron. A un año después del tratamiento, los niveles de ARNm de GC1 en las retinas tratadas fueron aproximadamente siete veces (tratado con AAV5) y 14 veces [tratado con AAV8(YY733F)] mayores que las vistas en el ratón de control GC1 /+ emparejados por edad (FIG. 24A y FIG.
24B). Usando una técnica de recuperación de ácido nucleico que permitió la repartición homogénea de la muestra en 2 mitades iguales, una para la extracción de ARN y la otra para ADN (Pang et al., 2011), sin embargo fue posible medir los niveles de ARNm y determinar el número de genomas de vector en la misma muestra. Se encontró que los altos niveles de ARNm de GC1 en las retinas tratadas correspondieron a la recuperación de muchos genomas de vector; 1,57 x 107 genomas de vector/gg de ADN para AAV8(Y733F) y 4,7 x 106 genomas de vector/gg para AAV5. A pesar de los altos niveles de ARNm de GC1 en las retinas tratadas, no se detectó expresión de GC1 en los nervios ópticos de los ojos tratados. Este resultado respalda además la noción de que los vectores evaluados en este estudio no dieron por resultado la expresión transgénica fuera de la diana. De acuerdo con los informes previos de que la reducción de GCAP1 en los ratones GC1KO es post-traduccional (es decir, los niveles de ARNm están inalterados), no se encontraron cambios sustanciales en los niveles de ARNm de GCAP1 entre las muestras (FIG. 24A y FIG. 24B).
Como una estimación inicial del tratamiento en otros ARN específicos de los conos, se evaluaron también varios tránscritos distintos en estas muestras. Para establecer una base para los niveles de transducina a de los conos (GNAT2), el ARN de GNAT2 se evaluó en muestras de GC1KO no tratados y se encontró que estaban reducidas respecto a los controles GC1 /+, un resultados debido probablemente a la pérdida de fotorreceptores de los conos en estas retinas (FIG. 24A y FIG. 24B). En contraste, hubo aumentos apreciables de los niveles de ARNm de GNAT2 en los ojos tratados con vectores o bien AAV5 o AAV8(Y733F) un resultado que respalda adicionalmente la noción de que los fotorreceptores de los conos se conservan en ratones GC1 KO tratados con AAV-mGC1. Los niveles de PDE6a de los bastones estuvieron relativamente inalterados entre las muestras probablemente porque los fotorreceptores de los bastones no degeneran en el ratón GC1 KO (FIG. 24A y FIG. 24B).
En conclusión, estos estudios demuestran que la expresión persistente de GC1 mediada con AAV es capaz de restaurar la función retiniana a largo plazo y conservar los fotorreceptores de los conos en el ratón GC1 KO. Cohortes de ratones CG1 KO tratados con AAV5 y a AV8(Y733F) se evaluaron para la recuperación de ERG durante 9 meses y 6 meses después de la inyección, respectivamente. Aunque la comparación estadística de las amplitudes de ERG de los conos no continuó más allá de estos puntos temporales debido a los tamaños decrecientes de muestra, todos los ratones tratados continuaron mostrando rescate funcional (ERG). Una variedad de ensayos realizados en subconjuntos de estos ratones que quedaban mostraron claros indicios de terapia en continuación. Esta longevidad terapéutica se validó en un número de diferentes niveles: 1) la existencia de proteína GC1 en los ojos tratados a los 10 meses después del tratamiento, 2) la restauración de la función de los conos como se mide por ERG a los 12 meses después del tratamiento, 3) la supervivencia aumentada de los conos en los ojos tratados a los 11 meses después del tratamiento y 4) la recuperación de genomas de vector y ARNm de GC1 en retinas a los 12 meses después del tratamiento. Cuando se vio como análisis discretos, individuales, los tamaños de la muestra usada en estos ensayos fueron a menudo pequeñas. Sin embargo, cuando se consideran todas como correlaciones de eficacia terapéutica en ratones que muestran claros signos de rescate funcional, el tamaño de muestra es efectivamente mucho mayor. En este contexto, por lo tanto, parece que la terapia persiste más allá del periodo estadísticamente evaluado para el rescate de ERG. Esta es la primera demostración de terapia a largo plazo en un modelo animal de deficiencia de GC1.
Se observaron los ERG de conos restaurados en ratones GC1KO tratados con AAV5 y AAV8(Y733) durante al menos 9 meses y 6 meses después del tratamiento, respectivamente. Las respuestas fueron estables y significativamente mayores que las respuestas de los conos de CG1KO no tratados a lo largo del estudio. La recuperación fue más pronunciada en ratones tratados con vector AAV8(Y733F). Las amplitudes promedio de onda b de los conos en ratones tratados con AAV8(Y733F) fueron de forma consistente ~20 gV mayores que las grabadas de ratones GC1 KO tratados con vectores AAV5 estándar (~55 gV frente a ~35 gV, respectivamente). A los 6 meses después del tratamiento, el último punto temporal en que todos los vectores se compararon estadísticamente, esta diferencia permanecía significativa. Este resultado confirma que un vector AAV8(Y733F) restauró de forma estable la estructura y la función retiniana al ratón rd10, un modelo refractario al tratamiento con vectores AAV estándar.
Cuantificar las diferencias en las amplitudes de los bastones entre ojos tratados y no tratados en el ratón GC1 KO se complica por el hecho de que la función de los bastones en este modelo está parcialmente ayudada por la guanilato ciclasa-2 (GC2) (Sun et al., 2010). Las respuestas de ERG de los bastones son por lo tanto variables de animal a animal (30-50% de lo normal). Por lo tanto, a diferencia de las comparaciones de respuestas de los conos tratados y no tratados, las respuestas de los bastones tratados no pueden compararse con una línea base cero. Sin embargo, los ojos GC1 KO emparejados tienen amplitudes ERG de bastones comparables, y la relación dentro del animal de los ERG de los bastones en los ojos compañeros, uno tratado y el otro no tratado, proporciona una métrica válida para evaluar los efectos del tratamiento en la función de los bastones. Las mejoras en las respuestas mediadas por los bastones en ratones GC1 KO tratados con AAV8(Y733F) se observaron de forma más consistente que las grabadas a partir de los ratones tratados con AAV5 como se indica comparando la relación dentro del individuo de las amplitudes de onda a y b de los bastones del ojo tratado y no tratado. Esto sugiere que la expresión agresiva de GC1 en el ojo GC1 KO puede complementar el efecto parcial de GC2 en la función de los bastones murinos.
La supervivencia de los fotorreceptores de los conos a largo plazo (11 meses después de la inyección) se demostró por inmunotinción de preparaciones completas retinianas tratadas y no tratadas de un ratón tratado con AAV5-smCBA-mGC1 con un anticuerpo dirigido contra la arrestina de los conos. Los conos de identificaron a lo largo de la retina GC1KO tratada. La retina tratada con AAV5-smCBA-mGC1 también contenía claramente más conos que el ojo no tratado que, coherente con los informes previos, retuvo solo una pequeña fracción de conos en su hemisferio superior (Provost et al., 2005). Aunque los conos conservados en la retina GC1KO tratada no se examinaron a un nivel ultraestructural (p.ej., microscopio electrónico), la observación de que los conos permanecieron funcionales en el tiempo por análisis ERG sugiere que su estructura estaba intacta. La conservación a largo plazo de los fotorreceptores de los conos mediada por AAV-GC1 terapéutico tiene relevancia clínica obvia porque sugiere el potencial para conservar los conos maculares y restaurar la visión diurna/color útil para los pacientes con deficiencia de GC1.
La expresión de GC1 mediada por AAV persistió durante al menos 10 meses después del tratamiento (el último punto temporal evaluado por IHC) y se situó exclusivamente en los fotorreceptores, a pesar del serotipo usado o si un promotor específico del fotorreceptor (hGRK1) o ubicuo (smCBA) dirigió su expresión. Aunque la expresión transgénica se limitó al tipo de célula diana, el promotor hGRK1 fue más específico en que dio por resultado la expresión exclusivamente en el compartimiento apropiado de la célula diana (segmentos externos del fotorreceptor). Este resultado, junto con otros estudios preliminares de eficacia exitosos que utilizan este promotor sugiere que el promotor hGRK1 debería considerarse en el diseño de un vector AAV clínico dirigido a fotorreceptores.
La inmunotinción de secciones retinianas GC1KO transversas a los 10 meses después del tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 reveló un adelgazamiento moderado de la ONL respecto a los controles tipo salvaje y GC1KO no tratado. Adicionalmente, en esta retina se encontró ocasionalmente GC1 en los cuerpos celulares de los fotorreceptores. Es posible que el fuerte promotor smCBA ubicuo condujera la expresión de GC1 a niveles que sobrepasaron la maquinaria de tráfico de algunos fotorreceptores y que la acumulación de producto transgénico en los cuerpos celulares del fotorreceptor constituyera una apoptosis iniciada por estrés en estas células. Se observó un adelgazamiento de ONL más dramático en un ratón inyectado con AAV5-hGRK1-mGC1. Con una n de 1, no puede concluirse definitivamente que el adelgazamiento de la retina estuviera presente en todos los ratones tratados con este vector. Sin embargo, coherente con la noción de toxicidad por sobreexpresión, el título del vector AAV5-hGRK1 -mGC1 fue el mayor de los tres vectores evaluados en este estudio. Sin embargo, debería notarse también que no hubo acumulación de GC1 en los cuerpos celulares del fotorreceptor con el vector AAV5-hGRK1 -mGC1 de alto título.
A pesar de la naturaleza exclusiva al fotorreceptor de la expresión de GC1 mediada por AAV, los inventores se interesaron en evaluar la expansión de los genomas del vector a tejidos fuera del espacio sub-retiniano. De forma importante, estos datos se recogieron de animales “enfermos”. Esto es relevante en base a la evidencia de que el patrón de transducción del vector es diferente en la retina enferma frente a la sana (Kolstad et al., 2010). Esto sugeriría que los patrones de biodistribución pueden ser también diferentes. Por esta razón, era importante evaluar la extensión de los genomas en el modelo animal rescatado en sí mismo (es decir, con sujetos que mostraron recuperación de ERG clara). Aunque el tamaño de la muestra era limitado, se recogió información útil sobre la distribución de los genomas distribuidos por AAV5 y AAV8(Y733F) en el nervio óptico y el cerebro.
Esta es la primera evaluación de la biodistribución para un vector AAV que contiene una mutación de tirosina expuesta en la superficie de la cápside. Los genomas del vector distribuido por AAV5 y AAV8(Y733F) se detectaron en los nervios ópticos de ojos inyectados en todos los puntos temporales evaluados. Solo en un punto temporal (7 meses después de la inyección) los genomas del vector AAV5 se detectaron en el cerebro de un ratón GC1KO tratado. Los genomas se recuperaron solo en el hemisferio opuesto al ojo inyectado. Este resultado contrasta con el descubrimiento de Provost et al., 2005 que presentó una falta de secuencia distribuida por AAV5 en los cerebros de ratas y perros inyectados de forma sub-retiniana. A los 10 meses después de la inyección, no se recuperaron genomas del vector de los cerebros de los ratones GC1KO tratados con AAV5 ni de los cerebros de ratones tratados con AAV8(Y733F) en ningún punto temporal. Sin embargo, debido al número relativamente pequeño de ratones analizados, no puede excluirse inequívocamente que los genomas distribuidos por AAV5 estuvieran presentes en cerebros a los 10 meses después de la inyección o que los genomas distribuidos por AAV8(Y733F) no están presentes nunca en los cerebros de ratones GC1KO tratados en cualquier momento.
A pesar de recuperar genomas del vector de los nervios ópticos de los ojos tratados, la inmunotinción reveló una falta de expresión de GC1 en los nervios ópticos de los ojos tratados con vectores tanto AAV5-smBCA-mGC1 como AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1. Un estudio previo de Stieger et al., (2005) detectó la expresión transgénica en los nervios ópticos y cerebros de ratas y perros a los 2 meses y 4 semanas después de la inyección sub-retiniana con AAV8 que contenía proteína fluorescente verde (GFP). Teniendo en cuenta que el vector AAV8(Y733F) contenía el promotor hGRK1 específico del fotorreceptor y el descubrimiento previo de que la expresión de GC1 estaba limitada a los fotorreceptores incluso cuando estaba bajo el control de un promotor ubicuo como smCBA, un carencia de expresión de GC1 en los nervios ópticos no es inesperada. Stieger et al., (2005) incorporó el fuerte promotor CMV ubicuo en su vector para conducir GFP, una proteína que es capaz de expresarse de forma estable en una amplia variedad de tejidos cuando se distribuye por medio de vectores víricos.
Aunque los vectores tanto de AAV5 como de AAV8(Y733F) fueron capaces de proporcionar terapia a largo plazo al ratón GC1KO, hay ventajas evidentes asociadas con el uso de AAV8(Y733F). Primera y principal, AAV8(Y733F) con un promotor específico del fotorreceptor confiere respuestas de ERG del cono significativamente mayores a los ratones tratados que cualquier vector AAV5. La razón para esto puede deberse a la capacidad de los vectores AAV8 de transducir áreas fuera de la vesícula de la inyección en la retina de los roedores mientras que el área de retina transducida por AAV5 permanece principalmente confinado en la vesícula (47). Por consiguiente, AAV8(733F) simplemente transduce de media un área mayor de la retina respecto a los vectores AAV5 y a su vez dan por resultado más transducción del cono y una fuerte respuesta de ERG del cono de campo completo, a través de cualquiera o ambas de supervivencia de conos total aumentada y/o un nivel aumentado de respuesta a la luz en cada cono transducido.
Ejemplo 8 - Secuencias de polipéptido GC1 de mamífero ejemplares
Las secuencias de aminoácidos ejemplares útiles en la práctica de la presente invención incluyen, sin limitación, una o más secuencias de aminoácidos que codifican una proteína de guanilato ciclasa de mamífero biológicamente activa. Dichas secuencias incluyen, sin limitación, las de origen humano, primate no humano, murino, bovino y canino, tal como las proteínas de guanilato ciclasa presentadas en SEQ ID n O:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11, a continuación:
Homo sapiens (humano, número de acceso GenPept: NP 000171)
MTACARRAGGLPDPGLCGPAWWAPSLPRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAVFTVGVLGPWACDP IFSRARPDLAARLAAARLNRDPGLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALARVSGLVGPVNPAA CRPAELLAEEAGIALVPWGCPWTQAEGTTAPAVTPAADALYALLRAFGWARVALVTAPQDLWVEAG RSLSTALRARGLPVASVTSMEPLDLSGAREALRKVRDGPRVTAVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAE ELGLTDGSLVFLPFDT1HYALSPGPEALAALANSSQLRRAHDAVLTLTRHCPSEGSVLDSLRRAQE
RRELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVFLLARGVAEARAAAGGRWVSGAAVARHIRDAQVPGFCGDLGG DEEPPFVLLDTDAAGDRLFATYMLDPARGSFLSAGTRMHFPRGGSAPGPDPSCWFDPNNICGGGLE PGLVFLGFLLWGMGLAGAFLAHYVRHRLLHMQMVSGPNKIILTVDDITFLHPHGGTSRKVAQGSR SSLGARSMSDIRSGPSQHLDSPNIGVYEGDRVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVAL YLGLFLARGAEGPAALWEGNLAWSEHCTRGSLQDLLAQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHR GVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPRAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLA GDVFSLAIIMQEWCRSAPYAMLELTPEEWQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPVECILLMKQCWAEQP ELRPSMDHTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLP PSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKV ETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGWG LTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYR1HVNLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWL VGRRGFNKPIPKPPDLQPGSSNHGISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS (SEQ ID NO:1)
Mus musculus (ratón; número de acceso GenPept: NP 032218)
MSAWLLPAGGLPGAGFCVPARQSPSSFSRVLRWPRPGLPGLLLLLLLPSPSALSAVFKVGVLGPWA CDPIFARARPDLAARLAANRLNRDFALDGGPRFEVALLPEPCLTPGSLGAVSSALSRVSGLVGPVN PAACRPAELLAQEAGVALVPWGCPGTRAAGTTAPAVTPAADALYVLLRAFRWARVALITAPQDLWV EAGRALSTALRARGLPVALVTSMETSDRSGAREALGRIRDGPRVRWIMVMHSVLLGGEEQRYLLE AAEELALTDGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAAFVNSSQLRRAHDAVLTLTRRCPPGGSVQDSLRR AQEHQELPLDLNLKQVSPLFGTIYDAVFLLAGGVKRARTAVGGGWVSGASVARQVREAQVSGFCGV LGRTEEPSFVLLDTDASGEQLFATHLLDPVLGSLRSAGTPMHFPRGGPAPGPDPSCWFDPDVICNG GVEPGLVFVGFLLVIGMGLTGAFLAHYLRHRLLHMQMASGPNKIILTLEDVTFLHPPGGSSRKWQ GSRSSLATRSASDIRSVPSQPQESTNVGLYEGDWVWLKKFPGEHHMAIRPATKTAFSKLRELRHEN VALYLGLFLAGTADSPATPGEGILAWSEHCARGSLHDLLAQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYL HHRGVAHGRLKSRNCWDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQRVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPSLERRG TLAGDVFSLAIIMQEWCRSTPYAMLELTPEEVIQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPMECIQLMTQCWA EHPELRPSMDLTFDLFKSINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELEQEKQKTDRLLTQ MLPPSVAEALKMGTSVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGAHDV YKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAG WGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNMSTVRILRALDQGFQMECRGRTELKGKGIEDT YWLVGRLGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPPERRKKLEKARPGQFTGK (SEQ ID NO:2)
Rattus norvegicus (rata noruega; número de acceso GenPept: NP 077356)
MSAWLLPAGGFPGAGFCIPAWQSRSSLSRVLRWPGPGLPGLLLLLLLPSPSAFSAVFKVGVLGPWA CDPIFARARPDLAARLATDRLNRDLALDGGPWFEVTLLPEPCLTPGSLGAVSSALTRVSGLVGPVN PAACRPAELLAQEAGVALVPWGCPGTRAAGTTAPAVTPAADALYVLLKAFRWARVAIilTAPQDLWV EAGRALSTALRARGLPVALVTSMVPSDLSGAREALRRIRDGPRVRWIMVMHSVLLGGEEQRYLLE AAEELGLTDGSLVFLPFDTLHYALSPGPEAIiAAFVNSSKLRRAHDAVLTLTRRCPPGGSVQDSLRR AQEHQELPLDLDLKQVSPLFGTIYDAVFLLAGGVTRARAAVGGGWVSGASVARQMREAQVFGFCGI LGRTEEPSFVLLDTDAAGERLFTTHLLDPVLGSLRSAGTPVHFPRGAPAPGPDPSCWFDPDVICNG GVEPGLVFVGFLLVIWGLTGAFLAHYLRHRLLHMQMVSGPNKIILTLEDVTFLHPQGGSSRKVAQ GSRSSLATRSTSDIRSVPSQPQESTNIGLYEGDWVWLKKFPGEHHMAIRPATKMAFSKLRELRHEN VALYLGLFLAGTADSPATPGEGILAWSEHCARGSLHDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYL HHRGVAHGRLKSRNCWDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQRVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERRG TLAGDVFSLGIIMQEWCRSTPYAMLELTPEEVIQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPMECIQLMAQCWA EHPELRPSMDLTFDLFKGINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELEQEKQKTDRLLTQ MLPPSVAEALKMGTSVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGSHDV YKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAG WGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYR1HVNMSTVRILRALDQGFQMECRGRTELKGKGVEDT YWLVGRVGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPPERRKKLEKARPGQFTGK (SEQ ID NO:3)
Bos taurus GC1 (bovino; número de acceso GenPept: NP 776973)
MTACTFLAGGLRDPGLCAPTRWSPSPPGLPPIPPRPRLRLRPPLLLLLLLPRSVLSAVFTVGVLGP WACDPIFARARPDLAARLAASRLNHAAALEGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALTRVSGLVGP VNPAACRPAELLAQEAGVALVPWGCPGTRAAGTTAPWTPAADALYALLRAFRWAHVALVTAPQDL WVEAGHALSTALRARGLPVALVTSMEPSDLSGAREALRRVQDGPRVRAVIMVMHSVLLGGEEQRCL LEAAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPDALAVLANSSQLRKAHDAVLTLTRHCPLGGSVRDSL RRAQEHRELPLDLNLQQVSPLFGTIYDSVFLLAGGVARARVAAGGGWVSGAAVARHIRDARVPGFC GALGGAEEPSFVLLDTDATGDQLFATYVLDPTQGFFHSAGTPVHFPKGGRGPGPDPSCWFDPDTIC NGGVEPSWFIGFLLWGMGLAGAFLAHYCRHRLLHIQMVSGPNKIILTLDDITFLHPHGGNSRKV AQGSRTSLAARSISDVRSIHSQLPDYTNIGLYEGDWVWLKKPPGDRHIAIRPATKMAFSKIRELRH ENVALYLGLFLAGGAGGPAAPGEGVLAWSEHCARGSLQDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGIR YLHHRGVAHGRLKSRNCWDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQRVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPVLER RGTLAGDVFSLGIIMQEWCRSAPYAMLELTPEEWKRVQSPPPLCRPSVSIDQAPMECIQLMKQC WAEQPELRPSMDRTFELFKSINKGRKMNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLL TQMLPPSVAEALKMGTPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGSH
DVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGHRHAAEIANMALDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCV AGWGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYR1HVNRSTVQILSALNEGFLTEVRGRTELKGKGAE ETYWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLHEIPPDRRQKLEKARPGQFSGK
(SEQ ID NO:4)
Canis lupus familiaris (canino; número de acceso GenPept: NP 001003207) MSACALLAGGLPDPRLCAPARWARSPPGVPGAPPWPQPRLRLLLLLLLLPPSALSAVFTVGVLGPW ACDPIFARARPDLAARLAAARLNRDAALEDGPRFEVTLLPEPCRTPGSLGAVSSALGRVSGLVGPV NPAACRPAELLAQEAGVALVPWSCPGTRAGGTTAPAGTPAADALYALLRAFRWARVALITAPQDLW VEAGRALSAALRARGLPVALVTTMEPSDLSGAREALRRVQDGPRVRAVIMVMHSVLLGGEEQRCLL QAAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAVLANSSQLRRAHDAVLILTRHCPPGGSVMDNLR RAQEHQELPSDLDLQQVSPFFGTIYDAVLLLAGGVARARAAAGGGWVSGATVAHHIPDAQVPGFCG TLGGAQEPPFVLLDTDAAGDRLFATYMLDPTRGSLLSAGTPVHFPRGGGTPGSDPSCWFEPGVICN GGVEPGLVFLGFLLWGMGLTGAFLAHYLRHRLLHIQMVSGPNKIILTLDDVTFLHPHGGSTRKW QGSRSSLAARSTSDIRSVPSQPLDNSNIGLFEGDWVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLRELRHE NWLYLGLFLGSGGAGGSAAGEGVLAWSEHCARGSLHDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRY LHHRGVAHGRLKSRNCWDGRFVLKVTDHGHARLMEAQRVLLEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERR GTLPGDVFSLGIIMQEWCRSAPYAMLELTPEEWERVRSPPPLCRPSVSMDQAPVECIQLMKQCW AEHPDLRPSLGHIFDQFKSINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLT QMLPPSVAEALKMGTPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGSHD VYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMALDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVA GWGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYR1HVNMSTVRILHALDEGFQTEVRGRTELKGKGAED TYWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPLDRRWKLEKARPGQFSGK
(SEQ ID NO:5)
Macaca mulatta (macaco rhesus; secuencia predicha de XP 001111670)
MTACARRAGGLPDPRLCGPARWAPALPRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAVFTVGVLGPWACDP IFSRARADLAARLAAARLNRDPDLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALTRVSGLVGPVNPAA CRPAELLAEEAGIALVPWGCPGTQAAGTTAPALTPAADALYALLRAFGWARVALVTAPQDLWVEAG HSLSTALRARGLPVASVTSMEPLDLSGAREALRKVRDGPRVTAVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAE ELGLTDGSLVFLPFDTVHYALSPGPEAIxAALANSSQLRRAHDAVLTLTRHCPSEGSVLDSLRRAQE RRELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVFLLVRGVAEARAAAGGRWVSGAAVARHVWDAQVPGFCGDLGG DEEPPFVLLDTDAVGDRLFATYMLDPTRGSLLSAGTPMHFPRGGSAPGPDPSCWFDPNNICGGGLE PGLVFLGFLLWGMGLAGAFLAHYVRHQLLHIQMVSGPNKIILTVDDITFLHPHGGTSRKVAQGSR SSLAARSMSDVRSGPSQPTDSPNVGVYEGDRVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVAL YLGLFLAQGAEGPAALWEGNLAWSEHCTRGSLQDLLAQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHR GVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPRAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLA GDVFSLAIIMQEWCRSAPYAMLELTPEEWQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPVEC1HLMKQCWAEQP ELRPSMDHTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLP PSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKV ETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGWG LTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWL VGRRGFNKPIPKPPDLQPGSSNHGISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS (SEQ ID NO:6) .
Pongo abelii (orangután de Sumatra; secuencia predicha de XP_002827037)
MTACARRAGGLPDPGLCGPARWAPSLPRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAVFTVGVLG PWACDPIFSRARPDLAARLiAAARLNRDPGLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALAR VSGDVGPVNPAACRPAELLADNPGIALVPWGCPWTQAEGTTAPCVTPAADALYALLRAFG WARVALVTAPQDLWVEAGRSLSTALRARGLPVASVTSMEPLDLSGAREALRKVRDGPRVT AVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAEELGLTDGSLVFLPFDT1HYALSPGPEALAALANSSQ LRRAHDAVLTLTRHCPSEGSVLDSLRRAQERRELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVFLLARG VAEAWAAAGGRWVSGAAVARHIRDAQVPGFCGDLGGDGEPPFVLLDTDAAGDRLFATYML DPARGSFLSAGTRMHFPRGGSAPGPDPSCWFDPNNICGGGLEPGLVFLGFLLWGMGLAG AFLAHYVRHRLLHIQMVSGPNKIILTVNDITFLHPHGGTSRKVAQGSRS SLAARSMSDIR
SGPSQPLDSPNVGVYEGDRVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVALYLGLFL ARGAEGPAALWEGNLAWSEHCTRGSLQDLLSQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHR GVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPRAEDQLWTAPELLRDPALE RRGTLAGDVFSLAIIMQEWCRSAPYAMLELTPEEWQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPVEC
1HLMKQCWAEQPELRPSMDHTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTE ELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIE WDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAV GTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGWGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHV NLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGSSNHG ISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS (SEQ ID NO:7)
Callithrix jacchus (tití de orejas peludas blancas; secuencia predicha de XP_002747985) MTACARRAGGLPDPGLCGPARWAPALSRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAQFTVGVLG PWACDPIFSRARPDLAARLAAARLNRDPSLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALAR VSGLVGPVNPAACRPAELLAEEAGIALVPWGCPGTQAAGTTAPWTPAADALYALLRAFG WARVALVTAPQDLWVEAGLSLSTALRARGLPWSVTSMEPLDLSGAREALRKVRNGPRVT AVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAEELGLTDGSLVFLPFDTIHYALSPGREALAALVNSSQ LRRAHDAVLTLTRHCSSEGSVLDSLRKAQQRRELPSDLNLEQVSPLFGTIYDAWLLARG VADARAAVGGRWVSGAAVARHVWDAQASGFCGDLGRDEEPSFVLLDTDAAGDQLFATYML DPARGS LLSAGTPMHFPRGGPAPGPDPSCWFDPNNICDGGLEPGFIFLGFLLWGMGLAG ALLAHYVRHQLLHIQMVSGPNKIILTVDDITFLHPHGGASRKVAQGSRSSLAAHSTSDIR SGPSQPSDSPNIGVYEGDRVWLKKFPGEQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVALYLGLFL AQGAEGPAALWEGNLAW SEHCTRGSLQDLLAQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHR GVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPKAEDQLWTAPELLRDPALE RRGTLAGDVFSLGIIMQEWCRSAPYAMLELTPDEWQRVRSPPPLCRPFVSMDQAPVEC
1HLMKQCWAEQPELRPSMDLTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTE ELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIE WDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAV GTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGWGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHV NLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHG ISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS(SEQ ID NO:8)
Ailuropoda melanoleuca (panda gigante; secuencia predicha de XP_002921218)
MRACALLAGGLPYPRLCAPTRWAPARPGVSRALPWPRPRLRLLLLLLLRPPSVLSAVFTV GVLGPWACDPIFARARPDLXXXXXXXXXDALYVLLRAFRWARVALVTAPQDLWVEAGRAL SAALRARGLPVALVTTMEPSDLSGAREALRRVQHGPRVSAVIMVMHSVLLGGEEQRCLLQ AAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAALANSSQLRRAHDAVLTLTRHCPPGGSV MDS LRRAQERQELPSDLNLEQVSPLFGTIYDAVFLLAGGVARARAAAADSRVPGFCGALG GAEEPPFVLLDTDAAGDRFFATYVLDPTRGSLHSAGTPVHFPRGGGAPGPDPSCWFEPDS ICNGGVEPGLVFTGFLLWGMGLMGAFLAHYVRHRLLHIQMVSGPNKIILTLDDITFLHP QGGSARKWQGSRSSLAARSTSDVRSVPSQPSDGGNIGLYEGDWVWLKKFPGSQHIAIRP ATKTAFSKLRELRHENVALYLGLFLGGGEGGSAAAGGGMLAWSEHCTRGSLHDLLAQRD IKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYLHHRGVAHGRLKSRNCWDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQK VLAEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLAGDVFSLGIIMQEWCRSSPYAMLELSARE WQRVRSPPPLCRPSVSVDQAPAECIQLMKQCWAEQPELRPSLDRTFDQFKSINKGRKTN IIDSMLRMLEQYSSNLEGLIRERTEELELEKRKTDRLRAASLPSSVAEALKMGTPVEPEY FEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVAS GLPQRNGQRHAAEIANMALDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGWGLTMPR YCLFGDTVNTASRMESTGLPYR1HVNMSTVRILRALDEGFQTEVRGRTELKGKGAEDTYW LVGXXXXXXXXPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPLDRRQKLEKARPGQFSGK (SEQ ID NO:9)
Monodelphis domestica (zarigüeya gris de cola corta; secuencia predicha de XP_001369029)
MLVPSINGLFHHPPWCFPPLPLPLFFLFLLLLLPVPVLPATFTIGVLGPWSCDPIFSRAR PDLAARLAATRMNHDQALEGGPWFEVILLPEPCRTSGSLGALSPSLARVSGLVGPVNPAA
CHPAELLAQEAGVPLVPWGCPQGKARTTAPALPLALDALYALLRAFHWAKVALITAPQDL WVEAGQALAGGLRSRGLPVAMVTSLETTDLESAKNALKRVRDGPKVKVLIMVMHSVLLGG EEQRLLLEAAEELGLVEGTMVFLPFDTLHYALPPGPEALRPITNSSRLRKAHDAVLTLTR YCPKGSVSASLRQAQEHRELPLDLKPQQVSPLFGTIYDAIYLLAGAVAGAQVAGGGGWVS GAAVARHIPNTLVSGFCGDLGGTKEP PFVLLDTDGMRDQLLPTYTLDPAQGVLHHAGNPI HFPHGGQGPGPDPPCWFDPNVICSGGIEPRFILLVILIIIGGGLWATLAYYVRRQLLHA QMVSGPNKMILTLEDITFFPRQGSSSRKATEGSRSSLIAHSASDMRSIPSQPPDNSNIGM YEGDWVWLKKFPGEHYTEIRPATKMAFSKLRELRHENVAVQMGLFLAGSMEGAAAGGLGG GILAWSEYCSRGSLQDLLIQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGLRYLHHRGVAHGRLKSRNC WDGRFVLKITDHAHGRLLEAQRVSLEPPQAEDRLWTAPELLRNEALERQGTLQGDVFSV GIIMQEWCRCEPYAMLELTPEEIIQKVQSPPPMCRPSVSVDQAPMECIQLMKQCWAEQP DLRPNMDTTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDKL LTQMLPPSVAEALKLGIPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWDLLNDLYTLF DAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPKRNGQRHAAEIANMSLDILSSVGSFRMRHMPEVP VRIRIGLHSGPCVAGWGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYR1HVNLSTVKILQGLN EGFQIEIRGRTELKGKGVEDTYWLVGRKGFDKPIPIPPDLLPGASNHGISLQEIPEDRRK KLEKARPGQPLGK (SEQ IDNO:10)
Equus caballus (caballo; secuencia predicha de XP_001918412) MVMHSVLLGGEEQRCLLEAAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAVLANNSQLRR AHDAVLTLTRHCPLGGSVLDSLRRAQEHQELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVYLLAGGVAR ARAAAGGSWVSGAAVAHHVRDAQVPGFCGALGGAEEPQFVLLDTDAAGDRLFATYMLDPT RGSLWSAGTPVHFFRGGRGPGPDPWCWFDPDDICNGGVEPRLVFIGFLLAVGMGLAGVFL AHYVRHRLLHIQMASGPNKIILTLDDITFLHPQGGSSRKVIQGSRSSLAARSVSDIRSVP SQPMDSSNIGLYEGDWVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLRELRHENVALYLGLFLAGG SSGAAAPREGMLAWSEHCARGSLHDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYLHHRGVA HGRLKSRNCWDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQKVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERQG TLAGDVFSLGIIIQEWCRSTPYAMLELTPEEWQRLQSPPPLCRPSVSMDQAPMECIQL MKQCWAEQPDLRPSMDRTFDLFKSINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELE LEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKMGTPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEWD LLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMALDILSAVGSF RMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGWGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNMS TVRILRALDEGFQVEVRGRTELKGKGVEDTYWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISL QEIPPERRQKLEKARPGQFSGK (SEQ ID NO:11)
Ejemplo 9 - Análisis de la secuencia de polipéptidos de GC1 de mamíferos conocidos
Todos los datos de alineación de GC1 se generaron usando la secuencia de aminoácidos para las siguientes especies: Bos taurus (bovino, 1110 residuos), Canis lupus familiaris (canino; 1109 residuos), Mus musculus (murino; 1108 residuos), y Homo sapiens (humano; 1103 residuos). Las posiciones de consenso y las regiones variables se basan en residuos numéricos que corresponden a Bos taurus ya que es la proteína de GC1 más larga, 1110 residuos, y no tiene huecos en la alineación.
Gráfico de similitud de alineación de las proteínas de GC1 de Bos taurus, Canis lupus familiaris, Mus musculus y Homo sapiens.
Figure imgf000045_0001
Regiones de consenso de GC1:
Posiciones de aminoácido: 44-49, 55-90, 98-155, 164-321,464-549, 561 -604, 620-761,813-1026, 1045-1054 y 1060­ 1110.
Regiones variables:
Posiciones de aminoácido: 4-43, 50-54, 91-97, 156-163, 322-463, 550-560, 605-619, 762-812, 1027-1044 y 1055­ 1059.
Otras regiones notables de la alineación de consenso de GC1 incluyen:
(1) Dominio de homología quinasa: posiciones de aminoácido 531 a 541 de la secuencia de consenso (conocida por ser esencial para la actividad en los fotorreceptores - véase, p.ej., Bereta et al., 2010).
(2) Residuos de serina fosforilada en el dominio de homología quinasa de la proteína GC1 murina (posición de consenso/bovina mostrada en paréntesis): 530 (532), 532 (534), 533 (535) y 538 (540).
Ejemplo 10 - Secuencia de nucleótidos del promotor smCBA
La secuencia de ácido nucleico de un promotor GRK1 humano (hGRK1) ilustrativo que se usó en los estudios descritos anteriormente se muestra a continuación:
Figure imgf000045_0002
La secuencia de ácido nucleico de un promotor smCBA ilustrativo que se usó en los estudios descritos anteriormente se muestra a continuación: AATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTGATAOCCCATATATGGA GTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGT GGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCC TATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTT TCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTT CTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATT ATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGA GGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAñAGTT TCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGT CGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCT GACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGC GCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGC TAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGT TATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG ¡SEQ ID NO:13)
Referencias
Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan detalles procedimentales ejemplarse u otros detalles complementarios a los descritos en la presente memoria.
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Patente de Estados Unidos 5.552.157, expedida el 3 de septiembre de 1996.
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Patente de Estados Unidos 5.631.359, expedida el 20 de mayo de 1997.
Patente de Estados Unidos 5.639.940, expedida el 17 de junio de 1997.
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Patente de Estados Unidos 5.656.016, expedida el 12 de agosto de 1997.
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Patente de Estados Unidos 5.720.936, expedida
Figure imgf000047_0001
de febrero de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.738.868, expedida el 14 de abril de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.741.516, expedida
Figure imgf000047_0002
21 de abril de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.770.219, expedida
Figure imgf000047_0003
23 de junio de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.779.708, expedida el
Figure imgf000047_0004
14 de julio de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.783.208, expedida
Figure imgf000047_0005
21 de julio de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.789.655, expedida el 4 de agosto de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.795.587, expedida el
Figure imgf000047_0006
8 de agosto de 1998.
Patente de Estados Unidos 5.797.898, expedida
Figure imgf000047_0007
5 de agosto de 1998.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un virión o partícula vírica que comprende un vector vírico adeno-asociado recombinante (rAAV) que comprende al menos un primer polinucleótido que comprende un promotor de rodopsina quinasa humana específico de fotorreceptor unido de forma operable a al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos un primer polipéptido de guanilato ciclasa humana específica de la retina, biológicamente activo, que comprende al menos una primera región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos idéntica en aproximadamente 95% a una secuencia de al menos 120 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1, en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 5 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV5) o en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8).
2. El virión o partícula vírica según la reivindicación 1, en el que el al menos un primer polipéptido de guanilato ciclasa humana específica de la retina, biológicamente activo, comprende una primera región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos idéntica en aproximadamente 95% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
3. El virión o partícula vírica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el promotor de rodopsina quinasa humana específico del fotorreceptor comprende una secuencia de ácido nucleico que consiste esencialmente en una secuencia de al menos 60 pares de bases contiguas de SEQ ID NO:12.
4. El virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector vírico adenoasociado recombinante (rAAV) comprende además al menos un primer potenciador o al menos una primera secuencia de intrón de mamífero unida de forma operable a al menos un primer segmento de ácido nucleico.
5. El virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virión o partícula vírica es del serotipo AAV5, AAV8 o AAV8 que tiene la sustitución de aminoácidos Y733F.
6. Una composición que comprende:
(1) el virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y
(2) un tampón, transporte, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
7. El virión o partícula vírica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición según la reivindicación 6 para usar en terapia, o para usar en el tratamiento de una distrofia, enfermedad o trastorno humano, que incluye la amaurosis congénita de Leber (LCA1).
8. El virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la composición de la reivindicación 6 para usar en diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, trastorno, disfunción o condición anormal de un ojo de mamífero, o uno o más síntomas del mismo.
9. El virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición según la reivindicación 6 para usar en el tratamiento de una enfermedad, disfunción, trastorno, deficiencia o condición anormal en un mamífero, o uno o más síntomas de los mismos, en el que el mamífero tiene, se sospecha que tiene, está en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con al menos un primer trastorno, enfermedad o distrofia de la retina.
10. El virión o partícula vírica o composición para el uso según la reivindicación 9, en el que el mamífero está en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con una deficiencia en el polipéptido de guanilato ciclasa retiniana biológicamente activo.
11. El virión o partícula vírica o composición para el uso según la reivindicación 9 o 10, en el que el mamífero es un neonato, recién nacido, bebé o joven humano que está en riesgo de desarrollar o se ha diagnosticado con una distrofia retiniana congénita tal como amaurosis congénita de Leber 1 (LCA-1).
12. El virión o partícula vírica o composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 11, en el que la enfermedad, disfunción, trastorno, deficiencia o condición anormal es amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1) o un síntoma de la misma.
13. El virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición según la reivindicación 6 para usar en un método de tratamiento proporcionando a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de guanilato ciclasa humana específica de la retina, biológicamente activo, a un mamífero que lo necesita, que comprende introducir en células adecuadas de un mamífero que lo necesita, una cantidad efectiva del virión o partícula vírica o composición, opcionalmente en el que el mamífero que lo necesita tiene un defecto, deficiencia, o ausencia sustancial de la proteína retGC1 biológicamente activa en al menos un primer tejido del mamífero, cuando se compara con el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en un mamífero normal, opcionalmente en el que se proporciona a las células adecuadas el virión o partícula vírica o composición ex vivo o in vitro, y el método comprende además introducir las células provistas en al menos un primer sitio de tejido en o alrededor del cuerpo del mamífero o en el que las células provistas se introducen en al menos un primer sitio en uno o ambos ojos del mamífero por inyección directa en la retina o el tejido circundante.
14. El virión o partícula vírica para el uso según la reivindicación 13, en el que la introducción del virión o partícula vírica o composición conserva los fotorreceptores de los conos, fotorreceptores, restaura la función mediada por los conos, restaura el comportamiento visual, o cualquier combinación de los mismos, en el ojo del mamífero, en el que preferiblemente una única introducción del virión o partícula vírica o composición en el ojo del mamífero conserva los fotorreceptores de los conos, restaura la función mediada por los conos, restaura el comportamiento visual o cualquier combinación de los mismos, en el mamífero durante un periodo de al menos seis meses o en el que una única introducción del virión o partícula vírica o composición en el ojo del mamífero conserva los fotorreceptores de los conos, restaura la función mediada por los conos, restaura el comportamiento visual, o cualquier combinación de los mismos, en el mamífero durante un periodo de al menos diez meses.
15. El virión o partícula vírica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición según la reivindicación 6 para el uso en un método de tratamiento que aumenta el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en una o más células retinianas de un mamífero que tiene, se sospecha que tiene, está diagnosticado con, o está en riesgo de desarrollar, LCA1, que comprende introducir el virión o partícula vírica o composición en al menos una primera población de células retinianas del mamífero, en una cantidad y durante un tiempo efectivo para aumentar el nivel de proteína retGC1 biológicamente activa en una o más células retinianas del mamífero.
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