RS58434B1 - Sastavi raav-guanilatne ciklaze i postupci tretiranja leberove urođene amauroze-1 (lca1) - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva prioritet privremene prijave patenta Sjedinjenih Država br.

61/327,521, koja je podneta 23. aprila 2010.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na oblasti molekularne biologije i virologije, i posebno na postupke za upotrebu sastava rekombinantnih adeno-povezanih virusa (rAAV) koje eksprimiraju barem prvi segment nukleinske kiseline koji kodira barem prvi terapijski genski proizvod, i posebno one proizvode koji su korisni u sprečavanju, tretmanu ili poboljšanju jednog ili više simptoma bolesti, poremećaja, trauma, povreda ili disfunkcije oka sisara. U posebnim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave koji uključuju rAAV vektore koji eksprimiraju biološki funkcionalni peptid, polipeptid ili protein guanilatne ciklaze za upotrebu u jednom ili više istraživačkih, dijagnostičkih i/ili terapijskih režima, uključujući, na primer, tretman jednog ili više poremećaja ili bolesti oka sisara, i naročito, za tretman urođenog slepila retine, uključujući, retinalnu distrofiju kao što je Leberova urođena amauroza, tip 1 (LCA1) kod ljudi. Takođe su pruženi postupci za pripremanje rAAV lekova na bazi vektora guanilatne ciklaze za upotrebu u genskim terapijama zasnovanim na virusnim vektorima, uključujući, na primer, vektore rAAV-LCA1 za tretman ili ublažavanje jednog ili više simptoma nedostatka guanilatne ciklaze kod ljudi.

OPIS POVEZANE STRUKE

[0003] Leberova urođena amauroza (LCA) (ranije „amaurosis congenita od Lebera“), prvi put opisana kao urođeni tip retinitis pigmentoze (RP) od strane nemačkog oftalmologa dr. Teodora Lebera 1869. godine, je najraniji i najteži oblik nasleđene retinopatije, i predstavlja oko 6% svih nasleđenih retinalnih distrofija. LCA je grupa degenerativnih oboljenja retine i najčešći je uzrok urođenog slepila kod dece. Ovo autosomno recesivno stanje se obično prepoznaje pri rođenju ili tokom prvih meseci života kod novorođenčeta sa totalnim slepilom ili značajno oštećenim vidom, normalnim fundusom i ugašenim elektroretinogramom (ERG) (pogledati npr., Perrault i dr., 1996). Uprkos ovim funkcionalnim deficitima, LCA1 pacijenti godinama zadržavaju neke fotoreceptore štapića i čepića u makularnoj i perifernoj retini. Simptomi bolesti uključuju retinalnu disfunkciju, nesigurno kretanje oka (nistagmus), oštećenje vida, spor odgovor zenice, i na kraju slepilo.

[0004] Kroz genetske analize, mutacije u guanilatnoj ciklazi-1 (Gucy2d), dodeljene lokusu LCA1, pokazalo se da čine 20% svih prijavljenih slučajeva LCA (pogledati npr., Milam i dr., 2003; Perrault i dr., 1996; Perrault i dr., 2000). Broj pacijenata obolelih od LCA1 je otprilike dvostruko veći od pacijenata pogođenih defektima u verziji bolesti 65-kDa proteina specifičnog za retinalni pigmentni epitel (LCP2), koji je privukao veliku pažnju u zajednici genetske terapije u skorije vreme.

[0005] Procenjuje se da 200,000 Amerikanaca ima Leberov tip 1. Gucy2d kodira guanilatnu ciklazu (retGC1) koja se eksprimira u membranama spoljašnjeg segmenta fotoreceptora (pogledati npr. Dizhoor i dr., 1994; Liu i dr., 1994) i igra ulogu u fazi oporavka fototransdukcije. Smatra se da mutacije koje smanjuju ili ukidaju aktivnost ovog enzima stvaraju biohemijski ekvivalent hronične izloženosti svetlosti u fotoreceptorima štapića i čepića. LCA se obično posmatra kao posledica poremećenog razvoja fotoreceptora ili izuzetno rane degeneracije ćelija koje su se normalno razvile. Lokus LCA1 (Gucy2d) je mapiran u ljudski hromozom 17p 13.1 (LCA1) mapiranjem homozigotnosti.

NEDOSTACI U STANJU TEHNIKE

[0006] Trenutno ne postoje efikasni profilaktički ili terapijski agensi za sprečavanje ili tretman LCA1 kod ljudi.

SAŽETAK PRONALASKA

[0007] U prvom aspektu predmetnog pronalaska pružen je rekombinantni adeno-povezani virusni (rAAV) vektor koji sadrži barem prvi polinukleotid koji sadrži fotoreceptor-specifičan promoter ljudske rodopsin kinaze, operativno vezan za barem prvi segment nukleinske kiseline koji kodira barem prvi biološki aktivni, retinalno-specifični ljudski polipeptid guanilatne ciklaze koji sadrži barem prvi susedni region aminokiselinske sekvence koja je najmanje oko 95% identična najmanje 120 susednih aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO: 1, gde je rAAV vektor rekombinantni vektor serotipa 5 (rAAV5) adeno-povezanog virusa ili gde je rAAV vektor rekombinantni vektor serotipa 8 (rAAV8) adeno-povezanog virusa.

[0008] U daljem aspektu predmetnog pronalaska pružen je sastav koji sadrži:

(1) vektor rAAV u skladu sa ovim pronalaskom; i

(2) farmaceutski prihvatljiv pufer, nosač, vozilo ili razblaživač.

[0009] U daljem aspektu predmetnog pronalaska pružen je vektor predmetnog pronalaska ili sastav predmetnog pronalaska za upotrebu u terapiji, poželjno za upotrebu u a) terapiji ili profilaksi ljudske distrofije, bolesti ili poremećaja, uključujući Leberovu urođenu amaurozu (LCA1) ili b) dijagnostifikovanje, sprečavanje, tretman ili ublažavanje bolesti, poremećaja, disfunkcije ili abnormalnog stanja oka sisara, ili jednog ili više simptoma.

[0010] U daljem aspektu predmetnog pronalaska pružen je vektor predmetnog pronalaska ili sastav prema prikazanom pronalasku za upotrebu u postupku za sprečavanje, tretman ili ublažavanje bolesti, disfunkcije, poremećaja, nedostatka ili abnormalnog stanja kod sisara. ili jedan ili više njihovih simptoma, gde se sumnja da je sisar izložen riziku za razvoj, ili mu je dijagnostifikovan barem prvi retinalni poremećaj, bolest ili distrofija.

[0011] Ovaj pronalazak prevazilazi ograničenja koja su svojstvena prethodnom stanju tehnike pružanjem novih, ne-očiglednih i korisnih genetskih konstrukata baziranih na rAAV koji kodiraju jedan ili više terapeutskih polipeptida sisara, i naročito onih proteina, peptida, polipeptida porodice guanilatne ciklaze, za profilaksu, tretman i/ili ublažavanje jedne ili više bolesti, poremećaja ili disfunkcija sisara, ili jednog ili više njihovih simptoma, koji su rezultat, ili su pogoršani zbog deficita, ili nedostatka, biološki aktivne polipeptidne aktivnosti guanilatne ciklaze. Naročito, pronalazak pruža genetske konstrukte koji kodiraju jedan ili više polipeptida retinalno-specifične guanilatne ciklaze (retGC1) sisara, za upotrebu u tretmanu takvih stanja kao što su LCA1, i drugih stanja oka, kao što su recesivni i dominantni oblici štapić-čepić distrofije koja se manifestuje zbog nedostatka ili odsustva fiziološki normalnih nivoa polipeptida guanilatne ciklaze.

[0012] Ovaj pronalazak pruža rekombinantni adeno-povezani virusni (rAAV) vektor koji uključuje barem prvi polinukleotid koji sadrži promoter koji je operativno vezan za barem prvi segment nukleinske kiseline koji kodira barem prvi protein, peptid ili polipeptid guanilatne ciklaze sisara. Poželjno, promoter je promoter specifičan za fotoreceptor (kao što je, na primer, ljudski promoter rodopsin kinaze), ili sveprisutni promoter (kao što je, na primer, skraćeni himerni CMV-pileći promoter β-aktina). Poželjno je da prvi segment nukleinske kiseline kodira barem prvi protein, peptid, ili polipeptid guanilatne ciklaze sisara koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili alternativno, sastoji se od barem prvog susednog regiona aminokiselinske sekvence koja je najmanje oko 80%, oko 85%), ili oko 90% ili više identična sa barem prvim regionom sekvence od najmanje oko 60, oko 70, oko 80, oko 90, ili oko 100 ili više susednih aminokiselina sekvence kao što je navedeno u bilo kom ili više proteina guanilatne ciklaze sisara prikazanih u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ili SEQ ID NO: 11.

[0013] U izvesnim opisanim otelotvorenjima, barem prvi segment nukleinske kiseline poželjno kodira barem prvi protein, peptid, ili polipeptid guanilatne ciklaze sisara koji uključuje barem prvu sekvencu regiona sekvence aminokiselina koja je najmanje oko 91%, oko 92% oko 93%), oko 94%, ili oko 95% ili više identična na primarnoj aminokiselinskoj sekvenci sa barem prvi regionom sekvence od najmanje oko 100, oko 110, oko 120, oko 130, oko 140, ili oko 150 ili više susednih aminokiselina sekvence kao što je prikazano u bilo kojoj ili više sekvenci proteina guanilatne ciklaze sisara navedenih u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11.

[0014] Poželjno, barem prvi segment nukleinske kiseline će kodirati barem jedan ili više proteina guanilatne ciklaze sisara, peptida, ili polipeptida koji svaki poželjno uključuje barem prvu susednu primarnu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% identična barem prvom regionu sekvence koja uključuje najmanje oko 90, oko 110, oko 130, oko 150, ili oko 170 ili više od 170 susednih aminokiselina barem prvog proteina guanilatne ciklaze, kao što je prikazano u jednom ili više od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11.

[0015] Poželjno, rAAV vektori predmetnog pronalaska uključuju barem prvi segment nukleinske kiseline koji kodira barem prvi protein, peptid, ili polipeptid guanilatne ciklaze sisara koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili alternativno, sastoji se od aminokiselinske sekvence bilo koje ili više od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11, ili polinukleotidne sekvenca koja je komplementarna ili specifično hibridizuje sa jednom ili više takvih sekvenci pod strogim, do visoko strogih uslova hibridizacije. Poželjno, prvi protein, peptid ili polipeptid guanilatne ciklaze sisara će imati aktivnost guanilatne ciklaze in vitro i in vivo u transformisanim ćelijama sisara, i poželjno, u transformisanim ćelijama domaćina. U određenim aspektima, protein, peptid ili polipeptid guanilatne ciklaze će imati značajnu aktivnost biološki aktivne guanilatne ciklaze in vitro i in vivo u transformisanim ćelijama sisara, i poželjno, u transformisanim ćelijama domaćina kada je segment nukleinske kiseline koji kodira peptid, protein, ili polipeptid operativno povezan sa barem prvim promoterom sposobnim za eksprimiranje sekvence u sisarskom, i poželjno, ljudskom, domaćinu ćelija.

[0016] Dok rAAV vektori predmetnog pronalaska nisu nužno ograničeni na određeni serotip, u izvesnim otelotvorenjima, pronalazači razmatraju korisne rezultate koji se mogu postići upotrebom rAAV vektora koji su jedan ili više od sledećih poznatih serotipova: vektor rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 1 (rAAV1), rekombinantnog adenopovezanog virusa serotipa 2 (rAAV2), rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 3 (rAAV3), rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 4 (rAAV4), rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 5 (rAAV5), rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 6 (rAAV6), rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 7 (rAAV7), rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 8 (rAAV8), ili rekombinantnog adenopovezanog virusa serotipa 9 (rAAV). U određenim primenama, rAAV vektori prema predmetnom pronalasku mogu biti samo-komplementarni rAAV (scAAV) vektor.

[0017] U otelotvorenjima u kojima je poželjan promoter specifičan za fotoreceptor, ovde opisani rAAV vektori mogu uključivati barem prvi promoter rodopsin kinaze specifičan za fotoreceptor. Primeri takvih promotera uključuju ljudski promoter rodopsin kinaze, koji je ilustrovan u SEQ ID NO: 12. U određenim aspektima pronalaska, upotreba promoterske sekvence koja uključuje najmanje oko 20, najmanje oko 25, najmanje oko 30, najmanje oko 35, najmanje oko 40, najmanje oko 45, ili najmanje oko 50 ili više susednih nukleotida iz SEQ ID NO: 12 je naročito poželjno kada je poželjno eksprimiranje terapeutskog konstrukta specifičnog za tkivo (i naročito, fotoreceptor).

[0018] Slično tome, u otelotvorenjima u kojima je poželjan sveprisutni promoter, ovde opisani rAAV vektori mogu uključiti barem prvi skraćeni himerni promoter CMV-pilećeg βaktina. Primeri takvih promotera uključuju skraćeni himerni promoter CMV-pilećeg β-aktina, koji je ilustrovan u SEQ ID NO: 13. U određenim aspektima pronalaska, upotreba promoterske sekvence koja uključuje najmanje oko 20, najmanje oko 25, najmanje oko 30, najmanje oko 35, najmanje oko 40, najmanje oko 45, ili najmanje oko 50 ili više nukleotida iz SEQ ID NO: 13 je naročito poželjna kada je poželjno eksprimiranje terapeutskog gena koje nije specifično za tkivo.

[0019] U nekim otelotvorenjima, promoterska sekvenca koja se koristi u opisanim terapeutskim genskim konstruktima može da sadrži, sastoji se u suštini od, ili alternativno, sastoji se od sekvence nukleinske kiseline koja uključuje najmanje 55, oko 60, oko 65, oko 70, oko 75, oko 80, oko 85, oko 90, oko 95, oko 100, oko 105, oko 110, oko 115, ili oko 120 ili više susednih nukleotida iz promoterskih sekvenci datih bilo u SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 13.

[0020] Vektori za gensku terapiju, koji su ovde opisani, mogu takođe dodatno, opciono, uključiti jednu ili više „uzvodnih“ ili „nizvodnih“ regulatornih sekvenci, kao što je prvi pojačivač operativno vezan za barem prvi nukleinski segment, ili transkripcioni regulatorni region, kao što je post-transkripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota.

Konstrukti predmetnog pronalaska mogu takođe dalje da uključuju jednu ili više intronskih sekvenci koje su operativno povezane sa najmanje jednim nukleinskim segmentom koji kodira terapeutski agens.

[0021] Segmenti nukleinske kiseline koji kodiraju proteine, peptide i polipeptide guanilatne ciklaze sisara mogu biti izvedeni iz prirodnih, polusintetičkih ili potpuno sintetičkih sekvenci, ali će poželjno biti poreklom od sisara. Primerni sisarski izvori uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude, primate koji nisu ljudi, miševe, mačke, pse, svinje, ovce, goveda, konje, epine, koze, lupine i slično.

[0022] rAAV vektori koji su ovde opisani mogu opciono biti sadržani unutar infektivne adeno-povezane virusne čestice, viriona, ili unutar jednog ili više od mnoštva infektivnih AAV čestica. Kao takav, ovaj pronalazak takođe obuhvata virione, virusne čestice, kao i izolovane rekombinantne ćelije domaćina koje sadrže jedan ili više obelodanjenih rAAV genetskih konstrukata. Posebno poželjne ćelije domaćini za primenu pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovane ćelije domaćina sisara koje uključuju jedan ili više od: rAAV vektora, AAV viriona, ili mnoštvo infektivnih virusnih čestica.

[0023] U drugim aspektima, pronalazak pruža nove i korisne sastave koji uključuju jedan ili više od (a) rAAV vektora, rAAV viriona, rAAV infektivne virusne čestice, mnoštvo takvih viriona ili infektivnih čestica, ili izolovana ćelija domaćina sisara koja je sadrži vektor, virion, infektivnu česticu ili više njih. Poželjno, takvi sastavi će dodatno po izboru uključivati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih pufera, nosača, vozila, razblaživača i slično, i mogu dodatno opciono uključivati jedan ili više lipida, lipozoma, lipidnih kompleksa, etozoma, niozoma, nanočestica, mikročestica, liposfera, nanokapsula, ili bilo koje njihove kombinacije. Poželjno je da su takvi sastave poželjno formulisani za davanje ljudskom oku, i mogu se koristiti u terapiji ili profilaksi, i naročito u terapiji ili profilaksi ljudske retinalne distrofije, bolesti ili poremećaja (kao što je LCA1).

[0024] Kao što je navedeno u daljem tekstu, pronalazak takođe obuhvata dijagnostičke, terapeutske i profilaktičke komplete koji uključuju jedan ili više rAAV vektorskih konstrukata koji su ovde opisani. Takvi kompleti mogu dodatno opciono uključivati jedan ili više protokola, režima doziranja ili uputstva za upotrebu sastava u dijagnostici, sprečavanju, tretmanu ili ublažavanju jednog ili više simptoma retinalne distrofije, bolesti, poremećaja ili abnormalnog stanja kod ljudi. U određenim aspektima, terapijski kompleti za tretman ljudskih pacijenata sa dijagnozom Leberove urođene amauroze-1 (LCA-1) su posebno razmatrani.

[0025] Ovaj pronalazak takođe obuhvata upotrebu jednog ili više od opisanih sastava baziranih na rAAV u terapiji, ili u profilaksi bolesti ili poremećaja kod sisara. Slično tome, pronalazak uključuje upotrebu opisanih sastava u proizvodnji lekova za dijagnostifikovanje, sprečavanje, tretman ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti, poremećaja, disfunkcije ili abnormalnog stanja oka sisara, i naročito, za tretman ili ublažavanje jednog ili više simptoma Leberove urođene amauroze-1 (LCA-1) kod ljudi.

[0026] Ovaj pronalazak takođe pruža postupak za sprečavanje, tretman ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti, disfunkcije, poremećaja, nedostatka ili abnormalnog stanja kod sisara. Takav postupak generalno uključuje davanje sisaru, kom je to potrebno, efikasne količine rAAV sastava koja je ovde opisana za vreme koje je dovoljno da se spreči, tretira i/ili poboljša jedan ili više simptoma bolesti, disfunkcije, poremećaja, nedostatka ili abnormalnosti stanja kod sisara. Takav sisar poželjno ima, sumnja se da ima, pod rizikom je za razvoj, ili mu je dijagnostifikovan barem prvi retinalni poremećaj, bolest ili distrofija, uključujući, na primer, Leberovu urođenu amaurozu-1 (LCA-1), ili gde je sisar izložen riziku za razvoj, ili je dijagnostifikovan sa jednim ili više nedostataka, defekata ili odsustva biološki aktivnog, funkcionalnog proteina, peptida ili polipeptida guanilatne ciklaze. Sisar može biti bilo kog uzrasta, ali će poželjnije biti novorođenče, beba, dete ili maloletnik koji je izložen riziku za razvoj ili mu je dijagnostifikovana urođena retinalna distrofija kao što je Leberova urođena amauroza-1 (LCA-1).

[0027] Obelodanjenje takođe pruža postupak za pružanje sisaru kom je to potrebno terapeutski efikasne količine biološki aktivnog peptida, polipeptida ili proteina guanilatne ciklaze. Takav postupak generalno uključuje barem korak uvođenja u pogodne ćelije sisara, kom je to potrebno, efikasne količinu jednog ili više vektora rAAV koji su ovde opisani, za vreme koje je dovoljno da proizvede biološki aktivan peptid, polipeptid ili protein guanilatne ciklaze u barem prvoj populaciji ćelija ili bar barem prvom tkivu sisara u kog je uveden rAAV vektor. U praksi postupka, sisar kom je to potrebno će poželjno imati jedan ili više defekata, nedostataka, ili suštinsko ili potpuno odsustvo funkcionalnog, biološki aktivnog retGC1 proteina u jednom ili više tkiva unutar ili oko tela sisara, kada se poredi sa nivoom biološki aktivnog retGC1 proteina kod normalnog sisara. U određenim primenama postupka, mnoštvo ćelija sisara je pruženo sa rAAV vektorom ex vivo ili in vitro, sa postupkom koji dalje uključuje dodatni korak naknadnog uvođenja mnoštva pruženih ćelija u barem prvo mesto tkiva unutar ili oko tela sisara. Na primer, mnoštvo dobijenih ćelija može biti uvedeno u barem prvo mesto unutar jednog ili oba oka sisara, uključujući, na primer, direktno davanje injekcije u retinu, sub-retinalni prostor, ili u jedno ili više tkiva koje okružuju retinu, ili u celo oku, ili u tkiva oko oka.

[0028] U određenim aspektima, uvođenje rAAV-vektorizovanog konstrukta gena guanilat ciklaze u ćeliju, i njegovo naknadno eksprimiranje dozvoljava translaciju funkcionalnog peptida, proteina, ili polipeptida guanilatne ciklaze, i kao rezultat toga, fotoreceptori čepića su sačuvani i konično posredovana funkcija je vraćena. Važno je da takav postupak pruža povratak normalnog vizuelnog ponašanja u oko sisara, i poželjno, povratak vida.

[0029] Primena rAAV vektora prema pronalasku može biti deo jednokratne terapije, ili može biti deo tekućeg režima terapije koji se ponavlja dva ili više puta tokom života pacijenta koji se tretira. U određenim aspektima, pojedinačna primena rAAV konstrukata proizvodi produženo formiranje proteina guanilatne ciklaze, sa očuvanjem fotoreceptora čepića, i obnavljanje funkcije posredovane čepićem i vizuelnog ponašanja tokom perioda od najmanje jednog meseca, najmanje dva meseca, na najmanje tri meseca ili duže nakon primene. Još poželjnije, dugotrajna terapija ili profilaksa se postiže korišćenjem jedne ili više naknadnih primena terapijskih konstrukata u oku sisara tokom perioda od nekoliko meseci do nekoliko godina. Poželjno je da su fotoreceptori čepića očuvani, i funkcija i vizuelno ponašanje koji se posreduju čepićem obnavljaju se kod sisara tokom perioda od najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, ili više nakon primene. U određenim aspektima, očuvanje fotoreceptora, funkcije posredovane čepićem i vizuelnog ponašanja se obnavljaju kod sisara tokom perioda od najmanje jedne godine, najmanje dve godine, najmanje tri godine, ili najmanje četiri godine ili duže nakon završetka režima tretmana koji uključuje sastave koji su ovde opisani. Pronalazak dalje pruža postupak za povećanje nivoa biološki aktivnog retGC1 proteina u jednoj ili više retinalnih ćelija kod sisara, za kog se sumnja da ima dijagnozu, ili je pod rizikom za razvoj, LCA1. Takav postupak generalno uključuje uvođenje u barem prvu populaciju retinalnih ćelija sisara kom je to potrebno, jednog ili više od opisanih virusnih vektorskih konstrukata rAAV-guanilatne ciklaze, u količini i za vreme efektivno da se poveća nivo biološki-aktivnog retGC1 proteina u jednoj ili više retinalnih ćelija sisara. Takav postupak je naročito razmatran za sprečavanje, tretman ili ublažavanje jednog ili više simptoma distinalne distrofije kod sisara, i poželjno može uključivati direktnu ili indirektnu primenu na retini, sub-retinalnom prostoru ili oku sisara jednog ili više od opisanih terapeutskih konstrukta, u količini i za vreme koje je dovoljno za tretman ili ublažavanje jednog ili više simptoma distinalne distrofije kod sisara.

[0030] Obelodanjenje takođe pruža sastave i postupke za sprečavanje, tretman ili ublažavanje simptoma nedostatka proteina guanilatne ciklaze kod sisara, i naročito za tretman ili smanjenje ozbiljnosti ili stepena nedostatka kod čoveka koji ispoljava jedan ili više poremećaja povezanih sa nedostatkom biološki aktivnih polipeptida guanilatne ciklaze. U opštem smislu, postupak uključuje davanje životinje najmanje jednog genetskog konstrukta

1

na bazi rAAV koji kodira jedan ili više peptida, polipeptida ili proteina guanilatne ciklaze u farmaceutski prihvatljivom nosaču, u količini i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni za tretman ili ublažavanje nedostatka kod životinje za koju se sumnja da pati od takvog poremećaja, ili jednog ili više njenih simptoma. Primerni polipeptidi guanilatne ciklaze korisni u primeni obelodanjenja uključuju, ali nisu ograničeni na peptide, polipeptide i proteine koji imaju aktivnost guanilatne ciklaze, i koji su suštinski identični u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci bilo kojoj od sekvenci opisanih u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO: 11, i na biološki funkcionalne ekvivalente, ili njihove derivate. Dodatni primeri peptida, proteina i polipeptida guanilatne ciklaze korisnih u primeni pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na one koji obuhvataju, suštinski se sastoje od ili se sastoje od aminokiselinske sekvence koja kodira guanilatnu ciklazu sisara, i naročito one sekvence kao što je opisano u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10, ili SEQ ID NO: 11, i na biološki funkcionalne ekvivalente, ili njihove derivate.

SASTAVI VEKTORA RAAV-GUANILATNE CILLAZE

[0031] U prvom otelotvorenju, obelodanjenje pruža rAAV vektor koji sadrži polipeptid koji sadrži barem prvi segment nukleinske kiseline koji kodira protein, peptid ili polipeptid guanilatne ciklaze, i naročito, protein, peptid ili polipeptid guanilatne ciklaze sisara (ili njegov biološki aktivan fragment ili derivata), operativno povezan za barem prvi promoter sposoban za eksprimiranje segmenta nukleinske kiseline u pogodnoj ćeliji domaćinu transformisanoj sa takvim vektorom. U poželjnim otelotvorenjima, segment nukleinske kiseline kodira sisarski, i naročito, ljudski, peptid, polipeptid ili protein guanilatne ciklaze, i naročito, peptid, polipeptid ili protein koji sadrži barem prvu susednu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% homologna sa najmanje 30 sekvenci sekvence aminokiselina jedne ili više aminokiselinskih sekvenci opisanih u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, ili njegov biološki aktivni fragment ili varijanta.

[0032] Poželjno, polipeptid sadrži barem prvu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% homologna sa najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, ili najmanje 80 susednih aminokiselinskih sekvenci iz SEQ ID NO: 1, i još poželjnije, polipeptid sadrži barem prvu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% homologna sa najmanje 90 susednih aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO: 1.

[0033] Alternativno, terapeutski konstrukti iz opisa mogu obuhvatiti segmente nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide guanilatne ciklaze bilo kog sisarskog porekla, kao što su, na primer, nukleinske kiseline, peptidi i polipeptidi miša, primata, ovaca, svinja, goveda, konja, epina, pasa, mačaka i/ili lupine, ili mogu obuhvatiti modifikovane ili specifične mutagenezirane segmente nukleinskih kiselina koje su prvobitno dobijene od jedne ili više vrsta sisara, i genetički modifikovane da budu eksprimirane u ljudskim ćelijama tako da se njihova aktivnost guanilatne ciklaze zadržala.

[0034] U drugim poželjnim otelotvorenjima, poželjni segmenti nukleinske kiseline za upotrebu u primeni ovog obelodanjenja, kodiraju polipeptid sisara, i posebno, ljudski polipeptid guanilatne ciklaze ili njegov biološki aktivan fragment ili varijantu.

[0035] Polinukleotidi sadržani u vektorima i virusnim česticama predmetnog obelodanjenja poželjno sadrže barem prvi konstitutivni ili inducibilni promoter koji je operativno povezan sa guanilatna ciklaza-kodirajućim segmentom nukleinske kiseline kako je ovde opisano. Takvi promoteri mogu biti homologni ili heterologni promoteri, i mogu biti operativno postavljeni uzvodno od segmenta nukleinske kiseline koja kodira polipeptid guanilatne ciklaze, tako da je eksprimiranje segmenta koji kodira guanilatnu ciklazu pod kontrolom promotera. Konstrukt može sadržati jedan promoter, ili alternativno, dva ili više promotera mogu da se koriste da se olakša eksprimiranje DNK sekvence koja kodira guanilatnu ciklazu.

[0036] Primeri promotera koji su korisni u primeni obelodanjenja uključuju, ali nisu ni na koji način ograničeni na one promoterske sekvence koje se nalaze u sisarskim, i posebno, ljudskim ćelijama domaćina, tkivima i organima, kao što su, na primer, sveprisutni promoteri, kao CMV promoter, promoter, β-aktinski promoter, hibridni CMV promoter, hibridni CMV-β-aktinski promoter, skraćeni CMV promoter, skraćeni β-aktinski promoter, skraćeni hibridni CMV-β-aktinski promoter, EF1 promoter, U1a promoter ili U1b promoter; ili jedan ili više promotera specifičnih za ćelije ili tkivo (uključujući, na primer, promoter specifičan za fotoreceptor kao što je promoter rodopsin kinaze [hGRK1]), ili inducibilni promoter kao što je Tet-inducibilni promoter ili VP16-LexA promoter .

[0037] U ilustrativnim otelotvorenjima, polinukleotid koji kodira terapeutski polipeptid je stavljen pod kontrolu sveprisutnog skraćenog hibridnog pilećeg β- aktinski (CBA) promotera, ili pod kontrolom hGRK1 promotera specifičnog za fotoreceptorske ćelije, i upotrebljen je da proizvede terapeutski efikasan nivo kodiranog polipeptida guanilatne ciklaze kada su odgovarajuće ćelije domaćini transformisane sa genetičkim konstruktom, i DNK koja kodira polipeptid guanilatne ciklaze je eksprimirana u takvim ćelijama. Primer pogodnog hGRK1 promotera je prikazan u SEQ ID NO: 12, dok je pogodan sveprisutni promoter, kao što je skraćeni hibridni pileći β-aktinski (CBA) promoter prikazan u SEQ ID NO: 13.

[0038] Polinukleotidi sadržani u vektorima i virusnim česticama predmetnog obelodanjenja mogu takođe dalje da sadrže jedan ili više prirodnih, sintetičkih, homolognih, heterolognih ili hibridnih pojačivača ili 5' regulatornih elemenata, na primer, prirodni pojačivač, kao što je CMV pojačivač ili alternativno, sintetički pojačivač. Takođe se smatra da su pojačivači specifični za ćelije ili tkiva, uključujući, na primer, one koji povećavaju eksprimiranje operativno vezanih sekvenci gena, posebno korisni u primeni obelodanjenja. Takvi pojačivači mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, retinalno-specifične pojačivače, štapić-specifične pojačivače, čepić-specifične pojačivače, i slično.

[0039] Polinukleotidi i segmenti nukleinske kiseline obuhvaćeni su vektorima i virusnim česticama predmetnog pronalaska

mogu takođe dalje da sadrži jednu ili više intronskih sekvenci. U takvim slučajevima, intronske sekvence će prvenstveno biti poreklom od sisara, i još poželjnije, poreklom od čoveka.

[0040] DNK sekvence, segmenti nukleinske kiseline i polinukleotidi koji se nalaze unutar vektora, viriona, čestica virusa, ćelije domaćina ili sastava prema prikazanom pronalasku takođe mogu dalje da sadrže jedan ili više prirodnih, sintetičkih, homolognih, heterolognih ili hibridnih post-transkripcijskih ili 3' regulatornih elemenata koji su operativno pozicionirani u odnosu na segmente nukleinske kiseline koji kodiraju guanilatnu ciklazu i koji su ovde opisani, kako bi se pružili veće eksprimiranje, veća stabilnost i/ili poboljšana translacija kodiranih polipeptida. Jedan takav primer je post-transkripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WPRE), operativno postavljen nizvodno od gena guanilatne ciklaze.

Upotreba elemenata kao što su ovi u takvim okolnostima je dobro poznata stručnjacima u molekularnoj biologiji.

1

[0041] U ilustrativnim otelotvorenjima, obelodanjenje se odnosi na davanje jednog ili više biološki aktivnih proteina, peptida, ili polipeptida guanilatne ciklaze koji sadrže najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25, najmanje oko 30 najmanje oko 35, najmanje oko 40, najmanje oko 45, najmanje oko 50, najmanje oko 55, najmanje oko 60, najmanje oko 65, najmanje oko 70, najmanje oko 75, najmanje oko 80, najmanje oko 85, najmanje oko 90, najmanje oko 95, ili najmanje 100, ili više susednih aminokiselinskih sekvenci od polipeptidnih i peptidnih sekvenci opisanih u daljem tekstu, i naročito onih polipeptida kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11.

[0042] Slično tome, u dodatnim ilustrativnim otelotvorenjima, obelodanjenje se odnosi na primenu jednog ili više biološki aktivne proteina, peptida ili polipeptida guanilatne ciklaze koji su kodirani segmentom nukleinske kiseline koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od najmanje oko 10, najmanje oko 20, najmanje oko 30, najmanje oko 40, najmanje oko 50, najmanje oko 60, najmanje oko 70, najmanje oko 80, najmanje oko 90, najmanje oko 100, najmanje oko 110, najmanje oko 120, najmanje oko 130, najmanje oko 140, najmanje oko 150, najmanje oko 160, najmanje oko 170, najmanje oko 180, najmanje oko 190, ili najmanje oko 200, oko 250, oko 300, oko 350, oko 400, oko 450, oko 500, oko 550, oko 600, oko 650, oko 700, oko 750, ili čak oko 800 ili više susednih ostataka nukleinskih kiselina iz segmenata nukleinske kiseline koji su ovde opisani, i naročito one DNK sekvence koje kodiraju bilo koji ili više proteina guanilatne ciklaze sisara, uključujući na primer, one koji su navedeni u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11.

[0043] Primeri adeno-povezanih virusnih vektorskih konstrukata i polinukleotida predmetnog pronalaska uključuju one koji sadrže, sastoje se u suštini od ili se sastoje od barem prvog segmenta nukleinske kiseline koji kodira peptid ili polipeptid koji je najmanje oko 75%, najmanje oko 80% %, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% identičan sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, gde peptid ili polipeptid ima aktivnost guanilatne ciklaze kada se eksprimira u odabranim ćelijama i/ili tkivima sisara.

[0044] U određenim otelotvorenjima, virusni vektorski konstrukti i polinukleotidi predmetnog pronalaska će poželjno uključivati one vektore i polinukleotide koji sadrže, sastoje se u suštini od ili se sastoje od barem prvog segmenta nukleinske kiseline koji kodiraju peptid ili polipeptid koji je najmanje oko 82 %, najmanje oko 84%, najmanje oko 86%, najmanje oko 88%, najmanje oko 92%, ili najmanje oko 94% identičan jednoj ili više sekvenci opisanih u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11. Takvi konstrukti će poželjno kodirati jedan ili više biološki aktivnih peptida ili polipeptida koji imaju aktivnost guanilatne ciklaze kada se eksprimiraju u odabranim ćelijama i/ili tkivima sisara i posebno u ljudskim ćelijama i/ili tkivima.

[0045] Primeri polinukleotida predmetnog pronalaska takođe obuhvataju one sekvence koje sadrže, sastoje se u suštini od ili se sastoje od barem prvog segmenta nukleinske kiseline koji je najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% identično sekvenci nukleinske kiseline koja kodira bilo koju od sekvenci sa ID br. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ili SEQ ID NO: 11, gde peptid ili polipeptid kodiran sa segmentom nukleinske kiseline ima aktivnost guanilatne ciklaze kada se eksprimira u odabranim ćelijama i/ili tkivima sisara.

RAAV VIRUSNE ČESTICE I VIRIONI, I ĆELIJE DOMAĆINI KOJE IH OBUHVATAJU

[0046] Drugi aspekti obelodanjenja se odnose na rAAV čestice i virione koji sadrže vektore rAAV-guanilatne ciklaze predmetnog pronalaska, mnoštvo takvih čestica i viriona, kao i farmaceutske sastave i ćelije domaćina koje sadrže jedan ili više vektora rAAV-guaniltne ciklaze kao što su, na primer, farmaceutske formulacije vektora ili viriona rAAV-guanilatne ciklaze namenjenih za davanje sisarima preko pogodnih sredstava, kao što su, intramuskularnom, intravenoznom ili direktnom injekcijom u odabrane ćelije, tkiva ili organe sisara, na primer, jedan ili više regiona oka odabranog sisara. Tipično, takvi sastavi će biti formulisani sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima, puferima, razblaživačima, adjuvantima ili nosačima, kao što je opisano u nastavku, i mogu dalje da sadrže jedan ili više

1

lipozoma, lipida, lipidnih kompleksa, mikrosfera, mikročestica, nanosfera ili formulacija nanočestica koje olakšavaju primenu odabranim organima, tkivima i ćelijama za koje je poželjna terapija.

[0047] Dalji aspekti obelodanjenja obuhvataju ćelije domaćina sisara i njihova mnoštva koja sadrže jedan ili više rAAV vektora, viriona ili infektivnih virusnih čestica, kao što je ovde opisano. Naročito poželjne ćelije su ljudske ćelije domaćini, i posebno ljudska očna tkiva, uključujući, na primer, ćelije retine.

TERAPIJSKI KOMPLETI I FARMACEUTSKI SASTAVI

[0048] Terapeutski kompleti za tretman ili ublažavanje simptoma stanja koje je rezultat nedostatka guanilatne ciklaze kod sisara su takođe deo ovog obelodanjenja.

[0049] Primeri kompleta su oni koji poželjno sadrže jedan ili više obelodanjenih vektorskih konstrukata, viriona, ili farmaceutskih sastava AAV-guanilatne ciklaze koji su ovde opisane, i uputstva za upotrebu kompleta. Upotreba takvih kompleta u postupcima tretmana nedostatka guanilatne ciklaze, i posebno, retinal-specifične guanilatne ciklaze-1, poželjna je pri tretmanu retGC1 defekta ili nedostatka i u tretmanu retinalnih distrofija kao što je LCA-1 kod pogođenog sisara.

[0050] Drugi važan aspekt ovog problema odnosi se na upotrebu opisanih vektora, viriona, sastav i ćelija domaćina koje su ovde opisane u pripremi lekova za tretman ili ublažavanje simptoma nedostatka guanilatne ciklaze kod sisara, i naročito kod ljudi. Upotreba takvih sastava u pripremi lekova i u postupcima za tretman neuroloških defekata i/ili defekata centralnih nervnih sistema, uključujući na primer, stanja koja su posledica nedostatka ili defekta GC1 retine, kao što je na primer kod retinalnim distrofijama kao što je LCA-1, generalno uključuje davanje sisaru, i naročito čoveku kom je to potrebno, jednog ili više obelodanjenih virusnih vektora, viriona, ćelija domaćina, ili sastava koji sadrže jednu ili više njih, u količini i za vreme dovoljno za tretman ili ublažavanje simptoma takvog nedostatka kod obolelog sisara. Postupci mogu takođe obuhvatiti profilaktički tretman životinja za koje se sumnja da imaju takva stanja, ili davanje takvih sastava životinjama pod rizikom za razvoj takvih stanja ili nakon dijagnoze, ili pre početka simptoma.

[0051] Drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na sastave koji sadrže jedan ili više

1

opisanih adeno-povezanih virusnih vektora, viriona, virusnih čestica i ćelija domaćina kao što je ovde opisano. Farmaceutske sastave koji sadrže takve su posebno razmatrane kao korisne u terapiji, i naročito u pripremi lekova za tretman obolelih sisara, i posebno ljudi.

TERAPEUTSKI POSTUPCI

[0052] Ovaj pronalazak takođe pruža postupke za isporuku terapeutski efikasnih količina polipeptida guanilatne ciklaze sisaru kom je to potrebno. Takvi postupci obično obuhvataju barem korak pružanja ili davanja takvom sisaru, jednu ili više smeša guanilatne ciklaze koja je ovde opisana. Na primer, postupak može da obuhvati davanje takvom sisaru jednog ili više rAAV vektora, viriona, virusnih čestica, ćelija domaćina ili farmaceutskih sastava kao što je ovde opisano. Poželjno je da takvo davanje ili takva primena budu u količini i za vreme efektivno da pruži terapeutski efikasna količina jednog ili više polipeptida guanilatne ciklaze koji su ovde opisani za izabrane ćelije, tkiva ili organe sisara, i naročito, terapeutski efikasne nivoe do ćelija oka sisara. Takvi postupci mogu uključivati sistemsku injekciju terapeutskog agensa, ili čak mogu uključivati direktnu ili indirektnu primenu, injekciju ili uvođenje terapeutskih sastava u određene ćelije, tkiva ili organe sisara.

[0053] Na primer, terapeutski sastav može biti pružena sisaru direktnom injekcijom u tkiva oka ili retine, ili u subretinalni prostor, ili u jedan ili više određenih tipova ćelija u oku sisara.

[0054] Obelodanjenje takođe pruža postupke za tretman, ublažavanje simptoma i smanjenje ozbiljnosti nedostatka guanilatne ciklaze kod životinje. Ovi postupci generalno obuhvataju najmanje korak pružanja životinji kojoj je to potrebno, jednog ili više sastava rAAV vektora guanilatne ciklaze koji su ovde opisane, u količini i za vreme koji su efikasni u tretmanu defekta ili nedostatka polipeptidnog retGC1, ili za tretman disfunkcije koji nastaju takvom akumulacijom, ili su rezultat nedovoljnog prisustva ili odsustva dovoljnog biološki aktivnog polipeptida guanilatne ciklaze u životinji, uključujući retinalne distrofije poput LCA1 i slično. Kao što je gore opisano, takvi postupci mogu uključivati sistemsku injekciju terapeutskog agensa, ili čak mogu uključivati direktnu ili indirektnu primenu, injekciju ili uvođenje terapeutskih sastav u određene ćelije, tkiva ili organe životinje.

[0055] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu adeno-povezanih virusnih vektora, viriona, virusnih čestica, ćelija domaćina i/ili farmaceutskih sastava koji su ovde opisani u proizvodnji leka za tretman defekta ili nedostatka guanilatne ciklaze, distinalne distrofije, ili

1

LCA1 ili druge očne bolesti, poremećaja ili disfunkcije povezane sa GC1 kod sisara. Ova upotreba može uključivati sistemsku ili lokalizovanu injekciju, infekciju, ili davanje jednoj ili više ćelija, tkiva ili organa sisara. Takva upotreba je posebno razmatrana kod ljudi koji imaju, sumnja se da imaju, ili su pod rizikom za razvijanje jedne ili više retinalnih distrofija kao što je LCA-1.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0056] Sledeći crteži čine deo ove specifikacije i uključeni su da dalje demonstriraju određene aspekte predmetnog pronalaska. Pronalazak se može bolje razumeti pozivanjem na sledeći opis koji je uzet zajedno sa priloženim crtežima, gde slični referentni brojevi identifikuju slične elemente, i gde:

SLIKA 1 prikazuje reprezentativne kupaste- (leva kolona) i štapić- (desna kolona) ERG tragove od /+ (gornji talasasti oblici), netretiranih GC1KO (srednji talasasti oblici) i AAV-mGC1-tretiranih (donji talasasti oblici) miševa. Crni tragovi odgovaraju očima kojima su date injekcije sa hGRK1-mGC1 (donji talasasti oblici) i njihovim kontralateralnim očima kojima nisu date injekcije (srednji talasasti oblici). Crveni tragovi odgovaraju očima kojima su date injekcije sa smCBA-mGCl (donji talasasti oblici) i kontralateralnim očima kojima nisu date injekcije (srednji talasasti oblici). Odgovori čepića u očima tretiranim sa AAV-mGC1 se vraćaju na približno 45% normale;

SLIKA 2A i SLIKA 2B pokazuju prosečne fotopične maksimalne amplitude b-talasa kod GC1KO, izogenim /+ kontrolama, smCBA-mGC1 tretiranim (SLIKA 2A) i hGRK1-mGC1-tretiranim (SLIKA 2B) GC1KO miševi tokom vremena. kupasti odgovori za miševe tretirane smCBA-mGCl i hGRK1-mGC1 su približno 45% normalni za najmanje 3 meseca nakon injekcije;

SLIKA 3A, SLIKA 3B, i SLIKA 3C ilustruju optomotornom analizom da je vizuelno izazvano ponašanje obnovljeno kod GC1KO miševa tretiranih bilo sa smCBA-mGCl ili hGRK1-mGC1. M1 do M9 odgovaraju devet miševa korišćenih za testiranje. Fotopične oštrine i kontrastne osetljivosti /+ kontrolnih miševa (M1, M2), naivnih GC1KO (M3, M4), smCBA-mGCl (M5, M6, M7) i hGRK1-mGC1-tretiranih miševa (M8, M9) otkrivaju da se tretirani miševi ponašaju kao normalno vidljivi miševi (SLIKA 3B i SLIKA 3C). Prikazani su proseci svih /+ očiju (n=4), GC1KO očiju (n=9) i AAV-mGC1-tretiranih očiju (n=5) (SLIKA 3C). Ispitivani ERG odgovori od svakog miša (M1-M9) prikazani su za elektrofiziološko poređenje

1

(SLIKA 3A);

SLIKA 4A, SLIKA 4B, SLIKA 4C, SLIKA 4D, SLIKA 4E, i SLIKA 4F pokazuju da AAV5-hGRK1-mGC1 pokreće eksprimiranje GC1 u spoljašnjim segmentima fotoreceptora GC1KO miševa (SLIKA 4A). Nema eksprimiranja GC1 u netretiranom kontralateralnom kontrolnom oku (SLIKA 4B). AAV5-smCBA-mGC1 pokreće eksprimiranje GC1 u spoljašnjim segmentima fotoreceptora (SLIKA 4C) i povremeno u telu fotoreceptora (bele strelice na SLICI 4F). Takvo GC1 eksprimiranje nije primećeno u netretiranom kontralateralnom kontrolnom oku (SLIKA 4D). Nivoi eksprimiranja terapijskog transgena u očima tretiranim sa AAV5-mGC1 slični su onima koji se vide u izogenim+/+ kontrolnim očima (SLIKA 4E). Sve retine su uzete od miševa 3 meseca nakon tretmana ili starosno usaglašenih netretiranih kontrola. Stubići skale na SLICI 4A = 100 µm; na SLICI 4F = 25 µm. OS = spoljni segmenti, IS = unutrašnji segmenti, ONL = spoljni nuklearni sloj;

SLIKA 5A, SLIKA 5B, SLIKA 5C, i SLIKA 5D pokazuju eksprimiranje arestina čepića u kupastim fotoreceptorima od /+, GC1KO, AAV5-smCBA-mGC1-tretiranih i AAV5-hGRK1-mGC1-tretiranih miševa. netretirane GC1KO retine sadrže karakteristične dezorganizovane, odvojene spoljne segmente čepića (SLIKA 5B), dok su spoljašnji segmenti čepića bili netaknuti, i distribucija arestina čepića je izgledala normalna u tretiranim GC1KO (SLIKA 5C i Slika 5D) i /+ (SLIKA 5A) retinalnim sekcijama Sve retine su uzimane od miševa 3 meseca posle tretmana ili starosti kontrolne grupe. Stubići skale na SLICI 5D = 100 µm. OS = spoljni segmenti, IS = unutrašnji segmenti, S = sinaptički terminali;

SLIKA 6A, SLIKA 6B, SLIKA 6C i SLIKA 6D pokazuju da AAV-mGC1 tretman rezultuje u očuvanju kupastog fotoreceptora u tretiranim očima najmanje tri meseca nakon tretmana. Reprezentativne retinalne količine iz hGRK1-mGC1 studije (SLIKA 6A: „bez TX“ = netretirano; SLIKA 6C: „TX“ = tretirano) i smCBA-mGCl studija (SLIKA 6B: „no TX = netretirano; SL: „TX“ = tretirano) i kontralateralne oči kojima nisu date injekcije obojene za arestin čepića otkrivaju da su fotoreceptori čepića sačuvani kod GC1KO miševa tretiranim sa AAV-mGC1 najmanje 3 meseca nakon tretmana. Gustine ćelijskih ćelija su brojane u centralnim i donjim retinama tretiranih i netretiranih miševa. Utvrđene su značajne razlike u oba regioni nakon tretmana bilo kojim virusnim vektorom;

SLIKA 7 ilustruje kaskadu fototransdukcije kičmenjaka. Nakon stimulacije svetlom, konformacione promene u rodopsinu (R) stimulišu kaskadu događaja uključujući

1

aktivaciju transducina (T) i cGMP fosfodiesterazu (PDE), što na kraju dovodi do hidrolize cGMP. Ovo snižavanje intracelularnog cGMP izaziva zatvaranje cikličnih nukleotidnih kanala (CNG) u membranama spoljašnjeg segmenta fotoreceptora. Zatvaranje ovih kanala izaziva hiperpolarizaciju ćelije i stoga dramatičan pad intracelularnog kalcijuma. Kada nivo kalcijuma opadne, slobodni aktivirajući protein guanilatne ciklaze (GCAP) slobodno stimuliše guanilatnu ciklazu (GC). GC ima ulogu u fazi oporavka fototransdukcije u tome što je njena svrha da proizvede cGMP. Kada su nivoi cGMP dovoljno povećani sa GC, cGMP-kanali se otvaraju, što dovodi do depolarizacije ćelije i povratka u prilagođen na tamno stanje;

SLIKA 8 pokazuje predviđenu strukturu i topologija retGC1 pokazuje homologiju za druge guanilatne ciklaze sa jednim transmembranskim regionom, intracelularnim i ekstracelularnim domenom. Intracelularni domen je dalje podeljen u region „sličan kinazi“ i katalitički domen. Regulacija retGC1 zavisna od kalcijuma i GCAP1 reguliše se kroz intracelularne domene (KHD). Kada je koncentracija kalcijuma u ćelijama fotoreceptora visoka (u tamnom/depolarizovanom stanju), GCAP1 vezan za kalcijum sprečava aktivaciju retGC1. Nakon stimulacije svetlom, nivo kalcijuma se smanjuje. Kalcijum je nevezan za GCAP1, što omogućava GCAP1 da aktivira retGC1. Uloga retGC1 je da proizvede cGMP;

SLIKA 9 prikazuje fotoreceptore čepića u normalnim (WT) naspram GC1KO miševa. U WT čepićima, GC1 funkcioniše normalno kako bi proizveo cGMP koji može efikasno ponovo otvoriti CNG kanale i vratiti ćeliju u svoje prilagođen na tamno/depolarizovano stanje. U kupastim fotoreceptorima GC1KO miševa, GC1 ne uspeva da proizvede cGMP. Ovaj neuspeh sprečava ponovno otvaranje CNG kanala. Ove ćelije su u suštini hronično hiperpolarizovane (prilagođene svetlosti). One ne prenose svetlost za vid (što se vidi iz nedostatka ERG-a) i na kraju će se degenerisati;

SLIKA 10 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence goveđeg GC1 (bov GC1) i mišjeg GC1 (mGC1) sa uključenom konsenzusnom sekvencom. Varijabilni region u N-terminalnom području je označen crvenim pravougaonikom;

SLIKA 11 prikazuje mape dva ilustrativna vektora. Jedan sadrži sveprisutni promoter smCBA, dok drugi koristi promoter specifičan za fotoreceptor, hGRK1;

SLIKA 12 prikazuje reprezentativnu retinalnu sekciju iz GC1KO oka kom je data injekcija sa AAV5-smCBA-mGCl obojenim za GC1 (crveni) i PNK lektin (zeleni) otkriva GC1 eksprimiranje u spoljašnjim segmentima čepića (žuti prekrivač) kao i spoljašnjim segmentima štapića (samo crveni). HGRK1-mGC1 oči kojima su date

2

injekcije pokazale su isti obrazac;

SLIKA 13A, SLIKA 13B, i SLIKA 13C pokazuju AAV-posredovanu restauraciju retinalne funkcije kod GC1KO miševa. SLIKA 13A: Reprezentativni fotopični (čepićem posredovani) tragovi zabeleženi od očiju GC1KO miševa tretiranih na 14P14 sa AAV5-hGRK1-mGC1 (crveno), AAV5-smCBA-mGC1 (zeleno) ili AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 ili starosno usklađene izogene GC1+/+ kontrole. Tragovi su generisani 4 meseca (levo), 7 meseci (sredina) i 9 meseci (desno) nakon davanja injekcije. SLIKA 13B: Prosečne amplitude kupastog b-talasa su generisane mesečno sa stimulansom od 12cds/m2 u tretiranim GC1KO miševima, netretiranim GC1KO i izogenim GC1+/+ kontrolnim miševima. SLIKA 13C: Skotopski (štapićem-posredovani) odgovori u tretiranim i netretiranim GC1KO miševima tokom vremena. Vrednosti predstavljaju odnos amplitude b-talasa štapića generisanih na 5 cds/m2 u tretiranim i netretiranim očima. Sva tri vektora daju stabilnu, dugotrajnu terapiju GC1KO miševima, gde je AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 najefikasniji;

SLIKA 14 pokazuje da su GC1KO miševi tretirani sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 žrtvovani 7 meseci posle injekcije. AAV5-smCBA-mGC1 i AAV5-hGRK1-mGC1-tretirani miševi su žrtvovani 9 meseci nakon injekcije. Ove oči, kao one od i GC1+/+ miševi starih 11 meseci, su razdvojene i retine obojene antitelima podignutim protiv GC1 (zeleni, gornji red) i arestina čepića (crveni, donji red). Sva tri terapijska vektora pokreću eksprimiranje GC1 isključivo u fotoreceptorima GC1KO miševa. Neka retinalna oštećenja su uočena kod miševa tretiranih sa AAV5-hGRK1-mGC1, rezultat verovatno zbog visokog titra ovog vektora. GC1 eksprimiranje i kupasta gustina/morfologija kod AAV8(Y733F)- i AAV5-smCBA-tretiranih miševa ličili su na one koji se vide kod GC1+/+ kontrola koje su starosno usklađeni. Naprotiv, retine GC1KO miševa koji su starosno usklađeni pokazale su odsustvo GC1 eksprimiranja i značajno smanjenje gustine ćelijskih membrana;

SLIKA 15 pokazuje da je na 7,5 meseci nakon injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, jedan GC1KO miš žrtvovan i njegove retine su korišćene za Western blot. Antitela koja su usmerena protiv GC1 pokazuju da je nivo AAC-posredovanog GC1 eksprimiranja u tretiranom GC1KO oku sličan onom koji je primećen u izogenom GC1+/+ kontrolnom oku. Nivoi guanilatne ciklaze koja aktivira eksprimiranje proteina-1 (GCAP1) (biohemijski partner guanilatne ciklaze) je takođe procenjena u tretiranim i netretiranim GC1KO kao i GC1+/+ kontrolnim očima. U skladu sa prethodnim izveštajima, GCAP1 protein je smanjen u netretiranim GC1KO očima.

Eksprimiranje GC1 posredovano sa AAV dovodi do povećanog eksprimiranja GCAP1, sličnog nivoima koji se vide u izogenoj GC1+/+ kontroli;

SLIKA 16A i SLIKA 16B pokazuju rezultate na 11 meseci nakon injekcije sa AAV5-smCBA-mGCl, jedan GC1KO miš je žrtvovan, njegove retine su potpuno postavljene i obojene sa antitelom podignutim protiv čepića. Imunobojenje je otkrilo da čepići nisu prisutni u netretiranom GC1KO oku (SLIKA 16A) osim u superiornoj retini. Eksprimiranje GC1 posredovano AAV-om čuva fotoreceptore čepića širom retine tretiranog oka (SLIKA 16B) najmanje 11 meseci (najnoviji vremenski period);

SLIKA 17 ilustruje podatke u kojima su GC1KO miševima kojima su date injekcije sa AAV8(733)-hGRK1-mGC1 žrtvovani 4 meseca i 7 meseci posle injekcije. GC1KO miševima kojima su date injekcije sa AAV5-smCBA-mGC1 i AAV5-hGRK1-mGC1 žrtvovani su 7 meseci i 10 meseci posle injekcije. Kao kontrolni uzorci korišćeni su naivni GC1KO miševi. Optički nervi iz tretiranih i netretiranih očiju, i delovi desnog i levog mozga koji sadrže vizuelne puteve, izolovani su i korišćeni za oporavak vektora genoma. Treba primetiti da je AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 kom je data injekcija u levo oko GC1KO miševa, dok su oba AAV5 vektora data kao injekcije u desno oko GC1KO miševa. genomi vektora su oporavljeni samo od optičkih živaca tretiranih očiju u svim slučajevima. Do 10 meseci nakon davanja injekcije AAV5 vektora, iz mozga nisu pronađeni genomi vektora. Najveći broj vektorskih genoma dobijen je iz GC1KO miševima kojima su date injekcije sa jakim, brzo-delujućim AAV8(733) vektorom;

SLIKA 18A i SLIKA 18B ilustruju podatke u kojima su OCT i štapić/kupasti ERG iz GCdko miševa dva meseca nakon injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1; SLIKA 19A i SLIKA 19B ilustruje podatke u kojima su reprezentativni ERG štapića i čepića iz GCdko miševa jedan mesec nakon injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1;

SLIKA 20A i SLIKA 20B prikazuje RT-PCR standarde u realnom vremenu.

Fluorescencija (log jedinice na Y-osi) je iscrtana u odnosu na prag ciklusa Cτvrednosti (X-osa). Svaki panel predstavlja standardne krive (generisane serijom razblaženja ukupne cDNK retine) za GC1 i Gapdh transkript koristeći retinalnu cDNK iz divljeg tipa, GC1+/+ miša (a) ili GC1KO miša tretiranog sa AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1. Standardne krive generisane sa GC1 i Gapdh skupovima primera su paralelne koristeći bilo koji predložak koji ukazuje na sličnu kinetiku amplifikacije. Cτ vrednost ciklusa se povećava sa smanjenjem količine šablona;

SLIKA 21A i SLIKA 21B pokazuju GC1 i eksprimiranje arestina čepića u retinama tretiranih i netretiranih GC1KO miševa i GC1+/+ kontrolama. SLIKA 21A:

Imunohistohemija zamrznutog preseka retine je korišćena za lokalizovanje eksprimiranja GC1 (zeleni, gornji red) i arestina čepića (crveni, donji red) kod GC1KO miševa tretiranih sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (7 meseci nakon injekcije), AAV5-smCBA-mGC1 (10 meseci nakon injekcije) ili AAV5-hGRK1-mGC1 (10 meseci nakon injekcije) vektora, kao i retine od 8 meseci starih netretiranih GC1KO i GC1+/+ kontrolnih miševa. Nukleusi su obojeni sa DAPI (plavo). Sve sekcije su snimljene pri uvećanju od 20x i izložene istim postavkama. SLIKA 21B: Imunološko čuvanje celokupnog retinalnog nosača od jednog GC1KO miša 11 meseci nakon tretmana sa AAV5-smCBA-mGCl (samo jedno oko) sa antitelom protiv arestina čepića, pokazalo je značajno očuvanje fotoreceptora čepića u tretiranom oku (donji desni) u poređenju sa netretiranim kontralateralnim kontrolnim okom (dole levo). Cele retine su bili orijentisane na sličan način, sa svojim temporalnim delovima u položaju 12 časova. Delovi celih retina su snimljeni pri uvećanju od 10x i spojeni zajedno za finalno izlaganje. OS = spoljni segmenti; ONL = spoljni nuklearni sloj; INL = unutrašnji nuklearni sloj;

SLIKA 22A i SLIKA 22B prikazuju elektroretinograme (ERGs) posredovane sa čepićem tretiranih i netretiranih GC1KO i netretiranih GC1+/+ kontrolnih očiju. SLIKA 22A: Reprezentativni čepićima posredovani tragovi izazvani sa 12 cds/m<2>blagim stimulusom iz GC1KO očiju tretiranih sa AAV5-hGRK1-mGC1 (crvena linija), AAV5-smCBA-mGC1 (zelena linija) ili AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (crna linija) ili netretiranih GC1+/+ kontrolnih očiju. Prikazani su reprezentativni tragovi nastali između 4-mesečnog i 1-godišnjeg tretmana (gornji panel). Skala: y-osa = 50 µV, x-osa = 20 ms. SLIKA 22B: Maksimalne amplitude kupastog b-taasa (one generisane na 12 cds/m<2>) izračunate su iz svakog miša i prosečno mesečno u svakoj tretiranoj grupi, kao i sa starosno usklađenim netretiranim GC1KO i GC1+/+ kontrolama. Poređenja su vršena između grupa životinja sa n> 3. Sve grupe AAV tretmana su statistički upoređene za 6-mesečni post-tretman. AAV5 tretirane oči statistički su upoređene sa 9-mesečnim post-tretmanom;

SLIKA 23A i SLIKA 23B ilustruju elektroretinograme (ERGs) posredovane štapićima tretiranih i netretiranih GC1KO i GC1+/+ kontrolnih očiju. SLIKA 23A: amplitude b-talasa (gornji levi) i amplitude a-talasa (gore desno) štapića izazvane sa 1 cds/m<2>stimulusa pod skotopskim uslovima su određene u tretiranim i netretiranim

2

očima GC1KO miševa tretiranih sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (crni krugovi), AAV5-hGRK1-mGC1 (crveni krugovi) ili AAV5-smCBA-mGCl (zeleni trouglovi) vektorom. Odnosi tretiranih i netretiranih očiju kod miša su generirani deljenjem maksimalne amplitude a- ili b-talasa u tretiranim očima s maksimalnom amplitudom u netretiranom oku. Ovi odnosi su uprosečeni mesečno u svim tretiranim grupama. Poređenja su vršena između grupa životinja sa n> 3. Sve grupe AAV tretmana su statistički upoređene 6 meseci. AAV5 vektori su takođe statistički upoređeni za 9 meseci. Poboljšanje posredovano vektorom definisano je prosečnim odnosom> 0,8. SLIKA 23B: Reprezentativni tragovi ERG-a posredovani sa štapićem od jednog GC1KO miša otkrivaju da su odgovori štapića iz AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-tretiranog oka (crne linije) bili veći od onih zabeleženih iz netretiranog kontralateralnog kontrolnog oka (zelena linija). Ovaj tretirani odgovor štapića je vraćen na ~ 50% od normalnog GC1+/+ odgovora štapića (crvena linija); i SLIKA 24A i SLIKA 24B pokazuju nivoe proteina i transkripta u tretiranim i netretiranim GC1KO miševima i GC1+/+ kontrolama. SLIKA 24A: Imunoblot retinalnih lizata iz jednog GC1KO mišjeg oka nakon 10 meseci nakon tretmana sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 i ispitan je sa anti-GCl i anti-GCAPl antitelima. Antiβ-aktin antitelo je korišćeno kao unutrašnja kontrola punjenja. SLIKA 24B:

Polukvantitativno RT-PCR u realnom vremenu od nekoliko transkripata (GC1, GCAP1, GNAT2 i PDE6a u jednoj GC1KO retini tretiranoj AAV5-smCBA-mGC1, jedna GC1KO retina tretirana sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 vektorom, i pojedinačno netretirane GC1KO ili GC1+/+ kontrolne retine Uzorci su izvedeni u triplikatu koristeći Gapdh-specifične prajmere kao standard. Podaci su predstavljeni kao promena u mRNK u odnosu na GC1+/+ kontrolu.

OPIS ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA

[0057] Ilustrativni primeri pronalaska su opisani u daljem tekstu. Zaran jasnoće, nisu sve karakteristike stvarne implementacije opisane u ovoj specifikaciji. Naravno, biće razumljivo da se u razvoju svakog takvog konkretnog otelotvorenja moraju doneti brojne odluke koje se odnose na implementaciju kako bi se postigli specifični ciljevi, kao što je usklađenost sa sistemskim i poslovnim ograničenjima, koja će se razlikovati od jedne do druge implementacije. Štaviše, biće razumljivo da takav razvojni napor može biti kompleksan i dugotrajan, ali bi ipak bio rutinski poduhvat za one koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike i koji imaju koristi od ovog obelodanjenja.

ADENO-POVEZANI VIRUS

[0058] Adeno-povezani virus-2 (AAV) je ljudski parvovirus koji se može propagirati i kao litički virus i kao provirus (Cukor i dr., 1984; Hoggan i dr., 1972). Virusni genom se sastoji od linearne jednolančane DNK (Rose i dr., 1969), 4679 baza dugačko (Srivastava i dr., 1983), okružene obrnutim terminalnim ponavljanjima od 145 baza (Lusby i dr., 1982). Za litički rast AAV zahteva koinfekciju sa pomoćnim virusom. Bilo adenovirus (Atchinson i dr., 1965; Hoggan, 1965; Parks i dr., 1967) ili herpes simpleks (Buller i dr., 1981) mogu da pruže pomoćnu funkciju. Bez pomagača, nema dokaza o AAV-specifičnoj replikaciji ili eksprimiranju gena (Rose i Koczot, 1972; Carter i dr., 1983). Kada nema pomoćnika, AAV može da traje kao integrisani provirus (Hoggan, 1965; Berns i dr., 1975; Handa i dr., 1977; Cheung i dr., 1980; Berns i dr., 1982).

[0059] Integracija očigledno uključuje rekombinaciju između AAV završetaka i sekvenci domaćina, i većina AAV sekvenci ostaju netaknute u provirusu. Sposobnost AAV da se integriše u DNK domaćina je očigledno inherentna strategija za osiguranje preživljavanja AAV sekvenci u odsustvu pomoćnog virusa. Kada se ćelije koje nose AAV provirus naknadno superinficiraju sa pomagačem, integrisani AAV genom je izbavljen i nastaje produktivni litički ciklus (Hoggan, 1965).

[0060] AAV sekvence klonirane u prokariotske plazmide su infektivne (Samulski i dr., 1982). Na primer, kada se plazmid divljeg tipa AAV/pBR322, pSM620, transfektuje u ljudske ćelije u prisustvu adenovirusa, AAV sekvence se izbavljaju iz plazmida i nastaje normalan AAV litički ciklus (Samulski i dr., 1982). Ovo omogućava da se modifikuju AAV sekvence u rekombinantnom plazmidu, i zatim da se uzgaja virusna količina mutanta transfekcijom plazmida u ljudske ćelije (Samulski i dr., 1983; Hermonat i dr., 1984). AAV sadrži najmanje tri fenotipski različita regiona (Hermonat i dr., 1984). Kodovi rep regiona za jedan ili više proteina koji su potrebni za replikaciju DNK i za spasavanje iz rekombinantnog plazmida, dok se regioni poklopca i usana pojavljuju kao kodiranje AAV kapsidnih proteina i mutanti unutar ovih regiona su sposobni za replikaciju DNK (Hermonat i dr., 1984).

Pokazano je da su AAV terminusi potrebni za replikaciju DNK (Samulski i dr., 1983).

[0061] Laughlin i dr. (1983) su opisali konstrukciju dva hibridna plazmida E. coli, od kojih svaki sadrži ceo DNK genoma AAV, i transfekciju rekombinantnih DNK u ljudske ćelijske

2

linije u prisustvu pomoćnog adenovirusa kako bi uspešno izbavili i replikujeli genom AAV (pogledati takođe Tratschin i dr., 1984a; 1984b).

[0062] Adeno-povezani virus (AAV) je posebno atraktivan za transfer gena jer ne indukuje nikakav patogeni odgovor i može se integrisati u ćelijski hromozom domaćina (Kotin i dr., 1990). AAV terminalna ponavljanja (TR) su jedine esencijalne cis-komponente za hromozomsku integraciju ( Muzyczka i McLaughin, 1988). Za ove TR je navedeno da imaju promotersku aktivnost (Flotte i dr., 1993). Oni mogu promovisati efikasan transfer gena iz citoplazme u nukleus ili povećati stabilnost plazmidne DNK i omogućiti dugotrajnije eksprimiranje gena (Bartlett i Samulski, 1998). Studije koje su koristile rekombinantne plazmidne DNK koje sadrže AAV TR izazvale su značajan interes. Pokazano je da plazmidi na bazi AAV dovode do većeg i dužeg eksprimiranja transgena od identičnih plazmida kojima nedostaje TR za AAV u većini tipova ćelija (Philip i dr., 1994; Shafron i dr., 1998; Wang i dr., 1998).

[0063] Postoji nekoliko faktora koji su naveli istraživače da prouče mogućnost korišćenja rAAV kao vektora eksprimiranja. Jedan od njih je da su zahtevi za isporuku gena za integraciju u hromozom domaćina iznenađujuće niski. Potrebno je imati ITR od 145 bp, što je samo 6% AAV genoma. Ovo ostavlja prostor u vektoru da sakupi 4,5-kb DNK umetanje. Dok ovaj kapacitet nošenja može sprečiti AAV da isporuči velike gene, on je u velikoj meri pogodan za isporuku antisens konstrukata predmetnog pronalaska.

[0064] AAV je takođe dobar izbor dostavnih nosača zbog svoje sigurnosti. Postoji relativno komplikovan mehanizam izbavljanja: nije samo adenovirus divljeg tipa, već su i AAV geni potrebni za mobilizaciju rAAV. Isto tako, AAV nije patogen i nije povezan sa bilo kojom bolešću. Uklanjanje virusnih kodirajućih sekvenci minimizuje imune reakcije na eksprimiranje virusnog gena, i stoga, rAAV ne izaziva upalni odgovor. Prema tome, AAV predstavlja idealnog kandidata za isporuku polinukleotida koji kodiraju guanilatnu ciklazu predmetnog pronalaska.

PROIZVODNJA RAAV VEKTORA

[0065] Tradicionalni protokoli za proizvodnju rAAV vektora uglavnom su zasnovani na sistemu sa tri komponente. Jedna komponenta ovog sistema je proviralni plazmid koji kodira rekombinantnu DNK koja se pakuje kao rAAV. Ova rekombinantna DNK se nalazi između

2

145 baznih parova (bp) AAV-2 obrnutih terminalnih ponavljanja (ITR) koji su minimalno cis delujuće AAV-2 sekvence koje usmeravaju replikaciju i pakovanje vektora. Druga komponenta sistema je plazmid koji kodira gene AAV-2, rep i cap. AAV-2 rep gen kodira četiri Rep proteina (Rep 78, 68, 52 i 40) koji deluju u trans da replikuju rAAV genom, razreši međuproizvode replikacije, i zatim upakuje jednolančane rAAV genome. AAV-2 cap gen kodira tri strukturna proteina (VP1, VP2 i VP3) koji sadrže virusni kapsid. Budući da se AAV-2 ne replikuje sam po sebi, treća komponenta rAAV sistema pakovanja je skup pomoćnih funkcija iz drugog DNK virusa. Ove pomoćne funkcije stvaraju ćelijsko okruženje u kom se rAAV replikacija i pakovanje mogu efikasno pojaviti. Pomoćne funkcije pružene adenovirusom (Ad) su skoro isključivo korišćene za proizvodnju rAAV i kodirane su genima E1a, E1b, E2a, E4orf6 i VA RNK. Dok se prve dve komponente sistema generalno uvode u ćelije u kojima se replikacija i pakovanje odvijaju transfekcijom, ad pomoćne funkcije se uvode superinfekcijom sa divljem tipom Ad virusa.

[0066] Tradicionalne rAAV tehnike proizvodnje su ograničene u svojoj sposobnosti da proizvode velike količine vektora zbog inherentnih neefikasnosti u transfekciji. Ozbiljne poteškoće se takođe susreću kada je skala transfekcije povećana. Zahtev za divljim tipom Ad može takođe smanjiti količinu proizvedenog rAAV, jer Ad može da se takmiči za ćelijske i virusne supstrate koji su potrebni za replikaciju virusa, ali su prisutni samo u ograničenim količinama. Drugi problem koji se susreće u tradicionalnim proizvodnim protokolima je da superinfekcija sa Ad-om zahtijeva razvoj delotvornih procedura za pročišćavanje Ad-a iz proizvedenog rAAV. Iako su ovi procesi prečišćavanja generalno uspešni u eliminisanju kontaminacije ad rAAV preparata, oni takođe smanjuju rAAV titre. Strogi testovi za kontaminaciju ad rAAV su takođe neophodni.

[0067] Kako bi se proizveo rAAV, koristi se postupak dvostruke ko-transfekcije za uvođenje plazmida vektorskog prenosa rAAV zajedno sa pDG (Grimm i dr., 1998) AAV pomoćni plazmid koji nosi AAV rep i cap gene, kao i Ad pomoćne gene potrebne za rAAV replikaciju i pakovanje u molarnom odnosu 1:1. Plazmidna DNK upotrebljena u transfekciji je prečišćena pomoću konvencionalnog alkalnog liza/CsCl gradijentnog protokola. Transfekcija se izvodi na sledeći način: 293 ćelije su podeljene 1:2 dan pre eksperimenta, tako da, kada je transfektovana, ćelijska konfluentnost je oko 75-80%. Deset 15-cm ploča se transfektuje kao jedna serija. Kako bi se napravio CaPO4 talog 0,7 mg pDG se meša sa 180 µg rAAV transfernog vektorskog plazmida u ukupnoj zapremini od 12,5 mL 0,25 M CaCl2. Stari

2

medijum je uklonjen iz ćelija i formiranje CaPO4-taloga je inicirano dodavanjem 12,5 ml 2X HBS (pH 7,05) koji je prethodno zagrejan na 37°C u rastvor DNK-CaCl2. DNK je inkubirana tokom 1 min; i prenošenje smeše u 200 mL prethodno zagrejanog DMEM-10% FBS zatim zaustavlja formiranje taloga. Dvadeset dva mL medijuma je odmah raspoređeno u svaku ploču i ćelije su inkubirane na 37°C tokom 48 sati. talog CaPO4 se ostavi da stoji na ćelijama tokom celog perioda inkubacije, bez ugrožavanja vitalnosti ćelija. Četrdeset osam sati posle transfekcije ćelija se sakupljaju centrifugiranjem na 1,140kg tokom 10 min. Ćelije su zatim lizirane u 15 ml 0,15 M MgCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) pomoću 3 ciklusa smrzavanja/odmrzavanja u kadama sa suvim ledom-etanolom i na 37°C. Benzonaza (Nycomed Pharma A/S, čista klasa) se dodaje u smešu (50 U/mL konačne koncentracije) i lizat se inkubira 30 min na 37°C. Lizat se pročisti centrifugiranjem na 3,700kg tokom 20 minuta i supernatant koji sadrži virus dalje se prečišćava korišćenjem diskontinuitetnog gradijenta gustine.

[0068] Tipični diskontinuitetni stepenasti gradijent se formira donjim slojem i zamenom manjeg gustog ćelijskog lizata sa jodiksanolom, 5,5"[(2-hidroksi-1-3-propandiil)-bis(acetilamino)]bis[N,N'bi,(2,3-dihidroksipropil-2-4,6-trijodo-l, 3-enzenekarboksamidom], pripremljenim korišćenjem 60% (težina/zapremina) sterilnog rastvora OptiPrep (Nycomed). Posebno, 15 mL razbistrenog lizata se prenese u Quick-Seal Ultra-Clear 25 × 89-mm centrifugalnu epruvetu (Beckman) pomoću šprica opremljenog sa spinalnom iglom od 1/27 × 89 mm. Pazi se da se izbegnu mehurići koji bi ometali naknadno punjenje i zatvaranje cevi. Peristaltička pumpa promenljive brzine, Model EP-1 (Bio-Rad), koristi se za podlogu: 9 mL 15% jodiksanola i 1 M NaCl u PBS-MK puferu koji sadrži Fenol Crvenu (2,5 µL 0,5% osnovnog rastvora) 5 ml 40% jodiksanola u PBS-MK puferu i na kraju 5 mL 60% jodiksanola u PBS-MK puferu koji sadrži Fenol Crvenu (0,1 µL/L). Cevi su zapečaćene i centrifugirane u Type 70 Ti rotoru (Beckman) na 350,000 × g tokom 1 sata na 18°C. Četiri ml bistrog 40% koraka usisava se nakon probijanja cevi sa strane pomoću šprica opremljenog iglom sa 18 merača sa nakošenim vrhom. Jodiksanol fragment se dalje prečišćava korišćenjem konvencionalne heparin agaroze afinitetne hromatografije.

[0069] Za hromatografiju, tipično, prethodno upakovana 2,5 mL kolona Heparin agarose tipa I (Sigma) je ekvilibrirana sa 20 mL PBS-MK pod gravitacijom. Fragment rAAV jodiksanola se zatim nanosi na prethodno ekvilibriranu kolonu, i kolona se ispere sa 10 mL PBS-MK. rAAV se eluira sa istim puferom koji sadrži 1 M NaCl. Posle primene eluacionog pufera,

2

prva 2 ml eluenta su odbačena i virus je sakupljen u sledećih 3,5 mL eluacionog pufera.

[0070] Virus se zatim koncentriše i desalinira centrifugiranjem kroz BIOMAX® 100 K filter (Millipore, Bedford, MA, USA) prema uputstvima proizvođača. Pufer sa visokim sadržajem soli je promenjen uzastopnim razblaživanjem koncentrovanog virusa sa Lactated Ringerovim rastvorom, i ponavljanjem titra i genoma koji sadrži čestice i infektivne čestice rAAV. Za određivanje fizičkih titara čestica koriste se konvencionalni dot-blot test, kvantitativni kompetitivni PCR (KC PCR) test, ili u skorije vreme kvantitativni PCR u realnom vremenu (aRT-PCR) (Zolotukhin i dr., 2002; Jacobson i dr., 2006) Infektivni titri su određeni testom infektivnog centra (ICA) i fluorescentnim testom ćelija (FCA), koji je rezultat eksprimiranja GFP (Zolotukhin i dr., 2002).

[0071] KC PCR postupak se zasniva na kompetitivnoj ko-amplifikaciji specifične ciljane sekvence sa internim standardnim plazmidom poznate koncentracije u reakcionoj cevi. On pruža precizno i brzo kvantifikovanje virusnih čestica. Interni standard mora da sadrži mesta za prepoznavanje prajmera sa specifičnim šablonom. I specifični predložak i interni standard moraju biti PCR-amplificirani sa istom efikasnošću i mora biti moguće analizirati PCR-amplificirane proizvode odvojeno. Najlakši način da se napravi razlika između šablona i internog standarda je da se ugradi razlika u veličini u dva proizvoda. Ovo se može postići, na primer, konstruisanjem standarda koji imaju istu sekvencu kao specifični cilj, ali sadrže brisanje. Zatim se vrši kvantifikacija upoređivanjem PCR signala specifičnog šablona sa PCR signalom koji se dobija sa poznatim koncentracijama konkurenta (interni standard).

Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR) je standardni postupak za procenu koncentracije DNK nepoznatog uzorka poređenjem formiranja PCR proizvoda u realnom vremenu sa poznatim standardom DNK.

[0072] Prečišćeni virusni stok se prvo tretira sa DNK kako bi se digestiral bilo koja kontaminirana neupakovana DNK. Deset µL pročišćenog virusnog stoka inkubirano je sa 10 U od DNKseI (Boehringer, Ingelheim am Rhein, Germany) u 100 µL reakcionoj smeši, koja sadrži 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC12 tokom 1 sata na 37°C. Na kraju reakcije, dodato je 10 µL od 10X proteinaza K pufera (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 10 mM EDTA, 1% SDS konačne koncentracije), praćeno dodavanjem 1 µL proteinaze K (18,6 mg/mL, Boehringer). Smeša je inkubirana na 37°C tokom 1 sata. Virusna DNK je prečišćena ekstrakcijom fenol/hloroformom (dva puta), i zatim ekstrakcijom hloroformom i taloženjem

2

etanola upotrebom 10 µg glikogena kao nosača. DNK pelet je rastvoren u 100 µL vode. Reakcione smeše KC PCR sadržale su po 1 µL razblažene virusne DNK i dvostruka serijska razblaženja internog standardne DNK plazmida, kao što je pdl-GFP. Otkriveno je da je najpouzdaniji opseg standardne DNK između 1 i 100 pg. Alikvot svake reakcije je zatim analiziran elektroforezom od 2% agaroznog gela, dok se dva PCR proizvoda ne rastvore. Analogna slika gela obojenog etidijum bromidom je digitalizovana upotrebom sistema ImageStore 7500 (UVP; Upland, CA, USA). Gustine ciljane i konkurentske trake u svakoj stazi su merene korišćenjem ZERO-Dscan Image Analysis System, verzija 1.0 (Scanalytics, Rockville, MD, USA) i njihovi odnosi su prikazani kao funkcija standardne koncentracije DNK. Za određivanje koncentracije DNK virusa korišćen je odnos 1,0, pri kom je broj viralnih molekula DNK jednak broju konkurentnih molekula DNK.

[0073] Modifikacija ranije objavljenog protokola (McLaughlin i dr., 1988) koristi se za merenje sposobnosti virusa da inficira C12 ćelije, raspakuje se i replikuje. Ukratko, C2 ćelije sadrže integrisane wtAAV rep i cap gene (Clark i dr., 1995) su stavljene u posudu sa 96 komorica na oko 75% konfluencije, i zatim su inficirane sa Ad5 na M.O.I od 20. Jedan µL serijski razblaženog rAAV-sCNTF je vizuelno ocenjivan pomoću fluorescentnog mikroskopa. CHROMA filter visoke osetljivosti #41012 HighQ FITC LP (Chroma Technology, Bellows Fall, VA, USA) je korišćen za praćenje fluorescencije. Kako bi se izračunao titar hibridizacijom, ćelije su sakupljene i prerađene u suštini kao što je prethodno opisano (McLaughlin i dr., 1988).

FARMACEUTSKI SASTAVI

[0074] U određenim otelotvorenjima, ovaj pronalazak se odnosi na formulaciju jednog ili više sastava rAAV-guaniltne ciklaze koje su ovde opisani u farmaceutski prihvatljivim rastvorima za primenu ćelijama ili životinjama, bilo sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih modaliteta terapije.

[0075] Takođe će se razumeti da se, ako se želi, nukleinsko kiselinski segment, RNK, DNK ili PNK sastava koji eksprimiraju terapeutski genski proizvod, kao što je ovde opisano, mogu davati u kombinaciji sa drugim agensima, kao što su, na primer, proteini ili polipeptidi ili različiti farmaceutski aktivni agensi, uključujući jednu ili više sistemskih ili topikalnih primena polipeptida guanilatne ciklaze. U stvari, praktično nema ograničenja za druge komponente koje takođe mogu biti uključene, s obzirom da dodatni agensi ne izazivaju značajan štetan efekat nakon dodira sa ciljanim ćelijama ili tkivima domaćina. Sastavi guanilatne ciklaze sa vektorom rAAV mogu se, dakle, isporučiti zajedno sa raznim drugim agensima, kako se zahteva u konkretnom slučaju. Takvi sastavi mogu biti prečišćeni iz ćelija domaćina ili drugih bioloških izvora, ili alternativno mogu biti hemijski sintetisani kao što je ovde opisano. Slično tome, takvi sastavi mogu dalje da sadrže supstituisane ili derivatizovane RNK, DNK ili PNK sastave.

[0076] Formulacija farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata i rastvora nosača je dobro poznata onima koji su verzirani u stanje tehnike, kao što je razvoj pogodnih režima doziranja i tretmana za korišćenje specifičnih sastava koji su ovde opisane u različitim režimima tretiranja, uključujući, na primer, oralno, parenteralno, intravenozno, intranazalno, intramuskularno i direktno davanje jednoj ili više ćelija ili tipova tkiva unutar životinje, uključujući na primer, okularnu, retinalnu i sub-retinalnu injekciju ili slično.

[0077] Tipično, ove formulacije mogu da sadrže najmanje oko 0,1% aktivnog jedinjenja ili više, mada procenat aktivnog sastojka može, naravno, da varira i može pogodno biti između oko 1 ili 2% i oko 60% ili 70% ili više mase ili zapremine ukupne formulacije. Naravno, količina aktivnog jedinjenja u svakom terapeutski korisnom sastavu može biti pripremljena tako da se dobije odgovarajuća doza u bilo kojoj datoj jediničnoj dozi jedinjenja. Faktori kao što su rastvorljivost, bioraspoloživost, biološki poluživot, put primene, rok trajanja proizvoda, kao i drugi farmakološki faktori će biti razmatrani od strane stručnjaka iz oblasti za pripremu takvih farmaceutskih formulacija, i kao takvi, različite doze i režimi tretmana mogu biti poželjni.

[0078] U određenim okolnostima biće poželjno da se farmaceutske sastave ovde opisane parenteralno, intravenozno, intramuskularno ili čak intraperitonealno kako je opisano (pogledati npr., U. S. Patent No.5,543,158; U. S. Patent No.5,641,515 i U. S. Patent No. 5,399,363. Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli mogu biti pripremljeni u vodi, pogodno pomešani sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama.

[0079] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore

1

ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija (pogledati npr., U. S. Patent No.5,466,468. U svim slučajevima oblik mora biti sterilan i mora biti fluidna do te mere da postoji lako davanje injekcije. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja, i mora se čuvati protiv kontaminantnog delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne smeše, i/ili biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom prevlake, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, poželjno je da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih sastava može se postići upotrebom u sastavma agenasa koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0080] Za parenteralno davanje u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba biti pogodno puferisan ako je neophodno i tečni razblaživač se prvo izotonizuje sa dovoljno slanog rastvora ili glukoze. Ovi posebni vodeni rastvori su naročito pogodni za intravenozno, intramuskularno, subkutano i intraperitonealno davanje. S tim u vezi, sterilni vodeni medijum koji se može koristiti će biti poznat stručnjacima u tehnici u svetlu ovog obelodanjenja. Na primer, jedna doza se može rastvoriti u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i dodati bilo do 1000 ml tečnosti hipodermoklize ili ubrizgati na predloženo mesto infuzije, (pogledati, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Ed., Str.1035-1038 i 1570-1580). Neke varijacije u doziranju će se nužno desiti u zavisnosti od stanja pacijenta koji se tretira. Osoba odgovorna za primenu će u svakom slučaju odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog pacijenta. Štaviše, za ljudsku primenu, preparati treba da zadovolje sterilnost, pirogenost, kao i opšte standarde bezbednosti i čistoće, kao što je propisano od strane United States Food and Drug Administration's (FDA) Office of Biologics Standards.

[0081] Sterilni rastvori za davanje injekcije se pripremaju tako što se aktivna jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču mešaju sa različitim drugim sastojcima kako su ovde nabrojani, kao što je zahtevano, praćeno filtriranjem sterilizacije. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži osnovni medijum za disperziju i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih

2

gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i tehnike sušenja zamrzavanjem koje daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilisanog filtracionog rastvora.

[0082] Ovde opisani sastavi mogu biti formulisani u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) koje su formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili takvim organskim kiselinama kao što je sirćetna, oksalna, vinska, mandelinska, i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili feri hidroksidi, i takve organske baze kao izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično. Posle formulacije, rastvori će se primenjivati na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze i u količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako daju u različitim doznim oblicima kao što su rastvori za davanje injekcije, kapsule za oslobađanje leka i slično.

[0083] Kad se ovde koristi, „nosač“ uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzioni medijum, nosače, prevlake, razblaživače, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense za apsorpciju, pufere, rastvore nosače, suspenzije, koloide i slično. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u struci. Osim u onoj meri u kojoj bilo koji konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa aktivnim sastojkom, razmatra se njegova upotreba u terapeutskim preparatima. Dodatni aktivni sastojci mogu takođe biti inkorporirani u sastave.

[0084] Fraza „farmaceutski prihvatljiv“ se odnosi na molekulske entitete i sastave koji ne proizvode alergijsku ili sličnu nepovoljnu reakciju kada se daju ljudima. Dobijanje vodenih sastava koji sadrži protein kao aktivni sastojak je dobro shvaćeno u struci. Tipično, takvi sastavi su pripremljeni kao injektabilni, ili kao tečni rastvori ili suspenzije; takođe mogu biti pripremljeni čvrsti oblici pogodni za rastvor u, ili suspenziju u tečnosti pre davanja injekcije. Preparat takođe može biti emulgiran.

POREĐENJE, IDENTITET I HOMOLOGIJA SEKVENCI

[0085] Za poređenje sekvenci i određivanje homologije, tipično jedna sekvenca deluje kao referentna sekvenca sa kojom se porede test sekvence. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, test i referentne sekvence se unose u računar, označavaju se koordinate podsekcije, ako je potrebno, i određuju se programski parametri algoritma sekvence. Algoritam za poređenje sekvenci se zatim može koristiti da se izračuna procenat identičnosti sekvence za test sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu određenih parametara programa.

[0086] Može se izvesti optimalno poravnanje sekvenci za poređenje, na primer, pomoću algoritma lokalne homologije (pogledati npr., Smith i Waterman, 1981), algoritma homolognog poravnanja (pogledati npr., Needleman i Wunsch, 1970), postupka poređenja sličnosti pretraživanja (pogledati npr., Pearson i Lipman, 1988), kompjuterskom implementacijom algoritama kao što su GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Software Softvare Package, Software Computer Group, Madison, WI, USA, ili vizualnim pregledom. Jedan primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identičnosti sekvenci i sličnosti sekvenci je algoritam BLAST (Altschul i dr., 1990) i BLOSUM62 matrica bodovanja (pogledati, npr., Henikoff i Henikoff, 1989). Softver za obavljanje BLAST analiza je javno dostupan putem National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0087] Pored izračunavanja procenta identičnosti sekvence, BLAST algoritam takođe obavlja statističku analizu sličnosti između dve sekvence (pogledati, npr., Karlin i Altschul, 1993). Drugi primer korisnog algoritma za poravnavanje sekvenci je PILEUP program, koji stvara višestruko poravnanje sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivna, parna poravnanja. Takođe se može iscrtati stablo koje prikazuje odnose klastera koji se koriste za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje metode poređenja progresivnog poravnanja (pogledati npr., Feng i Doolittle, 1987), i koristi opštu matricu usklađivanja sličnu onoj koju su opisali Higgins i Sharp (1989).

TERAPIJSKI I DIJAGNOSTIČKI KOMPLETI

[0088] Pronalazak takođe obuhvata jedan ili više sastav zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, nosača, razblaživača, adjuvanata i/ili drugih komponenti, kao što se mogu koristiti u formulaciji određenih formulacija rAAV-guaniltne ciklaze, i u pripremi terapeutskih agenasa za davanje sisaru, i naročito, čoveku, za jedan ili više stanja sa nedostatkom guanilatne ciklaze, kao što je distinalna distrofija poput LCA1, kao što je ovde opisano. Posebno, takvi kompleti mogu sadržati jednu ili više rAAV

4

vektorizovanih guanilatnih ciklaza u kombinaciji sa uputstvima za korišćenje virusnog vektora u tretmanu takvih poremećaja kod sisara, i tipično mogu dalje da sadrže kontejnere pripremljene za pogodno komercijalno pakovanje.

[0089] Kao takve, poželjne životinje za primenu ovde opisanih farmaceutskih sastava uključuju sisare, i naročito ljude. Druge poželjne životinje uključuju primate koji nisu ljudi, miševe, epine, goveda, ovce, konje, hircine, lupine, leporine, vulpine, svinje, pse, mačke i slično. Sastav može da obuhvati delimično ili značajno prečišćene sastave rAAV-guanilatne ciklaze, bilo same, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka, koji se mogu dobiti iz prirodnih ili rekombinantnih izvora, ili koji se mogu dobiti prirodno ili hemijski sintetisani, ili alternativno proizvedeni in vitro iz rekombinantnih ćelija domaćina koje eksprimiraju DNK segmente koji kodiraju takve dodatne aktivne sastojke.

[0090] Terapeutski kompleti mogu takođe da se pripreme da sadrže najmanje jedan od ovde opisanih sastava i uputstva za upotrebu sastava kao terapeutskog agensa. Kontejneri za takve komplete mogu tipično da sadrže najmanje jednu bočicu, epruvetu, bocu, špric ili druge kontejnere, u koje se smešta opisani sastav rAAV, i poželjno pogodno alikvotira. Tamo gde je takođe pružen sastav druge guanilatne ciklaze, komplet može takođe da sadrži drugi različit kontejner koji može da se postavi. Alternativno, mnoštvo sastava guanilatne ciklaze može biti pripremljeno u jednom farmaceutskom sastavu, i može biti upakovan u jedinstvenu posudu, kao što je bočica, boca, šprica ili drugi pogodni pojedinačni kontejner. Kompleti predmetnog pronalaska će takođe tipično uključivati načine za držanje bočice u neposrednoj blizini za komercijalnu prodaju, kao što su, na primer, injekcione ili plastične kontejnere oblikovane duvanjem u kojima se čuvaju željene bočice.

EKSPRIMIRANJE U ŽIVOTINJSKIM ĆELIJAMA

[0091] Pronalazači razmatraju da polinukleotid koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja se nalazi u blizini i koja kodira polipeptid terapeutske guanilatne ciklaze predmetnog pronalaska može da se koristi za tretman jednog ili više ćelijskih defekata u transformisanim ćelijama domaćinima. Takve ćelije su poželjno životinjske ćelije, uključujući ćelije sisara, kao što su one koje su dobijene od ljudi ili primata koji nisu ljudi, ili jedne ili više vrsta sisara, uključujući bez ograničenja, miševe, pse, goveda, konje, epine, mačke, ovce, hircine, lupine, leporine, svinje i slično. Predmetni pronalazači posebno razmatraju upotrebu takvih konstrukata za tretman i/ili ublažavanje jednog ili više simptoma distinalne retine poput LCA1, ili srodne retinalne ili očne bolesti, poremećaja, stanja ili disfunkcije kod ljudskog pacijenta za kog se sumnja da pati od takvog poremećaja.

[0092] Ćelije mogu biti transformisane sa jednim ili više rAAV vektora koji sadrže jedan ili više gena terapeutske guanilatne ciklaze od interesa, tako da je genetski konstrukt uveden u i eksprimiran u ćelijama domaćina životinje dovoljan da promeni, smanji, ublaži ili spreči štetno dejstvo ili stanje bolesti ili jedan ili više simptoma ex vivo, in vitro, ek situ, in situ, i/ili in vivo.

GUANILATNA CIKLAZA

[0093] Guanilatna ciklaza (GC) (EC 4.6.1.2) je lijaza koja katalizira konverziju gvanozin trifosfata (GTP) u 3',5'-ciklični gvanozin monofosfat (cGMP) i pirofosfat. U literaturi se alternativno nazivaju „guanil-ciklazom“ ili „guanilil-ciklazom“, i postoje oblici GC koji su vezani za membranu (tip 1) i rastvorljivi (tip 2).

LEBEROVA UROĐENA AMAUROZA

[0094] Leberova urođena amauroza (LCA) je autosomno recesivna grupa bolesti koja predstavlja najraniji i najteži oblik svih nasleđenih distinalnih distina. Prvi gen koji je bio uključen u nastanak ove genetički i klinički heterogene bolesti, i zbog toga je bio dodeljen lokusu LCA1, bio je retinalno-specifičan Guanilatna ciklaza-1 (Gucy2d) (Perrault i dr., 1996). Gucy2d kodira za retinalno-specifičnu proteinsku guanilatnu ciklazu (retGC1) koja se eksprimira pretežno u membranama spoljašnjeg segmenta fotoreceptora i igra ulogu u regulaciji nivoa cGMP i Ca2+ unutar ovih ćelija. Posle stimulacije svetlom, nivoi cGMP unutar spoljašnjih segmenata fotoreceptora brzo padaju zbog hidrolize cGMP fosfodiesteraze (PDE). Ova redukcija cGMP dovodi do zatvaranja cGMP-usmerenih kanala, smanjenog ulaska Ca2+ i hiperpolarizacije ćelije. Ovo smanjenje intracelularnog Ca2+ stimuliše oporavak svetlosno stimulisanih fotoreceptora u tamno stanje preko svoje interakcije sa aktivirajućim proteinima guanilatne ciklaze (GCAP), familije proteina za vezivanje kalcijuma koji regulišu aktivnost GC. U fotoreceptoru koji je adaptiran na tamno okruženje, Ca2+ vezani GCAP inhibiraju aktivnost GC. Međutim, nakon stimulacije svetlom, GCAP-ovi bez Ca2+ stimulišu GC aktivnost koja proizvodi povećanje nivoa cGMP, ponovno otvaranje cGMP-omeđenih kanala i povratak ćelije u depolarizovano stanje. Smatra se da mutacije koje smanjuju ili ukidaju sposobnost GC da popuni intracelularne cGMP i ponovo otvori cGMP-omeđene kationske kanale, kao što je slučaj u LCA1, stvaraju biohemijski ekvivalent hronične izloženosti svetlosti u fotoreceptorima štapića i čepića.

[0095] Mutacije u Gucy2d čine oko 15% svih slučajeva LCA što ga čini jednim od vodećih uzroka ove bolesti. Broj pacijenata obolelih od LCA1 približno je dvostruko veći nego što je broj pogođenih dobro poznatom RPE65 verzijom bolesti (LCA2), oblik za koju su uspešne studije genske terapije posredovane AAV-om nedavno privukle pažnju širom sveta.

Dijagnoza LCA1 se obično pravi u prvih nekoliko meseci života kod novorođenčeta sa totalnim slepilom ili teškim oštećenjem vida, ugašenim elektroretinogramom (ERG) i pendularnim nistagmusom (Perrault i dr., 1999; Chung i Traboulsi, 2009). Uprkos ovim funkcionalnim deficitima, LCA1 pacijenti su prisutni sa normalnim fundusom (Perrault i dr., 1999) i zadržavaju fotoreceptore štapića i čepića u svojoj makularnoj i perifernoj retini tokom godina (Milam i dr., 2003; Simonelli i dr., 2007; Pasadhika i dr., 2009). Koristeći spektralni domen optičke koherencijske tomografiju (SDOCT) za skeniranje centralnih makularnih i perifovealnih područja, nedavna studija je pokazala da su LCA1 pacijenti (starosno usklađeni raspon 20-53 godine) zadržali svih 6 retinalnih slojeva sa vidljivim unutrašnjim/spoljnim segmentom fotoreceptora. Održavanje strukture retine u LCA1 je za razliku od drugih oblika bolesti koji pokazuju izraženo oštećenje retine koje se generalno pogoršava sa godinama (Pasadhika i dr., 2009). Iako očuvanje retinalne strukture nije praćeno boljom oštrinom vida kod LCA1 pacijenata, ipak sugeriše da je bolje prilagođeno za buduće terapijske strategije.

ŽIVOTINJSKI MODELI

[0096] Dva životinjska modela sa nultim mutacijama u genu retGC1 korišćena su za procenu terapije za zamenu gena, prirodno nastale kokošiji GUCY1*B i guanilat-ciklaza-1 (GC1) knockout miševa (pogledati npr., Williams i dr., 2006; Haire i dr., 2006). GUCY1*B pilići su slepi kad se izlegu, pokazuju skotopičnu (posredovanu štapićima) i fotopičnu (posredovanu čepićima) ERG i retinalnu degeneraciju (pogledati npr., Ulshafer i dr., 1984; Huang i dr., 1998; Semple-Rowland i dr., 1998). Lentiviral-posredovan prenos Gucy2d do GUCY1*B retine obnavlja vid kod ovih životinja, što je dokazano testiranjem ponašanja i ERG (pogledati npr., Williams i dr., 2006). Uprkos kratkoročnom terapijskom uspehu, ova terapija nije dugoročno očuvala strukturu ili funkciju retine. Prolazna priroda ovog rezultata, dobijena u ne-sisarskim vrstama sa integrisanim virusnim vektorom in ovo sugerisali su potrebu za adekvatnijim translaconim studijama u pravcu razvoja kliničke primene.

[0097] LCA1 model sisara, GC1KO miševi, pokazuje degeneraciju kupastog fotoreceptora (pogledati npr., Yang i dr., 1999; Coleman i dr., 2004). Kao i LCA1 pacijenti, funkcija gubitka čepića u ovom mišjem modelu prethodi degeneraciji čepića (Yang i dr., 1999). Pored toga, poremećena je translokacija arestina čepića indukovana svetlošću. Fotoreceptori štapića u ovom modelu ne degenerišu i nastavljaju da generišu električne reakcije na svetlost (Yang i dr., 1999), što je verovatno rezultat prisustva GC2, bliskog srodnika GC1 u ovim ćelijama (pogledati npr., Lowe i dr., 1995; Yang i dr., 1995; Yang i Garbers, 1997; Karan i dr., 2010). AAV posredovan prenos Gucy2d na post-natalne GC1KO retine obnavlja svetlosno pokrenutu translokaciju arestina čepića u transdukovanim ćelijama, ali nije uspeo da povrati ERG odgovor čepića ili da spreči degeneraciju čepića (Haire i dr., 2006). U obe studije pilića i miševa, koje su sproveli isti istraživači, terapeutska cDNK je bila goveđeg porekla, što je vrsta proteina koja se istorijski koristi u biohemijskim analizama za procenu funkcionalnosti GC1 (Otto-Bruc i dr., 1997; Williams i dr., 2006).

PRIMERNE DEFINICIJE

[0098] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se uobičajeno podrazumeva od strane stručnjaka u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Mada se bilo koji postupci i sastavi slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, ovde su opisani poželjni postupci i sastavi. U svrhu predmetnog pronalaska, sledeći izrazi su definisani u nastavku:

[0099] U skladu sa dugogodišnjom konvencijom o patentnom pravu, oblici jednine kad se koriste u ovoj prijavi, uključujući i patentne zahteve, označavaju „jedan ili više“.

[0100] Kad se ovde koristi, izraz „oko“ treba generalno da se podrazumeva da se odnosi na oba broja u opsegu brojeva. Na primer, „oko 1 do 10“ treba da se razume kao „od oko 1 do oko 10“. Štaviše, svi numerički opsezi ovde treba da se razumeju da uključuju svaki ceo broj u opsegu, kao i svaku desetinu. Izraz „oko“, kad se ovde koristi, treba generalno da se podrazumeva pod „približno“, i tipično se odnosi na brojeve približno jednake datom broju koji se navodi unutar opsega brojeva. Štaviše, svi numerički rasponi ovde treba da se shvate kao da uključuju svaki ceo broj u opsegu.

[0101] U skladu sa ovim pronalaskom, polinukleotidi, segmenti nukleinske kiseline, sekvence nukleinskih kiselina, i slično, uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK (uključujući i ne ograničavajući se na genomske ili ekstragenomske DNK), gene, peptidne nukleinske kiseline (PNK) RNK (uključujući, ali ne ograničavajući se na rRNK, mRNK i tRNK), nukleozide i pogodne segmente nukleinske kiseline ili dobijene iz prirodnih izvora, hemijski sintetisane, modifikovane, ili na drugi način pripremljene ili sintetisane u celini ili delimično pomoću čoveka.

[0102] Kad se ovde koristi, izraz „nukleinska kiselina“ uključuje jedan ili više tipova: polideoksiribonukleotida (koji sadrže 2-deoksi-D-ribozu), poliribonukleotida (koji sadrže D-ribozu) i bilo kog drugog tipa polinukleotida koji je N-glikozid purinske ili pirimidinske baze, ili modifikovane purinske ili pirimidinske baze (uključujući abazna mesta). Izraz „nukleinska kiselina“, kad se ovde koristi, takođe uključuje polimere ribonukleozida ili deoksiribonukleozida koji su kovalentno vezani, tipično fosfodiesterskim vezama između podjedinica, ali u nekim slučajevima fosforotioatima, metilfosfonatima i slično. „Nukleinske kiseline“ uključuju jedno- i dvolančanu DNK, kao i jedno- i dvolančanu RNK. Primeri nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, gDNK; hnRNK; mRNK; rRNK, tRNK, mikro RNK

[0103] (miRNK), mala interferirajuća RNK (siRNK), mala nukleolarna RNK (snORNK), mala nuklearna RNK (snRNK), i mala temporalna RNK (stRNK), i slično, i bilo koja njihova kombinacija.

[0104] Kad se ovde koristi, izraz „segment DNK“ se odnosi na DNK molekul koji je izolovan bez ukupne genomske DNK određene vrste. Prema tome, DNK segment dobijen iz biološkog uzorka upotrebom jednog od ovde opisanih sastava odnosi se na jedan ili više segmenata DNK koji su izolovani, ili pročišćeni od ukupne genomske DNK određene vrste iz koje su dobijeni. U okviru izraza „segment DNK“, uključeni su segmenti DNK i manji fragmenti takvih segmenata, kao i rekombinantni vektori, uključujući, na primer, plazmide, kosmide, fage, viruse i slično.

[0105] Slično tome, izraz „RNK segment“ se odnosi na RNK molekul koji je izolovan od ukupne ćelijske RNK određene vrste. Prema tome, RNK segmenti se mogu odnositi na jedan ili više segmenata RNK (bilo nativnog ili sintetičkog porekla) koji su izolovani, ili pročišćeni od drugih RNK. U okviru termina „RNK segment“ uključeni su RNK segmenti i manji fragmenti takvih segmenata.

[0106] U kontekstu pronalaska, izraz „eksprimiranje“ treba da obuhvati kombinaciju intracelularnih procesa, uključujući transkripciju i translaciju kojoj je podvrgnut polinukleotid, kao što je strukturni gen, da sintetizuje kodirani peptid ili polipeptid.

[0107] Izraz „npr.“, Kad se ovde koristi, koristi se samo kao primer, bez namere da bude ograničavajući, i ne treba ga tumačiti tako da se odnosi samo na one stavke koje su eksplicitno nabrojane u specifikaciji.

[0108] Kad se ovde koristi, izraz „promoter“ je namenjen da opšte opisuje region ili regione sekvence nukleinske kiseline koji regulišu transkripciju.

[0109] Kad se ovde koristi, izraz „regulatorni element“ je namenjen da opšte opiše region ili regione sekvence nukleinske kiseline koja reguliše transkripciju. Primeri regulatornih elemenata uključuju, ali nisu ograničeni na, pojačivače, post-transkripcijske elemente, transkripcione kontrolne sekvence, i slično.

[0110] Kad se ovde koristi, izraz „strukturni gen“ treba da opšte opiše polinukleotid, kao što je gen, koji je eksprimiran da proizvede kodirani peptid, polipeptid, protein, ribozim, katalitički molekul RNK ili antisens molekul.

[0111] Kad se ovde koristi, izraz „transformacija“ treba da opšte opiše postupak uvođenja egzogene polinukleotidne sekvence (npr., virusnog vektora, plazmida, ili rekombinantne DNK ili RNK molekula) u ćeliju domaćina ili protoplastu u kojoj je egzogeni polinukleotid inkorporiran u barem prvi hromozom ili je sposoban za autonomnu replikaciju unutar transformisane ćelije domaćina. Transfekcija, elektroporacija i „goli“ unos nukleinske kiseline predstavljaju primere tehnika koje se koriste za transformaciju ćelije domaćina sa jednim ili više polinukleotida.

[0112] Kad se ovde koristi, izraz „transformisana ćelija“ označava ćeliju domaćina čiji je komplement nukleinske kiseline promenjen uvođenjem jednog ili više egzogenih polinukleotida u tu ćeliju.

[0113] Kad se ovde koristi, izraz „transgena ćelija“ je generalno namenjen da označava bilo

4

koju ćeliju koja je izvedena ili regenerisana iz transformisane ćelije ili izvedena iz druge transgene ćelije, ili iz potomstva ili potomstva bilo koje generacije takve transformisane ili transgene ćelije domaćina.

[0114] Kad se ovde koristi, izraz „vektor“ je generalno namenjen da označi molekul nukleinske kiseline (tipično sastavljen od DNK) sposoban za replikaciju u ćeliji domaćinu i/ili na koji drugi segment nukleinske kiseline može biti operativno povezan tako da dovede do replikacije priključenog segmenta. Plazmid, kosmid ili virus je primerni vektor.

[0115] Izrazi „suštinski odgovaraju“, „suštinski homologni“ ili „suštinski identnični“, kad se ovde koriste, označavaju karakteristiku nukleinske kiseline ili neke aminokiselinske sekvence, gde odabrana nukleinska kiselina ili aminokiselinska sekvenca ima najmanje oko 70 ili oko identičnosti sekvence od 75% u poređenju sa odabranom referentnom sekvencom nukleinske kiseline ili aminokiseline. Tipičnije, izabrana sekvenca i referentna sekvenca će imati najmanje oko 76, oko 77, oko 78, oko 79, oko 80, oko 81, oko 82, oko 83, oko 84 ili čak oko 85 procenata identičnosti sekvence, i više poželjno najmanje oko 86% identičnosti sekvence, najmanje oko 87% identičnosti sekvence, najmanje oko 88% identičnosti sekvence, najmanje oko 89% identičnosti sekvence, najmanje oko 90% identičnosti sekvence, najmanje oko 91% identičnosti sekvence, na najmanje oko 92% identičnosti sekvence, najmanje oko 93% identičnosti sekvence, najmanje oko 94% identičnosti sekvence, ili najmanje oko 95% ili više identičnosti sekvence. Još poželjnije, visoko homologne sekvence često dele više od najmanje oko 96% identičnosti sekvence, najmanje oko 97% identičnosti sekvence, najmanje oko 98% identičnosti sekvence, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence između izabrane sekvence i referentne sekvence sa kojom se poredi. Procenat identičnosti sekvence može da se izračuna za celu dužinu sekvenci koja treba da se poredi, ili se može izračunati isključivanjem malih brisanja ili dodataka koji ukupno čine manje od oko 25 procenata izabrane referentne sekvence. Referentna sekvenca može biti podgrupa veće sekvence, kao što je deo gena ili bočne sekvence, ili repetitivni deo hromozoma.

[0116] Međutim, u slučaju homologije sekvence dve ili više polinukleotidnih sekvenci, referentna sekvenca i ciljana sekvenca će tipično sadržati najmanje oko 18 do oko 25 susednih identičnih nukleotida, tipičnije najmanje oko 26 do oko 35 susednih nukleotida koji su identični. i još više tipično najmanje oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80, oko 90, ili čak oko 100 ili tako blizu susednih nukleotida koji su identični. Poželjno, koji su poželjni visoko homologni fragmenti, opseg ukupnog procenta identičnosti sekvence između dve date sekvence će biti najmanje oko 80% identičan poželjno najmanje oko 85% identičan, i još poželjnije oko 90% identičan, oko 91% identičan, oko 92% identičan, oko 93% identičan, oko 94% identičan, ili čak oko 95% ili više identičan, kao što je lako određeno jednim ili više algoritama za poređenje sekvenci koji su dobro poznati stručnjacima, kao što su, npr., FASTA programska analiza koju su opisali Pearson i Lipman (1988).

[0117] Izrazi „identičan“ ili procenat „identičnosti“, u kontekstu dve ili više sekvenci nukleinske kiseline ili polipeptida, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju određeni procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti, kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju, mereno korišćenjem jednog od niže opisanih algoritama za poređenje sekvenci (ili drugih algoritama dostupnih uobičajenim stručnjacima) ili vizuelnom inspekcijom.

[0118] Izraz „suštinski identična“ u kontekstu dve nukleinske kiseline odnosi se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje imaju najmanje oko 90%, poželjno 91%, najpoželjnije oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95% %, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 98,5%, oko 99%, oko 99,1%, oko 99,2%, oko 99,3%, oko 99,4%, oko 99,5%, oko 99,6%, oko 99,7%, oko 99,8%, ili oko 99,9% ili više identičnosti nukleotidnih ostataka, kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju, mereno korišćenjem algoritma za poređenje sekvenci ili vizuelnim pregledom. Takve „suštinski identične“ sekvence se obično smatraju „homolognim“, bez pozivanja na stvarno poreklo.

[0119] Izraz „prirodni“ koji se ovde koristi kako se primenjuje na neki predmet odnosi se na činjenicu da se neki objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koji se mogu izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji, prirodno se javlja. Kad se ovde koristi, laboratorijski sojevi glodara koji su selektivno uzgojeni u skladu sa klasičnom genetikom smatraju se životinjama koje se prirodno pojavljuju.

[0120] Kad se ovde koristi, „heterologni“ je definisan u odnosu na prethodno određenu sekvencu gena. Na primer, u odnosu na sekvencu strukturnog gena, heterologni promoter je definisan kao promoter koji se prirodno ne pojavljuje u blizini navedenog strukturnog gena, ali koji je pozicioniran pomoću laboratorijske manipulacije. Slično tome, heterologni gen ili segment nukleinske kiseline je definisan kao gen ili segment koji se prirodno ne pojavljuje u blizini pomenutih promoterskih i/ili pojačivačkih elemenata.

[0121] Kad se ovde koristi, izraz „homologija“ se odnosi na stepen komplementarnosti između dve ili više polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci. Reč „identičnost“ može zameniti reč „homologija“ kada prva sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline ima istu primarnu sekvencu kao sekvenca druge nukleinske kiseline ili aminokiseline. Homologija sekvenci i identičnost sekvence mogu se odrediti analizom dve ili više sekvenci koristeći algoritme i kompjuterske programe poznate u struci. Takvi postupci se mogu koristiti za procenu da li je data sekvenca identična ili homologna sa drugom izabranom sekvencom.

[0122] Kad se ovde koristi, „homologni“ označava, kada se odnosi na polinukleotide, sekvence koje imaju istu esencijalnu nukleotidnu sekvencu, uprkos tome što nastaju iz različitih izvora. Tipično, homologne sekvence nukleinskih kiselina su izvedene iz blisko srodnih gena ili organizama koji poseduju jednu ili više suštinski sličnih genomskih sekvenci. Nasuprot tome, „analogni“ polinukleotid je onaj koji deli istu funkciju sa polinukleotidom iz različitih vrsta ili organizama, ali može imati značajno različitu primarnu nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više proteina ili polipeptida koji ostvaruju slične funkcije ili poseduju slične biološke funkcije. aktivnost. Analogni polinukleotidi mogu često biti izvedeni iz dva ili više organizama koji nisu usko povezani (npr., bilo genetski ili filogenetski).

[0123] Kd se ovde koristi, izraz „polipeptid“ treba da obuhvati singularni „polipeptid“ kao i mnoštvo „polipeptida“, i uključuje bilo koji lanac ili lanac od dve ili više aminokiselina. Prema tome, kad se ovde koriste, izrazi koji uključuju, ali nisu ograničeni na

„peptid,“ „dipeptid,“ „tripeptid“, „protein,“ „enzim,“ „aminokiselinski lanac“ i „susedna aminokiselinska sekvenca“ su obuhvaćeni unutar definicija „polipeptida“ i izraz „polipeptid“ mogu se koristiti umesto, ili naizmenično, sa bilo kojim od ovih izraza. Izraz dalje obuhvata polipeptide koji su podvrgnuti jednoj ili više post-translacionoj modifikaciji, uključujući, na primer, ali bez ograničenja, glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju, proteolitičko razlaganje, obradu nakon prevođenja ili modifikaciju inkluzijom jedne ili više aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. U struci postoji konvencionalna nomenklatura za polinukleotidne i polipeptidne strukture. Na primer, skraćenice sa jednim slovom i tri slova se široko koriste za opisivanje aminokiselina: alanin (A; Ala), arginin (R;

4

Arg), asparagin (N; Asn), asparaginska kiselina (D; Asp), cistein ( C; Cis), glutamin (Q; Gln), glutaminska kiselina (E; Glu), glicin (G; gli), histidin (H; njegov), izoleucin (I; Ile), leucin (L; leu), metionin ( M; Met), fenilalanin (F; Phe), prolin (P; Pro), serin (S; Ser), treonin (T; Thr), triptofan (W; Trp), tirozin (I; Tir), valin (V) Val) i Lizin (K; Lis). Ovde opisani aminokiselinski ostaci su poželjni da budu u „L“ izomernom obliku. Međutim, ostaci u „D“ izomernom obliku mogu biti supstituisani sa bilo kojim L-aminokiselinskim ostatkom pod uslovom da se zadrže željena svojstva polipeptida.

[0124] „Protein“ se ovde koristi naizmenično sa „peptidom“ i „polipeptidom“, i uključuje i peptide i polipeptide proizvedene sintetički, rekombinantno, ili in vitro, i peptide i polipeptide eksprimirane in vivo nakon što se sekvence nukleinske kiseline primenjuju u životinji domaćinu ili čoveku. Izraz „polipeptid“ je poželjno da se odnosi na sve dužine lanaca aminokiselina, uključujući one dužine kratkih peptida od oko 2 do oko 20 aminokiselinskih ostataka, oligopeptida od oko 10 do oko 100 aminokiselinskih ostataka dužine, i polipeptida od oko 100 do oko 5000 ili više aminokiselinskih ostataka dužine. Izraz „sekvenca“, kada se odnosi na aminokiseline, odnosi se na sve ili na deo linearnog reda aminokiselina od N-terminala do C-terminala unutar datog aminokiselinskog lanca, npr., polipeptida ili proteina; „Podsekvenca“ označava bilo koje uzastopno istezanje aminokiselina unutar sekvence, npr., najmanje 3 uzastopne aminokiseline unutar datog proteina ili polipeptidne sekvence. U vezi sa nukleotidnim i polinukleotidnim lancima, „sekvenca“ i „podsekvenca“ imaju slična značenja koja se odnose na redosled nukleotida od 5' do 3'.

[0125] Kad se ovde koristi, izraz „u suštini homologni“ obuhvata dve ili više biomolekularne sekvence koje su međusobno značajno slične na nivou sekvence primarnog nukleotida. Na primer, u kontekstu dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina, „suštinski homologni“ mogu se odnositi na najmanje oko 75%, poželjno najmanje oko 80%, i još poželjnije najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90% identičnosti, i još poželjnije najmanje oko 95%, poželjnije najmanje oko 97% identičnosti, poželjnije najmanje oko 98% identičnosti, poželjnije najmanje oko 99% identičnosti, i još poželjnije još potpuno, potpuna identičnost (tj., 100% ili „invarijantno“).

[0126] Na sličan način, kad se ovde koristi, izraz „suštinski identičan“ obuhvata dve ili više biomolekularne sekvence (i posebno polinukleotidne sekvence) koje pokazuju visok stepen identičnosti jedna sa drugom na nivou nukleotida. Na primer, u kontekstu dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina, „suštinski identične“ mogu se odnositi na sekvence koje su najmanje oko 80%, i još poželjnije najmanje oko 85% ili najmanje oko 90% identične jedna drugoj, pa čak i još poželjnije najmanje oko 95%, poželjnije najmanje oko 97% identične, poželjnije najmanje oko 98% identične, poželjnije najmanje oko 99% identične, i još poželjnije još potpuno, potpuno identične (tj., 100% identičan ili „ne-degenerisan“).

[0127] Izraz „rekombinantni“ označava da je materijal (npr., polinukleotid ili polipeptid) veštački ili sintetički (ne-prirodno) promenjen ljudskom intervencijom. Izmena se može izvršiti na materijalu koji je unutar ili uklonjen iz svog prirodnog okruženja ili stanja.

Konkretno, npr., promoterska sekvenca je „rekombinantna“ kada se proizvodi eksprimiranjem segmenta nukleinske kiseline konstruisane od strane čoveka. Na primer, „rekombinantna nukleinska kiselina“ je ona koja je napravljena rekombinacijom nukleinskih kiselina, npr., tokom kloniranja, mešanja DNK ili drugih postupaka, ili hemijskom ili drugom mutagenezom; „rekombinantni polipeptid“ ili „rekombinantni protein“ je polipeptid ili protein koji je proizveden eksprimiranjem rekombinantne nukleinske kiseline; i „rekombinantni virus“, npr., rekombinantni AAV virus, proizvodi se eksprimiranjem rekombinantne nukleinske kiseline.

[0128] Kad se ovde koristi, izraz „operativno vezan“ se odnosi na vezivanje dva ili više polinukleotida ili dve ili više sekvenci nukleinske kiseline u funkcionalnom odnosu.

Nukleinska kiselina je „operativno povezana“ kada se stavi u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter ili pojačivač operabilno je povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju kodirajuće sekvence. „Operativno vezan“ označava da su sekvence nukleinske kiseline koje su povezane tipično susedne, ili suštinski susedne, i, gde je potrebno, da se spoje dva proteinska kodirajuća regiona, susedna i u okviru čitanja. Pošto pojačivači generalno funkcionišu kada su odvojeni od promotera sa nekoliko kilobaza i intronične sekvence mogu biti promenljive dužine; međutim, neki polinukleotidni elementi mogu biti operativno povezani ali ne i susedni.

[0129] „Transkripcioni regulatorni element“ se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja aktivira transkripciju sama ili u kombinaciji sa jednom ili više drugih sekvenci nukleinske kiseline. Transkripcioni regulatorni element može, na primer, da sadrži jedan ili više promotera, jedan ili više elemenata odgovora, jedan ili više negativnih regulatornih elemenata, i/ili jedan ili više pojačivača.

4

[0130] Kad se ovde koristi, „mesto prepoznavanja faktora transkripcije“ i „mesto vezivanja faktora transkripcije“ se odnose na polinukleotidnu sekvencu ili motiv sekvence koji su identifikovani kao mesta za sekvencno-specifičnu interakciju jednog ili više faktora transkripcije, često uzimajući oblik direktnog protein-DNK vezivanja. Tipično, mesta za vezivanje faktora transkripcije mogu da se identifikuju uz pomoć DNK tragova, testova pomeranja mobilnosti gela i slično, i/ili mogu da se predvide na osnovu poznatih motiva konsenzus sekvence, ili drugim postupcima poznatim stručnjacima.

[0131] „Transkripciona jedinica“ se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja sadrži barem prvi strukturni gen koji je operativno povezan sa najmanje jednom cis-delujućom promoterskom sekvencom i opciono povezan operativno sa jednom ili više drugih cisdelujućih sekvenci nukleinskih kiselina neophodnih za efikasnu transkripciju sekvence strukturalnog gena, i barem prvi distalni regulatorni element koji može biti potreban za odgovarajuću tkivno-specifičnu i razvojnu transkripciju sekvence strukturnog gena koja je operativno postavljena pod kontrolom promoterskih i/ili elemenata pojačivača, kao i bilo koje dodatne cis sekvence koje su neophodne za efikasnu transkripciju i translaciju (npr. mesto poliadenilacije, sekvence za kontrolu stabilnosti mRNK, itd.)

[0132] Izraz „suštinski komplementaran“, kada se koristi za definisanje bilo aminokiselinskih ili nukleinsko-kiselinskih sekvenci, znači da je određena predmetna sekvenca, na primer, oligonukleotidna sekvenca, suštinski komplementarna sa celom ili delom izabrane sekvence, i tako se specifično vezuju za deo mRNK koja kodira izabranu sekvencu. Kao takve, tipično, sekvence će biti visoko komplementarne sa mRNK „ciljanom“ sekvencom, i neće imati više od oko 1, oko 2, oko 3, oko 4, oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, ili oko 10 baznih neslaganja u komplementarnom delu sekvence. U mnogim slučajevima, može biti poželjno da sekvence budu tačne, tj., biti potpuno komplementarne sa sekvencom na koju se oligonukleotid specifično vezuje, i stoga ima nultu neusklađenost duž komplementarnog rastezanja. Kao takve, visoko komplementarne sekvence će se obično specifično vezati za region ciljane mRNK sekvence i stoga će biti visoko efikasne u redukciji i/ili čak inhibiranju translacije ciljane mRNK sekvence u polipeptidni proizvod.

[0133] Suštinski komplementarne sekvence nukleinskih kiselina će biti više od oko 80% komplementarne (ili „% potpune podudarnosti“) sa odgovarajućom nukleinskom kiselinom

4

ciljane sekvence na koju se nukleinska kiselina specifično vezuje, i poželjnije je da bude više od oko 85% komplementarna sa odgovarajućom ciljanom sekvencom na koju se nukleinska kiselina specifično vezuje. U određenim aspektima, kao što je gore opisano, biće poželjno da se ima još više komplementarne sekvence nukleinske kiseline za upotrebu u praksi pronalaska, i u takvim slučajevima, sekvence nukleinskih kiselina će biti više od oko 90% komplementarne sa odgovarajućom ciljanom sekvencom na koju se specifično vezuje nukleinska kiselina, i može u određenim otelotvorenjima biti više od oko 95% komplementarna sa odgovarajućom ciljanom sekvencom na koju se nukleinska kiselina specifično vezuje, pa čak i do i uključujući oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, pa čak i oko 100% tačne podudarnosti sa celom ili delom ciljane sekvence na koju se specifično vezuje dizajnirana nukleinska kiselina.

[0134] Procentualna sličnost ili procenat komplementaran bilo kojoj od opisanih sekvenci nukleinske kiseline može se odrediti, na primer, poređenjem informacija o sekvenci korišćenjem GAP kompjuterskog programa, verzija 6.0, koji je dostupan od strane University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP program koristi postupak poravnanja od Needleman i Wunsch (1970). Ukratko, GAP program definiše sličnost kao broj poravnatih simbola (tj. nukleotida ili aminokiselina) koji su slični, podeljeni sa ukupnim brojem simbola u kraćoj od dve sekvence. Poželjni podrazumevani parametri za GAP program uključuju: (1) unarnu matricu za poređenje (koja sadrži vrednost 1 za identičnosti i 0 za neidentičnosti) za nukleotide i ponderisanu matricu za poređenje Gribskov-a i Burgess-a (1986), (2) ) penal od 3,0 za svaku prazninu i dodatnih 0,10 penala za svaki simbol u svakoj praznini; i (3) bez penala za krajnje praznine.

[0135] Kad se ovde koriste, izrazi „protein,“ „polipeptid“ i „peptid“ se koriste naizmenično, i uključuju molekule koji uključuju najmanje jednu amidnu vezu koja povezuje dva ili više ostataka aminokiselina zajedno. Iako se naizmenično koristi, peptid je relativno kratak (na primer, od 2 do oko 100 aminokiselinskih ostataka dužine) molekul, dok su protein ili polipeptid relativno duži polimer (npr., 100 ili više ostataka dužine). Međutim, ukoliko nisu specifično definisani dužinom lanca, izrazi peptid, polipeptid i protein se koriste naizmenično.

[0136] Kad se ovde koristi, izraz „pacijent“ (koji se takođe naziva „domaćin“ ili „bolesnik“) odnosi se na bilo kog domaćina koji može da služi kao recipijent za jednu ili više sastava

4

guanilatne ciklaze na bazi rAAV kao što je ovde razmatrano. U određenim aspektima, primalac će biti životinja kičmenjak, koja je namenjena da označi bilo koju životinjsku vrstu (i poželjno, vrstu sisara kao što je ljudsko biće). U izvesnim otelotvorenjima, „pacijent“ se odnosi na bilo koju životinju domaćina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljude i primate koji nisu ljudi, goveda, psi, kaprine, kavine, rovine, epine, konji, mačke, hircine, lapine, leporine, lupine, miši, ovce, svinje, rasine, vulpine, i slično, uključujući, ali bez ograničavanja na, pripitomljenu stoku, stočarske ili migratorne životinje, egzotične ili zoološke primerke, kao i kućne životinje, kućne ljubimce i bilo koju životinju pod veterinarskim nadzorom.

[0137] Kad se ovde koristi, izraz „nosač“ treba da obuhvata bilo koji rastvarač, medijum za disperziju, premaz, razblaživač, pufer, izotonični agens, rastvor, suspenziju, koloid, inert ili slično, ili njihovu kombinacija koja je farmaceutski prihvatljiva za davanje relevantnoj životinji ili prihvatljiva za dijagnostičku svrhu, kako je primenljivo. Upotreba jednog ili više agensa za isporuku za konstrukte za gensku terapiju, virusne čestice, vektore i slično, dobro je poznata stručnjacima u farmaceutskoj i molekularnoj struci. Osim u onoj meri u kojoj bilo koji konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa aktivnim sastojkom, razmatra se njegova upotreba u profilaktičkim i/ili terapeutskim sastavima. Jedan ili više dopunskih aktivnih sastojaka mogu takođe biti inkorporirani u, ili se dati zajedno sa jednim ili više od opisanih sastava.

[0138] Kad se ovde koristi, stručnjak će razumeti da „efektivna količina“ pruža terapeutski, profilaktički ili na drugi način koristan efekat pacijenta primaoca.

[0139] Izrazi „izolovani“ ili „biološki čisti“ odnose se na materijal koji je suštinski, ili značajno, bez komponenti koje normalno prate materijal kao što se nalazi u njegovom prirodnom stanju. Prema tome, izolovani polinukleotidi u skladu sa pronalaskom poželjno ne sadrže materijale koji su normalno povezani sa tim polinukleotidima u njihovom prirodnom, ili in situ, okruženju.

[0140] „Veza“ ili „pridruživanje“ se odnosi na bilo koji postupak poznat u struci za funkcionalno povezivanje jednog ili više proteina, peptida, nukleinskih kiselina ili polinukleotida, uključujući, ali bez ograničavanja na, rekombinantnu fuziju, kovalentnu vezu, disulfidnu vezu, jonsku vezu, vodoničnu vezu, elektrostatičko vezivanje i slično.

4

[0141] Kad se ovde koristi, izraz „plazmid“ ili „vektor“ se odnosi na genetski konstrukt koji je sastavljen od genetskog materijala (tj., nukleinske kiseline). Tipično, plazmid ili vektor sadrže poreklo replikacije koja je funkcionalna u bakterijskim ćelijama domaćinima, npr., Escherichia coli, i selektivne markere za detektovanje bakterijskih ćelija domaćina uključujući plazmid. Plazmidi i vektori predmetnog pronalaska mogu da uključe jedan ili više genetskih elemenata kao što je ovde opisano, koji su tako uređeni, da umetnuta kodirajuća sekvenca može biti transkribovana i prevedena u pogodne eksprimirajuće ćelije. Pored toga, plazmid ili vektor mogu uključivati jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, gene, promotere, pojačivače, aktivatore, višestruke regione kloniranja, ili bilo koju njihovu kombinaciju, uključujući segmente koji su dobijeni ili izvedeni iz jednog ili više prirodnih i/ili veštačkih izvora.

[0142] Izraz „sekvenca suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO: X“ znači da sekvenca u suštini odgovara delu SEQ ID NO: X i ima relativno malo nukleotida (ili aminokiselina u slučaju polipeptidnih sekvenci) koje nisu identični ili biološki funkcionalni ekvivalent nukleotida (ili aminokiselina) SEQ ID NO: X. Izraz „biološki funkcionalni ekvivalent“ je dobro poznat u struci, i dalje je detaljno definisan ovde. Prema tome, sekvence koje imaju oko 85% do oko 90%; ili još poželjnije, oko 91% do oko 95%; ili još poželjnije, oko 96% do oko 99%; nukleotida koji su identični ili funkcionalno ekvivalentni jednoj ili više nukleotidnih sekvenci pruženih ovde su posebno razmatrane kao korisne u praksi pronalaska.

[0143] Pogodni standardni uslovi hibridizacije za ovaj pronalazak uključuju, na primer, hibridizaciju u 50% formamidu, 5× Denhardts-ovom rastvoru, 5 × SSC, 25mM natrijum fosfatu, 0,1% SDS i 100 µg/ml denaturisane DNK sperme lososa na 42°C tokom 16 sati, praćeno 1 satom sekvencijalnog ispiranja sa 0,1 × SSC, 0,1% SDS rastvorom na 60°C kako bi se uklonila željena količina pozadinskog signala. Uslovi hibridizacije niže strogosti za ovaj pronalazak obuhvataju, na primer, hibridizaciju u 35% formamidu, 5 × Denhardts-ovom rastvoru, 5 × SSC, 25 mM natrijum fosfatu, 0,1% SDS i 100 µg/ml denaturisane DNK sperme lososa ili DNK E. coli na 42°C tokom 16 sati praćeno sekvencijalnim ispiranjem sa 0,8 × SSC, 0,1% SDS na 55°C. Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da se uslovi mogu lako prilagoditi kako bi se dobio željeni nivo strogosti.

[0144] Naravno, ovaj pronalazak takođe obuhvata segmente nukleinske kiseline koji su

4

komplementarni, suštinski komplementarni i/ili značajno komplementarni sa najmanje jednom ili više specifičnih nukleotidnih sekvenci koje su ovde specifično navedene.

Sekvence nukleinske kiseline koje su „komplementarne“ su one koje su sposobne za uparivanje baza prema standardnim Watson-Crick-ovim pravilima komplementarnosti. Kad se ovde koristi, izraz „komplementarne sekvence“ označava sekvence nukleinske kiseline koje su suštinski komplementarne, kao što se može proceniti istim poređenjem nukleotida kao što je gore navedeno, ili kako je definisano kao sposobno za hibridizaciju sa jednim ili više specifičnih segmenata nukleinske kiseline ovde opisana pod relativno strogim uslovima kao što su oni opisani neposredno iznad.

[0145] Kao što je iznad opisano, sonde i prajmeri predmetnog pronalaska mogu biti bilo koje dužine. Dodeljivanjem numeričkih vrednosti sekvenci, na primer, prvi ostatak je 1, drugi ostatak je 2, itd., može se predložiti algoritam koji definiše sve sonde ili prajmere koji se nalaze u datoj sekvenci:

[0146] n do n y, gde je n ceo broj od 1 do poslednjeg broja sekvence i y je dužina sonde ili primera minus jedan, gde n y ne prelazi poslednji broj sekvence. Dakle, za sondu sa 25 baznih parova ili prajmera (tj, „25-mer“), skup sondi ili prajmera odgovara bazama 1 do 25, bazama 2 do 26, bazama 3 do 27, bazama 4 do 28, i tako dalje, preko cele dužine sekvence. Slično tome, za sondu ili prajmer sa 35-baznih parova (tj, „35-mer“), primerne sekvence prajmera ili sonde uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje odgovaraju bazama 1 do 35, bazama 2 do 36, bazama 3 do 37, bazama 4 do 38, i tako dalje, duž čitave dužine Slično tome, za 40-mere, takve sonde ili prajmeri mogu da odgovaraju nukleotidima od prvog baznog para do bp 40, od drugog bp sekvence do bp 41, od trećeg bp do bp 42, i tako dalje, dok za 50-mere, takve sonde ili prajmeri mogu da odgovaraju nukleotidnoj sekvenci koja se proteže od bp 1 do bp 50, od bp 2 do bp 51, od bp 3 do bp 52, od bp 4 do bp 53, i tako dalje.

[0147] U izvesnim otelotvorenjima, biće korisno da se koristi jedan ili više segmenata nukleinske kiseline predmetnog pronalaska u kombinaciji sa odgovarajućim markerom koji se može detektovati (tj. „etiketa“), kao u slučaju upotrebe obeleženih polinukleotidnih sondi u određivanju prisustva date ciljane sekvence u testu hibridizacije. U struci su poznati veliki broj odgovarajućih indikatorskih jedinjenja i sastava za obeležavanje oligonukleotidnih sondi, uključujući, ali bez ograničavanja na, fluorescentne, radioaktivne, enzimske ili druge ligande, kao što je avidin/biotin, itd. koji se mogu detektovati u pogodnom testu. U određenim varijantama, može se takođe koristiti jedna ili više fluorescentnih oznaka ili enzimska oznaka, kao što je ureaza, alkalna fosfataza ili peroksidaza, umesto radioaktivnih ili drugih manje poželjnih reagensa. U slučaju enzimskih oznaka, poznati su kolorimetrijski, hromogeni ili fluorigenski indikatori supstrata koji se mogu koristiti za pružanje postupka za detektovanje uzorka koji je vidljiv ljudskom oku, ili analitičkim postupcima kao što su scintigrafija, fluorimetrija, spektrofotometrija i slično, kako bi se identifikovala specifična hibridizacija sa uzorcima koji sadrže jednu ili više komplementarnih ili suštinski komplementarnih sekvenci nukleinske kiseline. U slučaju takozvanih „multipleksnih“ testova, gde su dve ili više obeleženih sondi detektovane ili simultano ili sekvencijalno, može biti poželjno da se označi prva oligonukleotidna sonda sa prvom oznakom koja ima prvo svojstvo ili parametar detektovanja (na primer, spektralni maksimum emisije i/ili pobuđivanja), koji je takođe obeležio drugu oligonukleotidnu sondu sa drugom oznakom koja ima drugo svojstvo ili parametar detektovanja koji je različit (tj, diskretan ili vidljiv sa prve oznake. Upotreba testova multipleksiranja, posebno u kontekstu protokola genetičke amplifikacije/detektovanja, dobro su poznati stručnjacima u molekularnoj genetici.

PRIMERI

[0148] Sledeći primeri su uključeni kako bi se prikazala poželjna otelotvorenja pronalaska. Stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da tehnike opisane u primerima koje slede predstavljaju tehnike otkrivene od strane pronalazača da dobro funkcionišu u praksi pronalaska, i stoga se mogu smatrati da predstavljaju poželjne načine za njegovu praksu.

PRIMER 1 – AAV-POSREDOVANA GENSKA TERAPIJA OBNAVLJA VIZUELNU FUNKCIJU

I PONAŠANJE U MIŠJEM MODELU LCA1

[0149] U ovom primeru, pronalazači su procenili da li isporuka verzije retGC1 specifične za određenu vrstu (tj., miševe) ćelijama čepića postnatalnih GC1KO miševa može vratiti funkciji ovih ćelija. Vektori vektora serotipa 5 su korišćeni za isporuku mGC1 u fotoreceptore postnatalnog dana 14 (P14) GC1KO miševa. Elektroretinogram (ERG) i bihejvioralni testovi su korišćeni za procenu vizuelne funkcije, i imunocitohemija je korišćena za ispitivanje eksprimiranja transgenog tela, lokalizaciju arestina čepića i gustinu fotoreceptora čepića u tretiranim i netretiranim očima.

1

[0150] Ovaj primer pokazuje da AAV vektor subretinalno isporučen jednom oku P14 GC1 KO miševa olakšava eksprimiranje divljeg tipa retGC1, obnavljanje vizuelne funkcije i ponašanja, i očuvanje fotoreceptora čepića. Četiri nedelje posle injekcije, vizuelna funkcija (ERG) je analizirana u tretiranim i netretiranim očima. ERG je vršena svake dve nedelje potom, do 3 meseca nakon injekcije (poslednja vremenska točka je ocenjena). Miševi sa pozitivnim ERG odgovorima, kao i izogeni divlji tip i kontrolni miševima kojima nisu date injekcije, procenjeni su za vraćanje vizuelnog ponašanja pomoću testa optokinetičkog refleksa. Na 3 meseca nakon injekcije, sve životinje su žrtvovane, i njihove tretirane i netretirane retine su ispitivane na eksprimiranje GC1 i lokalizaciju čepića.

[0151] Rezultati takođe potvrđuju da je čepićima-posredovana funkcija obnovljena kod tretiranih očiju GC1KO miševa (ERG amplitude su bile ~60% od normale). Štaviše, efekat tretmana je bio stabilan najmanje 3 meseca nakon primene. Testiranje ponašanja je pokazalo snažno poboljšanje vizuelnog ponašanja posredovanog čepićem, gde su odgovori tretiranih miševa bili slični ili identični onim od miševa divljeg tipa. Histologija je otkrila eksprimiranje GC1 posredstvom AAV u fotoreceptorima i restauraciju translokacije arestina čepića kod tretiranih miševa. Pored toga, gustine kupastih ćelija bile su više u tretiranim očima od kontra-lateralne kontrole. Ovaj rezultat sugeriše da je tretman sposoban da sačuva fotoreceptore čepića najmanje tri meseca nakon tretmana. Ovo je prva demonstracija da je postnatalna genska terapija sposobna da obnovi vizuelnu funkciju i ponašanje i očuva retinalnu strukturu u modelu LCA1 kod sisara. Važno je da su rezultati dobijeni korišćenjem dobro opisanog, klinički relevantnog AAV vektora; in vivo dobijeni podaci o životinjama daju osnovu za AAV-bazirani vektor genske terapije za tretman dece obolele od LCA1.

MATERIJALI I POSTUPCI:

Eksperimentalne životinje:

[0152] GC1 /- heterozigotni embrioni uklonjeni su iz kriokonzerviranog materijala u The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Heterozigoti su spojeni u prostorijama pronalazača kako bi proizveli GC1 KO (-/-) i izogeni /+ kontrolni potomci. Svi miševi su uzgajani i održavani u centralizovanoj ustanovi u prostorijama pronalazača pod 12 sati/12 sati ciklusima svetlo/mrak. Hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Sve studije na životinjama su odobrene od strane lokalnog Institutional Animal Care and Use Committee i sprovedene u skladu sa ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research i NIH

2

regulativnom.

Izgradnja AAV vektora:

[0153] Serotip 5 vektori adeno-povezanog virusa (AAV5) su korišćeni za isporuku mišjeg GC1 (mGC1) jer je pokazano da pokazuju robusnu efikasnost transdukcije i brži početak eksprimiranja u fotoreceptorima retine od drugih serotipova AAV (Yang i dr., 2002). I ćelijski specifični i sveprisutni promoteri su izabrani da pokrenu eksprimiranje mGC1.

Ćelijski specifična, G protein-spregnuta receptorska kinaza 1 (GRK1), takođe poznata kao promoter rodopsin kinaze, izabrana je zbog svoje sposobnosti da specifično cilja robusno eksprimiranje transgena u fotoreceptorima štapića i čepića kada se koristi zajedno sa AAV (Khani i dr., 2007). Sveprisutni promoter smCBA koji pokazuje sličan obrazac eksprimiranja kao CBA u punoj dužini retine je izabran zbog svoje sposobnosti da efikasno cilja na neuronsku retinu (Haire i dr., 2006). Lančana reakcija polimeraze koja koristi sledeći prednji primer:

5'-AAAAGCGGCCGCATGAGCGCTTGGCTCCTGCCAGCC-3' (SEQ ID NO:14)

i naredni obrnuti prajmer:

5'-AAAAGCGGCCGCTCACTTCCCAGTAAACTGGCCTGG-3' (SEQ ID NO:15)

je korišćen za amplifikaciju mGC1 iz plazmida koji sadrži mGC1-eGFP fuziju (Bhowmick i dr., 2009). Dobijeni fragment je kloniran u pCR plućni plazmid (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i verifikovana je sekvenca. AAV vektorski plazmid koji sadrži smCBA vođeno eksprimiranje mGC1 (pTR-smCBA-mGC1) je stvoren zamenom CBA pune dužine sa smCBA u plazmidu pTR-CB<SB>-HRPE65 (Jacobson i dr., 2006) putem EcoRI digestije i potom ligacije. Nakon toga, hRPE65 je zamenjen sa mGC1 putem NotI digestije i ligacije, što je rezultovalo stvaranjem pTR-smCBA-mGC1 (SLIKA 11). AAV vektorski plazmid koji sadrži ljudski promoter GRK1 koji pokreće eksprimiranje mGC1, pTR-GRK1-mGC1 je stvoren uklanjanjem hGFP iz pTR-hGRK1-hGFP (Beltran i dr., 2010) i zamenjuje ga sa mGC1 putem NotI digestije i lugacije (SLIKA 11). AAV vektori su pakovani prema prethodno objavljenim postupcima (Haire i dr., 2006). Virusne čestice su resuspendirane u Balanced Salt Solution (Alcon, Fort Worth, TX, USA) i titrirane kvantitativnom PCR u realnom vremenu (Jacobson i dr., 2006). Dobijeni titri su 4,69 × 10<12>virusni genomi po ml (vg/mL) i 4,12 × 10<13>vg/mL za AAV5-smCBA-mGC1, odnosno AAV5-hGRK1-mGC1.

Subretinalne injekcije:

[0154] Jedan µL AAV5-GRK1-mGC1 (4,12 × 10<10>isporučeni genomi vektora) ili AAV5smCBA-mGC1 (4,69 × 10<9>isporučeni genomi vektora) je isporučen subretinalno u postnatalnom danu 14 (P14) desnom oku svakog GC1KO miša, ostavljajući levo oko kao kontralateralnu kontrolu. Subretinalne injekcije su izvedene kao što je prethodno opisano (Timmers i dr., 2001; Pang i dr., 2006). Dalja analiza je obavljena samo na životinjama koje su primile uporedive, uspešne injekcije (> 60% odvajanje od retine i minimalne komplikacije). Dobro je utvrđeno da područje odvajanja retine odgovara području virusne transdukcije (Cideciyan i dr., 2008; Timmers i dr., 2001).

Elektroretinografska analiza:

[0155] Elektroretinogrami (ERG) tretiranih GC1KO (n=14) i izogene /+ kontrole (n=2) zabeležene su pomoću PC-bazirane jedinice za kontrolu i snimanje (Toennies Multiliner Vision; Jaeger/Toennies, Höchberg, Germany) prema postupcima prethodno opisani, uz male modifikacijame (Haire i dr., 2006). Početna merenja ERG su zabeležena na 4 nedelje nakon davanja injekcije, i svake naredne 2 nedelje nakon toga, do 3 meseca nakon davanja injekcije (poslednja vremenska tačka procenjena u studiji). Starosno usklađene /+ izogene kontrole su zabeležene zajedno sa tretiranim životinjama u svakoj vremenskoj tački. Miševi su adaptirani na mrak preko noći (više od 12 sati) i anestezirani sa smešom 100 mg/kg ketamina, 20 mg/kg ksilazina i fiziološkog rastvora u odnosu 1:1:5. Zenice su proširene sa 1% tropicamida i 2,5% fenilefrin hidrohlorida. Za održavanje temperature na 38°C korišćena je zagrejana vodena kupka. Hidroksipropil metilceluloza 2,5% je primenjena na svako oko kako bi se sprečila dehidracija rožnjače. ERG punog polja zabeleženi su korišćenjem rožnjačkih elektroda sa zlatnom žicom. Referentne i uzemljene elektrode su postavljene potkožno između očiju i repa. Snimci skotopskih štapića izazvani su nizom belih bljeskova sedam rastućih intenziteta (0,01 mcds/m<2>do 5 cds/m<2>). Interstimulusni intervali za stimuluse niskog intenziteta bili su 1,1 sekundi. Na tri najveća intenziteta (100 mcds/m<2>, 1 cds/ m<2>i 5 cds/m<2>), interstimulus intervali su bili 2,5, 5,0 i 20,0 sekundi, respektivno. Deset odgovora je zabeleženo i prosečno određeno za svaki intenzitet. Miševi su zatim osvetljeni na 100 cds/ m<2>bela pozadina 2 minuta. Odgovori fotopičnog čepića su izazvani serijom od pet povećanja intenziteta svetlosti (100 mcds/ m<2>do 12 cds/m<2>). Pedeset odgovora je zabeleženo i prosečno određeno za svaki intenzitet. Svi stimulusi su predstavljeni u prisustvu 100 cds/ m<2>pozadine. Amplitude B talasa su definisane kao razlika između a-talasnih korita i pozitivnih pikova svakog talasnog oblika.

[0156] Maksimalne amplitude b-talasa (generisane na 12 cds/m<2>) svih (n=8) GC1KO

4

tretiranih sa smCBA-mGC1 (n=6) i hGRK1-mGC1 (i tretirane i netretirane oči) i izogenih /+ kontrolnih miševa su prosečno izračunate i korišćene za generisanje standardnih grešaka. Ovi proračuni su napravljeni u svakoj vremenskoj tački (4 nedelje - 13 nedelja nakon davanja injekcije). Ovi podaci su uvezeni u Sigma Plot za konačnu grafičku prezentaciju. Upareni t-Test je korišćen za izračunavanje P-vrednosti između tretiranih i netretiranih očiju unutar svake promoterske grupe (smCBA ili hGRK1) i između svake promoterske grupe tokom vremena (4 nedelje nakon injekcije u odnosu na 3 meseca nakon injekcije). Standardni t-Test je korišćen za izračunavanje P-vrednosti između smCBA-mGCl u odnosu na hGRK1-mGC1 tretirane oči. Značajna razlika je definisana kao P-vrednost <0,05. Zbog toga što su neki od miševa iz svake tretirane grupe privremeno uklonjeni iz studije za bihevioralne analize, razlikuje se ukupan broj miševa u proseku i predstavljen u svakoj vremenskoj tački na SLICI 2A i SLICI 2B. Tri miša iz grupe tretirane sa smCBA-mGC1 su poslata za optomotorsko testiranje, ostavljajući „n“ od 3 miševa koji su korišćeni za ERG analizu tokom 8, 10 i 12 nedelja merenja (SLIKA 2A). Dva miša iz grupe tretirane sa hGRK1-mGC1 su poslata na optomotorsko testiranje, ostavljajući „n“ od 6 korišćenih za ERG analizu tokom 6, 8, 10 i 12 nedelja merenja (SLIKA 2B). Svi miševi koji su poslati za analizu ponašanja su mereni nakon 13 nedelja nakon injekcije, po povratku u laboratorije pronalazača (smCBA-mGC1: n=3, hGRK1-mGC1: n=2) nakon završetka analize ponašanja.

Optomotorno testiranje:

[0157] Fotopične vidne oštrine i kontrastne osetljivosti tretiranih i netretiranih GC1KO očiju miša su merene korišćenjem alternativnog oblika prisilnog izbora kako je prethodno opisano (pogledati npr., Umino i dr., 2008; Alexander i dr., 2007). Kako bismo testirali osetljivost pojedinačnih očiju od iste životinje, iskoristili smo činjenicu da vid kod miša ima minimalno binokularno preklapanje i da je levo oko osetljivije na rotaciju u smeru kazaljke na satu i desno na rotaciju suprotno od kazaljke na satu (Douglas i dr., 2005). Tako u optomotornom protokolu „slučajnog razdvajanja“ pronalazača, prag oštrine i kontrasta svakog oka je određen odvojeno i istovremeno putem stepenaste funkcije za ispravne odgovore u smeru kazaljke na satu i suprotno od kazaljke na satu. Pravilno detektovanje uzoraka koji se okreću u smeru kazaljke na satu primarno su vođeni vizuelnim signalima koji potiču iz levog oka, i ispravni odgovori u smeru suprotnom od kazaljke na satu izvedeni su iz vizuelnih signala koji potiču iz desnog oka. Oštrina je definisana kao najveća prostorna frekvencija (100% kontrast) koja daje prag odziva, i kontrastna osetljivost je definisana kao 100 podeljena sa najnižim procentom kontrasta koji daje prag odgovora. Za fotopičnu oštrinu, početni stimulus je bio 0,200 ciklusa/stepen sinusoidnog uzorka sa fiksnim 100% kontrastom. Za merenja osetljivosti na fotopični kontrast, početni uzorak je predstavljen sa 100% kontrastom, sa fiksnom prostornom frekvencijom od 0,128 ciklusa/stepen. Fotopični vid je meren pri srednjoj osvetljenosti od 70 cds/m<2>. Oštrina vida i kontrastne osetljivosti su mereni za oba oka svakog miša četiri do šest puta u periodu od 1 nedelje. Starsno usklađene, izogene /+ kontrolne životinje (M1, M2) i naivni GC1KO miševi (M3, M4) su prikazani zajedno sa miševima tretiranim sa smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) i hGRK1-mGC1 (M8, M9) na SLICI 3.

Čepićima-posredovane ERG amplitude generisane od 12 cds/m<2>stimulusa svih miševa (M1-M9) su prikazane zajedno sa rezultatima ponašanja. Neupareni t-testovi su vršeni na oštrini i procentnima vrednostima kontrasta kako bi se odredio značaj rezultata.

Priprema tkiva:

[0158] Tri meseca nakon davanja injekcije, GC1KO miševi tretirani sa P14 i starosno uklopljeni izogeni /+ kontrolni uzorci su bili prilagođeni za 2 sata. Odmah posle adaptacije na mrak, miševi su žrtvovani pod slabim- crvenim svetlom (> 650 nm). Limbus očiju kojima su date i kojima nisu date injekcije obeležen je vrućom iglom na položaju 12:00, što olakšava orijentaciju. Enukleacija je izvedena pod slabim crvenim svetlom i oči su odmah stavljene u 4% paraformaldehid. Oči koje su se koristile za krioseciranje su pripremljene prema prethodno opisanim postupcima (Haire i dr., 2006). Ukratko, rožnjače su uklonjene iz svakog oka, ostavljajući sočivo unutar preostale čaše za oči. Mali rez u obliku slova „V“ napravljen je u skleri pored spaljenog limbusa kako bi se održala orijentacija. Nakon fiksiranja preko noći, sočivo i staklasto tkivo su uklonjeni. Preostala očna školjka koja sadrži retinu/RPE je stavljena u 30% saharozu u PBS najmanje 1 sat na 4°C. Očne šoljke su zatim stavljene u kriostatno jedinjenje (Tissue Tek OCT 4583; Sakura Finetek, Inc., Torrance, CA, USA) i zamrznute u kupki sa suvim ledom/etanolom. Oči su serijski podeljene na 10 µm sa kriostatom (Microtome HM550; Walldorf, Germany). Oči koje su se koristile za celokupnu analizu pripremljene su prema prethodno opisanim postupcima (Pang i dr., 2010).

Orijentacija je postignuta kao što je ranije spomenuto. Nakon fiksacije preko noći, epitel od pigmenta rožnjače, sočiva, staklastog i retinalnog tkiva je uklonjen iz svakog oka bez ometanja retine. Napravljen je rez u superiornom (dorzalnom) delu retine u blizini prvobitnog limbusa kako bi se održala orijentacija.

Imunohistohemija i mikroskopija:

[0159] Kriosekcije retine i celi nosači su isprane 3 × u 1X PBS. Posle ovih ispiranja, uzorci su inkubirani u 0,5% Triton X-100® tokom 1 sata u mraku na sobnoj temperaturi. Zatim su uzorci blokirani u rastvoru 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Retinalne sekcije su inkubirane preko noći na 37°C sa zečjim poliklonskim GC1 antitelom (1: 200, sc-50512, Santa Cruz BioTechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) ili zečjim poliklonskim arestin čepića antitelom („Lumij“ 1:1000, dobijen od straneDr. Cheryl Craft, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA) razblažen u 0,3% Triton X-100®/1% BSA. Celi nosači retine inkubirani su preko noći na sobnoj temperaturi sa istim antitelom arestina čepića, razblaženim 1:1000 u 0,3% Triton X-100®/1% BSA. Posle primarne inkubacije, retinalne sekcije i celokupni nosači su isprani 3X sa IX PBS.

[0160] Retinalne sekcije su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa IgG sekundarnim antitelima označenim bilo sa Alexa-594 ili Alexa-488 fluoroforom (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) razblaženim 1:500 u IX PBS. Posle inkubacije sa sekundarnim antitelima, sekcije i celokupni nosači su isprani sa 1X PBS. Retinalne sekcije su kontraobojene sa 4',6'-diamino-2-fenilindolom (DAPI) tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Posle završnog ispiranja sa IX PBS i vodom, sekcije su postavljene u vodenoj sredini (DAKO) i pokrivene. Celi nosači retine su bili orijentisani na slajdovima sa superiornim (dorzalnim) delom retine postavljenim na položaju 12:00. Uzorci su postavljeni u DAKO i pokriveni.

[0161] Sekcije retine su analizirane konfokalnom mikroskopijom (Leica TCS SP2 AOBS Spectral Confocal Microscope opremljen sa LCS verzijom 2,61, Build 1537 softver, (Bannockburn, IL, USA). Sve slike su uzete sa identičnim podešavanjima ekspozicije na bilo 20× ili 63× uvećavanju. Talasne dužine pobuđivanja koje su korišćene za DAPI, GC1 i mrlje čepića arestina bile su 405 nm, 488 nm i 594 nm, emisioni spektri su bili 440-470 nm, 500-535 nm i 605-660 nm, respektivno. Širokopojasni fluorescentni mikroskop ( Axioplan 2) (Zeiss, Thornwood, NY, SAD) opremljen sa QImaging Retiga 4000R kamerom i QImaging QCapture Pro softverom (QImaging, Inc., Surrei, BC, Kanada) Kvadranti svakog celog nosača su slikani pri 5× pod identičnim postavkama ekspozicije i zatim spojeni u Photoshop® (Verzija 7.0) (Adobe, San Jose, CA, USA)

Analiza slike:

[0162] Gustine fotoreceptora u čepiću analizirane su u celom nosaču retine prebrojavanjem ćelija označenih sa sekundarnim fluoroforom usmerenim protiv antitela na kupasti arestin u centralnoj i donjoj retini korišćenjem softvera ImageJ® (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Ove vrednosti su dobijene zumiranjem 5X TIFF datoteka prikazanih na SLICI 5. Pet kvadrata (500 µm<2>) su postavljeni na identične površine u središnjoj i donjoj retini i tretiranih i netretiranih GC1KO očiju. Za centralnu retinu, kvadrati su postavljeni na jednaku ekscentričnost oko glave optičkog živca u svim očima (125 µm). Fotoreceptori čepića su prebrojavani u svakom retinalnom regionu, vrednosti su prosečno izračunate i izračunate su standardne devijacije. Standardni t-Test je korišćen za izračunavanje P-vrednosti između željenih uzoraka. Značajna razlika je definisana kao a P-vrednost <0,05.

REZULTATI

Funkcija fotoreceptora (ERG) je obnovljena kod GAC1KO miševa tretiranih sa AAV:

[0163] Prethodno je objavljeno da su odgovori čepića kod GC1KO miševa jedva detektovani do 1 meseca starosti. Ovde su pronalazači pokazali da je P14-tretman ovog miša sa AAV vektorom koji nosi gen GC1 miša pod kontrolom bilo fotoreceptor-specifičnog (hGRK1) ili sveprisutnog (smCBA) promotera doveo do značajne restauracije kupaste fotoreceptorske funkcije merene ERG. Reprezentativni kupasti tragovi (SLIKA 1) (kao i prosečne fotopične b-talasne amplitude (SLIKA 2A i SLIKA 2B) iz hGRK1-mGC1-tretiranih, smCBA-mGC1-tretiranih, GC1KO i izogenih /+ kontrola) su pokazali da je funkcija čepića u tretiranim očima vraćena na otprilike 45% normale na četiri nedelje nakon injekcije. Slično prethodnim izveštajima, kupasti odgovori u kontralateralnim, netretiranim očima su ablirani do ove vremenske tačke. Na 4 nedelje nakon davanja injekcije, prosečna čepićima-posredovana amplituda b-talasa u očima tretiranim sa smCBA-mGC1 (65,1 µV) bila je značajno viša (P = 0,006) nego u netretiranim očima (3,9 µV). Prosečna amplituda b-talasa posredovanog čepićem u očima tretiranim hGRK1-mGC1 (59,1 µV) bila je značajno veća (P <0,001) nego u netretiranim očima (3,2 µV). Nivo restauracije postignut četiri nedelje nakon isporuke fotoreceptora specifičnog hGRK1-mGC1 vektora nije bio značajno različit od onog koji je postignut sa sveprisutnim vektorima smCBA-mGCl koji sadrže promoter (P = 0,604). Na 3 meseca nakon davanja injekcije, prosečna amplituda b-talasa posredovanog čepićem u očima tretiranim sa smCBA-mGC1 (53,3 µV) bila je značajno viša (P < 0,001) nego u netretiranim očima (2,8 µV). Prosečna amplituda b-talasa posredovanog čepićem u očima koje su tretirane sa hGRK1-mGC1 (45,3 µV) bila je značajno veća (P <0,001) nego u netretiranim očima (3,4 µV). Nivo restauracije postignut 3 meseca posle isporuke fotoreceptor-specifičnog GRK1-mGC1 vektora nije bio značajno različit od onog postignutog sa sveprisutnim promoterom koji sadrži smCBA-mGCl vektor (P = 0,331). Oba promotera su kratkoročno podelila slične nivoe funkcionalne restauracije čepićima u tretiranim očima GC1KO miša. Važno je da je restauracija funkcije fotoreceptora čepića ostala stabilna tokom 3 meseca (poslednja vremenska tačka procenjena u ovoj studiji (pogledati SLIKU 1, SLIKU 2A i SLIKU 2B). Nije bilo značajne razlike u fotopičnim amplitudama b-talasa od smCBA- tretiranih očiju sa mGC1 ili hGRK1-mGC1 između 4 nedelje i 3 meseca posle tretmana (P = 0,174 i 0,125, respektivno).

[0164] ERG implicitna vremena koja su važna karakteristika u dijagnostici različitih retinalnih poremećaja uključujući i druge oblike LCA (Sun i dr., 2010) takođe su utvrđeni. Iako se takvo merenje ne može dobiti iz GC1KO oka (nema ERG odgovora u ovim očima), bilo je moguće uporediti implicitna vremena kupastog b-a u AAV-mGC1 tretiranim i izogenim /+ kontrolnim miševima. 4 nedelje nakon injekcije nije bilo značajne razlike između implicitnih vremena kupastog b-talasa u tretiranim i /+ kontrolnim očima (P= 0,884); prosečne vrednosti u AAV-mGC1 tretiranim i /+ očima u ovoj vremenskoj tački bile su 50,8 ms i 50,4 ms, respektivno. 3 meseca nakon injekcije, takođe nije bilo značajne razlike između ove dve grupe (P = 0,697); prosek svih implicitnih vremena kupastog b-talasa u tretiranim i /+ kontrolnim očima bio je 59,7 ms i 58,3 ms, respektivno. Kinetika odgovora čepića u tretiranoj GC1KO retini (kako je određeno implicitnim vremenskim merenjima) izgleda da je normalna i stabilna u kratkom roku.

[0165] Prethodno je izveštavano da ERG štapića kod GC1KO miševa pokazuju promene od 1 meseca starosti, i a-talas i b-talas štapića su značajno smanjeni (Yang i dr., 1999). Ova redukcija platoa pri starosti od 5 meseci sa odgovorom oko 50-70% od miševa divljeg tipa (WT). Dok su neki slučajevi AAV-mGC1-posredovanih poboljšanja opaženi u tretiranim očima GC1KO miševa u odnosu na netretirane kontrole (primer koji je prikazan na SLICI 1), ovaj rezultat nije bio tako konzistentan kao onaj koji je primećen u čepićima posredovanim odgovorima.

Vizuelno ponašanje je obnovljeno kod GAC1KO miševa tretiranim AAV-om:

[0166] Optomotorna analiza je pokazala da su oči GC1KO miševa tretiranih ili smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) ili hGRK1-mGC1 (M8, M9) reagovali značajno bolje od netretiranih očiju pod svim fotopičnim, čepićem posredovanim stanjima. netretirane GC1KO oči loše funkcionišu sa oštrinom vida od 0,163 ± 0,040 ciklusa po stepenu (SLIKA 3B i SLIKA 3C, bar, srednja vrednost ± s.d., n=9 očiju). Izogene GC1<+/+>kontrolne oči (M1, M2) reaguju značajno bolje, pokazujući prosečnu oštrinu od 0,418 ± 0,046 ciklusa po stepenu (n=4 oka). Oči tretirane sa AAV-mGC1 (M5-M9) imaju prosečnu oštrinu od 0,392 ± 0,077 ciklusa po stepenu (n=5 očiju), nivo koji je suštinski identičan kontrolnim /+ očima i značajno bolji od netretiranih GC1KO očiju (P <0,0001). Osetljivosti fotopičnog kontrasta (SLIKA 3B i SLIKA 3C) paralelne su sa rezultatima fotopične oštrine, sa očima tretiranim sa AAV-mGC1 (kontrastna osetljivost od 11,9 ± 7,37, n=5 očiju) pokazujući pragove kontrasta skoro identične /+ miševima (11,94 ± 3,03, n=4 oka). Opet, GC1KO oči tretirane na P14 sa AAV-mGC1 pokazale su se znatno bolje od netretiranih očiju, što je pokazalo da je prosečna kontrastna osetljivost 1,27 ± 0,31 (n=9, P <0,0001). U svim fotopičnim testovima, netretirane GC1KO oči prolaze ekstremno loše, u suštini ekvivalentno funkciji koja nije posredovana čepićem. Statistička poređenja ovih merenja prikazana su u Tabeli 1. Tragovi ERG posredovanih čepićem svih GC1<+/+>(M1, M2), GC1KO (M3, M4), smCBA-mGC1-tretiranih (M5, M5, M7) i hGRK1-mGC1-tretiranih (M8, M9) miševa korišćeni u analizi ponašanja su prikazani na SLICI 3A kako bi se povezala vizuelnu funkcija (ponašanje optomotora) sa funkcijom retine (elektrofiziologija).

[0167] Funkcija retine (ERG) je delimično sačuvana kod GC1KO miševa. Studije su pokazale da čak i veoma male ERG amplitude prenose u robustno vizuelno ponašanje (Williams i dr., 2006). U stvari, LCA2 pacijenti koji su primali AAV-RPE65 terapiju su otkriveni da pokazuju obnovu ponašanja uprkos potpunom nedostatku ERG odgovora (Maguire i dr., 2008). Optomotorni testovi su pokazali da su skotopske, vizuelne oštrine i kontrastne osetljivosti GC1KO očiju veoma slične kontrolama /+. Iz tog razloga nije bilo moguće uporediti vizuelnu restauraciju tretiranih u odnosu na netretirane oči na nivou ponašanja. Statistička poređenja ovih merenja prikazana su u Tabeli 1:

fotoreceptor-specifični i sveprisutni promoteri predvode mGC1 transgeno eksprimiranje u štapićima i čepićima GC1KO miševa:

[0168] Nedostatak GC1 utiče na fotoreceptore štapića i čepića kod LCA1 pacijenata.

Fotoreceptor-specifični ljudski RK promoter i sveprisutni smCBA promoter su stoga izabrani za ovu studiju kao sredstvo za ciljanje oba tipa ćelija. Ljudski RK promoter je izabran zbog svoje male veličine i sposobnosti da efikasno pokrene eksprimiranje transgena specifično u fotoreceptorskim ćelijama. Imunobojenje GC1KO mrežnjača 3 meseca nakon tretmana sa AAV-hGRK1-mGC1 otkrilo je da je ovaj promoter predvodio robusno GC1 eksprimiranje u

1

spoljašnjim segmentima fotoreceptora. Reprezentativna slika preseka retine iz oka kom je data injekcija sa ovim terapeutskim vektorom (SLIKA 4A) pokazuje intenzivno GC1 bojenje u OS sloju, dok kontralateralnom, netretiranom oku od istog miša nedostaje bilo koje GC 1 eksprimiranje (SLIKA 4B). smCBA promoter takođe efikasno predvodi GC1 eksprimiranje u ćelijama fotoreceptora. Fotoreceptor OS je pokazao robusno smCBA-posredovano GC1 eksprimiranje u tretiranim očima (SLIKA 4C), u odnosu na kontralateralno, netretirano oko (SLIKA 4D). Nivoi hGRK1 i smCBA-posredovano GC1 eksprimiranje su se približili onom koji se primećuju u izogenim, /+ kontrolnim očima (SLIKA 4E). Eksprimiranje GC1 u očima tretiranim sa hGRK1-mGC1 bilo je ograničeno na OS. U očima tretiranim sa smCBA-mGC1, GC1 eksprimiranje je povremeno pronađeno u telima fotoreceptorskih ćelija spoljnog nuklearnog sloja (pogledati npr. strelice na SLICI 4F). Značajno je, međutim, da ni jedan promoterski konstrukt nije izazvao terapeutsko GC1 eksprimiranje izvan fotoreceptorskih ćelija. Ovaj nedostatak eksprimiranja van ciljane grupe je relevantan za razvoj budućih kliničkih primena.

Translokacija arestina čepića je obnovljena kod GC1KO miševa tretiranim sa AAV-mGC1:

[0169] AAV-mGC1 tretman je obnovio translokaciju arestina čepića izazvanu svetlošću u fotoreceptorima čepića u tretiranoj GC1KO retini. Reprezentativni tretirani, netretirani i /+ retinalni poprečni preseci imunološki obojeni sa antitelom generisanim protiv arestina čepića pokazali su da je arestin čepića lokalizovan do spoljnih segmenata, unutrašnjih segmenata, aksona i sinaptičkih krajeva od /+, smCBA-mGC1-tretiranih i hGRK1- mGC1-tretiranih fotoreceptora čepića (SLIKA 5A, SLIKA 5C, odnosno Slika 5D). Naprotiv, arestin čepića je ostao lokalizovan uglavnom na spoljnim segmentima čepića kod netretiranih GC1KO retina ( SLIKA 5B). Ovaj rezultat je bio u skladu sa idejom da su čepići kod GC1KO retini miša hronično hiperpolarizovani. Ne samo da je opažena restauracija lokalizacije arestina čepića u tretiranim retinama prilagođenim na tamu, već je očigledna regulacija na gore proteina u tretiranim očima u odnosu na netretirane kontrole. Značajno je da su se i gustine ćelija čepića povećale u tretiranim očima u odnosu na netretirane kontrole (pogledati npr., SLIKU 5A, SLIKU 5B, i SLIKU 5C).

Fotoreceptori sa čepićem su sačuvani kod GC1KO miševa tretiranim sa AAV-mGC1:

[0170] Analiza smCBA-mGC1 kod hGRK-mGC1 tretiranih i netretiranih, kontralateralnih retinalnih celih nosača na 3 meseca nakon injekcije sa terapijskim vektorom obojenim antitelom usmerenim protiv arestina čepića, pokazalo je da su fotoreceptori čepića sačuvani

2

kao rezultat tretmana sa terapeutskim vektorom (SLIKA 6). Brojevi fotoreceptora čepića u inferiornim i centralnim retinama i tretiranih i netretiranih retinalnih celih nosača otkrili su da postoji statistički značajna razlika u gustini ćelija čepića u odnosu na netretirane oči. Ovaj rezultat je bio konzistentan sa zapažanjem da je robusna elektrofiziološka i bihevioralna restauracija bila jasno vidljiva. P14-tretman GC1KO miševa sa bilo kojim terapeutskim konstruktom bio je sposoban da sačuva strukturu fotoreceptora čepića tokom najmanje tri meseca.

PRIMER 2 - MODEL ŽIVOTINJA, KOJI SADRŽI GC1/GC2 DVOSTRUKE KNOCKOUT

[0171] Važno je napomenuti da dok su samo fotoreceptori čepića zahvaćeni kod GC1KO miševa (štapići samo gube delimičnu funkciju i ne degenerišu), LCA1 pacijenti pokazuju gubitak funkcije štapića i degeneraciju štapića. Razlog za ovu razliku je spekulativna razlika u zavisnosti od GC2, bliskog srodnika GC1 koji je izražen u fotoreceptorima štapića. Štapići miša mogu da funkcionišu u odsustvu GC1 verovatno zato što je GC2 sposoban da rekonstituiše aktivnost; međutim, kod ljudi to nije slučaj. GC1 je potreban za funkciju štapića, i time i za degeneraciju štapića. Generisan je GC1/GC2 model sa dvostrukim knockout miševima koji je pokazao da imaju gubitak funkcije štapića (pored gubitka funkcije čepića kao što se vidi kod GC1 K/O) (Baehr i dr., 2007). Biohemijskim studijama sa ovim modelom dokazano je da GC2 pruža funkciju štapića u odsustvu GC1. S obzirom na to, GC1/GC2 dvostruki knockout miš koji pouzdanije oponaša ljudsko stanje (i štapići i čepići su pogođeni) (Karan i dr., 2010). Kako bi se testirali i rAAV vektori-smCBA-mGC1 i rAAV-hGRK1-mGC1 kod GC1/GC2 dvostrukom knockout mišu, rAAV vektori se dostavljaju na potpuno isti način i vreme (post-natalni dan 14) kao i u gore pomenutim GC1 knockout studijama. Analiza restauracije vida, kako fiziološki, tako i ponašanja, takođe se izvodi na isti način kao što je gore opisano za GC1 studiju. Poseban naglasak je na skotopičnim (tj, štapić) odgovori, kao merljivi oporavak funkcije štapića se očekuje kod GC1/GC2 dvostruko knockout miševa tretiranih sa GC1 vektorskom konstrukcijom.

PRIMER 3 - 'HUMANIZOVANI' MIŠJI ŽIVOTINJSKI MODEL LCA1

[0172] Ovaj primer opisuje stvaranje „humanizovanog“ mišjeg životinjskog modela LCA1. U jednom otelotvorenju, model miša sadrži GC1/GC2/GCAP1 knockout. GCAP1 je protein koji aktivira GC1. Za kreiranje in-vivo sistema u kom se ljudski GC1 eksprimiran iz kliničkog rAAV vektora dizajniranog za upotrebu kod ljudi može proceniti za funkciju, koristi se GC1/GC2/GCAP1 trostruki knockout hGCAP1 transgeni miš. Kod ovog miša, vizuelna funkciji se obnavlja pomoću rAAV-posredovanog hGC1 samo u interakciji sa hGCAP1 (tj. nema endogenog mišjeg GCAP1). Iz ove studije, moguće je odrediti da li je ljudski GCAP1 protein potreban za stimulaciju ljudske GC1 aktivnosti u mišjem modelu, i da li se funkcija može vratiti u čepiće i štapiće kada se dva ljudska polipeptida rekonstituišu i eksprimiraju u ne-ljudskom (tj., mišjem) modelu bolesti. Kako bi generisali se GC1/GC2/GCAP1 trostruki knockout hGCAP1 transgeni miš, GC1/GC2 dvostruki knockout miš (Baehr et al, 2007) je ukršten sa GCAP1 knock out mišem (Mendez et al, 2001). Ljudski GCAP1 se zatim transgeno eksprimira u životinjskom modelu kako bi se generisao GC1/GC2/GCAP1 trostruki knockout hGCAP1 transgeni miš. Ispitivanja u kojima se rAAV vektorizovani hGC1 daju ovim životinjama se sprovode na način koji je suštinski identičan postupcima korišćenim kod GC1 studiji. Analiza vraćanja vida, kako fiziološki, tako i ponašanja, se zatim izvodi na isti način kao što je to učinjeno kod GC1 studiji.

PRIMER 4 - PRIMERI KONSTRUKTORA VEKTORA KOJI SU KORISNI U PRAKSI PRONALASKA

[0173] Karte dva ilustrativna vektora su prikazane na SLICI 11. Jedan sadrži nespecifični promoter smCBA, i drugi ima ograničeni promoter GRK1. Oba su upakovana u serotip 5 AAV. Sve doze vektora testirane do sada su sigurne u retini miševa. Kohorti GC1-/- miševa su zatim sub-retinalno dati kao injekcije u postnatalnom danu 14 (P14) i zatim analizirani periodično na ERG i fotopično optokinetičko (posredovan čepićem) ponašanje. Pošto GC1<-1->miš održava štapić posredovan ERG, praćenje funkcionalnog izbavljivanja fokusirano je prvenstveno na obnovu funkcije čepića. Za smCBA vektor ERG su procenjivane 4 nedelje posle tretmana i svake 2 nedelje nakon 12-13 nedelja posle tretmana. Svih 9 očiju tretiranih u 9 miševa reagovalo je na tretman. Rezultati, prikazani u nastavku, pokazuju značajnu obnovu fotopičnih ERG amplituda -a od suštinski neregistrovanih kod kontrolinih netretiranih očiju do približno 50% normalnosti kod očiju tretiranih partnerskim vektorom.

[0174] Četiri GC1<-/->miševi su zatim analizirana skotopskim optokinetičkim ponašanjem za razlike posredovane tretiranim u odnosu na netretirane partnerske oči (prikazano ispod). Sva četiri tretirana oka (289, 290, 294, 295, crveni stubići) pokazali su značajno poboljšanje vidne oštrine u odnosu na kontrolne oči, i tri od četiri pokazala su značajno poboljšanu kontrastnu osetljivost. Miševi 297 i 298 su divlji tip kontrole, i miš 299 je netretirani GC1<-/->miš.

Rezultati pokazuju da vektor ostvaruje funkcionalnu i bihevioralnu obnovu čepićima

4

posredovanog vida u životinjskom modelu LCA1.

[0175] Za GRK1 vektor koji ograničava eksprimiranje na štapiće i čepiće, ERG-ovi su procenjeni kod 14 GC1<-/->miševa tretiranih na jednom oku 4 nedelje nakon tretmana i svake 2 nedelje do 12-13 nedelja nakon tretmana. Odgovorilo je 12 od 14 tretiranih očiju kod 12 životinja. Rezultati (prikazani u nastavku) su otkrili značajnu obnovu fotopičnih ERG amplituda od suštinski neregistrovanih u kontroli netretiranih očiju do približno 40% normalnosti kod očiju tretiranih partnerskim vektorom.

[0176] Jedan GC1<-/->miš (# 293) je zatim analiziran skotopskim optokinetičkim ponašanjem za razlike u tretiranim u odnosu na netretirane partnerske oči (prikazano gore). Ovaj miš je pokazao značajno poboljšanje u oštrini vida i kontrastnoj osetljivosti u vektoru tretiranog desnog oka (crvena traka) u odnosu na kontrolu levog oka (plava traka). Odgovori su bili skoro ekvivalentni kontrolnim miševima divljeg tipa (297 i 298) i značajno poboljšani u odnosu na netretirane GC1<-/->miševe (299). Stoga je zaključeno da GRK1 vektor takođe postiže funkcionalnu i bihevioralnu obnovu čepićima posredovanog vida u ovom modelu LCA1.

PRIMER 5 – SPECIFIČNO CILJANJE ČEPIĆA OD WTGC1 UNAPREĐUJE IZBAVLJANJE

[0177] Gore predstavljeni podaci jasno pokazuju da se funkcija čepića i ponašanje posredovano čepićem mogu izbaviti sa štapićem/čepićem ograničenim GRK1 promoterom. Pošto ljudski LCA1 pokazuje i deficite štapića i čepića (za razliku od GC1-/- miša koji pokazuje primarno deficite čepića), eksprimiranje se ne mora dalje ograničavati kako bi se dobila čista specifičnost čepića. Međutim, postoji jedan konačni fenotip čepića u mišjem modelu koji je važan za proučavanje: u prilagođen na tamnim uslovima, membrana se ne kreće normalno od spoljašnjih segmenata čepića u unutrašnje segmente, aksone i sinaptičke krajeve kao u retini retkog tipa. Stoga su sprovedena ispitivanja kako bi se procenilo da li je i ovaj biološki fenotip ćelije korigovan kod GC1<-/->očima tretiranim vektorom. U prikazanim rezultatima, GC1-/- miš je tretiran na jednom oku sa GRK1 vektorom, zatim je 7 nedelja nakon davanja injekcije miš bio prilagođen na tamu. Tretirane (donji panel) i kontrolne (gornji panel) retine su zatim analizirane za lokalizaciju arestina čepića imunohistohemijom. U netretiranoj GC1<-/->retini (gornji panel), arestin čepića ostao je uglavnom u spoljnim segmentima čepića (OS) i sinaptičkom sloju (SL). Nasuprot tome, u kontralateralno tretiranoj retini (donji panel) značajni fragment (-50%) je premeštena u unutrašnje segmente i sinaptičke krajeve. Zaključeno je, dakle, da je vektorskim tretmanom obnovljena i ispravna translokacija arestina čepića.

PRIMER 6 - DUGOROČNA TERAPIJA LCA1 KORIŠĆENJEM RAAV-VEKTOROVANIH GENETSKIH KONSTRUKATA

[0178] Prethodni primeri su pokazali da je subretinalna injekcija rAAV vektora koji sadrži mišju GC1 cDNK (vođenu bilo fotoreceptor-specifičnom ljudskom rodopsin kinazom [hGRK1] ili sveprisutnim [smCBA] promoterom) bila sposobna da obnove funkciju i vizuelno ponašanje posredovano čepićima i očuvanje fotoreceptora čepića kod GC1KO miševa tokom najmanje tri meseca.

[0179] U ovom primeru, pronalazači su procenili da li je dugoročna terapija takođe moguća u glodarskom modelu LCA1. Pored toga, pronalazači su ispitali da li bi isporuka GC1 fotoreceptorima GC1/GC2 dvostrukog knockout miša (GCdko), model koji pokazuje gubitak strukture i funkcije štapića i čepića i fenotipski sličan ljudskom LCA1, davala terapiju ovim ćelijama.

POSTUPCI

[0180] Subretinalne injekcije AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 ili visoko efikasnog mutantnog kapsidnog tirozina AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 izvedene su u jednom oku GC1KO ili GCdko miševa između postnatalnog dana 14 (P14) i P25.

Fotoreceptorska funkcija štapića i čepića analizirana je elektroretinografski. Lokalizacija terapeutskog GC1 eksprimiranja i opseg konzerviranja fotoreceptora čepića određena je imunohistohemijom. Studije biodistribucije su korišćene za procenu prisustva vektorskih genoma u optičkim živcima i mozgovima tretiranih životinja.

REZULTATI

[0181] Funkcija fotoreceptora čepića obnovljena je kod GC1KO miševa tretiranih sa svim vektorima, gde je AAV8(733) najefikasniji. Odgovori su bili stabilni najmanje 10 meseci nakon tretmana. Terapeutski GC1 je pronađen u spoljašnjim segmentima fotoreceptora. Do 10 meseci nakon davanja injekcije, AAV5 i AAV8(733) genomi vektora su detektovani samo u optičkim nervima tretiranih očiju GC1KO miševa. AAV8(733)-vektorizovana funkcija mGC1 obnovljena je i za štapiće i čepiće u tretiranim GCdko miševima.

ZAKLJUČAK

[0182] Dugoročna terapija se može postići u modelu GC1 nedostatka kod sisara, GC1KO mišu, koristeći ovde opisane vektorske konstrukcije rAAV. Važno je da se terapija može postići i kod GCdko miša koji oponaša LCA1 štapić/čepić fenotip. Ovi rezultati pružaju dokaze za upotrebu vektora genske terapije zasnovanog na rAAV za tretiranje distrofija retine, i posebno LCA1.

PRIMER 7 - DUGOROČNO OČUVANJE FOTORECEPTORA ČEPIĆA I OBNAVLJANJA FUNKCIJE ČEPIĆA PREMA GENSKOJ TERAPIJI KOD GC1KO MIŠEVA

[0183] U prethodnim primerima, pokazano je da su subretinalni AAV5 vektori koji sadrže mišju GC1 cDNK vođeni bilo fotoreceptor-specifičnim (hGRK1) ili sveprisutnim (smCBA) promoterom bili sposobni da obnove funkciju i vizuelno ponašanje i očuvanje fotoreceptora čepića kod GC1KO miševa tokom tri meseca. U ovom primeru, dugotrajna terapija se procenjuje korišćenjem istog mišjeg modela. AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 ili visoko efikasni mutant AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 kapsidni tirozin su dostavljeni subretinalno GC1KO miševima između postnatalnog dana 14 (P14) i postnatalnog dana (P25). Funkcija retine analizirana je elektroretinogramima (ERG). Lokalizacija AAV-posredovanog GC1 eksprimiranja i preživljavanja čepića analizirana je imunohistohemijom, i širenje vektora genoma izvan retine je kvantifikovano pomoću PCR optičkog nerva i moždanog tkiva. Funkcija čepića je vraćena sa svim testiranim vektorima, i AAV8(Y733F) je najefikasniji. AAV-posredovano eksprimiranje GC1 pronađeno je isključivo u fotoreceptorima. Do 10 meseci nakon davanja injekcije, AAV genomi su otkriveni samo u optičkom nervu tretiranih očiju. Ovi rezultati po prvi put pokazuju da je dugoročna terapija moguća u sisarskom modelu GC 1 nedostatka.

[0184] Retinalna guanilatna ciklaza-1 (GC1) kodirana sa Gucy2d služi ključnu funkciju u fototransdukciji kičmenjaka (Pugh i dr., 1997). Posle svetlosnog stimulusa, ciklični GMP (cGMP) drugog mesindžera se brzo hidrolizuje fosfodiesterazom (PDE6) unutar ćelija fotoreceptora, što dovodi do zatvaranja cGMP-omeđenih katjonskih kanala i hiperpolarizacije ćelije. Kada je citoplazmatski [Ca<2+>] pada ispod 50 nM, GC1 se aktivira malim Ca<2+>vezujućim proteinima, GCAP (guanilatna ciklaza koja aktivira proteine). GC1 sintetiše cGMP koji vezuje i ponovo otvara cGMP-omeđene kanale, vraćajući fotoreceptor u „tamno“, depolarizovano stanje (Pugh i dr., 1997; Polans i dr., 1996; Vensel, 2008; Lamb i Pugh, 2006; Arshavsky et al, 2002). Tako GC1 igra vitalnu ulogu u ciklusima svetlo-tamno stanje, i oporavku, učvršćujući, putem cGMP, petlju povratne veze koja povezuje intracelularne nivoe kalcijuma i stanje polarizacije fotoreceptora.

[0185] GC 1 se eksprimira u spoljašnjim segmentima fotoreceptora štapića i čepića ljudske, majmunske i mišje retine (Dizhoor i dr., 1994; Liu i dr., 1994; Haire i dr., 2006). Kao i druge membranske guanilatne ciklaze, on sadrži N'-terminalnu signalnu sekvencu, ekstracelularni domen (ECD), jedan transmembranski domen, kinazni homologni domen (KHD), dimerizacioni domen (DD) i C'-terminalni katalitički domen (CCD), i prisutan je verovatno kao homomerni dimer (Yang i Garbers, 1997). Mutacije u Gucy2d povezane su sa recesivnom Leberovom urođenom amaurozom-1 (LCA1), kao i sa dominantnim i recesivnim oblicima distrofije čepića-štapića, CORD6 i CORD (Perrault et al, 1996; Perrault i dr., 2000; Kelsell i dr., 1998; Perrault i dr., 1998; Gregory-Evans i dr., 2000; Weigell-Weber i dr., 2000; Ugur i dr., 2010). LCA1 je ozbiljno, sa ranim početkom, autosomno recesivno slepilo koje karakteriše ugašeni elektroretinogram (ERG) koji prethodi degeneraciji fotoreceptora (Perrault i dr., 1999; Chung i Traboulsi, 2009). CORD6 je dominantan poremećaj koji karakteriše progresivna degeneracijom fotoreceptora koja počinje sa čepićima koji uzrokuju rani gubitak vidne oštrine i vida u boji, praćeni degeneracijom štapića što dovodi do progresivnog noćnog slepila i gubitka perifernog vidnog polja (Kelsell i dr., 1998; Perrault i dr., 1998). CORD6 mutacije su ograničene na domen dimerizacije (DD) i generalno izazivaju povećanje GCAP-posredovane aktivacije GC1 (Paine i dr., 2001; Downes i dr., 2001; Wilkie i dr., 2000). Nedavno pronađena recesivna mutacija koja izaziva CORD se nalazi u katalitičkom domenu (CD) od GC1 i smatra se da smanjuje ukupnu funkciju enzima (Ugur i dr., 2010). Mutacije koje izazivaju LCA1 se distribuiraju kroz ECD, KHD, DD i CCD domene GC1 (Karan i dr., 2010). Ove mutacije menjaju strukturu i stabilnost enzima, mogu uticati na retrogradni transport drugih proteina povezanih sa perifernim membranama, i često su nulti.

[0186] GC1KO miš nosi nultu mutaciju Gucy2e, mišji homolog od Gucy2d. Kao i LCA1 pacijenti, funkcija gubitka čepića u ovom modelu prethodi degeneraciji čepića (Timmers i dr., 2001). Štapići zadržavaju 30-50% svoje funkcije i ne degenerišu zbog prisustva GC2, druge funkcionalne guanilatne ciklaze u murinim fotoreceptorima (Yang i Garbers, 1997; Jacobson i dr., 2006; Timmers i dr., 2001; Cideciyan i dr., 2008; Song i dr., 2002). U ranijim primerima, pokazano je da subretinalna injekcija serotip 5 adeno-povezanih virusnih (AAV) vektora koji sadrži mišju GC1 cDNK, vođenu bilo fotoreceptor-specifičnom ljudskom rodopsin kinazom (hGRK1) ili sveprisutnim (smCBA) promoterom može da vrati čepićima posredovane funkcije i vizuelno ponašanje, i da čuvanje fotoreceptore čepića kod GC1KO miševa tokom tri meseca. U ovoj studiji, AAV-posredovana terapija za zamenu gena je procenjena u pogledu njene sposobnosti da pruži terapiju kod GC1KO miševa tokom dužeg perioda. AAV5-hGRK1-mGC1 i AAV5-smCBA-mGCl i visoko efikasni mutantni vektor kapsidnog tirozina AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 isporučeni su subretinalno GC1KO miševima između postnatalnog dana 14 (P14) i postnatalnog dana 25 (P25). Ovi rezultati prvi put pokazuju da se dugoročna terapija može postići u sisarskom modelu GC1 nedostatka. Biološka distribucija vektorskog genoma je takođe procenjena za vektore bazirane na AAV5 i AAV8(733). Ovi nalazi imaju direktan uticaj na razvoj AAV-baziranog kliničkog ispitivanja genske terapije za LCA1 (i eventualno distrofije kupastih štapića), i pomažu u razvoju standardizovanog vektorskog dizajna za širok raspon recesivnih retinalnih degeneracija posredovanih defektima u gena povezanim sa fotoreceptorima.

MATERIJALI I POSTUPCI

Eksperimentalne životinje:

[0187] GC1KO i kogenetske /+ kontrole izvedene iz heterozigotnih parenja GC1 /- miševa koji su pruženi od strane Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) uzgajane su i održavane u pronalazačevom postrojenju za zbrinjavanje životinja pod 12 sati/12 sati ciklusima svetla/tame. Hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Sve studije su sprovedene u skladu sa ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research i NIH regulativom.

Izgradnja AAV vektora:

[0188] Vektorski plazmidi Serotip 5 adeno-povezanog virusa (AAV5) koji sadrže ili sveprisutni (smCBA) ili fotoreceptor specifični ljudski rodopsin kinaza (hGRK1) promoter koji pokreće mišji GC1 (mGC1) cDNK su generisani prema prethodno opisanim postupcima (Boye i dr., 2010). Prijavljena je mutageneza površinski izloženih tirozinskih ostataka na AAV2 kapsidu (Zhong i dr., 2008). Slični postupci su korišćeni za generisanje AAV8(Y733F) kapsidnog mutanta opisanog ovde. Svi vektori su upakovani, prečišćeni i titrirani prema prethodno opisanim postupcima (Zolotukhin i dr., 2002; Jacobson i dr., 2006). Dobijeni titri za AAV5-smCBA-mGC1, AAV5-hGRK1-mGC1 i AAV8(Y733F)-hGRK1mGC1 su 4,69 × 10<12>genomi vektora po ml (vg/mL), 4,12 × 10<13>vg/mL i 1,08 × 10<13>vg/mL.

Subretinalne injekcije:

[0189] Jedan µL AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 × 10<9>vektorskih genoma), AAV5-hGRK1-mGC1 (4,12 × 10<10>vektorskih genoma) ili AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (1,08 × 10<10>vektorskih genoma) su dati kao injekcije subretinalno u jedno oko GC1KO miševa između postnatalnog dana 14 (P14) i postnatalnog dana 25 (P25). Kontralateralno kontrolno oko ostalo je bez injekcija. Subretinalne injekcije su izvedene kao što je prethodno opisano (Timmers i dr., 2001). Dalja analiza je sprovedena samo na životinjama koje su primile uporedive, uspešne injekcije (> 60% odvojenost retine uz minimalne komplikacije). Približno 75% svih grupa je dobilo „uspešne“ injekcije. Dobro je utvrđeno da područje vektorske transdukcije odgovara barem području odvajanja retine (Timmers i dr., 2001; Cideciyan i dr., 2008).

Elektroretinografska analiza:

[0190] ERG tretirane GC1KO i starosno usklađene, kongenične (+/+) kontrole su zabeležene pomoću PC-bazirane jedinice za kontrolu i snimanje (Toennies Multiliner Vision;

Jaeger/Toennies, Höchberg, Germany) prema postupcima koje su prethodno opisani sa malim modifikacijama (Haire i dr., 2006; Boye i dr., 2010). Snimci AAV5-smCBA-mGC1-tretiranih GC1KO miševa (n=10), AAV5-hGRK1-mGC1-tretiranih GC1KO miševa (n=6), AAV8(Y733F)-tretiranih GC1KO miševa (n=6) i kongeničnih (+/+) kontrola (n=8) su počeli na različite datume i stoga je svaka podgrupa miševa praćena za malo različite dužine vremena. ERG tretiranih GC1KO miševa je zabeležen 4 nedelje nakon injekcije i svakog meseca nakon toga do 1 godine nakon davanja injekcije (AAV5-tretirani miševi) ili 9 meseci nakon davanja injekcije (AAV8 [Y733F]-miševi). Starosno usklađeni, kongenični (+/+) kontrolni miševi su bile praćeni tokom 8 meseci. Miševi su uklonjeni iz studije u različitim vremenskim tačkama tokom eksperimenta za različite post-mortem studije (studije biodistribucije, retinalna imunohistokemijska analiza, RT-PCR u realnom vremenu tkiva retine) ili neočekivane bolesti/smrti. ERG podaci su predstavljeni samo za grupe životinja sa n> 3. Stoga, ova studija poredi nalaze na 9 meseci nakon injekcije za AAV5-tretirane miševe i 6 meseci nakon injekcije za AAV8(Y733F)-tretirane miševe. Tretirani miševi su nastavili da pokazuju ERG odgovore nakon ovih vremenskih tačaka, ali su veličine uzoraka bile dovoljno redukovane tako da statistička analiza više nije bila praktična. Prikazani su reprezentativni čepićima posredovani tragovi od pojedinačnih miševa 1 godinu nakon tretmana AAV5 vektorima i 9 meseci nakon tretmana sa AAV8(Y733F). Skotopski (štapić-posredovani) i fotopični (čepićem posredovani) snimci su dobijeni korišćenjem prethodno opisanih parametara snimanja (Boye i dr., 2010). B-talasne amplitude su definisane kao razlika između a-talasnih korita i sledećeg pozitivnog vrha svakog talasnog oblika. Štapićemposredovani ERG odgovori kod netretiranih GC1KO miševa variraju od životinje do životinje (Yang i dr., 1999), dakle, velike standardne devijacije su uočene kada su uprosečene amplitude skotopskih a i b talasa različitih životinja. ERG podaci su prikazani u razmeri (prosek intra-individualnih, tretiranih i netretiranih amplituda a- i b-talasa štapića). Kao takva, bilo koja vrednost iznad 1 ukazuje da je tretman AAV-mGC1 poboljšao odgovor štapića. Odnosi su izračunati pomoću amplituda generisanih sa 1 cds/m<2>stimulusom.

Maksimalne amplitude b-talasa posredovane sa čepićem u očima kojima su date i kojima nisu date injekcije svih tretiranih GC1KO miševa i kongeničnih (+/+) kontrolnih miševa generisanih na 12 cds/m<2>su uprosečene u svakoj vremenskoj tački i korišćene za generisanje standardnih grešaka. Svi podaci su uvezeni u Sigma Plot za konačnu grafičku prezentaciju. Standardni t-Test je korišćen za izračunavanje P-vrednosti između skupova podataka.

Značajna razlika je definisana kao a P-vrednost <0,05.

Biodistribucija:

[0191] Širenje vektorske DNK u tkivima tretiranih GC1KO miševa je određeno u uzorcima sakupljenim pri žrtvovanju prema prethodno opisanim postupcima sa manjim modifikacijama (Jacobson i dr., 2006). Miševi tretirani vektorom su žrtvovani u sledećim vremenskim tačkama: AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-tretirani miševi (4 meseca nakon davanja injekcije: n=1; 7 meseci nakon davanja injekcije: n=1), AAV5-smCBA-mGC1 (7 meseci nakon davanja injekcije: n=1; 10 meseci nakon davanja injekcije: n=5), AAV5-hGRK1-mGC1 (7 meseci nakon davanja injekcije: n=1; 10 meseci nakon davanja injekcije: n=1). Kontrolna tkiva od GC1KO miševa koji su starosno usklađeni na 7 meseci nakon davanja injekcije ili 10 nakon davanja injekcije, takođe su procenjivani zajedno sa eksperimentalnim životinjama. Posle žrtvovanja, korišćene su različite nove pincete kako bi se očistile tretirane i netretirane oči koje su zadržale približno 0,5 cm proksimalnog optičkog živca. Različite nove makaze za disekciju su zatim korišćene za odvajanje optičkih živaca od očne jabučice nakon čega su se smrznute u tečnom azotu i prenesene na -80°C gde su ostale do vremena ekstrakcije DNK. Očne jabučice su uronjene u 4% paraformaldehid (PAF) i tretirane za imunohistokemiju (pogledati u nastavku).

1

[0192] Mozgovi su uklonjeni i za izolaciju vizuelno specifičnih regiona korišćena je matrica koronalnog mišjeg mozga od nerđajućeg čelika (Harvard Apparatus, Holliston, MA). Desno i levo bočno genikulirajuće jezgro sakupljeno je od jednog miša po tretiranoj grupi (u poslednjoj vremenskoj tački), formalinom fiksirano i sačuvan za slučaju da vektori genoma izvađeni iz mozga i imunohistohemija budu neophodni. Odvojeni delovi desnog i levog mozga koji sadrže vizuelne puteve su sakupljeni, zamrznuti u tečnom azotu i prebačeni na -80°C gde su ostali do vremena ekstrakcije DNK. Preduzete su mere opreza kako bi se izbegla unakrsna kontaminacija pri prikupljanju tkiva. Genomska DNK je ekstrakovana iz tkiva prema protokolu proizvođača (Qiagen DNeasy komplet za tkivo). Koncentracije dobijene DNK su određene korišćenjem Eppendorf Biophotomotera (Model 6131; Eppendorf, Hamburg, Germany). Kvantitativni PCR su izvedeni prema prethodno opisanim postupcima sa malim modifikacijama (Jacobson i dr., 2006; Song i dr., 2002; Poirier i dr., 2004).

[0193] Parovi prajmera su dizajnirani za SV40 poli-adenilacioni signal (SV40 polyA) region u svakom vektoru genoma i standardne krive su utvrđene korišćenjem poznatih koncentracija plazmidne DNK koja sadrži istu SV40 polyA ciljanu sekvencu. Uzorci DNK su analizirani u triplikatu. Kako bi se isključili lažno negativni rezultati zbog inhibicije PCR-a, treći replikat je 'zašiljen' sa plazmidnom DNK koja sadrži metu (SV40 polyA) u odnosu od 100 kopija/µg genomske DNK. Ako je otkriveno> 40 kopija DNK sa 'vrhom', uzorak je smatran prihvatljivim za izveštavanje kopija vektora gena. U nekim slučajevima uzorci koji nisu imali 'vrh' reanalizirani su upotrebom manje od 1 µg genomske DNK u PCR reakcijama, čime se razblažuju PCR inhibitori koji se sjedinjuju sa DNK u ekstrakovanom tkivu. Broj kopija je smanjen proporcionalno kako bi se održao odnos od 100 kopija/µg DN. Kriterijumi za izveštavanje kopija vektora genoma uspostavljeni su prema prethodno opisanim postupcima (Jacobson i dr., 2006). Ukratko, više od 100 kopija genoma/µg smatrano je pozitivnim i prijavljeni broj merenja kopije/µg. Manje od 100 kopija/µg se smatralo negativnim.

Priprema tkiva, imunohistohemija i mikroskopija:

[0194] Pri žrtvovanju, istovremeno sa studijama biodistribucije sprovedenim 7 meseci nakon [AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1] i 10 meseci nakon (AAV5-smCBA-mGC1 i AAV5-hGRK1-mGC1) injekcije, limbusi tretiranih GC1KO miševa, starosno usklađenih netretiranih GC1KO miševa, kao i kongeničnih starosno usklađenih GC1+/+ miševa, obeleženi su vrućom iglom u položaju na gore, što olakšava orijentaciju. Netretirane GC1KO i GC1+/+ kontrole su bile starosno usklađene sa AAV8(Y733F)-tretiranim miševima (8 meseci starosti

2

u vreme žrtvovanja). Oči označene za krioseciranje su tretirane i imunološki obojene prema prethodno opisanim postupcima (Haire i dr., 2006). Ukratko, 10 µm rezinalne sekcije su inkubirane sa antitelima usmerenim na GC1 (zečji poliklonski 1:200, sc-50512 Santa Cruz BioTechnology, USA) ili mišji arestin čepića (zečji poliklonski „LUMIj“, 1:1000, pružen od strane Dr. Cheryl Craft, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA). Posle primarne inkubacije, primenjena su IgG sekundarna antitela Alexa-488 ili Alexa-594, respektivno, 1 sat na sobnoj temperaturi (1:500 u IX PBS). Sekcije su kontra-obojene sa 4',6'-diamino-2-fenil-indolom (DAPI) tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. 11 meseci nakon davanja injekcije, jedan GC1KO miš koji je primio tretman samo sa AAV5-smCBA-mGC1 žrtvovan je, i celokupni retinalni ožiljci iz tretiranih i netretiranih očiju tretirani su prema prethodno opisanim postupcima (Pang i dr., 2010). Ukratko, celokupni nosači su obojeni sa LUMIj (1:1000) praćeno IgG sekundarnim Alexa-594 (1: 500 u IX PBS) i pozicionirani na slajdovima sa superiornim (dorzalnim) delom retine orijentisanim na gore. Sekcije retine su analizirane konfokalnom mikroskopijom (Leica TCS SP2 AOBS Spectral Confocal Microscope opremljen sa LCS Version 2,61, Build 1537 softverom). Slike su snimljene sa identičnim postavkama ekspozicije pri 20X uvećanju. Celokupni retinalni nosači analizirani su sa fluorescentnim mikroskopom širokog polja (Zeiss Axioplan 2) opremljenim QImaging Retiga 4000R kamerom i QImaging QCapture Pro softverom. Kvadranti svakog celog nosača su snimljeni na 10X pod identičnim postavkama ekspozicije i zatim spojeni u Adobe Fotošopu.

Imunobloting:

[0195] Sedam meseci nakon injekcije, jedan miš kom je data injekcija sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 i starosno usklađeni, kongenični GC1+/+ (kontrolni) miš su žrtvovani, njihove oči su obojene i stavljene u IX PBS. Retine su odmah secirane i tretirane na sledeći način. Pojedinačne retine su rastvorene u PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM Na2HPO4) sa 1% Triton X-100 i kompletnim inhibitorom proteaze (Roche) tokom 1 sata na 4°C, nakon čega sledi centrifugiranje na 14000 o/min. Koncentracija proteina u supernatantu je određena pomoću BCA (Pierce) i 15 µg svakog uzorka je odvojeno na 12% poliakrilamidnom gelu (Bio-Rad) i prebačeno na Immobilon-FL membranu u trajanju od 1 časa u transfer puferu (25 mM Tris, 192 mM glicin) koji sadrži 15% metanola. Blotovi su tretirani sa blokirajućim puferom (Li-Cor) i obeleženi tokom 1 sata sa mišjim monoklonskim antitelom koje prepoznaje GC1 (IS4, 1:3000, pružen od strane Dr. Kris Palcweski, Case Western University, USA.) i zečjim poliklonskim antitelima podignutim protiv GCAP1 (pAb UW14, 1: 25,000, koja su pružena od strane Dr. Wolfgang Baehr, University of Utah) i β-aktinom (1: 5000, Abcam). Sekundarna antitela (kozji anti-mišji Ig konjugovana sa CW800 i kozji anti-zečji konjugat sa IR680) su primenjeni tokom 1 sata i mrlje su prikazane Odyssey Infrared Imaging System (Licor, Lincoln, NE, USA).

Kvantifikacija mRNK pomoću rtPCR, oporavak genoma retine i IHC optičkog nerva [0196] Pojedinačne tretirane oči sa optičkim živcem su sakupljene od GC1KO miševa 1 godinu nakon tretmana sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 ili AAV5-smCBA-mGC1, i starosno usklađenih, netretiranih GC1+/+ miševa. Retine su odmah razdvojene od oka i zamrznute u tečnom azotu. Optički nervi su odvojeni od očiju, fiksirani u 4% paraformaldehidu preko noći na 4°C, potopljeni u 30% saharoze tokom 2 sata na 4°C, i zatim brzo smrznute u jedinjenju kriostata (Tissue Tek® OCT 4583; Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA, USA) u kadi sa suvim ledom/etanolom. Optički nervi su presečeni na 10 µm i obojeni prema prethodno opisanim postupcima (Boye i dr., 2010). Retine su homogenizovane u 350 mL pufera RLT (RNeasy® Protect Mini Kit, Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA) plus BME tokom 45 sekundi. Uzorci su centrifugirani i lizat je podeljen na pola (jedna polovina određena za oporavak genoma, i druga polovina za ekstrakciju RNK) (Traint i Whitehead, 2009). Oporavak genoma je izveden kao što je gore opisano. Ekstrakcija RNK je izvedena sa RNeasy® Protect Mini Kit (Qiagen, Inc.). RNK je reverzno transkribovana (iScript® komplet za sintezu cDNK, Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA) i korišćena u realnom vremenu PCR (iQ SIBR® Green Supermix i MyiQ PCR detekcioni sistem u realnom vremenu povezan sa iCycler® termalnim ciklerom, Biorad Laboratories) za merenje sledećih mRNK specifičnih za retine: guanilatna ciklaza-1 (GC1), guanilatna ciklaza koja aktivira protein-1 (GCAP1), kupasti transducin α (GNAT2), štapić cGMP-specifične 3',5' ciklične fosfodiesteraze podjedinice alfa (PDE6a) i gen za održavanje, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH).

[0197] Parovi parjmera za GCAP1, GNAT2, PDEa i GAPDH su identični onima koje koristi Baehr i dr. (2007). Prajmeri za mišji GC1 (prednji prajmer: 5'-GACCCTTCCTGCTGGTTCGATCCA-3' [SEQ ID NO: 16], obrnuti prajmer: 5"-CTGCATGTGTAGCAGCCTGTGCCTC-3' [SEQ ID NO: 17]) su dizajnirani za bočni ekson 5, mesto poremećaja gena kod GC1KO miševa (Yang i dr., 1999) i generišu amplikon od 151 bp. PCR je proizveo amplikone odgovarajuće veličine kod GC1+/+ i AAV-mGC1 tretiranim GC1KO uzorcima retine, ali ne u netretiranoj GC1KO retini kao što se očekivalo. Identitet

4

amplikona je verifikovan restrikcionom digestijom sa StuI (NEB) koji se cepa unutar ciljane sekvence kako bi dao fragmente od 56 bps i 95 bps. rtPCR sa GC1 i GAPDH prajmerima na razblaženim serijama obrnuto transkribovanih DNK (iz GC1+/+ i AAV-mGC1-tretiranih GC1KOretina uzoraka) rezultovao je sličnim nagibima, što ukazuje na pogodnost GC1 prajmera za kvantifikovanje i endogene i vektorom posredovane GC1 poruke (SLIKE 20A i 20B).

[0198] Rezultati su prosek od 3 ponovljene reakcije i izračunati su korišćenjem 2<-ΔΔC>τ postupka (Livak i Schmittgen, 2001) sa GAPDH signalom koji se koristi za normalizaciju uzoraka i GC1+/+ uzorak koji služi kao kalibrator. Standardne devijacije su izračunate iz 3 ponovljene reakcije izvršene za svaki uzorak. Podaci su predstavljeni kao promena u nivou mRNK u odnosu na GC1+/+ uzorak.

REZULTATI

Dugoročno GC1 eksprimiranje specifično za fotoreceptore:

[0199] Imunobojenje sa antitelom usmerenim na GC1 otkrilo je da AAV-vektorizovano eksprimiranje terapijskog proteina ostaje isključivo u fotoreceptorima tretiranih GC1KO miševa tokom značajnog dela životnog veka životinje; AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 najmanje 7 meseci, AAV5-smCBA-mGC1 najmanje 10 meseci, i AAV5-hGRK1-mGC1 najmanje 10 meseci (SLIKA 21A i SLIKA 21B). Eksprimiranje GC1 bilo je ograničena na spoljne segmente štapića i čepića tretiranih sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 vektorom, dok je pronađen u oba spoljna segmenta, i ređe u telima fotoreceptorskih ćelija očiju tretiranih sa AAV5-smCBA-mGC1, što je rezultat skladu sa jačinom ovog sveprisutnog promotera u odnosu na fotoreceptor-specifičan, hGRK1 (Beltran i dr., 2010). Uočena su dva primera oštećenja retine. Prvi je blao GC1KOretina tretirana sa AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 × 10<9>ukupnih isporučenih genoma vektora). Spoljašnji nuklearni sloj (ONL) je blago razređen u odnosu na onaj koji je primećen kod GC1KO ili GC1+/+ kontrolnih retina (oba 8 meseca starosti). Ovo može biti rezultat prekomernog eksprimiranja GC1 posredovanog smCBA promoterom (Beltran i dr., 2010).

[0200] Drugo je uključivala GC1KO retinu tretiranu sa koncentrisanijim AAV5-hGRK1-mGC1 i kao ranije pokazalo je GC1 eksprimiranje specifično za fotoreceptore, ali sa dubokim stanjivanjem spoljnog nuklearnog sloja. Treba napomenuti da je ovaj vektor bio najviše koncentrisan od tri ispitivana u ovoj studiji (4,12 × 10<10>) isporučeni genomi vektora nasuprot 4,69 × 10<9>i 1,08 × 10<10>, za AAV5-smCBA-mGC1 prep i AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, respektivno), i ponovo naglašava da prekomerno eksprimiranje GC1 može biti uzrok uočenog stanjivanja. U najmanju ruku, ovi rezultati sugerišu da toksičnost koja ograničava dozu može biti vidljiva kod miša. GC1 eksprimiranje nije bilo prisutno u netretiranoj GC1KO retini (SLIKA 21A i SLIKA 21B).

Preživljavanje dugoročnih fotoreceptora sa čepićem postiže se pomoću AAV-vektorizovanog GC1

[0201] Fotoreceptori čepića u tretiranim i netretiranim GC1KO miševima, kao i GC1+/+ kontrole su identifikovani bojanjem za mišji arestin čepića. Analizirani su preseci retine od miševa žrtvovanih za konačnu studiju biodistribucije i retinalnog celog nosača iz GC1KO miševa 11 meseci posle tretmana sa AAV5-smCBA-mGC1 (samo desno oko). Ovde je pokazano da su gustine fotoreceptora čepića značajno smanjene u netretiranim GC1KO retinama do 10 meseci starosti i potvrđuju prethodne izveštaje da su čepići izgubljeni na topografski specifičan način u ovom mišjem modelu (Coleman i dr., 2004) (SLIKA 21A i SLIKA 21B). Celokupna analiza je pokazala da 11-godišnja netretirana retina pokazuje prosečnu gustinu čepića, sa rezidualnim čepićima koji se nalaze isključivo u superiornim retinalnim regionima, dok partnerska, P14-tretirana retina, zadržava mnogo veću gustinu čepića, sa izuzetkom male mrlje temporalne retina koja verovatno nije bila izložena vektoru tokom subretinalne injekcije i stoga nije sadržala transgeni proizvod. U poređenju sa onima koja je uočena u retinama tretiranim sa AAV5, gustine i struktura čepića u presecima retine kod miševa tretiranih sa AAV8(Y733F) su se pokazali kvalitativno najsličnijim onima koji se vide u normalnoj, GC1+/+ retini (SLIKA 21A i SLIKA 21B). Iako su njihove gustine povećane u odnosu na netretirane kontrole, čepići u retinama tretiranim sa AAV5 izgledali su blago dezorganizovani, što je verovatno rezultat malog ukupnog poremećaja/stanjivanja spoljnih nuklearnih slojeva kod ovih miševa.

Dugoročna obnova funkcije fotoreceptora (ERG) u AAC tretiranim GC1KO miševima [0202] U prethodnim primerima, funkcija posredovana čepićem mogla bi se vratiti kod GC1KO miševa 3 meseca nakon P14 isporuke AAV5-smCBA-mGC1 ili AAV5-hGRK1-mGC1 (Boye i dr., 2010). Prosečne amplitude fotopičnih b-talasa kod tretiranih miševa su delimično obnovljene 4 nedelje nakon davanja injekcije i ostale su stabilne tokom te studije. U ovom primeru, čepićima posredovani odgovori do 9 meseci posle tretmana su poređeni kod GC1KO miševima kojima su date injekcije između P14 i P25 sa identičnim vektorima koji su korišćeni u prethodnoj studiji. Svi preostali miševi tretirani sa AAV5-mGC1 vektorom su nastavili da pokazuju merljivu funkciju posredovanu čepićima od najmanje 1 godine nakon tretmana. Reprezentativni tragovi izazvani na 12 cds/m2 od pojedinačnog miša tretiranog sa AAV5-hGRK1-mGC1 su prikazani na SLICI 22A i SLICI 22B. Reakcije na čepiću bile su stabilne tokom vremena i bile su značajno veće od odgovora generisanih od netretiranih, kontralateralnih kontrola (p < 0,001), što sugeriše da je moguće obnoviti funkciju čepića tokom životnog veka životinje (SLIKA 22A). U skladu sa prethodnim primerom, nivo restauracije postignut nakon isporuke vektora koji sadrži specifičan promoter (hGRK1) nije bio značajno različit od onog koji je postignut sa vektorom koji sadrži sveprisutni promoter (smCBA) u bilo kojoj vremenskoj tački posle tretmana. Reprezentativni tragovi otkrivaju da je kinetika obnovljenog kupastog ERG izgledala normalna tokom čitavog trajanja studije (SLIKA 22B). Pored toga, pokazano je u ovom primeru da je funkcija fotoreceptora čepića stabilno obnovljena najmanje 6 meseci posle injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1.

[0203] Amplitude kupastog b-talasa kod GC1KO miševa kojima je data injekcija sa ovim jakim, brzo-delujućim AAV8 tirozinskim kapsidnim mutantom, bile su veće od onih koje su viđene kod GC1KO miševima kojima su date injekcije bilo kojim AAV5 vektorom u svakoj procenjenoj vremenskoj tački. Na 6 meseci nakon tretmana, poslednja vremenska tačka u kojoj su svi vektori mogli da se uporede paralelno, postojala je značajna razlika između amplituda b-talasa čepića kod AAV8(Y733)-hGRK1-mGC1 u odnosu na AAV5-hGRK1-mGC1-tretirane miševi (p = 0,033) i AAV (Y733F)-hGRK1-mGC1 u odnosu na miševe tretirane sa AAV5-smCBA-mGC1 (p = 0,025). Reprezentativni trag zabeležen 9 meseci nakon injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (n=1) bio je primetno manji od onog zabeleženog na 6 meseci nakon davanja injekcije.

[0204] Zbog varijabilnosti među miševima u odgovorima netretiranih GC1KO štapića (50-70% od WT do 5 meseci starosti (23), statističko poređenje prosečnih odgovora štapića u odnosu na netretirane oči su problematične. Međutim, unutar životinje, amplitude ERG štapića su skoro jednake između partnerskih očiju, stoga smo izračunali srednji odnos amplitude a-i b-talasa u mišjim štapićima za tretirane i netretirane oči i zatim prikazali ove odnose tokom vremena (SLIKA 23A i SLIKA 23B). AAV-posredovana restauracija funkcije štapića je prikazana odnosima sa vrednošću > 1,0. SLIKA 23A i SLIKA 23B pokazuju da, sa izuzetkom jedne vremenske tačke (4 meseca nakon tretmana), prosečni odnosi amplituda btalasa kod AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-tretiranih u odnosu na netretirane oči su bile > 1,0.

Odnosi AAV5 tretiranih u odnosu na netretirane oči su samo povremeno > 1,0. Slično, odnosi a-talasa su bili konzistentno viši kod miševa tretiranih sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, dok su oni često odbijani nakon tretmana bilo kojim AAV5 vektorom (SLIKA 23B). Ovi rezultati sugerišu da, iako su terapeutski efekti na štapiće suptilni, AAV8(Y733F) daje najjače funkcionalno poboljšanje posredovano štapićem kod GC1KO miševa (SLIKA 23B).

Reprezentativni štapićem posredovani skotopski ERG tragovi izazvani sa 1 cds/m<2>stimulansom su demonstrirani kod GC1KO miševa tretiranim sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (6 meseci posle tretmana), netretiranim kontralateralnim kontrolnim okom i starosno usklađenom GC1+/+ kontrolom. Poboljšanja AAV8(Y733F) posredovana u amplitudama ERG štapića su jasna u ovom primeru i ukazuju da pored amplitude pod-divljeg tipa, tretirana kinetika odgovora oka liči na on u viđenom kod GC1+/+ kontrole.

Biodistribucija vektora:

[0205] Ispitivanja biodistribucije su izvedena na GC1KO miševima tretiranim sa svakim vektorom kako bi se utvrdilo da li se AAV5 ili AAV8(Y733F)-isporučeni genomi vektora mogu detektovati u optičkim živcima i/ili mozgovima tretiranih miševa nakon perioda od nekoliko meseci. Miševi kojima su date injekcije sa AAV5 vektorom su procenjeni na 7 (n=2) i 10 (n=5) meseci nakon tretmana, i miševima kojima su date injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 su procenjeni na 4 (n=1) i 7 (n) = 1) meseci nakon tretmana. Pregledani su optički nervi iz očiju kojima su date i kojima nisu date injekcije, kao i delovi levog i desnog mozga koji sadrže vizuelne puteve. AAV5 vektori su ubrizgavani u desno oko GC1KO miševa. Shodno tome, genomi vektori su detektovani u desnom optičkom nervu AAV5-tretiranih miševa i 7 i 10 meseci nakon injekcije. Na 7 meseci nakon injekcije, genomi vektora su takođe detektovani u levom mozgu jednog miša kom je data injekcija sa AAV5-hGRK1-mGC1. Nijedan genom vektora nije detektovan iz desnog mozga te životinje.

Opservacija da su desni (date su im injekcije) optički živac i levi mozak pozitivni, anatomski je konzistentna, jer je leva hemisfera pretežno „povezana“ sa desnim okom.

[0206] Do 10 meseci nakon davanja injekcije, AAV5 isporučeni genomi vektora su još uvek detektovani u desnom (data mu je injekcija) optičkom nervu, ali su bili odsutni u obe moždane hemisfere. AAV8(Y733) vektor je dat kao injekcija u leve oči GC1KO miševa. U skladu sa tim, AAV8(Y733F)-isporučeni genomi vektora su detektovani u levim optičkim nervima i 4 i 7 meseci nakon injekcije. Ni u jednom trenutku genomi vektora nisu detektovani u bilo kojoj hemisferi mozga miša tretiranog sa AAV8(733). Veći prosečni broj vektorskih genoma je detektovan u optičkim nervima očiju kojima su date injekcije sa AAV5-GRK1-mGC1 u poređenju sa AAV5-smCBA-mGC1. Ovaj rezultat verovatno je suled većeg titra prvog (4,12 × 10<13>vg/mL) u poređenju sa kasnijim (4,69 × 10<12>vg/mL).

[0207] Dodatno, samo AAV5-hGRK1-mGC1-isporučeni genomi su otkriveni u moždanom tkivu tokom ove studije, drugo posmatranje verovatno usled relativno visokog titra ovog vektora. Uprkos činjenici da je titar AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 vektora koji je korišćen (1,08 × 10<13>vg/mL) bio je manji od AAV5-hGRK1-mGC1 vektora, detektovan je veći prosečni broj vektorskih genoma u optičkim nervima očiju AAV8(Y733F). Dok je poznato da je AAV5 neefikasan za transdukciju ganglijskih retinalnih ćelija miša (Stieger i dr., 2008), pokazano je da AAV8 prenosi ovaj tip ćelije (Jacobson i dr., 2006). Očekuje se izlaganje vektora ganglijskim ćelijama retine, jer špric prelazi unutrašnju retinu tokom subretinalne injekcije, i zato što je odnos mišića i ukupne veličine očiju visok. Veći broj vektorskih genoma detektovanih u optičkim nervima očiju tretiranih sa AAV8(Y733F) može biti posledica povećanog afiniteta AAV8(Y733F), u odnosu na AAV5, za retinalne ganglijske ćelije. Kao što se očekivalo, nijedan AAV vektorski genom nije izolovan iz bilo kog tkiva naivnih GC1KO kontrolnih miševa.

AAV-mGC1 tretman vraća nivoe divljeg tipa GC1 i GCAP1 tretiranoj GC1KO retini [0208] 7 meseci nakon injekcije sa AAV8(Y733F)-hGRKI-mGC1, tretirane i netretirane retine od jednog GC1KO miša kao i jednog GC1+/+ kontrolnog miša koji su starosno usklađeni su korišćene za ispitivanje nivoa GC1 i GCAP1 eksprimiranja proteina. Cilj ovog eksperimenta nije bio da se uporede nivoi GC1 preko tretiranih grupa, već da se uporede nivoi vektor-posredovanog eksprimiranja GC1 sa nivoima GC1 u divljem tipu životinje. Slično tome, procenili smo efekte AAV-isporučenog GC 1 na GCAP1 eksprimiranje. Kao što se očekivalo, GC 1 protein nije bio prisutan u netretiranom oku GC1KO miša. Nasuprot tome, nivoi GC1 kod AAV8(Y733F)-tretiranom oku su se približili onome što se vidi u normalnoj GC1+/+ kontroli (SLIKA 4). U skladu sa prethodnim izveštajima da je GCAP1 post-translaciono regulisan na dole kod GC1KO miševa, pokazali smo da je GCAP1 smanjen u netretiranoj GC1KO retini u odnosu na GC1+/+ kontrolu (39). Međutim, isporuka GC1 posredovana sa AAV8(Y733F) dovodi do regulacije u GCAP1 eksprimiranju u tretiranoj GC1KO retini miša. Nivoi eksprimiranja GCAP1 su takođe uporedivi sa onima koji se vide kod GC1+/+ kontrola.

[0209] Kod tretiranih GC1KO miševa, prisutan je GC1 mRNK i nivoi GNAT2 mRNK su povećani u odnosu na netretirane GC1KO miševe. Korišćenjem GC1 para prajmera koji prigušuje poremećaj gena neomicina koji se nalazi unutar eksona 5 GC1KO miša (Timmers i dr., 2001) bilo je moguće izmeriti GC1 mRNK i kod GC1+/+ i kod GC1KO miševa tretiranih vektorom. Zanimljivo je da je drugi GC1 prajmerski par ciljan na ekson 18 i 19 GC1, dosta nizvodno od poremećaja gena, proizveo PCR proizvod u netretiranom GC1KO uzorku miševa i prema tome, ti prajmeri nisu korišćeni. Jednu godinu nakon tretmana, nivoi GC1 mRNK u tretiranim retinama bili su približno sedam puta (tretirani AAV5) i 14-puta [AAV8 (IY733F)-tretirani] viši od onog koji su primećeni kod GC1+/+ kontrolnog miša (SLIKA 24A i SLIKA 24B). Koristeći tehniku oporavka nukleinske kiseline koja je omogućila homogenu podelu uzorka na 2 jednake polovine, jednu za ekstrakciju RNK i drugu za DNK (Pang i dr., 2011), mada je bilo moguće meriti nivoe mRNK i odrediti broj vektorskih genoma unutar istog uzorka. Otkriveno je da visoki nivoi GC1 mRNK u tretiranim retinama odgovaraju oporavku mnogih vektora genoma; 1,57 × 10<7>genomi vektora/µg DNK za AAV8(Y733F) i 4,7 × 10<6>genomi vektora/µg za AAV5. Uprkos visokim nivoima GC1 mRNK u tretiranim retinama, nije otkriveno GC1 eksprimiranje u optičkim nervima tretiranih očiju. Ovaj rezultat dalje potvrđuje ideju da vektori procenjeni kod ovoj studiji nisu rezultovali eksprimiranjem transgena izvan ciljane grupe. U skladu sa prethodnim izveštajima, smanjenje GCAP1 kod GC1KO miševa je post-translatorno (tj., nivoi mRNK su nepromenjeni), nismo našli značajne promene u nivoima GCAP1 mRNK u uzorcima (SLIKA 24A i SLIKA 24B).

[0210] Kao početna procena tretmana na drugim RNK specifičnim za čepić, takođe je procenjeno nekoliko drugih transkripata u ovim uzorcima. Kako bi se ustanovila osnovica za nivoe transducina čepića α (GNAT2), GNAT2 RNK je procenjena u netretiranim GC1KO uzorcima i ustanovljeno je da je redukovana u odnosu na GC1+/+ kontrole, rezultat verovatno usled gubitka fotoreceptora čepića u ovim retinama (SLIKA 24A i SLIKA 24B). Nasuprot tome, bilo je značajnih povećanja nivoa GNAT2 mRNK u očima tretiranim bilo AAV5 ili AAV8(Y733F) vektorima, rezultat koji dalje podupire ideju da se fotoreceptori čepića čuvaju kod GC1KO miševa tretiranim sa AAV-mGC1. Nivoi PDE6a štapića bili su relativno nepromenjeni preko uzoraka verovatno zato što fotoreceptori štapića ne degenerišu kod GC1KO miševa (SLIKA 24A i SLIKA 24B).

[0211] Kao zaključak, ove studije pokazuju da je perzistentno AAV-posredovano GC1 eksprimiranje sposobno da obnovi dugoročnu funkciju retine i sačuva fotoreceptore čepića kod GC1KO miševa. Kohorte GC1KO miševa tretirane sa AAV5 i AAV8(Y733F) su procenjeni za ERG oporavak tokom 9 meseci, odnosno 6 meseci nakon davanja injekcije. Dok statistički poređenje amplituda kupastog ERG nije nastavljeno nakon ovih vremenskih tačaka zbog smanjenja veličine uzoraka, svi tretirani miševi su nastavili da pokazuju funkcionalno (ERG) izbavljanje. Različiti testovi izvedeni na podskupovima ovih preostalih miševa pokazuju jasne indikacije kontinuirane terapije. Ova terapijska dugovečnost potvrđena je na više različitih nivoa: 1) postojanje GC1 proteina u tretiranim očima 10 meseci nakon tretmana, 2) vraćanje kupaste funkcije merene sa ERG na 12 meseci nakon tretmana, 3) povećano preživljavanje čepića u tretiranim očima 11 meseci nakon tretmana i 4) oporavak vektora genoma i GC1 mRNK u retinama 12 meseci nakon tretmana. Kada se posmatraju kao pojedinačne, diskretne analize, veličine uzoraka korišćene u ovim testovima su često male. Međutim, kada se svi smatraju korelacijom terapijske efikasnosti kod miševa koji pokazuju jasne znake funkcionalnog izbavljanja, veličina uzorka je efektivno mnogo veća. U tom kontekstu, izgleda da terapija traje i nakon perioda koji je statistički procenjen za ERG spasavanje. Ovo je prva demonstracija dugoročne terapije u životinjskom modelu nedostatka GC1.

[0212] Obnovljeni kupasti ERG su primećeni kod GC1KO miševa tretiranih sa AAV5 i AAV8(Y733) najmanje 9 meseci, odnosno 6 meseci nakon tretmana. Odgovori su bili stabilni i značajno viši od netretiranih GC1KO odgovora čepića tokom čitavog istraživanja. Oporavak je najizraženiji kod miševa tretiranih sa AAV8(Y733F) vektorom. Prosečne amplitude kupastog b-talasa kod miševa tretiranih sa AAV8(Y733F) su konstantno ~20µV više od onih koji su zabeleženi kod GC1KO miševa tretiranih sa standardnim AAV5 vektorima (~55µV naspram ~35µV). 6 meseci nakon tretmana, poslednja vremenska tačka u kojoj su svi vektori bili statistički upoređeni, ova razlika je ostala značajna. Ovaj rezultat potvrđuje da AAV8(Y733F) vektor stabilno obnavlja strukturu i funkciju retine rd10 miša, model koji je otporan na tretman sa standardnim AAV vektorima.

[0213] Kvantifikovanje razlika u amplitudama štapića između tretiranih i netretiranih očiju kod GC1KO miševa je zakomplikovano činjenicom da je funkcija štapića u ovom modelu delimično podvrgnuta guanilatnoj ciklazi-2 (GC2) (Sun i dr., 2010). ERG odgovori su stoga varijabilni od životinje do životinje (30-50% od normalnog). Prema tome, za razliku od poređenja odgovora tretiranih i netretiranih čepića, odgovor tretiranih štapića se ne može uporediti sa nultom osnovicom. Ipak, uparene GC1KO oči imaju uporedive ERG amplitude, i

1

odnos unutar životinje između ERG štapića u partnerskim očima, gde je jedno tretirano i drugo netretirano, daje validnu metriku za procenu efekata tretmana na funkciju štapića. Poboljšanja u odgovorima koji su posredovani štapićima kod GC1KO miševa koji su tretirani sa AAV8(Y733F) su primećeni konzistentnije od onih koji su zabeleženi kod miševa tretiranih sa AAV5, kao što je pokazano upoređivanjem intra-individualnog odnosa amplitude a- i b-talasa štapića od tretiranog i netretiranog oko. Ovo sugeriše da agresivno eksprimiranje GC1 u GC1KO oku može dopuniti parcijalni efekat GC2 na funkciju mišjeg štapića.

[0214] Dugoročno preživljavanje fotoreceptora čepića (11 meseci nakon injekcije) je demonstrirano imunobojenjem tretiranih i netretiranih retinalnih celulita iz jednog miša tretiranog sa AAV5-smCBA-mGC1 sa antitelom usmerenim protiv arestina čepića. Čepići su identifikovani kroz tretiranu GC1KO retinu. Retina koja je tretirana sa AAV5-smCBA-mGC1 takođe je jasno sadržala više čepića nego netretirano oko koje je, u skladu sa prethodnim izveštajima, zadržalo samo mali deo čepića u svojoj superiornoj hemisferi (Provost et al, 2005). Dok se konzervirani čepić u tretiranoj GC1KO retini nije ispitivao na ultrastrukturnom nivou (npr., elektronska mikroskopija), opažanje da su čepići ostali funkcionalni tokom ERG analize sugeriše da je njihova struktura netaknuta. Dugoročno očuvanje fotoreceptora čepića posredovano terapijskim AAV-GC1 ima očigledan klinički značaj, jer sugeriše potencijal za očuvanje makularnih čepića i vraćanje upotrebljivog dnevnog/vida u boji kod pacijenata sa nedostatkom GC1.

[0215] Eksprimiranje GC1 posredovano sa AAV je postojalo najmanje 10 meseci nakon tretmana (poslednja vremenska tačka procenjena sa IHC), i bilo je locirano isključivo u fotoreceptorima, bez obzira na serotip koji se koristi ili da li je fotoreceptor-specifičan (hGRK1) ili sveprisutan (smCBA) promoter je pokrenuo svoje eksprimiranje. Dok je eksprimiranje transgena bilo ograničeno na tip ciljane ćelije, hGRK1 promoter je bio specifičniji po tome što je rezultovao eksprimiranjem isključivo unutar odgovarajućeg dela ciljane ćelije (spoljašnji segmenti fotoreceptora). Ovaj rezultat, zajedno sa drugim uspešnim studijama o dokazu koncepta koji koriste ovaj promoter, sugeriše da promoter hGRK1 treba uzeti u obzir u dizajniranju kliničkog AAV vektora koji cilja fotoreceptore.

[0216] Imunobojenje transverzalnih GC1KO retinalnih sekcija na 10 meseci nakon tretmana sa AAV5-smcBA-mGC1 otkrilo je umereno stanjivanje ONL u odnosu na divlje tipove i

2

netretirane GC1KO kontrole. Dodatno, u ovoj retini GC1 je povremeno pronađen u ćelijskim telima fotoreceptora. Moguće je da jaki, sveprisutni promoter smCBA pokreće eksprimiranje GC1 na nivoima koji su preopteretili mehanizam saobraćanja nekih fotoreceptora i da akumulacija transgenog proizvoda u telima fotoreceptorskih ćelija predstavlja apoptozu izazvanu stresom u ovim ćelijama. Dramatičnije ONL stanjivanje je uočeno kod jednog miša kom je data injekcija sa AAV5-hGRK1-mGC1. Kako n iznosi 1, ne može se definitivno zaključiti da je retinalno oštećenje bilo prisutno kod svih miševa tretiranih ovim vektorom. Ipak, u skladu sa pojmom toksičnosti prekomernog eksprimiranja, titar AAV5-hGRK1-mGC1 vektora bio je najviši od tri vektora procenjena u ovoj studiji. Međutim, takođe treba napomenuti da nije bilo akumulacije GC 1 u telima fotoreceptora sa visokim titrom AAV5-hGRK1-mGC1 vektora.

[0217] Uprkos prirodi fotosenzitivnog AAV-posredovanog GC1 eksprimiranja, koja je isključivala fotoreceptore, pronalazači su bili zainteresovani za procenu širenja vektora genoma u tkivima izvan subretinalnog prostora. Važno je da su ovi podaci prikupljeni od 'bolesnih' životinja. Ovo je relevantno na osnovu dokaza da je uzorak vektorske transdukcije različit kod bolesnih u odnosu na zdrave retina (Kolstad i dr., 2010). Ovo bi sugerisalo da obrasci biodistribucije mogu biti različiti. Iz tog razloga, bilo je važno proceniti širenje genoma unutar samog spašenog životinjskog modela (tj., unutar pacijenata koji su pokazali jasan ERG oporavak). Iako je veličina uzorka bila ograničena, prikupljene su korisne informacije o distribuciji AAV5- i AAV8(Y733F)-isporučenih genoma u optičkom nervu i mozgu.

[0218] Ovo je prva procena biodistribucije za AAV vektor koji sadrži tirozin mutaciju na površini. AAV5- i AAV8(Y733F)-isporučeni genomi vektora su otkriveni u optičkim živcima očima kojima su date injekcije u svim vremenskim tačkama koje su procenjene. U samo jednoj vremenskoj tački (7 meseci posle injekcije) bili su detektovani AAV5 genomi vektora u mozgu tretiranog GC1KO miša. Genomi su pronađeni samo u hemisferi nasuprot oka kom je data injekcija. Ovaj rezultat je u suprotnosti sa nalazom koji su dali Provost i dr., 2005 koji su prijavili nedostatak AAV5-isporučene sekvence u mozgu pacova i pasa koji su dati kao subretinalne injekcije. Do 10 meseci nakon davanja injekcije, nijedan genom vektora nije otkriven iz mozgova AAV5-tretiranih GC1KO miševa, niti iz mozga miševa tretiranih sa AAV8(Y733F) u bilo kom trenutku. Međutim, zbog relativno malog broja analiziranih miševa, ne može se nedvosmisleno isključiti da su genomi isporučeni sa AAV5 prisutni u mozgu 10 meseci nakon davanja injekcije ili da AAV8(Y733F) isporučeni genomi nikada nisu prisutni u mozgovima tretiranih GC1KO miševa u bilo kom trenutku.

[0219] Uprkos oporavku vektora genoma iz optičkih živaca tretiranih očiju, imunološko bojenje otkriva nedostatak GC1 eksprimiranja u optičkim živcima očiju tretiranih bilo AAV5-smCBA-mGC1 ili AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 vektorima. Prethodna studija izvedena od strane Stiegera, i dr., (2005) otkrila je eksprimiranje transgena u optičkim živcima i mozgu pacova i pasa na 2 meseca i 4 nedelje nakon subretinalne injekcije sa AAV8 koji sadrži zeleni fluorescentni protein (GFP). Uzimajući u obzir da AAV8(Y733F) vektor sadrži fotoreceptor specifični hGRK1 promoter i prethodni nalaz da je GC1 eksprimiranje ograničeno na fotoreceptore čak i kada je pod kontrolom sveprisutnog promotera kao što je smCBA, nedostatak GC1 eksprimiranja u optičkim nervima nije neočekivano. Stieger i dr., (2005) uključio je jak, sveprisutni CMV promoter u njihov vektor kako bi pokrenuo GFP, protein koji je sposoban da se stabilno eksprimira u širokom spektru tkiva kada se isporučuje putem virusnih vektora.

[0220] Dok su i AAV5 i AAV8(Y733F) vektori bili sposobni da obezbede dugotrajnu terapiju kod GC1KO miševa, postoje očigledne prednosti povezane sa upotrebom AAV8(Y733F). Prvo i najvažnije, AAV8(Y733F) sa promoterom specifičnim za fotoreceptor je dao značajno viši ERG odgovor čepića kod tretiranih miševima nego bilo koji AAV5 vektor. Razlog za to može biti zbog sposobnosti AAV8 vektora da transdukuju područja izvan injekcionog bleba u retini glodara, dok područje retine transdukovane od strane AAV5 ostaje u velikoj meri ograničeno na bleb (47). Prema tome, AAV8 (733F) može jednostavno da transdukuje u proseku veću površinu retine relativno u odnosu na AAV5 vektore i zauzvrat rezultuje u većoj transdukciji čepića i robusnom ERG odgovoru čepića preko j povećanog opšteg preživljavanja čepića i/ili povećanog nivoa odgovora na svetlo u svakom transdukovanom čepiću.

PRIMER 8 - PRIMERI SEKVENCI POLIPEPTIDA GC1 SISARA

[0221] Primeri aminokiselinskih sekvenci korisnih u praksi predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje kodiraju biološki aktivan protein guanilatne ciklaze sisara. Takve sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, one ljudskog porekla, porekla od primata koji nije čovek, mišjeg, goveđeg i psećeg porekla, kao što su proteini guanilatne ciklaze navedeni u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4,

4

0

PRIMER 9 - ANALIZA SEKVENCI POZNATIH SISARSKIH POLIPEPTIDA GC1 [0222] Svi podaci GC1 poravnanja dobijeni korišćenjem aminokiselinske sekvence za sledeće vrste: Bos taurus (govedo; 1110 ostataka), Canis lupus familiaris (pas; 1109 ostataka), Mus musculus (miš; 1108 ostataka), i Homo sapiens (čovek; 1103 ostataka).

Položaji konsenzus i varijabilnih regioni su zasnovani na numeričkim ostacima koji odgovaraju Bos taurus pošto je ovo najduži GC1 protein, 1110 ostataka, i nema praznina u poravnanju.

[0223] Grafikon sličnosti poravnanja GC1 proteina iz Bos taurus, Canis lupus familiaris, Mus musculus, i Homo sapiens.

GC1 konsenzus regioni:

[0224] Položaji aminokiselina: 44-49, 55-90, 98-155, 164-321, 464-549, 561-604, 620-761, 813-1026, 1045-1054, i 1060-1110.

Varijabilni regioni:

[0225] Položaji aminokiselina: 4-43, 50-54, 91-97, 156-163, 322-463, 550-560, 605-619, 762-812, 1027-1044, i 1055-1059.

Drugi značajni regioni GC1 konsenzus poravnanja uključuju:

[0226]

(1) Domen homologije kinaze: aminokiselinski položaji 531 do 541 konsenzus sekvence (poznato da je neophodni za aktivnost u fotoreceptorima - pogledati, npr., Bereta i dr., 2010).

(2) Fosforilisani ostaci serina unutar domena kinaze homologije mišjeg GC1 proteina (konsenzus/goveđi položaj prikazan u zagradama): 530 (532), 532 (534), 533 (535) i 538 (540).

PRIMER 10 - NUKLEOTIDNA SEKVENCA SMCBA PROMOTERA

[0227] Sekvenca nukleinske kiseline ilustrativnog ljudskog promotera GRK1 (hGRK1) koji je korišćen u gore opisanim studijama je prikazana ispod:

[0228] Sekvenca nukleinske kiseline ilustrativnog smCBA promotera koji je korišćen u gore opisanim studijama je prikazana ispod:

REFERENCE

[0229] Naredne reference su priložene u obimo koji pruža primerne procedure ili druge detalje dopunske onima koji su ovde dati.

Patent Sjedinjenih Država 4,237,224, objavljen 2. decembra 1980.

Patent Sjedinjenih Država 4,554,101, objavljen 19. novembra 1985.

Patent Sjedinjenih Država 4,683,195, objavljen 28. jula 1987.

Patent Sjedinjenih Država 4,683,202, objavljen 28. jula 1987.

Patent Sjedinjenih Država 4,800,159, objavljen 24. januara 1989.

Patent Sjedinjenih Država 4,883,750, objavljen 28. novembra 1989.

Patent Sjedinjenih Država 4,987,071, objavljen 22. januara 1991.

Patent Sjedinjenih Država 5,145,684, objavljen 8. septembra 1992.

Patent Sjedinjenih Država 5,334,711, objavljen 2. avgusta 1994.

Patent Sjedinjenih Država 5,354,855, objavljen 11. oktobra 1994.

Patent Sjedinjenih Država 5,399,363, objavljen 21 marta 1995.

Patent Sjedinjenih Država 5,466,468, objavljen 14. novembra 1995.

Patent Sjedinjenih Država 5,543,158, objavljen 6. aprila 1996.

Patent Sjedinjenih Država 5,552,157, objavljen 3. septembra 1996.

Patent Sjedinjenih Država 5,565,213, objavljen 15. oktobra 1996.

Patent Sjedinjenih Država 5,567,434, objavljen 22. oktobra 1996.

Patent Sjedinjenih Država 5,602,306, objavljen 11. februara 1997.

Patent Sjedinjenih Država 5,631,359, objavljen 20. maja 1997.

Patent Sjedinjenih Država 5,639,940, objavljen 17. juna 1997.

Patent Sjedinjenih Država 5,641,515, objavljen 24. juna 1997.

Patent Sjedinjenih Država 5,656,016, objavljen 12. avgusta 1997.

Patent Sjedinjenih Država 5,697,899, objavljen 16. decembra 1997.

Patent Sjedinjenih Država 5,720,936, objavljen 24. februara 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,738,868, objavljen 14. aprila 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,741,516, objavljen 21. aprila 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,770,219, objavljen 23. juna 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,779,708, objavljen 14. jula 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,783,208, objavljen 21. jula 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,789,655, objavljen 4. avgusta 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,795,587, objavljen 18. avgusta 1998.

Patent Sjedinjenih Država 5,797,898, objavljen 25. avgusta 1998.

Međ. prij. patenta br. PCT/US87/00880.

Međ. prij. patenta br. PCT/US88/10315.

Međ. prij. patenta br. PCT/US89/01025.

Objava međ. prij. patenta br. WO 89/06700.

Objava međ. prij. patenta br. WO 91/03162.

Objava međ. prij. patenta br. WO 92/07065.

Objava međ. prij. patenta br. WO 93/15187.

Objava međ. prij. patenta br. WO 93/23569.

Objava međ. prij. patenta br. WO 94/02595.

Objava međ. prij. patenta br. WO 94/13688.

Objava Evr. prij. patenta br. EP 0329822.

Objava Evr. prij. patenta br. EP 0360257.

Objava Evr. prij. patenta br. EP 92110298.4.

Objava Evr. prij. patenta br.320,308.

Prijava Velike Britanije br..2202328.

Acland GM, Aguirre GD, Ray J, Zhang Q, Aleman TS, Cideciyan AV, Pearce-Kelling SE, Anand V, Zeng Y, Maguire AM, Jacobson SG, Hauswirth WW, Bennett J., "Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness," Nat. Genet., 28(1):92-5,2001.

Alexander JJ, Umino Y, Everhart D, Chang B, Min SH, i dr., "Restoration of cone

1

vision in a mouse model of achromatopsia," Nat. Med., 13:685-687,2007.

Alstrom, C. H. "Heredo-retinopathia congenitalis monohybrida recessiva autosomalis: a genetical-statistical study in clinical collaboration with Olof Olson," Hereditas, 43:1-178, 1957.

Arshavsky VY, Lamb TD, Pugh EN Jr , "G proteins and phototransduction," Annu. Rev. Physiol., 64:153-187, 2002.

Azadi S i dr., "RD3, the protein associated with Leber congenital amaurosis type 12, is required for guanylate cyclase trafficking in photoreceptor cells," Proc Natl Acad Sci USA, 107:21158-63, 2010.

Baehr W, Karan S, Maeda T, Luo DG, Li S, Bronson JD, Watt CB, Yau KW, Frederick JM, Palczewski K., "The function of guanylate cyclase 1 and guanylate cyclase 2 in rod and cone photoreceptors," J. Biol. Chem., 282(12):8837-47,2007. Bainbridge JW, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K i dr., "Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis," N. Engl. J. Med., 358:2231-2239, 2008.

Beltran W, Boye SL, Boye SE, Chiodo V, Lewin AS i dr., "rAAV2/5 gene-targeting to rods: dose-dependent efficiency and complications associated with different promoters," Gene Ther., 17:1162-1174, 2010.

Bereta G, Wang B, Kiser PD, Baehr W, Jang GF, Palczewski K., "A functional kinase homology domain is essential for the activity of photoreceptor guanylate cyclase 1," J. Biol. Chem., 285(3):1899-908, 2010.

Bhowmick R, Li M, Sun J, Baker SA, Insinna C, Besharse JC, "Photoreceptor IFT complexes containing chaperones, guanylyl cyclase 1 and rhodopsin," Traffic, 10:648-63, 2009.

Boye SE, Boye SL, Pang J, Ryals R, Everhart D, Umino Y i dr., "Functional and behavioral restoration of vision by gene therapy in the guanylate cyclase-1 (GC1) knockout mouse," PLoS One, 5:e11306, 2010.

Burns ME and Arshavsky VY, "Beyond counting photons: trials and trends in vertebrate visual transduction," Neuron, 48:387-401, 2005.

Camuzat, A.; Dollfus, H.; Rozet, J.-M.; Gerber, S.; Bonneau, D.; Bonnemaison, M.; Briard, M.-L.; Dufier, J.-L.; Ghazi, I.; Leowski, C.; Weissenbach, J.; Frezal, J.;

Munnich, A.; Kaplan, J., "A gene for Leber's congenital amaurosis maps to chromosome 17p," Hum. Molec. Genet., 4:1447-1452, 1995.

Camuzat, A.; Rozet, J.-M.; Dollfus, H.; Gerber, S.; Perrault, I.; Weissenbach, J.;

2

Munnich, A.; Kaplan, J., "Evidence of genetic heterogeneity of Leber's congenital amaurosis (LCA) and mapping of LCA1 to chromosome 17p13," Hum. Genet., 97:798-801, 1996.

Chung DC and Traboulsi EI, "Leber congenital amaurosis: clinical correlations with genotypes, gene therapy trials update, and future directions," J. AAPOS., 13:587-92, 2009.

Cideciyan AV, Aleman TS, Boye SL, Schwartz SB, Kaushal S et a/., "Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:15112-7, 2008.

Cideciyan AV, Hauswirth WW, Aleman TS, Kaushal S, Schwartz SB, Boye SL i dr., "Vision one year after gene therapy for Leber congenital amaurosis," N. Engl. J. Med., 361:725-727, 2009.

Coleman JE and Semple-Rowland SL, "GC1 deletion prevents light-dependent arrestin translocation in mouse cone photoreceptor cells," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46:12-6, 2005.

Coleman JE, Zhang Y, Brown GA, Semple-Rowland SL, "Cone cell survival and downregulation of GCAP1 protein in the retinas of GC1 knockout mice," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 45:3397-403, 2004.

Cremers, F. P. M.; van den Hurk, J. A. J. M.; den Hollander, A. I., "Molecular genetics of Leber congenital amaurosis," Hum. Molec. Genet.11:1169-1176,2002. den Hollander AI, Roepman R, Koenekoop RK, Cremers RP "Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms," Prog Ret Eye Res 27:301-419, 2008.

Dizhoor AM, Lowe DG, Olshevskaya EV, Laura RP and Hurley JB, "The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator," Neuron, 12:1345-52, 1994.

Douglas RM, Alam NM, Silver BD, McGill TJ, Tschetter WW i dr., "Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system," Vis. Neuro., 22:677-684,2005.

Downes SM, Payne AM, Kelsell RE, Fitzke FW, Holder GE, Hunt DM i dr., "Autosomal dominant cone-rod dystrophy with mutations in the guanylate cyclase 2D gene encoding retinal guanylate cyclase-1. Arch. Ophthalmol., 119:1667-1673, 2001. Ehara, H.; Nakano, C.; Ohno, K.; Goto, Y.-I.; Takeshita, K., "New autosomalrecessive syndrome of Leber congenital amaurosis, short stature, growth hormone insufficiency, mental retardation, hepatic dysfunction, and metabolic acidosis," Am. J. Med. Genet.71:258-266, 1997.

Ek, J.; Kase, B. F.; Reith, A.; Bjorkhem, I.; Pedersen, J. I., "Peroxisomal dysfunction in a boy with neurologic symptoms and amaurosis (Leber disease): clinical and biochemical findings similar to those observed in Zellweger syndrome," J.

Pediat..108:19-24, 1986.

Francois, J., "Leber's congenital tapetoretinal degeneration," Int. Ophthal. Clin., 8:929-947, 1968.

Gillespie, F. D., "Congenital amaurosis of Leber," Am. J. Ophthal., 61:874-880, 1966. Glushakova LG i dr., "Does recombinant adeno-associated virus-vectored proximal region of mouse rhodopsin promoter support only rod-type specific expression in vivo? Mol Vis. 12:298-309, 2006.

Gorczyca WA i dr., "Purification and physiological evaluation of a guanylate cyclase activating protein from retinal rods," Proc Natl Acad Sci USA, 91:4014-8, 1994. Haire SE, Pang J, Boye SL, Sokal I, Craft CM i dr., "Light-driven cone arrestin translocation in cones of postnatal guanylate cyclase-1 knockout mouse retina treated with AAV-GC1," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47(9):3745-53, 2006.

Hanein, S.; Perrault, I.; Gerber, S.; Tanguy, G.; Barbet, F.; Ducroq, D.; Calvas, P.; Dollfus, H.; Hamel, C.; Lopponen, T.; Munier, F.; Santos, L.; Shalev, S.; Zafeiriou, D.; Dufier, J.-L.; Munnich, A.; Rozet, J.-M.; Kaplan, J., "Leber congenital amaurosis: comprehensive survey of the genetic heterogeneity, refinement of the clinical definition, and genotype-phenotype correlations as a strategy for molecular diagnosis," Hum. Mutat.23:306-317, 2004.

Hanein, S.; Perrault, I.; Olsen, P.; Lopponen, T.; Hietala, M.; Gerber, S.; Jeanpierre, M.; Barbet, F.; Ducroq, D.; Hakiki, S.; Munnich, A.; Rozet, J.-M.; Kaplan, J., "Evidence of a founder effect for the RETGC1 (GUCY2D) 2943DelG mutation in Leber congenital amaurosis pedigrees of Finnish origin," (Abstract) Hum. Mutat., 20:322-323,2002.

Hauswirth W, Aleman TS, Kaushal S, Cideciyan AV, Schwartz SB, Wang L i dr., "Treatment of Leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: short-term results of a phase I trial," Hum. Gene Ther., 19:979-990, 2008.

Hayasaka, S.; Hara, S.; Mizuno, K.; Narisawa, K.; Tada, K., "Leber's congenital amaurosis associated with hyperthreoninemia," Am. J. Ophthal., 101:475-479, 1986.

4

Huang Y, Cideciyan AV, Papastergiou GI, Banin E, Semple-Rowland SL i dr., "Relation of optical coherence tomography to microanatomy in normal and rd chickens," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 39:2405-16, 1998.

Jacobson SG i dr., "Safety in nonhuman primates of ocular AAV2-RPE65, a candidate treatment for blindness in Leber congenital amaurosis," Hum Gene Ther. 17:845-58. 2006.

Jacobson SG, Acland GM, Aguirre GD, Aleman TS, Schwartz SB i dr., "Safety of recombinant adeno-associated virus type 2-RPE65 vector delivered by ocular subretinal injection," Mol. Ther., 13:1074-84, 2006.

Karan S, Frederick JM and Baehr W, "Novel functions of photoreceptor guanylate cyclases revealed by targeted deletion," Mol. Cell. Biochem., 334:141-55, 2010. Khani SC, Pawlyk BS, Bulgakov OV, Kasperek E, Young JE, "AAV-mediated expression targeting of rod and cone photoreceptors with a human rhodopsin kinase promoter," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48:3954-61,2007.

Khanna, H.; Davis, E. E.; Murga-Zamalloa, C. A.; Estrada-Cuzcano, A.; Lopez, I.; den Hollander, A. I.; Zonneveld, M. N.; Othman, M. I.; Waseem, N.; Chakarova, C. F.; Maubaret, C.; Diaz-Font, A. i dr., "A common allele in RPGRIP1L is a modifier of retinal degeneration in ciliopathies," Nature Genet., 41:739-745, 2009.

Kolstad KD i dr., "Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration," Hum. Gene Ther., 21:571-8, 2010.

Komáromy AM, Alexander JJ, Rowlan JS, Garcia MM, Chiodo VA, Kaya A i dr. "Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia." Hum Mol Genet. April 21 [Epub ahead of print], 2010.

Lamb TD, Pugh EN Jr, "Phototransduction, dark adaptation, and rhodopsin regeneration the proctor lecture," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47:5138-5152, 2006. Lambert, S. R.; Sherman, S.; Taylor, D.; Kriss, A.; Coffey, R.; Pembrey, M., "Concordance and recessive inheritance of Leber congenital amaurosis," Am. J. Med. Genet., 46:275-277, 1993.

Leber, T., "Ueber anomale formen der retinitis pigmentosa," Albrecht von Graefes Arch. Ophthal., 17:314-340, 1871.

Leber, T., "Ueber retinitis pigmentosa und angeborene amaurose," Albrecht von Graefes Arch. Ophthal.15:1-25, 1869.

Li T, Pawlyk BS, Bulgakov OV, Liu X, Xu X, Adamian M, Sun X, Khani SC, Berson EL, Sandberg M, "Replacement gene therapy with a human RPGRIP1 sequence slows photoreceptor degeneration in a murine model of Leber congenital amaurosis," Hum. Gene Ther., 21(8):993-1004, 2010.

Li W i dr., "Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye," Mol Vis., 14:267-75, 2009.

Liu X, Seno K, Nishizawa Y, Hayashi F, Yamazaki A i dr., "Ultrastructural localization of retinal guanylate cyclase in human and monkey retinas," Exp. Eye Res., 59:761-8, 1994.

Liu, L, Barone I, Dai X, Lei B, Boye SL, Chiodo V, Chang B, Hauswirth WW, Strettoi E, Pang JJ, "Gene therapy preserves inner retinal neurons and their connectivity in rd10 mice, a model of recessive retinitis pigmentosa with PDEβ mutations," Abstr. ARVOAnnu. Meet, #3112, 2010.

Livak KJ and Schmittgen "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25:402-8, 2001. Lotery AJ i dr. "Adeno-associated virus type 5 transduction efficiency and cell-type specificity in the primate retina," Hum Gene Ther., 14:1663-71, 2003.

Lowe DG, Dizhoor AM, Liu K, Gu Q, Spencer M i dr., "Cloning and expression of a second photoreceptor-specific membrane retina guanylyl cyclase (RetGC), RetGC-2," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5535-9, 1995.

Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh Jr EN, Mingozzi F, Bennicelli J i dr., "Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis," N. Engl. J. Med., 358:2240-2248, 2008.

Mah i dr., "Dual vectors expressing murine factor VIII result in sustained correction of hemophilia A mice," Hum. Gene Ther., 14(2):143-152, 2003.

Mancuso K et al "Gene therapy for red-green colour blindness in adult primates," Nature 461:784-7, 2009.

McCarty i dr., "Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates selfcomplementary vectors to overcome the rate-limiting step to transfuction in vivo," Gene Ther., 10(26):2112-2118, 2003.

Mendez A, Burns ME, Sokal I, Dizhoor AM, Baehr W, Palczewski K, Baylor DA, Chen J., "Role of guanylate cyclase-activating proteins (GCAPs) in setting the flash sensitivity of rod photoreceptors," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(17):9948-53,2001. Milam, A. H.; Barakat, M. R.; Gupta, N.; Rose, L.; Aleman, T. S.; Pianta, M. J.; Cideciyan, A. V.; Sheffield, V. C.; Stone, E. M.; Jacobson, S.G., "Clinicopathologic effects of mutant GUCY2D in Leber congenital amaurosis," Ophthalmology, 110:549-558, 2003.

Moore, A. T.; Taylor, D. S. I. "A syndrome of congenital retinal dystrophy and saccade palsy-a subset of Leber's amaurosis, Brit. J. Ophthal., 68:421-431, 1984. Nakamura, M.; Ito, S.; Miyake, Y. "Novel de novo mutation in CRX gene in a Japanese patient with Leber congenital amaurosis," Am. J. Ophthal., 134:465-467, 2002.

Natkunarajah M i dr., "Assessment of ocular transduction using single-stranded and self-complementary recombinant adeno-associated virus serotype 2/8," Gene Ther., 15:463-7, 2008.

Nickel, B.; Hoyt, C. S. "Leber's congenital amaurosis. Is mental retardation a frequent associated defect?" Arch. Ophthal., 100:1089-1092, 1982.

Otto-Bruc A, Buczylko J, Surgucheva I, Subbaraya I, Rudnicka-Nawrot M i dr., "Functional reconstitution of photoreceptor guanylate cyclase with native and mutant forms of guanylate cyclase-activating protein 1,"Biochemistry, 36:4295-302, 1997. Palczewski K i dr., "Molecular cloning and characterization of retinal photoreceptor guanylyl cyclase-activating protein," Neuron 13:395-404, 1994.

Pang J, Boye SE, Lei B, Boye SL, Everhart D, Ryals R, Umino Y, Rohrer B, Alexander J, Li J, Dai X, Li Q, Chang B, Barlow R, Hauswirth WW, "Selfcomplementary AAV-mediated gene therapy restores cone function and prevents cone degeneration in two models of Rpe65 deficiency," Gene Ther., 17(7):815-826, 2010. Pang JJ, Boye SL, Kumar A, Dinculescu A, Deng W, Li J, Li Q, Rani A, Foster TC, Chang B, Hawes NL, Boatright JH, Hauswirth WW, "AAV-mediated gene therapy for retinal degeneration in the rd10 mouse containing a recessive PDEbeta mutation," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 49(10):4278-83, 2008.

Pang JJ, Chang B, Kumar A, Nusinowitz S, Noorwez SM, Li J, Rani A, Foster TC, Chiodo VA, Doyle T, Li H, Malhotra R, Teusner JT, McDowell JH, Min SH, Li Q, Kaushal S, Hauswirth WW, "Gene therapy restores vision-dependent behavior as well as retinal structure and function in a mouse model of RPE65 Leber congenital amaurosis," Mol. Ther., 13(3):565-72.2006.

Pang JJ, Dai X, Boye SE, Barone I, Boye SL, Mao S i dr., "Long-term retinal function and structure rescue using capsid mutant AAV8 vector in the rd10 mouse, a model of recessive retinitis pigmentosa," Mol. Ther. 19:234-42, 2011.

Pang JJ, Dai X, Everhart D, 3, Lei B, Boye SL, Dinculescu A, Umino Y, Chang B, Barlow R, Hauswirth WW., "Long-term rescue following gene therapy with capsid mutant AAV8 in the rd10 mouse, a model of recessive retinitis pigmentosa," ARVO Abstract 2527, Annu. Meet., 2010.

Pasadhika S, Fishman GA, Stone EM, Lindeman M, Zelkha R i dr., "Differential macular morphology in patients with RPE65, CEP290, GUCY2D and AIPL1 related Leber congenital amaurosis," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 51(5):2608-2614, 2010. Pawlyk BS i dr., "Replacement gene therapy with a human RPGRIP1 sequence slows photoreceptor degeneration in a murine model of leber congenital amaurosis," Hum Gene Ther., Apr 12 [Epub ahead of print], 2010.

Payne AM, Morris AG, Downes SM, Johnson S, Bird AC, Moore AT i dr., "Clustering and frequency of mutations in the retinal guanylate cyclase (GUCY2D) gene patients with dominant cone-rod dystrophies," J Med Genet.38:611-614, 2001. Perrault i dr., "Retinal-specific guanylate cyclase gene mutations in Leber's congenital amaurosis," Nat. Genet., 14(4):461-4, 1996.

Perrault I, Rozet JM, Gerber S, Ghazi I, Ducroq D i dr., "Spectrum of retGC1 mutations in Leber's congenital amaurosis," Eur. J. Hum. Genet., 8:578-82, 2000. Perrault I, Rozet JM, Gerber S, Ghazi I, Leowski C i dr., "Leber congenital amaurosis," Mol. Genet. Metab., 68:200-8, 1999.

Perrault, I.; Rozet, J. M.; Calvas, P.; Gerber, S.; Camuzat, A.; Dollfus, H.; Chatelin, S.; Souied, E.; Ghazi, I.; Leowski, C.; Bonnemaison, M.; Le Paslier, D.; Frezal, J.; Dufier, J.-L.; Pittler, S.; Munnich, A.; Kaplan, J., "Retinal-specific guanylate cyclase gene mutations in Leber's congenital amaurosis," Nature Genet., 14:461-464, 1996. Perrault, I.; Rozet, J.-M.; Gerber, S.; Ghazi, I.; Leowski, C.; Ducroq, D.; Souied, E.; Dufier, J.-L.; Munnich, A.; Kaplan, J., "Leber congenital amaurosis," Molec. Genet. Metab., 68:200-208, 1999.

Petrs-Silva H, Dinculescu A, Li Q, Min SH, Chiodo V, Pang JJ, i dr. "High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors," Mol. Ther. 17:463-71, 2009.

Poirier, A i dr. "Toxicology and biodistribution studies of a recombinant adenoassociated virus 2-α-1 antitrypsin vector," Preclinica 2:43-51, 2004.

Polans A, Baehr W, Palczewski K "Turned on by Ca2+! The physiology and pathology of Ca2+ binding proteins in the retina," Trends Neurosci 19:547-554, 2006. Provost N i dr., "Biodistribution of rAAV vectors following intraocular administration: evidence for the presence and persistence of vector DNA in the optic nerve and in the brain," Mol Ther., 11:275-83, 2005.

Pugh EN Jr, Duda T, Sharma RK, Sitaramayya A "Photoreceptor guanylate cyclases: a review," Biosci Rep., 17:429-473, 1997.

Rahn, E. K.; Falls, H. F.; Knaggs, J. G.; Proux, D. J., "Leber's congenital amaurosis with an Ehlers-Danlos-like syndrome: study of an American family," Arch. Ophthal., 79:135-141, 1968.

Riess, O.; Weber, B.; Noeremolle, A.; Shaikh, R.A.; Hayden, M.R.; Musarella, M.A., "Linkage studies and mutation analysis of the PDEB gene in 23 families with Leber congenital amaurosis," Hum. Mutat., 1:478-485, 1992.

Russell-Eggitt, I. M.; Taylor, D. S. I.; Clayton, P. T.; Garner, A.; Kriss, A.; Taylor, J. F. N. "Leber's congenital amaurosis-a new syndrome with a cardiomyopathy," Brit. J. Ophthal., 73:250-254, 1989.

Schappert-Kimmijser, J.; Henkes, H. E.; Van den Bosch, J. "Amaurosis congenita (Leber)," Arch. Ophthal., 61:211-218, 1959.

Schroeder, R.; Mets, M. B.; Maumenee, I. H. "Leber's congenital amaurosis: retrospective review of 43 cases and a new fundus finding in two cases," Arch.

Ophthal., 105:356-359, 1987.

Schuil, J.; Meire, F. M.; Delleman, J. W. "Mental retardation in amaurosis congenita of Leber," Neuropediatrics, 29:294-297, 1998.

Semple-Rowland SL, Lee NR, Van Hooser JP, Palczewski K, Baehr W, "A null mutation in the photoreceptor guanylate cyclase gene causes the retinal degeneration chicken phenotype," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:1271-6, 1998.

Simonelli F, Ziviello C, Testa F, Rossi S, Fazzi E i dr., "Clinical and molecular genetics of Leber's congenital amaurosis: a multicenter study of Italian patients," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48:4284-90, 2007.

Sohocki, M. M.; Bowne, S. J.; Sullivan, L. S.; Blackshaw, S.; Cepko, C. L.; Payne, A. M.; Bhattacharya, S. S.; Khaliq, S.; Mehdi, S. Q.; Birch, D. G.; Harrison, W. R.; Elder, F. F. B.; Heckenlively, J. R.; Daiger, SP, "Mutations in a new photoreceptorpineal gene on 17p cause Leber congenital amaurosis," Nature Genet.. 24:79-83, 2000.

Song S i dr. "Intramuscular administration of recombinant adeno-associated virus 2 a-1 antitrypsin (rAAV-SERPINA1) vectors in a nonhuman primate model: safety and immunologic aspects," Mol. Ther., 6:329-335, 2002.

Sorsby, A.; Williams, C. E., "Retinal aplasia as a clinical entity," Brit. Med. J.1:293Stephen R i dr., "Stabilizing function for myristoyl group revealed by the crystal structure of a neuronal calcium sensor, guanylate cyclase-activating protein 1," Structure 15:1392-402, 2007.

Stieger K i dr., "Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain," Mol Ther.16:916-23, 2008.

Sun X, Pawlyk B, Xu X, Liu X, Bulgakov OV i dr., "Gene therapy with a promoter targeting both rods and cones rescues retinal degeneration caused by AIPL1 mutations," Gene Ther., 17:117-31, 2010.

Surace EM and Auricchio A. "Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer," Vis. Res., 48:353-359, 2007.

Tan MH, Smith AJ, Pawlyk B, Xu X, Liu X i dr., "Gene therapy for retinitis pigmentosa and Leber congenital amaurosis caused by defects in AIPL1: effective rescue of mouse models of partial and complete Aipll deficiency using AAV2/2 and AAV2/8 vectors," Hum. Mol. Genet., 18:2099-114, 2009.

Timmers AM, Zhang H, Squitieri A, Gonzalez-Pola C, "Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina," Mol. Vis., 7:131-7, 2001.

Traint and Whitehead, "Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples," J. Heredity, :100:246-250, 2009.

Ulshafer RJ, Allen C, Dawson WW and Wolf ED, "Hereditary retinal degeneration in the Rhode Island Red chicken. I. Histology and ERG," Exp. Eye Res., 39:125-35,1984.

Umino Y, Solessio E, Barlow RB, "Speed, spatial, and temporal tuning of rod and cone vision in mouse," J. Neurosci., 28:189-198, 2008.

Waardenburg, P. J.; Schappert-Kimmijser, J., "On various recessive biotypes of Leber's congenital amaurosis," Acta Ophthal., 41:317-320, 1963.

Wagner, R. S.; Caputo, A. R.; Nelson, L. B.; Zanoni, D., "High hyperopia in Leber's congenital amaurosis," Arch. Ophthal., 103:1507-1509, 1985.

Weiss ER, i dr., "Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction," J Neurosci., 21:9175-84, 2001.

Wensel TG "Signal transducing membrane complexes of photoreceptor outer segments," Vis Res.48:2052-2061,2008.

1

Wilkie SE, Newbold FJ, Deery E, Walker CE, Stinton I, Ramamurthy V i dr., "Functional characterization of missense mutations at codon 838 in retinal guanylate cyclase correlates with disease severity in patients with autosomal dominant cone-rod dystrophy," Hum Mol Genet., 9:3065-3073, 2000.

Williams GA and Jacobs GH"Cone-based vision in the aging mouse," Vision Res 47:2037-46, 2007.

Williams ML, Coleman JE, Haire SE, Aleman TS, Cideciyan AV, "Lentiviral expression of retinal guanylate cyclase-1 (RetGC1) restores vision in an avian model of childhood blindness," PLoS. Med., 3:e201, 2006.

Yang GS, Schmidt M, Yan Z, Lindbloom JD, Harding TC i dr., "Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size," J. Virol., 76:7651-60,2002.

Yang RB and Garbers DL, "Two eye guanylyl cyclases are expressed in the same photoreceptor cells and form homomers in preference to heteromers," J. Biol. Chem., 272:13738-42, 1997.

Yang RB, Foster DC, Garbers DL, Fülle HJ, "Two membrane forms of guanylyl cyclase found in the eye," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:602-6, 1995.

Yang RB and Garbers DL "Two eye guanylyl cyclases are expressed in the same photoreceptor cells and form homomers in preference to heteromers," J. Biol. Chem., 272:13738-13742, 1997.

Yang RB, Robinson SW, Xiong WH, Yau KW, Birch DG i dr., "Disruption of a retinal guanylyl cyclase gene leads to cone-specific dystrophy and paradoxical rod behavior," J. Neurosci., 19:5889-97, 1999.

Yano, S.; Oda, K.; Watanabe, Y.; Watanabe, S.; Matsuishi, T.; Kojima, K.; Abe, T.; Kato, H. "Two sib cases of Leber congenital amaurosis with cerebellar vermis hypoplasia and multiple systemic abnormalities," Am. J. Med. Genet., 78:429-432, 1998.

Yin L, Greenberg K, Hunter JJ, Dalkara D, Kolstad KD, Masella BD i dr., "Intravitreal injection of AAV2 transduces macaque inner retina," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., Feb 10, 2011.

Zernant, J.; Kulm, M.; Dharmaraj, S.; den Hollander, A. I.; Perrault, I.; Preising, M. N.; Lorenz, B.; Kaplan, J.; Cremers, F. P. M.; Maumenee, I.; Koenekoop, R. K.;

Allikmets, R., "Genotyping microarray (disease chip) for Leber congenital amaurosis: detection of modifier alleles," Invest. Ophthal. Vis. Sci., 46:3052-3059, 2005.

1 1

Zhang H, Huang W, Zhang H, Zhu X, Craft CM i dr., "Light-dependent redistribution of visual arrestins and transducin subunits in mice with defective phototransduction," Mol. Vis., 9:231-7, 2003.

Zhong L, i dr., "Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:7827-32, 2008.

Zhu X, Li A, Brown B, Weiss ER, Osawa S, Craft CM, "Mouse cone arrestin expression pattern: light induced translocation in cone photoreceptors," Mol. Vis., 8:462-71, 2002.

Zolotukhin S i dr., "Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors," Methods, 28(2):158-67, 2002.

[0230] Svi sastave i postupci koji su ovde opisani i zahtevani patentnim zahtevima mogu biti napravljeni i izvedeni bez nepotrebnog eksperimentisanja u svetlu ovog obelodanjenja.

1 2

1

��

�

1

1

�

�

11

11

11

11

11

11

11

��

12

��

��

��

12

��

�

11

12

�

��

�

1

�

�

�

14

��

��

��

14

14

14

�

11

��

�

Claims (20)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni adeno-povezani virusni (rAAV) vektor koji sadrži barem prvi polinukleotid koji sadrži fotoreceptor-specifičan ljudskom promoteru rodopsin kinaze operativno vezanom za barem prvi segment nukleinske kiseline koji kodira barem prvi biološki aktivan polipeptid ljudske guanilatne ciklaze specifičan za retinu koji sadrži barem prvu susednu sekvencu aminokiselinske sekvence koja je najmanje oko 95% identična sa najmanje 120 susednih aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO: 1, gde je rAAV vektor vektor rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 5 (rAAV5) ili gde je rAAV vektor vektor r rekombinantnog adeno-povezanog virusa serotipa 8 (rAAV8).

2. Vektor rAAV prema patentnom zahtevu 1, gde barem prvi biološki aktivan polipeptid ljudske guanilatne ciklaze specifičan za retinu sadrži prvi susedni region aminokiselinske sekvence koja je najmanje oko 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO : 1.

3. Vektor rAAV prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde promoter ljudske rodopsin kinaze specifične za fotoreceptor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja se u suštini sastoji od najmanje 60 susednih sekvenci baznog para od SEQ ID NO: 12.

4. Vektor rAAV prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje sadrži barem prvi pojačivač ili barem prvu intronsku sisarsku sekvencu koja je operativno povezana sa najmanje jednim segmentom nukleinske kiseline.

5. Vektor rAAV prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se rAAV vektor nalazi unutar infektivne adeno-povezane virusne čestice, viriona, mnoštva infektivnih AAV čestica ili izolovane ćelije domaćina sisara.

6. Vektor rAAV prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se rAAV vektor nalazi unutar AAV5 virusne čestice.

7. Vektor rAAV prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se rAAV vektor nalazi unutar AAV8 virusne čestice.

8. Vektor rAAV prema patentnom zahtevu 7, gde se rAAV vektor nalazi unutar AAV8 Y733F virusne čestice.

9. Sastav koji sadrži:

(1) vektor rAAV prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva; i

(2) farmaceutski prihvatljiv pufer, nosač, nosač ili razblaživač.

10. Vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do ,8 ili sastav prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u terapiji, poželjno za upotrebu u a) terapiji ili profilaksi ljudske distrofije, bolesti ili poremećaja, uključujući Leberovu urođenu amaurozu (LCA1) ili b) dijagnostifikovanje, sprečavanje, tretman ili ublažavanje bolesti, poremećaja, disfunkcije ili abnormalnog stanja oka sisara, ili jednog ili više njegovih simptoma.

11. Vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, ili sastav prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u postupku za sprečavanje, tretman ili ublažavanje bolesti, disfunkcije, poremećaja, nedostatka ili abnormalnog stanja kod sisara, ili jednog ili više njegovih simptoma, gde se sumnja da je sisar izložen riziku za razvoj, ili mu je dijagnostifikovan barem prvi retinalni poremećaj, bolest ili distrofija.

12. Vektor ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde je sisar izložen riziku za razvoj, ili mu je dijagnostifikovan nedostatak biološki aktivnog polipeptida guanilatne ciklaze retine.

13. Vektor ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili 12, gde je sisar čovek novorođenče, beba, dete ili maloletnik koji je izložen riziku za razvoj, ili mu je dijagnostifikovana urođena retinalna distrofija kao što je Leberova urođena amauroza-1 ( LCA-1).

14. Vektor ili sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 13, gde je bolest, disfunkcija, poremećaj, nedostatak ili abnormalno stanje Leberova urođena amauroza-1 (LCA1) ili njen simptom.

15. Vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili sastav prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u postupku za pružanje sisara sa terapeutski efikasnom količinom biološki aktivnog polipeptida ljudske guanilatne ciklaze specifičnog za retinu kod sisara kom je to potrebno,

1

koji obuhvata uvođenje u odgovarajuće ćelije sisara kojima je to potrebno, efikasne količine vektora rAAV.

16. Vektor ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, gde sisar kom je to potrebno ima defekt, nedostatak ili suštinsko odsustvo biološki aktivnog retGC1 proteina u barem prvom tkivu sisara, u poređenju sa nivoom biološki aktivnog retGC1 proteina kod normalnog sisara.

17. Vektor ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 15 ili 16, gde je mnoštvo ćelija sisara pruženo sa rAAV vektorom ex vivo ili in vitro, i gde postupak dalje obuhvata uvođenje mnoštva pruženih ćelija u barem prvo mesto tkiva unutar ili oko tela sisara, ili gde je mnoštvo dobijenih ćelija uvedeno u barem prvo mesto unutar jednog ili oba oka sisara direktnim davanjem injekcije u retinu ili okolno tkivo.

18. Vektor ili sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 17, gde uvođenje vektora rAAV čuva fotoreceptore čepića, vraća funkciju posredovanu čepićima, vraća vizuelno ponašanje, ili bilo koju njihovu kombinaciju u oku sisara, gde je poželjno da pojedinačno uvođenje rAAV vektora u oko sisara čuva fotoreceptore čepića, vraća funkciju posredovanu čepićima, vraća vizuelno ponašanje, ili bilo koju njihovu kombinaciju, kod sisara tokom perioda od najmanje šest meseci, ili gde jedno uvođenje rAAV vektor u oku sisara čuva fotoreceptore čepića, obnavlja funkciju posredovanu čepićima, vraća vizuelno ponašanje, ili bilo koju njihovu kombinaciju, kod sisara tokom perioda od najmanje deset meseci.

19. Vektor ili sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 18, gde sisar koji ima potrebu za tim ima urođenu amaurozu-1 (LCA1) ili njen simptom.

20. Vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 ili sastav prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u postupku za povećanje nivoa biološki aktivnog retGC1 proteina u jednoj ili više retinalnih ćelija kod sisara za kog se sumnja da ima, dijagnostifikovana mu je, ili je pod rizikom za razvoj LCA1, koji obuhvata uvođenje vektora u barem prvu populaciju retinalnih ćelija sisara, u količini i za vreme efektivnog povećanja nivoa biološki aktivnog retGC1 proteina u jednoj ili više retinalnih ćelija sisara.

1