ES2911246T3 - Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRT) para selección de células T transducidas - Google Patents

Abstract

Un método para seleccionar células T transducidas que comprende: (a) transducir una población de células T con un gen modificado del EGFR, que consiste en una secuencia que codifica un EGFR truncada que consiste en el dominio III del EGFR, el dominio transmembrana del EGFR y el dominio IV del EGFR; y (b) enriquecer la población de células T transducidas seleccionando las células transducidas con éxito con un anticuerpo monoclonal anti-EGFR.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRT) para selección de células T transducidas

Campo técnico

Los presentes métodos relacionados con la purificación de células modificadas genéticamente, específicamente con un receptor truncado apareado con un anticuerpo correspondiente, tal como un polipéptido derivado del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) apareado con cetuximab, para uso en inmunoterapia del cáncer.

Antecedentes

Los productos de células inmunitarias con expresión homogénea de receptores de antígenos quiméricos (CAR) dirigidos a tumores son deseables para la evaluación clínica de estrategias de terapia adoptiva para eliminar la variabilidad producto a producto de la expresión transgénica, por lo demás intrínseca a la transducción y otros procedimientos de modificación genética sin posterior selección. La inmunoterapia con células inmunitarias redirigidas genéticamente es un enfoque atractivo para tratar la enfermedad residual mínima en una variedad de pacientes con cáncer. Sin embargo, el rechazo inmunológico de productos celulares que expresan proteínas de selección de antibióticos como parte de la estrategia de transducción ha impedido esta estrategia. Un nuevo marcador de selección que no se expresa en linfocitos humanos, no contiene una función de señalización o tráfico endógeno, y se reconoce por un reactivo de anticuerpo de grado farmacéutico conocido, preferiblemente comercialmente disponible, que se puede utilizar para la selección, rastreo in vivo y el agotamiento de las células transducidas serían una mejora significativa en la técnica.

Sumario

La presente invención proporciona un método para seleccionar células T transducidas que comprende:

(a) transducir una población de células T con un gen modificado del EGFR, que consiste en una secuencia que codifica un EGFR truncada que consiste en el dominio III del EGFR, el dominio transmembrana del EGFR y el dominio IV del EGFR; y

(b) enriquecer la población de células T transducidas seleccionando las células transducidas con éxito con un anticuerpo monoclonal anti-EGFR.

En ciertas realizaciones, el gen modificado del EGFR se une a una secuencia de nucleótidos que codifica solamente la secuencia señal de la cadena alfa del GMCSFR.

En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos codificada por el gen modificado del EGFR es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.

En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos codificada por el gen modificado del EGFR consiste en la SEQ ID NO: 3.

En ciertas realizaciones, el gen modificado del EGFR está acoplado con una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico específico para un antígeno asociado a tumor, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico específico para un antígeno asociado a un tumor es seguido de una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador escindible 2A del terminal C y la secuencia de codificación para el gen modificado del EGFR.

En ciertas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico específico para un antígeno asociado a tumor se selecciona de CD19, CD20 y CD22.

En ciertas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es CD19.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab, matuzumab, necitumumab o panitumumab.

Un epítopo de selección no inmunogénico compatible con la selección inmunomagnética facilita la inmunoterapia en pacientes con cáncer sin un rechazo inmunológico indeseable de productos celulares (es decir, como se observa cuando se expresa en proteínas de selección de antibióticos) puede generarse eliminando ciertas secuencias de aminoácidos de la proteína. El epítopo de selección no inmunogénico es un gen que codifica una molécula endógena de la superficie celular que se trunca para retener un epítopo extracelular reconocido por un anticuerpo conocido o fragmento funcional del mismo, y para eliminar cualquier dominio de señalización o tráfico y/o cualquiera de los dominios extracelulares no reconocidos por el anticuerpo conocido. La eliminación de los dominios de señalización o tráfico y/o cualquiera de los dominios extracelulares no reconocidos por el anticuerpo conocido hace que la molécula endógena de la superficie celular sea inerte, que es una propiedad deseada para la molécula. El epítopo de selección no inmunogénico también se puede usar como un marcador de seguimiento.

La molécula endógena modificada de la superficie celular puede ser, pero no se limita a, cualquier receptor relacionado con la superficie celular, ligando, glicoproteína, molécula de adhesión celular, antígeno, integrina o grupo de diferenciación (CD) que se modifica como se describe en el presente documento. La molécula endógena de superficie celular modificada es un receptor de tirosina quinasa truncado. En un aspecto, el receptor de tirosina quinasa truncado es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4).

El receptor del factor de crecimiento epidérmico, también conocido como EGFR, ErbB1 y HER1, es un receptor de la superficie celular para los miembros de la familia de factores de crecimiento epidérmico de ligandos extracelulares. Las alteraciones en la actividad del EGFR se han implicado en ciertos cánceres. En un primer aspecto, un gen que codifica un polipéptido EGFR que comprende el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) que se construye mediante la eliminación de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que incluyen el dominio de unión a EGF distal de membrana y la cola de señalización citoplásmica (un "EGFR truncado" o "EGFRt"), pero retiene el epítopo proximal de la membrana extracelular reconocido por un anticuerpo anti-EGFR. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR conocido, disponible comercialmente, tal como cetuximab, matuzumab, necitumumab o panitumumab.

La aplicación de cetuximab biotinilado a la selección inmunomagnética en combinación con microperlas anti-biotina enriquece con éxito las células T que se han transducido de forma lentiviral con constructos que contienen EGFRt, desde un valor tan bajo como 2% de la población hasta una pureza superior al 90% sin toxicidad observable para la preparación celular. La expresión constitutiva de esta molécula del EGFRt inerte no afecta el fenotipo de las células T o la función efectora como lo indica el receptor de antígeno quimérico (CAR), CD19R, expresado de manera coordinada. A través del análisis de citometría de flujo, EGFRt se utilizó con éxito como un marcador de seguimiento in vivo para el injerto de células T en ratones. Además, se demostró que EGFRt tiene potencial genético suicida a través de las rutas de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediada por Erbitux®. Por lo tanto, EGFRt puede usarse como una herramienta de selección no inmunogénica, marcador de seguimiento y gen suicida para células T transducidas que tienen potencial inmunoterapéutico. El ácido nucleico del EGFRt también puede detectarse por medios bien conocidos en la técnica.

Se describen en este documento métodos para descubrir y diseñar moléculas de superficie celular endógenas modificadas, truncadas o alteradas que se unen a anticuerpos, preferiblemente anticuerpos disponibles comercialmente. Los métodos incluyen modelar la proteína de interés y truncar las porciones funcionales, mientras se dejan intactas las porciones de unión al anticuerpo. El receptor o ligando modificado resultante puede clasificarse utilizando un anticuerpo marcado y luego enriquecerse de tal manera que la concentración del receptor o ligando modificado aumente.

Una realización proporciona un método de selección de células T transducidas que comprende la transducción de células T con un EGFR truncado y luego la aplicación de un anticuerpo que une la secuencia del ligando o del receptor modificado a las células T transducidas. Si la secuencia del receptor modificado es EGFRt, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-EGFR biotinilado. Las células T luego se clasifican agregando microperlas anti-biotina y seleccionando las células T usando separación inmunomagnética, agregando anti-biotina conjugada con fluorocromo y seleccionando las células T usando la clasificación de células activadas por fluorescencia, o cualquier otro método confiable de clasificación de las células. Las secuencias del ligando o receptor modificadas, tales como la secuencia del EGFRt, pueden estar contenidas en un vehículo de transferencia adecuado tal como un vector lentiviral.

Estas y otras realizaciones se explican con más detalle en los dibujos y la descripción detallada en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquiera de las siguientes Figuras que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines comparativos.

La Figura 1 es un modelo molecular de proteínas del EGFR frente al EGFRt basadas en los archivos de estructura cristalina. La estructura del EGFR a la izquierda muestra un EGFR de longitud completa con la estructura de los cuatro dominios extracelulares (Dominios I-IV). La estructura central muestra el EGFR truncado (EGFRt), que carece del Dominio I, el Dominio II, el Dominio yuxtamembrana y el Dominio con actividad Tirosina Quinasa en comparación con un EGFR no modificado. El EGFRt a la derecha muestra una estructura truncada unida al Fab Eribitux®, compuesta por Vh-Ch¹ y Vl-Cl. Los dominios están separados con líneas de puntos.

La Figura 2 ilustra la selección de células T EGFRt+ utilizando cetuximab biotinilado (denominado en la Figura como Erbitux®). La Figura 2a es un esquema del proceso de biotinilación y reformulación del cetuximab. La Figura 2b es una gráfica que muestra la titulación de cetuximab biotinilado. Se tiñeron 106 células EGFR+ con 0 |jg (negro), 1,45 |jg (rojo), 0,145 jg (naranja), 14,5 ng (amarillo), 1,45 ng (verde), 0,145 ng (azul) o 14,5 pg (púrpura) de cetuximab biotinilado seguido de 0,5 jg de estreptavidina conjugada con PE y analizaron por citometría de flujo. Se consideraron suficientes 14,5 ng o más de cetuximab biotinilado para tinción adicional. La Figura 2c muestra esquemas de los procedimientos de selección del EGFRt inmunomagnético (arriba) y de clasificación de células activadas por fluorescencia (abajo).

La Figura 2d muestra la selección inmunomagnética de varias líneas de células T transducidas de forma lentiviral con constructos que contienen CAR y EGFRt. Los esquemas de los constructos CD19CAR-T2A-EGFRt (izquierda) y CD19CAR-T2A-EGFRt-IMPDH2dm (derecha) contenidos en vectores lentivirales se muestran más arriba de los análisis citométricos de flujo de selección previa y posterior correspondiente para la expresión del EGFRt de superficie. Se indican las porciones de secuencia optimizadas de codón del CAR específico de CD19 coestimulador de CD28, seguidos de los marcadores de selección autoescindibles T2A, EGFRt e IMPDH2dm, junto con las secuencias promotoras del Factor 1 de Elongación (EF-1p), y las secuencias de señales de cadena de alfa GCSFR (GCSFRss, que dirige la expresión de superficie). Se realizó un análisis citométrico de flujo de líneas de células T transducidas de forma lentiviral que se habían teñido con un anticuerpo de cetuximab biotinilado y un anticuerpo antibiotina conjugado con PE (histogramas con relleno) en las células T de entrada (PRE SLXN) y la fracción positiva obtenida de AutoMACSMR (POS FRXN). Los histogramas sin relleno representan la tinción con un anticuerpo antibiotina conjugado con PE solamente, y el porcentaje de células positivas se indica en cada histograma. La selección de la Línea A CD19CAR+EGFRt+ ocurrió 3 días después de la transducción de los blastos de células T. La selección de la Línea B CD19CAR+EGFRt+ ocurrió después de 3 estimulaciones REM de células derivadas de Tcm específicas de CMVpp65 transducidas. La selección de la Línea C CD19CAR+EGFRt+ se produjo después de 2 estimulaciones REM de células derivadas de Tcm CD8+transducidas. La selección de la Línea D CD19CAR+EGFRt+ ocurrió después de 1 estimulación con REM de células derivadas de Tem transducidas. La selección de la Línea E CD19CAR+EGFRt+IMPDH2dm+ ocurrió después de 1 estimulación con REM de las células derivadas de Tcm transducidas.

La Figura 3 muestra que el EGFRt expresado en células T seleccionadas es inerte. En la Figura 3a, EGFRt expresado en células T no se fosforila después de la incubación con EGF. Se incubaron células T de control negativas, células de línea A CD19CAR+EGFRt+ o células A431 durante 5 minutos con o sin 100 ng/mLde EGF o cetuximab (denominado en la Figura como Erbtx) y luego se lisaron en presencia del inhibidor de fosfatasa. Los lisados procesados en transferencias Western se sondearon utilizando anticuerpos específicos para p-actina, el dominio citoplasmático del EGFR o la tirosina fosforilada en la posición 1068 del EGFR. La Figura 3b muestra que EGF no se une a la superficie de las células T que expresan EGFRt. A431, la línea A y las células T de control negativo se tiñeron con anti-EGFR conjugado con PE, o bien cetuximab biotinilado o EGF biotinilado seguido de estreptavidina conjugada con PE (histograma con relleno) frente al Ab de control de isotipo conjugado con PE o estreptavidina sola (histograma sin relleno) por citometría de flujo. El porcentaje de tinción positiva está indicado en cada histograma.

La Figura 4 ilustra que las células T EGFRt+ CD19R+ se pueden expandir con el mantenimiento del fenotipo efector. La Figura 4a es una gráfica de líneas que muestra la expansión de las células T seleccionadas con EGFRt, Líneas A-E, durante 12 o más días después de que se inició la estimulación rápida del medio de expansión (REM) el día de la selección de AutoMACSMR (día 0). (MACS es la clasificación celular activada magnéticamente). La expansión de las células T en el medio de expansión rápida (REM) involucró la incubación de 106 células T con 30 ng/mL de anti-CD3£ (OKT3; Ortho Biotech, Raritan, NJ), 5 x 107 PBMC irradiadas con radiación y (3500 cGy) y 107 LCL irradiadas con radiación y (8.000 cGy) en 50 mL de CM; con la adición de 50 U/mL de rhlL-2 y 10 ng/mL de rhIL-15 (CellGenix) cada 48 horas, a partir del día 1. Las células T se volvieron a estimular de esta manera cada 14 días. La Figura 4b muestra histogramas que representan células T seleccionadas con EGFRt (11 a 13 días después de la estimulación) que se fenotiparon para EGFR de superficie (es decir, EGFRt, con cetuximab biotinilado), Fc (es decir, CAR) y marcadores de células T CD4 o CD8, (histograma con relleno) frente a Ab de control de isotipo (histograma sin relleno) por citometría de flujo. El porcentaje de tinción positiva está indicado en cada histograma. "N.D." indica que no hay datos. La Figura 4C son gráficos de cinco líneas, una para cada una de las Líneas A-E, de células T seleccionadas con EGFRt (dentro de los 11 a 15 días posteriores a la estimulación con REM) incubadas durante 4 horas con células NS0, marcado con 51Cr, U251T, NS0 que expresan CD19t, U251T que expresan pp65 del CMV, Daudi o SupB15 que expresan CD19, o LCL que expresan OKT3 como objetivos en las proporciones E:T indicadas. La liberación de cromo se midió para determinar la actividad citotóxica. La Figura 4d es una gráfica que muestra la resistencia a MPA de la Línea E CD19CAR+EGFRt+IMPDH2dm+. Las células T de control que no expresan IMPDH2dm y las células de la Línea E que expresan IMPDH2dm seleccionadas con EGFRt se cultivaron ya sea con o sin MPA 1 pM y se monitorizó el número de células totales.

La Figura 5 muestra que la expresión del EGFRt se puede usar como marcador de seguimiento para el injerto de células T in vivo. El Día 36, se tiñó la médula ósea recolectada de un ratón de control o de un ratón que había recibido 107 células de la Línea C CD19CAR+EGFRt+ el día 0 usando CD45 anti-humano conjugado con PerCP y cetuximab biotinilado ("Bio- Erb") seguido por estreptavidina conjugada con PE. Los cuadrantes se crearon en función de la tinción del control de isotipo y el porcentaje de tinción positiva en cada cuadrante se indica en cada histograma.

La Figura 6 es una gráfica que muestra las células T de los objetivos de expresión del EGFRt para ADCC mediada por cetuximab (denominadas en la figura como Erbitux®). Las células de la línea A marcadas con 51Cr se incubaron previamente con o sin hasta 20 pg/mL de cetuximab o mAb Rituxan específico de CD20 como control negativo antes de la adición de PBMC humana como efectores.

La Figura 7 son las secuencias de los nucleótidos (la cadena sentido es la SEQ ID NO: 1, la cadena antisentido es la SEQ ID NO: 2) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de la secuencia señal de la cadena alfa de GMCSFR unida a EGFRt.

La secuencia señal de la cadena alfa de GMCSFR, que dirige la expresión en la superficie, está codificada por los nucleótidos 1-66. EGFRt está codificada por los nucleótidos 67-1071.

La Figura 8 son las secuencias de nucleótidos (la cadena sentido es la SEQ ID NO: 4, la cadena antisentido es la SEQ ID NO: 5) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de CD19R-CD28gg-Zeta(CO)-T2A-EGFRt. CD19R-CD28gg-Zeta(CO) está codificada por los nucleótidos 1-2040; T2A está codificado por los nucleótidos 2041-2112; GMCSFR está codificada por los nucleótidos 2113-2178; EGFRt está codificada por los nucleótidos 2179-3186.

La Figura 9 es una gráfica que muestra la expresión de CD19R-CD28gg-Zeta(CO)-T2A-EGFRt. La transducción de blastos de células T primarias estimuladas con perlas anti-CD3/anti-CD28 con el vector lentiviral CD19R-CD28gg-Zeta(CO)-T2A-EGFRt_epHIV7 (MOI = 3) da como resultado la detección en la superficie de ambos CAR (utilizando un Ab anti-Fc biotinilado y estreptavidina-PE) y la molécula EGFR truncada (usando un Ab cetuximab biotinilado y estreptavidina-PE) por citometría de flujo en el día 4. El pico blanco en cada panel son blastos de células T de control no transducidas.

La Figura 10 es un esquema que muestra un posible flujo de proceso para ensayos clínicos para probar productos de la presente divulgación.

Descripción detallada

Ciertas realizaciones de la invención se describen en detalle, usando ejemplos específicos, secuencias y dibujos.

Erbitux® es una marca registrada para el anticuerpo monoclonal anti-EGFR cetuximab y se pretende que incluya de manera independiente la formulación del producto de nombre comercial, el medicamento genérico y el ingrediente o ingredientes farmacéuticos activos del producto de nombre comercial.

El término "modificación genética" significa cualquier proceso que agrega, elimina, altera o interrumpe una secuencia de nucleótidos endógena e incluye, pero no se limita a, transferencia de genes mediada por virus, transferencia mediada por liposomas, transformación, transfección y transducción, por ejemplo, transferencia génica mediada por virus, tal como el uso de vectores basados en virus de ADN como lentivirus, adenovirus, retrovirus, virus adenoasociados y virus del herpes.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpos que pueden ser humanos, de ratón, humanizados, quiméricos o derivados de otra especie. Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos que se dirige contra un sitio antigénico específico.

"Variante" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierta medida de un polipéptido de secuencia nativa. Normalmente, las variantes de la secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente, al menos aproximadamente 90% de homología por secuencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, supresiones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de referencia.

La "identidad porcentual" o "el porcentaje de identidad" se define como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear mejor las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Los métodos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Tales programas incluyen GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST o Align 2.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc, tal como células asesinas naturales, los neutrófilos y los macrófagos, reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y causa la lisis de la célula objetivo. La actividad de ADCC se puede evaluar utilizando métodos, tales como aquellos descritos en la patente de Estados Unidos N° 5.821.337.

Las "células efectoras" son leucocitos que expresan uno o más receptores de región constante y realizan funciones efectoras.

Para "tratar" una enfermedad o un trastorno, tal como el cáncer, significa tomar medidas terapéuticas o medidas preventivas para disminuir o mermar la enfermedad o trastorno. Dicho tratamiento incluye la prevención, el alivio de los síntomas, la disminución o estabilización del alcance y/o la remisión.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto o molécula eficaz para tratar una enfermedad o trastorno.

"Cáncer" se refiere a células que experimentan un crecimiento celular incontrolado. Los ejemplos de cáncer incluyen cáncer colorrectal y cáncer de cabeza y cuello. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer.

Una "citoquina" es una proteína liberada por una célula para actuar sobre otra célula como mediador intercelular.

"No inmunogénico" se refiere a un material que no inicia, provoca o mejora una respuesta inmunitaria en la que la respuesta inmunitaria incluye las respuestas inmunitarias adaptativas y/o innatas.

El término "gen" significa el segmento de ADN involucrado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye las regiones que preceden y siguen a la región de codificación "líder y tráiler", así como las secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos de codificación individuales (exones). Se pueden desarrollar algunos genes que carecen, total o parcialmente, de intrones. Algunas secuencias líderes pueden mejorar la traducción del ácido nucleico en polipéptidos.

El término "aislado" significa que el material se remueve de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se presenta en forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente en la naturaleza en un animal vivo no se aísla, pero se aísla el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía estar aislados, ya que dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.

Como se usa en el presente documento, un "vector" puede ser cualquier agente capaz de administrar o mantener ácido nucleico en una célula huésped, e incluye vectores virales (por ejemplo, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales o vectores virales adeno-asociados), plásmidos, ácidos nucleicos desnudos, ácidos nucleicos complejados con polipéptidos u otras moléculas y ácidos nucleicos inmovilizados sobre partículas de fase sólida. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasas de restricción apropiados mediante procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los expertos en la técnica. La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación de las pb 100 a 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus.

"Receptor" significa un polipéptido que es capaz de unirse específicamente a una molécula. Mientras que muchos receptores pueden operar típicamente en la superficie de una célula, algunos receptores pueden unirse a los ligandos cuando están ubicados dentro de la célula (y antes del transporte a la superficie) o pueden residir predominantemente intracelularmente y unirse al ligando en la misma.

"Anticuerpo o fragmento funcional del mismo" significa una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a, o es inmunológicamente reactiva con un antígeno o epítopo particular, e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. El término anticuerpo incluye formas de inmunoglobulinas modificadas genéticamente o modificadas de otra forma, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos). El término fragmento de anticuerpo funcional incluye fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab', F(ab')² , Fab, Fv, rlgG y scFv. El término scFv se refiere a un anticuerpo Fv de cadena única en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional de dos cadenas se han unido para formar una cadena.

En una realización, un gen que codifica un gen modificado del EGFR, que consiste en una secuencia que codifica un EGFR truncado que consiste en el Dominio de EGFR III, el dominio transmembrana del EGFR y el Dominio IV del EGFR, se utiliza como un epítopo de selección no inmunogénico compatible con selección inmunomagnética. Tal epítopo de selección no inmunogénico puede facilitar la inmunoterapia en pacientes con cáncer sin un rechazo inmunológico indeseable de productos celulares. El gen modificado del EGFR retiene un epítopo extracelular reconocido por un anticuerpo conocido o fragmento funcional del mismo, y para remover cualquier dominio de señalización o tráfico y/o cualquier dominio extracelular no reconocido por dicho anticuerpo conocido. Una molécula de superficie celular endógena modificada que carece de un dominio de señalización o tráfico y/o cualquier dominio extracelular no reconocido por dicho anticuerpo conocido se vuelve inerte.

Las moléculas de superficie celular endógenas modificadas descritas en el presente documento pero no reivindicadas, son cualquier receptor relacionado con la superficie celular no inmunogénico, glicoproteína, molécula de adhesión celular, antígeno, integrina o grupo de diferenciación (CD) que se modifica como se describe en el presente documento. La modificación de tales moléculas de la superficie celular se logra manteniendo un epítopo que es reconocido por un anticuerpo conocido o fragmento funcional del mismo; y remover cualquier dominio de señalización o tráfico y/o cualquier dominio extracelular no reconocido por un anticuerpo conocido. La remoción de los dominios de señalización o tráfico y/o cualquier dominio extracelular no reconocido por un anticuerpo conocido hace que la molécula endógena de la superficie celular no sea inmunógena y/o inerte.

Ejemplos de moléculas endógenas de la superficie celular que pueden modificarse o truncarse incluyen, entre otras, EpCAM, VEGFR, integrinas (por ejemplo, integrinas avp3, a4, aIIbp3, a4p7, a5p1, avp3, av), la superfamilia de receptores de TNF (por ejemplo, TRAIL-R1, TRAIL-R2), el receptor del PDGF, el receptor de interferón, el receptor de folato, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, receptor de IL-6, 5T4, GD2, GD3, o grupos de diferenciación (por ejemplo, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23, receptor de CD23/IgE, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/basigina, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7).

Los anticuerpos comerciales correspondientes que se pueden usar para reconocer una molécula endógena de la superficie celular modificada o truncada incluyen, pero no se limitan a, 3F8, abagovomab, abciximab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab pentetato, anatumomab mafenatox, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab (= tocilizumab), basiliximab, bectumomab, benralizumab, besilesomab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, brentuximab vedotina, cantuzumab mertansina, capromab pendetida, catumaxomab, CC49, cedelizumab, celmoleukin, citatuzumab bogatox, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetano, CNTO-95, conatumumab, dacetuzumab, daclizumab, daratumumab, detumomab, ecromeximab, edrecolomab, efalizumab, elotuzumab, enlimomab pegol, epitumomab cituxetano, epratuzumab, erlizumab, etaracizumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, galiximab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, glembatumumab vedotina, gomiliximab, ibalizumab, ibritumomab tiuxetano, igovomab, intetumumab, iratumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, keliximab, labetuzumab, lintuzumab, lexatumumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, muromonab-CD3, naptumomab estafenatox, natalizumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, oportuzumab monatox, oregovomab, otelixizumab, pemtumomab, priliximab, PRO 140, rituximab, rovelizumab, ruplizumab, satumomab pendetida, siplizumab, sontuzumab, tadocizumab, taplitumomab paptox, teneliximab, teplizumab, TGN1412, ticilimumab (= tremelimumab), tigatuzumab, tocilizumab (= atlizumab), toralizumab, tositumomab, tremelimumab, tucotuzumab, vedolizumab, veltuzumab, visilizumab, vitaxin, volociximab, votumumab, zanolimumab, ziralimumab, zolimomab aritox.

La molécula endógena de superficie celular modificada puede codificarse por un gen del receptor de tirosina quinasa modificado o truncado. Los ejemplos de receptores de tirosina quinasa que se pueden modificar o truncar incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento endotelial (EGRF/ErbB1/HER1; ErbB2/HER2/neu; ErbB3/HER3; ErbB4/HER4), el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR/c-MET) y el receptor-1 del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1R). De acuerdo con lo anterior, los receptores de tirosina quinasa modificados retienen un epítopo extracelular reconocido por un anticuerpo conocido o fragmento funcional del mismo, y carecen de al menos un dominio de tirosina quinasa. Un receptor de tirosina quinasa modificado que carece de al menos un dominio de tirosina quinasa hace que el receptor sea inerte.

Los anticuerpos comerciales que se pueden usar para reconocer un receptor de tirosina quinasa modificado incluyen, pero no se limitan a AMG-102, AMG-479, BIIB022OA-5D5, CP-751,871, IMC-A12, R1507, cetuximab, cixutumumab, ertumaxomab, figitumumab, matuzumab, necitumumab, panitumumab, pertuzumab, nimotuzumab, robatumumab, trastuzumab, zalutumumab.

En una realización, la molécula de superficie celular endógena modificada es un EGFR truncado (EGFRt). El EGFRt carece del Dominio I, el Dominio II, el Dominio de Yuxtamembrana y el Dominio tirosina quinasa en comparación con un EGFR no modificado (Figura 1).

Un gen que codifica un EGFR modificado puede usarse como un marcador de selección de células para una población modificada genéticamente de células T. El gen que codifica un EGFR modificado se puede acoplar a un gen que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a tumor. Estos genes pueden insertarse en un vector para transducir la población de células T para ser modificadas genéticamente. Después de la transducción, las células que se transducen exitosamente y expresan el CAR y la molécula endógena de la superficie celular modificada se enriquecen con cualquier método de purificación adecuado, tal como la purificación inmunomagnética con microperlas anti-biotina o anti-biotina conjugada con fluorocromo para la clasificación de células activadas por fluorescencia, utilizando un anticuerpo comercial que reconoce la molécula endógena de la superficie celular modificada expresada por la célula transducida.

En otra realización, un gen que codifica un receptor del factor de crecimiento epidérmico humano truncado (EGFRt) que carece del dominio de unión al EGF distal de membrana y la cola de señalización citoplasmática, pero retiene el epítopo proximal de la membrana extracelular reconocido por el anticuerpo monoclonal anti-EGFR (mAb) cetuximab aprobado por la FDA u otro anticuerpo anti-EGFR, se construye como se describe en este documento. El EGFRt se puede acoplar con receptores de antígenos quiméricos específicos para un antígeno asociado a un tumor. El antígeno asociado a tumor puede ser CD19, CD20 o CD22, o cualquier otro antígeno asociado a tumor, pero es preferiblemente CD19 (CD19CAR). El antígeno asociado al tumor es seguido por un enlazador escindible 2A del terminal C y la secuencia de codificación para EGFRt. El cetuximab biotinilado se puede usar junto con microperlas de anti-biotina disponibles comercialmente para el propósito de purificación inmunomagnética del antígeno asociado al tumor/transductores que expresan CAR. En el caso de que el antígeno asociado a tumor sea CD19, el producto son transductores que expresan CD19CAR. Alternativamente, el cetuximab biotinilado se puede usar junto con anti-biotina conjugada con fluorocromo para la clasificación de células activadas por fluorescencia.

Se puede usar una molécula endógena de la superficie celular modificada como un marcador para el injerto de células T in vivo. Por ejemplo, el EGFRt se puede usar para seguir la captación de las células T a las que está adherido in vivo, sin afectar la función celular de las células T o las células a las que se dirigen las células T, tal como las células de médula ósea en una situación de trasplante. El uso de cetuximab conjugado con sondas o genes informadores, tal como sr39TK, se puede usar para mejorar el potencial de seguimiento de células que expresan EGFRt a pacientes a través de técnicas de formación de imágenes PET.

Se puede usar una molécula endógena de superficie celular modificada para inducir el suicidio celular. Por ejemplo, EGFRt se puede usar como un gen suicida a través del complemento mediado por cetuximab y/o las vías de citotoxicidad mediadas por células dependientes de anticuerpos (ADCC). El hecho de que el cetuximab sea un anticuerpo terapéutico aprobado por la FDA facilita aún más el potencial del gen suicida de EGFRt en el entorno clínico.

En otras realizaciones, el epítopo de selección del receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) se une a otras secuencias. Un ejemplo de secuencia es la secuencia señal de cadena alfa GMCSFR, que dirige la expresión de superficie, unida a EGFRt. GMCSFR está codificado por los nucleótidos 1-66 y EGFRt está codificado por los nucleótidos 67-1071 de la SEQ ID NO: 1. Véase la Figura 7. También en la Figura 7 se encuentran las secuencias de cadena antisentido (SEQ ID NO: 2) y de aminoácido (SEQ ID NO: 3) de la secuencia señal de la cadena alfa de GMCSFR unida a EGFRt. Otra secuencia de este tipo es una secuencia de ADNc con codones optimizados que codifica un receptor de antígeno quimérico coestimulador anti-CD19 (CD19R-CD28gg-Zeta(CO)), y un enlazador T2A escindible. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) modificados para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para CD19 que envía señales a través de un dominio coestimulador citoplasmático (CD28) fusionado al dominio CD3-^ citoplasmático muestra una potencia antitumoral superior que puede atribuirse a la supervivencia mediada por CD28y la producción de citoquinas mejorada. Este constructo puede modificarse aún más para incorporar un enlazador escindible 2A en el terminal C seguido por la secuencia de codificación para un EGFR humano truncado (EGFRt) con el fin de purificación inmunomagnética de transductores que expresan CAR usando microperlas de cetuximab-biotina/antibiotina. Véase la secuencia de CD19R-CD28gg-Zeta(CO)-T2A-EGFRt unida como en la Figura 8, SEQ ID NOs: 4 (cadena sentido de nucleótidos), 5 (cadena antisentido de nucleótidos) y 6 (proteína). La transducción con lentivector de células T humanas primarias con este ADNc con codón optimizado dirige la expresión coordinada del CAR y EGFRt (Figura 9).

Para eliminar la variabilidad entre productos de expresión transgénica, ya sea intrínsecos a los procedimientos de transducción sin selección subsiguiente, se desarrolló un epítopo de selección no inmunogénico, EGFRt, compatible con selección inmunomagnética utilizando el dispositivo CliniMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Por ejemplo, EGFRt es un receptor del factor de crecimiento epidérmico humano truncado que carece del dominio de unión a EGF distal de la membrana y la cola de señalización ectoplasmática, pero retiene el epítopo proximal de la membrana extracelular reconocido por el mAb comercial anti-EGFR cetuximab. Véase la Figura 1. Cetuximab biotinilado se aplica a la selección inmunomagnética en combinación con microperlas anti-biotina (Miltenyi). Los blastos de OKT3 humanos que se habían transducido de forma lentiviral con CD19R-CD28gg-Zeta(CO)-T2A-EGFRt se sometieron a selección inmunomagnética utilizando el dispositivo Miltenyi AutoMACS, y la frecuencia de células T EGFRt+CAR+ se enriqueció desde el 22% (selección previa ) hasta el 99% (selección posterior) sin toxicidad observable para la preparación de células (Figura 3). También es posible que, en lugar de o además de clasificación inmunomagnética, el EGFRt se pueda purificar utilizando técnicas de clasificación de células con base en fluorescencia.

Debido a la ausencia de los dominios de unión a EGF y los dominios de señalización intracelular, el EGFRt es inactivo cuando se expresa por las células T. Es importante destacar que las células T seleccionadas con EGFRt mantienen su fenotipo efector deseado, incluida la actividad citotóxica antitumoral mediada por el receptor de antígeno quimérico que se expresa de manera coordinada con el EGFRt, y siguen siendo susceptibles a los protocolos de expansión establecidos.

En general, este EGFRt tiene varias ventajas para los productos celulares inmunoterapéuticos en comparación con otros marcadores de selección que se han informado previamente. Específicamente, a diferencia de los CD4 y CD19 truncados, no se expresa de manera endógena por las subpoblaciones de linfocitos. Además, en contraste con el CD34 truncado y el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad, no tiene ninguna actividad que pueda afectar negativamente al producto de las células inmunitarias (es decir, en términos de señalización o tráfico). Por último, solo puede ser unido/reconocido por un reactivo de anticuerpo de grado farmacéutico conocido, preferiblemente comercialmente disponible, es decir, cetuximab. Juntos, estos atributos hacen del EGFRt un marcador de selección superior para cualquier sistema de transfección/transducción que se pueda aplicar a la generación de productos celulares para la inmunoterapia adoptiva. Por lo tanto, EGFRt es muy adecuado para ser utilizado como un marcador de selección para células T transducidas de forma lentiviral de importancia inmunoterapéutica.

También se proporcionan métodos para identificar nuevos productos celulares terapéuticos que tienen los siguientes criterios: una molécula de superficie celular endógena modificada, ligando o un receptor que, como se modifica, no se expresa de forma endógena en el sujeto en el que se pretende utilizar terapéuticamente, no tiene ninguna actividad inmune u otra actividad funcional que pueda impedir el funcionamiento del producto o del sujeto en el que se administra el producto, y que puede ser reconocido por un anticuerpo conocido.

Los ejemplos se exponen para ayudar a comprender la invención pero no pretenden, y no deben interpretarse como limitantes de su alcance de ninguna manera. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en numerosas publicaciones.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquiera de los siguientes Ejemplos que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines comparativos.

Ejemplo 1: Generación del EGFRt y selección inmunomagnética de células T que expresan EGFRt

Materiales y métodos

Anticuerpos y citometría de flujo

Los controles de isotipo conjugados con FITC, PE y PerCP, anti-CD8 conjugados con PerCP, anti-CD4 conjugados con FITC, anti-IFNy conjugado con PE, anti-CD45 conjugado con PerCP y estreptavidina conjugada con PE se obtuvieron de BD Biosciences (San Jose, CA). El anti-Fc biotinilado se adquirió a través de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (Westgrove, PA). Anti-biotina conjugada con PE se adquirió a través de Miltenyi Biotec (Auburn, CA). EGF biotinilado se adquirió a través de Molecular Probes® Invitrogen (Carlsbad, CA). Anti-EGFR conjugado con PE se adquirió a través de Abcam Inc. (Cambridge, MA). Todos los anticuerpos y biotina-EGF se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La adquisición de datos de citometría de flujo se realizó en un FACScalibur (BD Biosciences), y el porcentaje de células en una región de análisis se calculó utilizando FCS Express V3 (De Novo Software, Los Ángeles, CA).

Para la generación de cetuximab biotinilado, se intercambió el regulador de 200 mg de cetuximab (Erbitux®) (19 horas) por PBS (D-PBS, pH 7,5 ± 0,1) utilizando un cartucho MidGee Hoop (UFP-30-E-H42LA) con 527 mL. El material con 2 mg/mL se modificó luego en una proporción de 20:1 utilizando Sulfo-NHS-LC-Biotina en una reacción que se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se diafiltró para eliminar el exceso de biotina. Se intercambió el regulador de 200 mg de cetuximab biotinilado (18 horas) por PBS (D-PBS, pH 7,5 ± 0,1) utilizando un cartucho MidGee Hoop (UFP-30-E-H42LA) con 533 mL. Se añadió glicerol hasta una concentración final del 20% y luego el material se congeló en viales.

Líneas celulares

A menos que se indique lo contrario, todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) suplementado con L-glutamina 2 mM (Irvine Scientific), ácido -2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico 25 mM (HEPES, Irvine Scientific), 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina (Irvine Scientific) y suero fetal de ternera al 10% inactivado por calor (FCS, Hyclone, Logan, UT), en lo sucesivo denominado como medio de cultivo (CM).

Para generar células T, se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a partir de sangre periférica heparinizada obtenida de donantes sanos que dieron su consentimiento que participan en un Protocolo aprobado por la Junta de Revisión Interna del Centro Médico Nacional City of Hope. Para la generación de la Línea A, se estimularon PBMC lavadas con 25 U/mL de IL-2 y una relación 1:1 (célula: perla) de Dynabeads® Human T expander CD3/CD28 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para la generación de otras líneas, se agotaron primero las PBMC lavadas con autoMACSMR usando perlas anti-CD45RA (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y en algunos casos también se agotaron con anti-CD4 conjugado con PE (BD Biosciences) con perlas anti-PE (Miltenyi Biotec). Las células resultantes se sometieron luego a la selección positiva con autoMACSMR utilizando DREG56 biotinilado (anti-CD62L) y perlas de anti-biotina (Miltenyi Biotec) para producir T^cm CD62L+CD45RO+ purificado. Las células CD8+ se seleccionaron adicionalmente en algunos casos utilizando AutoMACSMR (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se generaron células específicas para CMV mediante la estimulación de células T con 5 U/mL de rhIL-2 (Chiron, Emeryville, CA) y células presentadoras de antígeno viral irradiadas autólogas en una proporción de 4:1 (respondedor: estimulador) una vez a la semana durante tres semanas, usando suero humano al 10% en lugar de FCS para evitar la estimulación no específica. Las células presentadoras de antígeno viral se derivaron de PBMC que se habían modificado genéticamente para expresar el antígeno CMVpp65.

Las PBMC se resuspendieron en solución de nucleofección utilizando el kit nucleofector de células T humanas (Amaxa Inc., Gaithersburg, Md ), y se dividieron en partes alícuotas de 5 x 107 células en cubetas de 0,2 cm que contenían 10 |jg de HygroR-pp65_pEK (o pmaxGFP de Amaxa Inc., como control de transfección) en un volumen final de 100 jL/cubeta, y se sometió a electroporación usando el Nucleofector I de Amaxa (Amaxa Inc.), programa U-14, después de lo cual se les permitió a las células recuperarse durante 6 horas a 37°C. antes de la irradiación y (1200 cGy).

Los constructos lentivirales de CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7 (pJ02104) y CD19CAR-T2A-EGFRt-T2A-IMPDH2dm_epHIV7 (pJ02111) contienen a) las secuencias del receptor del antígeno quimérico (CAR) que consisten el los segmentos del génicos V^h y V^l del mAb, FnC63 específico de CD19, una bisagra C^h2-C^h3 de IgG1, los dominios de señalización transmembrana y citoplasmáticos de la molécula CD28 coestimuladora, y el dominio citoplasmático de la cadena CD3Z [10]; b) la secuencia T2A de autoescisión [11]; c) la secuencia de EGFR truncada (Véase Figura 1); y d) el doble mutante IMPDH2 que confiere resistencia a MPA, como se indicó. Se llevó a cabo la transducción lentiviral en células T que fueron estimuladas ya sea con 30 ng/mL de anti-CD3£ (OKT3; Ortho Biotech, Raritan, NJ) (es decir, para la Línea A) o con perlas CD3/CD28 Dynal humanas en una proporción 1:10 (es decir, para las líneas B, C, D y E) y 25 U de IL2/mL. Las células se cultivaron durante hasta 2 horas a 37°C en placas recubiertas con RetroNectin® (50 pg/mL) antes de la adición del lentivirus a un MOI de 3 y 5 pg/mL de polibreno. Después de 4 horas, se añadió medio caliente para triplicar su volumen, y luego las células se lavaron y se sembraron en placas en medio fresco después de 48 horas. Se llevó a cabo la clasificación con AutoMACSMR de células que expresan EGFRt con cetuximab biotinilado y microperlas anti-biotina (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expansión de las células T en medio de expansión rápida (REM) implicó la incubación de 106 células T con 30 ng/mL de anti-CD3£ (OKT3; Ortho Biotech, Raritan, NJ), 5 x 107 PBMC irradiadas con rayos gamma (3.500 cGy) y 107 LCL irradiados con y (8.000 cGy) en 50 mL de CM; con la adición de 50 U/mL de rhlL-2 y 10 ng/mL de rhIL-15 (CellGenix) cada 48 horas, a partir del día 1. Las células T se volvieron a estimular de esta manera cada 14 días.

Las líneas celulares linfoblastoides transformadas con EBV (LCL) se elaboraron a partir de PBMC como se describió previamente [13]. Las células LCL-OKT3 se generaron resuspendiendo LCL en solución de nucleofección utilizando el kit Nucleofector T de Amaxa, agregando el plásmido OKT3-2A-Higromicina_pEK (pJ01609) a razón de 5 pg/107 células, y se electroporaron las células utilizando el Nucleofector I de Amaxa, programa T-20. Se cultivaron las LCL OKT3-2A-Hygro_pEK resultantes (cJ03987) en CM que contenía 0,4 mg/mL de higromicina. La línea de mieloma de ratón NS0 (obsequio de Andrew Raubitschek, Centro Médico Nacional City of Hope, Duarte, CA) se resuspendió en solución de nucleofección utilizando el kit Nucleofector T (Amaxa Inc., Gaithersburg, MD), se añadió el plásmido CD19t-DHFRdm-2A-IL12_pEK (pJ01607) o GFP-IMPDH2dm-2A-IL15_pcDNA3.1(+) (pJ01043) a razón de 5 pg/5x106 células, y las células se sometieron a electroporación utilizando el Nucleofector I de Amaxa, programa T-27. Se cultivaron NS0-CD19t-DHFRdm-2A-IL12_pEK (cJ03935) y NS0-GFP:IMPDH2-IL15(IL2ss)_pcDNA3.1(+) (cJ02096) resultantes en DMEM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) suplementadas con FCS al 10% inactivado por calor, HEPES 25 mM y L-glutamina 2 mM en presencia ya sea de metotrexato 0,05 pM (MTX) o ácido micofenólico 6 pM (MPA). La cepa tumorigénica de U251, denominada U251T, fue un amable obsequio del Dr. Waldemar Debinski (Wake Forest, nC). Se generaron U251T-pp65 mediante transducción lentiviral de U251T con pp65-2A-eGFP-ffluc_epHIV7 (pj01928) a un MOI de 1. La U251T-pp65-2A-eGFP-ffluc_epHIV7 resultante se clasificó por FACS para la población GFP+ ( cJ05058). La línea de linfoma Daudi se adquirió a través de ATCC y se cultivó en medios que consiste en RPMI 1640 (Irvine Scientific), L-glutamina 2 mM (Irvine Scientific), FCS al 10% inactivado por calor (Hyclone). Se adquirieron células de leucemia linfoblástica aguda SupB15 y células de carcinoma epidermoide A431 a través de ATCC.

Análisis de proteínas

Se lisaron células (hasta 107 con 80 pL de regulador de lisis, Triton-X al 1% que contenía el cóctel II inhibidor de fosfatasa (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) (1:20 de inhibidor con respecto al regulador en volumen). Se cargaron 50 pg de proteína en cada carril, y se examinaron transferencias de Western con anticuerpos del kit muestreador de anticuerpos del receptor Phospho-EGF (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) seguido por anticuerpos anti­ conejo de cabra (LI-COR, Lincoln, NE) conjugados con IRDyeMR 680CW o 800CW, así como el anticuerpo anti-betaactina (LI-COR) conjugado con IRDyeMR 800 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes de las transferencias en el sistema de formación de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR). Ensayos de liberación de cromo

La actividad citolítica de las células T se determinó mediante un ensayo de liberación de cromo (CRA) de 4 horas, donde las células efectoras se sembraron en pozos por triplicado de microplacas de 96 pozos con fondo en V que contienen 5x103 células T objetivo marcadas con 51Cr (Na²51CrO⁴; (5 mCi/mL); Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) en diversas relaciones E:T en 200 pL de CM e incubadas durante 4 horas con 5% de CO², 37°C. Las placas se centrifugaron y se removieron 100 pL de sobrenadante de cada pozo para evaluar la liberación de cromo utilizando un contador y (Packard Cobra II, Downer's Grove, IL). El porcentaje específico de lisis se calculó de la siguiente manera: 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). La liberación máxima se determinó midiendo el contenido de 51Cr de los pozos que contenían objetivos etiquetados lisados con SDS al 2%.

La citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos se determinó mediante la liberación de cromo como se indicó anteriormente utilizando 5x103 células T objetivo marcadas con 51Cr que se habían preincubado durante 90 minutos con hasta 10 pg/mL de cetuximab o rituximab (un mAb específico de CD20), se lavaron y luego se incubaron conjuntamente con 5x105 PBMC recién aisladas.

Injerto de células T y suicidio mediado por cetuximab in vivo

Para el injerto de células T, se inyectaron ratones NOD/ScidIL-2RYCnuN de seis a diez semanas de edad en forma i.v. en el día 0 con 107 células T (línea C). Se administran 2x107 células irradiadas NS0-GFP:IMPDH2-IL15 (IL2ss)_pcDNA3.1(+) (cJ02096) irradiadas (8000 rads) en forma i.p. 3 veces a la semana a partir del día 0 para proporcionar un suministro sistémico de IL-15 in vivo. Se extrajo médula ósea de animales sacrificados y se analizó mediante citometría de flujo. Se realizan ensayos de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos para determinar la actividad de cetuximab contra células T EGFRt+.

Resultados

Selección inmunomagnética de células T que expresan EGFRt

Se generó un EGFR humano truncado (EGFRt), que contiene solo el dominio transmembrana y los dominios extracelulares III y IV del EGFR de longitud completa, como un epítopo de selección no inmunogénico compatible con la selección inmunomagnética. Como se muestra en el modelo molecular de la Figura 1, el EGFRt conserva la capacidad de unirse a cetuximab, pero no tiene ninguna capacidad de señalización debido a la ausencia de los dominios intracelulares. Además, carece del dominio del terminal N requerido para la unión a EGF.

Para seleccionar inmunomagnéticamente las células que expresan EGFRt, se generó cetuximab biotinilado (Figura 2a, b) que se usa junto con microperlas anti-biotina comercialmente disponibles y un separador AutoMACSMR (Miltenyi Biotec) (Figura 2c). La transducción lentiviral de varias líneas de células T con constructos que contienen EGFRt, donde el gen del EGFRt se separó de otros genes de interés en uno o ambos extremos con la secuencia T2A de autoescisión, dio como resultado la detección en la superficie de la molécula EGFRt en menos del 40% de las células (Figura 2d). La detección en la superficie también se puede lograr con una fusión EGFRt-sr39TK. La selección inmunomagnética permitió la recuperación de poblaciones de células T EGFRt+ con una pureza superior al 90%. Las poblaciones de células T que se sometieron a este procedimiento de transducción y selección incluyeron blastos de células T estimulados con perlas anti-CD3/anti-CD28 (para la línea A), las células T derivadas de memoria central (T^cm CD45RO+CD62L+) (para las líneas B, C y E), que en algunos casos también fueron preseleccionados para la especificidad de CMV (a través del TCR endógeno; para la Línea B) o la expresión de CD8 (para la Línea C), así como células T derivadas de la memoria efectora (T^em CD62L- CD45RO+) (para la línea D). Estos datos muestran que EGFRt se puede usar con éxito como un marcador de selección para varias fuentes de transductores de células T, incluso cuando la eficiencia de la transducción original fue tan baja como un 2%.

Inactividad del EGFRt en células T seleccionadas

Para confirmar que EGFRt es inactivo, se llevaron a cabo análisis de inmunotransferencia Western para fosforilación del EGFR en las células T seleccionadas con EGFRt después de cultivo con EGF o cetuximab. Como se esperaba, cetuximab no indujo fosforilación del EGFR por encima del fondo, incluso en la línea celular A431 EGFR+ (Figura 3a). Además, a diferencia de lo que se observa con las células A431, no se observó fosforilación en lisados de la Línea A después de incubación conjunta con EGF. En realidad, al utilizar EGF biotinilado, el análisis de citometría de flujo confirmó que EGF no puede unirse a células T seleccionadas con EGFRt (Figura 3b), como se esperaba debido al truncamiento en su extremo terminal N. Estas células T EGFRt tampoco fueron reconocidas por otro anticuerpo anti-EGFR distinto de cetuximab.

Mantenimiento del fenotipo efector en células T EGFRt+CD19CAR+ expandidas

Directamente después de la separación de AutoMACSMR, las células T seleccionadas se expandieron 30 veces o más dentro de los 12 días posteriores a la estimulación con REM con OKT3, alimentadores de PBMC irradiados y LCL, IL-2 e IL-15 (Figura 4a). El análisis de citometría de flujo de las células T EGFRt+ expandidas resultantes confirmó además que expresan los marcadores de células T y CD19CAR, tales como CD8, TCR, CD3, perforina, granzima, etc. (Figura 4b). Además, la actividad citotóxica dirigida por CD19CAR de estas líneas seleccionadas por EGFRt es evidente en los ensayos de liberación de cromo que utilizan objetivos tumorales que expresan CD19 (Figura 4c). Una comparación directa de la reactividad específica de CD19 de la Línea E frente a sus contrapartes no seleccionada o "parental" muestra que existe citotoxicidad mejorada mediada por CD19CAR tras la selección con EGFRt. Además, las células de la Línea B CD19CAR+EGFRt+ derivadas de T^cm específicas de CMV también muestran actividad citotóxica a través de su receptor de células T endógeno contra objetivos que expresan antígeno CMV-pp65.

Para la línea E de CD19CAR+EGFRt+IMPDH2dm+, la capacidad del mutante doble de inosina monofosfato deshidrogenasa 2 (IMPDH2dm) para conferir resistencia al ácido micofenólico inhibidor de IMPDH2 (MPA; un inmunosupresor común utilizado para prevenir el rechazo en el trasplante de órganos) también fue probado. Tras el cultivo en MPA 1 pM, la supervivencia y/o proliferación de células de Línea E no se inhibe (Figura 4d). Esto contrasta con la inhibición observada con una línea de células T de control que carece de expresión del gen de IMPDH2dn. Estos datos proporcionan evidencia adicional de que la selección mediada por EGFRt da como resultado la correspondiente la selección de los otros genes presentes en el constructo lentiviral utilizado para transducir células T.

Seguimiento de células T EGFRt+ in vivo

Para probar el potencial para detectar células T injertadas in vivo, se analizaron las células de médula ósea recolectadas de ratones que se habían injertado con la Línea C CD19CAR+EGFRt+ mediante citometría de flujo utilizando cetuximab biotinilado (Figura 5). Los ratones de control que no recibieron células T revelaron que hubo alguna reacción cruzada del cetuximab contra EGFR murino. Por lo tanto, se determinó que la detección exitosa de células de Línea C injertadas requería doble tinción tanto para CD45 humano como para EGFRt. Las células también pueden analizarse utilizando inmunohistoquímica para determinar el potencial para seleccionar material de biopsia.

Citotoxicidad mediada por cetuximab de células T EGFRt+

Debido a que se sabe que cetuximab lisan las células que expresan EGFR a través de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), se realizaron ensayos para determinar la actividad de ADCC de cetuximab contra las células T EGFRt+ (Figura 6). Utilizando células de Línea A marcadas con 51Cr como PBMC humanas seleccionadas y recién aisladas como efectoras, se encontró que cetuximab media significativamente la liberación de cromo por encima de lo observado cuando se usa el mAb Rituxan humanizado específico de CD20.

Ejemplo de uso terapéutico de células T EGFRt+

Los sujetos adultos con linfomas de células p de grado intermedio de alto riesgo que son candidatos para un procedimiento de trasplante de células madre mieloablativo autólogo pueden recibir inmunoterapia posterior al trasplante con Injertos de células T CD19R+CD8+EGFRt+ derivadas de Tcm autólogo transferido de forma adoptiva. Un producto de leucaféresis recolectado de cada paciente se somete a selección de Tcm, transducción con CD19CART2A-EGFRt_epHIV7, grado clínico y luego selección y expansión de células EGFRt+ en un sistema cerrado. Una vez que los productos celulares resultantes se han sometido a pruebas de control de calidad (incluidas las pruebas de esterilidad y citotoxicidad específica de tumores), se someten a crioconservación. Mientras tanto, después de la leucaféresis, los participantes del estudio comienzan con quimioterapia de rescate estándar, con movilización para la recolección automática de HSC con quimioterapia citorreductora y G-CSF. Dado que las células T específicas para CD19 seleccionadas con EGFRt también atacaran células B CD20+ (CD19+) normales, se puede disminuir primero el número de células B usando RituximabMR para reducir la respuesta inflamatoria del receptor para recibir CTL modificado genéticamente y también aumentar la disponibilidad de células T infundidas para atacar inmediatamente las células del linfoma. Además, RituximabMR puede mitigar una respuesta inmune humoral contra las células T modificadas genéticamente. Si RituximabMR no se administra como parte del régimen de quimioterapia de Salvación/Cebado, los participantes en la investigación pueden recibir una única infusión intravenosa de RituximabMR (anticuerpo anti-CD20 quimérico) con 375 mg/m2 dentro de las 4 semanas del procedimiento auto-HSCT planeado. La infusión de RituximabMR se llevaría a cabo de acuerdo con la práctica estándar, incluida la medicación previa con difenhidramina y acetaminofén e hidrocortisona. El día 2 o el día 3 después de HSCT, el producto de las células T CD19R+ CD8+ criopreservado en forma autóloga se transportará, descongelará e infundirá al lado de la cama del paciente. Los participantes en la investigación pueden ser previamente medicados al menos 30 minutos antes de la infusión de células T con 15 mg/kg de acetaminofén P.O. (máximo 650 mg) y difenhidramina 0,5-1 mg/kg en forma i.v. (dosis máxima 50 mg). Los estudios clínicos y de laboratorio correlativos de seguimiento pueden realizarse luego a discreción del médico, y pueden incluir estudios de RT-PCR cuantitativa para la presencia de células de linfoma que expresan CD19 y/o células T transferidas de forma adoptiva; barridos de FDG-PET y/o CT; examen de médula ósea para evaluación patológica específica de la enfermedad; biopsia de ganglio linfático; y/o seguimiento a largo plazo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Asesor de Modificadores de Respuesta Biológica de la FDA que se aplican a los estudios de transferencia de genes. La Figura 10 proporciona un posible esquema para las pruebas clínicas de los productos y métodos actuales.

Referencias

1. Berger, C, Flowers, ME, Warren, EH, y Riddell, SR (2006). Analysis of transgene-specific immune responses that limit the in vivo persistence of adoptively transferred HSV-TK-modified donor T cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood 107: 2294-302.

2. Tey, SK, Dotti, G, Rooney, CM, Heslop, HE, y Brenner, MK (2007). Inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of allodepleted T cells after haploidentical stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 13: 913-24.

3. Fehse, B, Richters, A, Putimtseva-Scharf, K, Klump, H, Li, Z, Ostertag, W, et al. (2000). CD34 splice variant: an attractive marker for selection of gene-modified cells. Mol Ther 1: 448-56.

4. Gaines, P, y Wojchowski, DM (1999). pIRES-CD4t, a dicistronic expression vector for MACS- or FACS-based selection of transfected cells. Biotechniques 26: 683-8.

5. Fehse, B, Uhde, A, Fehse, N, Eckert, HG, Clausen, J, Ruger, R, et al. (1997). Selective immunoaffinity-based enrichment of CD34+ cells transduced with retroviral vectors containing an intracytoplasmatically truncated version of the human low-affinity nerve growth factor receptor (deltaLNGFR) gene. Hum Gene Ther 8: 1815-24.

6. Lemoine, FM, Mesel-Lemoine, M, Cherai, M, Gallot, G, Vie, H, Leclercq, V, et al. (2004). Efficient transduction and selection of human T-lymphocytes with bicistronic Thy1/HSV1-TK retroviral vector produced by a human packaging cell line. J Gene Med 6: 374-86.

7. Li, S, Schmitz, KR, Jeffrey, PD, Wiltzius, JJ, Kussie, P, y Ferguson, KM (2005). Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell 7: 301-11.

8. Dawson, JP, Berger, MB, Lin, CC, Schlessinger, J, Lemmon, MA, y Ferguson, KM (2005). Epidermal growth factor receptor dimerization and activation require ligand-induced conformational changes in the dimer interface. Mol Cell Biol 25: 7734-42.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para seleccionar células T transducidas que comprende:

(a) transducir una población de células T con un gen modificado del EGFR, que consiste en una secuencia que codifica un EGFR truncada que consiste en el dominio III del EGFR, el dominio transmembrana del EGFR y el dominio IV del EGFR; y

(b) enriquecer la población de células T transducidas seleccionando las células transducidas con éxito con un anticuerpo monoclonal anti-EGFR.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el gen modificado del EGFR está unido a una secuencia de nucleótidos que codifica únicamente la secuencia señal de la cadena alfa de GMCSFR.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen modificado del EGFR es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 3.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen modificado del EGFR consiste en la SEQ ID NO: 3.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el gen modificado del EGFR está acoplado con una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico específico para un antígeno asociado a tumor, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico específico para un antígeno asociado a tumor es seguida por una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador escindible 2A del terminal C y la secuencia de codificación para el gen modificado del EGFR.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor del antígeno quimérico específico para un antígeno asociado a tumor se selecciona entre CD19, CD20, y CD22.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el antígeno asociado a tumor es CD19.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab, matuzumab, necitumumab o panitumumab.