BRPI0914780A2 - genes de toxina e métodos para uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

GENES DE TOXINA E MÉTODOS PARA USO DOS MESMOS A presente invenção refere-se a composições e a métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. São fornecidas composições que compreendem uma sequência codificadora de um polipeptídeo de delta-endotoxina. As sequências codificadoras podem ser utilizadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para a transformação e a expressão em plantas e bactérias. As composições compreendem ainda bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformados. Em particular, são fornecidas moléculas de ácidos nucleicos de delta-endotoxina isoladas. Adicionalmente, são abrangidas as sequências de aminoácidos que correspondem aos polinucleotídeos e os anticorpos que se ligam especificamente a tais sequências de aminoácidos. Em particular, a presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucleicos isoladas que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 61-121 e 133-141 ou a sequência de nucleotídeos apresentada nas SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283, bem como variantes e fragmentos das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES DE TOXINA E MÉTODOS PARA USO DOS MESMOS".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular. — São fornecidos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Estas prote- Ínas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são ú- teis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas 5 transgênicas resistentes a pragas.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO " 10 Bacillus thuringiensis é uma bactéria do solo formadora de espo- ros Gram-positiva caracterizada por sua capacidade de produzir inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de insetos, mas são inofensivas para as plantas e outros organismos são dire- cionados. Por esta razão, composições que incluem cepas de Bacillus thu- ringiensis ou suas proteínas inseticidas podem ser utilizadas como insetici- das ambientalmente aceitáveis para controlar pragas de insetos agrícolas ou vetores de insetos para uma variedade de doenças humanas ou de animais. As proteínas em cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thu- ringiensis possuem atividade inseticida potente contra predominantemente larvas de Lepidópteros, Dípteros e Coleópteros. Estas proteínas também exibiram atividade contra as ordens de pragas Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga e Acari, bem como outras ordens de invertebrados tais como Nemathelminthes, Platyhelminthes e Sarcomastigorphora (Feitel- son (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas foram clas- sificadas originalmente como Cryl até CryV com base primariamente em sua atividade inseticida. As classes principais eram específicas a Lepidoptera (1), específicas a Lepidoptera e a Diptera (Il), específicas a Coleoptera (Ill), es- pecíficas a Diptera (IV) e específicas a nematoides (V) e (VI). As proteínas foram adicionalmente classificadas em subfamílias; as proteínas mais alta- mente relacionadas dentro de cada família receberam letras divisionais tais como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. Proteínas ainda mais intimamente relacio-

. 2 nadas dentro de cada divisão receberam nomes tais como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Uma nova nomenclatura foi descrita recentemente para os ge- nes Cry com base na homologia de sequências de aminoácidos ao invés da especificidade ao inseto-alvo (Crickmore e outros (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). Na nova classificação, cada toxina recebe um nome único que incorpora uma classe primária (um número arábico), uma classe secun- . dária (uma letra maiúscula), uma classe terciária (uma letra minúscula) e uma classe quaternária (outro número arábico). Na nova classificação, nú- ' 10 meros romanos foram trocados por número arábicos na classe primária. As proteínas com menos que 45% de identidade de sequência possuem clas- ses primárias diferentes e os critérios para as classes secundárias e terciá- rias são 78% e 95%, respectivamente.

A proteína em cristal não exibe atividade inseticida até ser inge- ridae solubilizada no intestino médio do inseto. A pró-toxina ingerida é hidro- lisada por proteases no trato digestivo dos insetos em uma molécula tóxica ativa. (Hófte e Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se liga aos receptores de borda de microvilosidades apicais no intestino médio da larva alvo e se insere dentro da membrana apical criando canais iônicos ouporos, resultando na morte da larva.

As delta-endotoxinas possuem geralmente cinco domínios de sequências conservados e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd e outros (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primei- ro domínio estrutural conservado consiste em sete alfa hélices e está envol- vidonainserçãona membrana e na formação de poros. O domínio ll consis- te em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave grega e o domínio Il! consiste em duas folhas beta antiparalelas na formação "jelly-roll" (de Maagd e outros, 2001, supra). Os domínios || e Ill estão envolvidos no reconhecimento e na ligação de receptores e são, portanto, considerados determinantes da especificidade da toxina.

O uso intensivo de inseticidas à base de B. thuringiensis já deu origem à resistência em populações de campo da traça do gênero Scythro-

: 3 pia, Plutella xylostella (Ferré e Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501- 533). O mecanismo mais comum de resistência é a redução da ligação da toxina com seu(s) receptor(es) no intestino médio específico(s). Isto também pode conferir resistência cruzada a outras toxinas que compartilham o mes- moreceptor (Ferré e Van Rie (2002)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO As composições e os métodos para conferir pragas resistentes a - bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes são fornecidos. As composições incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam sequên- 7 10 cias para polipeptídeos de delta-endotoxina, vetores que compreendem tais moléculas de ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem os vetores. As composições incluem ainda as sequências polipeptídicas da en- dotoxina e anticorpos para tais polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser utilizadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para a transformação e a expressão em organismos, incluindo micro-organismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos podem ser se- quências sintéticas que foram planejadas para a expressão no organismo que inclui, mas não está limitado a um micro-organismo ou uma planta. As composições compreendem ainda bactérias, plantas, células vegetais, teci- dosesementes transformados.

Em particular, são fornecidas moléculas de ácidos nucleicos iso- ladas que correspondem às sequências de ácidos nucleicos da delta- endotoxina. Adicionalmente, são abrangidas as sequências de aminoácidos que correspondem aos polinucleotídeos. Em particular, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma se- quência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141 ou uma sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60 e 124- 132, bem como variantes e fragmentos das mesmas. As sequências de nu- —cleotídeos que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da invenção ou que se hibridizam com uma sequência da invenção também são abrangidas.

. 4 As composições e os métodos da invenção são úteis para a pro- dução de organismos com resistência a pesticidas, especificamente bacté- rias e plantas. Estes organismos e composições derivadas dos mesmos são desejáveis para as finalidades agrícolas. As composições da invenção tam- bémsão úteis para gerar proteínas de delta-endotoxina alteradas ou melho- radas que possuem atividade pesticida ou para a detecção da presença de proteínas ou ácidos nucleicos de deita-endotoxina nos produtos ou nos or- « ganismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA 7 10 A presente invenção retrata composições e métodos para a re- gulação da resistência a pragas em organismos, particularmente plantas ou células vegetais. Os métodos envolvem a transformação de organismos com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de delta- endotoxina da invenção. Em particular, as sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para a preparação de plantas e micro-organismos que possuem atividade pesticida. Assim, são fornecidas as bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformados. As composi- ções são ácidos nucleicos e proteínas da delta-endotoxina de Bacillus thu- ringiensis. As sequências encontram uso na construção de vetores de ex- pressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes da delta-endotoxina e para a produção de proteínas pesticidas alteradas através de métodos conheci- dos na técnica, tais como permuta de domínios ou embaralhamento de DNA. As proteínas encontram uso no controle e na morte de populações de pra- gas de lepidópteros, coleópteros e nematoides e para a produção de com- posições com atividade pesticida. Por "delta-endotoxina" é pretendida uma toxina proveniente de Bacillus thuringiensis que possui atividade tóxica contra uma ou mais pra- gas, incluindo, mas não limitadas a, membros das ordens Lepidoptera, Dip- terae Coleoptera ou membros do filo Nematoda ou uma proteína que possui homologia a tal proteína. Em alguns casos, as proteínas de delta-endotoxina foram isoladas de outros organismos, incluindo Clostridium bifermentans e

. 5 Paenibacillus popilliae. As proteínas de delta-endotoxina incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de nucleotídeos de comprimento completo divulgadas aqui e das sequências de aminoácidos que são mais curtas que as sequências de comprimento completo, devido ao uso de um sítio de início a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que possui atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo no qual a proteina é expressa ou na praga após - a ingestão da proteína. As delta-endotoxinas incluem proteínas identificadas como cry1 ' 10 até cry43, cyt1 e cyt2 e toxina similar a Cyt. Há atualmente mais de 250 es- pécies conhecidas de delta-endotoxinas com uma faixa ampla de especifici- dades e toxicidades. Para uma lista extensa ver Crickmore e outros (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813 e para atualizações regulares ver Crickmore e outros (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenciature", em www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.

São fornecidas aqui novas sequências de nucleotídeos isoladas que conferem atividade pesticida. Também são fornecidas as sequências de aminoácidos das proteínas de delta-endotoxina. A proteína que resulta da tradução deste gene permite que as células controlem ou matem as pragas queaingere. Moléculas de Ácidos Nucleicos Isoladas e Variantes e Fragmentos das Mesmas Um aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácidos nuclei- cos isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de nucleotí- deos que codificam proteínas e polipeptídeos de delta-endotoxina ou por- ções biologicamente ativas dos mesmos, bem como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para uso como sondas de hibridização para a identifi- cação de ácidos nucleicos que codificam a delta-endotoxina. Como utilizado aqui, é pretendido que o termo "molécula de ácido nucleico" inclua molécu- Jlasde DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou do RNA gerado utilizando análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico

. 6 pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.

Uma molécula de ácido nucleico ou proteína "isolada" ou "purifi- cada" ou uma porção biologicamente ativa da mesma está substancialmente livrede outro material celular ou meio de cultura quando produzida através de técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores quími- cos ou outros reagentes químicos quando sintetizada quimicamente.

Prefe- - rencialmente, um ácido nucleico "isolado" está livre de sequências (prefe- rencialmente sequências que codificam proteínas) que flanqueiam natural- , 10 menteo ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades a 5' e a 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado.

Para as finalidades da invenção, "isolada(s)" quando utilizado para se referir a moléculas de ácidos nucleicos exclui cromossomos isolados.

Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica a delta-endotoxina isolada pode conter menos que aproxima- damente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nu- cleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado.

Uma proteína de delta-endotoxina que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína que possuem menos que aproximadamente 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não delta-endotoxina (também referida aqui como uma "proteína contaminante"). As sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas da presente invenção incluem a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 1-60 e 124-132 e variantes, fragmentos e complementos das mesmas.

Por "com- plemento" pretende-se uma sequência de nucleotídeos que é suficientemen- te complementar a certa sequência de nucleotídeos de forma que possa se hibridizar com a sequência de nucleotídeos fornecida para formar assim um dúplex estável.

A sequência de aminoácidos correspondente da proteína de delta-endotoxina codificada por esta sequência de nucleotídeos é apresen- tada nas SEQ ID NO: 61-121 e 133-141. As moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos destas

. 7 sequências de nucleotídeos que codificam a delta-endotoxina também são abrangidas pela presente invenção.

Por "fragmento" é pretendida uma parte da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de delta- endotoxina.

Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína de delta-endotoxina ou pode ser um fragmento que pode ser utilizado como uma sonda de hibridiza- ção ou um iniciador da PCR utilizando métodos divulgados a seguir.

As mo- - léculas de ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência de nu- cleotídeos de delta-endotoxina compreendem pelo menos aproximadamente ' 10 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350 nucleotídeos contíguos ou atéo número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos que codifica delta-endotoxina de comprimento completo divulgada aqui de- pendendo do uso pretendido.

Por nucleotídeos "contíguos" pretendem-se resíduos de nucleotídeos que ficam imediatamente adjacentes um ao outro.

Os fragmentos das sequências de nucleotídeos da presente invenção codifi- carão fragmentos de proteínas que mantêm a atividade biológica da proteína de delta-endotoxina e, consequentemente, mantêm a atividade pesticida.

Por "mantém a atividade" pretende-se que o fragmento terá pelo menos a- proximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos a- proximadamente 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteina de delta-endotoxina.

Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica.

Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J.

Econ.

Entomol. 83:2480-2485; Andrews e outros (1988) Biochem.

J. 252:199-206; Marrone e outros (1985) J. of Economic Entomology 78:290- 293; e Patente U.S.

Nº 5.743.477, dos quais todos são incorporados aqui comoreferência em sua totalidade.

Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos que codifica delta-endotoxina que codifica uma porção biologicamente ativa de uma pro-

. 8 teina da invenção codificará pelo menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína de delta- endotoxinade comprimento completo da invenção.

As proteínas de delta-endotoxina preferidas da presente inven- ção são codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficientemente i- - dêntica à sequência de nucleotídeos das SEQ ID NO: 1-60 e 124-132. Por "suficientemente idêntica" pretende-se uma sequência de aminoácidos ou de , 10 nucleotídeos que possui pelo menos aproximadamente 60% ou 65% de i- dentidade de sequência, aproximadamente 70% ou 75% de identidade de sequência, aproximadamente 80% ou 85% de identidade de sequência, a- proximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade de sequência maior comparada com uma sequência de referência utilizando um dos programas de alinhamento descritos aqui utilizando parâ- metros padronizados. Um versado na técnica reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade corres- pondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos le- vando em consideração a degeneração do código, a similaridade dos ami- —noácidos,o posicionamento do quadro de leitura e similar.

Para determinar a porcentagem de identidade de duas sequên- cias de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinha- das com a finalidade de comparação ótima. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, porcentagem de identidade = nú- mero de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências possuem o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a comparação é realizada ao longo da totalidade da sequência de referência (por exemplo, ao longo da totalidade de uma das SEQ ID NO: 1-60 e 124-132 ou ao longo da totalidade de uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141). A porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas similares às

. 9 descritas abaixo, com ou sem a permissão de espaços ("gaps"). No cálculo da porcentagem de identidade, tipicamente são contadas as combinações exatas.

A determinação de porcentagem de identidade entre duas se- — quências pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático. Um exem- plo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. A- - cad. Sci. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos progra- ] 10 mas BLASTN e BLASTX de Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403.

As buscas de nucleotídeos com BLAST podem ser realizadas com o pro- grama BLASTN, escore = 100, comprimento de palavra = 12, para a obten- ção de sequências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácidos nucle- icos similares à delta-endotoxina da invenção. As buscas de proteínas com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, escore = 50, com- primento de palavra = 3, para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína de delta-endotoxina da invenção. Para a obtenção de alinhamentos com espaços com a finalidade de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Alts- chule outros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, o PSI- Blast pode ser utilizado para realizar uma busca repetida que detecta rela- ções distantes entre as moléculas. Ver Altschul e outros (1997) supra.

Quando os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast são utilizados, os parâmetros pré-estabelecidos dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser utilizados. O alinhamento também pode ser realizado de forma manual por inspeção.

Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utiliza- do para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins e ou- tros (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequên- ciase alinhaa totalidade da sequência de aminoácidos ou de DNA e assim pode fornecer dados em relação à conservação de sequência da sequência de aminoácidos inteira. O algoritmo ClustalW é utilizado em vários pacotes

. 10 de software para análise de DNA/aminoácidos disponíveis comercialmente, tais como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corpo- ration, Carisbad, CA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, a porcentagem de identidade de aminoácidos pode ser avali- ada Um exemplo não limitante de um programa de software útil para a aná- lise de alinhamentos com ClustaW é GENEDOCO. GENEDOCG (Karl Ni- Cholas) permite a avaliação da similaridade ou da identidade de aminoácidos - (ou DNA) entre várias proteínas. Outro exemplo não limitante de um algorit- mo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de ' 10 Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo é incorporado no pro- grama ALIGN (versão 2.0), que faz parte do GCG Wisconsin Genetics Soft- ware Package, Versão 10 (disponível na Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Quando o programa ALIGN é utilizado para a compa- ração das sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAMI120, uma penalidade de comprimento de espaço de 12 e uma penali- dade de espaço de 4 podem ser utilizadas.

A não ser que seja relatado de outra maneira, GAP Versão 10, que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, será utilizado para determinar a identidade ou a similaridade de sequência utilizando os parâmetros a seguir: % de identidade e % de si- milaridade para uma sequência de nucleotídeos utilizando Peso de Espaço de 50 e Peso de Comprimento de 3 e a matriz de classificação nvsgapd- na.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de ami- noácidos utilizando Peso de Espaço de 8 e Peso de Comprimento de 2e o programa de classificação BLOSUM62. Programas equivalentes também podem ser utilizados. Por "programa equivalente" pretende-se qualquer pro- grama de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que possui combinações de resíduos de nucleotídeos idênticas e uma porcentagem de identidade de sequências i- dêntica quando comparado com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10. A invenção abrange ainda moléculas de ácidos nucleicos variantes. "Variantes" das sequências de nucleotídeos que codificam a delta-

. 1 endotoxina incluem aquelas sequências que codificam as proteínas de delta- endotoxina divulgadas aqui, mas que diferem de forma conservativa por causa da degeneração do código genético bem como aquelas que são sufi- cientemente idênticas às discutidas anteriormente.

Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como reação em cadeia da polime- rase (PCR) e técnicas de hibridização que são descritas abaixo.

As sequên- - cias de nucleotídeos variantes incluem ainda sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que foram geradas, por exemplo, através da utili- ' 10 zaçãode mutagênese direcionada ao sítio, mas que ainda codificam as pro- teínas de delta-endotoxina divulgadas na presente invenção como discutido abaixo.

As proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biolo- gicamente ativas, isto é, continuam possuindo a atividade biológica desejada da proteína nativa, isto é, mantendo a atividade pesticida.

Por "mantém a atividade" pretende-se que a variante terá pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 70% ou pelo menos aproximadamente 80% da atividade pesticida da proteí- na nativa.

Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na arte.

Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J.

Econ.

Entomol. 83: 2480- 2485; Andrews e outros (1988) Biochem.

J. 252:199-206; Marrone e outros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente U.S.

Nº 5.743.477,

dos quais todos são incorporados aqui como referência em sua totalidade.

O versado na técnica considerará ainda que modificações po- dem ser introduzidas através da mutação das sequências de nucleotídeos da invenção levando assim a modificações na sequência de aminoácidos das proteínas de delta-endotoxina codificadas, sem alterar a atividade bioló- gica das proteínas.

Assim, podem ser criadas moléculas de ácidos nucleicos variantes isoladas através da introdução de uma ou mais substituições, adi- ções ou deleções de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos correspon- dente divulgada aqui, de forma que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos são introduzidas na proteína codificada.

Mutações podem ser introduzidas através de técnicas padronizadas, tais como muta-

. 12 gênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Tais sequên- cias de nucleotídeos variantes são também abrangidas pela presente inven- ção.

Por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos po- dem ser realizadas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado partindo da sequência do tipo selvagem de uma proteína de del- . ta-endotoxina sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substi- ' 10 tuição conservativa de aminoácidos" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias late- rais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadei- as laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exem- plo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, tripto- fano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, iso- leucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

As delta-endotoxinas geralmente possuem cinco domínios de sequência conservados e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd e outros (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primei —rodomínio estrutural conservado consiste em sete alfa hélices e está envol- vido na inserção de membrana e na formação de poros. O domínio Il consis- te em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave grega e o domínio Ill consiste em duas folhas beta antiparalelas na formação "jelly-roll" (de Maagd e outros, 2001, supra). Os domínios || e Ill estão envolvidos no reconhecimento e na ligação com o receptor e são, portanto, considerados determinantes da especificidade da toxina.

As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões

. 13 não conservadas que mantêm a função. Em geral, tais substituições não : seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados ou para resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Os exemplos de resí- — duos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento das sequências de aminoácidos da - presente invenção e sequências de delta-endotoxina conhecidas. Os exem- plos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substitui ' 10 ções conservativas de aminoácidos e ainda mantêm a atividade incluem, por exemplo, resíduos que possuem apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento das sequências de aminoá- cidos da presente invenção e sequências de delta-endotoxina conhecidas.

Entretanto, um versado na técnica entenderia que variantes funcionais po- demter alterações conservadas ou não conservadas menos importantes nos resíduos conservados.

Alternativamente, as sequências de nucleotídeos variantes po- dem ser produzidas através da introdução de mutações de forma aleatória ao longo de toda ou de parte da sequência codificadora, tal como através de mutagênese por saturação e os mutantes resultantes podem ser verificados em relação à capacidade de conferir atividade de delta-endotoxina para a identificação de mutantes que mantêm atividade. Após a mutagênese, a pro- teína codificada pode ser expressa de forma recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada utilizando técnicas de ensaio padronizadas.

Utilizando métodos tal como a PCR, a hibridização e as sequên- cias de delta-endotoxina correspondentes similares podem ser identificadas, tais sequências possuindo identidade substancial com as sequências da in- venção. Ver, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har- bor, NY) e Innís, e outros (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

Em um método de hibridização, toda ou parte da sequência de

: 14 nucleotídeos de delta-endotoxina pode ser utilizada para verificar bibliotecas de cDNA ou genômicas. Os métodos para a construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são divulga- dos em Sambrook e Russell, 2001, supra. As assim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo que pode ser detectado tal como *?P ou qualquer outro marcador - que pode ser detectado, tal como outros radioisótopos, um composto fluo- rescente, uma enzima ou um cofator de enzima. As sondas para hibridização : 10 podem ser produzidas através da marcação de oligonucleotídeos sintéticos baseada na sequência de nucleotídeos que codifica a delta-endotoxina co- nhecida divulgada aqui. Os iniciadores degenerados planejados com base nos resíduos de nucleotídeos ou de aminoácidos conservados na sequência de nucleotídeos ou na sequência de aminoácidos codificada podem ser adi- cionalmente utilizados. A sonda compreende tipicamente uma região de se- quência de nucleotídeos que se hibridiza sob condições estringentes com pelo menos aproximadamente 12, pelo menos aproximadamente 25, pelo menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ou 400 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos que codifica a delta-endotoxina da invenção ou um fragmento ou um variante da mesma. Os métodos para a preparação de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook e Russell, 2001, su- pra incorporados aqui por referência.

Por exemplo, uma sequência de delta-endotoxina inteira divul- —gada aquiou uma ou mais porções da mesma, pode ser utilizada como uma sonda capaz de se hibridizar especificamente com as sequências similares à delta-endotoxina correspondentes e os RNAs mensageiros. Para atingir a hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas inclu- em sequências que são únicas e possuem preferencialmente pelo menos aproximadamente 10 nucleotídeos de comprimento ou pelo menos aproxi- madamente 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser utili- zadas para amplificar sequências de delta-endotoxina correspondentes de

. 15 um organismo escolhido através de PCR. Esta técnica pode ser utilizada para isolar sequências codificadoras adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequên- cias codificadoras em um organismo. As técnicas de hibridização incluem a verificação da hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S- - pring Harbor, New York).

A hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condi- Ú 10 ções estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridiza- ção estringentes" pretendem-se condições sob as quais uma sonda irá se hibridizar com sua sequência-alvo até um grau de detecção maior que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao fundo). As condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Para o controle da estringência das condições de hibridização e/ou de lavagem, as sequências-alvo que são 100% com- plementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alter- nativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permi- tir algum pareamento errado nas sequências de forma que graus de similari- dade menores são detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos que aproximadamente 1000 nucleotídeos de comprimen- to, preferencialmente menos que 500 nucleotídeos de comprimento. Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é menor que aproximadamente 1,5 M de íon Na, tipica- mente aproximadamente 0,01 até 1,0 M de concentração de íon Na (ou ou- tros sais) em pH 7,0 até 8,3 e a temperatura é de pelo menos aproximada- mente 30ºC para sondas curtas (por exemplo, 10 até 50 nucleotídeos) e de pelo menos aproximadamente 60ºC para sondas longas (por exemplo, maio- res que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser a- tingidas com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida. Os exemplos de condições de estringência baixa incluem a hibridização com uma solução tampão de 30 até 35% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS

' 16 (dodeci!l sulfato de sódio) a 37ºC e uma lavagem em 1X até 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trissódico) a 50 até 55ºC. Os exem- plos de condições de estringência moderada incluem a hibridização em 40 até 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37ºC e uma lavagem emb5XatéiXSSC a 55 até 60ºC. Os exemplos de condições de estrin- gência alta incluem a hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37ºC e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 até 65ºC. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender aproximadamente 0,1% até aproximadamente 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente me- ' 10 nor que aproximadamente 24 horas, geralmente aproximadamente 4 até a- proximadamente 12 horas.

A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da so- lução de lavagem final. Para os híbridos DNA-DNA, à Tm pode ser aproxi- mada da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) — 0,61 (% de form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem dos nu- cleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50% de uma sequência alvo complementar se hibridizam com uma son- da perfeitamente combinada. A Tr, é reduzida em aproximadamente 1ºC pa- ra cada 1% de pareamento errado; assim, a Tm, a hibridização e/ou as con- dições de lavagem podem ser ajustadas para ocorrer a hibridização com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se forem buscadas se- quências com >90% de identidade, a Th pode ser diminuída 10ºC. Geral- mente, as condições estringentes são selecionadas como sendo aproxima- damente 5ºC menores que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e um pH definidos. En- tretanto, condições rigorosamente estringentes podem utilizar uma hibridiza- ção e/ou uma lavagem a 1, 2, 3 ou 4ºC abaixo do ponto de fusão térmica (Tm); as condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridi-

: 17 zação e/ou uma lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10ºC abaixo do ponto de fusão tér- mica (Tm); as condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridiza- ção e/ou uma lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20ºC abaixo do ponto de fu- são térmica (Tm). Utilizando a equação, as composições de hibridização e de lavageme a Th desejada, os peritos comuns entenderão que variações na estringência das soluções de hibridização e/ou de lavagem estão descritas inerentemente. Se o grau desejado de pareamento errado resultar em uma . Tm menor que 45ºC (solução aquosa) ou 32ºC (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC de forma que uma temperatura ' 10 mais alta possa ser utilizada. Um guia extensivo para a hibridização de áci- dos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Bio- chemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte |, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel e outros, eds. (1995) Cur- rent Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley- Interscience, New York). Ver Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Proteínas Isoladas e Variantes e Fragmentos das Mesmas As proteínas de delta-endotoxina são também abrangidas dentro da presente invenção. Por "proteína de delta-endotoxina" pretende-se uma proteína que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 61-121 e 133-141. Fragmentos, porções biologicamente ativas e varian- tes das mesmas são também fornecidos e podem ser utilizados para a práti- ca dos métodos da presente invenção.

"Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem frag- mentos de polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácidos su- ficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada em qual- quer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141 e que exibem atividade pestici- da. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína de delta-endotoxina — pode ser um polipeptídeo que possui, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas através de técnicas recombinantes e avaliadas em relação à ati-

. 18 vidade pesticida. Os métodos para medir a atividade pesticida são bem co- nhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Ento- mol. 83:2480-2485; Andrews e outros (1988) Biochem. J. 252:199-206; Mar- rone e outros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente U.S. Nº5.743.477, dos quais todos são incorporados aqui como referência em sua totalidade. Como utilizado aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141. A invenção - abrange outros fragmentos, entretanto, tal como qualquer fragmento na pro- teína maior que aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, ' 10 350,400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 ou 1300 aminoácidos. Por "variantes" pretendem-se proteínas ou polipeptídeos que possuem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximada- mente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141. As variantes incluem ainda polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com a molécula de áci- do nucleico das SEQ ID NO: 1-60 e 124-132 ou um complemento das mes- mas, sob condições estringentes. As variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos devido à mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, o que significa que continuam a possuir a atividade biológica desejada da pro- teína nativa, isto é, mantêm a atividade pesticida. Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Cza- pla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews e outros (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone e outros (1985) J. of Economic Entomo- logy 78:290-293; e Patente U.S. Nº 5.743.477, dos quais todos são incorpo- rados aqui como referência em sua totalidade.

Genes bacterianos, tais como os genes axmi desta invenção, possuem muito frequentemente vários códons de início de metionina em proximidade com o início do quadro aberto de leitura. Frequentemente, o

. 19 início da tradução em um ou mais destes códons de início levará à produção de uma proteína funcional.

Estes códons de início podem incluir os códons ATG.

Entretanto, bactérias tal como Bacillus sp. também reconhecem o có- don GTG como um códon de início e proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido.

Além disso, não é frequentemente determinado a priori quais destes códons são utiliza- dos naturalmente na bactéria.

Assim, é entendido que o uso de um dos có- . dons de metionina alternativos também pode levar à produção de proteínas de delta-endotoxina que codificam atividade pesticida.

Estas proteínas de ' 10 delta-endotoxina são abrangidas na presente invenção e podem ser utiliza- das nos métodos da presente invenção.

Anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção ou para variantes ou fragmentos dos mesmos, também são abrangidos.

Os métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por e- xemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente U.S.

Nº 4.196.265). Variantes Alteradas ou Melhoradas É reconhecido que sequências de DNA de uma delta-endotoxina podem ser alteradas através de vários métodos e que estas alterações po- dem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequên- cias de aminoácidos diferentes das codificadas por uma delta-endotoxina da presente invenção.

Esta proteína pode ser alterada de várias maneiras inclu- indo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos de um ou mais aminoácidos das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141, incluindo até aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximada- mente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, a- proximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproxima- damente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, apro- ximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximada- mente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105,

. 20 aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, apro- ximadamente 125, aproximadamente 130 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.

Os métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes de sequências de aminoácidos de uma proteína de delta-endotoxina podem ser preparadas por mutações no DNA. Isto também pode ser realizado através de uma de várias formas de muta- . gênese e/ou na evolução direcionada. Em alguns aspectos, as modificações codificadas na sequêricia de aminoácidos não irão afetar substancialmente a : 10 função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade pesticida desejada. Entretanto, é entendido que a capacidade de uma delta-endotoxina de con- ferir atividade pesticida pode ser aprimorada através do uso de tais técnicas sobre as composições desta invenção. Por exemplo, pode-se expressar uma delta-endotoxina em células hospedeiras que exibem altas taxas de incorpo- ração errada de bases durante a replicação do DNA, tal como XL-1 Red (S- tratagene). Após a propagação em tais cepas, pode-se isolar o DNA da del- ta-endotoxina (por exemplo, através da preparação do DNA plasmideal ou através da amplificação pela PCR e clonagem do fragmento de PCR resut- tante em um vetor), cultivar as mutações de delta-endotoxina em uma cepa não mutagênica e identificar os genes mutados da delta-endotoxina com ati- vidade pesticida, por exemplo, através da realização de um ensaio para tes- tar a atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e utilizada em ensaios de alimentação. Ver, por exemplo, Marrone e outros (1985) J. of E- conomic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir o contato de —plantascom uma ou mais pragas e a determinação da capacidade da planta de sobreviver e/ou causar a morte das pragas. Os exemplos de mutações que resultam em maior toxicidade são encontrados em Schnepf e outros (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806. Alternativamente, podem ser feitas alterações na sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carbóxi sem afetar subs- tancialmente a atividade. Isto pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tal como a PCR, incluindo

. 21 i amplificações pela PCR que alteram ou estendem a sequência codificadora da proteína em virtude da inclusão de sequências codificadoras de aminoá- cidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação pela PCR. Alternati- vamente, as sequências de proteínas adicionadas podem incluir sequências codificadoras de proteína inteiras, tais como aquelas comumente utilizadas na técnica para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são fre- quentemente utilizadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de . interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epi- topo para facilitar a purificação de proteína, a detecção de proteína ou outros : 10 usos experimentais conhecidos na técnica (3) direcionar a secreção ou a tradução de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, dos quais o último resulta frequentemente na glicosila- ção da proteína.

As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da presente invenção abrangem ainda sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tal como o embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões codificadoras de proteínas de delta- endotoxina diferentes podem ser utilizadas para criar uma nova proteína de delta-endotoxina que possui as propriedades desejadas. Desta maneira, bi- bliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas partindo de uma população de polinucleotídeos com sequências relacionadas compreenden- do regiões de sequência que possuem identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de forma homóloga in vitro ou in vivo. Por exem- plo, através da utilização desta abordagem, os motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene da delta-endotoxina da invenção e outros genes da delta-endotoxina conhe- cidos para a obtenção de um novo gene que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse aprimorada, tal como uma maior atividade insetici- da As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na téc- nica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri e outros

. 22 (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore e outros (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504- 4509; Crameri e outros (1998) Nature 391:288-291; e Patentes U.S. Nº

5.605.793 e 5.837.458.

A permuta ou o embaralhamento de domínios é outro mecanis- mo para a produção de proteínas de delta-endotoxina alteradas. Os domí- nios || e Ill podem sofrer permutas entre as proteínas de delta-endotoxina, . resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com maior atividade pesticida ou espectro-alvo. Os métodos para a produção de proteínas recombinantes ' 10 eparaotestedas mesmas em relação à atividade pesticida são bem conhe- cidos na técnica (ver, por exemplo, Naimov e outros (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd e outros (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge e outros (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf e outros (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang e outros 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925). Vetores Uma sequência de delta-endotoxina da invenção pode ser forne- cida em um cassete de expressão para a expressão em uma planta de inte- resse. Por "cassete de expressão de planta" pretende-se um construto de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína partindo de um quadro aberto de leitura em uma célula vegetal. Tipicamente este contém um promotor e uma sequência codificadora. Frequentemente, tais construtos conterão ainda uma região não traduzida 3'. Tais construtos podem conter uma "sequência sinal" ou uma "sequência líder" para facilitar o transporte cotradução ou pós-tradução do peptídeo para certas estruturas intracelulares tal como o cloroplasto (ou outro plastídeo), o retículo endoplasmático ou o complexo de Golgi. Por "sequência sinal" pretende-se uma sequência que é conhe- cida ou suspeita de resultar no transporte de peptídeos cotradução ou pós- tradução através da membrana celular. Em eucariotos, isto envolve tipica- mente a secreção dentro do aparelho de Golgi, com alguns resultando na glicosilação. Por "sequência líder" pretende-se qualquer sequência que

: 23 quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para ativar o transporte cotradução da cadeia peptídica para uma organela subce- lular.

Assim, esta inclui sequências líderes que direcionam o transporte e/ou a glicosilação através da passagem para dentro do retículo endoplasmático, da passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e similares.

Por "vetor de transformação de plantas" pretende-se uma molé- . cula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula vegetal.

Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressão ' 10 de plantase pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA de "ve- tor". Por exemplo, os vetores binários são vetores de transformação de plan- tas que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções que atuam em cis e em trans necessárias para a transformação de células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446- 451). "Vetor" refere-se a um construto de ácido nucleico planejado para transferência entre células hospedeiras diferentes. "Vetor de expressão" re- fere-se a um vetor que possui a capacidade de incorporar, integrar e expres- sar sequências de DNA heterólogas ou fragmentos em uma célula estranha.

O cassete incluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas de forma operacio- nalauma sequência da invenção.

Por "ligado(a) de forma operacional" pre- tende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequên- cia, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequên- cia de DNA que corresponde à segunda sequência.

Geralmente, ligado(a) de forma operacional significa que as sequências de ácidos nucleicos que estão ligadas são contíguas e, quando necessário unir duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

O cassete pode con- ter adicionalmente pelo menos um gene adicional que será cotransformado no organismo.

Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser for- necido(s) em vários cassetes de expressão. "Promotor" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que funciona para direcionar a transcrição de uma sequência codificadora a ju- sante.

O promotor junto com outras sequências de ácidos nucleicos regula-

: 24 i doras da transcrição e da tradução (também denominadas "sequências de controle") é necessário para a expressão de uma sequência de DNA de inte- resse. Tal cassete de expressão é fornecido com um grande número de sítios de restrição para a inserção da sequência de delta-endotoxina que está sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão incluirá na direção 5'-3' da transcrição, . uma região iniciadora da transcrição e da tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção e uma região de término da tradução e ' 10 da transcrição (isto é, região de término) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo ou estranho ou heterólogo, ao hospedeiro vege- tal e/ou à sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Quan- do o promotor for "nativo" ou "homólogo" ao hospedeiro vegetal, é pretendi- do que o promotor seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Quando o promotor for "estranho" ou "heterólogo" à sequência de DNA da invenção, é pretendido que o promotor não seja o promotor nati- vo ou que ocorre naturalmente para a sequência de DNA ligada de forma operacional da invenção.

A região de término pode ser nativa em relação à região de iní- cio da transcrição, pode ser nativa em relação à sequência de DNA ligada de forma operacional de interesse, pode ser nativa em relação ao hospedeiro vegetal ou pode ser derivada de uma outra fonte (isto é, estranha ou heteró- loga ao promotor, à sequência de DNA de interesse, ao hospedeiro vegetal ou qualquer combinação dos mesmos). As regiões de término convenientes estão disponíveis no plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de término da octopina sintase e da nopalina sintase. Ver também Guerine- au e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:67 1-674; Sanfacon e outros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen e ou- tros (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe e outros (1990) Gene 91:151- 158; Ballas e outros (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi e ou- tros (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

: 25 Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para maior expressão na célula hospedeira transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferidos pela célula hospedeira para maior expressão ou podem ser sintetizados utilizando códons em uma fre- — quênciade uso de códons preferida pelo hospedeiro. Geralmente, o conteú- do de GC do gene será aumentado. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códons preferi- . dos pelo hospedeiro. Estão disponíveis na técnica os métodos para a sínte- se de genes preferidos pelas plantas. Ver, por exemplo, as Patentes U.S.

' 10 Nº 5.380.831 e 5.436.391 e Murray e outros (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados aqui por referência.

Em uma modalidade, a delta-endotoxina é direcionada para o cloroplasto para expressão. Desta maneira, quando a delta-endotoxina não for inserida diretamente no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adi- cionalmente um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar a delta-endotoxina para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne e outros (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark e outros (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa e outros (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romere outros (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah e outros (1986) Science 233:478-481.

O gene da delta-endotoxina que será direcionado para o cloro- plasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto para ser responsá- vel por diferenças no uso de códons entre o núcleo vegetal e esta organela.

Destamaneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados uti- lizando códons preferidos pelo cloroplasto. Ver, por exemplo, a Patente U.S. Nº 5.380.831, incorporada aqui por referência. Transformação de Plantas Os métodos da invenção envolvem a introdução de um construto de nucleotídeos em uma planta. Por "introdução" pretende-se apresentar à planta o construto de nucleotídeos de tal maneira que o construto ganhe a- cesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não re-

: 26 querem que um método particular para a introdução de um construto de nu- cleotídeos em uma planta seja utilizado, apenas que o construção de nucleo- tídeos ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os mé- todos para a introdução de construtos de nucleotídeos nas plantas são co- —nhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, métodos de transforma- ção estável, métodos de transformação transitória e métodos mediados por vírus. - Por "planta" pretendem-se plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, células vegetais, propá- ] 10 gulos, embriões e progênie das mesmas. As células vegetais podem ser di- ferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células em cultura em suspensão, protoplastos, células da folha, células da raiz, células de floema, pólen). "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ou plantas ou células ou tecidos "transformados de forma estável" referem-se a plantas que incorporaram ou integraram sequências de ácidos nucleicos ou frag- mentos de DNA exógenos na célula vegetal. Estas sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas que são exógenas ou não estão presentes na célula vegetal não transformada, bem como aquelas que podem ser endó- genas ou presentes na célula vegetal não transformada. "Heterólogas" ge- ralmente refere-se às sequências de ácidos nucleicos que não são endóge- nas à célula ou parte do genoma nativo em que estão presentes e foram a- dicionadas na célula através de infecção, transfecção, microinjeção, eletro- poração, microprojeção ou similar.

A transformação de células vegetais pode ser realizada através de uma de várias técnicas conhecidas na técnica. O gene da delta- endotoxina da invenção pode ser modificado para a obtenção ou para au- mentar a expressão em células vegetais. Tipicamente uma construção que expressa tal uma proteína conteria um promotor para controlar a transcrição do gene, bem como uma região não traduzida 3' para permitir o término da transcrição e a poliadenilação. A organização de tais construções é bem co- nhecida na técnica. Em alguns casos, pode ser útil engenheirar o gene de

: 27 forma que o peptídeo resultante seja secretado ou direcionado de outra ma- neira para dentro da célula vegetal.

Por exemplo, o gene pode ser engenhei- rado para conter um peptídeo sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático.

Também pode ser preferível engenheirar o cassete de expressão de planta para conter um íntron, de forma que o pro-

cessamento do íntron no mMRNA seja necessário para expressão.

Tipicamente este "cassete de expressão de planta" será inserido . em um "vetor de transformação de plantas". Este vetor de transformação de plantas pode ser compreendido de um ou mais vetores de DNA necessários " 10 para conseguir a transformação das plantas.

Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de plantas que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo.

Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como "vetores binários". Os vetores binários bem como os vetores com plasmídeos auxiliadores são mais fre- quentemente utilizados para transformação mediada por Agrobacíterium, quando o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para atingir uma transformação eficiente são bastante grandes é vantajoso separar as funções em moléculas de DNA separadas.

Os vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmideal que contém as sequências que atu- amemcis necessárias para a transferência do T-DNA (tais como a borda esquerda e a borda direita), um marcador que pode ser selecionado, que é engenheirado para ser capaz de ser expresso em uma célula vegetal e um "gene de interesse" (um gene engenheirado para ser capaz de ser expresso em uma célula vegetal para a qual a produção de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes neste vetor plasmideal as sequências necessárias para a replicação de bactérias.

As sequências que atuam em cis são dispostas de uma maneira que permita a transferência eficiente para dentro das células vegetais e a expressão nas mesmas.

Por exemplo, o ge- ne marcador que pode ser selecionado e a delta-endotoxina ficam localiza- dos entre as bordas esquerda e direita.

Frequentemente um segundo vetor plasmideal contém os fatores que atuam em trans que medeiam a transfe- rência do T-DNA de Agrobacíterium para as células vegetais.

Este plasmídeo

: 28 i contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção das células vegetais por Agrobacterium e a transferência do DNA através da clivagem nas sequências de borda e a transferência de DNA me- diada por vir, como é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trendsin Plant Science 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA1OS etc.) podem ser utiliza- dos para a transformação de plantas. O segundo vetor plasmideal não é ne- - cessário para a transformação das plantas através de outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

' 10 Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem a transferência do DNA heterólogo para dentro das células vegetais alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo não diferenciado, protoplastos etc.), seguida pela aplicação de um nível limite máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador que pode ser selecionado) para recuperar as células vegetais transformadas de um grupo de massa celular não transformada. Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados repeti- damente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após colocar no meio de regeneração suplementado com um ní- vellimite máximo de agente de seleção. Os brotos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo para a recuperação do broto enrai- zado ou da plantícula. A plantícula transgênica então cresce em uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei e outros (1994) The Plant Joumal 6:271-282; Ishida e outros (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados repetidamente. Uma descrição geral das técnicas e dos métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommi- neni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma vez que o material transfor- —mado contém muitas células; tanto as células transformadas quanto as não transformadas estão presentes em qualquer pedaço do calo ou do tecido ou do grupo de células alvo submetido. A capacidade de matar células não

: 29 transformadas e de permitir que as células transformadas se proliferem re- sulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade de remover as células não transformadas é uma limitação para a recupera- ção rápida de células vegetais transformadas e a produção bem sucedida de plantastransgênicas.

Os protocolos de transformação bem como os protocolos para a introdução de sequências de nucleotídeos nas plantas podem variar depen- . dendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicoti- ledônea, direcionada para a transformação. A produção de plantas transgê- ' 10 nicas pode ser realizada através de um de vários métodos, incluindo, mas não limitados a, microinjeção, eletroporação, transferência gênica direta, in- trodução de DNA heterólogo por Agrobacterium nas células vegetais (trans- formação mediada por Agrobacterium), bombardeio de células vegetais com DNA estranho heterólogo aderido a partículas, aceleração balística de partí- culas, transformação com feixes de aerossol (Pedido de Patente U.S. Publi- cado No. 20010026941; Patente U.S. Nº 4.945.050; Publicação Internacional No. WO 91/00915; Pedido de Patente U.S. Publicado No. 2002015066), transformação de Lec1 e vários outros métodos mediados por direcionamen- to de não partículas para a transferência do DNA. Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Svab e outros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método se baseia no fornecimento por pistola de partículas de DNA contendo um marcador que pode ser selecionado e no direcionamento do DNA para o genoma do plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transfor- mação de plastídeos pode ser realizada através da transativação de um transgene carregado por plastídeo silencioso através da expressão preferida para o tecido de uma RNA polimerase codificada pelo núcleo e direcionada parao plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride e outros (1994) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Após a integração do DNA estranho heterólogo nas células ve-

: 30 getais, pode-se então aplicar um nível limite máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células supostamente transformadas que sobrevivem a este tratamento de seleção através da transferência de forma regular para um meio fresco. Para a passageme o desafio contínuos com esta seleção apropriada, pode-se identificar e proliferar as células que são transformadas com o vetor plasmi- deal. Métodos moleculares e bioquímicos podem ser então utilizados para . confirmar a presença do gene de interesse heterólogo integrado no genoma da planta transgênica.

' 10 As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas de acordo com maneiras convencionais. Ver, por exemplo, McCor- mick e outros (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser crescidas e polinizadas com a mesma linhagem transformada ou com linhagens diferentes e o híbrido resultante que possui expressão constitutiva da característica fenotípica desejada pode ser identificado. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para garantir que a expressão da caracterís- tica fenotípica desejada é mantida de forma estável e herdada e então as sementes são colhidas para garantir que a expressão da característica feno- típica desejada seja conseguida. Desta maneira, a presente invenção forne- ce semente transformada (também referida como "semente transgênica") que possui uma construção de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de forma estável em seu genoma.

Avaliação da Transformação de Plantas Após a introdução de DNA estranho heterólogo nas células ve- getais, a transformação ou a integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada através de vários métodos tal como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.

A análise de PCR é um método rápido para verificar as células, tecido ou brotos transformados em relação à presença do gene incorporado no estágio mais inicial antes do transplante para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labora-

: 31 i tory Press, Cold Spring Harbor, NY). A PCR é realizada utilizando iniciadores ] de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacterium, etc.

A transformação da planta pode ser confirmada através da aná- lisede Southern blot do DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para . uma membrana de nitrocelulose ou de náilon. A membrana ou "blot" é então submetido ao tratamento com sonda com, por exemplo, fragmento de DNA ' 10 alvo radiomarcado com *P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas-padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra).

Na análise de Northern blot, o RNA é isolado dos tecidos especí- ficos do transformante, fracionado em um gel de agarose com formaldeído e "blotted" sobre um filtro de náilon de acordo com procedimentos padroniza- dos que são utilizados rotineiramente na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão do RNA codificado pela delta-endotoxina é então testa- da através da hibridização do filtto com uma sonda radioativa derivada de uma delta-endotoxina, através de métodos conhecidos na técnica (Sambro- oke Russell 2001, supra).

Os ensaios de Western blot, bioquímicos e similares podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a presença da proteína codificada pelo gene da delta-endotoxina através de procedimentos padroni- zados (Sambrook e Russell, 2001, supra) utilizando anticorpos que se ligam aumoumais epitopos presentes na proteína de delta-endotoxina. Atividade Pesticida em Plantas Em outro aspecto da invenção, podem ser geradas plantas transgênicas que expressam uma delta-endotoxina que possui atividade pesticida. Os métodos descritos anteriormente com a finalidade de exemplo podem ser utilizados para gerar plantas transgênicas, mas a maneira em que as células vegetais transgênicas são geradas não é crítica para esta invenção. Os métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como a trans-

: 32 i formação mediada por Agrobacterium, a transformação biolística e os méto- dos não mediados por partículas podem ser utilizados a critério do indivíduo que conduz o experimento. As plantas que expressam uma delta-endotoxina podem ser isoladas através de métodos comuns descritos na técnica, por exemplo, através da transformação de calo, da seleção de calo transformado e da regeneração de plantas férteis partindo de tal calo transgênico. Em tal método, pode-se utilizar qualquer gene como um marcador que pode ser . selecionado contanto que sua expressão nas células vegetais confira capa- cidade de identificar ou selecionar células transformadas. ' 10 Um número de marcadores foi desenvolvido para uso com célu- las vegetais, tais como resistência ao cloranfenicol, ao aminoglicosídeo G418, à higromicina ou similar. Outros genes que codificam um produto en- volvido no metabolismo do cloroplasto também podem ser utilizados como marcadores que podem ser selecionados. Por exemplo, os genes que forne- cem resistência a herbicidas para plantas tais como glifosato, bromoxinila ou imidazolinona podem encontrar uso particular. Tais genes foram relatados (Stalker e outros (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene de nitrilase de resistência à bromoxinila); e Sathasivan e outros (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gene de resistência a AHAS imidazolinona). Adicionalmente, os genes divulgados aqui são úteis como marcadores para avaliar a transfor- mação de células bacterianas ou vegetais. Os métodos para a detecção da presença de um transgene em uma planta, um órgão de planta (por exem- plo, folhas, caules, raízes etc.), uma semente, uma célula vegetal, um pro- págulo, um embrião ou uma progênie da mesma são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada através do teste da atividade pesticida.

As plantas férteis que expressam uma delta-endotoxina podem ser testadas em relação à atividade pesticida e as plantas que exibem ativi- dade ótima são selecionadas para cruzamento adicional. Estão disponíveis na técnica os métodos para analisar a atividade para pragas. Geralmente, a proteína é misturada e utilizada em ensaios de alimentação. Ver, por exem- plo, Marrone e outros (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

: 33 A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitada a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e semente oleosa de colza, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, açafroa, a- mendoins, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, árvores de frutos cí- . tricos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, vegetais, plantas ornamentais e conífe- : 10 ras.

Os vegetais incluem, mas não estão limitados a, tomates, alface, ervilha verde, feijão de lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantaloupo e meloa. As plantas ornamentais incluem, mas não estão limitadas a, azaleia, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petú- nias, cravo, copo-de-leite e crisântemo. Preferencialmente, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba de açúcar, cana de açúcar, tabaco, cevada, semente oleosa de colza etc.). Uso no Controle de Pragas Os métodos gerais para empregar linhagens que compreendem uma sequência de nucleotídeos da presente invenção ou uma variante da mesma, no controle pesticida ou na engenharia de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. Nº 5.039.523 e a EP 0480762A2.

As cepas de Bacillus que contêm uma sequência de nucleotí- deos da presente invenção ou uma variante da mesma ou os micro- organismos que foram alterados geneticamente para conterem um gene e uma proteína pesticida podem ser utilizados para a proteção de plantas de cultivo e produtos agrícolas das pragas. Em um aspecto da invenção, células inteiras, isto é, não lisadas de um organismo que produz toxina (pesticida) são tratadas com reagentes que prolonga a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada no ambiente da(s) praga(s)-alvo.

: 34 Alternativamente, o pesticida é produzido através da introdução de um gene da delta-endotoxina em um hospedeiro celular.

A expressão do gene da delta-endotoxina resulta, diretamente ou indiretamente, na produção e na manutenção intracelular do pesticida.

Em um aspecto desta invenção, estas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada no ambiente da(s) praga(s)-alvo.

O produto resultante mantém a toxicidade da toxina.

Estes . pesticidas naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acor- do com técnicas convencionais para aplicação no ambiente que hospeda " 10 uma praga alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas.

Ver, por exemplo, EPA 0192319 e as referências citadas ali.

Alternativamente, po- dem ser formuladas as células que expressam um gene desta invenção de forma a permitir a aplicação do material resultante como um pesticida.

Composições Pesticidas Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de culti- vo ou na planta que será tratada, simultaneamente ou em sequência, a ou- tros compostos.

Estes compostos podem ser fertilizantes, agentes que ma- tam ervas daninhas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabões pesti- cidas, óleos inertes, polímeros e/ou formulações carreadoras de liberação controlada ou biodegradáveis que permitem a dosagem em longo prazo de uma área-alvo após uma única aplicação da formulação.

Estes também po- dem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, agentes que destroem vírus, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bacteriocidas, nema- tocidas, moluscicidas ou misturas de várias destas preparações, se deseja- do, junto com veículos, tensoativos ou agentes que promovem a aplicação aceitáveis na agricultura empregados de forma costumeira na técnica da formulação.

Os veículos e os adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias comumente empregadas na tecno- logia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regene- radas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de pegajosida- de, aglutinantes ou fertilizantes.

Similarmente as formulações podem ser

: 35 preparadas em "iscas" comestíveis ou elaboradas em "armadilhas" para pragas para permitir a alimentação ou a ingestão por uma praga-alvo da formulação pesticida.

Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que con- tém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacte- rianas da presente invenção incluem aplicação nas folhas, revestimento das - sementes e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplica- ção dependem da intensidade de infestação pela praga correspondente.

" 10 A composição pode ser formulada na forma de um pó, uma poei- ra, um pélete, um grânulo, um spray, uma emulsão, um coloide, uma solução ou similar e pode ser preparada através de meios convencionais tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concen- tração de aproximadamente 1% até aproximadamente 99% em peso.

As pragas de lepidóptero, coleóptero ou nematoide podem ser mortas ou reduzidas em números em certa área através dos métodos da invenção ou podem ser aplicadas de forma profilática em uma área ambien- tal para prevenir a infestação por uma praga susceptível. Preferencialmente a praga ingere ou é colocada em contato com uma quantidade pesticida- mente pesticidamente eficientedo polipeptídeo. Por "quantidade pesticida- mente pesticidamente eficiente" pretende-se uma quantidade do pesticida — queé capaz de provocar a morte de pelo menos uma praga ou de reduzir de forma visível o crescimento, a alimentação ou o desenvolvimento fisiológico normal da praga. Esta quantidade variará dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas- alvo específicas que devem ser controladas, o am- biente específico, a localização, a planta, o local de cultivo ou agrícola que será tratado, as condições ambientais e o método, a taxa, a concentração, a estabilidade e a quantidade de aplicação da composição de polipeptídeo pesticidamente eficiente. As formulações também podem variar em relação às condições climáticas, às considerações ambientais e/ou à frequência de aplicação e/ou à gravidade de infestação da praga.

As composições pesticidas descritas podem ser produzidas a- través da formulação da suspensão de células bacterianas, de cristais e/ou de esporos ou do componente de proteína isolado com o veículo aceitável na agricultura desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em uma forma apropriada tal como liofilizada, seca por conge- - lamento, dessecada ou em um veículo, um meio ou um diluente adequado aquoso, tal como solução salina ou outro tampão. As composições formula- ' 10 das podem estar na forma de uma poeira ou um material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões em óleo/água ou na forma de um pó que pode ser umedecido ou em combinação com qualquer outro material veículo adequado para a aplicação agrícola. Os veí- culos agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhe- cidos na técnica. O termo "veículo aceitável na agricultura" cobre todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, agentes de pe- gajosidade, aglutinantes, etc. que são comumente utilizados na tecnologia de formulação de pesticidas; estes são bem conhecidos pelos versados na formulação de pesticidas. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas através de vários meios, por exemplo, através de mistura homogênea, mescla e/ou trituração da composição pesticida com adjuvantes adequados utilizando técnicas de for- mulação convencionais. As formulações e os métodos de aplicação adequa- dos são descritos na Patente U.S. Nº 6.468.523, incorporada aqui como re- ferência.

"Praga" inclui, mas não está limitada a insetos, fungos, bactérias, nematoides, traças, carrapatos e similares. As pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepi- doptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera etc., particular mente Coleoptera, Lepidoptera e Diptera.

A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga.

: 37 i A subordem Adephaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, en- quanto que a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoi- dea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bos- trichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea e Curculionoi- dea.

A superfamília Caraboídea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae e Dytiscidae.

A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae.

A superfamí- - lia Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae.

A superfamília Staphylinoi- dea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae.

A superfamília Cantharoidea : 10 inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae.

A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae.

A superfamília Elateroidea inclui as fa- mílias Elateridae e Buprestidae.

A superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae.

A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae.

A superfa- mília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae.

A superfamília Scaraba- eoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae.

A superfamília Ce- rambycoidea inclui a família Cerambycidae.

A superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae.

A superfamília Curculionoidea inclui as famí- lias Curculionidae e Scolytidae.

A ordem Diptera inclui as subordens Nematocera, Brachycera e Cyclorhapha.

À subordem Nematocera incluí as famílias Tipulidae, Psycho- didae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae e Cecidomyiidae.

A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Ta- banidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae e Dolichopodidae.

À subordem Cyclorrhapha inclui as divisões Aschiza e Aschiza.

A divisão As- chizaincluias famílias Phoridae, Syrphidae e Conopidae.

A divisão Aschiza inclui as seções Acalyptratae e Calyptratae.

A seção Acalyptratae inclui as famílias Oftitidae, Tephritidae, Agromyzidae e Drosophilidae.

A seção Calyp- tratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomvyiida- e, Muscidae, Calliphoridae e Sarcophagidae.

A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaíidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Satumiidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae e

: 38 Tineidae.

Os nematoides incluem nematoides parasitas tais como nema- toides formadores de nós de raiz, de cistos e de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos ne- matoides formadores de cistos, incluindo, mas não limitados a, Heterodera glicinas (nematoide de cisto da soja); Heterodera schachtii (nematoide de cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematoide de cisto de cereais); e - Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematoides formadores de cistos da batata). Os nematoides formadores de lesões incluem Pratylen- ' 10 chusspp.

As pragas de insetos da invenção para as plantas de cultivo principais incluem: Milho: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta-rosca negra; Helicoverpa zea, lagarta da espiga de milho; Spodoptera frugiperda, lagarta militar cortadora; Diatraea grandiosella, broca do milho do sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule de milho inferior; Diatraea saccharalis, broca da cana de açúcar; Diabrotica virgifera, larva de raiz de milho do oeste; Diabrotica longicomis barberi, larva de raiz de milho do norte; Diabrotica undecimpunctata howardfi, larva de raiz de mi- lho do sul; Melanotus Spp., larvas arame; Cyclocephala borealis, northern masked chafer (white grub); Cyclocephala immaculata, escaravelho masca- rado do sul (lagarta branca); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocne- ma pulicaria, besouro saltador do milho; Sphenophorus maidis, pulgão do milho; Rhopalosiphum maidis, pulgão da folha do milho; Anuraphis maidira- dicis, pulgão da raiz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo de trigais;, Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas vermelhas; Melano- plus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya plafura, larva de grão de milho; Agromyza parvicormnis, minador foliar de mancha do milho; Anaphot- hrips obscrurus, tripes de gramínea; Solenopsis milesta, formiga ladra; Te- tranychus urticae, ácaro rajado; Sorgo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spo- doptera frugiperda, lagarta militar cortadora; Helicoverpa zea, lagarta da es- piga de milho; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule de milho inferior; Feltia subterranea, lagarta-rosca granulosa; Phyllophaga crinita, lagarta

: 39 branca; Eleodes, Conoderus e Aeolus spp., larvas arame; Oulema melano- pus, besouro de folha de cereais; Chaetocnema pulicaria, besouro saltador do milho; Sphenophorus maidis, pulgão do milho; Rhopalosiphum maidis; pulgão da folha do milho; Sipha flava, pulgão amarelo da cana de açúcar; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo de trigais; Contarinia sorghicola, mosquito-pólvora do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro rajado carmim; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta de - cereais; Spodoptera frugiperda, lagarta militar cortadora; Elasmopalpus lig- nosellus, broca do caule de milho inferior; Agrotis orthogonia, lagarta-rosca ' 10 dooeste; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule de milho inferior; Oulema melanopus, besouro de folha de cereais; Hypera punctata, gorgulho de folha de trevo; Diabrotica undecimpunctata howardfi, larva de raiz de milho do sul; pulgão do trigo russo; Schizaphis graminum, pulgão verde; Macrosiphum avenae, pulgão de grão inglês; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de per- nas vermelhas; Melanoplus diferentesialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório, Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito-pólvora do trigo; Meromyza americana, lar- va de caule de trigo; Hylemya coarctata, mosca de bulbo do trigo; Frankliniel- la fusca, tripes do tabaco; Cephus cinctus, vespão de caule de trigo; Aceria fulipae, ácaro do chochamento do trigo; Girassol: Suleima helianthana, mari- posa do botão de girassol; Homoeosoma electellum, mariposa do girassol; Zygogramma exclamationis, besouro do girassol; Bothyrus gibbosus, besou- ro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito-pólvora da semente de girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta do botão do algodão; Helico- verpazea, lagarta da cápsula do algodão; Spodoptera exígua, lagarta militar da beterraba; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus gran- dis, gorgulho da cápsula; Aphis gossypii, pulgão do algodão; Pseudatomos- celis seriatus, gafanhoto voador do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca de asas listradas; Lygus lineolaris, besouro de planta manchada; Me- lanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas vermelhas; Melanoplus diferen- tesialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripes da cebola; Franklinkiella fusca, tripes do tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro rajado carmim; Te-

: 40 tranychus urticae, ácaro rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana de açúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta militar cortadora; Helicoverpa zea, lagarta da espiga de milho; Colaspis brunnea, colaspis de uva; Lissorhopírus oryzophilus, gorgulho aquático do arroz; Sitophilus oryzae, gorgulho do ar- roz; Nephotettix nigropictus, gafanhoto do arroz; Blissus leucopterus leucop- terus, percevejo de trigais; Acrosternum hilare, percevejo verde; Soja: Pseu- doplusia incluemns, lagarta mede palmo da soja; Anticarsia gemmatalis, la- - garta da soja; Plathypena scabra, larva de trevo verde; Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta-rosca negra; Spodoptera ' 10 exigua, lagarta militar da beterraba; Heliothis virescens, lagarta do botão do algodão; Helicoverpa zea, lagarta da cápsula do algodão; Epilachna varives- tis, lagarta do feijão mexicano; Myzus persicae, pulgão de pêssego verde; Empoasca fabae, gafanhoto da batata; Acrosternum hilare, percevejo verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas vermelhas; Melanoplus dife- rentesialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, lavva da mosca de grão de milho; Sericotripes variabilis, tripes da soja; Thrips tabaci, tripes da cebo- la; Tetranychus turkestani, Tethranychidae do morango; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ip- silon, lagarta-rosca negra; Schizaphis graminum, pulgão verde; Blissus leu- copterus leucopterus, percevejo de trigais; Acrostemum hilare, percevejo verde; Euschistus servus, percevejo marrom; Delia platura, larva da mosca de grão de milho; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, traça marrom do trigo; Semente Oleosa de Colza: Brevicoryne brassicae, pulgão de repolho; Phyilotreta cruciíferaae, besouro saltador; Mamestra con- figurata, lagarta militar Bertha; Plutella xylostella, traça das crucíferas; Delia SSp., larvas de mosca de raiz.

Métodos para aumentar o rendimento da planta São fornecidos métodos para aumentar o rendimento da planta.

Os métodos compreendem a introdução em uma planta ou célula vegetal de um polinucleotíideo que compreende uma sequência pesticida divulgada a- qui.

Como definido aqui, o "rendimento" da planta refere-se à qualidade e/ou à quantidade de biomassa produzida pela planta.

Por "biomassa" pretende-

: 41 se qualquer produto vegetal medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer aprimoramento do rendimento do produto vegetal medido. O au- mento do rendimento da planta possui várias aplicações comerciais. Por e- xemplo, o aumento da biomassa foliar da planta pode aumentar o rendimen- tode vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa foliar pode ser utilizado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de plantas. Um aumento no - rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significa- tivo que inclui, mas não está limitado a, pelo menos um aumento de 1%, pe- " 10 lomenos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um au- mento de 30%, pelo menos um aumento de 50%, pelo menos um aumento de 70%, pelo menos um aumento de 100% ou maior do rendimento compa- rado com aquele de uma planta que não expressa a sequência pesticida.

Em métodos específicos, o rendimento da planta é maior como um resultado de maior resistência a pragas de uma planta que expressa uma proteína pesticida divulgada aqui. A expressão da proteína pesticida resulta em uma capacidade reduzida de uma praga de infestar ou de se ali- mentar da planta, aumentando assim o rendimento da planta.

Os exemplos a seguir são oferecidos com a finalidade de ilustra- ção e não com a finalidade de limitação.

EXPERIMENTAL Exemplo 1. Descoberta de novos genes pesticidas de Bacillus thuringiensis Os novos genes pesticidas foram identificados partindo de cepas de bactérias listadas na Tabela 1 utilizando as etapas a seguir: e Preparação de DNA extracromossômico proveniente da cepa, que inclui plasmídeos que carregam tipicamente genes da delta-endotoxina e Cisalhamento mecânico do DNA extracromossômico para ge- rar fragmentos distribuídos em relação ao tamanho + Clonagem de fragmentos de —-2 Kb até -10 Kb do DNA extra- cromossômico + Crescimento de —-1500 clones do DNA extracromossômico

: 42 e Sequenciamento parcial dos 1500 clones utilizando iniciadores específicos para o vetor de clonagem (leituras finais) e Identificação dos supostos genes de toxina através da análise da homologia pela abordagem de MiIDAS (como descrito na Publicação de PatenteU.S.

No. 20040014091, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade) e Acabamento das sequências ("walking") dos clones que con- - têm fragmentos dos supostos genes de toxina de interesse

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- 45 Exemplo 2. Descoberta de novos genes pesticidas de Bacillus thuringiensis Novos genes pesticidas foram identificados provenientes das cepas listadas na Tabela 2 utilizando a abordagem de MIDAS como descrito na Publicação de Patente U.S.

No. 20040014091, que é incorporada aqui porreferência em sua totalidade, utilizando as etapas a seguir: + Preparação de DNA extracromossômico proveniente da cepa.

O DNA extracromossômico contém uma mistura de alguns ou todos os se- - guintes: plasmídeos de vários tamanhos; cromossomos de fagos; fragmen- tos de DNA genômico não separados através do protocolo de purificação; " 10 outrasmoléculas extracromossômicas não caracterizadas. e Cisalhamento mecânico ou enzimático do DNA extracromos- sômico para gerar fragmentos distribuídos em relação ao tamanho. e Sequenciamento do DNA fragmentado e Identificação de supostos genes de toxina através da homolo- giae/oude outras análises de computador. * Quando necessário, o acabamento das sequências do gene de interesse através de uma de várias estratégias de PCR ou de clonagem (por exemplo, TAIL-PCR).

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- 53 | Exemplo 3. Descoberta de um novo gene de toxina Axmi068 da cepa ATX13046 de Bacillus thuringiensis. A cepa que codifica axmi068 foi identificada como a seguir: + A informação de sequência proveniente de genes de toxina co- —nhecidos ou suspeitos foi utilizada para gerar um alinhamento que represen- ta sequências de DNA conservadas e parcialmente conservadas dentro de um grupo (família) de toxinas. - e Os iniciadores da reação em cadeia da polimerase (PCR) fo- ram planejados para amplificar seletivamente um ou mais membros da famí- ' 10 liadetoxinacom base na sequência alinhada.

* O DNA isolado de cepas bacterianas foi verificado através da PCR para a identificação de cepas que contêm os supostos homólogos da família do gene-alvo.

+ Os produtos da PCR foram sequenciados para selecionar uma cepaque contém um gene de interesse.

A sequência gênica completa foi identificada partindo da cepa selecionada através da abordagem genômica de MiDAS (Publicação de Pa- tente U.S. No. 20040014091) como a seguir: + Preparação de DNA extracromossômico proveniente da cepa.

O DNA extracromossômico contém uma mistura de alguns ou todos os se- guintes: plasmídeos de vários tamanhos; cromossomos de fagos; fragmen- tos de DNA genômico não separados através do protocolo de purificação; outras moléculas extracromossômicas não caracterizadas.

e Cisalhamento mecânico ou enzimático do DNA extracromos- —sômico para gerar fragmentos distribuídos em relação ao tamanho.

+ Clonagem dos fragmentos de DNA extracromossômico em um vetor plasmideal.

e Crescimento e purificação do clone do DNA extracromossômi- co.

e Sequenciamento parcial dos clones.

e Identificação de supostos genes de toxina através da homolo- gia e/ou de outras análises de computador.

- 54 * Quando necessário, o acabamento das sequências ("walking") dos clones que contêm sequência dos supostos genes de toxina de interes- se. e A sequência de nucleotídeos para axmi068 é apresentada na SEQIDNO:16ea sequência de aminoácidos para AXMIO68 é apresentada na SEQ ID NO: 76. Características dos Genes e das Proteínas - Comprimento do gene, pares de bases de DNA:1.791 Comprimento da proteína, resíduos de aminoácidos:597 " 10 Peso molecular estimado da proteína.

Da:66.495 Homólogos conhecidos e porcentagem de identidade aproximada:Cry11d1, 714% Exemplo 4. Expressão em Bacillus O gene inseticida divulgado aqui é amplificado através da PCR e o produto da PCR é clonado no vetor de expressão pAX916 de Bacillus ou outro vetor adequado, através de métodos bem conhecidos na técnica.

À cepa de Bacillus resultante, contendo o vetor com o gene axmi é cultivada em um meio de crescimento convencional, tal como meio CYS (10 g/L de Bacto-casitona; 3 g/L de extrato de levedura; 6 g/L de KH2PO,4; 14 g/L de K2HPOs; 0,5 MM de MgSO,; 0,05 MM de MnClz; 0,05 mM de FeSO;,), até a esporulação ser evidente por verificação microscópica.

As amostras são preparadas e testadas em relação à atividade em ensaios biológicos.

Exemplo 5. Construção de sequências sintéticas Em um aspecto da invenção, foram geradas sequências sintéti- casde axmi.

Estas sequências sintéticas têm uma sequência de DNA alte- rada em relação à sequência de axmi original e codificam uma proteína que é colinear à proteína AXMI original à qual corresponde, mas falta o "domínio de cristal" C-terminal presente em muitas proteínas de delta-endotoxina.

Os genes sintéticos são apresentados na Tabela 3.

- 55 Tabela 3. No me do | Gene |do Nome do Gene Sintético Tipo Selvagem axmio5o axmio51 ' axmio52 axmi0o53 axmio54 axmio55 axmio56 axmio57 axmio5s8 axmios9 axmio60 axmio61 axmio67

. 56 No me de Gens do Nome do Gene Sintético Tipo Selvagem axmio69 axmio71 axmio72 axmio73 axmio74 axmio75 axmio79 axmio80 axmio82 axmio87 axmio88 axmio91 axmio93

. 57

No megdo Gene qdo Nome do Gene Sintético Tipo Selvagem axmio97

: axmio98 axmi100 axmi1o1 axmi102 axmito3 axmi104 axmito7 axmi1to8 axmi1o9 axmi1t10

. 58 No me do Gene Ido Nome do Gene Sintético Tipo Selvagem axmit11 axmi112 axmit14 axmi116 axmit17 axmit18 axmit19 axmi120 axmi121 axmit22 axmit23 axmi1t24 axmi125

No megdonGene sto Nome do Gene Sintético Tipo Selvagem axmi129 axmit37 axmi138 axmi1t51 axmi161 axmi164 axmi183 Em outro aspecto da invenção, versões modificadas de genes sintéticos são planejadas de forma que o peptídeo resultante seja direciona-

. 60 do para uma organela da planta, tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto.

As sequências peptídicas conhecidas por resultarem no direcio- namento de proteínas de fusão para organelas da planta são conhecidas na técnica.

Por exemplo, a região N-terminal do gene da fosfatase ácida do tremoceiro comum Lupinus albus (Genebank ID GI: 14276838; Miller e ou- tros (2001) Plant Physiology 127: 594-606) é conhecida na técnica por resul- tar no direcionamento para o retículo endoplasmático de proteínas heterólo- . gas.

Se a proteína de fusão resultante também contiver uma sequência de retenção endoplasmática que compreende o peptídeo N-termial-lisina-ácido ' 10 —aspártico-ácido glutâmico-leucina (isto é, o motivo "KDEL" (SEQ ID NO: 123) no terminal C, a proteína de fusão será direcionada para o retículo endo- plasmático.

Se a proteína de fusão não tiver uma sequência de direciona- mento para o retículo endoplasmático no terminal C, a proteína será direcio- nada para o retículo endoplasmático, mas será em última análise sequestra- dano apoplasto.

Exemplo 6. Expressão de axmi100 em E. coli e Bacillus O ORF completo de axmi100 (3,45 kb que codificam uma proteí- na de 1156 aminoácidos de comprimento) foi clonado em um vetor de ex- pressão de E. coli baseado no pRSF1b (para fornecer pAX5445) e um vetor de Bacillus baseado no pAX916 (para fornecer pAX5444). Os clones resul- tantes foram confirmados através da análise de restrição e finalmente, atra- vés do sequenciamento completo do gene clonado.

Para a expressão em E. coli, BL21*DE3 foi transformada com pAX5445. Uma colônia isolada foi inoculada em LB suplementado com ca- namicina e crescida durante a noite a 37ºC.

No dia seguinte, o meio fresco foi inoculado em duplicata com 1% da cultura crescida durante a noite e crescido a 37ºC até a fase logarítmica.

Subsequentemente, as culturas fo- ram induzidas com 1 mM de IPTG durante 3 horas a 37ºC ou durante a noite a 20ºC.

Cada pelota de células foi suspensa em 50 mM de tampão carbona- tode sódio, pH 10,5 suplementado com 1 mM de DTT e submetida a ultras- som.

A análise por SDS-PAGE detectou a expressão de uma proteína de 130 kD correspondendo a Axmi100.

. 61 Para a expressão em Bacillus, Bacillus thuringiensis foi trans- formado com pAX5444 e uma colônia isolada foi crescida em meio CYS-glu durante 3 dias até a esporulação.

A pelota de células foi então extraída com 50 mM de tampão carbonato de sódio, pH 10,5 suplementado com 1 mM de DTT.A fração solúvel mostrou a presença de uma proteína Axmi100 de 130 KkD junto com várias bandas de proteínas de pesos moleculares menores devido ao processamento de Axmi100. A tripsinização de Axmi100 forneceu . 2 bandas de proteínas distintas de aproximadamente 65 kD e 55 kD.

Exemplo 7. Ensaio Biológico de Axmi100 ' 10 Preparação de Amostras: Os extratos isentos de células de células expressando AXMI-100 foram tipicamente ressuspensos em 50 mM de tampão carbonato de sódio, PH 10,5, tipicamente com a inclusão de 1 mM de DTT como um agente redu- tor.

As amostras com e sem tripsina foram preparadas para o teste de en- saio biológico.

Sumário da Metodologia do Bioensaio: Placas de cultura de tecido de 24 poços (Corning) receberam 1 mL de dieta para várias espécies (Bio-Serv) e foi permitido que solidificas- sem.

Uma vez solidificadas, 40 ul. de amostra de proteína foram colocados na superfície da dieta de cada poço e foi permitido que embebes- . sem/secassem à temperatura ambiente.

Dependendo do experimento, mas- sas de ovo ECB, dez larvas neonatas ou uma única larva neonata foi colo- cada em cada poço.

As placas foram seladas com membranas permeáveis a gases (Research Products International) e incubadas a 25 ºC e 90% de UR.

Após cinco ou sete dias (dependendo do experimento), as amostras foram classificadas visualmente comparadas com um controle de apenas tampão ou de extrato não transformado.

A forte atividade de AXMI-100 foi observada sobre a Broca do Milho Europeu e da Larva de Botão do Tabaco.

A atividade sobre a lagarta- rosca negra foi observada em altas concentrações de proteína.

Alguma ati- vidade também foi observada em altas concentrações sobre a lagarta da soja, mas a atividade tanto sobre a lagarta-rosca negra quanto a lagarta da

' 62 soja era menos pronunciada e mais variável que para os outros insetos tes- tados. A tripsinização de Axmi100 forneceu 2 bandas de proteínas distintas de aproximadamente 65 kD e 55 kD e não parecia ser necessária para a atividade de AXMI-100. Exemplo8.Ensaios Adicionais da Atividade Pesticida ' A capacidade de uma proteína pesticida de atuar como um pes- tícida sobre uma praga é frequentemente avaliada de várias maneiras. Uma - maneira bem conhecida na técnica é a realização de um ensaio de alimenta- ção. Em tal ensaio de alimentação, a praga é exposta a uma amostra que ' 10 contém os compostos que serão testados ou amostras de controle. Frequen- temente isto é realizado colocando o material que será testado ou uma dilui- ção adequada de tal material, sobre um material que a praga irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material que será testado pode ser composto de um líquido, um sólido ou uma suspensão. O material que será testado pode ser colocado sobre a superfície e então é permitido que seque. Alternativa- mente, o material que será testado pode ser misturado com uma dieta artifi- cial fundida, então distribuído dentro da câmara de ensaio. A câmara de en- saio pode ser, por exemplo, um copo, um prato ou um poço de uma placa de microtitulação.

Os ensaios para pragas sugadoras (por exemplo, pulgões) po- dem envolver a separação do material de teste do inseto através de uma divisão, de forma ideal uma porção que pode ser perfurada pelas partes bu- cais sugadoras do inseto sugador, para permitir a ingestão do material de teste. Frequentemente o material de teste é misturado com um estimulante de alimentação, tal como a sacarose, para promover a ingestão do composto de teste.

Outros tipos de ensaios podem incluir a microinjeção do material de teste dentro da boca ou do intestino da praga, bem como o desenvolvi mento de plantas transgênicas, seguido pelo teste da capacidade da praga dese alimentar da planta transgênica. O teste com planta pode envolver o isolamento de partes da planta normalmente consumidas, por exemplo, pe- quenas gaiolas ligadas a uma folha ou o isolamento de plantas inteiras em

. 63 gaiolas contendo insetos.

Outros métodos e abordagens para analisar as pragas são co- nhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson, J.L. & H. K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, os ensaios estão comumente descritos nos pe- riódicos "Arthropod Management Tests" e "Journal of Economic Entomology" ou por discussão com membros da Sociedade Entomológica da América . (Entomological Society of America (ESA)). Exemplo 9. Bioensaio de Axmi079 e Axmi082 , 10 Expressão e Purificação Gênica e As regiões de DNA que codificam os domínios de toxina de Axmi079 e Axmi082 foram clonadas separadamente em um vetor de expres- são de E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE que codifica a proteína de liga- ção com a Maltose (MBP). Estas fusões em quadro resultaram na expressão de proteínas de fusão MBP-Axmi em E. coli.

e Para a expressão em E. coli, BL21*DE3 foi transformada com plasmídeos individuais. Uma colônia isolada foi inoculada em LB suplemen- tado com carbenicilina e glicose e crescida durante a noite a 37ºC. No dia seguinte, o meio fresco foi inoculado com 1% da cultura realizada durante a noitee crescido a 37ºC até a fase logarítmica. Subsequentemente, as cultu- ras foram induzidas com 0,3 mM de IPTG durante a noite a 20ºC. Cada pelo- ta de célula foi suspensa em 20 mM de tampão Tris-Cl, pH 7,4 + 200 mM de NaCl + 1 mM de DTT + inibidores de proteases e submetida a ultrassom. A análise por SDS-PAGE confirmou a expressão de proteínas de fusão.

e Extratos isentos de células totais foram corridos ao longo de uma coluna de amilose conectada ao FPLC para a purificação por afinidade das proteínas de fusão MBP-axmi. A proteína de fusão ligada foi eluída da resina com uma solução de maltose a 10 mM. As proteínas de fusão purifi- cadas foram então clivadas com Fator Xa ou tripsina para remover a marca- çãoMBP amino terminal da proteína Axmi. A clivagem e a solubilidade das proteínas foram determinadas por SDS-PAGE.

Bioensaios com Insetos

. 64 e As proteínas clivadas foram testadas em ensaios com insetos com controles apropriados.

Uma leitura das placas no dia 5 mostrou as atívi- dades a seguir destas proteínas.

Proteína Axmi | Proteína de fusão MBP- | Atividade sobre os insetos Axmi clivada com Axmio79 Fator Xa, tripsina Traça do gênero Scythropia Axmio82 Fator Xa, tripsina Traça do gênero Scythropia Resultados de bioensais com insetos adicionais: C. - amostra ele- Gene testada gans | VBC* SWCB* | CPB* | ECB* Hz* Hv* extrato AxXxmiso | bruto 3,3 purifica- da, dige- Axmi52 | rida 1,0% purifica- da, dige- AXmi58 | rida 4, 100% extrato AXmi68 | bruto 3,2 purifica- da, dige- AXmi88 | rida 1,0% 1,0% Purifica- da, dige- Axmi93 | rida 20% purifica- da, dige- Axmigs7 | rida 1,0% extrato Axmi102 | bruto 4,100% 3,75% purifica- da, dige- Axmi112 | rida 3,0% | 4/100% 3,25% 375% |10% |30% purífica- da, dige- Axmi117 | rida 1,25% purifica- da, dige- Axmi100 | rida 4,100% 4,100% VBC = Lagarta da soja DBM = traça do gênero Scythropia i SWCB = Broca do milho do sudoeste

W 65 CPB = Besouro da batata do Colorado ECB = Broca do milho europeu Hz = Helicoverpa zea Hv = Heliothis virescens * = representado como retardo do desenvolvimento e porcenta- gem de mortalidade quando o retardo do desenvolvimento é classificado de acordo com a escala a seguir: : [escore [Deinição o sematídade | [1 —— ÍRetardodo desenvolvimento não uniforme ligeiro [2 — — | Retardo do desenvolvimento não uniforme — == & |3 — — | Retardo do desenvolvimento uniforme | AE toa, sa na forma de uma porcentagem |s — | Retardo do desenvolvimento uniforme com 100% de mortalidade | Exemplo 10. Vetorização dos Genes Pesticidas da Invenção para Expressão em Plantas Cada uma das regiões codificadoras dos genes da invenção é conectada independentemente a sequências promotoras e terminadoras a- propriadas para a expressão em plantas.

Tais sequências são bem conheci- das na técnica e podem incluir o promotor da actina do arroz ou o promotor da ubiquitina do milho para a expressão em monocotiledôneas, o promotor UBO3 de Arabidopsis ou o promotor 358 de CaMV para a expressão em dicotiledôneas e os terminadores nos ou Pinll.

As técnicas para a produção e para a confirmação de construtos promotores — genes — terminadores também são bem conhecidas na técnica.

Exemplo 11. Transformação dos genes da invenção nas células vegetais através de transformação mediada por Agrobacterium As espigas são coletadas 8-12 dias após a polinização.

Os em- briões são isolados das espigas e tais embriões com tamanho de 0,8-1,5 mm são utilizados para a transformação.

Os embriões são plaqueados com o escutelo voltado para cima em um meio de incubação adequado e são in-

. 66 cubados durante a noite a 25ºC na escuridão.

Entretanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite.

Os embriões são colocados em contato com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para a transferência mediada pelo plasmídeo Ti durante 5-10 min e então —plaqueados em meio de cocultivo durante 3 dias (25ºC na escuridão). Após o cocultivo, os explantes são transferidos para o meio de período de recupe- ração durante cinco dias (a 25ºC na escuridão). Os explantes são incubados » em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção particular utilizada.

Após o período de sele- Í 10 ção,o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada.

Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob luz fraca e o método de regeneração é iniciado como conhecido na técnica.

É permiti- do que os brotos resultantes produzam raiz no meio de enraizamento e as plantas resultantes sejam transferidas para vasos de sementeiras e propa- gadas como plantas transgênicas.

Exemplo 12. Transformação de Células de Milho com os genes pesticidas da invenção As espigas de milho são coletadas 8-12 dias após a polinização.

Os embriões são isolados das espigas e os embriões com tamanho de 0,8- 1,5 mm são utilizados para a transformação.

Os embriões são plaqueados com o escutelo voltado para cima em um meio de incubação adequado, tal como o meio DN62A5S (3,98 g/L de Sais N6; 1 mL/L (de Estoque 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L del-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarose; 1 mU/L (de Estoque a 1 mg/mL) de 2,4-D) e incubados durante a noite a 25ºC na escu- ridão.

Os explantes resultantes são transferidos para quadrados de te- la (30-40 por placa), transferidos para o meio osmótico durante 30-45 minu- tos, então transferidos para uma placa de irradiação (ver, por exemplo, a Publicação PCT No.

WO/0138514 e a Patente U.S.

Nº 5.240.842). Os construtos de DNA planejados para expressarem os genes

. 67 da invenção nas células vegetais são acelerados para dentro do tecido vege- tal utilizando um acelerador de irradiação por aerossol, utilizando condições essencialmente como são descritas na Publicação PCT No.

WO/0138514. Após a irradiação, os embriões são incubados durante 30 min em meio os- mótico, então colocados em meio de incubação durante a noite a 25ºC na escuridão.

Para evitar danificar de forma desnecessária os explantes irradia- dos, estes são incubados durante pelo menos 24 horas antes da transferên- , cia para o meio de recuperação.

Os embriões são então espalhados sobre o meio de período de recuperação, durante 5 dias, 25ºC na escuridão, então ' 10 transferidos para um meio de seleção.

Os explantes são incubados no meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e das carac- terísticas da seleção particular utilizada.

Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação de embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada.

Os embriões —somáticos maduros são então colocados sob luz fraca e o processo de re- generação é iniciado através de métodos conhecidos na técnica.

É permitido que os brotos produzam raiz em meio de enraizamento e as plantas resul- tantes são transferidas para vasos de sementeiras e propagadas como plan- tas transgênicas.

Materiais Meio DN62A5S (Componentes = fortitro O Fonte | IN6 (Prod.

No.

C 416) Labs IN6 (Prod.

No.

C 149) Labs Labs Labs Labs

- 68 componentes — —poriiro | Fonte Ig/mL) Ajustar o pH da solução em pH até 5,8 com 1 N de KOH/1 N de KCl, adicionar Gelrite (Sigma) a 3g/L e autoclavar.

Após o resfriamento a 50ºC, adicionar 2 mU/L de uma solução estoque a 5 mg/mL de Nitrato de Prata (Phytotechnology Labs). O protocolo rende aproximadamente 20 pla- cas Todas as publicações e os pedidos de patentes mencionados no - relatório descritivo são indicativos do nível de conhecimento dos peritos na técnica à qual este invenção pertence.

Todas as publicações e os pedidos de patentes são incorporados aqui por referência até a mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado como referência.

Embora a invenção descrita acima tenha sido descrita em alguns detalhes através de ilustração e exemplo com a finalidade de clareza do entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO:1-60e124-132; b) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de qualquer a uma das SEQ ID NO: 1-60 e 124-132, em que a dita sequência de nucleotí- deos codifica um polipeptídeo que possui atividade pesticida; ] 10 c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141; e, d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos coma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141, em que o dito polipeptídeo possui atividade pesticida.

2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindi- cação 1, em que a dita sequência de nucleotídeos é uma sequência sintética que foi planejada para expressão em uma planta.

3. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindi- cação 2, em que a dita sequência de nucleotídeos é selecionada de qual- quer uma das SEQ ID NO: 142-283.

4. Vetor que compreende a molécula de ácido nucleico como de- finida na reivindicação 1.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, que compreende ain- da uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.

6. Célula hospedeira que contém o vetor como definido na rei- vindicação 4.

7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6, que é uma célula hospedeira bacteriana.

8. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6, que é uma célula vegetal.

- 2

9. Planta transgênica que compreende a célula hospedeira como definida na reivindicação 8.

10. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 9, em que a dita planta é selecionada do grupo que consiste em milho, sorgo, trigo, re- polho, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba de açúcar, cana de açúcar, tabaco, cevada e semente oleosa de colza. a

11. Polipeptídeo isolado com atividade pesticida, selecionado do grupo que consiste em: ' 10 a) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoáci- dos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141; b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoá- cidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a se- quência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133- 141,em que o dito polipeptídeo possui atividade pesticida; c) um polipeptídeo que é codificado pela sequência de nucleotí- deos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283; e, d) um polipeptídeo que é codificado por uma sequência de nu- cleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283, em que o dito poli- peptídeo possui atividade pesticida.

12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, que compre- ende ainda sequências de aminoácidos heterólogas.

13. Anticorpo que se liga seletivamente ao polipeptíideo como definido na reivindicação 11.

14. Composição que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 11.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que a di- ta composição é selecionada do grupo que consiste em um pó, uma poeira, um pélete, um grânulo, um spray, uma emulsão, um coloide e uma solução.

16. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que a di- ta composição é preparada através de dessecação, liofilização, homogenei-

- 3 i zação, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células de Bacillus thuringiensis.

17. Composição de acordo com a reivindicação 14, que compre- ende de aproximadamente 1% até aproximadamente 99% em peso do dito polipeptídeo.

18. Método para o controle de uma população de pragas de le- pidóptero ou coleóptero que compreende o contato da dita população com » uma quantidade pesticidamente eficiente do polipeptídeo como definido na reivindicação 11.

" 10 19. Método para matar uma praga de lepidóptero ou coleóptero, que compreende o contato da dita praga com ou a alimentação da dita pra- ga, uma quantidade pesticidamente eficiente do polipeptídeo como definido na reivindicação 11.

20. Método para a produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, que compreende o cultivo da célula hospedeira como definida na reivindicação 6, sob condições em que a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é expressa.

21. Planta que possui incorporada de forma estável em seu ge- noma um construto de DNA que compreende uma sequência de nucleotí- deos que codifica uma proteína que possui atividade pesticida, em que a dita sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283; b) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo que possui atividade pesticida; c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:61-121e133-141;e, d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos

- 4 com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141, em que o dito polipeptídeo possui atividade pesticida; em que a dita sequência de nucleotídeos é ligada de forma operacional a um promotor que controla a expressão de uma sequência codificadora em uma célulavegetal.

22. Planta de acordo com a reivindicação 21, em que a dita plan- ta é uma célula vegetal.

a 23. Semente transgênica da planta como definida na reivindica- ção 22.

. 10 24. Método para proteção de uma planta de uma praga, que compreende introdução na dita planta ou na célula da mesma de pelo menos um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pesticida, em que a dita sequência de nucleotí- deos é selecionada do grupo que consiste em: a) a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283; b) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo que possui atividade pesticida; c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141; e, d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 61-121 e 133-141, em que o dito polipeptídeo possui atividade pesticida.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita planta produz um polipeptídeo pesticida que possui atividade pesticida con- trauma praga de lepidóptero ou coleóptero.

i RESUMO Patente de Invenção: "GENES DE TOXINA E MÉTODOS PARA USO DOS MESMOS". A presente invenção refere-se a composições e a métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes.

São fornecidas composições que compreendem uma sequência codificadora de um polipeptídeo de delta-endotoxina.

As sequências codifi- - cadoras podem ser utilizadas em construtos de DNA ou cassetes de expres- são para a transformação e a expressão em plantas e bactérias.

As compo- . 10 sições compreendem ainda bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformados.

Em particular, são fornecidas moléculas de ácidos nucleicos de delta-endotoxina isoladas.

Adicionalmente, são abrangidas as sequências de aminoácidos que correspondem aos polinucleotídeos e os anticorpos que se ligam especificamente a tais sequências de aminoácidos.

Em particular, a presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nuclei- cos isoladas que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 61-121 e 133-141 ou a sequência de nucleotídeos apresentada nas SEQ ID NO: 1-60, 124-132 e 142-283, bem como variantes e fragmentos das mesmas.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: ' Código de Controle Campo 1

OVO O Campo 2 ano Outras Informações: - Nome do Arquivo: P171482List.Seq.conf.txt - Data de Geração do Código: 15-12-2010 - Hora de Geração do Código: 13:33:38 - Código de Controle: c - Campo 1: ESSD8A0328C20AD8 - Campo 2: 0430B628A5503F99 Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList)