ES2912932T3 - Anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos y procedimientos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo activable biespecífico, donde dicho anticuerpo activable biespecífico comprende: (i) un primer brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de células efectoras inmunitarias; (ii) un segundo brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de unión a la diana que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana; donde el AB1 está unido a un primer resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento del MM1 al AB1 reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana, donde el MM1 está acoplado al AB1 a través de una primera secuencia de resto escindible (CM1) que incluye un sustrato para una proteasa; donde el AB2 está unido a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 al AB2 reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana; donde el MM2 está acoplado al AB2 a través de una segunda secuencia de resto escindible (CM2) que incluye un sustrato para una proteasa; y donde el primer brazo del anticuerpo activable biespecífico en un estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM1-CM1-AB1 y el segundo brazo del anticuerpo activable biespecífico en el estado no escindido tiene una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM2-CM2-AB2.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos y procedimientos de uso de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere generalmente a anticuerpos activables biespecíficos que se unen específicamente a dos dianas o epítopos diferentes, así como a procedimientos de fabricación y uso de estos anticuerpos activables biespecíficos en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los anticuerpos monoclonales han surgido como moléculas para intervención terapéutica en una variedad de trastornos. Sin embargo, dirigirse a o neutralizar una sola proteína no siempre es suficiente para el tratamiento efectivo de ciertos trastornos, lo que limita el uso terapéutico de anticuerpos monoclonales monoespecíficos. Por otra parte, las terapias basadas en anticuerpos han demostrado ser tratamientos efectivos para varias enfermedades, pero en algunos casos, las toxicidades debidas a una expresión diana amplia han limitado su eficacia terapéutica. Además, terapias basadas en anticuerpos han mostrado otras limitaciones, tal como la depuración rápida de la circulación después de la administración. El documento WO2010/081173 describe anticuerpos modificados que contienen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) modificado con un resto de enmascaramiento (MM). Dichos anticuerpos modificados pueden acoplarse además a un resto escindible (CM), lo que resulta en anticuerpos activables (Aa ), donde el CM es capaz de escindirse, reducirse, fotolizarse o modificarse de otro modo. El documento US2013/150558 describe anticuerpos anti-EGFR enmascarados y establece que dos mAb pueden formar un heterodímero para producir un complejo de mAb enmascarado cruzado. Donaldson y col. (2009) Cancer Biology & Therapy, 8:22, pp.
2147-152, investigó fragmentos de anticuerpos anti-EGFR enmascarados. Reusch y otros. (2006) Clinical Cancer Research, 12:1, pp. 183-190, investigó la selección de anticuerpos EGFR combinados con citotoxicidad mediada por células T.
Por consiguiente, existe una necesidad de anticuerpos y agentes terapéuticos que permitan direccionamiento de múltiples dianas y/o múltiples epítopos con una sola molécula y también proporcionan una mayor selectividad para las dianas deseadas y una reducción de los efectos adversos tras la administración.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un anticuerpo activable biespecífico, tal como se define por el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Un aspecto de la presente descripción proporciona anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos activables multiespecíficos Los anticuerpos multiespecíficos proporcionados en esta invención son anticuerpos que reconocen dos o más antígenos o epítopos diferentes. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son anticuerpos multiespecíficos que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido al menos a un dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico de tal forma que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM está acoplado al dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico a través de un resto escindible (CM) que funciona como un sustrato para una proteasa. Los anticuerpos multiespecíficos activables proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a una diana que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos se diseñan para acoplarse a células efectoras inmunitarias, también denominadas en esta invención como anticuerpos multiespecíficos de acoplamiento inmunitario-efector y/o anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento inmunitario-efector. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a leucocitos, también denominados en esta invención como anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a leucocitos y/o anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a leucocitos. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a células T, también denominados en esta invención anticuerpos multiespecíficos de acoplamiento a células T y/o anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a células. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos se acoplan a un antígeno de superficie en un leucocito, tal como en un célula T, en una célula citolítica natural (NK), en una célula mononuclear mieloide, en un macrófago, y/o en otra célula efectora inmune. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un célula T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para unirse o interactuar de otro modo con más de una diana y/o más de un epítopo, también denominados en esta invención como anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos. Como se usa en esta invención, los términos "diana" y "antígeno" se usan indistintamente.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos que se acoplan a células efectoras inmunitarias incluyen un anticuerpo dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de células efectoras o porción de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias multiespecíficas incluye un anticuerpo dirigido al cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de célula efectora inmunitaria o porción de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria que se acopla a anticuerpos multiespecíficos incluye un anticuerpo IgG dirigido contra cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo y una célula efectora inmunitaria que se acopla a scFv. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un célula T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear mieloide.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos de acoplamiento de células T incluyen un anticuerpo dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento al célula T o porción de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos de acoplamiento de células T incluyen un anticuerpo dirigido al cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de células T o porción de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos de acoplamiento de células T incluyen un anticuerpo IgG dirigido contra cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo y un scFv que se acopla a células T. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico de acoplamiento a célula T incluye un scFv épsilon anti-CD3 (CD3e, también denominado en esta invención como CD3c y CD3) y un anticuerpo dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico que se acopla a células T incluye un anti-CD3£ scFv y un anticuerpo dirigido al cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico de acoplamiento de células T incluye un anti-CD3£ scFv y un anticuerpo de IgG dirigido contra cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico de acoplamiento de células T incluye un seFv anti-CD3 épsilon (CD3e) que se deriva de OKT3. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico de acoplamiento de células T incluye un scFv anti-CTLA-4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos que se acoplan a células efectoras inmunitarias de la descripción incluyen un anticuerpo dirigido o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo que se une a células efectoras inmunitarias o una parte de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno de los anticuerpos dirigidos o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo que se acopla a la célula efectora inmunitaria o la porción que se une al antígeno del mismo está enmascarada. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células efectoras inmunes, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2), de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células efectoras inmunes, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras no inmunes es un anticuerpo dirigido a un cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo efector de células no inmunes es una IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes es un scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido (por ejemplo, el anticuerpo efector de células no inmunes) es una IgG, y el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes es un scFv. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un célula T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear mieloide.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a células T de la descripción incluyen un anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de células T o porción de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo de acoplamiento a células T o porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento de unión al antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera Diana de acoplamiento de células T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a loa segunda diana.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a células T incluyen un anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de células T o porción de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo de acoplamiento a células T o porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento de células T incluyen un anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo y un scFv de acoplamiento a células T, donde al menos uno del anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo y/o el anticuerpo de acoplamiento a células T o porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana racionada con cáncer.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células efectoras inmunitarias, un antígeno es típicamente un antígeno presente en la superficie de una célula menor u otro tipo de célula asociado con la enfermedad, tal como, pero sin limitarse a, cualquier diana enumerada en la Tabla 1, tal como, pero sin limitarse a, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3 o CD71 (receptor de transferrina) y otro antígeno es típicamente un receptor estimulante o inhibidor presente en la superficie de una célula T, célula citolítica natural (NK), célula mononuclear mieloide, macrófago y/u otra célula efectora inmunitaria, tal como, pero sin limitarse a, B7-H4, BTLA,. CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28. CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT. TIM3 o VISTA. En algunas realizaciones, el antígeno es un receptor estimulante presente en la superficie de una célula T o célula NK; ejemplos de dichos receptores estimulantes incluyen, pero sin limitarse a, CD3.. c D27, CD28, CD137 (también denominado 4-1BB), GITR, HVEM, ICOS. NKG2D y OX40. En algunas realizaciones, el antígeno es un receptor inhibidor presente en la superficie de un célula T; ejemplos de dichos receptores inhibitorios incluyen, pero sin limitarse a, BTlA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3 y KIR expresadas en NK. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de células T también puede estar sustituido por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de células T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes. B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2 o TNFSF9.
Una realización de la descripción es un anticuerpo activable multiespecífico que es activable en un microambiente de cáncer y que incluye un anticuerpo, por ejemplo, una IgG o scFv. dirigido a una diana de tumor y un anticuerpo agonista, por ejemplo, una IgG o scFv dirigido a un receptor coestimulante expresado en la superficie de una célula T o célula NK activada, donde al menos uno del anticuerpo diana de cáncer y/o anticuerpo agonista está enmascarado. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a, CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D y OX40. En esta realización, el anticuerpo activable multiespecífico, una vez activado por proteasas asociadas con tumores, reticularía y activaría efectivamente los receptores coestimuladores expresados por células T o células NK de una manera dependiente del tumor para mejorar la actividad de células T que responden a cualquier antígeno tumoral a través de su antígeno de células T endógeno o receptores activadores de NK. La naturaleza dependiente de la activación de estos receptores coestimuladores de células T o células NK centraría la actividad del anticuerpo activable multiespecífico activado a células T específicas del tumor, sin activar todas las células T independientemente de su especificidad de antígeno. En una realización, al menos el anticuerpo receptor coestimulador del anticuerpo activable multiespecífico se enmascara para impedir la activación de células T autorreactivas que pueden estar presentes en tejidos que también expresan el antígeno reconocido por el anticuerpo dirigido a la diana tumoral en el anticuerpo activable multiespecífico, pero cuya actividad está restringida por la falta de acoplamiento del co-receptor.
Una realización de la descripción es un anticuerpo activable multiespecífico que se puede activar en una enfermedad caracterizada por sobreestimulación de células T, tal como, pero sin limitarse a, una enfermedad autoinmunitaria o microambiente de enfermedad inflamatoria. Dicho anticuerpo activable multiespecífico incluye un anticuerpo, por ejemplo una IgG o scFv, dirigida a una diana que comprende un antígeno de superficie expresado en un tejido dirigido por una célula T en enfermedad autoinmune o inflamatoria y un anticuerpo, por ejemplo una IgG o acFv, dirigida a un receptor inhibidor expresado en la superficie de un célula T o célula NK, donde al menos uno del anticuerpo diana de tejido de enfermedad y/o anticuerpo receptor inhibidor de células T está enmascarado. Ejemplos de receptores inhibidores incluyen, pero sin limitarse a, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, y KIR expresadas en NK. Ejemplos de un antígeno tisular dirigido por células T en enfermedad autoinmunitaria incluyen, pero sin limitarse a, un antígeno de superficie expresado en mielina o células nerviosas en esclerosis múltiple o un antígeno de superficie expresado en células de islotes pancreáticos en diabetes tipo 1. En esta realización, el anticuerpo multiespecífico capaz de actuar cuando se localiza en el tejido bajo ataque autoinmunitario o inflamación se activa y se co-acopla al inhibidor/ receptor de células T o células NK para suprimir la actividad de células T autorreactivas que responden a cualquier antígeno dirigido al tejido de la enfermedad a través de su TCR endógeno o receptores de activación. En una realización, al menos uno o múltiples anticuerpos se enmascaran para impedir la supresión de las respuestas de células T deseadas en tejidos sin enfermedad donde también se puede expresar el antígeno diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a células T incluye un anti-CD3 épsilon (CD3e, también denominado en esta invención CD3e y CD3) scFv y un anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del scFv anti-CD3£ y/o el anticuerpo dirigido o la porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del ABJ para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a células T incluye un anti-CD3E scFv y un anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del anti-CD3s scFv y/o el anticuerpo dirigido a cáncer o la porción de unión a antígeno del mismo está enmascarada. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a células T incluye un anti-CD3£ scFv y un anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno de anti-CD3£ scFv y/o el anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e,, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a células T incluye un anti-CD3 épsilon (CD3e) scFv que se deriva de OKT3. donde al menos uno del anticuerpo dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo y/o el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 está enmascarado. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecifico que se acopla a células T incluye un scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 y un anticuerpo dirigido al cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno del scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 y/o el anticuerpo dirigido al cáncer o porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células T incluye un scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 y un anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno del scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 y/o el anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo de IgG dirigido a cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AS1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a células T incluye un anti-CTLA-4 scFv, donde al menos uno del anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anti-CTLA-4 scFv está enmascarado. En algunas realizaciones, el CTLA-4 scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anti-CTLA-4 scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB I) que se une a CTLA-4, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecifico que se acopla a células T incluye un anti-CTLA-4 scFv y un anticuerpo de IgG dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo donde al menos uno de los anti-CTLA-4 scFv y/o el anticuerpo de IgG dirigido o porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el CTLA-4 scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el CTLA-4 scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4, y el anticuerpo de IgG dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una primera diana y/o un primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una segunda diana y/o un segundo epítopo. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o los anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a dos o más dianas diferentes. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o los anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a dos o más epítopos diferentes en la misma diana. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a una combinación de dos o más dianas diferentes y dos o más epítopos diferentes en la misma diana.
Varias realizaciones de anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción se muestran en las Figuras 3 A y 5­ 9. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende una IgG tiene los dominios variables de IgG enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende un scFv tiene los dominios de scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento y al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde cada uno de los dominios variables de IgG y los dominios de scFv está acoplado a su propio resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de células T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad para un antígeno diana y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad para otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad para un epítopo de un antígeno diana y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad para otro epítopo del antígeno diana.
En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo carboxilo de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG, o al extremo carboxilo de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv se puede fusionar al extremo amino de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo amino de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG o a los extremos amino de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv se puede fusionar a cualquier combinación de uno o más extremos carboxilo y uno o más extremos amino de un anticuerpo activable de IgG. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de la IgG. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de una IgG, y un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv.
La descripción proporciona ejemplos de estructuras de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen, pero sin limitarse a, los siguientes: (VL-CL)2(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 ; (VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 ;(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2 ; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2 : (VL-CL)2 :(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL12 :(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 : (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 (VL-CL-L4- VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*- L4-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 : (VL-CL-L4-VH*-L1-VL*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2 :(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH 1-CH2-CH3)2 ; (VL- CL-L4-VL*-L3-VH*)2 : (MM-L 1 -CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 :(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 : (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 : (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; o (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1 -MM)2 : (VH *-L3-VL*-L4-VH-CH 1-CH2-CH3)2. donde: VL y VH representan los dominios variables ligeros y pesados de la primera especificidad, contenidos en la IgG; VL* y VH* representan los dominios variables de la segunda especificidad, contenidos en el scFv; L1 es un péptido enlazador que conecta el resto de enmascaramiento (MM) y el resto escindible (CM); L2 es un péptido enlazador que conecta el resto escindible (CM), y el anticuerpo; L3 es un péptido enlazador que conecta los dominios variables del scFv; L4 es un péptido enlazador que conecta el anticuerpo de la primera especificidad con el anticuerpo de la segunda especificidad; CL es el dominio constante de cadena ligera y CH1, CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada. Las primera y segunda especificidades pueden ser hacia cualquier antígeno o epítopo.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a células T, un antígeno es típicamente un antígeno presente en la superficie de una célula tumoral u otro tipo de célula asociado con la enfermedad, tal como, pero sin limitarse a, cualquier diana enumerada en la Tabla 1, tal como, pero limitado a, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, o CD71 (receptor de transferrina) y otro antígeno es típicamente un estimulante (también denominado en esta invención como activador) o receptor inhibidor presente en la superficie de una célula T, célula citolítica natural (NK), célula mononuclear mieloide, macrófago y/u otra célula efectora inmunitaria, tal como, pero sin limitarse a, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27. CD28, CD32, CD56. CD137 (también denominado TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 o VISTA. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de células T también puede estar sustituido por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de células T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes, tales como, pero sin limitarse a, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2 o TNFSF9. En algunas realizaciones de un anticuerpo activable dirigido a múltiples antígenos, un antígeno se selecciona de entre el grupo de dianas enumeradas en la Tabla 1, y otro antígeno se selecciona de entre el grupo de dianas enumeradas en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo anti-EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v5, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v4, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v6, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo anti-Jagged. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es 4D11, que es específico para la unión a Jagged 1 y Jagged 2 humano y de ratón. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es 4D11v2, que es específico para la unión a Jagged 1 y Jagged 2 humano y de ratón.
En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido puede estar en forma de un anticuerpo activable. En algunas realizaciones, los scFv pueden estar en forma de un Pro- scFv (véase, por ejemplo, WO 2009/025846, WO 2010/081173).
En algunas realizaciones, el scFv es específico para unirse a CD3e, y es o se deriva de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD3e, por ejemplo, CH2527, FN18, H2C, OKt 3, 2C11, UCHT1, o V9. En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión a CTLA-4 (también denominado en esta invención como CTLA y CTLA4).
En algunas realizaciones, el anti-CD3£ scFv incluye una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5. En algunas realizaciones, el anti-CD3£ scFv incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en esas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en los Ejemplos 5.
En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión de una o más células T, una o más células NK y/o uno o más macrófagos. En algunas realizaciones, el scFv es específico para unirse a una diana seleccionada de entre el grupo que consiste en B7-H4. BTLA, CD3, CD4, CD8, CD 16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD 137. CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 o VISTA.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos, los anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o los anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SY AMS (SEQ ID NO: 6); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSv Kg (SEQ ID NO: 7); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8), y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2 y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL c DR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de la secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 9); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 10); una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11), y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos conjugados activables multiespecíficos proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2. y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SY AMS. (SEQ ID NO: 6); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos STDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8), y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, activables, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos multiespecíficos activables conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged. por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de la secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 9): una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 10); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11), y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2. y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos SY AMS (s Eq ID NO: 6); la secuencia VH CD2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7); la secuencia VH CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8); la secuencia VL CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 9); la secuencia VL CDR2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 10); y la secuencia VL CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11).
En algunas realizaciones, los, anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2. y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia Vh CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SY AMS (SEQ ID NO: 6); la secuencia VH CD2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7): la secuencia VH CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8); la secuencia VL CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 9); la secuencia VL CDR2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 10); y la secuencia VL CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11).
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 12); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de las secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 16); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17) y combinaciones de los mismos. /
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 12); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 91 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos multiespecíficos conjugados que se proporcionan en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de la secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15 ); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 16); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17), y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo ( AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos NYGVH (s Eq ID NO: 12); la secuencia VH CD2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); la secuencia VH CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); la secuencia VL CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); la secuencia VL CDR2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 16); y la secuencia VL CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17).
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 12): la secuencia VH CD2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); la secuencia VH CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); la secuencia VL CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); la secuencia VL CDR2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 16); y la secuencia VL CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17).
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se selecciona de entre el grupo que consiste en aquellas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se selecciona de entre el grupo que consiste en aquellas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se selecciona de entre el grupo que consiste en aquellas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se selecciona de entre el grupo que consiste en aquellas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la 'tabla 11 en la misma. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados proporcionados en esta invención incluyen al menos una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos, anticuerpos multiespecíficos conjugados y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados que se proporcionan en esta invención incluyen al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en aquellas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en esas secuencias que se muestran en la Tabla 7 y/o en el Ejemplo 5, que incluye la Tabla 11 en la misma.
En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente está conjugado con el anticuerpo activable multiespecífico a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente que se selecciona de entre el grupo enumerado en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una cahehcamicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico puede diseñarse para incluir uno o más enlaces disulfuro.
La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo activable multiespecífico descrito en esta invención, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La descripción proporciona procedimientos para producir un anticuerpo multiespecífico cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo, donde la célula comprende tal molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula comprende tal vector.
La descripción también proporciona anticuerpos activables multiespecíficos y/o composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana o un segundo epítopo, donde al menos el AB1 está acoplado o unido de otro modo a un resto de enmascaramiento (MM1), de modo que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM1 se acopla a AB1 a través de una primera secuencia de resto escindible (CM1) que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que se colocaliza con la diana de AB1 en un sitio de tratamiento o un sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a la diana de AB1 que es al menos comparable al anticuerpo multiespecífico correspondiente no modificado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el MM1 y el CM1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende un péptido de unión entre el CM1 y el AB1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), y al menos una porción del anticuerpo activable multiespecífico tiene la disposición estructural del extremo N al extremo C de la siguiente manera en el estado no escindido: MM1-LP1-CM1-LP2-AB1 o AB1-LP2-CM1-LP1-MM1. En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 18) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 19), donde n es un número entero de al menos uno. En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 incluye una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 20), GGSGG (SEQ ID NO: 21). GSGSG (SEQ ID NO: 22), GSGGG (SEQ ID NO: 23), GGGSG (SEQ ID NO: 24), y GSSSG (SEQ ID NO: 25).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une específicamente a una segunda diana o segundo epítopo. En algunas realizaciones, cada uno de AB en el anticuerpo activable multiespecífico se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, anticuerpo de dominio, cadena simple, fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio simple y un anticuerpo de cadena ligera de dominio simple. En algunas realizaciones, cada uno de Ab en el anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo monoclonal de roedor (por ejemplo, ratón o rata), quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, cada uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una constante de disociación de equilibrio de alrededor de 100 nM o menos para unirse a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones MM1 tiene una constante de disociación de equilibrio para unirse a su AB correspondiente que es mayor que la constante de disociación de equilibrio del AB a su diana o epítopo correspondiente,
En algunas realizaciones, MM1 tiene una constante de disociación de equilibrio para unirse a su AB correspondiente que no es más que la constante de disociación de equilibrio de AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 no interfiere ni compite con el AB correspondiente por unirse a la diana o epítopo correspondiente cuando el anticuerpo activable multiespecífico está en un estado escindido.
En algunas realizaciones MM1 es un polipéptido de alrededor de 2 a 40 aminoácidos en longitud. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos en longitud.
En algunas realizaciones, MM1 tiene una secuencia de polipéptidos que es diferente de la de la diana del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 tiene una secuencia de polipéptídos que no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones MM1 tiene una secuencia de polipéptídos que no es más de un 25 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones MM1 tiene una secuencia de polipéptídos que no es más de un 10 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 20 veces mayor que el Kd del AB cuando no se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 40 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de tal manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 100 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 1000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 10.000 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM I hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el MM1 es una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre MM que se muestran en los Ejemplos proporcionados en esta invención.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye como mínimo un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que inhibe la unión del AB2 a su diana cuando el anticuerpo activable multiespecífico se encuentra en un estado no escindido, y un segundo resto escindible (CM2) acoplado a la AB2, donde el CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para una segunda proteasa. En algunas realizaciones CM2 es un polipéptido de no más de 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la segunda proteasa se colocaliza con la segunda diana o epítopo en un tejido, y donde la segunda proteasa escinde el CM2 en el anticuerpo activable multiespecífico cuando el anticuerpo activable multiespecífico se expone a la segunda proteasa. En algunas realizaciones, la primera proteasa y la segunda proteasa son colocalizadas con la primera diana o epítopo y la segunda diana o epítopo en un tejido. En algunas realizaciones, la primera proteasa y la segunda proteasa son la misma proteasa. En algunas realizaciones, CM1 y CM2 son diferentes sustratos para la misma proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en de los que se muestran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la primera proteasa y la segunda proteasa son proteasas diferentes. En algunas realizaciones, la primera proteasa y la segunda proteasa son proteasas diferentes seleccionadas de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 3.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico, por ejemplo, MM1 y al menos MM2, tiene una constante de disociación de equilibrio para unirse a su AB correspondiente que es mayor que la constante de disociación de equilibrio del AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una constante de disociación de equilibrio para unirse a su AB correspondiente que no es más que la constante de disociación de equilibrio del AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico no interfiere ni compite con su AB correspondiente para unirse a la diana o epítopo correspondiente cuando el anticuerpo activable multiespecífico está en un estado escindido.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de alrededor de 2 a 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos en longitud.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia de polipéptidos que es diferente de la diana del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia de polipéptidos que no es más de 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia de polipéptidos que no es más de 25 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia de polipéptidos que no es más de 10 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de tal manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 20 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 40 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 100 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 1000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de forma que la constante de disociación (Kd) del A b cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 10.000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM es una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre un MM que se muestra en los Ejemplos proporcionados en esta invención.
En algunas realizaciones, la proteasa que escinde la primera secuencia de resto de escisión (CM1) se colocaliza con la diana del AB1 en el anticuerpo activable multiespecífico en un tejido, y la proteasa escinde el CM1 en el anticuerpo activable multiespecífico cuando el anticuerpo activable multiespecífico se expone a la proteasa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecifico incluye más de una secuencia de resto escindible, y la proteasa que escinde al menos una secuencia de resto escindible está colocalizada con la diana de al menos una de las regiones AB en el anticuerpo activable multiespecifico en un tejido, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable multiespecifico cuando el anticuerpo activable multiespecifico se expone a la proteasa.
En algunas realizaciones, cada CM, por ejemplo, CM1 y al menos CM2, se colocan en el anticuerpo activable multiespecífico de modo que en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones a B se reduce para ocurrir con una constante de disociación de equilibrio que es al menos 20 veces mayor que la constante de disociación de equilibrio de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada CM se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de modo que en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para ocurrir con una constante de disociación de equilibrio que es al menos 40 veces mayor que la constante de disociación de equilibrio de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada CM se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de modo que en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para ocurrir con una constante de disociación de equilibrio que es al menos 50 veces mayor que la constante de disociación de equilibrio de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana
En algunas realizaciones, cada CM se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de modo que en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para ocurrir con una constante de disociación de equilibrio que es al menos 100 veces mayor que la constante de disociación de equilibrio de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana
En algunas realizaciones, cada CM se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de modo que en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para ocurrir con una constante de disociación de equilibrio que es al menos 200 veces mayor que la constante de disociación de equilibrio de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana
En algunas realizaciones, cada CM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, al menos un CM en el anticuerpo activable multiespecífico incluye la secuencia de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26). En algunas realizaciones, al menos un resto escindible se selecciona para su uso con una proteasa específica, por ejemplo, una proteasa que se sabe que se colocaliza con por lo menos una diana del anticuerpo activable multiespecífico. Por ejemplo, restos escindibles adecuados para su uso en los anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción se escinden mediante al menos una proteasa tal como uroquinasa, legumaína y/o matriptasa (también denominada en esta invención MT-SP1 o MTSP1). En algunas realizaciones, un resto escindible adecuado incluye al menos una de las siguientes secuencias: TGRGPSWV (SEQ ID NO: 27); SARGPSRW (SEQ ID NO: 28); TARGPSFK (SEQ ID NO: 29): LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 30); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 31); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 32); AARGPAIH (SEQ ID NO: 33); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 34); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 35); RGPATPIM (SEQ ID NO: 36); RGPA (SEQ ID NO: 37); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 38); FPRPLGITGL (SEQ TD NO: 39); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO:40); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 41); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 42); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 43); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 44); y/o PLGL (SEQ ID NO: 45).
En algunas realizaciones, cada CM en el anticuerpo activable multiespecífico es un sustrato para una proteasa que se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en uPA, legumaína, MT-SP1, ADAM 17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, elastasa de neutrófilos, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13 y MMP-14. En algunas realizaciones, la proteasa es una catepsina, tal como, de modo no taxativo, catepsina S. En algunas realizaciones, cada CM en el anticuerpo activable multiespecífico es un sustrato para una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en uPA (activador de plasminógeno de uroquinasa), legumaína y MT-SP1 (matriptasa). En algunas realizaciones, la proteasa comprende uPA. En algunas realizaciones, la proteasa comprende legumaína. En algunas realizaciones, la proteasa comprende MT-SP1. En algunas realizaciones, la proteasa comprende una metaloproteinasa de matriz (MMP).
En algunas realizaciones, al menos, un CM en el anticuerpo activable multiespecífico es un sustrato para al menos dos proteasas. En algunas realizaciones, cada proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en los que se muestran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, al menos un CM en el anticuerpo activable multiespecífico es un sustrato para al menos dos proteasas, donde una de las proteasas se selecciona de entre el grupo que consiste en uPA, legumaína y MT-SP1 y la otra proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, al menos un CM en el anticuerpo activable multiespecífico es un sustrato para al menos dos proteasas seleccionadas de entre el grupo que consiste en uPA, legumaína y MT-SP1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye al menos un primer CM (CM1) y un segundo CM (CM2). En algunas realizaciones, CM1 y CM2 son parte de un único enlazador escindible que une un MM a un AB en algunas realizaciones,. CM1 es parte de un enlazador escindible que une MM1 a AB1, y CM2 es parte de un enlazador escindible separado que une un MM2 a AB2. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos CM. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos CM y más de dos MM. En algunas realizaciones, cada CM1 y CM2 son polipéptidos de no más de 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, al menos uno del primer CM y el segundo CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en aquellas listadas en la Tabla 3. En algunas realizaciones, al menos uno del primer CM y el segundo CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en uPA, legumaína y MT-SP1. En algunas realizaciones, el primer CM se escinde por un primer agente de escisión seleccionado de entre el grupo que consiste en uPA, legumaína y MT-SP1 en un tejido diana, y el segundo CM se escinde por un segundo agente de escisión en un tejido diana. En algunas realizaciones, la otra proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en aquellas que se muestran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en los mencionados en la Tabla 3, y el primer CM y el segundo Cm son diferentes sustratos para la enzima. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en uPA, legumaína y MT-SP1 y el primer CM y el segundo CM son diferentes sustratos para la enzima. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en las mostradas en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son proteasas diferentes. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son proteasas diferentes. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son diferentes proteasas seleccionadas de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión se colocalizan en el tejido diana. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM se escinden por al menos un agente de escisión en el tejido diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico se expone y se escinde por una proteasa de modo que, en el estado activado o escindido, el anticuerpo activable multiespecífico activado incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye al menos una porción de LP2 y/o una secuencia CM después de que la proteasa haya escindido el CM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable multiespecífico a través de un espaciador. En algunas realizaciones, el espaciador se conjuga con el anticuerpo activable multiespecífico en ausencia de un péptido señal. En algunas realizaciones, el espaciador se une directamente a al menos uno de los MM del anticuerpo activable multiespecífico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico en un estado no escindido comprende un espaciador que se une directamente a un primer MM y tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C del espaciador-MM1-CM-AB1. En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 46).
En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es mayor que la del anticuerpo multiespecífico correspondiente; por ejemplo, la pK del anticuerpo activable multiespecífico es mayor que la del anticuerpo multiespecífico correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es similar a la del anticuerpo multiespecífico correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecifico es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecifico es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
La descripción también proporciona composiciones y procedimientos que incluyen un anticuerpo activable multiespecífico que incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico está acoplado a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, cada AB está acoplado a un MM que disminuye la capacidad de su AB correspondiente a cada diana. Por ejemplo, en realizaciones de anticuerpos activables biespecíficos AB1 está acoplado a un primer resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana, y AB2 está acoplado a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos regiones AB; en tales realizaciones, AB1 está acoplado a un primer resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana, AB2 está acoplado a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana, AB3 está acoplado a un tercer resto de enmascaramiento (MM3) que disminuye la capacidad de AB3 para unirse a su diana, y así sucesivamente para cada AB en el anticuerpo activable multiespecífico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye además al menos un resto escindible (CM) que es un sustrato para una proteasa, donde el CM une un MM a un AB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico se acopla a través de un primer resto escindible (CM1) a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones de anticuerpos activables biespecíficos, AB1 está acoplado a través de CM1 a MM1, y AB2 está acoplado a través de un segundo resto escindible (CM2) a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos regiones AB; en algunas de estas realizaciones, AB1 está acoplado a través de CM1 a MM1, AB2 está acoplado a través de CM2 a MM2, y AB3 está acoplado a través de un tercer resto escindible (CM3) a un tercer resto de enmascaramiento (MM3) que disminuye la capacidad de AB3 para unirse a su diana, y así sucesivamente para cada AB en el anticuerpo activable multiespecífico.
Las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención permiten la unión de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en cualquiera de las regiones AB sin comprometer la actividad (por ejemplo, el enmascaramiento, la activación o la actividad de unión) del anticuerpo activable multiespecífico. En algunas realizaciones, las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención permiten la unión de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en cualquiera de las regiones AB sin reducir o alterar de otro modo uno o más enlaces disulfuro dentro de cualquiera de los MM. Las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención producen un anticuerpo activable multiespecífico que se conjuga con uno o más agentes, por ejemplo, cualquiera de una diversidad de agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o profilácticos, preferiblemente sin ninguno de los agentes que se conjugan con cualquiera de los MM del anticuerpo activable multiespecífico. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención producen anticuerpos activables multiespecíficos conjugados en los que cada uno de los MM conserva la capacidad de enmascarar efectiva y eficientemente su AB correspondiente del anticuerpo activable multiespecífico en un estado no escindido. Las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención producen anticuerpos activables multiespecíficos conjugados en los que el anticuerpo activable todavía está activado, es decir, escindido, en presencia de una proteasa que puede escindir el CM.
Los anticuerpos activables multiespecíficos tienen al menos un punto de conjugación para un agente, pero en los procedimientos y composiciones proporcionados en esta invención, menos que todos los posibles puntos de conjugación están disponibles para la conjugación con un agente. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro intercadena. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces sulfuro intercadena, pero no átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro intracadena. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre de cisteína u otros residuos de aminoácidos que contienen un átomo de azufre. Dichos residuos pueden aparecer de forma natural en la estructura del anticuerpo o pueden incorporarse al anticuerpo mediante mutagénesis dirigida a sitio, conversión química, o mala incorporación de aminoácidos no naturales.
También se proporcionan procedimientos para preparar un conjugado de un anticuerpo activable multiespecífico que tiene uno o más enlaces disulfuro intercadena en uno o más del AB y uno o más enlaces disulfuro intracadena en el MM correspondiente, y se proporciona un fármaco reactivo con tioles libres. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial de enlaces disulfuro intercadena en el anticuerpo activable con un agente reductor, tal como, por ejemplo, TCEP; y conjugar el reactivo farmacológico con tioles libres con el anticuerpo activable parcialmente reducido. Como se usa en esta invención, el término reducción parcial se refiere a situaciones donde un anticuerpo activable multiespecífico se pone en contacto con un agente reductor y se reducen menos de todos los enlaces disulfuro, por ejemplo, menos de todos los sitios posibles de conjugación. En algunas realizaciones, menos de 99 %, 98 %, 97 %.
96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o menos de 5 % de todos los posibles sitios de conjugación son reducidos.
En otras realizaciones más, se proporciona un procedimiento para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo activable multiespecífico que da como resultado selectividad en la colocación del agente. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial del anticuerpo activable multiespecífico con un agente reductor de manera que cualquiera de los sitios de conjugación en el resto de enmascaramiento u otra porción no AB del anticuerpo activable no se reduzca, y la conjugación del agente con tioles intercadena en una o más de las regiones AB del anticuerpo activable multiespecífico. El uno o más sitios de conjugación se seleccionan para permitir el posicionamiento deseado de un agente para permitir que la conjugación se produzca en un sitio deseado. El agente reductor es, por ejemplo, TCEP. Las condiciones de reacción de reducción, tales como, por ejemplo, la relación de un agente reductor con respecto a un anticuerpo activable, la duración de la incubación, la temperatura durante la incubación, el pH de la solución de reacción de reducción, etc., se determinan identificando las condiciones que producen un anticuerpo activable conjugado en el que el MM conserva la capacidad de enmascarar efectiva y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. La relación del agente de reducción con respecto al anticuerpo activable multiespecífico variará dependiendo del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la relación de agente reductor con respecto a anticuerpo activable multiespecífico estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5,o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas realizaciones la relación está en el intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la relación está un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para reducir los enlaces disulfuro intercadena en una o más de las regiones AB de un anticuerpo activable multiespecífico y conjugar un agente, por ejemplo, un agente que contiene tiol tal como un fármaco, con los tioles intercadena resultantes para localizar selectivamente uno o más agentes en el AB. El procedimiento generalmente incluye reducir parcialmente una o más de las regiones AB con un agente reductor para formar al menos dos tioles intercadena sin formar todos los tioles intercadena posibles en el anticuerpo activable; y conjugar el agente con los tioles intercadena del AB parcialmente reducido. Por ejemplo, una 0 más de las regiones AB del anticuerpo activable multiespecífico se reduce parcialmente durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37 °C en una relación deseada de agente reductor: anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la relación de agente reductor con respecto a anticuerpo activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
El reactivo que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína o N-acetilcisteína. El agente reductor puede ser, por ejemplo, TCEP. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable reducido puede purificarse antes de la conjugación, usando, por ejemplo, cromatografía en columna, diálisis o diafiltración. Alternativamente, el anticuerpo reducido no se purifica después de la reducción parcial y antes de la conjugación.
La descripción también proporciona anticuerpos activables multiespecíficos parcialmente reducidos en los que al menos un enlace disulfuro intercadena en el anticuerpo activable multiespecífico se ha reducido con un agente reductor sin alterar ningún enlace disulfuro intracadena en el anticuerpo activable multiespecífico, donde el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un primer anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a la diana, un primer resto de enmascaramiento (MM1) que inhibe la unión del ABI del anticuerpo activable multiespecífico en un estado no escindido a la diana, un primer resto escindible (CM1) acoplado al AB1, donde el CM1 es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa, y un segundo anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une específicamente a una segunda diana. En algunas realizaciones, el MM1 está acoplado al AB1 a través del CM1. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracadena del anticuerpo activable multiespecífico no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracadena del MM1 en el anticuerpo activable multiespecífico no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, el agente reductor es TCEP.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos descritos en esta invención se utilizan junto con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista, tal como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos y/o los anticuerpos activables multiespecíficos se pueden utilizar junto con un agente quimioterapéutico o agente anti-neoplásico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional se administran simultáneamente. De manera alternativa, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional están separados entre sí, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional se administran simultáneamente, o el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante el régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico se administra antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico se administra después de la administración del agente adicional, o el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional se administran de manera alterna. Tal como se describe en esta invención, el anticuerpo anti- multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y el agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo activable multiespecífico descrito en esta invención, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La descripción proporciona procedimientos para producir un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico, donde la célula comprende tal molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula comprende tal vector.
La descripción también proporciona un procedimiento para fabricar anticuerpos multiespecíficos de la descripción y/o anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción mediante (a) el cultivo de una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo multiespecífico y/o activable multiespecífico, y (b) la recuperación del anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico.
La presente descripción también proporciona procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión o mejorar de otro modo un síntoma de una o más patologías o aliviar un síntoma asociado con dichas patologías, mediante la administración de un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico de la descripción a un sujeto en el que se desea dicho tratamiento o prevención. El sujeto a tratar es, por ejemplo, humano u otro mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor.
La presente descripción también proporciona procedimientos para inducir la activación y destrucción de células T dependientes de la diana de una célula diana mediante la administración de un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción a un sujeto en el que se desea dicha inducción, donde cuando el anticuerpo activable multiespecífico se encuentra en el estado escindido, por ejemplo, cada resto de enmascaramiento en el anticuerpo activable multiespecífico ya no se une o se asocia de otro modo con el dominio AB correspondiente, se produce la activación y destrucción de células T dependientes de la diana de la célula diana, y cuando el anticuerpo activable multiespecífico se encuentra en el estado no escindido, por ejemplo, al menos un resto de enmascaramiento del anticuerpo activable multiespecífico se une o se asocia de otro modo con el dominio AB correspondiente, la activación y destrucción de células células T dependientes de la diana de la célula diana se reduce o se inhibe de otro modo. Cualquiera de los anticuerpos activables multiespecíficos descritos en esta invención son adecuados para su uso en dichos procedimientos. El sujeto a ser tratado, p.ej, es un humano u otro mamífero. En algunas realizaciones el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor.
Un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico utilizado en cualquiera de las realizaciones de estos procedimientos y usos se puede administrar en cualquier etapa de la enfermedad y/o cualquier etapa en la que se desee la activación y destrucción con células T de una célula diana. Por ejemplo, dicho anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico se puede administrar a un paciente que padece cáncer en cualquier etapa, desde temprano hasta metastásico. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente en esta invención. Un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico utilizado en cualquiera de las realizaciones de estos procedimientos y usos se puede utilizar en un régimen de tratamiento que comprende terapia neoadyuvante. Un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico utilizado en cualquiera de las realizaciones de estos procedimientos y usos puede administrarse solo o en combinación con uno o más agentes adicionales, que incluyen inhibidores de molécula pequeña, otras terapias basadas en anticuerpos, terapias basadas en polipéptidos o péptidos, terapias basadas en ácido nucleico y/u otras biologías.
La descripción proporciona procedimientos para usar los anticuerpos y/o anticuerpos activables en una diversidad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas. Por ejemplo, la descripción proporciona procedimientos y kits para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y una diana de interés en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable multiespecífico que incluye al menos un primer resto de enmascaramiento (MM1), un primer resto escindible (CM1) que se escinde por el agente de escisión, y al menos un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB1) que se une específicamente a la diana de interés, y un segundo dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB2) que se une específicamente a una segunda diana y/o a un segundo epítopo, (a) donde el MM1 es un péptido que inhibe la unión del AB1 a la diana, y donde el MM1 no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB1 y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB1; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM1 interfiere con la unión específica del AB1 a la diana, y en un estado activado escindido, el MM1 no interfiere ni compite con la unión específica del AB1 a la diana; y (ii) medir un nivel de anticuerpo activable multiespecífico activado en el sujeto o muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable multiespecífico activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable multiespecífico activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo activable multiespecífico con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB1. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable multiespecífico en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activable activado multiespecífico, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable multiespecífico incluye un marcador detectable. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador detectable incluye un agente de imagenología, un agente de contraste, una enzima, un marcador fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos, o un marcador basado en ligando. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de imagenología comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CEP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, o un derivado de europio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador luminiscente comprende un derivado de N-metilacridio. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el marcador comprende un marcador Alexa Fluor®, tal como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador basada en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor.
En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vivo. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in situ. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento ex vivo. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vitro.
En algunas realizaciones de los procedimientos y kits, el procedimiento o kit se usa para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el primer resto escindible (CM1) del anticuerpo activable multiespecífico que se está ensayando en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable multiespecífico que comprende tal CM1. Asimismo, los pacientes que den negativo tanto para la diana como para la proteasa que escinde el sustrato en el CM1 en el anticuerpo activable multiespecífico que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia.
En algunas realizaciones, se usa un procedimiento o kit para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable conjugado multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo activable multiespecífico con el que se conjuga un agente terapéutico) de la descripción, seguido de tratamiento mediante la administración de ese anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico conjugado a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el primer resto escindible (CM1) del anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado que se ensaya en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con un anticuerpo activable multiespecífico tal como y/o tal anticuerpo activable conjugado que comprende tal CM1, y a continuación se administra al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico conjugado que se ensayó. Asimismo, los pacientes que den negativo para cualquiera de o tanto la diana como la proteasa que escinde el sustrato en el CM1 en el anticuerpo activable multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico conjugado que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia.
En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otro anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico conjugado hasta que se identifique un anticuerpo adecuado multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado para el tratamiento, por ejemplo, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de enfermedad. En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico conjugado para el que el paciente dio positivo.
Composiciones farmacéuticas según la descripción pueden incluir un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
Un experto en la materia apreciará que los anticuerpos de la divulgación tienen una variedad de usos. Por ejemplo, las proteínas de la descripción se utilizan como agentes terapéuticos para una variedad de trastornos. Los anticuerpos de la descripción también se utilizan como reactivos en kits de diagnóstico o como herramientas de diagnóstico, o estos anticuerpos se pueden utilizar en ensayos de competencia para generar reactivos terapéuticos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una ilustración que representa varios formatos de anticuerpos biespecíficos (adaptados de Chan y Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010).
Las Figuras 2A-2C son una serie de ilustraciones que representan varios formatos de anticuerpos multiespecíficos adecuados para su uso en las composiciones y procedimientos de la descripción. En un anticuerpo biespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo carboxilo de la cadena pesada (Hc) de un anticuerpo de IgG (Figura 2A); al extremo carboxilo de la cadena ligera (Lc) (Figura 2B); o al extremo carboxilo de tanto la cadena pesada como ligera. (Figura 2C). La Figura 2D es un diagrama de una única construcción genética para la expresión de fusiones de anticuerpos multiespecíficos.
La Figura 3A es una serie de ilustraciones que representan varios formatos de anticuerpos activables adecuados para su uso en las composiciones y procedimientos de la descripción. La Figura 3B es un diagrama de construcciones genéticas para la expresión de fusiones de anticuerpos activables multiespecíficos.
En la Figura 4, los paneles A-J, son una serie de diagramas esquemáticos de un conjunto seleccionado de las permutaciones posibles de anticuerpos multiespecíficos de la descripción. Las casillas sombreadas en gris cubren las configuraciones representadas en la Figura 2 y son incluidas aquí para completitud y comparación.
En la Figura 5, los Paneles A-J. son una serie de diagramas esquemáticos de un conjunto seleccionado de las permutaciones posibles de anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción. Las casillas sombreadas en gris cubren las configuraciones representadas en la Figura 3 y el son incluidas aquí para completitud y comparación. En particular, esta figura muestra anticuerpos activables multiespecíficos en los que el sitio de unión al antígeno primario está enmascarado (es decir, activable) y los dominios de unión al antígeno adicionales no están enmascarados. En la Figura 6, los Paneles A-J, son una serie de diagramas esquemáticos de una matriz de anticuerpos activables multiespecíficos en los que todos los dominios de unión al antígeno están enmascarados.
En la Figura 7, Los paneles A-J. son una serie de diagramas esquemáticos de un conjunto de anticuerpos activables multiespecíficos en los que el dominio de unión al antígeno secundario está enmascarado y los dominios de unión al antígeno adicionales no están enmascarados.
En la Figura 8, los Paneles A-J, son una serie de diagramas esquemáticos de una matriz de anticuerpos activables multiespecíficos en los que la mayoría, pero no todos los dominios de unión al antígeno están enmascarados y al menos un dominio de unión al antígeno adicionales no está enmascarado.
En la Figura 9, los Paneles A-D son una serie de diagramas esquemáticos de una matriz de anticuerpos activables multiespecíficos en los que el dominio de unión al antígeno primario y otro dominio de unión al antígeno están enmascarados, y el o los dominios de unión al antígeno restantes no están enmascarados.
La Figura 10 es una fotografía que representa el análisis PAGE de anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos activables multiespecíficos que demuestran los pesos moleculares de las cadenas pesadas fusionadas con scFv, muestras 1-8, en comparación con los respectivos anticuerpos monoespecíficos o anticuerpos activables, muestras 9­ 11.
La Figura 11 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos multiespecíficos para unirse específicamente a sus antígenos cognados.
Las Figuras 12A-12B son una serie de gráficos que representan la capacidad de los anticuerpos multiespecíficos y los anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen scFv CTLA-4 anti -humano para unirse específicamente a (A) CTLA-4 de ratón y (B) humano.
La Figura 13 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos activables multiespecíficos que contienen OKT3 denominados en esta invención anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR 3954-1204-C225v5-OKT3 y anticuerpo activable multiespecífico anti-Jagged 5342-1204-4D11v2-OKT3 para unirse específicamente a CD3e humanos en experimentos de unión a ELISA.
La Figura 14 es una serie de fotografías que representan el análisis PAGE de digestos uPA que demuestran la activación de anticuerpos activables multiespecíficos sin escisión de fusiones scFv de cadena pesada.
La Figura 15 es una serie de gráficos que representan la capacidad de los anticuerpos activables multiespecíficos activados para unirse a varias dianas.
La Figura 16A es un gráfico que representa la unión de anticuerpos multiespecíficos de la descripción a células T Jurkat CD3e-positivas.
La Figura 16B es una gráfica que representa la counión de anticuerpos multiespecíficos de la descripción a células T Jurkat CD3e-positivas y EGFR.
La Figura 17 es una serie de gráficos que representan la activación dependiente de EGFR de células T Jurkat por anticuerpos multiespecíficos de la descripción.
La Figura 18A es un gráfico que representa la activación dependiente de EGFR de células T CD8+ primarias mediante anticuerpos multiespecíficos de la descripción.
La Figura 18B es un gráfico que representa la destrucción dependiente de EGFR de células diana mediante anticuerpos multiespecíficos de la descripción.
La Figura 18C es una serie de gráficos que representan la activación de CD69 de células T primarias por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N en células SW480 que expresan EGFR en comparación con la activación mínima en células U266 EGFR-negativas.
La Figura 18D es una serie de gráficos que representan la destrucción dependiente de EGFR de células diana por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N en células SW480 que expresan EGFR en comparación con la destrucción insignificante en los células U266 EGFR-negativas.
La Figura 19 es una serie de gráficas que representan la lisis de células T primarias de un panel de líneas celulares que expresan EGFR mediante el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N en comparación con la ausencia de lisis de la línea celular U266 EGFR-negativa.
La Figura 20A y la Figura 20B son una serie de gráficos que representan la disminución de la unión del anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N a células que expresan EGFR en comparación con la unión de EGFR por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N. Además, las Figuras 20A y 20B demuestran que la activación de proteasa del anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N por matriptasa (también denominado en esta invención MTSP1 o MT-SP1) restaura la unión de EGFR a un nivel equivalente al exhibido por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N. Las Figuras 20A y 20B también demuestran que dicho anticuerpo activable multiespecífico y anticuerpo multiespecífico se unen a EGFR de una manera similar a la del anticuerpo activable monoespecífico y el anticuerpo monoespecífico respectivos.
La Figura 21A y la Figura 21B son una serie de gráficos que representan la unión del anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo activado activable multiespecífico 3954-l204-C225v5-OKT3m-H-N, y anticuerpo multiespecífico C22Sv5- OKT3m-H-N a células T Jurkat CD3£-positivas.
La Figura 22 es una gráfica que representa la disminución de la activación dependiente de EGFR de células T Jurkat por el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N en comparación con la activación por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N. Además, la figura demuestra que la activación de proteasa del anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N por matriptasa restaura la activación dependiente de EGFR a un nivel equivalente al exhibido por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N.
La Figura 23A es una gráfica que representa la disminución de la activación dependiente de EGFR de células T CD8+ primarias por el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N en comparación con la activación por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N. Además, la figura demuestra que la activación de proteasa del anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N por matriptasa restaura la activación dependiente de EGFR a un nivel equivalente al exhibido por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N.
La Figura 23B es un gráfico que representa la disminución de la destrucción dependiente de EGFR de células diana por el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N en comparación con la destrucción por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N. Además, la figura demuestra que la activación de proteasa del anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225vS-OKT3m-H-N por la matriptasa restaura la destrucción de células diana dependientes de EGFR a un nivel equivalente al exhibido por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente descripción proporciona anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos. Tal como se usa en esta invención, un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo que reconoce dos o más antígenos o epítopos diferentes, y un anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico que incluye al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido a al menos un dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo para unirse a su diana. Los anticuerpos multiespecíficos activables proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a una diana que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado.
Ejemplos no taxativos de anticuerpos multiespecíficos incluyen anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos, anticuerpos tetraespecíficos y otros anticuerpos multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos proporcionados en esta invención también son multivalentes; tal como se usa en esta invención, multivalencia se refiere a la cantidad total de sitios de unión en el anticuerpo, independientemente de si los sitios de unión reconocen los mismos antígenos o epítopos o diferentes. Ejemplos no limitantes de anticuerpos activables multiespecíficos incluyen anticuerpos activable biespecíficos, anticuerpos activable triespecíficos, anticuerpos activable tetraespecíficos y otros anticuerpos activables multiespecíficos. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención también son multivalentes.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos o fragmentos de los mismos y/o anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos se diseñan para acoplarse a células T y/u otras células efectoras inmunitarias. Los anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos de acoplamiento de células T también se denominan en esta invención anticuerpos multiespecíficos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos y/o anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos que se acoplan a células efectoras inmunitarias también se mencionan en esta invención como anticuerpos multiespecíficos que se acoplan a células efectoras inmunitarias o fragmentos de los mismos y/o anticuerpos activables multiespecíficos que se acoplan a células efectoras inmunitarias o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos o fragmentos de los mismos y/o anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos se diseñan para unirse o interactuar de otro modo con más de una diana y/o más de un epítopo, también denominados en esta invención anticuerpos dirigidos a multi-antígenos o fragmentos de los mismos y/o anticuerpos activable dirigidos a multi-antígenos o fragmentos de los mismos.
En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo incluye un dominio IgG y un dominio scFv. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecifico o fragmento del mismo incluye un dominio variable IgG y un dominio scFv. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de células T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo tiene especificidad por un epítopo de un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro epítopo del mismo antígeno diana.
Diversas realizaciones de anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos de la descripción son mostradas en las Figuras 3A y 5-9. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo que comprende una IgG tiene los dominios variables de IgG enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecifico o fragmento del mismo que comprende un scFv tiene los dominios scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecifico o fragmento del mismo tiene tanto dominios variables de IgG como dominios scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento y al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde cada uno de los dominios variables de IgG y los dominios de scFv está acoplado a su propio resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de células T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo tiene especificidad por un epítopo de un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro epítopo del antígeno diana.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos o fragmentos de los mismos de la descripción incluyen al menos (i) un anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento de células T que es un antígeno de superficie en una célula T y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo está unido al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos unidos a una combinación de uno o más extremos N y/o uno o más extremos C del anticuerpo multiespecífico. La descripción también incluye anticuerpos multiespecíficos que comprenden otro anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias o fragmento del mismo, tal como uno que se une a un antígeno de superficie de una célula citolítica natural (NK), una célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otras células efectoras inmunitarias.
En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo'de la descripción incluye al menos dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores de activación de células T, tales como, por ejemplo, Fragmentos de scFv de acoplamiento de células T, que incluyen, pero sin limitarse a, OX40/GITR, c D 137/ GITR, CD 137/OX40, CD27/NKG2D. y una combinación adicional de receptores de activación, y un anticuerpo de unión a diana tal que los fragmentos de scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T, y un anticuerpo de unión a diana tal que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T están unidos a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes dianas de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a epítopos diferentes en la misma diana de acoplamiento de células T.
En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye al menos (i) un primer brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células T que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento de células T y (ii) un segundo brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de unión al antígeno del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo incluye (iii) al menos un tercer fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de unión a la diana que incluye un tercer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB3) que se une a una tercera diana. En algunas realizaciones, la segunda y tercera o más dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la segunda y tercera o más dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la segunda y tercera diana o más dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos de la descripción incluyen al menos (i) un anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento de células T que es un antígeno de superficie en una célula T, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende anticuerpos de acoplamiento a células T o fragmentos de los mismos unidos a una combinación de uno o más extremos N y/o uno o más extremos C del anticuerpo activable multiespecífico. La descripción también incluye anticuerpos activables multiespecíficos que comprenden otro anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias o fragmento del mismo, tal como uno que se une a un antígeno de superficie de una célula citolítica natural (NK), una célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otras células efectoras inmunitarias.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la divulgación incluye al menos (i) dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de anticuerpo de los mismos que se acoplan a uno o más receptores de activación de células T, tal como, por ejemplo, fragmentos scFv de acoplamiento de células T, que incluyen, de modo no taxativo, OX40/ GITR, CD137/ GITR, CD 137/OX40, CD27/NKG2D, y una combinación adicional de receptores de activación, donde el ABI de uno de los fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad de ese AB1 de unirse a su respectiva diana de acoplamiento de células T, y (ii) un anticuerpo de unión a diana tal que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T y un anticuerpo de unión a diana de modo que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T están unidos a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes dianas de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se acoplan a diferentes epítopos en la misma diana de acoplamiento de células T.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye al menos (i) dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores de activación de células T, tales como, por ejemplo, fragmentos de scFv de acoplamiento de células T, que incluyen pero sin limitarse a, OX40/GITR, CD 137/ GITR, Cd 137/OX40, CD27/NKG2D. y combinación adicional de receptores de activación, donde cada uno de AB1 de los fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se une a su propio resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento de cada Mm a su AB1 respectivo reduce la capacidad de ese AB1 de unirse a su diana de acoplamiento de células T respectiva, y (ii) un anticuerpo de unión a diana tal que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T y un anticuerpo de unión a diana de modo que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T estén unidos a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes dianas de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a epítopos diferentes en la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de uno o más receptores activadores de células T.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye al menos (i) un primer brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células T que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana y (ii) un segundo brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de unión al antígeno que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de uno o más receptores activadores de células T.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos de la descripción incluyen al menos (i) un anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento de células T que es un antígeno de superficie en un célula T y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende anticuerpos de acoplamiento a células T o fragmentos de los mismos unidos a una combinación de uno o más extremos N y/o uno o más extremos C del anticuerpo activable multiespecífico. La descripción también incluye anticuerpos activables multiespecíficos que comprenden otro anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias o fragmento del mismo, tal como uno que se une a un antígeno de superficie de una célula citolítica natural (NK), un célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otras células efectoras inmunitarias.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la divulgación incluye al menos (i) dos anticuerpos que se acoplan a células T o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores de activación de células T, tales como, por ejemplo, fragmentos de scFv de acoplamiento de células T, que incluyen, pero sin limitarse a, OX40/GITR, CD137/ GITR., CD137/OX40, CD27/NKO2D, y una combinación adicional de receptores de activación y (ii) un anticuerpo de unión a diana que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana, donde los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la presente descripción incluye dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T y un anticuerpo de unión a diana de modo que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes dianas de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a epítopos diferentes en la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de a uno o más receptores activadores de células T.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye al menos (i) un primer brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células T y (ii) un segundo brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de unión a la diana que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de uno o más receptores de activación de células T.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos o fragmentos de los mismos incluyen al menos (i) un anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, que es un antígeno de superficie en una célula T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo N de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento del mismo se une al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo específico de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos unidos a una combinación de uno o más extremos N y/o uno o más extremos C del anticuerpo activable multiespecífico. La descripción también incluye anticuerpos activables multiespecíficos que comprende otro anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias o fragmento del mismo, tal como uno que se une a un antígeno de superficie de una célula citolítica natural (NK), un célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otras células efectoras inmunitarias.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la divulgación incluye al menos (i) dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de anticuerpo del mismo que se acoplan a uno o más receptores que activan células T, tales como, por ejemplo, fragmentos scFv de acoplamiento de células T, que incluyen pero sin limitarse a, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/ NKG2D, y combinación adicional de receptores de activación, donde el AB1 de uno de los fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se une a un resto de enmascaramiento (MM) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad de ese AB1 de unirse a su respectiva diana de acoplamiento de células T, y (ii) un anticuerpo de unión a diana que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana, donde los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T y un anticuerpo de unión a diana de modo que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unan a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes dianas de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a epítopos diferentes en la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de uno o más receptores de activación de células T.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye al menos (i) dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de anticuerpo de los mismos que se acoplan a uno o más receptores de activación de células T, tal como, por ejemplo, fragmentos scFv de acoplamiento de células T, que incluyen pero sin limitarse a, OX40/GITR. CD137/ G iTr , CD137/OX40, CD27/NKG2D, y combinación adicional de receptores de activación, donde cada uno de AB1 de los fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T está unido a su propio resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento de cada MM1 a su respectivo AB1 reduce la capacidad de ese AB1 de unirse a su respectiva diana de acoplamiento de células T, y (ii) un anticuerpo de unión a diana que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana, donde los fragmentos scFv de acoplamiento de células T están unidos a ambos brazos del anticuerpo de unión de la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye dos anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos que se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T y un anticuerpo de unión a diana de modo que los fragmentos scFv de acoplamiento de células T se unen a ambos brazos del anticuerpo de unión a la diana. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes dianas de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los dos fragmentos de anticuerpo de acoplamiento de células T se unen a diferentes epítopos en la misma diana de acoplamiento de células T. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de uno o más receptores activadores de células T.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico o fragmento del mismo de la descripción incluye al menos (i) un primer brazo que comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células T que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento de células T, donde el AS1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana y (ii) un segundo brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células T que incluye un segundo anticuerpo 0 fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son el mismo antígeno. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son antígenos diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda dianas son epítopos diferentes en el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los anticuerpos de acoplamiento de células T o fragmentos de los mismos se acoplan a uno o más receptores inhibidores de células T en lugar de uno o más receptores activadores de células T.
En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno que está altamente expresado tanto en tejido normal y sano como en tejido enfermo. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la Tabla 1 que se expresa altamente tanto en tejido normal y sano como en tejido enfermo.
En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno que se expresa altamente en el tejido enfermo, pero no se expresa fuertemente en el tejido normal y sano. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la Tabla 1 que está altamente expresado en tejido enfermo, pero no está altamente expresado en tejido normal y sano. El antígeno diana puede ser expresado en tejido sano normal, pero no se expresa altamente ni se sobre-expresa de otra manera en el tejido sano normal.
En algunas realizaciones, el resto de enmascaramiento (MM) está acoplado al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB) a través de un resto escindible (CM) que funciona como un sustrato para una proteasa. Proteasas adecuadas para su uso en los anticuerpos activable multiespecíficos de la descripción se determinan en función de la expresión de proteasa en el sitio previsto de tratamiento y/o diagnóstico. En algunas realizaciones, la proteasa es un activador de plasminógeno de tipo u (uPA, también denominado uroquinasa), legumaína y/o matriptasa (también denominado MT-SP1 o MTSP1). En algunas realizaciones, la proteasa es una metaloproteasa de matriz (MMP).
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos se modifican genéticamente para incluir un resto de enmascaramiento (MM) que está acoplado a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB) a través de un enlazador no escindible. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células T que incluye un anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento a células T o porción de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo de acoplamiento a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células T, donde el AB1 se une a través de un enlazador no escindible a un resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo no se enmascara.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células T que incluye un anticuerpo dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de células T o porción de unión al antígeno del mismo, donde el anticuerpo de acoplamiento de células T o fragmento de unión al antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento de células T, donde el AB1 se une a través de un enlazador no escindible a un resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del ABI de unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión al antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a través de un enlazador escindible a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana.
El concepto general de anticuerpos biespecíficos se introdujo por primera vez hace al menos 50 años (Nisonoff, A. y Mandy, W.J., Nature 194, 355-359 (1962), como se cita en Chan, A.C. y Carter, P.J. Nature Reviews Immunol. 10, 301-316 (2010)).
Se ha descrito una variedad de plataformas biespecíficas (véase, por ejemplo, Figura 1; Liu, M.A.. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82, 8648-8652 <1985); revisado por Krocsen. B.J. col. Adv. Drug Delivery Rev. 31, 105-129 (1998); Marvin. J.S. y Zhu, Z., Acta Pharm. Sínica 26, 649-658 (2005); Chan y Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010; Fitzgerald y Lugovsky, MAbs. 3(3):299-309 (2011); Rielhmuller, G., Cancer Immunity 12, 12-18 (2012)). El concepto general, para la construcción de anticuerpos biespecíficos es unir dominios de unión a prolina, generalmente basados en múltiples dominios de inmunoglobulina, con el fin de construir una molécula que sea capaz de unirse a dos o más antígenos diana y demuestre distribución fisiológica, farmacocinética y función efectora similar a IgG. Estos últimos pueden incluir citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Reclutamiento de células T (BiTEs™) (Véase, por ejemplo, Baeuerle. P.A. y Reinhardt, C., Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009). y TandAbs™ (véase Cochiovius y col., Cancer Res. 54, 4336-4341 (2000)), y/o la administración de una carga útil citotóxica en forma de un resto conjugado químicamente tal como un inhibidor de microtúbulos, un alquilador de ADN u otra toxina, en forma de un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). Se están estudiando muchos formatos de anticuerpos biespecíficos, con IgG y BiTEs™ heterodiméricos convencionales que representan los más avanzados clínicamente a pesar de su producción y propiedades farmacológicas subóptimas (véase Chan y Carter. Nat. Rev, Immunol. 2010). Los anticuerpos biespecíficos tienen muchos usos potenciales, basados en características específicas de formatos particulares y los antígenos diana elegidos; no todos los formatos biespecíficos son apropiados para todas las aplicaciones. Por ejemplo, el formal Dos-en-uno Fab (Bostrom, J., y col., Science 323, 1610­ 1614 (2009)) consiste en un único dominio de unión para unirse a los antígenos A y B de una manera u otra; por lo tanto, este tipo de biespecífico puede acoplarse a dos copias del antígeno A, dos copias del antígeno B o una copia de cada antígeno. Por otro lado, el formato DVD (Wu, C., Y col., Nature Biotechnol. 25, 1290-1297 (2007)) proporciona el acoplamiento de dos copias del antígeno A además de dos copias del antígeno B. La separación y la orientación relativa de cada uno de los dominios de unión también pueden ser importantes para el acoplamiento de múltiples antígenos de tal manera que confieran la actividad prevista, por ejemplo, receptores de reticulación (Jackman, J., y col., J. Biol. Chem. 285. 20850-20859 (2010)), donde se requiere el acoplamiento de una copia de cada receptor, puede requerir una interacción monovalente con cada uno de dos antígenos distintos.
Un área mecánicamente distinta de la aplicación de anticuerpo biespecífico implica reclutar células efectoras inmunitarias (tales como células T citotóxicas, células NK y/o células efectoras mieloides) para atacar células tumorales mediante la construcción de un biespecífico que se acopla tanto a un antígeno en la superficie de una célula dirigida a la citotoxicidad (p. ej., una célula tumoral) como a un antígeno en la superficie de una célula inmunitaria citotóxica (p. ej., una célula T). Catumaxomab es un ejemplo de un anticuerpo biespecífico clínicamente validado que se dirige al antígeno tumoral EpCAM en células cancerosas y recluta células T citotóxicas mediante la unión a CD3 en la superficie de células T (Linke, R., Klein, A., y Seimetz, D., mAbs 2, 129-136 (2010)); sin embargo, su uso ha sido limitado y requiere administración intraperitoneal. Los anticuerpos BiTE™ son anticuerpos biespecíficos que logran el reclutamiento de células T en un formato diferente con diferentes propiedades farmacológicas (Bacuerle, P. A. y Reinhardt, C. Anti-Cancer Res. 69, 4941 - 4944 (2009))-en particular, los anticuerpos BiTE se componen de dos fragmentos variables de cadena simple (scFv) y tienen vidas medias farmacológicas muy cortas in vivo, por lo tanto, requieren la administración a través de infusión continua. Un formato similar, denominado TandAb™, es una construcción de diacuerpo biespecífico tetravalente en la que dos dominios variables se unen a un antígeno diana y dos dominios variables se unen a CD3 en la superficie de las células T (Cochlovius y col., Cancer Res. 60, 4336-4341 (2000)). Este formato ilustra que el acoplamiento bivalente tanto del antígeno diana como del antígeno de superficie de células T se puede utilizar para el acoplamiento de células T y la citotoxicidad dirigida al antígeno. Sin embargo, el formato TandAb también tiene una vida media muy corta in vivo.
Una limitación general de los anticuerpos biespecíficos de acoplamiento de células T se relaciona con el hecho de que la citotoxicidad de las células T puede ser extremadamente potente y se puede activar mediante niveles relativamente bajos de antígeno diana en la superficie de las células. Por lo tanto, incluso niveles modestos de expresión del antígeno diana, como EGFR en tejidos sanos pueden conducir a una toxicidad significativa, limitando o impidiendo las aplicaciones terapéuticas clínicas (Lutterbuese, R. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 12605-12610(2010)). Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de terapias efectivas a base de anticuerpos que exhiban una seguridad mejorada, por ejemplo, una toxicidad reducida.
Los anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción son más seguros que los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) porque la actividad de los anticuerpos activables multiespecíficos está restringida a un entorno de enfermedad localizado. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células efectoras inmunitarias. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a células T. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico reconoce dos o más dianas. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico comprende un formato IgG-scFv que confiere las propiedades de semivida larga de una IgG. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo activable multiespecífico se modula adicionalmente a través del uso de mutaciones Fc en el sitio de unión a FcRn (Petkova, S. B. y col., Intl. Immunol. 18, 1759-1769 (2006); Deng, R. y col., mAbs 4, 101-109 (2012); Olafson, T Methods Mol. Biol. 907, 537-556 (2012)). En algunas realizaciones, dicho anticuerpo activable multiespecífico incluye mutaciones en el dominio Fc, tal como una mutación N297A (Lund, J. y col., Mol. Immunol. 29, 53-39 (1992)) que reduce las funciones efectoras de IgG (ADCC y CDC) para reducir las toxicidades fuera de la diana.
Los anticuerpos activables multiespecíficos aprovechan la regulación por aumento de la actividad de la proteasa ampliamente reconocida como un sello distintivo de múltiples estados de enfermedad para lograr un direccionamiento específico tejido-enfermedad de tales terapias. El anticuerpo activable se basa en el uso de un anticuerpo IgG, o fragmento del mismo, tal como una región scFv, región Fab, dominio VH o VL simple que se ha modificado para incluir un resto de enmascaramiento (MM), unido al anticuerpo a través de un resto escindible (CM), tal como un resto escindible de proteasa (véase, por ejemplo, Publicación Internacional PCT Número WO 2009/025846, publicada el 26 de febrero de 2009; Publicación Internacional PCT Número WO 2010/081173, publicado el 15 de julio de 2010). Alternativamente, un dominio de proteína sin anticuerpo (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT Número WO 2010/096838, publicada el 26 de agosto de 2010; Boersma, Y.L. y col., J. Biol. Chem. 286, 41273-41285 (2011)) se puede utilizar para lograr una o más especificidades de unión. Un anticuerpo multiespecífico, como IgG convencional, se puede utilizar como el punto de partida para producir un anticuerpo activable multiespecífico. Dicho anticuerpo activable multiespecífico permitiría el direccionamiento de alta afinidad de todos los antígenos reconocidos por el anticuerpo multiespecífico original, pero con especificidad tisular dictada por el enlazador escindible activado selectivamente. Dependiendo del formato multiespecífico utilizado, el MM y CM pueden colocarse en el extremo N o C del dominio apropiado.
Un anticuerpo activable multiespecífico comprende al menos un dominio derivado de IgG con especificidad hacia un primer antígeno, unido sintética o biosintéticamente a otro dominio (que puede derivar de una IgG u otra proteína) con especificidad para unirse a un segundo antígeno. Se pueden añadir especificidades adicionales mediante la unión de dicho anticuerpo activable multiespecífico a uno o más dominios adicionales que confieren especificidades de unión adicionales para el primer antígeno, el segundo antígeno o antígenos adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene uno o más de estos dominios enmascarados por un resto de enmascaramiento (MM) adecuado. Cada uno de los formatos multiespecíficos descritos en la Figura 1 se puede convertir potencialmente en un anticuerpo activable multiespecífico al enmascarar uno o más de los restos de unión al antígeno de uno o más de los dominios de inmunoglobulina. Ejemplos de formatos de anticuerpos activables multiespecíficos adecuados se muestran en las Figuras 3 A y 5-9.
El uso de un dominio scFv para conferir especificidad a un antígeno específico permite una construcción modular de anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos activables multiespecíficos. El uso de los dominios scFv fusionados al extremo de las cadenas pesadas o ligeras de IgG para la construcción de anticuerpos biespecíficos se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Orcutt, K.D. y col., Prot. Eng. Design Select. 23, 221-228 (2010); Dong y col., (2011)). Este formato (“IgG-scFv”) permite que una IgG convencional se convierta en un anticuerpo biespecífico donde una primera especificidad se codifica en los dominios variables de la IgG y una segunda especificidad se codifica en los dominios scFv unidos a través de una región enlazadora flexible. Variaciones de este formato incluyen la fusión de dominios scFv en los extremos N o C de las cadenas pesadas o ligeras; los scFv pueden tener las mismas o diferentes especificidades de unión al antígeno (Spangler, J. B. y col., J. Mol. Biol. 422, 532-544 (2012)). Además, mediante el uso de heterodímeros de cadena pesada (por ejemplo, usando la construcción botón-orificio o construcciones similares), los scFv de diferentes especificidades se pueden unir al extremo N o C de cada cadena pesada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende una IgG tiene los dominios variables de IgG enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene los dominios scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto los dominios variables de IgG como los dominios scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de células T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un epítopo de un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro epítopo del antígeno diana.
La descripción proporciona ejemplos de estructuras de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen, pero sin limitarse a, los siguientes: (VL-CL)2(VH-CH1-CH2- CH3-L^-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1 -MM)2 ; (VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3- VH*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3- VL*}2: (MM-L1 -CM-L2-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2 : (VL-CL)2 :(MM -L1-CM-L2-VL*-L3-VH*L4-VH-CH 1-CH2-CH3)2 : (VL-CL)2 :(MM-L1-CM L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 : (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 : (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2 :(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH 1-CH2- CH3}2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 :(VH-CH 1-CH2-CH3)2 (VL-CL-L4- VL*-L3-VH*-L2-CM-L 1 -MM)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (MM-L 1-CM-L2-VL*-L3-VH* L4-VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4- VL-CL)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 : (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3- VH*-L2-CM-L1-MM)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2 :(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH 1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2 : (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 :(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 : (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 ; o (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L 1 -MM)2 : (VH *-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2. donde: VL y VH representan los dominios variables ligeros y pesados de la primera especificidad, contenidos en la IgG; VL* y VH* representan los dominios variables de la segunda especificidad, contenidos en el scFv; L1 es un péptido enlazador que conecta el resto de enmascaramiento (MM) y el resto escindible (CM); L2 es un péptido enlazador que conecta el resto escindible (CM) y el anticuerpo; L3 es un péptido enlazador que conecta los dominios variables del seFv; L4 es un péptido enlazador que conecta el anticuerpo de la primera especificidad con el anticuerpo de la segunda especificidad; CL es el dominio constante de cadena ligera; y CH1, c H2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada. Las primera y segunda especificidades pueden ser hacia cualquier antígeno o epítopo. Estructuras específicas incluyen, entre otras, las siguientes: (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 :(VH-CH1 -CH2-CH3)2 : (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4- VH*-L3-VL*)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2 ;(MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2 :(VH- CH1-CH2-H3)2 ; (VL-CL-L4-VH*L3-VL* -L2-CM-L1 -MM)2 : (VH-CH1-CH2-CH3-L4- VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2 ; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 :(VH-CH1- CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2 ; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2; o (MM-L1-CM-L2;VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2 :(VH-CH1-CH2-CH3)2.
En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende una IgG tiene los dominios variables de IgG enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende un scFv tiene los dominios de scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de TgG como dominios scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento y al menos uno de los dominios scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios scFv, donde cada uno de los dominios variables de IgG y los dominios scFv está acoplado a su propio resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de células T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un epítopo de un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro epítopo del antígeno diana.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células efectoras inmunitarias, tal como un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento de células T, un antígeno es típicamente un antígeno presente en la superficie de una célula tumoral u otro tipo de célula asociado con la enfermedad, tal como, pero sin limitarse a, cualquier diana enumerada en la Tabla 1, tal como, pero sin limitarse a, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3 o CD71 (receptor de transferrina), y otro antígeno es típicamente un antígeno estimulante o inhibidor presente en la superficie de una célula T, célula citolítica natural (NK), célula mononuclear mieloide, macrófago y/u otra célula efectora inmunitaria, tal como, pero sin limitarse a, B7-H4. BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, Cd 27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS. LAG3, NKG2D, OX40, PD-1. TIGIT, TIM3 o VISTA. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de las células T también puede estar sustituido por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de células T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes, tal como, sin limitarse a, B7-1, B7-2, B7H3, PD-Li, PD-L2 o TNFSF9. En algunas realizaciones de un anticuerpo activable dirigido a múltiples antígenos, un antígeno se selecciona de entre el grupo de dianas enumeradas en la Tabla 1, y otro antígeno se selecciona de entre el grupo de dianas enumeradas en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, un dominio variable de cadena simple, específico para unirse a una diana que se muestra en la superficie de células T, se fusiona al extremo carboxilo de un anticuerpo IgGI completamente humano (anticuerpo dirigido) que se une a un antígeno de superficie celular. La fusión del scFv puede ser al extremo carboxilo de la cadena pesada, al extremo carboxilo de la cadena ligera o a ambas cadenas (Figura 2). En algunas realizaciones, un dominio variable de cadena simple, específico para unirse a una diana que se muestra en la superficie de células T, se fusiona con el extremo amino de un anticuerpo IgGI completamente humano (anticuerpo dirigido) que se une a un antígeno de superficie celular. La fusión del scFv puede ser al extremo amino de la cadena pesada, al extremo amino de la cadena ligera o a ambas cadenas. Las fusiones se construyen como una sola construcción genética y se expresa en células en cultivo. El anticuerpo dirigido puede ser específico para la unión a uno o más antígenos de superficie tumoral, o cualquier célula dirigida a depleción. El scFv puede ser específico para el mismo o diferentes antígenos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo anti-EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v5, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v4, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v6, que es específico para la unión a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo anti-Jagged. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es 4D11, que es específico para la unión a Jagged 1 y Jagged 2 humano y de ratón. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es 4D11v2, que es específico para la unión a Jagged 1 y Jagged 2 humano y de ratón.
En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido puede estar en forma de un anticuerpo activable. En algunas realizaciones, los scFv pueden tener la forma de Pro-scFv (véase, p. ej., WO 2009/025846. WO 2010/081173).
En algunas realizaciones, el scFv es específico para unirse a CD3e; por ejemplo, OKT3. En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión a CTLA-4 (también denominado en esta invención CTLA y CTLA4).
En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión de una o más células T, una o más células NK y/o uno o más macrófagos. En algunas realizaciones, el scFv es específico para unirse a una diana seleccionada de entre el grupo que consiste en B7-H4. BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, C1725, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIM3 o VISTA, y combinaciones de los mismos.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo en esta invención, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligonucleótidos o polinucleótidos descritas en esta invención son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para la síntesis de oligonucleótidos de ADN recombinante y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en esta invención. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, p.ej., Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en esta invención son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Técnicas estándar se utilizan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
Según se utiliza según la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Como se emplea en esta invención, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "se une inmunoespecíficamente" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10-6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a, fragmentos policlonales, monoclonales, quiméricos, anticuerpo de dominio, monocatenarios, Fab y F(ab')2 , scFv, y una biblioteca de expresión de Fab.
Se sabe que el conjunto estructural básico de un anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción de extremo amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción de extremo carboxi de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos se relacionan con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4 y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en esta invención, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única por él.
El término "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") del extremo N de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por consiguiente, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas relativas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de las Secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Chothia y col. Nature 342:878- 883 (1989).
Como se usa en esta invención, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse contra péptidos de extremo N o extremo C de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 pM; por ejemplo, en algunas realizaciones, < 100 nM y en algunas realizaciones, < 10 nM.
Como se usa en esta invención, los términos "unión específica", "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se puede expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, donde una Kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica. Uno de estos procedimientos implica medir las tasas de formación y disociación de complejos de sitio/antígeno de unión a antígeno, donde esas tasas dependen de las concentraciones de las parejas de complejos, la afinidad de la interacción, y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante en la tasa" (Kon) como la "constante fuera de la tasa" (Koff) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación. (Véase Nature 361:186-87 (1993)). La relación de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd . (Véase, generalmente, Davies y col.(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente descripción se une específicamente a EGFR, cuando la constante de unión de equilibrio (Kd) es < 1 pM, por ejemplo en algunas realizaciones < 100 nM, en algunas realizaciones < 10 nM, y en algunas realizaciones < 100 pM a aproximadamente 1 pM, conforme medido por ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
El término "polinucleótido aislado", como se usa en esta invención, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos según la descripción incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en esta invención, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en esta invención.
El término "proteína aislada" a la que se hace referencia en esta invención significa una proteína de ADNc, ARN recombinante u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de obtención, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en esta invención como un término genérico para referirse a proteínas nativas, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos según la descripción comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en esta invención, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en esta invención, así como las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tal como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.
El término "de origen natural", como se usa en esta invención, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otra manera es de origen natural.
El término "unido operativamente", como se usa en esta invención, se refiere a las posiciones de los componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
La expresión "secuencia de control", como se usa en esta invención, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para llevar a cabo la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están unidas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas, y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión. El término "polinucleótido" al que se hace referencia en esta invención significa nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocadena y bicadena.
El término oligonucleótido al que se hace referencia en esta invención incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos entre sí por enlaces oligonucleotídicos de origen natural y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud, por ejemplo en algunas realizaciones, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos suelen ser monocadena, p. ej., para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de cadena doble, por ejemplo, para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la descripción son oligonucleótidos de sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en esta invención incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en esta invención incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" al que se hace referencia en esta invención incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato, y similares. Véase p.ej., LaPlanche y col, Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein y col. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon y col. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y col. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991): Stec y col. Patente EE. UU. No. 5.151.510: Uhlmann and Peynian Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.
Como se usa en esta invención, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edición, E.S. Golub y D.R. Gren. Eds., Sinauer Associates. Sunderland7 Mass. (1991)). Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales, tales como aminoácidos a, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente descripción. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, Y-carboxiglutamaico, £-N,N,N-trimetillisina, £ -N-actillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos utilizada en esta invención, la dirección de la izquierda es la dirección del extremo amino y la dirección de la derecha es la dirección del extremo carboxi, según el uso y la convención estándar.
Del mismo modo, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de secuencias de polinucleótidos de cadena simple es el extremo 5', la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena se denomina como la dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina regiones de secuencia de dirección de transcripción en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que se encuentran 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias corriente arriba", regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en el extremo 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de a Rn se denominan "secuencias corriente abajo".
Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de espacio predeterminados, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y en algunas realizaciones, al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia.
En algunas realizaciones, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Como se analiza en esta invención, variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina se contemplan incluidas por la presente descripción, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos se mantengan al menos al 75 %, por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos al 80 %, 90 %, 95 %, y en algunas realizaciones, al 99 %. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en cuanto a sus cadenas laterales. Aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en familias: (1) aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en esta invención. Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar fácilmente por medio de expertos en la materia. En algunas realizaciones, los extremos amino y carboxi de fragmentos o análogos ocurren cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. Se usan procedimientos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que tienen lugar en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen procedimientos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie y col. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según la descripción.
En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadoras) pueden hacerse en la secuencia natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservadora de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original, ni alterar otros tipos de la estructura secundaria que caracteriza la secuencia original). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.. W. H. Freeman and Company. New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Brandon y J. Tooze, eds„ Garland Publishing. New York, N.Y. (1991)); y Thermon y col. Nature 354:105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido", como se usa en esta invención, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción en el extremo amino y/o en el extremo carboxi y/o una o más deleciones internas, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6. 8 o 10 aminoácidos de longitud, por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos 14 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, al menos 20 aminoácidos de longitud, usualmente al menos 50 aminoácidos de longitud, y en algunas realizaciones, al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", como se usa en esta invención, se refiere a polipéptidos que están comprendidos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene una unión específica a la diana EGFR, en condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución conservadora de aminoácidos (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos típicamente tienen al menos 20 aminoácidos de longitud, por ejemplo., en algunas realizaciones, al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.
El término "agente" se usa en esta invención para representar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos.
Como se usa en esta invención, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por procedimientos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutica. Se conocen en la técnica y se pueden usar diversos procedimientos para marcar polipéptidos y glucoproteínas. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitarse a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N. 35S. 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 130I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, una rodamina fiuorófora, fósforos de lantánido), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (porejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en esta invención, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Como se usa en esta invención, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y en algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, en algunas realizaciones, más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y el 99 %. En algunas realizaciones, la especie objeto se purifica a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante procedimientos de detección convencionales), donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Otros términos químicos en esta invención se utilizan según el uso convencional en la técnica, como lo ejemplifica The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms ("Parker. S.. Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Anticuerpos Multiespecíficos y Anticuerpos Activables Multiespecíficos
Ejemplos de anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción incluyen, por ejemplo, los que se muestran en los Ejemplos proporcionados en esta invención y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB en el anticuerpo multiespecífico es una pareja de unión para cualquier diana enumerada en la Tabla 1.
Tabla 1 Dianas ejemplares
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En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB del anticuerpo multiespecífico es o se deriva de una secuencia expuesta en la Tabla 7 en los Ejemplos proporcionados en esta invención.
En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB del anticuerpo multiespecífico es un derivado de un anticuerpo enumerado en la Tabla 2.
Tabla 2: Fuentes ejemplares para AB
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También se incluyen en la descripción los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos descritos en esta invención.
Los expertos en la materia reconocerán que es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico tiene la misma especificidad o una especificidad similar que un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción al determinar si el primero evita que el último se una a una diana. Si el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico que se evalúa compite con el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción, a continuación los dos anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos se unen al mismo epítopo o a un epítopo estrechamente relacionado.
Una realización para determinar si un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico tiene la misma especificidad o una especificidad similar que un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción es preincubar el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción con diana soluble con la que normalmente reacciona, y luego agregar el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico que se está analizando para determinar si el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico que se está analizando está inhibido en su capacidad de unirse a la diana. Si el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico que se evalúa se inhibe a continuación, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente, que el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción.
Se genera un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico, por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos proporcionados a continuación. Un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico también se puede generar usando cualquiera de una serie de técnicas reconocidas en la técnica para la producción y/o purificación de anticuerpos.
Fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab')2 y Fab, para su uso en un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico se pueden preparar mediante escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante proteasa o escisión química. Alternativamente, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab'')2 incluiría secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguidas de un codón de terminación de traducción para proporcionar la molécula truncada.
Vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YAC, Cpisomas derivados de EBV y similares. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción adecuados modificados genéticamente para que cualquier secuencia VH o VL se pueda insertar y expresar fácilmente. En dichos vectores, el empalme generalmente ocurre entre el sitio donante de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción ocurren en sitios cromosómicos nativos corriente abajo de las regiones codificantes. El anticuerpo resultante puede unirse a cualquier promotor fuerte, que incluye LTR retrovirales, por ejemplo, promotor temprano de SV-40, (Okayama y col. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)). Rous sarcoma virus LTR (Gorman y col. P.N.A.S. 79:6777 (1982)) y Lt R del virus de la leucemia murina de moloncia (Grosschedl y col. Cell 41:885 (1985)). Además, como se apreciará, se pueden usar promotores de Ig nativos y similares.
Además, los anticuerpos multiespecíficos y los anticuerpos activables multiespecíficos pueden generarse a través de tecnologías de tipo de visualización, que incluyen, de modo no taxativo, visualización en fagos, visualización retroviral, visualización ribosómica y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, ya que dichas técnicas son bien conocidas en la técnica. Wright y col. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes y Plucklhun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (visualización ribosómica), Parrolcy y Smith Gene 73:305-318 (1988) (visuaglización en fagos), Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla y col. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel y col. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom y col. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswcll y McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992). y Patente EE. UU. No. 5.733.743.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo nuiltispecílico y el anticuerpo activable multiespecífico de la descripción con respecto a la función efectora, para mejorar o reducir dicha función para mejorar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades y trastornos. Por ejemplo, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de enlaces de disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). (Véase Caron y col, J. Exp Med., 176: 1191­ 1195 (1992) y Shopes. J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)).
De manera alternativa, se puede modificar genéticamente un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y, por lo tanto, puede tener capacidades mejoradas de lisis de complemento y ADCC. (Véase Stevenson y col.. Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)). En algunas realizaciones, las mutaciones de Fc se realizan para eliminar sitios de glicosilación, reduciendo así la función de Fc.
Anticuerpos Activables Multiespecíficos
Los anticuerpos activables multiespecíficos y las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos proporcionadas en esta invención contienen al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo (al que se hace referencia colectivamente como AB1 a lo largo de la descripción) que se une específicamente a una primera diana y/o un primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo (al que se hace referencia colectivamente como AB2 a lo largo de la descripción) que se une específicamente a una segunda diana y/o un segundo epítopo, donde al menos uno del AB se modifica mediante un resto de enmascaramiento (MM). En algunas realizaciones, cada AB en un anticuerpo activable multiespecífico es modificado por su propio resto de enmascaramiento.
Cuando el menos uno de los AB en un anticuerpo activable multiespecífico se modifica con un MM y está en presencia de su diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB original a la diana.
El Kd del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000,000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10- 1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-1.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100- 100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000 - 1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000­ 1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000- 1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces mayor que el Kd del AB no modificado con un MM o del AB original hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificado con un MM hacia la diana es de al menos 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10- 1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000- 100,000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000­ 1.000.000. o 100.000-10.000.000 de veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM o del AB original hacia la diana.
La constante de disociación (Kd) del MM hacia al menos uno del AB en el anticuerpo activable multiespecífico es generalmente mayor que la Kd del AB hacia la diana. La Kd del MM hacia el AB puede ser de al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces mayor que la Kd del AB hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del MM hacia el AB es generalmente menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana. La afinidad de unión de MM hacia el AB puede ser de al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana.
Cuando al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB original a la diana. En comparación con la unión del AB no modificado con un MM o la unión del AB original la la diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM se puede reducir en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %. 90 %. 92 %, 93 %. 94 %, 95 %, 96 %.
97 %, 98 %, 99 % e incluso 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28,24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días , o 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
El MM inhibe la unión de al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico a su diana. El MM se une al dominio de unión a antígeno del AB e inhibe la unión del AB a su diana. El MM puede inhibir estéricamente la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir alostéricamente la unión del AB a su diana. En estas realizaciones, cuando el AB se modifica o acopla a un MM y en presencia de la diana, no hay unión o sustancialmente ninguna unión del AB a la diana, o no más de 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %. 3 %. 4 %, 5 %. 6 %, 7 %, 8 %. 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 50 % de unión del AB la la diana, en comparación con la unión del AB no modificado con un MM, el AB original, o el AB no acoplado a un MM la la diana, durante al menos 2, 4. 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48. 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
Cuando al menos uno de los AB en un anticuerpo activable multiespecífico está acoplado o modificado por un MM, el MM "enmascara" o reduce o inhibe de otro modo la unión específica del AB a la diana. Cuando al menos uno de los AB en un anticuerpo activable multiespecífico está acoplado o modificado por un MM, dicho acoplamiento o modificación puede efectuar un cambio estructural que reduce o inhibe la capacidad del AB para unirse específicamente a su diana.
En un anticuerpo activable multiespecífico, cuando al menos un AB está acoplado o modificado con un MM, al menos una porción del anticuerpo activable multiespecífico puede estar representada por las siguientes fórmulas (en orden desde una región de extremo amino (N) a una región de extremo carboxilo (C):
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
donde MM es un resto de enmascaramiento, el AB es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, y el L es un enlazador. En muchas realizaciones, puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la composición para proporcionar flexibilidad.
En ciertas realizaciones, el MM no es una pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o sustancialmente no tiene homología con ninguna pareja de unión natural del AB. En otras realizaciones, el MM es no más de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % similar a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM es no más de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 25 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 50 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM es no más de un 20 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 10 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos incluyen un AB que está modificado por un MM y también incluye uno o más restos escindibles (CM). Dichos anticuerpos activables multiespecíficos exhiben unión activable/conmutable, a la diana del AB. Anticuerpos activables multiespecíficos generalmente incluyen al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB), modificado por o acoplado a un resto de enmascaramiento (MM) y un resto modificable o escindible (CM). En algunas realizaciones, el CM contiene una secuencia de aminoácidos que sirve como sustrato para una proteasa de interés.
Los elementos de los anticuerpos activables multiespecíficos están dispuestos de manera que el MM y el CM se posicionan de tal forma que, en un estado escindido (o relativamente activo) y en presencia de una diana, el AB correspondiente se une a una diana, mientras que, en un estado no escindible (o relativamente inactivo) en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe. La unión específica del AB a su diana puede reducirse debido a la inhibición o el enmascaramiento de la capacidad del AB para unirse específicamente su diana por el MM.
El Kd de cada AB modificado con un MM y un CM hacia la diana, es al menos 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10,000, 1.000-100.000, 1.000- 1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces mayor que el Kd del AB no modificado con un MM y un CM o del AB original hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión de cada AB modificado con un MM y un CM hacia la diana, es de al menos 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o mayor, o entre 5-10, 10­ 100, 10- 1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10,000, 100- 100.000, 100­ 1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100,000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000,000, 10.000-100.00 10.000­ 1.000.000, 10.000-10.000,000, 100.000- 1.000.000, o 100.000-10.000.000 de veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM y un CM o del AB original hacia la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y un CM y está en presencia de la diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, una proteasa), la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM y un CM o del AB original a la diana. Cuando se compara con la unión del AB original o la unión de un AB no modificado con un MM y un CM a su diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM y un CM se puede reducir en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso 100 % por al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro,
Como se usa en esta invención, el término estado escindido se refiere a la condición de los anticuerpos activables multiespecíficos luego de la modificación del CM por una proteasa. El término estado no escindido, como se usa en esta invención, se refiere a la condición de los anticuerpos activables mulotiespecíficos en ausencia de escisión del CM por una proteasa. Como se ha analizado anteriormente, el término "anticuerpos activables" se usa en esta invención para referirse a un anticuerpo activable tanto en su estado no escindido (nativo) como en su estado escindido. Será evidente para el experto en la técnica que, en algunas realizaciones, un anticuerpo activable escindido puede carecer de un m M debido a la escisión del CM por una proteasa, dando como resultado la liberación de al menos el MM (por ejemplo, cuando el MM no está unido a los anticuerpos activables multiespecíficos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro entre residuos de cisteína).
Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable multiespecífico exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando se encuentra en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana, en el estado desinhibido, desenmascarado y escindido (es decir, una segunda conformación), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión, en general, el acceso de la diana a la AB correspondiente del anticuerpo activable multiespecífico es mayor en presencia de un agente de escisión capaz de escindir el CM que en ausencia de este, un agente de escisión. Por lo tanto, cuando el anticuerpo activable multiespecífico está en el estado no escindido, al menos un AB se inhibe la unión a la diana y puede enmascararse de la unión a la diana (es decir, la primera conformación es tal que el AB no puede unirse a la diana), y en el estado escindido, el AB no se inhibe o se desenmascara con respecto a la unión a la diana.
El CM y AB de los anticuerpos activables multiespecíficos se seleccionan de modo que el primer AB represente un resto de unión para una primera diana y/o epítopo, y el CM representa un sustrato para una proteasa que es co­ localizada con la diana en un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos activables multiespecíficos descritos en esta invención encuentran un uso particular donde, por ejemplo, una proteasa capaz de escindir un sitio en el CM está presente a niveles relativamente más altos en el tejido que contiene la diana de un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico que en el tejido de sitios sin tratamiento (por ejemplo, en tejido sano).
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión del primer AB en sitios sin tratamiento si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo su unión a la diana.
En general, un anticuerpo activable multiespecífico puede diseñarse seleccionando un AB de interés y construyendo el resto del anticuerpo activable de manera que, cuando esté conformacionalmente limitado, el MM proporcione el enmascaramiento del AB o la reducción de la unión del AB a su diana. Se deben tener en cuenta los criterios de diseño estructural para proporcionar esta característica funcional.
Se proporcionan anticuerpos activables multiespecíficos que exhiben un fenotipo conmutable de un intervalo dinámico deseado para la unión a la diana en una conformación inhibida frente a una no inhibida. El intervalo dinámico generalmente se refiere a una relación de (a) un nivel máximo detectado de un parámetro en un primer conjunto de condiciones con respecto a (b) un valor mínimo detectado de ese parámetro en un segundo conjunto de condiciones. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo activable multiespecífico, el intervalo dinámico se refiere a la relación de (a) un nivel máximo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable multiespecífico en presencia de una proteasa capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables a (b) un nivel mínimo detectado de la proteína diana, uniéndose a un anticuerpo activable multiespecífico en ausencia de la proteasa. El intervalo dinámico de un anticuerpo activable multiespecífico puede calcularse como la relación de la constante de disociación de equilibrio del tratamiento de un agente de escisión de anticuerpos activables multiespecíficos (por ejemplo, enzima) con respecto a la constante de disociación de equiloibrio del tratamiento del agente de escisión de anticuerpos activables. Cuanto mayor sea el intervalo dinámico de un anticuerpo activable multiespecífico, mejor será el fenotipo conmutable del anticuerpo activable. Anticuerpos activables que tienen valores de intervalo dinámico relativamente más altos (por ejemplo, mayor de I) exhiben fenotipos conmutables más deseables, de tal manera que la unión de la proteína diana por los anticuerpos activables se produce en mayor medida (por ejemplo, predominantemente) en presencia de un agente de escisión (porejemplo, una enzima) capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables que en la ausencia de un agente de escisión.
Anticuerpos activables multiespecífico se pueden proporcionar en una diversidad de configuraciones estructurales. A continuación se proporcionan fórmulas de ejemplo para al menos una porción de un anticuerpo activable multiespecífico. Se contempla específicamente que el orden del extremo N a C del AB, MM y CM puede invertirse dentro de un anticuerpo activable. También se contempla específicamente que el CM y el MM pueden solaparse en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, de modo que el CM esté contenido dentro del MM.
[Por ejemplo, al menos una porción de los anticuerpos activables multiespecíficos se puede representar mediante la siguiente fórmula (en orden de una región de extremo amino (N) a una región de extremo carboxilo (C):
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
donde MM es un resto de enmascaramiento, CM es un resto escindible y AB es un primer anticuerpo o fragmento del mismo. Cabe señalar que, aunque MM y CM se indican como componentes distintos en las fórmulas anteriores, en todas las realizaciones ejemplares (incluidas las fórmulas) descritas en esta invención se contempla que las secuencias de aminoácidos del MM y el CM podrían superponerse, por ejemplo, de modo que el CM se contiene total o parcialmente dentro del MM. Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que se pueden colocar en el extremo N o en el extremo C con respecto a los elementos de anticuerpos activables.
En determinadas realizaciones, el MM no es una pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM. no contiene ninguna homología o sustancialmente ninguna a cualquier pareja de unión natural del AB. En otras realizaciones el MM es no más del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % similar a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM es no más de 50 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM es no más de 25 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de 20 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 10 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB.
En muchas realizaciones puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la construcción de anticuerpo activable para proporcionar flexibilidad en una o más de las uniones MM-CM, la unión CM-AB, o ambas. Por ejemplo, el AB, m M y/o CM puede no contener una cantidad suficiente de residuos (por ejemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly y Ser, particularmente Gly) para proporcionar la flexibilidad deseada. Como tal, el fenotipo conmutable de dichas construcciones de anticuerpos activables multiespecíficos puede beneficiarse de la introducción de uno o más aminoácidos para proporcionar un enlazador flexible, además, como se describe a continuación, donde el anticuerpo activable multiespecífico se proporciona como una construcción restringida conformacionalmente, un enlazador flexible puede ser insertado de forma operativa para facilitar la formación y el mantenimiento de una estructura cíclica en el anticuerpo activable multiespecífico no escindido.
Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico comprende una de las siguientes fórmulas (donde la fórmula a continuación representa una secuencia de aminoácidos en dirección del extremo N- a C o en dirección del extremo C- a N):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
donde MM, CM y AB son como se definió anteriormente; en donde L1 y L2 están cada uno independientemente y opcionalmente presentes o ausentes, son los mismos o diferentes enlazadores flexibles que incluyen al menos 1 aminoácido flexible (por ejemplo, Gly). Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que pueden posicionarse en el extremo N o C con respecto a los elementos de anticuerpos activables. Ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, restos de direccionamiento (por ejemplo, un ligando para un receptor de una célula presente en un tejido diana) y restos que extienden la semivida en suero (porejemplo, polipéptidos que se unen a proteínas séricas, tal como inmunoglobulina (por ejemplo, IgG) o albúmina sérica (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA)).
En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico es una pareja de unión para cualquier diana enumerada en la Tabla 1.
En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico comprende, es o se deriva de una secuencia expuesta en la Tabla 7 en los Ejemplos proporcionados en esta invención.
En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico comprende, es o se deriva de una secuencia expuesta en el Ejemplo 5 en los Ejemplos proporcionados en esta invención. En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico comprende, es o se deriva de una secuencia expuesta en la Tabla 11 en los Ejemplos proporcionados en esta invención.
En algunas realizaciones no taxativas, al menos uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico es o se deriva de un anticuerpo enumerado en la Tabla 2.
En algunas realizaciones, el resto de enmascaramiento se selecciona para su uso con un anticuerpo específico o fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, grupos de enmascaramiento adecuados para su uso con anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MM que incluyen la secuencia CISPRG (SEQ ID NO: 75). A modo de ejemplos no taxativos, el MM puede incluir una secuencia tal como CISPRGC (s Eq ID NO: 339), CISPRGCG (SEQ ID NO: 76); CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 77); CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID NO: 78). CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO: 79) y CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO: 80). Otros restos de enmascaramiento adecuados incluyen cualquiera de las máscaras específicas de EGFR descritas en la publicación PCT' No. WO 2010/08 1173, tal como, a modo de ejemplo no taxativo, GSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 81); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 82); CNHHYFYTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 83); ADHVFWGSYGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 84);CHHVYWGHCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 85); CPHFTTTSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 86) CNHHYHYYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 87); CPHVSFGSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 88) CPYYTLSYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 89) CNHVYFGTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 90) CNHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 91); CHHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 92) YNPCATPMCCISPRGCPG (SEQ ID NO: 93); CNHHYFYTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 94) CNHHYHYYCGCISPRGCG (SEQ TD NO: 95): CNHVYFGTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 96) CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 97): CPHFTTTSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 98) CNHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 99); CHHFTLTTCGCTSPRGCG (SEQ ID NO: 100) CPYYTLSYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 101); CPHVSFGSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 102) ADHVFWGSYGCISPRGCG (SEQ ID NO: 103): YNPCATPMCCISPRGCG (SEQ ID NO: 104) CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 105); C(N/P)H(H/V/F)(Y/ D)(F/W/T/L)(Y/G/T/SXT/S/Y/H)CGCISPRGCG (SEQ ID NO: 106); CI.SPRGCGQP.IPSVK (SEQ ID NO: 107); CISPRGCTQPYHVSR(SEQ ID NO: 108); y/o CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO: 109).
Restos de enmascaramiento adecuados para su uso con anticuerpos que se unen a un diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y"o Jagged 2, incluyen, a modo de ejemplo no taxativo, restos de enmascaramiento que incluyen una secuencia tal como QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 338); QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 110); PWCMQRQDFLRCPQP (SEQ ID NO: 111); QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO: 112); CNLWVSGGDCGGLQG (SEQ ID NO: 113); SCSLWTSGSCLPHSP (SEQ ID NO: 114); YCLQLPHYMQAMCGR (SEQ ID NO: 115);-CFLYSCTDVSYWNNT(SEQ ID NO: 116); PWCMQRQDYLRCPQP (SEQ ID NO: 117); CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO: 118); CNLWVSGGDCRGVQG (SEQ ID NO: 119): CNLW VSGGDCRGLRG (SEQ ID NO: 120); CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO: 121); CNLWVSGGDCRDAPW (SEQ ID NO: 122); CN LWVSGGDCRDLLG (SEQ ID NO: 123); CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO: 124); CNLWLHGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 125); CNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 126); CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO: 127); CNIWGPSVDCGALLG (SEQ ID NO: 128); CNIWVNGGDCRSFEG (SEQ ID NO: 129); YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO: 130); YCLALPHYMQADCAR (SEQ ID NO: 131); CFLYSCGDVSYWGSA (SEQ ID NO: 132); CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO: 133); CYLYSCNDVSYWSNT (SEQ ID NO: 134); CFLYSCTDVSYW (SEQ ID NO: 135); CTLYSCTDVAYWNSA (SEQ ID NO: 136); CFLYSCTD VSYWGDT (SEQ ID NO: 137); CFLYSCTDVSYWGNS (SEQ ID NO: 138); CFLYSCTD VAYWNNT (SEQ ID NO: 139); CFLYSCGDVSYWGNPGLS (SEQ ID NO: 140); CFLYSCTDVAYWSGT. (SEQ ID NO: 141); CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO: 142); CFLYSCSDVSY WGN1 (SEQ ID NO: 143); CFLYSCTDVAYW (SEQ ID NO: 144); CFLYSCTDVSYWGST (SEQ ID NO: 145); CFLYSCTDVAYWGDT (SEQ ID NO: 146); GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 147); GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 148); GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG (SEQ ID NO: 149); GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 150); GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 151); GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 152); GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 153); GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 154); GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 155); GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 156); GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 157); GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 158); GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 159); GCNRWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO 160) GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 161); GCNfWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO: 162); GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 163) GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 164); GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 165) GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO 166) GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 167) GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 169) GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 170): GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 171) ; y/o GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 172).
Restos de enmascaramiento adecuados para su uso con anticuerpos que se unen a una diana de interleucina 6, por ejemplo, el receptor de interleucina 6 (IL-6R), incluyen, a modo de ejemplo no taxativo, restos de enmascaramiento que incluyen una secuencia tal como QGQSGQYGs CsW n YVHIFMDC (SEQ ID NO: 174); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 175); QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 176): YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 177); PGAFDIPFPAHWYPNT (SEQ TD NO: 178); ESSCVWNYVHTYMDC (SEQ ID NO: 179); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 180); YRTCSWNYVGIFLDC (SEQ ID NO: 181); YGSCSWNY VHIFMDC (SEQ ID NO: 182); YGSCSWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 183); YGSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 184); YTSCNWNY VHIFMDC (SEQ ID NO: 185): YPGCKWN YDRIFLDC (SEQ ID NO: 186); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 187); WSNCHWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 188); DRSCTWNYVRISYDC (SEQ ID NO: 189); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 190); SRSCIWNYAHIHLDC (SEQ ID NO: 191); SMSCYWQYERIFLDC (SEQ ID NO: 192); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 193); YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 194); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 195); YKSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 196); YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 197); FSSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 198); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 199); YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 200); YRSCNWN YVHIFLDC (SEQ ID NO: 201); NMSCHWDY VHIFLDC (SEQ ID NO: 202); FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO: 203): XXs CXWXYvhlfXdC (SEQ ID NO: 204); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 205) RDTGGQCRWDYVHIFMDC (SEQ ID NO: 206); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 207); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 208); DGGPAGCSWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 209); AVGPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 210); CTWNYVHIFMDCGEGEGP (SEQ ID NO: 211); GGVPEGCTWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 212); AEVPAGCWWNY VHIFMEC (SEQ ID NO: 213); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 214); SGASGGCKWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 215); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 216); TPGCRWNYVHIFMECEAL (SEQ ID NO: 217); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 218); POAFDJPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 219); RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 220); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 221); XGafDIPFPAHWvPnT (SEQ ID NO: 222); RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 223); SGVGRDRDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 224); WAGGNDCDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 225); WGDGMDVDIPFPAHWVPVT (SEQ ID NO: 226); AGSGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 227); ESRSGYADIPFPAHWVPRT (SEQ TD NO: 228); y/o RECGRCGDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 173).
En algunas realizaciones, el resto de escisión (CM) del anticuerpo activable multiespecífico incluye una secuencia de aminoácidos que puede servir como sustrato para una proteasa, generalmente una proteasa extracelular. El CM puede seleccionarse basándose en una proteasa que está co-localizada en el tejido con la diana deseada de al menos un AB del anticuerpo activable multiespecífico. Se conoce una variedad de condiciones diferentes en las que una diana de interés se localiza conjuntamente con una proteasa, donde el sustrato de la proteasa se conoce en la técnica. En el ejemplo de cáncer, el tejido diana puede ser un tejido canceroso, particularmente tejido canceroso de un tumor sólido. Hay informes en la literatura de niveles aumentados de proteasas que tienen sustratos conocidos en una cantidad de cánceres, por ejemplo, tumores sólidos. Véase, por ejemplo, La Rocca y col., (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421, Ejemplos no taxativos de enfermedad incluyen: todos los tipos de cáncer (mama, pulmón, colorrectal, próstata, melanomas, cabeza y cuello, páncreas, etc.), artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, SLE, daño cardiovascular, isquemia, etc. Por ejemplo, las indicaciones incluirían leucemias, que incluyen leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), enfermedades linfoblásticas que incluyen mieloma múltiple y tumores sólidos, que incluyen cáncer pulmonar, colorrectal, prostático, pancreático y de mama, incluyendo cáncer de mama triple negativo, . Por ejemplo, las indicaciones incluyen enfermedad ósea o metástasis en cáncer, independientemente del origen del tumor primario; cáncer de mama, que incluye a modo de ejemplo no taxativo, cáncer de mama ER/PR+, cáncer de mama Her2+, cáncer de mama triple negativo; cáncer colorrectal; cáncer endometrial; cáncer gástrico; glioblastoma; cáncer de cabeza y cuello, tal como cáncer esofágico; cáncer de pulmón, tal como a modo de ejemplo no taxativo, cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de ovario de mieloma múltiple; cáncer pancreático; cáncer de próstata; sarcoma, tal como osteosarcoma; cáncer renal, tal como a modo de ejemplo no taxativo, carcinoma de células renales; y/o cáncer de piel, tal como a modo de ejemplo no taxativo, cáncer de células escamosas, carcinoma de células basales o melanoma. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma de células escamosas. En algunas realizaciones, el cáncer es el carcinoma de células escamosas de la piel. En algunas realizaciones, el cáncer es el carcinoma de células escamosas del esófago. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma de células escamosas delo pulmón.
El CM se escinde específicamente por una enzima a una velocidad de aproximadamente 0,001-1500 x 104M'1S'1 o alo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, o 1500 x 10-4 N'1S'1.
Para la escisión específica por una enzima, se establece el contacto entre la enzima y el CM. Cuando el anticuerpo activable multiespecífico que comprende al menos un primer AB acoplado a un MM y un CM está en presencia de una diana y actividad enzimática suficiente, el CM puede escindirse. Una actividad enzimática suficiente puede referirse a la capacidad de la enzima para entrar en contacto con el CM y realizar la escisión. Se puede prever fácilmente que una enzima puede estar en las proximidades del CM pero no puede escindirse debido a otros factores celulares o modificación de proteínas de la enzima.
Sustratos ejemplares incluyen, pero sin limitarse a, sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas enumeradas en la Tabla 3.
Tabla 3: Proteasas y/o enzimas ejemplares
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Caspasa 3 MMP1
Caspasa 4 MMP2 Transmembrana tipo II
Caspasa 5 MMP3 Serina proteasas (TTSP), por ejemplo, Caspasa 6 MMP7 DESC1
Caspasa 7 MMP8 DPP-4
Caspasa 8 MMP9 FAP
Caspasa 9 MMP10 llepsina
Caspasa 10 MMP 11 Matriptasa-2
Cas asa 14 MMP12 MT-SPl/Matri tasa
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Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sustrato es escindible por una o más de las siguientes enzimas o proteasas: uPA, legumaina MT-SP1. ADAM 17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13. y/o MMP-14. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona de entre el grupo de uPA, legumaína, y MT-SP 1. En algunas realizaciones, la proteasa es una metaloproteinasa de matriz. En algunas realizaciones, la proteasa comprende uPA. En algunas realizaciones, la proteasa comprende legumaína. En algunas realizaciones, la proteasa comprende MT-SP 1.
En algunas realizaciones, el CM se selecciona para su uso con una proteasa específica. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en un ADAM 17, una BMP-1, una proteasa de cisteína tal como una catepsina, una HtrA I, una legumaína, un matriptasa (MT-SP 1), una metaloproteinasa de matriz (MMP), una elastasa de neutrófilos, una TMPRSS, tal como TMPRSS3 o TMPRSS4, una trombina y un activador de plasminógeno de tipo u (uPA, también denominado uroquinasa).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para un ADAM17. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para un BMP-1. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una catepsina. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una cisteína proteasa. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una HtrA 1. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una legumaína. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una MT-SP1. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una MMP. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una elastasa de neutrófilos. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una trombina. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una TMPRSS. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para TMPRSS3. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para TMPRSS4. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para uPA.
En algunas realizaciones, el CM se selecciona para su uso con una proteasa específica, por ejemplo, una proteasa que se sabe que se localiza junto con la diana del anticuerpo activable. Por ejemplo, restos escindibles adecuados para su uso en los anticuerpos activables de la descripción incluyen la secuencia TGRGPSWV (SEQ ID NO: 27); SARGPSRW (SEQ TD NO: 28); TARGPSFK (SEQ ID NO: 29); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26): GGWHTGRN (SEQ ID NO: 30); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 31); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 32); AARGPAIH (SEQ ID NO: 33): RGPAFNPM (SEQ ID NO: 34); SSRCPAYL (SEQ TD NO: 35); ROPATPIM (SEQ ID NO: 36); RGPA (SEQ ID NO: 37): GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 38); FPRPILGITGL (SEQ ID NO: 39): VHMPLGFLOP (SEQ ID NO: 40); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 41); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 42); LAPLGLQRR (SEQ 1D NO: 43); SGGPLGVR ( SEQ ID NO: 44); y/o PLGL (SEQ ID NO: 45).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz MMP. Ejemplos de MMP incluyen MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MM P19; MMP20: MMP23; MMP24; MMP26; y MMP27. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP9, MMP14, MMP1. MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 y MMP19. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP7. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP9. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP14. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para dos o más MMP. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos MMP9 y MMP14. En algunas realizaciones, el CM comprende dos o más sustratos para la misma MMP. En algunas realizaciones, el CM comprende al menos dos o más sustratos de MMP9. En algunas realizaciones, el CM comprende al menos dos o más sustratos de MMP14.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para un MMP e incluye la secuencia ISSGLLSS (SEQ ID NO: 316); QNQALRMA (SEQ ID NO: 317); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 318); STFPFGMF (SEQ ID NO: 319); FVGYTSSL (SEQ ID NO: 320); DWLYWPG1 (SEQ ID NO: 321); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 322); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 323); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 324); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 325); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 326): LPGGLSPW (SEQ ID NO: 327); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 328); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 329); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 330); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 331); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 332); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 333); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 334); y/o 1SSGLSS (SEQ ID NO: 335).
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos y/o los anticuerpos activables multiespecíficos de la divulgación pueden hacerse biosintéticos utilizando tecnología y expresión de ADN recombinante en especies eucariotas o procariotas. Para los anticuerpos activables multiespecíficos los cADN que codifican el resto de enmascaramiento, la secuencia enlazadora (que puede incluir un resto escindible (CM) y la cadena de anticuerpo (pesada o ligera)) se puede enlazar en una secuencia de 5' a 3' (extremo N a C en el producto traducido) para crear la construcción de ácido nucleico, que se expresa como la proteína de anticuerpo activable multiespecífico después de un procedimiento de expresión de anticuerpo convencional. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico podría producirse semisintéticamente mediante la expresión de un CM-anticuerpo y luego acoplar la máscara químicamente en o cerca del extremo N de la proteína. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico podría producirse mediante la expresión de un anticuerpo y luego acoplar la máscara y el CM químicamente en o cerca del extremo N de la proteína de modo que el anticuerpo activable multiespecífico en el estado no escindido tenga la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM- MM.
Enlazadores adecuados para su uso en las composiciones descritas en esta invención generalmente son los que proporcionan flexibilidad del AB modificado o los anticuerpos activables para facilitar la inhibición de la unión del AB a la diana. Dichos enlazadores generalmente se denominan enlazadores flexibles. Enlazadores adecuados se pueden seleccionar fácilmente y pueden ser de cualquiera de las longitudes adecuadas, tales como de 1 aminoácido por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluidos 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, o 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, y puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.
Enlazadores flexibles ejemplares incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 18) y (GGGS)o (SEQ ID NO: 19), donde n es un número entero de al menos unode, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como una conexión neutra entre componentes. La glicina accede significativamente a más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (véase Scheraga, Rev. Computational Chem.
11173-142 (1992)). Ejemplos de enlazadores flexibles incluyen, pero no se limitan a Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 20), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 21), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 22), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 23). Gly-Gly- Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 24), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO; 25), y similares. El experto en la técnica reconocerá que el diseño de los anticuerpos activables puede incluir enlazadores que sean total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como una o más porciones que confieran una estructura menos flexible para proporcionar una estructura de anticuerpos activables multiespecíficos deseada.
Además de los elementos descritos anteriormente, los anticuerpos activables multiespecíficos pueden contener elementos adicionales tales como, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de extremo N o C de los anticuerpos activables multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos activables multiespecíficos pueden incluir un resto de direccionamiento para facilitar la administración a una célula o tejido de interés. Los anticuerpos activables multiespecíficos se pueden conjugar con un agente, tal como un agente terapéutico, un agente antineoplásico, una toxina o fragmento de la misma, un resto detectable o un agente de diagnóstico. Ejemplos de agentes se describen en esta invención.
Los anticuerpos activables multiespecíficos también pueden incluir cualquiera de los agentes conjugados, enlazadores y otros componentes descritos en esta invención junto con un anticuerpo multiespecífico de la descripción, que incluye, a modo de ejemplo no taxativo, cualquiera de los agentes enumerados en la T abla 4 y/o cualquiera de los enlazadores enumerados en la Tabla 5 y/o la Tabla 6.
Anticuerpos Multiespecíficos Conjugados y Anticuerpos Activables Multiespecíficos Conjugados
La descripción también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas y derivados de las mismas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAD, MMAF, MMAE). Por ejemplo, el agente citotóxico es monometil auristatina E. (MMAe ). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado de entre el grupo enumerado en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliccamicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina.
Las toxinas enzimáticamente activas en los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen la cadena de difteria A, los fragmentos activos no unidos de la toxina de difteria, la cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modeccina A, alfa-sarcina. Proteínas de aleuritas fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una diversidad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 64Cu, 125I, 131I, 131In, 99mTc, 90Y, 186Re y 89Zr.
Conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tal como glutareldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de bis-flúor activo (tal como 1,5-difluoro2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. (Véase WO94/11026).
La Tabla 4 enumera algunos de los agentes farmacéuticos ejemplares que pueden emplearse en la divulgación descrita en esta invención, pero de ninguna manera pretende ser una lista exhaustiva.
Tabla 4: Agentes farmacéuticos ejemplares para conjugación
AGENTES CITOTÓXICOS
Auri estatinas Turbostatina
Auristatina E Fenstatinas
Monometil auristatina D (MMAD) Hidroxifenstatina
Monometil auristatina E (MMAE) Spongi estatina 5
Desmetil auristatina E (DMAE) Spongi estatina 7
Auristatina F Hali estatina 1
Monometil auristatina F (MMAF) Hali estatina 2
Desmetil auristatina F (DMAF) Hali estatina 3
Derivados de auristatina, por ejemplo, amidas de la Briostatinas modificadas
misma
Auristatina tiramina Halocomstatinas
Auristatina quinolina Pirrolobencimidazoles (PBI)
Dolastatinas Cibrostatina 6
Derivados de dolastatina Doxaliform
Dolastatina 16 Dm J Aálogos de antraciclinas
Dolastatina 16 Dpv
Maitansinoides, p.ej. DM-1; DM-4
Derivados maitansinoides Análogo de cemadotina (CemCH2-SH) Duocarmicina Variante de la toxina A de Pseudomonas (PE38) Derivados de duocarmicina Variante de la toxina A de Pseudomonas (ZZ-PE38) Alfa-amanitin ZJ-101
Antraciclinas OSW-1
Doxorrubicina Derivados de 4-nitrobenciloxicarbonilo de O6-bencilguanina
Daunorrubicina Inhibidores de topoisomerasa
Briostatinas Hemiasterlina
Camptotecina Cefalotaxina
Derivados de camptotecina Homoharringtonina
Camptotecina 7-sustituida Dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) 10, 11- Pirrolobenzodiazepina funcionalizada Difluorometilendioxicamptotecina
Combretastatinas Caliqueamicina
Debromoaplisiatoxina Podofilotoxinas
Kahalalido F Taxanos
Discodermolida Alcaloides de vinca
Ecteinascidinas
DETECCIÓN DE CONJUGABLES REACTIVOS ANTIVIRALES
Fluoresceína y derivados de la misma
Aciclovir Isotiocianato de fluoresceína (FITC)
Vira A
Symmetrel PRODUCTOS RADIOFARMACÉUTICOS
ANTIFUNGICOS 1251
1311
Nistatina 89Zr
111In
ANTINEOPLÁSTICOS ADICIONALES 1231
1311
Adriamicina 99mTc
Cerubidina 201TI
Bleomicina 133Xe
Alkeran 11C
Velban 62Cu
Oncovin 18F
Fluorouracilo 68Ga
Metotrexato 13N
Tiotepa 15O
Bisantreno 38K
Novantrona 82Rb
Tioguanina 99mTc (Tecnecio)
Procarbazina
Citarabina METALES PESADOS
ANTIBACTERIANOS Bario
Oro
Aminoglucósidos Platino
Estreptomicina
Neomicina ANTIMICOPLASMALES
Kanamicina
Amikacina Tilosina
Gentamicina Espectinomicina
Tobramicina
Estreptomicina B
Espectinomicina
Ampicilina
Sulfanilamida
Polimixina
Cloramfenicol
Los expertos en la técnica reconocerán que una gran variedad de posibles restos se pueden acoplar a los anticuerpos multiespecíficos resultantes y/o anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción. (Véase, por ejemplo, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
El acoplamiento se puede lograr mediante cualquier reacción química que unirá las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el resto conserven sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. En algunas realizaciones, la unión preferida es, sin embargo, una unión covalente. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de unión bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente descripción, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidas en la técnica, sino que es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes. (Véase Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen y col., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta y col., Science 238:1098 (1987)).
En algunas realizaciones, además de las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención, el anticuerpo activable conjugado también puede modificarse para la conjugación específica del sitio a través de secuencias de aminoácidos modificadas insertadas o incluidas de otro modo en la secuencia de anticuerpo activable. Estas secuencias de aminoácidos modificadas están diseñadas para permitir la colocación controlada y/o la dosificación del agente conjugado dentro de un anticuerpo activable conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir sustituciones de cisteína en posiciones en las cadenas ligeras y pesadas que proporcionan grupos tiol reactivos y no afectan negativamente al plegamiento y ensamblaje de proteínas, ni alteran la unión al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se puede diseñar para incluir o de otro modo introducir uno o más residuos de aminoácidos no naturales dentro del anticuerpo activable para proporcionar sitios adecuados para la conjugación. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir o introducir de otro modo secuencias peptídicas enzimáticamente activables dentro de la secuencia de anticuerpo activable.
Enlazadores adecuados son descritos en la bibliografía. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. y col., Cancer Res.
44:201-208 (1984) que describe el uso de MBS (éster de M- maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también, Patente EE.UU. N.° 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenada acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. Enlazadores particularmente adecuados incluyen: (i) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (ii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat#21651G); y (iii) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2- piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G. Enlazadores adicionales incluyen, pero sin limitarse a, s MCc , sulfo-SMCC, SPDB o sulfo-SPDB.
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen atributos diferentes, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escinde in vitro, lo que da como resultado menos conjugado disponible.
El reactivo EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) es útil para crear una carboxamida comenzando con un ácido carboxílico y una amina primaria o secundaria. Por lo tanto, EDC se puede utilizar para enlazar residuos de lisina en un anticuerpo con un ácido carboxílico en un enlazador o toxina, o para enlazar residuos de aspartato o glutamato en un anticuerpo con una amina en un enlazador o toxina. Dichas reacciones de conjugación que utilizan EDC se pueden mejorar mediante la adición de NHS (N-hidroxisuccinimida) o sulfo-NHS (N-hidroxi-3-oxisulfonilsuccinimida). La adición de NHS o sulfo-NHS a dichas reacciones de conjugación puede mejorar la velocidad, integridad, selectividad y/o reproducibilidad de las reacciones de conjugación.
En algunas realizaciones, los enlazadores son escindibles. En algunas realizaciones, los enlazadores no son escindibles. En algunas realizaciones, están presentes dos o más enlazadores. Los dos o más enlazadores son todos iguales, es decir, escindibles o no escindibles, o los dos o más enlazadores son diferentes, es decir, al menos uno escindible y al menos uno no escindible.
La presente descripción utiliza varios procedimientos para unir agentes a Abs de los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos: (a) unión a los restos de carbohidrato de AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo del AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB. De acuerdo con la descripción, los AB pueden estar unidos covalentemente a un agente a través de un enlazador intermedio que tiene al menos dos grupos reactivos, uno para reaccionar con el AB y otro para reaccionar con el agente. El enlazador, que puede incluir cualquier compuesto orgánico compatible, se puede elegir de modo que la reacción con el AB (o agente) no afecte negativamente a la reactividad y la selectividad del AB. Además, la unión del enlazador al agente podría no destruir la actividad del agente. Enlazadores adecuados para la reacción con anticuerpos oxidados o fragmentos de anticuerpos oxidados incluyen aquellos que contienen una amina seleccionada de entre el grupo que consiste en grupos de amina primaria, amina secundaria, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida y tiosemicarbazida. Dichos grupos funcionales reactivos pueden existir como parte de la estructura del enlazador, o pueden introducirse mediante la modificación química adecuada de enlazadores que no contienen dichos grupos.
De acuerdo con la presente descripción, enlazadores adecuados para la unión a AB reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos reactivos capaces de reaccionar con un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo o fragmento reducido. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitarse a: grupos haloalquilo reactivos (incluyendo, por ejemplo, grupos haloacetilo), grupos p-mercuribenzoato y grupos aptos para reacciones de adición de tipo Michael (incluyendo, por ejemplo, maleimidas y grupos del tipo descrito por Mitra y Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097- 3110).
De acuerdo con la presente descripción, enlazadores adecuados para la unión a AB ni oxidados ni reducidos de los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos amino primarios presentes en residuos de lisina no modificados en el AB. Tales grupos reactivos incluyen, pero sin limitarse a: Ésteres carboxílicos o carbónicos de NHS, ésteres carboxílicos o carbónicos de sulfo-NHS. Ésteres 4-nitrofenil carboxílico o ésteres carbónicos, ésteres pentafluorofenil carboxílicos o carbónicos, imidazoles de acilo, isocianatos e isotiocianatos.
De acuerdo con la presente descripción, enlazadores adecuados para la unión a AB ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos de ácido carboxílico presentes en los residuos de aspartato o glutamato en el AB, que se han activado con reactivos adecuados. Reactivos de activación adecuados incluyen EDC, con o sin NHS o sulfo-NHS agregados y otros agentes de deshidratación utilizados para la formación de carboxamida. En estos casos, los grupos funcionales presentes en los enlazadores adecuados incluirían aminas primarias y secundarias, hidrazinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
El agente puede estar unido al enlazador antes o después de que el enlazador esté unido al AB. En ciertas aplicaciones, puede ser deseable producir primero un intermedio AB-enlazador en el que el enlazador esté libre de un agente asociado. Dependiendo de la aplicación particular, un agente específico puede unirse a continuación covalentemente al enlazador. En otras realizaciones, el AB se une primero al MM, CM y enlazadores asociados y a continuación se unen al enlazador para fines de conjugación.
Enlazadores ramificados. En realizaciones específicas, se utilizan enlazadores ramificados que tienen múltiples sitios para la unión de agentes. Para los enlazadores de sitios múltiples, una unión covalente única a un AB dará como resultado un intermediario AB-enlazador capaz de unirse a un agente en varios sitios. Los sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo o cualquier sitio químico al que se puedan unir agentes.
Alternativamente, se puede lograr una actividad específica más alta (o una relación más alta de agentes con respecto a AB) mediante la unión de un enlazador de sitio único en una pluralidad de sitios en el AB. Esta pluralidad de sitios puede introducirse en el AB por cualquiera de los dos procedimientos. Primero, se pueden generar múltiples grupos aldehído y/o grupos sulfhidrilo en el mismo AB. En segundo lugar, se puede unir a un aldehído o sulfhidrilo del AB un "enlazador ramificado" que tiene múltiples sitios funcionales para su posterior unión a los enlazadores. Los sitios funcionales del enlazador ramificado o del enlazador de múltiples sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo, o puede ser cualquier sitio químico al que se puedan unir los enlazadores. Se pueden obtener actividades específicas aún más altas combinando estas dos estrategias, es decir, uniendo enlazadores de múltiples sitios en varios sitios en el AB.
Enlazadores escindióles: Enlazadores peptídicos que son susceptibles a la escisión por enzimas del sistema del complemento, tales como, pero sin limitarse a, uroquinasa, activador de plasminógeno tisular, tisular, tripsina, plasmina u otra enzima que tenga actividad proteolítica pueden usarse en una realización de la presente descripción. De acuerdo con un procedimiento de la presente descripción, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por complemento.
El anticuerpo se selecciona de entre una clase que puede activar el complemento. Por lo tanto, el conjugado anticuerpo-agente activa la cascada del complemento y libera el agente en el sitio diana. De acuerdo con otro procedimiento de la presente descripción, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por enzimas que tienen una actividad proteolítica, tal como una oroquinasa, un activador de plasminógeno tisular, plasmina o tripsina. Estos enlazadores escindibles son útiles en anticuerpos activables conjugados que incluyen una toxina extracelular, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, cualquiera de las toxinas extracelulares mostradas en la Tabla 4.
En la Tabla 5 se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de enlazadores escindibles.
Tabla 5: Secuencias de enlazadores ejemplares para conjugación
Tipos de Secuencias Escindibles__________________ Secuencias de ácidos
Secuencias escindibles de plasmina
Pro-uroquinasa
TGFp PRFRIIGG (SEQ ID NO: 47)
PRFRIIGG (SEQ ID NO: 48)
Plasminógeno SSRHRRALD (SEQ ID NO: 49)
Estafilocinasa RKSSITIRMRVVL (SEQ ID NO: 50) SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 51) 25
SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 52) IEGR (SEQ ID NO: 53)
Secuencias de factor Xa escindible IDGR i SEQ ID NO: 54)
GGSIDGR(SEQ ID NO: 55)
PLGLWA (SEQ ID NO: 56)
Secuencias escindibles de MMP
Gelatinasa A GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 57)
Secuencias escindibles de colagenasa GPQGLLGA ( SEQ ID NO: 58)
Colágeno de piel de ternera (cadena ul (I)) CIAGQ (SEQ ID NO: 59)
Colágeno de piel de ternera (cadena a2(I)) GPLGIAGI (SEQ ID NO: 60)
Colágeno de cartílago bovino (cadena a1(II)) GPEGLRVG (SEQ ID NO: 61)
Colágeno hepático humano (cadena a1(III)) YGAGLGVV (SEQ ID NO: 62)
a2M humano AGLGVVER (SEQ ID NO: 63)
PZP humano AGLGISST (SEQ ID NO: 64)
EPQALAMS (SEQ ID NO: 65)
aiM de Rata QALAMSAI (SEQ ID NO: 66
AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 67)
a2M de Rata MDAFLESS (SEQ ID NO: 68)
ESLPVVAV (SEQ ID NO: 69)
a4I7(2J) de Rata SAPAVESE (SEQ ID NO: 70)
aiIa(27J) de Rata DVAQFVLT (SEQ ID NO: 71)
Colagenasa de fibroblasto humano VAQFVLTE (SEQ ID NO: 72)
(escisiones autolíticas) AQFVLTEG (SEQ ID NO: 73)
PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 74)
Además, los agentes pueden unirse mediante enlaces disulfuro (por ejemplo, los enlaces disulfuro en una molécula de cisteína) al AB. Dado que muchos tumores liberan naturalmente altos niveles de glutatión (un agente reductor), esto puede reducir los enlaces disulfuro con la posterior liberación del agente en el sitio de administración. En algunas realizaciones, el agente reductor que modificaría un CM también modificaría el enlazador del anticuerpo activable conjugado.
Espaciadores y Elementos Escindióles: En algunas realizaciones, puede ser necesario construir el enlazador de tal manera que se optimice el espacio entre el agente y el AB del anticuerpo activable. Esto se puede lograr mediante el uso de un enlazador de estructura general:
W-(CH2)n-Q
donde
W es --NH--CH2-- o -C H 2- ;
Q es un aminoácido, péptido: y
n es un número entero de 0 a 20.
En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un elemento espaciador y un elemento escindible. El elemento espaciador sirve para posicionar el elemento escindible lejos del núcleo del AB de manera que el elemento escindible sea más accesible para la enzima responsable de la escisión. Algunos de los enlazadores ramificados descritos anteriormente pueden servir como elementos espaciadores.
A lo largo de este análisis, debe entenderse que la unión del enlazador al agente (o del elemento espaciador al elemento escindible, o elemento escindible al agente) no necesita ser un modo particular de unión o reacción. Cualquier reacción que proporcione un producto de estabilidad y compatibilidad biológica adecuadas es aceptable.
Complemento de suero y selección de enlazadores: Según un procedimiento de la presente descripción, cuando se desea la liberación de un agente, se usa un AB que es un anticuerpo de una clase que puede activar el complemento. El conjugado resultante conserva tanto la capacidad de unirse al antígeno como la activación de la cascada del complemento. Por lo tanto, según esta realización de la presente descripción, un agente se une a un extremo del enlazador escindible o el elemento escindible y el otro extremo del grupo enlazador se une a un sitio específico en el AB. Por ejemplo, si el agente tiene un grupo hidroxilo o un grupo amino, puede estar unido al extremo carboxi de un péptido, aminoácido u otro enlazador adecuadamente elegido a través de un enlace éster o amida, respectivamente. Por ejemplo, dichos agentes pueden unirse al péptido enlazador mediante una reacción de carbodimida. Si el agente contiene grupos funcionales que interferirán con la unión al enlazador, estos grupos funcionales de interferencia pueden bloquearse antes de la unión y desbloquearse una vez que se realiza el producto conjugado o intermedio. A continuación, el extremo opuesto o amino del enlazador se usa directamente o después de una modificación adicional para la unión a un AB que es capaz de activar el complemento.
Los enlazadores (o elementos espaciadores de los enlazadores) pueden tener cualquier longitud deseada, un extremo de los cuales puede unirse covalentemente a sitios específicos en el AB del anticuerpo activable. El otro extremo del enlazador o elemento espaciador puede estar unido a un enlazador aminoacídico o peptídico.
Por lo tanto, cuando estos conjugados se unen al antígeno en presencia del complemento, el enlace amida o éster que une el agente al enlazador se escindirá, dando como resultado la liberación del agente en su forma activa. Estos conjugados, cuando se administran a un sujeto, lograrán la administración y liberación del agente en el sitio diana, y son particularmente efectivos para la administración in vivo de agentes farmacéuticos, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferativos y similares, como se presentan, pero sin limitarse a, los de la Tabla 4.
Enlazadores para liberación sin activación del complemento. En aún otra aplicación de administración dirigida, se desea la liberación del agente sin activación del complemento ya que la activación de la cascada del complemento finalmente lisará la célula diana. Por lo tanto, este enfoque es útil cuando la administración y liberación del agente debe realizarse sin destruir la célula diana. Este es el objetivo cuando se desea la administración de mediadores celulares tales como hormonas, enzimas, corticosteroides, neurotransmisores, genes o enzimas a las células dianas. Estos conjugados pueden prepararse uniendo el agente a un AB que no es capaz de activar el complemento a través de un enlazador que es ligeramente susceptible a la escisión por las proteasas séricas. Cuando este conjugado se administra a un individuo, los complejos antígeno-anticuerpo se formarán rápidamente, mientras que la escisión del agente se producirá lentamente, lo que dará como resultado la liberación del compuesto en el sitio diana.
Reticuloadores bioquímicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede conjugarse con uno o más agentes terapéuticos usando ciertos reticuladores bioquímicos. Los reactivos de reticulación forman puentes moleculares que unen grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas diferentes de forma escalonada, se pueden usar reticuladores heterobifuncionales que eliminen la formación de homopolímeros no deseados.
Los enlazadores de peptidilo escindibles por proteasas lisosómicas también son útiles, por ejemplo, Val-Cit, Val-Ala u otros dipéptidos. Además, los enlazadores lábiles al ácido se pueden escindir en el entorno de bajo pH del lisosoma, por ejemplo: bis-sialil éter. Otros enlazadores adecuados incluyen sustratos lábiles a catepsina, particularmente aquellos que muestran una función óptima a un pH ácido.
Se hace referencia a reticuladores heterobifuncionales ejemplares en la Tabla 6.
Tabla 6: Reticuladores Hetero-Bifuncionales Ejemplares
RETICULADORESHETETO-BIFUNCIONALES
Longitud del Brazo Reactivo a Ventajas y aplicaciones Espaciador después de Enlazador reticulación (Angstroms)
Aminas primarias
SMPT Mayor estabilidad 11,2 A
Sulfhidrilos
SPDP Aminas primarias Tiolación 6,8 A
LC-SPDP Aminas primarias Brazo espaciador extendido 15,6 A
Sulfo-LC-SPDP Aminas primarias Brazo espaciador extendido 15,6 A
SMCC Aminas primarias Grupo reactivo de maleimida estable 11,6 A
Sulfhidrilos Conjugación enzima-anticuerpo
Conjugación de proteína Haptenovehículo
Sulfo-SMCC Aminas primarias Grupo reactivo de maleimida estable 11,6 A
Sulfhidrilos Soluble en agua
MBS Aminas primarias Conjugación enzima-anticuerpo 9,9 A
Sulfhidrilos Conjugación de proteína hapteno-Sulfo-MBS Aminas primarias Soluble en agua 9,9 A
SIAB Aminas primarias Conjugación de enzima-anticuerpo 10,6 A
Sulfhidrilos
Sulfo-SIAB Aminas primarias Soluble en agua 10,6 A
SMPB Aminas primarias Brazo espaciador extendido 14,5 A
Sulfo-SMPB Aminas primarias Brazo espaciador extendido 14,5 A
EDE/Sulfo-NHS Aminas primarias Conjugación de hapteno-vehículo
0
ABH Carbohidratos Reacciona con grupos de azúcar 11,9 A
No selectivo
Enlazadores No-Escindibles o Unión Directa: En algunas otras realizaciones de la descripción, el conjugado puede diseñarse de modo que el agente se administre a la diana pero no se libere. Esto puede lograrse uniendo un agente a un AB directamente o mediante un enlazador no escindible.
Estos enlazadores no escindibles pueden incluir aminoácidos, péptidos, D-aminoácidos u otros compuestos orgánicos que pueden modificarse para incluir grupos funcionales que posteriormente pueden utilizarse en la unión a AB por los procedimientos descritos en esta invención. Una fórmula general para un enlazador orgánico de este tipo podría ser
W-(CH2)n-Q
donde
W es -NH-CH2- o -CH2-;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un número entero de 0 a 20.
Conjugados no Escindibles: De manera alternativa, un compuesto se puede unir a AB que no activan el complemento. Cuando se usan AB que son incapaces de activar el complemento, esta unión se puede lograr usando enlazadores que sean susceptibles de escisión por complemento activado o usando enlazadores que no sean susceptibles de escisión por complemento activado.
Los anticuerpos descritos en esta invención también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 77; 4030 (1980); y Patente EE. UU. No. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente EE.UU: N.° 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente descripción pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de disulfida-intercambio.
Anticuerpos Activables Multiespecíficos que tienen Restos Estéricos No Ligante o Parejas de Unión para Restos Estéricos No Ligantes
La descripción también proporciona anticuerpos activables que incluyen restos estéricos no ligantes (NB) o parejas de unión (BP) para restos estéricos no ligantes, donde el BP recluta o atrae de otro modo el NB al anticuerpo activable. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, un anticuerpo activable multiespecífico que incluye un resto estérico no ligante (NB), un enlazador escindible (CL) y al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une a una primera diana o epítopo; un anticuerpo activable multiespecífico que incluye una pareja de unión para un resto estérico no ligante (BP), un CL y un AB1; y un anticuerpo activable multiespecífico que incluye un BP para el que se ha reclutado un NB, un CL y un AB1 que se une a la primera diana o epítiopo. Los anticuerpos activables multiespecíficos en los que el NB está unido covalentemente al CL y al AB1 o está asociado por interacción con un BP que está unido covalentemente al CL y al AB1 se denominan en esta invención "anticuerpos activables multiespecíficos que contienen NB". Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana cuando el anticuerpo activable está en un estado no inhibido, no enmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación, es decir, un anticuerpo activado), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión a la diana. Las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos pueden exhibir una biodisponibilidad aumentada y una biodistribución más favorable en comparación con los productos terapéuticos de anticuerpos convencionales.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión en sitios sin tratamiento y/o sitios de diagnóstico si el anticuerpo activable multiespecífico no se enmascara o se inhibe de otro modo la unión a tal sitio. '
En una realización, el anticuerpo activable multiespecífico incluye un resto estérico no ligante (NB); un enlazador de escindible (CL): y al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o epítopo, donde el NB es un polipéptido que no se une específicamente al AB1; el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; el CL está posicionado de tal manera que en un estado no escindido, el Nb interfiere con la unión del AB1 a su diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB1 a su diana; y el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima. Tal como se usa en esta invención y en toda la presente, el término polipéptido se refiere a cualquier polipéptido que incluye al menos dos residuos de aminoácidos, incluyendo polipéptidos más grandes, proteínas de longitud completa y fragmentos del mismo, el término polipéptido no se limita polipéptidos de cadena única y puede incluir polipéptidos multi-conjunto, por ejemplo, multi-cadenas. En los casos en que el polipéptido es de una longitud más corta, por ejemplo, menos de 50 aminoácidos en total, los términos péptido y polipéptido se utilizan indistintamente en esta invención y en los casos en que el polipéptido es de una longitud más larga, por ejemplo, 50 aminoácidos o más, los términos polipéptido y proteína se usan indistintamente en esta invención.
En una realización, el anticuerpo activable multiespecífico incluye un resto estérico no ligante (NB); un enlazador escindible (CL); y al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o epítopo, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se une específicamente al AB1; (ii) el CL es un polipéptido de hasta 50 aminoácidos de longitud que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el CL está posicionado de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB1 a su diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB1 a su diana; y (iv) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima. Por ejemplo, el CL tiene una longitud de hasta 15 aminoácidos, una longitud de hasta 20 aminoácidos, una longitud de hasta 25 aminoácidos, una longitud de hasta 30 aminoácidos, una longitud de hasta 35 aminoácidos, una longitud de hasta 40 aminoácidos, una longitud de hasta 45 aminoácidos, una longitud de hasta 50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 10-50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 15-50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 20 -50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 25-50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 30-50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 35-50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 40-50 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 45-50 aminoácidos a longitud en el intervalo de 10-40 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 15-40 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 20-40 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 25­ 40 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 30-40 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 35-40 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 10-30 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 15-30 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 20-30 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 25-30 aminoácidos, una longitud en el intervalo de 10-20 aminoácidos, o una longitud en el intervalo de 10-15 aminoácidos.
En una realización, el anticuerpo activable multiespecífico incluye un resto estérico no ligante (NB); un enlazador escindible (CL): y al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o epítopo, donde (i) el NB incluye:- un polipéptido que no se une específicamente al AB1; (ii) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el CL está posicionado de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB1 a su diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB1 a su diana; (iv) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima; y (v) al menos una porción del anticuerpo multiespecífico tiene la disposición estructural de extremo N al extremo C de la siguiente manera en el estado no escindido: NB-CL-AB1 o AB1-CL-NB.
En una realización, (el anticuerpo activable multiespecífico incluye un resto estérico no ligante (NB); un enlazador escindible (CL); y al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o epítopo, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se une específicamente al AB1; (ii) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el CL está posicionado de tal manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB1 a su diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB1 a su diana, y donde el NB en el anticuerpo activable no escindido reduce la capacidad del AB1 para unirse a su diana en al menos 50 %, por ejemplo, en al menos 60 %, en al menos 70 %, en al menos 75 %, en al menos 80 %, en al menos 85 %, en al menos 90 %, en al menos 95 %, en al menos 96 %, en al menos 97 %, en al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 100 % en comparación con la capacidad del AB1 escindido para unirse a su diana; y (iv) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima. La reducción en la capacidad del AB para unirse a su diana se determina, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo como se describe en esta invención o un ensayo de desplazamiento de diana in vivo tal como, por ejemplo, el ensayo descrito en las publicaciones PCT n° WO 2009/025846 y WO 2010/081173.
En una realización, el anticuerpo activable multiespecífico incluye un pareja de unión (BP) para un resto estérico no ligante (NB); un enlazador escindible (CL); y al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una primera diana y/o epítopo, donde el BP es un polipéptido que se une al NB cuando se expone al mismo: el NB no se une específicamente al AB1; el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; el CL se coloca de manera que en un estado no escindido en presencia del NB. el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB la la diana y el BP no interfiere con la unión del AB la la diana; y el NB y el BP no inhiben la escisión de la CL por la enzima. En algunos ejemplos de esta realización, la BP del anticuerpo activable se une opcionalmente al NB. En una realización, el NB es reclutado por el BP del anticuerpo activable in vivo.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el anticuerpo activable multiespecífico se formula como una composición. En algunas de estas realizaciones, la composición también incluye el NB, donde el NB se coformula con el anticuerpo activable multiespecífico que incluye el BP, el CL. y el AB. En algunos ejemplos de esta realización, el BP se selecciona de entre el grupo que consiste en un péptido de unión a albúmina, un péptido de unión a fibrinógeno, un péptido de unión a fibronectina, un péptido de unión a hemoglobina, un péptido de unión a transferrina, un péptido de unión al dominio de inmunoglobulina y otros péptidos de unión a proteína sérica.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el NB es una proteína globular soluble. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el NB es una proteína que circula en el torrente sanguíneo. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el NB se selecciona de entre el grupo que consiste en albúmina, fibrinógeno, fibronectina, hemoglobina, transferrina, un dominio de inmunoglobulina y otras proteínas séricas.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una proteasa. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, la proteasa se localiza conjuntamente con su diana en un tejido, y la proteasa escinde el CL en el anticuerpo activable multiespecífico cuando el anticuerpo activable multiespecífico se expone a la proteasa. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el CL es un polipéptido de hasta 50 aminoácidos de longitud. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) que tiene una longitud de hasta 15 aminoácidos, por ejemplo, 3 aminoácidos de longitud, 4 aminoácidos de longitud, 5 aminoácidos de longitud, 6 aminoácidos de longitud, 7 aminoácidos de longitud, 8 aminoácidos de longitud, 9 aminoácidos de longitud, 10 aminoácidos de longitud, 11 aminoácidos de longitud, 12 aminoácidos longitud, 13 aminoácidos de longitud, 14 aminoácidos de longitud o 15 aminoácidos de longitud.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, al menos una porción del anticuerpo activable multiespecífico tiene la disposición estructural del extremo N extremo C de la siguiente manera en el estado no escindido: Nb -CL-AB, AB-CL-NB, BP-CL-AB o AB-CL-BP. En realizaciones donde el anticuerpo activable multiespecífico incluye un BP y el anticuerpo activable multiespecífico está en presencia del NB correspondiente, al menos una porción del anticuerpo activable multiespecífico tiene una disposición estructural desde el extremo N al extremo C de la siguiente manera en el estado no escindido: NB:BP-CM-AB o AB-CM-BP:NB, donde ":" representa una interacción, por ejemplo, unión, entre el NB y BP.
En algunos ejemplos de una de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico. el anticuerpo activable multiespecífico incluye un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a su diana y es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo de dominio, cadena simple, fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, una costra, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio simple y un anticuerpo de cadena ligera de dominio simple. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une a su diana es un anticuerpo monoclonal de ratón, quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecifico, el anticuerpo activable multiespecifico también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es unenlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado de entre el grupo enumerado en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o un derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables multiespecíficos, el anticuerpo activable rmiltispecífico también incluye un espaciador. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecifico, el anticuerpo activable multiespecifico también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable multiespecífico a través de un espaciador. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable multiespecífico.
En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo multiespecífico correspondiente; por ejemplo, la pK del anticuerpo activable multiespecífico es mayor que la del anticuerpo multiespecífico correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es similar a la del anticuerpo multiespecífico correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable multiespecífico es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo activable multiespecífico descrito en esta invención, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La descripción proporciona procedimientos para producir un anticuerpo activable multiespecífico cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, donde la célula comprende tal molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula comprende tal vector.
La constante de disociación (Kd) del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB hacia la diana es mayor que la Kd del AB hacia la diana cuando no está asociado con el NB o NB:BP. La constante de disociación (Kd) del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB hacia la diana es mayor que la Kd del AB original hacia la diana. Por ejemplo, la Kd del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10­ 100 , 10- 1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10- 1000000, 10- 10.000.000, 100- 1.000, 100-10.000, 100- 100.000, 100­ 1.000.000, 100- 10.000.000, 1.000- 10.000, 1.000- 100.000, 1.000-1.000.000, 1.000- 10.000.000, 10.000- 100000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000- 1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces, mayor que la del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o el Kd del AB original hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB hacia la diana es inferior a la afinidad de unión del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o menor que la afinidad de unión del AB original hacia la diana. Por ejemplo, la afinidad de unión del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB a la diana es de al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o mayor o entre 5-10, 10-100, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100­ 100.000, 100- 1.000.000, 100- 10.000.000, 1.000- 10.000, 1.000-100.000, 1.000- 1.000.000, 1.000- 10.000.000, 10.000100.000, 10.000- 1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000- 1.000.000, o 100.000- 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o menor que la afinidad de unión del AB original hacia la diana,
Cuando el anticuerpo activable multiespecífico de NB está en presencia de su diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP. Cuando el anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB está en presencia de su diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe,, en comparación con la unión específica del AB original a su diana. Cuando se compara con la unión del AB no asociada con un NB o NB:BP o la unión del AB original a su diana, la capacidad del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB para unirse a su diana se reduce, por ejemplo, en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vitro y/o in vivo.
Cuando el anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB está en presencia de su diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, una proteasa u otra enzima), la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP. Cuando el anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB está en presencia de su diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, una proteasa, otra enzima, agente de reducción o luz), la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB original a su diana. En comparación con la unión del AB no asociada con un NB o NB:BP o la unión del AB original a su diana, la capacidad del anticuerpo activable multiespecífico que contiene NB de unirse a su diana se reduce, por ejemplo, en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso al 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48. 60, 72. 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90. 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o menos cuando se mide in vitro y/o in vivo.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpo activable multiespecífico, el anticuerpo activable multiespecífico incluye un agente conjugado con el AB para producir un conjugado de anticuerpo activable multiespecífico. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable multiespecífico, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el agente es un marcador detectable. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable multiespecífico, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable multiespecífico, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones del anticuerpo activable conjugado de la invención, el agente está conjugado con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones del conjugado del anticuerpo activable multiespecífico, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado de entre el grupo enumerado en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos son anticuerpos activables multiespecíficos de unión a diana dual. Dichos anticuerpos activables multiespecíficos de unión a diana dual contienen dos Abs que pueden unirse a la misma diana o a dianas diferentes. En realizaciones específicas, los anticuerpos activables multiespecíficos de doble direccionamiento contienen anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos.
Anticuerpos activables multiespecíficos de unión a dianas duales están diseñados para tener un CL escindible por un agente de escisión que está colocalizado en un tejido diana con una o ambas de las dianas capaces de unirse a los AB de los anticuerpos activables multiespecíficos. Se pueden diseñar anticuerpos activables multiespecíficos de unión a diana dual con más de más de un AB para la misma o diferentes dianas para tener más de un CL, donde el primer CL es escindible por un agente de escisión en un primer tejido diana y donde el segundo CL es escindible por un agente de escisión en un segundo tejido diana, con uno o más de las dianas que se unen a los AB de los anticuerpos activables multiespecíficos. En una realización, el primer y segundo tejido diana están separados espacialmente, por ejemplo, en diferentes sitios del organismo. En una realización, el primer y el segundo tejido diana están separados temporalmente por el mismo tejido, por ejemplo, el mismo tejido en dos puntos de tiempo diferentes, por ejemplo, el primer punto de tiempo es cuando el tejido es un tumor en etapa temprana, y el segundo punto de tiempo es cuando el tejido es un tumor en etapa tardía.
La descripción también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos activables multiespecíficos descritos en esta invención. La descripción también proporciona vectores que incluyen estos ácidos nucleicos. Los anticuerpos activables multiespecíficos descritos en esta invención se producen mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, donde la célula incluye estas moléculas o vectores de ácido nucleico.
La descripción también proporciona procedimientos para fabricar anticuerpos activables multiespecíficos. En una realización, el procedimiento incluye las etapas de (a) cultivar una célula que incluye una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable multiespecífico en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, donde el anticuerpo activable multiespecífico incluye (i) un resto estérico no ligante (NB);(ii) un enlazador escindible (CL); y (iii) un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, donde (1) el NB no se une específicamente al AB; (2) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (3) el CL se coloca de manera que en un estado no escindido, el n B interfiere con la unión del AB la la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB la la diana; y (4) el NB no inhibe la escisión de la enzima por medio de la enzima; y (b) se recupera el anticuerpo activable multiespecífico.
En otra realización., el procedimiento incluye las etapas de (a) cultivo de una célula que incluye una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable multiespecífico en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, donde el anticuerpo activable multiespecífico incluye (i) un pareja de unión (BP) para un resto estérico no ligante (NB); (ii) un enlazador escindible (CL); y (iii) un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, donde (1) el NB no se une específicamente al AB; (2) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (3) el CL se coloca de manera que en un estado no escindido en presencia del n B, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB la la diana y el BP no interfiere con la unión del AB la la diana; y (4) el NB y el BP no inhiben la escisión del CL por la enzima; y (b) se recupera el anticuerpo activable multiespecífico. En algunos ejemplos, de esta realización, el BP del anticuerpo activable multiespecífico se une al NB.
Uso de Anticuerpos Multiespecíficos y de Anticuerpos Activables Multiespecíficos
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según la descripción se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se pueden encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, lípidos (catiónicos o aniónicos) que contienen vesículas (tales como Lipofectin™). Conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contengan carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente descripción, siempre que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000). Wang W, “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1 -2): 1-60 (2000). Channan WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell y col. “Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citaciones en el mismo para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
En una realización, un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la divulgación se pueden utilizar como agentes terapéuticos. Dichos agentes generalmente se emplearán para diagnosticar, pronosticar, monitorear, tratar, aliviar y/o impedir una enfermedad o patología en un sujeto. Un régimen terapéutico se lleva a cabo mediante la identificación de un sujeto, por ejemplo, un paciente humano u otro mamífero que padece (o corre el riesgo de desarrollar) un trastorno utilizando procedimientos estándar. Un anticuerpo multiespecífico y/o una preparación de anticuerpo activable multiespecífico, por ejemplo, en algunas realizaciones, una que tiene alta especificidad y alta afinidad por sus dos o más antígenos diana, se administra al sujeto y generalmente tendrá un efecto debido a su unión con las dianas. La administración del anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico puede anular o inhibir o interferir con la función de señalización de una o más de las dianas. La administración del anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico puede anular o inhibir o interferir con la unión de una o más de las dianas con un ligando endógeno al que se une naturalmente.
En general, el alivio o tratamiento de una enfermedad o trastorno implica la disminución de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, en el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede lograr uno o una combinación de lo siguientes: reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, inhibir la metástasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En algunas realizaciones, se puede utilizar una composición de esta descripción para impedir la aparición o reaparición de la enfermedad o trastorno en un sujeto, por ejemplo, un ser humano u otro mamífero, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), un animal de granja, un animal de trabajo o un animal de zoológico. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente en esta invención.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción se refiere generalmente a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como se señaló anteriormente, esto puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico y sus antígenos diana que, en determinados casos, interfiere con el funcionamiento de las dianas. La cantidad que se requiere administrar dependerá además de la afinidad de unión del anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico para su antígeno específico, y también dependerá de la velocidad a la que un anticuerpo multiespecífico administrado y/o un anticuerpo activable multiespecífico se agota del volumen libre de otro sujeto al que se administra. Intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente efectiva de un anticuerpo multiespecífico y/o fragmento de anticuerpo y/o un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción pueden ser, a modo de ejemplo no taxativo, de alrededor de 0,1 mg/kg de peso corporal a alrededor de 50 mg/kg de peso corporal. Frecuencias de dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez a la semana.
La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier procedimiento conocido para diagnosticar o tratar el trastorno particular. Procedimientos para la detección de anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero sin limitarse a, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y otras técnicas inmunológicamente mediadas conocidas en la técnica.
En otra realización, un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico dirigidos a dos o más dianas son utilizados en procedimientos conocidos dentro de la técnica relacionados con la localización y/o cuantificación de las dianas (por ejemplo, para su uso en la medición de niveles de una o más de las dianas dentro de muestras fisiológicas apropiadas, para su uso en procedimientos de diagnóstico, para su uso en imagenología de proteínas y similares). En una realización dada, un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico dirigido a dos o más dianas, o un derivado, fragmento, análogo u homólogo del mismo, que contienen el dominio de unión al antígeno derivado del anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacológicamente activos (denominados en lo sucesivo «terapéuticos»).
En otra realización, se utiliza un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico dirigido a dos o más dianas para aislar una o más de las dianas mediante técnicas estándar, tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico dirigido a dos o más dianas para un fragmento del mismo) se utilizan de forma diagnóstica para monitorear los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse mediante el acoplamiento (es decir, unión física) del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes. materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen125I, 131L, 35S o 3H.
En aun otra realización, se puede usar un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico dirigido a dos o más dianas como un agente para detectar la presencia de una o más de las dianas (o un fragmento de las mismas) en una muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una etiqueta detectable. Los anticuerpos son policlonales o, en algunas realizaciones, monoclonales. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv, o F(ab)2. El término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende incluir el marcado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o el anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcado final de una sonda de con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto, incluidos dentro del uso del término "muestra biológica", por lo tanto, está la sangre y una fracción o componente de sangre que incluye suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el procedimiento de detección de la descripción se puede usar para detectar una proteína en una muestra biológica in vitro, así como in vivo. Por ejemplo, técnicas in vitro para la detección de una proteína de analito incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones, e inmunofluorescencia. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en “ELISA: Theory and Practice; Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “ Immunoassay”, E. Diamandis y T. C'hristopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996: y “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, técnicas in vivo para la detección de una proteína de analito incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo de proteína anti-analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de imagenología estándar.
Los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción también son útiles en una diversidad de formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una realización, se administra un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico a pacientes que corren el riesgo de desarrollar uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En otra realización de la descripción, se administra un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos también son útiles en la detección de una o más dianas en muestras de pacientes y, en consecuencia, son útiles como diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles diana en una muestra de paciente.
En una realización, un anticuerpo y/o un anticuerpo activable de la descripción se inmoviliza sobre un soporte sólido (porejemplo, el pocillo o pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo multiespecífico inmovilizado y/o el anticuerpo activable multiespecífico inmovilizado con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de marcador detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en diversas etapas de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada etapa de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada estadio.
También pueden usarse anticuerpos multiespecíficos, y/o anticuerpos activables multiespecíficos en procedimientos de diagnóstico y/o imagenología. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vitro. En algunas realizaciones, tales procedimientos son Procedimientos in vivo. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo. Por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos, y/o anticuerpos activables multiespecíficos que tienen un CM escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas realizaciones, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado dependiendo de la naturaleza del CM) sino también que el tejido expresa al menos una diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse como sustrato de proteasa para una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. Al menos uno de los AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando procedimientos familiares para un experto en la técnica, un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente o marcador radiactivo o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo multiespecífico y/o anticuerpo activable multiespecífico. Marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando al menos un AB específico para una proteína o péptido del estado de la enfermedad, junto con una proteasa cuya actividad es elevada en el tejido de la enfermedad de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido de la enfermedad en relación con los tejidos donde la enzima específica del CM no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido de la enfermedad o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas pequeñas y los péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y dado que la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles inferiores en tejidos que no son de la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido de la enfermedad aumenta en relación con los tejidos que no son de la enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables multiespecíficos contienen un CM susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables multiespecíficos pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, donde los anticuerpos activables multiespecíficos contienen un CM susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables multiespecíficos pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables multiespecíficos pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables multiespecíficos inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra se evalúa a continuación mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables multiespecíficos antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable multiespecíficos por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir al menos un AB de los anticuerpos activables multiespecíficos cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en el marcador detectable de los anticuerpos activables multiespecíficos como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en imagenología in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, por ejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular. La imagenología in situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un colorante fluorescente (por ejemplo, un fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un marcador Alexa Fluor®), un colorante de infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección de la etiqueta en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable multiespecífico etiquetado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable multiespecífico. En algunas realizaciones, la presencia de la proteasa se puede confirmar usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como aquellos descritos como heroína, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa (MT-SP1) e inhibe la actividad proteolítica de MT-SP1; ver, por ejemplo, Publicación internacional Número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. El mismo enfoque del uso de inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una proteasa o clase de proteasas específicas para el CM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana o la etiqueta detectable puede competir con la diana no etiquetada. En algunas realizaciones, podría usarse un anticuerpo activable no etiquetado, con detección mediante un anticuerpo secundario etiquetado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la imagenología in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable multiespecífico.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de la proteasa en una variedad de células, tejidos y organismos en función del CM específico de proteasa en el anticuerpo activable multiespecífico.
Admin istración Terapéutica y Formulaciones de Anticuerpos Mutiespecificos y/o Anticuerpos Activables Mutiespecificos
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según la descripción se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Una multitud de formulaciones apropiadas se pueden encontrar en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington 's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)). particularmente el Capítulo 87 por Blaug. Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas absorbentes anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente descripción, siempre que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm, 203(1-2); 1-60 (2000). Charman WN ''Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell y col. “Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citaciones en los mismos para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados se administran junto con uno o más agentes adicionales, o una combinación de agentes adicionales. Agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados se pueden utilizar junto con un agente quimioterapéutico o antineoplásico adicional. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional se administran simultáneamente. De manera alternativa, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional están separados entre sí, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional se administran simultáneamente, o los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados se administran antes de la administración del agente adicional, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados se administran después de la administración del agente adicional, o los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional se administran de forma alterna. Tal como se describe en esta invención, los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados y el agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
En algunas realizaciones, el agente adicional está acoplado o unido de otro modo a los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados.
Agentes adicionales adecuados se seleccionan según el propósito de la aplicación prevista (es decir, destrucción, prevención de la proliferación celular, terapia hormonal o terapia génica). Dichos agentes pueden incluir, pero sin limitarse a, por ejemplo, agentes farmacéuticos, toxinas, fragmentos de toxinas, agentes alquilantes, enzimas, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferativos, hormonas, neurotransmisores, ADN, ARN, ARNip, oligonucleótidos, ARN antisentido, aptámeros, diagnósticos, colorantes radiopacos, isótopos radiactivos, compuestos fluorogénicos, etiquetas magnéticas, nanopartículas, compuestos marcadores, lectinas, compuestos que alteran la permeabilidad de la membrana celular, compuestos fotoquímicos, moléculas pequeñas, liposomas, micelas, vectores de terapia génica, vectores virales y similares. Finalmente, se pueden usar combinaciones de agentes o combinaciones de diferentes clases de agentes.
Los anticuerpos multiespecíficos, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o las composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos conjugados de la descripción (también denominados en esta invención "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Los principios y consideraciones involucrados en la preparación de dichas composiciones, así como la orientación en la elección de componentes se proporcionan, por ejemplo, en Remington 's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, y col., editores) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
Dichas composiciones comprenden típicamente el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Cuando un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico incluye un fragmento del dominio AB, se puede utilizar el fragmento más pequeño del AB que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conserven la capacidad del AB de unirse a la secuencia de proteínas diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. (Véase, e.g, Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)).
Como se usa en esta invención, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. Ejemplos adecuados de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero sin limitarse a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que un medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Una composición farmacéutica de la descripción se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, una solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.
Composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una aplicación con jeringa fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o se traga. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, troches y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación sostenida/controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilén vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de las formulaciones mencionadas anteriormente serán evidentes para los expertos en la materia.
Por ejemplo, los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (para ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato). o poli( vinilalcohol)), poli láctidos (Pat. EE. UU. N .° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etilenovinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en esta invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada dosis unitaria una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la descripción se dicta por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.
La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, por ejemplo, en algunas realizaciones, aquellas con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son efectivos para el fin previsto.
En una realización, los compuestos activos son administrables en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos autoinmunitarios y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se proporcionan de forma sustancialmente simultánea, al mismo tiempo o en secuencia. Si se administra en secuencia, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos todavía es detectable a concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento.
Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más anticuerpos de la descripción coformulados con, y/o coadministrados con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de citocinas y factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe en más detalle a continuación. Además, uno o más anticuerpos descritos en esta invención se pueden utilizar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos descritos en esta invención. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
En otras realizaciones, uno o más anticuerpos de la descripción se pueden coformular con, y/o coadministrar con uno o más fármacos antiinflamatorios, inmunosupresores o inhibidores metabólicos o enzimáticos. Ejemplos no taxativos de los fármacos o inhibidores que se pueden utilizar en combinación con los anticuerpos descritos en esta invención incluyen, pero sin limitarse a, uno o más fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID). por ejemplo, ibuprofeno, tenidap, naproxeno, meloxicam, piroxicam, diclofenaco, e indometacina: sulfasalazina; corticosteroides tales como prednisolona: fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas (CSAID); inhibidores de la biosíntesis de nucleótidos, por ejemplo, inhibidores de la biosíntesis de purina. antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato [N-[4-[[(2,4-diamino-6- pteridinil)metil] metilamino] benzoil]-L-ácido glutámico); e inhibidores de la biosíntesis de pirimidina, por ejemplo, inhibidores de dihidroorotato dehidrogenasa (DHODH). Agentes terapéuticos adecuados para su uso en combinación con los anticuerpos de la descripción incluyen inhibidores de NSAID, CSAID, (DHODH) (por ejemplo, leflunomida) y antagonistas del folato (por ejemplo, metotrexato).
Ejemplos de inhibidores adicionales incluyen uno o más de: corticosteroides (oral, inhalada e inyección local); inmunosupresores, por ejemplo.. ciclosporina, tacrolimus (FK- 506): e inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirulimus (rapamicina - RAPA-MUNE™ o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados de rapamicina solubles (por ejemplo, derivados de rapamicina de éster, por ejemplo, CCI- 779); agentes que interfieren con la señalización por citocinas nroinflamatorias tales como TNFa o IL-I (por ejemplo, IRAK., NIK, IKK. p38 o inhibidores de quinasa MAP): Inhibidores de COX2, p. ej., celecoxib, rofecoxib y variantes de los mismos; inhibidores de fosfodiesterasa, p. ej., R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa tipo IV); inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona); inhibidores del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares o receptor del factor de crecimiento, por ejemplo, Inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R; e inhibidores de la angiogénesis. Agentes terapéuticos adecuados para su uso en combinación con los anticuerpos de las descripción son inmunosupresores, p. ej., ciclosporina, tacrolimus (FK-506); inhibidores de mTOR, p. ej., sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, p. ej., derivados de rapamicina solubles (p. ej., derivados de rapamicina de éster, p. ej., CCI-779); inhibidores de COX2, p. ej., celecoxib y variantes de los mismos; y inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2), por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona.
Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden combinar con un anticuerpo de la divulgación incluyen uno o más de: 6-mercaptopurinas (6-MP); azatioprina sulfasalazina; mesalazina; olsalazina; cloroquina/ hidroxicloroquina (PLAQUENIL®); penicilamina; aurotiomalato (intramuscular y oral); azatioprina; colchicina; agonistas de los adrenorreceptores beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol); xantinas (teofilina, aminofilina); cromoglicato; nedocromilo; cetotifeno; ipratropio y oxitropio; micofenolato mofetilo; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento; y agentes adrenérgicos.
EJEMPLOS
Las siguientes secuencias mostradas en la Tabla 7 incluyen secuencias que se utilizaron a lo largo de los Ejemplos proporcionados en esta invención:
Tabla 7: Ejemplos de secuencias
Anticuerpo CTLA-4 scFv anti-humano:
GGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAG GC GGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTC TCCAGGCACCCTGTCT TTGTCTCCAGGGGAAAG AGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAG CAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC C TCATC TATGGTGCATCCAGCAGGGCCACT GGCA TCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTC GGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATG TATACTATACCAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGG CGTGGTCCAGCCTGCGACCTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGC AGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTA TTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGAC7CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACG GGCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCA CCCTGGTCACTCTCTCTTCAGCTAGC (SEO ID NO: 229)
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQ QKPGQAPRLL1YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTF GGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGWQPGRSLR1SCAASGSTFS SYAMSW’/KOAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS'/KGRl-TrSRDNSKNTLYLGHNSLFAEDT AVYYCATNSLYKYFDLWGRGTLVTVS SAS (SEQ ID NO: 230)
Anticuerpo CD3 épsilon OKT3 scFv anti-humano;
GGAGGTGGATCTGCAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGACGCTCAGGTGGTGGAGGATCAG GCGGAGG'rCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGT TAAAATGAGC'TGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAA CAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGOTATATCAATCCGAGCCG'rGGTTATACCA ACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAÜCAGCACCGC CTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGC AGTTT ATTACTGl'GC ACGCT AT TATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGüG'rCAGGGCACCACCCTGACCGTiAGCAGCG GTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCA GAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGC AGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGA TTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGT7CCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGG CACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCA6AAGATGCAGCAACCTATTATTGT CAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGG'r AGOGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 231) GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQUíQSGAE:A.RPGASVKKSCKASGYTF7RYTMHWVK CRPGQGI.ENIGYINPSRGYTNYNQKFKDXATL7TDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARY YDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQ1VLTQSPAIHSASPGEKVTMTCSAS
SSVSYMNKYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASCVPAHFRCSGSGTSYSLTISCMEAEDAATYYC QQWSSWPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 232)
Anticuerpo Jagged 4D11v2 Anti-humano: Cadena pesada
gaggtgcacctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactct cctgtgcagcctctgaattcacctttagcagctatgccatgagctgggxccgccaggctcc agggaaggggctggagtgggtgtcaagtactgacccggaaggtcggcagacat.atr.acgca gactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgcatctgc aaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtat.atcactgtgcgaaagacatcggcgg caggtcggcctttgactactggggccagggaaccctggrcaccgtctcctcagctagcacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctccíccaagagcacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggct.gtcc‘acagtcctcaggactctact;cc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacg tgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat.ctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg tggrggacgtgagccacgaagaccctgaggccaagttcaactggc.acg*ggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagcacaacagcacgtaccgcgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatcxccaaaaccaaagggcagccccg agaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagxgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccrtctt cctctacagcaagcccaccgcggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcaxgc tcegtgatgeatgaggctctgcacaaccactacaegeagaagagcctcxccctgtctecgg gtaaa (SEQ ID NO:233)
EVHLLESGGGI.VQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLSKVSSIDPEGRQTYYA DSVKGRFTISRDNSKUTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGPSAEDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAIjTSGVHTFPAVI/QSSGLYS LSSWTVPSSS LGTQTYICNVNH KPSNTXVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELI.GGPSVFL FPPKPKDTIJ4ISRTPEVTCWVDVSHBDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLfíQDKI.NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGGPREPQ'/YTLPPSREEHTKNCVS
ltclvkgfypsdiavewesncqpennykttppvldsdcsfflyskltvdksrwqqgnvfsc SVMHEALHNRYTQKSLSLSPCK (SEQ ID NO:234)
Anticuerpo Jagged 4D11v2 anti-humano: Cadena ligera
Gacatccagatgacccaatctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagccacca tcacttgccgggcaagtcagageattagcagccatttaaattggtatcagcagaaaccagg gaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccagttcgcaaagtggggtcccatcaagg ttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaag attttgcaacttactactgtcaacagacggttgtggcgcctccgttattcggccaagagac caaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatccgccttcatcttcccgccat.cr.gat aagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgcgcctgctgaataacttctatcccagag aggccaaaglacagtggaaggtggataacgccctccaaccgggtaactcccaggagagtgt cacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgancaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgc ccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEO IB NO: 235)
DIQMTQSPSSLSAS'/GDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPJCLLIVAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFU'LTISSLUPEDFATY YCQQTWAPPLFGQG'l'KVElKRTVAAPSVFIFPPSD EOLKSGTASWCLLNNFYPREAKVOKKVDNALQ5GNSQE5VTEQD3KDSTYSLSSTLTLXK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRÜEC (SEQ ID NO: 236)
Anticuerpo;. Jagged 4D11Anti-humano:. Cadena pesada
gaggtgcagctgtrggagtctgggggaggcctggtacagcctggggggtccctgagactct cctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctcc agggaaggggctggagcgggcgtcaagtattgacccggaaggtcggcagacatartacgca gactccgtgaagggccggctcaccatctccagagacaatrccaagaacacgctgtarctgc aaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagscatcggcgg caggtcggcctttgactactggggccagggaaccctggccaccgtctcctcagctagcacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctacccc etcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaaeg tgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtctccctc ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgyacccctgaggtcacatgcgtgg tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcaiaatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaecatccccaaagccaaaggccagccccg agaaccacaggtgtacaccctgcccccatccccggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgocatcgccgtggagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaacr.acaagaccacgcct.cccgcgctggactccgacggctcctr.ctt cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcayaagagcctctccctgtctccgg gtaaa !SEQ ID NO: 237)
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Anticuerpo Activable Anti-Jagged 5342-1204-4D11v2: Cadena ligera
caaggccagtctggccagtgcaatatttggctcgtaggcggtgattgcaggggctggcagg ggggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggtctgagcggccgttccgataatcatgg cggcggttctgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagac agagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagc agaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccagtttgcaaagtggggt cccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctg caacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagacggttgtggcgcctccgctattcg gccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttccc gccatctgatgagcagctgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccc aggagagtgtcacaaagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgac
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QGCSGQCNIKLVGGDCP.GWQGGSSGGSGGSCGI.SGRSDNHGGGSDIQM7QSPS5LSASVGD RVTITCRASQSISSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQKKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSESSTLTLXKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 240)
Anticuerpo Multiespecífico Anti-Jagged 4D11v2 - anti-CD3 OKT3: Cadena pesada GAGGTGCACCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCrrGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGC7ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGCTCGGCAGACATATTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACrGTGCGAAAGACATCGGCGG CAGGTCGGCC'i'TTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG'rCTCCTCAGCTAGCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAA?CrrGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC7GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGAGACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG7TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC7GAA7GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCC7CCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC7CCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCACAAGAGCACGTGGCAGCAGGGGAACGTC77CTCATGC TCCGT6ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC7GTCTCCGG GTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGC7CTGGCGGAGGCTCAGG7GGTGGAGG TTAAACAGCGTCCCGCTCACGGTCTGGAAT0GATTGCTTATA7CAATCCGAGCCGTGGTTA TACCAAC7ACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGC ACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGCATAGCGCAGTTTATTACTGTGCA': GCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTA77GGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAG CAGCGGTGCTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGT7CAGGCGGTGCCGGTAGCCAGATTGTTCTG ACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGG7GAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCG CCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTA7CAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACG TTGGATT7ATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTG7TCCGC-CACATTTTCGTGGTAGCGGT AGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATT ATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCnTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAA TCGT (SEO ID NO: 241)
EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSIDFEGRQTYYA DSVKGRFTI5RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDlGGRSAF0YWGQGTI.VrVSSAST KGPSVFPGAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAETSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWr^PSSSLGTCrTYICNVHHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL fppkpkdtlmisp.t p e v t c v w d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t x p r e e q y n s t y r w SVLTVUIODWLNCKEYKCKVSHKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNÜVS LTCLVKGFYPSÜIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD5DGSFFLYSKLTVDKSRWQ0GNVFSC SVMHEAL[)NHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSG*\ELAR?GA svkmsckasgytftrytmhwvkgrpgqglewigy:npsrgytnykqkfkdka?¡.ttdksss TAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQG7TLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVL tgspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkp.kiydtsxlasgvpahfrgsg SGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSG7KLEINR (SEQ ID NO: 242)
Anticuerpo anti-Jagged 4D11v2 - anti-CD3 OKT3: Cadena ligera
GACATCCAGA7GACCCAGTCTCCATCCTCCC7GTC7GCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGC7AT7TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGCCCCTAAGC7CCTGATCTATGCGGCA7CCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAC:CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAG ATTTTGCAACTTACTACtGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAACCTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTCAT GAGCAGT7GAAA7C7GCAACTGCCTC7CT7C7C7GCCTGCTGAATAACT7CTA7CCCAGAG ACGCCAAACTACAGTGGAACGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACACACCAGCACAGCAACGACAGCACCTACAGCC7CAGCAGCACCCTGACGC7GANCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAACTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCT7CAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGCATCTGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGC CGTGCACAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCG77AAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATA CCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGAT TGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCA ACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAG AGGATAGCGCAG77TATTACTGTGCACGCTAT7ATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTG GGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCA GGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGG GTGAAAAAGTTACCA7GACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAA7TGGTATCA GCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGA7TTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGT GTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTA TGGAAGCAGAAGA7GCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTT TGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 243) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLÍTOFYPREAKVQKKVDNALQSGNSQE5VTEQD3KDSTYSLSSTL.TI.XK ADYEKilKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQS GAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHKVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKA TLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQIVLTQS PAIMSAS PGEKVTMTCSA SSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIY DTSKLASG VPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTXLSIKP (SEO ID
NO: 244)
Anticuerpo activable multiespecífico anti-Jaaaed-anti-CD35342 - 1204-4D11v2—CD3 OKT3: Cadena ligera
CAAGGCCA6TCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGG GGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGA7AATCATGG CGGCCGTTCTCACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGACAC ACAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG'GTATTTAAATTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGT CCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTG CAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCG GCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTG TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGvTTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGANCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGC CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTG GCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCACGCGGAGGTCAGGTTCAGCT GCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGT7AAAATGAGCTGTAAAGCA AGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTC TGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAA AGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGC CTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTA'fGATGATCACTATTGCC TGGAT'rATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGG'i’AGTGGTGG CGGTGGTTCAGGCGGTGGGGGTAGCCAGAT7GTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGC GGAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGA ATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACT GGCAAGCGGTGTTCCGGCACA1TTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACC ATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATC CGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAA7TAATCGT (SEQ ID NO: 245> QGQSGQCNIWLVGGDCRGHOGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGSDIGMTQSPSSLSASVGD RVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLCSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL CPEDFATYYCQQTVyAPPLFGOGTKVEIXRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG'TASVVCLLNNF YPP.EAXVQKKVDNAI-QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLXKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGASLARPGASVKMSCKA
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/vSPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQOKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLT ISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTXLEINR (5EQ ID NO: 246)
Anticuerpo Multiespecífico Anti-Jagged 4D11v2-anti-CTLA-4: Cadena Pesada
GACCTGCACCTGTTGCAGTCTCGGGCAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC AOGGAAGGGGCTGGAGTGCGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGG CAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACrrCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGACCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC1*GAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCCTCCTCACCGTCCTGCACCAGCACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGCTCT CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCiCCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG'rCTrCTCATGC TCCGTGA7GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGC7CTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGG ATCAGGCGGAGG7GAAATTGTGTTGACACAGTC7CCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTC7CCTGCAGGGCCAGTCAGAG7GTTAGCAGCAGCTACT7AGCCTGGT ACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGG7C7GG6ACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTG7CAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCA CTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT7CCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTA TAATGTATAC7ATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGG GGACGCGTGG7CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCT TTAGCACCTATGCCATGACCTGCGTCCCCCACCCTCCAGCGAACGGGCTGGAGTGGGTCTC ACCTATTAGTGCTAGTGGTGGTAGCACATAC7ACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATCAACAGCCTGAGAGCCGAGG ACACGGCCCTATATTACTGTCCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCG TGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGC ÍSEQ ID NO: 247)
EVHLLESGGGLVCPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVP.QAPGKGLEKVSSIDPEGRQTYYA dsvkgrftisrdnskntlylgkkslraedtavyycakdicgpsafdykgqgtdvtvssast KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFFAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAFE1LGGPSVFL FPPKPKD’TLMISP.TPEVTCVWDVSHBDPEVKFNWY'/DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHODKI.NGKEYKCKV5NKALPAPIEKTISKAKGOPREPO\fYTLPPSREEHTKNGVS LTCLVKGFYP5DIAVEWESNG0PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW0CGNVFSC SVMHEALHNHYTQK5LSL3PGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLT0SPGTLSLSPG EPATLSCRASQSVSSSYLAWYOQKPGOAPRjLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIS RLEPEDFAVYYCCCYGSSPLTFGGCTKVEIKP.SGGSTITSYNVYYTKLSSSG7GVQLVQTG GCWQPGKSLRLSCAASGSTFSSYAMSKVRCAPCKGLEWVSA1SGSGGSTYYADSVKGRFT 1SRDNSKNTLYLCMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEO ID NO: 248)
Anticuerpo multiespecífico .Anti-Jagged 4D11v2-anti-CTLA-4: Cadena ligera
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG7CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTAT7TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGA7CTGGGACAGATTTCAC7CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAG ATTTTGC AACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCC AAGGGAC CAAGGTGGAAA7CAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG7GCCTGCTGAATAACTTCTA7CCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC7CAGCAGCACCCTGACGC7GANCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC7GAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCT7CAACAGGGGAGAGTG7GGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGA6GTGAAATTGTGT7GACACAGTCT CCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGCAAACAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGA CTGTTACCAGCACCTACTTACCCTGGTACCAGCAGAAACCTCGCCAGGCTCCCAGGCTCCT CATCTATGGTGCATCCAGCACCCCCACTGGCATCCCACACACGTTCAGTGGCAGTGGGTCT GGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACrGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGCAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACG TTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCC7CGAGCGGT ACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGCTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGAG TCTCCTG7GCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG7CTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAG GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATC TGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCT TTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC
(SEO ID NO: 249) DIQMTQSPSSLSASVG2RVTITCRAS0SI5SYLNWYQCKPGKAPKLLIYAA3SLQSGYPSR FSGSGSGTDr.TLTISSLOPEDFATYYCQQTVVAPPI.FGüCTKVEIKRTVAAPSVFlFPPSD EOLKSGTASWCLLNNFYPREAKVOKKVDNALCSGNSCESVTEODSKDSTYSLSSTLTLXK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQS PGTLSLSPGERATLSCRA3Q5VSSSYEAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVE1KRSGGST1TSYNVYYTK1SSSG TQVOLVQTGOGWQPGRSLRLSCAASOSTFSSYAMSk'VRQAPGKGEEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRUNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS
<SEO ID NO: 250)
Anticuerpo Activable Multiespecífico Anti-Jagged-anti-CTLA-45342-1204~4D11v2—CTLA-4: Cadena ligera c
CAAGGCCAGTCTCGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCACGGCCTGCCAGG GGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGG'TCTGAGCGGCCGTTCCGAGAATCATGG CGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG'TAGGAGAC AGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCAT7AGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGT CCCATCAAGG77CAG7GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTG CAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCG GCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGG7GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC CCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC7GAATAACTTC TATCCCAGAGACGCCAAAGTACAGTGGAAGCrrCGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGCACACTCTCACAGAGCACGACACCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTCAC GCTGAÍ1CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGC CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACACGGGAGAGTCTGGAGGTGGATC7GGAGCTG GCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAC-GCGGAGGTGAAATTGTGTT GACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT7GTCTCCAGGCCAAACAGCCACCC7C7CCTGCAGG GCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTC CCAGGCTCCTCA7CTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGG CAGTGGG7CTGGGACAGACTTCACTCTCACCA7CAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGG AAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATC CTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTCGTGCAGACTGGGGGAGCCGTGGTCCAGCCTGCGAGG TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGG TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAG CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGA CAAACTCCCTTTACTGGrACTTCGATCl’CTGGGGCCGTGGCACCCTGG'rcACTGTCTCTTC AGCTAGC (SEQ ID NC: 251> QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGG5GGI»5GRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD RVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLÍYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQ7WAPPLFGQGTKVEIXRTVAAP5VFIFPPSDEQLXSGTASWCU.NNF YPREAKVQKKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS7YSI.SSTI,TLXKADYEKaKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSCGGCSGGGE1VI.TQSPGTLSLSPGERATLSCR ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRA7GIPDRFSGSGSG7DFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPL7FGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKL5SSGTQVQLVQTGGGWQPGR 5LRLSCAASGS7FSSYAMSWVRQAPGKGL.EWSAISGSGGSTYYADSVKGRF7ISRDNSKN TLYLQMNSLRAED7AVYYCATNSI.YKYFDLWGRGTI.VTVS5AS (SEQ ID NO: 252)
Anti-EGFR c225v5 ■ Cadena Pesada de Anticuerpos
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcatta cctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagccc gggcaaaggcctggaarggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattaraacacc ccgtttaecagccgcctgagcattaacaaagcitaacagcaaaagccaggtgttttttaaaa tgaacagcctacaaagccaggataccgcgattcattattgcgcgcgcgcgctgacctatta tgattatgaatttgcatattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgeggctageacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcctggtcaaqgactacttccccgaaecggtgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacacettcccggctgtcctacagtcctcaggactetacecc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctceagcagcttgggcacecagacctacatctgcaacg tgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc ttceccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacecetgaggtcacatgcgtgg tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacaacacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaaggcagccccg agaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttctt cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaatga (SEQ ID NO: 253)
QVQLKQSCPGIjVQPSQSliSITCrVSGFSLTNYGVKWVRGSPGKGLEKLGV¿W5GGNTDYNT PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSliQSQDTAIYYCARALTYYDYSFAYWGQG7LVTVSAAST KGP3VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVP$SSLGTQ7YTCNVNHKPSN7XVDKKyEPKSCDKTHTCPPCPAPE:.LGG?SVFL, FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAXTKPREEQYNSTYPW SVLTVLHQDWI.ÍIGKEYFCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRF.PQVYTLPPSRDEITKNGVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK77PPVLDSDGSFF1.YSKLTVDKSRWQCGNVFSC SVMHEALHNHY7QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 254)
Anticuerpo anti-EGFR C225v5: Cadena Ligera
CAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTC7GAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCT TTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAA CGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGC TTTAGCGGCAGCGGCAGCCGCACCGATT7TACCC7GAGCATTAACAGCG7GGAAAGCGAAG ATATTGCGCATTATTATTCCCACCAGAACAACAACTCCCCGACCACCTTTGGCGCGCGCAC CAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTG7TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 255)
QILLTQSPVIL3VSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGI?SP FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYyCCXJNNIMPTTEGAGTKDELKRTVAAPSVFlFPPSD EGLKSGTASWCLLÍ4NFYPREAKVOKKVDNALG5GNSGESVTEOD3KDSTYSD3STLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 256)
Anticuerpo Anti-EGFR C225v5: Cadena pesada
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcatta cctgcaccgtgagcggctttagcccgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagccc gggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacacc ccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaa tgaacagcctgcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctatta tgattacgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagoacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggcgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcccacagtcctcaggactctactcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacg tgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgcgctgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagcacaacagcacgtaccgtgcggtc agcgtcctcaccatcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagcccccccagcccccaccgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccg agaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacarcgccgtggagtgggacagcaatg ggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgetggactccgacggctccttctt cctctacagcaagctcaccgtggocaogagcaggtggcagcaggggaacgtcttcccatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaacoactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaa (SEQ ID NO: 257)
QVQLKQSGPGLVCPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVP.C5PGKGLEKLGVIWSGGNTDYNT PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYKGQGTLVTVSAAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP77VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK'/EPKSCDKTHTCPPCPAFELLGGPSVFL FPPKPKDTLMI3RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW s v l t v l í i q d w e n g k e y k c k v s n k a l p a p i e k t i s k a k g q f r e p q v y t l p p s r d e l t k n q v s LTCLVKGFYPSDIA'/EWESNGQPEKNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGHVFSC SVMHEALKNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NC: 258)
Anticuerpo Anti-EGFR C225v5: Cadena ligera
Ggcggtacccagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaac gtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagca gcgcaccaacggcagccegcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattageggcatt ccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgcgg aaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacetttgg cgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccg ccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataact^ct atcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccca ggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagccccagcagcaccctgacg ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcccgcgaagtcacccatcagggcc tgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagcg (SEQ ID NO: 259)
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIP5R FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNVíPTTFGAGTKLELNRTVAAPSVFIFPPSD EQI.K SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDHALOSGNSGESVTEQDSKDSTYSLSSTLTI.SK ADYF.KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 260)
Anticuerpo Anti-EGFR C225v4: Cadena pesada
caggtgcagctgaaacagaacggcccgggcctggtgcagccgagccagagectaagcatta cctgcaccglgagcggctttagcctgaccaactatggcgt.gcattgggtgcgccdgagccc gggcaaaggcctggaatggctgggcgtgattt.ggagcggcggcaacaccgattataacacc ccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagcitaacagcaaaagccaggtgttttttaaaa tgaacagcctgcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctatta tgattatgaatttgcgtatcggggccagggcaccct.ggtgaccgtgagcgcggctagcacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcct;ggt;caaggactacttccccgaaccggt.gacggtgtcgf.ggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgt.cc:tácagtcctcaggactctactcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccccccagcagcztgggcacccaaacciacatctgcaacg tgaatcacaaacccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgccoaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc ttccccccaaaacccaaggacaccctcataat.ct;cccggacccctgaggtcacatgcgtgg t3gtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgt.ggacggcgtgga ggtgcataatgcoaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct.gaatQgcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccg agaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaígaactgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtagagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgccggactccgacggctccttctt cctctacagcaagctcaecgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgncttctcacgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaarga (SEQ ID NO: 261)
CVQLKQSGPGI.VQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSHPTAIYYCARA1TYYDYEFAYWGQGTLVTVSAAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPF.PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLGSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEZ.LGGPSVFL FPPKPKDTIWISFtTPEVTCWVDVSHEDPEVKFMWYVDGVEVHNAKTKPREFOYNSTYPW SVITVLHQDWI.NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNÜVS LTCLVKGFYPSDIAVEWFSNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQCGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 262)
Anticuerpo Anti-EGFR C225v4: Cadena Ligera
Cagatcttgctgacccagaqcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagct tLagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacaLtcattgytatcagcagcgcaccaa cggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagecgc tttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaag atattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcacgggcac caaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccar.ct:gccttcatcttccegccatctgat gagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagag aggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaaccgggtaactcccaggaqagtgt cacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccat.cagqgcctgagctcgc ccgtcacaaaaagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID NO: 263)
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVTIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGliSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 264)
Anticuerpo Anti-EGFR C225v6: Cadena pesada
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcatta cctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgcgcatcgggtgcgccagagccc gggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacacc ccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgtttcttaaaa tgaacagcctgcaaagccaggataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgaccta~ta tgattatgaattcgcgractggggccagggcaccctggtgaccgtigagcgcggccagcacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggcgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccúacagtcctcaggactctacrcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacg tgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagctgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaccccngaggtcacatgcgtgg tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacegcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgraccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggetgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaac.accauctccaaagccaaogggcagccccg agaaccacaggtguacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggucaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatg agcagccggagaacaactacaagaccacgcctccegtgctggactccgacggctccttctt cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaacoactacacgcagaagagcctctccctatctccgg
gtaaatga (SEC ID NO: 265)
OyQLKQSGPGLVCPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVKWVRQSPGKGLSKLGVIWSGGNTDYNT PFTSRLSINKDNSKSCVFFKMNSLQSQDTAIY'YCARALTYYDYEE'AYKGQGTIArTVSAAST KGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP'/TVSWNSGAL'ISGVtt'rFPAVLCSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISP.TPEVTCYWDVSHEDPEVKFÍÍWYVDGVEVHNAKTKPREEOYASTYRW SVLTVLHQDWI^GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWGCGHVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NC: 266)
Anticuerpo .Anti-EGFR C225v6: Cadena ligera
Cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagct ttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaa cggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgc tttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgcggaaagcgaag atattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcac caaactggaactgaaacgcacggtggctgcaccatctgtcttcaticttcccgccatctgat gagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagag aggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaaccgggtaactcccaggagagrgt cacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgc ccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEG ID NO: 267)
QI LLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASGSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
f s g s g s g t d f t l s i n s v e s e d i a d y y c q q n n n w p t t f g a g t k ê l k r t v a a p s v f i f p p s d EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEODSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHXVYACE'/THQCLSSPVTKSFNRCEC (SEQ ID NO: 268>
Anticuerpo activable anti-EGFR 3954-1204-C225v5: Cadena Ligera:
[Espaciador (SEQ ID NO: 283)][Máscara (SEQ ID NO: 284) VEnlazador 1 (SEQ ID NO: 285)][1204 Sustrato (SEQ ID NO: 286)j [XADNer 2 (SEQ ID NO: 287)][C225v5 cadena ligera (SEQ ID NO: 255)j
'caaggccagtctggccagl(tqcatctcacctcgtgqttqtccggacqqcccatacgtca tqtacqqctcgaqcqqcqccaqcqgtgqcCccggtqqatccggcl ctqaqeqqccqttcc
qataatcatl .qgcaqt&qcqgtacc)[cagatcttactgacccagagcccggtgattctg agcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagageat;tggcacca acattcattggtaucagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgag cgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagoggcagcggcaccgattttacc ctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatat.tgcggattattaLtgccagc¿gaacasca actggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcacc atctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt.gaaatctggaact.gcctctgttgtg tgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacaccc tocaaccgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggácágcacctacag cctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgc gaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt.gtt
ag) (SEQ ID NO: 269)
[Espaciador (SEQ ID NO: 46) ][Máscara (SEQ ID NO: 77) ][Enlazador 1 (SEQ ID NO: 288)1 [1204;Sustrato (SEQ ID NO: 26) ] [Xiafcer .2 (SEQ ID NO: 289)][C225v5 (SEQ ID NO: 256)]
.QGQSGQ.[CISPRGCPDGPYVMY][ GSSGGSGGSGCSG] [LSGRSDNH)[GSSGT] [QIL
LTQS PVILSVS PGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGS PRLLIKYASESISGIPSRFSG SGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC0QNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAP3VFIFPPSDEQL KSGTASVVCELNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*] (SEQ ID NO: 270)
Anticuerpo multiespecífico anti-EGFR C225v5 - Anti—CD3 OKT3: Cadena pesada
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTA CCTGCACCGTGAGCGGCTTTACCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCC GGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACC CCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACACCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAA TGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTA TGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC1-CTACTCC CTCAGCAGCGTGOTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC/vACTGoTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGG7G7ACACCCTGCCCCCA7CCCGGGATGAACTGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGC1TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC1-CCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC77CTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGC-GTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGG7GGTGGAGG ATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCA AGCGTTAAAA7GAGCTGTAAAGCAAGCGGTTA7ACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGG TTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGA'TTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTA TACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGC ACCGCCTATA7GCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCAC GCTATTATGA7GATCACTATTGCCTGGATTAT7GGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAG CAGCGGTGGTGG7GG7AGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGA7TGTTCTG ACCCAGAGTCCGGCAATTA7GAGCGCAAGTCCGGG7GAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCG CCAGCAGCAGCGT7AGCTA7ATGAATTGGTA7CAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACG TTGGATTTA7GATACCAGCAAACTGGCAAGCGG7GTTCCGGCACATTTTCG7GGTAGCGGT ACCGCCACC7CA7ATACCCTGACCAT7ACCGGTA7GCAACCAGAAGATCCAGCAACCTATT ATTCTCAGCAGTGG7CAACCAATCCG7T7ACC7T7GGTAG7GGCACCAAAC7GGAAATTAA TCGT {SEQ ID NO: 271)
QVQLKQSGPGLVQPSCSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSL0SQD7AIYYCARAL7YYDYEFAYKG0GTLVTVSAAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVíNGGALTSGVHTFPAVLCiSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAFELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPF.EECYNSTYPA'V SVLTVLHQDKLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKHQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWE3NCQPENNYK7TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK5RWCCGNVFSC SVMHEALHNHY7CK5LSLSPGKGGGSGGGG2GSGGGSGGGGSGGGQVQL0QSGAELARPGA SVKí4SCXASGY7ETRYTMHWV:«3RPG0GLEWIGYIN?SRGYTNYN0KFKDKA7LTTDKSSS TAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVL
T0SPAIMSASP'GEKV7MTCSASSSVSYMNWYQCKSGTSPKRWIYDTSKLA5GVPAHFRGSG SGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SSQ ID NO: 272)
Anticuerpo multiespecífico anti-EGFR C225v5 ~ Anti-CD3 OKT3: Cadena Ligera CAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCT TTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCCCACCAA CGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGC TTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAC-ATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCAC CAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA'TCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC7GAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGA6GTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGC GGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGT7AAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATA CCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGAT TGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCA ACCCTGACCACCCATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAG AGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTG GGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCA GGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGG GTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAC-GTATATGAATTGGTATCA GCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGT GTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTA TGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTT TGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 273) QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWY0CRTNGSPRLLIKYASE3ISGIPSR FSGSGSGTDFTLSINSVESEDlADYYCQQNNÍAÍpriTGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQKKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY5LSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVCLQQS GAELARPGAS VKHSCKASG YT FTRYTMRVí\'KORPGQGLEW 1G YINPSRGYTNYNGKFKDKA TLTTDKSSSTAYMCLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYKGOG'iTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQlVLTQSPAiMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQOXSGTSPKKWIYDTSKLASG VPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQ0WS5NPFTFGSGTKLSINP. (SEO ID
NO: 274)
Anticuerpo activable multiespecífico Anti-EGFR - anti-CD3 3954-1204-C225v5-OKT3: Cadena ligera CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGT ACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTCTGAGCGGCCGTrCCGATAA TCATGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGC CCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATT GGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCC7GCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCAT TAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCC7GAGCATT AACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTAT7ATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGA CCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC7GGAACTGCCTCTGTTGTG7GCCTGCTG AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG7GGAAGGTGGATAACGCCC7CCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGC7GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC7GCGAAGTCACC CATCAGCGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGAT CTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCA GGT-TCACCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGGGTTAAAATGAGC TGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGG GTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAAC7ACAACCA GAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGA7AAAAGCAGCAGCACCGCC7ATATGCAG CTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATC ACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGG TAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCA ATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAG7TACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTA GCTATATGAATTCGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATAC CAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTn'CGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATAT AGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGT CAAGCAATCCGTTTACCTTTGCTAGTGGCACCAAACTGCAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 275) QGQSGQCISPRGCPDGPYV’MYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVS PGERVSFSCRASQSIÜTNIHWYQQRTNGSPRLL1KYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTF GAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQL.KSG7ASWCL1» NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK.HKVYACEVT h q g l s s p v t k s f n r g e c g g g s g g g g s g s g g g s g g g g s g g g q v q l q q s g a e l a r p g a s v k m s CKASGYTFTRYTMHKVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQ LSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYKGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPA IMSASPGEKV7MTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRKIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSY S I.T ISGMEAR DAAT Y Y CQQWS SN PFTFGSGTK J,E INR (SEQ ID NO: 276)
Anticuerpo multiespecífico anti-EGFR C225v5—ADti--CTLA-4: cadena pesada CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTA CCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCC GGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGAT7ATAACACC CCGTTTACCAGCCGCC7GAGCATTAACAAAGA7AACAGCAAAAGCCAGG7G777TTTAAAA TGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTA TGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACC AAGGCCCCATCGCTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTCACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC7CAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGC7GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA7CTGCAACG TCAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG7GGACAAGAAAGTTGAGCCCAAA7C77GTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCC'TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA7GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTCAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGG7GTACACCCTGCCCCCA7CCCGGGATGAACTGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGG7CAAAGGCTTCTA7CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGI'GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCA7GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAAGGAGGTGGA7CTGGAGGTGGCGG7TCAGGCTCTGGCGGAGGC7CAGGTGGTGGAGG ATCAGGCGGAGGTGAAATTG7GTTGACACAGTCTCCAGGCACCC7G7C7TTG7CTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGl’GTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGT ACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCC7GAAGATTTTGCAGTG7AT7ACTG7CAGCAGTA7GG7AGC7CACCGCTCA CTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGn'CCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTA TAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGG GGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCT TTAGCAGCTA7GCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTC AGCTATTAGTGGTAG7GGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCAGAGACAAT7CCAAGAACACGC7G7A7C7GCAAATGAACAGCC7GAGAGCCGAGG ACACGGCCGTA7ATTACTGTGCGACAAACTCCC7TTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCG TGGCACCCTGG7CAC7GTCTCTTCAGCTAGC (SEO ID NO: 277)
QVQLKQSGPGI.VQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHKVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLCSQD7AIYYCARALTYYDYEFAYVG0GTLVTVSAAST KGPSVFFLAPSSKZTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFFAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAF'ELLGGPSVFL. FPPKPKPTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYP.Vn/ SVLTVLHQDWLNCKEYKCKVSNKALPAPISKTISKAKGQPREPQVY7LPPSRDEL7KKQVS L.TCLVKGFYPSDIAVEWESNGCPENNYK77PPVLDSDGSFF1.YSKL7VDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHY7CKSLSLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGG3IVL7QSPGTLSLSPG EPATLSCRASQSVSSEYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDP.FSGSGSGTDFTLTIS RLEPEDFAVYYCCQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTI73YNVYY7KLSSSG7CVQLVQTG GGWQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSKVROAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLCMNSLRAEDTAVYYCA7NSLYWYFDLWGRGTLV7VSSAS (SEC ID NO: 276)
Anticuerpo multiespecífico anti-EGFR C225v5~Anti~CTLA-4: Cadena ligera:
CAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGl'GAGCT TTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCAT7GGCACCAACAT7CA7TGGTA7CAGCAGCGCACCAA CGGCAGCCCGCGCCrGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGC TTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGA777TACCC7GAGCATTAACAGCG7GGAAAGCGAAG ATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCAC CAAACTGGAAC7GAAACG7ACGGTGGC7GCACCATC7GTC77CA7C77CCCGCCATC7GAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGYGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC7ACAGCCTCAGCAGCACCC7GACGC7GAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATC'IGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTCT CCAGGCACCC7GTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGA GTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCT CATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCA7CCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT GGGACAGACTTCACTC7CACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAG7GTATTACT GTCAGCAGTA7GG7AGCTCAC CGCTCAC777CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA CG TTCCGGAGGG7CGACCATAACTTCGTATAATG7ATACTATACGAAGTTATCC7CGAGCGGT ACCCAGG7GCAGC7GG7GCAGACTGGGGGAGGCG7GGTCCAGCC7GGGAGG7CCCTGAGAC TCTCCTG7GCAGCCTC7GGA7CCACC777AGCAGC7A7GCCATGAGC7GGGTCCGCCAGGC TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGCCCGGTTCACCATCTCCAGACACAA'TTCCAAGAACACGCTGTATC TGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAGTGTGCGACAAACTCCCT TTACTGGTACTTCCATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC
<SSQ ID NO: 279)
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD EOLKSGTASWCLLNNFYPREAXV&WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSX/SSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQS PGTLSLSPGERATL5CRASQSVSSSYLAWYQOKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOaYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSG TQVQLVQTGGGWQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAM5WVRQAPGKGL5WVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYKYFDLKGRGTLVTVSSAS
(SEQ ID NO: 280)
Anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR - Anti-CTLA-43954-1204 -C225v5-CTLA-4: Cadena ligera
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCArCTCACCTCGTGGl’TGTCCGGACGGCCCA'IACGTCATGT ACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAA TCATGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGC CCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATT GGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCAT TAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATT
7vACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTA??ATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGA CCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCA7CTGTCTT CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCICTGTTGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG7GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACC CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC77CAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGAT CTGGAGGTGGCGGT7CAGGCTCTGGCGGAGGC7CAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGA AATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCiTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTC
TCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGC7ACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTG GCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAG
GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAA GATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGA CCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATAC GAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAG CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAG TGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAAT TCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATT ACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCAC TGTCTCTTCAGCTAGC <SEQ ID NO: 281)
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVS PGERVSFSCRASOSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI
NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATL SCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPE DFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGWQ PGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAED7AVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEQ ID NO:
282)
EJEMPLO 1: Preparación de anticuerpos multiespecíficos
Este Ejemplo demuestra la construcción, expresión y purificación de anticuerpos multiespecíficos anti-Jagged - CD3, anti-Jagged - CTLA-4, anti-EGFR - CD3 y anti-EGFR - CTLA-4.
Los vectores se utilizaron para expresar la cadena pesada anti-Jagged (4D11v2), la cadena ligera 5342-1204-4D11v2, la cadena pesada anti-EGFR C225v5, y las secuencias de cadena ligera 3954-1204- C225v5 que se muestran anteriormente. Dichos vectores se describen en las solicitudes pendientes de tramitación WO2013/163631, depositada el 26 de abril de 2013 (titulada “Activatable Antibodies That Bind Epidermal Growth Factor Receptor And Methods Of Use Thereof') y WO2013/192550, depositada el 21 de junio de 2013 (titulada Anti-Jagged Antibodies, Activatable Anti-Jagged Antibodies and Methods of Use Thereof').
Los vectores se digirieron con las enzimas de restricción Nhel y Notl y el fragmento de vector aislado por electroforesis en gel. Los reactivos se prepararon de la siguiente manera: Fragmento CH2CH3 de IgG humana se amplificó en la reacción 1, a partir de Pop Hygro 4D11v2 usando cebador HCForNhe (Tabla 8, SEQ ID NO: 3) y cebador HCRevOL (Tabla 8, SEQ ID NO: 4), se amplificó CTLA-4 scFv en la reacción 2, a partir del ADNc de CTlA-4 scFv (SEQ ID NO: 229) usando cebador CTRevNot (Tabla 8, SEQ ID NO: 1) y cebador CTForOL (Tabla 8, SEQ ID NO: 2), se amplificó OkT3 scFv en la reacción 3, a partir del ADNc de OKT3 scFv (SEQ ID NO: 231) usando el cebador OKRevNot (Tabla 8, SEQ ID NO: 5) y cebador CTForOL (Tabla 8, SEQ ID NO: 2). Se prepararon fusiones de scFv de IgG humana, CH2CH3/CTLA-4 combinando 10 % de la reacción 1, 10 % de la reacción 2, y amplificando con cebadores, HCForNhe y CTRevNot.
Tabla 8. Secuencia del cebador
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
Después de la amplificación, el ADN resultante se digirió con las enzimas de restricción Nhel y Notl y el ADN de fusión CH2CH3/CTLA-4 scFv aislado por electroforesis en gel. Se prepararon fusiones de scFv de IgG humana, CH2CH3/OKT3 combinando 10 % de la reacción 1, 10 % de la reacción 3, y amplificando con cebadores, HCForNhe y CTRevNot. Después de la amplificación, el ADN resultante se digirió con enzimas de restricción Nhel y Notl y el ADN de fusión CH2CH3/CTLA-4 scFv aislado por electroforesis en gel.
Para insertar los fragmentos CH2CH3/scFv en los vectores de expresión, las siguientes combinaciones mostradas en la Tabla 9 se ligaron durante la noche con T4 ADN Ligasa (Invitrogen Inc., Carlsbad. CA). Después de la ligadura, el ADN se transformó en cepa E. coil MC106 y seleccionado para resistencia a la ampicilina. La secuenciación de ADN identificó clones que contenían insertos de ADN que codificaban los anticuerpos multiespecíficos correctos o anticuerpos activables multiespecíficos, y el ADN se preparó para la transfección de célula de mamífero.
Tabla 9: Reacciones de ligadura
Figure imgf000093_0002
EJEMPLO 2: Producción de anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos activables multiespecíficos
Las IgG completamente humanas se expresaron a partir de células HEK-293 transfectadas transitoriamente. La cotransfección con vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera distintos, mostrados en la Tabla 10, permitió la expresión de anticuerpos activables multiespecíficos.
Tabla 10
Figure imgf000094_0001
anticuerpos multiespecíficos y los anticuerpos activables multiespecíficos expresados en los células HEK-293 se purificaron mediante cromatografía de proteína A.
Ensayos de unión: Como se muestra en la figura 11, los experimentos de unión a ELISA revelaron que los anticuerpos multiespecíficos CTLA-4 anti-Jagged y OKT3 anti-Jagged y anticuerpos activables multiespecíficos unidos a Jagged 1 humano, y anticuerpos multiespecíficos anti-EGFR-CTLA-4 y anti-EGFR-OKT3 y anticuerpos activables multiespecíficos se unen específicamente a EGFR humano.
Jagged 1 -Fc humano (R&D Systems; C en # 1277-JG-050) y EGFR humana (R&D Systems, Cat # 344-ER-050) se adsorbieron a diferentes pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos. Se aplicaron anticuerpos anti-CTLA y anti-OKT3 anti-EGFR-CTLA o anti-EGFR -OKT3 purificados a la placa y se dejó que se unieran. El anticuerpo unido se visualizó con un conjugado IgG-HRP antihumano (Fab specific, Sigma, St Louis, MO; Cat v A0293-1ML) y se desarrolló con el sustrato cromogénico TMB.
Como se muestra en las Figuras 12A e 12B, los experimentos de unión a ELISA revelaron que el anti-CTLA-4 Jagged y anti-EGFR-CTLA-4 se unen específicamente tanto a CTLA-4 humano como de ratón (el anticuerpo anti CTLA-4 humano A-4 reacciona de forma cruzada con CTLA-4 humano y de ratón): Ya sea CTLA-4 humano (R&D Systems; Car # 325-CT-200/CF o CTLA-4 de ratón (R&D Systems, Cat # 434-CT-20D/CF) se adsorbieron a los pocillos de placas separadas de ELISA de 96 pocillos. Anticuerpo activable anti-Jagged 4D11v2-CTLA-4 purificado, el anticuerpo activable antiJagged 5342-11v2-CTLA-4, anti-EGFR C225v5-CTLA-4 o el anticuerpo activable 3954-1204-C225v5 CTLA-4 se aplicaron a la placa y se dejaron unir. Anticuerpo de unión se visualizó con un conjugado anti-IgG-HRP humano (específico de Fab. Sigma, St Louis, MO; Cat # A0293-1ML) y se desarrolló con el sustrato cromogénico TMB. La especificidad de la unión se demostró mediante la incapacidad de las fusiones de anticuerpo-OKT3, específicas para CD3e h u m a n o , para unirse.
EJEMPLO 3: Unión de OKT3 a CD3e
Como se muestra en la Fig. 13, los experimentos de unión a ELISA revelaron que el anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR 3954-1204-C225v5-OKT3 y el anticuerpo activable multiespecífico anti-Jagged 5342-1204-4D11v2 OKT3 se unen específicamente al CD3e humano. Se adsorbió CD3e humano (NovoProtein, Cat# C578) a los pocillos de una placa de ELISA de 96 pocillos. Se aplicó el anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR purificado 3954-1204-C22Sv5-CTLA-4, anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR 3954-1204-C225v5-OKT3, anticuerpo activable multiespecífico anti-Jagged 5342-1204-4D11v2- CTLA-4, o anticuerpo activable multiespecífico anti-Jagged 5342-1204-4D11v2-OKT3 en la placa y se permitió que se unieran. El anticuerpo unido se visualizó con un conjugado anti-IgG-HRP humano (Fab específico, Sigma, Si Louis, MO: Cat # A0293-1ML) y desarrollado con el sustrato cromogénico TMB.
EJEMPLO 4: Activación de profeasa de anticuerpos activables multiespecíficos.
Activación
Los anticuerpos multiespecíficos y los anticuerpos activables multiespecíficos se diluyeron en PBS hasta una concentración final de 0,8 mg/ml. UPA humana recombinante (R&D Systems. Catálogo 1310-SE) se agregó a una concentración final de 700 nM y se incubó a 37 °C durante -20 h. Se retiraron las alícuotas de digestión y se prepararon para análisis SDS-PAGE, como se describe a continuación, y se diluyeron a 100 nM en PBS; Tween 20 al 0,05 % y albúmina de exfoliación bovina de 10 mg/mL para el análisis en ensayos de ELISA de unión.
Para PAGE, las muestras se desnaturalizaron a 70 °C durante 10 minutos en 1 x tampón de muestra LDS y se agregó TCEP a una concentración final de 40 mM antes de la electroforesis. Se cargaron seis |jg de anticuerpo en un gel NuPAGE Bis-Tris al 10 % (Invitrogen) y las proteínas se separaron por tamaño usando el tampón de electroforesis MOPS. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con azul de Coomassie y los resultados se muestran en la Figura 14. El cambio en la movilidad de las cadenas ligeras del anticuerpo activable anti-EGFR 3954-1204- C225v5, anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR 3954-1204-C225v5-CTLA-4, el anticuerpo activable anti-Jagged 5342-1204-4D11v2. y el anticuerpo activable anti-Jagged multiespecífico 5342-1204-4D11v2-CTLA-4, en presencia de uPA, demuestran la activación proteolítica de los anticuerpos activables multiespecíficos. La falta de cualesquiera cambios en la movilidad de las fusiones de cadena pesada demuestra la resistencia a la escisión de proteasa.
Ensayos de Unión
El panel A de la Figura 15 muestra que el anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR 3954-1204-C225v5-CTLA-4 se unió a EGFR, mediante ELISA, con menor afinidad (Kd = 12,8 nM) en comparación con C225v5 (3 nM) o con C225v5- CTLA-4 (0,33 nM). Sin embargo, una vez activado por uPA. anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR 3954-1204-C225v5 CTLA-4 se unió a EGFR con afinidad similar (0,45 nM) en comparación con C225v5 (0,21 nM) y C225v5-CTLA4 (0,33 nM). Es importante destacar que uPA no escindió el anti-CTLA4 scFv fusionado al extremo carboxilo de la cadena pesada: Como se ilustra en el panel B de la Figura 15, un tratamiento con uPA no tuvo ningún efecto de unión al CTLA4 humano.
De manera similar, el anticuerpo activable multiespecífico anti-Jagged 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 se unió a Jagged 1. humano por ELISA, con menor afinidad (15 nM) en comparación con 4D11v2 (0,44 nM) o 4D11v2-CTLA4 (0,77 nM). Una vez activado, el anticuerpo activable multiespecífico anti-Jagged 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 se unió a Jagged 1 humano con afinidad similar a 4D11v2 (0,54 nM) y 4D11v2-CTLA4 (0,92 nM) (Figura 15, panel C). El tratamiento uPA no tuvo efecto sobre la unión a CTLA4 (Figura 15, panel D). Las mediciones de unión a ELISA se realizaron de la siguiente manera. Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; Cat #1277-JG-050), EGFR humano (R&D Systems; Cat# 344-ER-050) o CTLA4 humano (R&D Systems; Cat#325-CT-200/CF) se adsorbieron en pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos. Se aplicaron diluciones triples, a partir de 100 nM, de anticuerpos no tratados y tratados con uPA, anticuerpos multiespecíficos o anticuerpos activables multiespecíficos a la placa y se dejaron asociar con el antígeno unido a la placa durante 1 hora. Después de la unión, el anticuerpo unido se visualizó con un conjugado anti-IgG-HRP humano (Fab específico, Sigma. St Louis, MO; Cat # A0293-1ML) y desarrollado con el sustrato cromogénico TMB.
EJEMPLO 5: Secuencias de anticuerpos multiespecíficos y de anticuerpos activables multiespecíficos adicionales
Este Ejemplo proporciona las secuencias de anticuerpos multiespecíficos adicionales y anticuerpos activables multiespecíficos adicionales.
Anticuerpo OKT3m scFv
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS OVQLQOSGAEuARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKCRPGOSLSVflGYIMPSP.GYTKYN
QKETCDKATLTTDKSSSTAYÍWLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYKGQGTTLTVSSGGG
GSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNKYQQKSGTSPKRWIYD
TSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWS3NPFTFGSGTKLEINR
(SEO ID NO: 306)
S E C U E N C IA DE N U C L E Ó T ID O S
CAGGTTCAGC7GCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGG7GCAAGCG7TAAAATGA GCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGT7AAACAGCGTCC GGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAA7CCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAAC CAGAAATTCAAAGATAAAGCAACGCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGC AGCTGAGCAGCC7GACCTCAGAGGATAGCGCAG7T7ATTACTGTGCACGC7A77ATGATGA TCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCG77AGCAGCGGTGGTGGT GGTAGTGG7GGCGG7GGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATT6T7C7GACCCAGAGTCCGG CAATTATGAGCGCAAG7CCGGGTGAAAAAGT7ACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGT TAGCTATA7GAA77GG7A7CAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACG7TGGA7TTATGAT ACCAGCAAAC7GGCAAGCGGTG7TCCGGCACA77T7CGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCAT A7AGCCTGACCA77AGCGGTA7GGAAGCAGAAGA7GCAGCAACC7A7TAT7G7CAGCAGTG G7CAAGCAA7CCG7T7ACC777GGTAG7GGCACCAAACTGGAAA77AATCG7 (SEQ ID NO: 307)
Anticuerpo OKT3m scFv Lv
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQCKSGTSPKRKIYDTSKL.ASGVPAHF RGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQKSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 308)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
CAGATTGT7C7GACCCAGAG7CCGGCAAT7A7GAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCA TGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGC7A7A7GAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCAC CAGCCCGAAACG7TGGATT7ATGATACCAGCAAAC7GGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTT CGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCC7GACCATTAGCGGTA7GGAAGCAGAAGATG
CAGCAACCTAT7A7TGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCT7TGGTAG7GGCACCAA ACTGCAAA77AA7CG7 <SEQ ID NO: 309)
Anticuerpo OKT3m scFv Hv
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QVQI.QQSGAEI.ARPGASVKMSCKASGY7FTPYTMHWVKQRPGQGI.ENIGYINPSRGYTHYN QKFKDKATI.T7DKSSSTAYMQESSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYKGQGTTLTVSS (SEQ TO NO: 310)
S E C U E N C IA DE N U C I.E Ó T ID O S
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCG7TAAAATGA
GCTGTAÁAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCA1GCATTGGGTTAAACAGCGTCC
GGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAAC CAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGC AGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAG7TTATTACTGTGCACGCTATTATGATGA
TCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGC (SEQ 10
NO: 31 i)
Anticuerpo OKT3m scFv con enlazador largo para permitir que la unión al extremo C de la cadena pesada (HC) o la cadena ligera (LC) de un anticuerpo o anticuerpo activable para producir un anticuerpo multiespecífico o un anticuerpo activable, respectivamente
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAEIARPGASVKKSCKASGYTFTRYTMHWVK QRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLT7DKSSSTAYKQLSSLTSEDSAVYYCARY
YDDHYSI.DYKGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVl,TOSPATMSA$PGEKVTMTCSAS
SSVSYMKWYQQKSGTSPKRWIYDTSKliASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMFAEnAATYYC
QQWSSNPFTFGSGTKLE1NR* (SEO ID NO: 290)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
GGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAG GCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGG7GCAAGCGT
t a a a a t g a g c t g t a a a g c a a g c g g t t a t a c c t t t a c c c g t t a t a c c a t g c a t t g g g t t a a a
CAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGT7ATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCA
ACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGC CTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTAT TATGATGATCACTATACCCTGGATTATTGGCGTCAGCCCACCACCCTGACCC77AGCACCG
GTGGTGGTGGTAGTGGTGCCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGT7CTGACCCA
GAGTCCGGCAAT7ATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCA7GACCTGTAGCGCCAGC
AGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCAGCAGCCCGAAACGTTGGA TTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGG7GT7CCGGCACATTTTCG7GGTAGCGGTAGCGG
CACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACC7ATTATTGT
CAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACC77TGGTAGTGGCACCAAACTGGAAA7TAATCGTT
GA (SEQ ID NC: 291)
Anticuerpo OKT3m scFv con enlazador corto para permitir la unión al extremo N de la HC de un anticuerpo o anticuerpo activable para producir un anticuerpo multiespecífico o anticuerpo activable respectivamente
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QVGLQQSGAEIARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKGRPGOGLEKIGYINPSRGYTNYN QKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAP.YYDDHYSEDYKGQGTTLTVSSGGG
GSGGGGSGGGG5QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSV5YMNWYQQKSGTSPKRWIYD
TSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQOWSSNPFTFGSGTKLEINP.GGG
GS (SEQ ID NO: 292)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACCTCCGGGTGCAAGCGT'TAAAATGA GCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCC GGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTA.TATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAAC CAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGC AGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGA TCACTATAGCC'rGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGT GGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGG CAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTG'J’AGCGCCAGCAGCAGCGT TAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGArTTATGAT ACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCAT ATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTG7CAGCAGTG GTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTGGAGGTGGT GGATCC (SEQ ID NO: 293)
Anticuerpo multiespecífico de cadena pesada C225v5-OKT3m-H-N (anticuerpo OKT3m unido al extremo N del anticuerpo C225v5 HC)
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHKVKQRPGQCEEKIGYINPSRGYTNYN QKnCDKATLTTDKSSSTAYMQI£SLTSEDSA\^CARYYDDHYSLDYKGQGT?LTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYD TSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCCCWSSNPFTFGSGTKLEINRGGG GSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEKLGVIWSGGNTDY NTPFTSRI^INKCNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYSFAYKGCGTLVTVSAA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALYSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSV'/TVPSSSLGTOTYICNVNHKPoNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTliMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREECYNSTYR WSVLTVLMQüWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK?1SKAKG</PHEPQViTEPP3REEMTKN0 VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVIiDSDGSFPLYSKLTVDKSRWQQGHVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 294)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
c a g g t t c a g c t g c a g c a g a g c g g t g c a g a a c t g g c a c g t c c g g g t g c a a g c g?7a a a a t g a GCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCC GGGTCAGGG7CTGGAATGGA77GGTTA7ATCAA7CCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAAC CAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGC AGCTGAGCAGCC7GACCTCAGAGGATAGCGCAG7TTATTACTGTGCACGCTATTATGATGA TCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGT GGTAGTGGTGGCGGTGG77CAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGT7CTGACCCAGA6TCCGG CAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGT7ACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGT TAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAA.CGTTGGA7TTATGAT ACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCAT ATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTG GTCAA3CAA7CCGTTTACC7TTGGTAG7GGCACCAAAC7GGAAATTAATCG7GGAGGTGGT GGATCCCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGA GCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCA GAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTAT AACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTT TTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGAC CTATTATGATTATCAAT7TGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT0AGCGCGGCT AGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC7GGGGGCA CAGCGGCCC7GGGCTGCC7GGTCAAGGAC7ACT'?CCCCGAACCGGTGACGGTG7CGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC7GTCC7ACAGTCCTCAGGACTG TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG7GGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACC7GCCTGGTCAAAGGCT7CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG7GGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAACAGCAGGTGGCAGCAGGCGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT
C7CCGGGTAAATGA (SEO ID NO: 295)
Anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-C de cadena pesada (anticuerpo OKT3m unido al extremo C del anticuerpo C225v5 HC)
SECUENCIADE AMINOÁCIDOS
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRCSPGKGL5KLGVIWSGGNTDYNT PrrSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYF.FAYKGQGTL.VTVSAAST KGPSVFPIAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAI/TSGVHTFPAVLQSSGLYS L5SWTVPSS3LGTQTYICNVNHKPSNTXVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPXPXDTIjMISRTPEVTCWVDVSHEDPSVKFNWYVDGVEVHNAKTK pp.ee q y n st y p .w SVLTVLHGWr.NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGGPREPQVYTLPPSP.EEMTKNOVS LTCLVXGFYPSDIAVF.WESNGQPENNYKTTPPV:.DSDGSFFLYSKLTVDXSPWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSI-SLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELAPPGA SVXMSCXASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGISWIGYINPSRGYTNYNQXFKDKATLTTDKSSS TAYMGI.SSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVIi
TQSPAIMSASPCEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAfIFRGSG SCTSYSLTISCMEAEDAATYYCQCWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEO ID NC: 296)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGACCCAGAGCCTGAGCATTA CCTGCACCGTCAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGG7GCGCCAGAGCCC GGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGAT7ATAACACC CCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGT77TTTAAAA TGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTA TGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA7CTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT7GTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGCTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC-CCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG7GGCAGCAGGGGAACGTC77CTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC7GTCTCCGG GTAAAGGAGG7GGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGG ATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCA AGCGTTAAAA7GAGC7GTAAAGCAAGCGG77A7ACCTTTACCCGTTATACCA7GCATTGGG TTAAACAGCG7CCGGGTCAGGGTCTGGAATGGA77GGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTA TACCAACTACAACCAGAAA7TCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGC ACCGCCTATA7GCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCAC GCTATTA7GATGA7CACTA7AGCCTGGAT7AT7GGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAG CAGCGGTGGTGGTGG7AGTGGTGGCGGTGG77CAGGC6GTGGCGGTAGCCAGA7TGTTCTG ACCCAGAGTCCCGCAA7TATGAGCGCAAG7CCGGG7GAAAAAGTTACCA7GACCTGTAGCG CCACCACCACCGT7AGCTATATCAATTGG7ATCACCACAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACC T7GCATT7ATGA7ACCAGCAAACTGGCAAGCGG7G7TCCGGCACAT777CGTGGTAGCGGT AGCGGCACCTCA7ATAGCCTGACCATTAGCGGTA7GGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATT A7TGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTT7ACCT77GGTAGTGGCACCAAAC7GGAAATTAA
TCGTTGA (SEO ID NO: 297)
Anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-L-C de cadena ligera (anticuerpo OKT3m unido al extremo C del anticuerpo C225v5 LC)
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
DILLTQSPVIL5VSPCERVSFSCRASQSIGTNIHWYQCRTNGSPRLLIKYASE5ISGIPSR FSGSGSG7DFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAFSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKflKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLOOS GAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGY2NPSR6YTNYNQKFKDKA TLTTüKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYBTSKLASG VPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLBINR* (SEQ ID
NO: 298)
S E C U E N C IA DE N U C L E Ó T ID O S
GACATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTC7GAGCGTGAGCCr;GGGCGAACG?GTGAGCT TTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAA CGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGC TTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAG ATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCAC CAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA7CCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC7GAGCTCGC CCGTCACAAAGAGC7TCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGC GGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCG7TAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATA CCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGAT TCGTTATATCAA7CCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAACCA ACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCC7GACCTCAG AGGATACCGCAC7TTATTACTGTGCACGCTA7TA7GATGATCACTA7AGCCTGGATTATTG GGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGG7GGCGGTGGTTCA GGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGG GTGAAAAAGT7ACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCA GCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGT7GGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGT GTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTA TGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTA7TGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTT TGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG (SEQ ID NO: 299)
Anticuerpo multiespecífico C225v5(N297Q)-OKT3m-H-N de cadena pesada SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QV0LQQSGAE!,ARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKGRPGQGLEWíGYINP5RGYTNYN QKFKDKATUTTDKSSSTAYMQESSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYKGQGT7LTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSVSYy.NWYQQKSGTSPKRWIYD TSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSI.TISGMEAEDAATYYCGQKSSNPFTFGSGTKLEINFGGG GSQVQLKQSGPGLVOPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWP.QSPGKGLEWLGVrWSG-GNTDY NTPFTSRLSINKDNSKSGVFFKMNSLQSQDTAIYYCAPALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGI. YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEILGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEvKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEGYQSTYR WSVLTVLHQDVfLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSFEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT7PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 300)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
CAGGTTCAGC7GCAGCAGAGCGG7GCAGAAC7GGCACG7CCGGG7GCAAGCGT7AAAATGA GCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTA7ACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCC GGGTCAGGGTC7GGAA7GGA7TGGTTA7A7CAA7>7CGAGCCGTGGTTATACCAACTACAAC CAGAAAT7CAAAGA7AAAGCAACCC7GACCACCGA7AAAAGCAGCAGCACCGCC7A7ATGC AGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTAT7ATGATGA 7CACTATAGCC7GGA77ATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGT CAATTATGAGCGCAAG7CCGCG7CAAAAAG7TACCATCACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGT 7AGCTATA7GAA77GG7ATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACG77GGA77TATGA7 ACCAGCAAAC7CGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGG7AGCGGCACCTCAT A7AGCCTGACCA77AGCGG7ATGGAAGCAGAAGA7GCAGCAACC7A7TAT7G7CAGCAGTG G7CAAGCAA7CCGTT7ACC7TTGGTAG7GGCACCAAACTGGAAA77AATCGTGGAGGTGG7 GGATCCCAGG7GCAGC7GAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGA GCATTACC7GCACCG7GAGCGGCTTTAGCC7GACCAACTATGGCG7GCA7TGGGTGCGCCA GAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGC7GGGCGTGA7TTGGAGCGGCGGCAACACCGATTA7 AACACCCCG777ACCAGCCGCC7GAGCA77AACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTT7 TTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGA7A.CCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGAC CTATTATGA77ATGAA7T7GCCTATTGGCCCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGC7 AGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCC7GGGCTGCCTGGTCAAGGAC7ACT7CCCCGAACCGG7GACGG7GTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC1-CAGGACTC 7ACTCCC7CAGCAGCG7GG7GACCG7GCCCTCCAGCAGC77GGGCACCCAGACCTACATC7 GCAACGTGAA7CACAAGCCCACCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAAC7CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC 7TCCTCT7CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA7GA7CTCCCGGACCCCT6AGGTGACA7 GCGTGGTGG7GGACG7GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT7CAACTGG7ACGTGGACGG CGTGGAGG7GCA7AA7GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCG7 GTGGTCAGCG7CC7CACCGTCCrGCACCAGGAC7GGCTGAATGGCAAGGAG7ACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA7CTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGG7G7ACACCCTGCCCCCA7CCCGGGAGGAGA7GACCAAGAACCAG G7CAGCC7GACCTGCCTGG7CAAAGGCTTC7A7CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG6ACTCCGACGGCTC C7TCTTCCTC7ACAGCAAGC7CACCG7GGACAAGAGCAGG7GGCAG0AGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCG7GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC7CTCCCTGT C7CCGGGTAAA7GA (SEQ ID NO: 301)
Anticuerpo multiespecíficoC225v5(N297Q)-OKT3m-H-C de cadena pesada SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSL7NYGVKWVP.QSPCKGLSKLGVIWSGGNTDYN7 PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQD7AIYYCAFJU,TYYDYEFAYKGQG7LVTVSAAS7 KGPSVFFLAPSSKST3GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN5GAL.TSGVHTFFAVLQSSGLY5 LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFI, FPPKPKPTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK7KPREEQYQSTYRW SVLTVLHQDKLNGKEYKCKVSNKALPAPISKTISKAKGQPREF-QVYTLPPSREEKTKKQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFI.YSKLTVDKSRWQ9GIÍVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPCKGGGSGGGGSGSGGGSGGCGSGGGQVQLQQSGAELARPGA SVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQXFKDKA7LTTDKSSS TAYMGLSSLTSEDSAVYYCAP.YYDDHYSLDYWGCGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSOIVL TGSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRKIYDTSKIASGVPAHFRGSG SGTSYSLTISGMSAEDAATYYCQOWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEQ ID NC: 302)
SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCCGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTA CCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCC GGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACC CCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAA TGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTA TGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC7CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGC7GCC7GG7CAAGGACTAC77CCCCÜAACCGG7GACGGTG7CGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACA7GCCCACCG7GCCCAGCACCTGAACTCC7GGGGGGACCGTCAG7C7TCC7C 7TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC7CA7GA7C7CCCGGACCCC7GAGG7CACA7GCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCRCGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCC7GCACCAGGACTGGC7GAA7GGCAAGGAGTACAAG7GCAAGGTC7 CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAAGGACG7GGA7CTGGAGGTGGCGGTTCAGGC7CTGGCGGAGGCTCAGG7GGTGGAGG ATCACGCGCAGGTCAGCTTCAGCTCCAGCAGAGCGGTCCAGAACTGGCACGTCCGGGTCCA AGCGTTAAAA7GAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGG TTAAACAGCG7CCCGGTCAGCGTCTGGAATGCAT7GGTTATATCAA7CCGAGCCGTGGTTA TACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGC ACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCAC GCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGA7TATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAG CAGCGGTGGTGG7GGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGG7AGCCAGATTGTTCTG ACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCG CCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGG7ATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACG TTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGT AGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATT ATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAA TCGTTGA (SEO ID NO: 303)
Anticuerpo multiespecífico C225v5(N297Q)-OKT3m-L-C de cadena ligera SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
DILLTQSPVI1.SVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYÜQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR f s g s g s g t d f t l s i n s v e s e d i a d y y c q o n n n w p t t f g a g t k l e l k r t v a a p s v f i f p p s d EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGHSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQS GAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQP.PGQGLEWIGYINPSPGYTNYNOKFKDKA t l t t d k s s s t a y m q l s s l t s e d s a v y y c a r y y d d k y s l d y w g q g t t l t v s s g g g g s g g g g s GGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQOKSGTSPKRWIYDTSKLASG VPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEO 10 NO: 298)
SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS
g a c a t c t t g c t g a c c c a g a g c c c g g t g a t t c t g a g c g t g a g c c c g g g c g a a c g t g t g a g c t t t a g c t g c c g c g c g a g c c a g a g c a t t g g c a c c a a c a t t c a t t g g t a t c a g c a g c g c a c c a a CGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGA.AAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGC TTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAG ATATTGCGGAT7ATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCAC CAAACTGGAAC7GAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTG7TGTG7GCCTGCTGAATAACT7CTATCCCAGAG ACGCCAAAGTACAGTGCAAGGTCCATAACGCCC7CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAACGACAGCACC7ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGC7GAGCAAA GCAGACTACGACAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCA7CAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGA7CAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGC GGTGCAGAAC7GGCACGTCCGGGTGCAAGCGT7AAAA7GAGCTG7AAAGCAAGCGGTTA7A CCTTTACCCG77A7ACCATGCA7TGGG77AAACAGCG7CCGGGTCAGGGTC7GGAATGGAT TGGTTATA7CAATCCGAGCCGTGGTTATACCAAC7ACAACCAGAAAT7CAAAGATAAAGCA ACCCTGACCACCGA7AAAAGCAGCAGCACCGCC7A7ATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAG AGGATAGCGCAGT7TATTAC7GTGCACGC7ATTATGATGATCACTA7AGCC7GGATTATTG GGGTCAGGGCACCACCC7GACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCA GGCGGTGGCGG7AGCCAC-ATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTA7GAGCGCAAGTCCGG GTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAA7TGGTATCA GCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACG77GGA7TTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGT GTTCCGGCACA77TTCGTGG7AGCGG7AGCGGCACCTCATATAGCC7GACCA7TAGCGGTA TGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTCGTCAAGCAATCCGTTTACCTT TGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAA7CGTTAG (SEQ ID NO: 299)
Anticuerpo C225v5(N297Q) de cadena pesada
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QVCLKQSGPGLVQPSQSLS I7CTVSGFSL7NYGVHWVP.CS PGKGL5KLGVIWSGGN7DYNT PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGOGTLVTVSAAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFIj FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRW SVLTVLHQDKLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGCPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWeGGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 336)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
CAGCTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCC7GGTCCAGCCGAGCCAGAGCC7GAGCATTA CCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAAC7ATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCC GGGCAAAGGCC7GGAATGGCTGGGCGTGAT7TGGAGCGGCGGCAACACCGAT7ATAACACC CCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTT"TTTAAAA TCAACACCCTGCAAAGCCAGCATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTA TGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACC AAGGCCCCATCCGTCTTCCCCCTCGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCCCCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC7ACA7CTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATC77GTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC
t t c c c c c c a a a a c c c a a g g a c a c c c t c a t g a t c t c c c g g a c c c c t g a g g t c a c a t g c g t g g TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTl'CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCl'ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCrTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC7GTCTCCGG GTAAATGA (SEQ ID NO: 337)
Anticuerpo activable de cadena ligera 3954-1204-C225v5
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVS PGEP.VSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKPTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG7ASWCLI. NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL7LSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID NO: 304)
NUCEEOTIDE SEQUENCE
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGT ACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTCTGAGCGGCCGT7CCGATAA TCATGGCAGTAGCGGTACCCACATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGC CCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATT GGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCAT TAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATT AACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGA CCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC'TCTGTTGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACC CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGAT CTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCA GGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGC TGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGG GTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCA GAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAG CTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTT'i’ATTACTGTGCACGCTATTATGATGATC ACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTA6CAGCGGTGGTGGTGG TAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCA ATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTA GCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATAC CAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACA7TT7CGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATAT AGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGA7GCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGT CAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG (SEQ ID
NO: 305)
Anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, que comprende plásmido de cadena ligera 3954-1204-C225 y plásmido de cadena pesada C225v5-OKT3m-H-N.
Anticuerpo de cadena ligera C225v5
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
DILLTQSPVILiSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTIiGSPRLLIKYASESISGIPSR FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCOQNHNWPTTFGAGTKLELKF.'T/AAPSVFIFPPSD ECLKSGTAGV^/CLLNNFYPREAKVOvílO/DNALOSGNSCESVTEODSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC’- (SEQ ID NO: 314)
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
GACATCT7CCTGACCCAGAGCCCCCTGA7TCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACG7CTGAGCT
TTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAA CGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGC TTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAG ATATTGCGGATTATTATTG CCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCAC CAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTG7TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG
AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC7ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGC7GAGCAAA
GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC7GAGCTCGC
CCGTCACAAAGACCTTCAACAGGGCAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGG CTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGC GGTGCAGAAC7GGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATA
CCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGG7CTGGAATGGAT
T GGTTATATC AATCCGAGCCGTGGTTAT ACCAACTACAACCAGAAA7TCAAAGAT AAAGC A
AvCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGGAGC'TGAGCAGCCTGACCTCAG
AGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAiGCCTGGATTATTG
GGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCA GGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGG GTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAAT7GGTATCA
GCAGAAAAGGGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATrTATGATACCAGCAAACTGGGAAGCGGT
GTTCCGGCACATT7TCGTGGTAGCGG7AGCGGCACCTCATATAGCCTGACCA77AGCGGTA
TGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTA7TGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCG7TTACCTT
TGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG {SEO ID NO: 315)
La Tabla 11 muestra ejemplos de emparejamiento de secuencias de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) para producir un anticuerpo multiespecífico o un anticuerpo multiespecífico activable de la divulgación. Como se usa en esta invención cuando se hace referencia a cadenas ligeras, las cadenas ligeras de anticuerpos que comprenden C225v5 también se denominan cadenas ligeras que comprenden C225.
Tabla 11. Anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción
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Figure imgf000110_0001
vS se refiere a la versión 5 de C225.
EJEMPLO 6: Unión de anticuerpos multiespecíficos a CD3e en células T .Jurkat
Este ejemplo demuestra la capacidad de anticuerpos multiespecíficos de la descripción para unirse a células T.
Se probaron tres formatos de anticuerpos multiespecíficos: (1) C225v5-OKT3m- H-N. un anticuerpo multiespecífico en el que un scFv de OKT3m que se une a CD3e (también denominado en esta invención CD3e y CD3 en células T) se unió al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo anti-EGFR C225v5; (2) C225v5-OKT3m-H-C, un anticuerpo multiespecífico en el que un scFv de OKT3m se unió al extremo C de la cadena pesada de anti-EGFR anticuerpo C225v5; y (3) C225v5-OKT3m-L-C, un anticuerpo multiespecífico en el que un scFv de OKT3m se unió al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo anti-EGFR C225v5. Las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos multiespecíficos se proporcionan en esta invención, al igual que las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos C225v5 y OKT3. También se evaluó un control de isotipo, a saber, control de isotipo de IgGi humana, Enzo, Catálogo ALX-804-133-C100.
Para determinar si los tres formatos de anticuerpos multiespecíficos podían unirse a células T Jurkat positivas para CD3e (también denominadas en esta invención como células Jurkat y Jurkats), se realizó un ensayo de unión basado en citometría de flujo. Las células T Jurkat (clon E6-1, ATCC, TIB-l52) se cultivaron en RPMI-164o con GlutaMAX™ (Life Technologies, Catálogo 72400-120), suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (HI-FBS, Life Technologies, Catálogo 10438-026), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml (Life Technologies, Catálogo 15140-122) (también denominada en esta invención como medio completo) según las pautas de ATCC. Las células se recogieron mediante centrifugación (200xg, 4 °C, 5 min) y se volvieron a suspender en PBS con HI-FBS al 2 % (tampón FACS). Se transfirieron alrededor de 250.000 células Jurkat por pocillo a una placa de fondo en U de 96 pocillos, se recogieron y se volvieron a suspender en 50 microlitros (también denominados en esta invención pL o pl) de los anticuerpos que se analizan. La concentración inicial de los anticuerpos fue de 100 nM para los anticuerpos multiespecíficos y 166,7 nM para el control de isotipo, seguido de diluciones en serie de 5 veces para un total de 8 concentraciones para cada anticuerpo.
Las células y anticuerpos se incubaron a 4 °C con agitación durante aproximadamente 1 hora, se recogieron y se lavaron 3 veces con 200 pL de tampón FACS. Las células Jurkat resultantes se resuspendieron en 50 pl de IgG antihumana conjugada con AlexaFluor® 647 (H+L) (Jackson ImmunoResearch, Catálogo 709-606-149) y se incubaron a 4 °C con agitación durante alrededor de 30 min. Las células Jurkat resultantes se recogieron, se lavaron 3 veces con 200 pL de tampón FACS y se resuspendieron en un volumen final de 150 pL de tampón FACS con 2,5 pg/ml de 7-AAD (Bd Pharmingen, Catálogo 559925). Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo BD Accuri C6 (BD Biosciences), y la intensidad de fluorescencia media (MFI) de células viables se calculó usando FlowJo V10 (Treestar). La tinción de 7-AAD mostró que una compuerta de dispersión lateral delantera era suficiente para identificar células viables. Los valores de EC50 se calcularon en GraphPad Prism 6 ajustando los datos al log(agonista) frente a la respuesta (tres parámetros).
La Figura 16A demuestra que los tres formatos de anticuerpos multiespecíficos unen células T Jurkat con valores EC50 que varían de nM de un solo dígito a sub-nM.
EJEMPLO 7: Los anticuerpos multiespecíficos se unen a células T que expresan CD3e y EGFR humano recombinante
Este Ejemplo demuestra la capacidad de los anticuerpos multiespecíficos de la descripción para unirse a células T (también denominadas en esta invención como co-unión) y células que contienen antígenos diana.
Para determinar si el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N, C225v5- OKT3m-H-C, o C225v5-OKT3m-L-C podría unirse a las células Jurkat T positivas para CD3e y a EGFR, se realizó un ensayo de coagulación basado en citometría de flujo. Las células de Jurkat se pretrataron con una concentración de saturación de cada uno de los anticuerpos multiespecíficos seguida de titulación con EGFR biotinilado y detección con estreptavidina, conjugado de R-ficoeritrina (SAFE). También se analizó un control isotípico, a saber, IgGi humana; control isotípico, Enzo. Catálogo ALX-804-133-C100.
Las células Jurkat se cultivaron y recogieron como se describe en esta invención. Alrededor de 500.000 células Jurkat por pocillo se transfirieron a una placa de fondo en U, se recogieron y se resuspendieron en 50 pL de anticuerpo multiespecífico 40 nM o anticuerpo de isotipo 67 nM. Las células se incubaron a 4 °C con agitación durante alrededor de 1 hora, se recogieron y se lavaron 3 veces con 200 pL de tampón FACS. Las células Jurkat resultantes (que se unen a un anticuerpo multiespecífico de la descripción) se resuspendieron en 50 pl de proteína EGFR humana recombinante biotinilada (Abeam, Catálogo ab 168702) comenzando en alrededor de 290 nM seguido de diluciones en serie 5 veces para un total de 8 concentraciones. Las células se incubaron a 4 °C con agitación durante alrededor de 1 hora, se recogieron y se lavaron 3 veces con 200 pL de tampón FACS. Las células Jurkat resultantes se resuspendieron en 50 pl 10 pg/ml de estreptavidina, conjugado de R-Ficocritina (Life Technologies, S866) y se incubaron a 4 °C con agitación alrededor de 1 hora. Las células se recogieron, se lavaron una vez con 200 pL de tampón FACS y se resuspendieron en 150 pL de tampón FACS. Las muestras se analizaron en un BD Accuri C6 y MFI calculado como se describe en esta invención. Los valores de EC50 se calcularon en Graph Pad Prism 6 como se describe en esta invención.
La Figura 16B demuestra que los tres formatos de anticuerpos multiespecíficos exhibieron unión dependiente de la concentración de EGFR que requirió unión concomitante a CD3e en células T. Los valores de EC50 variaron de subnM a nM de un solo dígito.
EJEMPLO 8 Activación dependiente de la diana de células T por anticuerpos multiespecíficos
Este Ejemplo demuestra la capacidad de anticuerpos multiespecíficos de la divulgación para activar células T de una manera dependiente de la diana.
Para determinar si la unión de células T Jurkat y células diana positivas para EGFR mediante el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, o C225v5-OKT3m-L-C podría inducir la activación de células Jurkat, se empleó un ensayo basado en citometría de flujo. Las células Jurkat y las células diana marcadas con CFSE se co-cultivaron durante aproximadamente 15 h y la activación de células T se evaluó mediante tinción para la expresión superficial del marcador de activación de células T tempranas, CD69.
Células SW480 positivas para EGFR, también denominadas células SW480, (ATCC, Catálogo CCL-228) y células U266 negativas para EGFR, también denominadas células U266, (ATCC, Catálogo TIB-196) se cultivaron en RPMI-1640 con GlmaMAX™, HI-FBS al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (denominada medio completo) según las pautas de ATCC. Estas células diana se recogieron, se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en PBS a 2x10s células/ml. Un stock de CFSE de 5 mM (Life Technologies, Kit de proliferación celular CellTracc™ CFSE, Catálogo C34554) se preparó en DMSO y luego se diluyó a 30 nM en PBS. El stock de trabajo de PBS/CFSE se utilizó inmediatamente. Se combinaron volúmenes iguales de los células diana y el stock de CFSE para una concentración final de CFSE de 15 nM y una densidad celular final de 1x106 células/ml. Las células se incubaron durante 15 min a 37 °C. El etiquetado se inactivó mediante la adición de un volumen igual de HI-FBS. 'Las células diana incubadas se recogieron, se lavaron una vez con medio completo y se volvieron a suspender en medio completo a 5x105 células/ml. Se añadieron 50 pL de suspensión celular por pocillo a una placa de fondo plano de 96 pocillos para un total de 25.000 células diana por pocillo.
Células T Jurkat se cultivaron como se describe en esta invención. Las células Jurkat se recogieron, se resuspendieron en medio completo a 1 x 106 células/ml y se añadieron 50 pl de suspensión celular por pocillo a la placa de fondo plano que contenía células diana para un total de aproximadamente 50.000 células Jurkat por pocillo. La proporción de células T efectoras a células diana fue de 2:1.
Se prepararon stocks de anticuerpos concentrados tres veces en medios completos. Las concentraciones más altas utilizadas fueron 1,2 nM para cada uno de los formatos de anticuerpos multiespecíficos y 1,5 nM para OKT3 (BioLegend, Catálogo 317304), C225v5 (cuya secuencia de aminoácidos se proporciona en esta invención), y anticuerpos de control de isotipo. Se prepararon diluciones en serie de cinco veces en medios completos para un total de 8 concentraciones para cada anticuerpo. Se agregaron 50 pL de anticuerpo por pocillo a la placa de fondo plano que contenía las células T y las células diana, diluyendo todos los stocks 3 veces para una concentración inicial de 400 pM para cada uno de los formatos de anticuerpos multiespecíficos o 500 pM para cada uno de los OKT3, C225v5 y anticuerpos de isotipo.
Después de aproximadamente 15 h, las células se transfirieron a una placa con fondo en U y se recogieron. Para maximizar la recuperación, la placa de cultivo celular se lavó con 150 pL de tampón FACS y el lavado se transfirió a la placa de fondo en U. Las células se recogieron, se volvieron a suspender en anticuerpo conjugado PE anti-CD69 de 50 pL (BD Biosciences, Catálogo 555531, utilizado a la concentración recomendada por el fabricante), y teñido durante 1 h a 4 °C con agitación. Las células se lavaron una vez con 200 pl de Tampón FACS y luego se resuspendieron en un volumen final de 150 pL. Se utilizaron controles de un solo color para establecer la compensación en el BD Accuri C6. Se recogieron 10.000 células en una dispersión lateral delantera, compuerta CFSE negativa y MFI calculada usando FlowJo. Los valores de EC50 se calcularon en GraphPad Prism 6 como se describe en esta invención.
La Figura 17 demuestra que la activación de CD69 potente, evidente a partir de concentraciones sub-pM, dependía de que cada formato de anticuerpo multiespecífico se co-cultivara en presencia de células T Jurkat y células SW480 EGFR-positivas. En contraste, la activación de células T inducida por co-cultivo con células U266 negativas para EGFR fue significativamente menos eficiente, presentando valores de EC50 sub-nM y una reducción del 75 % en la inducción máxima de CD69 con respecto a la activación inducida por células positivas para EGFR. La activación independiente de EGFR de los anticuerpos multiespecíficos, como se vio cuando se usaron células U266, fue similar a la del anticuerpo OKT3, y se observó tinción de CD69 insignificante con C225v5 y anticuerpos de control isotípicos.
EJEMPLO 9: Activación dependiente de la diana de células T CD8+ primarias por anticuerpos multiespecíficos
Este Ejemplo demuestra la capacidad de anticuerpos multiespecíficos de la descripción para activar células T CD8 positivas primarias (CD8').
Para determinar si el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, o C225v5-OKT3m-L-C podría mediar la activación dependiente de EGFR de células T CD8' humanas primarias, se realizó un ensayo basado en citometría de flujo. Células T CD8' derivadas de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y células diana marcadas con DDAO-SE se co-cultivaron durante la noche, y la activación se evaluó mediante tinción para el marcador de activación temprana. CD69.
Células SW480 positivas para EGFR se cultivaron y etiquetaron como se describe en esta invención con las siguientes excepciones: (1) Células diana SW480 se marcaron con CellTrace™ FarRed DDAO-SE (Life Technologies, Catálogo C34553) y (2) medios completos se complementaron con 25 U/ml de IL-2 (R&D Systems, Catálogo 202-IL-050/CF). Se añadieron cincuenta 50 pL de suspensión de células diana (a 5x103 células/ml) por pocillo a una placa de fondo plano de 96 pocillos para un total de 25.000 células diana por pocillo.
Células T citotóxicas CD8+ de sangre periférica normal fresca (AllCells, Catálogo PB009-3) se obtuvieron de AllCells (Alameda, CA), se recogieron mediante centrifugación (200xg, RT, 15 min) y se volvieron a suspender en medios completos complementados con 25U/ml IL-2 a 1,5x 106 células/ml. Cincuenta pL de suspensión celular por pocillo se añadieron a la placa de fondo plano que contiene células diana para un total de aproximadamente 75.000 células T citotóxicas CD8+ por pocillo y una relación de 3:1 de células T a células diana.
Se prepararon stoks de anticuerpos tres veces concentradas en medios completos complementados con 25U/ml IL-2. La concentración más alta fue de 600 pM seguida de diluciones en serie de 5 veces para un total de ocho concentraciones para cada anticuerpo. Se añadieron 50 pL de anticuerpo por pocillo a la placa de fondo plano que contenía células CD8' y células diana, diluyendo todos los stocks 3 veces para una concentración inicial de 200 pM.
Después de una incubación durante la noche, la placa de fondo plano se centrifugó y se retiraron 100 pL de sobrenadante para el ensayo de citotoxicidad luminiscente descrito en esta invención. El sobrenadante restante se transfirió a una placa de fondo en U, y las células en la placa de fondo plano se separaron con tripsina al 0,25 % (Life Technologies, Catálogo 25200-056). La actividad de tripsina se inactivó mediante la adición de 3 volúmenes de Tampón FACS y la suspensión celular se transfirió a la placa de fondo en U. Después de la recogida, las células se resuspendieron en 50 pL de un cóctel de FITC anti-CD69 PE/Anti-CD8 (FITC anti-CD8, BD Biosciences, Catálogo 561948), control de isotipo FITC (BD BioSciences, Catálogo 340755). o control de isotipo PE (BD BioSciences, Catálogo 340761). Todos los anticuerpos se utilizaron a las concentraciones recomendadas por el fabricante. Las células se tiñeron durante 1 h a 4 °C con agitación, se recogieron y se resuspendieron en un volumen final de 150 pL de tampón FACS con 2,5 pg/ml de 7-AAD. Se utilizaron controles de un solo color para establecer la compensación en un Bd Accuri C6 y se recogió un volumen fijo de suspensión celular. La regulación en células CD8' fue suficiente para distinguir entre células diana y células T viables. La activación se cuantificó como el porcentaje de células T con expresión de CD69 por encima del control de isotipo de PE.
La Figura 18A demuestra que los tres formatos de anticuerpos multiespecíficos demostraron la activación dependiente de la concentración de células T CD8+ primarias con valores de pM EC50 de un solo dígito. El tratamiento con anticuerpos OKT3, C225v5 o de control de isotipo (Enzo) de IgG1 humana dio como resultado una inducción de CD69 insignificante.
EJEMPLO 10: Destrucción dependiente de diana de células diana por anticuerpos multiespecíficos
Este ejemplo demuestra la capacidad de los anticuerpos multiespecíficos de la descripción para inducir la lisis celular dependiente de diana dirigida por células T.
Para determinar si el anticuerpo multiespecífico C225v5-GKT3m-H-N, C225v5- OKT3m-H-C, o C225v5-OKT3m-L-C era capaz de inducir Iisis celular dirigida a células T, dependiente de la diana, se cocultivaron células SW480 con células T CD8+ a una relación de células efectoras a diana 3:1 como se describe en esta invención. Después de una incubación nocturna, 100 pL del sobrenadante se analizaron en placas de pared blanca de 96 pocillos (Greiner Bio One, Catálogo 655098) para determinar la actividad de proteasa distinta asociada con la citotoxicidad según el protocolo del fabricante (CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay, Catálogo G9292, Promega), que utiliza un sustrato peptídico luminogénico para medir la actividad de las proteasas liberadas por células que han perdido la integridad de la membrana y posteriormente se han sometido a citólisis. La citotoxicidad multiespecífica dependiente de anticuerpos de las células diana se expresó en luminiscencia después de la sustracción de fondo de los valores no tratados y se graficó en Prisma con análisis de ajuste de curva log(agonista) vs. respuesta (tres parámetros).
La Figura 18B demuestra que los tres formatos de anticuerpos multiespecíficos indujeron la destrucción de células SW480 mediada por por células T. Como se esperaba, el anticuerpo OKT3 solo no exhibió destrucción detectable de células SW480, lo que sugiere un requisito de co-acoplamiento de CD3 y diana tumoral para la citotoxicidad efectiva por los anticuerpos multiespecíficos.
EJEMPLO 11: Activación de células T dependientes de diana y destrucción de células diana por anticuerpos multiespecíficos
Este Ejemplo demuestra la capacidad de los anticuerpos multiespecíficos de la descripción para inducir la activación dirigida a células T, dependiente de la diana, de células T CD8- y la destrucción de células diana.
Para determinar si la activación de células T observada dependía de la expresión de EGFR por parte de la célula diana, se cocultivaron células SW480 positivas para EGFR marcadas con CFSE o células U266 negativas para EGFR con células T CD8' humanas en presencia del anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N u OKT3, cada uno en una serie de dilución de 5 veces a partir de 200 pM como se describió anteriormente. Se utilizó el marcado CFSE de las células diana (30 nM) para distinguir las células diana de las células T utilizando un procedimiento descrito en esta invención. Células T citotóxicas CD8' de sangre periférica normal congeladas (AllCells, Catálogo PB009-3F) se descongelaron según lo especificado por el fabricante. Después de una incubación durante la noche, se analizaron las células T (células negativas a CFSE) para determinar la expresión superficial del marcador de activación temprana, CD69, tal como se describe en esta invención. Brevemente, las células se retiraron de la placa de ensayo, las células adherentes se levantaron usando tripsina (Life Technologies) y las células se lavaron una vez con tampón FACS. Las células se tiñeron durante 1 hora con anti-CD69-PE (BD Bioscience). Las células se lavaron y analizaron en el BD Accuri C6 para la expresión de CD69 en la superficie celular. Los valores de MFI se calcularon como se describe en esta invención. Los resultados se expresaron como el porcentaje de células T con expresión de CD69 por encima del control de isotipo usando el software de análisis FCS Express y se graficaron en Prism con el análisis de ajuste de curva log(agonista) vs. respuesta (tres parámetros).
Como se muestra en la Figura 18C, el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N demostró una potente activación de células T a concentraciones sub-pM en presencia de células SW480 y solo una mínima activación de células T por células U266, incluso a concentraciones que eran mayores que 3 logs más altas que las concentraciones utilizadas con células SW480. El anticuerpo OKT3 exhibió una activación mínima de células T. Estos resultados demostraron que la activación efectiva de células T depende de la expresión de células diana de EGFR.
Para determinar la dependencia de la expresión de EGFR para la destrucción de células diana, se midieron l00 pl de sobrenadante del co-cultivo de células T con células SW480 o U266 para determinar la actividad de la proteasa asociada con la citotoxicidad (CytoTox-Glo, Promcga). Los resultados se expresaron en luminiscencia sin sustracción de fondo para mostrar la respuesta de U266 y se graficaron en Prisma con análisis de ajuste de curva log (agonista) vs. respuesta (tres parámetros).
La Figura 18D ilustra que el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N provoca citotoxicidad de células SW480 que expresan EGFR a concentraciones sub-pM mientras que no se detecta destrucción discernible de células U266 negativas para EGFR. El anticuerpo OKT3 tampoco mostró destrucción discernible de células SW480 o U266.
EJEMPLO 12: Capacidad de anticuerpos multiespecíficos para acoplarse a células T para destruir un panel de líneas celulares que expresan EGFR
Este Ejemplo demuestra la capacidad de los anticuerpos multiespecíficos de la descripción de acoplarse a células T para destruir un panel de líneas celulares que expresan EGFR.
Para determinar si el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N fue capaz de inducir citotoxicidad de líneas celulares adicionales que expresan EGFR, se cocultivaron células T CD8 humanas m RPM1-1640, suero humano al 2 % en placas de 96 pocillos de pared blanca con las siguientes líneas celulares que expresan EGFR en una relación efector a diana de 5:1 (con la excepción de las células U266, que se utilizaron en una relación 3:1 cultivadas en placas de fondo plano de 96 pocillos) y una titulación de anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N: HEK-293, h CT-15, HCT 116, Hs 766T, HT- 29, NCI-H2405, SW480, SK-OV-3, y una línea celular negativa para EGFR, U266 (todas líneas celulares de ATCC). Se utilizó el anticuerpo anti-EGFR C225v5 (a 200 pM) como control negativo. Después de una incubación durante la noche, se añadió el sustrato peptídico luminogénico del ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo TM (Promega) directamente a las placas (150 pl de sobrenadante) para medir la actividad de proteasa liberada, con la excepción de las muestras U266, donde se utilizaron 100 pl de sobrenadante de U266 para evaluar la actividad de proteasa. Los resultados se expresaron en luminiscencia después de la sustracción del fondo de los valores no tratados y se graficaron en Prisma con análisis de ajuste de curva log(agonista) vs. respuesta (tres parámetros).
La Figura 19 demuestra que todas las líneas celulares que expresan EGFR tratadas con el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N en presencia de células T CD8- exhibieron citotoxicidad dependiente de la dosis, en contraste, las células U266 negativas para EGFR no se vieron afectadas por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OT3m-H-N. Ninguna de las líneas celulares tratadas con el anticuerpo anti-EGFR C225v5 a 200 pM exhibió evidencia de citotoxicidad, independientemente de su expresión de EGFR.
EJEMPLO 13: Atenuación de la unión de EGFR por anticuerpos activables multiespecíficos
Este Ejemplo demuestra que la unión de EGFR por un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción se atenúa en comparación con la unión de EGFR por un anticuerpo multiespecífico de la descripción. Este Ejemplo también demuestra que la unión de EGFR del anticuerpo activable multiespecífico, que incluye un resto escindible de proteasa, se restaura tras la escisión del anticuerpo activable multiespecífico mediante dicha proteasa.
Se evaluaron el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N. anticuerpo activable activado multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N y el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3rn-H-N para determinar su capacidad de unirse a células SW480 que expresan EGFR.
La activación del anticuerpo activable multiespecífico se llevó a cabo como sigue; 825 pg de anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N en PBS se escindió mediante la adición de matriptasa valorada en el sitio activo (también denominado en esta invención MT-SP1 y MTSP1: disponible en R&D Systems, Catálogo 3946-SE-010) a una concentración final de 100 nM. El digesto se incubó a 37° C durante la noche y la escisión se confirmó mediante la eliminación de una alícuota para el análisis de electroforesis capilar (GX-II Capillary Electrophoresis, Perkin Elmer). La proteasa y el resto de enmascaramiento escindido se eliminaron mediante purificación con proteína A. ,En resumen, la muestra .sample digerida se diluyó a 2 ml con PBS Wish y se cargó en perlas MabSclect SuRe TM equilibradas (GE Healthcare Life Sciences, Producto 11-0026-01 AD). Las perlas se lavaron con 5 volúmenes de columna (CV) de 1xPBS, seguido de 5 CV de 5xPBS complementado con alcohol isopropílico (IPA) al 5 % y, finalmente, con 5 CV de 1xPBS. El anticuerpo se eluyó con 10 CV de glicina 0,1 M, pH 3,0, y las fracciones húmedas se neutralizaron con Tris 1 M, pH 8,0, se agruparon, se concentraron y se intercambiaron en tampón en PBS.
Las células SW480, que expresan EGFR, se levantaron con tampón de disociación celular (Sigma, Catálogo C5789), se lavaron e incubaron durante 1 hora con una dilución 5 veces de 1000 nM de anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N. anticuerpo activable multiespecífico activado 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo activable 3954-1204-C225v5, o anticuerpo C225v5 en tampón FACS en hielo. Las células se lavaron 3 veces con tampón FACS y se incubaron con 1:400 de un anticuerpo secundario, a saber, AF488 específico de FcGamma antihumano (Jackson immunoRcscarch, Catálogo 109-546-098) en tampón FACS en hielo. Las células se lavaron 3 veces con tampón FACS, y el MFI de AF488 se leyó en el citómetro de flujo BD Accuri (BD Biosciences). El MFI de una muestra que comprende solo el control de anticuerpo secundario se restó del MFI experimental y se graficó en Prism con análisis de ajuste de curva log(agonista) vs. respuesta (tres parámetros).
La Figura 20A demuestra que la unión de EGFR por el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N se atenuó en comparación con la unión de EGFR por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N, pero la unión de EGFR del anticuerpo activable multiespecífico se restauró completamente tras la escisión de la proteasa del anticuerpo activable multiespecífico por la matriptasa. La Figura 20B muestra que la unión de EGFR por el anticuerpo C225v5 y por el anticuerpo activable 3954-1204-C225v5 fueron comparables a la unión de EGFR por el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N y el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3mH-N, respectivamente, lo que demuestra que el resto anti-CD3£ presente en el formato multiespecífico alteró el perfil de unión de EGFR del anticuerpo multiespecífico o del anticuerpo activable multiespecífico.
EJEMPLO 14: Capacidad de anticuerpos activables multiespecíficos para unirse a células T CD3+
Este ejemplo demuestra que un anticuerpo activable multiespecífico, un anticuerpo activable multiespecífico activado y un anticuerpo multiespecífico, todas las realizaciones, son capaces de unirse a células T CD3-
Para determinar si la unión de CD3e se había visto afectada por el enmascaramiento del sitio de unión de EGFR de un anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR, se realizó un ensayo de unión de células T Jurkat como se describe en esta invención con el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo activable multiespecífico activado 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, y anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N. Las células Jurkat se incubaron con una dilución de 5 veces de 1000 nM de anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo activable multiespecífico activado con matriptasa 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N o anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m- H-N en tampón FACS durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron 3 veces y se incubaron con un anticuerpo secundario, a saber, 1:400 de AF488 específico de FcGamma antihumano (Jackson ImmunoResearch). Las células se lavaron 3 veces, y el MFI de AF488 se leyó en el citómetro de flujo BD Accuri (BD Biosciences). El MFI de una muestra que comprende solo el control de anticuerpo secundario se restó del MF1 experimental y se graficó en Prism con análisis de ajuste de curva log(agonista) vs. respuesta (tres parámetros
La Figura 21A demuestra que el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204- C225v5-OKT3m-H-N y el anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N presentan una unión equivalente a las células T Jurkat. La Figura 21B demuestra que el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N y el anticuerpo activable multiespecífico activado 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N presentan una unión equivalente a células T Jurkat. Estos resultados indican que el enmascaramiento del resto de unión a EGFR del anticuerpo activable multiespecífico no afecta la capacidad del anticuerpo activable multiespecífico para acoplarse a células T.
EJEMPLO 15: Activación de células T dependientes de diana por anticuerpos activables multiespecíficos
Este ejemplo demuestra que la activación de células T dependientes de diana mediante un anticuerpo activable multiespecífico dela descripción se atenúa en comparación con la activación exhibida por un anticuerpo multiespecífico de la descripción. Este Ejemplo también demuestra que la activación de células T dependiente de diana por el anticuerpo activable multiespecífico, que incluye un resto escindible de proteasa, se restaura tras la escisión del anticuerpo activable multiespecífico por dicha proteasa.
Para determinar si el enmascaramiento del sitio de unión a EGFR de un anticuerpo activable multiespecífico EGFR atenúa la activación de células T dependiente de diana y para determinar si la activación de la proteasa del anticuerpo activable multiespecífico restaura la activación, se realizó un ensayo de activación Jurkat, como se describe en esta invención, analizando el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, el anticuerpo activable multiespecífico activado 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo multiespecífico C225v5-OKT3m-H-N, anticuerpo anti-EGFR C225v5, y un control isotípico Synagis (Mcdimmune) como se describe en esta invención.
La Figura 22 demuestra que la activación dependiente de EGFR, determinada por la inducción de CD69 de células T Jurkat cocultivadas con células SW480 que expresan EOFR, por el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N se atenuó en comparación con la activación dependiente de EGFR exhibida por el anticuerpo multiespecífico C225v5- OKT3m-H-N. La Figura también indica que la activación dependiente de EGFR por el anticuerpo activable multiespecífico se restauró completamente tras la escisión de proteasa del anticuerpo activable multiespecífico por matriptasa. Ni el anticuerpo anti-EGFR C225v5 ni el anticuerpo de control de isotipo presentaron activación de células T.
EJEMPLO 16: Activación de células T dependientes de diana y destrucción de células diana por anticuerpos activables multiespecíficos
Este ejemplo demuestra que la activación y destrucción de células T dependiente de diana de células diana mediante un anticuerpo activable multiespecífico de la descripción se atenúa en comparación con la activación exhibida por un anticuerpo multiespecífico de la descripción. Este Ejemplo también demuestra que la activación y destrucción de células T dependiente de diana de células diana por el anticuerpo activable multiespecífico, que incluye un resto escindible de proteasa, se restaura tras la escisión del anticuerpo activable multiespecífico por dicha proteasa.
Para determinar si el enmascaramiento del sitio de unión a EGFR de un anticuerpo activable multiespecífico anti-EGFR atenúa la activación dependiente de diana y para determinar si la activación de la proteasa del anticuerpo activable multiespecífico restaura la activación, se realizó un ensayo de activación Jurkat, como se describe en esta invención, analizando el anticuerpo activable multiespecífico 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, el anticuerpo activable multiespecífico activado 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, el anticuerpo multiespecífico C225v5-O.KT3m-H-N, el anticuerpo anti-CD3£ OKT3, el anticuerpo anti-EGFR C225v5, y un control de isotipo como se describe en esta

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo activable biespecífico, donde dicho anticuerpo activable biespecífico comprende:
(i) un primer brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias que incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de células efectoras inmunitarias;
(ii) un segundo brazo que comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de unión a la diana que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana; donde el AB1 está unido a un primer resto de enmascaramiento (MM1) de modo que el acoplamiento del MM1 al AB1 reduce la capacidad del AB1 de unirse a la primera diana,
donde el MM1 está acoplado al AB1 a través de una primera secuencia de resto escindible (CM1) que incluye un sustrato para una proteasa;
donde el AB2 está unido a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 al AB2 reduce la capacidad del AB2 de unirse a la segunda diana;
donde el MM2 está acoplado al AB2 a través de una segunda secuencia de resto escindible (CM2) que incluye un sustrato para una proteasa; y
donde el primer brazo del anticuerpo activable biespecífico en un estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM1-CM1-AB1 y el segundo brazo del anticuerpo activable biespecífico en el estado no escindido tiene una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM2-CM2-AB2.
2. El anticuerpo activable biespecífico de la reivindicación 1, donde la segunda diana comprende una diana relacionada con el cáncer donde la diana relacionada con el cáncer es una diana tumoral, opcionalmente un tumor sólido.
3. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el AB1 es:
un anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias;
un anticuerpo de acoplamiento de leucocitos;
un anticuerpo de acoplamiento de células T;
un anticuerpo de acoplamiento de células NK;
un anticuerpo de acoplamiento de macrófagos; o
un anticuerpo de acoplamiento de células mononucleares.
4. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo de acoplamiento de células efectoras inmunitarias es un anticuerpo de acoplamiento de células T, y donde la primera diana de células efectoras inmunitarias es una diana de células T.
5. El anticuerpo activable biespecífico de la reivindicación 4, donde la diana de células T es CD3 o CTLA-4.
6. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la segunda diana se selecciona de entre el grupo de dianas de la Tabla 1, opcionalmente donde la segunda diana es Jagged o EGFR.
7. El anticuerpo activable biespecífico de la reivindicación 4, donde la diana de células T es CD3 y la segunda diana es EGFR.
8. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:
el primer brazo
comprende un péptido de unión entre el MM1 y el CM1; o
comprende un péptido de unión entre el CM1 y el AB1; o
comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), donde el anticuerpo activable biespecífico en el estado no escindido tiene una disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM1-LP1-CM1-LP2-AB, opcionalmente donde los dos péptidos de unión no son idénticos entre sí; o
el CM1 del primer brazo se coloca en el anticuerpo activable biespecífico de modo que, en un estado no escindido, el MM1 interfiere con la unión específica del AB1 a la primera diana.
9. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:
el MM1 tiene una constante de disociación de equilibrio para la unión al AB1 que es mayor que la constante de disociación de equilibrio del AB1 a su diana;
el MM1 no interfiere ni compite con el AB1 por unirse a la primera diana cuando el anticuerpo activable biespecífico está en un estado escindido;
la secuencia de polipéptidos MM1 es diferente de la de la primera diana;
la secuencia de polipéptidos MM1 no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB1; y/o el MM1 es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud.
10. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:
el segundo brazo
comprende un péptido de unión entre el MM2 y el CM2; o
comprende un péptido de unión entre el CM2 y el AB2; o
comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), donde el anticuerpo activable biespecífico en el estado no escindido tiene una disposición estructural del extremo N al extremo C de la siguiente manera: MM2-LP1-CM2-LP2-AB2, opcionalmente donde los dos péptidos de unión no son idénticos entre sí; o
el CM2 del segundo brazo se coloca en el anticuerpo activable biespecífico de modo que, en un estado no escindido, el MM2 interfiere con la unión específica del AB2 a la segunda diana.
11. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:
el MM2 tiene una constante de disociación de equilibrio para unirse al AB2 que es mayor que la constante de disociación de equilibrio del AB2 a su diana;
el MM2 no interfiere ni compite con el AB2 por unirse a la segunda diana cuando el anticuerpo activable biespecífico está en un estado escindido;
la secuencia de polipéptidos MM2 es diferente de la de la segunda diana;
la secuencia de polipéptidos MM2 no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB2; y/o el MM2 es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud.
12. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el fragmento de unión al antígeno del mismo de AB1 y/o AB2 se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio simple y un anticuerpo de cadena ligera de dominio simple.
13. El anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un agente conjugado con el anticuerpo, opcionalmente donde el agente es un agente terapéutico, un agente antineoplásico, una toxina o fragmento del mismo, un resto detectable o un agente de diagnóstico, opcionalmente donde el agente se conjuga con el anticuerpo mediante un enlazador, opcionalmente donde el enlazador es un enlazador escindible o un enlazador no escindible.
14. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 que comprende un agente adicional; opcionalmente donde el agente adicional es un agente terapéutico.
16. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
17. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 16.
18. Un procedimiento para producir un anticuerpo activable biespecífico mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable biespecífico, donde la célula comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o el vector de la reivindicación 17; conjugando opcionalmente un agente al anticuerpo activable biespecífico.
19. Un procedimiento de fabricación del anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento comprende:
(a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y
(b) recuperar el anticuerpo activable biespecífico; conjugando opcionalmente un agente al anticuerpo activable recuperado.
20. Un anticuerpo activable biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, o el anticuerpo activable biespecífico producido por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, para su uso como un medicamento.
21. El anticuerpo activable biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, o el anticuerpo activable biespecífico producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, para su uso en el alivio de un síntoma de una indicación clínica asociada con un trastorno en un sujeto, donde el anticuerpo activable biespecífico se administra a un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma de la indicación clínica asociada con el trastorno, opcionalmente donde dicho sujeto es un ser humano, opcionalmente donde el trastorno es cánce
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
ES2595638T3 (es) 2007-09-26 2017-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para modificar el punto isoeléctrico de un anticuerpo mediante la sustitución de aminoácidos en una CDR
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
US20150203591A1 (en) * 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
SG10201709559PA (en) 2012-08-24 2017-12-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
WO2014030750A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
CN105246914B (zh) 2013-04-02 2021-08-27 中外制药株式会社 Fc区变体
WO2014193973A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
CN104342453A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 深圳先进技术研究院 含基因工程抗体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
WO2015066279A2 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
IL263466B2 (en) 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
JP6596440B2 (ja) * 2014-03-26 2019-10-23 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド ３つの抗体を利用する発光酸素チャネリング免疫測定法並びにその製造方法及び使用
EP3613433B1 (en) 2014-05-30 2022-01-05 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-epidermal growth factor receptor (egfr) antibodies
JP6871155B2 (ja) * 2014-07-25 2021-05-12 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 二重特異性ｈｅｒ２及びｃｄ３結合分子
CA2955947A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
US11820832B2 (en) 2014-07-25 2023-11-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
PT3221356T (pt) 2014-11-20 2020-10-29 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas ativadoras das células t contra folr1 e cd3
DK3221357T3 (da) 2014-11-20 2020-08-10 Hoffmann La Roche Fælles letkæder og fremgangsmåder til anvendelse
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
CN107405399B (zh) * 2015-01-02 2022-02-08 武田药品工业株式会社 针对血浆激肽释放酶和因子xii的双特异性抗体
CA2973720A1 (en) * 2015-01-14 2016-07-21 Compass Therapeutics Llc Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
CN108112254B (zh) 2015-03-13 2022-01-28 西托姆克斯治疗公司 抗-pdl1抗体、可活化的抗-pdl1抗体、及其使用方法
IL292798A (en) * 2015-05-04 2022-07-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, preparations containing them and their uses
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
EP3296395B2 (en) 2015-05-13 2024-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multiple antigen binding molecular fusion, pharmaceutical composition, method for identifying linear epitope, and method for preparing multiple antigen binding molecular fusion
TWI614264B (zh) * 2015-05-20 2018-02-11 免疫功坊股份有限公司 含胜肽核的多臂接合物及其應用
US9708412B2 (en) 2015-05-21 2017-07-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
AU2016297018B9 (en) 2015-07-21 2022-12-01 Takeda Pharmaceutical Company Limited A monoclonal antibody inhibitor of factor XIIa
WO2017019729A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 The General Hospital Corporation Antibody derivatives with conditionally enabled effector function
SG11201800864XA (en) 2015-08-11 2018-03-28 Univ Osaka Antibody
IL319047A (en) 2015-08-28 2025-04-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
EA039736B1 (ru) * 2015-09-15 2022-03-04 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Анти-pdl1-антитела, активируемые анти-pdl1-антитела и способы их применения
AU2016325019B2 (en) 2015-09-18 2020-07-16 Société des Produits Nestlé S.A. Savoury concentrates with a flowable texture based on two starches
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
EP3373937B1 (en) 2015-11-09 2021-12-22 R.P. Scherer Technologies, LLC Anti-cd22 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
FI3377103T4 (fi) 2015-11-19 2025-04-16 Revitope Limited Funktionaalinen vasta-ainefragmenttikomplementointi kaksikomponenttiselle järjestelmälle epätoivottujen solujen uudelleenohjattua tappamista varten
US10533157B1 (en) 2015-12-03 2020-01-14 Nantbio, Inc. Recombinant NK cells expressing co-stimulatory molecules
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
IL260289B (en) * 2016-01-08 2022-08-01 Bioalliance Cv Tetravalent anti-psgl-1 antibodies and uses thereof
EP3192810A1 (en) * 2016-01-14 2017-07-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Psma binding antibody and uses thereof
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
JP7015244B2 (ja) * 2016-03-22 2022-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ｔ細胞二重特異性分子
WO2017162587A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific molecules
WO2017201493A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment cd3 binding proteins
EP3493844A4 (en) 2016-05-20 2021-03-24 Harpoon Therapeutics Inc. SINGLE DOMAIN SERUM ALBUMIN BINDING PROTEIN
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2018004338A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Cleavable tetrazine used in bio-orthogonal drug activation
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
CN110267990B (zh) * 2016-08-30 2023-11-07 Xencor股份有限公司 结合共刺激性和检查点受体的双特异性免疫调节抗体
CN106632681B (zh) * 2016-10-11 2017-11-14 北京东方百泰生物科技有限公司 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用
EP3529268B1 (en) * 2016-10-19 2025-02-26 The Scripps Research Institute Chimeric antigen receptor effector cell switches with humanized targeting moieties and/or optimized chimeric antigen receptor interacting domains and uses thereof
MA46770A (fr) * 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
JP7784795B2 (ja) 2016-11-15 2025-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
WO2018098356A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Psma targeting trispecific proteins and methods of use
AU2017363300A1 (en) 2016-11-23 2019-06-20 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
BR112019011564A2 (pt) 2016-12-09 2019-10-22 Seattle Genetics Inc anticorpos bivalentes mascarados por hélices superenroladas
WO2018108759A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to determine the presence of a target antigen in a tumor sample
CN108264561B (zh) * 2016-12-30 2021-09-10 惠和生物技术(上海)有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用
US11046768B2 (en) 2017-01-27 2021-06-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
AU2018219887B2 (en) 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, LLC Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CN110944661A (zh) 2017-02-20 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 结合her2、nkg2d和cd16的蛋白质
CA3177692A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multispecific binding proteins targeting caix, ano1, mesothelin, trop2, or claudin-18.2
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
KR102367658B1 (ko) * 2017-03-29 2022-02-25 타이페이 메디컬 유니이버시티 항원 특이적 t 세포 및 그의 용도
EP3601346A1 (en) * 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
SG11201909160WA (en) 2017-04-11 2019-10-30 Inhibrx Inc Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
WO2018209304A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Msln targeting trispecific proteins and methods of use
EP3621994A4 (en) 2017-05-12 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. MESOTHELIN BINDING PROTEINS
IL270803B1 (en) * 2017-05-23 2026-02-01 Dragonfly Therapeutics Inc NKG2D, CD16, and tumor-associated antigen binding protein
CN110914302A (zh) 2017-06-01 2020-03-24 赛托姆克斯治疗学股份有限公司 可活化抗pdl1抗体及其使用方法
KR102763369B1 (ko) * 2017-06-25 2025-02-05 시스트이뮨, 인코포레이티드 다중-특이적 항체 및 이를 제조하는 방법 및 이의 용도
US20200157224A1 (en) * 2017-06-25 2020-05-21 Systimmune, Inc. Multi-specific antibodies and methods of making and using thereof
TWI828625B (zh) * 2017-06-25 2024-01-11 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制蛋白質以及彼之製造及使用方法
EP3645050A4 (en) * 2017-06-25 2021-08-11 Systimmune, Inc. Multi-specific antibodies and methods of making and using thereof
JP2020530554A (ja) * 2017-07-20 2020-10-22 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化抗体の特性を定性的および／または定量的に分析する方法およびその使用
JP2020531430A (ja) 2017-08-16 2020-11-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗体を標的とする抗ｃｔｌａ４プロボディ療法
CN111356700A (zh) 2017-09-08 2020-06-30 马弗里克治疗公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
MX2020003915A (es) 2017-10-13 2020-10-08 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso.
EP3694885A1 (en) 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
KR20200117992A (ko) * 2017-12-11 2020-10-14 트리페이스 리서치 앤드 디벨로프먼트 쓰리 코포레이션 항-cd22 항체-메이탄신 컨쥬게이트, 그것의 조합, 및 사용 방법
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
IL325995A (en) 2018-02-08 2026-03-01 Genentech Inc Bispecific antigen binding molecules and methods of use
BR112020015994A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
WO2019164930A1 (en) 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
JP2021518603A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 哺乳動物対象における活性化可能抗体種の定量薬理学モデリングのためのシステムおよび方法
KR20260046525A (ko) 2018-04-11 2026-04-07 인히브릭스 바이오사이언스, 인크. 제한된 cd3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 관련된 방법 및 용도
WO2019213444A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
AU2019262520B2 (en) 2018-05-04 2025-07-10 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Tetrazines for high click conjugation yield in vivo and high click release yield
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
WO2019222296A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
BR112020023330A2 (pt) 2018-05-14 2021-04-20 Harpoon Therapeutics, Inc. porção de ligação para ativação condicional de moléculas de imunoglobulina
US20210353652A1 (en) * 2018-06-04 2021-11-18 Trustees Of Tufts College Tumor microenvironment-activated drug-binder conjugates, and uses related thereto
WO2019241216A1 (en) * 2018-06-14 2019-12-19 Bioatla, Llc Multi-specific antibody constructs
EP3827019A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
SG11202013248YA (en) * 2018-07-31 2021-02-25 Amgen Inc Pharmaceutical formulations of masked antibodies
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
KR102835308B1 (ko) 2018-08-08 2025-07-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
WO2020072306A1 (en) * 2018-10-01 2020-04-09 Amgen Inc. Methods for reducing aggregation of bispecific antibodies
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CN120623346A (zh) 2018-10-11 2025-09-12 因荷布瑞克斯生物科学公司 Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物
JP7611820B2 (ja) 2018-10-11 2025-01-10 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
JP2022504802A (ja) 2018-10-11 2022-01-13 インヒブルクス インコーポレイテッド ５ｔ４シングルドメイン抗体およびその治療組成物
SMT202400519T1 (it) 2018-11-12 2025-01-14 Debiopharm Int Sa Composti antibiotici. metodi di produzione degli stessi, composizioni farmaceutiche contenenti gli stessi e loro usi
EP4592313A3 (en) 2019-03-05 2025-11-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
EP3969035A4 (en) 2019-05-14 2023-06-21 Werewolf Therapeutics, Inc. SEPARATION UNITS AND METHODS AND THEIR USE
WO2020232247A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
AU2020275002A1 (en) 2019-05-14 2021-12-23 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
WO2020251878A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
US20220227887A1 (en) * 2019-06-11 2022-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunosuppressant
IL289094A (en) 2019-06-17 2022-02-01 Tagworks Pharmaceuticals B V Tetrazines for increasing the speed and yield of the "click release" reaction
DK3983363T3 (da) 2019-06-17 2024-06-24 Tagworks Pharmaceuticals B V Forbindelser til hurtig og effektiv klikfrigivelse
KR20210043475A (ko) 2019-10-10 2021-04-21 주식회사 와이바이오로직스 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
MX2022005330A (es) * 2019-11-05 2022-05-26 Regeneron Pharma Moleculas de union multiespecificas con scfv en el extremo nterminal.
JP7592712B2 (ja) * 2019-11-06 2024-12-02 システィミューン， インク． ガイダンス及びナビゲーションコントロールタンパク質、その製造方法及び使用方法
MX2022005666A (es) 2019-11-14 2022-10-07 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de citocina activables y metodos de uso de los mismos.
WO2021097800A1 (en) * 2019-11-22 2021-05-27 Abl Bio Inc. Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof
EP4069735A1 (en) * 2019-12-06 2022-10-12 OncoOne Research & Development GmbH Anti-oxmif/anti-cd3 bispecific antibody constructs
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
JP7789002B2 (ja) 2020-01-29 2025-12-19 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ２８シングルドメイン抗体ならびにその多価および多重特異性の構築物
US11976133B2 (en) * 2020-01-31 2024-05-07 Gensun Biopharma Inc. Bispecific T cell engagers
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法
TWI908779B (zh) * 2020-03-17 2025-12-21 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制(gnc)抗體樣蛋白質及製造與使用其之方法
JP2023521384A (ja) 2020-04-09 2023-05-24 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能抗体を含む組成物
JP7512394B2 (ja) 2020-05-06 2024-07-08 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６及びｃｌｅｃ１２ａに結合するタンパク質
IL298999A (en) 2020-06-11 2023-02-01 Provention Bio Inc Methods and compositions for the prevention of type 1 diabetes
US12286482B2 (en) 2020-08-05 2025-04-29 Synthekine, Inc. IL10RB binding molecules and encoding nucleic acids
US11859001B2 (en) 2020-08-05 2024-01-02 Synthekine, Inc. IL12RB1-Binding molecules and methods of use
KR102773428B1 (ko) 2020-08-05 2025-02-28 신테카인, 인크. Il10 수용체 결합 분자 및 사용 방법
WO2022031884A2 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il2rg binding molecules and methods of use
US12122839B2 (en) 2020-08-05 2024-10-22 Synthekine, Inc. IFNGR binding synthetic cytokines and methods of use
BR112023001723A2 (pt) 2020-08-05 2023-05-02 Synthekine Inc Moléculas de ligação à gp130 e métodos de uso
US12291572B2 (en) 2020-08-05 2025-05-06 Synthekine, Inc. IL12 receptor synthetic cytokines and methods of use
WO2022031890A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Ifngr2 binding molecules and methods of use
US12012457B1 (en) 2020-08-05 2024-06-18 Synthekine, Inc. IL23R binding molecules and methods of use
EP4192490A4 (en) 2020-08-05 2025-01-01 Synthekine, Inc. IL27RA-BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE
US20230279126A1 (en) * 2020-08-05 2023-09-07 Synthekine, Inc. Il23 receptor synthetic cytokines and methods of use
MX2023001415A (es) 2020-08-05 2023-04-24 Synthekine Inc Composiciones y métodos relacionados con la unión al receptor de il27.
EP4192489A4 (en) 2020-08-05 2024-12-11 Synthekine, Inc. IL2RB-BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE
WO2022031885A2 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il10ra binding molecules and methods of use
US12540188B2 (en) 2020-08-05 2026-02-03 Synthekine, Inc. IL10Rα/IL2Rγ synthetic cytokines
EP4259202A4 (en) * 2020-12-09 2025-01-15 Janux Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO TUMOR-ACTIVATED ANTIBODIES AGAINST TROP2 AND EFFECTOR CELL ANTIGENS
WO2022170619A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Adagene Pte. Ltd. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
EP4301774A4 (en) 2021-03-03 2025-08-13 Dragonfly Therapeutics Inc METHODS OF TREATING CANCER USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT BIND TO NKG2D, CD16, AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
WO2022216992A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for activation and expansion of natural killer cells and combinations with bispecific antibodies
EP4337330A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
JP2024520444A (ja) 2021-05-24 2024-05-24 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を治療するための方法
KR20240115809A (ko) 2021-10-15 2024-07-26 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화 가능한 폴리펩타이드 복합체
WO2023064955A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd3, anti-egfr, heteromultimeric bispecific polypeptide complex
US20230174995A1 (en) 2021-10-15 2023-06-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
WO2023083381A1 (zh) 2021-11-15 2023-05-19 成都百利多特生物药业有限责任公司 双特异性抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
WO2023150672A1 (en) * 2022-02-04 2023-08-10 Duke University Compositions for and methods of treating hematological cancers
CN118574934A (zh) * 2022-02-11 2024-08-30 因特尔乌斯生物治疗公司 促融合弹状病毒糖蛋白及其用途
CN114316062B (zh) * 2022-03-02 2022-06-07 珠海臻谱基因科技有限公司北京分公司 靶向HIV gp120蛋白和人CD3分子的多特异性抗体及其应用
US11958906B2 (en) 2022-04-13 2024-04-16 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
WO2024104988A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with activatable effector domain
IL326412A (en) 2023-08-11 2026-04-01 Wuxi Biologics Ireland Ltd Anti-muc16 antibodies and uses thereof
WO2025036892A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Morphosys Ag Cycat halfbody molecules comprising sterically occluding moieties
WO2025038668A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Voro Therapeutics, Inc. Therapeutic binding agents that conditionally promote myeloid cell activity against target cells and uses thereof
TW202540200A (zh) 2023-12-01 2025-10-16 美商基利科學股份有限公司 抗ｆａｐ－ｌｉｇｈｔ融合蛋白及其用途
WO2025189116A1 (en) * 2024-03-08 2025-09-12 Synthetic Design Lab, Inc. Multivalent multispecific constructs for targeted payload delivery
WO2025199278A2 (en) * 2024-03-20 2025-09-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Masked multispecific antigen-binding molecules with cleavable linkers
WO2025235515A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex formulations
WO2025240659A2 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable constructs, compositions and methods
WO2025237931A1 (en) * 2024-05-15 2025-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with conditionally activatable t cell and nk cell recruiting effector domains
WO2025259871A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Gilead Sciences, Inc. Anti-ccr8 antibodies and uses thereof
WO2026024841A1 (en) * 2024-07-24 2026-01-29 Astellas Us Llc Bispecific antibodies that bind cd3 and muc1 and methods of use thereof
WO2026082031A1 (zh) * 2024-10-14 2026-04-23 先声再明医药股份有限公司 一种包含抗cdh6抗体或其adc的药物组合物

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
EP0279862B1 (en) 1986-08-28 1993-11-03 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
WO1991001752A1 (en) 1989-07-27 1991-02-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunosuppressive monoclonal antibodies, hybridomas and methods of transplantation
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
GB9021679D0 (en) 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
US5968509A (en) 1990-10-05 1999-10-19 Btp International Limited Antibodies with binding affinity for the CD3 antigen
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
IT1271461B (it) 1993-12-01 1997-05-28 Menarini Ricerche Sud Spa Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso.
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
GB9815909D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Btg Int Ltd Antibody preparation
EP1286700A2 (en) * 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
WO2002030460A2 (en) 2000-10-09 2002-04-18 Isis Innovation Ltd. Therapeutic antibodies
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
AU2003244817B2 (en) * 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
US8809504B2 (en) 2002-09-03 2014-08-19 Vit Lauermann Inhibitor which is deactivatable by a reagent produced by a target cell
DK1629011T3 (da) 2003-05-31 2010-05-03 Micromet Ag Humane anti-humane-DC3-bindingsmolekyler
EP1668114B1 (en) 2003-08-18 2009-11-04 The Regents of the University of California Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof
MXPA06004035A (es) 2003-10-16 2006-08-31 Micromet Ag Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos.
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
AU2006284651C1 (en) 2005-08-31 2013-09-12 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
CN101309703A (zh) 2005-09-12 2008-11-19 诺维莫尼公司 抗cd3抗体组合物
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
JP2009529522A (ja) 2006-03-10 2009-08-20 ディアト 酵素で切断可能なリンカーを介して抗体に複合された抗癌剤
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
GB0605702D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Biotransformations Ltd Materials and methods for immune cell stimulation
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
CA2654794A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-21 Imclone Systems Incorporated Lyophilized formulations of anti-egfr antibodies
RU2769948C2 (ru) 2007-04-03 2022-04-11 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх CD3-Эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
MX2009010611A (es) 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
US8293685B2 (en) 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
KR20100058509A (ko) * 2007-07-31 2010-06-03 메디뮨 엘엘씨 다중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
US20110293619A1 (en) 2008-10-01 2011-12-01 Micromet Ag CROSS-SPECIES-SPECIFIC PSMAxCD3 BISPECIFIC SINGLE CHAIN ANTIBODY
EP2352765B1 (en) * 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
AU2009303318B2 (en) * 2008-10-10 2016-06-30 Aptevo Research And Development Llc TCR complex immunotherapeutics
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
WO2010077643A1 (en) 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
ES3000111T3 (en) 2009-02-13 2025-02-27 Immunomedics Inc Intermediates for preparing conjugates with an intracellularly-cleavable linkage
AU2010215761B2 (en) 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
US20100241584A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Bank Of America Flexible design pension account
WO2010109924A1 (ja) 2009-03-25 2010-09-30 国立大学法人東北大学 Ｌｈ型二重特異性抗体
AR076508A1 (es) 2009-05-01 2011-06-15 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA3253628A1 (en) 2010-03-05 2025-11-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
CN103068847B (zh) 2010-08-24 2019-05-07 罗切格利卡特公司 可活化的双特异性抗体
TWI452136B (zh) * 2010-11-17 2014-09-11 中外製藥股份有限公司 A multiple specific antigen-binding molecule that replaces the function of Factor VIII in blood coagulation
US9249217B2 (en) 2010-12-03 2016-02-02 Secretary, DHHS Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
TWI743461B (zh) 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
KR102060389B1 (ko) 2011-05-21 2019-12-31 마크로제닉스, 인크. 사람 및 비-사람 cd3에 결합할 수 있는 cd3-결합 분자
JP5960138B2 (ja) * 2011-06-28 2016-08-02 第一三共株式会社 リン酸エステル誘導体
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
JP6060162B2 (ja) 2011-08-23 2017-01-11 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
HUE033245T2 (hu) 2011-12-19 2017-11-28 Synimmune Gmbh Bispecifikus ellenanyag molekula
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
EP2863948B1 (en) * 2012-06-22 2018-10-24 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
US9856314B2 (en) 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
AU2013289883B2 (en) 2012-07-13 2018-11-01 Zymeworks Bc Inc. Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-CD3 constructs
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US9487590B2 (en) * 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
CN105008918A (zh) 2013-01-04 2015-10-28 西托姆克斯治疗公司 用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法
EP2986559B1 (en) * 2013-04-19 2018-12-05 ExxonMobil Chemical Patents Inc. Molecular sieve cok-5 and its synthesis
KR20160018579A (ko) * 2013-06-04 2016-02-17 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화가능 항체를 접합하기 위한 조성물 및 방법
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
CN112472699A (zh) * 2013-07-26 2021-03-12 种族肿瘤学公司 改善比生群及衍生物的治疗益处的组合方法
WO2015066279A2 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
US9562073B2 (en) * 2014-01-31 2017-02-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
CA2955947A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
MA40894A (fr) 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CA2984892A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
IL292798A (en) * 2015-05-04 2022-07-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, preparations containing them and their uses
EP3430058A4 (en) 2016-03-15 2019-10-23 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. MULTISPECIFIC FAB FUSION PROTEINS AND USES THEREOF
EP3694885A1 (en) * 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
WO2019213444A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DK3406633T3 (da) 2022-03-28
JP2020114872A (ja) 2020-07-30
AU2020200981A1 (en) 2020-02-27
JP7036860B2 (ja) 2022-03-15
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