RS63152B1 - Multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS63152B1
RS63152B1 RS20220391A RSP20220391A RS63152B1 RS 63152 B1 RS63152 B1 RS 63152B1 RS 20220391 A RS20220391 A RS 20220391A RS P20220391 A RSP20220391 A RS P20220391A RS 63152 B1 RS63152 B1 RS 63152B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
activatable
binding
multispecific
target molecule
Prior art date
Application number
RS20220391A
Other languages
English (en)
Inventor
Bryan Allen Irving
Daniel Robert Hostetter
Chihunt Wong
Henry Bernard Lowman
James William West
Porte Sherry Lynn La
Original Assignee
Cytomx Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51299065&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63152(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cytomx Therapeutics Inc filed Critical Cytomx Therapeutics Inc
Publication of RS63152B1 publication Critical patent/RS63152B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Pronalazak se uopšteno odnosi na bispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja se specifično vezuju za dva različita ciljna molekula ili epitopa, kao i na postupke za pravljenje i upotrebu ovih bispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju u raznim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Monoklonska antitela su se pokazala kao molekuli za terapijsko lečenje mnogih poremećaja. Međutim, ciljno delovanje na pojedinačni protein ili njegova neutralizacija nije uvek dovoljna za efikasno lečenje određenih poremećaja, što ograničava terapijsku upotrebu monospecifičnih monoklonskih antitela. Osim toga, terapije zasnovane na antitelima pokazale su se kao efikasni tretmani za neke bolesti, ali u nekim slučajevima, njihovu terapijsku efikasnost ograničila je toksičnost usled široke rasprostranjenosti ekspresije ciljnih molekula. Dodatno, terapije na bazi antitela su ispoljile i druga ograničenja, kao što je brzi klirens iz cirkulacije nakon primene. U WO2010/081173 opisana su modifikovana antitela koja obuhvataju antitelo ili fragment antitela (AB) modifikovan maskirajućim fragmentom (MM). Takva modifikovana antitela mogu zatim da se kupluju sa fragmentom koji može da se otcepi (CM), što rezultuje antitelima koja mogu da se aktiviraju (AA), pri čemu CM može da se otcepi, redukuje, podvrgne fotolizi, ili drugačije modifikuje. U US2013/150558 opisana su maskirana anti-EGFR antitela i navodi se da dva mAb mogu da obrazuju heterodimer čime nastaje kompleks unakrsno maskiranih mAb. Donaldson et al. (2009) Cancer Biology & Therapy, 8:22, pp.2147-152, su ispitivali maskirane fragmente anti-EGFR antitela. Reusch et al. (2006) Clinical Cancer Research, 12:1, pp.183-190, su ispitivali kombinovano usmeravanje antitela na EGFR sa citotoksičnošću posredovanom T-ćelijama.
[0003] Prema tome, postoji potreba za antitelima i terapeuticima koji omogućavaju usmereno delovanje na višestruke ciljeve i/ili višestruke epitope jednim molekulom i takođe obezbeđuju povećanu selektivnost za predviđene ciljeve i smanjenje neželjenih dejstava nakon primene.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0004] Pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje može da se aktivira, kao što je definisano priloženim skupom patentnih zahteva.
[0005] Jedan aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju. Multispecifična antitela koja su ovde data su antitela koja prepoznaju dva ili više različitih antigena ili epitopa. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde data su multispecifična antitela koja uključuju najmanje jedan maskirajući fragment (MM) vezan za najmanje jedan antigen- ili epitop-vezujući domen multispecifičnog antitela, tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost antigen- ili epitopvezujućeg domena da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM je kuplovan sa antigen- ili epitop-vezujućim domenom multispecifičnog antitela preko fragmenta koji može da se otcepi (CM), koji funkcioniše kao supstrat za proteazu. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde data su stabilna u cirkulaciji, aktiviraju se na predviđenim mestima za terapiju i/ili dijagnozu, ali ne i u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada su aktivirana, ispoljavaju vezivanje za ciljni molekul koje je najmanje uporedivo sa vezivanjem odgovarajućeg, nemodifikovanog multispecifičnog antitela.
[0006] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su konstruisana tako da vezuju imunske efektorske ćelije, ovde označena i kao multispecifična antitela koja vezuju imunske efektorske ćelije i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju imunske efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su konstruisana da vezuju leukocite, ovde označena i kao multispecifična antitela koja vezuju leukocite i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju leukocite. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su konstruisana da vezuju T-ćelije, ovde označena i kao multispecifična antitela koja vezuju T-ćelije i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju vezuju površinski antigen na leukocitu, na primer, na T-ćeliji, na ćeliji prirodnom ubici (NK), na mijeloidnoj mononuklearnoj ćeliji, na makrofagu, i/ili na drugoj imunskoj efektorskoj ćeliji. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je mononuklearna ćelija, kao što je mijeloidna mononuklearna ćelija. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju konstruisana su da se vežu ili drugačije interaguju sa više od jednog ciljnog molekula i/ili više od jednog epitopa, ovde označena i kao antitela usmerena na više antigena i/ili antitela usmerena na više antigena koja mogu da se aktiviraju. Kako se ovde koriste, pojmovi "ciljni molekul" i "antigen" predstavljaju sinonime.
[0007] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja vezuju imunske efektorske ćelije uključuju usmereno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, i antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije, ili njegov antigen-vezujući deo. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja vezuju imunske efektorske ćelije uključuju antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, i antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije, ili njegov antigen-vezujući deo. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja vezuju imunske efektorske ćelije uključuju IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigenvezujući fragment, i scFv koji vezuje imunske efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je mijeloidna mononuklearna ćelija.
[0008] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja vezuju T-ćelije uključuju usmereno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov antigen-vezujući deo. U nekim primerima izvođenja multispecifična antitela koja vezuju T-ćelije uključuju antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov antigen-vezujući deo. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja vezuju T-ćelije uključuju IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment i scFv koji vezuje T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje vezuje T-ćelije uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε, ovde označen i kao CD3e i CD3) scFv i usmereno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje vezuje T-ćelije uključuje anti-CD3ε scFv i antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje vezuje T-ćelije uključuje anti-CD3ε scFv i IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja multispecifično antitelo koje vezuje T-ćelije uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε) scFv koji potiče iz OKT3. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje vezuje T-ćelije uključuje anti-CTLA-4 scFv.
[0009] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju imunske efektorske ćelije, prema otkriću, uključuju usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije ili njegov antigenvezujući deo, gde je najmanje jedno od usmerenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje vezuje imunske efektorske ćelije ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul, koji vezuje imunske efektorske ćelije, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul, koji vezuje imunske efektorske ćelije, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul, a usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje ne vezuje imunske efektorske ćelije je antitelo usmereno na kancer. U nekim primerima izvođenja antitelo koje ne vezuje imunske efektorske ćelije je IgG. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije je scFv. U nekim primerima izvođenja usmereno antitelo (npr., antitelo koje ne vezuje imunske efektorske ćelije) je IgG, a antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije je scFv. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je mijeloidna mononuklearna ćelija.
[0010] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju T-ćelije prema otkriću uključuju usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov antigen-vezujući deo, gde je najmanje jedno od usmerenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje vezuje T-ćelije ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul, i usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul.
[0011] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju T-ćelije uključuju antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, i antitelo koje vezuje T-ćeliju, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu je najmanje jedno od antitela usmerenog na kancer, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje vezuje T-ćelije, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo usmereno na kancer ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul, a antitelo usmereno na kancer ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom.
[0012] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju T-ćelije uključuju IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment i scFv koji vezuje T-ćelije, gde je najmanje jedno od IgG antitela usmerenog na kancer, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje vezuje T-ćeliju, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, IgG antitelo usmereno na kancer ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul, a antitelo IgG usmereno na kancer ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom.
[0013] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje vezuje imunske efektorske ćelije, jedan antigen je tipično antigen prisutan na površini tumorske ćelije ili drugog tipa ćelije povezanog sa bolešću, kao što je, ali bez ograničenja, bilo koji ciljni molekul naveden u tabeli 1, kao što su, ali bez ograničenja, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, ili CD71 (receptor za transferin), a drugi antigen je obično stimulatorni ili inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK), mijeloidnih mononuklearnih ćelija, makrofaga, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija, kao što su, ali bez ograničenja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. U nekim primerima izvođenja, antigen je stimulatorni receptor prisutan na površini T-ćelija ili NK ćelija; primeri takvih stimulatornih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, CD3, CD27, CD28, CD137 (označen i kao 4-1BB), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D, i OX40.
U nekim primerima izvođenja, antigen je inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelija; primeri takvih inhibitornih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, i KIR eksprimirane na NK ćelijama. Domen antitela koji daje specifičnost za površinski antigen T-ćelije može takođe da bude supstituisan ligandom ili domenom liganda koji se vezuje za receptor T-ćelije, receptor NK-ćelije, receptor makrofaga, i/ili receptor druge imunske efektorske ćelije, kao što je, ali bez ograničenja, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ili TNFSF9.
[0014] Jedan primer izvođenja otkrića je multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje može da se aktivira u mikrookruženju kancera i koje uključuje antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno na tumorski ciljni molekul i agonističko antitelo, na primer lgG ili scFv, usmereno na ko-stimulatorni receptor eksprimiran na površini aktivirane T-ćelije ili NK ćelije, pri čemu je najmanje jedno od antitela usmerenog na kancer i/ili agonističkog antitela maskirano. Primeri ko-stimulatornih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D, i OX40. U ovom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira bi, kada se jednom aktivira proteazama povezanim sa tumorom, efikasno unakrsno povezalo i aktiviralo ko-stimulatorne receptore eksprimirane na T-ćelijama ili NK ćelijama na tumor-zavisan način, kako bi se poboljšala aktivnost T-ćelija koje reaguju na bilo koji tumorski antigen preko svog endogenog T-ćelijskog antigena ili receptora koji aktiviraju NK. Svojstvo zavisnosti od aktivacije kod ovih ko-stimulatornih receptora T-ćelija ili NK ćelija dovelo bi do usmeravanja delovanja aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira na tumorspecifične T-ćelije, uz izostanak aktivacije svih T-ćelija, nezavisno od njihove antigenske specifičnosti. U jednom primeru izvođenja, najmanje antitelo protiv ko-stimulatornog receptora u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je maskirano, kako bi se sprečila aktivacija auto-reaktivnih T-ćelija, koje mogu da budu prisutne u tkivima koja takođe eksprimiraju antigen koji prepoznaje antitelo usmereno na tumorski ciljni molekul u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, ali čija je aktivnost ograničena izostankom vezivanja ko-receptora.
[0015] Jedan primer izvođenja otkrića je multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje može da se aktivira kod bolesti koja se odlikuje prekomernom stimulacijom T-ćelija, kao što je, ali bez ograničenja, mikrookruženje autoimunske bolesti ili inflamatorne bolesti. Takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno na ciljni molekul koji obuhvata površinski antigen eksprimiran u tkivu na koji je usmerena T-ćelija u autoimunskoj ili inflamatornoj bolesti i antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno na inhibitorni receptor eksprimiran na površini T-ćelije ili NK ćelije, pri čemu je najmanje jedno od antitela usmerenog na obolelo tkivo i/ili antitela protiv receptora koji inhibira T-ćelije, maskirano. Primeri inhibitornih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, i KIR koje eksprimiraju NK ćelije. Primeri tkivnog antigena na koji su usmerene T-ćelije u autoimunskoj bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, površinski antigen eksprimiran na mijelinskim ili nervnim ćelijama kod multiple skleroze ili površinski antigen eksprimiran na ćelijama ostrvaca pankreasa kod dijabetesa tipa 1. U ovom primeru izvođenja, kada se multispecifično antitelo koje može da se aktivira nalazi u tkivu izloženom autoimunskom napadu ili pri inflamaciji, ono se aktivira i istovremeno vezuje inhibitorni receptor T-ćelija ili NK ćelija, kako bi se suprimirala aktivnost autoreaktivnih T-ćelija koje odgovaraju na bilo koje ciljne antigene u obolelom tkivu posredstvom svojih endogenih TCR ili aktivirajućih receptora. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedno, ili više antitela, je maskirano, da bi se sprečila supresija željenih T-ćelijskih odgovora u neobolelim tkivima u kojima ciljni antigen može takođe da bude eksprimiran.
[0016] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje vezuje T-ćelije uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε, ovde označen i kao CD3e i CD3) scFv i usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, gde je najmanje jedno od anti-CD3ε scFv i/ili usmerenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi target. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε, a usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul.
[0017] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje anti-CD3ε scFv i antitelo usmereno na kancer ili njegov antigenvezujući fragment, gde je najmanje jedno od anti-CD3ε scFv i/ili antitela usmerenog na kancer, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul, povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε, a antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul, povezan sa kancerom.
[0018] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje anti-CD3ε scFv i IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigenvezujući fragment, gde je najmanje jedno od anti-CD3ε scFv i/ili IgG antitela usmerenog na kancer, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε, a IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment
1
(MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom.
[0019] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε) scFv koji potiče od OKT3, gde je najmanje jedno od usmerenog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3, maskirano. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo, ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv, ili scFv poreklom od OKT3, uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za markirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε, a usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul.
[0020] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 i antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, gde je najmanje jedno od OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 i/ili antitela usmerenog na kancer, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, antitelo usmereno na kancer ili njegov antigenvezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv, ili scFv poreklom od OKT3, uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε, a antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom.
[0021] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 i IgG antitelo usmereno na kancer, ili njegov antigen-vezujući fragment, gde je najmanje jedno od OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 i/ili IgG antitela usmerenog na kancer ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili scFv poreklom od OKT3 uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, IgG antitelo usmereno na kancer ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv, ili scFv poreklom od OKT3, uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CD3ε, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CD3ε, a IgG antitelo usmereno na kancer ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi, ciljni molekul povezan sa kancerom.
[0022] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje anti-CTLA-4 scFv, gde je najmanje jedno od usmerenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili anti-CTLA-4 scFv, maskirano. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CTLA-4, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže CTLA-4. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CTLA-4, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CTLA-4, a usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul.
[0023] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, uključuje anti-CTLA-4 scFv i usmereno IgG antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, gde je najmanje jedno od anti-CTLA-4 scFv i/ili usmerenog IgG antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskirano. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CTLA-4, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CTLA-4. U nekim primerima izvođenja usmereno IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje CTLA-4, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za CTLA-4, a usmereno IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov fragment, koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul.
[0024] U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena uključuju najmanje prvo antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koje vezuje prvi ciljni molekul i/ili prvi epitop i drugo antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koje vezuje drugi ciljni molekul i/ili drugi epitop. U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena vezuju dva ili više različitih ciljnih molekula. U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena
1
na više antigena vezuju dva ili više različitih epitopa na istom ciljnom molekulu. U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena vezuju kombinaciju dva ili više različitih ciljnih molekula i dva ili više različitih epitopa na istom ciljnom molekulu.
[0025] Različiti primeri izvođenja multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću prikazani su na slikama 3A, i 5-9. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži IgG ima maskirane varijabilne domene IgG. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži scFv ima maskirane scFv domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od varijabilnih domena IgG kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od varijabilnih domena IgG kuplovan sa maskirajućim fragmentom i najmanje jedan od scFv domena je kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je svaki od varijabilnih domena IgG i scFv domena kuplovan sa svojim sopstvenim maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za površinski antigen T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za epitop ciljnog antigena, a drugi domen antitela je specifičan za drugi epitop ciljnog antigena.
[0026] U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može da bude fuzionisan sa karboksilnim krajem teškog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, sa karboksilnim krajem lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, ili sa karboksilnim krajem i teškog i lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira. U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može da bude fuzionisan sa amino-krajem teškog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, sa amino-krajem lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, ili sa aminokrajem i teškog i lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira. U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može da bude fuzionisan sa bilo kojom kombinacijom jednog ili više karboksilnih krajeva i jednog ili više amino-krajeva IgG antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) spojen sa fragmentom koji može da se otcepi (CM) vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen IgG. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) spojen sa fragmentom koji može da se otcepi (CM) vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen najmanje jednog scFv. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) spojen sa fragmentom koji može da se otcepi (CM), vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen IgG i maskirajući fragment (MM) spojen sa fragmentom koji može da se otcepi (CM), vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen najmanje jednog scFv.
[0027] Otkriće obezbeđuje primere struktura multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; ili (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, gde: VL i VH predstavljaju lake i teške varijabilne domene prve specifičnosti, sadržane u IgG; VL* i VH* predstavljaju varijabilne domene druge specifičnosti, sadržane u scFv; L1
1
je linkerski peptid koji povezuje maskirajući fragment (MM) i fragment koji može da se otcepi (CM); L2 je linkerski peptid koji povezuje fragment koji može da se otcepi (CM), i antitelo; L3 je linkerski peptid koji povezuje varijabilne domene scFv; L4 je linkerski peptid koji povezuje antitelo prve specifičnosti sa antitelom druge specifičnosti; CL je konstantni domen lakog lanca; i CH1, CH2, CH3 su konstantni domeni teškog lanca. Prva i druga specifičnost mogu da budu usmerene prema bilo kom antigenu ili epitopu.
[0028] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje vezuje T-ćelije, jedan antigen je tipično antigen prisutan na površini tumorske ćelije ili ćelije drugog tipa povezanog sa bolešću, kao što je, ali bez ograničenja, bilo koji ciljni molekul naveden u tabeli 1, kao što su, ali bez ograničenja, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, ili CD71 (receptor za transferin), a drugi antigen je obično stimulatorni (ovde označen i kao aktivirajući) ili inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK) ćelija, mijeloidnih mononuklearnih ćelija, makrofaga, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija, kao što su, ali bez ograničenja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (označene i kao TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. Domen antitela koji daje specifičnost za površinski antigen T-ćelije može takođe da bude supstituisan ligandom ili domenom liganda koji se vezuje za receptor T-ćelije, receptor NK-ćelije, receptor makrofaga, i/ili receptor druge imunske efektorske ćelije, kao što je, ali bez ograničenja, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ili TNFSF9. U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira usmerenog na više antigena, jedan antigen je izabran iz grupe ciljnih molekula navedenih u tabeli 1, i drugi antigen je izabran iz grupe ciljnih molekula navedenih u tabeli 1.
[0029] U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je anti-EGFR antitelo. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225v5, koje specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225, koje specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225v4, koje specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225v6, koje specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je anti-Jagged antitelo. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je 4D11, koje specifično vezuje za humani i mišji Jagged 1 i Jagged 2. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je 4D11v2, koje specifično vezuje za humani i mišji Jagged 1 i Jagged 2.
[0030] U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo može da bude u obliku antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više scFv mogu da budu u obliku Pro-scFv (videti, npr., WO 2009/025846. WO 2010/081173).
1
[0031] U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje CD3ε i predstavlja ili potiče od antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje CD3ε, npr., CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1, ili V9. U nekim primerima izvođenja, scFv specifično vezuje CTLA-4 (ovde označen i kao CTLA i CTLA4).
[0032] U nekim primerima izvođenja, anti-CD3ε scFv uključuje sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5. U nekim primerima izvođenja, anti-CD3ε scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5.
[0033] U nekim primerima izvođenja, scFv specifično vezuje jednu ili više T-ćelija, jednu ili više NK-ćelija i/ili jedan ili više makrofaga. U nekim primerima izvođenja, scFv specifično vezuje ciljni molekul izabran iz grupe koja se sastoji od B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA.
[0034] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje ciljni molekul Jagged, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH odabrana od sekvence CDR1 VH koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO: 6): sekvence CD2 VH koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7); sekvence CDR3 VH koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu DIGGRSAFDY (SEQ ID NO; 8), i njihovih kombinacija.
[0035] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje ciljni molekul Jagged, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL odabrana od sekvence CDR1 VL koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSISSY (SEQ ID NO: 9); sekvence CDR2 VL koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu AASSLQS (SEQ ID NO: 10); sekvence CDR3 VL koja
1
uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11), i njihovih kombinacija.
[0036] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje ciljni molekul Jagged, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH odabrana od sekvence CDR1 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci SYAMS (SEQ ID NO: 6); sekvence CD2 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7); sekvence CDR3 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8), i njihovih kombinacija.
[0037] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje ciljni molekul Jagged, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL odabrana od sekvence CDR1 VL koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci RASQSISSY (SEQ ID NO: 9): sekvence CDR2 VL koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci AASSLQS (SEQ ID NO: 10); i sekvence CDR3 VL koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11), i njihovih kombinacija.
[0038] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje ciljni molekul Jagged, npr.,
1
Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, sekvence CDR3 VH, sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, gde sekvenca CDR1 VH uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO: 6); sekvenca CD2 VH uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7): sekvenca CDR3 VH uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8); sekvenca CDR1 VL uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSISSY (SEQ ID NO: 9); sekvenca CDR2 VL uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu AASSLQS (SEQ ID NO: 10); i sekvenca CDR3 VL uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11).
[0039] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje ciljni molekul Jagged, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, sekvence CDR3 VH, sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, gde sekvenca CDR1 VH uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci SYAMS (SEQ ID NO: 6); sekvence CD2 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7); sekvence CDR3 VH uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8); sekvence CDR1 VL uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci RASQSISSY (SEQ ID NO: 9); sekvence CDR2 VL uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci AASSLQS (SEQ ID NO: 10); i sekvence CDR3 VL uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11).
[0040] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH,
1
i sekvence CDR3 VH odabrana od sekvence CDR1 VH koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu NYGVH (SEQ ID NO: 12); sekvence CD2 VH koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); sekvence CDR3 VH koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); i njihovih kombinacija.
[0041] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje EGFR i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL odabrana od sekvence CDR1 VL koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); sekvence CDR2 VL koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu KYASESIS (SEQ ID NO: 16); i sekvence CDR3 VL koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17), i njihovih kombinacija.
[0042] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje EGFR i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, i sekvence CDR3 VH odabrana od sekvence CDR1 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci NYGVH (SEQ ID NO: 12); sekvence CD2 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); sekvence CDR3 VH koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); i njihovih kombinacija.
[0043] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje EGFR i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, pri čemu je najmanje jedna od sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL odabrana
2
od sekvence CDR1 VL koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); sekvence CDR2 VL koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci KYASESIS (SEQ ID NO: 16); i sekvence CDR3 VL koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17), i njihovih kombinacija.
[0044] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje EGFR i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, sekvence CDR3 VH, sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, pri čemu sekvenca CDR1 VH uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu NYGVH (SEQ ID NO: 12); sekvenca CD2 VH uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); sekvenca CDR3 VH uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); sekvenca CDR1 VL uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); sekvenca CDR2 VL uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu KYASESIS (SEQ ID NO: 16); i sekvenca CDR3 VL uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17).
[0045] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje EGFR i koji sadrži kombinaciju sekvence CDR1 VH, sekvence CDR2 VH, sekvence CDR3 VH, sekvence CDR1 VL, sekvence CDR2 VL, i sekvence CDR3 VL, pri čemu sekvenca CDR1 VH uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci NYGVH (SEQ ID NO: 12); sekvenca CD2 VH uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13); sekvenca CDR3 VH uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14); sekvenca CDR1 VL uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15); sekvenca CDR2 VL uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci KYASESIS (SEQ ID NO: 16); i sekvenca CDR3 VL uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17).
[0046] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde obezbeđena uključuju najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu, i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu.
[0047] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena, uključuju najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu, i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci prikazanih u tabeli 7 i/ili u primeru 5, uključujući tabelu 11 u njemu.
[0048] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuju agens konjugovan sa AB. U nekim primerima izvođenja, agens je terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, agens je antineoplastični agens. U nekim primerima izvođenja, agens je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa multispecifičnim antitelom preko linkera. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji ne može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, agens je agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu, kao što je agens koji alkiluje DNK ili agens koji interkalira DNK, ili drugi agens koji oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je agens odabran iz grupe navedene u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin.
[0049] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuju detektabilni fragment. U nekim primerima izvođenja, detektabilni fragment je dijagnostički agens.
[0050] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira mogu da budu konstruisani tako da uključuju jednu ili više disulfidnih veza.
2
[0051] Otkriće takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde opisano multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, kao i vektore koji sadrže ove izolovane sekvence nukleinske kiseline. Otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju multispecifičnog antitela uzgajanjem ćelije pod uslovima koji vode ekspresiji antitela, pri čemu ćelija sadrži takav molekul nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži takav vektor.
[0052] Otkriće takođe obezbeđuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju, koje uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje prvi ciljni molekul ili prvi epitop, i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul ili drugi epitop, pri čemu je najmanje AB1 kuplovan ili drugačije vezan za maskirajući fragment (MM1), tako da kuplovanje sa MM1 redukuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM1 je kuplovan sa AB1 preko sekvence prvog fragmenta koji može da se otcepi (CM1), koja uključuje supstrat za proteazu, na primer, proteazu koja je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulom AB1 na mestu lečenja ili dijagnostičkom mestu kod subjekta. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde obezbeđena su stabilna u cirkulaciji, aktiviraju se na predviđenim mestima terapije i/ili dijagnostike, ali ne i u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada se aktiviraju, ispoljavaju vezivanje za ciljni molekul AB1 koje je najmanje uporedivo sa vezivanjem odgovarajućeg, nemodifikovanog multispecifičnog antitela.
[0053] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži povezujući peptid između MM1 i CM1.
[0054] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži povezujući peptid između CM1 i AB1.
[0055] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i najmanje deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima strukturni raspored od N-kraja ka C-kraja kao što sledi u neotcepljenom stanju: MM1-LP1-CM1-LP2-AB1 ili AB1-LP2-CM1-LP1-MM1. U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida ne moraju da budu međusobno identična.
[0056] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedno od LP1 ili LP2 uključuje aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 18) i (GGGS)n(SEQ ID NO: 19), gde je n ceo broj od najmanje jedan. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedno od LP1 ili LP2 uključuje aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGSG (SEQ ID NO: 20), GGSGG (SEQ ID NO: 21), GSGSG (SEQ ID NO: 22), GSGGG (SEQ ID NO: 23), GGGSG (SEQ ID NO: 24), i GSSSG (SEQ ID NO: 25).
[0057] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji specifično vezuje prvi ciljni molekul ili prvi epitop, i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji specifično vezuje drugi ciljni molekul ili drugi epitop. U nekim primerima izvođenja, svaki od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od monoklonskog antitela, domenskog antitela, jednolančanog antitela, Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta, scFv, scAb, dAb, jednodomenskog antitela sa teškim lancem, i jednodomenskog antitela sa lakim lancem. U nekim primerima izvođenja, svaki od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je glodarsko (npr., mišje ili pacovsko), himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0058] U nekim primerima izvođenja, svaki od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima ravnotežnu konstantu disocijacije od oko 100 nM ili manje za vezivanje za odgovarajući ciljni molekul ili epitop.
[0059] U nekim primerima izvođenja MM1 ima ravnotežnu konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajući AB koja je veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop.
[0060] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima ravnotežnu konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajući AB koja nije veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop.
[0061] U nekim primerima izvođenja, MM1 ne interferira ili kompetira sa odgovarajućim AB za vezivanje za odgovarajući ciljni molekul ili epitop kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju.
[0062] U nekim primerima izvođenja, MM1 je polipeptid dužine oko 2 do 40 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dužine ne veće od 40 aminokiselina.
[0063] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja je drugačija od sekvence ciljnog molekula odgovarajućeg AB.
[0064] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja nije više od 50% identična nijednom prirodnom vezujućem partneru odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja nije više od 25% identična nijednom prirodnom vezujućem partneru odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, MM1 ima
2
polipeptidnu sekvencu koja nije više od 10% identična nijednom prirodnom vezujućem partneru odgovarajućeg AB.
[0065] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa MM1 redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada je kuplovan sa MM1, najmanje 20 puta veća od Kdza vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada nije kuplovan sa MM1.
[0066] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa MM1 redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada je kuplovan sa MM1, najmanje 40 puta veća od Kdza vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada nije kuplovan sa MM1.
[0067] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa MM1 redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada je kuplovan sa MM1, najmanje 100 puta veća od Kdza vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada nije kuplovan sa MM1.
[0068] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa MM1 redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada je kuplovan sa MM1, najmanje 1000 puta veća od Kdza vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada nije kuplovan sa MM1.
[0069] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja odgovarajućeg AB za njegov ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada je kuplovan sa MM1, najmanje 10 000 puta veća od Kdza vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop, kada nije kuplovan sa MM1.
[0070] U nekim primerima izvođenja, MM1 je aminokiselinska sekvenca odabrana od MM prikazanih u primerima koji su ovde obezbeđeni.
[0071] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje drugi maskirajući fragment (MM2) koji inhibira vezivanje AB2 za svoj ciljni molekul kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, i drugi fragment koji može da se otcepi (CM2) kuplovan sa AB2, pri čemu je CM2 polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za drugu proteazu. U nekim primerima izvođenja, CM2 je polipeptid dužine ne veće od 15 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, druga proteaza je ko-lokalizovana sa drugim ciljnim molekulom ili epitopom u tkivu, i pri čemu druga proteaza otcepljuje CM2 u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo drugoj proteazi. U nekim primerima izvođenja, prva
2
proteaza i druga proteaza su ko-lokalizovane sa prvim ciljnim molekulom ili epitopom i drugim ciljnim molekulom ili epitopom u tkivu. U nekim primerima izvođenja, prva proteaza i druga proteaza su ista proteaza. U nekim primerima izvođenja, CM1 i CM2 su različiti supstrati za istu proteazu. U nekim primerima izvođenja, proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, prva proteaza i druga proteaza su različite proteaze. U nekim primerima izvođenja, prva proteaza i druga proteaza su različite proteaze izabrane iz grupe koja se sastoji od proteaza prikazanih u tabeli 3.
[0072] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, npr., MM1 i najmanje MM2, ima ravnotežnu konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajući AB koja je veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop.
[0073] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima ravnotežnu konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajući AB koja nije veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje AB za odgovarajući ciljni molekul ili epitop.
[0074] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ne interferira ili kompetira sa odgovarajućim AB za vezivanje za odgovarajući ciljni molekul ili epitop kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju.
[0075] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dužine od oko 2 do 40 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dužine ne veće od 40 aminokiselina.
[0076] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja je drugačija od sekvence ciljnog molekula odgovarajućeg AB.
[0077] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja nije više od 50% identična bilo kom prirodnom vezujućem partneru odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja nije više od 25% identična bilo kom prirodnom vezujućem partneru odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja nije više od 10% identična bilo kom prirodnom vezujućem partneru odgovarajućeg AB.
2
[0078] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa svakim od MM redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada je kuplovan sa MM, najmanje 20 puta veća od Kdza vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada nije kuplovan sa MM.
[0079] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa svakim od MM redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada je kuplovan sa MM, najmanje 40 puta veća od Kdza vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada nije kuplovan sa MM.
[0080] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa svakim od MM redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada je kuplovan sa MM, najmanje 100 puta veća od Kdza vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada nije kuplovan sa MM.
[0081] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa svakim od MM redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada je kuplovan sa MM, najmanje 1000 puta veća od Kdza vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada nije kuplovan sa MM.
[0082] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje sa svakim od MM redukuje sposobnost odgovarajućeg AB da veže svoj ciljni molekul ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada je kuplovan sa MM, najmanje 10 000 puta veća od Kdza vezivanje AB sa odgovarajućim ciljnim molekulom ili epitopom, kada nije kuplovan sa MM.
[0083] U nekim primerima izvođenja, svaki od MM je aminokiselinska sekvenca odabrana od MM prikazanih u primerima koji su ovde dati.
[0084] U nekim primerima izvođenja, proteaza koja cepa sekvencu prvog fragmenta koji može da se otcepi (CM1) je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulom AB1 u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira u tkivu, i proteaza otcepljuje CM1 u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi.
[0085] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje više od jedne sekvence fragmenta koji može da se otcepi, i proteaza koja otcepljuje sekvencu najmanje jednog fragmenta koji može da se otcepi je ko-lokalizovana sa ciljnim
2
molekulom najmanje jednog od AB regiona u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira u tkivu, i proteaza otcepljuje CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi.
[0086] U nekim primerima izvođenja, svaki CM, npr., CM1 i najmanje CM2, je postavljen u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da je u neotcepljenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za ciljni molekul jednog od regiona AB redukovano tako da se odvija sa ravnotežnom konstantom disocijacije koja je najmanje 20 puta veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje nemodifikovanog AB za njegov ciljni molekul, i dok je u otcepljenom stanju, AB vezuje svoj ciljni molekul.
[0087] U nekim primerima izvođenja, svaki CM je postavljen u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da je u neotcepljenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za ciljni molekul jednog od regiona AB redukovano tako da se odvija sa ravnotežnom konstantom disocijacije koja je najmanje 40 puta veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje nemodifikovanog AB za njegov ciljni molekul, i dok je u otcepljenom stanju, AB vezuje svoj ciljni molekul.
[0088] U nekim primerima izvođenja, svaki CM je postavljen u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da je u neotcepljenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za ciljni molekul jednog od regiona AB redukovano tako da se odvija sa ravnotežnom konstantom disocijacije koja je najmanje 50 puta veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje nemodifikovanog AB za njegov ciljni molekul, i dok je u otcepljenom stanju, AB vezuje svoj ciljni molekul.
[0089] U nekim primerima izvođenja, svaki CM je postavljen u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da je u neotcepljenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za ciljni molekul jednog od regiona AB redukovano tako da se odvija sa ravnotežnom konstantom disocijacije koja je najmanje 100 puta veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje nemodifikovanog AB za njegov ciljni molekul, i dok je u otcepljenom stanju, AB vezuje svoj ciljni molekul.
[0090] U nekim primerima izvođenja, svaki CM je postavljen u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da je u neotcepljenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za ciljni molekul jednog od regiona AB redukovano tako da se odvija sa ravnotežnom konstantom disocijacije koja je najmanje 200 puta veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje nemodifikovanog AB za njegov ciljni molekul, i dok je u otcepljenom stanju, AB vezuje svoj ciljni molekul.
2
[0091] U nekim primerima izvođenja, svaki CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dužine do 15 aminokiselina.
[0092] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26). U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan fragment koji može da se otcepi je odabran za upotrebu sa specifičnom proteazom, na primer proteazom za koju se zna da je ko-lokalizovana sa najmanje jednim ciljnim molekulom multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Na primer, pogodni fragmenti koji mogu da se otcepe za upotrebu u multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću se otcepljuju najmanje proteazom kao što je urokinaza, legumain, i/ili matriptaza (ovde označena i kao MT-SP1 ili MTSP1). U nekim primerima izvođenja, pogodan fragment koji može da se otcepi uključuje najmanje jednu od sledećih sekvenci: TGRGPSWV (SEQ ID NO: 27); SARGPSRW (SEQ ID NO: 28); TARGPSFK (SEQ ID NO: 29); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 30); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 31); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 32); AARGPAIH (SEQ ID NO: 33); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 34); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 35); RGPATPIM (SEQ ID NO: 36); RGPA (SEQ ID NO: 37); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 38); FPRPLGITGL (SEQ TD NO: 39); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 40); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 41); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 42); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 43); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 44); i/ili PLGL (SEQ ID NO: 45).
[0093] U nekim primerima izvođenja, svaki CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je supstrat za proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od uPA, legumaina, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, neutrofilne elastaze, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13, i MMP-14. U nekim primerima izvođenja, proteaza je katepsin, kao što je, ali bez ograničenja, katepsin S. U nekim primerima izvođenja, svaki CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je supstrat za proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od uPA (urokinazni aktivator plazminogena), legumaina i MT-SP1 (matriptaza). U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži uPA. U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži legumain. U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži MT-SP1. U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži matriksnu metaloproteinazu (MMP).
[0094] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je supstrat za najmanje dve proteaze. U nekim primerima izvođenja, svaka proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je supstrat za najmanje dve proteaze, pri čemu je jedna od proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od uPA, legumaina i MT-SP1, a druga proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je supstrat za najmanje dve proteaze izabrane iz grupe koja se sastoji od uPA, legumaina i MT-SP1.
[0095] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvi CM (CM1) i drugi CM (CM2). U nekim primerima izvođenja, CM1 i CM2 su deo jednog linkera koji može da se otcepi koji spaja MM sa AB. U nekim primerima izvođenja, CM1 je deo linkera koji može da se otcepi koji spaja MM1 sa AB1, i CM2 je deo posebnog linkera koji može da se otcepi koji spaja MM2 sa AB2. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži više od dva CM. U nekim primerima izvođenja, takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži više od dva CM i više od dva MM. U nekim primerima izvođenja, svaki od CM1 i CM2 je polipeptid dužine ne veće od 15 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od prvog CM i drugog CM je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od onih koje su navedene u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od prvog CM i drugog CM je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od uPA, legumaina, i MT-SP1. U nekim primerima izvođenja, prvi CM se otcepljuje prvim agensom za otcepljivanje izabranim iz grupe koja se sastoji od uPA, legumaina, i MT-SP1 u ciljnom tkivu, a drugi CM se otcepljuje drugim agensom za otcepljivanje u ciljnom tkivu. U nekim primerima izvođenja, druga proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za otcepljivanje i drugi agens za otcepljivanje su ista proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od onih koje su navedene u tabeli 3, i prvi CM i drugi CM su različiti supstrati za enzim. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za otcepljivanje i drugi agens za otcepljivanje su ista proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od uPA, legumaina, i MT-SP1, i prvi CM i drugi CM su različiti supstrati za enzim. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za otcepljivanje i drugi agens za otcepljivanje su ista proteaza odabrana iz grupe navedene u tabeli 3, i prvi CM i drugi CM su isti supstrat. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za otcepljivanje i drugi agens za otcepljivanje su različite proteaze. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za otcepljivanje i drugi agens za otcepljivanje su različite proteaze izabrane iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za otcepljivanje i drugi agens za otcepljivanje su ko-lokalizovani u ciljnom tkivu. U nekim primerima izvođenja, prvi CM i drugi CM se otcepljuju najmanje jednim agensom za otcepljivanje u ciljnom tkivu.
1
[0096] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je izloženo proteazi i cepa se proteazom tako da, u aktiviranom ili otcepljenom stanju, aktivirano multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja uključuje najmanje deo sekvence LP2 i/ili CM nakon što je proteaza otcepila CM.
[0097] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje signalni peptid. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je konjugovan sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira preko spejsera. U nekim primerima izvođenja, spejser je konjugovan sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira u odsustvu signalnog peptida. U nekim primerima izvođenja, spejser je spojen direktno sa najmanje jednim od MM multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
[0098] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju sadrži spejser koji je spojen direktno sa prvim MM i ima strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju spejser-MM1-CM-AB1. U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSGQ (SEQ ID NO: 46).
[0099] U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je duži od onog kod odgovarajućeg multispecifičnog antitela; npr., pK multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prevazilazi pK odgovarajućeg multispecifičnog antitela. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je sličan onom kod odgovarajućeg multispecifičnog antitela. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 15 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 12 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 11 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 10 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 9 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 8 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 7 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 6 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 5 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima
2
izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 4 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 3 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 2 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 24 časa kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 20 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 18 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 16 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 14 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 12 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 10 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 8 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 6 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 4 časa kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 3 časa kada se primeni u organizmu.
[0100] Otkriće obezbeđuje i kompozicije i postupke koji uključuju multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji specifično vezuje ciljni molekul i drugo antitelo ili fragment antitela (AB2), gde je najmanje prvi AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovan sa maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, svaki AB je kuplovan sa MM koji smanjuje sposobnost vezivanja odgovarajućeg AB za svaki ciljni molekul. Na primer, u primerima izvođenja bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, AB1 je kuplovan sa prvim maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov ciljni molekul, i AB2 je kuplovan sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za njegov ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži više od dva AB regiona; u takvim primerima izvođenja, AB1 je kuplovan sa prvim maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov ciljni molekul, AB2 je kuplovan sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za njegov ciljni molekul, AB3 je kuplovan sa trećim maskirajućim fragmentom (MM3) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB3 za njegov ciljni molekul, i tako za svaki AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira.
[0101] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira dalje uključuje najmanje jedan fragment koji može da se otcepi (CM) koji je supstrat za proteazu, gde CM povezuje MM za AB. Na primer, u nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji specifično vezuje ciljni molekul i drugo antitelo ili fragment antitela (AB2), gde je najmanje prvi AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovan preko prvog fragmenta koji može da se otcepi (CM1) sa maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, AB1 je kuplovan preko CM1 sa MM1, i AB2 je kuplovan preko drugog fragmenta koji može da se otcepi (CM2) sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za njegov ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži više od dva AB regiona; u nekim od ovih primera izvođenja, AB1 je kuplovan preko CM1 sa MM1, AB2 je kuplovan preko CM2 sa MM2, i AB3 je kuplovan preko trećeg fragmenta koji može da se otcepi (CM3) sa trećim maskirajućim fragmentom (MM3) koji smanjuje sposobnost vezivanja AB3 za njegov ciljni molekul, i tako za svaki AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira.
[0102] Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni omogućavaju vezivanje jednog ili više agenasa sa jednom ili više cisteinskih rezidua u bilo kom od regiona AB bez narušavanja aktivnosti (npr., aktivnosti maskiranja, aktiviranja ili vezivanja) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, kompozicije i postupci koji su ovde dati omogućavaju vezivanje jednog ili više agenasa sa jednom ili više cisteinskih rezidua u bilo kom od regiona AB bez redukovanja ili drugačijeg narušavanja jedne ili više disulfidnih veza u bilo kom od MM. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni proizvode multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje je konjugovano sa jednim ili više agenasa, npr., bilo kojim od mnogih terapijskih, dijagnostičkih i/ili profilaktičkih agenasa, a da poželjno nijedan od agenasa nije konjugovan sa bilo kojim od MM multispecifičnog antitela koje može da se
4
aktivira. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni proizvode konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima svaki od MM zadržava sposobnost da efektivno i efikasno maskira odgovarajući AB multispecifičnog antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni proizvode konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je antitelo koje može da se aktivira i dalje aktivirano, tj., otcepljeno, u prisustvu proteaze koja može da otcepi CM.
[0103] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju imaju najmanje jednu tačku konjugacije za agens, ali u ovde datim postupcima i kompozicijama, za konjugaciju sa agensom je dostupno manje od svih mogućih tačaka konjugacije. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančane disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančane sulfidne veze, ali ne i atomi sumpora uključeni u unutarlančane disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora cisteina ili drugih aminokiselinskih rezidua koje sadrže atom sumpora. Takve rezidue mogu da se jave prirodno u strukturi antitela ili mogu da budu ugrađene u antitelo mesto-specifičnom mutagenezom, hemijskom konverzijom, ili nepodudarnom ugradnjom neprirodnih aminokiselina.
[0104] Obezbeđeni su i postupci za pripremu konjugata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje ima jednu ili više međulančanih disulfidnih veza u jednom ili više AB i jednu ili više unutarlančanih disulfidnih veza u odgovarajućem MM, i obezbeđen je lek koji reaguje sa slobodnim tiolima. Postupak uopšteno uključuje delimičnu redukciju međulančanih disulfidnih veza u antitelu koje može da se aktivira pomoću redukcionog agensa, kao što je, na primer, TCEP; i konjugaciju leka koji reaguje sa slobodnim tiolima sa delimično redukovanim antitelom koje može da se aktivira. Kako se ovde koristi, termin delimična redukcija odnosi se na situacije u kojima se multispecifično antitelo koje može da se aktivira dovodi u kontakt sa redukcionim agensom, i redukuju se manje od svih disulfidnih veza, npr., manje od svih mogućih mesta konjugacije. U nekim primerima izvođenja, manje od 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, ili manje od 5% svih mogućih mesta konjugacije se redukuje.
[0105] U drugim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za redukciju i konjugaciju agensa, npr., leka, sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira, koji rezultuje selektivnošću u razmeštanju agensa. Postupak uopšteno uključuje delimičnu redukciju multispecifičnog antitela koje može da se aktivira redukcionim agensom, tako da nijedno od konjugacionih mesta u maskirajućim fragmentima ili drugom delu antitela koje može da se aktivira, koji nije AB, nije redukovano, i konjugaciju agensa sa međulančanim tiolima u jednom ili više AB regiona multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Konjugaciono mesto/mesta su odabrana tako da omoguće željeno razmeštanje agensa, kako bi se omogućilo da se konjugacija odvija na željenom mestu. Redukcioni agens je, na primer, TCEP. Uslovi redukcione reakcije kao što su, na primer, odnos redukcionog agensa prema antitelu koje može da se aktivira, dužina inkubacije, temperatura tokom inkubacije, pH rastvora redukcione reakcije, itd., određuju se identifikovanjem uslova koji proizvode konjugovano antitelo koje može da se aktivira u kome MM zadržava sposobnost da efektivno i efikasno maskira AB antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju. Odnos redukcionog agensa prema multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira variraće u zavisnosti od antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, odnos redukcionog agensa prema multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira biće u opsegu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1.5, od oko 10:1 do 1:1.5, od oko 9:1 do 1:1.5, od oko 8:1 do 1:1.5, od oko 7:1 do 1:1.5, od oko 6:1 do 1:1.5, od oko 5:1 do 1:1.5, od oko 4:1 do 1:1.5, od oko 3:1 do 1:1.5, od oko 2:1 do 1:1.5, od oko 1.5:1 do 1:1.5, ili od oko 1:1 do 1:1.5. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 2.5:1 do 1:1.
[0106] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za redukciju međulančanih disulfidnih veza u jednom ili više AB regiona multispecifičnog antitela koje može da se aktivira i konjugaciju agensa, npr., agensa koji sadrži tiol, kao što je lek, sa rezultujućim međulančanim tiolima za selektivno smeštanje agensa/agenasa u AB. Postupak uopšteno uključuje delimičnu redukciju jednog ili više AB regiona redukcionim agensom, da bi se formirala najmanje dva međulančana tiola bez formiranja svih mogućih međulančanih tiola u antitelu koje može da se aktivira; i konjugaciju agensa sa međulančanim tiolima delimično redukovanog AB. Na primer, jedan ili više AB regiona multispecifičnog antitela koje može da se aktivira se delimično redukuje oko 1 čas na oko 37°C pri željenom odnosu redukcioni agens: antitelo koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, odnos redukcionog agensa prema antitelu koje može da se aktivira biće u opsegu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1.5, od oko 10:1 do 1:1.5, od oko 9:1 do 1:1.5, od oko 8:1 do 1:1.5, od oko 7:1 do 1:1.5, od oko 6:1 do 1:1.5, od oko 5:1 do 1:1.5, od oko 4:1 do 1:1.5, od oko 3:1 do 1:1.5, od oko 2:1 do 1:1.5, od oko 1.5:1 do 1:1.5, ili od oko 1:1 do 1:1.5. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 2.5:1 do 1:1.
[0107] Reagens koji sadrži tiol može da bude, na primer, cistein ili N-acetil cistein. Redukcioni agens može da bude, na primer, TCEP. U nekim primerima izvođenja, redukovano antitelo koje može da se aktivira može da bude prečišćeno pre konjugacije, upotrebom na primer, hromatografije na koloni, dijalize, ili dijafiltracije. Alternativno, redukovano antitelo se ne prečišćava posle delimične redukcije i pre konjugacije.
[0108] Otkriće obezbeđuje i delimično redukovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je najmanje jedna međulančana disulfidna veza u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira redukovana redukcionim agensom bez narušavanja bilo kojih unutarlančanih disulfidnih veza u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, pri čemu multispecifičnom antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za ciljni molekul, prvi maskirajući fragment (MM1) koji inhibira vezivanje AB1 multispecifičnog antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju za ciljni molekul, prvi fragment koji može da se otcepi (CM1) kuplovan sa AB1, gde je CM1 polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu, i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se specifično vezuje za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM1 je kuplovan sa AB1 preko CM1. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više unutarlančanih disulfidnih veza multispecifičnog antitela koje može da se aktivira nije poremećena redukcionim agensom. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više unutarlančanih disulfidnih veza MM1 u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira nije poremećena redukcionim agensom. U nekim primerima izvođenja, redukcioni agens je TCEP.
[0109] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom dokumentu koriste se zajedno sa jednim ili više dodatnih agenasa ili kombinacijom dodatnih agenasa. Pogodni dodatni agensi uključuju aktuelne farmaceutske i/ili hirurške terapije za predviđenu primenu, kao što je, na primer, terapija kancera. Na primer, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste zajedno sa dodatnim hemoterapijskim ili antineoplastičnim agensom.
[0110] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens su formulisani u jednoj terapijskoj kompoziciji, i multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens se primenjuju istovremeno. Alternativno, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens su međusobno razdvojeni, npr., svaki je formulisan u posebnoj terapijskoj kompoziciji, i multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens se primenjuju istovremeno, ili se multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju u različitim vremenskim trenucima tokom režima lečenja. Na primer, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira se primenjuju pre primene dodatnog agensa, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira se primenjuju nakon primene dodatnog agensa, ili se multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju naizmenično. Kako je ovde opisano, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens se primenjuju u pojedinačnim dozama ili u višestrukim dozama.
[0111] Otkriće obezbeđuje i izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde opisano multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, kao i vektore koji uključuju ove izolovane sekvence nukleinske kiseline. Otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira uzgajanjem ćelije pod uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži takav molekul nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži takav vektor.
[0112] Otkriće obezbeđuje i postupak za proizvodnju multispecifičnih antitela prema otkriću i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću (a) uzgajanjem ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji kodira multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, i (b) izdvajanjem multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
[0113] Predmetno otkriće obezbeđuje i postupke za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije ili drugačije ublažavanje simptoma jedne ili više patologija ili ublažavanje simptoma povezanog sa takvim patologijama, primenom multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema otkriću kod subjekta kod koga je takvo lečenje ili prevencija poželjna. Subjekat koji treba da se leči je, npr., čovek ili drugi sisar. U nekim primerima izvođenja, subjekat je sisar izuzev čoveka, kao što je primat izuzev čoveka, životinja pratilac (npr., mačka, pas, konj), životinja sa farme, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekat je glodar.
[0114] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za indukciju aktivacije T-ćelija zavisne od ciljnog molekula i lizu ciljnih ćelija primenom multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema otkriću kod subjekta kod koga je takva indukcija poželjna, pri čemu, kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju, npr., nijedan maskirajući fragment u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira nije više vezan ili drugačije udružen sa odgovarajućim domenom AB, dolazi do aktivacije T-ćelija zavisne od ciljnog molekula i lize ciljnih ćelija, a kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, npr. najmanje jedan maskirajući fragment multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je vezan ili drugačije udružen sa odgovarajućim domenom AB, aktivacija T-ćelija zavisna od ciljnog molekula i liza ciljnih ćelija su redukovane ili drugačije inhibirane. Bilo koje od ovde opisanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju je pogodno za upotrebu u takvim postupcima. Subjekat koji treba da se leči je, npr., čovek ili drugi sisar. U nekim primerima izvođenja, subjekat je sisar izuzev čoveka, kao što je primat izuzev čoveka, životinja pratilac (npr., mačka, pas, konj), životinja sa farme, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekat je glodar.
[0115] Multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, upotrebljeni u bilo kom primeru izvođenja ovih postupaka i upotreba, mogu da se primene u bilo kom stadijumu bolesti i/ili u bilo kom stadijumu u kome su aktivacija T-ćelija zavisna od ciljnog molekula i liza ciljnih ćelija poželjne. Na primer, takvo multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira mogu da se primene kod pacijenta koji pati od kancera bilo kog stadijuma, od ranog do metastatskog. Termini subjekat i pacijent se ovde koriste kao sinonimi. Multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, upotrebljeni u bilo kom od primera izvođenja ovih postupaka i upotreba, mogu da se upotrebe u režimu lečenja koji obuhvata terapiju neoadjuvansom. Multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, upotrebljeni u bilo kom od primera izvođenja ovih postupaka i upotreba, mogu da se primene ili samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih agenasa, uključujući inhibitore sa malim molekulom, druge terapije koje se zasnivaju na antitelima, terapije koje se zasnivaju na polipeptidima ili peptidima, terapije koje se zasnivaju na nukleinskim kiselinama i/ili druge biološke agense.
[0116] Otkriće takođe obezbeđuje postupke i komplete za upotrebu multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju u brojnim dijagnostičkim i/ili profilaktičkim indikacijama. Na primer, otkriće obezbeđuje postupke i komplete za detektovanje prisustva ili odsustva agensa za otcepljivanje i ciljnog molekula od interesa kod subjekta ili u uzorku (i) dovođenjem u kontakt subjekta ili uzorka sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje najmanje prvi maskirajući fragment (MM1), prvi fragment koji može da se otcepi (CM1) koji se otcepljuje pomoću agensa za otcepljivanje, i najmanje prvi antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB1) koji specifično vezuje ciljni molekul od interesa i drugi antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB2) koji specifično vezuje drugi ciljni molekul i/ili drugi epitop, (a) pri čemu je MM1 peptid koji inhibira vezivanje AB1 za ciljni molekul, i pri čemu MM1 nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB1 i nije modifikovani oblik prirodnog vezujućeg partnera AB1; i (b) gde, u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, MM1 interferira sa specifičnim vezivanjem AB1 sa ciljnim molekulom, a u otcepljenom, aktiviranom stanju MM1 ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB1 sa ciljnim molekulom; i (ii) merenjem nivoa aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku, pri čemu detektabilan nivo aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da su agens za otcepljivanje i ciljni molekul prisutni kod subjekta ili u uzorku, i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da su agens za otcepljivanje, ciljni molekul, ili oba, i agens za otcepljivanje i ciljni molekul odsutni i/ili nisu prisutni u dovoljnoj meri kod subjekta ili u uzorku.
[0117] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB1. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa multispecifičnog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku se ostvaruje upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano multispecifično antitelo koje može da se aktivira, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0118] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja ovih
4
postupaka i kompleta, detektabilna oznaka uključuje agens za snimanje, kontrastni agens, enzim, fluorescentnu oznaku, hromofor, boju, jedan ili više metalnih jona ili oznaku na bazi liganda. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, agens za snimanje obuhvata radioizotop. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, radioizotop je indijum ili tehnecijum. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, kontrastni agens obuhvata jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, enzim obuhvata peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu ili β-galaktozidazu. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, fluorescentna oznaka obuhvata žuti fluorescentni protein (YFP), cijan fluorescentni protein (CFP), zeleni fluorescentni protein (GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (mRFP), tdimer2 crvenog fluorescentnog proteina (RFP tdimer2), HCRED, ili derivat evropijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, luminescentna oznaka obuhvata derivat N-metilakridijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, oznaka obuhvata oznaku Alexa Floor<®>, kao što je Alex Fluor<®>680 ili Alexa Fluor<®>750. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, oznaka na bazi liganda obuhvata biotin, avidin, streptavidin ili jedan ili više haptena.
[0119] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, subjekat je sisar. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, subjekat je čovek. U nekim primerima izvođenja subjekat je sisar izuzev čoveka, primat izuzev čoveka, životinja pratilac (npr., mačka, pas, konj), životinja sa farme, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekat je glodar.
[0120] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in situ postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je ex vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vitro postupak.
[0121] U nekim primerima izvođenja postupaka i kompleta, postupak ili komplet se koristi kako bi se identifikovala ili drugačije odredila populacija pacijenata pogodna za lečenje multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira prema otkriću. Na primer, pacijenti čiji su rezultati ispitivanja pozitivni i za ciljni molekul i za proteazu koja cepa supstrat u prvom fragmentu koji može da se otcepi (CM1) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ispitivani u ovim postupcima, identifikovani su kao pogodni kandidati za lečenje takvim multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM1. Slično tome, pacijenti čiji su rezultati ispitivanja negativni i za ciljni molekul i za proteazu koja cepa supstrat u prvom fragmentu koji može da se otcepi (CM1) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ispitivani u ovim postupcima, identifikovani su kao pogodni kandidati za lečenje drugim oblikom terapije.
[0122] U nekim primerima izvođenja, postupak ili komplet se koristi kako bi se identifikovala ili drugačije odredila populacija pacijenata pogodna za lečenje multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira i/ili konjugovanim multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira (npr., multispecifično antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens) prema otkriću, što je praćeno lečenjem primenom tog multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira kod subjekta kome je to potrebno. Na primer, pacijenti čiji su rezultati ispitivanja pozitivni i za ciljni molekul i za proteazu koja cepa supstrat u prvom fragmentu koji može da se otcepi (CM1) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ispitivani u ovim postupcima su identifikovani kao pogodni kandidati za lečenje multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM1 i/ili konjugovanim multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM1, i pacijentu se zatim daje terapijski efikasna količina multispecifičnog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje je ispitivano. Slično tome, pacijenti čiji su rezultati ispitivanja negativni za bilo koji, ili za oba elementa od ciljnog molekula i proteaze koja cepa supstrat u CM1 u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira i/ili konjugovanom multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ispitivani upotrebom ovih postupaka mogu da budu identifikovani kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije.
[0123] U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu da budu ispitivani pomoću drugih multispecifičnih antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju dok se ne identifikuje multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje, npr., multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu. U nekim primerima izvođenja, pacijentu se tada daje terapijski efikasna količina multispecifičnog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent pokazao pozitivan rezultat.
[0124] Farmaceutske kompozicije prema otkriću mogu da uključuju multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prema otkriću i nosač. Ove farmaceutske kompozicije mogu da budu uključene u komplete, kao što su, na primer, dijagnostički kompleti.
[0125] Stručnjak u ovoj oblasti će shvatiti da antitela prema otkriću imaju brojne upotrebe. Na primer, proteini prema otkriću se koriste kao terapijski agensi za razne poremećaje. Antitela prema otkriću se takođe koriste kao reagensi u dijagnostičkim kompletima ili kao dijagnostička sredstva, ili ova antitela mogu da se upotrebe u testovima kompeticije za generisanje terapijskih reagenasa.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0126]
Slika 1 predstavlja ilustraciju koja prikazuje različite formate bispecifičnog antitela (prilagođeno iz Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010).
Slike 2A-2C predstavljaju seriju ilustracija koja prikazuje različite formate multispecifičnih antitela pogodne za upotrebu u kompozicijama i postupcima prema otkriću. U bispecifičnom antitelu, scFv može da bude fuzionisan za karboksilni kraj teškog lanca (Hc) IgG antitela (slika 2A); za karboksilni kraj lakog lanca (Lc) (slika 2B); ili za karboksilni kraj oba, i teškog i lakog lanca (slika 2C). Slika 2D je dijagram pojedinačnog genetičkog konstrukta za ekspresiju fuzija multispecifičnog antitela. Slika 3A predstavlja seriju ilustracija koja prikazuje različite formate multispecifičnog antitela koje može da se aktivira pogodne za upotrebu u kompozicijama i postupcima prema otkriću. Slika 3B je dijagram genetičkog konstrukta za ekspresiju fuzija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
Slika 4, paneli A-J predstavljaju seriju šematskih dijagrama odabranog seta mogućih permutacija multispecifičnih antitela prema otkriću. Sivo osenčeni pravougaonici obuhvataju konfiguracije prikazane na slici 2 i ovde su uključeni zbog celovitosti i poređenja.
Slika 5, paneli A-J predstavljaju seriju šematskih dijagrama odabranog seta mogućih permutacija multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću. Sivo osenčeni pravougaonici obuhvataju konfiguracije prikazane na slici 3 i ovde su uključeni zbog celovitosti i poređenja. Konkretno, ova slika prikazuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je primarno antigen-vezujuće mesto maskirano (tj., može da se aktivira) a dodatni antigen-vezujući domen/domeni nisu maskirani.
Slika 6, paneli A-J predstavljaju seriju šematskih dijagrama niza multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima su svi antigen-vezujući domeni maskirani.
4
Slika 7. paneli A-J predstavljaju seriju šematskih dijagrama niza multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je sekundarni antigen-vezujući domen maskiran, a dodatni antigen-vezujući domen/domeni nisu maskirani.
Slika 8, paneli A-J predstavljaju seriju šematskih dijagrama niza multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je većina, ali nisu svi antigen-vezujući domeni maskirani i najmanje jedan dodatni antigen-vezujući domen/domeni nije maskiran.
Slika 9, paneli A-D predstavljaju seriju šematskih dijagrama niza multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima su primarni antigen-vezujući domen i drugi antigen-vezujući domen maskirani, a preostali antigen-vezujući domen/domeni nisu maskirani.
Slika 10 je fotografija koja prikazuje PAGE analizu multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju demonstrirajući molekulske težine teških lanaca fuzionisanih sa scFv, uzorci 1-8, u poređenju sa odgovarajućim monospecifičnim antitelima ili antitelima koja mogu da se aktiviraju, uzorci 9-11. Slika 11 je grafikon koji prikazuje sposobnost multispecifičnih antitela da se specifično vežu za svoje srodne antigene.
Slike 12A-12B su serija grafikona koji prikazuju sposobnost multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju scFv protiv humanog CTLA-4 da se specifično vežu za (A) mišji i (B) humani CTLA-4.
Slika 13 je grafikon koji prikazuje sposobnost multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže OKT3 ovde označenih kao anti-EGFR multispecifično antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5—OKT3 i multispecifično anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira 5342-1204-4D11v2—OKT3 da se specifično vežu za humani CD3ε u eksperimentima vezivanja na bazi ELISA testa.
Slika 14 je serija fotografija koje prikazuju PAGE analizu proizvoda digestije enzimom uPA demonstrirajući aktivaciju multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju bez otcepljivanja fuzija scFv i teškog lanca.
Slika 15 je serija grafikona koji prikazuju sposobnost aktiviranih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju da vežu različite ciljne molekule.
Slika 16A je grafikon koji prikazuje vezivanje multispecifičnih antitela prema otkriću za CD3ε-pozitivne T-ćelije Jurkat.
Slika 16B je grafikon koji prikazuje ko-vezivanje multispecifičnih antitela prema otkriću za CD3ε-pozitivne T-ćelije Jurkat i EGFR.
Slika 17 je serija grafikona koji prikazuju EGFR-zavisnu aktivaciju T-ćelija Jurkat multispecifičnim antitelima prema otkriću.
Slika 18A je grafikon koji prikazuje EGFR-zavisnu aktivaciju primarnih CD8<+>T-ćelija multispecifičnim antitelima prema otkriću.
Slika 18B je grafikon koji prikazuje EGFR-zavisnu lizu ciljnih ćelija multispecifičnim antitelima prema otkriću.
Slika 18C je serija grafikona koji prikazuju CD69 aktivaciju primarnih T-ćelija multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N u ćelijama SW480 koje eksprimiraju EGFR u poređenju sa minimalnom aktivacijom u EGFR-negativnim ćelijama U266. Slika 18D je serija grafikona koji prikazuju EGFR-zavisnu lizu ciljnih ćelija multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N ćelija SW480 koje eksprimiraju EGFR, u poređenju sa zanemarljivom lizom EGFR-negativnih ćelija U266.
Slika 19 je serija grafikona koji prikazuju lizu primarnih T-ćelija panela ćelijskih linija koje eksprimiraju EGFR multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N u poređenju sa odsustvom lize EGFR-negativne ćelijske linije U266.
Slika 20A i slika 20B predstavljaju seriju grafikona koji prikazuju sniženo vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N za ćelije koje eksprimiraju EGFR u poređenju sa vezivanjem EGFR multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N. Osim toga, slike 20A i 20B demonstriraju da proteazna aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N matriptazom (ovde označenom i kao MTSP1 ili MT-SP1) obnavlja vezivanje EGFR do nivoa ekvivalentnog onom koji ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N. Slike 20A i 20B takođe pokazuju da takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira i multispecifično antitelo vezuju EGFR na način sličan onom kod odgovarajućeg monospecifičnog antitela koje može da se aktivira i monospecifičnog antitela.
Slika 21A i slika 21B predstavljaju seriju grafikona koji prikazuju vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, i multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N za CD3ε-pozitivne T-ćelije Jurkat.
Slika 22 je grafikon koji prikazuje sniženu EGFR-zavisnu aktivacija T-ćelija Jurkat multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N u poređenju sa aktivacijom multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N. Osim
4
toga, slika demonstrira da proteazna aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N matriptazom obnavlja EGFR-zavisnu aktivaciju do nivoa ekvivalentnog onom koji ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N.
Slika 23A je grafikon koji prikazuje sniženu EGFR-zavisnu aktivacija primarnih CD8+ T-ćelija multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N u poređenju sa aktivacijom multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N. Osim toga, slika pokazuje da proteazna aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N matriptazom obnavlja EGFR-zavisnu aktivaciju do nivoa ekvivalentnog onom koji ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N.
Slika 23B je grafikon koji prikazuje sniženo EGFR-zavisnu lizu ciljnih ćelija multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N u poređenju sa lizom ćelija multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N. Osim toga, slika pokazuje da proteazna aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N matriptazom obnavlja EGFR-zavisnu lizu ciljnih ćelija do nivoa ekvivalentnog onom koji ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N.
DETALJAN OPIS
[0127] Predmetno otkriće obezbeđuje multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju. Kako se ovde koristi, multispecifično antitelo je antitelo koje prepoznaje dva ili više različitih antigena ili epitopa, a multispecifično antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje uključuje najmanje jedan maskirajući fragment (MM) vezan za najmanje jedan antigen- ili epitop-vezujući domen multispecifičnog antitela, tako da kuplovanje sa MM redukuje sposobnost antigen- ili epitop-vezujućeg domena da veže svoj ciljni molekul. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde obezbeđena su stabilna u cirkulaciji, aktiviraju se na mestima predviđenim za terapiju i/ili dijagnozu, ali ne i u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada su aktivirana ispoljavaju vezivanje za ciljni molekul koje je najmanje uporedivo sa vezivanjem odgovarajućeg, nemodifikovanog multispecifičnog antitela.
[0128] Neograničavajući primeri multispecifičnih antitela uključuju bispecifična antitela, trispecifična antitela, tetraspecifična antitela, i druga multispecifična antitela. Multispecifična antitela koja su ovde obezbeđena su takođe multivalentna; kako se ovde koristi, multivalentnost se odnosi na ukupan broj mesta za vezivanje na antitelu, bez obzira na to da li mesta vezivanja
4
prepoznaju isti ili različite antigene ili epitope. Neograničavajući primeri multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju bispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, trispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, tetraspecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, i druga multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja su ovde obezbeđena su takođe multivalentna.
[0129] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela ili njihovi fragmenti i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti su konstruisana da vezuju T-ćelije i/ili druge imunske efektorske ćelije. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti koji vezuju T-ćelije su ovde označeni i kao multispecifična antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju T-ćelije i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti koji vezuju T-ćelije. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti koji vezuju imunske efektorske ćelije su ovde označeni i kao multispecifična antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju imunske efektorske ćelije i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti koji vezuju imunske efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela ili njihovi fragmenti i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti su konstruisani da se vežu ili drugačije interaguju sa više od jednog ciljnog molekula i/ili više od jednog epitopa, ovde označena i kao antitela ili njihovi fragmenti usmereni na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti usmereni na više antigena.
[0130] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment uključuju IgG domen i scFv domen. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment uključuju varijabilni domen IgG i scFv domen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za površinski antigen T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta je specifičan za epitop ciljnog antigena, a drugi domen antitela je specifičan za drugi epitop istog ciljnog antigena.
[0131] Različiti primeri izvođenja multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovih fragmenata prema otkriću prikazani su na slikama 3A, i 5-9. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment, koji sadrže IgG imaju maskirane varijabilne domene IgG. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment, koji sadrže scFv, imaju maskirane scFv
4
domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment imaju i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od varijabilnih domena IgG kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment imaju i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment imaju i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od varijabilnih domena IgG kuplovan sa maskirajućim fragmentom i najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment imaju i varijabilne domene IgG i scFv domene, pri čemu je svaki od varijabilnih domena IgG i scFv domena kuplovan sa svojim sopstvenim maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ili njegovog fragmenta je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za površinski antigen T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ili njegovog fragmenta je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ili njegovog fragmenta je specifičan za epitop ciljnog antigena, a drugi domen antitela je specifičan za drugi epitop istog ciljnog antigena.
[0132] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela ili njihovi fragmenti prema otkriću uključuju najmanje (i) antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov fragment koji uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1), koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, koji predstavlja površinski antigen na T-ćeliji i (ii) drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2), koji vezuje drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, je vezano za N-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, je vezano za C-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, je vezano za N-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, je vezano za C-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo
4
sadrži antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente vezane za kombinaciju jednog ili više N-krajeva i/ili jednog ili više C-krajeva multispecifičnog antitela. Otkriće takođe uključuje multispecifična antitela koja sadrže antitelo, ili njegov fragment, koje vezuje druge imunske efektorske ćelije, kao ono, koje se vezuje sa površinskim antigenom ćelija prirodnih ubica (NK), mononuklearnih ćelija, kao što su mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija.
[0133] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću, uključuju najmanje dva antitela koja vezuju T-ćelije, ili njihove fragmente, koja vezuju jedan ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije, kao što su, na primer, scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, i dodatnu kombinaciju aktivirajućih receptora, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju dva antitela koja vezuju T-ćelije, ili njihove fragmente, koja vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju isti ciljni molekul za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite ciljne molekule za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite epitope na istom ciljnom molekulu za vezivanje T-ćelija.
[0134] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) prvu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje T-ćelije koji uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija i (ii) drugu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje ciljni molekul koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment uključuju (iii) najmanje treći antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje ciljni molekul koji uključuje treće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB3) koji vezuje treći ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, drugi i treći ili sledeći ciljni molekuli su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, drugi i treći ili sledeći ciljni molekuli su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, drugi i treći ili sledeći ciljni molekuli su različiti epitopi na istom antigenu.
4
[0135] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti prema otkriću uključuju najmanje (i) antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov fragment koji uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, koji predstavlja površinski antigen na T-ćeliji, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul i (ii) drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za N-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za C-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za N-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za C-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente vezane za kombinaciju jednog ili više N-krajeva i/ili jednog ili više C-krajeva multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Otkriće takođe uključuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže antitelo, ili njegov fragment, koji vezuje druge imunske efektorske ćelije, na primer vezivanjem sa površinskim antigenom ćelija prirodnih ubica (NK), mononuklearnih ćelija, kao što su mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija.
[0136] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente antitela koji vezuju jedan ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije, kao što su, na primer, scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, i dodatnu kombinaciju aktivirajućih receptora, pri čemu je AB1 jednog od fragmenata antitela koja vezuju T-ćelije vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov odgovarajući ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, i (ii) jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente, koji vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju isti ciljni molekul za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite ciljne molekule za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite epitope na istom ciljnom molekulu za vezivanje T-ćelija.
[0137] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente antitela, koji vezuju jedan ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije, kao što su, na primer, scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, i dodatnu kombinaciju aktivirajućih receptora, gde je svaki od AB1 fragmenata antitela koje vezuje T-ćelije vezan za sopstveni maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje svakog MM sa odgovarajućim AB1 redukuje sposobnost vezivanja AB1 za odgovarajući ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, i (ii) jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente, koji vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju isti ciljni molekul za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite ciljne molekule za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite epitope na istom ciljnom molekulu za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije umesto jednog ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije.
[0138] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) prvu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje T-ćelije koji uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, pri čemu je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul i (ii) drugu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje ciljni molekul koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji
1
vezuje drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije umesto jednog ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije.
[0139] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti prema otkriću uključuju najmanje (i) antitelo koje vezuje T-ćelije ili njegov fragment koji uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, koji je površinski antigen na T-ćeliji i (ii) drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost AB2 da veže drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za N-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za C-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za N-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za C-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži antitela koja vezuju T-ćelije, ili njihove fragmente, vezane za kombinaciju jednog ili više N-krajeva i/ili jednog ili više C-krajeva multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Otkriće takođe uključuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže antitelo, ili njegov fragment, koje vezuje druge imunske efektorske ćelije, na primer, ono koje vezuje površinski antigen ćelija prirodnih ubica (NK), mononuklearnih ćelija, kao što su mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija.
[0140] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente antitela koji vezuju jedan ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije, kao što su, na primer, scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, i dodatnu kombinaciju aktivirajućih receptora i (ii) jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul koje uključuje drugo
2
antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost AB2 da veže drugi ciljni molekul, pri čemu su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente koji vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju isti ciljni molekul za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite ciljne molekule za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite epitope na istom ciljnom molekulu za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije umesto jednog ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije.
[0141] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) prvu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje T-ćelije i (ii) drugu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje ciljni molekul koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije umesto jednog ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije.
[0142] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ili njihovi fragmenti prema otkriću uključuju najmanje (i) antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, koji uključuju prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, koji je površinski antigen na T-ćeliji, gde je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1), da kuplovanje sa MM1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul i (ii) drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul, U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za N-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za C-kraj teškog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za N-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov fragment, vezano je za C-kraj lakog lanca antitela specifičnog za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente vezane za kombinaciju jednog ili više N-krajeva i/ili jednog ili više C-krajeva multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Otkriće takođe uključuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže antitelo, ili njegov fragment, koje vezuje druge imunske efektorske ćelije, na primer, ono koje vezuje površinski antigen ćelija prirodnih ubica (NK), mononuklearnih ćelija, kao što je mijeloidna mononuklearna ćelija, makrofag, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija.
[0143] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente antitela koji vezuju jedan ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije, kao što su, na primer, scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, i dodatnu kombinaciju aktivirajućih receptora, pri čemu je AB1 jednog od fragmenata antitela koje vezuje T-ćelije vezan za maskirajući fragment (MM) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov odgovarajući ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, i (ii) jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul koje uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul, pri čemu su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente koji vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju isti ciljni molekul za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije
4
vezuju različite ciljne molekule za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite epitope na istom ciljnom molekulu za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije umesto jednog ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije.
[0144] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente antitela koji vezuju jedan ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije, kao što su, na primer, scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, OX40/GITR, CD137/GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, i dodatnu kombinaciju aktivirajućih receptora, pri čemu je svaki od AB1 fragmenata antitela koje vezuje T-ćelije vezan za sopstveni maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje svakog MM1 sa odgovarajućim AB1 redukuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov odgovarajući ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, i (ii) jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul, koje uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje sa MM2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul, pri čemu su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment prema otkriću uključuju dva antitela koja vezuju T-ćelije ili njihove fragmente koji vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije, i jedno antitelo koje vezuje ciljni molekul tako da su scFv fragmenti koji vezuju T-ćelije vezani za obe ručice antitela koje vezuje ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju isti ciljni molekul za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite ciljne molekule za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, dva fragmenta antitela koje vezuje T-ćelije vezuju različite epitope na istom ciljnom molekulu za vezivanje T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više receptora koji inhibiraju T-ćelije umesto jednog ili više receptora koji aktiviraju T-ćelije.
[0145] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov fragment prema otkriću uključuju najmanje (i) prvu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje T-ćelije koji uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, pri čemu je AB1 tako vezan za maskirajući fragment (MM1) da kuplovanje MM redukuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul i (ii) drugu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje ciljni molekul koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, pri čemu je AB2 tako vezan za maskirajući fragment (MM2), da kuplovanje MM redukuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su isti antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti antigeni. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi ciljni molekul su različiti epitopi na istom antigenu. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju T-ćelije ili njihovi fragmenti vezuju jedan ili više inhibitornih receptora T-ćelija, umesto jednog ili više aktivirajućih receptora T-ćelija.
[0146] U nekim primerima izvođenja, ciljni antigen je antigen koji je visoko eksprimiran i u normalnom, zdravom tkivu i u obolelom tkivu. U nekim primerima izvođenja, ciljni antigen je antigen iz tabele 1 koji je visoko eksprimiran i u normalnom, zdravom tkivu i u obolelom tkivu.
[0147] U nekim primerima izvođenja, ciljni antigen je antigen koji je visoko eksprimiran u obolelom tkivu, ali nije visoko eksprimiran u normalnom, zdravom tkivu. U nekim primerima izvođenja, ciljni antigen je antigen iz tabele 1 koji je visoko eksprimiran u obolelom tkivu, ali nije visoko eksprimiran u normalnom, zdravom tkivu. Ciljni antigen može da bude takav da je eksprimiran u normalnom, zdravom tkivu, ali da nije visoko, ili drugačije prekomerno, eksprimiran u normalnom, zdravom tkivu.
[0148] U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) je kuplovan sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom (AB) preko fragmenta koji može da se otcepi (CM) koji funkcioniše kao supstrat za proteazu. Pogodne proteaze za upotrebu u multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću određuju se na osnovu ekspresije proteaze na predviđenom mestu lečenja i/ili dijagnostičkom mestu. U nekim primerima izvođenja, proteaza je aktivator plazminogena u-tipa (uPA, označen i kao urokinaza), legumain, i/ili matriptaza (označena i kao MT-SP 1 ili MTSP1). U nekim primerima izvođenja, proteaza je matriksna metaloproteaza (MMP).
[0149] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su konstruisana tako da uključuju maskirajući fragment (MM) koji je kuplovan sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom (AB) preko linkera koji ne može da se otcepi. Na primer, u nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije, koje uključuje usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji vezuje T-ćeliju, pri čemu antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 vezan preko linkera koji ne može da se otcepi za<m>askirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul, a usmereno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, nije maskirano.
[0150] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje vezuje T-ćelije, koje uključuje usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji vezuje T-ćelije, pri čemu antitelo koje vezuje T-ćelije, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul za vezivanje T-ćelija, gde je AB1 vezan preko linkera koji ne može da se otcepi za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul, a usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuju drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul, gde je AB2 vezan preko linkera koji može da se otcepi za maskirajući fragment (MM2), tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost AB2 da veže drugi ciljni molekul.
[0151] Opšti koncept bispecifičnih antitela uveden je prvi put pre najmanje 50 godina (Nisonoff, A. and Mandy, W.J., Nature 194, 355-359 (1962), kako je navedeno u Chan, A.C. and Carter, P.J., Nature Reviews Immunol.10, 301-316 (2010)).
[0152] Opisane su brojne bispecifične platforme (videti npr., sliku 1; Liu, M.A., et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8648-8652 (1985); koju su revidirali Kroesen, B.J., et al. Adv. Drug Delivery Rev. 31. 105-129 (1998); Marvin, J.S. and Zhu, Z., Acta Pharm. Sinica 26, 649-658 (2005); Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010: Fitzgerald and Lugovsky. MAbs.
3(3):299-309 (2011); Riethmuller, G., Cancer Immunity 12. 12-18 (2012)). Opšti koncept konstruisanja bispecifičnih antitela podrazumeva povezivanje protein-vezujućih domena, obično zasnovanih na višestrukim imunoglobulinskim domenima, u cilju konstruisanja molekula koji ima sposobnost vezivanja za dva ili više ciljnih antigena i pokazuje fiziološku distribuciju, farmakokinetiku i efektorsku funkciju sličnu IgG. Ovo poslednje može da uključuje citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), regrutovanje T-ćelija (BiTEs™) (videti npr., Bacuerle, P.A. and Reinhardt, C., Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009), i TandAbs™ (videti Cochlovius et al., Cancer Res.60, 4336-4341 (2000)), i/ili isporuku citotoksičnog agensa u obliku hemijski konjugovanog fragmenta kao što je inhibitor mikrotubula, alkilator DNK, ili drugi toksin, u obliku konjugata antitelo-lek (ADC). Ispituju se mnogi formati bispecifičnog antitela, pri čemu konvencionalni heterodimerni IgG i BiTEs™ predstavljaju klinički najnaprednije formate, uprkos tome što je njihova proizvodnja niža od optimalne i farmakološkim svojstvima (videti Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol.
2010). Bispecifična antitela imaju mnoge potencijalne upotrebe, zasnovane na specifičnim svojstvima određenih formata i odabranih ciljnih antigena: nisu svi bispecifični formati pogodni za sve upotrebe. Na primer, format Fab dva-u-jedan (Bostrom, J., et al., Science 323, 1610-1614 (2009)) se sastoji od jednog vezujućeg domena za vezivanje za antigene A i B na ili/ili način; prema tome, ovaj bispecifični tip može da privuče dve kopije antigena A, dve kopije antigena B, ili jednu kopiju svakog antigena. Sa druge strane, format DVD (Wu, C., et al., Nature Biotechnol. 25. 1290-1297 (2007)) obezbeđuje vezivanje dve kopije antigena A, pored dve kopije antigena B. Razmak i relativna orjentacija svakog od vezujućih domena mogu takođe da budu važni za vezivanje više antigena na način koji daje željenu aktivnost-na primer, umrežavanje receptora (Jackman, J., et al., J. Biol. Chem. 285, 20850-20859 (2010)), gde je potrebno vezivanje jedne kopije svakog od receptora, može da zahteva monovalentnu interakciju sa svakim od dva posebna antigena.
[0153] Mehanistički drugačija oblast primene bispecifičnog antitela uključuje regrutovanje imunskih efektorskih ćelija (kao što su citotoksični T-limfociti, NK ćelije, i/ili mijeloidne efektorske ćelije) u napadu na tumorske ćelije konstruisanjem bispecifičnih molekula koji vezuju i antigen na površini ćelije predviđene da se na nju deluje citotoksično (npr., tumorska ćelija) i antigen na površini citotoksične imunske ćelije (npr. T-ćelija). Katumaksomab je primer klinički validiranog bispecifičnog antitela koje ciljno deluje na tumorski antigen EpCAM na ćelijama kancera i regrutuje citotoksične T-ćelije vezivanjem za CD3 na površini T-ćelija (Linke. R., Klein, A., and Seimetz, D., mAbs 2.129-136 (2010)); međutim, njegova upotreba je ograničena i zahteva intraperitonealnu primenu. BiTE™ antitela su bispecifična antitela koja ostvaruju regrutovanje T-ćelija u drugačijem formatu sa drugačijim farmakološkim svojstvima (Bacuerle, P.A. and Reinhardt. C., Anti-Cancer Res. 69, 4941 -4944 (2009))-konkretno, BiTE antitela su sačinjena od dva jednolančana varijabilna fragmenta (scFvs) i imaju veoma kratak farmakološki poluživot in vivo: stoga moraju da se isporuče kontinuiranom infuzijom. Sličan format, nazvan TandAb™, predstavlja konstrukt tetravalentnog, bispecifičnog dijatela u kome se dva varijabilna domena vezuju za ciljni antigen i dva varijabilna domena se vezuju za CD3 na površini T-ćelija (Cochlovius et al., Cancer Res.
60, 4336-4341 (2000)). Ovaj format ilustruje da bivalentno vezivanje i ciljnog antigena i antigena na površini T-ćelija može da se upotrebi za vezivanje T-ćelija i citotoksičnost usmerenu antigenom. Međutim, format TandAb takođe ima veoma kratak poluživot in vivo.
[0154] Opšte ograničenje bispecifičnih antitela koja vezuju T-ćelije povezano je sa činjenicom da citotoksičnost T-ćelija može da bude izuzetno snažna i može da bude aktivirana relativno niskim nivoima ciljnog antigena na površini ćelija. Prema tome, čak i umereni nivoi ekspresije ciljnog antigena, kao što je EGFR, u zdravim tkivima mogu da dovedu do značajne toksičnosti, ograničavajući ili sprečavajući kliničke terapijske primene (Lutterbuese, R. et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA 107, 12605-12610 (2010)). Stoga, ostaje potreba za efikasnim terapijama baziranim na antitelima koje ispoljavaju poboljšanu bezbednost, npr., sniženu toksičnost.
[0155] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću su bezbednija od multispecifičnih (npr., bispecifičnih) antitela jer je aktivnost multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ograničena na lokalizovano obolelo okruženje. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje imunske efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje vezuje T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira prepoznaje dva ili više ciljnih molekula. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži format IgG-scFv koji daje svojstva dugog poluživota IgG. U nekim primerima izvođenja, takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira je dodatno modulirano uvođenjem Fc-mutacija na mestu vezivanja sa FcRn (Petkova, S. B. et al., Intl. Immunol.18, 1759-1769 (2006); Deng, R. et al., mAbs 4, 101-109 (2012); Olafson, T Methods Mol. Biol. 907, 537-556 (2012)). U nekim primerima izvođenja, takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje mutacije u Fc domenu, kao što je mutacija N297A (Lund, J. et al., Mol. Immunol. 29, 53-39 (1992)) koja redukuje efektorske funkcije IgG (ADCC i CDC) i samim tim, dovodi do smanjenja neželjene toksičnosti.
[0156] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koriste ushodnu regulaciju aktivnosti proteaze, koja je široko poznata kao obeležje višestrukih bolesnih stanja, da bi se postiglo ciljno delovanje takvih terapeutika specifično za obolelo tkivo. Antitelo koje može da se aktivira se zasniva na upotrebi IgG antitela, ili njegovog fragmenta, kao što je scFv region, Fab region, pojedinačni VH ili VL domen koji je modifikovan tako da uključuje maskirajući fragment (MM), vezan za antitelo preko fragmenta koji može da se otcepi (CM), kao što je proteazni fragment koji može da se otcepi (videti, npr., PCT međunarodnu objavu broj WO 2009/025846, objavljenu 26. februara 2009; PCT međunarodnu objavu broj WO 2010/081173, objavljenu 15. jula 2010.). Alternativno, za postizanje jedne ili više specifičnosti vezivanja može da se upotrebi proteinski domen koji nije antitelo (videti npr., PCT međunarodnu objavu broj WO 2010/096838, objavljenu 26. avgusta 2010; Boersma, Y.L. et al., J. Biol. Chem. 286, 41273-41285 (2011)). Multispecifično antitelo, kao konvencionalni IgG, može da se koristi kao polazna tačka za proizvodnju multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira bi omogućilo visokoafinitetno ciljno delovanje na sve antigene koje prepoznaje polazno multispecifično antitelo, ali sa specifičnošću za tkivo koju diktira selektivno aktivirani linker koji može da se otcepi. U zavisnosti od upotrebljenog formata multispecifičnog antitela, MM i CM mogu da se postave na N- ili C-kraj odgovarajućeg domena.
[0157] Multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži najmanje jedan domen poreklom iz IgG sa specifičnošću prema prvom antigenu, vezan sintetski ili biosintetski za drugi domen (koji može da potiče iz IgG ili drugog proteina) specifičan za vezivanje za drugi antigen. Dodatne specifičnosti mogu da se postignu vezivanjem takvog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za jedan ili više dodatnih domena koji daju dodatne specifičnosti vezivanja za prvi antigen, drugi antigen, ili dodatne antigene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima jedan ili više od ovih domena maskiran odgovarajućim maskirajućim fragmentom (MM). Svaki od formata multispecifičnog antitela opisan na slici 1 može potencijalno da se pretvori u multispecifično antitelo koje može da se aktivira maskiranjem jednog ili više antigen-vezujućih fragmenata jednog ili više imunoglobulinskih domena. Primeri pogodnih formata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prikazani su na slikama 3A, i 5-9.
[0158] Upotreba scFv domena za obezbeđivanje specifičnosti za određeni antigen omogućava modularnu konstrukciju multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. Upotreba jednog ili više scFv domena spojenih sa krajem teškog ili lakog lanca IgG za konstruisanje bispecifičnih antitela prethodno je opisana (videti npr., Orcutt, K.D. et al., Prot. Eng. Design Select.23, 221-228 (2010); Dong et al., (2011)). Ovaj format ("IgG-scFv") omogućava da se konvencionalni IgG konvertuje u bispecifično antitelo pri čemu je prva specifičnost kodirana u varijabilnim domenima IgG, a druga specifičnost je kodirana u scFv domenima povezanim preko fleksibilnog regiona linkera. Varijacije ovog formata uključuju fuzionisanje scFv domena na N- ili C-krajevima teških ili lakih lanaca; scFv mogu da imaju iste ili različite specifičnosti vezivanja antigena (Spangler, J. B. et al., J. Mol. Biol.422, 532-544 (2012)). Pored toga, korišćenjem heterodimera teškog lanca (na primer, korišćenjem strukture ispupčenje-udubljenje ili sličnih konstrukcija), scFv različitih specifičnosti mogu da se pričvrste za N- ili C-kraj svakog teškog lanca.
[0159] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima maskirane varijabilne domene IgG. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima maskirane scFv domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima maskirane i varijabilne domene IgG i scFv domene. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za površinski antigen T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za epitop ciljnog antigena, a drugi domen antitela je specifičan za drugi epitop ciljnog antigena.
[0160] Otkriće obezbeđuje primere struktura multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje uključuju, ali nisu ograničene na sledeće: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; ili (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, gde: VL i VH predstavljaju varijabilne domene lakog i teškog lanca prve specifičnosti, sadržane u IgG; VL<∗>i VH<∗>predstavljaju varijabilne domene druge specifičnosti, sadržane u scFv: L1 je linkerski peptid koji povezuje maskirajući fragment (MM) i fragment koji može da se otcepi (CM); L2 je linkerski peptid koji povezuje fragment koji može da se otcepi (CM), i
1
antitelo; L3 je linkerski peptid koji povezuje varijabilni domeni scFv; L4 je linkerski peptid koji povezuje antitelo prve specifičnosti sa antitelom druge specifičnosti; CL konstantni domen lakog lanca: i CH1, CH2, CH3 su konstantni domeni teškog lanca. Prva i druga specifičnost mogu da budu usmerene na bilo koji antigen ili epitop. Dodatne strukture uključuju, ali nisu ograničene na sledeće: (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; ili (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2.
[0161] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži IgG ima maskirane varijabilne domene IgG. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži scFv ima maskirane scFv domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od varijabilnih domena IgG kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je najmanje jedan od varijabilnih domena IgG kuplovan sa maskirajućim fragmentom i najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i varijabilne domene IgG i scFv domene, gde je svaki od varijabilnih domena IgG i scFv domena kuplovan sa svojim maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za površinski antigen T-ćelije. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za ciljni antigen, a drugi domen antitela je specifičan za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je specifičan za epitop ciljnog antigena, a drugi domen antitela je specifičan za drugi epitop ciljnog antigena.
[0162] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje vezuje imunske efektorske ćelije kao što je multispecifično antitelo koje može da se aktivira
2
koje vezuje T-ćelije, jedan antigen je tipično antigen prisutan na površini tumorskih ćelija ili drugog tipa ćelija povezanog sa bolešću, kao što je, ali bez ograničenja, bilo koji ciljni molekul naveden u tabeli 1, kao što su, ali bez ograničenja, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, ili CD71 (receptor za transferin), a drugi antigen je tipično stimulatorni ili inhibitorni antigen prisutan na površini T-ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK), mijeloidnih mononuklearnih ćelija, makrofaga, i/ili drugih imunskih efektorskih ćelija, kao što su, ali bez ograničenja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. Domen antitela koji daje specifičnost za površinski antigen T-ćelije može takođe da bude supstituisan ligandom ili domenom liganda koji se vezuje za receptor T-ćelije, receptor NK-ćelije, receptor makrofaga, i/ili receptor druge imunske efektorske ćelije, kao što su, ali bez ograničenja, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ili TNFSF9. U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira usmerenog na više antigena, jedan antigen je izabran iz grupe ciljnih molekula navedenih u tabeli 1, i drugi antigen je izabran iz grupe ciljnih molekula navedenih u tabeli 1.
[0163] U nekim primerima izvođenja, jednolančani varijabilni domen, koji se specifično vezuje za ciljni molekul prikazan na površini T-ćelije fuzionisan je za karboksilni kraj potpuno humanog IgG1 antitela (usmereno antitelo) koje se vezuje za antigen na površini ćelije. Fragment scFv može da bude fuzionisan sa karboksilnim krajem teškog lanca, sa karboksilnim krajem lakog lanca ili sa oba lanca (slika 2). U nekim primerima izvođenja, jednolančani varijabilni domen, koji se specifično vezuje za ciljni molekul prikazan na površini T-ćelije fuzionisan je za amino-kraj potpuno humanog IgG1 antitela (usmereno antitelo) koje se vezuje za antigen na površini ćelije. Fragment scFv može da bude fuzionisan sa amino-krajem teškog lanca, sa amino-krajem lakog lanca ili sa oba lanca. Fuzije se konstruišu kao jedan genetički konstrukt i eksprimiraju u ćelijama u kulturi. Usmereno antitelo može da bude specifično za vezivanje za jedan ili više tumorskih površinskih antigena, ili za bilo koje ćelije čiji broj treba da se smanji. ScFv može da bude specifičan za isti ili različite antigene.
[0164] U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je anti-EGFR antitelo. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225v5, koje se specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225, koje se specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225v4, koje se specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je C225v6, koje se specifično vezuje za EGFR. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je anti-Jagged antitelo. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je 4D11 koje se specifično vezuje za humani i mišji Jagged 1 i Jagged 2. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je 4D11v2, koje se specifično vezuje za humani i mišji Jagged 1 i Jagged 2.
[0165] U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo može da bude u obliku antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više scFv može da bude u obliku Pro-scFv (videti, npr., WO 2009/025846, WO 2010/081173).
[0166] U nekim primerima izvođenja, scFv specifično vezuje CD3ε, npr., OKT3. U nekim primerima izvođenja, scFv specifično vezuje CTLA-4 (ovde označen i kao CTLA i CTLA4).
[0167] U nekim primerima izvođenja, scFv specifično vezuje jednu ili više T-ćelija, jednu ili više NK-ćelija i/ili jedan ili više makrofaga. U nekim primerima izvođenja scFv specifično vezuje ciljni molekul izabran iz grupe koja se sastoji od B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, C25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT,TIM3, ili VISTA, i njihovih kombinacija.
Definicije
[0168] Osim ako nije drugačije definisano, naučni i tehnički pojmovi korišćeni u vezi sa predmetnim otkrićem imaće značenja koja uobičajeno podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu. Uopšteno, nomenklatura upotrebljena u vezi sa, i tehnike, ćelijske i tkivne kulture, molekularne biologije i proteinske i oligo- ili polinukleotidne hemije i hibridizacije, koje su ovde opisane, su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, oligonukleotidnu sintezu, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja sprovode se prema specifikacijama proizvođača ili kao što se uobičajeno radi u ovoj oblasti ili kao što je opisano u ovom dokumentu. Gore pomenute tehnike i procedure se uopšteno sprovode prema uobičajenim postupcima dobro poznatim u stanju tehnike i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i o kojima je diskutovano u predmetnoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nomenklatura upotrebljena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetske organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku preparaciju, formulaciju, i isporuku, i lečenje pacijenata.
[0169] Ako se koriste u skladu sa ovim otkrićem, podrazumevaće se da sledeći izrazi, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja:
4
[0170] Kako se ovde koristi, pojam "antitelo" odnosi se na imunoglobulinske molekule i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina (Ig), tj., molekula koji sadrže antigenvezujuće mesto koje specifično vezuje (imunološki reaguje sa) antigenom. Pod "specifično vezuje" ili "imunološki reaguje sa" ili "imunospecifično vezuje" podrazumeva se da antitelo reaguje sa jednom ili više antigenih determinanti željenog antigena i ne reaguje sa drugim polipeptidima ili se vezuje sa mnogo nižim afinitetom (Kd> 10<-6>). Antitela uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonsko, monoklonsko, himerno, potpuno humano, domensko antitelo, jednolančano antitelo, Fab i F(ab')2fragmente, scFv, i biblioteku koja eksprimira Fab.
[0171] Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer je sačinjen od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektorsku funkciju. Uopšteno, molekuli antitela koji potiču od čoveka odnose se na bilo koju klasu IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, koje se međusobno razlikuju po prirodi teškog lanca koji je prisutan u molekulu. Određene klase imaju i potklase, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, i druge. Osim toga, kod ljudi, laki lanac može da bude kapa lanac ili lambda lanac.
[0172] Pojam "monoklonsko antitelo" (mAb) ili "kompozicija monoklonskog antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu molekulsku vrstu molekula antitela koja se sastoji od jedinstvenog proizvoda gena za laki lanac i jedinstvenog proizvoda gena za teški lanac. Konkretno, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) monoklonskog antitela identični su u svim molekulima populacije. MAb sadrže antigen- vezujuće mesto sposobno da imunološki reaguje sa određenim epitopom antigena koje se odlikuje jedinstvenim afinitetom vezivanja za njega.
[0173] Pojam "antigen-vezujuće mesto" ili "vezujući deo" odnosi se na deo imunoglobulinskog molekula koji učestvuje u vezivanju antigena. Antigen-vezujuće mesto obrazuju aminokiselinske rezidue N-terminalnih varijabilnih ("V") regiona teškog ("H") i lakog ("L") lanca. Tri visoko divergentna niza u V regionima teškog i lakog lanca, označena kao "hipervarijabilni regioni", umetnuta su između konzervativnijih bočnih nizova poznatih kao "okvirni regioni" ili "FR". Prema tome, pojam "FR" odnosi se na aminokiselinske sekvence koje se prirodno nalaze između, i odmah do, hipervarijabilnih regiona u imunoglobulinima. U molekulu antitela, tri hipervarijabilna regiona lakog lanca i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca postavljena su jedan prema drugom u trodimenzionalnom prostoru tako da formiraju antigen-vezujuću površinu. Antigen-vezujuća površina je komplementarna sa trodimenzionalnom površinom vezanog antigena, i tri hipervarijabilna regiona svakog teškog i lakog lanca označena su kao "regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR". Pripisivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama iz dela Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
[0174] Kako se ovde koristi, pojam "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin, scFv, ili T-ćelijski receptor. Pojam "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopske determinante obično se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične odlike trodimenzionalne strukture, kao i specifične odlike naelektrisanja. Na primer, antitela mogu da se razviju protiv N-terminalnih ili C-terminalnih peptida u polipeptidu. Kaže se da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disocijacije ≤ 1 µM; u nekim primerima izvođenja, ≤ 100 nM i u nekim primerima izvođenja, ≤ 10 nM.
[0175] Kako se ovde koriste, izrazi "specifično vezivanje", "imunološko vezivanje" i "svojstva imunološkog vezivanja" odnose se na nekovalentne interakcije tipa koji se javlja između molekula imunoglobulina i antigena za koji je imunoglobulin specifičan. Jačina, ili afinitet interakcija imunološkog vezivanja može da se izrazi kao konstanta disocijacije (Kd) interakcije, pri čemu manja Kdpredstavlja veći afinitet. Svojstva imunološkog vezivanja odabranih polipeptida mogu da se kvantifikuju upotrebom postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti. Jedan takav postupak uključuje merenje brzina obrazovanja i disocijacije kompleksa antigenvezujuće mesto/antigen, pri čemu te brzine zavise od koncentracija partnera kompleksa, afiniteta interakcije, i geometrijskih parametara koji jednako utiču na brzinu u oba smera. Prema tome, i "konstanta brzine vezivanja" (Kon) i "konstanta brzine disocijacije" (Koff) mogu da se odrede izračunavanjem koncentracija i stvarnih brzina asocijacije i disocijacije. (Videti Nature 361:186-87 (1993)). Odnos Koff/Konomogućava ukidanje svih parametara koji nisu povezani sa afinitetom, i jednak je konstanti disocijacije Kd. (Videti, uopšteno Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Kaže se da se antitelo predmetnog otkrića specifično vezuje za EGFR, kada je ravnotežna konstanta vezivanja (Kd) ≤1 µM, u nekim primerima izvođenja ≤ 100 nM, u nekim primerima izvođenja ≤ 10 nM, i u nekim primerima izvođenja ≤ 100 pM do oko 1 pM, mereno testovima kao što su testovi vezivanja radioliganda ili slični testovi poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0176] Pojam "izolovani polinukleotid", kako se ovde koristi, značiće polinukleotid genomskog, cDNA, ili sintetskog porekla ili neku njihovu kombinaciju, gde zbog svog porekla, "izolovani polinukleotid", (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kome se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) funkcionalno je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo veće sekvence. Polinukleotidi u skladu sa otkrićem uključuju molekule nukleinske kiseline koja kodira ovde prikazane teške lance molekula imunoglobulina, i molekule nukleinske kiseline koja kodira ovde prikazane lake lance molekula imunoglobulina.
[0177] Pojam "izolovani protein", na koji se ovde poziva označava protein poreklom od cDNA, rekombinantne RNK, ili sintetskog porekla ili neku njihovu kombinaciju, gde zbog svog porekla ili izvora derivacije "izolovani protein" (1) nije povezan sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) lišen je drugih proteina iz istog izvora, npr., mišjih proteina, (3) eksprimiran je u ćeliji poreklom od druge vrste, ili (4) se ne javlja u prirodi.
[0178] Pojam "polipeptid" se ovde koristi kao generički pojam da označi nativni protein, fragmente, ili analoge polipeptidne sekvence. Stoga, fragmenti nativnog proteina i analozi su vrste polipeptidnog roda. Polipeptidi u skladu sa otkrićem sadrže teški lanac molekula imunoglobulina koji je ovde prikazan, i laki lanac molekula imunoglobulina koji je ovde prikazan, kao i molekule antitela formirane od kombinacija koje sadrže teški lanac molekula imunoglobulina i laki lanac molekula imunoglobulina, kao što je kapa laki lanac molekula imunoglobulina, i obrnuto, kao i njihovi fragmenti i analozi.
[0179] Pojam "prirodni", kako se ovde koristi, primenjen na objekat odnosi se na činjenicu da objekat može da se nađe u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može da bude izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji ili drugačije, je prirodna.
[0180] Pojam "funkcionalno vezan", kako se ovde koristi, odnosi se na to da su pozicije tako opisanih komponenata u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca "funkcionalno vezana" za kodirajuću sekvencu je povezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnom sekvencom.
[0181] Pojam "kontrolna sekvenca", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne za ostvarivanje ekspresije i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina, kod prokariota, takve kontrolne sekvence uopšteno uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma, i sekvencu za završetak transkripcije, kod eukariota, uopšteno, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završetak transkripcije. Pojam "kontrolne sekvence" namenjen je da uključuje, najmanje, sve komponente čije prisustvo je od suštinskog značaja za ekspresiju i obradu, i može takođe da uključuje dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, liderske sekvence i sekvence fuzionog partnera. Pojam "polinukleotid", kako je ovde navedeno označava nukleotide dužine od najmanje 10 baza, bilo ribonukleotide ili dezoksinukleotide ili modifikovani oblik bilo kog od ta dva tipa nukleotida. Pojam uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0182] Pojam oligonukleotid kako je ovde navedeno uključuje prirodne, i modifikovane nukleotide međusobno vezane prirodnim, i neprirodnim oligonukleotidnim vezama. Oligonukleotidi su podset polinukleotida koji uopšteno ima dužinu od 200 baza ili manje. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidi su dugi 10 do 60 baza i u nekim primerima izvođenja, dugi su 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 baza. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr., za probe, mada oligonukleotidi mogu da budu dvolančani, npr., za upotrebu u konstruisanju genskog mutanta. Oligonukleotidi prema otkriću su ili "sens" ili "antisens" oligonukleotidi.
[0183] Pojam "prirodni nukleotidi", kako je ovde navedeno, uključuje dezoksiribonukleotide i ribonukleotide. Pojam "modifikovani nukleotidi" kako je ovde navedeno uključuje nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Pojam "oligonukleotidne veze" kako je ovde navedeno uključuje oligonukleotidne veze kao što je fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselerloat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforonmidat, i slično. Videti npr., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res.14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. SAD patent br. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotid može, po želji, da uključuje oznaku za detekciju.
[0184] Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate uobičajenu upotrebu. Videti Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su α-, α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takođe da budu pogodne komponente za polipeptide predmetnog otkrića. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4 hidroksiprolin, γkarboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetilizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, Nformilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). Pri zapisivanju polipeptida koje se ovde koristi, smer nalevo je smer ka amino-kraju, a smer nadesno je smer ka karboksi-kraju, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0185] Slično, ako nije navedeno drugačije, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj, smer nalevo dvolančanih polinukleotidnih sekvenci označen je kao 5' smer. Smer dodavanja od 5' ka 3' nascentnih RNK transkripata označen je kao transkripcioni smer, regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' u odnosu na 5' kraj RNK transkripta označeni su kao "ushodne sekvence", regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' u odnosu na 3' kraj RNK transkripta označeni su kao "nishodne sekvence".
[0186] Kada se primenjuje na polipeptide, pojam "suštinska identičnost" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT upotrebom zadatih težina za praznine, dele najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, na primer, u nekim primerima izvođenja, najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, u nekim primerima izvođenja, najmanje 95 procenata identičnosti sekvence, i u nekim primerima izvođenja, najmanje 99 procenata identičnosti sekvence.
[0187] U nekim primerima izvođenja, pozicije rezidua koje nisu identične razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
[0188] Kao što je ovde diskutovano, smatra se da su minorne varijacije u aminokiselinskim sekvencama antitela ili molekula imunoglobulina obuhvaćene ovim otkrićem, pod uslovom da varijacije u aminokiselinskoj sekvenci očuvaju najmanje 75%, na primer, u nekim primerima izvođenja, najmanje 80%, 90%, 95%, i u nekim primerima izvođenja, 99% sekvence. Konkretno, obuhvaćene su konzervativne aminokiselinske zamene. Konzervativne zamene su one koje se odvijaju unutar familije aminokiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Genetski kodirane aminokiseline su uopšteno podeljene u familije: (1) kisele aminokiseline su aspartat, glutamat; (2) bazne aminokiseline su lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne aminokiseline su alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan, i (4) nenaelektrisane polarne aminokiseline su glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Hidrofilne aminokiseline uključuju arginin, asparagin, aspartat, glutamin, glutamat, histidin, lizin, serin, i treonin. Hidrofobne aminokiseline uključuju alanin, cistein, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, triptofan, tirozin i valin. Druge familije aminokiselina uključuju (i) serin i treonin, koje su alifatična-hidroksi familija; (ii) asparagin i glutamin, koje su familija koja sadrži amid; (iii) alanin, valin, leucin i izoleucin, koje su alifatična familija; i (iv) fenilalanin, triptofan, i tirozin, koje su aromatična familija. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena aminokiseline strukturno srodnom aminokiselinom neće imati veliko dejstvo na vezivanje ili svojstva rezultujućeg molekula, posebno ako zamena ne uključuje aminokiselinu u okvirnom regionu. To da li aminokiselinska izmena rezultuje funkcionalnim peptidom može lako da se odredi ispitivanjem specifične aktivnosti derivata polipeptida. Testovi su ovde detaljno opisani. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da pripreme fragmente ili analoge antitela ili molekula imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, amino- i karboksi-krajevi fragmenata ili analoga javljaju se blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu da se identifikuju poređenjem podataka o nukleotidnoj i/ili aminokiselinskoj sekvenci sa javnim ili vlasničkim bazama podataka o sekvencama. Kompjuterizovani postupci za poređenje koriste se za identifikaciju motiva sekvence ili predviđene konformacije proteinskih domena koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikaciju proteinskih sekvenci koji se savijaju u poznatu trodimenzionalnu strukturu su poznati. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Prema tome, gore navedeni primeri pokazuju da stručnjaci u ovoj oblasti mogu da prepoznaju motive sekvence i strukturne konformacije koje mogu da se koriste za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena prema otkriću.
[0189] U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju osetljivost na proteolizu, (2) smanjuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za obrazovanje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i (4) doprinose ili modifikuju druga fizikohemijska ili funkcionalna svojstva takvih analoga. Analozi mogu da uključuju razne muteine sekvence drugačije od prirodne peptidne sekvence. Na primer, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (na primer, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se uvedu u prirodnu sekvencu (na primer, u delu polipeptida izvan jednog ili više domena koji formiraju međumolekulske kontakte. Konzervativna aminokiselinska supstitucija ne bi trebalo suštinski da promeni strukturne karakteristike parentalne sekvence (npr., zamenska aminokiselina ne bi trebalo da teži da naruši spiralu koja se javlja u parentalnoj sekvenci, ili da naruši druge vrste sekundarne strukture koja odlikuje parentalnu sekvencu). Primeri u struci poznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
[0190] Pojam "polipeptidni fragment", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju i/ili jednu ili više unutrašnjih delecija, ali u kome je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim pozicijama u prirodnoj sekvenci izvedena, na primer, iz cele dužine cDNA sekvence. Fragmenti su tipično najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina dugi, na primer u nekim primerima izvođenja, najmanje 14 aminokiselina dugi, u nekim primerima izvođenja, najmanje 20 aminokiselina dugi, obično najmanje 50 aminokiselina dugi, i u nekim primerima izvođenja, najmanje 70 aminokiselina dugi. Pojam "analog", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji su sačinjeni od segmenta od najmanje 25 aminokiselina koji ima suštinsku identičnost sa delom izvedene aminokiselinske sekvence i koji se specifično vezuje za EGFR, pod pogodnim uslovima vezivanja. Tipično, polipeptidni analozi sadrže konzervativnu aminokiselinsku supstituciju (ili adiciju ili deleciju) u odnosu na prirodnu sekvencu. Analozi su tipično najmanje 20 aminokiselina dugi, na primer, u nekim primerima izvođenja, najmanje 50 aminokiselina dugi ili duži, i mogu često da budu dugi kao prirodni polipeptid cele dužine.
[0191] Pojam "agens" se ovde koristi da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul, ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.
[0192] Kako se ovde koriste, pojmovi "oznaka" ili "obeležen" odnose se na ugradnju detektabilnog markera, npr., ugradnjom radioaktivno obeležene aminokiseline ili vezivanjem za polipeptid fragmenata biotinila koji mogu da budu detektovani obeleženim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja može da bude detektovana optičkim ili kalorimetrijskim metodama). U određenim situacijama, oznaka ili marker mogu takođe da budu terapijski. Različiti postupci za obeležavanje polipeptida i glikoproteina su poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne oznake (npr., fluorofor, rodamin, lantanid fosfore), enzimske oznake (npr., peroksidaza rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne agense, biotinil grupe, unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., sekvence leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopske oznake). U nekim primerima izvođenja, oznake su vezane pomoću ručica spejsera različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterna ometanja. Pojam "farmaceutski agens ili lek", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili kompoziciju sposobnu da indukuje željeno terapijsko dejstvo kada se pravilno primeni kod pacijenta.
1
[0193] Kako se ovde koristi, "suštinski čist" znači da je vrsta datog objekta pretežno prisutna vrsta (tj., na molarnoj osnovi je zastupljenija od bilo koje druge pojedinačne vrste u kompoziciji), i u nekim primerima izvođenja, suštinski prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj vrsta objekta čini najmanje oko 50 procenata (na molarnoj bazi) od svih prisutnih makromolekulskih vrsta.
[0194] Uopšteno, suštinski čista kompozicija će sadržati više od oko 80 procenata svih makromolekulskih vrsta prisutnih u kompoziciji, na primer, u nekim primerima izvođenja, više od oko 85%, 90%, 95%, i 99%. U nekim primerima izvođenja, vrsta datog objekta je prečišćena do suštinske homogenosti (vrste kontaminanata ne mogu da budu detektovane u kompoziciji konvencionalnim metodama detekcije) pri čemu se kompozicija suštinski sastoji od jedne makromolekulske vrste.
[0195] Pojam pacijent uključuje humane i veterinarske subjekte.
[0196] Ostali hemijski pojmovi ovde se koriste u skladu sa konvencionalnom upotrebom u ovoj oblasti, kao što je ilustrovano u The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju
[0197] Ilustrativna multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću uključuju, na primer, ona prikazana u primerima koji su ovde obezbeđeni, i njihove varijante.
[0198] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja najmanje jedno od AB u multispecifičnom antitelu je vezujući partner bilo kog ciljnog molekula navedenog u tabeli 1.
Tabela 1: Primeri ciljnih molekula
2
[0199] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedno od AB multispecifičnog antitela je, ili potiče od sekvence prikazane u tabeli 7 u primerima koji su ovde obezbeđeni.
[0200] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedno od AB multispecifičnog antitela je, ili potiče od antitela navedenog u tabeli 2.
Tabela 2: Primeri izvora AB
4
[0201] Otkrićem su takođe obuhvaćena multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za isti epitop kao ovde opisana multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0202] Stručnjaci u ovoj oblasti će znati da je moguće odrediti, bez nepotrebnog eksperimentisanja, da li multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira imaju istu ili sličnu specifičnost kao multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prema otkriću, utvrđivanjem da li prvo sprečava ovo drugo da se veže za ciljni molekul. Ako ispitivano multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira kompetiraju sa multispecifičnim antitelom i/ili multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira prema otkriću, što se vidi na osnovu smanjenog vezivanja multispecifičnim antitelom i/ili multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira prema otkriću, tada se dva multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju vezuju za isti, ili blisko srodni, epitop.
[0203] Jedan primer izvođenja za određivanje da li multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira imaju istu ili sličnu specifičnost kao multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prema otkriću je pre-inkubiranje multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema otkriću sa rastvorljivim ciljnim molekulom sa kojim ono obično reaguje, a zatim dodavanje ispitivanog multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, kako bi se utvrdilo da li je sposobnost ispitivanog multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, da vežu ciljni molekul inhibirana. Ako su ispitivano multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, inhibirani, tada, po svoj prilici, oni imaju istu, ili funkcionalno ekvivalentnu epitopsku specifičnost kao multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prema otkriću.
[0204] Multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira se generišu, na primer, upotrebom procedura opisanih u primerima datim dalje u tekstu. Multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira mogu takođe da se generišu upotrebom bilo koje od brojnih tehnika poznatih u ovoj oblasti za proizvodnju i/ili prečišćavanje antitela.
[0205] Fragmenti antitela, kao Fv, F(ab')2i Fab. za upotrebu u multispecifičnom antitelu i/ili multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira mogu da se pripreme cepanjem intaktnog proteina, npr., proteazom ili hemijskim cepanjem. Alternativno, konstruiše se skraćeni gen. Na primer, himerni gen koji kodira deo fragmenta F(ab')2bi uključivao sekvence DNK koje kodiraju CH1 domen i zglobni region H lanca, praćen translacionim stop kodonom kako bi se dobio skraćeni molekul.
[0206] Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, YAC, epizome poreklom iz EBV, i slično. Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu sekvencu CH ili CL humanog imunoglobulina, sa odgovarajućim restrikcionim mestima konstruisanim tako da bilo koja VH ili VL sekvenca može lako da se insertuje i eksprimira. U takvim vektorima, splajsovanje se obično odvija između donorskog mesta splajsovanja u insertovanom J regionu i akceptorskog mesta splajsovanja koje prethodi humanom C regionu, i takođe u regionima splajsovanja koji se javljaju u humanim egzonima CH. Poliadenilacija i terminacija transkripcije javljaju se na nativnim hromozomskim mestima nishodno od kodirajućih regiona. Dobijeno antitelo može da bude spojeno sa bilo kojim snažnim promotorom, uključujući retrovirusne LTR, npr., rani promotor SV-40, (Okayama et al. Mol. Cell. Bio.3:280 (1983)), LTR Rous sarkoma virusa (Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), i LTR Moloney mišjeg virusa leukemije (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)). Takođe, jasno je da mogu da se upotrebe nativni promotori Ig i slično.
[0207] Dalje, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu generisana tehnologijama tipa prikaza, uključujući, bez ograničenja, fagni prikaz, retrovirusni prikaz, ribozomalni prikaz, i druge tehnike, upotrebom tehnika koje su dobro poznate u ovoj oblasti i dobijeni molekuli mogu da budu podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je sazrevanje afiniteta, budući da su takve tehnike dobro poznate u ovoj oblasti. Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Plückthun PNAS USA .94:4937-4942 (1997) (ribozomalni prikaz), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (fagni prikaz), Scott, TIBS, vol.17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990). Russel et al. Nucl. Acids Research 21 :1081-1085 (1993), Hoganboom et al.
Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), i SAD patent br.5,733,743.
[0208] Modifikovanje multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema otkriću u odnosu na efektorsku funkciju može da bude poželjno, kako bi se poboljšala ili redukovala takva funkcija, u cilju poboljšanja efektivnosti lečenja bolesti i poremećaja antitelom. Na primer, cisteinska rezidua/rezidue mogu da budu uvedene u Fc region, čime se omogućava formiranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može da ima poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećanu lizu ćelija posredovanu komplementom i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). (Videti Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) i Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativno, antitelo može da bude konstruisano tako da ima dualne Fc regione i, time, pojačanu sposobnost lize posredovane komplementom i aktivnost ADCC. (Videti Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)), u nekim primerima izvođenja, uvedene su mutacije Fc kako bi se uklonila mesta glikozilacije, čime se redukuje funkcija Fc.
Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju
[0209] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i kompozicije multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju, koje su ovde obezbeđene, sadrže najmanje prvo antitelo ili njegov fragment antitela (zajednički označene kao AB1 u otkriću) koji specifično vezuje prvi ciljni molekul i/ili prvi epitop i drugi antitelo ili njegov fragment antitela (zajednički označene kao AB2 u otkriću) koji specifično vezuje drugi ciljni molekul i/ili drugi epitop, pri čemu je najmanje jedan od AB modifikovan maskirajućim fragmentom (MM). U nekim primerima izvođenja, svaki AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je modifikovan svojim sopstvenim maskirajućim fragmentom.
[0210] Kada je najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira modifikovan pomoću MM i nalazi se u prisustvu svog ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koji nije modifikovan pomoću MM ili specifičnim vezivanjem parentalnog AB za ciljni molekul.
[0211] Vrednost KdAB modifikovanog pomoću MM prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50 000, 100 000, 500000, 1 000 000, 5000 000, 10000 000, 50 000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10 000, 10-100000, 10-1 000 000, 10-10000 000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1 000 000, 100-10 000 000, 1000-10000, 1000-100 000, 1000-1 000 000, 1000-10000 000, 10 000-100 000, 10 000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100 000-1 000 000, ili 100 000-10 000 000 puta veća od vrednosti KdAB koji nije modifikovan pomoću MM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu. Obrnuto, afinitet vezivanja AB modifikovanog pomoću MM prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10 000, 50000, 100 000, 500000, 1000 000, 5 000 000, 10000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100 000, 10-1 000 000, 10-10000 000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1000 000, 100-10000 000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1 000 000, 1000-10 000 000, 10 000-100 000, 10 000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100 000-1 000 000, ili 100 000-10 000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB koji nije modifikovan pomoću MM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu.
[0212] Konstanta disocijacije (Kd) za vezivanje MM za najmanje jedan AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je uopšteno veća nego Kdza vezivanje AB za ciljni molekul. Vrednost Kdza vezivanje MM za AB može da bude najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10 000, 100 000, 1 000 000 ili čak 10000 000 puta veća nego Kdza vezivanje AB za ciljni molekul. Obrnuto, afinitet vezivanja MM za AB je uopšteno niži od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul. Afinitet vezivanja MM za AB može da bude najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 100 000, 1000 000 ili čak 10000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul.
[0213] Kada je najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira modifikovan pomoću MM i nalazi se u prisustvu ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koji nije modifikovan pomoću MM ili specifičnim vezivanjem parentalnog AB za ciljni molekul. U poređenju sa vezivanjem AB koji mije modifikovan pomoću MM ili vezivanjem parentalnog AB za ciljni molekul, sposobnost AB da veže ciljni molekul kada je modifikovan pomoću MM može da bude snižena za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova, ili 5, 10,15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili više, mereno in vivo ili u in vitro testu.
[0214] MM inhibira vezivanje najmanje jednog od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira za njegov ciljni molekul. MM vezuje antigen-vezujući domen AB i inhibira vezivanje AB za njegov ciljni molekul. MM može sterno da inhibira vezivanje AB za ciljni molekul. MM može alosterno da inhibira vezivanje AB za njegov ciljni molekul. U ovim primerima izvođenja, kada je AB modifikovan ili kuplovan sa MM i nalazi se u prisustvu ciljnog molekula, tada nema vezivanja ili suštinski nema vezivanja AB za ciljni molekul, ili ne više od 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ili 50% vezivanja AB za ciljni molekul, u poređenju sa vezivanjem AB koji nije modifikovan pomoću MM, parentalnog AB, ili AB koji nije kuplovan sa MM za ciljni molekul, tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže, mereno in vivo ili u in vitro testu.
[0215] Kada je najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovan sa, ili modifikovan pomoću MM, MM 'maskira' ili redukuje ili drugačije inhibira specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul. Kada je najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovan sa, ili modifikovan pomoću MM, takvo kuplovanje ili modifikacija može da utiče na strukturnu promenu koja redukuje ili inhibira sposobnost AB da specifično veže svoj ciljni molekul.
[0216] U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, kada je najmanje jedan AB kuplovan sa, ili modifikovan pomoću MM, najmanje deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira može da bude predstavljen sledećim formulama (redosledom od amino (N) terminalnog regiona ka karboksilnom (C) terminalnom regionu:
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
gde je MM maskirajući fragment, AB je antitelo ili njegov fragment antitela, i L je linker. U mnogim primerima izvođenja, može da bude poželjno ubaciti jedan ili više linkera, npr., fleksibilnih linkera, u kompoziciju kako bi se obezbedila fleksibilnost.
[0217] U određenim primerima izvođenja, MM nije prirodan vezujući partner AB. U nekim primerima izvođenja, MM nema ili suštinski nema homologiju sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U drugim primerima izvođenja MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% sličan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 25% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 50% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 20% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru
1
AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 10% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB.
[0218] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju AB koji je modifikovan pomoću MM i takođe uključuju jedan ili više fragmenata koji mogu da se otcepe (CM). Takva multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ispoljavaju vezivanje koje može da se aktivira/promenljivo vezivanje, za ciljni molekul AB. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju uopšteno uključuju najmanje jedno antitelo ili fragment antitela (AB), modifikovan ili kuplovan sa maskirajućim fragmentom (MM) i fragmentom koji može da se modifikuje ili otcepi (CM). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu koja služi kao supstrat za proteazu od interesa.
[0219] Elementi multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju su raspoređeni tako da su MM i CM raspoređeni na taj način da u otcepljenom (ili relativno aktivnom) stanju i u prisustvu ciljnog molekula, AB vezuje ciljni molekul, dok u neotcepljenom (ili relativno neaktivnom) stanju u prisustvu ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano. Specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul može da bude redukovano zahvaljujući inhibiciji ili maskiranju sposobnosti AB da specifično veže svoj ciljni molekul pomoću MM.
[0220] Vrednost Kdsvakog AB modifikovanog pomoću MM i CM prema ciljnom molekulu, je najmanje 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100 000, 500 000, 1000 000, 5 000 000, 10000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10 000, 10-100 000, 10-1 000 000, 10-10 000 000, 100-1000, 100-10 000, 100-100 000, 100-1000 000, 100-10000 000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1000 000, 1000-10 000 000, 10 000-100 000, 10 000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100 000-1 000 000, ili 100 000-10 000 000 puta veća od KdAB koji nije modifikovan pomoću MM i CM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu. Obrnuto, afinitet vezivanja AB modifikovanog pomoću MM i CM prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10 000, 50 000, 100 000, 500 000, 1 000 000, 5 000 000, 10 000000, 50 000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1 000 000, 10-10 000 000, 100-1000, 100-10000, 100-100 000, 100-1 000 000, 100-10000 000, 1000-10 000, 1000-100000, 1000-1000 000, 1000-10000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100000-1 000 000, ili 100000-10 000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB koji nije modifikovan pomoću MM i CM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu.
[0221] Kada je najmanje jedan AB modifikovan pomoću MM i CM i nalazi se u prisustvu ciljnog molekula, ali ne i u prisustvu modifikujućeg agensa (na primer proteaze), specifično
2
vezivanje tog AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koji nije modifikovan pomoću MM i CM ili parentalnog AB za ciljni molekul. Kada se poredi sa vezivanjem parentalnog AB ili vezivanjem AB koji nije modifikovan pomoću MM i CM za njegov ciljni molekul, sposobnost AB da veže ciljni molekul kada je modifikovan pomoću MM i CM može da bude redukovana za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže, mereno in vivo ili u in vitro testu.
[0222] Kako se ovde koristi, pojam otcepljeno stanje odnosi se na stanje multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju nakon modifikacije CM proteazom. Pojam neotcepljeno stanje, kako se ovde koristi, odnosi se na stanje multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju kada CM nije otcepljen pomoću proteaze. Kao što je gore diskutovano, termin "multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju" ovde se koristi da označi multispecifično antitelo koje može da se aktivira u oba njegova stanja, neotcepljenom (nativnom) stanju, kao i u otcepljenom stanju. Stručnjaku u oblasti biće jasno da u nekim primerima izvođenja otcepljenom multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira može da nedostaje MM zbog otcepljivanja CM proteazom, što rezultuje oslobađanjem najmanje MM (npr., kada MM nije spojen sa multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju kovalentnom vezom (npr., disulfidnom vezom između cisteinskih rezidua).
[0223] Pod pojmom "koje može da se aktivira" ili "promenljivo", podrazumeva se da multispecifično antitelo koje može da se aktivira ispoljava prvi nivo vezivanja za ciljni molekul kada je u inhibiranom, maskiranom ili neotcepljenom stanju (tj., prvoj konformaciji), i drugi nivo vezivanja za ciljni molekul u neinhibiranom, nemaskiranom i/ili otcepljenom stanju (tj., drugoj konformaciji), pri čemu je drugi nivo vezivanja ciljnog molekula veći od prvog nivoa vezivanja. Uopšteno, pristup ciljnog molekula do odgovarajućeg AB multispecifičnog antitela koje može da se aktivira veći je u prisustvu agensa za cepanje sposobnog da otcepi CM nego u odsustvu takvog agensa za otcepljivanje. Prema tome, kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje najmanje jednog AB za ciljni molekul je inhibirano i on može da bude maskiran za vezivanje ciljnog molekula (tj., prva konformacija je takva da AB ne može da veže ciljni molekul), a u otcepljenom stanju AB nije inhibiran ili nije maskiran za vezivanje ciljnog molekula.
[0224] CM i AB multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju odabrani su tako da AB predstavlja vezujući fragment za dati ciljni molekul i/ili epitop, a CM predstavlja supstrat za proteazu koja je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulom na mestu lečenja ili na mestu dijagnostikovanja u telu subjekta. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde opisana nalaze konkretnu primenu kada je, na primer, proteaza sposobna da cepa mesto u CM prisutna na relativno višim nivoima u tkivu koje sadrži ciljni molekul na mestu lečenja ili na mestu dijagnostikovanja, nego u tkivu na mestu koje nije mesto lečenja (na primer u zdravom tkivu).
[0225] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđuju redukovanu toksičnost i/ili sporedna neželjena dejstva koja bi inače mogla da nastanu vezivanjem AB na mestima koja nisu mesta lečenja, kada AB ne bi bio maskiran ili njegovo vezivanje za ciljni molekul drugačije inhibirano.
[0226] Uopšteno, multispecifično antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano prvo odabiranjem AB od interesa i konstruisanjem preostalog dela antitela koje može da se aktivira tako da, kad je konformaciono ograničeno, MM obezbeđuje maskiranje AB ili redukovano vezivanje AB za njegov ciljni molekul. Da bi se obezbedilo ovo funkcionalno svojstvo, mogu da budu uzeti u obzir kriterijumi strukturnog dizajna.
[0227] Obezbeđena su multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja ispoljavaju promenljivi fenotip željenog dinamičkog opsega za vezivanje ciljnog molekula u inhibiranoj naspram neinhibirane konformacije. Dinamički opseg uopšteno se odnosi na odnos (a) maksimalnog detektovanog nivoa parametra pod prvim setom uslova prema (b) minimalnoj detektovanoj vrednosti tog parametra pod drugim setom uslova. Na primer, u kontekstu multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, dinamički opseg odnosi se na odnos (a) maksimalnog detektovanog nivoa ciljnog proteina koji se vezuje za multispecifično antitelo koje može da se aktivira u prisustvu proteaze koja može da otcepi CM antitela koja mogu da se aktiviraju prema (b) minimalnom detektovanom nivou ciljnog proteina koji se vezuje za multispecifično antitelo koje može da se aktivira u odsustvu proteaze. Dinamički opseg multispecifičnog antitela koje može da se aktivira može da se izračuna kao odnos ravnotežne konstante disocijacije obrade multispecifičnog antitela koje može da se aktivira agensom za cepanje (npr., enzimom) prema ravnotežnoj konstanti disocijacije obrade antitela koja mogu da se aktiviraju agensom za cepanje. Što je veći dinamički opseg multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, bolji je promenljivi fenotip antitela koje može da se aktivira. Antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju relativno više vrednosti dinamičkog opsega (npr., veće od 1) ispoljavaju poželjnije promenljive fenotipe, tako da se vezivanje ciljnog proteina antitelima koja mogu da se aktiviraju javlja u većem stepenu (npr., pretežno se javlja) u prisustvu agensa
4
za cepanje (npr., enzima) koji može da otcepi CM antitela koja mogu da se aktiviraju, nego u odsustvu agensa za cepanje.
[0228] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu obezbeđena u raznim strukturnim konfiguracijama. Primeri formula za najmanje deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira dati su ispod. Posebno je predviđeno da redosled od N- ka C-kraju prvog AB, odgovarajućeg MM i CM može da bude obrnut u antitelu koje može da se aktivira. Takođe je specifično predviđeno da aminokiselinske sekvence CM i MM mogu da se preklapaju, npr., tako da je CM sadržan unutar MM.
[0229] Na primer, najmanje deo multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju može da bude predstavljen sledećom formulom (redosledom od amino (N) terminalnog regiona ka karboksilnom (C) terminalnom regionu):
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
gde je MM maskirajući fragment, CM je fragment koji može da se otcepi, i AB je prvo antitelo ili njegov fragment. Treba napomenuti da iako su MM i CM predstavljene kao odvojene komponente u formulama iznad, u svim primerima izvođenja (uključujući formule) koji su ovde opisani, predviđeno je da aminokiselinske sekvence MM i CM mogu da se preklapaju, npr., tako da je CM potpuno ili delimično sadržan u MM. Pored toga, formule iznad obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu da budu smeštene N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na elemente antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0230] U određenim primerima izvođenja, MM nije prirodni vezujući partner AB. U nekim primerima izvođenja, MM nema, ili suštinski nema homologiju sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U drugim primerima izvođenja MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% sličan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 50% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 25% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 20% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 10% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0231] U mnogim primerima izvođenja može da bude poželjno ubacivanje jednog ili više linkera, npr., fleksibilnih linkera, u konstrukt multispecifičnog antitela koje može da se aktivira tako da se obezbedi fleksibilnost na jednom ili više od MM-CM spojeva, CM-AB spojeva, ili oba. Na primer, AB, MM, i/ili CM mogu da ne sadrže dovoljan broj rezidua (npr., Gly, Ser, Asp, Asn, posebno Gly i Ser, naročito Gly) da obezbede željenu fleksibilnost. U tom slučaju, uvođenje jedne ili više aminokiselina može da bude korisno za promenljivi fenotip takvih konstrukata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, kako bi se obezbedio fleksibilni linker. Pored toga, kao što je opisano ispod, kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno kao konformacijski ograničen konstrukt, fleksibilni linker može da bude funkcionalno ubačen da olakša formiranje i održavanje ciklične strukture u neotcepljenom multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira.
[0232] Na primer, u određenim primerima izvođenja multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži jednu od sledećih formula (gde formula ispod predstavlja aminokiselinsku sekvencu u N- ka C-terminalnom smeru ili C- ka N-terminalnom smeru):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
pri čemu su MM, CM, i AB kao što je gore definisano; gde su L1 i L2 svaki nezavisno i opciono prisutni ili odsutni, isti ili različiti fleksibilni linkeri koji uključuju najmanje 1 fleksibilnu aminokiselinu (npr., Gly). Pored toga, formule iznad obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu da budu smeštene N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na elemente multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente koji ciljno deluju (npr., ligand za receptor ćelije prisutan u ciljnom tkivu) i fragmente koji produžavaju serumski poluživot (npr., polipeptide koji vezuju serumske proteine, kao što je imunoglobulin (npr., IgG) ili serumski albumin (npr., humani serumski albumin (HSA)).
[0233] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je vezujući partner za bilo koji ciljni molekul naveden u tabeli 1.
[0234] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira sadrži, predstavlja ili potiče od sekvence prikazane u tabeli 7 u primerima koji su ovde obezbeđeni.
[0235] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira sadrži, predstavlja ili potiče od sekvence prikazane u primeru 5 u primerima koji su ovde obezbeđeni. U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira sadrži, predstavlja ili potiče od sekvence prikazane u tabeli 11 u primerima koji su ovde obezbeđeni.
[0236] U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, najmanje jedan od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira predstavlja ili potiče od antitela navedenog u tabeli 2.
[0237] U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment je odabran za upotrebu sa specifičnim antitelom ili fragmentom antitela. Na primer, pogodni maskirajući fragmenti za upotrebu sa antitelima koja vezuju EGFR uključuju MM koji uključuju sekvencu CISPRG (SEQ ID NO: 75). U vidu neograničavajućih primera, MM može da uključuje sekvencu kao što su CISPRGC (SEQ ID NO: 339), CISPRGCG (SEQ ID NO: 76); CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 77); CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID NO: 78), CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO: 79) i CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO: 80). Drugi pogodni maskirajući fragmenti uključuju bilo koji od maskirajućih elemenata specifičnih za EGFR opisanih u PCT objavi br. WO 2010/081173, kao što su, kao neograničavajući primer, GSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 81); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 82); CNHHYFYTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 83); ADHVFWGSYGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 84); CHHVYWGHCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 85); CPHFTTTSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 86); CNHHYHYYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 87); CPHVSFGSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 88); CPYYTLSYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 89); CNHVYFGTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 90); CNHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 91); CHHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 92); YNPCATPMCCISPRGCPG (SEQ ID NO: 93); CNHHYFYTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 94); CNHHYHYYCGCISPRGCG (SEQ TD NO: 95); CNHVYFGTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 96); CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 97); CPHFTTTSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 98); CNHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 99); CHHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 100); CPYYTLSYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 101); CPHVSFGSCGCISPRGCG (SEQ IDNO: 102); ADHVFWGSYGCISPRGCG (SEQ ID NO: 103); YNPCATPMCCISPRGCG (SEQ ID NO: 104); CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 105); C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG (SEQ ID NO: 106); CISPRGCGQPIPSVK (SEQ ID NO: 107); CISPRGCTQPYHVSR (SEQ ID NO: 108); i/ili CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO: 109).
[0238] Pogodni maskirajući fragmenti za upotrebu sa antitelima koja vezuju ciljni molekul Jagged, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, uključuju, kao neograničavajući primer, maskirajuće fragmente koji uključuju sekvencu kao što je QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 338); QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 110); PWCMQRQDFLRCPQP (SEQ ID NO: 111): QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO: 112): CNLWVSGGDCGGLQG (SEQ ID NO: 113); SCSLWTSGSCLPHSP (SEQ ID NO: 114); YCLQLPHYMQAMCGR (SEQ ID NO: 115); CFLYSCTDVSYWNNT (SEQ ID NO: 116); PWCMQRQDYLRCPQP (SEQ ID NO: 117); CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO: 118); CNLWVSGGDCRGVQG (SEQ ID NO: 119); CNLWVSGGDCRGLRG (SEQ ID NO: 120); CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO: 121); CNLWVSGGDCRDAPW (SEQ ID NO: 122); CNLWVSGGDCRDLLG (SEQ ID NO: 123); CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO: 124); CNLWLHGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 125); CNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 126); CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO: 127); CNIWGPSVDCGALLG (SEQ ID NO: 128); CNIWVNGGDCRSFEG (SEQ ID NO: 129); YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO: 130); YCLALPHYMQADCAR (SEQ ID NO: 131); CFLYSCGDVSYWGSA (SEQ ID NO: 132); CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO: 133); CYLYSCNDVSYWSNT (SEQ ID NO: 134); CFLYSCTDVSYW (SEQ ID NO: 135); CFLYSCTDVAYWNSA (SEQ ID NO: 136); CFLYSCTDVSYWGDT (SEQ ID NO: 137); CFLYSCTDVSYWGNS (SEQ ID NO: 138); CFLYSCTDVAYWNNT (SEQ ID NO: 139); CFLYSCGDVSYWGNPGLS (SEQ ID NO: 140); CFLYSCTDVAYWSGL (SEQ ID NO: 141); CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO: 142); CFLYSCSDVSYWGNI (SEQ ID NO: 143); CFLYSCTDVAYW (SEQ ID NO: 144); CFLYSCTDVSYWGST (SEQ ID NO: 145); CFLYSCTDVAYWGDT (SEQ ID NO: 146); GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 147); GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 148); GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG (SEQ ID NO: 149); GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 150); GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 151); GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 152); GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 153); GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 154); GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 155); GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 156); GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 157); GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 158); GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 159); GCNRWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO: 160); GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 161); GCNIWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO: 162); GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 163); GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 164); GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 165); GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO: 166); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 167); GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: 168); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 169); GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 170): GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 171): i/ili GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 172).
[0239] Pogodni maskirajući fragmenti za upotrebu sa antitelima koja vezuju ciljni molekul interleukina 6, npr., receptor za interleukin 6 (IL-6R), uključuju, kao neograničavajući primer, maskirajuće fragmente koji uključuju sekvencu kao što je QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 174); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 175); QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 176): YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 177); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ TD NO: 178); ESSCVWNYVHIYMDC (SEQ ID NO: 179); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 180); YRTCSWNYVGIFLDC (SEQ ID NO: 181); YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 182); YGSCSWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 183); YGSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 184); YTSCNWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 185): YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 186); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 187); WSNCHWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 188); DRSCTWNYVRISYDC (SEQ ID NO: 189); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 190); SRSCIWNYAHIHLDC (SEQ ID NO: 191); SMSCYWQYERIFLDC (SEQ ID NO: 192); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 193); YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 194); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 195); YKSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 196); YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 197); FSSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 198); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 199); YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 200); YRSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 201); NMSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 202); FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO: 203); XXsCXWXYvhIfXdC (SEQ ID NO: 204); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 205); RDTGGQCRWDYVHIFMDC (SEQ ID NO: 206); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 207); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 208); DGGPAGCSWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 209); AVGPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 210); CTWNYVHIFMDCGEGEGP (SEQ ID NO: 211); GGVPEGCTWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 212); AEVPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 213); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 214); SGASGGCKWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 215); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 216); TPGCRWNYVHIFMECEAL (SEQ ID NO: 217); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 218); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 219); RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 220); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 221); XGafDIPFPAHWvPnT (SEQ ID NO: 222); RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 223); SGVGRDRDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 224); WAGGNDCDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 225); WGDGMDVDIPFPAHWVPVT (SEQ ID NO: 226); AGSGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 227); ESRSGYADIPFPAHWVPRT (SEQ TD NO: 228); i/ili RECGRCGDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 173).
[0240] U nekim primerima izvođenja, fragment koji može da se otcepi (CM) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira uključuje aminokiselinsku sekvencu koja može da služi kao supstrat za proteazu, obično ekstracelularnu proteazu. CM može da bude odabran na osnovu proteaze koja je ko-lokalizovana u tkivu sa željenim ciljnim molekulom najmanje jednog AB multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Poznata su brojna različita stanja u kojima je ciljni molekul od interesa ko-lokalizovan sa proteazom, gde je supstrat za proteazu poznat u stanju tehnike. Na primeru kancera, ciljno tkivo može da bude kancerozno tkivo, posebno kancerozno tkivo solidnog tumora. U literaturi postoje izveštaji o povišenim nivoima proteaza koje imaju poznate supstrate kod brojnih kancera, npr., solidnih tumora. Videti, npr., La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421. Neograničavajući primeri bolesti uključuju: sve tipove kancera (dojke, pluća, kolorektalni kancer, kancer prostate, melanome, kancer glave i vrata, pankreasa, itd.), reumatoidni artritis, Kronovu bolest, SLE, kardiovaskularno oštećenje, ishemiju, itd. Na primer, indikacije bi uključivale leukemije, uključujući akutnu limfoblastnu leukemiju T-ćelija (T-ALL), limfoblastne bolesti uključujući multipli mijelom, i solidne tumore, uključujući tumore pluća, kolorektalne, tumore prostate, pankreasa i dojke, uključujući trostruko negativni kancer dojke. Na primer, indikacije uključuju bolest kostiju ili metastazu kancera, bez obzira na primarno poreklo tumora; kancer dojke, uključujući, kao neograničavajući primer, ER/PR+ kancer dojke, Her2+ kancer dojke, trostruko-negativni kancer dojke; kolorektalni kancer; kancer endometrijuma; kancer želuca; glioblastom; kancer glave i vrata, kao što je kancer jednjaka; kancer pluća, kao što je, kao neograničavajući primer, nesitnoćelijski kancer pluća; multipli mijelom; kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate; sarkom, kao što je osteosarkom; renalni kancer, kao što je, kao neograničavajući primer, karcinom renalnih ćelija; i/ili kancer kože, kao što je, kao neograničavajući primer, kancer skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, ili melanom. U nekim primerima izvođenja, kancer je kancer skvamoznih ćelija. U nekim primerima izvođenja, kancer je karcinom skvamoznih ćelija kože. U nekim primerima izvođenja, kancer je karcinom skvamoznih ćelija jednjaka. U nekim primerima izvođenja, kancer je karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata. U nekim primerima izvođenja, kancer je karcinom skvamoznih ćelija pluća.
[0241] CM se specifično cepa pomoću enzima brzinom od oko 0.001-1500 x 10<4>M<-1>S<-1>ili najmanje 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, ili 1500 x 10<4>M<-1>S<-1>.
[0242] Za specifično cepanje enzimom, ostvaruje se kontakt između enzima i CM. Kada se multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži najmanje prvi AB kuplovan sa MM i CM nalazi u prisustvu ciljnog molekula i dovoljne aktivnosti enzima, CM može da bude otcepljen. Dovoljna aktivnost enzima može da se odnosi na sposobnost enzima da ostvari kontakt sa CM i ostvari cepanje. Lako može da se zamisli da enzim može da bude u blizini CM, ali ne može da obavi cepanje zbog drugih ćelijskih faktora ili modifikacije proteina enzima.
[0243] Ilustrativni supstrati uključuju, ali nisu ograničeni na supstrate koje može da cepa jedan ili više od sledećih enzima ili proteaza iz tabele 3:
Tabela 3: Primeri proteaza i/ili enzima
1
[0244] Na primer, u nekim primerima izvođenja, supstrat može da se cepa pomoću jednog ili više od sledećih enzima ili proteaza: uPA, legumain, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, i/ili MMP-14. U nekim primerima izvođenja, proteaza je odabrana iz grupe: uPA, legumain, i MT-SP1. U nekim primerima izvođenja, proteaza je matriksna metaloproteinaza. U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži uPA. U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži legumain. U nekim primerima izvođenja, proteaza sadrži MT-SP1.
2
[0245] U nekim primerima izvođenja, CM je odabran za upotrebu sa specifičnom proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od ADAM 17, BMP-1, cistein proteaze kao što je katepsin, HtrA1, legumaina, matriptaze (MT-SP1), matriksne metaloproteaze (MMP), neutrofilne elastaze, TMPRSS, kao što je TMPRSS3 ili TMPRSS4, trombina, i aktivatora plazminogena u-tipa (uPA, označen i kao urokinaza).
[0246] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za ADAM17. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za BMP-1. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za katepsin. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za cistein proteazu. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za HtrA1. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za legumain. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MT-SP1. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za neutrofilnu elastazu. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za trombin. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za TMPRSS. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za TMPRSS3. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za TMPRSS4. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za uPA.
[0247] U nekim primerima izvođenja, fragment koji može da se otcepi je odabran za upotrebu sa specifičnom proteazom, na primer sa proteazom za koju je poznato da je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulom antitela koje može da se aktivira. Na primer, pogodni fragmenti koji mogu da se otcepe za upotrebu u antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću uključuju sekvencu TGRGPSWV (SEQ ID NO: 27); SARGPSRW (SEQ TD NO: 28); TARGPSFK (SEQ ID NO: 29); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 30); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 31); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 32); AARGPAIH (SEQ ID NO: 33); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 34); SSRGPAYL (SEQ TD NO: 35); RGPATPIM (SEQ ID NO: 36); RGPA (SEQ ID NO: 37); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 38); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 39); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 40); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 41); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 42); LAPLGLQRR (SEQ 1D NO: 43); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 44); i/ili PLGL (SEQ ID NO: 45).
[0248] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP). Primeri MMP uključuju MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; i MMP27. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, i MMP19. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP7. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP9. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP14. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za dve ili više MMP. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje MMP9 i MMP14. U nekim primerima izvođenja, CM sadrži dva ili više supstrata za istu MMP. U nekim primerima izvođenja, CM sadrži najmanje dva ili više supstrata za MMP9. U nekim primerima izvođenja, CM sadrži najmanje dva ili više supstrata za MMP14.
[0249] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP i uključuje sekvencu ISSGLLSS (SEQ ID NO: 316); QNQALRMA (SEQ ID NO: 317); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 318); STFPFGMF (SEQ ID NO: 319); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 320); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 321); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 322); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 323); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 324); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 325); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 326); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 327); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 328); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 329); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 330); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 331); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 332); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 333); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 334); i/ili ISSGLSS (SEQ ID NO: 335).
[0250] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću mogu da budu napravljena biosintetski upotrebom tehnologije rekombinantne DNK i ekspresijom u eukariotskim ili prokariotskim vrstama. Kod multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju, cDNA koje kodiraju maskirajući fragment, linkersku sekvencu (koja može da uključuje fragment koji može da se otcepi (CM), i lanac antitela (teški ili laki)) mogu da budu povezane u 5' ka 3' (N- ka C-kraju u translatiranom proizvodu) sekvenci, kako bi nastao konstrukt nukleinske kiseline, koji se eksprimira kao protein multispecifičnog antitela koje može da se aktivira nakon uobičajenog postupka ekspresije antitela. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira moglo bi da bude proizvedeno polu-sintetski, ekspresijom konstrukta CM-antitelo, a zatim kuplovanjem maskirajućeg elementa hemijskim putem na, ili blizu N-kraja proteina. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira moglo bi da se proizvede ekspresijom antitela, a zatim kuplovanjem maskirajućeg elementa i CM hemijskim putem na, ili blizu N-kraja proteina, tako da multispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM.
[0251] Linkeri pogodni za upotrebu u ovde opisanim kompozicijama su uglavnom oni koji obezbeđuju fleksibilnost modifikovanog AB ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju kako bi se olakšala inhibicija vezivanja najmanje prvog AB za ciljni molekul. Takvi linkeri su uopšteno označeni kao fleksibilni linkeri. Pogodni linkeri mogu lako da se odaberu i
4
mogu da imaju bilo koju pogodnu dužinu, kao što je od 1 aminokiseline (npr.. Gly) do 20 aminokiselina, od 2 aminokiseline do 15 aminokiselina, od 3 aminokiseline do 12 aminokiselina, uključujući 4 aminokiseline do 10 aminokiselina, 5 aminokiselina do 9 aminokiselina, 6 aminokiselina do 8 aminokiselina, ili 7 aminokiselina do 8 aminokiselina, i mogu da budu dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 aminokiselina.
[0252] Primeri fleksibilnih linkera uključuju polimere glicina (G)n, polimere glicin-serin (uključujući, na primer, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 18) i (GGGS)n (SEQ ID NO: 19), gde je n ceo broj od najmanje jedan), polimere glicin-alanin, polimere alanin-serin, i druge fleksibilne linkere poznate u stanju tehnike. Polimeri glicina i glicin-serin su relativno nestrukturirani, i stoga mogu da služe kao neutralni spoj između komponenata. Glicin pokriva značajno veći prostor fi-psi čak i od alanina, i znatno je manje ograničen od rezidua sa dužim bočnim lancima (videti Scheraga. Rev. Computational Chem.11173-142 (1992)). Ilustrativni fleksibilni linkeri, uključuju, ali nisu ograničeni na Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 20), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 21), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 22), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 23). Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 24), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO; 25), i slično. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da dizajn antitela koja mogu da se aktiviraju može da uključuje linkere koji su potpuno ili delimično fleksibilni, tako da linker može da uključuje fleksibilni linker, kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu kako bi se dobila željena struktura multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0253] Pored iznad opisanih elemenata, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da sadrže dodatne elemente kao što su, na primer, aminokiselinska sekvenca N- ili C-terminalno od multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. Na primer, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da uključuju usmeravajući fragment za olakšanu isporuku u ćeliju ili tkivo od interesa. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu konjugovana sa agensom, kao što je terapijski agens, antineoplastični agens, toksin ili njegov fragment, detektabilni fragment ili dijagnostički agens. Primeri agenasa su ovde opisani.
[0254] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu takođe da uključuju bilo koji od konjugovanih agenasa, linkera i drugih komponenata koje su ovde opisane u vezi sa multispecifičnim antitelom prema otkriću, uključujući, kao neograničavajući primer, bilo koji od agenasa navedenih u tabeli 4 i/ili bilo koji od linkera navedenih u tabeli 5 i/ili tabeli 6. Konjugovana multispecifična antitela i konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju
[0255] Otkriće se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira konjugovane sa citotoksičnim agensom kao što je toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat). Pogodni citotoksični agensi uključuju, na primer, dolastatine i njihove derivate (npr. auristatin E, AFP, MMAD, MMAF, MMAE). Na primer, citotoksični agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je agens odabran iz grupe navedene u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin.
[0256] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji mogu da se upotrebe uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, diantin proteine, proteine Phytolacca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i trikotecene. Razni radionuklidi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<64>Cu,<125>I,<131>I,<131>In,<99m>Tc,<90>Y,<186>Re, i<89>Zr.
[0257] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa prave se upotrebom raznih bifunkcionalnih protein-kuplujućih agenasa kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je tolien 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricinski imunotoksin može da se pripremi kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).
1-Izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom 14 je primer helirajućeg agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. (Videti WO94/11026).
[0258] Tabela 4 navodi neke od primera farmaceutskih agenasa koji mogu da se koriste u ovde opisanom otkriću, ali to ni u kom slučaju nije isključiva lista.
Tabela 4: Primeri farmaceutskih agenasa za konjugaciju
[0259] Stručnjaci sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti prepoznaće da širok opseg mogućih fragmenata može da bude kuplovan sa rezultujućim multispecifičnim antitelima i/ili multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću. (Videti, na primer, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
[0260] Kuplovanje može da se postigne bilo kojom hemijskom reakcijom koja će vezati dva molekula, sve dok antitelo i drugi fragment zadržavaju svoje odgovarajuće aktivnosti. Ovo povezivanje može da uključuje mnoge hemijske mehanizme, na primer kovalentno vezivanje, afinitetno vezivanje, interkalaciju, koordinatno vezivanje i kompleksiranje. U nekim primerima izvođenja, poželjno vezivanje je, međutim, kovalentno vezivanje. Kovalentno vezivanje može da se postigne ili direktnom kondenzacijom postojećih bočnih lanaca ili ugradnjom spoljašnjih premošćujućih molekula. Mnogi bivalentni ili polivalentni vezujući agensi su korisni u kuplovanju proteinskih molekula, kao što su antitela predmetnog otkrića, sa drugim molekulima. Na primer, reprezentativni agensi za kuplovanje mogu da uključuju organska jedinjenja kao što su tioestri, karbodiimidi, sukcinimid estri, diizocijanati, glutaraldehid, diazobenzeni i heksametilen diamini. Ovaj spisak nije namenjen da bude kompletan za različite klase agenasa za kuplovanje poznate u stanju tehnike, već predstavlja primere uobičajenih agenasa za kuplovanje. (Videti Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); i Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)).
[0261] U nekim primerima izvođenja, pored kompozicija i postupaka koji su ovde obezbeđeni, konjugovano antitelo koje može da se aktivira može takođe da bude modifikovano za mestospecifičnu konjugaciju putem modifikovanih aminokiselinskih sekvenci ubačenih ili drugačije uključenih u sekvencu antitela koje može da se aktivira. Ove modifikovane aminokiselinske sekvence su konstruisane da omoguće kontrolisano postavljanje i/ili doziranje konjugovanog agensa u konjugovanom antitelu koje može da se aktivira. Na primer, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako da uključuje cisteinske supstitucije na pozicijama na lakim i teškim lancima koje obezbeđuju reaktivne tiolne grupe i ne utiču negativno na savijanje i sklapanje proteina, niti menjaju vezivanje antigena. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako da se jedna ili više neprirodnih
1
aminokiselinskih rezidua uključuju, ili drugačije uvode u antitelo koje može da se aktivira da bi se obezbedila pogodna mesta za konjugaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako, da se peptidne sekvence koje mogu da se aktiviraju putem enzima uključuju, ili drugačije uvode u sekvencu antitela koje može da se aktivira.
[0262] Pogodni linkeri su opisani u literaturi. (Videti, na primer, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984) gde je opisana upotreba MBS (M-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estra). Videti takođe, SAD patent br. 5,030,719, koji opisuje upotrebu halogenovanog derivata acetil hidrazida kuplovanog sa antitelom pomoću oligopeptidnog linkera. Naročito pogodni linkeri uključuju: (i) SMPT (4-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metilalfa-(2-pridil-ditio)-toluen (Pierce Chem. Co., kat. (21558G); (ii) SPDP (sukcinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]heksanoat (Pierce Chem. Co., kat. br. 21651G); i (iii) Sulfo-LC-SPDP (sulfosukcinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamid] heksanoat (Pierce Chem. Co. kat. br. 2165-G. Dodatni linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, SMCC, sulfo-SMCC, SPDB, ili sulfo-SPDB.
[0263] Gore opisani linkeri sadrže komponente koje imaju različite osobine, što dovodi do nastanka konjugata sa različitim fizikohemijskim svojstvima. Na primer, linker SMPT sadrži sterno ometenu disulfidnu vezu, i može da formira konjugate povećane stabilnosti. Disulfidne veze su uopšteno manje stabilne od drugih veza jer se disulfidna veza cepa in vitro, što za rezultat ima manje dostupnog konjugata.
[0264] Reagens EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid) je koristan za stvaranje karboksamida polazeći od karboksilne kiseline i primarnog ili sekundarnog amina. Prema tome, EDC može da se upotrebi da veže lizinske rezidue u antitelu sa karboksilnom kiselinom u linkeru ili toksinu, ili da veže rezidue aspartata ili glutamata u antitelu sa aminom u linkeru ili toksinu. Takve reakcije konjugacije koje koriste EDC mogu da se pojačaju dodavanjem NHS (N-hidroksisuckinimid) ili sulfo-NHS (N-hidroksi-3-oksisulfonilsuckinimid). Dodavanje NHS ili sulfo-NHS takvim reakcijama konjugacije može da poveća brzinu, potpunost, selektivnost, i/ili reproducibilnost reakcija konjugacije.
[0265] U nekim primerima izvođenja, linkeri mogu da se otcepe. U nekim primerima izvođenja, linkeri ne mogu da se otcepe. U nekim primerima izvođenja, prisutna su dva ili više linkera. Dva ili više linkera su svi isti, tj., mogu da se otcepe ili ne mogu da se otcepe, ili su dva ili više linkera različiti, tj., najmanje jedan koji može da se otcepi i najmanje jedan koji ne može da se otcepi.
1 1
[0266] Predmetno otkriće koristi nekoliko postupaka za vezivanje agenasa za Ab multispecifičnih antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju: (a) vezivanje za karbohidratne fragmente AB, ili (b) vezivanje za sulfhidrilne grupe AB, ili (c) vezivanje za amino grupe AB, ili (d) vezivanje za karboksilatne grupe AB. Prema otkriću, AB mogu da budu kovalentno vezani za agens preko intermedijarnog linkera koji ima najmanje dve reaktivne grupe, jednu za reakciju sa AB i jednu za reakciju sa agensom. Linker, koji može da uključuje bilo koje kompatibilno organsko jedinjenje, može da bude odabran tako da reakcija sa AB (ili agensom) ne utiče negativno na reaktivnost i selektivnost AB. Osim toga, vezivanje linkera za agens može da ne naruši aktivnost agensa. Pogodni linkeri za reakciju sa oksidovanim antitelima ili oksidovanim fragmentima antitela uključuju one koji sadrže amin izabran iz grupe koja se sastoji od primarne amino, sekundarne amino, hidrazinske, hidrazidne, hidrokailamino, fenilhidrazinske, semikarbazidne i tiosemikarbazidne grupe. Takve reaktivne funkcionalne grupe mogu da postoje kao deo strukture linkera, ili mogu da se uvedu pogodnom hemijskom modifikacijom linkera koji ne sadrže takve grupe.
[0267] Prema predmetnom otkriću, pogodni linkeri za vezivanje sa redukovanim AB multispecifičnih antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju one koji imaju određene reaktivne grupe sposobne da reaguju sa sulfhidrilnom grupom redukovanog antitela ili fragmenta. Takve reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na: reaktivne haloalkil grupe (uključujući, na primer, haloacetil grupe), p-merkuribenzoatne grupe i grupe sposobne za reakcije tipa Majklove adicije (uključujući, na primer, maleimide i grupe tipa opisanog kod Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc.101: 3097-3110).
[0268] Prema predmetnom otkriću, pogodni linkeri za vezivanje sa AB multispecifičnih antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju, koji nisu ni oksidovani ni redukovani, uključuju one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa primarnim amino grupama prisutne u nemodifikovanim lizinskim reziduama u AB. Takve reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, NHS estre karboksilne ili ugljene kiseline, sulfo-NHS estre karboksilne ili ugljene kiseline, 4-nitrofenil estre karboksilne ili ugljene kiseline, pentafluorofenil estre karboksilne ili ugljene kiseline, acil imidazole, izocijanate i izotiocijanate.
[0269] Prema predmetnom otkriću, pogodni linkeri za vezivanje sa AB koji nisu ni oksidovani ni redukovani uključuju one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa grupama karboksilne kiseline prisutnim u reziduama aspartata ili glutamata u AB, koje su aktivirane odgovarajućim reagensima. Pogodni aktivirajući reagensi uključuju EDC, sa ili bez dodatog NHS ili sulfo-NHS, i druge dehidratacione agense koji se upotrebljavaju za formiranje
1 2
karboksamida. U ovim slučajevima, funkcionalne grupe prisutne u pogodnim linkerima uključivale bi primarne i sekundarne amino, hidrazinske, hidroksilaminske i hidrazidne grupe.
[0270] Agens može da bude vezan za linker pre ili posle vezivanja linkera za AB. U određenim primenama može da bude poželjno da se prvo proizvede intermedijer AB-linker u kome je linker bez povezanog agensa. U zavisnosti od konkretne primene, specifični agens može zatim da se kovalentno veže za linker. U drugim primerima izvođenja, AB se prvo veže za MM, CM i povezane linkere, a zatim se veže za linker koji služi za konjugaciju.
[0271] Granati linkeri: U specifičnim primerima izvođenja, upotrebljavaju se granati linkeri koji imaju višestruke pozicije za vezivanje agenasa. Kod linkera sa višestrukim pozicijama, pojedinačno kovalentno vezivanje za AB rezultovalo bi intermedijerom AB-linker sposobnim za vezivanje agensa na većem broju pozicija. Pozicije mogu da budu aldehidne ili sulfhidrilne grupe ili bilo koja hemijska pozicija za koju agens može da se veže.
[0272] Alternativno, veća specifična aktivnost (ili veći odnos agenasa prema AB) može da se ostvari vezivanjem linkera sa jednom pozicijom na većem broju pozicija u AB. Ovo mnoštvo pozicija može da bude uvedeno u AB bilo kojim od dva postupka. Prvo, mogu da se generišu višestruke aldehidne grupe i/ili sulfhidrilne grupe u istom AB. Drugo, za aldehid ili sulfhidril u AB može da se veže "granati linker" koji ima višestruke funkcionalne pozicije za naknadno vezivanje za linkere. Funkcionalne pozicije granatog linkera ili linkera sa višestrukim pozicijama mogu da budu aldehidne ili sulfhidrilne grupe, ili može da bude bilo koja hemijska pozicija za koju linkeri mogu da budu vezani. Još veće specifične aktivnosti mogu se dobiti kombinovanjem ova dva pristupa, odnosno vezivanjem linkera sa višestrukim pozicijama na nekoliko pozicija u AB.
[0273] Linkeri koji mogu da se otcepe: Peptidni linkeri koji su podložni cepanju enzimima sistema komplementa kao što su, ali bez ograničenja urokinaza, tkivni aktivator plazminogena, tripsin, plazmin, ili drugi enzim koji ima proteolitičku aktivnost, mogu da se koriste u jednom primeru izvođenja predmetnog otkrića. Prema jednom postupku predmetnog otkrića, agens se vezuje preko linkera podložnog cepanju dejstvom komplementa.
[0274] Antitelo se bira iz klase koja može da aktivira komplement. Konjugat antitelo-agens, prema tome, aktivira kaskadu komplementa i oslobađa agens na ciljnoj poziciji. Prema sledećem postupku predmetnog otkrića, agens se vezuje preko linkera podložnog cepanju enzimima koji imaju proteolitičku aktivnost, kao što su urokinaza, tkivni aktivator plazminogena, plazmin ili tripsin. Ovi linkeri koji mogu da se otcepe su korisni u konjugovanim antitelima koja mogu da se aktiviraju koja uključuju vanćelijski toksin, npr., u smislu neograničavajućeg primera, bilo koji od vanćelijskih toksina prikazanih u tabeli 4.
1
[0275] Neograničavajući primeri sekvenci linkera koji mogu da se otcepe dati su u tabeli 5.
Tabela 5: Primeri sekvenci linkera za konjugaciju
1 4
[0276] Pored toga, agensi mogu da budu vezani putem disulfidnih veza (na primer, disulfidnih veza na molekulu cisteina) za AB. Budući da mnogi tumori prirodno oslobađaju visoke nivoe glutationa (redukcioni agens), to može da redukuje disulfidne veze uz naknadno oslobađanje agensa na mestu isporuke. U nekim specifičnim primerima izvođenja, redukcioni agens koji bi modifikovao CM takođe bi modifikovao linker konjugovanog antitela koje može da se aktivira.
[0277] Spejseri i elementi koji mogu da se otcepe: U sledećim primerima izvođenja, može da bude neophodno konstruisanje linkera na taj način da se optimizuje razmak između agensa i AB antitela koje može da se aktivira. Ovo može da se ostvari upotrebom linkera opšte strukture:
W - (CH2)n-Q
gde
W je ili -NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je aminokiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
1
[0278] U još nekim primerima izvođenja, linker može da sadrži spejserski element i element koji može da se otcepi. Spejserski element služi da pozicionira element koji može da se otcepi dalje od jezgra AB, tako da je element koji može da se otcepi pristupačniji za enzim odgovoran za cepanje. Određeni granati linkeri koji su opisani iznad mogu da služe kao spejserski elementi.
[0279] U ovoj diskusiji se podrazumeva da vezivanje linkera za agens (ili spejserskog elementa za element koji može da se otcepi, ili elementa koji može da se otcepi za agens) ne mora da predstavlja poseban način vezivanja ili reakciju. Prihvatljiva je svaka reakcija koja daje proizvod odgovarajuće stabilnosti i biološke kompatibilnosti.
[0280] Serumski komplement i izbor linkera: Prema jednom postupku predmetnog otkrića, kada je poželjno oslobađanje agensa, upotrebljava se AB koji predstavlja antitelo klase koja može da aktivira komplement. Rezultujući konjugat zadržava i sposobnost da veže antigen i da aktivira kaskadu komplementa. Prema tome, prema ovom primeru izvođenja predmetnog otkrića, agens je spojen za jedan kraj linkera koji može da se otcepi ili elementa koji može da se otcepi, a drugi kraj linkerske grupe vezan je za specifičnu poziciju u AB. Na primer, ako agens ima hidroksilnu grupu ili amino grupu, može da bude vezan za karboksilni kraj peptida, aminokiselinu, ili drugi pogodno odabran linker, preko estrske, odnosno amidne veze. Na primer, takvi agensi mogu da budu vezani za peptidni linker preko karbodimidne reakcije. Ako agens sadrži funkcionalne grupe koje bi interferirale sa vezivanjem za linker, ove interferirajuće funkcionalne grupe mogu da budu blokirane pre vezivanja i deblokirane kada proizvod, konjugat ili intermedijer, bude napravljen. Suprotni ili amino-kraj linkera se tada koristi ili direktno, ili posle dalje modifikacije za vezivanje sa AB koje može da aktivira komplement.
[0281] Linkeri (ili spejserski elementi linkera) mogu da budu bilo koje željene dužine, jedan njihov kraj može da bude kovalentno vezan za specifične pozicije na AB antitela koje može da se aktivira. Drugi kraj linkera ili spejserskog elementa može da bude vezan za aminokiselinu ili peptidni linker.
[0282] Prema tome, kada se ovi konjugati vežu za antigen u prisustvu komplementa, amidna ili estarska veza koja povezuje agens sa linkerom će biti razdvojena, što rezultuje oslobađanjem agensa u njegovom aktivnom obliku. Ovi konjugati, kada se primene kod subjekta, izvršiće isporuku i oslobađanje agensa na ciljnom mestu, i posebno su efikasni za in vivo isporuku farmaceutskih agenasa, antibiotika, antimetabolita, antiproliferativnih agenasa i slično, kao što je predstavljeno, ali bez ograničenja, u tabeli 4.
1
[0283] Linkeri za oslobađanje bez aktivacije komplementa: U još jednoj primeni ciljne isporuke, poželjno je oslobađanje agensa bez aktivacije komplementa, budući da će aktivacija kaskade komplementa na kraju lizirati ciljnu ćeliju. Stoga, ovaj pristup je koristan kada treba da se postigne isporuka i oslobađanje agensa bez istovremene lize ciljne ćelije. To je slučaj kada je u ciljne ćelije potrebno isporučiti ćelijske medijatore, kao što su hormoni, enzimi, kortikosteroidi, neurotransmiteri, geni ili enzimi. Ovi konjugati mogu da se pripreme vezivanjem agensa za AB koji nije sposoban za aktivaciju komplementa preko linkera koji je umereno podložan cepanju serumskim proteazama. Kada se ovaj konjugat primeni kod osobe, kompleksi antigen-antitelo će se brzo formirati, dok će se otcepljivanje agensa odvijati sporo, dovodeći, na taj način, do oslobađanja jedinjenja na ciljnom mestu.
[0284] Biohemijski unakrsni linkeri: U drugim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može da bude konjugovano sa jednim ili više terapijskih agenasa upotrebom određenih biohemijskih unakrsnih linkera. Umrežavajući reagensi obrazuju molekulske mostove koji povezuju funkcionalne grupe dva različita molekula. Da bi se dva različita proteina postupno spojila, mogu da se koriste hetero-bifunkcionalni unakrsni linkeri koji eliminišu nepoželjno obrazovanje homopolimera.
[0285] Peptidni linkeri koji mogu da se otcepe pomoću lizozomalnih proteaza su takođe korisni, na primer, Val-Cit, Val-Ala ili drugi dipeptidi. Pored toga, mogu da se upotrebe linkeri nepostojani u prisustvu kiselina koji mogu da se otcepe u lizozomskom okruženju sa niskim pH, na primer: bis-sialil etar. Drugi pogodni linkeri uključuju supstrate nepostojane u prisustvu katepsina, posebno one koji pokazuju optimalnu funkciju na kiselom pH.
[0286] Primeri hetero-bifunkcionalnih unakrsnih linkera navedeni su u tabeli 6.
Tabela 6: Primeri hetero-bifunkcionalnih unakrsnih linkera
1
HETERO-BIFUNKCIONALNI UNAKRSNI LINKERI
1
[0287] Linkeri koji ne mogu da se otcepe ili direktno vezivanje: U sledećim primerima izvođenja prema otkriću, konjugat može da bude konstruisan tako da se agens isporuči na cilj, ali bez oslobađanja. Ovo može da se obavi vezivanjem agensa za AB bilo direktno ili preko linkera koji ne može da se otcepi.
[0288] Ovi linkeri koji ne mogu da se otcepe mogu da uključuju aminokiseline, peptide, D-aminokiseline ili druga organska jedinjenja koja mogu da budu modifikovana tako da uključuju funkcionalne grupe koje mogu naknadno da se upotrebe u vezivanju za AB ovde opisanim postupcima. Opšta formula za takav organski linker mogla bi da bude
W - (CH2)n – Q
gde
W je ili --NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je aminokiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0289] Konjugati koji ne mogu da se otcepe: Alternativno, jedinjenje može da bude vezano za AB koji ne aktiviraju komplement. Kada se upotrebljavaju AB koji nisu sposobni da aktiviraju komplement, ovo povezivanje može da se ostvari upotrebom linkera koji su podložni cepanju aktiviranim komplementom ili upotrebom linkera koji nisu podložni cepanju aktiviranim komplementom.
[0290] Ovde opisana antitela mogu takođe da budu formulisana kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo pripremaju se postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što je opisano kod Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad.
1
Sci. USA, 77: 4030 (1980); i SAD pat. br. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom cirkulacije opisani su u SAD patentu br.5,013,556.
[0291] Posebno korisni lipozomi mogu da budu napravljeni postupkom reverzno-fazne evaporacije sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol, i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se protiskuju kroz filtere definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab' fragmenti antitela predmetnog otkrića mogu da budu konjugovani sa lipozomima kao što je opisano kod Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) preko reakcije izmene disulfida.
Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju nevezujuće sterne fragmente ili vezujuće partnere za nevezujuće sterne fragmente
[0292] Otkriće takođe obezbeđuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju nevezujuće sterne fragmente (NB) ili vezujuće partnere (BP) za nevezujuće sterne fragmente, gde BP regrutuje ili na drugi način privlači NB ka multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira. Ovde obezbeđena multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju, na primer, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje nevezujući sterni fragment (NB), linker koji može da se otcepi (CL) i najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul ili epitop; multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje vezujućeg partnera za nevezujući sterni fragment (BP), CL i AB1; i multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje BP koji privlači NB, CL i AB1 koji vezuje prvi ciljni molekul ili epitop. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je NB kovalentno vezan za CL i AB1 ili je udružen interakcijom sa BP koji je kovalentno vezan za CL i AB1 ovde su označena kao "multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže NB". Pod izrazom koje može da se aktivira ili promenljivo, misli se da antitelo koje može da se aktivira ispoljava prvi nivo vezivanja za ciljni molekul kada je antitelo koje može da se aktivira u inhibiranom, maskiranom ili neotcepljenom stanju (tj., prvoj konformaciji), i drugi nivo vezivanja za ciljni molekul kada je antitelo koje može da se aktivira u neinhibiranom, nemaskiranom i/ili otcepljenom stanju (tj., drugoj konformaciji, tj., aktivirano antitelo), gde je drugi nivo vezivanja ciljnog molekula veći od prvog nivoa vezivanja ciljnog molekula. Kompozicije multispecifičnog antitela koje može da se aktivira mogu da ispolje povećanu biološku raspoloživost i povoljniju biološku raspodelu u poređenju sa konvencionalnim terapeuticima na bazi antitela.
[0293] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđuju smanjenu toksičnost i/ili neželjena sporedna dejstva, koja bi inače mogla da nastanu vezivanjem multispecifičnog antitela koje može da se aktivira na mestima koja nisu
11
mesta lečenja i/ili dijagnostike, kada multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju ne bi bila maskirana, ili njihovo vezivanje na takvom mestu drugačije inhibirano.
[0294] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujući sterni fragment (NB); linker koji može da se otcepi (CL); i najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za prvi ciljni molekul ili epitop, gde je NB polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB1; CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju NB interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul, a u otcepljenom stanju NB ne interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul; i NB ne inhibira otcepljivanje CL enzimom. Kako se koristi ovde i na drugom mestu, termin polipeptid se odnosi na bilo koji polipeptid koji uključuje najmanje dve aminokiselinske rezidue, uključujući veće polipeptide, proteine cele dužine i njihove fragmente, i termin polipeptid nije ograničen na jednolančane polipeptide i može da uključuje višejedinične, npr., višelančane polipeptide. U slučajevima kada je polipeptid kraći, na primer, manje od ukupno 50 aminokiselina, termini peptid i polipeptid se ovde koriste kao sinonimi, a u slučajevima kada je polipeptid veće dužine, na primer, 50 aminokiselina, ili više, termini polipeptid i protein se ovde koriste kao sinonimi.
[0295] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujući sterni fragment (NB); linker koji može da se otcepi (CL); i najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za prvi ciljni molekul ili epitop, gde (i) NB uključuje polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB1; (ii) CL je polipeptid dužine do 50 aminokiselina koji uključuje supstrat (S) za enzim; (iii) CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju, NB interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul, a u otcepljenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul; i (iv) NB ne inhibira otcepljivanje CL enzimom. Na primer, CL ima dužinu do 15 aminokiselina, dužinu do 20 aminokiselina, dužinu do 25 aminokiselina, dužinu do 30 aminokiselina, dužinu do 35 aminokiselina, dužinu do 40 aminokiselina, dužinu do 45 aminokiselina, dužinu do 50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 10-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 15-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 20-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 25-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 30-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 35-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 40-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 45-50 aminokiselina, dužinu u opsegu od 10-40 aminokiselina, dužinu u opsegu od 15-40 aminokiselina, dužinu u opsegu od 20-40 aminokiselina, dužinu u opsegu od 25-40 aminokiselina, dužinu u opsegu od 30-40 aminokiselina, dužinu u opsegu od 35-40 aminokiselina, dužinu u opsegu od 10-30 aminokiselina, dužinu u opsegu od 15-30 aminokiselina, dužinu u opsegu od 20-30 aminokiselina, dužinu u opsegu od 25-30 aminokiselina, dužinu u opsegu od 10-20 aminokiselina, ili dužinu u opsegu od 10-15 aminokiselina.
[0296] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujući sterni fragment (NB); linker koji može da se otcepi (CL); i najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za prvi ciljni molekul ili epitop, gde (i) NB uključuje polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB1; (ii) CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (iii) CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju NB interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul, a u otcepljenom stanju NB ne interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul; (iv) NB ne inhibira otcepljivanje CL enzimom; i (v) najmanje deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraja u neotcepljenom stanju: NB-CL-AB1 ili AB1-CL-NB.
[0297] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujući sterni fragment (NB); linker koji može da se otcepi (CL); i najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za prvi ciljni molekul ili epitop, gde (i) NB uključuje polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB1; (ii) CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (iii) CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju NB interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul, a u otcepljenom stanju NB ne interferira sa vezivanjem AB1 za njegov ciljni molekul, i gde NB u neotcepljenom antitelu koje može da se aktivira redukuje sposobnost vezivanja AB1 za njegov ciljni molekul za najmanje 50%, na primer, za najmanje 60%, za najmanje 70%, za najmanje 75%, za najmanje 80%, za najmanje 85%, za najmanje 90%, za najmanje 95%, za najmanje 96%, za najmanje 97%, za najmanje 98%, za najmanje 99%, za najmanje 100% u poređenju sa sposobnošću otcepljenog AB1 da veže svoj ciljni molekul: i (iv) NB ne inhibira otcepljivanje CL enzimom. Smanjenje sposobnosti vezivanja AB za njegov ciljni molekul određuje se, na primer, upotrebom testa koji je ovde opisan ili in vitro testa zamene ciljnog molekula kao što je, na primer, test opisan u PCT objavama br. WO 2009/025846 i WO 2010/081173.
[0298] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje vezujućeg partnera (BP) za nevezujući sterni fragment (NB); linker koji može da se otcepi (CL); i najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za prvi ciljni molekul i/ili epitop, gde je BP polipeptid koji se vezuje za NB kada mu je izložen; NB se ne vezuje specifično za AB1; CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju u prisustvu NB, NB interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul, a u otcepljenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul i BP ne interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul; i NB i BP ne inhibiraju otcepljivanje CL enzimom. U nekim primerima ovog primera izvođenja, BP antitela koje može da se aktivira je opciono vezan za NB. U jednom primeru izvođenja, BP antitela koje može da se aktivira privlači NB in vivo.
[0299] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira je formulisano kao kompozicija. U nekim od ovih primera izvođenja, kompozicija takođe uključuje NB, pri čemu je NB ko-formulisan sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje BP, CL i AB. U nekim primerima ovog primera izvođenja, BP je izabran iz grupe koja se sastoji od albumin-vezujućeg peptida, fibrinogen-vezujućeg peptida, fibronektin-vezujućeg peptida, hemoglobin-vezujućeg peptida, transferin-vezujućeg peptida, peptida koji vezuje imunoglobulinske domene, i peptida koji vezuju druge serumske proteine.
[0300] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, NB je solubilan, globularni protein. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, NB je protein koji cirkuliše u krvotoku. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, NB je izabran iz grupe koja se sastoji od albumina, fibrinogena, fibronektina, hemoglobina, transferina, imunoglobulinskog domena, i drugih serumskih proteina.
[0301] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za proteazu. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, proteaza je ko-lokalizovana sa svojim ciljnim molekulom u tkivu, i proteaza cepa CL u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, CL je polipeptid dužine do 50 aminokiselina. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) koji ima dužinu do 15 aminokiselina, npr., dužine 3 aminokiseline, dužine 4 aminokiseline, dužine 5 aminokiselina, dužine 6 aminokiselina, dužine 7 aminokiselina, dužine 8 aminokiselina, dužine 9 aminokiselina, dužine 10 aminokiselina, dužine 11 aminokiselina, dužine 12 aminokiselina, dužine 13 aminokiselina, dužine 14 aminokiselina, ili dužine 15 aminokiselina.
11
[0302] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, najmanje deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju u neotcepljenom stanju: NB-CL-AB, AB-CL-NB, BP-CL-AB ili AB-CL-BP. U primerima izvođenja gde multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje BP i multispecifično antitelo koje može da se aktivira se nalazi u prisustvu odgovarajućeg NB, najmanje deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju u neotcepljenom stanju: NB:BP-CM-AB ili AB-CM-BP:NB, gde ":" predstavlja interakciju, npr., vezivanje, između NB i BP.
[0303] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje njegov ciljni molekul i predstavlja monoklonsko antitelo, domensko antitelo, jedan lanac, Fab fragment, F(ab')2fragment, scFv, scab, dAb, jednodomensko antitelo sa teškim lancem, i jednodomensko antitelo sa lakim lancem. U nekim primerima izvođenja, takvo antitelo ili njegov imunološki aktivan fragment koji vezuje ciljni molekul je mišje, himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0304] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje agens konjugovana sa AB. U nekim primerima izvođenja, agens je terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, agens jen antineoplastični agens. U nekim primerima izvođenja, agens je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovana sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens jen agens odabran iz grupe navedene u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens jen auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin.
[0305] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje detektabilni fragment. U nekim primerima izvođenja, detektabilni fragment je dijagnostički agens.
[0306] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje spejser. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje signalni peptid. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je konjugovana sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira preko spejsera. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, spejser je spojen direktno sa MM multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
[0307] U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je duži od poluživota odgovarajućeg multispecifičnog antitela; npr., pK multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prevazilazi pK odgovarajućeg multispecifičnog antitela. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira sličan je poluživotu odgovarajućeg multispecifičnog antitela. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 15 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 12 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 11 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 10 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 9 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 8 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 7 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 6 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 5 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 4 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 3 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima
11
izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 2 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 24 časa kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 20 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 18 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 16 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 14 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 12 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 10 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 8 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 6 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 4 časa kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot multispecifičnog antitela koje može da se aktivira je najmanje 3 časa kada se primeni u organizmu.
[0308] Otkriće takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od ovih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju, kao i vektore koji sadrže ove izolovane sekvence nukleinske kiseline. Otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju multispecifičnog antitela koje može da se aktivira uzgajanjem ćelija u uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži takvu sekvencu nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži takav vektor.
[0309] Konstanta disocijacije (Kd) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB za vezivanje za ciljni molekul je veća od Kdza vezivanje AB za ciljni molekul kada nije povezan sa NB ili NB:BP. Konstanta disocijacije (Kd) multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB za vezivanje za ciljni molekul je veća od Kdparentalnog AB za vezivanje za ciljni molekul. Na primer, Kdmultispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB za vezivanje za ciljni molekul je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000 000, 5000 000, 10000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10 000, 10-100 000, 10-1 000 000, 10-
11
10 000 000, 100-1000, 100-10 000, 100-100 000, 100-1 000 000, 100-10 000 000, 1000-10 000, 1000-100000, 1000-1000 000, 1000-10000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100000-1 000 000, ili 100000-10 000 000 puta veća od KdAB kada nije povezan sa NB ili NB:BP ili od Kdparentalnog AB za vezivanje za ciljni molekul Obrnuto, afinitet vezivanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB za ciljni molekul je niži od afiniteta vezivanja AB kada nije povezan sa NB ili NB:BP ili niži od afiniteta vezivanja parentalnog AB za ciljni molekul. Na primer, afinitet vezivanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000 000, 5000 000, 10 000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1 000 000, 10-10 000 000, 100-1000, 100-10 000, 100-100 000, 100-1 000000, 100-10 000 000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1 000 000, 1000-10000 000, 10000-100 000, 10 000-1 000 000, 10000-10 000 000, 100000-1 000 000, ili 100000-10 000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB kada nije povezan sa NB ili NB:BP ili niži od afiniteta vezivanja parentalnog AB prema ciljnom molekulu.
[0310] Kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži NB u prisustvu svog ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB kada nije povezan sa NB ili NB:BP. Kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži NB u prisustvu svog ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem parentalnog AB za njegov ciljni molekul. Kada se uporedi sa vezivanjem AB kada nije povezan sa NB ili NB:BP, ili sa vezivanjem parentalnog AB za svoj ciljni molekul, sposobnost multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB da veže svoj ciljni molekul je redukovana, na primer, za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže kada se meri in vitro i/ili in vivo.
[0311] Kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži NB u prisustvu svog ciljnog molekula, ali nije u prisustvu modifikujućeg agensa (na primer proteaze ili drugog enzima), specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB kada nije povezan sa NB ili NB:BP. Kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži NB u prisustvu svog ciljnog molekula, ali nije u prisustvu modifikujućeg agensa (na primer proteaze, drugog enzima,
11
redukcionog agensa, ili svetla), specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem parentalnog AB za njegov ciljni molekul. Kada se uporedi sa vezivanjem AB koji nije povezan sa NB ili NB:BP ili vezivanjem parentalnog AB za njegov ciljni molekul, sposobnost multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje sadrži NB da veže svoj ciljni molekul je redukovana, na primer, za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1.2. 3, 4, 5, 6.7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže, mereno in vitro i/ili in vivo.
[0312] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje agens konjugovan sa AB kako bi se proizveo konjugat multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja konjugata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, agens je terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, agens je dijagnostički agens. U nekim primerima izvođenja, agens je detektabilni marker. U nekim primerima izvođenja konjugata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, agens jen antineoplastični agens. U nekim primerima izvođenja konjugata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, agens je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja konjugata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, agens je konjugovana sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja konjugata multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, linker je linker koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je agens odabran iz grupe navedene u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens jen auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin.
[0313] U nekim primerima bilo kog od ovih primera izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja se vezuju za dualni ciljni molekul. Takva multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za dualni ciljni molekul sadrže dva Ab koja mogu da vežu iste ili različite ciljne molekule. U specifičnim primerima
11
izvođenja multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za dualni ciljni molekul sadrže bispecifična antitela ili fragmente antitela.
[0314] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za dualni ciljni molekul su konstruisana tako da imaju CL koji može da se otcepi agensom za otcepljivanje koji je ko-lokalizovan u ciljnom tkivu sa jednim ili oba ciljna molekula koji mogu da se vežu za AB multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za dualni ciljni molekul sa više od jednog AB za iste ili različite ciljne molekule mogu da budu konstruisana tako da imaju više od jednog CL, pri čemu prvi CL može da se otcepi pomoću agensa za otcepljivanje u prvom ciljnom tkivu i pri čemu drugi CL može da se otcepi pomoću agensa za otcepljivanje u drugom ciljnom tkivu, sa jednim ili više ciljnih molekula koji se vezuju za AB multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. U jednom primeru izvođenja, prvo i drugo ciljno tkivo je prostorno odvojeno, na primer, na različitim mestima u organizmu. U jednom primeru izvođenja, prvo i drugo ciljno tkivo je isto tkivo koje je vremenski odvojeno, na primer isto tkivo u dva različita vremenska trenutka, na primer prvi vremenski trenutak je kada je tkivo u ranom stadijumu tumora, a drugi vremenski trenutak je kada je tkivo u kasnom stadijumu tumora.
[0315] Otkriće takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju ovde opisana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju. Otkriće takođe obezbeđuje vektore koji sadrže ove nukleinske kiseline. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde opisana proizvedena su uzgajanjem ćelija u uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelije uključuju ove molekule nukleinske kiseline ili vektore.
[0316] Otkriće takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje korake (a) uzgajanja ćelije koja uključuje konstrukt nukleinske kiseline koji kodira multispecifično antitelo koje može da se aktivira u uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, gde multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje (i) nevezujući sterni fragment (NB); (ii) linker koji može da se otcepi (CL); i (iii) antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul, pri čemu (1) NB se ne vezuje specifično za AB; (2) CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (3) CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju NB interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul, a u otcepljenom stanju NB ne interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul; i (4) NB ne inhibira cepanje CL enzimom; i (b) izdvajanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
11
[0317] U još jednom primeru izvođenja, postupak uključuje korake (a) uzgajanja ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji kodira multispecifično antitelo koje može da se aktivira u uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, pri čemu multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje (i) vezujućeg partnera (BP) za nevezujući sterni fragment (NB): (ii) linker koji može da se otcepi (CL); i (iii) antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul, pri čemu (1) NB se ne vezuje specifično za AB; (2) CL je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (3) CL je postavljen tako da u neotcepljenom stanju u prisustvu NB, NB interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul, a u otcepljenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul i BP ne interferira sa vezivanjem AB za ciljni molekul; i (4) NB i BP ne inhibiraju cepanje CL enzimom; i (b) izdvajanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima ovog primera izvođenja, BP multispecifičnog antitela koje može da se aktivira vezan je za NB.
Upotreba multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju [0318] Treba imati u vidu da će se primena terapijskih entiteta u skladu sa otkrićem odvijati sa odgovarajućim nosačima, ekscipijensima, i drugim agensima koji su uključeni u formulacije da obezbede poboljšani prenos, isporuku, toleranciju, i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može da se pronađe u zbirci formula poznatoj svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), posebno poglavlje 87 autora Blaug, Seymour, u njemu. Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je Lipofectin™), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovaks (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrste gelove, i polučvrste smeše koje sadrže karbovaks. Bilo koja od gore pomenutih smeša može da bude pogodna u lečenjima i terapijama u skladu sa predmetnim otkrićem, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerabilna u odnosu na put primene. Videti takođe Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm.203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i citate u njima za
12
dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijensima i nosačima koji su dobro poznati farmaceutskim hemičarima.
[0319] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prema otkriću mogu da se upotrebe kao terapijski agensi. Takvi agensi će uglavnom biti upotrebljeni za dijagnostikovanje, prognozu, praćenje, lečenje, ublažavanje, i/ili sprečavanje bolesti ili patologije kod subjekta. Terapijski režim se sprovodi identifikovanjem subjekta, npr., humanog pacijenta ili drugog sisara koji pati od (ili je u riziku od razvoja) poremećaja upotrebom standardnih postupaka. Preparat multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, na primer u nekim primerima izvođenja, onog koje ima visoku specifičnost i visok afinitet za svoja dva ili više ciljnih antigena, primenjuje se kod subjekta i po pravilu će imati efekta zahvaljujući vezivanju sa ciljnim molekulima. Primena multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira može da poništi ili inhibira ili ometa signalnu funkciju jednog ili više ciljnih molekula. Primena multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira može da poništi ili inhibira ili ometa vezivanje jednog ili više ciljnih molekula sa endogenim ligandom za koji se oni prirodno vezuju.
[0320] U principu, ublažavanje ili lečenje bolesti ili poremećaja uključuje smanjenje jednog ili više simptoma ili medicinskih problema povezanih sa bolešću ili poremećajem. Na primer, u slučaju kancera, terapijski efikasna količina leka može da postigne jedno, ili kombinaciju sledećeg: da smanji broj ćelija kancera; smanji veličinu tumora; inhibira (tj. da u određenoj meri smanji i/ili zaustavi) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibira metastaze tumora; inhibira, u određenoj meri, rast tumora; i/ili donekle ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ovog otkrića može da se koristi za sprečavanje početka ili ponovnog pojavljivanja bolesti ili poremećaja kod subjekta, npr. čoveka ili drugog sisara, kao što je primat koji nije čovek, životinja pratilac (npr. mačka, pas, konj), životinja sa farme, radna životinja ili životinja u zoološkom vrtu. Termini subjekt i pacijent se ovde koriste kao sinonimi.
[0321] Terapijski efikasna količina multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku se generalno odnosi na količinu potrebnu za postizanje terapijskog cilja. Kao što je gore navedeno, ovo može biti interakcija vezivanja između multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira i njegovih ciljnih antigena koja, u određenim slučajevima, ometa funkcionisanje ciljnih molekula. Količina koja je potrebna da se primeni će dalje zavisiti od afiniteta vezivanja multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za njegov specifični antigen, a takođe će zavisiti od brzine kojom se primenjeno multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira iscrpljuju iz slobodnog volumena subjekta kod koga se primenjuju. Uobičajeni rasponi za terapijski efektivno doziranje multispecifičnog antitela i/ili fragmenta antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema otkriću mogu da budu, kao neograničavajući primer, od oko 0.1 mg/kg telesne težine do oko 50 mg/kg telesne težine. Uobičajene učestalosti doziranja mogu se kretati, na primer, od dva puta dnevno do jednom nedeljno.
[0322] Efikasnost lečenja se određuje pomoću bilo koje poznate metode za dijagnostikovanje ili lečenje određenog poremećaja. Postupci za skrining multispecifičnih antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju koja poseduju željenu specifičnost obuhvataju, ali nisu ograničeni na, enzimski imunosorbentni test (ELISA) i druge imunološki posredovane tehnike poznate u struci.
[0323] U još jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, usmereni na dva ili više ciljnih molekula, koriste se u postupcima poznatim u struci koji se odnose na lokalizaciju i/ili kvantifikaciju ciljnih molekula (npr. za upotrebu u merenju nivoa jednog ili više ciljnih molekula u odgovarajućim fiziološkim uzorcima, za upotrebu u dijagnostičkim metodama, za upotrebu u vizuelizaciji proteina i slično). U datom primeru izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, usmereni na dva ili više ciljnih molekula, ili njihov derivat, fragment, analog ili homolog, koji sadrži domen za vezivanje antigena koji potiče od antitela, koriste se kao farmakološki aktivna jedinjenja (u nastavku teksta označena kao "terapeutici").
[0324] U još jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, usmereni na dva ili više ciljnih molekula, koriste se za izolovanje jednog ili više ciljnih molekula standardnim tehnikama, kao što su imunoafinitetne, hromatografske ili imunoprecipitacione tehnike. Multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, usmereni na dva ili više ciljnih molekula (ili na njihov fragment), koriste se u dijagnostici za praćenje nivoa proteina u tkivu kao deo procedure kliničkog testiranja, na primer, za određivanje efikasnosti datog režima lečenja. Detekcija može da se olakša kuplovanjem (tj. fizičkim povezivanjem) antitela sa supstancom koja može da se detektuje. Primeri supstanci koje mogu da se detektuju uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa protetičke grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uključuje luminol; primeri bioluminiscentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i akvorin, a primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S ili<3>H.
[0325] U još jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira, usmereni na dva ili više ciljnih molekula, mogu da se koriste kao agens za detekciju prisustva jednog ili više ciljnih molekula (ili njihovog fragmenta) u uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži detektabilnu oznaku. Antitela su poliklonska, ili u nekim primerima izvođenja, monoklonska. Koristi se intaktno antitelo, ili njegov fragment (npr., Fab, scFv, ili F(ab')2). Pojam "obeležen", u smislu probe ili antitela, namenjen je da obuhvati direktno obeležavanje probe ili antitela kuplovanjem (tj., fizičkim spajanjem) detektabilne supstance za probu ili antitelo, kao i indirektno obeležavanje probe ili antitela reaktivnošću sa drugim reagensom koji je direktno obeležen. Primeri indirektnog obeležavanja uključuju detekciju primarnog antitela upotrebom fluorescentno-obeleženog sekundarnog antitela i obeležavanje krajeva antitela biotinom tako da može da se detektuje fluorescentnoobeleženim streptavidinom. Pojam "biološki uzorak" namenjen je da uključuje tkiva, ćelije i biološke fluide izolovane iz subjekta, kao i tkiva, ćelije i fluide prisutne u telu subjekta. Prema tome, upotreba pojma "biološki uzorak", uključuje krv i frakciju ili komponentu krvi uključujući krvni serum, krvnu plazmu, ili limfu. To znači da postupak za detekciju prema otkriću može da se koristi za detekciju proteina u biološkom uzorku in vitro kao i in vivo. Na primer, in vitro tehnike za detekciju proteinskog analita uključuju enzimski vezane imunosorbentne testove (ELISA), Western blot, imunoprecipitacije i imunofluorescenciju. Procedure za sprovođenje imunoloških testova opisane su, na primer u "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol.42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; i "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Osim toga, in vivo tehnike za detekciju proteinskog analita uključuju uvođenje u telo subjekta obeleženog antitela protiv proteinskog analita. Na primer, antitelo može da bude obeleženo radioaktivnim markerom čije prisustvo i lokacija u telu subjekta mogu da se detektuju standardnim tehnikama vizualizacije.
[0326] Multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću su takođe korisna u različitim dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednom primeru izvođenja, antitelo, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira primenjuju se kod pacijenata koji nose rizik od razvoja jednog ili više od gore
12
pomenutih poremećaja. Predispozicija pacijenta ili organa za jedan ili više od gore pomenutih poremećaja može da se odredi upotrebom genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0327] U još jednom primeru izvođenja prema otkriću, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira primenjuju se kod osoba kojima je dijagnostikovana klinička indikacija povezana sa jednim ili više od gore pomenutih poremećaja. Nakon dijagnoze, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira primenjuju se za ublažavanje ili reverziju dejstava kliničke indikacije.
[0328] Multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju takođe su korisna u detekciji jednog ili više ciljnih molekula u uzorcima uzetim od pacijenta i prema tome je takođe korisno kao dijagnostičko sredstvo. Na primer, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću koriste se u in vitro testovima, npr., ELISA, za detekciju nivoa jednog ili više ciljnih molekula u uzorku uzetom od pacijenta.
[0329] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira su imobilisani na čvrstoj podlozi (npr., bunarčić/bunarčići mikrotitarske ploče). Imobilisano antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira služi kao antitelo koje hvata bilo koji jedan ili više ciljnih molekula koji mogu da budu prisutni u ispitivanom uzorku. Pre dovođenja u kontakt imobilisanog multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira sa uzorkom uzetim od pacijenta, čvrsta podloga se ispira i tretira agensom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0330] Zatim se bunarčići tretiraju ispitivanim uzorkom za koji se sumnja da sadrži antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, npr., uzorak seruma subjekta za koga se sumnja da ima nivo cirkulišućeg antigena koji se smatra dijagnostičkim za patologiju. Posle ispiranja ispitivanog uzorka ili standarda, čvrsta podloga se tretira drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nivo detektabilne oznake se meri, i koncentracija jednog ili više ciljnih antigena u ispitivanom uzorku određuje se poređenjem sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.
[0331] Jasno je da je na osnovu rezultata dobijenih upotrebom multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira u in vitro dijagnostičkom testu, moguće odrediti stadijum bolesti kod subjekta na osnovu nivoa ekspresije jednog ili više ciljnih antigena. Za datu bolest, uzorci krvi se uzimaju od subjekata kod kojih su dijagnostikovani različiti stadijumi bolesti, i/ili se uzimaju na različitim tačkama terapijskog lečenja bolesti.
Upotrebom populacije uzoraka koji pružaju statistički značajne rezultate za svaki stadijum progresije ili terapije, određuje se opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stadijum.
[0332] Multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu takođe da se koriste u dijagnostičkim postupcima i/ili postupcima za vizualizaciju. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vitro postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vivo postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in situ postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su ex vivo postupci. Na primer, multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju CM koji može da se enzimski otcepi mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva enzima koji može da otcepi CM. Takva multispecifična antitela i/ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste u dijagnostici, koja može da uključuje in vivo detekciju (npr., kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim primerima izvođenja, okruženja sa povećanim redukcionim potencijalom kao što je ono koje može da obezbedi redukciju disulfidne veze) putem izmerenog nakupljanja multispecifičnih aktiviranih antitela (tj., antitela koja nastaju cepanjem multispecifičnog antitela koje može da se aktivira) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma-domaćina. Takvo nakupljanje aktiviranih multispecifičnih antitela ukazuje ne samo na to da tkivo eksprimira enzimsku aktivnost (ili povećani redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM) već i da tkivo eksprimira najmanje jedan ciljni molekul za koji se aktivirano antitelo vezuje.
[0333] Na primer, CM može da bude odabran tako da bude supstrat za najmanje jednu proteazu nađenu na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr., kao što je u apscesu, u organu, i slično), i slično. Najmanje jedan od AB može da bude onaj koji vezuje ciljni antigen. Upotrebom postupaka koji su ovde opisani, ili kada je pogodno, postupaka poznatih stručnjaku u ovoj oblasti, detektabilna oznaka (npr., fluorescentna oznaka ili radioaktivna oznaka ili radioaktivni obeleživač) može da bude konjugovana sa AB ili drugim regionom multispecifičnog antitela i/ili multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Pogodne detektabilne oznake razmatraju se u kontekstu gornjih metoda skrininga i dodatni specifični primeri su dati u tekstu ispod. Upotrebom najmanje jednog AB specifičnog za protein ili peptid obolelog stanja, zajedno sa najmanje jednom proteazom čija aktivnost je povišena u obolelom tkivu od interesa, antitela koja mogu da se aktiviraju će ispoljiti povećanu stopu vezivanja za obolelo tkivo u odnosu na tkiva gde enzim specifičan za CM nije prisutan na detektabilnom nivou, ili je prisutan na nižem nivou nego u obolelom tkivu, ili je neaktivan (npr., u obliku zimogena ili u kompleksu sa inhibitorom).
12
Budući da se mali proteini i peptidi brzo uklanjaju iz krvi pomoću sistema bubrežne filtracije, i budući da enzim specifičan za CM nije prisutan na detektabilnom nivou (ili je prisutan na nižim nivoima u neobolelim tkivima ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji), nakupljanje aktiviranih multispecifičnih antitela u obolelom tkivu je pojačano u odnosu na neobolela tkiva.
[0334] U drugom primeru, multispecifična koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje u uzorku. Na primer, kada multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM podložan cepanju pomoću enzima, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju (bilo kvalitativnu ili kvantitativnu) prisustva enzima u uzorku. U drugom primeru, kada multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM podložan cepanju pomoću redukcionog agensa, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju (bilo kvalitativnu ili kvantitativnu) prisustva redukujućih uslova u uzorku. Da bi se olakšala analiza u ovim postupcima, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu detektabilno obeležena, i mogu da budu vezana za podlogu (npr., čvrstu podlogu, kao što je pločica ili perla). Detektabilna oznaka može da bude smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji nije oslobođen nakon cepanja, na primer, detektabilna oznaka može da bude prigušena fluorescentna oznaka ili druga oznaka koja nije detektabilna dok se ne dogodi cepanje. Test može da bude izveden, na primer, dovođenjem u kontakt imobilisanih, detektabilno obeleženih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju sa uzorkom za koji se smatra da sadrži enzim i/ili redukcioni agens tokom vremena dovoljnog da dođe do cepanja, zatim pranjem da bi se uklonio višak uzorka i kontaminanti. Prisustvo ili odsustvo agensa za cepanje (npr., enzima ili redukcionog agensa) u uzorku se zatim procenjuje promenom u detektabilnom signalu multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju pre dovođenja u kontakt sa uzorkom npr., prisustvo i/ili porast detektabilnog signala zahvaljujući cepanju multispecifičnog antitela koje može da se aktivira pomoću agensa za cepanje u uzorku.
[0335] Takvi postupci za detekciju mogu da se prilagode tako da omogućavaju i detekciju prisustva ili odsustva ciljnog molekula koji može da veže najmanje jedan AB multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju kada je otcepljen. Tako, testovi mogu da se prilagode za procenu prisustva ili odsustva agensa za cepanje i prisustva ili odsustva ciljnog molekula od interesa. Prisustvo ili odsustvo agensa za cepanje može da bude detektovano pomoću prisustva i/ili porasta detektabilne oznake multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju kao što je gore opisano, a prisustvo ili odsustvo ciljnog molekula može da bude detektovano detekcijom kompleksa ciljni molekul-AB npr., upotrebom detektabilno obeleženog antitela protiv ciljnog molekula.
12
[0336] Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju takođe su korisna u in situ vizualizaciji za validaciju aktivacije antitela koje može da se aktivira, npr., cepanjem proteazom, i vezivanja za određeni ciljni molekul. In situ vizualizacija je tehnika koja omogućava lokalizaciju proteolitičke aktivnosti i ciljnog molekula u biološkim uzorcima kao što su ćelijske kulture ili isečci tkiva. Upotrebom ove tehnike, moguće je potvrditi i vezivanje za dati ciljni molekul i proteolitičku aktivnost na osnovu prisustva detektabilne oznake (npr., fluorescentna oznaka).
[0337] Ove tehnike su korisne za rad sa bilo kojim zamrznutim ćelijama ili tkivom koje potiče sa obolelog mesta (npr. tumorsko tkivo) ili zdravim tkivima. Ove tehnike su takođe korisne za rad sa svežim uzorcima ćelija ili tkiva.
[0338] U ovim tehnikama, antitelo koje može da se aktivira obeleženo je detektabilnom oznakom. Detektabilna oznaka može da bude fluorescentna boja, (npr. fluorofor, fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin izotiocijanat (TRITC), Alexa Fluor® oznaka), boja u blizini infracrvenog spektra (NIR) (npr., Qdot® nanokristali), koloidni metal, hapten, radioaktivni marker, biotin i amplifikacioni reagens kao što je streptavidin, ili enzim (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
[0339] Detekcija oznake u uzorku koji je bio inkubiran sa obeleženim multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira ukazuje na to da uzorak sadrži ciljni molekul i sadrži proteazu koja je specifična za CM multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo proteaze može da se potvrdi upotrebom širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili upotrebom agensa koji je specifičan za proteazu, na primer, antitela kao što je A11, koje je specifično za proteazu matriptazu (MT-SP1) i inhibira proteolitičku aktivnost MT-SP1; videti npr., međunarodnu objavu broj WO 2010/129609, objavljenu 11. novembra 2010. Isti pristup upotrebe širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili upotreba selektivnijeg inhibitornog agensa može da se koristi za identifikaciju proteaze ili klase proteaza koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo ciljnog molekula može da se potvrdi upotrebom agensa koji je specifičan za ciljni molekul, npr., drugo antitelo, ili detektabilna oznaka može da se stavi u kompeticiju sa neobeleženim ciljnim molekulom. U nekim primerima izvođenja, može da se koristi neobeleženo antitelo koje može da se aktivira, primenom detekcije obeleženim sekundarnim antitelom ili kompleksnijim sistemom za detekciju.
[0340] Slične tehnike su korisne i za in vivo vizualizaciju kod koje detekcija fluorescentnog signala kod subjekta, npr., sisara, uključujući čoveka, ukazuje na to da obolelo mesto sadrži
12
ciljni molekul i sadrži proteazu koja je specifična za CM multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
[0341] Ove tehnike su korisne i u kompletima i/ili kao reagensi za detekciju, identifikaciju ili karakterizaciju aktivnosti proteaze u raznim ćelijama, tkivima i organizmima na osnovu proteaza-specifičnog CM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira.
Terapijska primena i formulacije multispecifičnih antitela i/ili multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju
[0342] Treba imati u vidu da će se primena terapijskih entiteta u skladu sa otkrićem odvijati sa odgovarajućim nosačima, ekscipijensima, i drugim agensima koji su uključeni u formulacije da obezbede poboljšani prenos, isporuku, toleranciju, i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može da se pronađe u zbirci formula poznatoj svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), posebno poglavlje 87 autora Blaug, Seymour, u njemu. Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je Lipofectin™), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovaks (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrste gelove, i polučvrste smeše koje sadrže karbovaks. Bilo koja od gore pomenutih smeša može da bude pogodna u lečenjima i terapijama u skladu sa predmetnim otkrićem, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerabilna u odnosu na put primene. Videti takođe Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm.203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i citate u njima za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijensima i nosačima koji su dobro poznati farmaceutskim hemičarima.
[0343] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju se primenjuju zajedno sa jednim ili više dodatnih agenasa, ili kombinacijom dodatnih agenasa. Pogodni dodatni agensi uključuju aktuelne farmaceutske i/ili hirurške terapije za predviđenu primenu. Na primer, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se
12
aktiviraju mogu da se koriste zajedno sa dodatnim hemoterapijskim ili antineoplastičnim agensom. Na primer, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens su formulisani u jednoj terapijskoj kompoziciji, i multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens se primenjuju istovremeno. Alternativno, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens su međusobno odvojeni, npr., svaki je formulisan u posebnoj terapijskoj kompoziciji, i multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens se primenjuju istovremeno, ili se multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens primenjuju u različitim vremenskim trenucima tokom režima lečenja. Na primer, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju se primenjuju pre primene dodatnog agensa, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju se primenjuju nakon primene dodatnog agensa, ili se multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens primenjuju naizmenično. Kao što je ovde opisano, multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju i dodatni agens se primenjuju u pojedinačnim dozama ili u višestrukim dozama.
[0344] U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je kuplovan ili drugačije vezan za multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0345] Pogodni dodatni agensi se biraju prema svrsi predviđene primene (tj., liza ćelija, prevencija ćelijske proliferacije, hormonska terapija ili genska terapija). Takvi agensi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, na primer, farmaceutske agense, toksine, fragmente toksina, alkilirajuće agense, enzime, antibiotike, antimetabolite, antiproliferativne agense, hormone, neurotransmitere, DNK, RNK, siRNA, oligonukleotide, antisens RNK, aptamere, dijagnostička sredstva, radionepropusne boje, radioaktivne izotope, fluorogena jedinjenja, magnetne oznake, nanočestice, markere, lektine, jedinjenja koja menjaju permeabilnost
12
ćelijske membrane, fotohemijska jedinjenja, male molekule, lipozome, micele, vektore za gensku terapiju, virusne vektore i slično. Najzad, mogu da se upotrebe kombinacije agenasa ili kombinacije različitih klasa agenasa.
[0346] Multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije konjugovanih multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću (ovde označena i kao "aktivna jedinjenja"), i njihovi derivati, fragmenti, analozi i homolozi, mogu da budu uključeni u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. Principi i razmatranja uključena u pripremu takvih kompozicija, kao i vodič za izbor komponenata dati su, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; i Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New York.
[0347] Takve kompozicije obično sadrže multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kada multispecifično antitelo i/ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuju fragment domena AB, može da se upotrebi najmanji fragment AB koji se specifično vezuje za vezujući domen ciljnog proteina. Na primer, na osnovu sekvence varijabilnog regiona antitela, mogu da budu konstruisani peptidni molekuli koji zadržavaju sposobnost AB da veže ciljnu proteinsku sekvencu. Takvi peptidi mogu da budu sintetisani hemijski i/ili proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK. (Videti, npr., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)).
[0348] Kako se ovde koristi, pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač" namenjen je da uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične agense i agense koji odlažu apsorpciju, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Pogodni nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences, standardnog referentnog teksta u ovoj oblasti. Pogodni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, fiziološki rastvor, Ringerove rastvore, dekstrozni rastvor, i 5% humani serumski albumin. Mogu da se koriste i lipozomi i nevodeni vehikulumi kao što su fiksna ulja. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u ovoj oblasti. Osim ako je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nespojiv sa aktivnim jedinjenjem, njegova upotreba u kompozicijama je predviđena. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe da budu uključena u kompozicije.
1
[0349] Formulacije koje će se koristiti za in vivo primenu moraju da budu sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz membrane za sterilnu filtraciju.
[0350] Farmaceutska kompozicija prema otkriću je formulisana da bude kompatibilna sa predviđenim putem njene primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, subkutanu, oralnu (npr., inhalaciju), transdermalnu (tj., topikalnu), transmukoznu, i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije koje se koriste za parenteralnu, intradermalnu, ili subkutanu primenu mogu da uključuju sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksna ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetski rastvarači; antibakterijske agense kao što je benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuće agense kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i agense za podešavanje toničnosti kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. Vrednost pH može da se podesi kiselinama ili bazama, kao što je hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može da bude obuhvaćen u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili multidoznim bočicama od stakla ili plastike.
[0351] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne prahove za magistralnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude fluidna u stepenu koji omogućava laku primenu špricem. Mora da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora da bude konzervirana protiv kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može da bude rastvarač ili medijum za dispergovanje koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Ispravna fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antigljivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima, biće pogodno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol, natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se postigne uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
1 1
[0352] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih u tekstu iznad, po potrebi, praćenim sterilnom filtracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži bazni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, postupci za pripremu su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem koje daje prah aktivnog sastojka i bilo kog dodatnog željenog sastojka iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0353] Oralne kompozicije uopšteno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. One mogu da budu zatvorene u želatinskim kapsulama ili komprimovane u tablete. U svrhu oralne terapijske primene, aktivno jedinjenje može da bude ugrađeno sa ekscipijensima i upotrebljeno u obliku tableta, troha, ili kapsula. Oralne kompozicije mogu da budu pripremljene i upotrebom fluidnog nosača za upotrebu kao tečnost za ispiranje usta, gde se jedinjenje u fluidnom nosaču primenjuje oralno i promućka i ispljune ili proguta. Farmaceutski kompatibilni vezivni agensi, i/ili adjuvansi mogu da budu uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, trohe i slično mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo kao što je mikrokristalna celuloza, guma tragakant ili želatin; ekscipijens kao što je skrob ili laktoza, gens za raspadanje kao što je alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; sredstvo za klizanje kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aroma kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.
[0354] Za primenu inhalacijom, jedinjenja se isporučuju u obliku aerosolnog spreja iz posude pod pritiskom ili raspršivača koji sadrži pogodan propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid, ili nebulizera.
[0355] Sistemska primena može takođe da bude transmukozna ili transdermalna. Kod transmukozne ili transdermalne primene, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri kroz koju treba da se prodre. Takvi penetranti su uopšteno poznati u ovoj oblasti, i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli, i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozna primena može da se postigne upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove, ili kreme kao što je opšte poznato u ovoj oblasti.
[0356] Jedinjenja mogu da se pripreme i u obliku supozitorija (npr., sa uobičajenim bazama za supozitorije kao što su kakao buter i drugi gliceridi) ili retencione klizme za rektalnu isporuku.
1 2
[0357] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjenja su pripremljena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što su formulacije sa produženim/kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu da se koriste biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija biće očigledni stručnjacima u ovoj oblasti.
[0358] Na primer, aktivni sastojci mogu takođe da budu obuhvaćeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinske polimerizacije, na primer, u hidroksimetilceluloznim ili želatinskim mikrokapsulama i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsulama, redom, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nano-čestice, i nanokapsule) ili u makroemulzijama.
[0359] Mogu da se pripreme preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, gde su matrice u obliku uobličenih artikala, npr., filmova, ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD pat. br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamata, nedegradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT ™ (injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuterne kiseline. Dok polimeri kao što je etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda.
[0360] Materijali mogu da se dobiju i komercijalno od Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome usmerene na inficirane ćelije sa monoklonskim antitelima na virusne antigene) mogu da se koriste i kao farmaceutski prihvatljivi nosači. One mogu da se pripreme prema postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, na primer, kao što je opisano u SAD patentu br.4,522,811.
[0361] Posebno je pogodno formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u jediničnim doznim oblicima za jednostavnost primene i ujednačenost doze. Jedinični dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice pogodne kao jedinstvene doze za lečenje subjekta; pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da proizvodi željeno terapijsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne oblike prema otkriću je uslovljena i direktno zavisi od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i konkretnog terapijskog dejstva koje treba
1
da se postigne, i ograničenja svojstvenih oblasti dobijanja jedinjenja, takvih kao aktivno jedinjenje za lečenje subjekata.
[0362] Farmaceutske kompozicije mogu da se smeste u posudu, pakovanje ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.
[0363] Formulacija može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja prema potrebi za konkretnu indikaciju koja se leči, na primer, jedinjenja sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može da sadrži agens koji pojačava njenu funkciju, kao što je, na primer, citotoksični agens, citokin, hemoterapijski agens, ili agens koji inhibira rast. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenjenu svrhu.
[0364] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjenja se primenjuju u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovana sa drugim agensima, npr., terapijskim agensima, koji su korisni za lečenje patoloških stanja ili poremećaja, kao što su autoimunski poremećaji i inflamatorne bolesti. Termin "u kombinaciji" u ovom kontekstu znači da se agensi daju suštinski zajedno, bilo istovremeno ili uzastopno. Ako se daju uzastopno, na početku primene drugog jedinjenja, prvo od dva jedinjenja je još uvek detektabilno u efektivnim koncentracijama na mestu lečenja.
[0365] Na primer, kombinovana terapija može da uključuje jedno ili više antitela prema otkriću ko-formulisanih sa, i/ili ko-administriranih sa, jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa, npr., jednim ili više inhibitora citokina i faktora rasta, imunosupresiva, antiinflamatornih agenasa, metaboličkih inhibitora, inhibitora enzima, i/ili citotoksičnih ili citostatičkih agenasa, kao što je detaljnije opisano u nastavku teksta. Osim toga, jedno ili više ovde opisanih antitela može da se koristi u kombinaciji sa dva ili više ovde opisanih terapijskih agenasa. Kod takvih kombinovanih terapija mogu pogodno da se koriste niže doze primenjenih terapijskih agenasa, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa raznim monoterapijama.
[0366] U drugim primerima izvođenja, jedno ili više antitela prema otkriću mogu da budu koformulisana sa, i/ili ko-administrirana sa, jednim ili više antiinflamatornih lekova, imunosupresiva, ili metaboličkih ili enzimskih inhibitora. Neograničavajući primeri lekova ili inhibitora koji mogu da se koriste u kombinaciji sa ovde opisanim antitelima, uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više od sledećeg: nesteroidne antiinflamatorne lek(ove) (NSAID), npr., ibuprofen, tenidap, naproksen, meloksikam, piroksikam, diklofenak, i indometacin; sulfasalazin; kortikosteroide, kao prednizolon; antiinflamatorne lek(ove) koji suprimiraju citokine (CSAID); inhibitore biosinteze nukleotida, npr., inhibitore biosinteze purina, antagoniste folata (npr., metotreksat (N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil] metilamino]
1 4
benzoil]-L-glutaminska kiselina); i inhibitore biosinteze pirimidina, npr., inhibitore dihidroorotat dehidrogenaze (DHODH). Pogodni terapijski agensi za upotrebu u kombinaciji sa antitelima prema otkriću uključuju NSAID, CSAID, inhibitore (DHODH) (npr., leflunomid) i antagoniste folata (npr., metotreksat).
[0367] Primeri dodatnih inhibitora uključuju jedno ili više od sledećeg: kortikosteroide (oralni, za inhalaciju i lokalnu injekciju); imunosupresive, npr., ciklosporin, takrolimus (FK-506); i inhibitore mTOR, npr., sirolimus (rapamicin - RAPAMUNE™ ili derivati rapamicina, npr., rastvorljivi derivati rapamicina (npr., derivati estra rapamicina, npr., CCI-779); agense koji interferiraju sa signaliziranjem proinflamatornih citokina kao što su TNFα ili IL-1 (npr., IRAK, NIK, IKK, p38 ili inhibitori kinaze MAP); inhibitore COX2, npr., celekoksib, rofekoksib, i njihove varijante; inhibitore fosfodiesteraze, npr., R973401 (inhibitor fosfodiesteraze tipa IV); inhibitore fosfolipaze, npr., inhibitore citosolne fosfolipaze 2 (cPLA2) (npr., analozi trifluorometil ketona); inhibitore faktora rasta vaskularnih endotelnih ćelija ili receptora faktora rasta, npr., inhibitor VEGF i/ili inhibitor VEGF-R, i inhibitore angiogeneze. Pogodni terapijski agensi za upotrebu u kombinaciji sa antitelima prema otkriću su imunosupresivi, npr., ciklosporin, takrolimus (FK-506); inhibitori mTOR, npr., sirolimus (rapamicin) ili derivati rapamicina, npr., rastvorljivi derivati rapamicina (npr., derivati estra rapamicina, npr., CCI-779); inhibitori COX2, npr., celekoksib i njegove varijante; i inhibitori fosfolipaze, npr., inhibitori citosolne fosfolipaze 2 (cPLA2), npr., analozi trifluorometil ketona.
[0368] Dodatni primeri terapijskih agenasa koji mogu da se kombinuju sa antitelom prema otkriću uključuju jedno ili više od sledećeg: 6-merkaptopurine (6-MP); azatioprin sulfasalazin; mesalazin; olsalazin; hlorokin/hidroksihlorokin (PLAQUENIL<®>); penicilamin; aurotiomalat (intramuskularni i oralni); azatioprin; kolhicin; agoniste beta-2 adrenoreceptora (salbutamol, terbutalin, salmeterol); ksantine (teofilin, aminofilin); kromoglikat; nedokromil; ketotifen; ipratropijum i oksitropijum; mikofenolat mofetil; agoniste adenozina; antitrombotičke agense; inhibitore komplementa; i adrenergičke agense.
PRIMERI
[0369] Sledeće sekvence prikazane u tabeli 7 uključuju sekvence koje su upotrebljene u ovde datim primerima:
1
Tabela 7: Ilustrativne sekvence
1
1
1
Antitelo 5342-1204-4D11v2 protiv Jagged koje može da se aktivira: laki lanac
Multispecifično anti-Jagged antitelo 4D11v2 - anti-CD3 antitelo OKT3: teški lanac
1
��
Multispecifično anti-Jagged antitelo 4D11v2-anti-CTLA-4 antitelo: teški lanac
14
Multispecifično anti-Jagged antitelo 4D11v2-anti-CTLA-4 antitelo: laki lanac
14
Multispecifično anti-Jagged-anti-CTLA-4 antitelo 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 koje može da se aktivira: laki lanac
14
14
14
14
1
Anti-EGFR antitelo C225v6: teški lanac
11
12
1
Multispecifično anti-EGFR antitelo C225v5 - anti-CD3 antitelo OKT3: teški lanac
1 4
Multispecifično anti-EGFR antitelo C225v5 - anti-CD3 antitelo OKT3: laki lanac
1
Multispecifično anti-EGFR antitelo - anti-CD3 antitelo 3954-1204-C225v5-OKT3 koje može da se aktivira: laki lanac
1
Multispecifično anti-EGFR antitelo C225v5-anti-CTLA-4 antitelo: teški lanac
1
�
Multispecifično anti-EGFR antitelo C225v5-anti-CTLA-4 antitelo: laki lanac
1
Multispecifično anti-EGFR antitelo - anti-CTLA-4 antitelo 3954-1204-C225v5-CTLA-4 koje može da se aktivira: laki lanac
1
PRIMER 1: Priprema multispecifičnih antitela
[0370] Ovaj primer pokazuje konstruisanje, ekspresiju i prečišćavanje anti-Jagged - CD3, anti-Jagged - CTLA-4, anti-EGFR - CD3 i anti-EGFR - CTLA-4 multispecifičnih antitela.
[0371] Za ekspresiju sekvenci teškog lanca anti-Jagged antitela (4D11v2), lakog lanca antitela 5342-1204-4D11v2, teškog lanca anti-EGFR antitela C225v5, i lakog lanca antitela 3954-1204-C225v5 koje su gore prikazane upotrebljeni su vektori. Takvi vektori su opisani u istovremeno razmatranim prijavama WO2013/163631, podnetoj 26. aprila 2013, (pod nazivom "Activatable Antibodies That Bind Epidermal Growth Factor Receptor And Methods Of Use Thereof") i WO2013/192550, podnetoj 21. juna 2013, (pod nazivom "Anti-Jagged Antibodies, Activatable Anti-Jagged Antibodies and Methods of Use Thereof").
[0372] Vektori su podvrgnuti digestiji restrikcionim enzimima NheI i NotI i fragment vektora je izolovan gel elektroforezom. Inserti su pripremljeni na sledeći način. Fragment CH2CH3 humanog IgG je amplifikovan u reakciji 1, iz Pop Hygro 4D11v2 upotrebom prajmera HCForNhe (Tabela 8, SEQ ID NO: 3) i prajmera HCRevOL (Tabela 8, SEQ ID NO: 4), anti-CTLA-4 scFv je amplifikovan u reakciji 2, iz cDNA anti-CTLA-4 scFv (SEQ ID NO: 229) upotrebom prajmera CTRevNot (Tabela 8, SEQ ID NO: 1) i prajmera CTForOL (Tabela 8, SEQ ID NO: 2), scFv OKT3 je amplifikovan u reakciji 3, iz cDNA scFv OKT3 (SEQ ID NO: 231) upotrebom prajmera OKRevNot (Tabela 8, SEQ ID NO: 5) i prajmera CTForOL (Tabela 8, SEQ ID NO: 2). Fuzije CH2CH3/CTLA-4 scFv humanog IgG su pripremljene kombinovanjem 10% proizvoda reakcije 1, 10% proizvoda reakcije 2, i amplifikovanjem upotrebom prajmera HCForNhe i CTRevNot.
Tabela 8. Sekvence prajmera
1 1
[0373] Nakon amplifikacije, rezultujuća DNK je podvrgnuta digestiji restrikcionim enzimima NheI i NotI i DNK fuzije CH2CH3/CTLA-4 scFv je izolovana gel elektroforezom. Fuzije CH2CH3/OKT3 scFv humanog IgG, su pripremljene kombinovanjem 10% proizvoda reakcije 1, 10% proizvoda reakcije 3, i amplifikacijom sa prajmerima HCForNhe i CTRevNot. Nakon amplifikacije, rezultujuća DNK je podvrgnuta digestiji restrikcionim enzimima NheI i NotI i DNK fuzije CH2CH3/CTLA-4 scFv je izolovana gel elektroforezom.
[0374] Kako bi se u ekspresione vektore ubacili fragmenti CH2CH3/scFv, sledeće kombinacije prikazane u tabeli 9 su ligirane preko noći pomoću DNK-ligaze T4 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Nakon ligacije, DNK je transformisana u soj MC106 E. coil i selektovana na osnovu rezistencije na ampicilin. Sekvenciranjem DNK identifikovani su klonovi koji sadrže inserte DNK koji kodiraju ispravna multispecifična antitela ili multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, i DNK je pripremljena za transfekciju sisarskih ćelija.
Tabela 9: Reakcije ligacije
1 2
PRIMER 2: Proizvodnja multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu
da se aktiviraju
[0375] Potpuno humana IgG su eksprimirana iz prolazno transfektovanih ćelija HEK-293. Kotransfekcija posebnim ekspresionim vektorima za teški lanac i laki lanac, prikazanim u tabeli 10 omogućila je ekspresiju multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju.
Tabela 10
[0376] Multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju eksprimirana u ćelijama HEK-293 prečišćena su hromatografijom na proteinu A.
[0377] Analiza vezivanja: Kao što je prikazano na slici 11, eksperimenti vezivanja pomoću ELISA testa pokazali su da anti-Jagged-CTLA-4 i anti-Jagged-OKT3 multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju vezuju humani Jagged 1, a anti-EGFR-CTLA-4 i anti-EGFR-OKT3 multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju specifično vezuju humani EGFR.
[0378] Humani Jagged 1-Fc (R&D Systems; kat. br. 1277-JG-050) i humani EGFR (R&D Systems, kat. br.344-ER-050) su adsorbovani na različite bunarčiće ploče za ELISA test sa 96
1
bunarčića. Prečišćena anti-Jagged-CTLA i anti-Jagged-OKT3, anti-EGFR-CTLA ili anti-EGFR-OKT3 antitela su naneta na ploču i ostavljena da se vežu. Vezano antitelo je vizuelizovano pomoću konjugata anti-humani IgG-HRP (Fab specifično, Sigma, St Louis, MO; kat. br. A0293-1ML) i razvijanjem sa hromogenim supstratom TMB.
[0379] Kao što je prikazano na slikama 12A i 12B, eksperimenti vezivanja pomoću ELISA-testa pokazali su da se anti-Jagged-CTLA-4 i anti-EGFR-CTLA-4 antitela specifično vezuju i za humani i za mišji CTLA-4 (antitelo protiv humanog CTLA-4 unakrsno reaguje i sa mišjim i sa humanim CTLA-4): Humani CTLA-4 (R&D Systems; kat. br. 325-CT-200/CF) ili mišji CTLA-4 (R&D Systems, kat. br.434-CT-200/CF) je adsorbovan na bunarčiće posebnih ploča za ELISA test sa 96 bunarčića. Prečišćeno anti-Jagged antitelo 4D11v2-CTLA-4, anti-Jagged antitelo 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 koje može da se aktivira, anti-EGFR antitelo C225v5-CTLA-4 ili antitelo 3954-1204-C225v5-CTLA-4 koje može da se aktivira su naneta na ploču i ostavljena da se vežu. Vezano antitelo je vizuelizovano pomoću konjugata anti-humani IgG-HRP (Fab specifično, Sigma, St Louis, MO; kat. br. A0293-1ML) i razvijanjem sa hromogenim supstratom TMB. Specifičnost vezivanja je pokazana nemogućnošću fuzija antitelo-OKT3, specifičnih za humani CD3ε, da se vežu.
PRIMER 3: Vezivanje OKT3 za CD3ε
[0380] Kao što je prikazano na slici 13, eksperimenti vezivanja ELISA-testom pokazali su da multispecifično anti-EGFR antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3 i multispecifično anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira 5342-1204-4D11v2-OKT3 specifično vezuju humani CD3ε. Humani CD3ε (NovoProtein, kat. br. C578) je adsorbovan na bunarčiće ploče za ELISA-test sa 96 bunarčića. Prečišćeno multispecifično anti-EGFR antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-CTLA-4, multispecifično anti-EGFR antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3, multispecifično anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira 5342-1204-4D11v2-CTLA-4, ili multispecifično anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira 5342-1204-4D11v2-OKT3 su naneti na ploču i ostavljeni da se vežu. Vezano antitelo je vizuelizovano pomoću konjugata anti-humani IgG-HRP (Fab specifično, Sigma. St Louis, MO; kat. br. A0293-1ML) i razvijanjem sa hromogenim supstratom TMB.
PRIMER 4: Proteazna aktivacija multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju.
Aktivacija
[0381] Multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su razblažena u PBS do finalne koncentracije od 0.8 mg/ml. Rekombinantna humana uPA (R&D Systems, katalog 1310-SE) je dodata do finalne koncentracije od 700 nM i inkubirana na 37°C tokom ~20 h. Alikvoti proizvoda digestije su sakupljeni i pripremljeni za analizu SDS-PAGE
1 4
kao što je ispod opisano, i razblaženi do 100 nM u PBS; 0.05% Tween20 i 10 mg/mL goveđeg serumskog albumina za analizu vezivanja ELISA-testom.
[0382] Za PAGE, uzorci su denaturisani na 70°C 10 min u puferu za uzorke 1x LDS i dodat je TCEP do finalne koncentracije od 40 mM pre elektroforeze. Šest µg antitela je naneto na NuPAGE 10% Bis-Tris gel (Invitrogen) i proteini su razdvojeni po veličini upotrebom pufera za elektroforezu MOPS. Nakon elektroforeze, gel je obojen komazi plavom i rezultati su prikazani na slici 14. Promena u pokretljivosti anti-EGFR antitela 3954-1204-C225v5 koje može da se aktivira, multispecifičnog anti-EGFR antitela 3954-1204-C225v5-CTLA-4 koje može da se aktivira, anti-Jagged antitela 5342-1204-4D11v2 koje može da se aktivira i lakih lanaca multispecifičnog anti-Jagged antitela 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 koje može da se aktivira, u prisustvu uPA, ukazuje na proteolitičku aktivaciju multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju. Nedostatak bilo kakve promene u pokretljivosti fuzija teškog lanca ukazuje na otpornost na cepanje proteazom.
Testovi vezivanja
[0383] Na panelu A na slici 15 prikazano je da se multispecifično anti-EGFR antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-CTLA-4 vezuje za EGFR, prema ELISA-testu, sa nižim afinitetom (Kd = 12.8 nM) u poređenju sa C225v5 (3 nM) ili sa C225v5-CTLA-4 (0.33 nM). Međutim, kada se aktivira dejstvom uPA, multispecifično anti-EGFR antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-CTLA-4 vezuje se za EGFR sa sličnim afinitetom (0.45 nM) kao i C225v5 (0.21 nM) i C225v5-CTLA4 (0.33 nM). Važno je napomenuti da uPA nije otcepila anti-CTLA4 scFv fuzionisan sa karboksilnim krajem teškog lanca: Kao što je ilustrovano na panelu B slike 15, obrada enzimom uPA nije imala efekta na vezivanje za humani CTLA4.
[0384] Slično tome, multispecifično anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 vezuje se za humani Jagged 1, prema ELISA-testu, sa nižim afinitetom (15 nM) u poređenju sa 4D11v2 (0.44 nM) ili 4D11v2-CTLA4 (0.77 nM). Nakon aktiviranja, multispecifično anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 vezuje se za humani Jagged 1 sličnim afinitetom kao 4D11v2 (0.54 nM) i 4D11v2-CTLA4 (0.92 nM) (Slika 15, panel C). Obrada enzimom uPA nije imala efekta na vezivanje CTLA4 (Slika 15, panel D). Merenja vezivanja ELISA-testom urađena su na sledeći način. Humani Jagged 1-Fc (R&D Systems: kat. br. 1277-JG-050). humani EGFR (R&D Systems, kat. br.
344-ER-050) ili humani CTLA4 (R&D Systems; kat. br.325-CT-200/CF) su adsorbovani na bunarčiće ploče za ELISA-test sa 96 bunarčića. Trostruka razblaženja, počevši od 100 nM, netretiranih antitela i antitela obrađenih enzimom uPA, multispecifičnih antitela ili
1
multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju naneta su na ploču i ostavljena da se povežu sa antigenom vezanim za ploču 1 čas. Nakon vezivanja, vezano antitelo je vizuelizovano pomoću konjugata anti-humani IgG-HRP (Fab specifično, Sigma, St Louis. MO; kat. br. A0293-1ML) i razvijanjem sa hromogenim supstratom TMB.
PRIMER 5: Sekvence dodatnih multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju
[0385] Ovaj primer obezbeđuje sekvence dodatnih multispecifičnih antitela i multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju.
Antitelo OKT3m scFv
AMINOKISELINSKA SEKVENCA
NUKLEOTIDNA SEKVENCA
1
Antitelo OKT3m scFv sa dugim linkerom koji omogućava vezivanje za C-kraj bilo teškog lanca (HC) ili lakog lanca (LC) antitela ili antitela koje može da se aktivira kako bi se proizvelo multispecifično antitelo, odnosno antitelo koje može da se aktivira AMINOKISELINSKA SEKVENCA
1
Antitelo OKT3m scFv sa kratkim linkerom koji omogućava vezivanje za N-kraj HC antitela ili antitela koje može da se aktivira, kako bi se proizvelo multispecifično antitelo, odnosno antitelo koje može da se aktivira
AMINOKISELINSKA SEKVENCA
Teški lanac multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N (antitelo OKT3m vezano za N-kraj antitela C225v5 HC)
AMINOKISELINSKA SEKVENCA
1
1
Teški lanac multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-C (antitelo OKT3m vezano za C-kraj antitela C225v5 HC)
AMINOKISELINSKA SEKVENCA
NUKLEOTIDNA SEKVENCA
1
Laki lanac multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-L-C (antitelo OKT3m vezano za C-kraj antitela C225v5 LC)
AMINOKISELINSKA SEKVENCA
1 1
Teški lanac multispecifičnog antitela C225v5(N297Q)-OKT3m-H-N AMINOKISELINSKA SEKVENCA
1 2
1
14
1
1
1
1
[0386] Multispecifično antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, koje sadrži plazmid koji kodira laki lanac 3954-1204-C225 i plazmid koji kodira teški lanac C225v5-OKT3m-H-N.
Laki lanac antitela C225v5
AMINOKISELINSKA SEKVENCA
NUKLEOTIDNA SEKVENCA
1
[0387] U tabeli 11 prikazani su primeri sparivanja sekvenci teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) kako bi nastalo multispecifično antitelo ili multispecifično antitelo koje može da se aktivira prema otkriću. Kako se ovde koristi, pri upotrebi naziva laki lanci, laki lanci antitela koji sadrže C225v5 su označeni i kao laki lanci koji sadrže C225.
Tabela 11. Multispecifična antitela i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću
1
vS se odnosi na verziju 5 antitela C225
PRIMER 6: Vezivanje multispecifičnih antitela za CD3ε na T-ćelijama Jurkat
[0388] Ovaj primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da se vežu za T-ćelije.
[0389] Ispitivana su tri formata multispecifičnih antitela: (1) C225v5-OKT3m-H-N, multispecifično antitelo u kome je OKT3m scFv (koji vezuje CD3ε (ovde označen i kao CD3e i CD3) na T-ćelijama) vezan za N-kraj teškog lanca anti-EGFR antitela C225v5; (2) C225v5-OKT3m-H-C, multispecifično antitelo u kome je OKT3m scFv vezan za C-kraj teškog lanca anti-EGFR antitela C225v5; i (3) C225v5-OKT3m-L-C, multispecifično antitelo u kome je OKT3m scFv vezan za C-kraj lakog lanca anti-EGFR antitela C225v5. U ovom dokumentu su date aminokiselinske sekvence ovih multispecifičnih antitela, kao i aminokiselinske sekvence antitela C225v5 i OKT3. Ispitivana je i izotipska kontrola, odnosno izotipska kontrola humanog IgG1, Enzo, katalog ALX-804-133-C100.
[0390] Kako bi se odredilo da li tri formata multispecifičnog antitelo mogu da se vežu za CD3εpozitivne T-ćelije Jurkat (ovde označene i kao Jurkat ćelije i Jurkat), urađen je test vezivanja na bazi protočne citometrije. T-ćelije Jurkat (klon E6-1, ATCC, TIB-152) su uzgajane u RPMI-1640 sa GlutaMAX™ (Life Technologies, katalog 72400-120), 10% toplotom inaktivisanog
1 1
fetalnog goveđeg seruma (HI-FBS, Life Technologies, katalog 10438-026), 100 U/ml penicilina, i 100 µg/ml streptomicina (Life Technologies, katalog 15140-122) (ovde označen i kao kompletni medijum) prema smernicama ATCC. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem (200xg, 4°C, 5 min) i resuspendovane u PBS sa 2% HI-FBS (FACS pufer). Oko 250000 ćelija Jurkat po bunarčiću je preneto u ploču sa U dnom sa 96 bunarčića, sakupljeno, i resuspendovano u 50 mikrolitara (ovde označen i kao µL ili ul) ispitivanih antitela. Polazna koncentracija antitela bila je 100 nM za multispecifična antitela i 166.7 nM za izotipsku kontrolu, a zatim su urađena 5-struka serijska razblaženja čime je dobijeno ukupno osam koncentracija za svako antitelo.
[0391] Ćelije i antitela su inkubirani na 4°C uz mućkanje oko 1 čas, sakupljeni, i oprani 3 puta sa 200 µL FACS pufera. Tako dobijene ćelije Jurkat su resuspendovane u 50 µl antitela protiv humanog IgG (H+L) konjugovanih sa AlexaFluor<®>647 (Jackson ImmunoResearch, katalog 709-606-149) i inkubirane na 4°C uz mućkanje oko 30 min. Rezultujuće ćelije Jurkat su sakupljene, oprane 3 puta sa 200 µL FACS pufera, i resuspendovane u finalnoj zapremini od 150 µL FACS pufera sa 2.5 µg/ml 7-AAD (BD Pharmingen, katalog 559925). Uzorci su analizirani protočnim citometrom BD Accuri C6 (BD Biosciences), i medijana intenziteta fluorescencije (MFI) vijabilnih ćelija je izračunata upotrebom FlowJo V10 (Treestar). Bojenje sa 7-AAD je pokazalo da je selekcija na osnovu rasipanja svetlosti unapred/u stranu bila dovoljna za identifikovanje vijabilnih ćelija. Vrednosti EC50su izračunate pomoću GraphPad Prism 6 prilagođavanjem krive zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
[0392] Slika 16A pokazuje da sva tri formata multispecifičnog antitela vezuju T-ćelije Jurkat sa vrednostima EC50u opsegu od jednocifrenih veličina nM do sub-nM veličina.
PRIMER 7: Multispecifična antitela se vezuju za T-ćelije koje eksprimiraju CD3ε i rekombinantni humani EGFR
[0393] Ovaj primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da se vežu za obe vrste ćelija (ovde označeno i kao ko-vezivanje), za T-ćelije, kao i za ćelije koje sadrže ciljni antigen.
[0394] Da bi se utvrdilo da li multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, ili C225v5-OKT3m-L-C mogu da vežu CD3ε-pozitivne T-ćelije Jurkat i EGFR, urađen je test vezivanja na bazi protočne citometrije. Ćelije Jurkat su prethodno obrađene zasićujućom koncentracijom svakog od multispecifičnih antitela praćenom titracijom biotinilisanim EGFR i detekcijom pomoću konjugata streptavidina i R-fikoeritrina (SAPE).
1 2
Ispitana je i izotipska kontrola, odnosno izotipska kontrola za humani IgG1, Enzo, katalog ALX-804-133-C100.
[0395] Ćelije Jurkat su uzgajane i sakupljene kao što je ovde opisano. Oko 500000 ćelija Jurkat po bunarčiću je preneto u ploču sa U-dnom, sakupljeno, i resuspendovano u 50 µL 40 nM multispecifičnog antitela ili 67 nM izotipskog antitela. Ćelije su inkubirane na 4°C uz mućkanje oko 1 čas, sakupljene, i oprane 3 puta sa 200 µL FACS pufera. Tako dobijene ćelije Jurkat (koje vezuju multispecifično antitelo prema otkriću) su resuspendovane u 50 µl biotinilisanog rekombinantnog humanog proteina EGFR (Abcam, katalog ab168702) počevši na oko 290 nM, a zatim su urađena 5-struka serijska razblaženja čime je dobijeno ukupno osam koncentracija. Ćelije su inkubirane na 4°C uz mućkanje oko 1 čas, sakupljene, i oprane 3 puta sa 200 µL FACS pufera. Tako dobijene ćelije Jurkat su resuspendovane u 50 µl 10 µg/ml konjugata streptavidina i R-fikoeritrina (Life Technologies, S866) i inkubirane na 4°C uz mućkanje oko 1 čas. Ćelije su sakupljene, oprane jednom sa 200 µL FACS pufera, i resuspendovane u 150 µl FACS pufera. Uzorci su analizirane pomoću BD Accuri C6 i MFI je izračunata kao što je ovde opisano. Vrednosti EC50su izračunate pomoću GraphPad Prism 6 kao što je ovde opisano.
[0396] Slika 16B pokazuje da sva tri formata multispecifičnog antitela ispoljavaju vezivanje EGFR zavisno od koncentracije koje zahteva istovremeno vezivanje za CD3ε na T-ćelijama. Vrednosti EC50su varirale od sub-nM veličina do jednocifrenih nM veličina.
PRIMER 8: Aktivacija T-ćelija multispecifičnim antitelima zavisna od ciljnog molekula [0397] Ovaj primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da aktiviraju T-ćelije na način zavisan od ciljnog molekula.
[0398] Da bi se utvrdilo može li istovremeno vezivanje T-ćelija Jurkat i EGFR-pozitivnih ciljnih ćelija multispecifičnim antitelima C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, ili C225v5-OKT3m-L-C da indukuje aktivaciju ćelija Jurkat, upotrebljen je test na bazi protočne citometrije. Ćelije Jurkat i ciljne ćelije obeležene sa CFSE su ko-kultivisane oko 15 h i aktivacija T-ćelija je procenjena bojenjem koje ukazuje na površinsku ekspresiju markera rane aktivacije T-ćelija CD69.
[0399] EGFR-pozitivne ćelije SW480, označene i kao ćelije SW480, (ATCC, katalog CCL-228) i EGFR-negativne ćelije U266, označene i kao ćelije U266, (ATCC, katalog TIB-196) su uzgajane u RPMI-1640 sa GlutaMAX™, 10% HI-FBS, 100 U/ml penicilina, i 100 µg/ml streptomicina (označen kao kompletni medijum) prema smernicama ATCC. Ove ciljne ćelije su sakupljene, oprane jednom sa PBS, i resuspendovane u PBS pri 2×10<6>ćelija/ml.5 mM štoka CFSE (Life Technologies. CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit, katalog C34554) je pripremljeno u DMSO i zatim razblaženo do 30 nM u PBS. Radni štok PBS/CFSE je odmah
1
upotrebljen. Jednake zapremine ciljnih ćelija i štoka CFSE su kombinovane za finalnu koncentraciju CFSE od 15 nM i finalnu gustinu ćelija od 1×10<6>ćelija/ml. Ćelije su inkubirane 15 min na 37°C. Obeležavanje je zaustavljeno dodavanjem jednake zapremine HI-FBS. Inkubirane ciljne ćelije su sakupljene, oprane jednom kompletnim medijumom, i resuspendovane u kompletnom medijumu pri 5×10<5>ćelija/ml. 50 µL ćelijske suspenzije po bunarčiću je dodato u ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića do ukupno 25000 ciljnih ćelija po bunarčiću.
[0400] T-ćelije Jurkat su uzgajane kao što je ovde opisano. Ćelije Jurkat su sakupljene, resuspendovane u kompletnom medijumu pri 1×10<6>ćelija/ml, i 50 µL ćelijske suspenzije po bunarčiću dodato je u ploču sa ravnim dnom koja sadrži ciljne ćelije do ukupno oko 50000 ćelija Jurkat po bunarčiću. Odnos efektorskih T-ćelija prema ciljnim ćelijama bio je 2:1.
[0401] Trostruko koncentrovani štokovi antitela pripremljeni su u kompletnom medijumu. Najviše upotrebljene koncentracije bile su 1.2 nM za svaki od formata multispecifičnog antitela i 1.5 nM za OKT3 (BioLegend, katalog 317304), C225v5 (čija je aminokiselinska sekvenca ovde data), i izotipsku kontrolu antitela. Pripremljena su petostruka serijska razblaženja u kompletnom medijumu za ukupno 8 koncentracija za svako antitelo. Pedeset µL antitela po bunarčiću je dodato u ploču sa ravnim dnom koja sadrži T-ćelije i ciljne ćelije, i svi štokovi su razblaženi 3 puta za početnu koncentraciju od 400 pM za svaki od formata multispecifičnog antitela ili 500 pM za svaki od OKT3, C225v5, i izotipskih antitela.
[0402] Nakon oko 15 h, ćelije su prenete u ploču sa U-dnom i sakupljene. Kako bi se sakupilo što više ćelija, ploča za kulturu ćelija je oprana sa 150 µL FACS pufera, i ispirak je prenet u ploču sa U-dnom. Ćelije su sakupljene, resuspendovane u 50 µL PE-konjugovanog anti-CD69 antitela (BD Biosciences. katalog 555531, upotrebljeno u koncentraciji koju je preporučio proizvođač), i bojene 1 h at 4°C uz mućkanje. Ćelije su oprane jednom sa 200 µL FACS pufera i zatim resuspendovane u finalnoj zapremini od 150 µL. Monohromatske kontrole su upotrebljene za podešavanje kompenzacije na uređaju BD Accuri C6. Sakupljeno je 10000 ćelija CFSE-negativnom selekcijom na osnovu rasipanja svetlosti unapred/u stranu i MFI je izračunata upotrebom FlowJo. Vrednosti EC50su izračunate pomoću GraphPad Prism 6 kao što je ovde opisano.
[0403] Slika 17 pokazuje da najsnažnija CD69-aktivacija, vidljiva počevši sa sub-pM koncentracijama, zavisi od formata svakog multispecifičnog antitela koje se ko-kultiviše u prisustvu T-ćelija Jurkat i EGFR-pozitivnih ćelija SW480. Nasuprot tome, aktivacija T-ćelija indukovana ko-kultivacijom sa EGFR-negativnim ćelijama U266 bila je značajno manje efikasna, ispoljavajući sub-nM vrednosti EC50i redukciju od 75% maksimalne CD69-
1 4
indukcije, u odnosu na aktivaciju indukovanu EGFR-pozitivnim ćelijama. Aktivacija multispecifičnih antitela nezavisna od EGFR, zapažena kada su korišćene ćelije U266, bila je slična onoj kod antitela OKT3, a u slučaju antitela C225v5 i izotipske kontrole antitela, zapaženo je zanemarljivo bojenje CD69.
PRIMER 9: Aktivacija primarnih CD8<+>T-ćelija multispecifičnim antitelima zavisna od ciljnog molekula
[0404] Ovaj primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da aktiviraju primarne CD8-pozitivne (CD8<+>) T-ćelije.
[0405] Da bi se odredilo da li multispecifična antitela C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, ili C225v5-OKT3m-L-C mogu da posreduju u EGFR-zavisnoj aktivaciji primarnih humanih CD8<+>T-ćelija, urađen je test zasnovan na protočnoj citometriji. CD8<+>T-ćelije poreklom iz humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) i ciljne ćelije obeležene sa DDAO-SE su ko-kultivisane preko noći, i aktivacija je procenjena bojenjem za marker rane aktivacije, CD69.
[0406] EGFR-pozitivne ćelije SW480 su uzgajane i obeležene kao što je ovde opisano sa sledećim izuzecima: (1) ciljne ćelije SW480 su obeležene pomoću CellTrace™ FarRed DDAO-SE (Life Technologies, katalog C34553) i (2) kompletni medijum je obogaćen sa 25 U/ml IL-2 (R&D Systems, katalog 202-IL-050/CF). Pedeset µL suspenzije ciljnih ćelija (pri 5×10<5>ćelija/ml) po bunarčiću dodato je u ploču ravnog dna sa 96 bunarčića za ukupno 25 000 ciljnih ćelija po bunarčiću.
[0407] Sveže citotoksične CD8<+>T-ćelije normalne periferne krvi (AllCells, katalog PB009-3) dobijene od AllCells (Alameda, CA), sakupljene su centrifugiranjem (200×g, RT, 15 min), i resuspendovane u kompletnom medijumu obogaćenom sa 25U/ml IL-2 pri 1.5×10<6>ćelija/ml. Pedeset µL ćelijske suspenzije po bunarčiću dodato je u ploču ravnog dna koja sadrži ciljne ćelije za ukupno oko 75000 CD8<+>citotoksičnih T-ćelija po bunarčiću, pri čemu odnos T-ćelija prema ciljnim ćelijama iznosi 3:1.
[0408] Trostruko koncentrovani štokovi antitela pripremljeni su u kompletnom medijumu obogaćenom sa 25U/ml IL-2. Najviša koncentracija bila je 600 pM, a zatim su urađena 5-struka serijska razblaženja čime je dobijeno ukupno osam koncentracija za svako antitelo. Pedeset µL antitela po bunarčiću dodato je u ploču ravnog dna koja sadrži CD8<+>ćelije i ciljne ćelije, razblažujući sve štokove 3 puta za polaznu koncentraciju od 200 pM.
[0409] Nakon inkubacije preko noći, ploča ravnog dna je centrifugirana i uzeto je 100 µL supernatanta za ovde opisani luminescentni test citotoksičnosti. Preostali supernatant je prenet u ploču sa U-dnom, i ćelije u ploči ravnog dna su odvojene od podloge pomoću 0.25% tripsina
1
(Life Technologies, katalog 25200-056). Aktivnost tripsina je zaustavljena dodavanjem 3 zapremine FACS pufera, i ćelijska suspenzija je prebačena u ploču sa U-dnom. Nakon sakupljanja, ćelije su resuspendovane u 50 µL koktela PE-konjugovanih anti-CD69 antitela/FITC-konjugovanih anti-CD8 antitela (anti-CD8 FITC, BD Biosciences, katalog 561948), FITC-konjugovane izotipske kontrole (BD Biosciences, katalog 340755), ili PE-konjugovane izotipske kontrole (BD BioSciences, katalog 340761). Sva antitela su korišćena u koncentracijama koje je preporučio proizvođač. Ćelije su bojene tokom 1 h na 4°C uz mućkanje, sakupljene i resuspendovane u finalnoj zapremini od 150 µL FACS pufera sa 2.5 µg/ml 7-AAD. Monohromatske kontrole su upotrebljene za podešavanje kompenzacije na uređaju BD Accuri C6, i sakupljena je fiksna zapremina ćelijske suspenzije. Selekcija za CD8<+>ćelije bila je dovoljna za razlikovanje ciljnih ćelija i vijabilnih T-ćelija. Aktivacija je kvantifikovana kao procenat T-ćelija sa ekspresijom CD69 iznad PE-konjugovane izotipske kontrole.
[0410] Slika 18A pokazuje da sva tri formata multispecifičnog antitela pokazuju aktivaciju zavisnu od koncentracije primarnih CD8<+>T-ćelija pri vrednostima EC50u oblasti jednocifrenih veličina pM. Tretman sa OKT3, C225v5, ili izotipskom kontrolom humanog IgG1 (Enzo) antitela rezultovao je neznatnom indukcijom CD69.
PRIMER 10: Liza ciljnih ćelija multispecifičnim antitelima zavisna od ciljnog molekula [0411] Ovij primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da indukuju ćelijsku lizu usmerenu T-ćelijama, zavisnu od ciljnog molekula.
[0412] Da bi se odredilo da li multispecifična antitela C225v5-GKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, ili C225v5-OKT3m-L-C mogu da indukuju ćelijsku lizu usmerenu T-ćelijama, zavisnu od ciljnog molekula, ćelije SW480 su ko-kultivisane sa CD8<+>T-ćelijama u odnosu efektorskih prema ciljnim ćelijama od 3:1, kao što je ovde opisano. Nakon inkubacije preko noći, 100 µL supernatanta je ispitano u pločama belih zidova sa 96 bunarčića (Greiner Bio One katalog 655098) za određenu proteaznu aktivnost povezanu sa citotoksičnošću prema protokolu proizvođača (CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay, katalog G9292, Promega). koji koristi luminogeni peptidni supstrat za merenje aktivnosti proteaza koje oslobađaju ćelije koje su izgubile membranski integritet i zatim podlegle citolizi. Citotoksičnost ciljnih ćelija zavisna od multispecifičnog antitela izražena je kao intenzitet luminiscencije nakon oduzimanja pozadinskog šuma za vrednosti netretiranih uzoraka i pomoću programa Prism konstruisana je kriva zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
[0413] Slika 18B pokazuje da sva tri formata multispecifičnog antitela indukuju lizu ćelija SW480 posredovanu T-ćelijama. Kao što je i očekivano, samo antitelo OKT3 nije ispoljilo
1
detektabilnu lizu ćelija SW480, što ukazuje na to da je za efikasnu citotoksičnost pod dejstvom multispecifičnih antitela potrebno istovremeno vezivanje CD3 i tumorskog ciljnog molekula.
PRIMER 11: Aktivacija T-ćelija i liza ciljnih ćelija multispecifičnim antitelima zavisna od ciljnog molekula
[0414] Ovaj primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da indukuju aktivaciju CD8<+>T-ćelija zavisnu od ciljnog molekula usmerenu T-ćelijama i lizu ciljnih ćelija.
[0415] Da bi se odredilo da li je zapažena aktivacija T-ćelija zavisna od ekspresije EGFR na ciljnim ćelijama, CFSE-obeležene EGFR-pozitivne ćelije SW480 ili EGFR-negativne ćelije U266 su ko-kultivisane sa humanim CD8<+>T-ćelijama u prisustvu multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N ili OKT3, svakog u seriji 5-strukih razblaženja počevši od 200 pM, kao što je gore opisano. Obeležavanje ciljnih ćelija pomoću CFSE (30 nM) upotrebljeno je za razlikovanje ciljnih ćelija od T-ćelija upotrebom ovde opisanog postupka. Zamrznute CD8<+>citotoksične T-ćelije normalne periferne krvi (AllCells, katalog PB009-3F) su odmrznute prema uputstvu proizvođača. Nakon inkubacije preko noći, ispitana je površinska ekspresija ranog markera aktivacije CD69 na T-ćelijama (CFSE-negativne ćelije), kao što je ovde opisano. Ukratko, ćelije su uklonjene iz ploče za test, prilepljene ćelije su odvojene upotrebom tripsina (Life Technologies), i ćelije su oprane jednom FACS puferom. Ćelije su bojene 1 čas PE-konjugovanim anti-CD69 antitelom (BD Bioscience). Ćelije su oprane i upotrebom BD Accuri C6 analizirana je ekspresija CD69 na površini ćelija. Vrednosti MFI su izračunate kao što je ovde opisano. Rezultati su izraženi kao procenat T-ćelija sa ekspresijom CD69 iznad izotipske kontrole upotrebom softvera za analizu FCS Express i grafički prikazani pomoću programa Prism prilagođavanjem krive zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) -odgovor (po tri parametra).
[0416] Kao što je prikazano na slici 18C, multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N je pokazalo snažnu aktivaciju T-ćelija na sub-pM koncentracijama u prisustvu ćelija SW480 i samo minimalnu aktivaciju T-ćelija ćelijama U266, čak i na koncentracijama koje su bile više od 3 logaritma više od koncentracija upotrebljenih kod ćelija SW480. Antitelo OKT3 je ispoljilo minimalnu aktivaciju T-ćelija. Ovi rezultati su pokazali da efikasna aktivacija T-ćelija zavisi od ekspresije EGFR na ciljnim ćelijama.
[0417] Da bi se odredila zavisnost lize ciljnih ćelija od ekspresije EGFR, u 100 µl supernatanta zajedničke kulture T-ćelija sa ćelijama SW480 ili U266 merena je proteazna aktivnost povezana sa citotoksičnošću (CytoTox-Glo, Promega). Rezultati su izraženi kao intenzitet luminiscencije bez oduzimanja pozadinskog šuma kako bi se pokazao odgovor U266 i pomoću
1
programa Prism konstruisana je kriva zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
[0418] Slika 18D ilustruje da multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N izaziva citotoksičnost ćelija SW480 koje eksprimiraju EGFR na sub-pM koncentracijama, dok nikakva uočljiva liza EGFR-negativnih ćelija U266 nije detektovana. Ni antitelo OKT3 ne ispoljava uočljivu lizu ćelija SW480 ili U266.
PRIMER 12: Sposobnost multispecifičnih antitela da aktiviraju T-ćelije za liziranje panela ćelijskih linija koje eksprimiraju EGFR
[0419] Ovaj primer pokazuje sposobnost multispecifičnih antitela prema otkriću da aktiviraju T-ćelije za liziranje panela ćelijskih linija koje eksprimiraju EGFR.
[0420] Da bi se odredilo da li multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N može da indukuje citotoksičnost za dodatne ćelijske linije koje eksprimiraju EGFR, humane CD8<+>T-ćelije su istovremeno uzgajane u medijumu RPM1-1640, sa 2% humanog seruma, u pločama belih zidova sa 96 bunarčića, sa sledećim ćelijskim linijama koje eksprimiraju EGFR, u odnosu efektorskih prema ciljnim ćelijama od 5:1 (osim ćelija U266, koje su upotrebljene za kultivisanje u odnosu 3:1 u pločama ravnog dna sa 96 bunarčića) i titracijom multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N: HEK-293, HCT-15, HCT 116, Hs 766T, HT-29, NCI-H2405, SW480, SK-OV-3, i EGFR-negativne ćelijske linije, U266 (sve ćelijske linije potiču iz ATCC). Anti-EGFR antitelo C225v5 (u koncentraciji od 200 pM) upotrebljeno je kao negativna kontrola. Nakon inkubacije preko noći, luminogeni peptidni supstrat testa za citotoksičnost CytoTox-Glo™ (Promega) dodat je direktno u ploče (150 µl supernatanta) za merenje oslobođene proteazne aktivnosti, osim uzoraka U266, kod kojih je 100 µl supernatanta U266 upotrebljeno za ispitivanje proteazne aktivnosti. Rezultati su izraženi kao intenzitet luminiscencije posle oduzimanja pozadinskog šuma za vrednosti netretiranih uzoraka i pomoću programa Prism konstruisana je kriva zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
[0421] Slika 19 pokazuje da je kod svih ćelijskih linija koje eksprimiraju EGFR, tretiranih multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N, u prisustvu CD8<+>T-ćelija zapažena doznozavisna citotoksičnost. Nasuprot tome, multispecifično antitelo C225v5-OT3m-H-N nije delovalo na EGFR-negativne ćelije U266. Ni kod jedne od ćelijskih linija tretiranih anti-EGFR antitelom C225v5 u koncentraciji od 200 pM nije pronađen nikakav dokaz citotoksičnosti, bez obzira na ekspresiju EGFR.
PRIMER 13: Atenuacija vezivanja multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju za EGFR
1
[0422] Ovaj primer pokazuje da je vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema otkriću za EGFR atenuirano, u poređenju sa vezivanjem multispecifičnog antitela prema otkriću za EGFR. Ovaj primer takođe pokazuje da se vezivanje za EGFR multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, koje uključuje fragment koji može da se otcepi proteazom, obnavlja nakon cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira takvom proteazom.
[0423] Ispitivana je sposobnost multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, i multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N da se vežu za ćelije SW480 koje eksprimiraju EGFR.
[0424] Aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira sprovedena je na sledeći način: 825 µg multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N u PBS podvrgnuto je cepanju dodatkom matriptaze titrirane po aktivnom mestu (ovde označene i kao MT-SP1 i MTSP1; dostupne kod R&D Systems, katalog 3946-SE-010) do finalne koncentracije od 100 nM. Proizvod digestije je inkubiran na 37°C preko noći, i cepanje je potvrđeno uzimanjem alikvota za analizu kapilarnom elektroforezom (GX-II Capillary Electrophoresis, Perkin Elmer). Proteaza i otcepljeni maskirajući fragment su uklonjeni prečišćavanjem na proteinu A. Ukratko, uzorak podvrgnut digestiji je razblažen do 2 ml pomoću PBS i nanet na uravnotežene perle MabSelect SuRe™ s (GE Healtheare Life Sciences, proizvod 11-0026-01 AD). Perle su oprane sa 5 zapremina kolone (CV) 1xPBS, a zatim sa 5 CV 5xPBS sa dodatkom 5% izopropil alkohola (IPA), i najzad sa 5 CV 1xPBS. Antitelo je eluirano sa 10 CV 0.1 M glicina, pH 3.0, i frakcije su neutralisane dodatkom 1 M Tris, pH 8.0, sakupljene, koncentrovane i pufer je promenjen u PBS.
[0425] Ćelije SW480, koje eksprimiraju EGFR, odvojene su od podloge pomoću pufera za disocijaciju ćelija (Sigma, katalog C5789), oprane, i inkubirane 1 čas sa 5-strukim razblaženjem 1000 nM multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N, antitela 3954-1204-C225v5 koje može da se aktivira, ili antitela C225v5 u FACS puferu na ledu. Ćelije su oprane 3 puta FACS puferom i inkubirane sa sekundarnim antitelom, naime, antitelom AF488 specifičnim za humani Fc-gama (Jackson lmmunoResearch katalog 109-546-098) u FACS puferu na ledu u odnosu 1:400. Ćelije su oprane 3 puta FACS puferom, i MFI za AF488 je očitana pomoću protočnog citometra BD Accuri (BD Biosciences). Vrednost MFI uzorka, koji sadrži samo sekundarno kontrolno antitelo, oduzeta je od eksperimentalne MFI i pomoću
1
programa Prism konstruisana je kriva zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
[0426] Slika 20A pokazuje da je vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N za EGFR atenuirano u poređenju sa vezivanjem multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N za EGFR, ali da je vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za EGFR potpuno obnovljeno nakon proteaznog cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira matriptazom. Slika 20B pokazuje da je vezivanje antitela C225v5 i antitela 3954-1204-C225v5 koje može da se aktivira za EGFR uporedivo sa vezivanjem multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N, odnosno multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N za EGFR, što pokazuje da fragment anti-CD3ε antitela prisutan u multispecifičnom formatu nije izmenio profil vezivanja za EGFR multispecifičnog antitela, kao ni multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
PRIMER 14: Sposobnost multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju da se vežu za CD3<+>T-ćelije
[0427] Ovaj primer pokazuje da svako od multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, i multispecifičnog antitela, sva prema primerima izvođenja, može da se veže za CD3<+>T-ćelije.
[0428] Da bi se utvrdilo da li je na vezivanje za CD3ε uticalo maskiranje vezujućeg mesta za EGFR u anti-EGFR multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, sproveden je test vezivanja T-ćelija Jurkat, kao što je ovde opisano, sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranim multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, i multispecifičnim antitelom C225v5-OKT3m-H-N. Ćelije Jurkat su inkubirane sa 5-strukim razblaženjem 1000 nM multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, matriptaza-aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, ili multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N u FACS puferu 1 čas na 4°C. Ćelije su oprane 3 puta i inkubirane sa sekundarnim antitelom, naime antitelom AF488 specifičnim za humani Fc-gama (Jackson lmmunoResearch) u odnosu 1:400. Ćelije su oprane 3 puta, i MFI za AF488 je očitana pomoći protočnog citometra BD Accuri (BD Biosciences). Vrednost MFI uzorka, koji sadrži samo sekundarno kontrolno antitelo, oduzeta je od eksperimentalne MFI i pomoću programa Prism konstruisana je kriva zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
1
[0429] Slika 21A pokazuje da multispecifično antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N i multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N ispoljavaju ekvivalentno vezivanje za T-ćelije Jurkat. Slika 21B pokazuje da multispecifično antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N i aktivirano multispecifično antitelo koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N ispoljavaju ekvivalentno vezivanje za T-ćelije Jurkat. Ovi rezultati ukazuju na to da maskiranje EGFR-vezujućeg fragmenta multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ne utiče na sposobnost multispecifičnog antitela koje može da se aktivira da veže T-ćelije.
PRIMER 15: Aktivacija T-ćelija multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju zavisna od ciljnog molekula
[0430] Ovaj primer pokazuje da je aktivacija T-ćelija zavisna od ciljnog molekula multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću atenuirana u poređenju sa aktivacijom koju ispoljava multispecifično antitelo prema otkriću. Ovaj primer takođe pokazuje da je aktivacija T-ćelija zavisna od ciljnog molekula multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira, koje uključuje fragment koji može da se otcepi proteazom, obnovljena nakon cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira takvom proteazom.
[0431] Da bi se utvrdilo da li maskiranje EGFR-vezujućeg mesta multispecifičnog anti-EGFR antitela koje može da se aktivira atenuira aktivaciju T-ćelija zavisnu od ciljnog molekula i da bi se odredilo da li proteazna aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ponovo uspostavlja aktivaciju, sproveden je test aktivacije ćelija Jurkat, kao što je ovde opisano, ispitivanjem multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N, anti-EGFR antitela C225v5, i izotipske kontrole Synagis (Medimmune) kao što je ovde opisano.
[0432] Slika 22 pokazuje da je EGFR-zavisna aktivacija, određena CD69-indukcijom T-ćelija Jurkat koje su uzgajane zajedno sa ćelijama SW480 koje eksprimiraju EGFR, pod dejstvom multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N atenuirana u poređenju sa EGFR-zavisnom aktivacijom koju ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N. Slika takođe pokazuje da je EGFR-zavisna aktivacija pod dejstvom multispecifičnog antitela koje može da se aktivira potpuno obnovljena nakon proteaznog cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira matriptazom. Ni anti-EGFR C225v5 antitelo, niti izotipsko kontrolno antitelo nisu ispoljili aktivaciju T-ćelija.
PRIMER 16: Aktivacija T-ćelija i liza ciljnih ćelija multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju zavisna od ciljnog molekula
1 1
[0433] Ovaj primer pokazuje da je aktivacija T-ćelija i liza ciljnih ćelija zavisna od ciljnog molekula multispecifičnim antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću atenuirana u poređenju sa aktivacijom koju ispoljava multispecifično antitelo prema otkriću. Ovaj primer takođe pokazuje da se aktivacija T-ćelija i liza ciljnih ćelija zavisna od ciljnog molekula multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira, koje uključuje fragment koji može da se otcepi proteazom, ponovno uspostavlja nakon cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira takvom proteazom.
[0434] Da bi se utvrdilo da li maskiranje EGFR-vezujućeg mesta multispecifičnog anti-EGFR antitela koje može da se aktivira atenuira aktivaciju zavisnu od ciljnog molekula, i da bi se utvrdilo da li proteazna aktivacija multispecifičnog antitela koje može da se aktivira obnavlja aktivaciju, sproveden je test aktivacije ćelija Jurkat, kao što je ovde opisano, ispitivanjem multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N, anti-CD3ε antitela OKT3, anti-EGFR antitela C225v5, i izotipske kontrole, kao što je ovde opisano.
[0435] Da bi se utvrdio uticaj maskiranja EGFR-vezujućeg mesta multispecifičnog anti-EGFR antitela koje može da se aktivira na citotoksičnost i sposobnost proteazne aktivacije da obnovi citotoksičnu aktivnost aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, ćelije SW480 koje eksprimiraju EGFR su uzgajane zajedno sa T-ćelijama u odnosu efektorskih prema ciljnim ćelijama od 5:1 sa serijom 5-strukih razblaženja, počevši od 200 pM, multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, ili multispecifičnog antitela C225v5-OKT3m-H-N. Po 200 pM OKT3, C225v5, i izotipske kontrole Synagis (Medimmune) IgG1 antitela upotrebljeno je za kontrole. Nakon inkubacije preko noći, u 100 µL supernatanta u pločama belih zidova sa 96 bunarčića ispitivana je distinktivna proteazna aktivnost povezana sa citotoksičnošću (CytoTox-Glo, Promega). Rezultati su izraženi kao intenzitet luminiscencije nakon oduzimanja pozadinskog šuma za vrednosti netretiranih uzoraka i pomoću programa Prism konstruisana je kriva zavisnosti logaritamskih podataka log(agonist) - odgovor (po tri parametra).
[0436] Slika 23A pokazuje da je EGFR-zavisna aktivacija, određena CD69-indukcijom primarnih T-ćelija koje su uzgajane zajedno sa ćelijama SW480 koje eksprimiraju EGFR, pod dejstvom multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N atenuirana u poređenju sa EGFR-zavisnom aktivacijom koju ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N. Slika takođe pokazuje da je EGFR-zavisna aktivacija pod dejstvom
1 2
multispecifičnog antitela koje može da se aktivira potpuno obnovljena nakon proteaznog cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira matriptazom. Antitelo OKT3, anti-EGFR antitelo C225v5, i antitelo IgG1 izotipske kontrole Synagis ispoljili su zanemarljivu aktivaciju T-ćelija.
[0437] Slika 23B pokazuje da je liza ćelija SW480 zavisna od EGFR pod dejstvom multispecifičnog antitela koje može da se aktivira 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N atenuirana u poređenju sa citotoksičnošću zavisnom od EGFR koju ispoljava multispecifično antitelo C225v5-OKT3m-H-N. Slika takođe pokazuje da se citotoksičnost zavisna od EGFR koju ispoljava multispecifično antitelo koje može da se aktivira potpuno obnavlja nakon proteaznog cepanja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira matriptazom. Antitelo C225v5 i OKT3 i antitelo IgG1 izotipske kontrole Synagis ispoljili su zanemarljivu citotoksičnost.
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
�
24
2
2
2
2
2
2
21
22
�
��
2
2
�
2
2
2
21
22
2
��
�
2
2
�
2
2
21
22
2
24
�
2
2
2
�
1
2
�
1
11
12
1
14
�
�
1
1
�
2
21
22
2
24
2
�
�
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
�
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira, naznačeno time, što navedeno bispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži:
(i) prvu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje imunske efektorske ćelije koje uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi ciljni molekul na imunskoj efektorskoj ćeliji;
(ii) drugu ručicu koja sadrži antigen-vezujući fragment antitela koje vezuje ciljni molekul koje uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul;
pri čemu je AB1 tako povezan sa prvim maskirajućim fragmentom (MM1), da kuplovanje MM1 sa AB1 smanjuje sposobnost vezivanja AB1 za prvi ciljni molekul, gde je MM1 kuplovan sa AB1 preko sekvence prvog fragmenta koji može da se otcepi (CM1) koja uključuje supstrat za proteazu;
pri čemu je AB2 tako povezan sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2), da kuplovanje MM2 sa AB2 smanjuje sposobnost vezivanja AB2 za drugi ciljni molekul; gde je MM2 kuplovan sa AB2 preko sekvence drugog fragmenta koji može da se otcepi (CM2) koja uključuje supstrat za proteazu; i
gde prva ručica bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju: MM1-CM1-AB1, a druga ručica bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju: MM2-CM2-AB2.
2. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što drugi ciljni molekul sadrži ciljni molekul povezan sa kancerom, pri čemu je ciljni molekul povezan sa kancerom ciljni molekul tumora, opciono solidnog tumora.
3. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačeno time što je AB1:
antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije;
antitelo koje vezuje leukocite;
antitelo koje vezuje T-ćelije;
antitelo koje vezuje NK-ćelije;
antitelo koje vezuje makrofage; ili
antitelo koje vezuje mononuklearne ćelije.
4. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je antitelo koje vezuje imunske efektorske ćelije antitelo koje vezuje T-ćelije, i gde je prvi ciljni molekul na imunskoj efektorskoj ćeliji ciljni molekul na T-ćeliji.
5. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je ciljni molekul na T-ćeliji CD3 ili CTLA-4.
6. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je drugi ciljni molekul odabran iz grupe ciljnih molekula iz tabele 1, pri čemu je opciono drugi ciljni molekul Jagged ili EGFR.
7. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je ciljni molekul na T-ćeliji CD3, a drugi ciljni molekul je EGFR.
8. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što:
prva ručica
sadrži povezujući peptid između MM1 i CM1; ili
sadrži povezujući peptid između CM1 i AB1; ili
sadrži prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2),
pri čemu bispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju: MM1-LP1-CM1-LP2-AB, gde opciono dva povezujuća peptida nisu identična jedan drugom; ili
CM1 prve ručice je postavljen u bispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da, u neotcepljenom stanju, MM1 interferira sa specifičnim vezivanjem AB1 za prvi ciljni molekul.
9. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što:
MM1 ima ravnotežnu konstantu disocijacije za vezivanje za AB1 koja je veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje AB1 za njegov ciljni molekul;
MM1 ne interferira ili kompetira sa AB1 za vezivanje za prvi ciljni molekul kada je bispecifično antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju;
polipeptidna sekvenca MM1 je različita od sekvence prvog ciljnog molekula; polipeptidna sekvenca MM1 nije više od 50% identična bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB1; i/ili
MM1 je polipeptid dužine koja nije veća od 40 aminokiselina.
10. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što:
druga ručica
sadrži povezujući peptid između MM2 i CM2; ili
sadrži povezujući peptid između CM2 i AB2; ili
sadrži prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2),
pri čemu bispecifično antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-kraja ka C-kraju: MM2-LP1-CM2-LP2-AB2, gde opciono dva povezujuća peptida nisu identična jedan drugom; ili
CM2 druge ručice je postavljen u bispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da, u neotcepljenom stanju, MM2 interferira sa specifičnim vezivanjem AB2 za drugi ciljni molekul.
11. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što:
MM2 ima ravnotežnu konstantu disocijacije za vezivanje za AB2 koja je veća od ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje AB2 za njegov ciljni molekul;
1
MM2 ne interferira ili kompetira sa AB2 za vezivanje za drugi ciljni molekul kada je bispecifično antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju;
polipeptidna sekvenca MM2 je različita od sekvence drugog ciljnog molekula; polipeptidna sekvenca MM2 nije više od 50% identična bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB2; i/ili
MM2 je polipeptid dužine koja nije veća od 40 aminokiselina.
12. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je njegov antigen-vezujući fragment u AB1 i/ili AB2 izabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta, scFv, scAb, dAb, jednodomenskog antitela sa teškim lancem i jednodomenskog antitela sa lakim lancem.
13. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje sadrži agens konjugovan sa antitelom, gde je opciono agens terapijski agens, antineoplastični agens, toksin ili njegov fragment, detektabilni fragment ili dijagnostički agens, pri čemu je opciono agens konjugovan sa antitelom preko linkera, gde opciono linker predstavlja linker koji može da se otcepi ili linker koji ne može da se otcepi.
14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i nosač.
15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14, koja sadrži dodatni agens; gde opciono dodatni agens predstavlja terapijski agens.
16. Molekul izolovane nukleinske kiseline koji kodira bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12.
17. Vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 16.
18. Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela koje može da se aktivira uzgajanjem ćelije u uslovima koji vode ekspresiji bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, naznačen time što ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 16 ili vektor prema patentnom zahtevu 17; opciono konjugovanjem agensa sa bispecifičnim antitelom koje može da se aktivira.
2
19. Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde postupak obuhvata:
(a) uzgajanje ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji kodira bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 u uslovima koji vode ekspresiji bispecifičnog antitela koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, i
(b) izdvajanje bispecifičnog antitela koje može da se aktivira; opciono konjugovanje agensa sa izdvojenim antitelom koje može da se aktivira.
20. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 14 ili 15, ili bispecifično antitelo koje može da se aktivira proizvedeno postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 18 ili 19, za upotrebu kao lek.
21. Bispecifično antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 14 ili 15, ili bispecifično antitelo koje može da se aktivira proizvedeno postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 18 ili 19, za upotrebu u ublažavanju simptoma kliničke indikacije povezane sa poremećajem kod subjekta, pri čemu se bispecifično antitelo koje može da se aktivira primenjuje kod subjekta kome je to potrebno u količini dovoljnoj da ublaži simptom kliničke indikacije povezane sa poremećajem, gde je opciono navedeni subjekat čovek, pri čemu je poremećaj opciono kancer.
RS20220391A 2013-07-25 2014-07-25 Multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu RS63152B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361858402P 2013-07-25 2013-07-25
EP18163581.4A EP3406633B1 (en) 2013-07-25 2014-07-25 Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63152B1 true RS63152B1 (sr) 2022-05-31

Family

ID=51299065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220391A RS63152B1 (sr) 2013-07-25 2014-07-25 Multispecifična antitela, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11161906B2 (sr)
EP (3) EP3024851B1 (sr)
JP (4) JP6693872B2 (sr)
KR (1) KR102216088B1 (sr)
CN (2) CN105722859B (sr)
AU (2) AU2014292924B2 (sr)
BR (1) BR112016001611B1 (sr)
CA (1) CA2918795A1 (sr)
DK (2) DK3406633T3 (sr)
ES (2) ES2683268T3 (sr)
HR (1) HRP20220553T1 (sr)
IL (1) IL243752B (sr)
PL (1) PL3406633T3 (sr)
PT (1) PT3406633T (sr)
RS (1) RS63152B1 (sr)
RU (1) RU2727836C2 (sr)
WO (1) WO2015013671A1 (sr)

Families Citing this family (182)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
ES2595638T3 (es) 2007-09-26 2017-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para modificar el punto isoeléctrico de un anticuerpo mediante la sustitución de aminoácidos en una CDR
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
US20150203591A1 (en) * 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
SG10201709559PA (en) 2012-08-24 2017-12-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
WO2014030750A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
CN105246914B (zh) 2013-04-02 2021-08-27 中外制药株式会社 Fc区变体
WO2014193973A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
CN104342453A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 深圳先进技术研究院 含基因工程抗体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
WO2015066279A2 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
IL263466B2 (en) 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
JP6596440B2 (ja) * 2014-03-26 2019-10-23 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド ３つの抗体を利用する発光酸素チャネリング免疫測定法並びにその製造方法及び使用
EP3613433B1 (en) 2014-05-30 2022-01-05 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-epidermal growth factor receptor (egfr) antibodies
JP6871155B2 (ja) * 2014-07-25 2021-05-12 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 二重特異性ｈｅｒ２及びｃｄ３結合分子
CA2955947A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
US11820832B2 (en) 2014-07-25 2023-11-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
PT3221356T (pt) 2014-11-20 2020-10-29 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas ativadoras das células t contra folr1 e cd3
DK3221357T3 (da) 2014-11-20 2020-08-10 Hoffmann La Roche Fælles letkæder og fremgangsmåder til anvendelse
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
CN107405399B (zh) * 2015-01-02 2022-02-08 武田药品工业株式会社 针对血浆激肽释放酶和因子xii的双特异性抗体
CA2973720A1 (en) * 2015-01-14 2016-07-21 Compass Therapeutics Llc Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
CN108112254B (zh) 2015-03-13 2022-01-28 西托姆克斯治疗公司 抗-pdl1抗体、可活化的抗-pdl1抗体、及其使用方法
IL292798A (en) * 2015-05-04 2022-07-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, preparations containing them and their uses
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
EP3296395B2 (en) 2015-05-13 2024-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multiple antigen binding molecular fusion, pharmaceutical composition, method for identifying linear epitope, and method for preparing multiple antigen binding molecular fusion
TWI614264B (zh) * 2015-05-20 2018-02-11 免疫功坊股份有限公司 含胜肽核的多臂接合物及其應用
US9708412B2 (en) 2015-05-21 2017-07-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
AU2016297018B9 (en) 2015-07-21 2022-12-01 Takeda Pharmaceutical Company Limited A monoclonal antibody inhibitor of factor XIIa
WO2017019729A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 The General Hospital Corporation Antibody derivatives with conditionally enabled effector function
SG11201800864XA (en) 2015-08-11 2018-03-28 Univ Osaka Antibody
IL319047A (en) 2015-08-28 2025-04-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
EA039736B1 (ru) * 2015-09-15 2022-03-04 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Анти-pdl1-антитела, активируемые анти-pdl1-антитела и способы их применения
AU2016325019B2 (en) 2015-09-18 2020-07-16 Société des Produits Nestlé S.A. Savoury concentrates with a flowable texture based on two starches
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
EP3373937B1 (en) 2015-11-09 2021-12-22 R.P. Scherer Technologies, LLC Anti-cd22 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
FI3377103T4 (fi) 2015-11-19 2025-04-16 Revitope Limited Funktionaalinen vasta-ainefragmenttikomplementointi kaksikomponenttiselle järjestelmälle epätoivottujen solujen uudelleenohjattua tappamista varten
US10533157B1 (en) 2015-12-03 2020-01-14 Nantbio, Inc. Recombinant NK cells expressing co-stimulatory molecules
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
IL260289B (en) * 2016-01-08 2022-08-01 Bioalliance Cv Tetravalent anti-psgl-1 antibodies and uses thereof
EP3192810A1 (en) * 2016-01-14 2017-07-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Psma binding antibody and uses thereof
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
JP7015244B2 (ja) * 2016-03-22 2022-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ｔ細胞二重特異性分子
WO2017162587A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific molecules
WO2017201493A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment cd3 binding proteins
EP3493844A4 (en) 2016-05-20 2021-03-24 Harpoon Therapeutics Inc. SINGLE DOMAIN SERUM ALBUMIN BINDING PROTEIN
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2018004338A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Cleavable tetrazine used in bio-orthogonal drug activation
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
CN110267990B (zh) * 2016-08-30 2023-11-07 Xencor股份有限公司 结合共刺激性和检查点受体的双特异性免疫调节抗体
CN106632681B (zh) * 2016-10-11 2017-11-14 北京东方百泰生物科技有限公司 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用
EP3529268B1 (en) * 2016-10-19 2025-02-26 The Scripps Research Institute Chimeric antigen receptor effector cell switches with humanized targeting moieties and/or optimized chimeric antigen receptor interacting domains and uses thereof
MA46770A (fr) * 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
JP7784795B2 (ja) 2016-11-15 2025-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
WO2018098356A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Psma targeting trispecific proteins and methods of use
AU2017363300A1 (en) 2016-11-23 2019-06-20 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
BR112019011564A2 (pt) 2016-12-09 2019-10-22 Seattle Genetics Inc anticorpos bivalentes mascarados por hélices superenroladas
WO2018108759A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to determine the presence of a target antigen in a tumor sample
CN108264561B (zh) * 2016-12-30 2021-09-10 惠和生物技术(上海)有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用
US11046768B2 (en) 2017-01-27 2021-06-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
AU2018219887B2 (en) 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, LLC Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CN110944661A (zh) 2017-02-20 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 结合her2、nkg2d和cd16的蛋白质
CA3177692A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multispecific binding proteins targeting caix, ano1, mesothelin, trop2, or claudin-18.2
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
KR102367658B1 (ko) * 2017-03-29 2022-02-25 타이페이 메디컬 유니이버시티 항원 특이적 t 세포 및 그의 용도
EP3601346A1 (en) * 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
SG11201909160WA (en) 2017-04-11 2019-10-30 Inhibrx Inc Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
WO2018209304A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Msln targeting trispecific proteins and methods of use
EP3621994A4 (en) 2017-05-12 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. MESOTHELIN BINDING PROTEINS
IL270803B1 (en) * 2017-05-23 2026-02-01 Dragonfly Therapeutics Inc NKG2D, CD16, and tumor-associated antigen binding protein
CN110914302A (zh) 2017-06-01 2020-03-24 赛托姆克斯治疗学股份有限公司 可活化抗pdl1抗体及其使用方法
KR102763369B1 (ko) * 2017-06-25 2025-02-05 시스트이뮨, 인코포레이티드 다중-특이적 항체 및 이를 제조하는 방법 및 이의 용도
US20200157224A1 (en) * 2017-06-25 2020-05-21 Systimmune, Inc. Multi-specific antibodies and methods of making and using thereof
TWI828625B (zh) * 2017-06-25 2024-01-11 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制蛋白質以及彼之製造及使用方法
EP3645050A4 (en) * 2017-06-25 2021-08-11 Systimmune, Inc. Multi-specific antibodies and methods of making and using thereof
JP2020530554A (ja) * 2017-07-20 2020-10-22 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化抗体の特性を定性的および／または定量的に分析する方法およびその使用
JP2020531430A (ja) 2017-08-16 2020-11-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗体を標的とする抗ｃｔｌａ４プロボディ療法
CN111356700A (zh) 2017-09-08 2020-06-30 马弗里克治疗公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
MX2020003915A (es) 2017-10-13 2020-10-08 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso.
EP3694885A1 (en) 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
KR20200117992A (ko) * 2017-12-11 2020-10-14 트리페이스 리서치 앤드 디벨로프먼트 쓰리 코포레이션 항-cd22 항체-메이탄신 컨쥬게이트, 그것의 조합, 및 사용 방법
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
IL325995A (en) 2018-02-08 2026-03-01 Genentech Inc Bispecific antigen binding molecules and methods of use
BR112020015994A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
WO2019164930A1 (en) 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
JP2021518603A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 哺乳動物対象における活性化可能抗体種の定量薬理学モデリングのためのシステムおよび方法
KR20260046525A (ko) 2018-04-11 2026-04-07 인히브릭스 바이오사이언스, 인크. 제한된 cd3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 관련된 방법 및 용도
WO2019213444A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
AU2019262520B2 (en) 2018-05-04 2025-07-10 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Tetrazines for high click conjugation yield in vivo and high click release yield
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
WO2019222296A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
BR112020023330A2 (pt) 2018-05-14 2021-04-20 Harpoon Therapeutics, Inc. porção de ligação para ativação condicional de moléculas de imunoglobulina
US20210353652A1 (en) * 2018-06-04 2021-11-18 Trustees Of Tufts College Tumor microenvironment-activated drug-binder conjugates, and uses related thereto
WO2019241216A1 (en) * 2018-06-14 2019-12-19 Bioatla, Llc Multi-specific antibody constructs
EP3827019A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
SG11202013248YA (en) * 2018-07-31 2021-02-25 Amgen Inc Pharmaceutical formulations of masked antibodies
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
KR102835308B1 (ko) 2018-08-08 2025-07-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
WO2020072306A1 (en) * 2018-10-01 2020-04-09 Amgen Inc. Methods for reducing aggregation of bispecific antibodies
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CN120623346A (zh) 2018-10-11 2025-09-12 因荷布瑞克斯生物科学公司 Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物
JP7611820B2 (ja) 2018-10-11 2025-01-10 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
JP2022504802A (ja) 2018-10-11 2022-01-13 インヒブルクス インコーポレイテッド ５ｔ４シングルドメイン抗体およびその治療組成物
SMT202400519T1 (it) 2018-11-12 2025-01-14 Debiopharm Int Sa Composti antibiotici. metodi di produzione degli stessi, composizioni farmaceutiche contenenti gli stessi e loro usi
EP4592313A3 (en) 2019-03-05 2025-11-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
EP3969035A4 (en) 2019-05-14 2023-06-21 Werewolf Therapeutics, Inc. SEPARATION UNITS AND METHODS AND THEIR USE
WO2020232247A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
AU2020275002A1 (en) 2019-05-14 2021-12-23 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
WO2020251878A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
US20220227887A1 (en) * 2019-06-11 2022-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunosuppressant
IL289094A (en) 2019-06-17 2022-02-01 Tagworks Pharmaceuticals B V Tetrazines for increasing the speed and yield of the "click release" reaction
DK3983363T3 (da) 2019-06-17 2024-06-24 Tagworks Pharmaceuticals B V Forbindelser til hurtig og effektiv klikfrigivelse
KR20210043475A (ko) 2019-10-10 2021-04-21 주식회사 와이바이오로직스 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
MX2022005330A (es) * 2019-11-05 2022-05-26 Regeneron Pharma Moleculas de union multiespecificas con scfv en el extremo nterminal.
JP7592712B2 (ja) * 2019-11-06 2024-12-02 システィミューン， インク． ガイダンス及びナビゲーションコントロールタンパク質、その製造方法及び使用方法
MX2022005666A (es) 2019-11-14 2022-10-07 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de citocina activables y metodos de uso de los mismos.
WO2021097800A1 (en) * 2019-11-22 2021-05-27 Abl Bio Inc. Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof
EP4069735A1 (en) * 2019-12-06 2022-10-12 OncoOne Research & Development GmbH Anti-oxmif/anti-cd3 bispecific antibody constructs
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
JP7789002B2 (ja) 2020-01-29 2025-12-19 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ２８シングルドメイン抗体ならびにその多価および多重特異性の構築物
US11976133B2 (en) * 2020-01-31 2024-05-07 Gensun Biopharma Inc. Bispecific T cell engagers
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法
TWI908779B (zh) * 2020-03-17 2025-12-21 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制(gnc)抗體樣蛋白質及製造與使用其之方法
JP2023521384A (ja) 2020-04-09 2023-05-24 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能抗体を含む組成物
JP7512394B2 (ja) 2020-05-06 2024-07-08 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６及びｃｌｅｃ１２ａに結合するタンパク質
IL298999A (en) 2020-06-11 2023-02-01 Provention Bio Inc Methods and compositions for the prevention of type 1 diabetes
US12286482B2 (en) 2020-08-05 2025-04-29 Synthekine, Inc. IL10RB binding molecules and encoding nucleic acids
US11859001B2 (en) 2020-08-05 2024-01-02 Synthekine, Inc. IL12RB1-Binding molecules and methods of use
KR102773428B1 (ko) 2020-08-05 2025-02-28 신테카인, 인크. Il10 수용체 결합 분자 및 사용 방법
WO2022031884A2 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il2rg binding molecules and methods of use
US12122839B2 (en) 2020-08-05 2024-10-22 Synthekine, Inc. IFNGR binding synthetic cytokines and methods of use
BR112023001723A2 (pt) 2020-08-05 2023-05-02 Synthekine Inc Moléculas de ligação à gp130 e métodos de uso
US12291572B2 (en) 2020-08-05 2025-05-06 Synthekine, Inc. IL12 receptor synthetic cytokines and methods of use
WO2022031890A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Ifngr2 binding molecules and methods of use
US12012457B1 (en) 2020-08-05 2024-06-18 Synthekine, Inc. IL23R binding molecules and methods of use
EP4192490A4 (en) 2020-08-05 2025-01-01 Synthekine, Inc. IL27RA-BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE
US20230279126A1 (en) * 2020-08-05 2023-09-07 Synthekine, Inc. Il23 receptor synthetic cytokines and methods of use
MX2023001415A (es) 2020-08-05 2023-04-24 Synthekine Inc Composiciones y métodos relacionados con la unión al receptor de il27.
EP4192489A4 (en) 2020-08-05 2024-12-11 Synthekine, Inc. IL2RB-BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE
WO2022031885A2 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il10ra binding molecules and methods of use
US12540188B2 (en) 2020-08-05 2026-02-03 Synthekine, Inc. IL10Rα/IL2Rγ synthetic cytokines
EP4259202A4 (en) * 2020-12-09 2025-01-15 Janux Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO TUMOR-ACTIVATED ANTIBODIES AGAINST TROP2 AND EFFECTOR CELL ANTIGENS
WO2022170619A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Adagene Pte. Ltd. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
EP4301774A4 (en) 2021-03-03 2025-08-13 Dragonfly Therapeutics Inc METHODS OF TREATING CANCER USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT BIND TO NKG2D, CD16, AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
WO2022216992A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for activation and expansion of natural killer cells and combinations with bispecific antibodies
EP4337330A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
JP2024520444A (ja) 2021-05-24 2024-05-24 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を治療するための方法
KR20240115809A (ko) 2021-10-15 2024-07-26 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화 가능한 폴리펩타이드 복합체
WO2023064955A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd3, anti-egfr, heteromultimeric bispecific polypeptide complex
US20230174995A1 (en) 2021-10-15 2023-06-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
WO2023083381A1 (zh) 2021-11-15 2023-05-19 成都百利多特生物药业有限责任公司 双特异性抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
WO2023150672A1 (en) * 2022-02-04 2023-08-10 Duke University Compositions for and methods of treating hematological cancers
CN118574934A (zh) * 2022-02-11 2024-08-30 因特尔乌斯生物治疗公司 促融合弹状病毒糖蛋白及其用途
CN114316062B (zh) * 2022-03-02 2022-06-07 珠海臻谱基因科技有限公司北京分公司 靶向HIV gp120蛋白和人CD3分子的多特异性抗体及其应用
US11958906B2 (en) 2022-04-13 2024-04-16 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
WO2024104988A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with activatable effector domain
IL326412A (en) 2023-08-11 2026-04-01 Wuxi Biologics Ireland Ltd Anti-muc16 antibodies and uses thereof
WO2025036892A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Morphosys Ag Cycat halfbody molecules comprising sterically occluding moieties
WO2025038668A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Voro Therapeutics, Inc. Therapeutic binding agents that conditionally promote myeloid cell activity against target cells and uses thereof
TW202540200A (zh) 2023-12-01 2025-10-16 美商基利科學股份有限公司 抗ｆａｐ－ｌｉｇｈｔ融合蛋白及其用途
WO2025189116A1 (en) * 2024-03-08 2025-09-12 Synthetic Design Lab, Inc. Multivalent multispecific constructs for targeted payload delivery
WO2025199278A2 (en) * 2024-03-20 2025-09-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Masked multispecific antigen-binding molecules with cleavable linkers
WO2025235515A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex formulations
WO2025240659A2 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable constructs, compositions and methods
WO2025237931A1 (en) * 2024-05-15 2025-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with conditionally activatable t cell and nk cell recruiting effector domains
WO2025259871A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Gilead Sciences, Inc. Anti-ccr8 antibodies and uses thereof
WO2026024841A1 (en) * 2024-07-24 2026-01-29 Astellas Us Llc Bispecific antibodies that bind cd3 and muc1 and methods of use thereof
WO2026082031A1 (zh) * 2024-10-14 2026-04-23 先声再明医药股份有限公司 一种包含抗cdh6抗体或其adc的药物组合物

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
EP0279862B1 (en) 1986-08-28 1993-11-03 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
WO1991001752A1 (en) 1989-07-27 1991-02-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunosuppressive monoclonal antibodies, hybridomas and methods of transplantation
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
GB9021679D0 (en) 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
US5968509A (en) 1990-10-05 1999-10-19 Btp International Limited Antibodies with binding affinity for the CD3 antigen
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
IT1271461B (it) 1993-12-01 1997-05-28 Menarini Ricerche Sud Spa Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso.
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
GB9815909D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Btg Int Ltd Antibody preparation
EP1286700A2 (en) * 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
WO2002030460A2 (en) 2000-10-09 2002-04-18 Isis Innovation Ltd. Therapeutic antibodies
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
AU2003244817B2 (en) * 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
US8809504B2 (en) 2002-09-03 2014-08-19 Vit Lauermann Inhibitor which is deactivatable by a reagent produced by a target cell
DK1629011T3 (da) 2003-05-31 2010-05-03 Micromet Ag Humane anti-humane-DC3-bindingsmolekyler
EP1668114B1 (en) 2003-08-18 2009-11-04 The Regents of the University of California Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof
MXPA06004035A (es) 2003-10-16 2006-08-31 Micromet Ag Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos.
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
AU2006284651C1 (en) 2005-08-31 2013-09-12 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
CN101309703A (zh) 2005-09-12 2008-11-19 诺维莫尼公司 抗cd3抗体组合物
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
JP2009529522A (ja) 2006-03-10 2009-08-20 ディアト 酵素で切断可能なリンカーを介して抗体に複合された抗癌剤
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
GB0605702D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Biotransformations Ltd Materials and methods for immune cell stimulation
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
CA2654794A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-21 Imclone Systems Incorporated Lyophilized formulations of anti-egfr antibodies
RU2769948C2 (ru) 2007-04-03 2022-04-11 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх CD3-Эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
MX2009010611A (es) 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
US8293685B2 (en) 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
KR20100058509A (ko) * 2007-07-31 2010-06-03 메디뮨 엘엘씨 다중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
US20110293619A1 (en) 2008-10-01 2011-12-01 Micromet Ag CROSS-SPECIES-SPECIFIC PSMAxCD3 BISPECIFIC SINGLE CHAIN ANTIBODY
EP2352765B1 (en) * 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
AU2009303318B2 (en) * 2008-10-10 2016-06-30 Aptevo Research And Development Llc TCR complex immunotherapeutics
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
WO2010077643A1 (en) 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
ES3000111T3 (en) 2009-02-13 2025-02-27 Immunomedics Inc Intermediates for preparing conjugates with an intracellularly-cleavable linkage
AU2010215761B2 (en) 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
US20100241584A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Bank Of America Flexible design pension account
WO2010109924A1 (ja) 2009-03-25 2010-09-30 国立大学法人東北大学 Ｌｈ型二重特異性抗体
AR076508A1 (es) 2009-05-01 2011-06-15 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA3253628A1 (en) 2010-03-05 2025-11-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
CN103068847B (zh) 2010-08-24 2019-05-07 罗切格利卡特公司 可活化的双特异性抗体
TWI452136B (zh) * 2010-11-17 2014-09-11 中外製藥股份有限公司 A multiple specific antigen-binding molecule that replaces the function of Factor VIII in blood coagulation
US9249217B2 (en) 2010-12-03 2016-02-02 Secretary, DHHS Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
TWI743461B (zh) 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
KR102060389B1 (ko) 2011-05-21 2019-12-31 마크로제닉스, 인크. 사람 및 비-사람 cd3에 결합할 수 있는 cd3-결합 분자
JP5960138B2 (ja) * 2011-06-28 2016-08-02 第一三共株式会社 リン酸エステル誘導体
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
JP6060162B2 (ja) 2011-08-23 2017-01-11 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
HUE033245T2 (hu) 2011-12-19 2017-11-28 Synimmune Gmbh Bispecifikus ellenanyag molekula
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
EP2863948B1 (en) * 2012-06-22 2018-10-24 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
US9856314B2 (en) 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
AU2013289883B2 (en) 2012-07-13 2018-11-01 Zymeworks Bc Inc. Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-CD3 constructs
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US9487590B2 (en) * 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
CN105008918A (zh) 2013-01-04 2015-10-28 西托姆克斯治疗公司 用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法
EP2986559B1 (en) * 2013-04-19 2018-12-05 ExxonMobil Chemical Patents Inc. Molecular sieve cok-5 and its synthesis
KR20160018579A (ko) * 2013-06-04 2016-02-17 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화가능 항체를 접합하기 위한 조성물 및 방법
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
CN112472699A (zh) * 2013-07-26 2021-03-12 种族肿瘤学公司 改善比生群及衍生物的治疗益处的组合方法
WO2015066279A2 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
US9562073B2 (en) * 2014-01-31 2017-02-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
CA2955947A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
MA40894A (fr) 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CA2984892A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
IL292798A (en) * 2015-05-04 2022-07-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, preparations containing them and their uses
EP3430058A4 (en) 2016-03-15 2019-10-23 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. MULTISPECIFIC FAB FUSION PROTEINS AND USES THEREOF
EP3694885A1 (en) * 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
WO2019213444A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DK3406633T3 (da) 2022-03-28
JP2020114872A (ja) 2020-07-30
AU2020200981A1 (en) 2020-02-27
JP7036860B2 (ja) 2022-03-15
BR112016001611B1 (pt) 2024-01-09
NZ716064A (en) 2022-03-25
RU2016106115A (ru) 2017-08-30
KR102216088B1 (ko) 2021-02-15
EP3024851A1 (en) 2016-06-01
DK3024851T3 (en) 2018-08-06
CN113150164A (zh) 2021-07-23
CA2918795A1 (en) 2015-01-29
HRP20220553T1 (hr) 2022-06-10
AU2014292924B2 (en) 2019-11-21
US20210238291A1 (en) 2021-08-05
JP2022065174A (ja) 2022-04-26
JP2024083331A (ja) 2024-06-20
NZ755670A (en) 2022-03-25
BR112016001611A2 (pt) 2017-08-29
US11161906B2 (en) 2021-11-02
CN105722859B (zh) 2021-05-07
ES2912932T3 (es) 2022-05-30
RU2016106115A3 (sr) 2018-07-24
AU2014292924A1 (en) 2016-02-11
AU2020200981B2 (en) 2021-11-18
ES2683268T3 (es) 2018-09-25
IL243752B (en) 2021-10-31
EP3024851B1 (en) 2018-05-09
EP4067383A1 (en) 2022-10-05
US20150079088A1 (en) 2015-03-19
PL3406633T3 (pl) 2022-05-23
IL243752A0 (en) 2016-04-21
JP6693872B2 (ja) 2020-05-13
JP2016525551A (ja) 2016-08-25
EP3406633A1 (en) 2018-11-28
KR20160035065A (ko) 2016-03-30
EP3406633B1 (en) 2022-03-02
RU2727836C2 (ru) 2020-07-24
PT3406633T (pt) 2022-05-04
CN105722859A (zh) 2016-06-29
RU2020123264A (ru) 2020-10-14
WO2015013671A1 (en) 2015-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7564853B2 (ja) 抗－ｃｄ３抗体、活性化可能抗－ｃｄ３抗体、多重特異的抗－ｃｄ３抗体、多重特異的活性化可能抗－ｃｄ３抗体、及びそれらの使用方法
JP7036860B2 (ja) 多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及びそれらの使用方法
JP2025016554A (ja) マトリックスメタロプロテイナーゼ基質及び他の切断可能部分並びにそれらの使用方法
AU2016233495A1 (en) Anti-PDL1 antibodies, activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
HK40000977A (en) Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
HK40000977B (en) Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
HK1224687B (en) Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
HK1224687A1 (en) Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same