ES2915576T3 - Modificación de la especificidad de moléculas de ARN no codificantes de plantas para silenciar la expresión génica - Google Patents

Abstract

Un método para modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN para un ARN diana en una célula vegetal, comprendiendo el método introducir en la célula vegetal un agente de edición de ADN que redirige una especificidad silenciadora de dicha molécula silenciadora de ARN hacia un segundo ARN diana, siendo dicho ARN diana y dicho segundo ARN diana distintos e introducir en la célula vegetal un oligonucleótido donante para generar un cambio preciso en el genoma, modificando así el gen que codifica la molécula silenciadora de ARN de manera que se suprime la especificidad original de la molécula silenciadora de ARN y se gana una nueva especificidad hacia el segundo ARN diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Modificación de la especificidad de moléculas de ARN no codificantes de plantas para silenciar la expresión génica

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la modificación de genes que codifican o se procesan en moléculas silenciadoras de ARN y, más particularmente, pero no exclusivamente, al uso de los mismos para silenciar la expresión génica diana endógena o exógena de interés en las plantas.

El silenciamiento de ARN o interferencia de ARN (ARNi), el mecanismo regulador genético endógeno co- o postranscripcional en el que las moléculas de ARN inhiben la expresión o traducción génica, generalmente está mediado por moléculas de ARN no codificantes, incluidos los microARN (miARN), ARN interferentes pequeños (ARNip), ARNpi de acción trans (ta-ARNip), ARN de interacción con piwi (ARNpi), ARN antisentido, etc. Recientemente, se ha implicado que los ARN no codificantes adicionales albergan una actividad silenciadora de ARN, incluidos ARN de transferencia (ARNt), ARN nuclear pequeño (ARNncp), ARN nucleolar pequeño (ARNnop) y ARN derivado de repeticiones. Estas moléculas silenciadoras de ARN canónicas y no canónicas difieren en sus sustratos, biogénesis, proteínas efectoras y modos de regulación negativa de la diana.

Por otra parte, proteínas argonauta, en complejo con ARN pequeños, forman el núcleo del complejo de silenciamiento inducido por a Rn (RISC), el complejo efector ARN-interferencia (ARNi). La superfamilia argonauta se segrega en dos clados, denominados Ago y Piwi. Las proteínas Ago (por ejemplo, Ago1 y Ago2) suelen formar complejos con miARN y ARNpi, mientras que las proteínas Piwi (por ejemplo, Piwi, Ago3 y Aubergine (Aub)) suelen formar complejos con ARNip.

Los ARN pequeños de interferencia (ARNpi) son moléculas de ARN de doble cadena de 20-25 nucleótidos (nt) de longitud, que interfieren con la expresión de genes específicos con secuencias nucleotídicas complementarias al degradar su transcripción durante o después de la transcripción, lo que da como resultado que no haya traducción.

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes endógenos (ARNnc) de 20 a 24 nt de longitud, que proceden precursores largos autocomplementarios. Los miARN maduros regulan la expresión génica de dos maneras; (i) inhibiendo la traducción o (ii) degradando los ARNm codificantes por un complemento perfecto o casi perfecto con la transcripción diana. La mayoría de los ARNm diana de plantas contienen un solo sitio complementario de miARN, lo que da como resultado que los ARNm diana sean escindidos y degradados por la molécula silenciadora de ARN y la maquinaria de descomposición del ARN.

Los ARN que interaccionan con piwi (ARNip) son pequeños ARN no codificantes que son el producto de moléculas precursoras monocatenarias largas y que se generan sin una etapa de corte. Los ARNip suelen tener una longitud de 26 a 31 nt y son en su mayoría antisentido. Los ARNip forman complejos de ARN-proteína a través de interacciones con proteínas Piwi. Los ARNip antisentido normalmente se cargan en Piwi o Aub.

Los ARNip de transacción (ARNtasi) son una clase de ARN pequeños de interferencia (ARNpi) que reprimen la expresión génica a través del silenciamiento génico postranscripcional. Su biogénesis está impulsada por la asociación de miARN a precursores de ARNtasi, que recluta ARN polimerasas dependientes de ARN (RpRd) que sintetizan ARNbc a partir del molde precursor de ARNtasi. A continuación, dicho ARNbc es procesado por DICER-LIKE 4 (DCL4) en ARNtasi maduros a intervalos "en fase" de aproximadamente 21 nucleótidos.

Los avances recientes en las técnicas de edición del genoma han hecho posible alterar las secuencias de ADN en las células vivas. Al editar solo unos pocos de los miles de millones de nucleótidos en las células de las plantas, estas nuevas técnicas podrían ser la forma más efectiva de hacer que los cultivos crezcan mejor en climas severos (rendimiento de los cultivos y estrés abiótico) y mejorar la resistencia al estrés biótico (insectos, virus, bacteria, escarabajos, nematodos, etc.). Existen enfoques limitados para lograr la resistencia a las plagas utilizando tecnologías de edición del genoma, tales como CRISPR/Cas9: inactivación de genes susceptibles de plantas (tales como los conocidos genes MLO), mediante la introducción de codones de terminación, desplazamiento del marco, inserciones, deleciones, etc.; o regulación positiva de genes de resistencia, como los genes R, mediante modificación de elementos reguladores como promotores, sitios de unión de microARN, etc. No obstante, los enfoques que están dirigidos específicamente al patógeno se limitan a las aplicaciones transgénicas de CRISPR.

Trabajos previos sobre la edición del genoma de moléculas de ARN en varios organismos (por ejemplo, murino, de ser humano, de gambas, de plantas), centrados en eliminar la actividad de miARN o cambiar su sitio de unión en los ARN diana, por ejemplo:

Zhao et al., [Zhao et al., Scientific Reports (2014) 4:3943] han proporcionado una estrategia de inhibición de miARN empleando el sistema CRISPR en células murinas. Zhao usó un ARNg diseñado específicamente para cortar un gen de miARN en un solo sitio mediante Cas9, lo que da como resultado la inactivación del miARN en células murinas.

Jiang et al. [Jiang et al., RNA Biology (2014) 11 (10): 1243-9] usaron CRISPR/Cas9 para deplecionar el miR-93 humano de un clúster apuntando a su región 5' en las células HeLa. Se indujeron varios indeles pequeños en la región objetivo que contenía el sitio de procesamiento de Drosha (es decir, la posición en la que Drosha, una enzima ARNasa III específica de ARN de doble cadena, se une a, escinde y, por lo tanto, procesa los miARN primarios (pri-miARN) en pre-miARN en el núcleo de una célula huésped) y las secuencias semilla (es decir, las secuencias heptamétricas conservadas que son esenciales para la unión del miARN al ARNm, típicamente situadas en las posiciones 2-7 desde el extremo 5' del miARN). Según Jiang et al., incluso la deleción de un solo nucleótido condujo a la inactivación completa del miARN diana con alta especificidad.

Con respecto a la edición del genoma de las plantas, Bortesi y Fischer [Bortesi y Fischer, Biotechnology Advances (2015) 33: 41-52] trató el uso de la tecnología CRISPR-Cas9 en plantas en comparación con ZFN y TALEN, y Basak y Nithin [Basak y Nithin, Front Plant Sci. (2015) 6: 1001] demostraron el uso de la tecnología CRISPR-Cas9 para la inactivación de genes que codifican proteínas en plantas modelo tales como Arabidopsis y tabaco y cultivos como trigo, maíz y arroz.

Además de la interrupción de la actividad de miARN o de los sitios de unión a la diana, se usó silenciamiento génico utilizando silenciamiento génico mediado por microARN artificiales (miARNa) y genes diana endógenos y exógenos [Tiwari et al. Plant Mol Biol (2014) 86: 1]. Similar a los microARN, los miARNa son monocatenarios, de aproximadamente 21 nt de longitud y se diseñaron reemplazando las secuencias de miARN maduras de dúplex dentro de pre-miARN [Tiwari et al. (2014) citado anteriormente]. Estos miARNa se introducen como un transgén dentro de un casete de expresión artificial (que incluye un promotor, un terminador, etc.) [Carbonell et al., Plant Physiology (2014) pág. 113.234989], se procesan a través de la biogénesis de ARN pequeño y la maquinaria de silenciamiento y regulan por disminución la expresión de la diana. Según Schwab et al. [Schwab et al. The Plant Cell (2006) Vol. 18, 1121­ 1133], los miARNa son activos cuando se expresan bajo promotores inducibles o específicos de tejido y se pueden usar para silenciar genes específicos en plantas, especialmente cuando varios genes diana relacionados, pero no idénticos, necesitan ser regulados por disminución.

Senis et al. [Senis et al., Nucleic Acids Research (2017) Vol. 45(1): e3] desvelan la modificación por ingeniería de un miARN antiviral sin promotor en un locus de miARN endógeno. De manera específica, Senis et al. insertan un transgén precursor de miARNa (pri-miARNa en horquilla) adyacente a un gen de miARN de origen natural (por ejemplo, miR122) mediante recombinación de ADN dirigida por homología que es inducida por nucleasa específica de secuencia, tal como Cas9 o TALEN. Este enfoque usa miARNa sin promotor y sin terminador usando ADN activo transcripcionalmente que expresa miARN natural (miR122), es decir, el promotor y el terminador endógenos impulsaron y regularon la transcripción del transgén de miARNa insertado.

Anteriormente se han descrito varios métodos libres de ADN para introducir ARN y/o proteínas en las células. Por ejemplo, la transfección de ARN mediante electroporación y lipofección se ha descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20160289675. Cho describió la administración directa de los complejos de ribonucleoproteína Cas9/ARNg (RNP) a las células mediante microinyección de los complejos de proteína Cas9 y ARNg [Cho et al., "Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-ARNgc ribonucleoproteins", Genetics (2013) 195:1177-1180]. Kim describió la administración de complejos de proteína Cas9/ARNg mediante electroporación en [Kim et al., "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins" Genome Res. (2014) 24:1012-1019]. Zuris publicó la administración de complejos de ARNg asociado con proteína Cas9 mediante liposomas [Zuris et al., "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo" Nat Biotechnol. (2014) doi: 10.1038/nbt.3081].

Zhou et al. (Frontiers in Plant Science 8 (2017): 1598) se refiere a la edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 y el estudio de la función y regulación del microARN en arroz. Ramirez ("Function of microRNAs in plant innate immunity", 2017) se refiere con la función de los microARN en la inmunidad innata de las plantas. Jacobs et al. (b Mc Biotechnology 15.1 (2015): 1-10) se refiere a modificaciones del genoma dirigidas en soja con CRISPR/Cas9. El documento WO 2016/100333 A1 se refiere a portadores de microARN pesticidas y a su uso.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones dependientes, se definen aspectos y realizaciones preferidas adicionales. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.

La invención proporciona un método para modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN para un ARN diana en una célula vegetal, comprendiendo el método introducir en la célula vegetal un agente de edición de ADN que redirige una especificidad silenciadora de dicha molécula silenciadora de ARN hacia un segundo ARN diana, siendo dicho ARN diana y dicho segundo ARN diana distintos e introducir en la célula vegetal un oligonucleótido donante para generar un cambio preciso en el genoma, modificando así el gen que codifica la molécula silenciadora de ARN de manera que se suprime la especificidad original de la molécula silenciadora de ARN y se gana una nueva especificidad hacia el segundo ARN diana.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para producir una planta con expresión reducida de un gen diana, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN a un ARN diana en una célula vegetal de acuerdo con un método de la invención, generar una planta a partir de dicha célula vegetal, produciendo así la planta con expresión reducida de un gen diana.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar una planta con mayor tolerancia al estrés, rendimiento aumentado, tasa de crecimiento aumentada o calidad del rendimiento aumentada, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal según algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad al estrés, rendimiento disminuido, tasa de crecimiento disminuido o calidad de rendimiento disminuido, generando así la planta.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a patógenos, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ^a Rⁿ en una célula vegetal según algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad al patógeno, generando así la planta tolerante o resistente al patógeno.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a patógenos, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de a Rn en una célula vegetal según algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen del patógeno, generando así la planta tolerante o resistente al patógeno.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a plagas, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal según algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la plaga, generando así la planta tolerante o resistente a plagas.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a plagas, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal según algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad a la plaga, generando así la planta tolerante o resistente a plagas.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para generar una planta resistente a herbicidas, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal según algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad al herbicida, generando así la planta resistente a herbicidas.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el gen que codifica o se procesa en la molécula silenciadora de ARN es endógeno a la célula vegetal.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, modificar el gen que codifica la molécula silenciadora de ARN comprende impartir a la molécula silenciadora de ARN una complementariedad de al menos un 45 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la especificidad de silenciamiento de la molécula silenciadora de ARN se determina midiendo el nivel de ARN del segundo ARN diana.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la especificidad de silenciamiento de la molécula silenciadora de ARN se determina fenotípicamente.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la determinación fenotípica se efectúa mediante la determinación de al menos un fenotipo vegetal seleccionado del grupo que consiste en una coloración de las hojas, una coloración de las flores, una tasa de crecimiento, un tamaño de la planta, rendimientos de un cultivo, un rasgo de fruta, una resistencia al estrés biótico y una resistencia al estrés abiótico.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el fenotipo de la planta se determina antes que el genotipo de la planta.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el genotipo de la planta se determina antes que el fenotipo de la planta.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la molécula silenciadora de ARN es una molécula de interferencia de ARN (ARNi).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la molécula de ARNi se selecciona entre el grupo que consiste en ARN pequeño de interferencia (ARNpi), un ARN en horquilla corta (ARNhc), un microARN (miARN), un ARN que interacciona con Piwi (ARNip) y un ARNpi que actúa en trans (ARNtasi).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la molécula de ARN o molécula de ARNi se diseña de manera que una secuencia de la molécula de ARNi se modifica para preservar la originalidad de la estructura y para ser reconocida por factores de ARNi celular.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación del gen se efectúa mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en una deleción, una inserción, una mutación puntual y una combinación de las mismas.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación está en una región de tallo de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación está en una región de bucle de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación está en una región no estructurada de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación está en una región de tallo y una región de bucle de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación está en una región de tallo y una región de bucle y en la región no estructurada de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación es una inserción.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación es una deleción.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación es una mutación puntual.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 200 nucleótidos.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente de edición de ADN comprende al menos un ARNg unido operativamente a un promotor expresable en plantas.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente de edición de ADN no comprende una endonucleasa. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente de edición de ADN comprende una endonucleasa. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente de edición de ADN es un sistema de edición de ADN seleccionado entre el grupo que consiste en una meganucleasa, una nucleasa de dedos de cinc (ZFN), una nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN) y CRISPR.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la endonucleasa comprende Cas9.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente de edición de ADN se aplica a la célula como ADN, ARN o RNP.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente de edición de ADN está unido a un indicador para controlar la expresión en una célula vegetal.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el indicador es una proteína fluorescente.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el segundo ARN diana es endógeno a la célula vegetal. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el segundo ARN diana es exógeno a la célula vegetal.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención,

la célula vegetal es un protoplasto.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la siembra comprende cruces o autofecundaciones.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la planta no está modificada genéticamente (no-OMG).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la planta se selecciona entre el grupo que consiste en un cultivo, una flor y un árbol.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la invención. Aunque en la práctica o el ensayo de realizaciones de la invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y/o materiales ilustrativos. En caso de conflicto, la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones, prevalecerá. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitantes.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Las características mostradas son a modo de ejemplo y con fines ilustrativos de la discusión de realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada junto con los dibujos hace evidente para los expertos en la materia cómo pueden ponerse en práctica realizaciones de la invención.

En los dibujos:

La FIG. 1 es un diagrama de flujo de la realización del reemplazo del silenciamiento génico inducido por edición del genoma (GEiGS) del miARN endógeno con ARNpi dirigido al gen PDS, induciendo así el silenciamiento génico del gen PDS endógeno. Para introducir la modificación, se está utilizando un sistema de 2 componentes. El primero, un sistema CRISPR/CAS9, en un vector que contiene GFP, genera una escisión en los loci elegidos, a través de ARN guía específicos diseñados para promover la reparación del ADN homólogo (HDR) en el sitio. El segundo, una secuencia DONANTE, con la modificación deseada de la secuencia de miARN, para apuntar a los genes recién asignados, se introduce como molde para el HDR. Este sistema se está utilizando en la transformación de protoplastos, se enriquece por FACS debido a la señal GFP en el vector CRISPR/CAS9, se recupera y se regenera en las plantas.

Las FIG. 2A-C son fotografías que ilustran que el silenciamiento del gen PDS provoca fotoblanqueo. El silenciamiento del gen PDS en plantas de Nicotiana (Figuras 2A-B) y Arabidopsis (Figura 2C) provoca fotoblanqueo en N. benthamiana (Figura 2B) y Arabidopsis (Figura 2C, lado derecho). Las fotografías se tomaron 3 © semanas después del silenciamiento del PDS.

Las FIG. 3A-D son fotografías de reducción de los niveles de expresión de GFP en Arabidopsis usando GEiGS.

Los protoplastos de Arabidopsis que expresan GFP se ilustran como control (Figuras 3A-B) en comparación con los protoplastos editados usando GEiGS para expresar ARNip de GFP (Figuras 3C-D). Cabe señalar que, los protoplastos o plantas GEiGS se silencian para la expresión de la proteína GFP.

La FIG. 4 es un diagrama de flujo de realización del reemplazo de GEiGS de miARN endógeno con ARNpi dirigido a GFP, que genera plantas de Arabidopsis con ARNi activo contra GFP. Para introducir la modificación, un sistema CRISPR/CAS9, en un vector que contiene RFP, genera una escisión en los loci elegidos, a través de ARN guía específicos diseñados para promover la reparación del ADN homólogo (HDR) en el sitio. El segundo, una secuencia DONANTE, con la modificación deseada de la secuencia de miARN, para apuntar al gen GFP, se introduce como molde para el HDR. Este sistema se está utilizando en protoplastos que expresan GFP. Se está realizando y recuperando el enriquecimiento de células supuestamente modificadas por FACS debido a la señal de RFP en el vector CRISPR/CAS9. Las plantas regeneradas están siendo analizadas para determinar la intensidad de la señal GFP.

La FIG. 5 es un diagrama de flujo de realización del reemplazo de GEiGS de miARN endógeno con ARNpi dirigido a GFP, que genera plantas de Arabidopsis con ARNi dirigido por GEiGS contra GFP. Cabe señalar que, las plantas GEiGS se silencian para la expresión de GFP después de la transformación de la planta. Se está usando RFP para el enriquecimiento de células con presencia transitoria del vector CRISPR/CAS9.

La FIG. 6 es un diagrama de flujo de realización del reemplazo de GEiGS de miARN endógeno con ARNpi dirigido a GFP, que genera plantas resistentes a la infección vírica, por ejemplo, infección por TMV (es decir, gen exógeno).

Se está usando RFP para el enriquecimiento de células con presencia transitoria del vector CRISPR/CAS9.

La FIG. 7 es una fotografía de plantas de plátano que sufren encamado causado por el nematodo barrenador, Radopholus similis.

La FIG. 8 es una tabla que ilustra la presencia de Radopholus similis y Pratylenchus coffeae en diferentes cultivos en el área de Tay Nguyen.

La FIG. 9 es un diagrama de flujo de la realización de canalización computacional para generar moldes de GEiGS.

La canalización computacional de GEiGS aplica metadatos biológicos y permite una generación automática de moldes de donantes de ADN de GEiGS que se utilizan para editar mínimamente genes de ARN no codificantes endógenos (por ejemplo, genes de miARN), lo que conduce a una nueva ganancia de función, es decir, la redirección de su capacidad de silenciamiento para dirigirse a la expresión del gen de interés.

La FIG. 10 es un diagrama de flujo de la realización que ilustra el diseño de una planta resistente a plagas que se dirige a cualquier gen de plaga exógeno deseado. Reemplazo de GEiGS de miARN endógeno con ARNpi dirigido al gen esencial de patógenos/plagas, que genera plantas resistentes a la infección por patógenos/plagas.

La FIG. 11 es un dibujo de realización que ilustra las etapas principales requeridas para diseñar una molécula silenciadora de ARN y con bases génicas de miARN mínimamente editadas.

Las FIG. 12A-G ilustran transcritos primarios de miR-390 y estructura de miR390 modificada y secuencias dirigidas. Representación de la estructura secundaria de los transcritos primarios de miR390 y sus versiones modificadas (Figura 12A) de tipo salvaje; (Figuras 12B-C) versión modificada para apuntar a GFP; (Figuras 12D-E) versión modificada para apuntar a AtPDS3; (Figuras 12F-G) versión modificada para apuntar a AtADH1. Los miARN/ARNpi maduros se destacan en rojo, exhibiendo la conservación de la estructura a través del diseño. Las regiones seleccionadas para su manipulación mediante el sistema CRISPR/CAS9 están delineadas en púrpura y la secuencia NGG está resaltada en amarillo (Figura 12A).

Las FIG. 13A-G ilustran transcritos primarios de miR-173 y estructura de miR173 modificada y secuencias dirigidas. Representación de la estructura secundaria de los transcritos primarios de miR173 y sus versiones modificadas (Figura 13A) de tipo salvaje; (Figuras 13B-C) versión modificada para apuntar a GFP; (Figura 13D-E) versión modificada para apuntar a AtPDS3; (Figura 13F-G) versión modificada para apuntar a AtADH1. Los miARN/ARNpi maduros se destacan en rojo, exhibiendo la conservación de la estructura a través del diseño. Las regiones seleccionadas para su manipulación mediante el sistema CRISPR/CAS9 están delineadas en púrpura y la secuencia NGG está resaltada en amarillo (Figura 13A).

La FIG. 13H ilustra ejemplos de realización de diseños de oligo GEiGS en los que la estructura precursora no desempeña un papel en la biogénesis, por lo tanto, no es necesario mantenerla. Diseño basado en ARNtasi bnTAS3B de Brassica rapa. De arriba a abajo: ARNtasi de tipo salvaje, diseño GEiGS con cambios de secuencia mínimos y diseño GEiGS con cambios de secuencia máximos. Las selecciones de precursores de ARN no codificantes que dan lugar a moléculas de ARN pequeñas maduras se resaltan en verde. Las diferencias de secuencia entre los oligos GEiGS y la secuencia de tipo salvaje se resaltan en rojo. Cabe señalar que, la biogénesis de ARNtasi, a diferencia de los miARN y los ARNt, no depende de la estructura secundaria precursora.

Las FIG. 14A-D ilustran el direccionamiento de genes por miR-173 y sus versiones modificadas. (Figura 14A) El miR-173 de tipo salvaje se dirige al transcrito TASlc por complementariedad de secuencia del miARN maduro con una secuencia en el gen (en rojo). Los miARN recién modificados (INTERCAMBIOS 1, 2, 3, 4, 9 y 10) fueron diseñados para apuntar (Figura 14B) a GFP, (Figura 14C) AtPDS3 y (Figura 14D) AtADH1 mediante complementariedad de secuencia con su secuencia (en rojo). Los nucleótidos modificados de la secuencia sv, se escriben en minúsculas.

Las FIG. 15A-D ilustran el direccionamiento de genes por miR-390 y sus versiones modificadas. (Figura 15A) El miR-390 de tipo salvaje se dirige al transcrito TAS3 por complementariedad de secuencia del miARN maduro con una secuencia en el gen (en rojo). Los miARN recién modificados (INTERCAMBIOS 5, 6, 7, 8, 11 y 12) fueron diseñados para apuntar (Figura 15B) a GFP, (Figura 15C) AtPDS3 y (Figura 15D) AtADH1 mediante complementariedad de secuencia con su secuencia (en rojo). Los nucleótidos modificados de la secuencia sv, se escriben en minúsculas.

La FIG. 16 ilustra el fenotipo/genotipo de PDS3: las plantas con fenotipo blanqueado se seleccionaron y genotiparon mediante PCR de amplicón interno seguido de análisis de digestión de restricción con BtsaI (NEB) para verificar la presencia del donante frente a la secuencia de tipo salvaje. Carril 1: Plantas tratadas SIN DONANTE, restringidas, Carriles 2-4: Plantas tratadas con PDS3 que contienen DONANTE restringido, Carril 5: Control de DONANTE de plásmido positivo sin restricciones, Carril 6: Agua sin control de molde, Carril 7: Donante de plásmido positivo restringido, Carril 8: Plantas bombardeadas con DONANTE negativo restringido, Carril 9: Plantas de control no tratadas restringidas. La posterior amplificación por PCR externa del amplicón se procesó y secuenció para validar la inserción.

La FIG. 17 ilustra el fenotipo/genotipo de ADH1: Las plantas se seleccionaron a través de la resistencia al alcohol alílico y se genotipificaron mediante PCR de amplicón interno seguido de digestión de restricción BccI (NEB) para verificar la presencia de donantes. Carril 1: Planta de control sensible al alcohol alílico restringida, Carril 2-4: Plantas resistentes al alcohol alílico que contienen DONANTE restringido, Carril 5: Control de DONANTE de plásmido positivo sin restricciones, Carril 6: control sin molde, Carril 7: Donante de plásmido positivo restringido, Carril 8: Planta bombardeada con DONANTE no específico restringido, Carril 9: Control no tratado con alcohol alílico restringido.

La FIG. 18 es un gráfico que ilustra el análisis de expresión génica en plantas modificadas con miR-173 dirigidas al transcrito de AtPDS3. El análisis de la expresión de AtPDS3 se realizó mediante qRT-PCR, en la regeneración de plantas bombardeadas con GEiGSN.°4 e INTERCAMBIO3 en comparación con plantas bombardeadas con GEiGS#5 e INTERCAMBIO1 y 2 (GFP). Cabe señalar que, se observó una reducción del 82 % en el nivel de expresión génica, en promedio, cuando miR-173 se modificó para apuntar a AtPDS3, en comparación con las plantas de control (las barras de error presentan SD; valor de p < 0,01 calculado sobre los valores de Ct).

La FIG. 19 es un gráfico que ilustra el análisis de expresión génica en plantas modificadas con miR-390 dirigidas al transcrito de AtPDS3. El análisis de la expresión de AtADH1 se realizó mediante qRT-PCR, en la regeneración de plantas bombardeadas con GEiGSn.°1 e INTERCAMBIO11, en comparación con plantas bombardeadas con GEiGSN.°5 e INTERCAMBIO1 y 2 (GFP). Cabe señalar que, se observó una reducción del 82 % en el nivel de expresión génica, en promedio, cuando miR-390 se modificó para apuntar a AtADH1, en comparación con las plantas de control (las barras de error representan SD; valor de p < 0,01 calculado sobre los valores de Ct).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a la modificación de genes que codifican o se procesan en moléculas silenciadoras de ARN y, más particularmente, pero no exclusivamente, al uso de los mismos para silenciar ARN diana endógeno o exógeno de interés en plantas.

Los principios y la operación de la presente invención pueden entenderse mejor en referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas.

Debe entenderse que la invención no se limita necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados por los ejemplos. La invención tiene capacidad para otras realizaciones o puede practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras. Asimismo, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en el presente documento son con fines descriptivos y no deberían interpretarse como limitantes.

Trabajos previos sobre la edición del genoma de moléculas de ARN en varios organismos (por ejemplo, murino, de ser humano, de plantas), se centró en la interrupción de la actividad de miARN o los sitios de unión objetivo mediante transgénesis. La edición del genoma en plantas se ha concentrado aún más en el uso de la tecnología CRISPR-Cas9, ZFN y TALEN, para la eliminación de genes o inserciones en plantas modelo. Por otra parte, se describió el silenciamiento de genes en plantas usando transgenes de microARN artificiales para silenciar genes diana endógenos y exógenos [Molnar A et al. Plant J. (2009) 58(1):165-74. doi: 10.1111/j.1365-313X.2008.03767.x. Epub 2009 Jan 19; Borges y Martienssen, Nature Reviews Molecular Cell Biology | AOP, publicado online el 4 de noviembre de 2015; doi: 10.1038/nrm4085]. Los transgenes de miARN artificiales se introducen en las células vegetales dentro de un casete de expresión artificial (que incluye un promotor, un terminador, un marcador de selección, etc.) y regulan por disminución la expresión diana.

Los presentes inventores han ideado una tecnología de edición de genes dirigida a moléculas de ARN no codificantes (por ejemplo, endógenas) diseñadas para dirigirse e interferir con un gen diana no natural de interés (endógeno o exógeno a la célula vegetal). La tecnología de edición de genes descrita en el presente documento no implementa las herramientas genéticas y transgénicas moleculares clásicas que comprenden casetes de expresión que tienen un promotor, un terminador, marcador de selección.

Como se muestra a continuación en el presente documento y en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han diseñado una plataforma de silenciamiento génico inducido por edición del genoma (GEiGS) capaz de utilizar moléculas de ARN no codificantes endógenas de una célula vegetal que incluyen, por ejemplo, moléculas silenciadoras de ARN (por ejemplo, ARNpi, miARN, ARNip, tasiARN, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ARNsn, ARNsno, etc.) y modificándolos para apuntar y regular por disminuir cualquier diana de ARN de interés (véase el diagrama de flujo de ejemplo en la Figura 1). Usando GEiGS, el presente método permite detectar posibles moléculas de ARN no codificantes, editar nucleótidos en estas moléculas de ARN endógeno y, por lo tanto, redirigir su especificidad para apuntar y regular por disminuir de manera efectiva y específica cualquier ARN de interés, incluidos, ARN endógeno y/o exógeno codificado por patógenos y plagas (véase el diagrama de flujo de ejemplo en la figura 9). Considerados en conjunto, GEiGS se puede utilizar como una nueva tecnología no modificada genéticamente para aumentar el rendimiento de los cultivos, la tasa de crecimiento de los cultivos, la calidad del cultivo, así como para la protección del cultivo contra el estrés, patógenos, plagas y herbicidas.

El término "planta" como se usa en el presente documento abarca plantas completas, una planta injertada, ancestros y descendencia de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, raíces (incluyendo tubérculos), portainjertos, vástago y células vegetales, tejidos y órganos. La planta puede estar en cualquier forma, incluyendo cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, gametofitos, esporofitos, polen y micrósporas. Las plantas que pueden ser particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo una legumbre forrajera o de pienso, planta ornamental, cultivo alimentario, árbol o arbusto seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia disolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, plátano, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, repollo, colza, zanahoria, coliflor, apio, berza, lino, kale, lenteja, colza de semilla oleaginosa, quingombó, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, té de calabaza, árboles. Como alternativa, se pueden usar algas y otras no Viridiplantae para los métodos de algunas realizaciones de la presente invención.

De acuerdo con una realización específica, la planta es un cultivo, una flor o un árbol.

De acuerdo con una realización específica, la planta es una especie de planta leñosa, por ejemplo, Actinidia chinensis (Actinidiaceae), Manihotesculenta (Euphorbiaceae), Firiodendron tulipifera (Magnoliaceae), Populus (Salicaceae), Santalum album (Santalaceae), Ulmus (Ulmaceae) y diferentes especies de Rosaceae (Malus, Prunus, Pyrus) y las Rutaceae (Citrus, Microcitrus), Gimnospermas, por ejemplo, Picea glauca y Pinus taeda, árboles del bosque (por ejemplo, Betuláceas, Fagáceas, Gimnospermas y especies de árboles tropicales), árboles frutales, arbustos o hierbas, por ejemplo, (plátano, cacao, coco, café, dátil, uva y té) y aceite de palma.

De acuerdo con una realización específica, la planta es de un cultivo tropical, por ejemplo, café, macadamia, plátano, piña, taro, papaya, mango, cebada, judías, mandioca, garbanzo, cacao (chocolate), caupí, maíz, mijo, arroz, sorgo, caña de azúcar, batata, tabaco, taro, té, ñame.

"Grano", "semilla", o "vaina", se refiere a la unidad de reproducción de una planta con flores, capaz de convertirse en otra planta similar. Como se utiliza en el presente documento, los términos se usan como sinónimos e intercambiablemente.

De acuerdo con una realización específica, la planta es una célula vegetal, por ejemplo, célula vegetal en una suspensión de células embrionarias.

De acuerdo con una realización específica, la célula vegetal es un protoplasto.

Los protoplastos derivan de cualquier tejido vegetal, por ejemplo, frutos, flores, raíces, hojas, embriones, suspensión de células embrionarias, callos o tejido de plántulas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de ARN no codificante" se refiere a una secuencia de ARN que no se traduce en una secuencia de aminoácidos y no codifica una proteína.

De acuerdo con una realización, la molécula de ARN no codificante está típicamente sujeta al mecanismo o actividad de procesamiento de silenciamiento de ARN. Sin embargo, también se contemplan en el presente documento algunos cambios en los nucleótidos (por ejemplo, para miARN de hasta 24 nucleótidos) que pueden provocar un mecanismo de procesamiento que da como resultado la interferencia del ARN o la inhibición de la traducción.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante es endógena (de origen natural, por ejemplo, nativa) a la célula. Se apreciará que la molécula de ARN no codificante también puede ser exógena a la célula (es decir, añadida externamente y que no se produce de forma natural en la célula).

De acuerdo con algunas realizaciones, la molécula de ARN no codificante comprende una actividad de inhibición de la traducción intrínseca.

De acuerdo con algunas realizaciones, la molécula de ARN no codificante comprende una actividad intrínseca de ARNi.

De acuerdo con una realización de la invención, la molécula de ARN no codificante es específica de un ARN diana (por ejemplo, un ARN diana natural) y no inhibe de forma cruzada ni silencia un segundo ARN diana o un ARN diana de interés a menos que esté diseñado para hacerlo (como se explica a continuación) y presenta un 100 % o menos homología global con el gen diana, por ejemplo, menos del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 % de homología global con el gen diana; según lo determinado a nivel de ARN o proteína por RT-PCR, transferencia Western, inmunohistoquímica y/o citometría de flujo, secuenciación o cualquier otro método de detección.

La expresión "silenciamiento de ARN" o ARNi se refiere a un mecanismo de regulación celular en el que median moléculas de ARN no codificantes (la "molécula silenciadora de ARN" o "molécula de ARNi"), de una manera específica de la secuencia, inhibición co- o post-transcripcional de la expresión o traducción génica.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN es capaz de mediar en la represión de ARN durante la transcripción (silenciamiento génico cotranscripcional).

De acuerdo con una realización específica, el silenciamiento génico cotranscripcional incluye el silenciamiento epigenético (por ejemplo, el estado cromático que impide la expresión génica funcional).

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN es capaz de mediar en la represión de ARN después de la transcripción (silenciamiento génico postranscripcional).

El silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) generalmente se refiere al proceso (que generalmente ocurre en el citocitoplasma celular) de degradación o escisión de moléculas de ARN mensajero (ARNm) que disminuyen su actividad al impedir la traducción.

Por ejemplo, y como se analiza con detalle a continuación, una hebra guía de una molécula silenciadora de ARN se empareja con una secuencia complementaria en una molécula de ARNm e induce la escisión, por ejemplo, Argonauta 2 (Ago2).

El silenciamiento génico cotranscripcional normalmente se refiere a la inactivación de la actividad génica (es decir, la represión de la transcripción) y normalmente se produce en el núcleo celular. Tal represión de la actividad génica está mediada por factores relacionados con la epigenética, tales como, por ejemplo, metil-transferasas, que metilan el ADN diana y las histonas. Por lo tanto, en el silenciamiento génico cotranscripcional, la asociación de un ARN pequeño con un ARN diana (interacción ARN pequeño-transcrito) desestabiliza el transcrito naciente diana y recluta enzimas modificadoras de ADN e histonas (es decir, factores epigenéticos) que inducen la remodelación de la cromatina en una estructura que reprime la actividad génica y la transcripción. Asimismo, en el silenciamiento génico cotranscripcional, los armazones de ARN no codificantes largos asociados a la cromatina pueden reclutar complejos modificadores de la cromatina independientemente de los ARN pequeños. Estos mecanismos de silenciamiento cotranscripcional forman sistemas de vigilancia de ARN que detectan y silencian eventos de transcripción inapropiados y proporcionan una memoria de estos eventos a través de bucles epigenéticos que se refuerzan a sí mismos [como se describe en D. Hoch y D. Moazed, RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression, Nat Rev Genet. (2015) 16(2): 71-84].

De acuerdo con una realización de la invención, la maquinaria de biogénesis/procesamiento de ARNi genera la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con una realización de la invención, la maquinaria de biogénesis/procesamiento de ARNi genera la molécula silenciadora de ARN, pero no se ha identificado una diana específica.

A continuación sigue una descripción detallada de moléculas de ARN no codificantes que comprenden una actividad intrínseca de ARNi (por ejemplo, son moléculas silenciadoras de ARN) que pueden usarse de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor de ARN monocatenario (ARNmc) estructurado.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor de ARN monocatenario no estructurado en dúplex.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor de ARNbc (por ejemplo, que comprende apareamiento de bases perfecto e imperfecto).

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor de ARN no estructurado.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor de ARN codificante de proteína.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor de ARN no codificante.

De acuerdo con una realización, el ARNbc puede derivar de dos ARN complementarios diferentes o de un ARN sencillo que se pliega sobre sí mismo para formar ARNbc.

ARN de bases apareadas de forma perfecta o imperfecta (es decir, ARN bicatenario; ARNbc), ARNpi y ARNhc - La presencia de ARNbc largos en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada dicer. Dicer (también conocida como endoribonucleasa Dicer o helicasa con motivo de ARNasa) es una enzima que en las plantas se suele denominar proteína similar a Dicer (DCL). Diferentes plantas tienen diferentes números de genes DCL, de este modo, por ejemplo, el genoma de Arabidopsis típicamente tiene cuatro genes DCL, el arroz tiene ocho genes DCL y el genoma del maíz tiene cinco genes DCL. Dicer participa en el procesamiento del ARNbc en fragmentos cortos de ARNbc conocidos como ARN de interferencia cortos (ARNpi). Los ARNpi derivados de la actividad dicer tienen típicamente de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden aproximadamente dúplex de 19 pares de bases con dos salientes de nucleótidos en 3'.

En consecuencia, algunas realizaciones de la invención contemplan la modificación de un gen que codifica un ARNbc para redirigir una especificidad de silenciamiento (incluida la actividad de silenciamiento) hacia un segundo ARN diana (es decir, el ARN de interés).

De acuerdo con una realización, se usan precursores de ARNbc de más de 21 pb. Varios estudios demuestran que los ARNbc largos se pueden usar para silenciar la expresión génica sin inducir la respuesta al estrés o causar efectos fuera de la diana significativos; véase, por ejemplo, [Strat et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, N.° 133803­ 3810; Bhargava A et al. Brain Res. Protoc. 2004;13:115-125; Diallo M., et al., Oligonucleotides. 2003;13:381-392; Paddison P.J., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99:1443-1448; Tran N., et al., FEBS Lett. 2004;573:127-134].

El término "ARNpi" se refiere a pequeños dúplex de ARN inhibidores (generalmente 18-30 pares de bases) que inducen la vía de interferencia de ARN (ARNi). Típicamente, los ARNpi se sintetizan químicamente como 21 unidades con una región dúplex central de 19 pb y salientes en 3' simétricos de 2 bases en los extremos, aunque se ha descrito recientemente que los dúplex de ARN sintetizados químicamente de 25-30 bases de longitud pueden tener un aumento de potencia de hasta 100 veces en comparación con 21 unidades en la misma ubicación. Se sugiere que el aumento de potencia observado obtenido usando ARN más largos en la activación de ARNi es el resultado de proporcionar a Dicer un sustrato (27 unidaes) en lugar de un producto (21 unidades) y que esto mejora la velocidad o la eficiencia de entrada del dúplex de ARNpi en RISC.

Se ha descubierto que la posición, pero no la composición, del saliente en 3' influye en la potencia de un ARNpi y los dúplex asimétricos que tienen un saliente en 3' en la cadena antisentido son generalmente más potentes que aquellos con el saliente en 3' en la cadena sentido (Rose et al., 2005).

Las cadenas de un ARN de interferencia bicatenario (por ejemplo, un ARNpi) se pueden conectar para formar una estructura de horquilla o bucle (por ejemplo, un ARNsh). Por lo tanto, como se ha mencionado, la molécula silenciadora de ARN utilizada de acuerdo con algunas realizaciones de la invención también puede ser un ARN de horquilla corto (ARNhc).

El término ARN de horquilla corto, "ARNhc", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN que tiene una estructura de tallo-bucle, que comprende una primera y una segunda región de secuencia complementaria, el grado de complementariedad y orientación de las regiones es suficiente para que se produzca un apareamiento de bases entre las regiones, estando unidas la primera y la segunda regiones por una región de bucle, el bucle resultante de la falta de apareamiento de bases entre nucleótidos (o análogos de nucleótidos) dentro de la región del bucle. El número de nucleótidos en el bucle es un número entre 3 y 23 ambos incluido, o entre 5 y 15, o entre 7 y 13, o entre 4 y 9, o entre 9 y 11. Algunos de los nucleótidos del bucle pueden participar en interacciones de pares de bases con otros nucleótidos del bucle. Los ejemplos de secuencias oligonucleotídicas que se pueden usar para formar el bucle incluyen 5'-CAAGAGA-3' y 5'-UUACAA-3' (solicitudes de patente internacional números WO2013126963 y WO2014107763). Un experto en la técnica reconocerá que el oligonucleótido monocatenario resultante forma una estructura de horquilla o tallo-bucle que comprende una región de doble cadena capaz de interaccionar con la maquinaria de ARNi.

La molécula silenciadora de ARN usada de acuerdo con algunas realizaciones de la invención no necesita limitarse a aquellas moléculas que contienen solo ARN, pero incluye además nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente.

La presente invención contempla varios tipos de ARNpi, incluidos los ARNpi que actúan en trans (Ta-ARNpi), ARNpi asociados a repeticiones (Ra-ARNpi) y ARNpi derivados de transcritos antisentido naturales (Nat-ARNpi).

De acuerdo con una realización, el ARN silenciador incluye "ARNip, que es una clase de ARN que interacciona con Piwi de aproximadamente 26 y 31 nucleótidos de longitud. Los ARNip suelen formar complejos de proteína-ARN a través de interacciones con proteínas Piwi, es decir, los ARNip antisentido normalmente se cargan en proteínas Piwi (por ejemplo, Piwi, Ago3 y Aubergine (Aub)).

miARN: según otra realización, la molécula silenciadora de ARN puede ser un miARN.

El término "microARN", "miARN" y "miR" son sinónimos y se refieren a un conjunto de moléculas de ARN monocatenario no codificante de aproximadamente 19-24 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión génica. Los miARN se encuentran en una amplia gama de organismos (por ejemplo, insectos, mamíferos, plantas, nematodos) y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo, la homeostasis y la etiología de la enfermedad.

Inicialmente, el pre-miARN está presente como un ARN de bucle tallo bicatenario largo no perfecto que Dicer procesa aún más en un dúplex similar a ARNpi, que comprende la cadena guía madura (miARN) y un fragmento de tamaño similar conocido como cadena pasajera (miARN*). El miARN y el miARN* pueden derivar de brazos opuestos del primiARN y el pre-miARN. Las secuencias de miARN* se pueden encontrar en bibliotecas de miARN clonados, pero normalmente con una frecuencia más baja que los miARN.

Aunque inicialmente presente como una especie de doble cadena con miARN*, el miARN finalmente se incorpora como un ARN monocatenario en un complejo de ribonucleoproteína conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Varias proteínas pueden formar el RISC, lo que puede dar lugar a una variabilidad en la especificidad de los dúplex de miARN/miARN*, sitio de unión del gen diana, actividad del miARN (reprimir o activar) y qué cadena del dúplex miARN/miARN* se carga en el RISC.

Cuando la cadena de miARN del dúplex miARN:miARN* se carga en el RISC, el miARN* se retira y se degrada. La cadena del dúplex miARN:miARN* que se carga en el RISC es la cadena cuyo extremo 5' está apareado con menos fuerza. En los casos en que ambos extremos del miARN:miARN* tienen un apareamiento 5' aproximadamente equivalente, tanto miARN como miARN* pueden tener actividad de silenciamiento génico.

El RISC identifica los ácidos nucleicos diana basándose en altos niveles de complementariedad entre el miARN y el ARNm, especialmente por los nucleótidos 2-8 del miARN (denominado "secuencia semilla").

Varios estudios han analizado el requisito de apareamiento de bases entre el miARN y su ARNm diana para lograr una inhibición eficiente de la traducción (revisado por Bartel 2004, Cell 116-281). Estudios computacionales, que analizan la unión de miARN en genomas completos ha sugerido un papel específico para las bases 2-8 en el 5' del miARN (también denominado "secuencia semilla") en la unión a la diana, pero el papel del primer nucleótido, que normalmente se ha visto que es "A" también se ha reconocido (Lewis et al. 2005 Cell 120-15). De forma análoga, Krek et al. utilizaron los nucleótidos 1-7 o 2-8 para identificar y validar dianas (2005, Nat Genet 37-495). Los sitios diana del ARNm pueden estar en la 5' UTR, la 3' UTR o en la región de codificación. De manera interesante, Múltiples miARN pueden regular la misma diana de ARNm reconociendo el mismo o varios sitios. La presencia de múltiples sitios de unión de miARN en la mayoría de las dianas identificadas genéticamente puede indicar que la acción cooperativa de múltiples RISC proporciona la inhibición de la traducción más eficiente.

Los miARN pueden indicar al RISC que regule por disminución la expresión génica mediante cualquiera de dos mecanismos: escisión del ARNm o represión de la traducción. El miARN puede especificar la escisión del ARNm si el ARNm tiene un cierto grado de complementariedad con el miARN. Cuando un miARN guía la escisión, el corte suele estar entre los nucleótidos que se aparean con los restos 10 y 11 del miARN. Como alternativa, el miARN puede reprimir la traducción si el miARN no tiene el grado necesario de complementariedad con el miARN. La represión traduccional puede ser más frecuente en animales, ya que los animales pueden tener un menor grado de complementariedad entre el miARN y el sitio de unión.

Cabe señalar que puede haber variabilidad en los extremos 5' y 3' de cualquier par de miARN y miARN*. Esta variabilidad puede deberse a la variabilidad en el procesamiento enzimático de Drosha y Dicer con respecto al sitio de escisión. La variabilidad en los extremos 5' y 3' de miARN y miARN* también puede deberse a desajustes en las estructuras del tallo de primiARN y pre-miARN. Los desajustes de las cadenas del tallo pueden dar lugar a una población de diferentes estructuras en horquilla. La variabilidad en las estructuras del tallo también puede conducir a la variabilidad en los productos de escisión de Drosha y Dicer.

Se apreciará que la secuencia de pre-miARN puede comprender de 45-90, 60-80 o 60-70 nucleótidos mientras que la secuencia de pri-miARN puede comprender de 45-30.000, 50-25.000, 100-20.000, 1.000-1.500 u 80-100 nucleótidos.

De acuerdo con una realización, el miARN comprende miR-390a (como se expone en la SEQ ID NO: 28).

De acuerdo con una realización, el miARN comprende miR-173 (como se expone en la SEQ ID NO: 29).

Antisentido: el antisentido es un ARN monocatenario diseñado para prevenir o inhibir la expresión de un gen mediante la hibridación específica con su ARNm. La regulación por disminución de un ARN diana puede efectuarse usando un polinucleótido antisentido capaz de hibridarse específicamente con un transcrito de ARNm que codifica el ARN diana.

Como se ha mencionado anteriormente, los métodos de algunas realizaciones de la invención se utilizan para redirigir una actividad silenciadora y/o una especificidad de la molécula de ARN no codificante hacia un segundo ARN diana o hacia un ARN diana de interés.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "redirige una especificidad silenciadora" se refiere a la reprogramación de la especificidad original del ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) hacia una diana no natural del ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN). En consecuencia, se elimina la especificidad original del ARN no codificante (es decir, pérdida de función) y la nueva especificidad es hacia una diana de ARN distinta de la diana natural (es decir, el ARN de interés), es decir, ganancia de función. Se apreciará que solo se produce ganancia de función en los casos en que el ARN no codificante no tiene actividad silenciadora.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ARN diana" se refiere a una secuencia de ARN unida naturalmente por una molécula de ARN no codificante. Por lo tanto, el ARN diana es considerado por el experto en la materia como un sustrato para el ARN no codificante.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "segundo ARN diana" se refiere a una secuencia de ARN (codificante o no codificante) que no se une naturalmente a una molécula de ARN no codificante. Por lo tanto, el segundo ARN diana no es un sustrato natural del ARN no codificante.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ARN diana de interés" se refiere a una secuencia de ARN (codificante o no codificante) para ser silenciada por la molécula de ARN no codificante diseñada.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "silenciar un gen diana" se refiere a la ausencia o reducción observable en el nivel de ARNm y/o productos proteicos del gen diana (por ejemplo, debido al silenciamiento génico co- y/o postranscripcional). Por lo tanto, el silenciamiento de un gen diana puede ser del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % en comparación con un gen diana no dirigido por la molécula de ARN no codificante diseñada utilizada de acuerdo con la invención.

Las consecuencias del silenciamiento pueden confirmarse mediante el examen de las propiedades externas de una célula vegetal o planta completa u otro organismo que absorba el ARN no codificante diseñado de la planta o mediante técnicas bioquímicas (como se analiza a continuación).

Se apreciará que la molécula de ARN no codificante diseñada utilizada de acuerdo con algunas realizaciones de la invención puede tener algunos efectos de especificidad fuera de la diana siempre que no afecte a un rasgo valioso desde el punto de vista agrícola (por ejemplo, biomasa, rendimiento, etc).

De acuerdo con una realización, el segundo ARN diana es endógeno a la célula vegetal. El segundo ARN diana endógeno de ejemplo incluye, pero sin limitación, un producto de un gen que confiere sensibilidad al estrés, a la infección, a los herbicidas, o un producto de un gen relacionado con la tasa de crecimiento de las plantas, rendimientos de los cultivos, como se trata más adelante en el presente documento.

De acuerdo con una realización, el segundo ARN diana es exógeno a la célula vegetal (también denominado en el presente documento heterólogo). En tal caso, el segundo ARN diana es un producto de un gen que no forma parte naturalmente del genoma de la planta. El segundo ARN diana exógeno de ejemplo incluye, pero sin limitación, un producto de un gen de un patógeno vegetal tal como, pero sin limitación, un insecto, un virus, una bacteria, un hongo, un nematodo, como se trata más adelante en el presente documento. Un ARN diana exógeno (codificante o no codificante) puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comparte identidad de secuencia con una secuencia de ARN endógeno (por ejemplo, puede ser parcialmente homóloga a una secuencia de ácido nucleico endógeno) de la planta.

La unión específica de una molécula de ARN endógeno no codificante con un ARN diana puede determinarse mediante algoritmos computacionales (tal como BLAST) y verificarse mediante métodos que incluyen, por ejemplo, transferencia Northern, hibridación in situ, ensayo QuantiGene Plex, etc.

Mediante el uso del término "complementariedad" o "complementario" se entiende que la molécula de ARN no codificante (o al menos una parte de ella que está presente en forma de ARN pequeño procesado, o al menos una cadena de un polinucleótido de doble hebra o una porción del mismo, o una porción de un polinucleótido monocatenario) se hibrida en condiciones fisiológicas con el ARN diana, o un fragmento del mismo, para efectuar la regulación o función o supresión del gen diana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una molécula de ARN no codificante tiene una identidad de secuencia del 100 por cien o al menos aproximadamente de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por cien de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o nucleótidos más contiguos en el ARN diana (o miembros de la familia de un gen diana dado).

Como se utiliza en el presente documento, se dice que las moléculas de ARN no codificantes, o sus pequeñas formas de ARN procesadas, exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las secuencias que se lee de 5' a 3' es complementario a cada nucleótido de la otra secuencia cuando se lee de 3' a 5'. Una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a una secuencia de nucleótidos de referencia exhibirá una secuencia idéntica a la secuencia del complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de referencia.

Los métodos para determinar la complementariedad de secuencia son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, herramientas bioinformáticas que son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, BLAST, alineación de secuencias múltiples).

De acuerdo con una realización, si la molécula de ARN no codificante se procesa o se transforma en un ARNpi, la complementariedad está en el intervalo de 90-100 % (por ejemplo, 100 %) con su secuencia diana.

De acuerdo con una realización, si la molécula de ARN no codificante es o se procesa en un miARN o ARNip, la complementariedad está en el intervalo de 33-100 % con su secuencia diana.

De acuerdo con una realización, si la molécula de ARN no codificante es un miARN, la complementariedad de la secuencia semilla (es decir, los nucleótidos 2-8 del 5') está en el intervalo de 85-100 % (por ejemplo, 100 %) con respecto a su secuencia diana.

De acuerdo con una realización, el ARN no codificante puede procesarse aún más en una forma de ARN pequeño (por ejemplo, el premiARN se procesa en un miARN maduro). En tal caso, la homología se mide en función de la forma de ARN pequeño procesada (por ejemplo, la secuencia de miARN madura).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "forma de ARN pequeño" se refiere al ARN pequeño maduro que es capaz de hibridarse con un ARN diana (o fragmento del mismo). De acuerdo con una realización, la forma de ARN pequeño tiene una actividad silenciadora.

De acuerdo con una realización, la complementariedad con la secuencia diana es al menos aproximadamente el 33 % de la forma de ARN pequeño procesada (por ejemplo, el 33 % de los 21-28 nt). Por lo tanto, por ejemplo, si la molécula de ARN no codificante es un miARN, el 33 % de la secuencia de miARN maduro (por ejemplo, 21 nt) comprende la complementación de la semilla (por ejemplo, 7 nt de los 21 nt).

De acuerdo con una realización, la complementariedad con la secuencia diana es al menos aproximadamente el 45 % de la forma de ARN pequeño procesada (por ejemplo, el 45 % de los 21-28 nt). Por lo tanto, por ejemplo, si la molécula de ARN no codificante es un miARN, el 45 % de la secuencia de miARN maduro (por ejemplo, 21 nt) comprende la complementación de la semilla (por ejemplo, 9-10 nt de los 21 nt).

De acuerdo con una realización, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que tiene aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 33 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o hasta un 99 % de complementariedad hacia la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 99 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 98 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 97 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 96 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 95 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 94 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 93 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 92 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 91 % de complementariedad con la secuencia de la segunda diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 90 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 85 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 50 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (es decir, antes de la modificación) normalmente se selecciona como una que no tenga más del 33 % de complementariedad con respecto a la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para comprender al menos aproximadamente un 33 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso un 100 % de complementariedad hacia la secuencia del segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para comprender un mínimo del 33 % de complementariedad con respecto al segundo ARN diana (por ejemplo, 85-100 % de coincidencia inicial).

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 40 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 45 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 50 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 45 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 60 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 70 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 80 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 85 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 90 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 91 % con respecto al segundo ARN diana. De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 92 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 93 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 94 % con respecto al segundo ARN diana

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 95 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 96 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 97 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 98 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga una complementariedad mínima del 99 % con respecto al segundo ARN diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) está diseñada para que tenga un 100 % de complementariedad con el segundo a Rn diana.

Para redirigir una actividad silenciadora y/o especificidad de una molécula de ARN no codificante (por ejemplo, una molécula silenciadora de ARN) hacia un segundo ARN diana o ARN diana de interés, el gen que codifica una molécula de ARN no codificante (por ejemplo, una molécula silenciadora de ARN) se modifica usando un agente de edición de ADN.

A continuación sigue es una descripción de varios ejemplos no limitantes de métodos y agentes de edición de ADN utilizados para introducir alteraciones de ácido nucleico en un gen que codifica una molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) y agentes para implementar los mismos que se pueden utilizar según realizaciones de la presente divulgación.

Edición del genoma usando endonucleasas genomodificadas - este enfoque se refiere a un método de genética inversa que utiliza nucleasas genomanipuladas artificialmente para cortar y crear típicamente roturas específicas de doble cadena (DSB) en una ubicación o ubicaciones deseadas en el genoma, que luego se reparan mediante procesos endógenos celulares tales como, recombinación homóloga (RH) o unión de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ une directamente los extremos del ADN en una rotura de doble cadena (DSB) con o sin un recorte mínimo de extremos, mientras que HR utiliza una secuencia donante homóloga como molde (es decir, la cromátida hermana formada durante la fase S) para regenerar/copiar la secuencia de ADN que falta en el sitio de rotura. Para introducir modificaciones específicas de nucleótidos en el ADN genómico, un molde de reparación de ADN del donante que contenga la secuencia deseada debe estar presente durante la HR (ADN monocatenario o bicatenario proporcionado exógenamente).

La edición del genoma no se puede realizar utilizando endonucleasas de restricción tradicionales, ya que la mayoría de las enzimas de restricción reconocen algunos pares de bases en el ADN como su diana y estas secuencias a menudo se encontrarán en muchas ubicaciones a lo largo del genoma, lo que da como resultado cortes múltiples que no están limitados a una ubicación deseada. Para superar este problema y crear roturas de una cadena o de doble cadena específicas del sitio (DSB), hasta la fecha se han descubierto y genomodificado varias clases distintas de nucleasas. Estas incluyen las meganucleasas, las nucleasas de dedo de cinc (ZFN), las nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN) y el sistema CRISPR/ Cas9.

Meganucleasas - Las meganucleasas se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de cajas His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan a la actividad catalítica y a la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan por tener una o dos copias del motivo LAGLIDADG conservado. Las cuatro familias de meganucleasas están ampliamente separadas entre sí con respecto a los elementos estructurales conservados y, por consiguiente, la especificidad de la secuencia de reconocimiento de ADN y la actividad catalítica. Las meganucleasas se encuentran comúnmente en especies microbianas y tienen la propiedad única de tener secuencias de reconocimiento muy largas (> 14 pb), lo que las hace naturalmente muy específicas para cortar en una ubicación deseada.

Esto se puede aprovechar para realizar roturas de doble cadena específicas del sitio (DSB= en la edición del genoma.

Un experto en la materia puede usar estas meganucleasas de origen natural, sin embargo, el número de dichas meganucleasas de origen natural es limitado. Para superar este problema, se han utilizado métodos de detección de alto rendimiento y mutagénesis para crear variantes de meganucleasa que reconocen secuencias únicas. Por ejemplo, se han fusionado varias meganucleasas para crear enzimas híbridas que reconocen una nueva secuencia.

Como alternativa, los aminoácidos de la meganucleasa que interaccionan con el ADN se pueden alterar para diseñar meganucleasas específicas de secuencia (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 8.021.867). Las meganucleasas se pueden diseñar usando los métodos descritos en, por ejemplo, Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975; las patentes de Estados Unidos N.° 8.304.222; 8.021.867; 8.119.381; 8.124.369; 8.129.134; 8.133.697; 8.143.015; 8.143.016; 8.148.098; u 8.163.514. Como alternativa, las meganucleasas con características de corte específicas del sitio se pueden obtener utilizando tecnologías disponibles comercialmente, por ejemplo, Tecnología de edición del genoma Directed Nuclease Editor™ de Precision BioSciences.

ZFN y TALEN: dos clases distintas de nucleasas modificadas por ingeniería, nucleasas de dedo de cinc (ZFN) y nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), se ha demostrado que ambas son eficaces en la producción de roturas de doble cadena (DSB) específicas (Christian et al., 2010; Kim et al., 1996; Li et al., 2011; Mahfouz et al., 2011; Miller et al., 2010).

Básicamente, la tecnología de endonucleasas de restricción ZFN y TALEN utiliza una enzima de corte de ADN no específica que está unida a un dominio de unión de ADN específico (ya sea una serie de dominios de dedos de cinc o repeticiones TALE, respectivamente). Normalmente, se selecciona una enzima de restricción cuyo sitio de reconocimiento de ADN y sitio de escisión están separados entre sí. La porción escindida se separa y luego se une a un dominio de unión al ADN, produciendo así una endonucleasa con una especificidad muy alta para una secuencia deseada. Una enzima de restricción ilustrativa con dichas propiedades es FokI. Además, Fokl tiene la ventaja de requerir dimerización para tener actividad nucleasa y esto significa que la especificidad aumenta considerablemente a medida que cada pareja de nucleasa reconoce una secuencia de ADN única. Para potenciar este efecto, Se han genomodificado nucleasas FokI que solo pueden funcionar como heterodímeros y tienen una mayor actividad catalítica. Las nucleasas que funcionan como heterodímeros evitan la posibilidad de actividad homodímera no deseada y, por tanto, aumentan la especificidad de la rotura de doble cadena (DSB).

Por lo tanto, por ejemplo, para apuntar a un sitio específico, ZFN y TALEN se construyen como pares de nucleasas, con cada miembro del par diseñado para unirse a secuencias adyacentes en el sitio diana. T ras la expresión transitoria en las células, las nucleasas se unen a sus sitios diana y los dominios FokI se heterodimerizan para crear una rotura de la doble cadena (DSB). La reparación de estas roturas de doble cadena (DSB) a través de la ruta de unión de extremos no homólogos (NHEJ) a menudo da como resultado pequeñas deleciones o pequeñas inserciones de secuencia (Indels). Dado que cada reparación hecha por NHEJ es única, el uso de un solo par de nucleasas puede producir una serie alélica con una variedad de inserciones o deleciones diferentes en el sitio diana.

En general, la NHEJ es relativamente precisa (aproximadamente el 85 % de las DSB en células humanas son reparados por NHEJ dentro de los 30 minutos posteriores a la detección) en la edición de genes. NHEJ erróneo depende de cuando la reparación es precisa, la nucleasa seguirá cortando hasta que el producto de reparación sea mutagénico y el motivo de reconocimiento/sitio de corte/PAM se ha ido/mutado o que la nucleasa introducida transitoriamente ya no está presente.

Las deleciones suelen oscilar entre unos pocos pares de bases y unos cientos de pares de bases de longitud, pero se han generado con éxito deleciones más grandes en cultivos celulares usando dos pares de nucleasas simultáneamente (Carlson et al., 2012; Lee et al., 2010). Adicionalmente, cuando se introduce un fragmento de ADN con homología con la región diana junto con el par de nucleasas, la rotura de doble cadena (DSB) se puede reparar mediante recombinación homóloga (HR) para generar modificaciones específicas (Li et al., 2011; Miller et al., 2010; Urnov et al., 2005).

Aunque las porciones de nucleasa tanto de ZFN como de TALEN tienen propiedades similares, la diferencia entre estas nucleasas genomodificadas está en su péptido de reconocimiento de ADN. Las ZFN se basan en dedos de cinc Cys2-His2 y las TALEN en los TALE. Ambos dominios peptídicos que reconocen ADN tienen la característica de que se encuentran naturalmente en combinaciones en sus proteínas. Los dedos de Cinc Cys2-His2 se encuentran normalmente en repeticiones que están separadas por 3 pb y se encuentran en diversas combinaciones en diversas proteínas que interaccionan con ácidos nucleicos. Los t A l E, por otro lado, se encuentran en repeticiones con una relación de reconocimiento uno a uno entre los aminoácidos y los pares de nucleótidos reconocidos. Debido a que tanto los dedos de cinc como los TALE ocurren en patrones repetidos, se pueden probar diferentes combinaciones para crear una amplia variedad de especificidades de secuencia. Los enfoques para fabricar endonucleasas de dedos de cinc específicas para del sitio incluyen, por ejemplo, ensamblaje modular (donde los dedos de cinc correlacionados con una secuencia de triplete se unen en una fila para cubrir la secuencia requerida), OPEN (selección de dominios peptídicos de baja rigurosidad frente a triplete de nucleótidos seguida de selecciones de alta rigurosidad de una combinación de péptidos frente a la diana final en sistemas bacterianos) y selección bacteriana de un híbrido de bibliotecas de dedos de cinc, entre otras. Los ZFN también se pueden diseñar y obtener comercialmente de, por ejemplo, Sangamo Biosciences™ (Richmond, CA).

En, por ejemplo, Reyon et al. Nature Biotechnology 2012 May; 30(5):460-5 se describen métodos para diseñar y obtener TALEN; Miller et al. Nat Biotechnol. (2011) 29: 143-148; Cermak et al. Nucleic Acids Research (2011) 39 (12): e82 y Zhang et al. Nature Biotechnology (2011) 29 (2): 149-53. Mayo Clinic presentó un programa basado en la web recientemente desarrollado llamado Mojo Hand para diseñar construcciones TAL y TALEN para aplicaciones de edición del genoma (se puede acceder a través de www(dot)talendesign(dot)org). TALEN también se puede diseñar y obtener comercialmente de, por ejemplo, Sangamo Biosciences™ (Richmond, CA).

Sistema T-GEE (motor de edición del genoma de TargetGene): un complejo molecular de nucleoproteína programable que contiene una fracción polipeptídica y un ácido nucleico que confiere especificidad (SCNA) que se ensambla in vivo, en una célula diana y es capaz de interaccionar con la secuencia de ácido nucleico diana predeterminada. El complejo molecular de nucleoproteína programable es capaz de modificar y/o editar específicamente un sitio diana dentro de la secuencia de ácido nucleico diana y/o modificar la función de la secuencia de ácido nucleico diana. La composición de nucleoproteína comprende (a) una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico y que comprende (i) un dominio funcional capaz de modificar el sitio diana y (ii) un dominio de unión que es capaz de interaccionar con un ácido nucleico que confiere especificidad y (b) ácido nucleico que confiere especificidad (SCNA) que comprende (i) una secuencia de nucleótidos complementaria a una región del ácido nucleico diana que flanquea el sitio diana y (ii) una región de reconocimiento capaz de unirse específicamente al dominio de unión del polipéptido. La composición permite modificar una secuencia de ácido nucleico predeterminada de manera precisa, de forma fiable y rentable con alta especificidad y capacidades de unión del complejo molecular al ácido nucleico diana a través del apareamiento de bases del ácido nucleico que confiere especificidad y un ácido nucleico diana. La composición es menos genotóxica, modular en su ensamblaje, utiliza una sola plataforma sin personalización, práctica para su uso independiente fuera de instalaciones centrales especializadas, y tiene un marco de tiempo de desarrollo más corto y costos reducidos.

Sistema CRISPR-Cas y todas sus variantes (también denominado en el presente documento "CRISPR"): muchas bacterias y arqueas contienen sistemas inmunitarios adaptativos basados en ARN endógeno que pueden degradar los ácidos nucleicos de los fagos y plásmidos invasores. Estos sistemas consisten en secuencias de nucleótidos de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas y regularmente interespaciadas que producen componentes de ARN y genes asociados a CRISPR (Cas) que codifican componentes de proteínas. Los ARN CRISPR (ARNcr) contienen tramos cortos de homología con el ADN de virus y plásmidos específicos y actúan como guías para dirigir las nucleasas Cas para degradar los ácidos nucleicos complementarios del patógeno correspondiente. Los estudios del sistema CRISPR/Cas tipo II de Streptococcus pyogenes han demostrado que tres componentes forman un complejo de ARN/proteína y juntos son suficientes para la actividad de nucleasa específica de secuencia: la nucleasa Cas9, un ARNcr que contiene 20 pares de bases de homología con la secuencia diana, y un ARNcr transactivador (traARNcr) (Jinek et al. Science (2012) 337: 816-821).

Se demostró además que un ARN guía quimérico sintético (ARNg) compuesto por una fusión entre ARNcr y traARNcr podría dirigir a Cas9 para escindir dianas de ADN que son complementarios al ARNcr in vitro. También se demostró que la expresión transitoria de Cas9 junto con ARNg sintéticos se puede usar para producir roturas de doble cadena (DSB) específicas en diversas especies diferentes (Cho et al., 2013; Cong et al., 2013; DiCarlo et al., 2013; Hwang et al., 2013a,b; Jinek et al., 2013; Mali et al., 2013).

El sistema CRISPR/Cas para la edición del genoma contiene dos componentes distintos: un ARNg y una endonucleasa, por ejemplo, Cas9.

El ARNg (también denominado en el presente documento ARN guía corto (ARNgc)) suele ser una secuencia de 20 nucleótidos que codifica una combinación de la secuencia homóloga diana (ARNcr) y el ARN bacteriano endógeno que une el ARNcr con la nucleasa Cas9 (ARNtracr) en una sola transcripción quimérica. El complejo ARNg/Cas9 se recluta en la secuencia diana mediante el apareamiento de bases entre la secuencia de ARNg y el ADN genómico complementario. Para la unión exitosa de Cas9, la secuencia diana genómica también debe contener la secuencia del motivo adyacente protoespaciador (PAM) correcto inmediatamente después de la secuencia diana. La unión del complejo ARNg/Cas9 localiza Cas9 en la secuencia genómica diana para que Cas9 pueda cortar ambas cadenas del ADN provocando una rotura de doble cadena (DSB). Al igual que con ZFN y TALEN, las roturas de doble cadena (DSB) producidas por CRISPR/Cas pueden sufrir una recombinación homóloga o NHEJ y son susceptibles a una modificación de secuencia específica durante la reparación del ADN.

La nucleasa Cas9 tiene dos dominios funcionales: RuvC y HNH, cada uno cortando una cadena de ADN diferente. Cuando ambos dominios están activos, el Cas9 provoca roturas de doble cadena (DSB) en el ADN genómico.

Una ventaja significativa de CRISPR/Cas es que la alta eficiencia de este sistema se combina con la capacidad de crear fácilmente ARNg sintéticos. Esto crea un sistema que puede modificarse fácilmente para apuntar a modificaciones en diferentes sitios genómicos y/o para apuntar a diferentes modificaciones en el mismo sitio. Además, se han establecido protocolos que permiten el direccionamiento simultáneo de múltiples genes. La mayoría de las células portadoras de la mutación presentan mutaciones bialélicas en los genes diana.

Sin embargo, la aparente flexibilidad en las interacciones de apareamiento de bases entre la secuencia de ARNg y la secuencia diana de ADN genómico permite que Cas9 corte coincidencias imperfectas con la secuencia diana.

Versiones modificadas de la enzima Cas9 que contienen un solo dominio catalítico inactivo, ya sea RuvC- o HNH-, se llaman 'nickasas'. Con un solo dominio de nucleasa activo, la nickasa Cas9 corta solo una cadena del ADN diana, creando una rotura o "muesca" de una sola cadena. Una rotura o muesca de una sola cadena, se repara principalmente mediante un mecanismo de reparación de rotura de una sola cadena que implica proteínas tales como, entre otras, PARP (sensor) y complejo XRCC1/LIG III (ligadura). Si se genera una rotura de cadena única (SSB) por venenos de topoisomerasa I o por medicamentos que atrapan PARP1 en SSB naturales, entonces estos podrían persistir y cuando la célula entre en la fase S y la horquilla de replicación encuentre tales SSB, se convertirán en DSB de un solo extremo. que solo puede ser reparado por recursos humanos. Sin embargo, dos muescas de cadena opuestas proximales introducidas por una nickasa Cas9 se tratan como una rotura de doble cadena, en lo que a menudo se denomina un sistema CRISPR de "doble muesca". Una doble muesca, que es básicamente DSB no paralela, puede ser reparada como otras DSB mediante HR o NHEJ dependiendo del efecto deseado en el gen diana y la presencia de una secuencia donante y la etapa del ciclo celular (HR es de abundancia mucho menor y solo puede ocurrir en las etapas S y G2 del ciclo celular). Por lo tanto, si la especificidad y la reducción de los efectos fuera de la diana son cruciales, el uso de la nickasa Cas9 para crear una muesca doble mediante el diseño de dos ARNg con secuencias diana muy próximas y en cadenas opuestas del ADN genómico disminuiría el efecto fuera de la diana, ya que el ARNg por sí solo producirá muescas que probablemente no cambien el ADN genómico, aunque estos eventos no son imposibles.

Las versiones modificadas de la enzima Cas9 que contienen dos dominios catalíticos inactivos (Cas9 muerto o dCas9) no tienen actividad de nucleasa y aún pueden unirse al ADN en función de la especificidad del ARNg. El dCas9 se puede utilizar como una plataforma para que los reguladores transcripcionales de ADN activen o repriman la expresión génica al fusionar la enzima inactiva con dominios reguladores conocidos. Por ejemplo, la unión de dCas9 solo a una secuencia diana en el ADN genómico puede interferir con la transcripción génica.

Hay una serie de herramientas disponibles públicamente para ayudar a elegir y/o diseñar secuencias diana, así como listas de ARNg únicos determinados bioinformáticamente para diferentes genes en diferentes especies, tales como, pero sin limitación, el Feng Zhang lab's Target Finder, el Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP), las herramientas RGEN: Cas-OFFinder, el CasFinder: El algoritmo flexible para identificar dianas Cas9 específicas en genomas y el CRISPR Optimal Target Finder.

Para utilizar el sistema CRISPR, tanto el ARNg como una endonucleasa Cas (por ejemplo, Cas9) deben expresarse o estar presentes (por ejemplo, como un complejo de ribonucleoproteína) en una célula diana. El vector de inserción puede contener ambos casetes en un solo plásmido o los casetes se expresan a partir de dos plásmidos separados. Los plásmidos CRISPR están disponibles comercialmente, tal como el plásmido px330 de Addgene (75 Sidney St, Suite 550A • Cambridge, MA 02139). El uso de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) asociadas a la tecnología de ARN guía (Cas) y una endonucleasa Cas para modificar genomas de plantas también son al menos desvelados por Svitashev et al., 2015, Plant Physiology, 169 (2): 931-945; Kumar y Jain, 2015, J Exp Bot 66: 47-57; y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20150082478. Las endonucleasas cas que se pueden usar para efectuar la edición de ADN con ARNg incluyen, pero sin limitación, Cas9, Cpf1 (Zetsche et al., 2015, Cell. 163(3):759-71), C2c1, C2c2 y C2c3 (Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97).

De acuerdo con una realización específica, el CRISPR comprende un ARN de guía corto (ARNgc) que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4 o s Eq ID NO: 235­ 366.

"Hit and run" o "in-out": implica un procedimiento de recombinación de dos etapas. En la primera etapa, se usa un vector de tipo inserción que contiene un casete de marcador seleccionable doble positivo/negativo para introducir la alteración de secuencia deseada. El vector de inserción contiene una sola región continua de homología con el locus diana y se modifica para llevar la mutación de interés. Esta construcción dirigida se linealiza con una enzima de restricción en un sitio dentro de la región de homología, se introduce en las células y se realiza una selección positiva para aislar eventos mediados por recombinación homóloga. El ADN que lleva la secuencia homóloga se puede proporcionar como un plásmido, oligos monocatenarios o bicatenarios. Estos recombinantes homólogos contienen una duplicación local que está separada por la secuencia del vector que interviene, incluido el casete de selección. En la segunda etapa, los clones seleccionados se someten a selección negativa para identificar las células que han perdido el casete de selección a través de la recombinación intracromosómica entre las secuencias duplicadas. El evento de recombinación local elimina la duplicación y, dependiendo del sitio de recombinación, el alelo retiene la mutación introducida o vuelve al tipo salvaje. El resultado final es la introducción de la modificación deseada sin la retención de ninguna secuencia exógena.

La estrategia de "reemplazo doble" o "etiquetar e intercambiar" implica un procedimiento de selección de dos etapas similar al enfoque de hit and run, pero requiere el uso de dos construcciones de orientación diferentes. En la primera etapa, se utiliza un vector de orientación estándar con brazos de homología de 3' y 5' para insertar un doble casete seleccionable positivo/negativo cerca del lugar donde se va a introducir la mutación. Después de que los componentes del sistema se hayan introducido en la célula y se haya aplicado la selección positiva, podrían identificarse eventos mediados por HR. A continuación, se introduce un segundo vector de dirección que contiene una región de homología con la mutación deseada en los clones seleccionados y se aplica selección negativa para eliminar el casete de selección e introducir la mutación. El alelo final contiene la mutación deseada mientras elimina las secuencias exógenas no deseadas.

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN comprende un módulo de selección de ADN (por ejemplo, ARNg).

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN no comprende una endonucleasa.

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN comprende una nucleasa (por ejemplo, una endonucleasa) y un módulo de selección de ADN (por ejemplo, ARNg).

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN es CRISPR/Cas, por ejemplo, ARNg y Cas9.

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN es TALEN.

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN es ZFN.

De acuerdo con una realización específica, el agente de edición de ADN es meganucleasa.

De acuerdo con una realización, el agente de edición de ADN está unido a un indicador para controlar la expresión en una célula vegetal.

De acuerdo con una realización, el indicador es una proteína indicadora fluorescente.

La expresión "una proteína fluorescente" se refiere a un polipéptido que emite fluorescencia y normalmente es detectable por citometría de flujo, microscopia o cualquier sistema de imágenes fluorescentes, por lo tanto, puede usarse como base para la selección de células que expresan dicha proteína.

Los ejemplos de proteínas fluorescentes que se pueden utilizar como indicadores son, pero sin limitación, la proteína fluorescente verde (GFP), la proteína fluorescente azul (BFP) y las proteínas fluorescentes rojas (por ejemplo, dsRed, mCherry, RFP). Una lista no limitativa de indicadores fluorescentes u otros incluye proteínas detectables por luminiscencia (por ejemplo, luciferasa) o ensayo colorimétrico (por ejemplo, GUS). De acuerdo con una realización específica, el indicador fluorescente es una proteína fluorescente roja (por ejemplo, dsRed, mCherry, RFP) o GFP.

Se puede encontrar una revisión de las nuevas clases de proteínas fluorescentes y sus aplicaciones en Trends in Biochemical Sciences [Rodríguez, Erik A.; Campbell, Robert E.; Lin, John Y.; Lin, Michael Z.; Miyawaki, Atsushi; Palmer, Amy E.; Shu, Xiao-kun; Zhang, Jin; Tsien, Roger Y. "The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins". Trends in Biochemical Sciences. doi:10.1016/j.tibs.2016.09.010],

De acuerdo con otra realización, el indicador es un gen endógeno de una planta. Un indicador de ejemplo es el gen de la fitoeno desaturasa (PDS3) que codifica una de las enzimas importantes en la ruta de biosíntesis de carotenoides. Su silenciamiento produce un fenotipo albino/blanqueado. En consecuencia, las plantas con expresión reducida de PDS3 exhiben niveles reducidos de clorofila, hasta albino completo y enanismo. Los genes adicionales que se pueden usar de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, pero sin limitación, genes que intervienen en la protección de cultivos. Los genes de ejemplo se describen en la Tabla 1B, a continuación.

De acuerdo con otra realización, el indicador es un marcador de selección de antibióticos. Los ejemplos de marcadores de selección de antibióticos que pueden usarse como indicadores son, pero sin limitación, neomicina fosfotransferasa II (nptll) e higromicina fosfotransferasa (hpt). Los genes marcadores adicionales que se pueden usar de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, pero sin limitación, genes de resistencia a gentamicina acetiltransferasa (accC3) y resistencia a bleomicina y fleomicina.

Se apreciará que la enzima NPTII inactiva por fosforilación una serie de antibióticos aminoglucósidos, tales como kanamicina, neomicina, geneticina (o G418) y paromomicina. De estos, kanamicina, neomicina y paromomicina se utilizan en una amplia gama de especies de plantas.

De acuerdo con otra realización, el indicador es un marcador de selección tóxico. Un marcador de selección tóxico de ejemplo que se puede utilizar como indicador es, pero sin limitación, selección de alcohol alílico utilizando el gen de la alcohol deshidrogenasa (ADH1). ADH1, que comprende un grupo de enzimas deshidrogenasas que catalizan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con la reducción concomitante de NAD+ o NADP+, descompone las sustancias tóxicas alcohólicas dentro de los tejidos. Las plantas que albergan una expresión reducida de ADH1 exhiben una mayor tolerancia al alcohol alílico. En consecuencia, las plantas con ADH1 reducida son resistentes al efecto tóxico del alcohol alílico.

Independientemente del agente de edición de ADN utilizado, el método de la invención se emplea de manera que el gen que codifica la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, la molécula silenciadora de ARN) se modifica mediante al menos una deleción, una inserción o una mutación puntual.

De acuerdo con una realización, la modificación está en una región estructurada de la molécula silenciadora de De acuerdo con una realización, la modificación está en una región de tallo de la molécula silenciadora de ARN. De acuerdo con una realización, la modificación está en una región de bucle de la molécula silenciadora de AR De acuerdo con una realización, la modificación está en una región de tallo y una región de bucle de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con una realización, la modificación está en una región no estructurada de la molécula silenciadora de

ARN.

De acuerdo con una realización, la modificación está en una región de tallo y una región de bucle y en la región no estructurada de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de aproximadamente 10-250 nucleótidos, aproximadamente 10-200 nucleótidos, aproximadamente 10-150 nucleótidos, aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 10-50 nucleótidos, aproximadamente 1-50 nucleótidos, aproximadamente 1-10 nucleótidos, aproximadamente 50-150 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos o aproximadamente 100­

200 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora

de ARN).

De acuerdo con una realización, la modificación comprende una modificación de como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 100,

110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o como máximo 250 nucleótidos (en comparación con la molécula

de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización, la modificación puede estar en una secuencia de ácido nucleico consecutiva (por ejemplo, al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 bases).

De acuerdo con una realización, la modificación puede ser de manera no consecutiva, por ejemplo, a lo largo de una secuencia de 20, 50, 100, 150, 200, 500, 1000 ácidos nucleicos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 200 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 150 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 100 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 50 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 25 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 20 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 15 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 10 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la modificación comprende una modificación de, como máximo, 5 nucleótidos.

De acuerdo con una realización, la modificación depende de la estructura de la molécula silenciadora de ARN.

En consecuencia, cuando la molécula silenciadora de ARN contiene una estructura no esencial (es decir, una estructura secundaria de la molécula silenciadora de ARN que no desempeña un papel en su biogénesis y/o función adecuadas) o es puramente ARNbc (es decir, la molécula silenciadora de ARN que tiene una estructura perfecta o ARNbc casi perfecto), algunas modificaciones (por ejemplo, 20-30 nucleótidos, por ejemplo, 1-10 nucleótidos, por ejemplo, 5 nucleótidos) se introducen para redirigir la especificidad de silencio de la molécula silenciadora de ARN. De acuerdo con otra realización, cuando la molécula silenciadora de ARN tiene una estructura esencial (es decir, la biogénesis adecuada y/o la actividad de la molécula silenciadora de ARN depende de su estructura secundaria), modificaciones más grandes (por ejemplo, 10-200 nucleótidos, por ejemplo, 50-150 nucleótidos, por ejemplo, más de 30 nucleótidos y no más de 200 nucleótidos, 30-200 nucleótidos, 35-200 nucleótidos, 35-150 nucleótidos, 35-100 nucleótidos) se introducen para redirigir la especificidad de silencio de la molécula silenciadora de ARN.

De acuerdo con una realización, la modificación es tal que el motivo de reconocimiento/sitio de corte/PAM de la molécula silenciadora de ARN se modifica para abolir el sitio de reconocimiento de PAM original.

De acuerdo con una realización específica, la modificación está en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ácidos nucleicos en un motivo PAM.

De acuerdo con una realización, la modificación comprende una inserción.

De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de aproximadamente 10-250 nucleótidos, aproximadamente 10-200 nucleótidos, aproximadamente 10-150 nucleótidos, aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 10-50 nucleótidos, aproximadamente 1-50 nucleótidos, aproximadamente 1-10 nucleótidos, aproximadamente 50-150 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos o aproximadamente 100­ 200 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización, la inserción comprende una inserción de como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o como máximo 250 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 200 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 150 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 100 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 50 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 25 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 20 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 15 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 10 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la inserción comprende una inserción de como máximo 5 nucleótidos. De acuerdo con una realización, la modificación comprende una deleción.

De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de aproximadamente 10-250 nucleótidos, aproximadamente 10-200 nucleótidos, aproximadamente 10-150 nucleótidos, aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 10-50 nucleótidos, aproximadamente 1-50 nucleótidos, aproximadamente 1-10 nucleótidos, aproximadamente 50-150 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos o aproximadamente 100­ 200 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización, la deleción comprende una deleción de como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o como máximo 250 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 200 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 150 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 100 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 50 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 25 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 20 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 15 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 10 nucleótidos. De acuerdo con una realización específica, la deleción comprende una deleción de como máximo 5 nucleótidos. De acuerdo con una realización, la modificación comprende una mutación puntual.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual de aproximadamente 10-250 nucleótidos, aproximadamente 10-200 nucleótidos, aproximadamente 10-150 nucleótidos, aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 10-50 nucleótidos, aproximadamente 1-50 nucleótidos, aproximadamente 1-10 nucleótidos, aproximadamente 50-150 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos o aproximadamente 100­ 200 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización, la mutación puntual comprende una mutación puntual en como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o como máximo 250 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 200 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 150 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 100 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 50 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 25 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 20 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 15 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 10 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, la mutación puntual comprende una mutación puntual en un máximo de 5 nucleótidos.

De acuerdo con una realización, la modificación comprende una combinación de cualquiera de una deleción, una inserción y/o una mutación puntual.

De acuerdo con una realización, la modificación comprende el reemplazo de nucleótidos (por ejemplo, intercambio de nucleótidos).

De acuerdo con una realización específica, el intercambio comprende el intercambio de aproximadamente 10-250 nucleótidos, aproximadamente 10-200 nucleótidos, aproximadamente 10-150 nucleótidos, aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 10-50 nucleótidos, aproximadamente 1-50 nucleótidos, aproximadamente 1-10 nucleótidos, aproximadamente 50-150 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos o aproximadamente 100­ 200 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o como máximo 250 nucleótidos (en comparación con la molécula de ARN no codificante nativa, por ejemplo, molécula silenciadora de ARN).

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 200 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 150 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 100 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 50 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 25 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 20 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 15 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 10 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, el intercambio de nucleótidos comprende un reemplazo de nucleótidos en un máximo de 5 nucleótidos.

De acuerdo con una realización, el gen que codifica la molécula silenciadora de ARN se modifica intercambiando una secuencia de una molécula silenciadora de ARN endógena (por ejemplo, miARN) con una secuencia silenciadora de ARN de elección (por ejemplo, ARNpi).

De acuerdo con una realización específica, la secuencia de un ARNpi utilizado para el intercambio de genes de una molécula silenciadora de ARN endógeno (por ejemplo, miARN) que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5-12 o SeQ ID NO: 103-234.

De acuerdo con una realización, la cadena guía de la molécula silenciadora de ARN, tal como los precursores de miARN (pri/pre-miARN) o los precursores de ARNpi (ARNbc), se modifica para preservar la originalidad de la estructura y mantener el mismo perfil de apareamiento de bases.

De acuerdo con una realización, la cadena pasajera de la molécula silenciadora de ARN, tal como los precursores de miARN (pri/pre-miARN) o los precursores de ARNpi (ARNbc), se modifica para preservar la originalidad de la estructura y mantener el mismo perfil de apareamiento de bases.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "originalidad de la estructura" se refiere a la estructura del ARN secundario (es decir, perfil de apareamiento de bases). Mantener la originalidad de la estructura es importante para una biogénesis/procesamiento correcto y eficiente del ARN no codificante

(por ejemplo, molécula silenciadora de ARN como ARNpi o miARN) que depende de la estructura y no puramente de la secuencia.

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se modifica en la cadena guía (cadena silenciadora) para que comprenda aproximadamente un 50 - 100 % de complementariedad con el ARN diana (como se ha tratado anteriormente), mientras que la cadena pasajera se modifica para preservar la estructura de ARN no codificante original (sin modificar).

De acuerdo con una realización, la molécula silenciadora de ARN se modifica de manera que la secuencia inicial (por ejemplo, para los nucleótidos de miARN 2-8 desde el extremo 5') sea complementaria a la secuencia diana.

De acuerdo con una realización específica, la molécula silenciadora de ARN (es decir, la molécula de ARNi) está diseñada de manera que una secuencia de la molécula de ARNi se modifica para preservar la originalidad de la estructura y para ser reconocida por los factores de procesamiento y ejecución de ARNi celular.

El agente de edición de ADN usado de acuerdo con la invención puede introducirse en células vegetales usando métodos de liberación de ADN (por ejemplo, mediante vectores de expresión) o usando métodos libres de ADN.

De acuerdo con una realización, el ARNg (o cualquier otro módulo de reconocimiento de ADN utilizado, dependiendo del sistema de edición de ADN que se utilice) se puede proporcionar como ARN a la célula.

Por lo tanto, se apreciará que las presentes técnicas se refieren a la introducción del agente de edición de ADN utilizando métodos libres de ADN o ADN transitorio, tal como la transfección de ARN (por ejemplo, transfección de ARNm ARNg) o la transfección de ribonucleoproteína (RNP) (por ejemplo, transfección del complejo proteína-ARN, por ejemplo, transfección del complejo de ribonucleoproteína (RNP) Cas9/ARNg).

Por ejemplo, Cas9 se puede introducir como un plásmido de expresión de ADN, transcrito in vitro (es decir, ARN), o como una proteína recombinante unida a la porción de ARN en una partícula de ribonucleoproteína (RNP). El ARNg, por ejemplo, puede administrarse como un plásmido de ADN o como un transcrito in vitro (es decir, ARN).

Cualquier método conocido en la técnica para la transfección de ARN o RNP se puede utilizar de acuerdo con las presentes enseñanzas, tales como, pero, sin limitaciones, microinyección [según lo descrito por Cho et al., "Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins", Genetics (2013) 195:1177-1180], electroporación [según lo descrito por Kim et al., "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins" Genome Res. (2014) 24:1012-1019], o transfección mediada por lípidos, por ejemplo, usando liposomas [como se describe en Zuris et al., "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo" Nat Biotechnol. (2014) doi: 10.1038/nbt.3081]. Otros métodos de transfección de ARN se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20160289675.

Una ventaja de los métodos de transfección de ARN descritos en el presente documento es que la transfección de ARN es esencialmente transitoria y libre de vectores. Un transgén de ARN puede administrarse a una célula y expresarse en ella, como un casete de expresión mínima sin necesidad de ninguna secuencia adicional (por ejemplo, secuencias de virus).

De acuerdo con una realización, el agente de edición de ADN usado de acuerdo con la invención se introduce en la célula vegetal usando vectores de expresión.

El "vector de expresión" (también denominado en el presente documento como "una construcción de ácido nucleico", "vector" o "construcción") utilizado de acuerdo con algunas realizaciones de la invención incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación en procariotas, eucariotas, o preferentemente ambos (por ejemplo, vectores lanzadera).

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con algunas realizaciones de la invención pueden construirse usando tecnología de ADN recombinante bien conocida por los expertos en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico pueden insertarse en vectores, que pueden estar disponibles en el mercado, adecuados para la transformación en plantas y adecuado para la expresión transitoria del gen de interés en las células transformadas. La construcción genética puede ser un vector de expresión en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una o más secuencias reguladoras que permiten la expresión en las células vegetales.

De acuerdo con una realización, para expresar un agente de edición de ADN funcional, en los casos en que el módulo de escisión (nucleasa) no sea una parte integral de la unidad de reconocimiento de ADN, el vector de expresión puede codificar el módulo de escisión así como la unidad de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNg en el caso de CRISPR/Cas).

Como alternativa, el módulo de escisión (nucleasa) y la unidad de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNg) pueden clonarse en vectores de expresión separados. En tal caso, al menos dos vectores de expresión diferentes deben transformarse en la misma célula vegetal.

Como alternativa, cuando no se utiliza una nucleasa (es decir, no se administra desde una fuente exógena a la célula), la unidad de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNg) puede clonarse y expresarse utilizando un solo vector de expresión.

Los vectores de expresión típicos también pueden contener una secuencia de iniciación de la transcripción y la traducción, terminador de transcripción y traducción y, opcionalmente, una señal de poliadenilación.

De acuerdo con una realización, el agente de edición de ADN comprende un agente de ácido nucleico que codifica al menos una unidad de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNg) unida operativamente a un elemento regulador que actúa en cis activo en células vegetales (por ejemplo, promotor).

De acuerdo con una realización, la nucleasa (por ejemplo, endonucleasa) y la unidad de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNg) se codifican a partir del mismo vector de expresión. Tal vector puede comprender un solo elemento regulador que actúa en cis activo en células vegetales (por ejemplo, promotor) para la expresión tanto de la nucleasa como de la unidad de reconocimiento de ADN. Como alternativa, la nucleasa y la unidad de reconocimiento de ADN pueden estar unidas operativamente cada una a un elemento regulador que actúa en cis activo en células vegetales (por ejemplo, promotor).

De acuerdo con una realización, la nucleasa (por ejemplo, endonucleasa) y la unidad de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNg) se codifican a partir de diferentes vectores de expresión, por lo que cada uno se une operativamente a un elemento regulador que actúa en cis activo en células vegetales (por ejemplo, promotor).

Como se usa en el presente documento, la expresión "expresable en plantas" o "activo en células vegetales" se refiere a una secuencia promotora, incluyendo cualquier elemento regulador adicional añadido a la misma o contenido en la misma, que es al menos capaz de inducir, conferir, activar o potenciar la expresión en una célula vegetal, tejido u órgano, preferentemente, una célula vegetal monocotiledónea o dicotiledónea, tejido u órgano.

El promotor vegetal empleado puede ser un promotor constitutivo, un promotor específico del tejido, un promotor inducible, un promotor quimérico o un promotor regulado por el desarrollo.

Se presentan ejemplos de promotores preferidos útiles para los métodos de algunas realizaciones de la invención se presentan en la tabla I, II, III y IV.

Tabla I: Promotores constitutivos ilustrativos para su uso en la ejecución de algunas realizaciones de la invención

Tabla II

continuación

Tabla III

Tabla IV

continuación

El promotor inducible es un promotor inducido en un tejido vegetal específico, por una etapa de desarrollo o por un estímulo específico, como condiciones de estrés que comprenden, por ejemplo, luz, temperatura, productos químicos, sequía, alta salinidad, choque osmótico, condiciones oxidantes o en caso de patogenicidad e incluyen, pero sin limitación, el promotor inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante, el promotor 5 del gen rbcS de la alfalfa, los promotores DRE, MYC y MYB activos en sequía; los promotores INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 y RD21 activos en alta salinidad y estrés osmótico, y los promotores hsr203J y str246C activos en estrés patógeno.

De acuerdo con una realización, el promotor es un promotor inducible por patógenos. Estos promotores dirigen la expresión de genes en plantas después de la infección con un patógeno, tal como 10 bacterias, hongos, virus, nematodos e insectos. Dichos promotores incluyen los de proteínas relacionadas con la patogenia (proteínas PR), que se inducen después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Véase, por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116.

De acuerdo con una realización, cuando se usa más de un promotor en el vector de expresión, los promotores son idénticos (por ejemplo, todos idénticos, al menos dos idénticos).

De acuerdo con una realización, cuando se usa más de un promotor en el vector de expresión, los promotores son diferentes (por ejemplo, al menos dos son diferentes, todos son diferentes).

De acuerdo con una realización, el promotor en el vector de expresión incluye, pero sin limitación, CaMV 35S, 2x CaMV 35S, CaMV 19S, ubiquitina, AtU626 o TaU6.

De acuerdo con una realización específica, el promotor en el vector de expresión comprende un promotor 35S.

De acuerdo con una realización específica, el promotor en el vector de expresión comprende un promotor U6.

Los vectores de expresión también pueden comprender secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción, secuencias de terminación de transcripción y traducción y, opcionalmente, una señal de poliadenilación.

De acuerdo con una realización específica, el vector de expresión comprende una secuencia de terminación, tales como, pero sin limitación, una secuencia de terminación G7, una secuencia de terminación de AtuNos o una secuencia de terminación de CaMV-35S.

Las células vegetales pueden transformarse de manera estable o transitoria con las construcciones de ácido nucleico utilizadas de acuerdo con algunas realizaciones de la invención. En la transformación estable, la molécula de ácido nucleico utilizada de acuerdo con algunas realizaciones de la invención se integra en el genoma de la planta y como tal representa un rasgo heredado y estable. En la transformación transitoria, la molécula de ácido nucleico se expresa por la célula transformada pero no está integrada en el genoma y como tal representa un rasgo transitorio.

Existen diversos métodos para introducir genes extraños en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42: 205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

Los principales métodos para provocar integración estable de ADN exógeno en ADN genómico de planta incluyen dos enfoques principales:

(i) Transferencia génica mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) pág. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, eds. Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) pág. 93-112.

(ii) Captación directa de ADN: Paszkowski et al., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) pág. 52-68; incluyendo métodos para captación directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074. Captación de ADN inducida por descarga eléctrica breve de células vegetales: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319: 791-793. Inyección de ADN en células o tejidos vegetales mediante bombardeo de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6: 559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6: 923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79: 206-209; mediante el uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75: 30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79: 213-217; transformación con fibras de vidrio o filamentos de carburo de silicio de cultivos celulares, embriones o tejido calloso, patente de Estados Unidos n.° 5.464.765 o mediante la incubación directa de ADN con polen germinante, DeWet et al. en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, Londres, (1985) pág. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían según la especie de la planta y el sistema de administración de Agrobacterium. Un enfoque ampliamente usado es el procedimiento del disco de hoja que puede realizarse con cualquier explante tisular que proporcione una buena fuente para el inicio de la diferenciación de la planta completa. Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) pág. 1-9. Otro enfoque complementario emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable en la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

De acuerdo con una realización, se utiliza un método de expresión libre de agrobacterias para introducir genes extraños en las células vegetales. De acuerdo con una realización, el método de expresión libre de agrobacterias es transitorio. De acuerdo con una realización específica, se utiliza un método de bombardeo para introducir genes extraños en las células vegetales. De acuerdo con otra realización específica, el bombardeo de la raíz de una planta se utiliza para introducir genes extraños en las células vegetales. Un método de bombardeo de ejemplo que puede usarse de acuerdo con algunas realizaciones de la invención se analiza en la sección de ejemplos que sigue.

Por otra parte, se pueden usar varios kits de clonación o síntesis de genes de acuerdo con las enseñanzas de algunas realizaciones de la invención.

De acuerdo con una realización, la construcción de ácido nucleico es un vector binario. Los ejemplos de vectores binarios son pBIN19, pBI101, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA, pBIB-HYG, pBecks, pGreen o pPZP (Hajukiewicz, P. et al., Plant Mol. Biol. 25, 989 (1994) y Hellens et al, Trends in Plant Science 5, 446 (2000)).

Los ejemplos de otros vectores que se utilizarán en otros métodos de liberación de ADN (por ejemplo, transfección, electroporación, bombardeo, inoculación vírica como se analiza a continuación) son: pGE-ARNgc (Zhang et al. Nat. Comms. 20167:12697), pJIT163-Ubi-Cas9 (Wang et al. Nat. Biotechnol 200432, 947-951), pICH47742::2x35S-5'UTR-hCas9(STOP)-NOST (Belhan et al. Plant Methods 2013 11;9(1):39), pAHC25 (Christensen, A.H. y P.H. Quail, 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research 5: 213-218), pHBT-sGFP(S65T)-NOS (Sheen et al. Protein phosphatase activity is required for light-inducible gene expression in maize, EMBO J. 12 (9), 3497-3505 (1993). Como se utiliza en el presente documento, la expresión "oligonucleótidos donantes" u "oligos donantes" se refiere a nucleótidos exógenos, es decir, introducidos externamente en la célula vegetal para generar un cambio preciso en el genoma. De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes son sintéticos.

De acuerdo con una realización, los oligos donantes son oligos de ARN.

De acuerdo con una realización, los oligos donantes son oligos de ADN.

De acuerdo con una realización, los oligos donantes son oligos sintéticos.

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden oligonucleótidos donantes monocatenarios (ODNmc).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden oligonucleótidos donantes bicatenarios (ODNbc).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden ADN bicatenario (ADNbc).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden dúplex de ADN-ARN bicatenario (dúplex de ADN-ARN).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden un híbrido de ADN-ARN bicatenario De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden un híbrido de ADN-ARN monocatenario. De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden ADN monocatenario (ADNmc). De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden ARN bicatenario (ARNbc). De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden ARN monocatenario (ARNmc). De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden la secuencia de ADN o ARN para el intercambio (como se ha tratado anteriormente).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes se proporcionan en un formato de vector u oligo no expresado.

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden un plásmido donante de ADN (por ejemplo, plásmido circular o linealizado).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos donantes comprenden aproximadamente 50-5000, aproximadamente 100-5000, aproximadamente 250-5000, aproximadamente 500-5000, aproximadamente 750-5000, aproximadamente 1000-5000, aproximadamente 1500-5000, aproximadamente 2000-5000, aproximadamente 2500­ 5000, aproximadamente 3000-5000, aproximadamente 4000-5000, aproximadamente 50-4000, aproximadamente 100-4000, aproximadamente 250-4000, aproximadamente 500-4000, aproximadamente 750-4000, aproximadamente 1000-4000, aproximadamente 1500-4000, aproximadamente 2000-4000, aproximadamente 2500-4000, aproximadamente 3000-4000, aproximadamente 50-3000, aproximadamente 100-3000, aproximadamente 250-3000, aproximadamente 500-3000, aproximadamente 750-3000, aproximadamente 1000-3000, aproximadamente 1500­ 3000, aproximadamente 2000-3000, aproximadamente 50-2000, aproximadamente 100-2000, aproximadamente 250­ 2000, aproximadamente 500-2000, aproximadamente 750-2000, aproximadamente 1000-2000, aproximadamente 1500-2000, aproximadamente 50-1000, aproximadamente 100-1000, aproximadamente 250-1000, aproximadamente 500-1000, aproximadamente 750-1000, aproximadamente 50-750, aproximadamente 150-750, aproximadamente 250-750, aproximadamente 500-750, aproximadamente 50-500, aproximadamente 150-500, aproximadamente 200­ 500, aproximadamente 250-500, aproximadamente 350-500, aproximadamente 50-250, aproximadamente 150-250 o aproximadamente 200-250 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, los oligonucleótidos donantes que comprenden ODNmc (por ejemplo, ADNmc o ARNmc) comprenden aproximadamente 200-500 nucleótidos.

De acuerdo con una realización específica, los oligonucleótidos donantes que comprenden ODNbc (por ejemplo, ADNbc o ARNbc) comprenden aproximadamente 250-5000 nucleótidos.

De acuerdo con una realización, para el intercambio de genes de una molécula silenciadora de ARN endógeno (por ejemplo, miARN) con una secuencia de silenciamiento de ARN de elección (por ejemplo, ARNpi), el vector de expresión, ODNmc (por ejemplo, ADNmc o ARNmc) u ODNbc (por ejemplo, ADNbc o ARNbc) no tienen que expresarse en una célula vegetal y podrían servir como un molde sin expresión. De acuerdo con una realización específica, en tal caso, solo es necesario expresar el agente de edición de ADN (por ejemplo, módulos Cas9/ARNgc) si se proporciona en forma de ADN.

De acuerdo con algunas realizaciones, para la edición de genes de una molécula de ARN no codificante endógena (por ejemplo, una molécula silenciadora de ARN) sin el uso de una nucleasa, el agente de edición de ADN (por ejemplo, ARNg) puede introducirse en la célula eucariota con o sin (por ejemplo, ADN o ARN donante de oligonucleótidos, tal como se analiza en el presente documento).

De acuerdo con una realización, la introducción de oligonucleótidos en el donante de células vegetales se efectúa utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, utilizando los vectores de expresión o la transfección r Np ).

De acuerdo con una realización, los oligonucleótidos del donante de ARNg y ADN se introducen simultáneamente en la célula vegetal (por ejemplo, mediante bombardeo). Se apreciará que cualquier factor adicional (por ejemplo, nucleasa) puede cointroducirse con el mismo.

De acuerdo con una realización, el ARNg se introduce en la célula vegetal antes que los oligonucleótidos del donante de ADN (por ejemplo, en unos pocos minutos o unas pocas horas). Se apreciará que cualquier factor adicional (por ejemplo, nucleasa) puede introducirse antes de, concomitantemente con, o después del ARNg o de los oligonucleótidos donantes de ADN.

De acuerdo con una realización, el ARNg se introduce en la célula vegetal después de los oligonucleótidos del donante de ADN (por ejemplo, en unos pocos minutos o unas pocas horas). Se apreciará que cualquier factor adicional (por ejemplo, nucleasa) puede introducirse antes de, concomitantemente con, o después del ARNg o de los oligonucleótidos donantes de ADN.

De acuerdo con una realización, se proporciona una composición que comprende al menos un oligonucleótido donante de ARNg y ADN para la edición del genoma.

De acuerdo con una realización, se proporciona una composición que comprende al menos un ARNg, una nucleasa (por ejemplo, endonucleasa) y oligonucleótidos donantes de ADN para la edición del genoma.

Existen varios métodos de transferencia directa de ADN a células vegetales y el experto en la materia sabrá cuál seleccionar. En electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un campo eléctrico fuerte. En microinyección, el ADN se inyecta de manera mecánica directamente en las células usando micropipetas muy pequeñas. En bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles, tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de oro o tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente en protoplastos, células o tejidos vegetales.

Por lo tanto, la liberación de ácidos nucleicos puede introducirse en una célula vegetal en realizaciones de la invención mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo y sin limitación: mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.508.184); mediante absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (véase, por ejemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8); mediante electroporación (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.384.253); mediante agitación con fibras de carburo de silicio (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.302.523 y 5.464.765); mediante transformación mediada por Agrobacterium (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.824.877, 5.981.840 y 6.384.301); mediante aceleración de partículas recubiertas de ADN (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861 y 6,403,865) y mediante nanopartículas, nanoportadores y péptidos de penetración celular (documentos WO201126644A2; WO2009046384A1; WO2008148223A1) en los métodos para administrar ADN, ARN, péptidos y/o proteínas o combinaciones de ácidos nucleicos y péptidos en células vegetales.

Otros métodos de transfección incluyen el uso de reactivos de transfección (por ejemplo, Lipofectin, ThermoFisher), dendrímeros (Kukowska-Latallo, J.F. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. UsA93, 4897-902), péptidos penetradores celulares (Mae et al., 2005, Internalisation of cell-penetrating peptides into tobacco protoplasts, Biochimica et Biophysica Acta 1669(2): 101-7) o poliaminas (Zhang y Vinogradov, 2010, Short biodegradable polyamines for gene delivery and transfection of brain capillary endothelial cells, J Control Release, 143(3):359-366).

De acuerdo con una realización específica, para introducir ADN en células vegetales (por ejemplo, protoplastos), el método comprende la captación de ADN mediada por polietilenglicol (PEG). Para detalles adicionales, véase Karesch et al. (1991) Plant Cell Rep. 9:575-578; Mathur et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:221-226; Negrutiu et al. (1987) Plant Cell Mol. Biol. 8: 363-373. Luego, las células vegetales (por ejemplo, protoplastos) se cultivan en condiciones que les permitieron desarrollar paredes celulares, comenzar a dividirse para formar un callo, desarrollar brotes y raíces, y regenerar plantas enteras.

Después de la transformación estable, se realiza propagación de la planta. El método más común de propagación de plantas es mediante semillas. La regeneración mediante propagación por semillas, sin embargo, tiene la deficiencia de que, debido a la heterocigosidad, existe una falta de uniformidad en el cultivo, ya que las semillas son producidas por plantas según las variaciones genéticas regidas por las normas mendelianas. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se produzca de manera que la planta regenerada tenga los rasgos y características idénticos de la planta transgénica original. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se regenere por micropropagación que proporciona una reproducción rápida y consistente de las plantas transformadas genéticamente idénticas.

La micropropagación es un proceso de cultivo de plantas de nueva generación a partir de un solo trozo de tejido que se ha escindido de una planta o cultivar original seleccionado. Este proceso permite la reproducción masiva de plantas con la característica deseada. Las plantas de nueva generación son genéticamente idénticas a, y tienen todas las características de, la planta original. La micropropagación (o clonación) permite la producción en masa de material vegetal de calidad en un periodo de tiempo corto y ofrece una multiplicación rápida de cultivares seleccionados en la conservación de las características de la planta original transgénica o transformada. Las ventajas de la clonación de plantas son la velocidad de multiplicación de plantas y la calidad y uniformidad de plantas producidas.

La micropropagación es un procedimiento de múltiples etapas que requiere alteración del medio de cultivo o de las condiciones de crecimiento entre las etapas. Por lo tanto, el proceso de micropropagación implica cuatro etapas básicas: Etapa uno, cultivo de tejido inicial; etapa dos, multiplicación de cultivo tisular; etapa tres, diferenciación y formación de plantas; y etapa cuatro, cultivo y endurecimiento en invernadero. Durante la etapa uno, cultivo tisular inicial, el cultivo tisular se establece y se certifica que está exento de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo tisular inicial se multiplica hasta que se produce un número suficiente de muestras tisulares para cumplir los objetivos de producción. Durante la etapa tres, las muestras tisulares cultivadas en la etapa dos se dividen y cultivan en plántulas individuales. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para su endurecimiento, donde la tolerancia de las plantas a la luz aumenta gradualmente de modo que pueda cultivarse en el entorno natural.

Aunque actualmente se prefiere la transformación estable, algunas realizaciones de la invención también contemplan la transformación transitoria de las células de la hoja, células meristemáticas o la planta completa.

Puede efectuarse transformación transitoria mediante cualquiera de los métodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o mediante infección vírica usando virus vegetales modificados.

Los virus que se han mostrado que son útiles para la transformación de hospedadores vegetales incluyen CaMV, TMV, TRV y BV. Se describe transformación de plantas usando virus vegetales en la patente de Estados Unidos n.° 4.855.237 (BGV), documento EP-A 67.553 (TMV), solicitud publicada japonesa n.° 63-14693 (TMV), documento EPA 194.809 (BV), documento EPA 278.667 (Bv ); y Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pág. 172-189 (1988). Las partículas de pseudovirus para su uso en la expresión de ADN extraño en muchos huéspedes, incluyendo plantas, se describe en el documento WO 87/06261.

La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión de secuencias de ácido nucleico exógenas no víricas en plantas se demuestra por las referencias anteriores, así como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; y Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

Cuando el virus es un virus de ADN, se pueden hacer modificaciones adecuadas al virus en sí mismo. Como alternativa, el virus se puede clonar primero en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector vírico deseado con el ADN extraño. Después, el virus puede escindirse del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, puede unirse un origen bacteriano de replicación al ADN vírico, que después es replicado por las bacterias. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de cubierta que encapsulará el ADN vírico. Si el virus es un virus de ARN, el virus generalmente se clona como un ADNc y se inserta en un plásmido. El plásmido se usa después para realizar todas las construcciones. El virus de ARN se produce después al transcribir la secuencia vírica del plásmido y la traducción de los genes víricos para producir la o las proteínas de cubierta que encapsidan el ARN vírico.

La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión en plantas de secuencias de ácido nucleico exógenas no virales tales como las incluidas en la construcción utilizada de acuerdo con algunas realizaciones de la invención se demuestra mediante las referencias anteriores, así como en la patente de Estados Unidos n.° 5.316.931.

En una realización, se proporciona un ácido nucleico vírico de planta en el que la secuencia codificante de la proteína de cubierta nativa se ha delecionado de un ácido nucleico vírico, una secuencia de codificación de proteína de cubierta vírica vegetal no nativa y un promotor no nativo, preferentemente se ha insertado el promotor subgenómico de la secuencia codificante de la proteína de cubierta no nativa, capaz de expresión en la planta huésped, empaquetado del ácido nucleico vírico vegetal recombinante y asegurando una infección sistémica del huésped por el ácido nucleico vírica vegetal recombinante. Como alternativa, el gen de la proteína de cubierta puede inactivarse mediante inserción de una secuencia de ácido nucleico no nativa dentro de él, de modo que se produce una proteína. El ácido nucleico vírico de la planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes adyacentes o secuencias de ácido nucleico en el hospedador vegetal e incapaz de recombinarse entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativas (extrañas) adyacentes al promotor subgenómico vírico o los promotores subgenómicos víricos de planta nativa y una no nativa si se incluye más de una secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico no nativas se transcriben o expresan en la planta hospedadora bajo control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.

En una segunda realización, se proporciona un ácido nucleico vírico de planta recombinante como en la primera realización, excepto que la secuencia codificante de proteína de cubierta nativa se coloca adyacente a uno de los promotores subgenómicos de proteína de cubierta no nativa en lugar de una secuencia codificante de proteína de cubierta no nativa.

En una tercera realización, se proporciona un ácido nucleico vírico de planta recombinante en el que el gen de la proteína de cubierta nativa está adyacente a su promotor subgenómico y se han insertado uno o más promotores subgenómicos no nativos en el ácido nucleico vírico. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en una planta hospedadora y son incapaces de recombinarse entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativas adyacentes a los promotores víricos de plantas subgenómicos no nativos de modo que las secuencias se transcriban o expresen en la planta hospedadora bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.

En una cuarta realización, se proporciona un ácido nucleico vírico de planta recombinante como en la tercera realización, excepto que la secuencia codificante de proteína de cubierta nativa se reemplaza por una secuencia codificante de proteína de cubierta no nativa.

Los vectores víricos están encapsidados por las proteínas de cubierta codificadas por el ácido nucleico vírico de la planta recombinante para producir un virus vegetal recombinante. El ácido nucleico vírico de planta recombinante o virus de planta recombinante se usa para infectar plantas hospedadoras adecuadas. El ácido nucleico vírico de la planta recombinante tiene capacidad de replicación en el hospedador, diseminación sistémica en el hospedador y transcripción o expresión de gen o genes extraños (ácido nucleico aislado) en el hospedador para producir la proteína deseada.

Además de lo anterior, la molécula de ácido nucleico utilizada de acuerdo con algunas realizaciones de la invención también se puede introducir en un genoma de cloroplasto permitiendo así la expresión de cloroplasto.

Se conoce una técnica para introducir secuencias de ácido nucleico exógenas en el genoma de los cloroplastos. Esta técnica implica los siguientes procedimientos. El primero, las células vegetales se tratan químicamente para reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente uno. Después, el ácido nucleico exógeno se introduce mediante bombardeo de partículas en las células con el objetivo de introducir al menos una molécula de ácido nucleico exógena en los cloroplastos. El ácido nucleico exógeno se selecciona de modo que se puedan integrar en el genoma del cloroplasto mediante recombinación homóloga que se efectúa fácilmente mediante enzimas inherentes al cloroplasto. Con este fin, el ácido nucleico exógeno incluye, además de un gen de interés, al menos un tramo de ácido nucleico que procede del genoma del cloroplasto. Adicionalmente, el ácido nucleico exógeno incluye un marcador seleccionable, que actúa mediante procedimientos de selección secuencial para determinar que todas o sustancialmente todas las copias de los genomas de cloroplasto después de dicha selección incluirán el ácido nucleico exógeno. Se encuentran detalles adicionales relacionados con esta técnica en las patentes de Estados Unidos n.° 4.945.050; y 5.693.507. Por tanto, el sistema de expresión de proteínas del cloroplasto puede producir un polipéptido y este puede integrarse en la membrana interna del cloroplasto.

Independientemente del método de transformación/infección empleado, las presentes enseñanzas seleccionan además células transformadas que comprenden un evento de edición del genoma.

De acuerdo con una realización específica, la selección se lleva a cabo de tal manera que solo se seleccionan las células que comprenden una modificación precisa exitosa (por ejemplo, intercambio, inserción, deleción, mutación puntual) en el locus específico. En consecuencia, las células que comprenden cualquier evento que incluye una modificación (por ejemplo, una inserción, deleción, mutación puntual) en un locus no deseado no se seleccionan.

De acuerdo con una realización, la selección de células modificadas se puede realizar a nivel fenotípico, mediante detección de un evento molecular, mediante detección de un indicador fluorescente o mediante crecimiento en presencia de selección (por ejemplo, antibiótico).

De acuerdo con una realización, la selección de células modificadas se realiza analizando la biogénesis y la aparición de la molécula de ARN no codificante recién editada (por ejemplo, la presencia de una nueva versión de miARN, la presencia de nuevos ARNpi editados, ARNip, ARNtasi, etc.).

De acuerdo con una realización, la selección de células modificadas se realiza analizando la actividad silenciadora y/o la especificidad de la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) hacia un segundo ARN diana mediante la validación de al menos un fenotipo en la planta o el organismo que codifica el ARN diana, por ejemplo, coloración de hojas de plantas, por ejemplo, pérdida parcial o completa de clorofila en hojas y otros órganos (blanqueamiento), presencia/ausencia de patrones nacróticos, coloración de flores, rasgos de la fruta (tal como la vida útil, la firmeza y el sabor), tasa de crecimiento, tamaño de la planta (por ejemplo, enanismo), rendimientos de los cultivos, resistencia al estrés biótico (por ejemplo, resistencia a enfermedades, mortalidad de nematodos, tasa de puesta de huevos del escarabajo u otros fenotipos resistentes asociados con cualquiera de bacterias, virus, hongos, parásitos, insectos, malas hierbas y plantas cultivadas o autóctonas), resistencia al estrés abiótico (por ejemplo, resistencia al frío/calor, resistencia a la sequía, resistencia a la sal, resistencia al alcohol alílico o resistencia a la falta de nutrientes, por ejemplo, fósforo (P)).

De acuerdo con una realización, la especificidad de silenciamiento de la molécula de ARN no codificante se determina genotípicamente, por ejemplo, mediante expresión de un gen o falta de expresión.

De acuerdo con una realización, la especificidad de silenciamiento de la molécula de ARN no codificante se determina fenotípicamente.

De acuerdo con una realización, un fenotipo de la planta se determina antes que un genotipo.

De acuerdo con una realización, un genotipo de la planta se determina antes que un fenotipo.

De acuerdo con una realización, la selección de células modificadas se realiza analizando la actividad silenciadora y/o la especificidad de la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) hacia un segundo ARN diana o ARN diana de interés midiendo el nivel de ARN del segundo ARN diana o diana ARN de interés. Esto puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante transferencia Northern, ensayos de protección de nucleasa, hibridación in situ o RT-PCR cuantitativa.

De acuerdo con una realización, la selección de células modificadas se realiza mediante el análisis de células vegetales o clones que comprenden el evento de edición de ADN, también denominado en el presente documento "mutación" o "edición", dependiendo del tipo de edición buscada, por ejemplo, inserción, deleción, inserción-deleción Indel), inversión, sustitución y combinaciones de los mismos.

Los métodos para detectar la alteración de secuencia son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, Secuenciación de ADN y ARN (por ejemplo, secuenciación de próxima generación), electroforesis, un ensayo de detección de desajuste basado en enzimas y un ensayo de hibridación como PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, hibridación in situ, extensión del cebador, transferencia Southern, transferencia Northern y transferencia puntual. También se pueden utilizar varios métodos utilizados para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), tal como la endonucleasa T7 basada en PCR, secuenciación Hetroduplex y Sanger, o PCR seguida de digestión de restricción para detectar la aparición o desaparición de sitios de restricción únicos.

Otro método para validar la presencia de un evento de edición de ADN, por ejemplo, Indels, comprende un ensayo de escisión de desajustes que utiliza una enzima selectiva de estructura (por ejemplo, endonucleasa) que reconoce y escinde el ADN no coincidente.

De acuerdo con una realización, la selección de células transformadas se efectúa mediante citometría de flujo (FACS) seleccionando células transformadas que exhiben fluorescencia emitida por el indicador fluorescente. Después de la clasificación FACS, se recolectan los grupos seleccionados positivamente de células vegetales transformadas, que muestran el marcador fluorescente y se puede usar una alícuota para probar el evento de edición de ADN como se ha tratado anteriormente.

En los casos en que se utilizó marcador de selección de antibióticos, después de la transformación, los clones de células vegetales se cultivan en presencia de selección (por ejemplo, antibiótico) hasta que se convierten en colonias, es decir, clones y micro-callos. Luego, una parte de las células de los callos se analiza (valida) para el evento de edición de ADN, tal como se ha analizado anteriormente.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización de la invención, el método comprende además validar en las células transformadas la complementariedad de la molécula de ARN no codificante endógena (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) hacia el segundo ARN diana.

Como se ha mencionado anteriormente, después de la modificación del gen que codifica la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN), la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN) comprende al menos aproximadamente un 30 %, 33 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % de complementariedad hacia la secuencia del segundo ARN diana o ARN diana de interés.

La unión específica de la molécula de ARN no codificante diseñada con un ARN diana de interés puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por algoritmos computacionales (por ejemplo, BLAST) y verificado por métodos que incluyen, por ejemplo, transferencia Northern, hibridación in situ, ensayo QuantiGene Plex, etc.

Se apreciará que los clones positivos pueden ser homocigotos o heterocigotos para el evento de edición de ADN. En el caso de una célula heterocigota, la célula (por ejemplo, cuando es diploide) puede comprender una copia de un gen modificado y una copia de un gen no modificado de la molécula de ARN no codificante (por ejemplo, molécula silenciadora de ARN). El experto en la materia seleccionará el clon para cultivo/regeneración adicional de acuerdo con el uso previsto.

De acuerdo con una realización, cuando se desea un método transitorio, los clones que exhiben la presencia de un evento de edición de ADN como se desea se analizan y seleccionan adicionalmente por la ausencia del agente de edición de ADN, a saber, pérdida de secuencias de ADN que codifican el agente de edición de ADN. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante el análisis de la pérdida de expresión del agente de edición de ADN (por ejemplo, en el ARNm, proteína) por ejemplo, por detección fluorescente de GFP o q-PCR, HPLC.

De acuerdo con una realización, cuando se desea un método transitorio, las células pueden analizarse en busca de la ausencia del constructo de ácido nucleico como se describe en el presente documento o porciones del mismo, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de edición de ADN. Esto puede afirmarse mediante microscopia fluorescente, q-PCR, FACS, y/o cualquier otro método como transferencia Southern, PCR, secuenciación, HPLC).

La planta se puede cruzar para obtener una planta desprovista del agente de edición de ADN (por ejemplo, de la endonucleasa), como se indica a continuación.

Los clones positivos pueden almacenarse (por ejemplo, criopreservarse).

Como alternativa, las células vegetales (por ejemplo, protoplastos) pueden regenerarse en plantas completas primero creciendo en un grupo de células vegetales que se desarrolla en un callo y luego mediante la regeneración de brotes (callogénesis) del callo usando métodos de cultivo de tejido vegetal. El crecimiento de protoplastos en callos y la regeneración de brotes requiere el equilibrio adecuado de los reguladores del crecimiento de las plantas en el medio de cultivo de tejidos que debe personalizarse para cada especie de planta.

Los protoplastos también se pueden utilizar para el cultivo de plantas, usando una técnica llamada fusión de protoplastos. Se induce la fusión de protoplastos de diferentes especies mediante el uso de un campo eléctrico o una solución de polietilenglicol. Esta técnica puede usarse para generar híbridos somáticos en cultivo de tejidos.

Se conocen bien en la técnica los métodos de regeneración de protoplastos. Varios factores afectan al aislamiento, cultivo y regeneración de protoplastos, a saber, el genotipo, el tejido del donante y su pretratamiento, el tratamiento enzimático para el aislamiento de protoplastos, el método de cultivo de protoplastos, el cultivo, el medio de cultivo y el ambiente físico. Para una revisión exhaustiva, véase Maheshwari et al. 1986 Differentiation of Protoplasts and of Transformed Plant Cells: 3-36. Springer-Verlag, Berlín.

Las plantas regeneradas pueden someterse a cultivo y selección adicionales según lo estime conveniente el experto en la materia. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una planta con expresión reducida de un gen diana, comprendiendo el método: modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN para un ARN diana en una célula vegetal de acuerdo con un método de la invención, generar una planta a partir de dicha célula vegetal, produciendo así la planta con expresión reducida de un gen diana.

La reproducción puede comprender el cruzamiento o la autofecundación.

El término "cruzamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la fertilización de plantas femeninas (o gametos) por plantas masculinas (o gametos). El término "gameto" se refiere a la célula reproductora haploide (óvulo o esperma) producida en las plantas por mitosis de un gametofito e implicada en la reproducción sexual, durante la cual dos gametos del sexo opuesto se fusionan para formar un cigoto diploide. El término generalmente incluye referencia a un polen (incluido el espermatozoide) y un óvulo (incluido el óvulo). por lo tanto, "cruzamiento" generalmente se refiere a la fertilización de óvulos de un individuo con polen de otro individuo, mientras que "autopolinización" se refiere a la fertilización de óvulos de un individuo con polen del mismo individuo. El cruzamiento se usa ampliamente en el mejoramiento de plantas y da como resultado una mezcla de información genómica entre las dos plantas cruzadas, un cromosoma de la madre y un cromosoma del padre. Esto dará como resultado una nueva combinación de rasgos heredados genéticamente.

Como se ha mencionado anteriormente, la planta puede cruzarse para obtener una planta libre de factores no deseados, por ejemplo, agente de edición de ADN (por ejemplo, endonucleasa).

De acuerdo con una realización, se proporciona un método para generar una planta con mayor tolerancia al estrés, rendimiento aumentado, tasa de crecimiento aumentada o calidad del rendimiento aumentada, el método que comprende la modificación de un gen que codifica o se procesa en un silenciamiento de ARN en una célula vegetal de acuerdo con el método de algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad al estrés, rendimiento disminuido, tasa de crecimiento disminuido o calidad de rendimiento disminuido, generando así la planta.

La expresión "tolerancia al estrés", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una planta para soportar un estrés biótico o abiótico sin sufrir una alteración sustancial en el metabolismo, crecimiento, productividad y/o viabilidad.

La expresión "estrés abiótico", como se usa en el presente documento se refiere a la exposición de una planta, célula vegetal o similar, a un agente físico o químico no vivo ("abiótico") que tiene un efecto adverso sobre el metabolismo, crecimiento, desarrollo, propagación o supervivencia de la planta (colectivamente, "crecimiento"). Se puede imponer un estrés abiótico a una planta debido, por ejemplo, a un factor ambiental tal como agua (por ejemplo, inundación, sequía o deshidratación), condiciones anaeróbicas (por ejemplo, un nivel más bajo de oxígeno o un nivel alto de CO2), condiciones osmóticas anormales (por ejemplo, estrés osmótico), salinidad o temperatura (por ejemplo, calor/calor, frío, congelación o escarcha), una exposición a contaminantes (por ejemplo, toxicidad por metales pesados), anaerobiosis, deficiencia de nutrientes (por ejemplo, deficiencia de nitrógeno o nitrógeno limitado), contaminación atmosférica o radiación ultravioleta.

La expresión "estrés biótico", como se usa en el presente documento se refiere a la exposición de una planta, célula vegetal o similar, a un organismo vivo ("biótico") que tiene un efecto adverso sobre el metabolismo, crecimiento, desarrollo, propagación o supervivencia de la planta (colectivamente, "crecimiento"). El estrés biótico puede ser causado por, por ejemplo, bacteria, virus, hongos, parásitos, insectos beneficiosos y dañinos, malezas y plantas cultivadas o nativas.

La frase "rendimiento" o "rendimiento de la planta", como se usa en el presente documento, se refiere al aumento del crecimiento de la planta (tasa de crecimiento), aumento del crecimiento de los cultivos, aumento de la biomasa y/o aumento de la producción de productos vegetales (incluidos cereales, frutos, semillas, etc.).

De acuerdo con una realización, para generar una planta con mayor tolerancia al estrés, rendimiento aumentado, tasa de crecimiento aumentada o calidad del rendimiento aumentada, la molécula de ARN no codificante está diseñada para dirigirse a un ARN de interés de un gen de la planta que confiere sensibilidad al estrés, rendimiento disminuido, tasa de crecimiento disminuida o calidad del rendimiento disminuida.

De acuerdo con una realización, los genes de plantas de susceptibilidad de ejemplo a los que se apunta (por ejemplo, inactivación) incluyen, pero sin limitación, los genes S de susceptibilidad, tales como los que residen en loci genéticos conocidos como MLO (Mildew Locus O).

De acuerdo con una realización, las plantas generadas por el presente método comprenden una mayor tolerancia al estrés, rendimiento aumentado, mayor calidad del rendimiento, tasa de crecimiento aumentada, en al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 100 % en comparación con plantas no generadas por los presentes métodos.

Cualquier método conocido en la técnica para evaluar la tolerancia a la tensión aumentada puede usarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos de ejemplo para evaluar una mayor tolerancia al estrés incluyen, pero sin limitación, regulación por disminución de PagSAP1 en álamo para aumentar la tolerancia al estrés salino como se describe en Yoon, SK., Bae, EK., Lee, H. et al. Trees (2018) 32: 823. www(dot)doi(dot)org/10.1007/s00468-018-1675-2), y mayor tolerancia a la sequía en tomates mediante regulación por disminución de SlbZIP38 (Pan Y et al. Genes 2017, 8, 402; doi:10.3390/genes8120402.

Cualquier método conocido en la técnica para evaluar el aumento del rendimiento puede usarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos de ejemplo para evaluar el aumento del rendimiento incluyen, pero sin limitación, expresión reducida de DST en arroz como se describe en Ar-Rafi Md. Faisal, et al., AJPS> Vol. 8 N.° 9, agosto de 2017 DOI: 10.4236/ajps. 2017,89149; y la regulación por disminución de BnFTA en colza dio como resultado un mayor rendimiento, como se describe en Wang Y et al., Mol Plant. 2009 Jan; 2(1): 191-200.doi: 10.1093/mp/ssn088).

Cualquier método conocido en la técnica para evaluar la tasa de crecimiento aumentada puede usarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos de ejemplo para evaluar el aumento de la tasa de crecimiento incluyen, pero sin limitación, la expresión reducida de BIG BROTHER en Arabidopsis o GA2-OXIDASA da como resultado un aumento del crecimiento y la biomasa como se describe en Marcelo de Freitas Lima et al. Biotechnology Research and Innovation(2017)1,14—25.

Cualquier método conocido en la técnica para evaluar la calidad del rendimiento incrementado puede usarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos de ejemplo para evaluar una mayor calidad del rendimiento incluyen, pero sin limitación, la regulación por disminución de OsCKX2 en el arroz da como resultado la producción de más macollos, más granos y los granos eran más pesadoscomo se describe en Yeh S_Y et al. Rice (N Y). 2015; 8: 36; y reducir los niveles de OMT en muchas plantas, que dan como resultado una acumulación alterada de lignina, incremento de la digestibilidad del material para fines industriales como se describe en Verma SR y Dwivedi UN, South African Journal of Botany Volume 91, marzo de 2014, páginas 107-125.

De acuerdo con una realización, el método permite además la generación de una planta que comprende mayor dulzura, mayor contenido de azúcar, mayor sabor, control mejorado de la maduración, mayor tolerancia al estrés hídrico, mayor tolerancia al estrés por calor y mayor tolerancia a la sal. Un experto en la técnica sabrá cómo utilizar los métodos descritos en el presente documento para elegir secuencias de ARN diana para la modificación.

De acuerdo con una realización, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a patógenos, el método que comprende modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal de acuerdo con el método de algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad al patógeno, generando así la planta tolerante o resistente al patógeno.

De acuerdo con una realización, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a patógenos, el método que comprende modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal de acuerdo con el método de algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen del patógeno, generando así la planta tolerante o resistente al patógeno.

De acuerdo con una realización, se proporciona un método para generar una planta tolerante o resistente a plagas, el método que comprende modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal de acuerdo con el método de algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la plaga, generando así la planta tolerante o resistente a plagas.

Como se usa en el presente documento, el término "patógeno" se refiere a un organismo que afecta negativamente a las plantas al colonizar, dañar, atacarlos o infectarlos. Por lo tanto, un patógeno puede afectar al crecimiento, desarrollo, reproducción, cosecha o rendimiento de una planta. Esto incluye organismos que propagan enfermedades y/o dañan al huésped y/o compiten por los nutrientes del huésped. Los patógenos de las plantas incluyen, pero sin limitación, hongos, oomicetos, bacteria, virus, viroides, organismos similares a virus, fitoplasmas, protozoos, nematodos, insectos y plantas parásitas.

Los ejemplos no limitantes de patógenos incluyen, pero sin limitación, barrenador de cabeza redonda, tal como los barrenadores de cuernos largos; psílidos, tal como psílido rojo del eucalipto (Glycaspis brimblecombei), psílido de eucalipto, psílido australiano del eucalipto manchado, psílido del limón; escarabajos tortuga; gorgojos; escarabajos del olmo; armilaria de miel; Thaumastocoris peregrinus; avispas sésiles de las agallas (Cynipidae) tales como Leptocybe invasa, Ophelimus maskelli y Selitrichodes globules; orugas que se alimentan de follaje, tales como Omnivorous looper y Orange tortrix; francotirador de alas vidriosas; y moscas blancas, tal como la mosca blanca gigante. Otros ejemplos no limitantes de patógenos incluyen pulgones tales como Chaitophorus spp., pulgón del álamo y Períphyllus spp.; escalas blindadas, tales como la escala Oystershell y la escala San José; gusano carpintero; barrenadores de la polilla de las alas claras tales como la polilla del avispón americano y las alas claras del álamo occidental; barrenadores de cabeza plana, tal como el barrenador del abedul de bronce y el barrenador del álamo de bronce; orugas que se alimentan de follaje, tal como el gusano tejedor de otoño, enrollador de árboles frutales, oruga de joroba roja, oruga de la polilla del satén, oruga del olmo espinoso, oruga de la tienda, polillas de mechón y mariposa cola de golondrina tigre occidental; mineros de la hoja, tal como barrenador del escudo del álamo; ácaros de las agallas y ampollas, tal como el ácaro de las agallas del chopo; pulgones de las agallas, tal como el pulgón del álamo; francotirador de alas vidriosas; escarabajos de las hojas y escarabajos pulgas; cochinillas; barrenador de álamos y sauces; barrenadores de cabeza redonda; moscas de sierra; escalas blandas, tal como la escala negra, escala blanda marrón, escala algodonosa del arce y lecanio de fruta europeo; saltarines, tales como el saltarín búfalo; y chinches del campo, tal como chinche de encaje y chinches lygus.

Otros ejemplos no limitantes de patógenos víricos de plantas incluyen, pero sin limitación, especies: Virus del pardeamiento temprano del guisante (PEBV), Género: Tobravirus. Especie: virus de la mancha anular del pimiento (PepRSV), Género: Tobravirus. Especie: virus del mosaico de la sandía (WMV), Género: Potyvirus y otros virus del Género Potyvirus. Especie: Género del virus del mosaico del tabaco (TMV), Tobamovirus y otros virus del género Tobamovirus. Especie: virus de la patata Género X (PVX), Potexvirus y otros virus del género Potexvirus. Por lo tanto, las presentes enseñanzas prevén el direccionamiento de virus de ARN así como de ADN (por ejemplo, virus Gemini o Bigeminivirus). Los virus Geminiviridae a los que se puede apuntar incluyen, pero sin limitación, bigeminivirus del mosaico de abutilón, bigeminivirus de la vena amarilla Ageratum, bigeminivirus del mosaico calicó de la judía, bigeminivirus del mosaico dorado de la judía, bigeminivirus del mosaico de la vena amarilla de Bhendi, bigeminivirus del mosaico africano de la yuca, bigeminivirus del mosaico indio de la yuca, bigeminivirus chino del tomate, bigeminivirus arrugado de la hoja de algodón, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja de algodón, bigeminivirus del mosaico de la vena amarilla de Croton, bigeminivirus del mosaico amarillo Dolichos, bigeminivirus del mosaico de Euphorbia, bigeminivirus del mosaico amarillo de la judía grande, bigeminivirus del mosaico de Jatropha, bigeminivirus del mosaico dorado de la semilla de Lima, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja del melón, bigeminivirus del mosaico amarillo del frijol mungo, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja de okra, bigeminivirus de chile hausteco, bigeminivirus de pimiento de Texas, bigeminivirus del mosaico amarillo de la patata, bigeminivirus del mosaico de Rhynchosia, bigeminivirus del mosaico dorado serrano, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja de calabaza, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja del tabaco, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja australiano del tomate, bigeminivirus del mosaico dorado del tomate, bigeminivirus del enrollamiento de la hoja indio del tomate, bigeminivirus arrugado de la hoja de tomate, bigeminivirus moteado del tomate, bigeminivirus de la rizadura amarilla del tomate, bigeminivirus del mosaico amarillo del tomate, bigeminivirus del acrobacia clorótica de la sandía y bigeminivirus del moteado rizado de la sandía.

Como se usa en el presente documento, el término "plaga" se refiere a un organismo que daña directa o indirectamente a la planta. Un efecto directo incluye, por ejemplo, alimentación de las hojas de la planta. El efecto indirecto incluye, por ejemplo, transmisión de un agente patógeno (por ejemplo, un virus, bacteria, etc.) a la planta. En este último caso, la plaga sirve como vector para la transmisión de patógenos. Las plagas de ejemplo incluyen, pero sin limitación, escarabajos, psílidos, insectos, nematodos, caracoles.

De acuerdo con una realización, el patógeno es un nematodo. Los nematodos de ejemplo incluyen, pero sin limitación, el nematodo barrenador (Radopholus similis), Caenorhabditis elegans, Radopholus aracoffeae, Pratylenchus coffeae, nematodos de los nudos de la raíz (Meloidogyne spp.), nematodo del quiste (Heterodera y Globodera spp.), nematodo de lesión de la raíz (Pratylenchus spp.), nematodo del tallo (Ditylenchus dipsaci), nematodo del marchitamiento del pino (Bursaphelenchus xylophilus), el nematodo reniforme (Rotylenchulus reniformis), Xiphinema index, Nacobbus aberrans y Aphelenchoides besseyi.

De acuerdo con una realización, el patógeno es un hongo. Los hongos de ejemplo incluyen, pero sin limitación, Fusarium oxysporum, Leptosphaeria maculans (Phoma lingam), Sclerotinia sclerotiorum, Pyricularia grisea, Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme), Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Puccinia spp., Fusarium graminearum, Blumeria graminis, Mycosphaerella graminicola, Colletotrichum spp., Ustilago maydis, Melampsora lini, Phakopsora pachyrhizi y Rhizoctonia solani.

De acuerdo con una realización, para generar una planta resistente o tolerante a patógenos, la molécula de ARN no codificante está diseñada para dirigirse a un ARN de interés de un gen de la planta que confiere sensibilidad a un patógeno.

De acuerdo con una realización, un gen vegetal de ejemplo al que se apunta incluye, pero sin limitación, el gen eIF4E que confiere sensibilidad a la infección vírica en pepino.

De acuerdo con una realización, para generar una planta resistente o tolerante a patógenos, la molécula de ARN no codificante está diseñada para dirigirse a un ARN de interés de un gen del patógeno.

La determinación de los genes diana de la planta o del patógeno se puede lograr utilizando cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante análisis bioinformático de rutina.

De acuerdo con una realización, el gen patógeno del nematodo comprende los genes de calreticulina13 (CRT) o colágeno 5 (col-5) de Radopholus similis.

De acuerdo con una realización, el gen del patógeno fúngico comprende los genes FOW2, FRP1 y OPR de Fusarium oxysporum.

De acuerdo con una realización, el gen del patógeno incluye, por ejemplo, ATPasa vacuolar (vATPasa), dvssj 1 y dvssj2, a-tubulina y snf7.

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Brassica napus (colza), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Leptosphaeria maculans (Phoma lingam) (que causa, por ejemplo, el cancro del tallo de Phoma) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AM933613.1); un gen del escarabajo pulga (Phyllotreta vittula o Chrysomelidae, por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KT959245.1); o un gen de Sclerotinia sclerotiorum (que causa, por ejemplo, la pudrición del tallo por Sclerotinia) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: NW_001820833.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es Citrus x sinensis (naranja), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Citrus canker (CCK) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AE008925); un gen de Candidatus Liberibacter spp. (causando, por ejemplo, la enfermedad del enverdecimiento de los cítricos) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: CP001677.5); o un gen de la pudrición de la raíz por Armillaria (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KY389267.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Elaeis guineensis (palma de aceite), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Ganoderma spp. (que causa, por ejemplo, pudrición del tallo basal (BSR), también conocida como pudrición basal por Ganoderma) (por ejemplo, como se expone en el número de acceso de GenBank: U56128.1), un gen de oruga de ortiga o un gen de cualquiera de Fusarium spp., Phytophthora spp., Pythium spp., Rhizoctonia solani (que causa, por ejemplo, pudrición de la raíz).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Fragaria vesca (fresa silvestre), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Verticillium dahlia (que causa, por ejemplo, el marchitamiento por Verticillium) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: DS572713.1); o un gen de Fusarium oxysporum f.sp. fragariae (causando, por ejemplo, marchitez por Fusarium) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KR855868.1);

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Glycine max (Soja), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de P. pachyrhizi (que causa, por ejemplo, la roya de la soja, también conocida como roya asiática) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: DQ026061.1); un gen del áfido de la soja (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KJ451424.1); un gen del virus del enanismo de la soja (SbDV) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: NC_003056.1); o un gen de la chinche apestosa verde (Acrosternum hilare) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: NW_020110722.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Gossypium raimondii (algodón), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum (que causa, por ejemplo, el marchitamiento por Fusarium) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: JN416614.1); un gen del áfido de la soja (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KJ451424.1); o un gen del gusano cogollero rosado (Pectinophora gossypiella) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KU550964.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Oryza sativa (arroz), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Pyricularia grisea (que causa, por ejemplo, la roya del arroz) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AF027979.1); un gen de Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme) (que causa, por ejemplo, la enfermedad de Bakanae) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AY862192.1); o un gen de un barrenador del tallo, por ejemplo, Scirpophaga incertulas Walker - barrenador amarillo del tallo, S. innota Walker - barrenador blanco del tallo, Chilo suppressalis Walker - Barrenador del tallo del arroz, Sesamia inferens Walker - barrenador del tallo rosa (por ejemplo, como se expone en el número de acceso de GenBank: KF290773.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Solanum lycopersicum (tomate), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Phytophthora infestans (que causa, por ejemplo, el tizón tardío) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AY855210.1); un gen de una mosca blanca Bemisia tabaci (por ejemplo, Gennadius, por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: KX390870.1); o un gen del geminivirus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV) (por ejemplo, como se expone en el número de acceso de GenBank: LN846610.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Solanum tuberosum (patata), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Phytophthora infestans (que causa, por ejemplo, el tizón tardío) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AY050538.3); un gen de Erwinia spp. (que causa, por ejemplo, pierna negra y podredumbre blanda) (por ejemplo, como se expone en el número de acceso de GenBank: CP001654.1); o un gen de nematodos formadores de quistes (por ejemplo, Globodera pallida y G.rostochiensis) (por ejemplo, como se expone en el número de acceso de GenBank: KF963519.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es un Theobroma cacao (cacao), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de un gen del basidiomiceto Moniliophthora roreri (que causa, por ejemplo, monoliasis del cacao) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: LATX01001521.1); un gen de Moniliophthora perniciosa (que causa, por ejemplo, la enfermedad de la escoba de bruja); o un gen de Mirids, por ejemplo, Distantiella theobroma y Sahlbergella singularis, Helopeltis spp, especie Monalonion.

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Vitis vinifera (uva o vida), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de closterovirus GVA (que causa, por ejemplo, la enfermedad de la madera rugosa) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AF007415.2); un gen del virus del enrollamiento de la hoja de la vid (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: FJ436234.1); un gen del virus de la enfermedad de la degeneración de la hoja en abanico de la vid (GFLV) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: NC_003203.1); o un gen de la enfermedad de la mancha de la vid (GFkV) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: NC_003347.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una Zea mays (maíz también conocido como maíz), el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de un gusano cogollero (por ejemplo, Spodoptera frugiperda) (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: AJ488181.3); un gen del barrenador europeo del maíz (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: GU329524.1); o un gen de gusanos de la raíz del maíz del norte y del oeste (por ejemplo, como se establece en el número de acceso de GenBank: NM_001039403.1).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una caña de azúcar, el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de un barrenador de entrenudos (por ejemplo, Chilo Saccharifagus Indicus), un gen de Xanthomonas Albileneans (que causa, por ejemplo, escaldadura de la hoja) o un gen de un virus de la hoja amarilla de la caña de azúcar (SCYLV).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es trigo, el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de una Puccinia striiformis (que causa, por ejemplo, la roya lineal) o un gen de un áfido.

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es cebada, el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de una Puccinia hordei (que causa, por ejemplo, la roya de la hoja), un gen de Puccinia striiformis f. sp. Hordei (que causa, por ejemplo, la roya lineal), o un gen de un áfido.

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es un girasol, el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de una Puccinia helianthi (que causa, por ejemplo, la enfermedad de la roya); un gen de Boerema macdonaldii (que causa, por ejemplo, tallo negro del girasol); un gen de un gorgojo de la semilla (por ejemplo, rojo y gris), por ejemplo, Smicronyx fulvus (rojo); Smicronyx sordidus (gris); o un gen de Sclerotinia sclerotiorum (que causa, por ejemplo, la enfermedad de pudrición del tallo y la cabeza de por Sclerotinia).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una planta de caucho, el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de un Microcyclus ulei (que causa, por ejemplo, el tizón de la hoja de América del Sur (SALB)); un gen de Rigidoporus microporus (que causa, por ejemplo, la enfermedad de la raíz blanca); un gen de Ganoderma pseudoferreum (que causa, por ejemplo, la enfermedad de la raíz roja).

De acuerdo con una realización específica, cuando la planta es una planta de manzana, el ARN diana de interés incluye, pero sin limitación, un gen de Neonectria ditissima (que causa, por ejemplo, el cancro de la manzana), un gen de Podosphaera leucotricha (que causa, por ejemplo, oídio de la manzana) o un gen de Venturia inaequalis (que causa, por ejemplo, sarna de la manzana).

En la Tabla 1B se proporcionan ejemplos de moléculas de ARN no codificantes endógenas que pueden modificarse para dirigirse al ARN de interés (por ejemplo, un gen de un patógeno), ejemplos de secuencias de ARNg (es decir, un agente de edición de ADN) que pueden usarse para modificar las moléculas de ARN endógeno no codificante, y ejemplos de secuencias de nucleótidos para redirigir una especificidad de silenciamiento de la molécula de ARN endógeno no codificante hacia el ARN diana de interés, a continuación en el presente documento.

Tabla 1B: Ejemplos de diseños de oligo GEiGS para generar diferentes rasgos en varios huéspedes

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La Tabla 1B proporciona ejemplos de oligos GeiGS diseñados contra una variedad de objetivos en varios organismos huéspedes. Para cada combinación huésped diana, se proporcionan cuatro oligos: cambios de secuencia mínimos con estructura coincidente y ARNpi eficiente; cambios máximos de secuencia con estructura coincidente y ARNpi eficiente; cambios máximos de secuencia y estructura no coincidente y ARNpi eficiente; y cambios máximos de secuencia con estructura coincidente y ARNpi ineficiente.

De acuerdo con una realización, las plantas generadas por el presente método son más resistentes o tolerantes a los patógenos en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % en comparación con plantas no generadas por los presentes métodos (es decir, en comparación con plantas de tipo salvaje).

Cualquier método conocido en la técnica para evaluar la tolerancia o la resistencia a un patógeno de una planta puede usarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, reducir la expresión de MYB46 en Arabidopsis, lo que resulta en una mayor resistencia a Botrytis cinereal como se describe en Ramirez V1, García-Andrade J, Vera P, Plant Signal Behav. 2011 Jun; 6(6):911-3. Epub 1 de junio de 2011; o la regulación por disminución de HCT en alfalfa promueve la activación de la respuesta de defensa en la planta como se describe en Gallego-Giraldo L. et al. New Phytologist (2011) 190: 627-639 doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03621.x).

De acuerdo con una realización, se proporciona un método para generar una planta resistente a herbicidas, comprendiendo el método modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN en una célula vegetal de acuerdo con los métodos de algunas realizaciones de la invención, en el que el ARN diana de interés es de un gen de la planta que confiere sensibilidad al herbicida, generando así la planta resistente a herbicidas.

De acuerdo con una realización, los herbicidas se dirigen a las vías que residen dentro de los plástidos (por ejemplo, dentro del cloroplasto).

Así, generar plantas resistentes a herbicidas, la molécula de ARN no codificante está diseñada para apuntar a un ARN de interés que incluye, pero sin limitación, el gen del cloroplasto psbA (que codifica la proteína de membrana Q^b de unión a quinona fotosintética, la diana del herbicida atrazina) y el gen para la EPSP sintasa (una proteína nuclear, sin embargo, su sobreexpresión o acumulación en el cloroplasto permite la resistencia de las plantas al herbicida glifosato, ya que aumenta la tasa de transcripción de las EPSP y reduce la renovación de la enzima).

De acuerdo con una realización, las plantas generadas por el presente método son más resistentes a los herbicidas en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 100 % en comparación con plantas no generadas por los presentes métodos.

El diseño de GEiGS con modificaciones/ediciones mínimas de nucleótidos en el ARN no codificante endógeno se puede lograr utilizando métodos in silico, que se basan en herramientas bioinformáticas que son bien conocidas por el experto en la materia.

De acuerdo con una realización, tal método se efectúa de la siguiente manera:

La siguiente información debe estar disponible: a) Secuencia diana a silenciar mediante silenciamiento génico inducido por edición génica (GEiGS) ("diana"); b) Elegir si el GEiGS (es decir, el ARN no codificante con actividad silenciadora modificada y/o especificidad) se expresaría de forma ubicua (por ejemplo, constitutivamente) o específicamente (por ejemplo, expresión específica de un determinado tejido, etapa de desarrollo, estrés, golpe de calor/frío, etc.).

Enviar esta información a conjuntos de datos de miARN disponibles públicamente o internamente (por ejemplo, secuenciación de ARN pequeño, secuencias genómicas, micromatrices, etc.) para filtrar (es decir, elegir) solo miARN relevantes que coincidan con los criterios de entrada: miARN que se expresan de acuerdo con el o los requisitos descritos anteriormente, tales como miRbase (Kozommara y Griffiths-Jones (2014)), tasRNAdb (Zhang Changqing, et al. (2013)) y mirEx 2.0 (Zielezinski, Andrzej et al. "mirEX 2.0 - an Integrated Environment for Expression Profiling of Plant microRNAs". BMC Plant Biology 15 (2015): 144. PMC. Web. 15 de septiembre de 2018).

Usando herramientas disponibles públicamente, se puede generar una lista de potentes secuencias de ARNpi específicas de la diana. Los miARN pueden alinearse contra las potentes secuencias de ARNpi y pueden elegirse los miARN más homólogos. Los miARN filtrados pueden tener una secuencia similar en la misma orientación que los ARNpi potentes.

Modificar las secuencias de miARN naturalmente maduras, que se califican para tener una alta homología con los ARNpi potentes específicos de la diana, para que coincida perfectamente con la secuencia de la diana. Esta modificación puede ocurrir en una cadena de miARN madura con la homología de diana más alta (por ejemplo, podría ser la guía de miARN original o la cadena pasajera). Este 100 % complementario a la diana puede potencialmente convertir la secuencia de miARN en un ARNpi.

La GE mínima puede lograrse filtrando secuencias de miARN con alta homología natural (complemento inverso) con la diana.

Uso de los genes de miARN modificados primarios para generar oligos de ADNmc (por ejemplo, ADNmc de 200-500 nt de longitud) y fragmentos de ADNbc (por ejemplo, fragmentos de 250-5000 nt de ADNbc solo o clonados dentro de plásmidos) en función de las secuencias de ADN genómico que flanquean la secuencia precursora de miARN modificada (pre-miARN). La secuencia de la cadena guía (cadena silenciadora) del miARN modificado puede diseñarse para que sea 100 % complementaria a la diana.

Modificar la secuencia de la otra región del gen de miARN para preservar el precursor del miARN original (no modificado) y la estructura madura, manteniendo el mismo perfil de apareamiento de bases.

Diseñar ARNgc para dirigirse específicamente al gen de miARN original no modificado (específico de los loci genómicos de miARN) y no a la versión modificada (es decir, las secuencias de oligo/fragmento).

Analizar el sitio de la enzima de restricción comparativa entre el gen de miARN modificado y el original y resumir los sitios de restricción diferenciales. Dicho sistema de detección se basa en la PCR seguida de digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel.

Validar como se ha tratado con detalle anteriormente.

Examinar la direccionalidad del ARN no codificante hacia otras dianas (por ejemplo, "efecto fuera de la diana"), usando métodos in silico, cuando el ARN no codificante endógeno (por ejemplo, miARN) comprende una alta homología natural con la diana (por ejemplo, un 60-90 %), para obtener un silenciamiento específico de la diana de interés. Modificar mínimamente el ARN no codificante endógeno (por ejemplo, miARN) para aumentar su potencia para silenciar la diana de interés.

Validación del resultado de GEiGS de los genes de miARN primarios mínimamente editados para generar miARN candidatos refinados mínimamente editados. Un resultado primario de GEiGS experimentalmente efectivo (los genes de miARN primarios mínimamente editados) se considera miARN con una cadena guía o pasajera que se modifica para que coincida con la diana en un 100 %.

Generar varias secuencias de cadenas guía o pasajeras que se revierten gradualmente a la secuencia original (como se ilustra en la Figura 11).

Mantener la secuencia semilla de manera que haya al menos 5 coincidencias de los siete nucleótidos semilla (nucleótidos 2-8 desde el extremo 5').

Probar los diversos genes de miARN candidatos refinados mínimamente editados para la eficiencia de silenciamiento de la diana. Elegir la inactivación mediada por el gen GE proporciona el silenciamiento más alto con la modificación mínima de la secuencia de miARN.

Probar posibles "efectos fuera de la diana" de candidatos refinados de miARN mínimamente editados. Una predicción significativa de "efectos fuera de la diana" afecta a la evaluación final de los genes de miARN refinados mínimamente editados.

Probar los candidatos a genes de miARN mínimamente editados menos refinados en función de la validación experimental.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.

Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugaciones significan "que incluye pero sin limitación".

La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura puede incluir ingredientes adicionales, etapas y/o partes, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el método o la estructura reivindicadas.

Como se utiliza en el presente documento, la forma en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible sobre el alcance de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha desvelado específicamente todos los posibles subintervalos así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las expresiones "que varía/varía entre" un primer número indicador y un segundo número indicador y "que varía/varía de" un primer número indicador "a" un segundo número indicador se usan indistintamente en el presente documento y se entiende que incluyen los números indicadores primero y segundo, y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada incluyendo, pero sin limitación, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos tanto conocidos como desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los especialistas de las ciencias químicas, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresión de una afección, aliviar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. En cambio, diversas características de la invención, que por razones de brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se han delineado anteriormente en el presente documento y como se reivindica más adelante en la sección de reivindicaciones encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Se entiende que cualquier número de identificación de secuencia (SEQ ID NO) desvelado en la presente solicitud puede referirse a una secuencia de ADN o una secuencia de ARN, dependiendo del contexto donde se menciona ese SEQ ID NO, incluso si ese SEQ ID NO se expresa solo en un formato de secuencia de ADN o en un formato de secuencia de ARN. Por ejemplo, los SEQ ID NO: 1-4 se expresan en un formato de secuencia de ADN (por ejemplo, citar T para timina), pero puede referirse a una secuencia de ADN que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de ARNg o a la secuencia de ARN de una secuencia de ácido nucleico de molécula de ARN. De forma análoga, aunque algunas secuencias se expresan en un formato de secuencia de ARN (por ejemplo, citar U para uracilo), dependiendo del tipo real de la molécula que se describe, puede referirse a la secuencia de una molécula de ARN que comprende un ARNbc o a la secuencia de una molécula de ADN que corresponde a la secuencia de ARN que se muestra. En cualquier caso, se contemplan moléculas tanto de ADN como de ARN que tienen las secuencias desveladas con cualquier sustituto.

Ejemplos

A continuación se hace referencia a los siguientes ejemplos.

En general, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías expuestas en las patentes de los Estados Unidos n.° 4666828; 4.683.202; 4.801.531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); se describen ampliamente inmunoensayos disponibles en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo del presente documento. Se cree que los procedimientos de las mismas son bien conocidos en la materia y se proporcionan para la comodidad del lector.

MATERIALES GENERALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Cultivo de células de Arabidopsis

Los cultivos de células de Arabidopsis thaliana (ecotipo Landsberg erecta) se mantuvieron en 100 ml de medio de cultivo líquido (4,4 g/l de sales de Murashige y Skoog (MS) con vitaminas [Duchefa, Haarlem, Países Bajos], 30 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de ácido 1-naftalenoacético (NAA) y 0,5 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP) a 25 °C, fotoperíodo de 16 horas y agitación suave (100 rpm). Cada semana se transfirieron 6 ml de cultivo a medio nuevo.

Crecimiento de plantas

Las plántulas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Colombia-0) se esterilizaron superficialmente y se cultivaron en placas que contenían medio MS suplementado con 0,8 g/l de agar a 20 °C en un fotoperíodo de 16 horas.

Transformación estable del cultivo de células de Arabidopsis

Las Agrobacterium portadoras del plásmido pK7WGF2 se cultivaron en medio LB suplementado con 100 mg/l de espectinomicina a 28 °C hasta una Do de 0,8. Las bacterias se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en la misma cantidad de medio de cultivo de células vegetales. Cuatro días después de la transferencia a medio fresco, se incubaron 4 ml de células de Arabidopsis con 0,1 ml de la suspensión de Agrobacterium en una placa de Petri a 25 °C en oscuridad con agitación suave (130 rpm). Después de 48 horas, las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron cinco veces con medio de cultivo celular para eliminar la mayor parte de las bacterias. Por último, las células se resuspendieron en 2 ml de medio de cultivo celular y las placas se colocaron en una placa de Petri que contenía medio de cultivo celular suplementado con Phytagel al 0,4 %, 500 mg/l de timenten y 50 mg/l de kanamicina. Las placas se almacenaron a 25 °C en oscuridad hasta que se observó la formación de callos, generalmente después de 2 o 3 semanas

Callos embriogénicos de plátano:

El callo embriogénico del banano se desarrolla a partir de un explante inicial, tal como flores masculinas inmaduras o punta de brote, como lo describe Ma [Ma S.S., Proceedings of Symposium on Tissue culture of horticultural crops, Taipei, Taiwán, 8-9 de marzo de 1988, pág. 181-188] y Schoofs [Schoofs H., The origin of embryogenic cells in Musa. PhD thesis, KULeuven, Bélgica (1997)]. Las suspensiones de células embriogénicas se inician a partir de callos altamente embriogénicos recién desarrollados en medio líquido. El 80 % del medio se refresca cada 12-14 días hasta que la suspensión celular iniciada se establece por completo (6-9 meses).

Callos embrionarios de café:

Los callos embrionarios de café se obtienen como se ha descrito previamente [Etienne, H., Protocol for somatic embryogenesis in woody plants (2005) Springer. pág. 167-1795]. Resumiendo, las hojas jóvenes se esterilizan superficialmente, se cortan en piezas de 1 cm2 y se colocan en medio MS semisólido de potencia media suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,26 pM (2,4-D), ácido indol-3-butírico (IBA) 4,92 pM e isopenteniladenina (iP) 9,84 pM durante un mes. A continuación, los explantes se transfieren a medio MS semisólido de potencia media que contiene 2,4-D 4,52 pM y 6-bencilaminopurina (6-BAP) 17,76 pM durante 6 a 8 meses hasta la regeneración de los callos embriogénicos. Los callos embriogénicos se mantienen en medios MS suplementados con 6-BAP 5 pM.

Los cultivos de suspensión celular se generan a partir de callos embriogénicos como se ha descrito previamente [Acuna, J.R. y M. de Pena, Plant Cell Reports (1991) 10(6): pág. 345-348]. Los callos embriogénicos (30 g/l) se colocan en medio MS líquido suplementado con 6-BAP 13,32 pM. Los matraces se colocan en una incubadora con agitación (110 rpm) a 28 °C. La suspensión celular se subcultiva/pasa cada dos a cuatro semanas hasta que se establece por completo. Los cultivos de suspensión celular se mantienen en medio MS líquido con 6-BAP 4,44 pM.

Canalización computacional para generar moldes de GEiGS

La canalización computacional de GEiGS aplica metadatos biológicos y permite una generación automática de moldes de ADN de GEiGS que se utilizan para editar mínimamente genes de ARN no codificantes (por ejemplo, genes de miARN), lo que conduce a una nueva ganancia de función. es decir, la redirección de su capacidad de silenciamiento a la secuencia diana de interés.

Como se ilustra en la figura 9, la canalización comienza con el llenado y el envío de entrada: a) secuencia diana que se va a silenciar mediante GEiGS; b) el organismo huésped para ser editado genéticamente y para expresar el GEiGS; c) se puede elegir si el GEiGS se expresaría de forma ubicua o no. Si se requiere una expresión GEiGS específica, se puede elegir entre algunas opciones (expresión específica de un determinado tejido, etapa de desarrollo, estrés, choque de calor/frío, etc.).

Cuando se envían todas las entradas requeridas, el proceso computacional comienza con la búsqueda entre conjuntos de datos de miARN (por ejemplo, secuenciación de ARN pequeño, micromatrices, etc.) y filtrado de solo los miARN relevantes que coinciden con los criterios de entrada. A continuación, las secuencias de miARN maduras seleccionadas se alinean contra la secuencia diana y se filtran los miARN con los niveles complementarios más altos. Estas secuencias de miARN maduras naturalmente complementarias a la diana se modifican luego para que coincidan perfectamente con la secuencia de la diana. Después, las secuencias de miARN maduras modificadas se pasan por un algoritmo que predice la potencia del ARNpi y se filtran las 20 principales con la puntuación de silenciamiento más alta. Estos genes de miARN modificados finales se utilizan luego para generar secuencias de ADNmc de 200-500 nt o 250-5000 nt de longitud de la siguiente manera:

los oligos de ADNmc de 200-500 nt y los fragmentos de ADNbc de 250-5000 nt se diseñan en función de la secuencia de ADN genómico que flanquea el miARN modificado. La secuencia de pre-miARN se encuentra en el centro del oligo. La secuencia de la cadena guía (silenciamiento) del miARN modificado es 100 % complementaria a la diana. Sin embargo, la secuencia de la cadena de miARN pasajero modificada se modifica aún más para preservar la estructura de miARN original (sin modificar), manteniendo el mismo perfil de apareamiento de bases.

A continuación, los ARNgc diferenciales están diseñados para dirigirse específicamente al gen de miARN original no modificado y no a la versión de intercambio modificada. Por último, se realiza un análisis comparativo del sitio de la enzima de restricción entre el gen de miARN modificado y el original y se resumen los sitios de restricción diferenciales.

Por lo tanto, la salida de la canalización incluye:

a) Secuencia de fragmento de ADNbc ce 200-500 nt u oligo ADNmc de 250-5000 nt con miARN mínimamente modificado

b) 2-3 ARNgc diferenciales que se dirigen específicamente al gen miARN original y no al modificado c) Lista de sitios de enzimas de restricción diferenciales entre el gen de miARN modificado y original

Genes diana

Gen de la fitoeno desaturasa (PDS

Fundamento:

El PDS es un gen esencial en la ruta de la biosíntesis de la clorofila y la pérdida de la función del PDS en las plantas da como resultado un fenotipo albino [Fan et al., Sci Rep (2015) 5:12217]. Cuando se utiliza como gen diana en la estrategia de edición del genoma (GE) o ARNi, las plantas editadas positivamente se identifican fácilmente por la pérdida parcial o total de clorofila en las hojas y otros órganos (blanqueamiento).

Métodos:

se eligen miARN con un perfil de expresión ubicuo (depende de la aplicación, se pueden elegir miARN con un perfil de expresión específico para un determinado tejido, etapa de desarrollo, temperatura, estrés, etc.).

Los miARN se modifican a ARNpi dirigidos al gen de PDS de Arabidopsis (véase la Tabla 1A, a continuación). Después de la transfección y la clasificación con FACS (se usan RFP/GFP para identificar eventos de transfección Cas9/ARNgc positivos), las protocolonias (o callos) se transfieren a medios de regeneración sólidos (MS de potencia media vitaminas B5, 20 g/l de sacarosa, 0,8 % de agar) hasta que se regeneren los brotes. La pérdida de pigmentación en estos brotes indica pérdida de función del gen PDS y GE correcta. No se observa ningún fenotipo albino en las plántulas de control transfectadas con una secuencia aleatoria portadora de oligo.

Gen de la proteína fluorescente verde (GFP)

Fundamento:

La GFP es una proteína compuesta por 238 restos de aminoácido (26,9 kDa) que exhibe una fluorescencia verde brillante cuando se expone a la luz en el rango azul a ultravioleta. Aunque muchos otros organismos marinos tienen proteínas fluorescentes verdes similares, GFP tradicionalmente se refiere a la proteína aislada por primera vez de la medusa Aequorea victoria. La GFP de A. victoria tiene un pico de excitación mayor a una longitud de onda de 395 nm y uno menor a 475 nm. Su pico de emisión está a 509 nm, que está en la porción verde inferior del espectro visible. El rendimiento cuántico de fluorescencia (QY) de GFP es 0,79. La GFP del pensamiento de mar (Renilla reniformis) tiene un solo pico de excitación principal a 498 nm. GFP es una herramienta excelente en muchas áreas de la biología debido a su capacidad para formar cromóforos internos sin necesidad de cofactores accesorios, productos génicos o enzimas/sustratos distintos del oxígeno molecular.

Métodos:

se eligen miARN con un perfil de expresión ubicua (depende de la aplicación, se pueden elegir miARN con un perfil de expresión específico para un determinado tejido, etapa de desarrollo, temperatura, estrés, etc.).

Los miARN se modifican en ARNpi dirigidos al gen GFP (véase la Tabla 1A, a continuación). Después de la transfección, se realiza clasificación mediante FACS, aislamiento de protoplastos que expresan mCherry (mCherry se utiliza para identificar eventos de transfección positivos de Cas9/ARNgc) sin señal de GFP o con una señal baja. En el control (oligo con secuencia de ARNpi no diana), todos los protoplastos expresan mCherry y GFP. A continuación, el protoplasto GE candidato con éxito (mCherry positivo y GFP negativo) se regenera en plantas para análisis adicionales. Los protoplastos también se documentan cualitativamente bajo el microscopio. Para el análisis de cuantificación y proporciones se utilizó análisis FACS.

T l 1A: ID n i n

Diseño de ARNpi

Los ARNpi específicos de la diana están diseñados por diseñadores de ARNpi disponibles públicamente, como "BLOCK-iT™ RNAi Designer" de ThermoFisher Scientific y "Find siRNA sequences" de Invivogen.

Diseño de ARNgc

Los ARNgc están diseñados para apuntar a los genes endógenos de miARN utilizando el diseñador de ARNgc disponible públicamente, como se han descrito anteriormente en Park et al., Bioinformatics (2015) 31(24): 4014-4016. Se diseñan dos ARNgc para cada casete, pero se expresa un solo ARNgc por célula para iniciar el intercambio de genes. Los ARNgc corresponden a la secuencia pre-miARN que se modifica después del intercambio.

Con el fin de maximizar la posibilidad de una elección eficiente de ARNgc, se usan dos algoritmos diferentes disponibles públicamente (CRISPER Design: www(dot)crispr(dot)mit(dot)edu:8079/ and CHOPCHOP: www(dot)chopchop(dot)cbu(dot)uib(dot)no/) y se selecciona el ARNgc de mayor puntuación de cada algoritmo.

Intercambio de diseño de oligo ADNmc:

El oligo ADNmc de 400 b se diseña en función de la secuencia de ADN genómico del gen miARN. La secuencia de pre-miARN se encuentra en el centro del oligo. A continuación, las secuencias de ARNpi de doble cadena se intercambian con las secuencias de miARN maduras de manera que la cadena de ARNpi guía (silenciadora) se mantiene 100 % complementaria a la diana. La secuencia de la cadena de ARNpi pasajero se modifica para preservar la estructura original de miARN, manteniendo el mismo perfil de apareamiento de bases.

Diseño de ADN plasmídico de intercambio

El fragmento de ADNbc de 4000 pb se diseña en función de la secuencia de ADN genómico del gen miARN. La secuencia de pre-miARN se encuentra en el centro del fragmento de ADNbc. A continuación, las secuencias de ARNpi de doble cadena se intercambian con las secuencias de miARN maduras de manera que la cadena de ARNpi guía (silenciadora) se mantiene 100 % complementaria a la diana. La secuencia de la cadena de ARNpi pasajero se modifica para preservar la estructura original de miARN, manteniendo el mismo perfil de apareamiento de bases. Por último, el fragmento se clona en un vector estándar (por ejemplo, pBluescript).

Plásmidos largos para intercambio:

Plásmido-1: GEiGS_mir173_si-GFP_1 (SEQ ID NO: 31)

Plásmido-2: GEiGS_mir173_si-GFP_2 (SEQ ID NO: 32)

Plásmido-3: GFiGS_mir173_si-PDS_1 (SEQ ID NO: 33)

Plásmido-4: GEiGS_mir173_si-PDS_2 (SEQ ID NO: 34)

Plásmido-5: GEiGS_mir390a_si-GFP_1 (SEQ ID NO: 35)

Plásmido-6: GEiGS_mir390a _si-GFP_2 (SEQ ID NO: 36)

Plásmido-7:GEiGS_mir390a_si-PDS_1 (SEQ ID NO: 37)

Plásmido-8: GEiGS_mir390a _si-PDS2 (SEQ ID NO: 38)

Secuencias de ARNgc:

mir-390A de Arabidopsis:

1. CTATCCATCCTGAGTTTCATTGG (SEQ ID NO: 1);

2. AAGAATCTGTAAAGCTCAGGAGG (SEQ ID NO: 2);

mir-173 de Arabidopsis:

1. CTTGCAGAGAGAAATCACAGTGG (SEQ ID NO: 3);

2. GCTTACACAGAGAATCACAGAGG (SEQ ID NO: 4);

Lista de miARN endógenos que se intercambian:

1. mir-390A de Arabidopsis

2. mir-173 de Arabidopsis

Oligos de ADNmc utilizados para el intercambio de genes:

Oligo-1: GEiGS_mir173_si-GFP_1 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 5)

Oligo-2: GEiGS_mir173_si-GFP_2 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 6)

Oligo-3: GEiGS_mir173_si-PDS_1 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 7)

Oligo-4: GEiGS_mir173_si-PDS_2 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 8)

Oligo-5: GEiGS_mir390a_si-GFP_1 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 9)

Oligo-6: GEiGS_mir390a_si-GFP2 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 10)

Oligo-7: GEiGS_mir390a_si-PDS_1 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 11)

Oligo-8: GEiGS_ mir390a_si-PDS2 (5' ^ 3') (SEQ ID NO: 12)

Clonación de ARNgc

El plásmido de transfección utilizado estaba compuesto por 4 módulos que comprenden de

1) mCherry dirigido por el promotor CsVMV terminado por una secuencia de terminación G7;

2) 2 x 35S::hCas9-35S-ter, es decir, hCas9 dirigido por el promotor 35S terminado por la secuencia de terminación AtuNos;

3) el promotor sintético AtU6-26 y/o U6 que dirige el ARNgc para la guía 1;

Diseño del plásmido

Para la expresión transitoria, se utiliza un plásmido que contiene tres unidades transcripcionales. La primera unidad transcripcional contiene el promotor CsVMV que dirige la expresión de mCherry y el terminador G7. La siguiente unidad transcripcional consiste en la expresión de Cas9 y el terminador 35S que dirigen el promotor 2x-35S. El tercero contiene el promotor U6 de Arabidopsis que expresa ARNgc para apuntar a genes de miARN (cada vector comprende un único ARNgc).

Diseño y clonación de CRISPR/CAS9 para apuntar a miR-173 y miR-390 e introducción de INTERCAMBIO para apuntar a GFP, AtPDS3 y AtADH1

Los presentes inventores han diseñado cambios en las secuencias de miR-173 y miR-390 maduros, en su contexto genómico, para apuntar a GFP, AtPDS3 o AtADHI, al producir un pequeño ARN que invierte los complementos de los genes diana, visualizado en las Figuras 12A-G y 13A-G. Además, para mantener la estructura secundaria del transcrito precursor de miARN, se llevaron a cabo más cambios en el pri-miARN, como se especifica en las Figuras 12A-G, 13A-G, 14A-D y 15A-D y la Tabla 2 (más adelante). Estos fragmentos se clonaron en plásmidos PUC y se denominaron DONANTES y los fragmentos de ADN se denominan INTERCAMBIO. Para secuencias para modificar miR-173 -INTERCAMBIO1 e INTERCAMBIO 2 para apuntar a GFP, INTERCAMBIO3 y INTERCAMBIO4 para apuntar a AtPDS3 y INTERCAMBIO9 y INTERCAMBIO10 para apuntar a AtADH1 (véase la Tabla 2 a continuación). Para secuencias para modificar miR-390 - INTERCAMBIO5 y INTERCAMBIO6 para apuntar a GFP, ⁱN^t ERCAMBIO7 y INTERCAMBIO8 para apuntar a AtPDS3 y INTERCAMBIO11 y INTERCAMBIO12 para apuntar a AtADH1 (véase la Tabla 2 a continuación).

Los ARN guía dirigidos a miR-173 y miR-390 se introdujeron en el sistema de vector CRISPR/CAS9 para generar una escisión de ADN en los loci de miARN deseados. Estos se introdujeron conjuntamente en las plantas con los vectores DONANTES a través del protocolo de bombardeo de genes, para introducir las modificaciones deseadas a través de la reparación del ADN homólogo (HDR). Estos ARN guía se especifican en la Tabla 2, más adelante y se ilustran en las Figuras 12A y 13A.

T l 2: n i li iliz n l x rim n

continuación

Aislamiento de protoplastos

Los protoplastos se aislaron incubando material vegetal (por ejemplo, hojas, callos, suspensiones celulares) en una solución de digestión (1 % de celulasa, 0,5 % de macroenzima, 0,5 % de driselasa, manitol 0,4 M, NaCl 154 mM, KCl 20 mM, MES 20 mM pH 5,6, CaCb 10 mM) durante 4-24 horas a temperatura ambiente y agitación suave. Después de la digestión, el material vegetal restante se lavó con solución W5 (NaCl 154 mM, CaCb 125 mM, KCl 5 mM, MES 2 mM pH 5,6) y la suspensión de protoplastos se filtró a través de un filtro de 40 pm. Después de centrifugar a 80 g durante 3 minutos a temperatura ambiente, los protoplastos se resuspendieron en 2 ml de tampón W5 y se precipitaron por gravedad en hielo. El precipitado final de protoplastos se resuspendió en 2 ml de MMg (manitol 0,4 M, MgCb 15 mM, MES 4 mM pH 5,6) y la concentración de protoplastos se determinó usando un hemocitómetro. La viabilidad de los protoplastos se estimó mediante tinción con azul tripán.

Transfección de plásmido mediada por polietilenglicol (PEG)

La transfección de protoplastos con PEG se efectuó usando una versión modificada de la estrategia publicada por Wang [Wang et al., Scientia Horticultura (2015) 191: pág. 82-89]. Los protoplastos se resuspendieron a una densidad de 2-5 x 106 protoplastos/ml en solución de MMg. Se añadieron 100-200 pl de suspensión de protoplastos a un tubo que contenía el plásmido. La relación plásmido:protoplasto afecta en gran medida a la eficiencia de la transformación, por lo tanto, se analizó un intervalo de concentraciones de plásmido en suspensión de protoplasto, 5-300 pg/pl. Se añadió solución de PEG (100-200 pl) a la mezcla y se incubó a 23 °C durante varios períodos de tiempo que oscilaron entre 10 y 60 minutos. Se optimizó la concentración de PEG4000, se analizó un intervalo de 20-80 % de PEG4000 en manitol 200-400 mM, solución de CaCb 100-500 mM. A continuación, los protoplastos se lavaron en W5 y se centrifugaron a 80 g durante 3 minutos, previa resuspensión en 1 ml de W5 e incubación en oscuridad a 23 °C. Después de la incubación durante 24-72 horas, se detectó la fluorescencia por microscopia.

Clasificación FACS de células que expresan proteínas fluorescentes

24-72 horas después de la liberación del plásmido/ARN, las células se recolectaron y clasificaron para la expresión de proteínas fluorescentes usando un citómetro de flujo para enriquecer las células que expresan mCherry/Agente de edición como se ha descrito previamente [Chiang et al., Sci Rep (2016) 6: 24356]. Esta etapa de enriquecimiento permite eludir la selección con antibióticos y recolectar solo células que expresan transitoriamente la proteína fluorescente, Cas9 y el ARNgc. Estas células pueden someterse a pruebas adicionales para la edición del gen diana mediante HR, lo que produce eventos de intercambio exitosos y la pérdida de la expresión génica correspondiente.

Bombardeo y regeneración de plantas

Preparación de raíz de Arabidopsis:

Se sembraron semillas de Arabidopsis esterilizadas con gas cloro (cv. Col-0) en placas MS sin sacarosa y se vernalizaron durante tres días en oscuridad a 4 °C, seguido de germinación vertical a 25 °C con luz constante. Después de dos semanas, las raíces se extirparon en segmentos de raíz de 1 cm y se colocaron en placas con medio inductor de callos (MIC: 1/2 MS con vitaminas B5, glucosa al 2 %, pH 5,7, 0,8 % de agar, 2 mg/l de IAA, 0,5 mg/l de 2,4-D, 0,05 mg/l de kinetina). Después de seis días de incubación en la oscuridad, a 25 °C, los segmentos de raíz se transfirieron a discos de papel de filtro y se colocaron en placas CIMM, (1/2 MS sin vitaminas, glucosa al 2 %, manitol 0,4 M, pH 5,7 y 0,8 % de agar) durante 4-6 horas, en preparación para el bombardeo.

Bombardeo

Las construcciones de plásmidos se introdujeron en el tejido de la raíz a través de PDS-1000/He Particle Delivery (Bio-Rad; PDS-1000/He System n.°1652257), se requirieron varias etapas preparatorias, descritas más adelante, para llevar a cabo este procedimiento.

Preparación de reserva de oro

Se mezclaron 40 mg de oro de 0,6 pm (Bio-Rad; n.° de cat: 1652262) con 1 ml de etanol al 100 %, se centrifugaron en pulsos hasta

obtener el sedimento y se retiró el etanol. Este procedimiento de lavado se repitió otras dos veces.

Una vez lavado, el sedimento se resuspendió en 1 ml de agua destilada estéril y se dispensó en tubos de 1,5 ml de volúmenes de trabajo alícuotas de 50 pl.

Preparación de perlas

En resumen, se realizó lo siguiente:

Un solo tubo era oro suficiente para bombardear 2 placas de raíces de Arabidopsis, (2 brotes por placa), por lo tanto, cada tubo se distribuyó entre 4 (1100 psi) discos de rotura biolística (Bio-Rad; n.° de cat: 1652329).

Los bombardeos que requieren múltiples placas de la misma muestra, los tubos se combinaron y los volúmenes de mezcla de ADN y CaCb/espermidina se ajustaron en consecuencia, para mantener la consistencia de la muestra y minimizar las preparaciones generales.

El siguiente protocolo resume el proceso de preparación de un tubo de oro, estos deben ajustarse de acuerdo con el número de tubos de oro utilizados.

Todos los procesos posteriores se llevaron a cabo a 4 °C en un termomezclador Eppendorf.

Se prepararon muestras de ADN plasmídico, comprendiendo cada tubo 11 pg de ADN añadido a una concentración de 1000 ng/pl

1) Se añadieron 493 pl de ddH2O a 1 alícuota (7 pl) de espermidina (Sigma-Aldrich; S0266), dando una concentración final de espermidina 0,1 M. Se añadieron 1250 pl de CaCb 2,5 M a la mezcla de espermidina, se agitó y se colocó en hielo.

2) Se colocó un tubo de oro previamente preparado en la termomezcladora y se hizo girar a una velocidad de 1400 rpm.

3) Se añadieron 11 |jl de ADN al tubo, se agitó y se volvió a colocar en la termomezcladora giratoria.

4) Para la unión, la mezcla de ADN/partículas de oro, 70 j l de espermidina CaCb se añadió a cada tubo (en el termomezclador).

5) Los tubos se agitaron enérgicamente durante 15-30 segundos y se colocaron en hielo durante aproximadamente 70 a 80 segundos.

6) La mezcla se centrifugó durante 1 minutos a 7000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se colocó en hielo.

7) Se añadieron 500 j l de etanol al 100 % a cada tubo y el sedimento se resuspendió mediante pipeteo y agitación vorticial.

8) Los tubos se centrifugaron a 7000 rpm durante 1 minuto.

9) Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 50 j l de etanol al 100 % y se almacenó en hielo.

Preparación de macroportadores

En una campana de flujo laminar se realizó lo siguiente:

1) Los macroportadores (Bio-Rad; 1652335), pantallas de parada (Bio-Rad; 1652336) y los portadiscos macroportadores se esterilizaron y se secaron.

2) Los macroportadores se colocaron en plano en los soportes de discos de macroportadores.

3) La mezcla de oro recubierta de ADN se agitó y se esparció (5 j l) sobre el centro de cada disco Biolistic Rupture.

Se dejó evaporar el etanol.

PDS-1000 (Sistema de liberación de partículas de helio)

En resumen, se realizó lo siguiente:

La válvula reguladora de la botella de helio se ajustó a una presión de entrada de al menos 1300 psi. El vacío se creó presionando el interruptor vac/vent/ret y manteniendo presionado el interruptor de encendido durante 3 segundos. Esto aseguró que el helio se purgara en las tuberías.

Se colocaron discos de rotura de 1100 psi en isopropanol y se mezclaron para eliminar la estática.

1) Se colocó un disco de rotura en la tapa de retención del disco.

2) Se construyó el conjunto de lanzamiento del microportador (con una pantalla de parada y un microportador que contiene oro).

3) Se colocó callo de la raíz de Arabidopsis en placas de Petri de 6 m por debajo del conjunto de lanzamiento. 4) La presión de vacío se ajustó a 27 pulgadas de Hg (mercurio) y se abrió la válvula de helio (a aproximadamente 1100 psi).

5) Se liberó el vacío; se retiraron el conjunto de lanzamiento del microportador y la tapa de retención del disco de rotura.

6) Bombardeo sobre el mismo tejido (es decir, cada placa se bombardeó 2 veces).

7) Las raíces bombardeadas se colocaron posteriormente en placas MIC, en la oscuridad, a 25 °C, durante 24 horas adicionales.

Co-bombardeos

Al bombardear las combinaciones de plásmidos GEiGS, se mezclaron 5 jg (1000 ng/jl) del plásmido ARNgc con 8,5 jg (1000 ng/jl) de plásmido de intercambio y se añadieron 11 j l de esta mezcla a la muestra. Si se bombardea con más plásmidos GEiGS al mismo tiempo, la proporción de concentración de plásmidos de ARNgc y plásmidos de intercambio utilizados fue de 1:1,7 y se añadieron a la muestra 11 jg (1000 ng/jl) de esta mezcla. Si se co-bombardea con plásmidos no asociados con el intercambio de GEiGS, se mezclaron proporciones iguales y se añadieron 11 jg (1000 ng/jl) de la mezcla a cada muestra.

Regeneración de plantas

Para la regeneración de brotes, se llevó a cabo el protocolo modificado de Valvekens et al. D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1988) 85(15): 5536-5540]. Las raíces bombardeadas se colocaron en placas de medios de inducción de brotes (SIM), que incluía 1/2 MS con vitaminas B5, glucosa al 2 %, pH 5,7, 0,8 % de agar, 5 mg/l de 2 iP, 0,15 mg/l de IAA. Las placas se dejaron en ciclos de 16 horas de luz a 25 °C-8 horas de oscuridad a 23 °C. Después de 10 días, las placas se transfirieron a placas MS con sacarosa al 3 %, agar al 0,8 % durante una semana, luego se transfirieron a placas similares nuevas. Una vez regeneradas las plantas, se extirparon de las raíces y se colocaron en placas MS con sacarosa al 3 %, agar al 0,8 %, hasta su análisis.

Formación de colonias y regeneración de plantas

Las células positivas para proteína fluorescente se muestrearon en parte y se usaron para la extracción de ADN y las pruebas de edición del genoma (GE) y se sembraron en placas parcialmente a alta dilución en medio líquido para permitir la formación de colonias durante 28-35 días. Se recogieron las colonias, se cultivaron y se dividieron en dos alícuotas. Se usó una alícuota para la extracción de ADN y la prueba de edición del genoma (GE) y la prueba libre de ADN CRISPR (véase más adelante), mientras que los demás se mantuvieron en cultivo hasta que se verificó su estado. Solo se seleccionaron los que mostraban claramente estar libres de ADN de GE y CRISPR. Las colonias se cultivaron en medio de cultivo durante aproximadamente 6-10 semanas. Las protocolonias (o callos) se subcultivaron en medios de regeneración (por ejemplo, vitaminas MS B5 de potencia media, 20 g/l de sacarosa). Las plántulas regeneradas se colocaron en medio solidificado (agar al 0,8 %) con una intensidad de luz baja a 28 °C. Después de 2 meses, las plántulas se transfirieron al suelo y se colocaron en un invernadero a 80-100 % de humedad.

Inoculación de virus y liberación de ADN a plántulas de Arabidopsis

La savia de las hojas de Arabidopsis infectadas con el clon infeccioso p35S::TuMV-GFP de TuMV (0,1 mg/ml) se usa para inoculaciones mecánicas.

Propagación de plantas

Los clones que se secuenciaron y se predijo que habían perdido la expresión de los genes diana y se observó que estaban libres del ADN/ARN del sistema CRISPR se propagaron para su generación en grandes cantidades y, en paralelo, se diferenciaron para generar plántulas a partir de las cuales se realiza un ensayo funcional para evaluar el rasgo deseado.

Análisis fenotípico

Como se ha descrito anteriormente, tal como observando la pigmentación, la fluorescencia o la morfología dependiente del gen diana.

Selección de alcohol alílico

Para la selección de plantas con alcohol alílico, 10 días después del bombardeo, las raíces se colocaron en medios SIM. Las raíces se sumergieron en alcohol alílico 30 mM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 2 horas. Luego, las raíces se lavaron tres veces con medio MS y se colocaron en placas MS con sacarosa al 3 %, 0,8 % de agar. El proceso de regeneración se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.

Genotipos

Las muestras de tejido se trataron y los amplicones se amplificaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. MyTaq Plant-PCR Kit (BioLine BIO 25056) para amplificación interna corta y Phire Plant Direct PCR Kit (Thermo Scientific; F-130WH) para amplificaciones externas más largas. Los oligos utilizados para estas amplificaciones se especifican en la Tabla 2, anteriormente. Se identificaron diferentes modificaciones en los loci de miARN a través de diferentes patrones de digestión de los amplicones, de la siguiente manera:

Para las modificaciones de miR-390, el amplicón interno tenía una longitud de 978 pares de bases y para la amplificación externa, 2629 pares de bases. Para la identificación del swap 7, la digestión con NlaIII resultó en un tamaño de fragmento de 636 pares de bases, mientras que en la versión sv se dividió en 420 y 216 fragmentos largos. Para la identificación del swap 8, la digestión con Hpy188I dio como resultado fragmentos de 293 y 339 pares de bases, mientras que en la versión sv este sitio estaba ausente y dio como resultado un fragmento de 632 de longitud. Para la preparación de los intercambios 11 y 12, la digestión con BccI dio como resultado un tamaño de fragmento de 662 pares de bases, mientras que en la versión sv se dividió en 147 y 417 fragmentos largos.

Para las modificaciones de miR-173, el amplicón interno tenía una longitud de 574 pares de bases, y para la amplificación externa anidada, tenía 466 pares de bases. Para la identificación del swap 3, la digestión con BslI dio como resultado fragmentos de 217 y 249 pares de bases en el amplicón externo y 317 y 149 en el interno. En la versión sv, este sitio estaba ausente y dio como resultado un fragmento de 466 de longitud en el amplicón externo y 574 en la reacción interna. Para la identificación del swap 4, la digestión con BtsaI dio como resultado fragmentos de 212 y 254 pares de bases en el amplicón externo y de 212 y 362 en el interno. En la versión sv, este sitio estaba ausente y dio como resultado un fragmento de 466 de longitud en el amplicón externo y 574 en la reacción interna. Para la identificación del swap 9, la digestión con NlaIII dio como resultado fragmentos de 317 y 149 pares de bases en el amplicón externo y de 317 y 244 en el interno. En la versión sv, este sitio estaba ausente y dio como resultado un fragmento de 466 de longitud en el amplicón externo y 561 en la reacción interna. Para la identificación del swap 10, la digestión con NlaIII dio como resultado fragmentos de 375 y 91 pares de bases en el amplicón externo y de 375 y 186 en el interno. En la versión sv, este sitio estaba ausente y dio como resultado un fragmento de 466 de longitud en el amplicón externo y 561 en la reacción interna.

Aislamiento de ADN y ARN

Las muestras se recogieron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento. La trituración del tejido se llevó a cabo en tubos colocados en hielo seco, utilizando morteros trituradores de tejidos de plástico (Axygen, EE.UU). El aislamiento de ADN y ARN total del tejido molido se llevó a cabo utilizando el kit de purificación de ARN/ADN (cat. 48700; Norgen Biotek Corp., Canadá), según las instrucciones del fabricante. En el caso de una relación 260/230 baja (< 1,6), de la fracción de ARN, el ARN aislado se precipitó durante la noche a -20 °C, con 1 pl de glucógeno (cat. 10814010; Invitrogen, EE. UU.) acetato de sodio al 10 % v/v, 3 M pH 5,5 (cat. AM9740, Invitrogen, EE. UU.) y 3 veces el volumen de etanol. La solución se centrifugó durante 30 minutos a máxima velocidad, a 4 °C. A esto le siguieron dos lavados con etanol al 70 %, secado al aire durante 15 minutos y resuspensión en agua libre de Nucleasa (cat. 10977035; Invitrogen, EE.UU.).

Transcripción inversa (RT) y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Se trató un microgramo de ARN total aislado con ADNasa I según el manual del fabricante (AMPD1; Sigma-Aldrich, EE.UU.). La muestra se transcribió inversamente, siguiendo el manual del instructor del kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (cat 4368814; Applied Biosystems, US).

Para la expresión génica, El análisis de PCR en tiempo real cuantitativo (qRT-PCR) se llevó a cabo en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch™ (BioRad, EE. UU.) y SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (S4438, Sigma-Aldrich, EE.UU.), según los protocolos del fabricante y se analizó con el programa administrador Bio-RadCFX (versión 3.1). Para el análisis de AtADHI (AT1G77120) se utilizó el siguiente conjunto de cebadores: Directo GTTGAGAGTGTTGGAGAAGGAG SEQ ID NO: 367 e inverso CTCGGTGTTGATCCTGAGAAG SEQ ID NO: 368; Para el análisis de AtPDS3 (AT4G14210), se utilizó el siguiente conjunto de cebadores: Directo GTACTGCTGGTCCTTTGCAG SEQ ID NO: 369 e inverso AGGAGCACTACGGAAGGATG SEQ ID NO: 370; Para el gen de calibración endógeno, se usó el gen de ARN ribosómico 18S (NC_037304) - Directo ACACCCTGGGAATTGGTTT SEQ ID NO: 371 e inverso GTATGCGCCAATAAGACCAC SEQ ID NO: 372.

EJEMPLO 1A

Silenciamiento génico inducido por edición del genoma (GEiGS)

Para diseñar oligos GEiGS, se requieren moléculas de ARN molde no codificantes (precursores) que se procesan y dan lugar a pequeñas moléculas de ARN silenciadoras derivadas (maduras). Se usaron dos fuentes de precursores y sus secuencias maduras correspondientes para generar oligos GEiGS. Para los miARN, las secuencias se obtuvieron de la base de datos miRBase [Kozomara, A. y Griffiths-Jones, S., Nucleic Acids Res (2014) 42: D68,ÁiD73]. Los precursores y maduros de ARNtasi se obtuvieron de la base de datos ARNtasidb [Zhang, C. et al, Bioinformatics (2014) 30: 1045,Ái1046].

Las dianas de silenciamiento se eligieron en diversos organismos huésped (véase la Tabla 1B, anteriormente). Se diseñaron ARNpi contra estas dianas usando el software siRNArules [Holen, T., RNA (2006) 12: 1620,Ái1625.]. Cada una de estas moléculas de ARNpi se usó para reemplazar las secuencias maduras presentes en cada precursor, generando oligos GEiGS "ingenuos". La estructura de estas secuencias ingenuas se ajustó para aproximarse lo más posible a la estructura del precursor de tipo salvaje utilizando el paquete ViennaRNA v2.6 [Lorenz, R. et al., ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology (2011) 6: 26]. Después del ajuste de la estructura, se calcularon el número de secuencias y los cambios de estructura secundaria entre el oligo de tipo salvaje y el modificado. Estos cálculos son esenciales para identificar oligos GEiGS potencialmente funcionales que requieren cambios de secuencia mínimos con respecto al tipo salvaje.

Se generaron pequeños ARN guía CRISPR/cas9 (ARNgc) contra los precursores de tipo salvaje utilizando el software CasOT [Xiao, A. et al., Bioinformatics (2014) 30: 1180,Ái 1182] (véase la Tabla 1B, anteriormente). Las ARNgc se seleccionaron cuando las modificaciones aplicadas para generar el oligo GEiGS afectan a la región PAM del ARNgc, haciéndolo ineficaz contra el oligo modificado.

EJEMPLO 1B

Silenciamiento génico de un gen vegetal endógeno - PDS

Con el fin de establecer un cribado de alto rendimiento para la evaluación cuantitativa del silenciamiento génico endógeno mediante el silenciamiento génico inducido por edición del genoma (GEiGS), los presentes inventores consideraron varios marcadores visuales potenciales. Los presentes inventores optaron por centrarse en los genes implicados en la acumulación de pigmentos, tales como los que codifican la fitoeno desaturasa (PDS). El silenciamiento de PDS provoca el fotoblanqueo (Figura 2B) que permite usarlo como robusta prueba de detección de plántulas después de la edición de genes como prueba de concepto (POC). Las Figuras 2A-C muestran un experimento representativo con plantas de N. benthamiana y Arabidopsis silenciadas para PDS. Las plantas muestran el fenotipo fotoblanqueador característico observado en plantas con cantidades disminuidas de carotenoides.

En el experimento POC, la elección de ARNpi se llevó a cabo del modo siguiente:

Para iniciar la maquinaria de ARNi en Arabidopsis o Nicotiana benthamiana contra el gen DE PDS usando la aplicación GEiGS, existe la necesidad de identificar ARNpi efectivo de 21-24 pb que se dirija a PDS. Se utilizan dos enfoques para encontrar secuencias activas de ARNpi: 1) selección de la bibliografía, dado que el silenciamiento de PDS es un ensayo bien conocido en muchas plantas, los presentes inventores están identificando secuencias cortas de ARNpi bien caracterizadas en diferentes plantas que podrían coincidir al 100 % con el gen en Arabidopsis o Nicotiana benthamiana. 2) Hay muchos algoritmos públicos que se utilizan para predecir qué ARNpi será eficaz para iniciar el silenciamiento génico de un gen determinado. Dado que las predicciones de estos algoritmos no son del 100 %, los presentes inventores están utilizando solo secuencias que son el resultado de al menos dos algoritmos diferentes.

Para utilizar secuencias de ARNpi que silencian el gen PDS, los presentes inventores los están intercambiando con una secuencia de gen de ARN no codificante endógeno conocido usando el sistema CRISPR/Cas9 (por ejemplo, cambiando una secuencia de miARN, cambiando una secuencia larga de ARNbc, creando ARN antisentido, cambiando el ARNt, etc.). Hay muchas bases de datos de ARN no codificante caracterizados, por ejemplo, miARN; los presentes inventores eligen varios ARN no codificantes endógenos conocidos de Arabidopsis o Nicotiana benthamiana, por ejemplo, miARN con diferentes perfiles de expresión (por ejemplo, baja expresión constitutiva, alta expresión, inducida en el estrés, etc.). Por ejemplo, para intercambiar la secuencia endógena de miARN con ARNpi dirigido al gen PDS, los presentes inventores usan el enfoque de HR (recombinación homóloga). Usando HR, se contemplan dos opciones: usando una secuencia oligo de ADNmc de donante de alrededor de 250-500 nt que incluye, por ejemplo, la secuencia de miARN modificada en el medio o usando plásmidos que llevan un inserto de 1 Kb - 4 Kb que es casi un 100 % idéntico al miARN que rodea el genoma de la planta excepto los 2 x 21 pb del miARN y el *miARN que se cambia a ARNpi del PDS (500-2000 pb aguas arriba y aguas abajo del ARNpi, como se ilustra en la Figura 1). La transfección incluye las siguientes construcciones: sensor CRISPR:Cas9/GFP para rastrear y enriquecer células transformadas positivas, ARNgc que guían a Cas9 para producir una rotura de doble cadena (DSB) que es reparada por HR dependiendo del vector/oligo de inserción. El vector/oligo de inserción contiene dos regiones continuas de homología que rodean el locus diana que se reemplazan (es decir, miARN) y se modifican para llevar la mutación de interés (es decir, ARNpi). Si se utiliza plásmido, la construcción dirigida comprende o está libre de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción y se usa como molde para la recombinación homóloga que finaliza con el reemplazo del miARN con el ARNpi de elección. Después de la transfección a protoplastos, se usa FACS para enriquecer eventos transfectados con Cas9/ARNgc, los protoplastos se regeneran en plantas y las plántulas blanqueadas se examinan y califican (véase la Figura 1). Como control, los protoplastos se transfectan con un oligo que lleva una secuencia de direccionamiento aleatoria que no es PDS. Se espera que las plantas editadas positivas produzcan secuencias de ARNpi dirigidas a PDS y, por lo tanto, el gen de PDS se silencia y las plántulas se ven blancas en comparación con el control sin ARNg. Es importante señalar que después del intercambio, el miARN editado aún se procesará como miARN porque se mantiene el perfil original de apareamiento de bases. Sin embargo, el miARN procesado recién editado tiene una alta complementariedad con la diana (por ejemplo, 100 %) y, por lo tanto, en la práctica, el ARN pequeño recién editado actuará como ARNpi.

EJEMPLO 2

Silenciamiento génico de transgén "endógeno" - GFP

Otro enfoque rápido y sólido para verificar la eficiencia de GEiGS es silenciar un transgén que también es un gen marcador como GFP (proteína fluorescente verde). Hay pocas opciones fáciles para evaluar la efectividad del silenciamiento de GFP en la célula, por ejemplo, análisis FACS, PCR y microscopia. Para mostrar la POC del silenciamiento de GFP usando GEiGS, los presentes inventores usan líneas transgénicas de Arabidopsis o tabaco que expresan de forma estable GFP. Los protoplastos de plantas que expresan GFP se usan con metodología GEiGS para modificar ARN no codificante endógeno, por ejemplo, miARN para actuar como ARNpi potente para iniciar el mecanismo de silenciamiento de ARN dirigido al gen GFP. Cabe esperar que las plantas editadas positivas estén silenciadas para la expresión de GFP como se ilustra en la Figura 3. Por otra parte, el silenciamiento de GFP en plantas está bien caracterizado y hay muchas secuencias de ARN corto (ARpi) disponibles que se pueden usar para iniciar el silenciamiento de GFP. Por lo tanto, para el intercambio de genes, los presentes inventores usan herramientas disponibles públicamente para generar ARNpi específico de GFP o usan moléculas de ARNpi conocidas disponibles en la bibliografía.

Para usar secuencias de ARNpi que silenciarán el gen de GFP, los presentes inventores los intercambian con una secuencia de gen de ARN no codificante endógeno conocido, por ejemplo secuencia del gen de miARN usando el sistema CRISPR/Cas9 (por ejemplo, cambiando una secuencia de miARN, cambiando una secuencia larga de ARNbc, creando ARN antisentido, cambiando el ARNt, etc.). Hay muchas bases de datos de ARN no codificantes caracterizados, por ejemplo, miARN, los presentes inventores eligen varios ARN no codificantes de Arabidopsis o Nicotiana benthamiana conocidos, por ejemplo, miARN con diferentes perfiles de expresión (por ejemplo, baja expresión constitutiva, alta expresión, inducida en el estrés, etc.). Por ejemplo, para intercambiar la secuencia endógena de miARN con ARNpi, los presentes inventores usan el enfoque de HR. En la HR se contemplan dos opciones: uso de una secuencia de oligos donantes de aproximadamente 250-500 pb que incluye, por ejemplo, la secuencia de ARNpi en el medio o utilizando plásmidos que expresan un inserto de 1 Kb - 4 Kb que es casi 100 % idéntico al miARN que rodea el genoma de la planta excepto los 2 x 21 pb del miARN y el *miARN que se cambia al ARNpi de la GFP (500-2000 pb aguas arriba y aguas abajo del ARNpi, véase la figura 1). La transfección incluye las siguientes construcciones: sensor CRISPR:Cas9/RFP para rastrear y enriquecer células transformadas positivas usando, por ejemplo, el análisis FACS, ARNgc que guían a Cas9 para producir un DSB que es reparado por HR dependiendo del vector/oligo de inserción. El vector de inserción contiene dos regiones continuas de homología que rodean el locus diana que se reemplazan (es decir, miARN) y se modifican para llevar la mutación de interés (es decir, ARNpi). La construcción dirigida comprende o está libre de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción y se utiliza como molde para la recombinación homóloga que finaliza con el reemplazo del miARN por el ARNpi de elección. Después de la transfección a protoplastos, se usa FACS para enriquecer eventos transfectados positivos (usando el marcador de proteína fluorescente roja (RFP)), los protoplastos enriquecidos se puntúan para el silenciamiento de GFP bajo un microscopio (Figura 4). Se espera que los protoplastos editados positivos produzcan secuencias de ARNpi dirigidas a GFP y, por lo tanto, se espera que la expresión de GFP del transgén sea silenciada en comparación con los protoplastos de control. GFP es un método más rápido que PDS ya que las dos últimas etapas de recuperación y regeneración no son necesarias, la puntuación se puede realizar a nivel de protoplastos/células.

EJEMPLO 3

Silenciamiento génico de transgén-GFP exógeno en Arabidopsis

Además del ejemplo anterior de silenciamiento de GFP, otra forma de demostrar la eficiencia de GEiGS es silenciar un gen marcador como GFP (proteína fluorescente verde) en un ensayo de transformación de GFP transitorio. En este ejemplo, las primeras células vegetales (por ejemplo, Arabidopsis) se tratan usando GEiGS para expresar pequeñas moléculas de ARNpi dirigidas a GFP (el método para utilizar siGFP se analiza en el Ejemplo 2 anterior). Los protoplastos de control (por ejemplo, GEiGS-PDS) y los protoplastos editados usando GEiGS (que expresan siGFP) se transfectan luego con un plásmido que expresa por separado dos marcadores (sensor) GFP+RFP. Los protoplastos que expresan solo RFP pero no GFP en el tratamiento con GEiGS son los resultados del silenciamiento de GFP debido a la expresión de siGFP (como se ilustra en la Figura 5).

EJEMPLO 4

Plantas inmunizadas contra la infección por virus, silenciamiento del gen del virus exógeno (usando GFP como marcador)

Para probar que GEiGS es un método robusto para la inmunización de plantas con la capacidad de eliminar genes exógenos, los presentes inventores proporcionan un ejemplo de silenciamiento de un gen de virus. Existen varios virus que infectan a diferentes especies vegetales y que pueden ser utilizados en la presente POC: TuMV, CMV, TMV, etc.

El virus del mosaico del nabo (TuMV) se transmite de forma no persistente por pulgones y causa enfermedades prevalentes en cultivos de crucíferas en muchas partes del mundo. El genoma de TuMV, que es monocatenario, es una molécula de ARN de sentido positivo de aproximadamente 10.000 nt (número de acceso NC_002509). El TuMV tiene la misma organización genética típica de potyvirus tratada previamente por Urcuqui-Inchima et al. [Urcuqui-Inchima et al., Virus Res. (2001) 74: 157-175]. Los síntomas de TuMV son moteados en áreas irregulares, circulares, amarillas y amplias. Las hojas más viejas a menudo se vuelven de color amarillo brillante por todas partes. La lámina a menudo se vuelve necrótica. Se hizo un uso extensivo de TuMV-GFP y TuMV-AS9-GFP deficiente en supresores para exponer las actividades de silenciamiento antiviral en Arabidopsis. Las plantas de tipo salvaje eran inmunes a TuMV-AS9-GFP, pero la inmunidad fue suprimida de forma eficaz por la pérdida de DCL2 y DCL4, lo que indica que TuMV normalmente enmascara los efectos de una respuesta antiviral dependiente de ARNpi [Hernan Garcia-Ruiz et al., The Plant Cell (2010) 22: 481-496].

El virus del mosaico del pepino (CMV) es un virus fitopatógeno de la familia Bromoviridae. Es el miembro tipo del género de virus de plantas, Cucumovirus. Este virus tiene una distribución mundial y una gama de huéspedes muy amplia. De hecho, tiene la reputación de tener la gama de huéspedes más amplia de cualquier virus vegetal conocido. Puede transmitirse de una planta a otra tanto mecánicamente por la savia como por pulgones a través de estiletes. Este virus se encontró por primera vez en pepinos (Cucumis sativus) que mostraban síntomas de mosaico en 1934, de ahí el nombre de mosaico de pepino. Se desarrolló un vector de expresión basado en CMV que utiliza el mutante 3a MP para el movimiento de célula a célula independiente de CP. Este nuevo vector [Fujiki et al., Virology (2008) 381(1): 136-142] se incorporó a un vector binario de agrobacterium y se administró a las plantas mediante agroinfiltración. Los resultados demuestran que este nuevo vector de expresión basado en CMV es muy prometedor para la producción de proteínas recombinantes.

El virus del mosaico del tabaco (TMV), un virus de ARN monocatenario que comúnmente infecta plantas solanáceas, una familia de plantas que incluye muchas especies, tales como petunias, tomates y tabaco. El virus causa un patrón de mosaico de manchas marrones en la superficie de las hojas. El virus no suele causar la muerte de la planta, pero puede impedir seriamente su crecimiento. Las hojas inferiores pueden sufrir "quemaduras de mosaico" en climas cálidos y secos, donde grandes áreas de la hoja mueren. Este virus no puede entrar en las plantas por sí solo. Las plantas generalmente se infectan a través de heridas en las plantas después de la manipulación humana o mediante equipos contaminados. Una vez dentro de la planta, el virus libera su código genético (ARN). La planta se confunde con este código, confundiéndolo con el suyo propio, y comienza a producir proteínas virales. Los sistemas de expresión basados en virus en plantas son particularmente atractivos frente a los sistemas de expresión transitorios alternativos debido al alto nivel de multiplicación de genes y los niveles elevados concomitantes de expresión que se pueden lograr en un corto período de tiempo mientras se minimiza el deterioro de las actividades del huésped. El TMV es uno de los virus de plantas más estudiados y, por lo tanto, se ha convertido en una opción natural para el desarrollo de vectores. Los vectores basados en TMV han llevado a un rendimiento de proteína recombinante de hasta el 80 % de la proteína soluble total. La agroinfección es barata y reproducible, convirtiéndolo en un método preferido para administrar vectores de expresión viral en tejidos vegetales como parte del ADN-T de un vector binario transportado por Agrobacterium tumefaciens.

Los presentes inventores están usando TuMV-GFP para la infección de Arabidopsis o TMV-GFP para plantas de tabaco. Para crear plantas resistentes a la infección por virus, los presentes inventores usan un virus diseñado que expresa GFP tras la infección de la planta. El uso de dicho virus permitirá usar las mismas construcciones que se describen en el Ejemplo 3, anteriormente. La diferencia es que ahora la GFP se expresa a partir de la infección por el virus. Las plantas de control que están infectadas con virus-GFP (CMV o TMV) muestran expresión de GFP bajo el microscopio (Figura 6), sin embargo, Se espera que las plantas GEiGS diseñadas para expresar siRNA GFP muestren niveles reducidos de GFP (Figura 6). En consecuencia, generar plantas GEiGS sin expresión de GFP después de la infección con virus-GFP demostrará que se logró silenciar el gen exógeno por ARNi y que GEiGS es un método eficaz para inmunizar plantas contra virus y potencialmente otros patógenos. Hay pocas opciones fáciles para evaluar la efectividad del silenciamiento de GFP en la célula, tal como el uso de análisis FACS, PCR y microscopia. El silenciamiento de GFP en plantas está bien caracterizado y hay muchas secuencias cortas de ARN disponibles (ARNpi) que son activas para iniciar el silenciamiento de GFP. Por lo tanto, para el intercambio de genes, los presentes inventores usan unas pocas moléculas de ARNpi conocidas disponibles en la bibliografía.

Para usar secuencias de ARNpi que silenciarán el gen de GFP, los presentes inventores los están intercambiando con un ARN no codificante endógeno conocido, por ejemplo, secuencia del gen de miARN utilizando el sistema CRISPR/Cas9 (como se ha tratado anteriormente, hay muchas otras opciones para introducir estas secuencias de ARNpi, como cambiar secuencias largas de ARNbc, creando ARN antisentido, cambiando el ARNt, etc.). Hay muchas bases de datos de ARN no codificante endógeno caracterizado, por ejemplo, miARN, los presentes inventores eligen varios ARN no codificantes de Arabidopsis o Nicotiana benthamianaconocidos, por ejemplo, miARN con diferentes perfiles de expresión (por ejemplo, baja expresión constitutiva, alta expresión, inducida en el estrés, etc.). Por ejemplo, para intercambiar la secuencia endógena de miARN con ARNpi, los presentes inventores usan el enfoque de HR. En la HR se contemplan dos opciones: uso de una secuencia de oligos donantes de aproximadamente 250-500 pb que incluye, por ejemplo, la secuencia de ARNpi en el medio o utilizando plásmidos que expresan un inserto de 1 Kb -4 Kb que es casi 100 % idéntico al miARN que rodea el genoma de la planta excepto los 2 x 21 pb del miARN y el *miARN que se cambia al ARNpi de la GFP (500-2000 pb aguas arriba y aguas abajo del ARNpi, véase la figura 1). La transfección incluye las siguientes construcciones: sensor CRISPR:Cas9/RFP para rastrear y enriquecer células transformadas positivas usando, por ejemplo, el análisis FACS, ARNgc que guían a Cas9 para producir un DSB que es reparado por HR dependiendo del vector/oligo de inserción. El vector de inserción contiene dos regiones continuas de homología que rodean el locus diana que se reemplazan (es decir, miARN) y se modifican para llevar la mutación de interés (es decir, ARNpi). La construcción dirigida comprende o está libre de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción y se utiliza como molde para la recombinación homóloga que finaliza con el reemplazo del miARN por el ARNpi de elección. Después de la transfección a protoplastos, se usa FACS para enriquecer los eventos transfectados positivos, los protoplastos se regeneran en plantas y las plantas se infectan con el virus mediante inoculaciones mecánicas. Las plantas se califican para el silenciamiento de GFP bajo el microscopio (como se describe en la Figura 6). Se espera que los protoplastos editados positivos con GEiGS produzcan secuencias de ARNpi dirigidas a GFP y, por lo tanto, se espera que la expresión del gen de GFP del virus se silencie en comparación con las plantas de control sin editar.

EJEMPLO 5

Planta de plátano resistente a nematodos

El daño a la productividad del plátano debido a los nematodos es tremendo, alcanzando hasta un 50 % de pérdida de rendimiento en suelos no tratados. El problema se acentúa en las plantaciones tradicionales de plátano donde el monocultivo es una práctica común. La prohibición de nematicidas como bromuro de metilo en varias partes del mundo exacerbó el problema y deja a los agricultores con alternativas inapropiadas y poco confiables. Radopholus similis, el nematodo excavador, es el parásito nematodo del plátano de mayor importancia económica en el mundo. La infección por el nematodo excavador causa la enfermedad del derribo del plátano, amarillamiento del pimiento y disminución de la propagación de los cítricos. Estas enfermedades son el resultado de la infección por nematodos excavadores que destruyen el tejido de la raíz, dejando a las plantas con poco o ningún apoyo o capacidad para absorber agua y translocar nutrientes. Por los daños que provoca en los cítricos, plantas ornamentales y otras industrias agrícolas, a nivel mundial, el nematodo excavador es una de las plagas de plantas de nematodos más reguladas (Figura 7).

El ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una herramienta invaluable de silenciamiento de genes para el análisis funcional en una amplia variedad de organismos, particularmente el nematodo modelo de vida libre Caenorhabditis elegans. Un número creciente de estudios han descrito su aplicación a nematodos parásitos de plantas. Los genes expresados en una variedad de tipos de células se silencian cuando los nematodos captan ARN de doble cadena (ARNbc) o ARN de interferencia cortos (ARNpi) que provocan una respuesta sistémica de ARNi. Los extensos estudios de ARNpi con C. elegans sugieren que la prevención exitosa de que los nematodos completen su ciclo de vida se atribuye al silenciamiento de genes que se expresan temprano en el desarrollo embrionario. En R. similis, tales genes candidatos podrían ser Calreticulinal3 (CRT) o el gen colágeno 5 (col-5). La CRT es una proteína multifuncional de unión a Ca2+ que desempeña un papel clave en el parasitismo, la evasión inmunitaria, la reproducción y la patogenia de muchos parásitos animales y nematodos de plantas. Por lo tanto, CRT es una diana prometedora para controlar R. similis. Col-5 pertenece a los genes de colágeno de los nematodos que codifican proteínas que tienen una amplia gama de funciones. Entre sus productos más abundantes se encuentran los colágenos cuticulares, que incluyen aproximadamente el 80 % de las proteínas presentes en la cutícula del nematodo. Se ha encontrado que las estructuras de estos colágenos son sorprendentemente similares en las especies de nematodos parásitos y de vida libre estudiadas hasta ahora, y los genes que los codifican parecen constituir una gran familia multigénica cuya expresión está sujeta a la regulación del desarrollo.

Usando GEiGS, los presentes inventores están creando plantas de plátano que expresan moléculas de ARNpi que se transmiten desde sus raíces a los nematodos al alimentarse, y posteriormente inducen el silenciamiento de los genes de los nematodos. El silenciamiento de genes esenciales para la sucesión en el ciclo de vida inhibe la propagación de nematodos y anula los daños causados por nematodos. Los presentes inventores están cambiando algunos ARN no codificantes endógenos de plátano, por ejemplo, secuencias de miARN con secuencias cortas de los genes CRT o col-5. GEiGS se usa en protoplastos de plátano que se regeneran en plántulas y luego se analizan con diferentes nematodos para determinar su resistencia.

EJEMPLO 6

Planta de plátano resistente a Fusarium oxysporum

El género Fusarium incluye varias especies de hongos que se encuentran ampliamente distribuidos en suelos y sustratos orgánicos en todo el mundo. Fusarium oxysporum es una de las especies más relevantes de este género y es el agente causal de las pudriciones de raíces, enfermedades de marchitamiento y marchitamiento en más de 100 especies de plantas, incluyendo una amplia gama de cultivos hortícolas económicamente importantes, flores, árboles y una serie de cultivos de campo, tal como repollo, plátano y algodón. Fusarium oxysporum es un patógeno devastador que causa grandes pérdidas de rendimiento en una variedad de cultivos y el desarrollo de cultivos sostenibles y sostenibles, métodos respetuosos con el medio ambiente para mejorar la resistencia de los cultivos es crucial. F. oxysporum consiste en más de 120 formas especiales de cepas patógenas determinadas por sus plantas hospedantes primarias. Todas las cepas de F. oxysporum son saprófitas, siendo capaz de crecer y sobrevivir durante largos periodos sobre materia orgánica en el suelo haciéndolo muy difícil de controlar. Su ciclo de vida patogénico comienza con la germinación de esporas al reconocer un huésped adecuado. Una vez formadas las hifas, el patógeno ingresa a su huésped penetrando directamente en las raíces y lo coloniza dentro del xilema produciendo microconidios que conducen a la formación de micelio. La colonización y la producción de toxinas por el patógeno da como resultado el bloqueo del sistema vascular del huésped, causando síntomas característicos de la enfermedad, incluyendo coloración amarillenta de la vasculatura, aclaramiento de la vena, clorosis y necrosis en las nervaduras y hojas de las hojas, desprendimiento de hojas y marchitamiento. Una vez que la planta muere, el hongo esporula en las superficies de las hojas podridas. F. oxysporum es más prevalente en regiones tropicales y subtropicales y se espera que su rango geográfico se amplíe debido al cambio climático. Los métodos de control actuales para el marchitamiento por Fusarium son muy limitados y la rotación de cultivos es ineficaz debido a la gran variedad de huéspedes y su persistencia en el suelo. El manejo del marchitamiento por Fusarium se realiza principalmente a través de prácticas culturales e higiene de la granja que solo reducen la transmisión del inóculo, mientras que la esterilización del suelo solo se puede realizar en invernaderos. La fumigación del suelo con biocidas de amplio espectro, como el bromuro de metilo, es costosa y tiene muchos efectos peligrosos para el medio ambiente.

Huz han utilizado la tecnología de interferencia de ARN liberado por el huésped para silenciar parcialmente tres genes diferentes (FOW2, FRP1 y OPR) en el hongo hemibiotrófico F. oxysporum f. sp. Conglutinans [Hu et al., Front Chem. (2015) 20 (3):1]. La expresión de moléculas de ARN de doble cadena (ARNbc) dirigidas a genes de patógenos fúngicos se logró en varias líneas transgénicas de Arabidopsis. F. oxysporum que infectó las líneas transgénicas mostró niveles de ARNm sustancialmente reducidos en los tres genes diana, con un promedio de 75, 83 y 72 % de reducción para FOW2, FRP1 y OPR, respectivamente. El silenciamiento de genes patógenos tuvo un claro efecto positivo en la capacidad de las líneas transgénicas para combatir infecciones. Todas las líneas transgénicas mostraron una mayor resistencia a F. oxysporum con un retraso en el desarrollo de los síntomas de la enfermedad, especialmente las líneas FRP1 y OPR. Las tasas de supervivencia después de la infección fúngica fueron más altas en las líneas transgénicas en comparación con las plantas de tipo salvaje de control que mostraron consistentemente tasas de supervivencia del 10 %, con líneas FOW2 que muestran un 25 % de supervivencia; líneas FRP1 30-50 % de supervivencia y OPR entre 45 y 70 % de supervivencia. El efecto de regulación por disminución fue específico para los genes diana sin efectos imprevistos en los genes relacionados (Hu Z. (2015) citado anteriormente). Se demostró que en los hongos, tanto los ARNbc largos como los cortos se internalizan por igual e inducen al ARNi para silenciar los genes diana.

Los presentes inventores usan GEiGS para crear plantas de plátano resistentes a F. oxysporum cambiando algunos ARN no codificantes endógenos, por ejemplo, secuencias de miARN para apuntar específicamente a los genes de hongos como FOW2, FRP1 y OPR. Los protoplastos editados se regeneran en plántulas y se exponen a F. oxysporum en un entorno controlado, las plantas resistentes se verifican para expresar el ARNpi relevante.

EJEMPLO 7

Árbol del café resistente al nematodo

El café es un género de plantas con flores cuyas semillas, llamados granos de café, se utilizan para hacer diversas bebidas y productos de café. Es un miembro de la familia de Rubiaceae. Son arbustos o pequeños árboles nativos de África tropical y meridional y Asia tropical. El café se clasifica como uno de los cultivos básicos más valiosos y ampliamente comercializados del mundo y es un importante producto de exportación de varios países, incluidos los de América Central y del Sur, el Caribe y África. Se ha atribuido una disminución constante en la producción de café a limitaciones bióticas y socioeconómicas. Entre las limitaciones bióticas menos estudiadas se encuentran los nematodos.

Los nematodos fitoparásitos se consideran una grave limitación para la producción de café en el mundo y especialmente en Vietnam (Figura 8). Las especies dominantes y más importantes son Radopholus arabocoffeae y Pratylenchus coffeae. Ambas especies son responsables de la muerte de plantas menores de 5 años. Convencionalmente, el método principal para controlar P. coffeae es por medios químicos; no existe una estrategia particular de control contra R. aracoffeae.

Los presentes inventores usan la estrategia GEiGS (como se describe en el Ejemplo 5 anterior) para crear árboles de Coffea canephora (Robusta) que expresan moléculas de ARNpi que se transmiten desde sus raíces a los nematodos al alimentarse y, posteriormente, inducir el silenciamiento de los genes de los nematodos. El silenciamiento de genes esenciales para la sucesión en el ciclo de vida inhibe la propagación de nematodos y anula los daños causados por nematodos. Por lo tanto, los presentes inventores cambian algunos ARN no codificantes endógenos, por ejemplo, secuencias de miARN con secuencias cortas de los genes de nematodos. GEiGS se usa en protoplastos de café que se regeneran en plántulas y luego se analizan con diferentes nematodos para determinar su resistencia.

EJEMPLO 8

Generación de plantas con miARN endógeno modificado para apuntar a diferentes genes

Mínimas modificaciones en los loci genómicos de un miARN, en su secuencia de reconocimiento (que madurará a un miARN) puede conducir a un nuevo sistema para regular nuevos genes, de manera no transgénica. Por lo tanto, se utilizó un método de expresión transitoria libre de agrobacterias, para introducir estas modificaciones por bombardeo de raíces de Arabidopsis y su regeneración para su posterior análisis. Los presentes inventores habían elegido apuntar a dos genes, PDS3 y ADH1 en plantas de Arabidopsis.

Los carotenoides desempeñan un papel importante en muchos procesos fisiológicos de las plantas y el gen de la fitoeno desaturasa (PDS3) codifica una de las enzimas importantes en la ruta de biosíntesis de carotenoides, su silenciamiento produce un fenotipo albino/blanqueado. En consecuencia, las plantas con expresión reducida de PDS3 exhiben niveles reducidos de clorofila, hasta albino completo y enanismo.

La alcohol deshidrogenasa (ADH1) comprende un grupo de enzimas deshidrogenasas que catalizan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con la reducción concomitante de NAD+ o NADP+. El propósito metabólico principal de esta enzima es la descomposición de sustancias tóxicas alcohólicas dentro de los tejidos. Las plantas que albergan una expresión reducida de ADH1 exhiben una mayor tolerancia al alcohol alílico. En consecuencia, las plantas con ADH1 reducido son resistentes al efecto tóxico del alcohol alílico, por lo que su regeneración se realizó con selección de alcohol alílico.

Se eligieron dos miARN bien establecidos para ser modificados, miR-173 y miR-390, que previamente se demostró que se expresan a lo largo del desarrollo de la planta [Zielezinski A et al., BMC Plant Biology (2015) 15: 144]. Para introducir la modificación, se utilizó un sistema de 2 componentes. El primero, se utilizó el sistema CRISPR/CAS9, para generar una escisión en los loci miR-173 y miR-390, a través de a Rn guía específicos diseñados (Figuras 12A y 13A; y la Tabla 2, anteriormente), para promover la reparación del ADN homólogo (HDR) en el sitio. El segundo, una secuencia DONANTE, con la modificación deseada de la secuencia de miARN, para apuntar a los genes recién asignados, se introdujo como molde para el HDR (Figuras 12A-G, 13A-G, 14A-D y 15A-D; Tabla 2, anteriormente). Adicionalmente, dado que la estructura secundaria del transcrito primario del miARN (pri-miARN) es importante para la correcta biogénesis y actividad del miARN maduro, se introdujeron modificaciones adicionales en la cadena complementaria en el pri-miARN y se analizaron en mFOLD (www(dot)unafold(dot)rna(dot)Albany(dot)edu) para la conservación de la estructura (Figuras 12A-G y 13A-G). En total, se diseñaron dos guías para cada loci de miARN y dos secuencias DONANTES diferentes (secuencias de miARN modificadas) para cada gen (Figuras 14A-D y 15A-D, y Tabla 2, anteriormente).

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para modificar un gen que codifica o se procesa en una molécula silenciadora de ARN para un ARN diana en una célula vegetal, comprendiendo el método introducir en la célula vegetal un agente de edición de ADN que redirige una especificidad silenciadora de dicha molécula silenciadora de ARN hacia un segundo ARN diana, siendo dicho ARN diana y dicho segundo ARN diana distintos e introducir en la célula vegetal un oligonucleótido donante para generar un cambio preciso en el genoma, modificando así el gen que codifica la molécula silenciadora de ARN de manera que se suprime la especificidad original de la molécula silenciadora de ARN y se gana una nueva especificidad hacia el segundo ARN diana.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el gen que codifica la molécula silenciadora de ARN es endógeno a la célula vegetal.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha modificación de dicho gen que codifica dicha molécula silenciadora de ARN comprende impartir dicha molécula silenciadora de ARN con al menos un 45 % de complementariedad hacia dicho segundo ARN diana.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha especificidad de silenciamiento de dicha molécula silenciadora de ARN se determina midiendo un nivel de ARN de dicho segundo ARN diana y/o se determina fenotípicamente y/o se determina genotípicamente.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha molécula silenciadora de ARN se procesa a partir de un precursor,

opcionalmente, en el que dicha molécula silenciadora de ARN es una molécula de ARN de interferencia (ARNi) seleccionada entre el grupo que consiste en un pequeño ARN de interferencia (ARNpi), un ARN en horquilla corta (ARNhc), un microARN (miARN), un ARN que interacciona con Piwi (ARNip) y un ARNpi que actúa en trans (ARNtasi),

opcionalmente, en el que dicha molécula de ARNi se diseña de manera que una secuencia de dicha molécula de ARNi se modifica para conservar la estructura del ARN secundario y para ser reconocida por factores de ARNi celulares.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha modificación de dicho gen se efectúa mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en una deleción, una inserción, una mutación puntual y una combinación de las mismas,

opcionalmente en el que dicha modificación está en una región de tallo; en una región de bucle; en una región lineal y una región de bucle; en una región no estructurada; o en una región de tallo, una región de bucle y una región no estructurada de dicha molécula silenciadora de ARN,

opcionalmente en el que dicha modificación comprende una modificación de como máximo 200 nucleótidos.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho agente de edición de ADN comprende una endonucleasa,

opcionalmente en el que el agente de edición de ADN comprende una endonucleasa y una molécula dirigida a ADN,

opcionalmente en el que la molécula dirigida al ADN es ARNg,

opcionalmente en el que dicha endonucleasa comprende Cas9.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho agente de edición de ADN se aplica a la célula como ADN, ARN o RNP, en el que el agente de edición de ADN se introduce en la célula vegetal utilizando métodos de administración de ADN o métodos sin ADN,

opcionalmente en el que el agente de edición de ADN se introduce en la célula vegetal utilizando vectores de expresión,

opcionalmente, en el que dicho agente de edición de ADN comprende al menos un ARNg unido operativamente a un promotor expresable en plantas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho agente de edición de ADN es un sistema de edición de ADN seleccionado del grupo que consiste en una meganucleasa, una nucleasa de dedos de cinc (ZFN), una nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN) y CRISPR.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho segundo ARN diana es exógeno a la célula vegetal.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, comprendiendo dicho método además generar una planta que comprende dicha célula vegetal, produciendo así una planta con expresión reducida de dicho segundo ARN diana.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicho segundo ARN diana es un gen de la planta que confiere sensibilidad a un patógeno o una plaga, o en el que el segundo ARN diana es un gen de un patógeno o una plaga, generando así una planta tolerante o resistente a patógenos o plagas.